JP2002517230A - インターフェロン誘導性の遺伝子工学的に作製された弱毒ウイルス - Google Patents
インターフェロン誘導性の遺伝子工学的に作製された弱毒ウイルスInfo
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、遺伝子工学的に作製された弱毒ウイルスおよびその作製方法に関する。特に、本発明は、改変型NS遺伝子セグメントを含む生存能のある弱毒ウイルスを遺伝子工学的に作製することに関する。組換えDNA技術を用いると、ウイルスゲノムの１以上の非コード領域に、１以上のウイルス遺伝子のダウンレギュレーションをもたらす部位特異的突然変異を導入することができる。また、組換えDNA技術を用いると、ウイルスゲノムのコード領域に、１以上のアミノ酸残基またはエピトープの挿入、欠失または置換を含むがこれらに限らない突然変異を導入して、該遺伝子工学的に作製されたウイルスに改変型またはキメラ型ウイルスタンパク質を発現させることができる。
Description
【０００１】 本出願に記載されている研究は、一部、米国立衛生研究所からの助成による支
援を受けたものであり、政府は本発明における一定の権利をもつことがある。
援を受けたものであり、政府は本発明における一定の権利をもつことがある。
【０００２】 1. 緒言 本発明は、非コード領域またはウイルスの非構造(NS)遺伝子のコード配列を改
変することにより遺伝子工学的に作製された弱毒ウイルスに関する。特に、本発
明はインターフェロンおよびその関連経路を誘導する遺伝子工学的に作製された
生存能のある弱毒インフルエンザウイルスに関する。本発明はさらに、腫瘍特異
的抗原を含む、広範な病原菌および/または抗原に対する弱毒ウイルスおよびウ
イルスベクターの使用に関する。本発明はまた、遺伝子操作されたインフルエン
ザウイルスを同定するための宿主制限に基づく選択系に関する。特に本発明は、
改変型NS遺伝子セグメントを含むインフルエンザウイルスを同定する選択系に関
する。
変することにより遺伝子工学的に作製された弱毒ウイルスに関する。特に、本発
明はインターフェロンおよびその関連経路を誘導する遺伝子工学的に作製された
生存能のある弱毒インフルエンザウイルスに関する。本発明はさらに、腫瘍特異
的抗原を含む、広範な病原菌および/または抗原に対する弱毒ウイルスおよびウ
イルスベクターの使用に関する。本発明はまた、遺伝子操作されたインフルエン
ザウイルスを同定するための宿主制限に基づく選択系に関する。特に本発明は、
改変型NS遺伝子セグメントを含むインフルエンザウイルスを同定する選択系に関
する。
【０００３】 2. 発明の背景 2.1 弱毒ウイルス 不活化ウイルスワクチンは、例えば、熱やホルマリン処理によってウイルス性
病原菌を「殺す」ことにより製造されるため、これを複製することは不可能であ
る。不活化ワクチンは持続的な免疫を与えず、従って保護も制限されるため、不
活化ワクチンの用途は限られていた。ウイルスワクチンを作製する代替法として
、生存能のある弱毒ウイルスワクチンの使用がある。弱毒ウイルスは複製可能で
はあるが病原性はなく、従ってより持続性のある免疫を与えると共に保護力もよ
り大きい。しかしながら、弱毒ウイルスを作製する常法には、その多くが温度感
受性である宿主域突然変異体の偶発的な単離が含まれる。例えば、前記ウイルス
は人為的な宿主によって継代され、免疫性はあるが未だ病原性ではない子ウイル
スが選択されている。
病原菌を「殺す」ことにより製造されるため、これを複製することは不可能であ
る。不活化ワクチンは持続的な免疫を与えず、従って保護も制限されるため、不
活化ワクチンの用途は限られていた。ウイルスワクチンを作製する代替法として
、生存能のある弱毒ウイルスワクチンの使用がある。弱毒ウイルスは複製可能で
はあるが病原性はなく、従ってより持続性のある免疫を与えると共に保護力もよ
り大きい。しかしながら、弱毒ウイルスを作製する常法には、その多くが温度感
受性である宿主域突然変異体の偶発的な単離が含まれる。例えば、前記ウイルス
は人為的な宿主によって継代され、免疫性はあるが未だ病原性ではない子ウイル
スが選択されている。
【０００４】 特異的突然変異は意図的にウイルスゲノムへ遺伝子操作することができるため
、理論上組換えDNA技術および遺伝子工学技術は弱毒ウイルスの作製にとって優
れた方法となる。しかしながら、ウイルスの弱毒化に必要な遺伝子改変は知られ
ておらず、また予測できるものでもない。一般に、ウイルスワクチンを遺伝子工
学的に操作するための組換えDNA技術を利用しようとする試みは、ほとんどの場
合、ワクチニアウイルスやバキュロウイルスのような組換えウイルスベクターで
発現される、免疫応答に関与する病原菌のタンパク質サブユニットのみを含むサ
ブユニットワクチンの作製に関するものであった。さらに最近では、天然または
公知の宿主域突然変異体において発見された弱毒ウイルスを模倣したヘルペスウ
イルス欠失突然変異体やポリオウイルスを作製する試みに組換えDNA技術が利用
されるようになった。ごく最近に至るまで、マイナス鎖RNAウイルスはまったく
部位特異的遺伝子操作になじまず、従ってその遺伝子工学的な操作は不可能であ
った。
、理論上組換えDNA技術および遺伝子工学技術は弱毒ウイルスの作製にとって優
れた方法となる。しかしながら、ウイルスの弱毒化に必要な遺伝子改変は知られ
ておらず、また予測できるものでもない。一般に、ウイルスワクチンを遺伝子工
学的に操作するための組換えDNA技術を利用しようとする試みは、ほとんどの場
合、ワクチニアウイルスやバキュロウイルスのような組換えウイルスベクターで
発現される、免疫応答に関与する病原菌のタンパク質サブユニットのみを含むサ
ブユニットワクチンの作製に関するものであった。さらに最近では、天然または
公知の宿主域突然変異体において発見された弱毒ウイルスを模倣したヘルペスウ
イルス欠失突然変異体やポリオウイルスを作製する試みに組換えDNA技術が利用
されるようになった。ごく最近に至るまで、マイナス鎖RNAウイルスはまったく
部位特異的遺伝子操作になじまず、従ってその遺伝子工学的な操作は不可能であ
った。
【０００５】 2.2 インフルエンザウイルス エンベロープをもち、マイナス極性ゲノムである1本鎖RNAを含むウイルスファ
ミリーは非セグメント(分節)ゲノムをもつグループ(パラミクソウイルス科(Para
myxoviridae)、ラブドウイルス科(Rhabdoviridae))または、セグメントゲノムを
もつグループ(オルトミクソウイルス科(Orthomyxoviridae)、ブニヤウイルス科(
Bunyaviridae)およびアレナウイルス科(Arenaviridae))に分類される。以下詳細
に説明する本発明の実施例に使用されたオルトミクソウイルス科には、A型、B型
およびC型のインフルエンザウイルスのみが含まれる。
ミリーは非セグメント(分節)ゲノムをもつグループ(パラミクソウイルス科(Para
myxoviridae)、ラブドウイルス科(Rhabdoviridae))または、セグメントゲノムを
もつグループ(オルトミクソウイルス科(Orthomyxoviridae)、ブニヤウイルス科(
Bunyaviridae)およびアレナウイルス科(Arenaviridae))に分類される。以下詳細
に説明する本発明の実施例に使用されたオルトミクソウイルス科には、A型、B型
およびC型のインフルエンザウイルスのみが含まれる。
【０００６】 インフルエンザウイルス粒子は1本鎖RNAゲノムを含む内部のリボ核タンパク質
コア(らせん状のヌクレオキャプシド)、およびマトリックスタンパク質(M)によ
って内部が覆われた外側の核タンパク質エンベロープとからなる。インフルエン
ザAのセグメントゲノムは、10個のポリペプチドをコードする線状のマイナス極
性1本鎖RNAの8分子(インフルエンザC型は7分子)からなり、該ポリペプチドには
、RNA依存性RNAポリメラーゼタンパク質(PB2、PB1およびPA)およびヌクレオキャ
プシドを形成する核タンパク質(NP)；マトリックスタンパク質(M1、M2)；リポタ
ンパク質エンベロープから出る2個の表面糖タンパク質；赤血球凝集素(HA)およ
びノイラミニダーゼ(NA)；ならびにその機能が知られていない非構造タンパク質
(NS1およびNS2)が含まれる。ゲノムの転写および複製は、核内で起こり、形質膜
での出芽を通してアセンブリーが生じる。ウイルスは混合感染中に遺伝子を再構
成する(reassort)ことができる。
コア(らせん状のヌクレオキャプシド)、およびマトリックスタンパク質(M)によ
って内部が覆われた外側の核タンパク質エンベロープとからなる。インフルエン
ザAのセグメントゲノムは、10個のポリペプチドをコードする線状のマイナス極
性1本鎖RNAの8分子(インフルエンザC型は7分子)からなり、該ポリペプチドには
、RNA依存性RNAポリメラーゼタンパク質(PB2、PB1およびPA)およびヌクレオキャ
プシドを形成する核タンパク質(NP)；マトリックスタンパク質(M1、M2)；リポタ
ンパク質エンベロープから出る2個の表面糖タンパク質；赤血球凝集素(HA)およ
びノイラミニダーゼ(NA)；ならびにその機能が知られていない非構造タンパク質
(NS1およびNS2)が含まれる。ゲノムの転写および複製は、核内で起こり、形質膜
での出芽を通してアセンブリーが生じる。ウイルスは混合感染中に遺伝子を再構
成する(reassort)ことができる。
【０００７】 インフルエンザウイルスは、HAを介して細胞膜糖タンパク質および糖脂質中の
シアリルオリゴ糖に吸着する。ウイルス粒子のエンドサイトーシスに続いて、膜
融合を助ける細胞エンドソーム内でHA分子のコンホメーション変化が生じて脱外
皮を誘導する。ヌクレオキャプシドが核のほうへ移動すると、そこで感染に必須
の最初の事象としてウイルスmRNAが転写される。ウイルスmRNAは、ユニークなメ
カニズムによって転写される。該メカニズムにおいては、エンドヌクレアーゼが
細胞性異種mRNAから、キャップをもつ5'末端を切断すし、この5'末端がウイルス
転写酵素によってウイルスRNAテンプレートを転写するためのプライマーとして
働く。転写物はそのテンプレートの末端から15〜22塩基の部位で終了するが、そ
こではオリゴ(U)配列がポリ(A)鎖をテンプレート非依存的に付加するシグナルと
して作用する。そうして作製された8個のウイルスmRNA分子のうち6個は、HA、NA
、NPを表すタンパク質ならびにウイルスポリメラーゼタンパク質PB2、PB1および
PAへ直接翻訳されるモノシストロン性メッセージである。他の転写物2個はスプ
ライシングを受け、それぞれ2個のmRNAとなるが、これは異なるリーディングフ
レームで翻訳されてM1、M2、NS1およびNS2を産生する。換言すれば、8個のウイ
ルスmRNAが10個のタンパク質をコードするのであり、8個は構造タンパク質であ
り、2個は非構造タンパク質である。インフルエンザウイルスの遺伝子およびそ
のタンパク質産物を下記表Iにまとめて示す。
シアリルオリゴ糖に吸着する。ウイルス粒子のエンドサイトーシスに続いて、膜
融合を助ける細胞エンドソーム内でHA分子のコンホメーション変化が生じて脱外
皮を誘導する。ヌクレオキャプシドが核のほうへ移動すると、そこで感染に必須
の最初の事象としてウイルスmRNAが転写される。ウイルスmRNAは、ユニークなメ
カニズムによって転写される。該メカニズムにおいては、エンドヌクレアーゼが
細胞性異種mRNAから、キャップをもつ5'末端を切断すし、この5'末端がウイルス
転写酵素によってウイルスRNAテンプレートを転写するためのプライマーとして
働く。転写物はそのテンプレートの末端から15〜22塩基の部位で終了するが、そ
こではオリゴ(U)配列がポリ(A)鎖をテンプレート非依存的に付加するシグナルと
して作用する。そうして作製された8個のウイルスmRNA分子のうち6個は、HA、NA
、NPを表すタンパク質ならびにウイルスポリメラーゼタンパク質PB2、PB1および
PAへ直接翻訳されるモノシストロン性メッセージである。他の転写物2個はスプ
ライシングを受け、それぞれ2個のmRNAとなるが、これは異なるリーディングフ
レームで翻訳されてM1、M2、NS1およびNS2を産生する。換言すれば、8個のウイ
ルスmRNAが10個のタンパク質をコードするのであり、8個は構造タンパク質であ
り、2個は非構造タンパク質である。インフルエンザウイルスの遺伝子およびそ
のタンパク質産物を下記表Iにまとめて示す。
【０００８】
【０００９】 インフルエンザA型のゲノムはマイナス極性をもつ1本鎖RNAのセグメント8個をも
っており、これらは9個の構造タンパク質および1個の非構造タンパク質をコード
する。非構造タンパク質NS1はインフルエンザウイルスに感染した細胞に豊富に
見られるが、ウイルス粒子では検出されていない。NS1は感染初期の核およびウ
イルスサイクル後期の細胞原形質にも見出されるリンタンパク質である(King et
al., 1975, Virology 64: 378)。NS遺伝子に損傷をもつ温度感受性(ts)インフ
ルエンザ突然変異体の研究によれば、NS1タンパク質は、ウイルスが宿主細胞の
遺伝子発現を阻害でき、かつウイルスタンパク質合成を促進できるメカニズムの
転写レギュレーターであり転写後レギュレーターでもあることが示唆される。転
写後プロセシングを制御するその他多くのタンパク質と同じように、NS1タンパ
ク質は特定のRNA配列および構造と相互作用する。NS1タンパク質は、vRNA、ポリ
A、U6 SNRNA、ウイルスmRNAおよびds RNAについて5'未翻訳領域を含む、異なるR
NA種に結合することが報告されている(Qiu et al., 1995, Rna 1: 304; Qiu et
al., 1994, J. Virol. 68: 2425)。感染細胞におけるcDNAからのNS1タンパク質
発現は、いくつかの効果、すなわち、mRNAの核-細胞質輸送の阻害、mRNAスプラ
イシング前の阻害、宿主mRNAポリアデニル化の阻害およびウイルスmRNAの翻訳促
進と関連している(Fortes, et al., 1994, Embo J. 13: 704, Enami, K. et al.
, 1994, J. Virol. 68: 1432; de la Luna, et al., 1995, J. Virol. 69: 2427
; Lu, Y. et al., 1994, Genes Dev. 8: 1817; Park, et al., 1995, J. Biol.
Chem. 270, 28433)。
っており、これらは9個の構造タンパク質および1個の非構造タンパク質をコード
する。非構造タンパク質NS1はインフルエンザウイルスに感染した細胞に豊富に
見られるが、ウイルス粒子では検出されていない。NS1は感染初期の核およびウ
イルスサイクル後期の細胞原形質にも見出されるリンタンパク質である(King et
al., 1975, Virology 64: 378)。NS遺伝子に損傷をもつ温度感受性(ts)インフ
ルエンザ突然変異体の研究によれば、NS1タンパク質は、ウイルスが宿主細胞の
遺伝子発現を阻害でき、かつウイルスタンパク質合成を促進できるメカニズムの
転写レギュレーターであり転写後レギュレーターでもあることが示唆される。転
写後プロセシングを制御するその他多くのタンパク質と同じように、NS1タンパ
ク質は特定のRNA配列および構造と相互作用する。NS1タンパク質は、vRNA、ポリ
A、U6 SNRNA、ウイルスmRNAおよびds RNAについて5'未翻訳領域を含む、異なるR
NA種に結合することが報告されている(Qiu et al., 1995, Rna 1: 304; Qiu et
al., 1994, J. Virol. 68: 2425)。感染細胞におけるcDNAからのNS1タンパク質
発現は、いくつかの効果、すなわち、mRNAの核-細胞質輸送の阻害、mRNAスプラ
イシング前の阻害、宿主mRNAポリアデニル化の阻害およびウイルスmRNAの翻訳促
進と関連している(Fortes, et al., 1994, Embo J. 13: 704, Enami, K. et al.
, 1994, J. Virol. 68: 1432; de la Luna, et al., 1995, J. Virol. 69: 2427
; Lu, Y. et al., 1994, Genes Dev. 8: 1817; Park, et al., 1995, J. Biol.
Chem. 270, 28433)。
【００１０】 3. 発明の概要 本発明は、インターフェロンおよび関連する応答を誘導する、遺伝子工学的に
作製された生存能のある弱毒ウイルスに関する。好ましい態様によれば、本発明
は、改変型NS遺伝子セグメントを含む、遺伝子工学的に作製された生存能のある
弱毒ウイルスに関する。本発明はまた、弱毒表現型およびインターフェロン誘導
性表現型をもつよう遺伝子工学的に作製されたセグメントおよび非セグメントウ
イルスの両方に関する。上記の表現型は、細胞のインターフェロン応答を妨害す
るウイルス遺伝子産物を標的とすることにより達成される。本発明の弱毒ウイル
スは、ウイルス遺伝子の転写および/または複製を制御するNS遺伝子セグメント
の非コード領域をダウンレギュレートするように改変することによって、遺伝子
工学的に作製することができる。非セグメントウイルスの場合、ウイルス遺伝子
のダウンレギュレーションによって、複製中に作製された感染ウイルス粒子の数
を減少させることができ、その結果ウイルスは弱毒化された特性を示す。第2の
方法はNSコード領域の遺伝子工学的改変を含むため、発現されたウイルスタンパ
ク質はアミノ酸残基またはエピトープの挿入、欠失または置換によって改変され
、弱毒キメラウイルスが産生する。この方法は、多くの異なるウイルスに適用す
ることができ、マイナス鎖RNAウイルスの遺伝子工学的作製に有利に用いられる
。その際NS遺伝子産物は、インターフェロンが媒介するウイルスタンパク質の翻
訳阻害を制御する役割を果たす。
作製された生存能のある弱毒ウイルスに関する。好ましい態様によれば、本発明
は、改変型NS遺伝子セグメントを含む、遺伝子工学的に作製された生存能のある
弱毒ウイルスに関する。本発明はまた、弱毒表現型およびインターフェロン誘導
性表現型をもつよう遺伝子工学的に作製されたセグメントおよび非セグメントウ
イルスの両方に関する。上記の表現型は、細胞のインターフェロン応答を妨害す
るウイルス遺伝子産物を標的とすることにより達成される。本発明の弱毒ウイル
スは、ウイルス遺伝子の転写および/または複製を制御するNS遺伝子セグメント
の非コード領域をダウンレギュレートするように改変することによって、遺伝子
工学的に作製することができる。非セグメントウイルスの場合、ウイルス遺伝子
のダウンレギュレーションによって、複製中に作製された感染ウイルス粒子の数
を減少させることができ、その結果ウイルスは弱毒化された特性を示す。第2の
方法はNSコード領域の遺伝子工学的改変を含むため、発現されたウイルスタンパ
ク質はアミノ酸残基またはエピトープの挿入、欠失または置換によって改変され
、弱毒キメラウイルスが産生する。この方法は、多くの異なるウイルスに適用す
ることができ、マイナス鎖RNAウイルスの遺伝子工学的作製に有利に用いられる
。その際NS遺伝子産物は、インターフェロンが媒介するウイルスタンパク質の翻
訳阻害を制御する役割を果たす。
【００１１】 本発明はさらに、ウイルス感染を阻害するワクチンおよび方法に関する。本発
明の弱毒ウイルスはウイルス感染から保護するために使用することもできる。本
明細書の実施例に提示の証拠に示すとおり、本発明の弱毒ウイルスは、野生型ウ
イルスに感染する前に投与すると抗ウイルス活性を示し、従って本発明の弱毒ウ
イルスには予防的な効用がある。
明の弱毒ウイルスはウイルス感染から保護するために使用することもできる。本
明細書の実施例に提示の証拠に示すとおり、本発明の弱毒ウイルスは、野生型ウ
イルスに感染する前に投与すると抗ウイルス活性を示し、従って本発明の弱毒ウ
イルスには予防的な効用がある。
【００１２】 本発明はまた、遺伝子操作されたインフルエンザウイルスを同定するための宿
主制限に基づく選択系に関する。本発明の選択系は、より具体的には、改変され
たNS遺伝子セグメントを含む遺伝子操作されたインフルエンザウイルスの同定に
関する。
主制限に基づく選択系に関する。本発明の選択系は、より具体的には、改変され
たNS遺伝子セグメントを含む遺伝子操作されたインフルエンザウイルスの同定に
関する。
【００１３】 本発明の一部は、出願人の驚くべき発見に基づくものである。その発見とは、
NS1遺伝子を欠失した遺伝子工学的に作製されたインフルエンザA型ウイルスが2
型IFNを産生しない細胞系では増殖できるが、インフルエンザウイルスに対する2
つの常用基質である、マディン-ダービー(Mardin-Darby)イヌ腎臓(MDCK)細胞お
よび孵化鶏卵の尿膜では検知不可能であるというものである。出願人はまた、ヒ
ト細胞が、野生型ウイルスではなく、NS1遺伝子を欠失する遺伝子工学的に作製
されたインフルエンザA型ウイルスに感染すると、IFN誘導性プロモーターの制御
下で高レベルの遺伝子発現が誘導されることも見出した。以上の結果は、従来NS
1欠失表現型のウイルスをスクリーニングすることが不可能であった、NS1突然変
異を含むインフルエンザウイルスの効率的な選択系を初めて可能にするものであ
る。
NS1遺伝子を欠失した遺伝子工学的に作製されたインフルエンザA型ウイルスが2
型IFNを産生しない細胞系では増殖できるが、インフルエンザウイルスに対する2
つの常用基質である、マディン-ダービー(Mardin-Darby)イヌ腎臓(MDCK)細胞お
よび孵化鶏卵の尿膜では検知不可能であるというものである。出願人はまた、ヒ
ト細胞が、野生型ウイルスではなく、NS1遺伝子を欠失する遺伝子工学的に作製
されたインフルエンザA型ウイルスに感染すると、IFN誘導性プロモーターの制御
下で高レベルの遺伝子発現が誘導されることも見出した。以上の結果は、従来NS
1欠失表現型のウイルスをスクリーニングすることが不可能であった、NS1突然変
異を含むインフルエンザウイルスの効率的な選択系を初めて可能にするものであ
る。
【００１４】 本発明の弱毒ウイルスは、生存能のあるウイルスワクチン製剤化において安全
に有利に使用することができる。本明細書において用いられる場合、「弱毒」ウ
イルスなる語は感染性ではあるが病原性ではないウイルス、あるいは、病原性で
あってもなくてもよいが各複製ラウンド中に欠陥粒子を産生するかまたは複製中
に対応する野生型ウイルスよりも少ない子ウイルス粒子を産生する感染性ウイル
スをいう。欠陥粒子または減少数の子ウイルス粒子を産生するよう遺伝子操作さ
れている病原性ウイルスは、そのウイルスがたとえ病気を引き起こすことができ
ても、ワクチン接種個体で得られるウイルス力価が無症状レベルの感染しか示さ
ないいう意味において、「弱毒」性である。
に有利に使用することができる。本明細書において用いられる場合、「弱毒」ウ
イルスなる語は感染性ではあるが病原性ではないウイルス、あるいは、病原性で
あってもなくてもよいが各複製ラウンド中に欠陥粒子を産生するかまたは複製中
に対応する野生型ウイルスよりも少ない子ウイルス粒子を産生する感染性ウイル
スをいう。欠陥粒子または減少数の子ウイルス粒子を産生するよう遺伝子操作さ
れている病原性ウイルスは、そのウイルスがたとえ病気を引き起こすことができ
ても、ワクチン接種個体で得られるウイルス力価が無症状レベルの感染しか示さ
ないいう意味において、「弱毒」性である。
【００１５】4. 図面の簡単な説明 （下記参照）。
【００１６】 5. 発明の説明 本発明は、遺伝子工学によって作成された弱毒ウイルスおよびその製造方法に
関する。より詳細には、本発明は、改変型NS遺伝子セグメントを有する弱毒生ウ
イルスの作成に関わる。組換えDNA技法を用いて、ウイルスゲノムの１または２
以上の非コード領域内に部位特異的突然変異を起すことが可能で、その結果、１
または２以上のウイルス遺伝子のダウンレギュレーションを生じる。あるいはま
た、組換えDNA技術を用いて以下のような突然変異を起すことができる。すなわ
ち、この突然変異は、ウイルスゲノムのコード領域へのアミノ酸残基またはエピ
トープの挿入、欠失、または置換を含むが、それらに限定されない。結果として
、作成されたウイルスは改変型またはキメラ型ウイルスタンパク質を発現する。
関する。より詳細には、本発明は、改変型NS遺伝子セグメントを有する弱毒生ウ
イルスの作成に関わる。組換えDNA技法を用いて、ウイルスゲノムの１または２
以上の非コード領域内に部位特異的突然変異を起すことが可能で、その結果、１
または２以上のウイルス遺伝子のダウンレギュレーションを生じる。あるいはま
た、組換えDNA技術を用いて以下のような突然変異を起すことができる。すなわ
ち、この突然変異は、ウイルスゲノムのコード領域へのアミノ酸残基またはエピ
トープの挿入、欠失、または置換を含むが、それらに限定されない。結果として
、作成されたウイルスは改変型またはキメラ型ウイルスタンパク質を発現する。
【００１７】 さらに、本発明は、改変型NS遺伝子セグメントを有するインフルエンザウイル
スを同定するための新規選択法に関する。本発明の選択方法は、1つには、野生
型インフルエンザウイルスの宿主制限、およびNS遺伝子セグメントに改変を有す
るインフルエンザウイルスがINF欠損細胞に感染し増殖する能力を有することに
基づく。
スを同定するための新規選択法に関する。本発明の選択方法は、1つには、野生
型インフルエンザウイルスの宿主制限、およびNS遺伝子セグメントに改変を有す
るインフルエンザウイルスがINF欠損細胞に感染し増殖する能力を有することに
基づく。
【００１８】 本発明はまた、1つには、NS1遺伝子セグメントに欠失を有する遺伝子工学的に
作成されたA型インフルエンザウイルスは、INFを生産できない細胞系においては
増殖可能であるが、インフルエンザウイルスの二つの従来から一般的な宿主であ
るMadin-Darbyイヌ腎臓（MDCK）細胞および孵化鶏卵の尿膜においては検出でき
ないという、本発明者らによる驚くべき発見に基づく。さらにNS1の欠失を含む
遺伝子工学的に作成されたインフルエンザウイルスが、ヒト細胞においてIFN応
答を誘発することが、本発明者らにより明らかになった。また、本発明者らは、
NS1の欠失を含む遺伝子工学的に作成されたインフルエンザウイルスが、野生型
マウスでは病原性を示さないが、INFのシグナル伝達が不十分な動物においては
、複製して疾病を引き起こす能力を有することを見出した。
作成されたA型インフルエンザウイルスは、INFを生産できない細胞系においては
増殖可能であるが、インフルエンザウイルスの二つの従来から一般的な宿主であ
るMadin-Darbyイヌ腎臓（MDCK）細胞および孵化鶏卵の尿膜においては検出でき
ないという、本発明者らによる驚くべき発見に基づく。さらにNS1の欠失を含む
遺伝子工学的に作成されたインフルエンザウイルスが、ヒト細胞においてIFN応
答を誘発することが、本発明者らにより明らかになった。また、本発明者らは、
NS1の欠失を含む遺伝子工学的に作成されたインフルエンザウイルスが、野生型
マウスでは病原性を示さないが、INFのシグナル伝達が不十分な動物においては
、複製して疾病を引き起こす能力を有することを見出した。
【００１９】 さらに本発明は、広範なウイルスおよび／または抗原（腫瘍特異抗原を含む）
に対するワクチンとして、本発明の弱毒ウイルスを使用することに関する。免疫
応答を受けるヒトまたは動物に弱毒生ウイルス製剤を導入するために、多数の方
法を用いることができる。この方法は、経口、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮
下、および鼻腔内の経路を包含するが、それらに限定されない。望ましい実施形
態において、本発明の弱毒ウイルスは鼻腔内ワクチンとして送達されるように製
剤化される。
に対するワクチンとして、本発明の弱毒ウイルスを使用することに関する。免疫
応答を受けるヒトまたは動物に弱毒生ウイルス製剤を導入するために、多数の方
法を用いることができる。この方法は、経口、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮
下、および鼻腔内の経路を包含するが、それらに限定されない。望ましい実施形
態において、本発明の弱毒ウイルスは鼻腔内ワクチンとして送達されるように製
剤化される。
【００２０】 5.1. インターフェロン応答を誘導する弱毒ウイルス 本発明は、遺伝子工学によって作成された、特定の遺伝子に改変、突然変異、
置換、または欠失を有する(-)鎖RNAウイルスに関するが、ここにおいて、上記の
遺伝子産物は細胞のインターフェロン応答をウイルスが回避する原因となる。し
たがって、本発明は、セグメントに分かれている、あるいは分かれていないに関
わらず、細胞のINF応答のダウンレギュレーションを引き起こす遺伝子に突然変
異を有する、遺伝子工学によって作成されたRNAウイルスに関する。遺伝子工学
によって作成された本発明の弱毒ウイルスは、野生型ウイルスが細胞のインター
フェロンによる応答を阻害するのに対して、インターフェロンを誘発する表現型
を示す。
置換、または欠失を有する(-)鎖RNAウイルスに関するが、ここにおいて、上記の
遺伝子産物は細胞のインターフェロン応答をウイルスが回避する原因となる。し
たがって、本発明は、セグメントに分かれている、あるいは分かれていないに関
わらず、細胞のINF応答のダウンレギュレーションを引き起こす遺伝子に突然変
異を有する、遺伝子工学によって作成されたRNAウイルスに関する。遺伝子工学
によって作成された本発明の弱毒ウイルスは、野生型ウイルスが細胞のインター
フェロンによる応答を阻害するのに対して、インターフェロンを誘発する表現型
を示す。
【００２１】 望ましい態様において、本発明は、改変型NS遺伝子セグメントを有する弱毒イ
ンフルエンザウイルス、およびこのような改変型インフルエンザウイルスを同定
する方法に関する。また、本発明は、1つには、NS1改変型ウイルスがベロ細胞の
ようなINF欠損細胞では増殖可能であるが、その複製能力はMDCK細胞および孵化
鶏卵では甚だしく損なわれたという発見に基づくものである。このような増殖欠
損の原因がNS遺伝子以外のRNAセグメントにおける変化にあるという可能性も考
えられる。こうした可能性を除外するために、delNS1ウイルスの中に、遺伝子工
学的に作成した野生型NS遺伝子をレスキューすることによってウイルスを「修復
」した。こうして得られたトランスフェクタントウイルスはMDCK細胞および卵に
おいて、野生型並に増殖したので、このことから、NS1遺伝子の欠失がdelNS1ウ
イルスの表現形質を決定することが明らかになった。
ンフルエンザウイルス、およびこのような改変型インフルエンザウイルスを同定
する方法に関する。また、本発明は、1つには、NS1改変型ウイルスがベロ細胞の
ようなINF欠損細胞では増殖可能であるが、その複製能力はMDCK細胞および孵化
鶏卵では甚だしく損なわれたという発見に基づくものである。このような増殖欠
損の原因がNS遺伝子以外のRNAセグメントにおける変化にあるという可能性も考
えられる。こうした可能性を除外するために、delNS1ウイルスの中に、遺伝子工
学的に作成した野生型NS遺伝子をレスキューすることによってウイルスを「修復
」した。こうして得られたトランスフェクタントウイルスはMDCK細胞および卵に
おいて、野生型並に増殖したので、このことから、NS1遺伝子の欠失がdelNS1ウ
イルスの表現形質を決定することが明らかになった。
【００２２】 NS改変型ウイルスは、INF発現が欠損したベロ細胞においては複製能を有する
ので、このことから組織培養や卵でNS改変型ウイルスの増殖が変化した原因がIN
Fが媒介する作用であることは明らかである。以下の証拠がINFが媒介する作用の
役割を支持する：(a)ウイルスタンパク質の発現レベルが、delNS1ウイルスに感
染したベロ細胞およびINFαR-/-細胞では同様であるが、MDSK細胞では著しく減
少する。INFαR-/-細胞およびベロ細胞はいずれも抗ウイルス性のINF応答の誘導
が欠損していること、ただしこうした欠損の原因となる遺伝子の欠失は上記二つ
の細胞系で異なることを念頭に置く必要がある。(b)野生型ウイルスではなくてN
S改変ウイルスによる感染が、293細胞においてINF刺激レポーター遺伝子のトラ
ンス活性化を誘導した。(c)最後に、delNS1ウイルスはINFシグナル伝達を欠損し
たマウス、すなわちSTAT1-/-動物において複製し疾病を引き起こすことができた
が、野生型マウスにおいては病原性を示さなかった。
ので、このことから組織培養や卵でNS改変型ウイルスの増殖が変化した原因がIN
Fが媒介する作用であることは明らかである。以下の証拠がINFが媒介する作用の
役割を支持する：(a)ウイルスタンパク質の発現レベルが、delNS1ウイルスに感
染したベロ細胞およびINFαR-/-細胞では同様であるが、MDSK細胞では著しく減
少する。INFαR-/-細胞およびベロ細胞はいずれも抗ウイルス性のINF応答の誘導
が欠損していること、ただしこうした欠損の原因となる遺伝子の欠失は上記二つ
の細胞系で異なることを念頭に置く必要がある。(b)野生型ウイルスではなくてN
S改変ウイルスによる感染が、293細胞においてINF刺激レポーター遺伝子のトラ
ンス活性化を誘導した。(c)最後に、delNS1ウイルスはINFシグナル伝達を欠損し
たマウス、すなわちSTAT1-/-動物において複製し疾病を引き起こすことができた
が、野生型マウスにおいては病原性を示さなかった。
【００２３】 Ｉ型INFの重要性は、多くのウイルスが宿主によるINF応答をうち消すアンタゴ
ニストを発現するという事実によって明示される。例としては、アデノウイルス
のVA RNA、エプスタイン−バールウイルスがコードする構造低分子RNA、ワクシ
ニアウイルスのK3LおよびB3L遺伝子産物、グループCロタウイルスのNSP3遺伝子
産物、およびレオウイルスσ３タンパク質などがある。これらのウイルス産物の
うちのいくつかが、A型インフルエンザウイルスのNS1タンパク質と同様に、二本
鎖RNAに結合してPKR（二本鎖RNA依存性プロテインキナーゼ）の活性化を妨げる
ことができることは興味深い。したがって、大半のウイルスがこれを回避するた
めに複雑なメカニズムを発達させてきた反応である、INF媒介性応答を増強する
ことによって、いずれかの抗ウイルス治療を補うために、本発明の弱毒ウイルス
を利用することができる。
ニストを発現するという事実によって明示される。例としては、アデノウイルス
のVA RNA、エプスタイン−バールウイルスがコードする構造低分子RNA、ワクシ
ニアウイルスのK3LおよびB3L遺伝子産物、グループCロタウイルスのNSP3遺伝子
産物、およびレオウイルスσ３タンパク質などがある。これらのウイルス産物の
うちのいくつかが、A型インフルエンザウイルスのNS1タンパク質と同様に、二本
鎖RNAに結合してPKR（二本鎖RNA依存性プロテインキナーゼ）の活性化を妨げる
ことができることは興味深い。したがって、大半のウイルスがこれを回避するた
めに複雑なメカニズムを発達させてきた反応である、INF媒介性応答を増強する
ことによって、いずれかの抗ウイルス治療を補うために、本発明の弱毒ウイルス
を利用することができる。
【００２４】 本発明の弱毒インフルエンザウイルスを用いて、ウイルス抗原および腫瘍抗原
を包む異種配列を発現させることができる。したがって、さまざまな抗原エピト
ープ（すなわち、さまざまな病原体のいずれかに対する防御的免疫応答を誘導す
るエピトープ） を発現させるために、この弱毒ウイルスを利用することができ
、または中和抗体に結合する抗原を、キメラ型ウイルスによって、あるいはその
一部として発現させることができる。本発明の弱毒ウイルスは、それがINF媒介
性応答を誘導し宿主に対して病原性を示さないとすると、抗原エピトープを導入
するためのすぐれた担体である。
を包む異種配列を発現させることができる。したがって、さまざまな抗原エピト
ープ（すなわち、さまざまな病原体のいずれかに対する防御的免疫応答を誘導す
るエピトープ） を発現させるために、この弱毒ウイルスを利用することができ
、または中和抗体に結合する抗原を、キメラ型ウイルスによって、あるいはその
一部として発現させることができる。本発明の弱毒ウイルスは、それがINF媒介
性応答を誘導し宿主に対して病原性を示さないとすると、抗原エピトープを導入
するためのすぐれた担体である。
【００２５】 本発明に従って、A型インフルエンザウイルスのNS遺伝子の遺伝子操作を、新
規抗原および／またはポリペプチドを発現するウイルスワクチンベクターの生産
の助力とし得る。NS RNAセグメントは８つのウイルスRNAの中でもっとも短いの
で、NS RNAは他のウイルスRNAよりも長い異種配列の挿入に耐えられる。さらに
、NS RNAセグメントは感染した細胞内で高レベルのタンパク質合成を指令するが
、このことはそのセグメントが異種抗原の挿入のために理想的なセグメントであ
ることを示唆する。しかしながら、本発明に従って、インフルエンザの８つのセ
グメントは、いずれも異種配列の挿入のために使用することができる。
規抗原および／またはポリペプチドを発現するウイルスワクチンベクターの生産
の助力とし得る。NS RNAセグメントは８つのウイルスRNAの中でもっとも短いの
で、NS RNAは他のウイルスRNAよりも長い異種配列の挿入に耐えられる。さらに
、NS RNAセグメントは感染した細胞内で高レベルのタンパク質合成を指令するが
、このことはそのセグメントが異種抗原の挿入のために理想的なセグメントであ
ることを示唆する。しかしながら、本発明に従って、インフルエンザの８つのセ
グメントは、いずれも異種配列の挿入のために使用することができる。
【００２６】 当業者に公知の方法を用いて、たとえば3'-インフルエンザウイルス末端の相
補的配列、または3'-および5'-インフルエンザウイルス末端の両方に相補的な配
列等、ウイルスのポリメラーゼ結合部位／プロモーターの相補的配列に隣接する
異種遺伝子コード配列を構築することができる。バクテリオファージT7, T3また
はSp6ポリメラーゼ等のようなDNA依存性RNAポリメラーゼによって、上記のよう
なハイブリッド配列を含有する組換えDNA分子をクローニングし、転写すること
ができ、それによって、ウイルスポリメラーゼの識別および活性を可能にする適
当なウイルス配列を有する組換えRNA鋳型を作成することができる。
補的配列、または3'-および5'-インフルエンザウイルス末端の両方に相補的な配
列等、ウイルスのポリメラーゼ結合部位／プロモーターの相補的配列に隣接する
異種遺伝子コード配列を構築することができる。バクテリオファージT7, T3また
はSp6ポリメラーゼ等のようなDNA依存性RNAポリメラーゼによって、上記のよう
なハイブリッド配列を含有する組換えDNA分子をクローニングし、転写すること
ができ、それによって、ウイルスポリメラーゼの識別および活性を可能にする適
当なウイルス配列を有する組換えRNA鋳型を作成することができる。
【００２７】 上記のようなハイブリッド分子を構築するための方法の一つは、インフルエン
ザウイルスゲノムセグメントの相補的DNAへの異種コード配列の挿入であり、そ
れによって異種配列はウイルスポリメラーゼ活性のために必要とされるウイルス
配列、すなわちウイルスポリメラーゼ結合部位／プロモーター（以下の文ではウ
イルスポリメラーゼ結合部位と称する）、に隣接する。また別の方法では、ウイ
ルスポリメラーゼ結合部位をコードするオリゴヌクレオチド、たとえばウイルス
ゲノムセグメントの3'-または両末端の相補的配列を異種コード配列に結合して
、ハイブリッド分子を構築することができる。異種遺伝子または異種遺伝子セグ
メントの標的配列内での配置は、その標的配列内の適当な制限酵素切断部位の存
在によって予め指定された。しかしながら、分子生物学の最近の進歩によって、
こうした問題は大幅に軽減されるようになった。部位特異的突然変異誘発を用い
ることによって、制限酵素切断部位は容易にどこにでも配置することができる（
たとえば、Kunkel, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.82 ; 488 によって記
載された方法を参照のこと）。以下に記載のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法の変
法によって、配列（すなわち制限酵素切断部位）の特異的な挿入が可能となり、
ハイブリッド分子を容易に構築することができる。また、クローニングの必要な
しに組換え鋳型を調製するために、PCR反応を利用することができると考えられ
る。たとえば、DNA依存性RNAポリメラーゼプロモーター（たとえば、バクテリオ
ファージT3, T7またはSp6）を含有する二本鎖DNA分子、および異種遺伝子および
インフルエンザウイルスポリメラーゼ結合部位を含有するハイブリッド配列を調
製するために、PCR反応を利用することができると考えられる。さらに、RNA鋳型
をこうした組換えDNAから直接転写することができる。さらに別の実施形態にお
いて、組換えRNA鋳型は、異種遺伝子およびウイルスポリメラーゼ結合部位の負
の極性を条件として指定して、RNAリガーゼを用いてRNAを結合することによって
調製することができる。ウイルスポリメラーゼ活性のために必要な配列の要件、
および本発明に従って使用される構築物を以下の分節で説明する。
ザウイルスゲノムセグメントの相補的DNAへの異種コード配列の挿入であり、そ
れによって異種配列はウイルスポリメラーゼ活性のために必要とされるウイルス
配列、すなわちウイルスポリメラーゼ結合部位／プロモーター（以下の文ではウ
イルスポリメラーゼ結合部位と称する）、に隣接する。また別の方法では、ウイ
ルスポリメラーゼ結合部位をコードするオリゴヌクレオチド、たとえばウイルス
ゲノムセグメントの3'-または両末端の相補的配列を異種コード配列に結合して
、ハイブリッド分子を構築することができる。異種遺伝子または異種遺伝子セグ
メントの標的配列内での配置は、その標的配列内の適当な制限酵素切断部位の存
在によって予め指定された。しかしながら、分子生物学の最近の進歩によって、
こうした問題は大幅に軽減されるようになった。部位特異的突然変異誘発を用い
ることによって、制限酵素切断部位は容易にどこにでも配置することができる（
たとえば、Kunkel, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.82 ; 488 によって記
載された方法を参照のこと）。以下に記載のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法の変
法によって、配列（すなわち制限酵素切断部位）の特異的な挿入が可能となり、
ハイブリッド分子を容易に構築することができる。また、クローニングの必要な
しに組換え鋳型を調製するために、PCR反応を利用することができると考えられ
る。たとえば、DNA依存性RNAポリメラーゼプロモーター（たとえば、バクテリオ
ファージT3, T7またはSp6）を含有する二本鎖DNA分子、および異種遺伝子および
インフルエンザウイルスポリメラーゼ結合部位を含有するハイブリッド配列を調
製するために、PCR反応を利用することができると考えられる。さらに、RNA鋳型
をこうした組換えDNAから直接転写することができる。さらに別の実施形態にお
いて、組換えRNA鋳型は、異種遺伝子およびウイルスポリメラーゼ結合部位の負
の極性を条件として指定して、RNAリガーゼを用いてRNAを結合することによって
調製することができる。ウイルスポリメラーゼ活性のために必要な配列の要件、
および本発明に従って使用される構築物を以下の分節で説明する。
【００２８】 5.2. 弱毒ウイルスの生産 本発明は、遺伝子工学によって作成された弱毒ウイルス、およびその生産に関
する。より詳細には、本発明は、結果としてINF非依存性およびINF誘導性表現型
となるように改変された弱毒インフルエンザウイルスに関する。下記の節では、
本発明に従って弱毒表現型を生産するために利用できる様々な方法を説明する。
ウイルスゲノムの１または２以上の非コード領域内に部位特異的突然変異を遺伝
子工学的に操作するために組換えDNA技法を利用することができ、その結果１ま
たは２以上のウイルス遺伝子のダウンレギュレーションがおこる。また、アミノ
酸残基またはエピトープの挿入、欠失、または置換を包含するがそれらに限定さ
れない突然変異を、ウイルスゲノムのコード領域に作り出すために、組換えDNA
技法を利用することができ、その結果、改変型またはキメラ型ウイルスタンパク
質が遺伝子工学的に作成されたウイルスによって発現される。この発明は、ひと
つには、セグメントウイルスにおけるウイルス遺伝子のダウンレギュレーション
の結果として、複製を繰り返すごとに不完全な粒子が産生されることとなり、そ
の結果ウイルスは弱まった特性を示すという発見に基づく。非セグメントウイル
スでは、ウイルス遺伝子のダウンレギュレーションの結果、野生型ウイルスによ
って産生されるより数少ないウイルス粒子が産生される。上記のウイルスタンパ
ク質変化は、詳細には理解されていない理由によって弱毒化をもたらす。
する。より詳細には、本発明は、結果としてINF非依存性およびINF誘導性表現型
となるように改変された弱毒インフルエンザウイルスに関する。下記の節では、
本発明に従って弱毒表現型を生産するために利用できる様々な方法を説明する。
ウイルスゲノムの１または２以上の非コード領域内に部位特異的突然変異を遺伝
子工学的に操作するために組換えDNA技法を利用することができ、その結果１ま
たは２以上のウイルス遺伝子のダウンレギュレーションがおこる。また、アミノ
酸残基またはエピトープの挿入、欠失、または置換を包含するがそれらに限定さ
れない突然変異を、ウイルスゲノムのコード領域に作り出すために、組換えDNA
技法を利用することができ、その結果、改変型またはキメラ型ウイルスタンパク
質が遺伝子工学的に作成されたウイルスによって発現される。この発明は、ひと
つには、セグメントウイルスにおけるウイルス遺伝子のダウンレギュレーション
の結果として、複製を繰り返すごとに不完全な粒子が産生されることとなり、そ
の結果ウイルスは弱まった特性を示すという発見に基づく。非セグメントウイル
スでは、ウイルス遺伝子のダウンレギュレーションの結果、野生型ウイルスによ
って産生されるより数少ないウイルス粒子が産生される。上記のウイルスタンパ
ク質変化は、詳細には理解されていない理由によって弱毒化をもたらす。
【００２９】 多くの方法を用いて、免疫応答を誘導するために弱毒生ウイルスをヒトまたは
動物に導入することができる；このような方法は、経口、皮内、筋内、腹腔内、
静脈内、皮下、および鼻腔内の経路を包含するが、それらに限定されない。自然
の感染経路でキメラ型ウイルスワクチンを導入することが望ましい。
動物に導入することができる；このような方法は、経口、皮内、筋内、腹腔内、
静脈内、皮下、および鼻腔内の経路を包含するが、それらに限定されない。自然
の感染経路でキメラ型ウイルスワクチンを導入することが望ましい。
【００３０】 本発明に従って、安全な生ウイルスワクチンとしての使用に適した弱毒株を作
成するためにあらゆるウイルスを遺伝子工学的に作り出すことができる。ここに
おいて、このウイルスは下記の表１に記載の科に属するウイルスを包含するが限
定されない。
成するためにあらゆるウイルスを遺伝子工学的に作り出すことができる。ここに
おいて、このウイルスは下記の表１に記載の科に属するウイルスを包含するが限
定されない。
【００３１】
【表１】
【００３２】 当業者に公知の組換えDNA技術を用いて、容易に、DNAウイルス（例としては、ワ
クシニア、アデノウイルス、バキュロウイルス）および(+)鎖RNAウイルス（例、
ポリオウイルス）を遺伝子工学的に作成することができる（たとえば、米国特許
第4,769,330号、Paoletti；米国特許第4,215,051号、Smith；Racanielloら、198
1, Science 214: 916-919参照）。しかしながら、ウイルスRNAは感染性でないた
め、最近まで、(-)鎖RNAウイルス（例、インフルエンザ）に部位特異的遺伝子操
作を行なうことは困難であった。ところが、「逆遺伝学(reverse genetics)」と
称される最近の技術の進歩により、組換え(-)鎖RNAウイルスを遺伝子工学的に作
成し生産することが可能となっている。
クシニア、アデノウイルス、バキュロウイルス）および(+)鎖RNAウイルス（例、
ポリオウイルス）を遺伝子工学的に作成することができる（たとえば、米国特許
第4,769,330号、Paoletti；米国特許第4,215,051号、Smith；Racanielloら、198
1, Science 214: 916-919参照）。しかしながら、ウイルスRNAは感染性でないた
め、最近まで、(-)鎖RNAウイルス（例、インフルエンザ）に部位特異的遺伝子操
作を行なうことは困難であった。ところが、「逆遺伝学(reverse genetics)」と
称される最近の技術の進歩により、組換え(-)鎖RNAウイルスを遺伝子工学的に作
成し生産することが可能となっている。
【００３３】 逆遺伝学技術とは、ウイルスポリメラーゼによるウイルスRNAの識別に必須で
あり、成熟ビリオンを生成するために必要なパッケージングシグナルに欠かせな
い、(-)鎖ウイルスの非コード領域を含有する、合成組換えウイルスRNAの調製を
含むものである。組換えRNAは、組換えDNA鋳型から合成され、in vitroで精製ウ
イルスポリメラーゼ複合体を用いて再構成されて、細胞のトランスフェクション
に利用できる組換えリボ核タンパク質(RNP)を形成する。合成RNAのin vitroでの
転写に際してウイルスポリメラーゼタンパク質が存在するならば、より効率の良
いトランスフェクションが達成される。合成組換えRNPを感染性のウイルス粒子
内にレスキューすることができる。上記の技法は1992年11月24日に交付された米
国特許第5,166,057号、およびEnami & Palese, 1991, J. Virol. 65 : 2711-271
3に記述され、これらはいずれも、その全体が引用によって本文に編入される。
さらに、NS遺伝子の軸部分に挿入、欠失、および突然変異を有するA型インフル
エンザウイルスは、変化して、宿主域突然変異体として作用する。
あり、成熟ビリオンを生成するために必要なパッケージングシグナルに欠かせな
い、(-)鎖ウイルスの非コード領域を含有する、合成組換えウイルスRNAの調製を
含むものである。組換えRNAは、組換えDNA鋳型から合成され、in vitroで精製ウ
イルスポリメラーゼ複合体を用いて再構成されて、細胞のトランスフェクション
に利用できる組換えリボ核タンパク質(RNP)を形成する。合成RNAのin vitroでの
転写に際してウイルスポリメラーゼタンパク質が存在するならば、より効率の良
いトランスフェクションが達成される。合成組換えRNPを感染性のウイルス粒子
内にレスキューすることができる。上記の技法は1992年11月24日に交付された米
国特許第5,166,057号、およびEnami & Palese, 1991, J. Virol. 65 : 2711-271
3に記述され、これらはいずれも、その全体が引用によって本文に編入される。
さらに、NS遺伝子の軸部分に挿入、欠失、および突然変異を有するA型インフル
エンザウイルスは、変化して、宿主域突然変異体として作用する。
【００３４】 5.2.1. ウイルス遺伝子のダウンレギュレーション 本発明によれば、ウイルスの非コード調節領域を改変して、細胞のIFN媒介応
答のダウンレギュレーションに関与するウイルス遺伝子をダウンレギュレートす
る、例えば、そのmRNAの転写を低下および／またはvRNA（ウイルスRNA）の複製
を低下させることにより、IFN誘導性表現型を有する弱毒ウイルスを生成するこ
とができる。
答のダウンレギュレーションに関与するウイルス遺伝子をダウンレギュレートす
る、例えば、そのmRNAの転写を低下および／またはvRNA（ウイルスRNA）の複製
を低下させることにより、IFN誘導性表現型を有する弱毒ウイルスを生成するこ
とができる。
【００３５】 この手法は、あらゆるウイルスに適用可能であるが、特に、セグメントゲノム
を有するウイルス、すなわち、ゲノムがビリオンにパッケージングされたセグメ
ントに分かれているウイルスを作製するのに有利である。例えば、Ａ型インフル
エンザウイルス（オルトミクソウイルス）のセグメントゲノムは、10のポリペプ
チドをコードする線状(-)センスssRNAの８つの分子から構成されており、これら
には、次のものが含まれる：ヌクレオキャプシドを形成する、RNA依存性RNAポリ
メラーゼタンパク質（PB2、PB1およびPA）および核タンパク質（NP）；エンベロ
ープから突出した２つの表面糖タンパク質、すなわち、赤血球凝集素（HA）およ
びノイラミニダーゼ（NA）；ならびに、機能が未知の非構造タンパク質（NS1お
よびNS2）。各セグメントの末端は、ウイルスポリメラーゼによる認識に不可欠
であり、かつ成熟ウイルス粒子の生成に必要なシグナルをパッケージングするの
に必須の非コード領域を含む。この末端の配列は、8つのすべてのセグメント間
で高度に保存されている。別の例として、レオウイルスのセグメントゲノムは、
６〜10の主構造ポリペプチド、転写酵素およびその他の酵素をコードする線状ds
RNAの10〜12のセグメントから成る。
を有するウイルス、すなわち、ゲノムがビリオンにパッケージングされたセグメ
ントに分かれているウイルスを作製するのに有利である。例えば、Ａ型インフル
エンザウイルス（オルトミクソウイルス）のセグメントゲノムは、10のポリペプ
チドをコードする線状(-)センスssRNAの８つの分子から構成されており、これら
には、次のものが含まれる：ヌクレオキャプシドを形成する、RNA依存性RNAポリ
メラーゼタンパク質（PB2、PB1およびPA）および核タンパク質（NP）；エンベロ
ープから突出した２つの表面糖タンパク質、すなわち、赤血球凝集素（HA）およ
びノイラミニダーゼ（NA）；ならびに、機能が未知の非構造タンパク質（NS1お
よびNS2）。各セグメントの末端は、ウイルスポリメラーゼによる認識に不可欠
であり、かつ成熟ウイルス粒子の生成に必要なシグナルをパッケージングするの
に必須の非コード領域を含む。この末端の配列は、8つのすべてのセグメント間
で高度に保存されている。別の例として、レオウイルスのセグメントゲノムは、
６〜10の主構造ポリペプチド、転写酵素およびその他の酵素をコードする線状ds
RNAの10〜12のセグメントから成る。
【００３６】 上記の手法は、非セグメントRNAウイルスにも同様に適用可能であり、この場
合、細胞IFN媒介応答のダウンレギュレーションに関与するウイルス遺伝子の転
写をダウンレギュレートすることにより、そのmRNAおよびコードされた遺伝子産
物の生成が低下し、その結果、インターフェロン誘導性表現型がもたらされる。
合、細胞IFN媒介応答のダウンレギュレーションに関与するウイルス遺伝子の転
写をダウンレギュレートすることにより、そのmRNAおよびコードされた遺伝子産
物の生成が低下し、その結果、インターフェロン誘導性表現型がもたらされる。
【００３７】 効率または強度を低下させる非コード調節領域のあらゆる改変を、本発明に従
って実施することができる。例えば、ウイルスプロモーターの強度は、ステム構
造の改変により低下させることができる。弱毒表現型を達成するためには、細胞
のIFN媒介応答のダウンレギュレーションに関与するウイルス遺伝子のシスエレ
メントに突然変異を起こすことによって、該遺伝子の転写および複写に著しい作
用を及ぼすことが可能である。
って実施することができる。例えば、ウイルスプロモーターの強度は、ステム構
造の改変により低下させることができる。弱毒表現型を達成するためには、細胞
のIFN媒介応答のダウンレギュレーションに関与するウイルス遺伝子のシスエレ
メントに突然変異を起こすことによって、該遺伝子の転写および複写に著しい作
用を及ぼすことが可能である。
【００３８】 Ａ型インフルエンザウイルスが、どのようにして、その８つのRNAゲノムセグ
メントをパッケージングするかは、依然として、関心を集める疑問のままである
。これまで、インフルエンザウイルスRNAのパッケージングについては、２つの
異なる機構が提示されている。１つは、８つのRNAが選択的にパッケージングさ
れるとするものであり、他方は、ウイルスRNAがランダムにパッケージングされ
るとするものである（Compansら、1970，In The Biology Of Large RNA Viruses
、Barry & Marry、Eds.、 pp. 87-108、Academic Press、N.Y.；Lamb & Choppin
、1983、Ann. Rev. Biochem. 467-506；Smith & Hay、1982、Virology 118： 96
-108）．現在、ランダムパッケージング機構を支持する証拠が多く集まっている
。ランダムパッケージング論は、インフルエンザウイルスの、物理的粒子に対す
る感染性粒子の比が低いという事実に由来するものである。１ビリオンにつき、
平均11のRNAがパッケージングされるとすると、予想される比は、in vivoでみい
だされたものと適合する（Enamiら、1991、Virology 185：291-298）。また、こ
の仮説は、2つの異なるウイルスに由来する同じセグメントの２つのコピーを含
む再構築ウイルスの知見によっても支持されている（Scholtissek、1978、Virol
ogy 89：506-516）。さらに、この理論は、感染性となるために、９つのRNAを必
要とするＡ型インフルエンザウイルスを記載したさらに最近の報告（Enamiら、1
991、Virology 185：291-298）からも支持されている。
メントをパッケージングするかは、依然として、関心を集める疑問のままである
。これまで、インフルエンザウイルスRNAのパッケージングについては、２つの
異なる機構が提示されている。１つは、８つのRNAが選択的にパッケージングさ
れるとするものであり、他方は、ウイルスRNAがランダムにパッケージングされ
るとするものである（Compansら、1970，In The Biology Of Large RNA Viruses
、Barry & Marry、Eds.、 pp. 87-108、Academic Press、N.Y.；Lamb & Choppin
、1983、Ann. Rev. Biochem. 467-506；Smith & Hay、1982、Virology 118： 96
-108）．現在、ランダムパッケージング機構を支持する証拠が多く集まっている
。ランダムパッケージング論は、インフルエンザウイルスの、物理的粒子に対す
る感染性粒子の比が低いという事実に由来するものである。１ビリオンにつき、
平均11のRNAがパッケージングされるとすると、予想される比は、in vivoでみい
だされたものと適合する（Enamiら、1991、Virology 185：291-298）。また、こ
の仮説は、2つの異なるウイルスに由来する同じセグメントの２つのコピーを含
む再構築ウイルスの知見によっても支持されている（Scholtissek、1978、Virol
ogy 89：506-516）。さらに、この理論は、感染性となるために、９つのRNAを必
要とするＡ型インフルエンザウイルスを記載したさらに最近の報告（Enamiら、1
991、Virology 185：291-298）からも支持されている。
【００３９】 要約すると、弱毒表現型は、NS遺伝子セグメントのシスエレメントを標的とし
て、該遺伝子セグメントをダウンレギュレートさせることにより、達成すること
ができる。このウイルスのタンパク質は、野生型ウイルスと比較して、変わって
いないため、弱毒化は、非効率的なシス作用シグナルの結果であるに違いない。
この弱毒化の原理は、セグメントゲノムを有する他のウイルスにも同様に適用す
ることができる。例えば、ロタウイルス遺伝子もしくはその他のセグメントdsRN
Aウイルスの遺伝子(Ronerら, 1990, Virology 179: 845-852)の非コード配列に
修飾を導入しても、これらウイルスの病原性を改変することができるだろう。
て、該遺伝子セグメントをダウンレギュレートさせることにより、達成すること
ができる。このウイルスのタンパク質は、野生型ウイルスと比較して、変わって
いないため、弱毒化は、非効率的なシス作用シグナルの結果であるに違いない。
この弱毒化の原理は、セグメントゲノムを有する他のウイルスにも同様に適用す
ることができる。例えば、ロタウイルス遺伝子もしくはその他のセグメントdsRN
Aウイルスの遺伝子(Ronerら, 1990, Virology 179: 845-852)の非コード配列に
修飾を導入しても、これらウイルスの病原性を改変することができるだろう。
【００４０】 5.2.2. ウイルスタンパク質の改変 弱毒ウイルスを作製する別の方法は、改変の導入を伴うが、かかる改変は、細
胞のIFN媒介応答のダウンレギュレーションに関与する１つ以上のウイルスタン
パク質への、１つ以上のアミノ酸残基および／またはエピトープの挿入、欠失も
しくは置換を含むが、これらに限定されるわけではない。これは、対応するウイ
ルス遺伝子配列への適切な改変を実施することにより容易に達成することができ
る。細胞のIFN媒介応答のダウンレギュレーションに関与するウイルスタンパク
質の活性を改変することにより、ウイルスの複製を改変もしくは低下させるあら
ゆる変化は、本発明に従って達成することが可能である。
胞のIFN媒介応答のダウンレギュレーションに関与する１つ以上のウイルスタン
パク質への、１つ以上のアミノ酸残基および／またはエピトープの挿入、欠失も
しくは置換を含むが、これらに限定されるわけではない。これは、対応するウイ
ルス遺伝子配列への適切な改変を実施することにより容易に達成することができ
る。細胞のIFN媒介応答のダウンレギュレーションに関与するウイルスタンパク
質の活性を改変することにより、ウイルスの複製を改変もしくは低下させるあら
ゆる変化は、本発明に従って達成することが可能である。
【００４１】 例えば、宿主細胞受容体へのウイルスの結合とそれに続く感染を妨害するが、
完全に排除するわけではない改変を、プロセッシングに関与するウイルスの表面
抗原またはウイルスプロテアアーゼに施し、弱毒株を生成することができる。こ
の実施形態によれば、ウイルスの表面抗原を改変することにより、宿主細胞受容
体に対するウイルス抗原の結合親和性を妨害する、もしくは低下させる１つ以上
のアミノ酸またはエピトープの挿入、置換または欠失を含むようにすることがで
きる。この手法は、弱毒化された特性も示す、外来エピトープを発現するキメラ
型ウイルスを生成できるというもう１つの利点をもたらす。このようなウイルス
は、組換え生ワクチンとして使用するための理想的な候補である。例えば、本発
明のキメラ型ウイルスに作製することができる異種遺伝子配列は、限定するもの
ではないが、gp120等のヒト免疫不全ウイルス（HIV）のエピトープ；Ｂ型肝炎ウ
イルス表面抗原（HBsAg）；ヘルペスウイルスの糖タンパク質（例えば、gD、gE
）；ポリオウイルスのVP1；ならびに、細菌や寄生虫等の非ウイルス病原体の抗
原決定基を含むが、ここに挙げた例はわずかにすぎない。
完全に排除するわけではない改変を、プロセッシングに関与するウイルスの表面
抗原またはウイルスプロテアアーゼに施し、弱毒株を生成することができる。こ
の実施形態によれば、ウイルスの表面抗原を改変することにより、宿主細胞受容
体に対するウイルス抗原の結合親和性を妨害する、もしくは低下させる１つ以上
のアミノ酸またはエピトープの挿入、置換または欠失を含むようにすることがで
きる。この手法は、弱毒化された特性も示す、外来エピトープを発現するキメラ
型ウイルスを生成できるというもう１つの利点をもたらす。このようなウイルス
は、組換え生ワクチンとして使用するための理想的な候補である。例えば、本発
明のキメラ型ウイルスに作製することができる異種遺伝子配列は、限定するもの
ではないが、gp120等のヒト免疫不全ウイルス（HIV）のエピトープ；Ｂ型肝炎ウ
イルス表面抗原（HBsAg）；ヘルペスウイルスの糖タンパク質（例えば、gD、gE
）；ポリオウイルスのVP1；ならびに、細菌や寄生虫等の非ウイルス病原体の抗
原決定基を含むが、ここに挙げた例はわずかにすぎない。
【００４２】 この点に関して、インフルエンザは、外来エピトープを作製する理想的な系で
ある。というのは、キメラ型ウイルスを構築するための何千種ものインフルエン
ザウイルス変異体から選択できることが、ワクシニア等の他のウイルスベクター
を使用した場合に発生する宿主耐性もしくは免疫寛容の問題を回避するからであ
る。さらに、インフルエンザは、活発な分泌および細胞障害性Ｔ細胞応答を刺激
することから、インフルエンザバックグラウンドに外来エピトープを提示するこ
とにより、分泌免疫および細胞性免疫をもたらすことも可能である。例えば、イ
ンフルエンザのHAタンパク質に、アミノ酸残基の挿入、欠失または置換を施すこ
とにより、弱毒株を生成することができる。この場合、HAのＢ領域またはＥ領域
への改変を用いてもよい。この手法に従い、Plasmodium yoelii（NEDSYVPSAEQI
）マラリアのエピトープ(ME１)をインフルエンザの赤血球凝集素の抗原部位Ｅに
導入した。得られたキメラ型ウイルスは、マウスで検定した場合、野生型ウイル
スより500〜1,000倍低いLD50（致死量50）を有する。別の実施形態では、1型ポ
リオウイルスの主抗原決定基、すなわち、1型ポリオウイルスのVP1のBCループ（
PASTTNKDKL）をインフルエンザHAタンパク質のＢ領域に導入した。このキメラ型
ウイルスも弱毒化されている。
ある。というのは、キメラ型ウイルスを構築するための何千種ものインフルエン
ザウイルス変異体から選択できることが、ワクシニア等の他のウイルスベクター
を使用した場合に発生する宿主耐性もしくは免疫寛容の問題を回避するからであ
る。さらに、インフルエンザは、活発な分泌および細胞障害性Ｔ細胞応答を刺激
することから、インフルエンザバックグラウンドに外来エピトープを提示するこ
とにより、分泌免疫および細胞性免疫をもたらすことも可能である。例えば、イ
ンフルエンザのHAタンパク質に、アミノ酸残基の挿入、欠失または置換を施すこ
とにより、弱毒株を生成することができる。この場合、HAのＢ領域またはＥ領域
への改変を用いてもよい。この手法に従い、Plasmodium yoelii（NEDSYVPSAEQI
）マラリアのエピトープ(ME１)をインフルエンザの赤血球凝集素の抗原部位Ｅに
導入した。得られたキメラ型ウイルスは、マウスで検定した場合、野生型ウイル
スより500〜1,000倍低いLD50（致死量50）を有する。別の実施形態では、1型ポ
リオウイルスの主抗原決定基、すなわち、1型ポリオウイルスのVP1のBCループ（
PASTTNKDKL）をインフルエンザHAタンパク質のＢ領域に導入した。このキメラ型
ウイルスも弱毒化されている。
【００４３】 別の実施形態では、ウイルスタンパク質のプロセッシングに必要なウイルスプ
ロテアーゼの改変を施すことにより、弱毒化を行うことができる。酵素活性に作
用し、プロセッシングにおけるこの酵素の効率を低下させる改変は、ウイルスの
感染力、パッケージング、および／または放出に影響を及ぼして、弱毒ウイルス
を生成することになる。例えば、インフルエンザのNSタンパク質に対する改変を
施すことにより、NS酵素活性を低下させ、複製中に放出された子孫ウイルスの数
および／または感染力を減少させることができる。
ロテアーゼの改変を施すことにより、弱毒化を行うことができる。酵素活性に作
用し、プロセッシングにおけるこの酵素の効率を低下させる改変は、ウイルスの
感染力、パッケージング、および／または放出に影響を及ぼして、弱毒ウイルス
を生成することになる。例えば、インフルエンザのNSタンパク質に対する改変を
施すことにより、NS酵素活性を低下させ、複製中に放出された子孫ウイルスの数
および／または感染力を減少させることができる。
【００４４】 別の実施形態では、ウイルスの複製およびウイルス遺伝子の転写に関与するウ
イルス酵素、例えば、ウイルスポリメラーゼ、レプリカーゼ、ヘリカーゼ等を改
変して、該酵素の効率または活性を低下させることが可能である。このような酵
素の活性の低下によって、子孫ゲノムおよび／またはウイルス転写産物が少なく
なり、その結果、複製中に生成される感染性粒子の数が減少する。
イルス酵素、例えば、ウイルスポリメラーゼ、レプリカーゼ、ヘリカーゼ等を改
変して、該酵素の効率または活性を低下させることが可能である。このような酵
素の活性の低下によって、子孫ゲノムおよび／またはウイルス転写産物が少なく
なり、その結果、複製中に生成される感染性粒子の数が減少する。
【００４５】 上記ウイルス酵素のいずれかに施される改変には、分子の活性部位のアミノ酸
配列の挿入、欠失および置換が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
例えば、酵素の結合部位を改変して、基質に対するその結合親和性を低下させる
ことができる。その結果、上記酵素の特異性および／または効率が低下する。例
えば、すべてのポリメラーゼタンパク質には、温度感受性の高い突然変異が存在
することから、好適な標的は、ウイルスポリメラーゼ複合体である。従って、こ
のような温度感受性に関連したアミノ酸位置に導入された改変をウイルスポリメ
ラーゼ遺伝子に施し、弱毒株を生成することができる。
配列の挿入、欠失および置換が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
例えば、酵素の結合部位を改変して、基質に対するその結合親和性を低下させる
ことができる。その結果、上記酵素の特異性および／または効率が低下する。例
えば、すべてのポリメラーゼタンパク質には、温度感受性の高い突然変異が存在
することから、好適な標的は、ウイルスポリメラーゼ複合体である。従って、こ
のような温度感受性に関連したアミノ酸位置に導入された改変をウイルスポリメ
ラーゼ遺伝子に施し、弱毒株を生成することができる。
【００４６】 5.3. 宿主制限に基づく選択系 本発明は、遺伝子工学的に操作されたインフルエンザウイルスを同定するため
の宿主制限に基づく選択系に関する。さらに具体的には、本発明の選択系は、改
変型NS遺伝子セグメントを含む遺伝子工学的に操作されたインフルエンザウイル
スの同定に関する。本発明の選択系によって、遺伝子工学的に作製されたインフ
ルエンザウイルスのスクリーニングから、改変型NS遺伝子セグメントを有するウ
イルスを同定することが可能となる。
の宿主制限に基づく選択系に関する。さらに具体的には、本発明の選択系は、改
変型NS遺伝子セグメントを含む遺伝子工学的に操作されたインフルエンザウイル
スの同定に関する。本発明の選択系によって、遺伝子工学的に作製されたインフ
ルエンザウイルスのスクリーニングから、改変型NS遺伝子セグメントを有するウ
イルスを同定することが可能となる。
【００４７】 本発明の選択系は、NS1遺伝子の欠失した、遺伝子工学的に作製されたＡ型イ
ンフルエンザウイルスが、IFN生産欠損細胞系において増殖できるのに、同じ細
胞系が、野生型インフルエンザウイルスの感染および増殖を支持しないという本
発明者らの発見に部分的に基づくものである。このNS1欠失ウイルスは、インフ
ルエンザウイルス用の通常の培養基では、感染および増殖することができなかっ
た。従って、本発明は、改変型NS1遺伝子を含む遺伝子工学的に作製されたイン
フルエンザウイルスを同定するための、非常に単純かつ容易なスクリーニング方
法を提供する。
ンフルエンザウイルスが、IFN生産欠損細胞系において増殖できるのに、同じ細
胞系が、野生型インフルエンザウイルスの感染および増殖を支持しないという本
発明者らの発見に部分的に基づくものである。このNS1欠失ウイルスは、インフ
ルエンザウイルス用の通常の培養基では、感染および増殖することができなかっ
た。従って、本発明は、改変型NS1遺伝子を含む遺伝子工学的に作製されたイン
フルエンザウイルスを同定するための、非常に単純かつ容易なスクリーニング方
法を提供する。
【００４８】 5.4. キメラ型ウイルスを用いたワクチン製剤 実質的にあらゆる異種遺伝子配列は、ワクチンに用いる本発明のキメラ型ウイ
ルスへと構築することが可能である。好ましくは、多種の病原体、または、中和
抗体と結合する抗原のいずれかに対する防御免疫応答を誘導するエピトープを、
キメラ型ウイルスによって、もしくはその一部として発現させることができる。
例えば、ワクチンに用いる本発明のキメラ型ウイルスに構築することができる異
種遺伝子配列としては、限定するものではないが、gp120等のヒト免疫不全ウイ
ルス（HIV）のエピトープ；Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（HBsAg）；ヘルペスウイ
ルスの糖タンパク質（例えば、gD、gE）;ポリオウイルスのVP1；細菌および寄生
虫等の非ウイルス病原体の抗原決定基などが含まれるが、ここに挙げた例はわず
かにすぎない。別の実施形態では、免疫グロブリン遺伝子の全部または一部を発
現させることができる。例えば、このようなエピトープを擬態する抗イディオタ
イプ免疫グロブリンの可変領域を本発明のキメラ型ウイルスに構築することがで
きる。
ルスへと構築することが可能である。好ましくは、多種の病原体、または、中和
抗体と結合する抗原のいずれかに対する防御免疫応答を誘導するエピトープを、
キメラ型ウイルスによって、もしくはその一部として発現させることができる。
例えば、ワクチンに用いる本発明のキメラ型ウイルスに構築することができる異
種遺伝子配列としては、限定するものではないが、gp120等のヒト免疫不全ウイ
ルス（HIV）のエピトープ；Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（HBsAg）；ヘルペスウイ
ルスの糖タンパク質（例えば、gD、gE）;ポリオウイルスのVP1；細菌および寄生
虫等の非ウイルス病原体の抗原決定基などが含まれるが、ここに挙げた例はわず
かにすぎない。別の実施形態では、免疫グロブリン遺伝子の全部または一部を発
現させることができる。例えば、このようなエピトープを擬態する抗イディオタ
イプ免疫グロブリンの可変領域を本発明のキメラ型ウイルスに構築することがで
きる。
【００４９】 組換えウイルス生ワクチンまたは不活性化組換えウイルスワクチンのいずれを
製剤化することもできる。宿主内での増殖は、自然感染で発生するものと同様の
種類および大きさの刺激を持続させ、従って、実質的な長期持続性免疫を賦与す
ることから、生ワクチンが好ましいと思われる。このような組換えウイルス生ワ
クチン製剤の調製は、細胞培養物またはニワトリ胚の尿嚢でのウイルスの増殖と
、それに続く精製を含む従来の方法を用いて達成することができる。
製剤化することもできる。宿主内での増殖は、自然感染で発生するものと同様の
種類および大きさの刺激を持続させ、従って、実質的な長期持続性免疫を賦与す
ることから、生ワクチンが好ましいと思われる。このような組換えウイルス生ワ
クチン製剤の調製は、細胞培養物またはニワトリ胚の尿嚢でのウイルスの増殖と
、それに続く精製を含む従来の方法を用いて達成することができる。
【００５０】 これに関して、ワクチンを目的として、遺伝子工学的に作製されたインフルエ
ンザウイルス（ベクター）を使用するためには、これらの株が、弱毒性を有する
必要があると考えられる。ヒトに使用するためのこのウイルス生ワクチン候補は
、低温適応性であるか、温度感受性であるか、あるいは、トリウイルス由来の数
個（６）の遺伝子を誘導するように継代される（passaged）かのいずれかであり
、これにより、弱毒化がもたらされる。適切な突然変異（例えば、欠失）を、ト
ランスフェクションに使用する鋳型に導入することにより、弱毒性を有する新規
のウイルスを作製することができる。例えば、温度感受性または低温適応と関連
する特定のミスセンス突然変異を、欠失突然変異に起こすことができる。これら
の突然変異は、低温または温度感受性突然変異体に関連した点突然変異よりも安
定しており、復帰頻度は極めて低い。
ンザウイルス（ベクター）を使用するためには、これらの株が、弱毒性を有する
必要があると考えられる。ヒトに使用するためのこのウイルス生ワクチン候補は
、低温適応性であるか、温度感受性であるか、あるいは、トリウイルス由来の数
個（６）の遺伝子を誘導するように継代される（passaged）かのいずれかであり
、これにより、弱毒化がもたらされる。適切な突然変異（例えば、欠失）を、ト
ランスフェクションに使用する鋳型に導入することにより、弱毒性を有する新規
のウイルスを作製することができる。例えば、温度感受性または低温適応と関連
する特定のミスセンス突然変異を、欠失突然変異に起こすことができる。これら
の突然変異は、低温または温度感受性突然変異体に関連した点突然変異よりも安
定しており、復帰頻度は極めて低い。
【００５１】 あるいは、「自殺」特性を有するキメラ型ウイルスを構築することもできる。
このようなウイルスは、宿主中で、１ラウンドのみ、もしくは２、３ラウンドの
複製しか経ない。例えば、複製を再開するためには、HAの切断が必要である。従
って、HA切断部位の改変によって、ヒト宿主ではなく、適切な細胞系で複製する
ウイルスが生成されると考えられる。ワクチンとして用いた場合には、組換えウ
イルスは、1回の複製サイクルを経て、十分なレベルの免疫応答を誘導するが、
ヒト宿主ではそれ以上進展しないため、疾病を引き起こさない。1つ以上の必須
インフルエンザウイルス遺伝子を欠失する組換えウイルスは、次に続くラウンド
の複製を経ることができない。このような欠陥ウイルスは、特定の遺伝子を欠失
した再構築RNPを、該遺伝子を永久的に発現する細胞系に共トランスフェクショ
ンすることにより、生成することができる。必須遺伝子を欠失したウイルスは、
これらの細胞系で複製されるが、ヒト宿主に投与する場合には、1ラウンドの複
製を完了することができない。このような調製物は、−上記の不稔サイクルにお
いて−免疫応答を誘導するのに十分な数の遺伝子を転写および翻訳する。あるい
は、さらに多量の菌株を投与して、これらの調製物が不活性化（死滅）ウイルス
ワクチンとして役立つようにすることも可能である。不活性化ワクチンについて
は、異種遺伝子産物をウイルス成分として発現させ、該遺伝子産物がビリオンに
随伴するようにするのが好ましい。このような調製物の利点は、これらが、天然
のタンパク質を含み、死滅ウイルスワクチンの製造に用いられるホルマリンもし
くはその他の薬剤での処理による不活性化を被らないことである。
このようなウイルスは、宿主中で、１ラウンドのみ、もしくは２、３ラウンドの
複製しか経ない。例えば、複製を再開するためには、HAの切断が必要である。従
って、HA切断部位の改変によって、ヒト宿主ではなく、適切な細胞系で複製する
ウイルスが生成されると考えられる。ワクチンとして用いた場合には、組換えウ
イルスは、1回の複製サイクルを経て、十分なレベルの免疫応答を誘導するが、
ヒト宿主ではそれ以上進展しないため、疾病を引き起こさない。1つ以上の必須
インフルエンザウイルス遺伝子を欠失する組換えウイルスは、次に続くラウンド
の複製を経ることができない。このような欠陥ウイルスは、特定の遺伝子を欠失
した再構築RNPを、該遺伝子を永久的に発現する細胞系に共トランスフェクショ
ンすることにより、生成することができる。必須遺伝子を欠失したウイルスは、
これらの細胞系で複製されるが、ヒト宿主に投与する場合には、1ラウンドの複
製を完了することができない。このような調製物は、−上記の不稔サイクルにお
いて−免疫応答を誘導するのに十分な数の遺伝子を転写および翻訳する。あるい
は、さらに多量の菌株を投与して、これらの調製物が不活性化（死滅）ウイルス
ワクチンとして役立つようにすることも可能である。不活性化ワクチンについて
は、異種遺伝子産物をウイルス成分として発現させ、該遺伝子産物がビリオンに
随伴するようにするのが好ましい。このような調製物の利点は、これらが、天然
のタンパク質を含み、死滅ウイルスワクチンの製造に用いられるホルマリンもし
くはその他の薬剤での処理による不活性化を被らないことである。
【００５２】 本発明のこの側面に関する別の実施形態では、キメラ型ウイルスを「死滅させ
る」従来の方法を用いて、不活性化ワクチン製剤を調製することができる。不活
性化ワクチンは、それらの感染力が破壊されているという意味で、「死んで」い
る。理想的には、ウイルスの感染力は、その免疫原性に影響を及ぼすことなく、
破壊されている。不活性化ワクチンを調製するためには、キメラ型ウイルスを細
胞培養物もしくはニワトリ胚の尿嚢中で増殖させ、ゾーン超遠心分離により精製
し、ホルムアルデヒドまたはβ-プロピオラクトンで不活性化した後、プールす
る。こうして得られたワクチンは、通常、筋肉内に接種される。
る」従来の方法を用いて、不活性化ワクチン製剤を調製することができる。不活
性化ワクチンは、それらの感染力が破壊されているという意味で、「死んで」い
る。理想的には、ウイルスの感染力は、その免疫原性に影響を及ぼすことなく、
破壊されている。不活性化ワクチンを調製するためには、キメラ型ウイルスを細
胞培養物もしくはニワトリ胚の尿嚢中で増殖させ、ゾーン超遠心分離により精製
し、ホルムアルデヒドまたはβ-プロピオラクトンで不活性化した後、プールす
る。こうして得られたワクチンは、通常、筋肉内に接種される。
【００５３】 不活性化ウイルスは、免疫応答を増強するのに適したアジュバントを用いて製
剤化することができる。このようなアジュバントとしては、ミネラルゲル、例え
ば、水酸化アルミニウム；リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオ
ン等の界面活性物質；ペプチド；油性エマルション；ならびにBCGやCorynebacte
rium parvumなどの潜在的に有用なヒトアジュバントを挙げることができるが、
これらに限定されるわけではない。
剤化することができる。このようなアジュバントとしては、ミネラルゲル、例え
ば、水酸化アルミニウム；リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオ
ン等の界面活性物質；ペプチド；油性エマルション；ならびにBCGやCorynebacte
rium parvumなどの潜在的に有用なヒトアジュバントを挙げることができるが、
これらに限定されるわけではない。
【００５４】 多くの方法を用いて、上に記載したワクチン製剤を導入することができる。こ
れらの方法には、経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、ならびに鼻腔内
経路が含まれるが、これらに限定されるわけではない。ワクチンを設計しようと
する病原体の自然感染経路を介して、キメラ型ウイルスワクチン製剤を導入する
のが望ましい。キメラ型ウイルス生ワクチン製剤を使用する場合には、インフル
エンザウイルス感染の自然経路を介して、該製剤を導入するのが好ましい。イン
フルエンザウイルスが活発な分泌および細胞性免疫応答を誘導する能力を有利に
利用することができる。例えば、キメラ型インフルエンザウイルスによる気道の
感染は、例えば、泌尿生殖器系において強い分泌免疫応答を誘導するが、これに
は特定の病原体に対する防御が付随する。
れらの方法には、経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、ならびに鼻腔内
経路が含まれるが、これらに限定されるわけではない。ワクチンを設計しようと
する病原体の自然感染経路を介して、キメラ型ウイルスワクチン製剤を導入する
のが望ましい。キメラ型ウイルス生ワクチン製剤を使用する場合には、インフル
エンザウイルス感染の自然経路を介して、該製剤を導入するのが好ましい。イン
フルエンザウイルスが活発な分泌および細胞性免疫応答を誘導する能力を有利に
利用することができる。例えば、キメラ型インフルエンザウイルスによる気道の
感染は、例えば、泌尿生殖器系において強い分泌免疫応答を誘導するが、これに
は特定の病原体に対する防御が付随する。
【００５５】 ６．材料および方法 以下の第７節から第11節では、下記の材料および方法を使用した。
【００５６】 ウイルスおよび細胞： インフルエンザA/PR/8/34（PR8）ウイルスを10日齢の
孵化鶏卵中に37℃で増殖させた。低温適応型株Ａ/Leningrad/134/47/57由来のNS
セグメントと、PR8ウイルス由来の残りの遺伝子を含む再構築ウイルスである、
Ａ型インフルエンザウイルス25A-1（Egorovら、1994、Vopr. Virusol. 39：201-
205；Shawら、1996、in Options for the control of IFNluenza III, eds. Bro
wn, Hampson Webster（Elsevier Science）pp.433-436）を、ベロ細胞中に34℃
で増殖させる。この25A-1ウイルスは、哺乳動物細胞において温度感受性（ts）
であり、delNS1トランスフェクタントウイルスのレスキュー（rescue）用のヘル
パーウイルスとして使用した。１μg／mlのトリプシン（Difco Laboratories、D
etroit、Michigan）を含む最少必須培地（MEM）中のベロ細胞およびMDCK細胞を
インフルエンザウイルスの増殖のために用いた。ベロ細胞はまた、delNS1ウイル
スの選択、プラーク精製および力価測定にも用いた。MDCK細胞、293細胞、なら
びに、IFNαR-/-マウスの14〜16日齢の胚に由来するマウス胚繊維芽細胞（MEF）
を、10％熱不活性化ウシ胎児血清を含むDMEM（ダルベッコの最少必須培地）に維
持した。不死化したIFNαR-/-繊維芽細胞は、連続継代により、MEFから誘導した
ものである（Todaroら、1963、J. Cell. Biol. 17；299-313）。ベロ細胞をAIM-
V培地中で増殖させた（Life Technologies, Grand Island, NY）。
孵化鶏卵中に37℃で増殖させた。低温適応型株Ａ/Leningrad/134/47/57由来のNS
セグメントと、PR8ウイルス由来の残りの遺伝子を含む再構築ウイルスである、
Ａ型インフルエンザウイルス25A-1（Egorovら、1994、Vopr. Virusol. 39：201-
205；Shawら、1996、in Options for the control of IFNluenza III, eds. Bro
wn, Hampson Webster（Elsevier Science）pp.433-436）を、ベロ細胞中に34℃
で増殖させる。この25A-1ウイルスは、哺乳動物細胞において温度感受性（ts）
であり、delNS1トランスフェクタントウイルスのレスキュー（rescue）用のヘル
パーウイルスとして使用した。１μg／mlのトリプシン（Difco Laboratories、D
etroit、Michigan）を含む最少必須培地（MEM）中のベロ細胞およびMDCK細胞を
インフルエンザウイルスの増殖のために用いた。ベロ細胞はまた、delNS1ウイル
スの選択、プラーク精製および力価測定にも用いた。MDCK細胞、293細胞、なら
びに、IFNαR-/-マウスの14〜16日齢の胚に由来するマウス胚繊維芽細胞（MEF）
を、10％熱不活性化ウシ胎児血清を含むDMEM（ダルベッコの最少必須培地）に維
持した。不死化したIFNαR-/-繊維芽細胞は、連続継代により、MEFから誘導した
ものである（Todaroら、1963、J. Cell. Biol. 17；299-313）。ベロ細胞をAIM-
V培地中で増殖させた（Life Technologies, Grand Island, NY）。
【００５７】 マウス： 以前に記載されたもの（Durbinら、1996、Cell 84：443-450）と同
様に、STAT1の標的欠失についてホモ接合のC57BL/6マウスを作製した。IFNαR-/
-マウスもすでに記載されている（Hwangら、1995、Proc. Natl. Aced. Sci. USA
92：11284-11288）。特定の病原体のないC57BL/6およびBALB/c（野生型）マウ
スをTaconic Farmsから購入した。
様に、STAT1の標的欠失についてホモ接合のC57BL/6マウスを作製した。IFNαR-/
-マウスもすでに記載されている（Hwangら、1995、Proc. Natl. Aced. Sci. USA
92：11284-11288）。特定の病原体のないC57BL/6およびBALB/c（野生型）マウ
スをTaconic Farmsから購入した。
【００５８】 動物の感染： 生後６〜12週間の雌のマウスをインフルエンザウイルスの感染
に用いた。delNS1ウイルスの５ｘ104プラーク形成単位（pfu）を含む50μlのMEM
を用いて、エーテル麻酔下の野生型マウスとSTAT1-/-マウスに、鼻腔内（i.n.）
接種を実施した。動物を毎日監視し、極端な状態（extremis）を観測した場合に
は、処分した。すべての手順は、実験動物の保護および使用に関するNIH指針に
従った。
に用いた。delNS1ウイルスの５ｘ104プラーク形成単位（pfu）を含む50μlのMEM
を用いて、エーテル麻酔下の野生型マウスとSTAT1-/-マウスに、鼻腔内（i.n.）
接種を実施した。動物を毎日監視し、極端な状態（extremis）を観測した場合に
は、処分した。すべての手順は、実験動物の保護および使用に関するNIH指針に
従った。
【００５９】 プラスミド： pT3delNS1を次のように作製した。まず、プライマー5’-CTGAA
AGCTTGACACAGTGTTG-3’および5’-GACATACTGCTGAGGATGTC-3’ （CODON Genetic
Systems、 Weiden,、Austria）を用いる逆PCR（Ochmanら、1988、Genetics 120
：621-623）で、T3 RNAポリメラーゼプロモーターおよびBpuAI制限部位が両端に
隣接するPR8ウイルスの完全NS遺伝子を含むpPUC19-T3/NS PRR8を増幅した。この
ようにして得られたNS1遺伝子を欠失したcDNAをリン酸化し、クレノウ処理し、
自己連結した後、大腸菌株TG1中で増殖させた。精製後得られた構築物をpT3de1N
S1と名づけ、配列決定により確認した。PR8ウイルスのNP、PB1、PB2、およびPA
タンパク質の発現用のプラスミド（pHMG- NP、pHMG- PB1、pHMG- PB2、およびpH
MG- PA）については、すでに記載されている（Pleschkaら、1996、J. Virol. 70
：4188-4192）。インフルエンザA/WSN/33（WSN）ウイルスのNS遺伝子のコード領
域に由来するRT-PCR産物内の、pPOLI-CAT-RT（Pleschkaら、1996、J. Virol. 70
：4188-4192）のCATオープンリーディングフレームを置換することにより、pPOL
I-NS-RBを調製した。このプラスミドは、切断型ヒトポリメラーゼＩプロモータ
ーの制御下でWSNウイルスのNS特異的ウイルスRNAセグメントを発現する。pHISG5
4-1-CAT（Bluyssenら、1994、Eur. J. Biochem. 220：395-402）は、ISG-54K遺
伝子のIFNα刺激プロモーターの転写制御下で、CATレポーター遺伝子をコードす
る。
AGCTTGACACAGTGTTG-3’および5’-GACATACTGCTGAGGATGTC-3’ （CODON Genetic
Systems、 Weiden,、Austria）を用いる逆PCR（Ochmanら、1988、Genetics 120
：621-623）で、T3 RNAポリメラーゼプロモーターおよびBpuAI制限部位が両端に
隣接するPR8ウイルスの完全NS遺伝子を含むpPUC19-T3/NS PRR8を増幅した。この
ようにして得られたNS1遺伝子を欠失したcDNAをリン酸化し、クレノウ処理し、
自己連結した後、大腸菌株TG1中で増殖させた。精製後得られた構築物をpT3de1N
S1と名づけ、配列決定により確認した。PR8ウイルスのNP、PB1、PB2、およびPA
タンパク質の発現用のプラスミド（pHMG- NP、pHMG- PB1、pHMG- PB2、およびpH
MG- PA）については、すでに記載されている（Pleschkaら、1996、J. Virol. 70
：4188-4192）。インフルエンザA/WSN/33（WSN）ウイルスのNS遺伝子のコード領
域に由来するRT-PCR産物内の、pPOLI-CAT-RT（Pleschkaら、1996、J. Virol. 70
：4188-4192）のCATオープンリーディングフレームを置換することにより、pPOL
I-NS-RBを調製した。このプラスミドは、切断型ヒトポリメラーゼＩプロモータ
ーの制御下でWSNウイルスのNS特異的ウイルスRNAセグメントを発現する。pHISG5
4-1-CAT（Bluyssenら、1994、Eur. J. Biochem. 220：395-402）は、ISG-54K遺
伝子のIFNα刺激プロモーターの転写制御下で、CATレポーター遺伝子をコードす
る。
【００６０】 トランスフェクタントウイルスの作製： delNS1ウイルスの作製は、リボ核タ
ンパク質（RNP）トランスフェクションにより実施した（Luytijesら、1989、Cel
l 59：1107-1113）。RPNは、インフルエンザ25A-1ウイルスの精製された核タン
パク質およびポリメラーゼの存在下で、BpuAIで線状化されたpT3delNS1からのT3
RNAポリメラーゼ転写により形成される（Enamiら、1991、J. Virol 65：2711-27
13）。RNP複合体を、予め25A-1ウイルスを感染させたベロ細胞にトランスフェク
ションした。トランスフェクションした細胞を、37℃で18時間インキュベートし
、次に、上清をベロ細胞中で40℃で2回継代させた後、寒天オーバーレイ培地で
被覆したベロ細胞において37℃で3回プラーク精製した．単離したdelNS1ウイル
スをRT-PCRによって分析した。尚、このRT-PCRは、プライマー：5’-GGCCTCTAGA
TAATACGACTC−ACTATAAGCAAAAGCAGGGTGACAAAG-3’（NS遺伝子の3’非コード末端
での位置１〜21に相補的）および5’-GATCGCCTTCTATTAGTAGAAA-CAAGGGTGTTTTTAT
TAAATAAGCTG-3’（ NS遺伝子の５’非コード末端の最後の38ヌクレオチドを含む
）を用いている。NS/WSNトランスフェクタントウイルスを次のように作製した。
35mm皿中のベロ細胞を、以前の記載（Pleschkaら、1996、J. Virol.. 70：4188-
4192）と同様に、プラスミド：pHMG-NP、pHMG-PB1、pHMG-PB2、pHMG-PAおよびpP
OLI-NS-RBでトランスフェクションした。トランスフェクションから2日後、細胞
に５ｘ104pfuのdelNS1ウイルスを感染させ、37℃でさらに2日間インキュベート
した。細胞の上清をMDCK細胞中で1回、さらに、孵化鶏卵中で2回継代させた。ト
ランスフェクタントウイルスを卵の希釈を制限することによりクローン化した。
精製されたNS/WSNトランスフェクタントウイルスからのゲノムRNAを、以前の記
載（Zhengら、1996、Virology 217：242-251）と同様に、ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動により分析した。
ンパク質（RNP）トランスフェクションにより実施した（Luytijesら、1989、Cel
l 59：1107-1113）。RPNは、インフルエンザ25A-1ウイルスの精製された核タン
パク質およびポリメラーゼの存在下で、BpuAIで線状化されたpT3delNS1からのT3
RNAポリメラーゼ転写により形成される（Enamiら、1991、J. Virol 65：2711-27
13）。RNP複合体を、予め25A-1ウイルスを感染させたベロ細胞にトランスフェク
ションした。トランスフェクションした細胞を、37℃で18時間インキュベートし
、次に、上清をベロ細胞中で40℃で2回継代させた後、寒天オーバーレイ培地で
被覆したベロ細胞において37℃で3回プラーク精製した．単離したdelNS1ウイル
スをRT-PCRによって分析した。尚、このRT-PCRは、プライマー：5’-GGCCTCTAGA
TAATACGACTC−ACTATAAGCAAAAGCAGGGTGACAAAG-3’（NS遺伝子の3’非コード末端
での位置１〜21に相補的）および5’-GATCGCCTTCTATTAGTAGAAA-CAAGGGTGTTTTTAT
TAAATAAGCTG-3’（ NS遺伝子の５’非コード末端の最後の38ヌクレオチドを含む
）を用いている。NS/WSNトランスフェクタントウイルスを次のように作製した。
35mm皿中のベロ細胞を、以前の記載（Pleschkaら、1996、J. Virol.. 70：4188-
4192）と同様に、プラスミド：pHMG-NP、pHMG-PB1、pHMG-PB2、pHMG-PAおよびpP
OLI-NS-RBでトランスフェクションした。トランスフェクションから2日後、細胞
に５ｘ104pfuのdelNS1ウイルスを感染させ、37℃でさらに2日間インキュベート
した。細胞の上清をMDCK細胞中で1回、さらに、孵化鶏卵中で2回継代させた。ト
ランスフェクタントウイルスを卵の希釈を制限することによりクローン化した。
精製されたNS/WSNトランスフェクタントウイルスからのゲノムRNAを、以前の記
載（Zhengら、1996、Virology 217：242-251）と同様に、ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動により分析した。
【００６１】 感染細胞におけるウイルスタンパク質合成の分析： 35mm皿中の細胞単層に、
２ｘ104pfuのdellNS1ウイルスを感染させた。感染後に時間をおいて、表示した
時間について、L-[35S]システインおよびL-[35S]メチオニンで、細胞を標識した
。標識した細胞を、150mM NaCl、５mM EDTA、１mM PMSF、10％グリセロール、１
％トリトンX-100、１％デオキシコール酸ナトリウムおよび0.1％ドデシル硫酸ナ
トリウム（SDS）を含有する10mM トリスHCｌ（ｐH 7.4）中で溶解させた。ウサ
ギのポリクロナール抗インフルエンザウイルス血清を用いて、タンパク質を免疫
沈降させた。免疫沈降させたタンパク質を、SDS-10％ポリアクリルアミドゲル電
気泳動（SDS-PAGE）により分析した。
２ｘ104pfuのdellNS1ウイルスを感染させた。感染後に時間をおいて、表示した
時間について、L-[35S]システインおよびL-[35S]メチオニンで、細胞を標識した
。標識した細胞を、150mM NaCl、５mM EDTA、１mM PMSF、10％グリセロール、１
％トリトンX-100、１％デオキシコール酸ナトリウムおよび0.1％ドデシル硫酸ナ
トリウム（SDS）を含有する10mM トリスHCｌ（ｐH 7.4）中で溶解させた。ウサ
ギのポリクロナール抗インフルエンザウイルス血清を用いて、タンパク質を免疫
沈降させた。免疫沈降させたタンパク質を、SDS-10％ポリアクリルアミドゲル電
気泳動（SDS-PAGE）により分析した。
【００６２】 CATトランスフェクション： 35-mm皿中の293細胞単層を、DOTAPリポフェクシ
ョン試薬（Boehringer Mannheim）を用いて、製造者の指示に従って、１μgのpH
ISG54-1-CATでトランスフェクションした後、37℃でインキュベートした。トラ
ンスフェクションから1日後の細胞に、指示された感染多重度（MOI）で、delNS1
ウイルスまたはPR8ウイルスを感染させた。対照として、細胞を擬似感染させる
か、あるいは、50μgのポリ（I-C）でトランスフェクションさせた。37℃でさら
に1日放置した後、細胞抽出物を調製し、記載されている（Percyら、1994、J. V
irol. 68：4486-4492）ように、CAT活性について検定した。
ョン試薬（Boehringer Mannheim）を用いて、製造者の指示に従って、１μgのpH
ISG54-1-CATでトランスフェクションした後、37℃でインキュベートした。トラ
ンスフェクションから1日後の細胞に、指示された感染多重度（MOI）で、delNS1
ウイルスまたはPR8ウイルスを感染させた。対照として、細胞を擬似感染させる
か、あるいは、50μgのポリ（I-C）でトランスフェクションさせた。37℃でさら
に1日放置した後、細胞抽出物を調製し、記載されている（Percyら、1994、J. V
irol. 68：4486-4492）ように、CAT活性について検定した。
【００６３】 ７．実施例：NS1遺伝子を欠失したトランスフェクタントインフルエンザウイル
スdelNS1の作製 Ａ型インフルエンザウイルスのNS特異的ウイルスRNAセグメントは、NS1および
NEP（核輸出タンパク質）タンパク質の両方をコードする。スプライシングされ
ていないNS特異的mRNAは、NS1タンパク質に翻訳されるが、スプライシングされ
たRNAはNEPの合成を命令する。インフルエンザPR8ウイルスからの突然変異NS遺
伝子を発現するプラスミドpT3delNS1を構築した。この突然変異RNAセグメントは
、NS1特異的オープンリーディングフレーム（PR8 NS遺伝子のヌクレオチド位置5
7〜528（Baezら、1980、Nucleic Acids Res. 8：5845-5858））の欠失を含み、
従って、これは、NEPだけをコードする（図1）。ts 25A-1ヘルパーウイルスを用
いたdelNS1遺伝子のRNPトランスフェクションによって、子孫ウイルスが得られ
たが、この子孫ウイルスは、ベロ細胞において40℃で増殖することができた。レ
スキューされたウイルスのNS遺伝子のRT-PCRによる増幅で、上記ヘルパーウイル
スのNS遺伝子の、トランスフェクションされたdelNS1遺伝子に由来するNS遺伝子
による置換を確認した（図２）。
スdelNS1の作製 Ａ型インフルエンザウイルスのNS特異的ウイルスRNAセグメントは、NS1および
NEP（核輸出タンパク質）タンパク質の両方をコードする。スプライシングされ
ていないNS特異的mRNAは、NS1タンパク質に翻訳されるが、スプライシングされ
たRNAはNEPの合成を命令する。インフルエンザPR8ウイルスからの突然変異NS遺
伝子を発現するプラスミドpT3delNS1を構築した。この突然変異RNAセグメントは
、NS1特異的オープンリーディングフレーム（PR8 NS遺伝子のヌクレオチド位置5
7〜528（Baezら、1980、Nucleic Acids Res. 8：5845-5858））の欠失を含み、
従って、これは、NEPだけをコードする（図1）。ts 25A-1ヘルパーウイルスを用
いたdelNS1遺伝子のRNPトランスフェクションによって、子孫ウイルスが得られ
たが、この子孫ウイルスは、ベロ細胞において40℃で増殖することができた。レ
スキューされたウイルスのNS遺伝子のRT-PCRによる増幅で、上記ヘルパーウイル
スのNS遺伝子の、トランスフェクションされたdelNS1遺伝子に由来するNS遺伝子
による置換を確認した（図２）。
【００６４】 ８．実施例：組織培養および卵におけるdelNS1ウイルスの増殖特性 delNS1ウイルスおよび野生型PR8ウイルスの増殖特性を、ベロ細胞、MDCK細胞
、ならびに10日齢の孵化鶏卵において比較した。約106個のベロ細胞またはMDCK
細胞を含む細胞単層に、約0.0005のMOIで、delNS1ウイルスまたはPR8ウイルスを
感染させた。１μg／mlのトリプシンを含むMEMを用いて、37℃で4日間インキュ
ベートした後、上清を赤血球凝集反応アッセイに使用した。これ以外に、10日齢
の孵化鶏卵の尿膜腔に、104pfuのdelNS1またはPR8ウイルスを注入し、37℃で3日
間インキュベートした後、尿膜腔液中の赤血球凝集反応力価を測定した。表２に
示すように、野生型PR8ウイルスの128の力価と比較して、delNS1ウイルスは、16
の力価までベロ細胞中で増殖することができた。しかし、delNS1ウイルス複製は
、MDCK細胞および鶏卵では甚だしく損なわれた（これらのサンプルでは、赤血球
凝集反応力価は測定不可能であった）。
、ならびに10日齢の孵化鶏卵において比較した。約106個のベロ細胞またはMDCK
細胞を含む細胞単層に、約0.0005のMOIで、delNS1ウイルスまたはPR8ウイルスを
感染させた。１μg／mlのトリプシンを含むMEMを用いて、37℃で4日間インキュ
ベートした後、上清を赤血球凝集反応アッセイに使用した。これ以外に、10日齢
の孵化鶏卵の尿膜腔に、104pfuのdelNS1またはPR8ウイルスを注入し、37℃で3日
間インキュベートした後、尿膜腔液中の赤血球凝集反応力価を測定した。表２に
示すように、野生型PR8ウイルスの128の力価と比較して、delNS1ウイルスは、16
の力価までベロ細胞中で増殖することができた。しかし、delNS1ウイルス複製は
、MDCK細胞および鶏卵では甚だしく損なわれた（これらのサンプルでは、赤血球
凝集反応力価は測定不可能であった）。
【００６５】 表２組織培養細胞および鶏卵におけるdelNS1ウイルス複製 赤血球凝集反応力価1 培地 delNS1 WT PR82 ベロ細胞 16 128 MDCK細胞 ＞２ 512 鶏卵 ＞２ 2,048 1：力価は、赤血球凝集反応活性を有する最大希釈度を示す。
【００６６】 2：野生型Ａ型インフルエンザ/PR/8/34ウイルス
【００６７】 8.1. delNS1の増殖特性は、NS1遺伝子の欠失に依る MDCK細胞および鶏卵におけるdelNS1ウイルスのウイルス増殖欠損が、NS1遺伝
子の欠失によるものであって、delNS1およびPR8ウイルスの他のRNAセグメントに
存在し得る相違によるものではないことを証明するために、野生型NS遺伝子をレ
スキューするためのヘルパーウイルスとしてdelNS1ウイルスを用いた。トランス
フェクションは、インフルエンザA/WSN/34ウイルスの野生型NS遺伝子用の、プラ
スミドに基づく発現系を用いる「材料および方法」（Pleschkaら、1996、J. Vir
ol. 70：4188-4192）に記載されている通りに実施した。トランスフェクタントN
S/WSNウイルスの選択は、MDCK細胞および鶏卵中における連続的継代により実施
した。NS/WSNウイルス由来の精製ウイルスRNAのSDS-PAGE分析により、そのNS RN
Aセグメントの野生型の長さを確認した。WSNウイルス由来のNS RNAセグメントと
、delNS1（PR8）ウイルス由来の残存セグメントを含むトランスフェクタントNS/
WSNウイルスは、MDCK細胞および10日齢の孵化鶏卵中の野生型PR8ウイルスと同じ
力価まで増殖することができた。
子の欠失によるものであって、delNS1およびPR8ウイルスの他のRNAセグメントに
存在し得る相違によるものではないことを証明するために、野生型NS遺伝子をレ
スキューするためのヘルパーウイルスとしてdelNS1ウイルスを用いた。トランス
フェクションは、インフルエンザA/WSN/34ウイルスの野生型NS遺伝子用の、プラ
スミドに基づく発現系を用いる「材料および方法」（Pleschkaら、1996、J. Vir
ol. 70：4188-4192）に記載されている通りに実施した。トランスフェクタントN
S/WSNウイルスの選択は、MDCK細胞および鶏卵中における連続的継代により実施
した。NS/WSNウイルス由来の精製ウイルスRNAのSDS-PAGE分析により、そのNS RN
Aセグメントの野生型の長さを確認した。WSNウイルス由来のNS RNAセグメントと
、delNS1（PR8）ウイルス由来の残存セグメントを含むトランスフェクタントNS/
WSNウイルスは、MDCK細胞および10日齢の孵化鶏卵中の野生型PR8ウイルスと同じ
力価まで増殖することができた。
【００６８】 8.2. delNS1ウイルス感染MDCKおよびベロ細胞におけるウイルスタンパク質発現
レベル delNS1ウイルス複製MDCK細胞の欠損が、ウイルスタンパク質の発現レベルの減
少と相関するかどうかを調べるために、［35S］標識実験を実施した。MDCKまた
はベロ細胞に、MOI：0.02でdelNS1ウイルスを感染させ、表示された時間につい
て、L-［35S］システインおよびL-［35S］メチオニンで標識した。標識の後、ウ
イルスタンパク質を細胞抽出物から免疫沈降させ、PAGEにより分離した（図3）
。35Sシグナルの数量化から、感染したMDCK細胞によって、約20倍少ないウイル
スタンパク質が合成されたことがわかった。
レベル delNS1ウイルス複製MDCK細胞の欠損が、ウイルスタンパク質の発現レベルの減
少と相関するかどうかを調べるために、［35S］標識実験を実施した。MDCKまた
はベロ細胞に、MOI：0.02でdelNS1ウイルスを感染させ、表示された時間につい
て、L-［35S］システインおよびL-［35S］メチオニンで標識した。標識の後、ウ
イルスタンパク質を細胞抽出物から免疫沈降させ、PAGEにより分離した（図3）
。35Sシグナルの数量化から、感染したMDCK細胞によって、約20倍少ないウイル
スタンパク質が合成されたことがわかった。
【００６９】 8.3. delNS1ウイルス感染ベロ細胞およびIFNαR-/-細胞は、ウイルスタンパク
質の発現レベルが類似している delNS1ウイルス複製およびウイルスタンパク質発現の支持に関する、ベロ細胞
およびMDCK細胞間の相違の理由は、ベロ細胞にIFNを合成する能力がないことに
関すると思われる（Desmyterら、1968、J. Virol. 2：955-961；Moscaら、1986
、Mol. Cell. Biol. 6：2279-2283；Diazら、1988、Proc. NeH、Acad. Sci. USA
85：52595263）。この仮説を試験するために、IFNに応答することができないマ
ウス細胞株で、ウイルスタンパク質発現のパターンを調べた。IFNαRノックアウ
ト細胞に、MOI：0.02でdelNS1ウイルスを感染させ、前述と同様に標識した。対
照として、delNS1ウイルス感染ベロ細胞を、感染後８〜10時間後に、同時に標識
した。ウイルスタンパク質の発現レベルは、両細胞株で類似しており（図4）、d
elNS1ウイルスが、IFN欠損系において複製できることを示していた。ここで、IF
NαR -/-細胞におけるdelNS1ウイルスの多サイクル複製の調査ができなかったこ
とに留意されたい。これは、これらの細胞が、ウイルスの赤血球凝集素活性化お
よびウイルス感染力に必要なトリプシンの存在下ですぐに死んでしまうためであ
る。
質の発現レベルが類似している delNS1ウイルス複製およびウイルスタンパク質発現の支持に関する、ベロ細胞
およびMDCK細胞間の相違の理由は、ベロ細胞にIFNを合成する能力がないことに
関すると思われる（Desmyterら、1968、J. Virol. 2：955-961；Moscaら、1986
、Mol. Cell. Biol. 6：2279-2283；Diazら、1988、Proc. NeH、Acad. Sci. USA
85：52595263）。この仮説を試験するために、IFNに応答することができないマ
ウス細胞株で、ウイルスタンパク質発現のパターンを調べた。IFNαRノックアウ
ト細胞に、MOI：0.02でdelNS1ウイルスを感染させ、前述と同様に標識した。対
照として、delNS1ウイルス感染ベロ細胞を、感染後８〜10時間後に、同時に標識
した。ウイルスタンパク質の発現レベルは、両細胞株で類似しており（図4）、d
elNS1ウイルスが、IFN欠損系において複製できることを示していた。ここで、IF
NαR -/-細胞におけるdelNS1ウイルスの多サイクル複製の調査ができなかったこ
とに留意されたい。これは、これらの細胞が、ウイルスの赤血球凝集素活性化お
よびウイルス感染力に必要なトリプシンの存在下ですぐに死んでしまうためであ
る。
【００７０】 ９．実施例：デルタNS1ウイルスは、インターフェロン応答の潜在的誘導物質で
ある トランスフェクタントdelNS1ウイルスの感染による、IFN調節プロモーターか
らの転写の刺激。delNS1ウイルスにおけるNS1遺伝子の欠失により、感染細胞に
増強されたIFN応答が起こるかどうかを調べるために、pHISG54-1-CATを用いて、
トランスフェクション実験を実施した。このプラスミドは、ISG-54K遺伝子のIFN
α刺激プロモーターの前端にCATレポーター遺伝子を含む（Bluyssenら、1994、E
ur. J. Biochem. 220：395-402）。293細胞をpHISG54-1-CATでトランスフェクシ
ョンし、「材料および方法」で記載したように、表示したMOIで、delNS1ウイル
スまたは野生型PR8を感染させた。感染細胞抽出物のCAT活性を、感染していない
細胞の抽出物のそれと比較した。陽性対照として、IFN調節プロモーターからの
転写を、ポリ（I-C）で刺激した。図5に示すように、野生型ウイルスではなく、
delNS1ウイルスによるMOI：0.05の感染は、約6倍のレポーター遺伝子発現の刺激
を誘導した。従って、NS1遺伝子を欠失したトランスフェクタントウイルスは、2
93感染細胞におけるIFN応答を阻害する能力が欠損していた。
ある トランスフェクタントdelNS1ウイルスの感染による、IFN調節プロモーターか
らの転写の刺激。delNS1ウイルスにおけるNS1遺伝子の欠失により、感染細胞に
増強されたIFN応答が起こるかどうかを調べるために、pHISG54-1-CATを用いて、
トランスフェクション実験を実施した。このプラスミドは、ISG-54K遺伝子のIFN
α刺激プロモーターの前端にCATレポーター遺伝子を含む（Bluyssenら、1994、E
ur. J. Biochem. 220：395-402）。293細胞をpHISG54-1-CATでトランスフェクシ
ョンし、「材料および方法」で記載したように、表示したMOIで、delNS1ウイル
スまたは野生型PR8を感染させた。感染細胞抽出物のCAT活性を、感染していない
細胞の抽出物のそれと比較した。陽性対照として、IFN調節プロモーターからの
転写を、ポリ（I-C）で刺激した。図5に示すように、野生型ウイルスではなく、
delNS1ウイルスによるMOI：0.05の感染は、約6倍のレポーター遺伝子発現の刺激
を誘導した。従って、NS1遺伝子を欠失したトランスフェクタントウイルスは、2
93感染細胞におけるIFN応答を阻害する能力が欠損していた。
【００７１】 10．実施例：デルタNS1ウイルスの病原性 トランスフェクタントdelNS1ウイルスは、STAT1-/-マウスにおいて病原性であ
る。delNS1ウイルスの、野生型マウスおよびIFN応答が欠失したマウスにおいて
、複製して疾病を誘発する能力を調べた。この目的のために、５ｘ104pfuのdelN
S1ウイルスを用いて、3匹のC57BL/6変異マウスに鼻腔内(i.n.)感染させた。これ
らのマウスは、IFNシグナル化に必要なトランスアクチベーターであるSTAT1の標
的欠失について、ホモ接合である（Durbinら、1996、Cell 84：443-450；Merez
ら、1996、Cell 84：431-442）。また、３〜4匹の野生型C57BL/6およびBALB/cマ
ウスにもdelNS1ウイルスを接種した。感染した-STAT-/-マウスは、感染から３日
後にはぐったりとしてきた。感染から7日までには、3匹の感染した-STAT-/-マウ
スすべてが死んだ（表３）。delNS1ウイルスを、瀕死の-STAT-/-マウスの肺から
回収したが、これは、このウイルスが、これらの動物において複製していたこと
を示している。しかし、野生型の感染マウスは、delNS1ウイルスの感染にもかか
わらず、何の疾病症状を現すこともなく、すべて生存した（表３）。
る。delNS1ウイルスの、野生型マウスおよびIFN応答が欠失したマウスにおいて
、複製して疾病を誘発する能力を調べた。この目的のために、５ｘ104pfuのdelN
S1ウイルスを用いて、3匹のC57BL/6変異マウスに鼻腔内(i.n.)感染させた。これ
らのマウスは、IFNシグナル化に必要なトランスアクチベーターであるSTAT1の標
的欠失について、ホモ接合である（Durbinら、1996、Cell 84：443-450；Merez
ら、1996、Cell 84：431-442）。また、３〜4匹の野生型C57BL/6およびBALB/cマ
ウスにもdelNS1ウイルスを接種した。感染した-STAT-/-マウスは、感染から３日
後にはぐったりとしてきた。感染から7日までには、3匹の感染した-STAT-/-マウ
スすべてが死んだ（表３）。delNS1ウイルスを、瀕死の-STAT-/-マウスの肺から
回収したが、これは、このウイルスが、これらの動物において複製していたこと
を示している。しかし、野生型の感染マウスは、delNS1ウイルスの感染にもかか
わらず、何の疾病症状を現すこともなく、すべて生存した（表３）。
【００７２】 表３ delNS1ウイルス感染１後の生存マウス数 感染からの日数 マウス 1日 ７日 14日 STAT1-/- C57BL/6 ３匹のうち３匹 ３匹のうち０匹 ３匹のうち０匹 野生型 C57BL/6 ３匹のうち３匹 ３匹のうち３匹 ３匹のうち３匹 野生型 BALB/c ４匹のうち4匹 4匹のうち4匹 ４匹のうち４匹 1：エーテル麻酔下のマウスに、５ｘ104pfu のdelNS1ウイルスを鼻腔内接種した
。
。
【００７３】 11．実施例：delNS1ウイルスの前接種はインフルエンザの複製を阻害する delNS1ウイルスの前接種が、野生型インフルエンザの感染もしくは複製に抑制
効果を及ぼすかどうかを調べるために、次の実験を実施した。
効果を及ぼすかどうかを調べるために、次の実験を実施した。
【００７４】 この実験では、10日齢の孵化鶏卵に、20,000 pfu のdelNS1ウイルスを接種す
るか、あるいは、尿膜腔にPBSを接種した。37℃での8時間のインキュベーション
後、さらに、これら鶏卵に、103pfuのH1N1Ａ型インフルエンザ/WSN/33（WSN）；
H1N1Ａ型インフルエンザ/PR/8ウイルス（PR8）、H3N2Ａ型インフルエンザ/X-31
ウイルス（X-31）、Ｂ型インフルエンザ/Lee/40ウイルス（B-Lee）またはSendai
ウイルスを感染させた後、37℃で40時間さらにインキュベートした。ただし、B-
Lee感染細胞は、35℃でインキュベートした。図６に示すように、delNS1ウイル
スで処理した鶏卵のウイルス感染は、非処理の細胞と比較して、検出不可能なレ
ベルとなっている。従って、delNS1ウイルスの抗ウイルス活性、ならびに、抗ウ
イルス治療薬および予防薬としてのその可能性が示されている。
るか、あるいは、尿膜腔にPBSを接種した。37℃での8時間のインキュベーション
後、さらに、これら鶏卵に、103pfuのH1N1Ａ型インフルエンザ/WSN/33（WSN）；
H1N1Ａ型インフルエンザ/PR/8ウイルス（PR8）、H3N2Ａ型インフルエンザ/X-31
ウイルス（X-31）、Ｂ型インフルエンザ/Lee/40ウイルス（B-Lee）またはSendai
ウイルスを感染させた後、37℃で40時間さらにインキュベートした。ただし、B-
Lee感染細胞は、35℃でインキュベートした。図６に示すように、delNS1ウイル
スで処理した鶏卵のウイルス感染は、非処理の細胞と比較して、検出不可能なレ
ベルとなっている。従って、delNS1ウイルスの抗ウイルス活性、ならびに、抗ウ
イルス治療薬および予防薬としてのその可能性が示されている。
【００７５】 本発明は、本発明の個々の態様を説明するためだけに記載した具体的実施形態
によってその範囲が限定されることはなく、また、機能的に同等のあらゆる構築
物またはウイルスが、本発明の範囲に含まれる。実際、ここに示し、説明したも
の以外にも、本発明の多様な変更が、以上の説明および添付の図面から、当業者
には明らかとなるであろう。このような変更は、添付の請求の範囲に含まれるも
のとする。
によってその範囲が限定されることはなく、また、機能的に同等のあらゆる構築
物またはウイルスが、本発明の範囲に含まれる。実際、ここに示し、説明したも
の以外にも、本発明の多様な変更が、以上の説明および添付の図面から、当業者
には明らかとなるであろう。このような変更は、添付の請求の範囲に含まれるも
のとする。
【００７６】 ここに、様々な参照文献を引用したが、その開示内容の全文を参照として本明
細書に組み込むものとする。
細書に組み込むものとする。
【図１】 図1は、(A)野生型インフルエンザA/PR/9/34ウイルス(WT NS)および(B)トラン
スフェクタントdelNS1インフルエンザウイルスのNS遺伝子とNS特異的mRNAの概略
図である。ゲノムRNAセグメントは黒い四角でふちどった白いボックスとして表
す。後方の四角部分は遺伝子の非コード領域を示す。NS特異的mRNAも示す。mRNA
末端の細い線は非翻訳領域を示す。mRNAの5'キャップ構造(黒丸)およびポリ(A)
テールが示されている。NS1タンパク質のオープンリーディングフレームは灰色
のボックスとして示す。特異的NEP (核輸出タンパク質;Nuclear Export Protein
)オープンリーディングフレームは斜線つきボックスで示す。野生型NS遺伝子に
由来するNEP mRNAは、V型ラインで示すように、NS1 mRNAのスプライシング産物
である。
スフェクタントdelNS1インフルエンザウイルスのNS遺伝子とNS特異的mRNAの概略
図である。ゲノムRNAセグメントは黒い四角でふちどった白いボックスとして表
す。後方の四角部分は遺伝子の非コード領域を示す。NS特異的mRNAも示す。mRNA
末端の細い線は非翻訳領域を示す。mRNAの5'キャップ構造(黒丸)およびポリ(A)
テールが示されている。NS1タンパク質のオープンリーディングフレームは灰色
のボックスとして示す。特異的NEP (核輸出タンパク質;Nuclear Export Protein
)オープンリーディングフレームは斜線つきボックスで示す。野生型NS遺伝子に
由来するNEP mRNAは、V型ラインで示すように、NS1 mRNAのスプライシング産物
である。
【図２】 図2は、delNS1トランスフェクタントウイルスのNS RNAセグメントのRT-PCR分
析を示す。精製インフルエンザA/PR/8/33ウイルス(wt)またはdelNS1ウイルス(de
lNS1)由来のNSウイルスRNAを、第6節に記載のオリゴヌクレオチドプライマーを
用いた逆転写-PCRの組み合わせにより増幅した。PCR産物を2%アガロースゲルで
泳動し、臭化エチジウムにより染色した。サイズマーカーの位置を右側に示す。
析を示す。精製インフルエンザA/PR/8/33ウイルス(wt)またはdelNS1ウイルス(de
lNS1)由来のNSウイルスRNAを、第6節に記載のオリゴヌクレオチドプライマーを
用いた逆転写-PCRの組み合わせにより増幅した。PCR産物を2%アガロースゲルで
泳動し、臭化エチジウムにより染色した。サイズマーカーの位置を右側に示す。
【図３】 図3は、delNS1ウイルスに感染した(A)ベロ細胞および(B)MDCK細胞のタンパク
質発現を示す。細胞をMOI 0.02でdelNS1ウイルスに感染させ、指示時点において
[32S]標識を行い、ウイルスタンパク質の全体量を、インフルエンザウイルスに
対するポリクローナル抗血清を用いて免疫沈降させた。免疫沈降生成物はSDS-PA
GEにより分析した。主な構造ウイルスタンパク質である、赤血球凝集素(HA)、核
タンパク質(NP)、ノイラミニダーゼ(NA)およびマトリックスタンパク質(M1)を矢
印で示す。分子サイズマーカーは左側に示す。
質発現を示す。細胞をMOI 0.02でdelNS1ウイルスに感染させ、指示時点において
[32S]標識を行い、ウイルスタンパク質の全体量を、インフルエンザウイルスに
対するポリクローナル抗血清を用いて免疫沈降させた。免疫沈降生成物はSDS-PA
GEにより分析した。主な構造ウイルスタンパク質である、赤血球凝集素(HA)、核
タンパク質(NP)、ノイラミニダーゼ(NA)およびマトリックスタンパク質(M1)を矢
印で示す。分子サイズマーカーは左側に示す。
【図４】 図4は、delNS1ウイルス感染IFNαR-/-細胞におけるタンパク質発現を示す。細
胞は細胞をMOI 0.02でdelNS1ウイルスに感染させ、指示時点において[32S]標識
を行った。対照として、感染の8〜10時間後の同じ実験においてdelNS1ウイルス
感染ベロ細胞を標識した。ウイルスタンパク質の全体量を、インフルエンザウイ
ルスに対するポリクローナル抗血清を用いて免疫沈降させた。免疫沈降生成物は
SDS-PAGEにより分析した。主な構造ウイルスタンパク質である、赤血球凝集素(H
A)、核タンパク質(NP)、ノイラミニダーゼ(NA)およびマトリックスタンパク質(M
1)を矢印で示す。分子サイズマーカーは左側に示した。
胞は細胞をMOI 0.02でdelNS1ウイルスに感染させ、指示時点において[32S]標識
を行った。対照として、感染の8〜10時間後の同じ実験においてdelNS1ウイルス
感染ベロ細胞を標識した。ウイルスタンパク質の全体量を、インフルエンザウイ
ルスに対するポリクローナル抗血清を用いて免疫沈降させた。免疫沈降生成物は
SDS-PAGEにより分析した。主な構造ウイルスタンパク質である、赤血球凝集素(H
A)、核タンパク質(NP)、ノイラミニダーゼ(NA)およびマトリックスタンパク質(M
1)を矢印で示す。分子サイズマーカーは左側に示した。
【図５】 図5は、delNS1ウイルス感染によるIFN刺激プロモーターからの転写誘導を示す
。I型IFN刺激プロモーターの制御下、レポーター遺伝子CATをコードするプラス
ミドpHISGS4-1-CATで239細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの
1日後、細胞をdsRNA 50μgでトランスフェクトするか、または指定の各MOIでdel
NS1ウイルスかもしくは野生型インフルエンザA/PR/8/34ウイルス(wt)に感染させ
た。感染後1日たってから細胞抽出液でCAT活性を測定した。異なる処理後のCAT
活性刺激を示す。
。I型IFN刺激プロモーターの制御下、レポーター遺伝子CATをコードするプラス
ミドpHISGS4-1-CATで239細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの
1日後、細胞をdsRNA 50μgでトランスフェクトするか、または指定の各MOIでdel
NS1ウイルスかもしくは野生型インフルエンザA/PR/8/34ウイルス(wt)に感染させ
た。感染後1日たってから細胞抽出液でCAT活性を測定した。異なる処理後のCAT
活性刺激を示す。
【図６】 図6は、delNS1ウイルスによる孵化卵での抗ウイルス応答の誘導を示す。10日
齢の孵化鶏卵に、20,000プラーク形成単位のdelNS1ウイルスまたはPBS(未処置)
を接種した。37℃で8時間インキュベートした後、該鶏卵に再びH1N1インフルエ
ンザA/WSN/33ウイルス(WSN)、H1N1インフルエンザA/PR/8ウイルス(PR8)、H3N2イ
ンフルエンザA/X-31ウイルス(X-31)、インフルエンザB/Lee/40ウイルス(B-Lee)
またはセンダイウイルス(Sendai)を103 pfu感染させた。B-Lee感染卵は35℃でさ
らに40時間インキュベートした。他の卵はすべて37℃でさらに40時間インキュベ
ートした。血球凝集反応アッセイにより尿液に存在するウイルスを滴定した。
齢の孵化鶏卵に、20,000プラーク形成単位のdelNS1ウイルスまたはPBS(未処置)
を接種した。37℃で8時間インキュベートした後、該鶏卵に再びH1N1インフルエ
ンザA/WSN/33ウイルス(WSN)、H1N1インフルエンザA/PR/8ウイルス(PR8)、H3N2イ
ンフルエンザA/X-31ウイルス(X-31)、インフルエンザB/Lee/40ウイルス(B-Lee)
またはセンダイウイルス(Sendai)を103 pfu感染させた。B-Lee感染卵は35℃でさ
らに40時間インキュベートした。他の卵はすべて37℃でさらに40時間インキュベ
ートした。血球凝集反応アッセイにより尿液に存在するウイルスを滴定した。
【手続補正書】
【提出日】平成１３年３月２１日（２００１．３．２１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４２】 この点に関して、インフルエンザは、外来エピトープを作製する理想的な系で
ある。というのは、キメラ型ウイルスを構築するための何千種ものインフルエン
ザウイルス変異体から選択できることが、ワクシニア等の他のウイルスベクター
を使用した場合に発生する宿主耐性もしくは免疫寛容の問題を回避するからであ
る。さらに、インフルエンザは、活発な分泌および細胞障害性Ｔ細胞応答を刺激
することから、インフルエンザバックグラウンドに外来エピトープを提示するこ
とにより、分泌免疫および細胞性免疫をもたらすことも可能である。例えば、イ
ンフルエンザのHAタンパク質に、アミノ酸残基の挿入、欠失または置換を施すこ
とにより、弱毒株を生成することができる。この場合、HAのＢ領域またはＥ領域
への改変を用いてもよい。この手法に従い、Plasmodium yoelii（NEDSYVPSAEQI
）マラリアのエピトープ(ME１)をインフルエンザの赤血球凝集素の抗原部位Ｅに
導入した。得られたキメラ型ウイルスは、マウスで検定した場合、野生型ウイル
スより500〜1,000倍低いLD50（致死量50）を有する。別の実施形態では、1型ポ
リオウイルスの主抗原決定基、すなわち、1型ポリオウイルスのVP1のBCループ（
PASTTNKDKL；配列番号５）をインフルエンザHAタンパク質のＢ領域に導入した。
このキメラ型ウイルスも弱毒化されている。
ある。というのは、キメラ型ウイルスを構築するための何千種ものインフルエン
ザウイルス変異体から選択できることが、ワクシニア等の他のウイルスベクター
を使用した場合に発生する宿主耐性もしくは免疫寛容の問題を回避するからであ
る。さらに、インフルエンザは、活発な分泌および細胞障害性Ｔ細胞応答を刺激
することから、インフルエンザバックグラウンドに外来エピトープを提示するこ
とにより、分泌免疫および細胞性免疫をもたらすことも可能である。例えば、イ
ンフルエンザのHAタンパク質に、アミノ酸残基の挿入、欠失または置換を施すこ
とにより、弱毒株を生成することができる。この場合、HAのＢ領域またはＥ領域
への改変を用いてもよい。この手法に従い、Plasmodium yoelii（NEDSYVPSAEQI
）マラリアのエピトープ(ME１)をインフルエンザの赤血球凝集素の抗原部位Ｅに
導入した。得られたキメラ型ウイルスは、マウスで検定した場合、野生型ウイル
スより500〜1,000倍低いLD50（致死量50）を有する。別の実施形態では、1型ポ
リオウイルスの主抗原決定基、すなわち、1型ポリオウイルスのVP1のBCループ（
PASTTNKDKL；配列番号５）をインフルエンザHAタンパク質のＢ領域に導入した。
このキメラ型ウイルスも弱毒化されている。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５９】 プラスミド： pT3delNS1を次のように作製した。まず、プライマー5'-CTGAAA
GCTTGACACAGTGTTTG-3'（配列番号１）および5'-GACATACTGCTGAGGATGTC-3' （配
列番号２）（CODON Genetic Systems、 Weiden,、Austria）を用いる逆PCR（Och
manら、1988、Genetics 120：621-623）で、T3 RNAポリメラーゼプロモーターお
よびBpuAI制限部位が両端に隣接するPR8ウイルスの完全NS遺伝子を含むpPUC19-T
3/NS PRR8を増幅した。このようにして得られたNS1遺伝子を欠失したcDNAをリン
酸化し、クレノウ処理し、自己連結した後、大腸菌株TG1中で増殖させた。精製
後得られた構築物をpT3de1NS1と名づけ、配列決定により確認した。PR8ウイルス
のNP、PB1、PB2、およびPAタンパク質の発現用のプラスミド（pHMG- NP、pHMG-
PB1、pHMG- PB2、およびpHMG- PA）については、すでに記載されている（Plesch
kaら、1996、J. Virol. 70：4188-4192）。インフルエンザA/WSN/33（WSN）ウイ
ルスのNS遺伝子のコード領域に由来するRT-PCR産物内の、pPOLI-CAT-RT（Plesch
kaら、1996、J. Virol. 70：4188-4192）のCATオープンリーディングフレームを
置換することにより、pPOLI-NS-RBを調製した。このプラスミドは、切断型ヒト
ポリメラーゼＩプロモーターの制御下でWSNウイルスのNS特異的ウイルスRNAセグ
メントを発現する。pHISG54-1-CAT（Bluyssenら、1994、Eur. J. Biochem. 220
：395-402）は、ISG-54K遺伝子のIFNα刺激プロモーターの転写制御下で、CATレ
ポーター遺伝子をコードする。
GCTTGACACAGTGTTTG-3'（配列番号１）および5'-GACATACTGCTGAGGATGTC-3' （配
列番号２）（CODON Genetic Systems、 Weiden,、Austria）を用いる逆PCR（Och
manら、1988、Genetics 120：621-623）で、T3 RNAポリメラーゼプロモーターお
よびBpuAI制限部位が両端に隣接するPR8ウイルスの完全NS遺伝子を含むpPUC19-T
3/NS PRR8を増幅した。このようにして得られたNS1遺伝子を欠失したcDNAをリン
酸化し、クレノウ処理し、自己連結した後、大腸菌株TG1中で増殖させた。精製
後得られた構築物をpT3de1NS1と名づけ、配列決定により確認した。PR8ウイルス
のNP、PB1、PB2、およびPAタンパク質の発現用のプラスミド（pHMG- NP、pHMG-
PB1、pHMG- PB2、およびpHMG- PA）については、すでに記載されている（Plesch
kaら、1996、J. Virol. 70：4188-4192）。インフルエンザA/WSN/33（WSN）ウイ
ルスのNS遺伝子のコード領域に由来するRT-PCR産物内の、pPOLI-CAT-RT（Plesch
kaら、1996、J. Virol. 70：4188-4192）のCATオープンリーディングフレームを
置換することにより、pPOLI-NS-RBを調製した。このプラスミドは、切断型ヒト
ポリメラーゼＩプロモーターの制御下でWSNウイルスのNS特異的ウイルスRNAセグ
メントを発現する。pHISG54-1-CAT（Bluyssenら、1994、Eur. J. Biochem. 220
：395-402）は、ISG-54K遺伝子のIFNα刺激プロモーターの転写制御下で、CATレ
ポーター遺伝子をコードする。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００６０】 トランスフェクタントウイルスの作製： delNS1ウイルスの作製は、リボ核タ
ンパク質（RNP）トランスフェクションにより実施した（Luytijesら、1989、Cel
l 59：1107-1113）。RPNは、インフルエンザ25A-1ウイルスの精製された核タン
パク質およびポリメラーゼの存在下で、BpuAIで線状化されたpT3delNS1からのT3
RNAポリメラーゼ転写により形成される（Enamiら、1991、J. Virol 65：2711-27
13）。RNP複合体を、予め25A-1ウイルスを感染させたベロ細胞にトランスフェク
ションした。トランスフェクションした細胞を、37℃で18時間インキュベートし
、次に、上清をベロ細胞中で40℃で2回継代させた後、寒天オーバーレイ培地で
被覆したベロ細胞において37℃で3回プラーク精製した．単離したdelNS1ウイル
スをRT-PCRによって分析した。尚、このRT-PCRは、プライマー：5'-GGCCTCTAGAT
AATACGACTC−ACTATAAGCAAAAGCAGGGTGACAAAG-3'（NS遺伝子の3'非コード末端での
位置１〜21に相補的；配列番号３）および5'-GATCGCCTTCTATTAGTAGAAA-CAAGGGTG
TTTTTATTAAATAAGCTG-3'（ NS遺伝子の５'非コード末端の最後の38ヌクレオチド
を含む；配列番号４）を用いている。NS/WSNトランスフェクタントウイルスを次
のように作製した。35mm皿中のベロ細胞を、以前の記載（Pleschkaら、1996、J.
Virol.. 70：4188-4192）と同様に、プラスミド：pHMG-NP、pHMG-PB1、pHMG-PB
2、pHMG-PAおよびpPOLI-NS-RBでトランスフェクションした。トランスフェクシ
ョンから2日後、細胞に５ｘ104pfuのdelNS1ウイルスを感染させ、37℃でさらに2
日間インキュベートした。細胞の上清をMDCK細胞中で1回、さらに、孵化鶏卵中
で2回継代させた。トランスフェクタントウイルスを卵の希釈を制限することに
よりクローン化した。精製されたNS/WSNトランスフェクタントウイルスからのゲ
ノムRNAを、以前の記載（Zhengら、1996、Virology 217：242-251）と同様に、
ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。
ンパク質（RNP）トランスフェクションにより実施した（Luytijesら、1989、Cel
l 59：1107-1113）。RPNは、インフルエンザ25A-1ウイルスの精製された核タン
パク質およびポリメラーゼの存在下で、BpuAIで線状化されたpT3delNS1からのT3
RNAポリメラーゼ転写により形成される（Enamiら、1991、J. Virol 65：2711-27
13）。RNP複合体を、予め25A-1ウイルスを感染させたベロ細胞にトランスフェク
ションした。トランスフェクションした細胞を、37℃で18時間インキュベートし
、次に、上清をベロ細胞中で40℃で2回継代させた後、寒天オーバーレイ培地で
被覆したベロ細胞において37℃で3回プラーク精製した．単離したdelNS1ウイル
スをRT-PCRによって分析した。尚、このRT-PCRは、プライマー：5'-GGCCTCTAGAT
AATACGACTC−ACTATAAGCAAAAGCAGGGTGACAAAG-3'（NS遺伝子の3'非コード末端での
位置１〜21に相補的；配列番号３）および5'-GATCGCCTTCTATTAGTAGAAA-CAAGGGTG
TTTTTATTAAATAAGCTG-3'（ NS遺伝子の５'非コード末端の最後の38ヌクレオチド
を含む；配列番号４）を用いている。NS/WSNトランスフェクタントウイルスを次
のように作製した。35mm皿中のベロ細胞を、以前の記載（Pleschkaら、1996、J.
Virol.. 70：4188-4192）と同様に、プラスミド：pHMG-NP、pHMG-PB1、pHMG-PB
2、pHMG-PAおよびpPOLI-NS-RBでトランスフェクションした。トランスフェクシ
ョンから2日後、細胞に５ｘ104pfuのdelNS1ウイルスを感染させ、37℃でさらに2
日間インキュベートした。細胞の上清をMDCK細胞中で1回、さらに、孵化鶏卵中
で2回継代させた。トランスフェクタントウイルスを卵の希釈を制限することに
よりクローン化した。精製されたNS/WSNトランスフェクタントウイルスからのゲ
ノムRNAを、以前の記載（Zhengら、1996、Virology 217：242-251）と同様に、
ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 7/04 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，Ｚ Ｗ (71)出願人 マスター，トーマス アメリカ合衆国 10029−6574 ニューヨ ーク州，ニュー ヨーク，ワン ガステイ ブ レヴィー プレイス (72)発明者 エゴロフ，アンドレジ アメリカ合衆国 10029−6574 ニューヨ ーク州，ニュー ヨーク，ワン ガステイ ブ レヴィー プレイス (72)発明者 マスター，トーマス アメリカ合衆国 10029−6574 ニューヨ ーク州，ニュー ヨーク，ワン ガステイ ブ レヴィー プレイス (72)発明者 ガルシア−サスト−レ，アドルフォ アメリカ合衆国 10128 ニューヨーク州， ニュー ヨーク，イースト 96番 ストリ ート 16，アパートメント ３ジー (72)発明者 パレッサ，ピーター アメリカ合衆国 07605 ニュージャージ ー州，レオニア，ハイウッド アベニュー 414 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA32 CA04 DA02 EA02 HA01 4B065 AA97X AB01 BA02 BA14 CA45 4C085 AA03 BA55 BB01 CC07 CC08 EE01 GG10
Claims (8)
- 【請求項１】 NS1遺伝子セグメントのノックアウトを含む、インターフェ
ロン誘導性表現型を有する遺伝子工学的に作製された弱毒Ａ型インフルエンザウ
イルス。 - 【請求項２】 インターフェロン(IFN)欠損細胞系に感染して、その中で複
製する能力がある、全NS1遺伝子セグメントの欠失を含む遺伝子工学的に作製さ
れた弱毒Ａ型インフルエンザウイルス。 - 【請求項３】 異種配列をさらにコードしている、請求項１または２記載の
弱毒ウイルス。 - 【請求項４】 異種配列がウイルス抗原ペプチドをコードする、請求項３記
載の弱毒ウイルス。 - 【請求項５】 異種配列が腫瘍抗原ペプチドをコードする、請求項３記載の
弱毒ウイルス。 - 【請求項６】 適当な医薬製剤中にNS1遺伝子セグメントの完全な欠失を含
む遺伝子工学的に作製された弱毒Ａ型インフルエンザウイルスを含有するワクチ
ン。 - 【請求項７】 鼻腔内送達用に製剤化されている、請求項６記載のワクチン
。 - 【請求項８】 請求項６記載のワクチンを被験者に投与することを含むワク
チン接種方法。
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|---|---|---|---|
| US8910398P | 1998-06-12 | 1998-06-12 | |
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|---|---|---|---|
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| JP (1) | JP4441595B2 (ja) |
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