ES2301241T3 - Virus de influenza a atenuados, y composiciones inmunogenicas y formulaciones de vacunas que los contienen. - Google Patents
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Abstract
Un virus influenza A atenuado genéticamente elaborado, caracterizado porque dicho virus comprende un genoma viral en el que está suprimido el segmento completo del gen NS1 (de1NS1).
Description
Virus de influenza A atenuados, y composiciones
inmunogénicas y formulaciones de vacunas que los contienen.
El trabajo reflejado en esta solicitud ha sido
financiado, en parte, por una subvención del Instituto Nacional de
la Salud, y el Gobierno puede tener ciertos derechos en la
invención.
La presente invención se refiere a la
elaboración de virus influenza A atenuados mediante la alteración de
la secuencia de codificación del gen viral N51. En particular, la
presente invención se refiere a la preparación de virus influenza A
atenuados vivos que inducen el interferón y vías asociadas. La
presente invención se refiere además al uso de los virus atenuados y
vectores virales contra un amplio espectro de patógenos y/o
antígenos, incluidos los antígenos específicos de tumores.
Las vacunas de virus inactivado se preparan
"matando" el patógeno viral, por ejemplo, mediante tratamiento
con calor o formalina, para que no pueda replicarse. Las vacunas
inactivadas tienen una utilidad limitada debido a que no
proporcionan inmunidad de larga duración y, por lo tanto, permiten
una protección limitada. Una aproximación alternativa a la
producción de vacunas con virus implica el uso de vacunas con virus
atenuados vivos. Los virus atenuados son capaces de replicación
pero no son patógenos, y, por lo tanto, proporcionan una inmunidad
de duración más larga y permiten mayor protección. Sin embargo, los
métodos convencionales para producir virus atenuados implica el
aislamiento aleatorio de mutantes del rango de huéspedes, muchos de
los cuales son sensibles a la temperatura; por ejemplo, el virus
atraviesa huéspedes artificiales, y se seleccionan los virus
progenie que son inmunogénicos, todavía no patógenos. La tecnología
de ADN recombinante así como las técnicas de ingeniería genética,
en teoría, permitirían una aproximación superior a la producción de
un virus atenuado ya que se podrían preparar deliberadamente
mutaciones específicas dentro del genoma viral. Sin embargo, las
alteraciones genéticas necesarias para la atenuación de virus no son
conocidas o predecibles. En general, los intentos para usar la
tecnología de ADN recombinante para elaborar vacunas virales se han
dirigido principalmente a la producción de vacunas subunitarias que
contienen solamente subunidades de proteínas del patógeno implicado
en la respuesta inmune, expresado en vectores virales recombinantes
como el virus vaccinia o baculovirus. Más recientemente, se han
utilizado técnicas de ADN recombinante en un intento de producir
mutantes de deleción del virus herpes o poliovirus que imitan los
virus atenuados encontrados en la naturaleza o mutantes conocidos
del rango de huéspedes. Hasta muy recientemente, los virus de ARN de
hebra negativa no respondían bien a la manipulación específica del
sitio, y por lo tanto no podían elaborarse genéticamente.
Las familias de virus que contienen ARN envuelto
de única hebra del genoma de sentido negativo están clasificadas en
dos grupos que tienen genomas no-segmentados
(Paramyxoviridae, Rhabdoviridae) o aquellos que tienen genomas
segmentados (Orthomyxoviridae, Bunyaviridae y Arenaviridae). La
familia de Orthomyxoviridae, descrita detalladamente a
continuación, y utilizada en los ejemplos aquí, contiene solamente
los virus de influenza, tipos A, B y C.
Los viriones de influenza se componen de un
núcleo interno de ribonucleoproteína (una nucleocápside helicoidal)
que contiene el genoma ARN de única hebra, y una envoltura exterior
de lipoproteína recubierta dentro por una proteína matriz (M). El
genoma segmentado de influenza A se compone de ocho moléculas (siete
para la influenza C) de ARNs lineales, de polaridad negativa, de
única hebra que codifican diez polipéptidos, que incluyen: las
proteínas de ARN polimerasa ARN dirigidas (PB2, PB1 y PA) y la
nucleoproteína (NP) que forma la nucleocápside; las proteínas
matrices (M1, M2); dos glicoproteínas superficiales que se proyectan
desde la envoltura de lipoproteína: hemaglutinina (HA) y
neuraminidasa (NA); y proteínas no-estructurales
cuya función es desconocida (NS1 y NS2). La transcripción y
replicación del genoma tienen lugar en el núcleo y el ensamblaje
ocurre a través de brotes en la membrana plasmática. Los virus
pueden re-clasificar los genes durante las
infecciones mixtas.
El virus influenza se adsorbe mediante la HA a
los sialil-oligosacáridos en las glicoproteínas y
glicolípidos de la membrana celular. Después de la endocitosis del
virión, un cambio conformacional en la molécula de HA tiene lugar
dentro del endosoma celular lo que facilita la fusión de la
membrana, desencadenando así el descapado. La nucleocápside migra
hacia el núcleo donde se transcribe el mARN viral como evento
inicial esencial en la infección. El mARN viral se transcribe
mediante un mecanismo único en el que la endonucleasa viral segmenta
el 5'-terminal protegido de los mARN celulares
heterólogos que sirven entonces de iniciadores para la transcripción
de las plantillas de ARN viral por la transcriptasa viral. Las
transcripciones terminan en los sitios 15 a 22 bases desde los
extremos de sus plantillas, donde las secuencias de oligo(U)
actúan como señales para la adición independiente de la plantilla
de tractos poli(A). De las ocho moléculas de mARN virales así
producidas, seis son mensajes monocistrónicos que son traducidos
directamente en las proteínas que representan la HA, NA, NP y las
proteínas polimerasa viral, PB2, PB1 y PA. Las otras dos
transcripciones experimentan un empalme, produciendo cada una dos
mARN que son traducidos en distintos marcos de lectura para producir
M1, M2, NS1 y NS2.
En otras palabras, los ocho mARN virales
codifican para diez proteínas: ocho estructurales y dos
no-estructurales. Se muestra en el Cuadro I a
continuación un sumario de los genes del virus influenza y sus
productos proteicos.
\vskip1.000000\baselineskip
CUADRO
I
Segmentos de ARN del Genoma del
Virus Influenza y Asignaciones de
Codificación
El genoma de Influenza A contiene ocho segmentos
de ARN de una sola hebra de polaridad negativa, que codifican para
nueve proteínas estructurales y una no-estructural.
La proteína no-estructural NS1 es abundante en las
células infectadas con el virus influenza, pero no ha sido detectada
en viriones. NS1 es una fosfoproteína encontrada pronto en el
núcleo durante la infección y también en el citoplasma en momento
más tardíos del ciclo viral (King y col., 1975, Virology 64:378).
Los estudios con mutantes de influenza sensibles a la temperatura
(ts) que llevan lesiones en el gen NS sugirieron que la proteína NS1
es un regulador transcripcional y
pos-transcripcional de los mecanismos por los que
el virus es capaz de inhibir la expresión del gen de las células
huésped y estimular la síntesis de las proteínas virales. Como
muchas otras proteínas que regulan procesos
post-transcripcionales, la proteína NS1 interactúa
con las secuencias y estructuras específicas del ARN. Se ha dicho
que la proteína NS1 se unía a distintas especies de ARN incluidas:
vARN, poli-A, U6 snARN, región
no-traducida 5' en cuanto a los mARN virales y ds
ARN (Qiu y col., 1995, Rna 1: 304; Qiu y col., 1994, J. Virol. 68:
2425). La expresión de la proteína NS1 procedente del cADN en las
células transfectadas ha sido asociada a distintos efectos:
inhibición del transporte nucleo-citoplásmico de
mARN, inhibición del empalme de pre-mARN; inhibición
de la poliadenilación de mARN huésped y estimulación de la
traducción del mARN viral (Fortes, y col., 1994, Embo J. 13: 704;
Enami, K. y col., 1994, J. Virol. 68: 1432 de la Luna, y col., 1995,
J. Virol. 69:2427; Lu, Y. y col., 1994, Genes Dev. 8:1817; Park y
col., 1995, J. Biol. Chem. 270, 28433).
La presente invención se refiere a los virus
influenza A atenuados vivos genéticamente elaborados que inducen el
interferón y respuestas asociadas. La presente invención se refiere
a la preparación de virus influenza A atenuados vivos con los
segmentos del gen NS suprimidos. El virus influenza A atenuado puede
codificar además una secuencia heteróloga, tal como un péptido
antigénico viral o un péptido antigénico tumoral. Por ejemplo, el
péptido antigénico viral puede ser el virus de inmunodeficiencia
humana gp120, el antígeno superficial del virus de la hepatitis B,
una glicoproteína del virus del herpes, o el VP1 del virus de la
polio. La secuencia heteróloga puede codificar también un gen de
inmunoglobulina o una proteína de la misma. La secuencia heteróloga
puede proceder de una bacteria, virus o parásito, tal como el
epítopo de malaria (ME1) de Plasmodium yoelii.
La presente invención se refiere además a
vacunas y métodos para inhibir la infección vírica. La vacuna se
puede formular para administración intranasal. Los virus atenuados
de la presente invención pueden utilizarse para proteger contra la
infección vírica. Tal como lo demuestra la evidencia presentada en
los Ejemplos presentados, los virus atenuados de la presente
invención tienen actividad antiviral cuando se administran antes de
la infección con virus de tipo salvaje, demostrando así la utilidad
profiláctica de los virus atenuados de la presente invención.
La presente invención se basa en parte, en el
descubrimiento sorprendente de los solicitantes de que un virus de
influenza A elaborado con el gen NS1 suprimido era capaz de
desarrollarse en una línea celular carente de la producción de IFN
de tipo 2, pero era indetectable en las células de riñón canino
Madin-Darby (MDCK) y en la membrana alantoica de
los huevos embrionados de pollo, dos substratos convencionales para
el virus de influenza. Los solicitantes descubrieron además que la
infección de las células humanas con el virus de influenza A
elaborado con el gen NS1 suprimido, pero no el virus de tipo
salvaje, inducía altos niveles de expresión de los genes bajo el
control del promotor inducido por el IFN. Estos resultados por vez
primera tienen en cuenta un sistema de selección eficaz para los
virus de influenza que contienen los mutantes de NS1, cuando
anteriormente no era posible filtrar los virus con un fenotipo de
NS1 suprimido.
Los virus atenuados de la invención se pueden
utilizar ventajosamente con seguridad en la formulación de vacunas
con virus vivos. Tal como se emplea aquí, el término virus
"atenuado" se refiere a un virus que es infeccioso pero no
patógeno; o un virus infeccioso que puede ser o no patógeno, pero
que produce partículas defectuosas durante cada serie de
replicación o produce menos viriones de progenie que lo hacen los
virus correspondientes de tipo salvaje durante la replicación. Los
virus patógenos que se elaboran para producir partículas defectuosas
o un número reducido de viriones de progenie son "atenuados"
en lo que aunque el virus sea capaz de causar enfermedad, las
concentraciones de virus obtenidas en un individuo vacunado
proporcionarán solamente niveles subclínicos de infección.
Fig. 1. Representaciones esquemáticas de los
genes NS y mARNs específicos de NS de (A) el virus de influenza
A/PR/9/34 de tipo salvaje (WT NS) y (B) virus de influenza de1NS1
transfectante. Los segmentos de ARN genómico vienen representados
por casillas blancas flanqueadas por cuadrados negros. Los últimos
representan las regiones de no-codificación del gen.
Los mARN específicos de NS también vienen representados. Unas líneas
finas en los extremos de los mARN representan las regiones
no-traducidas. Se muestran las estructuras
protegidas 5' (círculos negros) y las colas de poli(A) en los
mARN. El marco de lectura abierta de la proteína NS1 viene
representado por una casilla gris. El marco de lectura abierta de la
NEP (Proteína con Exportación Nuclear) específica se muestra con una
casilla sombreada. El mARN de la NEP procedente del gen NS de tipo
salvaje es un producto empalmado del mARN de NS1, tal como lo
indica la línea en forma de V.
Fig. 2. Análisis por RT-PCR del
segmento de ARN con NS del virus transfectante de1NS1. El ARN viral
de NS procedente del virus de influenza A/PR/8/33 purificado (wt) o
del virus de de1NS1 (de1NS1) fue amplificado mediante transcripción
inversa acoplada PCR utilizando los iniciadores de oligonucleótidos
descritos en la Sección 6. Los productos de PCR se realizaron sobre
gel con un 2% de agarosa y se colorearon con bromuro de etidio. Se
indican a la derecha las posiciones de seis marcadores.
Fig. 3. Expresión de la proteína en células Vero
infectadas por el virus de1NS1 (A) y células MDCK (B). Las células
se infectaron con el virus de1NS1 a una MOI de 0,02, se marcaron con
[35S] en los puntos de tiempo indicados, y la cantidad total de
proteínas virales se inmunoprecipitó utilizando un antisuero
policlonal contra el virus de influenza. Se analizaron los productos
inmunoprecipitados mediante SDS-PAGE. Las mayores
proteínas virales estructurales, la hemaglutinina (HA),
nucleoproteína (NP), neuraminidasa (NA) y proteína matriz (M1)
vienen indicadas por flechas. Se muestran a la izquierda los
marcadores moleculares de tamaño.
Fig. 4. Expresión de la proteína en las células
IFN\alphaR-/- infectadas con el virus de1NS1. Las células fueron
infectadas con el virus de1NS1 a una MOI de 0,02, y se marcaron con
[35S] en los puntos de tiempo indicados. Como control, células Vero
infectadas con el virus de1NS1 se marcaron en el mismo experimento
de 8 a 10 horas después de la infección. La cantidad total de
proteínas virales fueron inmunoprecipitadas utilizando un antisuero
policlonal contra el virus de influenza. Los productos
inmunoprecipitados se analizaron mediante SDS-PAGE.
Las mayores proteínas virales estructurales, la hemaglutinina (HA),
nucleoproteína (NP), neuraminidasa (NA) y proteína matriz (M1)
vienen indicadas por flechas. Se muestran a la izquierda los
marcadores moleculares de tamaño.
Fig. 5. Inducción de la transcripción desde un
promotor estimulado por IFN por infección con el virus de1NS1. Se
transfectaron 293 células con el plásmido
pHISG54-1-CAT que codifica el gen
reportero CAT bajo el control de un promotor estimulado por IFN de
tipo I. Un día después de la transfección, se transfectaron las
células con 50 \mug de dsARN, o se infectaron con el virus de1NS1
o con el virus A/PR/8/34 influenza de tipo salvaje (wt) a las MOI
indicadas. Un día después de la infección, se determinó la actividad
de CAT en extractos celulares. Se indica la estimulación de la
actividad de CAT después de los distintos tratamientos.
Fig. 6. Inducción de la respuesta antivírica en
huevos embrionados por el virus de1NS1. Se inocularon unos huevos de
pollo embrionados de 10 días con 20.000 unidades formadoras de
placas del virus de1NS1 o con PBS (no-tratado).
Después de una incubación de 8 horas a 37ºC, se reinfectaron los
huevos con 103 pfu de virus influenza A/WSN/33 (WSN) de H1N1, virus
influenza A/PR/8 (PR8) de H1N1, virus influenza
A/X-31 (X-31) de H3N2, virus
influenza B/Lee/40 (B-Lee), o virus Sendai (Sendai):
Los huevos infectados por B-Lee se incubaron a 35ºC
durante 40 horas más. Todos los demás huevos se incubaron a 37ºC
durante 40 horas más. El virus presente en el fluido alantoico fue
valorado por el ensayo de hemaglutinación.
La presente invención se refiere a virus
influenza A atenuados genéticamente elaborados y a los métodos para
su producción. En particular, la presente invención se refiere a la
elaboración de virus atenuados vivos con el segmento del gen NS1
suprimido.
La presente invención se basa, en parte, en el
descubrimiento sorprendente de los solicitantes de que un virus
elaborado de influenza A con el segmento del gen NS1 suprimido es
capaz de desarrollarse en una línea celular carente de la
producción de IFN, pero es indetectable en las células de riñón
canino Madin-Darby (MDCK) y en la membrana
alantoica de los huevos embrionados de pollo, dos substratos
convencionales para el virus de influenza. Los solicitantes
descubrieron además que el virus de influenza A elaborado con el gen
NS1 suprimido inducía respuestas al IFN en las células humanas. Los
solicitantes descubrieron también que los virus de influenza
elaborados con NS1 suprimido son capaces de replicar e inducir la
enfermedad en animales que carecen de señalización de IFN, pero no
son patógenos en ratones de tipo salvaje.
La presente invención se refiere además a la
utilización de los virus atenuados de la presente invención como
vacuna contra un amplio espectro de virus y/o antígenos, incluidos
los antígenos específicos de los tumores. Se pueden emplear
numerosos métodos para introducir las formulaciones de virus
atenuados vivos en un ser humano o un animal sujeto a una respuesta
inmune.
Estos incluyen, sin limitarse a los mismos las
vías oral, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal,
intravenosa, subcutánea e intranasal. En una realización
preferente, los virus atenuados de la presente invención son
formulados para su suministro como vacuna intranasal.
Los virus atenuados de influenza A elaborados
genéticamente de la presente invención tienen un fenotipo inductor
de interferón, en oposición a los virus de tipo salvaje que inhiben
las respuestas celulares mediadas por interferón.
La presente invención se refiere a virus
atenuados de influenza A con un segmento del gen NS1 suprimido. La
presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento en lo que
aunque un virus modificado por NS1 sea capaz de desarrollarse en
células carentes de IFN, como las células Vero, su capacidad para
replicarse fue seriamente perjudicada en las células MDCK y en los
huevos de pollo embrionados. Es posible que estas carencias de
crecimiento sean debidas a cambios en los segmentos de ARN distintos
del gen NS. Con el fin de descartar esta posibilidad, "se
reparó" el virus rescatando un gen NS elaborado de tipo salvaje
dentro del virus de1NS1. El virus transfectante resultante se
desarrolló hasta niveles de tipo salvaje en las células MDCK y en
los huevos, demostrando que la falta del gen NS1 determina las
características fenotípicas del virus de1NS1.
Como los virus modificados por NS son capaces de
replicación en las células Vero que son carentes de expresión de
IFN, esto indica que el crecimiento alterado en el cultivo de tejido
y en los huevos de los virus modificados por NS se debe a los
efectos mediados por IFN. La siguiente evidencia sostiene el papel
de los efectos mediados por IFN: (a) Los niveles de expresión viral
de la proteína son similares en las células Vero infectadas por el
virus de1NS1 y en las células IFN\alphaR-/-, pero son notablemente
reducidos en las células MDCK. Se debe observar que las células
IFN\alphaR-/- y las células Vero son ambas defectuosas en la
inducción de una respuesta antiviral a IFN, aunque el defecto
genético responsable de esta carencia sea distinto para estos dos
líneas celulares. (b) Infección con el virus modificado por NS pero
no con la transactivación inducida por el virus de tipo salvaje de
un gen reportero estimulado por IFN en 293 células. (c) Finalmente,
el virus de1NS1 fue capaz de replicar e inducir la enfermedad en
ratones que carecían de señalización de IFN, es decir, animales
STAT1-/-, pero el virus no era patógeno en ratones de tipo
salvaje.
La importancia del IFN de tipo I es ilustrada
por el hecho de que numerosos virus expresan antagonistas que
contrarrestan las respuestas mediadas por IFN por el huésped. Los
ejemplos incluyen los ARN VA de adenovirus, los ARN codificados por
el virus Epstein-Barr estructurales pequeños, los
productos genéticos K3L y E3L del virus vaccinia, el producto
genético NSP3 del rotavirus del grupo C, y la proteína del reovirus
\delta3, entre otros. Es interesante que varios de estos
productos virales, como la proteína de NS1 del virus de influenza
A, sean capaces de unirse a dsARN que impide la activación de PKR.
Así, los virus atenuados de la presente invención se pueden
utilizar también para complementar cualquier producto terapéutico
antiviral en lo que aumenta la respuesta mediada por IFN, una
respuesta de que la mayoría de los virus han desarrollado mecanismos
complejos para desviarse.
El virus atenuado de influenza de la presente
invención se puede utilizar para expresar secuencias heterólogas,
incluidos los antígenos virales y tumorales. Así, los virus
atenuados se pueden utilizar para expresar una amplia variedad de
epítopos antígenos, es decir, que los epítopos que inducen una
respuesta protectora inmune a cualquiera de una variedad de
patógenos, o antígenos que unen anticuerpos neutralizantes pueden
ser expresados por o como parte de los virus quiméricos. El virus
atenuado de la presente invención es un vehículo excelente para
introducir epítopos antigénicos dado que induce una respuesta
mediada por IFN y no es patógeno al huésped. De acuerdo con la
presente invención, la manipulación genética del gen NS de los virus
de influenza A puede ayudar a generar vectores virales de vacuna
que expresen nuevos antígenos y/o polipéptidos.
Como el segmento de ARN de NS es el más corto
entre los ocho ARN virales, es posible que el ARN de NS tolere
inserciones más largas de secuencias heterólogas que otros ARN
virales. Además, el segmento de ARN de NS dirige la síntesis de
altos niveles de proteína en células infectadas, lo que sugiere que
sería un segmento ideal para inserciones de antígenos extraños. Sin
embargo, de acuerdo con la presente invención, se puede utilizar
cualquiera de los ocho segmentos de influenza para la inserción de
secuencias heterólogas.
Las secuencias heterólogas de codificación
genética flanqueadas por el complemento del sitio/promotor de unión
de polimerasa viral, por ejemplo, el complemento del terminal del
virus 3'-influenza, o los complementos de los
terminales del virus tanto 3'- como 5'-influenza, se
pueden construir utilizando técnicas conocidas en el arte. Las
moléculas de ADN recombinante que contienen estas secuencias
híbridas pueden ser clonadas y transcritas por una ARN polimerasa
ADN dirigida, como el bacteriófago T7, T3 o la polimerasa Sp6 y
similares, para producir plantillas de ARN recombinante que poseen
secuencias virales apropiadas que tienen en cuenta el reconocimiento
y actividad de la polimerasa viral.
Una aproximación para construir estas moléculas
híbridas consiste en insertar la secuencia heteróloga de
codificación en un complemento de ADN de un segmento de virus
influenza genómico para que la secuencia heteróloga esté flanqueada
de las secuencias virales necesarias para la actividad de la
polimerasa viral; es decir, el sitio/promotor de unión de la
polimerasa, denominado en adelante el sitio de unión de la
polimerasa viral. En una aproximación alternativa, los
oligonucleótidos que codifican el sitio de unión de la polimerasa
viral, por ejemplo, el complemento del terminal-3'
o ambos terminales de los segmentos genómicos del virus puede estar
ligado a la secuencia heteróloga de codificación para construir la
molécula híbrida. La colocación de un gen o segmento extraño de un
gen extraño dentro de una secuencia diana ha sido anteriormente
dictada por la presencia de sitios adecuados de la enzima de
restricción dentro de la secuencia diana. Sin embargo, los recientes
avances en biología molecular han reducido mucho este problema. Los
sitios de la enzima de restricción se pueden localizar fácilmente
en cualquier sitio dentro de una secuencia diana mediante el uso de
la mutagénesis dirigida al sitio (por ejemplo, véase por ejemplo
las técnicas descritas por Kunkel, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 82; 488). Las variaciones en la tecnología de reacción en
cadena de la polimerasa (PCR), descrita debajo, tienen en cuenta
también la inserción específica de las secuencias (es decir, sitio
de la enzima de restricción) y tienen en cuenta la fácil
construcción de moléculas híbridas. Alternativamente, las reacciones
PCR se pueden utilizar para preparar plantillas recombinantes sin
necesidad de clonación. Por ejemplo, las reacciones PCR se pueden
utilizar para preparar moléculas de ADN de doble hebra que contienen
un promotor de ARN polimerasa ADN dirigida (por ejemplo,
bacteriofase T3, T7 o Sp6) y la secuencia híbrida que contiene el
gen heterólogo y el sitio de unión de la polimerasa viral de
influenza. Las plantillas de ARN pueden ser transcritas entonces
directamente desde este ADN recombinante. En todavía otra
realización, las plantillas de ARN recombinante se pueden preparar
ligando los ARN que especifican la polaridad negativa del gen
heterólogo y el sitio de unión de la polimerasa viral utilizando
una ARN ligasa. Los requisitos de la secuencia para la actividad y
construcciones de la polimerasa viral que se pueden utilizar de
acuerdo con la invención están descritos en las subsecciones a
continuación.
La invención se refiere a virus atenuados de
influenza A que han sido modificados de modo tal que resulten en un
fenotipo inductor de IFN e independiente de IFN. La sección
siguiente describe las distintas aproximaciones que se pueden
utilizar de acuerdo con la invención para generar un fenotipo
atenuado. Se pueden utilizar técnicas de ADN recombinante para
realizar una deleción del segmento completo del gen NS1. La
invención se basa, en parte, sobre el descubrimiento de que la
regulación a la baja del gen NS1 del virus influenza resulta en la
producción de partículas defectuosas en cada serie de replicación,
para que el virus demuestre características atenuadas.
Se pueden emplear muchos métodos para introducir
las formulaciones de virus atenuados vivos en un ser humano o
animal sujeto a la inducción de una respuesta inmune; estos
incluyen, sin limitarse a los mismos, las vías oral, intradérmica,
intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea e
intranasal. Es preferible introducir la vacuna quimérica del virus
por su vía natural de infección. Hasta recientemente, los virus de
ARN de hebra negativa (por ejemplo, influenza) no respondían a la
manipulación genética específica del sitio debido a que los ARN
virales no son infecciosos. Sin embargo, una técnica recientemente
desarrollada, denominada "genética inversa", permite la
elaboración y producción de virus de ARN recombinante de hebra
negativa.
La técnica de la genética inversa implica la
preparación de ARN virales recombinantes sintéticos que contienen
las regiones de no-codificación del virus de hebra
negativa que son esenciales para el reconocimiento de ARN viral por
las polimerasas virales y para el empaquetamiento de las señales
necesarias para generar un virión maduro. Los ARN recombinantes se
sintetizan a partir de una plantilla de ADN recombinante y se
reconstituyen in vitro con el complejo polimerasa viral
purificada para formar ribonucleoproteínas (RNP) recombinantes que
se pueden utilizar para transfectar las células. Se realiza una
transfección más eficaz si las proteínas de polimerasa viral están
presentes durante la transcripción in vitro de los ARN
sintéticos. Las RNP recombinantes sintéticas se pueden rescatar
dentro de partículas de virus infecciosas. Se describen las técnicas
precedentes en la patente de los Estados Unidos No. 5.166.057,
emitida a 24 de noviembre de 1992 y en Enami & Palese, 1991, J.
Virol. 65: 2711-2713, y los virus de influenza A que
contienen inserciones, deleciones y mutaciones con la parte del
tronco del gen NS, cambios que actúan como mutante del rango de
huéspedes.
\vskip1.000000\baselineskip
Los virus quiméricos atenuados de influenza A
que expresan una secuencia heteróloga pueden elaborarse mediante la
introducción de una alteración, incluida pero no limitada a una
inserción, deleción o sustitución de uno o más residuos de
aminoácidos y/o epítopos en una o más de las proteínas virales
implicadas en la regulación a la baja de la respuesta celular
mediada por IFN. Esto se puede realizar fácilmente mediante la
elaboración de la alteración adecuada dentro de la secuencia del
gen viral correspondiente. Cualquier cambio que altere la actividad
de la proteína viral implicada en la regulación a la baja de la
respuesta celular mediada por IFN para que la replicación viral sea
modificada o reducida puede realizarse de acuerdo con la
invención.
Por ejemplo, las alteraciones que interfieren en
pero que no suprimen completamente la unión viral a los receptores
de la célula huésped y subsiguiente infección pueden elaborarse
dentro de los antígenos superficiales virales o las proteasas
virales implicadas en el procesamiento para producir una cepa
atenuada. De acuerdo con esta realización, los antígenos
superficiales virales pueden ser modificados para contener
inserciones, sustituciones o deleciones de uno o más aminoácidos o
epítopos que interfieren en o reducen la afinidad de unión del
antígeno viral para los receptores de la célula huésped. Esta
aproximación ofrece una ventaja añadida en lo que se puede producir
un virus quimérico que expresa un epítopo extraño lo que demuestra
también las características atenuadas. Estos virus son candidatos
ideales para su uso como vacunas recombinantes vivas. Por ejemplo,
las secuencias heterólogas del gen que se pueden elaborar dentro de
los virus quiméricos de la invención incluyen, sin limitarse a los
mismos, los epítopos del virus de inmunodeficiencia humana (VIH)
como gp120; el antígeno superficial del virus de la hepatitis B
(HBsAg); las glicoproteínas del virus del herpes (por ejemplo, gD,
gE); VP1 del poliovirus; y los determinantes antigénicos de los
patógenos no-virales como las bacterias y parásitos
por nombrar unos pocos.
A este respecto, el influenza es un sistema
ideal en el que elaborar epítopos extraños, porque la capacidad de
seleccionar a partir de miles de variantes de virus influenza para
construir virus quiméricos evita el problema de la resistencia al
huésped o tolerancia inmune encontrado cuando se utilizan otros
vectores de virus como el vaccinia. Además, como el influenza
estimula una respuesta vigorosa de la célula T citotóxica y
secretoria, la presentación de epítopos extraños en el origen del
influenza puede también prever la inmunidad secretoria y la
inmunidad mediada por la célula. A modo de ejemplo, se puede
elaborar la inserción, deleción o sustitución de residuos de
aminoácidos en la proteína HA del influenza para producir una cepa
atenuada. A este respecto, se pueden utilizar alteraciones a la
región B o la región E de la HA. De acuerdo con esta aproximación,
el epítopo de la malaria (ME 1) de Plasmodium yoelii (NEDSYVPSAEQI)
se introdujo en el sitio E antigénico de la hemaglutinina del
influenza. El virus quimérico resultante tiene un LD50 500 a 1.000
veces más bajo (dosis letal 50) que el del virus de tipo salvaje
cuando se somete a ensayo en ratones. En otra realización, el mayor
determinante antigénico del tipo 1 de poliovirus, es decir, el bucle
BC del VP1 del tipo 1 de poliovirus (PASTTNKDKL) se elaboró en la
región B de la proteína de HA del influenza. Este virus quimérico
también está atenuado.
\newpage
En otra realización, se pueden elaborar
alteraciones de las proteasas virales necesarias para procesar
proteínas virales para producir la atenuación. Las alteraciones que
afectan a la actividad enzimática y hacen que la enzima se vuelva
menos eficaz en el procesamiento, tendrían que afectar a la
infectividad viral, empaquetamiento y/o liberación para producir un
virus atenuado. Por ejemplo, se pueden elaborar alteraciones a la
proteína de NS del virus influenza para reducir la actividad
enzimática de NS y disminuir el número y/o la infectividad del virus
progenie liberado durante la replicación.
En otra realización, se pueden alterar las
enzimas virales implicadas en la replicación viral y la
transcripción de genes virales, por ejemplo, las polimerasas
virales, replicasas, helicasas, etc., para que la enzima sea menos
eficaz o activa. La reducción de esta actividad enzimática puede
resultar en la producción de menos genomas de progenie y/o
transcripciones virales para que se produzcan menos partículas
infecciosas durante la replicación.
Las alteraciones elaboradas dentro de cualquiera
de las enzimas virales incluyen pero no se limitan a inserciones,
deleciones y sustituciones en la secuencia de aminoácidos del sitio
activo de la molécula. Por ejemplo, el sitio de unión de la enzima
podría alterarse para que se reduzca su afinidad de unión para el
substrato, y como consecuencia, la enzima es menos específica y/o
eficaz. Por ejemplo, la diana de elección es el complejo de
polimerasa viral ya que mutaciones sensibles a la temperatura
existen en todas las proteínas de polimerasa. Así, cambios
introducidos en las posiciones de aminoácidos asociadas a esta
sensibilidad de temperatura se pueden elaborar en el gen polimerasa
viral para que se produzca una cepa atenuada.
Se proporciona un sistema de selección basado en
la restricción del huésped para la identificación de los virus de
influenza A genéticamente manipulados. El sistema de selección de
forma más particular está asociado a la identificación de virus de
influenza A genéticamente manipulados que contienen segmentos
modificados del gen NS. El sistema de selección tiene en cuenta el
cribado de los virus de influenza genéticamente elaborados para
identificar aquellos virus con un segmento modificado del gen
NS.
El sistema de selección se basa, en parte, sobre
el descubrimiento de los solicitantes de que un virus elaborado de
influenza A con el gen NS1 suprimido era capaz de desarrollarse en
una línea celular carente de producción de IFN, mientras que la
misma línea celular no soportaría la infección y el crecimiento del
virus influenza de tipo salvaje. El virus con NS suprimido era
incapaz de infectar y desarrollarse en los substratos convencionales
para el virus influenza. Así, se puede utilizar una criba muy
sencilla y fácil para identificar aquellos virus de influenza
genéticamente elaborados que contienen un gen NS1 modificado.
Virtualmente, cualquier secuencia heteróloga de
gen se puede construir en los virus quiméricos de la invención para
su uso en vacunas. Preferentemente, los epítopos que inducen una
respuesta protectora inmune a cualquiera de una variedad de
patógenos o antígenos que unen anticuerpos neutralizantes pueden ser
expresados por o como parte de los virus quiméricos. Por ejemplo,
las secuencias heterólogas del gen que se pueden construir dentro
de los virus quiméricos de la invención para su uso en vacunas
incluyen pero no se limitan a los epítopos del virus de
inmunodeficiencia humana (VIH) como gp120; el antígeno superficial
del virus de la hepatitis B (HBsAg); las glicoproteínas del virus
del herpes (por ejemplo, gD, gE); VP1 del poliovirus; determinantes
antigénicos de patógenos no-virales tales como las
bacterias y parásitos, por nombrar unos pocos. En otra realización,
se pueden expresar todos o partes de los genes de inmunoglobulina.
Por ejemplo, se pueden construir regiones variables de
inmunoglobulinas anti-idiotípicas que imitan estos
epítopos dentro de los virus quiméricos de la invención.
Se puede formular una vacuna viral recombinante
viva o una vacuna viral recombinante inactivada. Puede resultar
preferible una vacuna viva debido a que la multiplicación en el
huésped conduce a un estímulo prolongado de tipo y magnitud
similares al que ocurre en infecciones naturales, y por lo tanto,
confiere una inmunidad sustancial de larga duración. La producción
de estas formulaciones de vacunas de virus recombinante vivo se
puede realizar utilizando métodos convencionales que implican la
propagación del virus en el cultivo celular o en el alantoide del
embrión de pollo seguido de la purificación.
A este respecto, el uso del virus influenza
genéticamente elaborado (vectores) con un propósito de vacunas
puede necesitar la presencia de características de atenuación en
estas cepas. Los candidatos actuales de vacunas de virus vivos para
su uso en seres humanos se adaptan en frío, son sensibles a la
temperatura o pasados para que deriven varios (seis) genes
procedentes de virus aviar, lo que resulta en la atenuación. La
introducción de mutaciones apropiadas (por ejemplo, deleciones) en
las plantillas utilizadas para la transfección puede proporcionar
nuevos virus con características de atenuación. Por ejemplo, las
mutaciones sin sentido específicas que están asociadas a la
sensibilidad a la temperatura o la adaptación al frío pueden
transformarse en mutaciones de deleción.
Estas mutaciones deberían ser más estables que
las mutaciones de punto asociadas a mutantes sensibles al frío o a
la temperatura y las frecuencias de reversión deberían ser
extremadamente bajas. Alternativamente, se pueden construir virus
quiméricos con características de "suicidio". Estos virus
seguirían solamente una o unas pocas series de replicación en el
huésped. Por ejemplo, la segmentación de la HA es necesaria para
tener en cuenta la reiniciación de la replicación. Por lo tanto,
los cambios en el sitio de segmentación de HA pueden producir un
virus que se replica en un sistema celular apropiado pero no en el
huésped humano. Cuando se utiliza como vacuna, el virus
recombinante seguiría un único ciclo de replicación e induciría un
nivel suficiente de respuesta inmune pero no iría más adelante en
el huésped humano y provocaría la enfermedad. Los virus
recombinantes que carecen de uno o más de los genes esenciales del
virus de influenza no serían capaces de experimentar series
sucesivas de replicación. Estos virus defectuosos pueden producirse
mediante la co-transfección de los RNP
reconstituidos que carecen de un gen(es)
específico(s) dentro de las líneas celulares que expresan permanentemente este gen(es). Los virus carentes de un gen(es) esencial(es) se replicarán en estas líneas celulares pero cuando se administren al huésped humano no serán capaces de completar una serie de replicación. Estas preparaciones pueden transcribe y traducir -en este ciclo fallido- un número suficiente de genes para inducir una respuesta inmune.
específico(s) dentro de las líneas celulares que expresan permanentemente este gen(es). Los virus carentes de un gen(es) esencial(es) se replicarán en estas líneas celulares pero cuando se administren al huésped humano no serán capaces de completar una serie de replicación. Estas preparaciones pueden transcribe y traducir -en este ciclo fallido- un número suficiente de genes para inducir una respuesta inmune.
Alternativamente, se podrían administrar
cantidades más importantes de cepas, para que estas preparaciones
sirvan de vacunas de virus inactivado (matado). En cuanto a las
vacunas inactivadas, es preferible que el producto genético
heterólogo se exprese como componente viral, para que el producto
genético se asocie al virión. La ventaja de estas preparaciones
consiste en que contienen proteínas nativas y no experimentan
ninguna inactivación por el tratamiento con formalina u otros
agentes utilizados en la fabricación de vacunas con virus matado.
En otra realización de este aspecto de la invención, se pueden
preparar formulaciones de vacuna inactivada mediante la utilización
de técnicas convencionales para "matar" los virus quiméricos.
Las vacunas inactivadas están "muertas" en el sentido de que
su infectividad ha sido destruida. Idealmente, la infectividad del
virus se destruye sin afectar a su inmunogenicidad. Con el fin de
preparar vacunas inactivadas, se puede cultivar el virus quimérico
en cultivo celular o en el alantoide del embrión de pollo, se
purifica por ultracentrifugación zonal, se inactiva mediante
formaldehído o \beta-propiolactona, y se agrupa.
La vacuna resultante es inoculada normalmente de forma
intramuscular.
Los virus inactivados se pueden formular con un
adyuvante adecuado para mejorar la respuesta inmunológica. Estos
adyuvantes pueden incluir pero no se limitan a los geles minerales,
por ejemplo, hidróxido de aluminio; sustancias superficiales
activas como la lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones;
péptidos; emulsiones aceitosas; y adyuvantes humanos potencialmente
útiles como el BCG y el Corynebacterium parvum.
Se pueden emplear numerosos métodos para
introducir las formulaciones de vacunas descritas anteriormente,
estas incluyen pero no se limitan a las vías oral, intradérmica,
intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, e
intranasal. Puede resultar preferible introducir la formulación de
vacuna con virus quimérico por la vía natural de infección del
patógeno para el que está diseñada la vacuna. Cuando se utiliza una
preparación de vacuna con virus quimérico vivo, puede resultar
preferible introducir la formulación por la vía natural de
infección por el virus influenza. La capacidad del virus influenza
para inducir una respuesta inmune secretoria y celular vigorosa se
puede utilizar ventajosamente. Por ejemplo, la infección del tracto
respiratorio por los virus quiméricos de influenza puede inducir
una fuerte respuesta inmune secretoria, por ejemplo en el sistema
urogenital, con protección concomitante contra un agente particular
causante de la enfermedad.
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes materiales y métodos se
utilizaron en las siguientes Secciones 7 a 11.
Virus y células. Se propagó el virus
influenza A/PR/8/34 (PR8) en huevos embrionados de pollo de 10 días
a 37ºC. El virus 25A-1 de influenza A, un virus
reasortante que contiene el segmento NS procedente de la cepa
adaptada al frío A/Leningrad/134/47/57 y los genes restantes
procedentes del virus PR8 (Egorov y col., 1994, Vopr. Virusol.
39:201-205; Shaw y col., 1996, Options for the
control of influenza III,. Brown, Hampson Webster (Elsevier
Science) pp. 433-436) se cultivó en células Vero a
34ºC. El virus 25A-1 es ts en células mamíferas, y
se usó como virus auxiliar para el rescate del virus transfectante
de1NS1. Se usaron células Vero y MDCK en el medio mínimo esencial
(MEM) que contenía 1 \mug/ml de tripsina (Difco Laboratories,
Detroit, Michigan) para el cultivo del virus influenza. Se
utilizaron también las células Vero para la selección, purificación
en placas y valoración del virus de1NS1. Las células MDCK, 293
células y los fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) procedentes
de embriones de ratones con IFN\alphaR-/- de 14-16
días se mantuvieron en DMEM (medio mínimo esencial de Dulbecco) que
contenía un 10% de suero de ternera fetal inactivado por calor. Los
fibroblastos inmortalizados de IFN\alphaR-/- derivaban de MEF por
paso continuo (Todaro y col., 1963, J. Cell. Biol.
17:299-313). Las células Vero se cultivaron en medio
AIM-V (Life Technologies, Grand Island, NY).
Ratones. Los ratones C57BL/6 homocigos
para una deleción diana de STAT1 se generaron tal como se ha
descrito anteriormente (Durbin y col., 1996, Cell
84:443-450). Se han descrito también los ratones
IFN\alphaR-/- (Hwang y col., 1995, Proc. Natl. Aced. Sci. USA
92:11284-11288). Se compraron a Taconic Farms
ratones exentos de patógenos específicos C57BL/6 y BALB/c (tipo
salvaje).
Infecciones de los animales. Se
utilizaron ratones hembra para la infección con virus influenza a
las 6 a 12 semanas de edad. Se realizaron inoculaciones
intranasales (i.n.) en ratones de tipo salvaje y STAT1-/- bajo
anestesia con éter utilizando 50 \mul de MEM que contenía 5x104
unidades formadoras de placas (pfu) de virus de1NS1. Se controlaron
diariamente los animales y se sacrificaron cuando se observaron en
un estado "in extremis". Todos los procedimientos
estaban acorde con las directrices de NIH sobre el cuidado y
utilización de los animales de laboratorio.
\newpage
Plásmidos. Se elaboró pT3de1NS1 como
sigue.
En primer lugar, pPUC19-T3/NS
PR8, que contiene el gen NS completo del virus PR8 flanqueado por el
promotor ARN polimerasa T3 y el sitio de restricción BpuAI se
amplificó mediante PCR inversa (Ochman y col., 1988. Genetics
120:621-623) utilizando los iniciadores
5'-CTGAAAGCTTGACACAGTGTTTG-3' y
5'-GACATACTGCT
GAGGATGTC-3' (CODON Genetic Systems, Weiden, Austria). El cADN obtenido que carecía por lo tanto del gen NS1 se fosforiló, se trató con Klenow, se autoligó y se propagó en la cepa E. coli TG1. La construcción obtenida después de la purificación se denominó pT3de1NS1 y se verificó mediante secuenciación. Los plásmidos para la expresión de las proteínas NP, PB1, PB2 y PA del virus PR8 (pHMG-NP, pHMG-PB1, pHMG-PB2, y pHMG-PA) han sido descritos anteriormente (Pleschka y col., 1996, J. Virol. 70:4188-4192). Se realizó pPOLI-NS-RB mediante la sustitución del marco de lectura abierta CAT de pPOLI-CAT-RT (Pleschka y col., 1996, J. Virol. 70:4188-4192) dentro del producto RT-PCR derivado de la región de codificación del gen NS del virus influenza A/WSN/33 (WSN). Este plásmido expresa el segmento de ARN viral específico de NS del virus WSN bajo el control de un promotor de polimerasa I humana truncada. pHISG54-1-CAT (Bluyssen y col., 1994, Eur. J. Biochem. 220:395-402) codifica el gen reportero CAT bajo el control transcripcional del promotor estimulado por IFN\alpha del gen ISG-54K.
GAGGATGTC-3' (CODON Genetic Systems, Weiden, Austria). El cADN obtenido que carecía por lo tanto del gen NS1 se fosforiló, se trató con Klenow, se autoligó y se propagó en la cepa E. coli TG1. La construcción obtenida después de la purificación se denominó pT3de1NS1 y se verificó mediante secuenciación. Los plásmidos para la expresión de las proteínas NP, PB1, PB2 y PA del virus PR8 (pHMG-NP, pHMG-PB1, pHMG-PB2, y pHMG-PA) han sido descritos anteriormente (Pleschka y col., 1996, J. Virol. 70:4188-4192). Se realizó pPOLI-NS-RB mediante la sustitución del marco de lectura abierta CAT de pPOLI-CAT-RT (Pleschka y col., 1996, J. Virol. 70:4188-4192) dentro del producto RT-PCR derivado de la región de codificación del gen NS del virus influenza A/WSN/33 (WSN). Este plásmido expresa el segmento de ARN viral específico de NS del virus WSN bajo el control de un promotor de polimerasa I humana truncada. pHISG54-1-CAT (Bluyssen y col., 1994, Eur. J. Biochem. 220:395-402) codifica el gen reportero CAT bajo el control transcripcional del promotor estimulado por IFN\alpha del gen ISG-54K.
Generación de virus transfectantes. La
generación del virus de1NS1 se realizó por transfección de la
ribonucleoproteína (RNP) (Luytijes y col., 1989, Cell
59:1107-1113). Las RNP se formaron mediante
transcripción de ARN polimerasa T3 a partir de pT3de1NS1
linearizado con BpuAI en presencia de la nucleoproteína purificada y
la polimerasa del virus influenza 25A-1 (Enami y
col., 1991, J. Virol 65:2711-2713). Los complejos de
RNP se transfectaron en células Vero que estaban previamente
infectadas con virus 25A-1. Las células
transfectadas se incubaron durante 18 horas a 37ºC, se pasó dos
veces el sobrenadante por las células Vero a 40ºC y se purificó en
placas tres veces en las células Vero cubiertas de medios en capa de
agar a 37ºC. El virus aislado de1NS1 se analizó por
RT-PCR utilizando los iniciadores
5'-GGCCTCTAGATAATACGACTCACTATAAGCAAAAGCAGGGTGACAAAG-3'
(complementario a las posiciones 1 a 21 del extremo 3' de
no-codificación del gen NS) y
5'-GATCGCCTTCTAT
TAGTAGAAACAAGGGTGTTTTTATTAAA TAAGCTG-3' (que contiene los últimos 38 nucleótidos del extremo 5' de no-codificación del gen NS). El virus transfectante NS/WSN se generó como sigue. Las células Vero en platos de 35 mm se transfectaron con los plásmidos pHMG-NP, pHMG-PB1, pHMG-PB2, pHMG-PA y pPOLI-NS-RB, tal como se ha descrito anteriormente (Pleschka y col., 1996, J. Virol. 70:4188-4192). Dos días después de la transfección, se infectaron las células con 5x104 pfu del virus de1NS1 y se incubaron 2 días más a 37ºC. Se pasó el supernatante celular una vez por las células MDCK y dos veces por en huevos embrionados de pollo. Los virus transfectantes fueron clonados por dilución limitante en huevos. El ARN genómico procedente del virus transfectante purificado NS/WSN se analizó por electrofóresis en gel de poliacrilamida, tal como ha sido descrito anteriormente (Zheng y col., 1996, Virology 217:242-251).
TAGTAGAAACAAGGGTGTTTTTATTAAA TAAGCTG-3' (que contiene los últimos 38 nucleótidos del extremo 5' de no-codificación del gen NS). El virus transfectante NS/WSN se generó como sigue. Las células Vero en platos de 35 mm se transfectaron con los plásmidos pHMG-NP, pHMG-PB1, pHMG-PB2, pHMG-PA y pPOLI-NS-RB, tal como se ha descrito anteriormente (Pleschka y col., 1996, J. Virol. 70:4188-4192). Dos días después de la transfección, se infectaron las células con 5x104 pfu del virus de1NS1 y se incubaron 2 días más a 37ºC. Se pasó el supernatante celular una vez por las células MDCK y dos veces por en huevos embrionados de pollo. Los virus transfectantes fueron clonados por dilución limitante en huevos. El ARN genómico procedente del virus transfectante purificado NS/WSN se analizó por electrofóresis en gel de poliacrilamida, tal como ha sido descrito anteriormente (Zheng y col., 1996, Virology 217:242-251).
Análisis de la síntesis proteica en virus en
células infectadas. Monocapas celulares en platos de 35 mm se
infectaron con 2x104 pfu del virus de1NS1. A intervalos después de
la infección, se marcaron las células con L-[35S]cisteína y
L-[35S]metionina durante los tiempos indicados. Las células
marcadas fueron lisadas en 10 mM de tris-HC1 (pH de
7.4) que contenía 150 mM de NaCl, 5 mM de EDTA, 1 mM de PMSF, un 10%
de glicerol, un 1% de Triton X-100, un 1% de
desoxicolato de sodio y un 0,1% de dodecil sulfato de sodio (SDS).
Se inmunoprecipitaron las proteínas por medio de un suero de conejo
policlonal con virus antiinfluenza. Se analizaron las proteínas
inmunoprecipitadas mediante electrofóresis en gel de poliacrilamida
con SDS al 10% (SDS-PAGE).
Transfecciones con CAT. 293 monocapas
celulares en platos de 35 mm se transfectaron con 1 \mug de
pHISG54-1-CAT utilizando el
reactivo de lipofección DOTAP (Boehringer Mannheim) de acuerdo con
las instrucciones del fabricante, y se incubaron a 37ºC. Un día
después de la transfección se infectaron las células con el virus
de1NS1 o el virus PR8 a las multiplicidades indicadas de infección
(MOI). Como controles, unas células fueron infectadas por
simulación o transfectadas con 50 \mug de
poli(I-C). Después de 1 día más a 37ºC, se
elaboraron unos extractos celulares y su actividad CAT fue sometida
a prueba, tal como se ha descrito (Percy y col., 1994, J. Virol.
68:4486-4492).
El segmento de ARN viral específico de NS del
virus influenza A codifica las proteínas tanto NS1 como NEP
(Proteína con Exportación Nuclear). El mARN específico de NS
no-empalmado se traduce en la proteína NS1, mientras
el ARN empalmado dirige la síntesis de la NEP. Se construyó el
plásmido pT3de1NS1 que expresa un gen NS mutado procedente del
virus influenza PR8. Este segmento de ARN mutado contiene una
deleción del marco de lectura abierta específico de NS1 (posiciones
nt 57 a 528 del gen NS de PR8 (Baez y col., 1980, Nucleic Acids Res.
8:5845-5858) y por lo tanto codifica solamente la
NEP (Fig. 1). La transfección de RNP del gen de1NS1 utilizando el
virus auxiliar ts 25A-1 produjo un virus de progenie
que era capaz de desarrollarse a 40ºC en las células Vero. La
amplificación del gen NS del virus rescatado por
RT-PCR confirmó la sustitución del gen NS del virus
auxiliar por aquel derivado del gen transfectado de1NS1 (Fig.
2).
Las propiedades de desarrollo del virus de1NS1 y
del virus PR8 de tipo salvaje fueron comparadas en células Vero,
células MDCK y huevos embrionados de pollo de 10 días. Las monocapas
celulares que contenían aproximadamente 106 de células Vero o MDCK
fueron infectadas con el virus de1NS1 o el virus PR8 a una MOI de
aproximadamente 0,0005. Después de 4 días de incubación a 37ºC
utilizando MEM que contenía 1 \mug/ml de tripsina, se utilizaron
supernatantes en un ensayo de hemaglutinación. Alternativamente, la
cavidad alantoica de huevos embrionados de pollo de 10 días se
inyectó con 104 pfu del virus de1NS1 o PR8, y la valoración por
hemaglutinación en los fluidos alantoicos fue determinada después
de 3 días de incubación a 37ºC. Tal como se muestra en el Cuadro 2,
el virus de1NS1 era capaz de desarrollarse en las células Vero a
concentraciones de 16 en comparación con una concentración de 128
para el virus PR8 de tipo salvaje. Sin embargo, la replicación del
virus de1NS1 se deterioró seriamente en las células MDCK y en los
huevos (las concentraciones de hemaglutinación fueron indetectables
en estas muestras).
\vskip1.000000\baselineskip
CUADRO
2
Replicación del Virus de1NS1 en
Células de Cultivo de Tejidos y en
Huevos
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de demostrar que el desarrollo viral
deteriorado del virus de1NS1 en las células MDCK y en huevos era
debido a la deleción del gen NS1 y no a posibles diferencias en
otros segmentos de ARN de los virus de1NS1 y PR8, utilizamos el
virus de1NS1 como virus auxiliar para rescatar un gen NS de tipo
salvaje. Las transfecciones se llevaron a cabo tal como se describe
en Materiales y Métodos utilizando un sistema de expresión basado
en plásmidos (Pleschka y col., 1996, J. Virol.
70:4188-4192) para el gen NS de tipo salvaje del
virus influenza A/WSN/34. La selección de los virus transfectantes
NS/WSN se realizó por pasos seriales en células MDCK y huevos. Los
análisis por SDS-PAGE del ARN viral purificado
procedente del virus NS/WSN confirmaron la longitud de tipo salvaje
de su segmento ARN de NS.
El virus transfectante NS/WSN que contenía el
segmento ARN de NS derivado del virus WSN y los segmentos restantes
procedentes del virus de1NS1 (PR8) era capaz de desarrollarse hasta
concentraciones idénticas a las del virus PR8 de tipo salvaje en
células MDCK y en huevos embrionados de pollo de 10 días.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de investigar si la deficiencia de
las células MDCK de replicación del virus de1NS1 tenía correlación
con una disminución en los niveles de expresión de las proteínas
virales, se realizaron experimentos de marcado con [35S]. Se
infectaron las células MDCK o Vero con el virus de1NS1 a una MOI de
0,02 y se marcaron con L-[35S]cisteína y
L-[35S]metionina durante los tiempos indicados. Después del
marcado, las proteínas virales se inmunoprecipitaron a partir de
extractos celulares y se separaron mediante PAGE (Fig. 3). La
cuantificación de la señal 35S indica que aproximadamente 20 veces
menos de proteína viral fue sintetizada por las células MDCK
infectadas.
\vskip1.000000\baselineskip
La razón por las diferencias entre las células
Vero y MDCK para soportar la replicación del virus de1NS1 y la
expresión proteica viral puede tener relación con la incapacidad de
las células Vero para sintetizar IFN (Desmyter y col., 1968, J.
Virol. 2:955-961; Mosca y col., 1986, Mol. Cell.
Biol. 6:2279-2283; Diaz y col., 1988, Proc. NeH.
Acad. Sci. USA 85:52595263). Con el fin de probar esta hipótesis, se
investigó el modelo de expresión proteica viral en una línea
celular murina que es incapaz de responder a IFN. Se infectaron
células noqueadas de IFN\alphaR con el virus de1NS1 a una MOI de
0,02 y se marcaron tal como se ha descrito anteriormente. Como
control, las células Vero infectadas por el virus de1NS1 se marcaron
al mismo tiempo de 8 a 10 horas después de la infección. Los
niveles de expresión proteica viral eran similares en ambas líneas
celulares (Fig. 4), lo que sugiere que el virus de1NS1 es capaz de
replicarse en los sistemas carentes de IFN. Se debe tomar nota de
que no pudimos investigar la replicación por multiciclos del virus
de1NS1 en las células IFN\alphaR debido a que estas células
mueren rápidamente en presencia de tripsina, lo que es necesario
para la activación viral de la hemaglutinina y la infectividad del
virus.
\vskip1.000000\baselineskip
Estimulación de la transcripción a partir de un
promotor regulado por IFN mediante infección con el virus
transfectante de1NS1. Para investigar si la deleción del gen NS1 en
el virus de1NS1 resulta en una respuesta mejorada de IFN en las
células infectadas, realizamos experimentos de transfección
utilizando pHISG54-1-CAT. Este
plásmido contiene el gen reportero CAT en frente del promotor
estimulado por IFN\alpha del gen ISG-54K
(Bluyssen y col., 1994, Eur. J. Biochem.
220:395-402). 293 células fueron transfectadas con
pHISG54-1-CAT e infectadas con el
virus de1NS1 o el PR8 de tipo salvaje a las MOI indicadas tal como
se describe en Material y Métodos. Se comparó la actividad de CAT
en los extractos celulares infectados con la actividad en los
extractos celulares no-infectados. Como control
positivo, la transcripción desde el promotor regulado por IFN fue
estimulada mediante poli(I-C). Tal como se
muestra en la Fig. 5, la infección a una MOI de 0,05 con el virus
de1NS1, pero no con el virus de tipo salvaje, indujo una
estimulación de la expresión del gen reportero aproximadamente 6
veces más importante. El virus transfectante carente del gen NS1 por
lo tanto estaba deteriorado en su capacidad para inhibir la
respuesta de IFN en las 293 células infectadas.
\vskip1.000000\baselineskip
El virus transfectante de1NS1 es patógeno en los
ratones STAT1. Se investigó la capacidad del virus de1NS1 para
replicarse y causar la enfermedad en ratones de tipo salvaje y en
ratones deficientes en las respuestas de IFN. Con este propósito,
5x104 pfu de virus de1NS1 se utilizó para infectar i.n. tres ratones
C57BL/6 mutante que eran homocigos para una deleción diana de
STAT1, un transactivador que era necesario para la señalización de
IFN (Durbin y col., 1996, Cell 84:443-450; Merez y
col., 1996, Cell 84:431-442). De tres a cuatro
ratones BALB/c y C57BL/6 de tipo salvaje fueron inoculados también
con el virus de1NS1. Los ratones STAT1 infectados parecían enfermos
al día 3 después de la infección. El día 7 después de la infección,
los tres ratones STAT1 infectados murieron (Cuadro 3). Se recuperó
el virus de1NS1 de los pulmones de los ratones moribundos STAT1, lo
que indicaba que el virus se estaba replicando en estos animales.
Sin embargo, todos los ratones infectados de tipo salvaje
sobrevivieron a la infección con de1NS1 sin desarrollar síntomas de
enfermedad (Cuadro 3).
\vskip1.000000\baselineskip
CUADRO
3
Supervivencia de los ratones
después de la infección con virus
de1NS11
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de investigar si la preinoculación
con el virus de1NS1 tiene un efecto inhibitorio sobre la infección
o replicación del virus influenza de tipo salvaje, se realizó el
siguiente experimento.
En este estudio se inocularon huevos embrionados
de pollo de 10 días con 20.000 pfu del virus de1NS1 o con PBS
dentro de la cavidad alantoica. Después de 8 horas de incubación a
37ºC, se reinfectaron los huevos con 103 pfu de H1N1 influenza
A/WSN/33 (WSN); virus H1N1 influenza A/PR/8 (PR8), virus H3N2
influenza A/X-31 (X-31); virus
influenza B/Lee/40 (B-Lee) o virus Sendai y se
incubaron durante 40 horas más a 37ºC, excepto para las células
infectadas con B-Lee que fueron incubadas a 35ºC.
Como se muestra en la Figura 6, los huevos tratados con el virus
de1NS1 resultaron en niveles indetectables de infección viral, en
comparación con las células no-tratadas,
demostrando así la actividad antiviral del virus de1NS1 y su
potencial como producto profiláctico y terapéutico antiviral.
<110> Escuela de Medicina Monte Sinaí de
la ciudad universitaria de Nueva York
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Virus atenuados
interferón-inducidos obtenidos por ingeniería
genética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> M 4404EU
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> EP 99927440.0
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
1999-06-11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/089.103
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1998-06-12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgaagctt gacacagtgt ttg
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgacatactgc tgaggatgtc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggcctctaga taatacgact cactataagc aaaagcaggg tgacaaaag
\hfill48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatcgccttc tattagtaga aacaagggtg tttttattaa ataagctg
\hfill48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> Proteína
\vskip0.400000\baselineskip
<213> tipo Poliovirus (VP1)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Ala Ser Thr Thr Asn Lys Asp Lys
Leu}
Claims (22)
1. Un virus influenza A atenuado genéticamente
elaborado, caracterizado porque dicho virus comprende un
genoma viral en el que está suprimido el segmento completo del gen
NS1 (de1NS1).
2. El virus atenuado según la Reivindicación 1,
que codifica además una secuencia heteróloga.
3. El virus atenuado según la Reivindicación 2
en el que la secuencia heteróloga codifica un péptido viral
antigénico.
4. El virus atenuado según la Reivindicación 2
en el que la secuencia heteróloga codifica un péptido antigénico
tumoral.
5. El virus atenuado según la Reivindicación 2,
caracterizado porque la secuencia heteróloga procede de una
bacteria, virus o parásito.
6. Una composición inmunogénica que comprende un
virus influenza A (de1NS1) según la Reivindicación 1, y un
excipiente adecuado farmacéuticamente aceptable.
7. La composición inmunogénica según la
Reivindicación 6, que se formula para suministro intranasal.
8. Una formulación de vacuna que comprende un
virus influenza A atenuado genéticamente elaborado que contiene una
deleción completa en su segmento del gen NS1 y un excipiente
farmacéuticamente aceptable.
9. La formulación de vacuna según la
Reivindicación 8 que se formula para suministro intranasal.
10. La formulación de vacuna según la
Reivindicación 8, caracterizada porque el virus influenza A
atenuado genéticamente elaborado es un virus quimérico que expresa
una secuencia heteróloga.
11. La formulación de vacuna según la
Reivindicación 10, caracterizada porque la secuencia
heteróloga codifica un antígeno viral.
12. La formulación de vacuna según la
Reivindicación 11, caracterizada porque el antígeno viral es
el virus de inmunodeficiencia humana gp120, el antígeno superficial
del virus de la hepatitis B, una glicoproteína del virus del herpes
o el VP1 de polivirus.
13. La formulación de vacuna según la
Reivindicación 10, caracterizada porque la secuencia
heteróloga codifica un antígeno tumoral.
14. La formulación de vacuna según la
Reivindicación 10, caracterizada porque la secuencia
heteróloga deriva de una bacteria, virus o parásito.
15. La formulación de vacuna según la
Reivindicación 10, caracterizada porque la secuencia
heteróloga codifica un gen de inmunoglobulina o una parte del
mismo.
16. La formulación de vacuna según la
Reivindicación 10, caracterizada porque la secuencia
heteróloga es el epítopo de la malaria (ME 1) de Plasmodium
yoelii.
17. La formulación de vacuna según la
Reivindicación 10 que se formula como vacuna intranasal.
18. El uso de la formulación inmunogénica según
la Reivindicación 6 ó 7 para la fabricación de un medicamento para
inducir una respuesta inmune en un sujeto.
19. El uso de la formulación de vacuna según la
Reivindicación 8, 9, 10 ó 17 para la fabricación de un medicamento
para vacunar a un sujeto.
20. El uso según la Reivindicación 18 ó 19,
caracterizado porque el sujeto es un animal.
21. El uso según la Reivindicación 18 ó 19,
caracterizado porque el sujeto es un ser humano.
22. El uso según la Reivindicación 19,
caracterizado porque el medicamento fabricado es adecuado
para administración intranasal, oral, intradérmica, intramuscular,
intraperitoneal o subcutánea.
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