JP2003512009A - 組換えニューキャッスル病ウイルスｒｎａの発現系およびワクチン - Google Patents
組換えニューキャッスル病ウイルスｒｎａの発現系およびワクチンInfo
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、異種遺伝子を発現するか、または突然変異したニューキャッスル病ウイルス遺伝子を発現するか、またはニューキャッスル病ウイルスの異種株に由来するウイルス遺伝子の組合せを発現する、遺伝子工学的に操作されたニューキャッスル病ウイルス、およびウイルスベクターに関する。本発明は、組換えマイナス鎖NDVウイルスRNA鋳型の構築、およびその使用に関する。前記RNA鋳型は、適切な宿主細胞において異種遺伝子産物を発現させるために、および/またはウイルス粒子内での異種遺伝子をレスキューするために、ウイルスRNA依存性RNAポリメラーゼと共に使用できる。本発明の特定の実施形態では、異種遺伝子産物は、ヒト免疫不全ウイルスのゲノムに由来するペプチドまたはタンパク質である。本発明のRNA鋳型は、バクテリオファージT7、T3、SP6ポリメラーゼ、または真核生物ポリメラーゼIのようなDNA依存性RNAポリメラーゼのいずれかを用いて、適当なDNA配列を転写することにより調製可能である。
Description
【０００１】
本出願は、その全文を参照により本明細書に組み込まれる、1998年９月１４日
に出願の出願第09/152,845号の一部継続出願である。
に出願の出願第09/152,845号の一部継続出願である。
【０００２】１．発明の分野
本発明は、適切な宿主細胞系における異種遺伝子産物の発現、ならびに/また
は異種遺伝子産物を発現、パッケージング、および/もしくは提示する組換えウ
イルスの構築に使用されうる組換えニューキャッスル病ウイルスRNA鋳型に関す
る。該発現産物およびキメラウイルスはワクチン製剤に有利に使用されうる。ま
た本発明は、遺伝子工学的に操作された、ワクチン製剤への使用に好適な(毒弱
化した表現型または免疫原性の増大など）組換えウイルスを作製する改変および
/または突然変異を含む組換えニューキャッスル病ウイルスにも関する。
は異種遺伝子産物を発現、パッケージング、および/もしくは提示する組換えウ
イルスの構築に使用されうる組換えニューキャッスル病ウイルスRNA鋳型に関す
る。該発現産物およびキメラウイルスはワクチン製剤に有利に使用されうる。ま
た本発明は、遺伝子工学的に操作された、ワクチン製剤への使用に好適な(毒弱
化した表現型または免疫原性の増大など）組換えウイルスを作製する改変および
/または突然変異を含む組換えニューキャッスル病ウイルスにも関する。
【０００３】
本発明は、インターフェロンおよび関連する経路を誘導する組換えニューキャ
ッスル病ウイルスに関する。本発明は、広範な病原体、および/または腫瘍特異
抗原を含む抗原に対する組換えニューキャッスル病ウイルスおよびウイルスベク
ターの使用に関する。本発明は、負の極性の異種遺伝子コード配列を含む組換え
ニューキャッスル病ウイルスRNA鋳型を構築した例によって、実証される。本発
明はさらに、正の極性の異種遺伝子コード配列を含む組換えニューキャッスル病
ウイルスRNA鋳型の構築に関する。係る異種遺伝子配列は、ヒト免疫不全ウイル
ス(HIV)に由来する配列を含む。
ッスル病ウイルスに関する。本発明は、広範な病原体、および/または腫瘍特異
抗原を含む抗原に対する組換えニューキャッスル病ウイルスおよびウイルスベク
ターの使用に関する。本発明は、負の極性の異種遺伝子コード配列を含む組換え
ニューキャッスル病ウイルスRNA鋳型を構築した例によって、実証される。本発
明はさらに、正の極性の異種遺伝子コード配列を含む組換えニューキャッスル病
ウイルスRNA鋳型の構築に関する。係る異種遺伝子配列は、ヒト免疫不全ウイル
ス(HIV)に由来する配列を含む。
【０００４】２．発明の背景
いくつかのDNAウイルスは、宿主細胞系において異種タンパク質を発現するよ
うに遺伝子工学的に操作されてきた（例えば、ワクシニアウイルス、バキュロウ
イルスなど）。最近、プラス鎖RNAウイルス（例えば、ポリオウイルス）を用い
て、同じ様な利点が得られた。これらの構築物の発現産物（つまり異種遺伝子産
物、または異種遺伝子産物を発現するキメラウイルス）は、ワクチン製剤（サブ
ユニットウイルスワクチンまたは完全ウイルスワクチン）に潜在的に有用である
と考えられる。ワクチンに使用する組換えウイルスまたはキメラウイルスの構築
においてワクシニアなどのウイルスを使用することの障害の一つは、その主要な
エピトープに変異形がないことである。このウイルス種の変異形の欠如のために
、キメラワクシニアを繰り返して使用することは厳しく制限される。それは、複
数のワクチン注射で該ウイルス種に対する宿主耐性が生じ、接種したウイルスは
宿主に感染できなくなるからである。そのために、キメラワクシニアによる耐性
の個体への接種は、免疫刺激を誘導しない。
うに遺伝子工学的に操作されてきた（例えば、ワクシニアウイルス、バキュロウ
イルスなど）。最近、プラス鎖RNAウイルス（例えば、ポリオウイルス）を用い
て、同じ様な利点が得られた。これらの構築物の発現産物（つまり異種遺伝子産
物、または異種遺伝子産物を発現するキメラウイルス）は、ワクチン製剤（サブ
ユニットウイルスワクチンまたは完全ウイルスワクチン）に潜在的に有用である
と考えられる。ワクチンに使用する組換えウイルスまたはキメラウイルスの構築
においてワクシニアなどのウイルスを使用することの障害の一つは、その主要な
エピトープに変異形がないことである。このウイルス種の変異形の欠如のために
、キメラワクシニアを繰り返して使用することは厳しく制限される。それは、複
数のワクチン注射で該ウイルス種に対する宿主耐性が生じ、接種したウイルスは
宿主に感染できなくなるからである。そのために、キメラワクシニアによる耐性
の個体への接種は、免疫刺激を誘導しない。
【０００５】
対照的に、マイナス鎖RNAウイルスは、ワクチンに使用するキメラウイルスの
構築について、魅力的な候補であろう。マイナス鎖RNAウイルス（例えばインフ
ルエンザ）は、その広範な遺伝子の可変性が、耐性を生じさせることなく免疫系
を刺激する膨大な種類のワクチン製剤の構築を可能するため望ましい。最近、感
染性組換え体、またはキメラマイナス鎖RNA粒子の構築は、インフルエンザウイ
ルスを用いて達成された(Paleseら、米国特許第5,166,057号、その全文を本明細
書に参照により組み込む）。
構築について、魅力的な候補であろう。マイナス鎖RNAウイルス（例えばインフ
ルエンザ）は、その広範な遺伝子の可変性が、耐性を生じさせることなく免疫系
を刺激する膨大な種類のワクチン製剤の構築を可能するため望ましい。最近、感
染性組換え体、またはキメラマイナス鎖RNA粒子の構築は、インフルエンザウイ
ルスを用いて達成された(Paleseら、米国特許第5,166,057号、その全文を本明細
書に参照により組み込む）。
【０００６】2.1. ニューキャッスル病ウイルス
エンベロープに囲まれたネガティブセンスゲノムの一本鎖RNAを含むウイルス
ファミリーは、非セグメント化ゲノムを有する群（パラミクソウイルス科(Param
yxoviridae)、ラブドウイルス科(Rhabdoviridae)）または、セグメント化ゲノム
を有する群（オルソミクソウイルス科(Orthomyxoviridae)、ブンヤウイルス科(B
unyaviridae)、およびアレナウイルス科(Arenaviridae)）に分類される。本明細
書中で記載および実施例で使用する、パラミクソウイルス科ファミリー（その詳
細については後述する）は、ニューキャッスル病ウイルス(NDV)、パラインフル
エンザウイルス、センダイウイルス、シミアンウイルス５，および流行性耳下炎
ウイルスを含む。
ファミリーは、非セグメント化ゲノムを有する群（パラミクソウイルス科(Param
yxoviridae)、ラブドウイルス科(Rhabdoviridae)）または、セグメント化ゲノム
を有する群（オルソミクソウイルス科(Orthomyxoviridae)、ブンヤウイルス科(B
unyaviridae)、およびアレナウイルス科(Arenaviridae)）に分類される。本明細
書中で記載および実施例で使用する、パラミクソウイルス科ファミリー（その詳
細については後述する）は、ニューキャッスル病ウイルス(NDV)、パラインフル
エンザウイルス、センダイウイルス、シミアンウイルス５，および流行性耳下炎
ウイルスを含む。
【０００７】
ニューキャッスル病ウイルスは、線状一本鎖の非セグメント化ネガティブセン
スRNAゲノムを含有するエンベロープで囲まれたウイルスである。ゲノムRNAは3'
-NP-P-M-F-HN-Lの順に並んだ遺伝子を含有する（さらなる詳細は後述する）。該
ゲノムRNAはまた、3'末端にリーダー配列も含む。
スRNAゲノムを含有するエンベロープで囲まれたウイルスである。ゲノムRNAは3'
-NP-P-M-F-HN-Lの順に並んだ遺伝子を含有する（さらなる詳細は後述する）。該
ゲノムRNAはまた、3'末端にリーダー配列も含む。
【０００８】
ビリオンの構造エレメントは、細胞形質膜由来の脂質二重層であるウイルスエ
ンベロープを含む。糖タンパク質である赤血球凝集素-ノイラミニダーゼ(HN)は
、エンベロープから突き出ており、該ウイルスにヘマグルチニンとノイラミニダ
ーゼ活性の双方の含有を付与する。同じくウイルス膜と相互作用する、融合糖タ
ンパク質(F)は、不活性型前駆体としてまず生産され、その後、翻訳後に切断さ
れてジスルフィド結合した２つのポリペプチドが生成される。活性型Ｆタンパク
質は、ウイルスエンベロープと宿主の細胞形質膜との融合を促進させることによ
りNDVの宿主細胞への侵入に関与している。マトリックスタンパク質（M)は、ウ
イルスの集合に関与しており、ウイルス膜ならびにヌクレオキャプシドタンパク
質の両方と相互作用する。
ンベロープを含む。糖タンパク質である赤血球凝集素-ノイラミニダーゼ(HN)は
、エンベロープから突き出ており、該ウイルスにヘマグルチニンとノイラミニダ
ーゼ活性の双方の含有を付与する。同じくウイルス膜と相互作用する、融合糖タ
ンパク質(F)は、不活性型前駆体としてまず生産され、その後、翻訳後に切断さ
れてジスルフィド結合した２つのポリペプチドが生成される。活性型Ｆタンパク
質は、ウイルスエンベロープと宿主の細胞形質膜との融合を促進させることによ
りNDVの宿主細胞への侵入に関与している。マトリックスタンパク質（M)は、ウ
イルスの集合に関与しており、ウイルス膜ならびにヌクレオキャプシドタンパク
質の両方と相互作用する。
【０００９】
ヌクレオキャプシドの主要なタンパク質サブユニットは、ヌクレオキャプシド
タンパク質(NP)であり、これが該キャプシドを螺旋対称形にする。ＰおよびＬタ
ンパク質は、ヌクレオキャプシドと関係する。リン酸化を受けるリンタンパク質
（P）は、転写において調節的な役割を担っており、メチル化、リン酸化、およ
びポリアデニル化にも関与していると考えられている。Ｌ遺伝子は、RNA依存性R
NAポリメラーゼをコードし、Ｐタンパク質とともにウイルスのRNA合成に必要で
ある。ウイルスゲノムのコード許容量のほぼ半分を占めるＬタンパク質は、ウイ
ルスタンパク質の中で最も大きく、転写および複製の双方において重要な役割を
担っている。
タンパク質(NP)であり、これが該キャプシドを螺旋対称形にする。ＰおよびＬタ
ンパク質は、ヌクレオキャプシドと関係する。リン酸化を受けるリンタンパク質
（P）は、転写において調節的な役割を担っており、メチル化、リン酸化、およ
びポリアデニル化にも関与していると考えられている。Ｌ遺伝子は、RNA依存性R
NAポリメラーゼをコードし、Ｐタンパク質とともにウイルスのRNA合成に必要で
ある。ウイルスゲノムのコード許容量のほぼ半分を占めるＬタンパク質は、ウイ
ルスタンパク質の中で最も大きく、転写および複製の双方において重要な役割を
担っている。
【００１０】
RNAの複製に必要な細胞機構がないので、NDVを含む全てのマイナス鎖RNAウイ
ルスの複製は複雑である。さらに、マイナス鎖ゲノムを、直接タンパク質に翻訳
できず、まずプラス鎖（mRNA）コピーに転写されなければならない。従って、宿
主細胞に侵入した際、ゲノムRNA単独では、必要なRNA依存性RNAポリメラーゼを
合成することができない。Ｌ、Ｐ、およびＮＰタンパク質が、感染時にゲノムに
伴って細胞内に侵入しなければならない。
ルスの複製は複雑である。さらに、マイナス鎖ゲノムを、直接タンパク質に翻訳
できず、まずプラス鎖（mRNA）コピーに転写されなければならない。従って、宿
主細胞に侵入した際、ゲノムRNA単独では、必要なRNA依存性RNAポリメラーゼを
合成することができない。Ｌ、Ｐ、およびＮＰタンパク質が、感染時にゲノムに
伴って細胞内に侵入しなければならない。
【００１１】
ほとんどまたは全ての、NDV mRNAを転写するウイルスタンパク質が、それらの
複製も行うという仮説がある。同じタンパク質の物の代替的な利用（つまり、転
写または複製）を調節する機構は、明確に特定されていないが、一種以上のヌク
レオキャプシドタンパク質、特にＮＰタンパク質の遊離型が豊富に存在すること
が関係しているようである。ウイルスの侵入に続いてすぐに、ヌクレオキャプシ
ド中のネガティブセンスRNAを鋳型として用いて、Ｌタンパク質により転写が始
まる。ウイルスのRNA合成は、翻訳の間にモノシストロン性mRNAを生成するよう
に調節される。
複製も行うという仮説がある。同じタンパク質の物の代替的な利用（つまり、転
写または複製）を調節する機構は、明確に特定されていないが、一種以上のヌク
レオキャプシドタンパク質、特にＮＰタンパク質の遊離型が豊富に存在すること
が関係しているようである。ウイルスの侵入に続いてすぐに、ヌクレオキャプシ
ド中のネガティブセンスRNAを鋳型として用いて、Ｌタンパク質により転写が始
まる。ウイルスのRNA合成は、翻訳の間にモノシストロン性mRNAを生成するよう
に調節される。
【００１２】
ウイルスゲノムの複製は、マイナス鎖RNAウイルスによる感染において、転写
に続く第二の必須な事象である。他のマイナス鎖RNAウイルスと同じく、ニュー
キャッスル病ウイルス（NDV）におけるウイルスゲノムの複製は、ウイルス特異
的タンパク質によって仲介される。複製RNA合成の最初の産物は、NDVゲノムRNA
の相補的コピー（つまり、正の極性）(cRNA）である。これらのプラス鎖コピー(
アンチゲノム)は、プラス鎖mRNA転写物とはそれらの末端の構造に相違がある。m
RNA転写物とは異なり、アンチゲノムcRNAは、5'末端にキャッピングおよびメチ
ル化を受け、3'末端では末端切断およびポリアデニル化を受ける。該cRNAは、そ
のマイナス鎖鋳型と末端が同じ（coterminal）であり、相補型のゲノムRNAセグ
メントのそれぞれのゲノム情報を全て含む。該cRNAはNDVマイナス鎖ウイルスゲ
ノム(vRNA)の合成に対する鋳型として作用する。
に続く第二の必須な事象である。他のマイナス鎖RNAウイルスと同じく、ニュー
キャッスル病ウイルス（NDV）におけるウイルスゲノムの複製は、ウイルス特異
的タンパク質によって仲介される。複製RNA合成の最初の産物は、NDVゲノムRNA
の相補的コピー（つまり、正の極性）(cRNA）である。これらのプラス鎖コピー(
アンチゲノム)は、プラス鎖mRNA転写物とはそれらの末端の構造に相違がある。m
RNA転写物とは異なり、アンチゲノムcRNAは、5'末端にキャッピングおよびメチ
ル化を受け、3'末端では末端切断およびポリアデニル化を受ける。該cRNAは、そ
のマイナス鎖鋳型と末端が同じ（coterminal）であり、相補型のゲノムRNAセグ
メントのそれぞれのゲノム情報を全て含む。該cRNAはNDVマイナス鎖ウイルスゲ
ノム(vRNA)の合成に対する鋳型として作用する。
【００１３】
NDVマイナス鎖ゲノム(vRNA)およびアンチゲノム(cRNA)の双方とも、ヌクレオ
キャプシドタンパク質により、キャプシド形成を受ける；つまり、キャプシド形
成していないRNA種だけがウイルスmRNAである。NDVにとっては、細胞質は、ウイ
ルスRNA複製の場であると同時に、翻訳の場でもある。宿主細胞の細胞形質膜で
ウイルスの構成成分の集合が起こり、成熟ウイルスは出芽により放出される。
キャプシドタンパク質により、キャプシド形成を受ける；つまり、キャプシド形
成していないRNA種だけがウイルスmRNAである。NDVにとっては、細胞質は、ウイ
ルスRNA複製の場であると同時に、翻訳の場でもある。宿主細胞の細胞形質膜で
ウイルスの構成成分の集合が起こり、成熟ウイルスは出芽により放出される。
【００１４】2.2. マイナス鎖RNAウイルスの遺伝子操作
動物ウイルスのRNA依存性RNAポリメラーゼは、タンパク質構造および反応条件
の多くの局面に関して広く研究されてきた。しかし、該ポリメラーゼにより最適
の発現を促進する鋳型RNAのエレメントは、既存のウイルスRNA配列を用いて、推
論による研究しかなされ得なかった。感染した細胞に見られる宿主がコードする
多くのRNAの中から、ウイルスポリメラーゼが特定のウイルスRNAをどのようにし
て認識するのかということが分かっていないので、このプロモーター解析は興味
深いものである。
の多くの局面に関して広く研究されてきた。しかし、該ポリメラーゼにより最適
の発現を促進する鋳型RNAのエレメントは、既存のウイルスRNA配列を用いて、推
論による研究しかなされ得なかった。感染した細胞に見られる宿主がコードする
多くのRNAの中から、ウイルスポリメラーゼが特定のウイルスRNAをどのようにし
て認識するのかということが分かっていないので、このプロモーター解析は興味
深いものである。
【００１５】
プラスミドに由来するRNAをトランスフェクションによって細胞に導入すると
、プラスセンスゲノムRNAを含む動物ウイルスを複製できる(例えば、Racaniello
ら、1981、Science 214: 916-919; Levisら、1986、Cell 44: 137-145)。ポリオ
ウイルスの場合、精製したポリメラーゼはin vitroでの反応でゲノムRNAを複製
し、このプラスセンスRNA調製物を細胞にトランスフェクトすると、感染する(Ka
planら、1985、Proc. Natl. Acad. Sci.USA 82:8424-8428)。しかし、RNAのホモ
ポリマーがコピー可能になってからも(Wardら、1988、J.Virol. 62: 558-562)、
ポリオウイルスがコードするポリメラーゼに対して転写プロモーターとして作用
する鋳型エレメントは分かっていない。SP6転写物は、シンドビスウイルスゲノ
ムについての欠陥干渉(DI)RNAのモデルを作製するのに使用されてきた。RNAが感
染細胞に導入されると、複製され、パッケージングされる。シンドビスウイルス
ポリメラーゼによる認識およびウイルス粒子へのゲノムのパッケージングの双方
を担うRNA配列は、ゲノムの5'末端の162ヌクレオチド(nt)および3'末端の19 nt
の中にあることが示された(Levisら、1986、Cell 44: 137-145）。プラス鎖RNA
植物ウイルスであるブロム−モザイクウイルス(BMV)の場合、SP６転写物を用い
て、そのプロモーターが134 nt のtRNA様3'末端であると同定した(Dreherおよび
Hall, 1988, J.Mol. Biol. 201:31-40)。ポリメラーゼの認識および合成は、配
列および二次構造の特徴の双方に依存していることが示された(Dreherら、1984
、Nature 311: 171-175)。
、プラスセンスゲノムRNAを含む動物ウイルスを複製できる(例えば、Racaniello
ら、1981、Science 214: 916-919; Levisら、1986、Cell 44: 137-145)。ポリオ
ウイルスの場合、精製したポリメラーゼはin vitroでの反応でゲノムRNAを複製
し、このプラスセンスRNA調製物を細胞にトランスフェクトすると、感染する(Ka
planら、1985、Proc. Natl. Acad. Sci.USA 82:8424-8428)。しかし、RNAのホモ
ポリマーがコピー可能になってからも(Wardら、1988、J.Virol. 62: 558-562)、
ポリオウイルスがコードするポリメラーゼに対して転写プロモーターとして作用
する鋳型エレメントは分かっていない。SP6転写物は、シンドビスウイルスゲノ
ムについての欠陥干渉(DI)RNAのモデルを作製するのに使用されてきた。RNAが感
染細胞に導入されると、複製され、パッケージングされる。シンドビスウイルス
ポリメラーゼによる認識およびウイルス粒子へのゲノムのパッケージングの双方
を担うRNA配列は、ゲノムの5'末端の162ヌクレオチド(nt)および3'末端の19 nt
の中にあることが示された(Levisら、1986、Cell 44: 137-145）。プラス鎖RNA
植物ウイルスであるブロム−モザイクウイルス(BMV)の場合、SP６転写物を用い
て、そのプロモーターが134 nt のtRNA様3'末端であると同定した(Dreherおよび
Hall, 1988, J.Mol. Biol. 201:31-40)。ポリメラーゼの認識および合成は、配
列および二次構造の特徴の双方に依存していることが示された(Dreherら、1984
、Nature 311: 171-175)。
【００１６】
レプリカーゼを必要とする配列の研究には、ネガティブセンスRNAウイルスは
手強かった。水疱性口内炎ウイルスの精製ポリメラーゼは、ウイルスに由来する
リボ核タンパク質複合体（RNP)を鋳型として含む場合にのみ、転写活性を有する
(DeおよびBanerjee、1985、Biochem. Biophys. Res. Commun. 126: 40-49; Emer
sonおよびYu、1975、J.Virol. 15: 1348-1356; NaitoおよびIshihama、1976、J.
Biol.Chem. 251:4307-4314)。インフルエンザウイルスに関しては、ウイルスか
ら精製した裸のRNAを用いてRNPを再構築したと報告された。ウイルスのヌクレオ
キャプシドおよびポリメラーゼタンパク質は、ゲルを用いて精製され、チオレド
キシンを用いてウイルスRNA上で再生された(Szewczykら、1988、Proc.Natl. Aca
d. Sci. USA, 85: 7907-7911)。しかし、これらの筆者らは、かかる調製物の活
性がインフルエンザウイルスRNAに特異的であることは示さず、また、転写を促
進するシグナルの解析も行わなかった。
手強かった。水疱性口内炎ウイルスの精製ポリメラーゼは、ウイルスに由来する
リボ核タンパク質複合体（RNP)を鋳型として含む場合にのみ、転写活性を有する
(DeおよびBanerjee、1985、Biochem. Biophys. Res. Commun. 126: 40-49; Emer
sonおよびYu、1975、J.Virol. 15: 1348-1356; NaitoおよびIshihama、1976、J.
Biol.Chem. 251:4307-4314)。インフルエンザウイルスに関しては、ウイルスか
ら精製した裸のRNAを用いてRNPを再構築したと報告された。ウイルスのヌクレオ
キャプシドおよびポリメラーゼタンパク質は、ゲルを用いて精製され、チオレド
キシンを用いてウイルスRNA上で再生された(Szewczykら、1988、Proc.Natl. Aca
d. Sci. USA, 85: 7907-7911)。しかし、これらの筆者らは、かかる調製物の活
性がインフルエンザウイルスRNAに特異的であることは示さず、また、転写を促
進するシグナルの解析も行わなかった。
【００１７】
最近になって、組換え逆遺伝子学的手法を用いるマイナス鎖RNAウイルスの回
復が可能となった(Paleseら、米国特許第5,166,057号)。この手法は、最初、イ
ンフルエンザウイルスゲノムを遺伝子操作するのに適用されたが(Luytjesら、19
89、Cell 59: 1107-1113; Enamiら、1990、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92: 11563-
11567)、狂犬病ウイルス(Schnellら、1994、EMBO J. 13:4195-4203); RSウイル
ス(respiratory syncytial virus)(Collinsら、1991、Proc.Natl.Acad.Sci.USA
88: 9663-9667); およびセンダイウイルス(Parkら、1991、Proc.Natl.Acad.Sci.
USA 88: 5537-5541; Katoら、1996、Genes Cell 1:569-579)を含む、広範なセ
グメント化および非セグメント化マイナス鎖RNAウイルスに適用することに成功
した。しかし、この手法は、未だ、ニューキャッスル病ウイルスRNAゲノムには
適用されていない。
復が可能となった(Paleseら、米国特許第5,166,057号)。この手法は、最初、イ
ンフルエンザウイルスゲノムを遺伝子操作するのに適用されたが(Luytjesら、19
89、Cell 59: 1107-1113; Enamiら、1990、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92: 11563-
11567)、狂犬病ウイルス(Schnellら、1994、EMBO J. 13:4195-4203); RSウイル
ス(respiratory syncytial virus)(Collinsら、1991、Proc.Natl.Acad.Sci.USA
88: 9663-9667); およびセンダイウイルス(Parkら、1991、Proc.Natl.Acad.Sci.
USA 88: 5537-5541; Katoら、1996、Genes Cell 1:569-579)を含む、広範なセ
グメント化および非セグメント化マイナス鎖RNAウイルスに適用することに成功
した。しかし、この手法は、未だ、ニューキャッスル病ウイルスRNAゲノムには
適用されていない。
【００１８】３．発明の概要
本明細書に記載の組換えニューキャッスル病ウイルスRNA鋳型は、RNA依存性RN
Aポリメラーゼと一緒に使用して、異種遺伝子産物を適切な宿主細胞で発現させ
、および/またウイルス粒子内の異種遺伝子をレスキューすることが可能である
。一つの実施形態において、本発明は、インターフェロンおよび関連する経路を
誘導する組換えニューキャッスル病ウイルスに関する。本発明は、ワクチン製剤
における使用にとって、より好適な組換えウイルスを作り出す表現型(毒弱化し
た表現型および免疫原性の増大など)を導く改変を含む組換えニューキャッスル
病ウイルスに関する。別の実施形態においては、本発明は、他のウイルス、病原
体、細胞性遺伝子、腫瘍抗原などの遺伝子を含む異種遺伝子を含有する組換えニ
ューキャッスル病ウイルスおよびウイルスベクターの遺伝子操作に関する。
Aポリメラーゼと一緒に使用して、異種遺伝子産物を適切な宿主細胞で発現させ
、および/またウイルス粒子内の異種遺伝子をレスキューすることが可能である
。一つの実施形態において、本発明は、インターフェロンおよび関連する経路を
誘導する組換えニューキャッスル病ウイルスに関する。本発明は、ワクチン製剤
における使用にとって、より好適な組換えウイルスを作り出す表現型(毒弱化し
た表現型および免疫原性の増大など)を導く改変を含む組換えニューキャッスル
病ウイルスに関する。別の実施形態においては、本発明は、他のウイルス、病原
体、細胞性遺伝子、腫瘍抗原などの遺伝子を含む異種遺伝子を含有する組換えニ
ューキャッスル病ウイルスおよびウイルスベクターの遺伝子操作に関する。
【００１９】
別の実施形態では、本発明は、ワクチンとして利用するための組換えニューキ
ャッスル病ウイルスおよびウイルスベクターの遺伝子操作に関する。本発明は、
ヒトへの投与ならびに獣医学的な使用に適したワクチン製剤に関する。本発明の
ワクチンはネコやイヌを含むペット動物、キツネおよびアライグマを含む野生動
物、ウマ、ウシ、ヒツジ、シチメンチョウ、およびニワトリを含む家畜および家
禽に投与するために設計可能である。
ャッスル病ウイルスおよびウイルスベクターの遺伝子操作に関する。本発明は、
ヒトへの投与ならびに獣医学的な使用に適したワクチン製剤に関する。本発明の
ワクチンはネコやイヌを含むペット動物、キツネおよびアライグマを含む野生動
物、ウマ、ウシ、ヒツジ、シチメンチョウ、およびニワトリを含む家畜および家
禽に投与するために設計可能である。
【００２０】
さらに別の実施形態では、本発明は、突然変異型ニューキャッスル病ウイルス
遺伝子をコードするように、またはニューキャッスル病ウイルスの異なる株に由
来する遺伝子を組み合わせたものをコードするように、遺伝子操作された組換え
ニューキャッスル病ウイルスベクターおよびウイルスに関する。本発明のRNA鋳
型は、DNA依存性RNAポリメラーゼを用いて適切なDNA配列を転写することにより
調製する。得られたRNA鋳型は、負の極性を有し、ウイルスRNA合成装置が鋳型を
認識できる適切な末端配列を含む。一方、ウイルスRNA合成装置が鋳型を認識で
きる適切な末端配列を含む正の極性のRNA鋳型も使用してよい。正の極性のRNA鋳
型からの発現はDNA依存性RNAポリメラーゼによって認識されるプロモーターを有
するプラスミドのトランスフェクションにより達成されうる。例えば、Ｔ７プロ
モーターの制御下にあるポジティブRNA鋳型をコードするプラスミドDNAはワクシ
ニアウイルスＴ７系と組み合わせて使用できる。
遺伝子をコードするように、またはニューキャッスル病ウイルスの異なる株に由
来する遺伝子を組み合わせたものをコードするように、遺伝子操作された組換え
ニューキャッスル病ウイルスベクターおよびウイルスに関する。本発明のRNA鋳
型は、DNA依存性RNAポリメラーゼを用いて適切なDNA配列を転写することにより
調製する。得られたRNA鋳型は、負の極性を有し、ウイルスRNA合成装置が鋳型を
認識できる適切な末端配列を含む。一方、ウイルスRNA合成装置が鋳型を認識で
きる適切な末端配列を含む正の極性のRNA鋳型も使用してよい。正の極性のRNA鋳
型からの発現はDNA依存性RNAポリメラーゼによって認識されるプロモーターを有
するプラスミドのトランスフェクションにより達成されうる。例えば、Ｔ７プロ
モーターの制御下にあるポジティブRNA鋳型をコードするプラスミドDNAはワクシ
ニアウイルスＴ７系と組み合わせて使用できる。
【００２１】
二シストロン性mRNAを構築して、ウイルス配列の翻訳の内部開始を可能にし、
通常の末端開始部位からの外来タンパク質をコードする配列を発現させることが
可能であり、またその逆も可能である。あるいは、その転写単位に開始部位およ
びポリアデニル化部位を含有している内部転写単位から、外来タンパク質を発現
させてもよい。他の実施形態では、得られる発現タンパク質が融合タンパク質に
なるように、外来遺伝子をNDV遺伝子内に挿入する。
通常の末端開始部位からの外来タンパク質をコードする配列を発現させることが
可能であり、またその逆も可能である。あるいは、その転写単位に開始部位およ
びポリアデニル化部位を含有している内部転写単位から、外来タンパク質を発現
させてもよい。他の実施形態では、得られる発現タンパク質が融合タンパク質に
なるように、外来遺伝子をNDV遺伝子内に挿入する。
【００２２】
本発明の組換え突然変異型ニューキャッスル病ウイルスRNA鋳型を、RNA依存性
RNAポリメラーゼを発現する形質転換した細胞系をトランスフェクトするのに使
用して、相補することができる。あるいは、適当なプロモーターから発現するプ
ラスミドは、ウイルス特異的（キメラの）RNAのトランスフェクションに用いる
ことができる。RNA依存性RNAポリメラーゼを提供するヘルパーウイルスを使用し
て、相補を達成することもできる。さらに、ニューキャッスル病ウイルスについ
ての非ウイルス依存的な複製系についても記載する。ウイルスに特異的な複製お
よび発現に必要なニューキャッスル病ウイルスタンパク質の最小のサブセットは
、Ｌ、Ｐ、およびＮＰの３種のタンパク質であり、これらは、ワクシニアウイル
スＴ７系によりプラスミドから発現され得る。さらに別の実施形態において、ND
Vゲノムのアンチゲノムコピーをコードするプラスミドを用いて、ウイルスゲノ
ムを供給する場合、ウイルスに特異的な複製および発現に必要なニューキャッス
ル病ウイルスタンパク質の最小のサブセットは、ＬおよびＰタンパク質である。
NDVゲノムのアンチゲノムコピーが転写される場合、ＮＰポリメラーゼタンパク
質は最初に転写されるタンパク質であり、従って、さらにin transでＮＰポリメ
ラーゼを提供する必要はない。
RNAポリメラーゼを発現する形質転換した細胞系をトランスフェクトするのに使
用して、相補することができる。あるいは、適当なプロモーターから発現するプ
ラスミドは、ウイルス特異的（キメラの）RNAのトランスフェクションに用いる
ことができる。RNA依存性RNAポリメラーゼを提供するヘルパーウイルスを使用し
て、相補を達成することもできる。さらに、ニューキャッスル病ウイルスについ
ての非ウイルス依存的な複製系についても記載する。ウイルスに特異的な複製お
よび発現に必要なニューキャッスル病ウイルスタンパク質の最小のサブセットは
、Ｌ、Ｐ、およびＮＰの３種のタンパク質であり、これらは、ワクシニアウイル
スＴ７系によりプラスミドから発現され得る。さらに別の実施形態において、ND
Vゲノムのアンチゲノムコピーをコードするプラスミドを用いて、ウイルスゲノ
ムを供給する場合、ウイルスに特異的な複製および発現に必要なニューキャッス
ル病ウイルスタンパク質の最小のサブセットは、ＬおよびＰタンパク質である。
NDVゲノムのアンチゲノムコピーが転写される場合、ＮＰポリメラーゼタンパク
質は最初に転写されるタンパク質であり、従って、さらにin transでＮＰポリメ
ラーゼを提供する必要はない。
【００２３】
発現産物および/または得られるキメラビリオンはワクチン製剤への使用に有
利であろう。本発明の発現産物およびキメラビリオンを遺伝子操作して、ウイル
ス抗原、腫瘍抗原および自己免疫性障害に関与する自己抗原を含む広範な病原体
に対するワクチンを作製できる。特に、本発明のキメラビリオンを遺伝子操作し
て、抗HIVワクチンを作製できる。その場合、gp160由来の、および/またはHIVの
内部タンパク質由来の免疫原性を有するポリペプチドを糖タンパク質であるＨＮ
タンパク質内へと遺伝子操作して、脊椎動物の液性および細胞性免疫応答の双方
を誘起可能なワクチンを構築する。この目的のための組換えニューキャッスル病
ウイルスの使用は、特に魅力あるものである。なぜならば、ニューキャッスル病
ウイルスはヒトに対する病原性を持たないからである。腫瘍抗原を送達するため
の組換えニューキャッスル病ウイルスの使用は、該ウイルスの既知の抗腫瘍性お
よび免疫増強特性を考えると、特に魅力的である。
利であろう。本発明の発現産物およびキメラビリオンを遺伝子操作して、ウイル
ス抗原、腫瘍抗原および自己免疫性障害に関与する自己抗原を含む広範な病原体
に対するワクチンを作製できる。特に、本発明のキメラビリオンを遺伝子操作し
て、抗HIVワクチンを作製できる。その場合、gp160由来の、および/またはHIVの
内部タンパク質由来の免疫原性を有するポリペプチドを糖タンパク質であるＨＮ
タンパク質内へと遺伝子操作して、脊椎動物の液性および細胞性免疫応答の双方
を誘起可能なワクチンを構築する。この目的のための組換えニューキャッスル病
ウイルスの使用は、特に魅力あるものである。なぜならば、ニューキャッスル病
ウイルスはヒトに対する病原性を持たないからである。腫瘍抗原を送達するため
の組換えニューキャッスル病ウイルスの使用は、該ウイルスの既知の抗腫瘍性お
よび免疫増強特性を考えると、特に魅力的である。
【００２４】3.1. 定義
本明細書で用いる以下の用語は、指示する意味を有するものである：
cRNA＝アンチゲノムRNA
HIV＝ヒト免疫不全ウイルス
Ｌ＝大型タンパク質
Ｍ＝マトリックスタンパク質（エンベロープの内側に並んでいる）
MDCK＝マディンダービー(Mardin Darby)イヌ腎臓細胞
MDBK＝マディンダービー(Mardin Darby)ウシ腎臓細胞
moi＝感染多重度
NA＝ノイラミニダーゼ（エンベロープ糖タンパク質）
NDV＝ニューキャッスル病ウイルス
NP＝核タンパク質（RNAと会合し、ポリメラーゼ活性に必須）
NS＝非構造タンパク質（機能は不明）
nt＝ヌクレオチド
PA、PB1、PB2＝RNA依存性RNAポリメラーゼ構成成分
RNP＝リボ核タンパク質
rRNP＝組換えRNP
vRNA＝ゲノムウイルスRNA
WSN＝インフルエンザA/WSN/33ウイルス
WSN-HKウイルス；WSNウイルス由来の７つの遺伝子およびインフルエンザA/HK/8/
68ウイルス由来のNA遺伝子を含む再構成（reassortment)したウイルス
68ウイルス由来のNA遺伝子を含む再構成（reassortment)したウイルス
【００２５】４．図面の簡単な説明
（図面の簡単な説明については下記参照）
【００２６】５．詳細な説明
本発明は、異種遺伝子、または突然変異型ニューキャッスル病ウイルス遺伝子
、または異なるニューキャッスル病ウイルスの株に由来するウイルス遺伝子の組
み合わせを発現する、遺伝子工学的に操作されたニューキャッスル病ウイルス、
およびウイルスベクターに関する。本発明は、ウイルスRNA依存性RNAポリメラー
ゼと共に使用して、好適な宿主細胞において異種遺伝子産物を発現し、および/
またはウイルス粒子内での異種遺伝子をレスキューすることが可能な組換えマイ
ナス鎖NDVウイルスRNA鋳型の構築および使用に関する。本発明の特定の実施形態
においては、異種遺伝子産物は、ヒト免疫不全ウイルスのゲノム由来のペプチド
またはタンパク質である。本発明のRNA鋳型は、バクテリオファージT7、T3、SP6
ポリメラーゼ、またはポリメラーゼIのような真核生物ポリメラーゼなどのDNA依
存性RNAポリメラーゼを用いて、適当なDNA配列をin vitroまたはin vivoのいず
れかにおいて転写することにより調製しうる。
、または異なるニューキャッスル病ウイルスの株に由来するウイルス遺伝子の組
み合わせを発現する、遺伝子工学的に操作されたニューキャッスル病ウイルス、
およびウイルスベクターに関する。本発明は、ウイルスRNA依存性RNAポリメラー
ゼと共に使用して、好適な宿主細胞において異種遺伝子産物を発現し、および/
またはウイルス粒子内での異種遺伝子をレスキューすることが可能な組換えマイ
ナス鎖NDVウイルスRNA鋳型の構築および使用に関する。本発明の特定の実施形態
においては、異種遺伝子産物は、ヒト免疫不全ウイルスのゲノム由来のペプチド
またはタンパク質である。本発明のRNA鋳型は、バクテリオファージT7、T3、SP6
ポリメラーゼ、またはポリメラーゼIのような真核生物ポリメラーゼなどのDNA依
存性RNAポリメラーゼを用いて、適当なDNA配列をin vitroまたはin vivoのいず
れかにおいて転写することにより調製しうる。
【００２７】
組換えRNA鋳型を使用して、補足を可能にするRNA依存性RNAポリメラーゼタン
パク質を発現する連続的な/トランスフェクトした細胞系にトランスフェクトし
てもよい。これは、NDV-CL(California strain/11914/1944様の株）（Meindlら
、1974、Virology 58: 457-463)RNAの5'末端および3'末端のヌクレオチドに隣接
したクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)遺伝子のコード領
域（ネガティブセンス方向）を含むクローン化したDNAのRNA転写物をNDVポリメ
ラーゼタンパク質を発現する細胞にトランスフェクトした実施例に示す通りであ
る。好ましい実施形態では、非ウイルス依存的な複製系を使用して、キメラNDV
を回復する。この場合においては、以下に記載する実施例によって示されるとお
り、NDVゲノムまたはアンチゲノムをコードするプラスミドDNAをウイルスに特異
的な複製および発現に必要なニューキャッスル病ウイルスタンパク質の最小部分
集合をコードするプラスミドDNAとともに共発現する。
パク質を発現する連続的な/トランスフェクトした細胞系にトランスフェクトし
てもよい。これは、NDV-CL(California strain/11914/1944様の株）（Meindlら
、1974、Virology 58: 457-463)RNAの5'末端および3'末端のヌクレオチドに隣接
したクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)遺伝子のコード領
域（ネガティブセンス方向）を含むクローン化したDNAのRNA転写物をNDVポリメ
ラーゼタンパク質を発現する細胞にトランスフェクトした実施例に示す通りであ
る。好ましい実施形態では、非ウイルス依存的な複製系を使用して、キメラNDV
を回復する。この場合においては、以下に記載する実施例によって示されるとお
り、NDVゲノムまたはアンチゲノムをコードするプラスミドDNAをウイルスに特異
的な複製および発現に必要なニューキャッスル病ウイルスタンパク質の最小部分
集合をコードするプラスミドDNAとともに共発現する。
【００２８】
in vivoでNDVを再構築する能力は、外来遺伝子を発現するか、または突然変異
NDV遺伝子を発現する、新規のキメラNDVウイルスの設計を可能にする。in vivo
でNDVを再構築する能力はまた、NDVの異なる株に由来する遺伝子を発現する新規
のキメラNDVの設計も可能にする。この目的を達成する一つの方法は、既存のNDV
遺伝子の改変を含む。例えば、ＨＮ遺伝子を改変して、細胞外ドメインに外来配
列を含ませてよい。異種配列が病原体のエピトープまたは抗原である場合、これ
らのキメラウイルスを使用して、これらの決定基が由来する病原体に対する防御
免疫応答を誘導することが可能である。
NDV遺伝子を発現する、新規のキメラNDVウイルスの設計を可能にする。in vivo
でNDVを再構築する能力はまた、NDVの異なる株に由来する遺伝子を発現する新規
のキメラNDVの設計も可能にする。この目的を達成する一つの方法は、既存のNDV
遺伝子の改変を含む。例えば、ＨＮ遺伝子を改変して、細胞外ドメインに外来配
列を含ませてよい。異種配列が病原体のエピトープまたは抗原である場合、これ
らのキメラウイルスを使用して、これらの決定基が由来する病原体に対する防御
免疫応答を誘導することが可能である。
【００２９】
本発明に従って、ヒト免疫不全ウイルスのgp160コード領域に由来するコード
配列をNDVのＨＮコード配列に挿入してキメラRNAを構築し、そして、このキメラ
RNAセグメントを野生型NDVを感染させた宿主細胞にトランスフェクションしてキ
メラウイルスを作製する。さらに、このようなキメラウイルスは、脊椎動物の体
液性および細胞性免疫応答の双方を誘起できる。さらに、本発明は、組換えまた
はキメラNDVウイルスによるインターフェロンおよび関連する経路の誘導にも関
する。
配列をNDVのＨＮコード配列に挿入してキメラRNAを構築し、そして、このキメラ
RNAセグメントを野生型NDVを感染させた宿主細胞にトランスフェクションしてキ
メラウイルスを作製する。さらに、このようなキメラウイルスは、脊椎動物の体
液性および細胞性免疫応答の双方を誘起できる。さらに、本発明は、組換えまた
はキメラNDVウイルスによるインターフェロンおよび関連する経路の誘導にも関
する。
【００３０】
本発明は、広範なウイルス、および/または腫瘍抗原を含む抗原に対するワク
チンを製剤化するための、本発明のウイルスベクターおよびキメラウイルスの使
用に関する。本発明のウイルスベクターおよびキメラウイルスを用いて、体液性
免疫応答、細胞性免疫応答を刺激することにより、または抗原に対する耐性を刺
激することによって、対象となる免疫系を調節できる。本明細書で用いる場合、
対象とは、ヒト、霊長類、馬、牛、羊、豚、山羊、犬、ネコ、鳥類種、および齧
歯類を意味する。腫瘍抗原を送達する場合、本発明は、非固形腫瘍または小さな
固形腫瘍のような免疫が介在する拒絶反応に影響され易い疾患を有する対象の処
置に使用されうる。本明細書に記載のウイルスベクターおよびキメラウイルスに
よる腫瘍抗原の送達は、大きな固形腫瘍の摘出後の処置に有用であることも考え
られる。本発明は、また、癌があると疑われる対象の処置にも有用であろう。
チンを製剤化するための、本発明のウイルスベクターおよびキメラウイルスの使
用に関する。本発明のウイルスベクターおよびキメラウイルスを用いて、体液性
免疫応答、細胞性免疫応答を刺激することにより、または抗原に対する耐性を刺
激することによって、対象となる免疫系を調節できる。本明細書で用いる場合、
対象とは、ヒト、霊長類、馬、牛、羊、豚、山羊、犬、ネコ、鳥類種、および齧
歯類を意味する。腫瘍抗原を送達する場合、本発明は、非固形腫瘍または小さな
固形腫瘍のような免疫が介在する拒絶反応に影響され易い疾患を有する対象の処
置に使用されうる。本明細書に記載のウイルスベクターおよびキメラウイルスに
よる腫瘍抗原の送達は、大きな固形腫瘍の摘出後の処置に有用であることも考え
られる。本発明は、また、癌があると疑われる対象の処置にも有用であろう。
【００３１】
本発明は、制限するのではなく、単に記載の目的のために、(a)組換えRNA鋳型
の構築、(b)組換えRNA鋳型を用いる異種遺伝子産物の発現、および(c)組換え型
ウイルス粒子における該異種遺伝子のレスキュー：の段階に分け得る。考察を明
確にするために、本発明を、NDV-CL(California strain/11914/1944 様の株）を
用いる実施例において説明するが、NDVの任意の株を利用してよい。
の構築、(b)組換えRNA鋳型を用いる異種遺伝子産物の発現、および(c)組換え型
ウイルス粒子における該異種遺伝子のレスキュー：の段階に分け得る。考察を明
確にするために、本発明を、NDV-CL(California strain/11914/1944 様の株）を
用いる実施例において説明するが、NDVの任意の株を利用してよい。
【００３２】5.1. 組換えRNA鋳型の構築
本発明の特定の実施形態とは、NDVのネガティブセンスゲノムRNAの5'および3'
末端の正確なヌクレオチド配列を本発明者らが同定したことである。図５に示す
ように、本発明のNDVネガティブセンスゲノムRNAの5'および3'末端のヌクレオチ
ド配列は、以前に開示されたNDVの3'末端配列とは有意に相違する。NDVの5'およ
び3'末端の正確なヌクレオチド配列の同定により初めて、組換えNDV RNA鋳型の
遺伝子工学的操作、組換えRNA鋳型の発現、および組換えNDV粒子のレスキューが
可能となる。本発明は、図５に示したヌクレオチド配列を有する5'および3'末端
を包含するだけでなく、野生型の末端の機能（つまり、鋳型を認識するウイルス
RNA合成装置に必要なシグナル）を維持している該末端のあらゆる改変または突
然変異、またはその断片のあらゆるものをも包含する。
末端の正確なヌクレオチド配列を本発明者らが同定したことである。図５に示す
ように、本発明のNDVネガティブセンスゲノムRNAの5'および3'末端のヌクレオチ
ド配列は、以前に開示されたNDVの3'末端配列とは有意に相違する。NDVの5'およ
び3'末端の正確なヌクレオチド配列の同定により初めて、組換えNDV RNA鋳型の
遺伝子工学的操作、組換えRNA鋳型の発現、および組換えNDV粒子のレスキューが
可能となる。本発明は、図５に示したヌクレオチド配列を有する5'および3'末端
を包含するだけでなく、野生型の末端の機能（つまり、鋳型を認識するウイルス
RNA合成装置に必要なシグナル）を維持している該末端のあらゆる改変または突
然変異、またはその断片のあらゆるものをも包含する。
【００３３】
ウイルスポリメラーゼ結合部位/プロモーターの補足物（例えば、本発明の3'-
NDVウイルス末端の補足物、または3'-および5'-NDVウイルス末端の双方の補足物
）に隣接する異種遺伝子コード配列を、当技術分野で周知の技術を用いて構築し
てもよい。得られるRNA鋳型は負の極性であってよく、ウイルスのRNA合成装置が
鋳型を認識できるようにする適当な末端配列を含みうる。あるいはまた、ウイル
スのRNA合成装置が鋳型を認識できるようにする適当な末端配列を含む正の極性
のRNA鋳型も使用してよい。これらのハイブリッド配列を含む組換えDNA分子は、
クローン化でき、バクテリオファージT7、T3、SP6ポリメラーゼ、またはポリメ
ラーゼIなどの真核生物ポリメラーゼのようなDNA依存性RNAポリメラーゼによる
転写が可能であり、ウイルスポリメラーゼの認識および活性化を可能にする適当
なウイルス配列を有する組換えRNA鋳型をin vitroまたはin vivoで作製すること
ができる。
NDVウイルス末端の補足物、または3'-および5'-NDVウイルス末端の双方の補足物
）に隣接する異種遺伝子コード配列を、当技術分野で周知の技術を用いて構築し
てもよい。得られるRNA鋳型は負の極性であってよく、ウイルスのRNA合成装置が
鋳型を認識できるようにする適当な末端配列を含みうる。あるいはまた、ウイル
スのRNA合成装置が鋳型を認識できるようにする適当な末端配列を含む正の極性
のRNA鋳型も使用してよい。これらのハイブリッド配列を含む組換えDNA分子は、
クローン化でき、バクテリオファージT7、T3、SP6ポリメラーゼ、またはポリメ
ラーゼIなどの真核生物ポリメラーゼのようなDNA依存性RNAポリメラーゼによる
転写が可能であり、ウイルスポリメラーゼの認識および活性化を可能にする適当
なウイルス配列を有する組換えRNA鋳型をin vitroまたはin vivoで作製すること
ができる。
【００３４】
さらに別の実施形態では、事実上あらゆる異種配列を本発明のキメラウイルス
の中に構築できる。該異種配列には、限定するものではないが、１）病原体に特
徴的な抗原；２）自己免疫疾患に特徴的な抗原；３）アレルゲンに特徴的な抗原
；および４）腫瘍に特徴的な抗原、などを含む。例えば、本発明のキメラウイル
スの中に操作して入れることが可能な異種遺伝子配列は、少数であるが名を挙げ
ると、gp160のようなヒト免疫不全ウイルス(HIV)のエピトープ；Ｂ型肝炎ウイル
ス表面抗原（HBsAg)；ヘルペスウイルスの糖タンパク質（例えば、gD、gE）；ポ
リオウイルスのVP1；およびバクテリアおよび寄生虫のような非ウイルス性の病
原体の抗原決定基などを含むが、これらに限定しない。
の中に構築できる。該異種配列には、限定するものではないが、１）病原体に特
徴的な抗原；２）自己免疫疾患に特徴的な抗原；３）アレルゲンに特徴的な抗原
；および４）腫瘍に特徴的な抗原、などを含む。例えば、本発明のキメラウイル
スの中に操作して入れることが可能な異種遺伝子配列は、少数であるが名を挙げ
ると、gp160のようなヒト免疫不全ウイルス(HIV)のエピトープ；Ｂ型肝炎ウイル
ス表面抗原（HBsAg)；ヘルペスウイルスの糖タンパク質（例えば、gD、gE）；ポ
リオウイルスのVP1；およびバクテリアおよび寄生虫のような非ウイルス性の病
原体の抗原決定基などを含むが、これらに限定しない。
【００３５】
糖尿病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、悪性貧血、
アジソン病、強皮症、自己免疫性萎縮性胃炎、若年性糖尿病、ジスコールドエリ
テマトーデス（discold lupus erythromatosus）などに特徴的な抗原を含む、自
己免疫疾患に特徴的な抗原は、典型的には哺乳動物の細胞表面、細胞質、核、ミ
トコンドリア、組織などに由来するであろう。
アジソン病、強皮症、自己免疫性萎縮性胃炎、若年性糖尿病、ジスコールドエリ
テマトーデス（discold lupus erythromatosus）などに特徴的な抗原を含む、自
己免疫疾患に特徴的な抗原は、典型的には哺乳動物の細胞表面、細胞質、核、ミ
トコンドリア、組織などに由来するであろう。
【００３６】
花粉症、ほこり、カビ、胞子、ふけ、虫、および食物に由来する抗原を含む、
アレルゲンとなる抗原は、一般的にタンパク質または糖タンパク質である。
アレルゲンとなる抗原は、一般的にタンパク質または糖タンパク質である。
【００３７】
腫瘍抗原に特徴的な抗原は、典型的に、腫瘍組織の細胞の細胞表面、細胞質、
核、細胞小器官などに由来するであろう。例としては、突然変異した癌遺伝子に
コードされるタンパク質、腫瘍関連ウイルスタンパク質、および糖タンパク質を
含む、腫瘍タンパク質に特徴的な抗原が挙げられる。腫瘍は、口唇、鼻咽頭、咽
頭および口腔、食道、胃、結腸、直腸、肝臓、胆嚢、膵臓、喉頭、肺および気管
支、皮膚の黒色腫、乳房、子宮頚部、子宮（uterine)、卵巣、膀胱、腎臓、子宮
(uterus)、脳および神経系の他の部位、甲状腺、前立腺、精巣、ホジキン病、非
ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫および白血病などの種類の癌に由来する腫瘍を
含むが、これらに限定するものではない。
核、細胞小器官などに由来するであろう。例としては、突然変異した癌遺伝子に
コードされるタンパク質、腫瘍関連ウイルスタンパク質、および糖タンパク質を
含む、腫瘍タンパク質に特徴的な抗原が挙げられる。腫瘍は、口唇、鼻咽頭、咽
頭および口腔、食道、胃、結腸、直腸、肝臓、胆嚢、膵臓、喉頭、肺および気管
支、皮膚の黒色腫、乳房、子宮頚部、子宮（uterine)、卵巣、膀胱、腎臓、子宮
(uterus)、脳および神経系の他の部位、甲状腺、前立腺、精巣、ホジキン病、非
ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫および白血病などの種類の癌に由来する腫瘍を
含むが、これらに限定するものではない。
【００３８】
本発明の一つの特殊な実施形態においては、異種配列はヒト免疫不全ウイルス
(HIV)のゲノムに由来し、好ましくは、ヒト免疫不全ウイルス-1またはヒト免疫
不全ウイルス-2のゲノムに由来する。本発明の他の実施形態では、異種コード配
列をNDV遺伝子のコード配列内に挿入して、NDVウイルスタンパク質内の異種ペプ
チド配列を含むキメラ遺伝子産物を発現させ得る。また本発明のこのような実施
形態において、異種配列は、ヒト免疫不全ウイルスのゲノム、好ましくは、ヒト
免疫不全ウイルス-1またはヒト免疫不全ウイルス-2のゲノムに由来してもよい。
(HIV)のゲノムに由来し、好ましくは、ヒト免疫不全ウイルス-1またはヒト免疫
不全ウイルス-2のゲノムに由来する。本発明の他の実施形態では、異種コード配
列をNDV遺伝子のコード配列内に挿入して、NDVウイルスタンパク質内の異種ペプ
チド配列を含むキメラ遺伝子産物を発現させ得る。また本発明のこのような実施
形態において、異種配列は、ヒト免疫不全ウイルスのゲノム、好ましくは、ヒト
免疫不全ウイルス-1またはヒト免疫不全ウイルス-2のゲノムに由来してもよい。
【００３９】
異種配列がHIVに由来する場合には、このような配列は、env 遺伝子（つまりg
p160、gp120、および/またはgp41の全てまたは一部をコードする配列）、pol 遺
伝子（つまり、逆転写酵素、エンドヌクレアーゼ、プロテアーゼ、および/また
は、インテグラーゼの全てまたは一部をコードする配列）、gag 遺伝子（つまり
、p7、p6、p55、p17/18、p24/25の全てまたは一部をコードする配列）、tat、re
v、nef、vif、vpu、vpr、および/またはvpxに由来する配列を含むが、これらに
限定はしない。
p160、gp120、および/またはgp41の全てまたは一部をコードする配列）、pol 遺
伝子（つまり、逆転写酵素、エンドヌクレアーゼ、プロテアーゼ、および/また
は、インテグラーゼの全てまたは一部をコードする配列）、gag 遺伝子（つまり
、p7、p6、p55、p17/18、p24/25の全てまたは一部をコードする配列）、tat、re
v、nef、vif、vpu、vpr、および/またはvpxに由来する配列を含むが、これらに
限定はしない。
【００４０】
さらに他の実施形態では、キメラウイルス内へ操作可能な異種遺伝子配列は、
免疫増強活性を有するタンパク質をコードする配列を含む。免疫増強性タンパク
質の例としては、限定するものではないが、サイトカイン、１型インターフェロ
ン、γインターフェロン、コロニー刺激因子、インターロイキン-1、-2、-4、-5
、-6、-12が挙げられる。
免疫増強活性を有するタンパク質をコードする配列を含む。免疫増強性タンパク
質の例としては、限定するものではないが、サイトカイン、１型インターフェロ
ン、γインターフェロン、コロニー刺激因子、インターロイキン-1、-2、-4、-5
、-6、-12が挙げられる。
【００４１】
これらのハイブリッド分子を構築する一つの手法は、NDV遺伝子のDNA補足物中
に異種コード配列を、該異種配列がウイルスポリメラーゼ活性に必要なウイルス
配列（つまり、ウイルスポリメラーゼ結合部位/プロモーター（以下ウイルスポ
リメラーゼ結合部位という）、およびポリアデニル化部位）に隣接するように挿
入することである。好ましい実施形態においては、異種コード配列は、5'および
3'末端の複製プロモーター、遺伝子の開始配列および遺伝子の終止配列、および
5'および/または3'末端に見られるパッケージングシグナルを含むウイルス配列
に隣接している。別の手法においては、ウイルスポリメラーゼ結合部位をコード
するオリゴヌクレオチド、（例えば、ウイルスゲノムセグメントの3'末端または
両端の補足物）を異種コード配列に連結し、ハイブリッド分子を構築する。以前
は、標的配列内の外来遺伝子または外来遺伝子のセグメントの位置は、該標的配
列内の適切な制限酵素部位の存在によって決められていた。しかし、分子生物学
の最近の進歩により、この問題は大幅に小さくなった。制限酵素部位は、部位特
異的突然変異誘発を利用して、標的配列内の任意の場所に容易に配置できる(例
えば、Kunkel、1985、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82;488に記載の技術を参照のこ
と)。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術の変法(後述)によっても、配列（つまり、
制限酵素部位）を特異的に挿入することが可能であり、また、ハイブリッド分子
の容易な構築が可能である。あるいはまた、PCR反応を用いて、クローニングを
必要とせずに、組換え型の鋳型を調製することが可能であろう。例えば、PCR反
応を使って、DNA依存性RNAポリメラーゼプロモーター(例えば、バクテリオファ
ージＴ３、Ｔ７、ＳＰ６)、および、異種遺伝子とNDVポリメラーゼ結合部位を含
むハイブリッド配列を含む、２本鎖DNA分子の調製が可能である。続いて、この
組換えDNAから直接RNA鋳型を転写できる。さらに他の実施形態では、RNAリガー
ゼを用いて、異種遺伝子の負の極性を特定するRNAとウイルスポリメラーゼ結合
部位を連結することによって、組換えRNA鋳型をを調製してもよい。ウイルスポ
リメラーゼ活性に必要な配列、および本発明で用いられる構築物については、以
下の小節に記載する。
に異種コード配列を、該異種配列がウイルスポリメラーゼ活性に必要なウイルス
配列（つまり、ウイルスポリメラーゼ結合部位/プロモーター（以下ウイルスポ
リメラーゼ結合部位という）、およびポリアデニル化部位）に隣接するように挿
入することである。好ましい実施形態においては、異種コード配列は、5'および
3'末端の複製プロモーター、遺伝子の開始配列および遺伝子の終止配列、および
5'および/または3'末端に見られるパッケージングシグナルを含むウイルス配列
に隣接している。別の手法においては、ウイルスポリメラーゼ結合部位をコード
するオリゴヌクレオチド、（例えば、ウイルスゲノムセグメントの3'末端または
両端の補足物）を異種コード配列に連結し、ハイブリッド分子を構築する。以前
は、標的配列内の外来遺伝子または外来遺伝子のセグメントの位置は、該標的配
列内の適切な制限酵素部位の存在によって決められていた。しかし、分子生物学
の最近の進歩により、この問題は大幅に小さくなった。制限酵素部位は、部位特
異的突然変異誘発を利用して、標的配列内の任意の場所に容易に配置できる(例
えば、Kunkel、1985、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82;488に記載の技術を参照のこ
と)。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術の変法(後述)によっても、配列（つまり、
制限酵素部位）を特異的に挿入することが可能であり、また、ハイブリッド分子
の容易な構築が可能である。あるいはまた、PCR反応を用いて、クローニングを
必要とせずに、組換え型の鋳型を調製することが可能であろう。例えば、PCR反
応を使って、DNA依存性RNAポリメラーゼプロモーター(例えば、バクテリオファ
ージＴ３、Ｔ７、ＳＰ６)、および、異種遺伝子とNDVポリメラーゼ結合部位を含
むハイブリッド配列を含む、２本鎖DNA分子の調製が可能である。続いて、この
組換えDNAから直接RNA鋳型を転写できる。さらに他の実施形態では、RNAリガー
ゼを用いて、異種遺伝子の負の極性を特定するRNAとウイルスポリメラーゼ結合
部位を連結することによって、組換えRNA鋳型をを調製してもよい。ウイルスポ
リメラーゼ活性に必要な配列、および本発明で用いられる構築物については、以
下の小節に記載する。
【００４２】5.1.1. ＨＮ、Ｐ、ＮＰ、Ｍ、Ｆ、Ｌ遺伝子への異種遺伝子配列の挿入
ＨＮ、Ｐ、ＮＰ、Ｍ、Ｆ、またはＬタンパク質をコードする遺伝子セグメント
は異種遺伝子産物の挿入に使用できる。これらのセグメントのいずれかへの外来
遺伝子配列の挿入は、ウイルスのコード領域を外来遺伝子と完全に置換するか、
または部分的に置換することにより達成できる。完全に置換するには、PCRによ
り指定される突然変異誘発（PCR-directed mutagenesis)を用いて行うのが、お
そらく最良であろう。簡単に説明すると、PCRプライマーAは、5'から3'末端へ：
クラスIIS制限酵素の部位のような、ユニークな（稀にしかない）制限酵素（言
い換えれば、特異配列を認識するが、その配列の上流または下流でDNAを切断す
る「シフター酵素」）の部位； NDV遺伝子の領域に相補的な一続きのヌクレオチ
ド；および外来遺伝子産物のカルボキシ末端コード部分に相補的な一続きのヌク
レオチドを含む。PCRプライマーＢは、5'から3'末端へ：ユニークな制限酵素部
位； NDV遺伝子に相補的な一続きのヌクレオチド；および外来遺伝子の5'コード
部分に相当する一続きのヌクレオチドを含む。これらのプライマーを外来遺伝子
のクローン化したコピーと共に用いるPCR反応の後、その産物を、ユニークな制
限部位を用いて、切り出して、クローン化できる。クラスIIS制限酵素を用いて
消化し、および精製ファージポリメラーゼを用いて転写することにより、外来遺
伝子が挿入されているNDV遺伝子の正確な非翻訳末端を含むRNA分子が得られるで
あろう。別の実施形態においては、PCR開始反応を用いて、バクテリオファージ
プロモーター配列、およびハイブリッド遺伝子配列を含む二本鎖DNAを調製でき
、RNA鋳型をクローニングせずに転写できる。
は異種遺伝子産物の挿入に使用できる。これらのセグメントのいずれかへの外来
遺伝子配列の挿入は、ウイルスのコード領域を外来遺伝子と完全に置換するか、
または部分的に置換することにより達成できる。完全に置換するには、PCRによ
り指定される突然変異誘発（PCR-directed mutagenesis)を用いて行うのが、お
そらく最良であろう。簡単に説明すると、PCRプライマーAは、5'から3'末端へ：
クラスIIS制限酵素の部位のような、ユニークな（稀にしかない）制限酵素（言
い換えれば、特異配列を認識するが、その配列の上流または下流でDNAを切断す
る「シフター酵素」）の部位； NDV遺伝子の領域に相補的な一続きのヌクレオチ
ド；および外来遺伝子産物のカルボキシ末端コード部分に相補的な一続きのヌク
レオチドを含む。PCRプライマーＢは、5'から3'末端へ：ユニークな制限酵素部
位； NDV遺伝子に相補的な一続きのヌクレオチド；および外来遺伝子の5'コード
部分に相当する一続きのヌクレオチドを含む。これらのプライマーを外来遺伝子
のクローン化したコピーと共に用いるPCR反応の後、その産物を、ユニークな制
限部位を用いて、切り出して、クローン化できる。クラスIIS制限酵素を用いて
消化し、および精製ファージポリメラーゼを用いて転写することにより、外来遺
伝子が挿入されているNDV遺伝子の正確な非翻訳末端を含むRNA分子が得られるで
あろう。別の実施形態においては、PCR開始反応を用いて、バクテリオファージ
プロモーター配列、およびハイブリッド遺伝子配列を含む二本鎖DNAを調製でき
、RNA鋳型をクローニングせずに転写できる。
【００４３】5.1.2 ＨＮ遺伝子への異種遺伝子配列の挿入
NDVのヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼ活性は、単一遺伝子、ＨＮにコ
ードされている。ＨＮタンパク質は、ウイルスの主要な表面糖タンパク質である
。多くのウイルス（インフルエンザなど）において、ヘマグルチニンおよびノイ
ラミニダーゼタンパク質は数多くの抗原部位を含むことが示された。従って、該
タンパク質は、感染後の体液性免疫応答における潜在的な標的となる。それ故、
ＨＮ内の抗原部位を外来タンパク質の一部分と置き換えることで、この外来ペプ
チドに対する旺盛な体液性応答を得ることができる。ある配列がＨＮ分子に挿入
されて、ＨＮの外側表面に発現すると、免疫原性を有するであろう。例えば、HI
Vのgp160に由来するペプチドをＨＮタンパク質の抗原部位に配置すると、その結
果として双方が体液性免疫を誘発する。別の手法では、ウイルス配列を全く欠失
させることなく、外来ペプチド配列の抗原部位内への挿入が可能である。このよ
うな構築物の発現産物は、外来抗原に対するワクチンにおいて有用であるだろう
し、実際、以前に議論されていた、ワクチン接種した宿主内での組換えウイルス
の増殖に関する問題を回避できる。抗原部位にのみ置換物を含んでいる完全なＨ
Ｎ分子は、ＨＮの機能を果たしうるので、生存能力のあるウイルスの構築を可能
とする。従って、該ウイルスは、別途のヘルパー機能を必要としないで、増殖で
きる。該ウイルスは、あらゆる偶発的な漏出の危険性を避けるために、他の手段
により、弱毒化することも可能である。
ードされている。ＨＮタンパク質は、ウイルスの主要な表面糖タンパク質である
。多くのウイルス（インフルエンザなど）において、ヘマグルチニンおよびノイ
ラミニダーゼタンパク質は数多くの抗原部位を含むことが示された。従って、該
タンパク質は、感染後の体液性免疫応答における潜在的な標的となる。それ故、
ＨＮ内の抗原部位を外来タンパク質の一部分と置き換えることで、この外来ペプ
チドに対する旺盛な体液性応答を得ることができる。ある配列がＨＮ分子に挿入
されて、ＨＮの外側表面に発現すると、免疫原性を有するであろう。例えば、HI
Vのgp160に由来するペプチドをＨＮタンパク質の抗原部位に配置すると、その結
果として双方が体液性免疫を誘発する。別の手法では、ウイルス配列を全く欠失
させることなく、外来ペプチド配列の抗原部位内への挿入が可能である。このよ
うな構築物の発現産物は、外来抗原に対するワクチンにおいて有用であるだろう
し、実際、以前に議論されていた、ワクチン接種した宿主内での組換えウイルス
の増殖に関する問題を回避できる。抗原部位にのみ置換物を含んでいる完全なＨ
Ｎ分子は、ＨＮの機能を果たしうるので、生存能力のあるウイルスの構築を可能
とする。従って、該ウイルスは、別途のヘルパー機能を必要としないで、増殖で
きる。該ウイルスは、あらゆる偶発的な漏出の危険性を避けるために、他の手段
により、弱毒化することも可能である。
【００４４】
他のハイブリッド構築物を、タンパク質を細胞表面に発現するように、または
タンパク質を細胞から放出できるように作製しうる。なぜならば、表面性糖タン
パク質であるＨＮは、細胞表面への輸送に必要なアミノ末端の切断可能なシグナ
ル配列、および膜での固定化（anchoring)に必要なカルボキシ末端配列を有して
いるからである。細胞表面に完全な形の外来タンパク質を発現させるには、これ
らのＨＮシグナルを用いてハイブリッドタンパク質を作製する必要がある場合が
ある。このような場合、該融合タンパク質は、別々の融合タンパク質として、他
の内在性プロモーターによって発現されうる。あるいはまた、輸送シグナルのみ
が存在し、膜固定化ドメインがない場合、そのタンパク質は、細胞から分泌され
る。
タンパク質を細胞から放出できるように作製しうる。なぜならば、表面性糖タン
パク質であるＨＮは、細胞表面への輸送に必要なアミノ末端の切断可能なシグナ
ル配列、および膜での固定化（anchoring)に必要なカルボキシ末端配列を有して
いるからである。細胞表面に完全な形の外来タンパク質を発現させるには、これ
らのＨＮシグナルを用いてハイブリッドタンパク質を作製する必要がある場合が
ある。このような場合、該融合タンパク質は、別々の融合タンパク質として、他
の内在性プロモーターによって発現されうる。あるいはまた、輸送シグナルのみ
が存在し、膜固定化ドメインがない場合、そのタンパク質は、細胞から分泌され
る。
【００４５】5.1.3. ２つのシストロンを有するRNAの構築および異種タンパク質の発現
ウイルス配列の翻訳の内部開始を可能にし、通常の末端にある開始部位から外
来タンパク質コード配列を発現するための、２つのシストロンを有するmRNAを構
築できるだろう。あるいはまた、ウイルス配列は通常の末端オープンリーディン
グフレームから翻訳され、一方、外来配列は内部の部位から始まるような、２つ
のシストロンを有するmRNA配列を構築してもよい。特定の内部リボソーム開始部
位(IRES)配列を使ってよい。選択されるIRES配列は、ニューキャッスル病ウイル
スのパッケージングの制限により妨害されないように、十分に短いものでなけれ
ばならない。従って、このような２つのシストロンを用いる手法のために選択さ
れるIRESは、長さが500ヌクレオチド以下であることが好ましく、250ヌクレオチ
ドより小さいものが、より好ましい。さらに、用いるIRESが、ピコナウイルスの
構成要素と、配列が共通ではなく、構造的に相同性のないことが好ましい。好ま
しいIRES構成要素は、限定はしないが、哺乳動物のBiP IRESおよびＣ型肝炎ウイ
ルスのIRESを含む。
来タンパク質コード配列を発現するための、２つのシストロンを有するmRNAを構
築できるだろう。あるいはまた、ウイルス配列は通常の末端オープンリーディン
グフレームから翻訳され、一方、外来配列は内部の部位から始まるような、２つ
のシストロンを有するmRNA配列を構築してもよい。特定の内部リボソーム開始部
位(IRES)配列を使ってよい。選択されるIRES配列は、ニューキャッスル病ウイル
スのパッケージングの制限により妨害されないように、十分に短いものでなけれ
ばならない。従って、このような２つのシストロンを用いる手法のために選択さ
れるIRESは、長さが500ヌクレオチド以下であることが好ましく、250ヌクレオチ
ドより小さいものが、より好ましい。さらに、用いるIRESが、ピコナウイルスの
構成要素と、配列が共通ではなく、構造的に相同性のないことが好ましい。好ま
しいIRES構成要素は、限定はしないが、哺乳動物のBiP IRESおよびＣ型肝炎ウイ
ルスのIRESを含む。
【００４６】
あるいはまた、外来タンパク質は、新しい内在性転写ユニットから発現でき、
その場合、該転写ユニットは開始部位とポリアデニル化部位を有している。他の
実施例では、得られる発現タンパク質が融合タンパク質になるように、外来遺伝
子をNDV遺伝子に挿入する。
その場合、該転写ユニットは開始部位とポリアデニル化部位を有している。他の
実施例では、得られる発現タンパク質が融合タンパク質になるように、外来遺伝
子をNDV遺伝子に挿入する。
【００４７】5.2. 組換えRNA鋳型を用いた異種遺伝子産物の発現
上述の通りに調製した組換え鋳型は、適切な宿主細胞で異種遺伝子産物を発現
するための、または、異種遺伝子産物を発現するキメラウイルスを作製するため
の、さまざまな方法に利用できる。一つの実施形態では、組換え鋳型を用いて、
適切な宿主細胞にトランスフェクトでき、異種遺伝子産物の高レベルな発現が導
かれうる。高レベルの発現を提供する宿主細胞系は、NDVに重感染した細胞系の
ようなウイルス機能を提供する連続的な細胞系、NDVの機能を補足するように操
作された細胞系などを含む。
するための、または、異種遺伝子産物を発現するキメラウイルスを作製するため
の、さまざまな方法に利用できる。一つの実施形態では、組換え鋳型を用いて、
適切な宿主細胞にトランスフェクトでき、異種遺伝子産物の高レベルな発現が導
かれうる。高レベルの発現を提供する宿主細胞系は、NDVに重感染した細胞系の
ようなウイルス機能を提供する連続的な細胞系、NDVの機能を補足するように操
作された細胞系などを含む。
【００４８】
本発明の他の実施形態では、異種遺伝子産物の発現を達成するために、組換え
鋳型を用いて、ウイルスポリメラーゼタンパク質を発現する細胞系にトランスフ
ェクトしてよい。この目的のために、Ｌタンパク質などのポリメラーゼタンパク
質を発現する形質転換した細胞系を、適切な宿主細胞として用いてよい。宿主細
胞を、ＮＰまたはＨＮなどの他のウイルス機能、またはさらなる機能を提供する
ように操作できる。
鋳型を用いて、ウイルスポリメラーゼタンパク質を発現する細胞系にトランスフ
ェクトしてよい。この目的のために、Ｌタンパク質などのポリメラーゼタンパク
質を発現する形質転換した細胞系を、適切な宿主細胞として用いてよい。宿主細
胞を、ＮＰまたはＨＮなどの他のウイルス機能、またはさらなる機能を提供する
ように操作できる。
【００４９】
他の実施形態では、異種遺伝子産物の発現を達成するために、ヘルパーウイル
スが、細胞が利用するRNAポリメラーゼタンパク質を提供することも可能である
。
スが、細胞が利用するRNAポリメラーゼタンパク質を提供することも可能である
。
【００５０】
さらに他の実施形態では、ＮＰ、Ｐ、およびＬタンパク質などのウイルスタン
パク質をコードするベクターで細胞をトランスフェクトできる。このようなベク
ターの例は図２Ａ〜２Ｃに示しておく。
パク質をコードするベクターで細胞をトランスフェクトできる。このようなベク
ターの例は図２Ａ〜２Ｃに示しておく。
【００５１】5.3. キメラマイナス鎖RNAウイルスの調製
キメラウイルスを調製するために、プラスセンスまたはマイナスセンスにNDV
ゲノムおよび/または外来タンパク質をコードする改変したNDVウイルスRNA、cDN
AまたはRNAを用いて、複製およびレスキューに必要なウイルスタンパク質および
機能を提供する細胞、または「親株」のNDVにも感染している細胞を、トランス
フェクトしてよい。ほかの手法では、ゲノムまたはアンチゲノムNDV RNAをコー
ドするプラスミド(野生型または改変型のいずれでも良い)を、ウイルスポリメラ
ーゼタンパク質、（例えば、ＮＰ、ＰまたはＬ）をコードするプラスミドととも
に、宿主細胞に共トランスフェクトしてもよい。他の実施形態では、アンチゲノ
ムNDV RNAをコードするプラスミドは、ウイルスポリメラーゼタンパク質である
ＰおよびＬをコードするプラスミドと共トランスフェクトしてよい。なぜなら、
ＮＰポリメラーゼタンパク質はNDVゲノムのアンチゲノムコピーによって最初に
翻訳されるので、ＮＰポリメラーゼをin transで付加的に提供する必要はない。
ゲノムおよび/または外来タンパク質をコードする改変したNDVウイルスRNA、cDN
AまたはRNAを用いて、複製およびレスキューに必要なウイルスタンパク質および
機能を提供する細胞、または「親株」のNDVにも感染している細胞を、トランス
フェクトしてよい。ほかの手法では、ゲノムまたはアンチゲノムNDV RNAをコー
ドするプラスミド(野生型または改変型のいずれでも良い)を、ウイルスポリメラ
ーゼタンパク質、（例えば、ＮＰ、ＰまたはＬ）をコードするプラスミドととも
に、宿主細胞に共トランスフェクトしてもよい。他の実施形態では、アンチゲノ
ムNDV RNAをコードするプラスミドは、ウイルスポリメラーゼタンパク質である
ＰおよびＬをコードするプラスミドと共トランスフェクトしてよい。なぜなら、
ＮＰポリメラーゼタンパク質はNDVゲノムのアンチゲノムコピーによって最初に
翻訳されるので、ＮＰポリメラーゼをin transで付加的に提供する必要はない。
【００５２】
本発明のある実施形態では、逆遺伝学的技術を利用して、キメラマイナス鎖RN
Aウイルスを操作することも可能である。この技術は、ウイルスポリメラーゼに
よる認識、および成熟ウイルス粒子の産生のために必須であるパッケージングシ
グナルに不可欠なマイナス鎖ウイルスRNAの非コード領域を含む、合成組換えウ
イルスRNAの調製を包含する。合成組換えプラスミドDNAおよびRNAは、１９９２
年１１月２４日に公開の米国特許5,166,057号；１９９８年１２月２９日に公開
の米国特許5,854,037号；１９９６年２月２０日に公開された欧州特許公開EP 07
02085A1；米国特許仮出願番号第09/152,845号；１９９７年４月３日に公開され
た国際特許公開PCT WO97/12032；１９９６年に１１月７日に公開されたWO 96/34
625；欧州特許公開 EP-A780475；１９９９年１月２１日に公開されたWO 99/026
57；１９９８年１１月２６日に公開されたWO98／53078；１９９８年１月２２日
に公開されたWO98/02530；１９９９年４月１日に公開されたWO 99/15672；１９
９８年４月２日に公開されたWO 98/13501；１９９７年２月２０日に公開されたW
O 97/06270；１９９７年６月２５日に公開されたEPO 780 47SA1（それぞれは、
全文を参照により本明細書に組み込む。）に記載の、当技術分野で公知の方法の
いずれかによって、感染性ウイルス粒子の中で複製およびレスキューされる。
Aウイルスを操作することも可能である。この技術は、ウイルスポリメラーゼに
よる認識、および成熟ウイルス粒子の産生のために必須であるパッケージングシ
グナルに不可欠なマイナス鎖ウイルスRNAの非コード領域を含む、合成組換えウ
イルスRNAの調製を包含する。合成組換えプラスミドDNAおよびRNAは、１９９２
年１１月２４日に公開の米国特許5,166,057号；１９９８年１２月２９日に公開
の米国特許5,854,037号；１９９６年２月２０日に公開された欧州特許公開EP 07
02085A1；米国特許仮出願番号第09/152,845号；１９９７年４月３日に公開され
た国際特許公開PCT WO97/12032；１９９６年に１１月７日に公開されたWO 96/34
625；欧州特許公開 EP-A780475；１９９９年１月２１日に公開されたWO 99/026
57；１９９８年１１月２６日に公開されたWO98／53078；１９９８年１月２２日
に公開されたWO98/02530；１９９９年４月１日に公開されたWO 99/15672；１９
９８年４月２日に公開されたWO 98/13501；１９９７年２月２０日に公開されたW
O 97/06270；１９９７年６月２５日に公開されたEPO 780 47SA1（それぞれは、
全文を参照により本明細書に組み込む。）に記載の、当技術分野で公知の方法の
いずれかによって、感染性ウイルス粒子の中で複製およびレスキューされる。
【００５３】
多くの異なった手法を用いて、マイナス鎖RNAウイルスをレスキューするため
に逆遺伝学的手法を適用できる。まず第一に、組換えRNAは組換えDNA鋳型から合
成され、in vitroで精製ウイルスポリメラーゼ複合体と再構成されて、細胞をト
ランスフェクトするために使用できる組換えリボヌクレオタンパク質（RNP）を
形成する。別の手法において、合成RNAをin vitroまたはin vivoのいずれかで転
写する際にウイルスポリメラーゼタンパク質が存在する場合、より効率的なトラ
ンスフェクションが達成される。この手法を用いることで、合成RNAはcDNAプラ
スミドから翻訳されうる。cDNAプラスミドは、in vitroで、ポリメラーゼタンパ
ク質をコードするcDNAプラスミドと一緒に転写されるか、またはポリメラーゼタ
ンパク質の存在下で(すなわち、一過性または恒常的にポリメラーゼタンパク質
を発現する細胞中で)in vivoで転写されてもよい。
に逆遺伝学的手法を適用できる。まず第一に、組換えRNAは組換えDNA鋳型から合
成され、in vitroで精製ウイルスポリメラーゼ複合体と再構成されて、細胞をト
ランスフェクトするために使用できる組換えリボヌクレオタンパク質（RNP）を
形成する。別の手法において、合成RNAをin vitroまたはin vivoのいずれかで転
写する際にウイルスポリメラーゼタンパク質が存在する場合、より効率的なトラ
ンスフェクションが達成される。この手法を用いることで、合成RNAはcDNAプラ
スミドから翻訳されうる。cDNAプラスミドは、in vitroで、ポリメラーゼタンパ
ク質をコードするcDNAプラスミドと一緒に転写されるか、またはポリメラーゼタ
ンパク質の存在下で(すなわち、一過性または恒常的にポリメラーゼタンパク質
を発現する細胞中で)in vivoで転写されてもよい。
【００５４】
別の実施形態では、逆遺伝学的技術と再構成（reassortant）技術を組み合わ
せて用いることにより、セグメント化したRNAウイルス中に所望のエピトープを
有する弱毒化ウイルスを操作できる。例えば、弱毒化ウイルス（（自然淘汰、突
然変異誘発または逆遺伝学的技術によって生じる）および、所望のワクチンエピ
トープを担持する株（自然淘汰、突然変異誘発または逆遺伝学的技術によって生
じる）を、セグメント化したゲノムの再構成を可能にする宿主に共感染させてよ
い。その後、弱毒化された表現型および所望のエピトープの双方を提示する再構
成体が選択されうる。
せて用いることにより、セグメント化したRNAウイルス中に所望のエピトープを
有する弱毒化ウイルスを操作できる。例えば、弱毒化ウイルス（（自然淘汰、突
然変異誘発または逆遺伝学的技術によって生じる）および、所望のワクチンエピ
トープを担持する株（自然淘汰、突然変異誘発または逆遺伝学的技術によって生
じる）を、セグメント化したゲノムの再構成を可能にする宿主に共感染させてよ
い。その後、弱毒化された表現型および所望のエピトープの双方を提示する再構
成体が選択されうる。
【００５５】
再構成に続いて、新しいウイルスが単離でき、そのゲノムをハイブリダイゼー
ション分析により同定できる。本明細書に記載のさらなる手法においては、感染
性キメラウイルスの産生は、NDVウイルスポリメラーゼタンパク質を発現する宿
主細胞系(例えば、ウイルス/宿主細胞発現系；ポリメラーゼタンパク質を発現す
るように操作された形質転換した細胞系など)で複製可能であり、そうすると、
感染性キメラウイルスがレスキューされる。この例においては、ヘルパーウイル
スは必要でない。なぜならば、発現されるウイルスポリメラーゼタンパク質によ
りこの機能が提供されるからである。
ション分析により同定できる。本明細書に記載のさらなる手法においては、感染
性キメラウイルスの産生は、NDVウイルスポリメラーゼタンパク質を発現する宿
主細胞系(例えば、ウイルス/宿主細胞発現系；ポリメラーゼタンパク質を発現す
るように操作された形質転換した細胞系など)で複製可能であり、そうすると、
感染性キメラウイルスがレスキューされる。この例においては、ヘルパーウイル
スは必要でない。なぜならば、発現されるウイルスポリメラーゼタンパク質によ
りこの機能が提供されるからである。
【００５６】
本発明において、当技術分野の当業者に周知の技術を用いて、キメラウイルス
の複製とレスキューが達成できる。ある手法は、宿主細胞をトランスフェクトす
る前に、in vitroでの複製に必要なウイルスタンパク質および機能を供給するこ
とを含む。このような実施形態において、野生型ウイルス、ヘルパーウイルス、
精製ウイルスタンパク質、または組換えにより発現したウイルスタンパク質の形
で、ウイルスタンパク質が供給される。該ウイルスタンパク質は、キメラウイル
スをコードする合成cDNAまたはRNAの転写の前、あるいは転写の際、または転写
後に供給されうる。該混合物全体を宿主細胞へのトランスフェクトに用いてよい
。他の手法では、複製に必要なウイルスタンパク質および機能は、キメラウイル
スをコードする合成cDNAまたはRNAの転写の前、あるいは転写の際に供給されう
る。このような実施形態において、野生型ウイルス、ヘルパーウイルス、ウイル
ス抽出物、ウイルスタンパク質を発現する合成cDNAまたはRNAの形で、複製に必
要なウイルスタンパク質および機能が供給されて、感染またはトランスフェクシ
ョンにより宿主細胞に導入される。この感染/トランスフェクションは、キメラ
ウイルスをコードする合成cDNAまたはRNAの導入の前、または導入と同時に行う
。
の複製とレスキューが達成できる。ある手法は、宿主細胞をトランスフェクトす
る前に、in vitroでの複製に必要なウイルスタンパク質および機能を供給するこ
とを含む。このような実施形態において、野生型ウイルス、ヘルパーウイルス、
精製ウイルスタンパク質、または組換えにより発現したウイルスタンパク質の形
で、ウイルスタンパク質が供給される。該ウイルスタンパク質は、キメラウイル
スをコードする合成cDNAまたはRNAの転写の前、あるいは転写の際、または転写
後に供給されうる。該混合物全体を宿主細胞へのトランスフェクトに用いてよい
。他の手法では、複製に必要なウイルスタンパク質および機能は、キメラウイル
スをコードする合成cDNAまたはRNAの転写の前、あるいは転写の際に供給されう
る。このような実施形態において、野生型ウイルス、ヘルパーウイルス、ウイル
ス抽出物、ウイルスタンパク質を発現する合成cDNAまたはRNAの形で、複製に必
要なウイルスタンパク質および機能が供給されて、感染またはトランスフェクシ
ョンにより宿主細胞に導入される。この感染/トランスフェクションは、キメラ
ウイルスをコードする合成cDNAまたはRNAの導入の前、または導入と同時に行う
。
【００５７】
特に望ましい手法では、NDVウイルス遺伝子の全てを発現するように操作され
た細胞は、所望の遺伝子型を含む感染性キメラウイルスの産生を可能とし、従っ
て選択システムを不要とする。理論的には、NDVの６個の遺伝子のいずれか、ま
たは該６個の遺伝子のいずれか一つの一部分を、外来配列と置換することが可能
である。しかし、不完全なウイルス（正常のウイルス遺伝子産物が欠損している
か、または改変されているため、不完全である）を増殖させる能力が、この理論
には不可欠な側面である。この問題を回避するための多くの可能な手法がある。
一つの手法は、ある突然変異タンパク質を有するウイルスは、その同じタンパク
質の野生型を恒常的に発現するように構築した細胞系内では増殖可能である。こ
のようにして、細胞系がウイルスの突然変異を補足する。同様の技術を用いて、
NDV遺伝子のいずれかを恒常的に発現する形質転換した細胞系を構築してもよい
。これらの、ウイルスタンパク質を発現するように作成された細胞系を用いて組
換えウイルスにおける欠損を補足して、該ウイルスを増殖できる。あるいはまた
、特定の天然の宿主域の系を、組換えウイルスを増殖させるために利用すること
も可能である。
た細胞は、所望の遺伝子型を含む感染性キメラウイルスの産生を可能とし、従っ
て選択システムを不要とする。理論的には、NDVの６個の遺伝子のいずれか、ま
たは該６個の遺伝子のいずれか一つの一部分を、外来配列と置換することが可能
である。しかし、不完全なウイルス（正常のウイルス遺伝子産物が欠損している
か、または改変されているため、不完全である）を増殖させる能力が、この理論
には不可欠な側面である。この問題を回避するための多くの可能な手法がある。
一つの手法は、ある突然変異タンパク質を有するウイルスは、その同じタンパク
質の野生型を恒常的に発現するように構築した細胞系内では増殖可能である。こ
のようにして、細胞系がウイルスの突然変異を補足する。同様の技術を用いて、
NDV遺伝子のいずれかを恒常的に発現する形質転換した細胞系を構築してもよい
。これらの、ウイルスタンパク質を発現するように作成された細胞系を用いて組
換えウイルスにおける欠損を補足して、該ウイルスを増殖できる。あるいはまた
、特定の天然の宿主域の系を、組換えウイルスを増殖させるために利用すること
も可能である。
【００５８】
さらに他の実施形態においては、複製に必要なウイルスタンパク質および機能
は、合成cDNAまたはRNAの形で遺伝物質として提供されて、キメラウイルスをコ
ードする合成cDNAまたはRNAとともに転写されうる。特に望ましい手法において
は、実施例に記載の通り（上述の第11節を参照のこと）、キメラウイルス、なら
びにウイルスポリメラーゼおよび/または他のウイルス機能を発現するプラスミ
ドを宿主細胞に共トランスフェクトする。
は、合成cDNAまたはRNAの形で遺伝物質として提供されて、キメラウイルスをコ
ードする合成cDNAまたはRNAとともに転写されうる。特に望ましい手法において
は、実施例に記載の通り（上述の第11節を参照のこと）、キメラウイルス、なら
びにウイルスポリメラーゼおよび/または他のウイルス機能を発現するプラスミ
ドを宿主細胞に共トランスフェクトする。
【００５９】
組換えウイルスを増殖させる他の手法は、野生型ウイルスとの共培養を含む。
該手法は、単純に、組換えウイルスを得て、それと他の野生型ウイルス（好まし
くはワクチンの株）を細胞に共感染させるだけでよい。該野生型ウイルスは、欠
損したウイルス遺伝子産物を補足し、野生型および組換え型ウイルスの双方を増
殖させねばならない。あるいは、組換えウイルスの増殖を助けるために、ヘルパ
ーウイルスを用いてもよい。
該手法は、単純に、組換えウイルスを得て、それと他の野生型ウイルス（好まし
くはワクチンの株）を細胞に共感染させるだけでよい。該野生型ウイルスは、欠
損したウイルス遺伝子産物を補足し、野生型および組換え型ウイルスの双方を増
殖させねばならない。あるいは、組換えウイルスの増殖を助けるために、ヘルパ
ーウイルスを用いてもよい。
【００６０】
もう一つの手法においては、合成した鋳型は、NDVウイルスポリメラーゼタン
パク質を発現する組換えウイルスに共感染した細胞内で複製できる。実際、この
方法を使用して、本発明の組換え感染性ウイルスをレスキューできる。この目的
のために、NDVポリメラーゼタンパク質を、ウイルス発現ベクター（例えば、ワ
クシニアウイルス、アデノウイルス、バキュロウイルスなど）、またはポリメラ
ーゼタンパク質を発現する細胞系（例えば、Krystalら、1986、Proc. Natl. Aca
d. Sci.USA 83:2709-2713） を含む（しかし、限定するわけではない）いずれか
の発現ベクター/宿主細胞系において発現させ得る。さらに、６種のNDVタンパク
質の全てを発現する宿主細胞への感染により、感染性キメラウイルス粒子を産生
することができる。この系においては、産生される全ての組換えウイルスが所望
の遺伝子型を有しているため、選択システムの必要性を省けるであろう。ウイル
スの生存可能性を改変することなく、組換えウイルスを構築できることは、注目
されるべきである。さらに、これらの改変ウイルスは、増殖可能であり、複製に
ヘルパー機能を必要としない。
パク質を発現する組換えウイルスに共感染した細胞内で複製できる。実際、この
方法を使用して、本発明の組換え感染性ウイルスをレスキューできる。この目的
のために、NDVポリメラーゼタンパク質を、ウイルス発現ベクター（例えば、ワ
クシニアウイルス、アデノウイルス、バキュロウイルスなど）、またはポリメラ
ーゼタンパク質を発現する細胞系（例えば、Krystalら、1986、Proc. Natl. Aca
d. Sci.USA 83:2709-2713） を含む（しかし、限定するわけではない）いずれか
の発現ベクター/宿主細胞系において発現させ得る。さらに、６種のNDVタンパク
質の全てを発現する宿主細胞への感染により、感染性キメラウイルス粒子を産生
することができる。この系においては、産生される全ての組換えウイルスが所望
の遺伝子型を有しているため、選択システムの必要性を省けるであろう。ウイル
スの生存可能性を改変することなく、組換えウイルスを構築できることは、注目
されるべきである。さらに、これらの改変ウイルスは、増殖可能であり、複製に
ヘルパー機能を必要としない。
【００６１】5.4. キメラウイルスを用いたワクチン製剤
本発明は、本発明の遺伝子操作したマイナス鎖RNAウイルスを含有するワクチ
ン製剤を包含する。本発明は、NDV感染症に対してL防御を与えるように改変され
た組換えNDVウイルスのワクチン製剤における使用を包含する。他の実施形態に
おいては、本発明の組換えNDVウイルスを、種々の病原体の任意のものに対する
防御応答を誘導する外来エピトープを発現するためのビヒクルとして使用し得る
。
ン製剤を包含する。本発明は、NDV感染症に対してL防御を与えるように改変され
た組換えNDVウイルスのワクチン製剤における使用を包含する。他の実施形態に
おいては、本発明の組換えNDVウイルスを、種々の病原体の任意のものに対する
防御応答を誘導する外来エピトープを発現するためのビヒクルとして使用し得る
。
【００６２】
本発明は、ヒトおよび動物に投与するワクチン製剤を包含する。特に本発明は
、家庭用動物（イヌおよびネコなど）、野生動物（キツネおよびアライグマなど
）、家畜類（ウシ、ウマおよびブタ、ヒツジおよびヤギなど）、ならびに家禽（
ニワトリおよびシチメンチョウなど）に投与するワクチン製剤を包含する。
、家庭用動物（イヌおよびネコなど）、野生動物（キツネおよびアライグマなど
）、家畜類（ウシ、ウマおよびブタ、ヒツジおよびヤギなど）、ならびに家禽（
ニワトリおよびシチメンチョウなど）に投与するワクチン製剤を包含する。
【００６３】
本発明は、NDV、マレク病ウイルス（MDV）、伝染性ファルビキウス病ウイルス
（IBDV）、伝染性気管支炎ウイルス（IBV）、伝染性滑液包炎ウイルス、ニワト
リ貧血ウイルス（CAV）、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ILV）、トリ白血症ウイル
ス（ALV）、細網内皮症ウイルス（RV）、およびトリインフルエンザウイルスを
含む鳥類疾患を引き起こす因子に対して有用なワクチン製剤を包含する。
（IBDV）、伝染性気管支炎ウイルス（IBV）、伝染性滑液包炎ウイルス、ニワト
リ貧血ウイルス（CAV）、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ILV）、トリ白血症ウイル
ス（ALV）、細網内皮症ウイルス（RV）、およびトリインフルエンザウイルスを
含む鳥類疾患を引き起こす因子に対して有用なワクチン製剤を包含する。
【００６４】
他の実施形態において、本発明は、狂犬病ウイルス、ネコ白血病ウイルス（FL
V）およびイヌジステンパーウイルスを含む家畜病（domestic disease）を引き
起こす因子に対し有用なワクチン製剤を包含する。さらに他の実施形態において
は、本発明は、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、牛疫ウイルス、豚痘ウ
イルスに対する家畜類の防御に有用なワクチン製剤、およびさらに狂犬病ウイル
スに対する野生動物の防御に有用なワクチン製剤を包含する。
V）およびイヌジステンパーウイルスを含む家畜病（domestic disease）を引き
起こす因子に対し有用なワクチン製剤を包含する。さらに他の実施形態において
は、本発明は、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、牛疫ウイルス、豚痘ウ
イルスに対する家畜類の防御に有用なワクチン製剤、およびさらに狂犬病ウイル
スに対する野生動物の防御に有用なワクチン製剤を包含する。
【００６５】
逆方向遺伝学的アプローチにより作製された弱毒化ウイルスを本明細書に記載
するワクチンおよび医薬製剤に使用し得る。また逆方向遺伝学的手法を使用して
、ワクチン製造に重要な他のウイルス遺伝子にさらに突然変異を遺伝子操作し得
る。すなわち、有用なワクチン株変異体のエピトープを弱毒化ウイルス中に遺伝
子操作しうる。あるいは、完全に外来のエピトープ、例えば他のウイルス病原体
または非ウイルス病原体に由来する抗原を弱毒化株中に遺伝子操作し得る。例え
ば、HIV（gp160、gp120、gp41）などの関係の無いウイルスの抗原、寄生生物（
マラリアなど）の抗原、細菌もしくは真菌の抗原または腫瘍抗原を弱毒化株中に
遺伝子操作し得る。あるいは、ウイルス親和性をin vivoにて改変するエピトー
プを本発明のキメラ弱毒化ウイルス中に遺伝子操作し得る。
するワクチンおよび医薬製剤に使用し得る。また逆方向遺伝学的手法を使用して
、ワクチン製造に重要な他のウイルス遺伝子にさらに突然変異を遺伝子操作し得
る。すなわち、有用なワクチン株変異体のエピトープを弱毒化ウイルス中に遺伝
子操作しうる。あるいは、完全に外来のエピトープ、例えば他のウイルス病原体
または非ウイルス病原体に由来する抗原を弱毒化株中に遺伝子操作し得る。例え
ば、HIV（gp160、gp120、gp41）などの関係の無いウイルスの抗原、寄生生物（
マラリアなど）の抗原、細菌もしくは真菌の抗原または腫瘍抗原を弱毒化株中に
遺伝子操作し得る。あるいは、ウイルス親和性をin vivoにて改変するエピトー
プを本発明のキメラ弱毒化ウイルス中に遺伝子操作し得る。
【００６６】
実際には、任意の異種遺伝子配列をワクチンに使用するための本発明のキメラ
ウイルス中に構築し得る。好ましくは、種々の病原体、または中和抗体に結合す
る抗原のいずれかに対して防御免疫応答を誘導するエピトープを、キメラウイル
スにより、またはその一部として発現させ得る。例えば、本発明のキメラウイル
ス中に構築し得る異種遺伝子配列には、限定するものではないが、インフルエン
ザ糖タンパク質、特に、赤血球凝集素H5、H7、マレク病ウイルスのエピトープ；
伝染性ファルビキウス病ウイルス（IBDV）、伝染性気管支炎ウイルス（IBV）、
ニワトリ貧血ウイルス（CAV）、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ILV）、トリ白血症
ウイルス（ALV）、細網内皮症ウイルス（RV）、トリインフルエンザウイルス（A
IV）、狂犬病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、イヌジステンパーウイルス、水疱
性口内炎ウイルス、牛疫ウイルス、および豚痘ウイルスのエピトープが含まれる
（Fieldsら(編)、1991, Fundamental Virology, 第2版, Raven Press, New York
を参照のこと。参照によりその全文を本明細書に組み入れる。）。
ウイルス中に構築し得る。好ましくは、種々の病原体、または中和抗体に結合す
る抗原のいずれかに対して防御免疫応答を誘導するエピトープを、キメラウイル
スにより、またはその一部として発現させ得る。例えば、本発明のキメラウイル
ス中に構築し得る異種遺伝子配列には、限定するものではないが、インフルエン
ザ糖タンパク質、特に、赤血球凝集素H5、H7、マレク病ウイルスのエピトープ；
伝染性ファルビキウス病ウイルス（IBDV）、伝染性気管支炎ウイルス（IBV）、
ニワトリ貧血ウイルス（CAV）、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ILV）、トリ白血症
ウイルス（ALV）、細網内皮症ウイルス（RV）、トリインフルエンザウイルス（A
IV）、狂犬病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、イヌジステンパーウイルス、水疱
性口内炎ウイルス、牛疫ウイルス、および豚痘ウイルスのエピトープが含まれる
（Fieldsら(編)、1991, Fundamental Virology, 第2版, Raven Press, New York
を参照のこと。参照によりその全文を本明細書に組み入れる。）。
【００６７】
さらに他の実施形態において、キメラウイルス中に遺伝子操作し得る異種遺伝
子配列には、免疫増強活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が含まれる。
免疫増強タンパク質の例としては、限定するものではないが、サイトカイン、I
型インターフェロン、γインターフェロン、コロニー刺激因子、インターロイキ
ン-1、-2、-4、-5、-6、-12が含まれる。
子配列には、免疫増強活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が含まれる。
免疫増強タンパク質の例としては、限定するものではないが、サイトカイン、I
型インターフェロン、γインターフェロン、コロニー刺激因子、インターロイキ
ン-1、-2、-4、-5、-6、-12が含まれる。
【００６８】
さらに、ワクチンに使用するための本発明のキメラウイルス中に構築し得る異
種遺伝子配列には、限定するものではないが、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、
好ましくは1型または2型由来の配列が含まれる。好ましい実施形態においては、
抗原の供与源となり得る免疫原性HIV由来のペプチドを、キメラNDV中に構築して
、その後でそれを使用して脊椎動物の免疫応答を誘導し得る。かかるHIV由来の
ペプチドには、限定するものではないが、env遺伝子由来の配列（すなわち、gp1
60、gp120、および／もしくはgp41の全てもしくは一部をコードする配列）、pol
遺伝子由来の配列（すなわち、逆転写酵素、エンドヌクレアーゼ、プロテアーゼ
、および／もしくはインテグラーゼの全てもしくは一部をコードする配列）、ga
g遺伝子由来の配列（すなわち、p7、p6、p55、p17/18、p24/25の全てもしくは一
部をコードする配列）、tat、rev、nef、vif、vpu、vpr、ならびに／またはvpx
に由来する配列が含まれる。
種遺伝子配列には、限定するものではないが、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、
好ましくは1型または2型由来の配列が含まれる。好ましい実施形態においては、
抗原の供与源となり得る免疫原性HIV由来のペプチドを、キメラNDV中に構築して
、その後でそれを使用して脊椎動物の免疫応答を誘導し得る。かかるHIV由来の
ペプチドには、限定するものではないが、env遺伝子由来の配列（すなわち、gp1
60、gp120、および／もしくはgp41の全てもしくは一部をコードする配列）、pol
遺伝子由来の配列（すなわち、逆転写酵素、エンドヌクレアーゼ、プロテアーゼ
、および／もしくはインテグラーゼの全てもしくは一部をコードする配列）、ga
g遺伝子由来の配列（すなわち、p7、p6、p55、p17/18、p24/25の全てもしくは一
部をコードする配列）、tat、rev、nef、vif、vpu、vpr、ならびに／またはvpx
に由来する配列が含まれる。
【００６９】
他の異種配列は、いくつかを挙げると、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（HBsAg）
；A型もしくはC型肝炎ウイルス表面抗原、エプスタイン-バーウイルスの糖タン
パク質；ヒトパピローマウイルスの糖タンパク質；RSウイルス、パラインフルエ
ンザウイルス、センダイウイルス、シミアンウイルス5もしくは流行性耳下腺炎
ウイルスの糖タンパク質；インフルエンザウイルスの糖タンパク質；ヘルペスウ
イルスの糖タンパク質（例えばgD、gE）；ポリオウイルスのVP1；非ウイルス病
原体（細菌および寄生生物など）の抗原決定基に由来し得る。他の実施形態にお
いては、免疫グロブリン遺伝子の全てまたは一部を発現させ得る。例えば、かか
るエピトープを模倣する抗イディオタイプ免疫グロブリンの可変領域を本発明の
キメラウイルス中に構築し得る。
；A型もしくはC型肝炎ウイルス表面抗原、エプスタイン-バーウイルスの糖タン
パク質；ヒトパピローマウイルスの糖タンパク質；RSウイルス、パラインフルエ
ンザウイルス、センダイウイルス、シミアンウイルス5もしくは流行性耳下腺炎
ウイルスの糖タンパク質；インフルエンザウイルスの糖タンパク質；ヘルペスウ
イルスの糖タンパク質（例えばgD、gE）；ポリオウイルスのVP1；非ウイルス病
原体（細菌および寄生生物など）の抗原決定基に由来し得る。他の実施形態にお
いては、免疫グロブリン遺伝子の全てまたは一部を発現させ得る。例えば、かか
るエピトープを模倣する抗イディオタイプ免疫グロブリンの可変領域を本発明の
キメラウイルス中に構築し得る。
【００７０】
他の異種配列を腫瘍抗原から誘導し、得られたキメラウイルスを使用して腫瘍
細胞に対する免疫応答を生じさせ、in vivoで腫瘍退縮をもたらし得る。これら
のワクチンは、腫瘍治療のための他の治療処方計画と組み合わせて使用してもよ
い。かかる治療レジメンには、限定するものではないが、化学療法、放射線療法
、外科手術、骨髄移植などが含まれる。本発明に従って組換えウイルスを、腫瘍
関連抗原（TAA）を発現するように遺伝子操作し得る。該TAAには、限定するもの
ではないが、T細胞により認識されるヒト腫瘍抗原（RobbinsおよびKawakami、19
96, Curr. Opin. Immunol. 8: 628-636、参照によりその全文を本明細書に組み
入れる）、メラニン細胞系統タンパク質（gp100、MART-1/MelanA、TRP-1(gp75)
、チロシナーゼなど）、広く共有されている腫瘍特異的抗原（MAGE-1、MAGE-3、
BAGE、GAGE-1、GAGE-1、N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ-V、p15
など）、腫瘍特異的突然変異抗原（βカテニン、MUM-1、CDK4など）、ならびに
乳癌、卵巣癌、頸癌、および膵癌の非メラノーマ抗原（HER-2/neu、ヒトパピロ
ーマウイルス-E6、-E7、MUC-1）が含まれる。
細胞に対する免疫応答を生じさせ、in vivoで腫瘍退縮をもたらし得る。これら
のワクチンは、腫瘍治療のための他の治療処方計画と組み合わせて使用してもよ
い。かかる治療レジメンには、限定するものではないが、化学療法、放射線療法
、外科手術、骨髄移植などが含まれる。本発明に従って組換えウイルスを、腫瘍
関連抗原（TAA）を発現するように遺伝子操作し得る。該TAAには、限定するもの
ではないが、T細胞により認識されるヒト腫瘍抗原（RobbinsおよびKawakami、19
96, Curr. Opin. Immunol. 8: 628-636、参照によりその全文を本明細書に組み
入れる）、メラニン細胞系統タンパク質（gp100、MART-1/MelanA、TRP-1(gp75)
、チロシナーゼなど）、広く共有されている腫瘍特異的抗原（MAGE-1、MAGE-3、
BAGE、GAGE-1、GAGE-1、N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ-V、p15
など）、腫瘍特異的突然変異抗原（βカテニン、MUM-1、CDK4など）、ならびに
乳癌、卵巣癌、頸癌、および膵癌の非メラノーマ抗原（HER-2/neu、ヒトパピロ
ーマウイルス-E6、-E7、MUC-1）が含まれる。
【００７１】
組換えウイルス生ワクチンまたは組換えウイルス不活化ワクチンのいずれかを
製剤化し得る。宿主における操作により天然感染で生じるのと同種かつ同程度の
持続性刺激がもたらされ、それゆえ実質的な長期持続性免疫を付与するので、生
ワクチンが好ましい。かかる組換えウイルス生ワクチン製剤の製造は、慣例的方
法を用いて達成し得るが、それには、細胞培養物中またはニワトリ胚の尿膜中で
ウイルスを増殖させ、続いて精製を行うことが含まれる。さらに、NDVがヒトに
おいて非病原性であると示されているので、このウイルスは生ワクチンとしての
使用に非常に適している。
製剤化し得る。宿主における操作により天然感染で生じるのと同種かつ同程度の
持続性刺激がもたらされ、それゆえ実質的な長期持続性免疫を付与するので、生
ワクチンが好ましい。かかる組換えウイルス生ワクチン製剤の製造は、慣例的方
法を用いて達成し得るが、それには、細胞培養物中またはニワトリ胚の尿膜中で
ウイルスを増殖させ、続いて精製を行うことが含まれる。さらに、NDVがヒトに
おいて非病原性であると示されているので、このウイルスは生ワクチンとしての
使用に非常に適している。
【００７２】
上記の点に関して、ワクチン用途のための遺伝子操作したNDV（ベクター）の
使用においては、これらの株に弱毒化特性あることが望ましい。トランスフェク
ションに使用する鋳型への適切な突然変異（例えば欠失）の導入によって、弱毒
化特性を有する新規ウイルスが提供され得る。例えば、温度感受性または低温適
応に関連する特定のミスセンス突然変異を欠失突然変異とし得る。これらの突然
変異は、低温または温度感受性の突然変異体に関連する点突然変異よりも安定で
ある必要があり、また復帰突然変異頻度が極めて低くなければならない。
使用においては、これらの株に弱毒化特性あることが望ましい。トランスフェク
ションに使用する鋳型への適切な突然変異（例えば欠失）の導入によって、弱毒
化特性を有する新規ウイルスが提供され得る。例えば、温度感受性または低温適
応に関連する特定のミスセンス突然変異を欠失突然変異とし得る。これらの突然
変異は、低温または温度感受性の突然変異体に関連する点突然変異よりも安定で
ある必要があり、また復帰突然変異頻度が極めて低くなければならない。
【００７３】
あるいは、「自殺」特性を有するキメラウイルスを構築してもよい。かかるウ
イルスは、宿主内でほんの1もしくは数ラウンドの複製を行う。ワクチンとして
使用する場合、該組換えウイルスは、制限された複製サイクルを経て、十分なレ
ベルの免疫応答を誘導するが、ヒト宿主中ではそれ以上の複製サイクルを経て疾
病を引き起こすことはない。1個以上のNDV遺伝子を欠損するまたは突然変異NDV
遺伝子を有する組換えウイルスは、複製の連続的ラウンドを経ることができない
。欠陥ウイルスは、かかる遺伝子を永久に発現する細胞系で産生させうる。必須
遺伝子を欠損するウイルスは、これらの細胞系で複製するが、ヒト宿主に投与さ
れると、複製のラウンドを完結することができない。かかる調製物は、この不全
サイクルにおいて、免疫応答を誘導するのに十分な数の遺伝子を転写および翻訳
し得る。あるいは、より多量の株を投与して、これらの調製物を不活化（死滅）
ウイルスワクチンとして作用させてもよい。不活化ワクチンに関しては、異種遺
伝子産物がビリオンと会合するように、異種遺伝子配列をウイルス成分として発
現させるのが好ましい。かかる調製物の利点は、それらが天然タンパク質を含有
し、ホルマリンまたは死滅ウイルスワクチンの製造に使用する他の薬剤による処
理によって不活化を受けないことである。あるいは、cDNAから作製した突然変異
NDVをほんの数ラウンドの複製を行うように、高度に弱毒化してもよい。
イルスは、宿主内でほんの1もしくは数ラウンドの複製を行う。ワクチンとして
使用する場合、該組換えウイルスは、制限された複製サイクルを経て、十分なレ
ベルの免疫応答を誘導するが、ヒト宿主中ではそれ以上の複製サイクルを経て疾
病を引き起こすことはない。1個以上のNDV遺伝子を欠損するまたは突然変異NDV
遺伝子を有する組換えウイルスは、複製の連続的ラウンドを経ることができない
。欠陥ウイルスは、かかる遺伝子を永久に発現する細胞系で産生させうる。必須
遺伝子を欠損するウイルスは、これらの細胞系で複製するが、ヒト宿主に投与さ
れると、複製のラウンドを完結することができない。かかる調製物は、この不全
サイクルにおいて、免疫応答を誘導するのに十分な数の遺伝子を転写および翻訳
し得る。あるいは、より多量の株を投与して、これらの調製物を不活化（死滅）
ウイルスワクチンとして作用させてもよい。不活化ワクチンに関しては、異種遺
伝子産物がビリオンと会合するように、異種遺伝子配列をウイルス成分として発
現させるのが好ましい。かかる調製物の利点は、それらが天然タンパク質を含有
し、ホルマリンまたは死滅ウイルスワクチンの製造に使用する他の薬剤による処
理によって不活化を受けないことである。あるいは、cDNAから作製した突然変異
NDVをほんの数ラウンドの複製を行うように、高度に弱毒化してもよい。
【００７４】
本発明のこの態様の他の実施形態においては、不活化ワクチン製剤を、キメラ
ウイルスを「死滅」させるための慣例法を使用して調製し得る。不活化ワクチン
は、それらの感染力が破壊されているという点で「死んでいる」。理想的には、
ウイルスの感染力をその免疫原性に影響を及ぼすことなく破壊する。不活化ワク
チンを調製するために、キメラウイルスを細胞培養物またはニワトリ胚の尿膜中
で増殖させ、ゾーン超遠心分離法により精製し、ホルムアルデヒドまたはβ-プ
ロピオラクトンにより不活化し、そしてプールする。得られたワクチンは通常筋
肉内に接種する。
ウイルスを「死滅」させるための慣例法を使用して調製し得る。不活化ワクチン
は、それらの感染力が破壊されているという点で「死んでいる」。理想的には、
ウイルスの感染力をその免疫原性に影響を及ぼすことなく破壊する。不活化ワク
チンを調製するために、キメラウイルスを細胞培養物またはニワトリ胚の尿膜中
で増殖させ、ゾーン超遠心分離法により精製し、ホルムアルデヒドまたはβ-プ
ロピオラクトンにより不活化し、そしてプールする。得られたワクチンは通常筋
肉内に接種する。
【００７５】
不活化ウイルスを、免疫応答を高めるために適切なアジュバンドと共に製剤化
し得る。かかるアジュバントには、限定するものではないが、無機ゲル（水酸化
アルミニウムなど）；界面活性物質（リゾレシチン、プルロニックポリオール、
ポリアニオンなど）；ペプチド；油乳剤；ならびに潜在的に有用なヒトアジュバ
ント（BCGおよび挫瘡プロピオンバクテリウム(Corynebacterium parvum)など）
が含まれ得る。
し得る。かかるアジュバントには、限定するものではないが、無機ゲル（水酸化
アルミニウムなど）；界面活性物質（リゾレシチン、プルロニックポリオール、
ポリアニオンなど）；ペプチド；油乳剤；ならびに潜在的に有用なヒトアジュバ
ント（BCGおよび挫瘡プロピオンバクテリウム(Corynebacterium parvum)など）
が含まれ得る。
【００７６】
上述のワクチン製剤を導入するために多くの方法を使用することができ、これ
ら方法には、限定するものではないが、経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、
皮下、および鼻腔内経路が含まれる。ワクチン設計にかかる病原体の感染の自然
経路によりキメラウイルスワクチン製剤を導入することが好ましい。
ら方法には、限定するものではないが、経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、
皮下、および鼻腔内経路が含まれる。ワクチン設計にかかる病原体の感染の自然
経路によりキメラウイルスワクチン製剤を導入することが好ましい。
【００７７】6. 実施例：組換えNDVによる外来遺伝子の発現およびパッケージング
NDVミニゲノムを用いたクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺
伝子（CAT）の発現を記載する。NDVミニゲノムを、CAT遺伝子を含有する組換え
プラスミドであるpNDVCATを用いて調製した。pNDVCATプラスミドは、配列中に、
T7プロモーター、非コードNDV RNA配列の191ヌクレオチドを含むNDVゲノムRNAの
5'末端、挿入された5ヌクレオチド （3'CTTAA）、逆方向および相補方向（compl
emented order）のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）遺
伝子の完全コード配列、非コードNDV RNA配列の121ヌクレオチドを含むNDVゲノ
ムRNA配列の3'末端、BbsIクローニング部位、ならびに鋳型のラン・オフ転写法
を可能にするいくつかの制限部位を含む、pUC19プラスミドである。pNDVCATを、
T7ポリメラーゼを用いて転写し、CAT遺伝子の付近に逆配向でニューキャッスル
病ウイルスのセンスフランキング配列を有するRNAを作製し得る。
伝子（CAT）の発現を記載する。NDVミニゲノムを、CAT遺伝子を含有する組換え
プラスミドであるpNDVCATを用いて調製した。pNDVCATプラスミドは、配列中に、
T7プロモーター、非コードNDV RNA配列の191ヌクレオチドを含むNDVゲノムRNAの
5'末端、挿入された5ヌクレオチド （3'CTTAA）、逆方向および相補方向（compl
emented order）のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）遺
伝子の完全コード配列、非コードNDV RNA配列の121ヌクレオチドを含むNDVゲノ
ムRNA配列の3'末端、BbsIクローニング部位、ならびに鋳型のラン・オフ転写法
を可能にするいくつかの制限部位を含む、pUC19プラスミドである。pNDVCATを、
T7ポリメラーゼを用いて転写し、CAT遺伝子の付近に逆配向でニューキャッスル
病ウイルスのセンスフランキング配列を有するRNAを作製し得る。
【００７８】
パラミクソウイルスRNAの長さは、RNA複製のレベルを決定する主要な因子であ
り、ゲノム複製は、ヌクレオチドの総数が6の倍数である場合に最も効率がよい
。NDVに関しては、この6の法則が複製に重要であるかどうかの問題を、1〜5ヌク
レオチドで異なるような種々の長さのCATミニレプリコンを作製することにより
調べた。ゲノムが6で割り切れる構築物1つのみが高CAT活性を誘導することがで
きた。
り、ゲノム複製は、ヌクレオチドの総数が6の倍数である場合に最も効率がよい
。NDVに関しては、この6の法則が複製に重要であるかどうかの問題を、1〜5ヌク
レオチドで異なるような種々の長さのCATミニレプリコンを作製することにより
調べた。ゲノムが6で割り切れる構築物1つのみが高CAT活性を誘導することがで
きた。
【００７９】6.1. ニューキャッスル病ウイルスミニゲノムの構築
NDVミニゲノムを構築するために、前掲に記載の通りに以下の手法を使用した
。ゲノムNDV RNAの5'末端配列を、当技術分野で標準的な技法を用いてRACE（Gib
co, BRL）により得た。RACE反応用の鋳型は、NDVビリオン（NDV-CL：California
/11914/1944など）から精製したゲノムRNAであった。図３に示すように、この末
端配列は、64ヌクレオチドのトレーラー配列および127ヌクレオチドのL遺伝子の
非翻訳領域を含有していた。191ヌクレオチドのウイルス配列に隣接して位置す
るように、5ヌクレオチド配列（3' CCTTAA）を挿入した。CAT遺伝子は、ウイル
スの5'末端と3'末端の非コード領域の間に位置する667ヌクレオチドのCATオープ
ンリーディングフレームを含有した。NDV配列の3'末端領域を得るために、RT-PC
Rを使用した。RT-PCR反応用の鋳型は、NDVのin vitroポリアデニル化ゲノムRNA
であった。図３に示すように、3'末端領域の121ヌクレオチドは、56ヌクレオチ
ドのNP遺伝子の非翻訳領域および65ヌクレオチドのリーダー配列から構成された
。得られたNDVミニゲノムの構築物を図１に示す。3'および5'の非コード末端領
域のヌクレオチド配列を図３に示す。
。ゲノムNDV RNAの5'末端配列を、当技術分野で標準的な技法を用いてRACE（Gib
co, BRL）により得た。RACE反応用の鋳型は、NDVビリオン（NDV-CL：California
/11914/1944など）から精製したゲノムRNAであった。図３に示すように、この末
端配列は、64ヌクレオチドのトレーラー配列および127ヌクレオチドのL遺伝子の
非翻訳領域を含有していた。191ヌクレオチドのウイルス配列に隣接して位置す
るように、5ヌクレオチド配列（3' CCTTAA）を挿入した。CAT遺伝子は、ウイル
スの5'末端と3'末端の非コード領域の間に位置する667ヌクレオチドのCATオープ
ンリーディングフレームを含有した。NDV配列の3'末端領域を得るために、RT-PC
Rを使用した。RT-PCR反応用の鋳型は、NDVのin vitroポリアデニル化ゲノムRNA
であった。図３に示すように、3'末端領域の121ヌクレオチドは、56ヌクレオチ
ドのNP遺伝子の非翻訳領域および65ヌクレオチドのリーダー配列から構成された
。得られたNDVミニゲノムの構築物を図１に示す。3'および5'の非コード末端領
域のヌクレオチド配列を図３に示す。
【００８０】6.2. NDV NP、PおよびL発現プラスミドの構築
第5節に記載のように、マイナス鎖RNAゲノムの転写または複製には、ウイルス
によりもたらされるべきいくつかのタンパク質成分が必要であり、Lタンパク質
、Pタンパク質およびNPタンパク質が含まれる。NDVミニゲノムからの発現を促進
するために、L、PおよびNPタンパク質をそれぞれコードする遺伝子を、図2A〜C
に記載のようにpTM1発現ベクター中にクローニングした。pTM1発現ベクターは、
T7プロモーター、目的の遺伝子（L、PまたはNP）の挿入用のいくつかのクローニ
ング部位、T7ターミネーター、pUC19複製起点、およびアンピシリン耐性遺伝子
を含有する。発現プラスミドを構築するために、NDV核タンパク質（NP）、リン
タンパク質（P）およびポリメラーゼ（L）の全長DNAをRT-PCR増幅により得た。
これらのDNAをT7ポリメラーゼ発現ベクターであるpTM1にそれぞれクローニング
した（図2A〜C）。
によりもたらされるべきいくつかのタンパク質成分が必要であり、Lタンパク質
、Pタンパク質およびNPタンパク質が含まれる。NDVミニゲノムからの発現を促進
するために、L、PおよびNPタンパク質をそれぞれコードする遺伝子を、図2A〜C
に記載のようにpTM1発現ベクター中にクローニングした。pTM1発現ベクターは、
T7プロモーター、目的の遺伝子（L、PまたはNP）の挿入用のいくつかのクローニ
ング部位、T7ターミネーター、pUC19複製起点、およびアンピシリン耐性遺伝子
を含有する。発現プラスミドを構築するために、NDV核タンパク質（NP）、リン
タンパク質（P）およびポリメラーゼ（L）の全長DNAをRT-PCR増幅により得た。
これらのDNAをT7ポリメラーゼ発現ベクターであるpTM1にそれぞれクローニング
した（図2A〜C）。
【００８１】6.3. NDVミニゲノムのRNA転写
NDVミニ遺伝子プラスミドからのRNA転写を、Ribomaxキット（Promega）を説明
書に記載のように用いて実施した。ラン・オフ転写法を可能にするために、1μg
のNDVミニゲノムプラスミド（pNDVCAT）をBbs Iにより消化した。続いてこの線
状化プラスミドを転写反応（37℃にて2時間）の鋳型として使用した。鋳型DNAを
除去するために、得られた反応混合物をRNase非含有DNaseにより処理（37℃にて
15分間）し、フェノール-クロロホルム抽出、続いてエタノール沈殿を行って精
製した。
書に記載のように用いて実施した。ラン・オフ転写法を可能にするために、1μg
のNDVミニゲノムプラスミド（pNDVCAT）をBbs Iにより消化した。続いてこの線
状化プラスミドを転写反応（37℃にて2時間）の鋳型として使用した。鋳型DNAを
除去するために、得られた反応混合物をRNase非含有DNaseにより処理（37℃にて
15分間）し、フェノール-クロロホルム抽出、続いてエタノール沈殿を行って精
製した。
【００８２】6.4. 細胞トランスフェクション
Cos-1細胞または293T細胞を35 mmディッシュ上で増殖させ、トランスフェクシ
ョンの前に1時間かけて感染多重度（moi）約1でヘルパーウイルスrVV T7を感染
させた。次に該細胞をNDVのNP、PおよびLタンパク質をコードする発現ベクター
を用いてトランスフェクトした。具体的には、トランスフェクションをDOTAP（B
oehringer Mannheim）を用いて実施した。ヘルパーウイルス感染の後、細胞をpT
M1-NP（1μg）、pTM1-P（1μg）およびpTM1-L（0.1μg）を用いて4時間かけてト
ランスフェクトした。Lタンパク質を欠損する対照トランスフェクションは、pTM
1-NP（1μg）、pTM1-P（1μg）および偽pTM1-L（0μg）を用いて同様の細胞セッ
トで実施した。4時間のインキュベーション期間の後、細胞を0.5μgのNDV-CATキ
メラ(-)RNAを用いたRNAトランスフェクションにかけた（図１参照）。RNAトラン
スフェクションの後、細胞を18時間インキュベートした。続いて細胞溶解物をCA
Tアッセイのために回収した。
ョンの前に1時間かけて感染多重度（moi）約1でヘルパーウイルスrVV T7を感染
させた。次に該細胞をNDVのNP、PおよびLタンパク質をコードする発現ベクター
を用いてトランスフェクトした。具体的には、トランスフェクションをDOTAP（B
oehringer Mannheim）を用いて実施した。ヘルパーウイルス感染の後、細胞をpT
M1-NP（1μg）、pTM1-P（1μg）およびpTM1-L（0.1μg）を用いて4時間かけてト
ランスフェクトした。Lタンパク質を欠損する対照トランスフェクションは、pTM
1-NP（1μg）、pTM1-P（1μg）および偽pTM1-L（0μg）を用いて同様の細胞セッ
トで実施した。4時間のインキュベーション期間の後、細胞を0.5μgのNDV-CATキ
メラ(-)RNAを用いたRNAトランスフェクションにかけた（図１参照）。RNAトラン
スフェクションの後、細胞を18時間インキュベートした。続いて細胞溶解物をCA
Tアッセイのために回収した。
【００８３】6.5. CATアッセイ
CATアッセイを、Gormanら、1982, Mol. Cell. Biol. 2: 1044-1051から改作し
た標準法に従って実施した。該アッセイでは、0.25M Trisバッファー（pH 7.5）
中に10μlの14Cクロラムフェニコール（0.5μCi；8.3 nM；NEN）、20μlの40 mM
アセチルCoA（Boehringer）および50μlの細胞抽出物を含有させた。インキュベ
ーション時間は16〜18時間であった。
た標準法に従って実施した。該アッセイでは、0.25M Trisバッファー（pH 7.5）
中に10μlの14Cクロラムフェニコール（0.5μCi；8.3 nM；NEN）、20μlの40 mM
アセチルCoA（Boehringer）および50μlの細胞抽出物を含有させた。インキュベ
ーション時間は16〜18時間であった。
【００８４】6.6. 結果
NP、P、L発現ベクター、およびキメラNDV-CAT RNAを用いてトランスフェクト
したそれぞれの細胞系において、トランスフェクションの18時間後に高レベルの
CAT発現が得られた。さらに、Lタンパク質を欠損する対照のトランスフェクト細
胞はCATを発現しなかった。
したそれぞれの細胞系において、トランスフェクションの18時間後に高レベルの
CAT発現が得られた。さらに、Lタンパク質を欠損する対照のトランスフェクト細
胞はCATを発現しなかった。
【００８５】7. 特定の組換えDNAに由来するRNAを用いた感染性NDVウイルスのレスキュー
以下の小節に記載の実験は、特定の組換えDNAに由来するRNAを用いた感染性ND
Vのレスキューを示している。キメラNDV-CAT RNAに対応するRNAを使用して、ウ
イルスRNAの5'末端の191ヌクレオチドおよび3'末端ヌクレオチドの121ヌクレオ
チドが、モデルNDV RNAの転写、複製およびパッケージングに必要なシグナルを
全て含有することを示し得る。NDVゲノムの転写単位全てを含有するRNAをトラン
スフェクトしたプラスミドから発現させ得る。したがってこの技法によって、cD
NAクローンおよびこれらのゲノムの部位特異的突然変異誘発を用いた感染性NDV
ウイルスの遺伝子操作が可能になる。更にこの技法により、組織培養物、動物ま
たはヒトにおける遺伝子発現に効率的なベクターとして使用し得る感染性キメラ
NDVウイルスの構築が可能になり得る。
Vのレスキューを示している。キメラNDV-CAT RNAに対応するRNAを使用して、ウ
イルスRNAの5'末端の191ヌクレオチドおよび3'末端ヌクレオチドの121ヌクレオ
チドが、モデルNDV RNAの転写、複製およびパッケージングに必要なシグナルを
全て含有することを示し得る。NDVゲノムの転写単位全てを含有するRNAをトラン
スフェクトしたプラスミドから発現させ得る。したがってこの技法によって、cD
NAクローンおよびこれらのゲノムの部位特異的突然変異誘発を用いた感染性NDV
ウイルスの遺伝子操作が可能になる。更にこの技法により、組織培養物、動物ま
たはヒトにおける遺伝子発現に効率的なベクターとして使用し得る感染性キメラ
NDVウイルスの構築が可能になり得る。
【００８６】8. 実施例：NDVゲノム中に挿入されたHIV抗原gp160エピトープを含有する組換
えニューキャッスル病ウイルス 本明細書に記載の実施例において、キメラNDVを、HIVのgp160由来の異種抗原
を発現させるために構築する。以下の小節に記載の実験は、NDVゲノム内にHIV g
p160由来のペプチドを発現するキメラNDVを作製するための組換えRNA鋳型の使用
を示すものである。またさらに、このキメラNDVを使用して、脊椎動物の体液お
よび細胞が媒介する免疫応答を誘導する。
えニューキャッスル病ウイルス 本明細書に記載の実施例において、キメラNDVを、HIVのgp160由来の異種抗原
を発現させるために構築する。以下の小節に記載の実験は、NDVゲノム内にHIV g
p160由来のペプチドを発現するキメラNDVを作製するための組換えRNA鋳型の使用
を示すものである。またさらに、このキメラNDVを使用して、脊椎動物の体液お
よび細胞が媒介する免疫応答を誘導する。
【００８７】8.1. プラスミドの構築
HIV gp160タンパク質を発現する組換えNDV cDNAクローンは、当技術分野で公
知のいくつかの方法で構築し得る。例えば、図４に示すように、HIV EnvおよびG
agタンパク質をNDVのいくつかの位置に挿入し得る。一例として、EnvおよびGag
タンパク質をM遺伝子とL遺伝子との間に挿入する。異なる例として、EnvおよびG
agタンパク質をNP遺伝子の3'側（リーダー配列とNPとの間）に挿入する。あるい
は、これらのHIVタンパク質を3'末端におけるNDVエンベロープタンパク質（HNと
F）の間に組み入れる。またこれらのタンパク質を任意のNDV遺伝子中に、または
それらの間に挿入してもよい。
知のいくつかの方法で構築し得る。例えば、図４に示すように、HIV EnvおよびG
agタンパク質をNDVのいくつかの位置に挿入し得る。一例として、EnvおよびGag
タンパク質をM遺伝子とL遺伝子との間に挿入する。異なる例として、EnvおよびG
agタンパク質をNP遺伝子の3'側（リーダー配列とNPとの間）に挿入する。あるい
は、これらのHIVタンパク質を3'末端におけるNDVエンベロープタンパク質（HNと
F）の間に組み入れる。またこれらのタンパク質を任意のNDV遺伝子中に、または
それらの間に挿入してもよい。
【００８８】8.2. 感染性キメラウイルスの作製
組換えNDVゲノムを含むプラスミドに由来するRNAのトランスフェクションを、
例えば、COS、293 MDBKなどの細胞にトランスフェクトし、感染性キメラウイル
スの選択を既に記載されているように実施し得る。米国特許第5,166,057号を参
照のこと（参照によりその全文を本明細書に組み入れる）。得られたRNAは、標
準トランスフェクションプロトコルの手法を用いて野生型ウイルスを感染させた
細胞中にトランスフェクトし得る。トランスフェクション後、上清を回収し、そ
して種々の希釈で使用して、NDV抗血清の存在下にて新鮮な細胞に感染させ得る
。また上清を同じ抗血清の存在下におけるプラークアッセイにも使用し得る。続
いてレスキューしたウイルスの精製および特性決定を行って、それを、例えば抗
体産生に使用し得る。
例えば、COS、293 MDBKなどの細胞にトランスフェクトし、感染性キメラウイル
スの選択を既に記載されているように実施し得る。米国特許第5,166,057号を参
照のこと（参照によりその全文を本明細書に組み入れる）。得られたRNAは、標
準トランスフェクションプロトコルの手法を用いて野生型ウイルスを感染させた
細胞中にトランスフェクトし得る。トランスフェクション後、上清を回収し、そ
して種々の希釈で使用して、NDV抗血清の存在下にて新鮮な細胞に感染させ得る
。また上清を同じ抗血清の存在下におけるプラークアッセイにも使用し得る。続
いてレスキューしたウイルスの精製および特性決定を行って、それを、例えば抗
体産生に使用し得る。
【００８９】8.3. 赤血球凝集阻害アッセイおよびウイルス中和アッセイ
赤血球凝集阻害（HI）アッセイを既に記載されている（Palmer, D.F.ら、1975
, Immunol. Ser. 6:51-52）ように実施する。モノクローナル抗体（2G9、4B2、2
F1O、25-5）を、ヒト抗-gp120モノクローナル抗体を用いて標準的な方法により
調製する。モノクローナル抗体含有腹水液を、既に記載されている（Palmer, D.
F.ら、1975, Immunol. Ser. 6:51-52）ように受容体破壊酵素で処理する。
, Immunol. Ser. 6:51-52）ように実施する。モノクローナル抗体（2G9、4B2、2
F1O、25-5）を、ヒト抗-gp120モノクローナル抗体を用いて標準的な方法により
調製する。モノクローナル抗体含有腹水液を、既に記載されている（Palmer, D.
F.ら、1975, Immunol. Ser. 6:51-52）ように受容体破壊酵素で処理する。
【００９０】
ウイルス中和アッセイに関して、直径30mmのディッシュ中の細胞にウイルスを
感染させる。1時間の吸着の後、種々の希釈で抗体を含有する寒天重層を添加す
る。続いて感染の72時間後に細胞単層を0.1%クリスタルバイオレットで染色する
。
感染させる。1時間の吸着の後、種々の希釈で抗体を含有する寒天重層を添加す
る。続いて感染の72時間後に細胞単層を0.1%クリスタルバイオレットで染色する
。
【００９１】8.4. 免疫
6週齢のBALB/cマウスに、ウイルスをエーロゾル経路により感染させるか、ま
たは10μgの精製ウイルスを用いて腹腔内（i.p.）に免疫する。追加免疫に関し
ては全て、10μgの精製ウイルスをi.p.に投与する。それぞれの免疫後7日目に血
清を回収する。
たは10μgの精製ウイルスを用いて腹腔内（i.p.）に免疫する。追加免疫に関し
ては全て、10μgの精製ウイルスをi.p.に投与する。それぞれの免疫後7日目に血
清を回収する。
【００９２】8.5. ラジオイムノアッセイ
ラジオイムノアッセイを既に記載されている（Zaghouani, H.ら、1991, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 88:5645-6549）ように実施する。簡単に説明すると、マ
イクロタイタープレートを、リン酸緩衝化食塩水（PBS）中の2% BSAで飽和させ
た5μg/ml のペプチド-BSAコンジュゲートで被覆し、種々の希釈の血清と共にイ
ンキュベートする。結合した抗体を125I標識抗マウスκモノクローナル抗体を用
いて検出する。
Natl. Acad. Sci. USA 88:5645-6549）ように実施する。簡単に説明すると、マ
イクロタイタープレートを、リン酸緩衝化食塩水（PBS）中の2% BSAで飽和させ
た5μg/ml のペプチド-BSAコンジュゲートで被覆し、種々の希釈の血清と共にイ
ンキュベートする。結合した抗体を125I標識抗マウスκモノクローナル抗体を用
いて検出する。
【００９３】8.6. 放射線免疫沈降法
H9ヒトT細胞系にHIVを急性に感染させる。感染後4日目に、5×107個の感染細
胞を、35S-システイン、35S-メチオニン、および3H-イソロイシンを用いて標識
する。その際、1ml当り100μCiの各同位体を含有する培地中に、該細胞が2×106 個/mlとなるようにする。代謝標識の20時間後、放射性ビリオンを45,000 rpmに
て1時間遠心分離を行ってペレット化する。続いて該ペレットを、1% Triton X-1
00および2mMフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）を含有する1.0mlの溶
解バッファー中に再懸濁する。約20μlの血清または0.5μgのモノクローナル抗
体（20μl PBS中）および175μlのビリオン溶解物を、0.5％ドデシル硫酸ナトリ
ウム（SDS）、1 mg/ml BSA、2% Triton X-100、および50 mMリン酸ナトリウムを
含有する0.5mlの免疫沈降バッファー（pH 7.4）中で4℃にて一晩インキュベート
する。抗原-抗体複合体をプロテインA-セファロースビースに結合させ、10% SDS
-ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動により分析する。
胞を、35S-システイン、35S-メチオニン、および3H-イソロイシンを用いて標識
する。その際、1ml当り100μCiの各同位体を含有する培地中に、該細胞が2×106 個/mlとなるようにする。代謝標識の20時間後、放射性ビリオンを45,000 rpmに
て1時間遠心分離を行ってペレット化する。続いて該ペレットを、1% Triton X-1
00および2mMフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）を含有する1.0mlの溶
解バッファー中に再懸濁する。約20μlの血清または0.5μgのモノクローナル抗
体（20μl PBS中）および175μlのビリオン溶解物を、0.5％ドデシル硫酸ナトリ
ウム（SDS）、1 mg/ml BSA、2% Triton X-100、および50 mMリン酸ナトリウムを
含有する0.5mlの免疫沈降バッファー（pH 7.4）中で4℃にて一晩インキュベート
する。抗原-抗体複合体をプロテインA-セファロースビースに結合させ、10% SDS
-ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動により分析する。
【００９４】8.7. HIV-1中和アッセイ
in vitro中和アッセイを既に記載されている（Nara, P.L.ら、1987, AIDS Res
. Hum. Retroviruses 3:283-302）ように実施する。簡単に説明すると、熱不活
化血清の連続2倍希釈液を、H9細胞中で産生させた150〜200シンシチウム形成単
位のHIVウイルスと共に室温で1時間インキュベートする。該ウイルス／血清混合
物を50,000個のDEAE-デキストラン処理CEMss細胞（ポリ-L-リシンを用いてマイ
クロプレートディッシュに固着させてある）、または50,000個のH9懸濁細胞と共
に37℃にて1時間インキュベートする。ウイルスの吸着後、未結合ウイルスを除
去し、各ウエルに200μlの培地を添加する。感染後4日目に、50μlの上清培地を
ウイルスp24gagタンパク質定量（Coulter Source, Inc.）のために取り出す。CE
Mss細胞中のシンシチウムの総数は感染後5日目に計数する。中和力価を、ウイル
スのみの対照ウエルと比較して算出し、シンシチウム数を50%以上低減させる、
またはp24合成を50％以上阻害する最高血清希釈率の逆数として表す。
. Hum. Retroviruses 3:283-302）ように実施する。簡単に説明すると、熱不活
化血清の連続2倍希釈液を、H9細胞中で産生させた150〜200シンシチウム形成単
位のHIVウイルスと共に室温で1時間インキュベートする。該ウイルス／血清混合
物を50,000個のDEAE-デキストラン処理CEMss細胞（ポリ-L-リシンを用いてマイ
クロプレートディッシュに固着させてある）、または50,000個のH9懸濁細胞と共
に37℃にて1時間インキュベートする。ウイルスの吸着後、未結合ウイルスを除
去し、各ウエルに200μlの培地を添加する。感染後4日目に、50μlの上清培地を
ウイルスp24gagタンパク質定量（Coulter Source, Inc.）のために取り出す。CE
Mss細胞中のシンシチウムの総数は感染後5日目に計数する。中和力価を、ウイル
スのみの対照ウエルと比較して算出し、シンシチウム数を50%以上低減させる、
またはp24合成を50％以上阻害する最高血清希釈率の逆数として表す。
【００９５】8.8. CTL応答の誘導
BALB/cマウスを、107 PFUのキメラNDVウイルスを含有する0.2 mlのウイルス懸
濁液を用いて免疫する。7日後、脾臓細胞を採取し、既に記載されている（Zagho
uani, H.ら、1992, J. Immunol. 148:3604-3609）ように、放射線照射した脾臓
細胞単独、またはこれを免疫原性ペプチドで被覆したものを用い、上清中10%の
コンカナバリンA存在下にて、in vitroで5日間再刺激する。
濁液を用いて免疫する。7日後、脾臓細胞を採取し、既に記載されている（Zagho
uani, H.ら、1992, J. Immunol. 148:3604-3609）ように、放射線照射した脾臓
細胞単独、またはこれを免疫原性ペプチドで被覆したものを用い、上清中10%の
コンカナバリンA存在下にて、in vitroで5日間再刺激する。
【００９６】8.9. 細胞溶解アッセイ
ペプチドで被覆した標的細胞を、Na51 Cr4（100μCi/106個の細胞）を用いて3
7℃にて1時間かけて標識する。2回洗浄した後、細胞をV底96ウエルプレートに移
し、エフェクター細胞を添加し、7% CO2中で37℃にてインキュベートする。4時
間後、上清を回収して計数する。最大クロム放出は、細胞を1% Nonidet P40界面
活性剤と共にインキュベートして決定する。特異的溶解の割合（％）は、以下に
示す式に従って算出する：［（cpmサンプル−cpm自然放出）／（cpm最大放出−c
pm自然放出）］×100。
7℃にて1時間かけて標識する。2回洗浄した後、細胞をV底96ウエルプレートに移
し、エフェクター細胞を添加し、7% CO2中で37℃にてインキュベートする。4時
間後、上清を回収して計数する。最大クロム放出は、細胞を1% Nonidet P40界面
活性剤と共にインキュベートして決定する。特異的溶解の割合（％）は、以下に
示す式に従って算出する：［（cpmサンプル−cpm自然放出）／（cpm最大放出−c
pm自然放出）］×100。
【００９７】9. キメラNDV-CAT RNAの細胞内発現
NDVミニゲノムの発現効率を高めるために、NDV-CAT RNAの細胞内発現のために
プラスミド（pT7-NDV-CAT-RB）を構築した。これは、NDV-CAT RNAの3'非コード
領域の末端のすぐ後にデルタ肝炎ウイルス由来のリボザイムを挿入して達成した
。既にrVV-T7もしくはT7ポリメラーゼを発現する改変アンカラワクシニアウイル
ス（MVA-T7）を感染させてある293、293T、COS1、CV1、もしくはニワトリ胚繊維
芽細胞（CEF）の細胞中にpTM1-NP、pTM1-P、pTM1-LおよびpT7-NDV-CAT-RTを共ト
ランスフェクトすることにより、高レベルのCAT活性がもたらされた（図６）。
このCAT活性は、NDV-CAT RNAの直接RNAトランスフェクションにより達成された
活性よりも約100〜1,000倍高かった。
プラスミド（pT7-NDV-CAT-RB）を構築した。これは、NDV-CAT RNAの3'非コード
領域の末端のすぐ後にデルタ肝炎ウイルス由来のリボザイムを挿入して達成した
。既にrVV-T7もしくはT7ポリメラーゼを発現する改変アンカラワクシニアウイル
ス（MVA-T7）を感染させてある293、293T、COS1、CV1、もしくはニワトリ胚繊維
芽細胞（CEF）の細胞中にpTM1-NP、pTM1-P、pTM1-LおよびpT7-NDV-CAT-RTを共ト
ランスフェクトすることにより、高レベルのCAT活性がもたらされた（図６）。
このCAT活性は、NDV-CAT RNAの直接RNAトランスフェクションにより達成された
活性よりも約100〜1,000倍高かった。
【００９８】10. 特定の組換えDNAに由来するRNAを用いた感染性NDVウイルスのレスキュー
非ウイルス依存的プラスミド誘導系からの組換えウイルスのレスキューを達成
するために、NDVの全長アンチゲノムの細胞内発現を可能にするプラスミドを構
築した。NDV cDNAをNDVのカリフォルニア様（California-like；NDV-CL）株の精
製RNAに由来するいくつかの断片でRT-PCRを実施した（Meindlら、1974, Virolog
y 58: 457-463）。cDNA断片を連結し、T7プロモーターおよびリボザイムフラン
キング配列を有するプラスミド中に構築し、プラスミドpT7-NDV+RBを得た。XmaI
制限部位を作製するサイレント突然変異をpT7-NDV+RBのLオープンリーディング
フレーム中に導入した。10cmディッシュ中のCEF細胞単層にMVA-T7を感染多重度
約0.1で感染させた。1時間後、細胞を2.4μgのpTM1-NP、1.2μgのpTM1-P、1.2μ
gのpTM-1Lおよび1.5μgのpT7-NDV+-RBを用いてトランスフェクト（リポフェクシ
ョン）した。37℃にて8時間のインキュベーション後、新鮮な培地を添加した。
トランスフェクションの20時間後に、ワクシニアウイルスインヒビターであるar
aCを最終濃度が60μg/mlとなるよう添加した。トランスフェクション後2日目に
、100μg/mlのaraCを含有する新鮮な培地を添加した。感染後4日目のトランスフ
ェクト細胞からの上清を使用して、10日齢の孵化鶏卵の尿膜腔に接種した。37℃
にて2日間のインキュベーション後、尿膜腔液を採取し、赤血球凝集反応によりN
DV-CATウイルスの存在について陽性であることを認めた。レスキューしたウイル
スから単離されたRNAの分析によって、新しく挿入されたXmaI部位の存在が確認
され、該ウイルスがクローン化プラスミドcDNAに由来することが証明された。レ
スキュー手法のプロトコルの概略図を図７に示す。
するために、NDVの全長アンチゲノムの細胞内発現を可能にするプラスミドを構
築した。NDV cDNAをNDVのカリフォルニア様（California-like；NDV-CL）株の精
製RNAに由来するいくつかの断片でRT-PCRを実施した（Meindlら、1974, Virolog
y 58: 457-463）。cDNA断片を連結し、T7プロモーターおよびリボザイムフラン
キング配列を有するプラスミド中に構築し、プラスミドpT7-NDV+RBを得た。XmaI
制限部位を作製するサイレント突然変異をpT7-NDV+RBのLオープンリーディング
フレーム中に導入した。10cmディッシュ中のCEF細胞単層にMVA-T7を感染多重度
約0.1で感染させた。1時間後、細胞を2.4μgのpTM1-NP、1.2μgのpTM1-P、1.2μ
gのpTM-1Lおよび1.5μgのpT7-NDV+-RBを用いてトランスフェクト（リポフェクシ
ョン）した。37℃にて8時間のインキュベーション後、新鮮な培地を添加した。
トランスフェクションの20時間後に、ワクシニアウイルスインヒビターであるar
aCを最終濃度が60μg/mlとなるよう添加した。トランスフェクション後2日目に
、100μg/mlのaraCを含有する新鮮な培地を添加した。感染後4日目のトランスフ
ェクト細胞からの上清を使用して、10日齢の孵化鶏卵の尿膜腔に接種した。37℃
にて2日間のインキュベーション後、尿膜腔液を採取し、赤血球凝集反応によりN
DV-CATウイルスの存在について陽性であることを認めた。レスキューしたウイル
スから単離されたRNAの分析によって、新しく挿入されたXmaI部位の存在が確認
され、該ウイルスがクローン化プラスミドcDNAに由来することが証明された。レ
スキュー手法のプロトコルの概略図を図７に示す。
【００９９】11. キメラNDVゲノムの内部シストロンからの外来遺伝子の発現
プラスミドpT7-NDV+-CAT/RN-RBは、NDV-CL cDNA中のHNオープンリーディング
フレームをCATオープンリーディングフレームと置換することにより構築した。
得られるキメラNDV RNAの総ヌクレオチド長が6で割り切れるように、さらに追加
のヌクレオチドを非コード領域に付加した。MVA-T7ウイルスを既に感染させてあ
るCEF細胞単層中へ、pTN1-NP、pTM1-PおよびpTM1-Lと共にpT7-NDV+-CAT/HN-RBを
共トランスフェクトすることによって、トランスフェクション後2日目に測定し
たものと同程度のCAT活性がもたらされた（図８）。これらの結果は、転写単位
としてNDVゲノム中にクローニングされた外来遺伝子の発現用ベクターとしてNDV
が使用可能であることを示している。
フレームをCATオープンリーディングフレームと置換することにより構築した。
得られるキメラNDV RNAの総ヌクレオチド長が6で割り切れるように、さらに追加
のヌクレオチドを非コード領域に付加した。MVA-T7ウイルスを既に感染させてあ
るCEF細胞単層中へ、pTN1-NP、pTM1-PおよびpTM1-Lと共にpT7-NDV+-CAT/HN-RBを
共トランスフェクトすることによって、トランスフェクション後2日目に測定し
たものと同程度のCAT活性がもたらされた（図８）。これらの結果は、転写単位
としてNDVゲノム中にクローニングされた外来遺伝子の発現用ベクターとしてNDV
が使用可能であることを示している。
【０１００】
本発明は、記載した特定の実施形態によりその範囲を制限されるものではなく
、該実施形態は本発明の個々の態様の1つの例示を意図するものである。機能的
に同等な構築物、ウイルスまたは酵素はいずれも本発明の範囲内に入る。実際、
当業者であれば、本明細書の記載および添付の図面から、本明細書に示し記載し
たものに加えて本発明の種々の変更が明らかだろう。かかる変更は、本発明の特
許請求の範囲内に入ることを意図する。
、該実施形態は本発明の個々の態様の1つの例示を意図するものである。機能的
に同等な構築物、ウイルスまたは酵素はいずれも本発明の範囲内に入る。実際、
当業者であれば、本明細書の記載および添付の図面から、本明細書に示し記載し
たものに加えて本発明の種々の変更が明らかだろう。かかる変更は、本発明の特
許請求の範囲内に入ることを意図する。
【０１０１】
本明細書で引用した参照文献はいずれも、全ての目的についてその全体を参照
により本明細書に組み入れる。
により本明細書に組み入れる。
【図１】
NDVミニゲノムの模式図である。上の図は、Ｔ７プロモーター；5'末端配列（
ゲノムRNAの5'末端、191nt）；挿入されたヌクレオチド(CTTAA)； 667nt のCAT
ORF；3'末端配列(ゲノムRNAの3'末端、121nt)BbsIおよびヌクレアーゼ部位を含
む、PNDVCATプラスミドを示す。下の図は、in vitro転写により得られたキメラN
DV-CAT RNAを示す。NDV-CATキメラミニゲノムのNDVに基づく増幅および転写の結
果、トランスフェクトした細胞でCAT活性が検出される。
ゲノムRNAの5'末端、191nt）；挿入されたヌクレオチド(CTTAA)； 667nt のCAT
ORF；3'末端配列(ゲノムRNAの3'末端、121nt)BbsIおよびヌクレアーゼ部位を含
む、PNDVCATプラスミドを示す。下の図は、in vitro転写により得られたキメラN
DV-CAT RNAを示す。NDV-CATキメラミニゲノムのNDVに基づく増幅および転写の結
果、トランスフェクトした細胞でCAT活性が検出される。
【図２】
図２Ａ〜Ｃ；PTMI発現ベクターの概略図を示す。
PTM1-NPは、NDVＮＰタンパク質をコードする。
PTM1-Pは、NDVＰタンパク質をコードする。
PTM1-LはNDVＬタンパク質をコードする。
【図３】
NDVの5'および3'末端の非コード領域のRNA配列（プラスセンス）を示す。CAT
遺伝子の5'側の配列は、56ntのＮＰ遺伝子UTRに続く65ntのリーダー配列(太字)
を含む、121ntのNDVプラスセンスゲノムの5'末端非コード領域を示す。CAT遺伝
子の3'側の配列は、挿入したヌクレオチドcuuaa(小文字)、および127ntのL遺伝
子のUTRに続く64ntのトレーラー領域（太字）を含む191ntのNDVプラスセンスゲ
ノムの非コード末端領域を示す。
遺伝子の5'側の配列は、56ntのＮＰ遺伝子UTRに続く65ntのリーダー配列(太字)
を含む、121ntのNDVプラスセンスゲノムの5'末端非コード領域を示す。CAT遺伝
子の3'側の配列は、挿入したヌクレオチドcuuaa(小文字)、および127ntのL遺伝
子のUTRに続く64ntのトレーラー領域（太字）を含む191ntのNDVプラスセンスゲ
ノムの非コード末端領域を示す。
【図４】
図４ＡおよびＢは、組換えNDVクローンの構造の概略図を示す。図４Ｂ；HIVの
EnvおよびGagを発現する感染性NDVを示す。上の図；Ｍ遺伝子とＬ遺伝子の間にH
IVのEnvおよびGagが存在する。下の図；ＮＰ遺伝子の3'側にHIVのEnvおよびGag
が存在する。
EnvおよびGagを発現する感染性NDVを示す。上の図；Ｍ遺伝子とＬ遺伝子の間にH
IVのEnvおよびGagが存在する。下の図；ＮＰ遺伝子の3'側にHIVのEnvおよびGag
が存在する。
【図５】
NDVの3'および5'末端を、Kurillaら、1985、Virology 145:203-212 (3'末端)
、およびYusoffら、1987、Nucleic Acids Research 15:3961-3976 (5'末端)の配
列とアライメントをとった概略図である。
、およびYusoffら、1987、Nucleic Acids Research 15:3961-3976 (5'末端)の配
列とアライメントをとった概略図である。
【図６】
外来遺伝子をNDVに基づいて発現させるための、プラスミドに基づく逆遺伝学
的方法を示す。T7ポリメラーゼを発現する組換えワクシニアウイルスを細胞に感
染させる。さらに、 １）NDVのＬ、ＮＰ、およびＰタンパク質を、T7プロモーター（それぞれ、pTM1-
L、pTM1-NP、およびpTM1-P）の転写制御下にコードするプラスミドDNA、ならび
に ２）T7プロモーターの転写制御下に、キメラNDV-CATミニゲノムをコードするプ
ラスミドDNA（pT7-NDV-CAT-RB）、 を細胞にトランスフェクトする。リボザイム配列(RB)によって切断が促進される
ことにより、適切なNDV-CATミニゲノムの3'末端が得られる。NDV-CATキメラミニ
ゲノムの増幅および転写により、トランスフェクトした細胞中にCAT活性が検出
される。NDV-CATミニゲノムの3'および5'末端にある非コード領域は、黒の四角
で表す。
的方法を示す。T7ポリメラーゼを発現する組換えワクシニアウイルスを細胞に感
染させる。さらに、 １）NDVのＬ、ＮＰ、およびＰタンパク質を、T7プロモーター（それぞれ、pTM1-
L、pTM1-NP、およびpTM1-P）の転写制御下にコードするプラスミドDNA、ならび
に ２）T7プロモーターの転写制御下に、キメラNDV-CATミニゲノムをコードするプ
ラスミドDNA（pT7-NDV-CAT-RB）、 を細胞にトランスフェクトする。リボザイム配列(RB)によって切断が促進される
ことにより、適切なNDV-CATミニゲノムの3'末端が得られる。NDV-CATキメラミニ
ゲノムの増幅および転写により、トランスフェクトした細胞中にCAT活性が検出
される。NDV-CATミニゲノムの3'および5'末端にある非コード領域は、黒の四角
で表す。
【図７】
合成DNA由来のNDVのレスキューを示す。T7ポリメラーゼを発現する組換えワク
シニアウイルスを細胞に感染させる。さらに、 １）NDVのＬ、ＮＰ、およびＰタンパク質を、T7プロモーター（それぞれ、pTM1-
L、pTM1-NP、およびpTM1-P）の転写制御下にコードするプラスミドDNA、ならび
に ２）T7プロモーターの転写制御下にNDVアンチゲノムをコードするプラスミドDNA
（pT7-NDV+-RB）、 を細胞にトランスフェクトする。リボザイム配列(RB)によって切断が促進される
ことにより、適切なNDVアンチゲノムの3'末端が得られる。NDVアンチゲノムの増
幅および転写により、感染性NDVウイルスがレスキューできる。NDVアンチゲノム
の3'および5'末端にある非コード領域は、黒の四角で表す。
シニアウイルスを細胞に感染させる。さらに、 １）NDVのＬ、ＮＰ、およびＰタンパク質を、T7プロモーター（それぞれ、pTM1-
L、pTM1-NP、およびpTM1-P）の転写制御下にコードするプラスミドDNA、ならび
に ２）T7プロモーターの転写制御下にNDVアンチゲノムをコードするプラスミドDNA
（pT7-NDV+-RB）、 を細胞にトランスフェクトする。リボザイム配列(RB)によって切断が促進される
ことにより、適切なNDVアンチゲノムの3'末端が得られる。NDVアンチゲノムの増
幅および転写により、感染性NDVウイルスがレスキューできる。NDVアンチゲノム
の3'および5'末端にある非コード領域は、黒の四角で表す。
【図８】
内部転写単位と同様に、NDVアンチゲノム中に挿入された外来遺伝子のNDVに基
づいた発現を示す。T7ポリメラーゼを発現する組換えワクシニアウイルスを細胞
に感染させる。さらに、 １）NDVのＬ、ＮＰ、およびＰタンパク質を、T7プロモーター（それぞれ、pTM1-
L、pTM1-NP、およびpTM1-P）の転写制御下にコードするプラスミドDNA、ならび
に ２）T7プロモーターの転写制御下にキメラNDV-CATアンチゲノムをコードするプ
ラスミドDNA（pT7-NDV-CAT-RB）、 を細胞にトランスフェクトする。キメラNDV-CATアンチゲノム中で、CATのオープ
ンリーディングフレームを野生型NDVアンチゲノムの天然に存在するHNオープン
リーディングフレームと置換する。リボザイム配列(RB)によって切断が促進され
ることにより、キメラNDV-CATアンチゲノムの適切な3'末端が得られる。キメラN
DV-CATアンチゲノムの増幅および転写により、トランスフェクトした細胞中にCA
T活性が検出される。キメラNDV-CATアンチゲノムの3'および5'末端にある非コー
ド領域は、黒の四角で表す。
づいた発現を示す。T7ポリメラーゼを発現する組換えワクシニアウイルスを細胞
に感染させる。さらに、 １）NDVのＬ、ＮＰ、およびＰタンパク質を、T7プロモーター（それぞれ、pTM1-
L、pTM1-NP、およびpTM1-P）の転写制御下にコードするプラスミドDNA、ならび
に ２）T7プロモーターの転写制御下にキメラNDV-CATアンチゲノムをコードするプ
ラスミドDNA（pT7-NDV-CAT-RB）、 を細胞にトランスフェクトする。キメラNDV-CATアンチゲノム中で、CATのオープ
ンリーディングフレームを野生型NDVアンチゲノムの天然に存在するHNオープン
リーディングフレームと置換する。リボザイム配列(RB)によって切断が促進され
ることにより、キメラNDV-CATアンチゲノムの適切な3'末端が得られる。キメラN
DV-CATアンチゲノムの増幅および転写により、トランスフェクトした細胞中にCA
T活性が検出される。キメラNDV-CATアンチゲノムの3'および5'末端にある非コー
ド領域は、黒の四角で表す。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｋ 39/175 Ａ６１Ｋ 39/205
39/205 39/21
39/21 39/215
39/215 39/23
39/23 39/255
39/255 39/285
39/285 Ａ６１Ｐ 31/12
Ａ６１Ｐ 31/12 １７１
１７１ 31/16
31/16 Ｃ１２Ｎ 1/15
Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19
1/19 1/21
1/21 7/00
5/10 7/02
7/00 15/00 ＺＮＡＡ
7/02 5/00 Ａ
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ
，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，
ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ
Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ
)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，
ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，
ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ
Ｕ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ
，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，
ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，Ｌ
Ｋ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ
，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，
ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，Ｔ
Ｍ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ
，ＺＷ
(72)発明者 パレセ，ピーター
アメリカ合衆国 07605 ニュージャージ
ー州 レオニア，ハイウッド アベニュー
414
Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA32 CA04 CA11 DA02
EA02 EA04 FA02 GA11 HA01
4B065 AA90X AA93X AA95X AA95Y
AA97Y AB01 AC15 BA02
CA24 CA45
4C085 AA03 BA55 BA59 BA60 BA64
BA65 BA67 BA69 BA71 BA75
BA81 BA86 BB01 CC08 DD22
EE01
Claims (19)
- 【請求項１】 異種RNA配列に機能的に連結された、ニューキャッスル病ウ
イルスのRNAポリメラーゼに対して特異的な結合部位と、NDVが介在する複製およ
び転写に必要なシグナルとを含む、組換えRNA分子。 - 【請求項２】 ニューキャッスル病ウイルス遺伝子に機能的に連結された、
ニューキャッスル病ウイルスのRNAポリメラーゼに対して特異的な結合部位と、N
DVが介在する複製および転写に必要なシグナルとを含む、組換えRNA分子であっ
て、突然変異、挿入、または欠失を含む上記RNA分子。 - 【請求項３】 ポリメラーゼ結合部位がニューキャッスル病ウイルスRNAゲ
ノムの３'および５'非コードフランキング領域に含まれるポリメラーゼ結合部位
から成る、請求項１または２に記載の組換えRNA分子。 - 【請求項４】 ３'および５'非コードフランキング領域が図１に示すウイル
スセンス配列を含む、請求項３に記載の組換えRNA分子。 - 【請求項５】 異種RNAがウイルス抗原をコードする、請求項１に記載の組
換えRNA分子。 - 【請求項６】 ウイルス抗原が、ヒト免疫不全ウイルス、ニューキャッスル
病ウイルス、インフルエンザ、RSウイルス(respiratory syncytial virus)、マ
レク病ウイルス、伝染性ファルビキウス病ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、
伝染性滑液包炎ウイルス、ニワトリ貧血ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス、
トリ白血症ウイルス、細網内皮症ウイルス、トリインフルエンザウイルス、狂犬
病ウイルス、ネコジステンパーウイルス、水疱性口内炎ウイルス、牛疫ウイルス
、または豚痘ウイルスに由来する、請求項５に記載の組換えRNA分子。 - 【請求項７】 請求項１記載の組換えNDV分子をコードするヌクレオチド配
列と、NDV RNAポリメラーゼタンパク質ＰおよびＬをコードするヌクレオチド配
列とを含む、組換え細胞。 - 【請求項８】 請求項１または２に記載の組換えRNA分子を含むマイナス鎖R
NAウイルスを含むキメラウイルス。 - 【請求項９】 異種RNAがウイルス抗原に由来する、請求項８に記載のキメ
ラウイルス。 - 【請求項１０】 ウイルス抗原が、ヒト免疫不全ウイルス、ニューキャッス
ル病ウイルス、インフルエンザ、RSウイルス、マレク病ウイルス、伝染性ファル
ビキウス病ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、伝染性滑液包炎ウイルス、ニワ
トリ貧血ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス、トリ白血症ウイルス、細網内皮
症ウイルス、トリインフルエンザウイルス、狂犬病ウイルス、ネコジステンパー
ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、牛疫ウイルス、または豚痘ウイルスに由来す
る、請求項９に記載のキメラウイルス。 - 【請求項１１】 異種RNAをニューキャッスル病ウイルスのＨＮ遺伝子内に
含む、請求項８に記載のキメラウイルス。 - 【請求項１２】 請求項１または２に記載の組換えRNAと、複製および転写
に必要なウイルス機能とをコードするヌクレオチド配列を、宿主細胞にトランス
フェクトし、そして、その培養物から該キメラウイルスを回収することを含む、
キメラなマイナス鎖RNAウイルスを産生する方法。 - 【請求項１３】 弱毒化した表現型をもたらす改変を含む遺伝子工学的に操
作されたニューキャッスル病ウイルス、および生理的に許容される賦形剤を含有
するワクチン製剤。 - 【請求項１４】 前記改変が天然に存在する突然変異体に由来する、請求項
１３に記載のワクチン製剤。 - 【請求項１５】 遺伝子工学的に操作されたキメラなニューキャッスル病ウ
イルス、および製薬上許容される賦形剤を含有するワクチン製剤であって、該ウ
イルスのゲノムが異種エピトープをコードする、上記ワクチン製剤。 - 【請求項１６】 異種エピトープがウイルス抗原である、請求項１５に記載
のワクチン製剤。 - 【請求項１７】 ウイルス抗原が、ヒト免疫不全ウイルス、ニューキャッス
ル病ウイルス、インフルエンザ、RSウイルス、マレク病ウイルス、伝染性ファル
ビキウス病ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、伝染性滑液包炎ウイルス、ニワ
トリ貧血ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス、トリ白血症ウイルス、細網内皮
症ウイルス、トリインフルエンザウイルス、狂犬病ウイルス、ネコジステンパー
ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、牛疫ウイルス、または豚痘ウイルスに由来す
る、請求項１６に記載のワクチン製剤。 - 【請求項１８】 異種エピトープが免疫賦活タンパク質である、請求項１５
に記載のワクチン製剤。 - 【請求項１９】 異種エピトープが腫瘍抗原である、請求項１５に記載のワ
クチン製剤。
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|---|---|---|---|
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| US09/152,845 US6146642A (en) | 1998-09-14 | 1998-09-14 | Recombinant new castle disease virus RNA expression systems and vaccines |
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|---|---|
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|---|---|---|---|
| JP2000570380A Expired - Lifetime JP4558203B2 (ja) | 1998-09-14 | 1999-09-14 | 組換えニューキャッスル病ウイルスｒｎａの発現系およびワクチン |
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| ZA (1) | ZA200102546B (ja) |
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