KR100776398B1

KR100776398B1 - 조류 ｈｎ 단백질의 에피토프 및 상기 변이 에피토프를포함하는 뉴캐슬병 바이러스

Info

Publication number: KR100776398B1
Application number: KR1020060026667A
Authority: KR
Inventors: 권혁준; 조선희; 김태은; 안영진; 김선중; 박영호; 김채현; 김태환
Original assignee: 주식회사 고려비엔피; 주식회사 바이오포아
Priority date: 2006-03-23
Filing date: 2006-03-23
Publication date: 2007-11-28
Also published as: KR20070096379A

Abstract

본 발명은 조류 면역계에 의해 인식되는 뉴캐슬병 바이러스 HN 단백질 에피토프 및 이의 항체, 항체를 이용한 뉴캐슬병 바이러스 탐지방법, 그리고 상기 에피토프 돌연변이을 포함하는 뉴캐슬병 바이러스 및 이를 이용한 백신에 관한 것으로서, 본 발명의 조류 면역계 인식 HN 에피토프와 상기 에피토프 변이 뉴캐슬병바이러스는 뉴캐슬병 바이러스를 이용하여 효과적인 백신을 개발할 수 있을 뿐만 아니라, 뉴캐슬병 바이러스을 신속하고 정확하게 진단할 수 있다.

뉴캐슬병 바이러스, HN 단백질, 선형 에피토프

Description

조류 ＨＮ 단백질의 에피토프 및 상기 변이 에피토프를 포함하는 뉴캐슬병 바이러스{HN epitope recognized by avian immune system and antigenic variant Newcastle disease viruses carrying changes in the epitope}

도 1은 뉴캐슬병 바이러스 균주들 사이에서 HN 단백질의 선형 에피토프 아미노산 서열(345-355)을 비교한 것이고,

도 2 및 도 3는 백신주 (라소타 주, B1 주, 울스터 등)와 과거 대부분의 병원성 야외주(권혁준, 2000, 서울대학교 대학원 박사학위논문) HN 단백질의 선형 에피토프 아미노산 서열을 갖는 펩티드와 변이주의 아미노산 서열을 갖는 펩티드에 대한 항-라소타 혈청과 항-KBNP-4152 혈청의 반응성 차이를 ELISA 법으로 비교한 시험 결과이고,

도 4은 라소타 백신주와 항원성 변이 야외주인 KBNP-4152의 신규 HN 선형 에피토프 펩티드에 대한 항-라소타 혈청과 항-KBNP-4152 혈청의 반응성을 혈구응집억제반응법으로 비교한 것이고,

도 5는 KBNP-4152에 대한 항-라소타 혈청과 항-KBNP-4152 혈청의 바이러스 중화시험 결과이고,

도 6 내지 도 11은 본 발명에 따른 뉴캐슬병 바이러스의 HN 단백질의 서열을 나타낸다.

본 발명은 본 발명은 조류 면역계에 의해 인식되는 뉴캐슬병 바이러스 HN 단백질 에피토프 및 이의 항체, 항체를 이용한 뉴캐슬병 바이러스 탐지방법, 그리고 상기 에피토프 돌연변이을 포함하는 뉴캐슬병 바이러스 및 이를 이용한 백신에 관한 것이다.

뉴캐슬병(Newcastle disease)은 가금에서 치명적이고 전염성이 강한 제 1종 가축 전염병으로 백신을 접종하지 않은 닭에 감염될 때는 100% 폐사율을 초래하며, 적절한 백신을 하지 않는 경우 호흡기 및 소화기 증상과 산란계에서 산란율 저하로 경제적인 피해를 일으키는 치명적인 질병이다. 매년 발생주의보를 발표하고 있으나 발생이 계속 증가하고 전국적으로 발생되는 추세에 있으며 양계 농가에 큰 피해를 주고 있다. 적절한 백신을 접종하지 않은 경우 백신 항체가가 낮은 산란계나 종계는 산란율이 떨어지거나 중지되기도 한다. 또한 예방 접종을 했더라도 접종 시기나 방법이 잘못되어 항체가가 높지 않은 닭에서는 다리와 목이 마비되는 신경증상이 나타기도 한다.

뉴캐슬병 바이러스는 단일 가닥(single stranded) RNA 바이러스로 아부라바이러스 속(genus Avulavirus )에 속한다. 뉴캐슬병 바이러스는 엔벨롭(envelope)을 가지고 있으며 엔벨롭에는 바이러스가 숙주 세포에 결합할 수 있도록 해주는 HN(Haemagglutinin-Neuraminidase) 단백질과 엔벨롭과 숙주 세포의 융합을 일으키 는 F(Fusion) 단백질이 있다. F 단백질과 HN 단백질은 글리코단백질(glycoprotein)로서 엔벨롭의 표면에 분포되어 있다.

뉴캐슬병 바이러스는 F 유전자의 염기서열의 계통분석에 의해 I부터 VIII까지의 유전형으로 분류되며, 이 중 유전형 VI 형과 Ⅶ 형은 아시아 국가인 인도네시아, 중국, 대만 및 일본에 있는 것으로 보고되었다. 아시아 지역의 VII형 바이러스들은 아프리카 균주(Ⅶb)에서부터 분기된 Ⅶa로 표시한다(Herczeg et al., 1999). 국내에서 VIIa 유전형의 바이러스가 존재한다는 사실이 밝혀졌는데, 이들의 HN 단백질 선형 에피토프은 모두 백신주들과 동일한 아미노산 서열을 가지고 있다고 알려졌다(Kwon et al., 2003; Lee et al., 2004). 중국의 일부 VII 형 바이러스는 기존의 백신에 의해 방어가 완벽하게 이루어지지 않는 것으로 알려져 있으나 (Yu et al., 2001) 그 원인은 밝혀져 있지 않다.

F 단백질은 Ⅰ형 막 글리코단백질(type Ⅰ membrane glycoprotein)로써 삼합체(trimeric) 구조를 형성한다(Gorman et al., 1988; Russell et al., 1994; Reitter et al., 1995). HN 단백질은 Ⅱ형 막 글리코단백질(type Ⅱ membrane glycoprotein)로 바이러스 엔벨롭의 표면에서 4합체(tetramer)를 형성하여 세포막에 침투한다(Gorman et al., 1988; Ng et al., 1989). F 단백질은 13개의 시스테인 잔기와 5개의 글리코실화 자리가 있고, HN 단백질은 14개의 시스테인 잔기와 4개의 글리코실화 자리를 가지고 있다.

단백질의 구조에서 시스테인 잔기와 당쇄화(glycosylation)는 단백질 형태와 올리고머 형성에서 매우 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 또한 시스테인 잔기는 에피토프 형성과 유전자의 당쇄화 위치를 결정하는데 중요한 역할을 한다. HN 단백질의 시스테인 잔기인 C123에서 돌연변이는 분자간 이중황 결합(disulfide bond)을 형성하지 않고 공유 다이머를 형성하지 못하며, 또한 다른 시스테인 잔기에서의 돌연변이는 항원의 구조에 영향을 미친다(McGinnes and Morrison, 1994, 1997). 모든 뉴캐슬병 바이러스 균주는 시스테인 잔기가 매우 보존되어 있고, 이것은 구조와 기능의 엄격한 상호작용을 의미한다. F 단백질에서 각각의 시스테인 잔기의 생물학적 역할이 모두 밝혀지지는 않았다. 단지 C199가 C76과 이중황 결합을 하고 이 결합이 F 단백질이 잘린 후 F1과 F2 폴리펩티드 사이의 연결을 유지하는 역할을 한다는 보고가 있다(Wang et al., 1992).

F 단백질과 HN 단백질은 중요한 방어 항원이고 그들의 에피토프(epitopes)는 생쥐 모노클로날 항체를 이용하여 결정되었다. 지금까지 F 단백질에서 3개의 3차 구조적(conformational) 에피토프(epitope)과 HN 단백질에서 2개의 구조, 하나의 선형(linear) 에피토프가 밝혀졌다(Nishikawa et al., 1983, 1986; Sakaguchi et al., 1989). HN 단백질의 선형 에피토프를 이루는 8개 아미노산 서열은 ₃₄₆아스파탐산-글루탐산-글루타민-아스파탐산-티로신-글루타민-이소루이신-아르기닌₃₅₃ 으로 알려졌다.

F 단백질과 HN 단백질은 뉴캐슬병 바이러스의 중요한 방어항원이므로, 이 단백질들을 항원으로 사용하여 조류를 면역화시키면 뉴캐슬병 바이러스에 대한 감염 및 이로 인한 폐사를 예방할 수 있다. 또한, F 단백질과 HN 단백질에 대해 생긴 항 체를 이용하여 조류의 뉴캐슬병에 대한 혈청학적인 진단을 하고 있다. 특히 HN 단백질에 대한 항체는 혈구응집억제법을 통해 전세계적으로 널리 측정되고 있으며, 항체역가 수준과 방어 능력과의 높은 관련성으로 혈구응집억제법이 항체 검사에 선호되고 있으나, 실험실마다 항체 수준의 편차가 심하고, 자동화하기 어려워 ELISA 법에 비해 단점이 있다. ELISA 법은 자동화 및 결과의 수치화가 가능하다는 장점이 있으나 전체 바이러스 항원을 사용하므로 F나 HN 단백질에 비해 월등히 많은 뉴클레오캡시드에 대한 항체에 의해 기존의 혈구응집법에 의해 측정된 항체수준과 상관관계가 낮아지는 단점이 있다.

본 발명자들은 기존의 백신접종에 의한 방어율이 낮아 양계 농가에 피해를 주는 항원성 변이 뉴캐슬병 바이러스의 피해를 줄이기 위하여 진단 및 백신 개발에 유용하게 사용될 수 있는 조류 면역계 인식 HN 단백질 에피토프와 변이된 선형 에피토프를 갖는 뉴캐슬병 바이러스를 제공함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 조류의 뉴캐슬병 바이러스의 HN 단백질 에피토프, 상기 에피토프에 대한 항체 또는 항체의 단편, 및 상기 항체를 이용한 뉴캐슬병 바이러스의 탐지방법 및 탐지키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 변이형 HN 단백질 에피토프를 가지는 신규한 조류 뉴캐슬병 바이러스, 상기 바이러스에 대한 백신, 상기 백신을 포함하는 사료, 사료 첨가제를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, 및 SEQ ID NO: 6에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하며, 조류 뉴캐슬병 바이러스 HN 단백질의 에피토프(epitope)인 폴리펩티드를 제공하는 것이다. 상기 폴리펩티드는 조류 뉴캐슬병 바이러스 HN 단백질의 345번째 아미노산부터 358번째 아미노산 서열이다.

또한, 본 발명은 SEQ ID NO: 6에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 변형된 조류 뉴캐슬병 바이러스 HN 단백질의 에피토프(epitope)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 뉴캐슬병 바이러스(기탁번호 KCTC 10919BP)에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 SEQ ID NO: 6에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 변형된 조류 뉴캐슬병 바이러스 HN 단백질의 에피토프(epitope)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 뉴캐슬병 바이러스(기탁번호 KCTC 10919BP)을 포함하는 조류 뉴캐슬병 바이러스용 백신에 관한 것이다. 본 발명은 상기 백신이 생백신, 약독화백신, 또는 사백신일 수 있으며, 백신을 사료 또는 사료 첨가제로도 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, 및 SEQ ID NO: 6에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하며, 조류 뉴캐슬병 바이러스 HN 단백질의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항체 또는 항체의 단편에 관한 것이다. 상기 항체는 단클론 항체 또는 다클론 항체일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 HN 단백질의 에피토프에 대한 항체를 조류 뉴캐슬병 바이러스를 포함하는 시료에 반응시키고, 상기 항체에 대한 양성반응을 이용하여 뉴캐슬병 바이러스를 탐지하는 것을 포함하는 조류 류캐슬병의 진단방법에 관한 것이다. 상기 항체에 대한 양성반응은 항원-항체 반응을 검출하는 방법 또는 혈구응집억제반응법을 이용하여 수행할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 항체 또는 항체의 단편을 포함하는 조류 류캐슬병 진단용 폴리펩티드 키트에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, 및 SEQ ID NO: 5에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 조류 뉴캐슬병 진단용 핵산 키트에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명에 따른 조류 뉴캐슬병 바이러스 HN 단백질의 에피토프(epitope)인 폴리펩티드는 조류 뉴캐슬병 바이러스 HN 단백질의 345번째 아미노산부터 358번째 아미노산으로 구성된 14개 아미노산으로 이루어진 펩티드이다. 본 발명의 HN 단백질의 에피토프는 기존에 알려진 8개 펩티드 항원인 ₃₄₆아스파탐산-글루탐산-글루타민-아스파탐산-티로신-글루타민-이소루이신-아르기닌₃₅₃ 보다 우수한 항원적 특성을 가지고 있다. 상기 8개 아미노산으로 구성된 HN 단백질 에피토프는 생쥐의 단클론 항체를 이용하여 에피토프 활성을 확인하였으나, 생쥐와 조류간에는 전혀 다른 면역체계를 가지고 있어 생쥐에서 확인한 에피토프가 반드시 조류에서 인식가능한 에피토프일 수는 없다. 본 발명에 따른 14개의 아미노산으로 구성된 펩티드를 포함하는 HN 단백질 에티토프는 조류에서 인식가능하면 우수한 면역원성을 나타낸다.

본 발명자들은 국내에서 분리된 강병원성 뉴캐슬병 바이러스의 균주로부터 RNA를 추출하고 이를 RT-PCR한 후 염기서열을 밝혀내고 그로부터 아미노산 서열을 얻었다. 그 결과, 본 발명의 HN 단백질 선형 에피토프의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 및 SEQ ID NO: 6에 나타냈으며, 이를 암호화하는 염기서열을 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, 및 SEQ ID NO: 5에 기재하였다. SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 및 SEQ ID NO: 6으로 나타낸 아미노산 서열을 포함하는, 뉴캐슬병 바이러스의 HN 단백질 선형 에피토프 아미노산 서열을 백신주, 국내 및 외국 뉴캐슬병 바이러스 균주와 비교 분석하였다.

그 결과, HN 선형 에피토프의 경우 SNU0202는 백신주와 동일한 SEQ ID NO: 2을 가지고 있었고, SNU5070은 SEQ ID NO: 4를 가지고 있었으며, KBNP-4152와 SNU5005, SNU5009, SNU5074는 신규한 SEQ ID NO: 6을 가지고 있었다(도 1 참조). SEQ ID NO: 6으로 기재되는 선형 에피토프는 VII 형 외국주들에서는 발견되지 않았다.

본 발명자들은 SEQ ID NO: 2과 SEQ ID NO: 6으로 기재되는 펩티드를 Fmoc-화학을 이용해 합성하였으며, 합성된 펩티드를 96-웰 플레이트에 코팅하여 SEQ ID NO: 1을 갖는 라소타 백신주를 면역하여 얻은 닭의 항혈청(항-라소타 주 항혈청)과 SEQ ID NO: 3을 갖는 KBNP-4152를 면역하여 얻은 닭의 항혈청(항-KBNP-4152 항혈청)으로 ELISA 법을 수행하였다.

그 결과, 항-라소타 주 항혈청은 SEQ ID NO: 2의 펩티드에 대해 높은 반응성을 보인 반면, SEQ ID NO: 6을 갖는 펩티드에 대해서는 낮은 반응성을 보였고, 항-KBNP-4152 항혈청은 SEQ ID NO: 6을 갖는 펩티드에 대해서는 높은 반응성을 보인 반면 SEQ ID NO: 1을 갖는 펩티드에 대해서는 낮은 반응성을 보여 이러한 선형 에피토프가 조류 면역계에 의해 인식된다는 사실을 처음으로 확인하였고, SEQ ID NO: 6을 갖는 최근 야외 바이러스들은 기존의 백신 항체에 의해 중화가 거의 일어나지 않는다는 사실을 확인하였다 (도 2 , 도 3 참조).

본 발명은 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, 및 SEQ ID NO: 6에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하며, 조류 뉴캐슬병 바이러스 HN 단백질의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항체 또는 항체의 단편을 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 상기 항체 또는 항체의 단편은 SEQ ID NO: 2에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 HN 단백질의 에피토프를 포함하는 폴리펩티드를 항원으로 하여 제조되며, SEQ ID NO: 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인식하는 항체 또는 항체의 단편이다.

본 발명의 또 다른 예에서, 상기 항체 또는 항체의 단편은 SEQ ID NO: 4에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 HN 단백질의 에피토프를 포함하는 폴리펩티드를 항원으로 하여 제조되며, SEQ ID NO: 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인식하는 항체 또는 항체의 단편이다.

본 발명의 또다른 예에서, 상기 항체 또는 항체의 단편은 SEQ ID NO: 6에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 HN 단백질의 에피토프를 포함하는 폴리펩티드를 항원으로 하여 제조되며, SEQ ID NO: 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인식하는 항체 또는 항체의 단편이다.

상기 항체는 단클론 또는 다클론 항체일 수 있으며, 닭, 꿩, 오리, 칠면조, 메추리, 타조 등 조류의 항체인 것인 항체일 수 있다. 상기 항체는 닭, 꿩, 오리, 칠면조, 메추리, 타조 등 조류의 뉴캐슬병 바이러스에 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 항체 또는 항체의 단편을 조류 뉴캐슬병 바이러스를 포함하는 시료에 반응시키고, 상기 항체에 대한 양성반응을 나타내는 시료를 뉴캐슬병으로 판단하는 것을 포함하는 조류 뉴캐슬병의 진단방법을 제공하는 것이다. 상기 양성반응 확인은 통상의 항체-항원 반응을 탐지하는 방법으로 수행될 수 있으며, 예컨대 상기 항체 또는 항체의 단편에 방사선동위원소, 형광물질, 발광물질, 효소, 크로모젠(chromogen), 및 염색물질로 이루어진 군에서 선택된 표지물질로 표지하고, 상기 표지물질에 의한 반응결과를 검출하여 수행할 수 있다. 예를 들면, ELISA 이다.

또한, 본 발명은 상기 항체 또는 항체의 단편을 조류 뉴캐슬병 바이러스를 포함하는 시료에 반응시키고, 닭 적혈구를 반응시켜 뉴캐슬병 바이러스에 의한 혈구응집 억제 유무를 검사하는 상기 항체에 대한 혈구응집억제반응법을 이용하여 뉴캐슬 바이러스를 탐지하는 것을 포함하는 조류 뉴캐슬병의 진단방법에 관한 것이다. 본 발명의 일실시예에 따른 조류 뉴캐슬병 바이러스 HN 단백질 에피토프에 대한 항체를 이용한 혈구응집억제반응방법에는 통상의 바이러스 혈구응집억제반응방법을 적용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 HN 단백질의 에피토프를 인식하는 항체 또는 항체의 단편을 포함하는 조류 뉴캐슬병 진단용 폴리펩티드 키트 또는 상기 HN 단백질의 에 피토프를 암호화하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 상기 뉴캐슬병 바이러스 진단용 핵산 키트에 관한 것이다. 상기 핵산 키트는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, 및 SEQ ID NO: 5에 나타낸 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 프로브로 하여 폴리 엘 라이신 처리 유리기판이나 나이트로셀룰로오스, 나일론 막 등의 기판(substrate)에 코팅완충용액과 함께 점적하여 자연건조나, 자외선으로 결합시켜 바이러스 RNA나 RT-PCR 산물을 형광 염색약, 바이오틴, 다이곡시지닌 등으로 표지한 후 반응하는 서던 또는 노던 블로팅에 사용하거나 실시간 중합효소연쇄반응에 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 HN 단백질 에피토프를 암호화하는 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 프로브로 사용하여 통상의 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이을 이용한 바이러스 검출방법과 동일하게 적용할 수 있으며, 상기 핵산키트도 본 발명에 따른 HN 단백질 에피토프를 암호화하는 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 프로브로 사용하는 것을 제외하고는 통상의 핵산 키트와 동일하낟.

SEQ ID NO: 6에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 변형된 조류 뉴캐슬병 바이러스 HN 단백질의 에피토프(epitope)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 뉴캐슬병 바이러스(기탁번호 KCTC 10919BP)을 포함하는 조류 뉴캐슬병 바이러스용 백신.

본 발명은 또한 SEQ ID NO: 6에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 변형된 조류 뉴캐슬병 바이러스 HN 단백질의 에피토프(epitope)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 뉴캐슬병 바이러스에 관한 것이다. 상기 바이러스는 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하여 2005년 10월 26일에 기탁번호 KCTC 10919BP를 받았다. 상기 바이러스는 SEQ ID NO: 6에 나타낸 바와 같이 HN 단백질의 에피토프인 345번째 아미노산부터 358번째 아미노산을 포함하는 펩티드중에서 347번째 아미노산 및 354번째 아미노산이 라이신으로 변형되었다. 또한 단백질 3차 구조형성에 중요한 역할을 하는 시스테인(HN: C1-C13, F: C1-C13)과 N-결합 글리코실화 영역(HN: G1 - G6, F: G1-G6)에서 본 발명에 따른 변이주 SNU4152와 라소타 주를 비교한 결과 HN에서 C1과 G5, F에서 C2의 차이를 보였다.

본 발명은 상기 SEQ ID NO: 6에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 변형된 조류 뉴캐슬병 바이러스 HN 단백질의 에피토프(epitope)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 뉴캐슬병 바이러스(기탁번호 KCTC 10919BP)을 포함하는 조류 뉴캐슬병 바이러스용 백신을 제공하며, 상기 백신은 생백신, 약독화(attenuated) 백신, 또는 사 백신일 수 있다. 본 발명에 따른 백신은 통상의 조류 뉴캐슬병 바이러스용 백신에 포함될 수 있는 추가적인 부형제 또는 첨가제 등, 예를들면 미네랄오일, 수산화알루미늄 겔, 면역보조제로서 사포닌, 비타민, 모노소디움글루탐산, 지질다당체, 비씨지, 키토산, 글루칸, 펩티도글루칸 등을 추가할 수 있다. 상기 항체는 닭, 꿩, 오리, 칠면조, 메추리, 타조 등 조류의 뉴캐슬병 바이러스에 사용할 수 있다. 상기 백신의 조류 투여방법은 피하나 근육주사로 접종하고 육추기, 산란전, 산란 중에 1회 또는 반복하여 접종하여 수행할 수 있으며 접종량은 통상의 조류 뉴캐슬병 바이러스의 백신 투여량과 동일하다.

뉴캐슬병 바이러스의 F 단백질은 비활성 전구체 형태(F0)로 만들어지고 골지 막(Golgi membranes)을 통해 이동하는 동안 활성 형태인 F1과 F2로 잘리게 된다[Morrison , T., and A. Portner, Structure, function, and intracellular processing of the glycoproteins of Paramyxoviridae, 1991, p. 347-375. In D. Kingsbyry (ed.), The Paramyxoviruses. Plenum Press, New York.]. 이러한 과정은 F1 소단위체(subunit)의 아미노 말단에서 소수성 도메인(domain)을 노출시키고 이것은 성숙한 단백질의 생물학적 활성에 중요한 역할을 한다(Scheid and Choppin, 1974; Scheid and Choppin, 1978). 융합 펩티드(fusion peptide)라 불리는 소수성 도메인은 파라믹소바이러스(paramyxovirus) F 단백질에서 매우 보존되어 있고 막 융합을 매개하는데 직접적으로 관여하고 있을 것이라 여겨지고 있다(Lamb, 1993). 파라믹소바이러스 F 단백질은 7개 반복(heptad repeats)을 포함하고 알파 헬릭스 구조를 형성할 가능성이 있는 두 지역을 포함하는 여러 개의 공통된 구조 형태를 갖고 있다(Lamb, 1993). 두 반복중 가장 긴 7개 반복 A(heptad repeat A)는 F1의 아미노 말단에서 소수성 융합 펩티드와 인접해 있으며, 7개 반복 B는 관통막(transmembrane) 지역의 윗부분에 밀착하여 있다. 7개 반복 B는 매 7개 잔기마다 매우 보존된 루이신 혹은 이소루이신의 연속으로 구성되어 있다(Buckland and Wild, 1989).

HN 단백질은 비리온(virion)이 글리코접합(glycoconjugates)의 시알산(sialic acids)에 결합함으로써 호스트 세포 표면에 위치시키는 기능을 한다. HN 단백질은 관통막(transmembrane) 도메인, 줄기(stalk) 도메인 및 구형(globular) 도메인의 세 지역으로 나뉜다. 항원성인 수용체 결합과 뉴라미니다제 (neuraminidase) 활성 위치는 모두 구형 도메인에 위치해 있다. 융합 유도 활성은 줄기 도메인에 위치해 있고 이것은 F 단백질과 상호작용 한다(Sergei et al., 1993). 줄기 도메인은 예상되는 형태로 α-헬릭스와 함께 2개의 7개 반복 지역 A(74-88 위치)와 7개 반복 지역 B(96-110 위치)를 갖고 있다. 또한, 구조를 파괴하는 어떤 돌연변이도 수용체 결합과 뉴라미니다제 활성을 감소시키는 원인이 된다는 보고가 있다(Stone-Hulslander and Morrison, 1999).

본 발명자들은 SEQ ID NO: 6을 갖는 KBNP-0028과 라소타 주를 이용하여 교차 혈구응집억제검사법을 수행하였다. 그 결과, 항-라소타 주 혈청은 라소타 주에 대해 높은 혈구응집억제역가를 보였으나 항-KBNP-4152 혈청은 4배 내지 8배 낮은 혈구응집억제역가를 보였고, 항-KBNP-4152 혈청은 KBNP-4152 바이러스에 대해 항-라소타 주 혈청 대비 4배 내지 8배 높은 혈구응집억제역가를 보여 SEQ ID NO: 1을 갖는 라소타 주와 SEQ ID NO: 6을 갖는 KBNP-4152 간에 항원성의 차이가 있음을 재확인 하였다(도 4 참조).

또한, 본 발명자들은 항-라소타 주 혈청과 항-KBNP-4152 혈청으로 각각 중화시킨 KBNP-4152를 계태아섬유아세포에 감염시켜 바이러스 중화시험을 수행하였다. 그 결과, 항-라소타 주 혈청은 항-KBNP-4152 혈청에 비해 바이러스 중화능력이 128배 낮아 두 바이러스 간의 항원성 차이를 확인하였다(도 5 참조).

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> HN 단백질의 선형 에피토프 염기 서열 분석

<1-1> 바이러스 균주의 분리

뉴캐슬병 바이러스 균주는 닭으로부터 표준적인 방법(Alexander, 1989)에 의해 분리해 내었다. 구체적으로, 호흡관(trachea), 전위(proventriculus), 소장(small intestine) 및 맹장편도(cecal tonsil)와 같은 출혈성 병변(hemorrhagic lesions) 부위의 샘플을 사용하여 바이러스를 분리하였다. 상기 분리한 바이러스를 10% BCS(bovine calf serum, Gibco/BRL, Grand Island, NY)를 첨가한 DMEM(Gibco/BRL, Grand Island, NY) 배지에서 키운 계태아(chicken embryo) 섬유아세포에 접종하였고, 세포들은 5% CO₂, 37℃ 습윤에서 배양하였다. 융합세포(syncytia)를 관찰한 후에 상층액을 10 내지11일된 SPF(specific pathogen free) 발육란(Sunrise Co., NY)의 요막강(allantoic cavity)에 접종한 후 37℃에서 3일간 배양한 후 4℃에 정치한 후 요막액(allantoic fluids)을 회수하였다. 상기 회수한 요막액은 닭 적혈구 세포의 응집반응(agglutination)과 박테리아 감염을 테스트하였다. HN 단백질 선형 에피토프 염기서열을 분석하기 위하여 SNU0202, KBNP-4152, SNU5005, SNU5009, SNU5070, SNU5074 를 사용하였으며 뉴캐슬병 바이러스 최종 동정은 <실시예 1-3>에서 결정된 염기서열로 하였다. 바이러스 동정 및 선형항원 분석을 위한 HN 부분 염기서열을 첨부된 SEQ ID NO: 10 내지 15 및 도 6 내지 도 11에 나타냈다.

[표 1]

균주 추출원

균 주	품종	농장위치	나이 (일령)	임상 증상^**
KBNP-4152	산란계	나주	41	호흡기증상 및 폐사(25%)
SNU0202	산란계	안성	28	폐사
SNU5070	황새	청주	-	폐사
SNU5005	산란종계	평택	193	산란율 저하
SNU5009	산란계	평택	31	호흡기증상 및 폐사
SNU5074	산비둘기	철원	-	폐사

<1-2> RNA 분리와 RT-PCR

바이러스 게놈 RNA는 산-구아니디넘-페놀(acid-guanidinium-phenol) 방법(Chomzinski and Sacci, 1985)에 의해 요막액으로부터 추출하였다. 구체적으로 요막액 100 ㎕를 1 ㎖의 TRI 반응물(MRC co., MA)에 첨가하여 추출하고 RNA 침전물을 0.1% DEPC(diethyl pyrocarbonate) 처리된 일차증류수(DW) 50 ㎕로 녹였다.

상기에서 추출한 RNA 1 ㎕, 랜덤 헥사머(random hexamer, 20 ng/㎕) 1 ㎕, 5x 1^st 가닥 버퍼 2 ㎕, DEPC 처리된 DW 4.5 ㎕를 잘 섞어서 72℃에서 15분간 반응시키고 얼음에 냉각하였다. dNTPs(Bioneer co., Korea) 1 ㎕와 MMLV 역전사 효소(Superscript Ⅱ, Gibco, BRL) 0.5 ㎕를 상기 반응물에 첨가하여 42℃에서 60분간 반응시키고 역전사 효소는 94℃에서 5분 동안 처리하여 불활성화 시켰다. 4배 희석한 cDNA 1 ㎕, 10x PCR 버퍼 1 ㎕, 2.5 mM dNTPs 0.2 ㎕, 각각의 프라이머 (SEQ ID NO: 7 내지 SEQ ID NO: 8) 2 ㎕, Taq 중합효소(Bioneer co., 1 U/㎕) 1 ㎕ 및 DW 7.2 ㎕를 혼합하였다. 상기 반응액을 94℃에서 4분동안 변성시킨 후 94℃ 30초, 52℃ 10초, 72℃ 60초로 35번 반복 실시하고 난 뒤 72℃에서 7분간 더 반응시 켰다. PCR 산물은 2% 아가로스 젤에서 전기영동하여 EtBr로 염색하여 관찰하였다.

그 결과, 예측되는 크기의 증폭산물을 관찰하였으며 염기서열을 분석한 결과 특이적인 밴드임을 확인하였다.

<1-3> 염기서열 분석

HN 단백질의 유전자를 ABI377 DNA 자동분석장치와 다이 종결 키트(dye terminator kit, Perkin Elmer, Foster, CA)를 사용하여 염기서열을 분석하였다(Kwon et al., 2000). 구체적으로, PCR 산물 5 ㎕를 3 M 소듐 아세테이트(pH 5.2) 1 ㎕, 95% 에탄올 12.5 ㎕에 첨가하여 얼음에 10분간 방치한 후 14,000 rpm에서 15분간 원심분리하고 70% 에탄올로 세척한 후 침전물을 건조시키고 이를 1x PCR 버퍼 10 ㎕에 용해시켰다. 염기서열 분석을 경제적으로 하기 위해 다이 종결 키트(Taq 중합효소, FS; Perkin Elmer Co.)를 DW로 2.5배 희석하고 희석된 키트 2 ㎕를 DNA 1 ㎕, 1x PCR 버퍼 2 ㎕, 염기서열 결정용 프라이머(SEQ ID NO: 9, 3 pmol/㎕) 1 ㎕에 첨가하였다. PCR은 96℃에서 10초 동안 반응 후 96℃ 10초, 56℃ 5초, 60℃ 20초의 반응을 25회 반복 실시하고 4℃에서 반응을 종료시켰다. PCR이 끝난 후 PCR 산물은 에탄올 침전을 실시하였고 침전물을 말린 후 블루 덱스트란/EDTA(Blue Dextran/EDTA, Perkin Elmer Co.) 로딩 버퍼(포름아미드 5 부피, 블루 덱스트란/EDTA 1 부피) 2 ㎕에 녹였다. 변성 후 ABI377 DNA 자동분석장치에서 반응을 실시하였다.

그 결과, SNU0202는 SEQ ID NO: 2을 가지고 있었고, SNU5070은 SEQ ID NO: 4를 가지고 있었으며, KBNP-4152와 SNU5005, SNU5009, SNU5074는 SEQ ID NO: 6을 가지고 있었다(도 1 참조).

<1-4> 다른 균주와 비교 분석

상기에서 분석된 HN 단백질의 선형 에피토프 아미노산 서열은 단백질-단백질 BLAST 검색(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)을 통해 분석하였다.

그 결과, SEQ ID NO: 1로 기재되는 HN 선형 에피토프는 백신주인 라소타, B1, 울스터 등을 포함하는 대부분의 뉴캐슬병 바이러스에서 관찰되었고, SEQ ID NO: 2로 기재되는 선형 에피토프는 SL03(ABB45815), JS06(ABB45825), SGM01(ABB45828), TJ03(ABB51144), SBZ02(ABB51145), JS01(ABB51146), JS02(ABB51147), JS04(ABB51148), JS05(ABB51149), SCL03(ABB51151), SQD04(ABB51152), JS03(ABB51154), GD05(ABC86693), wfan-3-01(AAY46244), ytan-1-01(AAAY56378), P35742(IBA/85), SNU9358GG (Kwon et al., 2000), SNU9444 (Kwon et al., 2000), SNU9598 (Kwon et al., 2000)에서 관찰되었으며, SEQ ID NO: 3으로 기재되는 선형 에피토프는 외국의 뉴캐슬병 바이러스에서는 관찰되지 않았다.

<실시예 2> HN 선형 에피토프의 닭 항체 반응성 조사

<2-1> 펩티드 합성

SEQ ID NO: 1과 SEQ ID NO: 3에 해당하는 펩티드를 Fmoc-화학(Gloor et al., 1994)을 이용하여 합성(펩트론 사, 대전, 한국) 하였으며, 96-웰 플레이트에 코팅 효율을 높이기 위해 SEQ ID NO: 1의 아미노 말단에 7개의 리신을 붙였고, SEQ ID NO: 3의 카복실 말단에는 아미노카프로익 산(aminocaproic acid) 4개를 붙였다.

<2-2> 항혈청 제조

라소타 바이러스(혈구응집역가 1,024/25㎕)는 0.2% 포르말린으로 불활화 하였고, KBNP-4152(혈구응집역가 248/25㎕)는 0.025% 포르말린으로 불활화 하였으며, 각각 SPF 발육란 5개에 200㎕ 씩 접종하여 3일간 관찰하였고, 요막액을 수확하여 혈구응집 검사를 실시하여 음성임을 확인하였다. 프로인트 완전 보조액과 불활화 바이러스 동량을 혼합하여 유중수 에멀젼을 만들어 각각 SPF 닭 2마리에 수당 200㎕ 씩 접종하였고, 2마리는 음성 대조군으로 실험기간 동안 사육하며, 뉴캐슬병바이러스 항체 음성여부를 확인하였다. 백신 접종 4주후 채혈하여 혈청을 분리하여 냉장 또는 냉동하여 실험에 사용하였다.

<2-3> ELISA

SEQ ID NO: 2과 SEQ ID NO: 6으로 기재되는 펩티드를 50mM 카보네이트-바이카보네이트(pH9.6) 완충용액에 부유하여 96-웰 플레이트 웰당 125ng과 4㎍을 실온에서 4시간 코팅한 후 3% 소혈청알부민 200㎕를 첨가하여 4℃에서 종야 블로킹하였다. 블로킹 용액을 인산완충용액(pH7.2)으로 세척한 후 항-라소타 혈청과 항-KBNP-4152 혈청을 16배, 32배, 128배, 256배 희석하여 각각의 펩티드가 코팅된 웰에 첨가하여 실온에서 1시간 반응한 후 인산완충용액으로 3회 세척하였다. 항-닭 면역글로부린-HRP 접합 이차항체를 첨가한 후 실온에서 1시간 반응한 후 인산완충용액으로 3회 세척한 후 기질 용액(TMB, 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine)을 첨가하였고, 정지용액을 넣어 450nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도는 혈청을 넣지 않은 웰의 흡광도와 펩티드를 코팅하지 않은 웰의 흡광도를 차감하여 수치를 보정하였다.

그 결과, SEQ ID NO: 2로 기재되는 펩티드는 항-라소타 주 혈청에 대해 높은 반응성을 보인반면 SEQ ID NO: 6으로 기재되는 펩티드에 대해서는 반응을 보이지 않았고, 항-KBNP-4152 혈청은 SEQ ID NO: 6으로 기재되는 펩티드에 높은 반응성을 보였다 (도 5 참조). 따라서 SEQ ID NO: 2과 SEQ ID NO: 6으로 기재되는 펩티드는 조류 면역계에 의해 모두 인식된다는 사실을 처음으로 확인하였으며, SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열의 변화는 항원성에 변화를 일으켜 기존의 백신주에 대한 항체에 대한 반응성이 급격히 저하된다는 사실을 증명하였다.

<실시예 3> 교차 혈구응집억제 검사

일방향-혈구응집 억제검사를 위하여 먼저 라소타 주와 KBNP-4152의 혈구응집 역가를 측정하였다. 구체적으로, 96-웰 플레이트(96-well plate)의 각각의 웰에 인산완충용액 50 ㎕ 씩을 분주하고, 첫번째 웰에 바이러스 50 ㎕를 첨가하여 혼합한 후 다시 50 ㎕를 채취하여 다음 웰에 첨가하여 섞어주는 과정을 반복하며 마지막 웰에서는 50 ㎕를 채취해 제거하는 방법으로 연쇄 희석(serial dilution)을 실시하였다. 상기와 같이 바이러스가 2배 단위로 희석된 각 웰에 0.5% 닭 적혈구(v/v) 50 ㎕를 첨가하여 혼합한 후 4℃에서 30분 동안 반응시킨 후 완벽한 혈구응 집이 일어난 웰의 희석배수(2ⁿ, n=희석배수)를 혈구응집 역가로 하였다.

상기에서 설정한 역가에 기초하여 교차-혈구응집 억제검사를 실시하였다. 즉, 4-혈구응집단위의 라소타 주 25 ㎕와 항-라소타 주 혈청 25 ㎕, 라소타 주 25 ㎕와 항-KBNP-4152 혈청 25 ㎕, KBNP-4152 25 ㎕와 항-KBNP-4152 혈청 25 ㎕, KBNP-4152 25 ㎕와 항-라소타 주 혈청 25 ㎕를 혼합하여 실온에서 30분 간 반응시킨 후 0.5% 닭 적혈구 50 ㎕를 첨가하여 4℃에서 30분 경과 후 혈구응집이 완전히 억제된 웰의 수를 혈구응집 억제역가로 하였다.

그 결과, 항-라소타 주 혈청은 라소타 주에 대해 높은 혈구응집억제역가를 보였으나 항-KBNP-4152 혈청은 4배 내지 8배 낮은 혈구응집억제역가를 보였고, 항-KBNP-4152 혈청은 KBNP-4152 바이러스에 대해 항-라소타 주 혈청 대비 4배 내지 8배 높은 혈구응집억제역가를 보여 SEQ ID NO: 2을 갖는 라소타 주와 SEQ ID NO: 6을 갖는 KBNP-4152 간에 항원성의 차이가 있음을 재확인 하였다(도 4 참조).

<실시예 4> 일방향-바이러스 중화시험

라소타 주 백신과 KBNP-4152 접종으로 생성된 항체의 KBNP-4152에 대한 중화능력을 평가하기 위해 일방향-바이러스 중화시험을 실시하였다. 즉 시험관에서 혈청을 PBS로 2진 희석한 후 96-웰 플레이트에 100㎕씩 옮기고 동량의 바이러스 (100 TCID₅₀/25㎕)를 첨가한 후 37℃에서 1시간동안 중화시킨다. 중화재료 25㎕와 섬유아세포 부유액 100㎕를 각 웰에 접종한다. 37℃에서 4일간 배양하여 완전 중화가 일 어나 세포변성효과가 전혀 나타나지 않은 최고 희석 배수의 역수를 중화 역가로 하였다.

그 결과, 항-라소타 주 혈청은 항-KBNP-4152 혈청에 비해 바이러스 중화능력이 128배 낮아 두 바이러스 간의 항원성 차이를 확인하였다(도 5 참조).

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 조류 면역계 인식 HN 에피토프와 상기 에피토프 변이 뉴캐슬병바이러스는 뉴캐슬병 바이러스를 이용하여 효과적인 백신을 개발할 수 있을 뿐만 아니라, 뉴캐슬병 바이러스을 신속하고 정확하게 진단할 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, 및 SEQ ID NO: 6에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어지는, 조류 뉴캐슬병 바이러스 HN 단백질의 에피토프(epitope)인 폴리펩티드.
제 1 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 조류 뉴캐슬병 바이러스 HN 단백질의 345번째 아미노산부터 358번째 아미노산 서열인 것인 폴리펩티드.
SEQ ID NO: 6에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 변형된 조류 뉴캐슬병 바이러스 HN 단백질의 에피토프(epitope)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로 이루어지는 뉴캐슬병 바이러스(기탁번호 KCTC 10919BP).
SEQ ID NO: 6에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 변형된 조류 뉴캐슬병 바이러스 HN 단백질의 에피토프(epitope)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로 이루어지는 뉴캐슬병 바이러스(기탁번호 KCTC 10919BP)을 포함하는 조류 뉴캐슬병 바이러스용 백신.
제 4 항에 있어서, 상기 백신은 생백신, 약독화(attenuated) 백신, 또는 사 백신인 백신.
SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, 및 SEQ ID NO: 6에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어지는, 조류 뉴캐슬병 바이러스 HN 단백질의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항체.
제 6 항에 있어서, 상기 항체는 SEQ ID NO: 2에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 HN 단백질의 에피토프를 포함하는 폴리펩티드를 항원으로 하여 제조되며, SEQ ID NO: 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 인식하는 항체.
제 6 항에 있어서, 상기 항체는 SEQ ID NO: 4에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 HN 단백질의 에피토프를 포함하는 폴리펩티드를 항원으로 하여 제조되며, SEQ ID NO: 4에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 인식하는 항체.
제 6 항에 있어서, 상기 항체는 SEQ ID NO: 6에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 HN 단백질의 에피토프를 포함하는 폴리펩티드를 항원으로 하여 제조되며, SEQ ID NO: 6에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 인식하는 항체.
제 6 항에 있어서, 상기 항체는 단클론 또는 다클론 항체인 항체.
제 6 항에 있어서, 상기 조류는 닭, 꿩, 오리, 칠면조, 메추리, 또는 타조인 것인 항체.
제 6항 내지 11항중 어느 한항에 따른 항체를 조류 뉴캐슬병 바이러스를 포함하는 시료에 반응시키고, 상기 항체에 대한 양성반응을 나타내는 시료를 뉴캐슬병으로 판단하는 것을 포함하는 조류 뉴캐슬병의 진단방법.
제 6항 내지 11항중 어느 한항에 따른 항체를 조류 뉴캐슬병 바이러스를 포함하는 시료에 반응시키고, 닭 적혈구를 반응시켜 뉴캐슬병 바이러스에 의한 혈구응집 억제 유무를 검사하는 상기 항체에 대한 혈구응집억제반응법을 이용하여 뉴캐슬 바이러스를 탐지하는 것을 포함하는 조류 뉴캐슬병의 진단방법.
제 13 항에 있어서, 상기 양성반응은 상기 항체에 방사선동위원소, 형광물질, 발광물질, 효소, 크로메젠(chromogen), 및 염색물질로 이루어진 군에서 선택된 표지물질로 표지하고, 상기 표지물질에 의한 반응결과를 검출하여 수행하는 것인 조류 뉴캐슬병의 진단방법.
제 6항 내지 11항중 어느 한항에 따른 항체를 포함하는 조류 뉴캐슬병 진단용 폴리펩티드 키트.
SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, 및 SEQ ID NO: 5에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 조류 뉴캐슬병 진단용 핵산 키트.