MX2010014562A - Nuevo astrovirus. - Google Patents

Abstract

La presente invención es concerniente con el aislamiento y uso de nuevos astrovirus aviares. La presente invención también es concerniente con vacunas, kits y métodos para detección de un nuevo astrovirus. La presente invención es concerniente además con la vacunación de aviares, prevención y/o tratamiento de infecciones aviares asociadas con astrovirus. Las infecciones de aves de corral por este nuevo astrovirus están asociadas con síndromes de atrofia o impedimento de crecimiento de animales pequeños.

Description

NUEVO ASTROVIRUS CAMPO DE LA INVENCIÓN . La presente invención es corcerniente con el aislamiento y usos de nuevos astrovirus aviares. La presente invención también es concerniente con vacunas, kits y métodos para detección de un nuevo astrovirus. La presente invención es concerniente además con la vacunación de aviares, prevención y/o tratamiento de infecciones aviares asociadas con astrovirus. Las infecciones de aves de corral por este nuevo astrovirus están asociados con los síndromes de atrofia o impedimento de crecimiento normal de animal pequeño.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Astrovirus Los astrovirus fueron identificados por primera vez en 1980 por McNulty et al. del contenido intestinal de aves de corral de pavos de 11 días edad con diarrea y mortandad incrementada. Subsecuentemente, astrovirus en parvadas de pavos jóvenes fueron reportados en los Estados Unidos de América en 1985, 1986 y más recientemente en 2000.

Los astrovirus causan o han sido asociados con gastroenteritis en humanos, ganado, puercos, ovejas, gatos, perros, venados, ratones y pavos, también como hepatitis fatal en patos. En pollos, el virus de nefritis aviar (ANV) fue clasificado como Astroviridae en base a la organización genómica. Más recientemente, astrovirus han sido detectados en aves con enteritis de aves de corral y síndrome mortandad (PEMS) . Los astrovirus son frecuentemente el único virus detectado en parvadas con enfermedad entérica. En general, se presentan con otros virus entéricos, especialmente rotavirus de grupo D.

Los astrovirus son virus pequeños, redondos comúnmente de 25-35 nanómetros de diámetro. Obtienen su nombre de las proyecciones de superficie semejantes a estrellas de 5 o 6 puntas observados utilizando microscopía electrónica. Sin embargo, solamente el 10% de los astrovirus en una población pueden exhibir esta morfología y la visualización es dependiente de la preparación de la muestra. Los astrovirus son virus ARN de sentido positivo no envueltos. Su genoma viral es de 6.5-7.5 kilobases de largo y contiene tres cuadros de lectura abierta (ORF) . Estos cuadros de lectura codifican por proteínas no estructurales (ORFla) , una polimerasa de ARN viral ARN dependiente (ORFlb) y proteína de cápsido de precursor (ORF2) .

Los astrovirus son molecularmente distintos de los picornavirus en que sintetizan un mensaje sub-genómico durante la replicacion y difieren de los picornavirus y calicivirus en que tienen una secuencia de señal de desplazamiento de cuadro semejante a retrovirus entre ORFla y ORFlb. Actualmente, solamente el astrovirus humano (HAstV) , dos cepas distintas de astrovirus de pavo (TAstV) , astrovirus de puerco (SAstV) y virus de nefritis aviar (A V) han tenido sus genomas plenamente secuenciados . Los astrovirus aviares son molecularmente distintos, compartiendo muy poca similaridad de secuencia en los diferentes segmentos de gen. Sin embargo, los astrovirus de pavo se agrupan en grupo distinto de ANV.

Infecciones virales de nefritis aviar Las infecciones virales de nefritis aviar son infecciones contagiosas de pollos y pavos caracterizadas por daño renal y depósitos de urato visceral, retardo del crecimiento, síndrome de atrofia o impedimento de crecimiento normal de animal pequeño y mortandad limitada (2-6%) . Son vistos principalmente en pollos de < 7 días de edad, pero nefritis intersticial puede ser observada en pollos de hasta cuatro semanas de edad. Estas infecciones han sido reportadas en todo el mundo. Las infecciones sub-clínicas son comunes y han sido detectadas mediante estudios serológicos en algunas parvadas de SPF. Los virus causales son virus de nefritis aviar (ANV, un astrovirus) , virus semejantes a ANV y virus semejantes a enterovirus relacionados (ELV) . Las cepas varían en influencia y en anti-genicidad . La transmisión ocurre mediante contacto directo o indirecto. La evidencia indirecta sugiere que la transmisión por huevo puede ocurrir. La infección puede ser transmitida mediante administración oral de virus a aves de un día edad. El virus es aislado consistentemente de los ríñones por las heces durante los primeros diez días después de la infección. Los signos clínicos varían de ninguno al llamado síndrome de atrofia o impedimento de crecimiento normal de animal pequeño (RSS) . La diarrea y retardo en el crecimiento son comunes en las crías. Brotes con mortandad de 2-6% pueden ocurrir en pollos recién nacidos hasta 7 días de edad; hallazgos de necropsia cardinal son daños renales y depósitos de urato visceral (nefropatía de pollo bebé) .

Síndrome de mala absorción aviar El síndrome de mala absorción aviar (MAS) es una enfermedad de aves de corral en crecimiento, especialmente pollos, con los tipo carne o recién nacidos siendo afectados más comúnmente. Esta enfermedad ha sido reportada en los Países Bajos (Kouwenhoven et al., 1978) como síndrome de atrofia o impedimento de crecimiento normal de animal pequeño (RSS) pero también bajo nombres diferentes en todo el mundo como por ejemplo síndrome de impedimento del crecimiento infeccioso, enteritis, síndrome de ave pálida, enfermedad de helicóptero, proventriculitis infecciosa, enfermedad de hueso quebradizo y necrosis de cabeza femoral.

Kouwenhoven et al. (Avian Pathology 17:879-892, (1988)) definió además el MAS por cinco criterios: 1) deterioro del crecimiento hasta tres semanas después de la infección de pollos de un día de edad; 2) excreción de mucoide anaranjado amarillo a depósitos húmedos; 3) actividad de fosfatasa alcalina en el plasma incrementado (ALP) ; concentración de carotenoide en el plasma disminuido (PCC) y 5) placas de crecimiento epifiseal macroscópicamente ensanchadas de la tibia próxima. La condición ha sido caracterizada adicionalmente por crecimiento disminuido, plumaje deficiente, alimento mal digerido, carencia de pigmentación de piel, enteritis, atrofia pancreática, proventriculitis , atrofia química y bursal y cambios de hueso .

Vertommen et al. (1980) describen la transmisión de la enfermedad mediante inoculación oral de homogenados intestinales de pollos afectados a crías de un día. En aquel experimento, se demostró que bajos niveles de carotenoide en el plasma y actividades de ALP elevadas son herramientas apropiadas para diagnosis de MAS. En experimentos adicionales, MAS fue transmitido mediante inoculación oral de homogenados de hígado de pollos afectados a crías de un día de edad. A pesar de años de investigación, la etiología de MAStodavía no ha sido plenamente establecida y la condición es todavía un problema mayor para la industria de aves de corral. Se cree que un virus es responsable, pero las bacterias u otros organismos no han sido excluidos como agentes causales .

Los virus que han sido asociados con brotes de MAS y/o nefritis posiblemente incluyen astrovirus, rotavirus, parvovirus, virus semejantes a entero y virus semejantes a togavirus (McNulty and McFerran, 1993 ) . McNulty (World Poultry 14 : 57 - 58 ) ( 1998 ) ) , resumieron el estado del arte en cuanto a las MAS y ha postulado que la identificación del agente causal es todavía desconocida y recomienda el control mediante manejo cuidadoso de los sitios de producción.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención provee un nuevo serotipo de astrovirus aislado, designado AVS-1 , que ha sido depositado con la ' American Type Culture Collectioh ("ATCC" 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209 USA) bajo el Tratado de Budapest el 26 de junio de 2008 y tiene el número de acceso PTA-9298 . El nuevo serotipo de astrovirus ha sido caracterizado en la presente como posible agente viral que provoca infecciones aviares .

En otra modalidad, se provee una vacuna para uso en la protección y un método de vacunación de aves de corral contra condiciones de enfermedad resultantes . de una infección de astrovirus aviar, que comprende los astrovirus revelados en la presente y un portador aceptable farmacéuticamente. La presente invención también provee anti-suero que es inducido en un animal por los astrovirus revelados en la presente. En otra modalidad, también se proveen anticuerpos que se enlazan a los astrovirus revelados en la presente.

La presente invención también provee un método para proteger las aves de corral contra condiciones de enfermedad resultantes de una infección de astrovirus aviar, que comprenden la etapa de administrar la vacuna revelada en la presente a las aves de corral .

En particular, las condiciones de enfermedad de aves de corral incluyen MAS o síndrome de impedimento o atrofia del crecimiento .

Una región de genoma de AVS-1 ha sido secuenciada. Esta región comprende una secuencia de nucleótidos como se resume en SEQ ID NO: l o una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos 85%, preferiblemente por lo menos 90%, 93%, más preferiblemente 95% o 98% o entre 98% y 100% de identidad de secuencia con la secuencia resumida en SEQ ID NO: l o con un fragmento de la misma. También se provee una secuencia de nucleótidos apta de hibridización a SEQ ID NO: 1 bajo condiciones severas y fragmentos de la misma.

La presente invención también provee un método para detectar la presencia de astrovirus aviar en aves de corral, que comprende las etapas de: obtener una muestra de las aves de corral; poner en contacto la muestra con anticuerpos que se enlazan a los astrovirus revelados en la presente y detectar el enlace de los anticuerpos a la muestra, en donde la detección del enlace indicaría la presencia de astrovirus de la presente invención en las aves de corral .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra parte de la secuencia de nucléotidos (SEQ ID NO: 1) correspondiente al gen de polimerasa del aislado de astrovirus de AVS-1.

La Figura 2A-E) muestra la alineación de aminoácidos de la secuencia de nucléotidos de AVS-1 como es resumida en la SEQ ID NO: 1 (designada ASTHB) con la misma región de astrovirus aislados de casos clínicos similares (designados ASTV, ASTLE, ASTPL, ASTEK) utilizando el programa de alineación de secuencias múltiple ClustalW, la alineación de secuencia de nucléotidos reveló 99.3-99.7% de similaridad con el aislado de ASV-1.

La Figura 3 muestra el árbol filogénico de varias secuencias de astrovirus aviar.

La Figura 4 muestra la estructura de genoma del astrovirus aviar aislado AVS-1 y ubicación del cebador usado para la caracterización molecular de la aislado de AVS-1.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En una modalidad, la presente invención provee una nueva clase antígena de astrovirus aviar. En particular, la presente invención provee un nuevo serotipo de astrovirus aislado designado AVS-1 que ha sido depositado con la American Type Culture Collection ("ATCC" 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209 USA) bajo el Tratado de Budapest el 26 de junio de 2008' y tiene el número de acceso PTA-9298. El astrovirus recién caracterizado AVS-1 es antígenamente distinto de astrovirus previamente conocidos .

También, una porción del genoma del aislado de AVS-1 ha sido secuenciada. La secuencia comprende parte del gen de polimerasa del nuevo aislado de astrovirus AVS-1. La comparación de la secuencia con otros astrovirus bien conocidos muestra similaridad de secuencia entre 73-75% a otros astrovirus bien conocidos y 91% similar a secuencias en Genbank, mostrando claramente mediante esto que el nuevo serotipo distinto de cepas previamente conocidas ha sido aislado .

La presente invención provee asi una secuencia de nucleótidos aislada que tiene por lo menos 85%, preferiblemente por lo menos 90%, 93%, más preferiblemente 95% o 98% o entre 98% y 100% de identidad de la secuencia con la secuencia resumida en SEQ ID NO : l o con un fragmento de la misma. También se provee una secuencia de nucleótidos apta de hibridización a SEQ ID NO: 1 bajo condiciones severas y fragmentos de la misma.

Identidad de secuencia o porcentaje de identidad se refiere a un porcentaje especificado de residuos en las dos secuencias que son los mismos cuando son alineados para máxima correspondencia en una ventana de comparación especificada, tal como es medida mediante algoritmos de comparación de secuencias o mediante inspección visual. Esto es determinado en relación con secuencias de nucleótidos provistas por la invención, la identidad de secuencia es determinada utilizando un algoritmo matemático apropiado. Implementaciones de computadora de tales algoritmos matemáticos pueden ser utilizados para comparación de secuencias para determinar la identidad de secuencia. Tales implementaciones incluyen pero no están limitados a CLUSTAL en el programa PC/Gene; el programa ALIGN y BESTFIT, BLAST, FASTA.

Hibridización se refiere al enlace o formación de dúplex o hibridización de una molécula solamente a una secuencia de nucleótidos particular bajo condiciones severas cuando aquella secuencia está presente en un ADN o AUN de muestra de ave de corral. Comúnmente, para obtener hibridización severa, temperaturas de aproximadamente 5°C a aproximadamente 20°C menor que la Tm (Temperatura de fusión a la cual la mitad de las moléculas se disocian de sus socios) son utilizadas. Tales condiciones son definidas además por la fuerza iónica y pH de la solución. Por ejemplo, condiciones de hibridización altamente severas son obtenidas a NaCl 0.15 molar a 72 °C por aproximadamente 15 minutos. Un ejemplo de una condición lavado severo es un lavado de SSC 0.2X a 65°C por 15 minutos. Un ejemplo de un lavado de severidad media para dúplex de ADN de por ejemplo, más de 100 nucleótidos, es SSC IX a 45°C por 15 minutos. Un ejemplo de un lavado de baja severidad para un dúplex de por ejemplo más de 100 nucleótidos es SSC 4-6X a 40°C por 15 minutos. Para sondas cortas de 10 a 15 nucleótidos, las condiciones severas involucran comúnmente concentraciones de sal de menos de aproximadamente 1.5 molar, más preferiblemente alrededor de 0.01 a 1.0 molar, concentración de ion de Na a pH 7.0 a 8.3 y la temperatura es comúnmente por lo menos aproximadamente 30°C y por lo menos 60°C para sondas largas de aproximadamente 50 nucleótidos.

La presente invención también provee secuencias de aminoácidos que son codificadas por las secuencias de nucleótidos descritas anteriormente. Tales secuencias de aminoácidos son aptas de generar una respuesta inmunógena contra el nuevo aislado de astrovirus de AVS-1. La presente invención provee ventajosamente un fragmento de una secuencia de nucleótidos como se revela anteriormente que codifica una secuencia de aminoácidos que es apta de generar una respuesta inmunógena contra el nuevo aislado de astrovirus de AVS-1. Tales péptidos inmunógenos exhiben por lo menos un sitio antígeno al cual la respuesta inmune puede ser dirigida. La respuesta inmunógena es contra por lo menos un sitio antigénico, tal como por. ejemplo la proteína de cápsido del aislado de astrovirus de AVS-1.

La invención provee además un constructo genético que porta por lo menos una secuencia de nucléotidos como se revela en la présente o una porción de la misma que codifica un péptido inmunogénico, bajo el control de secuencia de promotor que es enlazada operativamente a dicha secuencia de nucleótidos, también como un vector y células huésped que contienen tal constructo genético. Vectores apropiados son bien conocidos en el arte e incluyen por ejemplo plásmidos procariónticos o eucariónticos, virus tales como baculovirus, adenovirus, etc. y vectores de levadura. Las células huésped pueden ser células bacterianas, células de insecto, células de planta, células de levadura, etc. De acuerdo con este aspecto, se provee un método para producir un péptido codificado por una secuencia de nucleótidos como se describe anteriormente, que comprende la etapa de: (i) poner en contacto la célula huésped apropiada con un vector como se describe anteriormente y (ii) cultivar la célula huésped bajo condiciones apropiadas para la producción de un polipéptido o un fragmento del mismo. Las células huésped preferidas son células bacterianas tales como Escherichia coli o células de levadura tales como Pichia. La invención provee así un péptido antigénico obtenible mediante el método anterior. El péptido antigénico así obtenido puede ser aislado y purificado del cultivo de células huésped en el cual es expresado .

La invención así también es concerniente con anticuerpos policlonales o monoclonales que se enlazan específicamente a tales polipéptidos antigénicos, también como una composición para vacunación de aves de corral que comprende tales polipéptidos antigénicos y/o una composición para tratar infecciones de aves de corral que comprenden tales anticuerpos policlonales o monoclonales .

En otra modalidad, la presente invención provee una vacuna que proporciona efectivamente protección en aves de corral contra enfermedades provocadas por el aislado de astrovirus aviar de la nueva clase antigénica y una vacuna para inmunización contra síndrome de atrofia de crecimiento de animal pequeño en aves de corral. En efecto, la vacunación puede ser usada ventajosamente para controlar tal enfermedad, ya que las aves de corral vacunadas son menos susceptibles a efectos adversos provocados por infecciones virales subsecuentes por el mismo agente infeccioso.

En general, el antisuero apropiado criado contra el aislado de astrovirus vivo revelado en la presente puede ser preparado al inocular pollos de 3 a 4 semanas de edad subcutánea o intramuscularmente con una cepa de virus vivo que tiene un título infeccioso de entre 102- 109TC ID50/ animal; más preferiblemente entre 103 - 106 TC ID50/ animal. La sangre puede ser recolectada de 3 a 4 semanas después de la infección, preferiblemente 4 semanas después de la infección. Los pollos pueden también ser re-infectados con la misma cepa de virus vivo 3 a 4 semanas después de la primera infección con aproximadamente la dosis como la usada en la primera infección. La sangre es recolectada entre 2 y 4 semanas después de la segunda infección.

El antisuero apropiado puede también ser criado contra el aislado de cepa de astrovirus aviar inactivado revelado en la presente al inocular pollos de 3 a 4 semanas de edad subcutánea o intramuscularmente con la preparación de virus desactivada. El título infeccioso de la preparación antes de la desactivación puede ser de entre 107 - 1011 TC ID50/ animal; más preferiblemente entre 108 - 1010 TC ID50/ animal. La sangre puede ser recolectada 3 a 4 semanas después de la inoculación, preferiblemente 4 semanas después de la inoculación. Los pollos pueden también ser re-inoculados con la misma preparación de virus desactivada 3 a 6 semanas después de la primera inoculación. La sangre es recolectada entre 2 y 4 semanas después dé la segunda inoculación.

La presente invención también provee una vacuna para uso en la protección de aves de corral contra condiciones de enfermedad resultantes de una infección de astrovirus aviar, tal como MAS o síndrome de atrofia de crecimiento de animal pequeño, que comprende un aislado de astrovirus aviar de acuerdo con la invención y un portador o diluyente aceptable farmacéuticamente.

El aislado de astrovirus de acuerdo con la presente invención puede ser incorporado a la vacuna como un virus atenuado o desactivado vivo. La propiedad del aislado de astrovirus aviar para inducir condiciones de enfermedad MAS-asociadas o condiciones de síndrome de atrofia de crecimiento de animal pequeño como se describe en la presente son reducidos significativamente o están completamente ausentes si el astrovirus aviar está en una forma atenuada o desactivada viva.

La atenuación del aislado de astrovirus aviar de acuerdo con la invención puede ser obtenida mediante métodos bien conocidos en el arte para este propósito, tal como se revela en Gouvea · et al. (virology 126:240-247, (1983)). Brevemente, después del aislamiento del virus de un animal objetivo, una suspensión de virus es inoculada sobre cultivos celulares primarios (aviar) tales como células de hígado de embrión de pollo (CEL) , fibroblastos de embrión de pollo primarios (CEF) o células de riñon de pollo (CK) o líneas de células mamíferas tales como la línea de célula VERO, la línea de células BGM-70 o línea de célula aviar tal como QT-35, QM-7 0 LMH. Si el aislado no es apto de producir efecto citopático (CPE) , entonces el virus se hace pasar repetidamente (por ejemplo, 3-10 veces) hasta que se observa CPE. Tan pronto como el CPE es visible, las células y fluidos de cultivo celular son recolectados, congelados y deshelados, clarificados mediante centrifugación y el sobrenadante que contiene el aislado de astrovirus aviar es sometido a alícuotas y almacenado a -20°C. Este proceso puede ser repetido (por ejemplo 10-100 veces) para atenuar adicionalmente el virus .

En una modalidad, una vacuna de acuerdo con la presente invención puede ser preparada mediante métodos convencionales, tal como por ejemplo usados comúnmente para las vacunas de astrovi^rus vivas y desactivadas disponibles comercialmente . Por ejemplo, la propagación de composiciones de vacunas veterinarias es descrita en "VaccinesforVeterinaryApplications" (ed. : Peters, A. R. et al., Butterworth-HeinemannLtd, 1993).

En una modalidad, la vacuna de acuerdo con la presente invención que contiene virus atenuado vivo puede ser preparada y comercializada en forma de una suspensión (congelada) o en forma liofilizada. La vacuna puede contener adicionalmente un portador o diluyente aceptable farmacéuticamente usado acostumbradamente para tales composiciones. Los portadores incluyen estabilizadores, conservadores y soluciones reguladoras del pH. Estabilizadores apropiados son, por ejemplo SPGA, carbohidratos (tal como sorbitol, manitol, almidón, sacarosa, dextrana, glutamato o glucosa), proteínas (tal como suero de leche . seca, albúmina o caseína) o productos de degradación de los mismos. Soluciones reguladoras del pH apropiadas son por ejemplo fosfatos de metal alcalino. Conservadores apropiados son timerosal, mertiolato y gentamicina. Los diluyentes incluyen agua, solución reguladora del pH acuosa (tal como solución salina de pH regulado), alcoholes y polioles (tal como glicerol) .

En otra modalidad, las vacunas vivas de acuerdo con la presente invención pueden contener un adyuvante. Ejemplos de compuestos y composiciones apropiados con actividad adyuvante son en general conocidos en el arte para preparación de vacunas .

Aunque la administración mediante inyección, por ejemplo intramuscular, subcutánea de la vacuna viva de acuerdo con la presente invención es posible. La vacuna viva es preferiblemente administrada mediante las técnicas de aplicación en masa no caras usadas comúnmente para vacunación de astrovirus aviar. Estas técnicas incluyen agua potable y vacunación de atomización. Métodos alternativos para administración de la vacuna viva incluyen administración in ovo, colirios y administración por inmersión en vaso de precipitados.

En otra modalidad, la presente invención provee una vacuna contra MAS o síndrome de atrofia de crecimiento de animal pequeño y/o con nefritis aviar, que comprende el aislado de astrovirus revelado en la presente en forma desactivada. La ventaja principal de una vacuna desactivada son los niveles elevados de anticuerpos protectores de larga duración que pueden ser obtenidos. Esta propiedad hace a tal vacuna desactivada en particular apropiada para vacunación de criador.

El objetivo de desactivación de los virus cosechados después de la etapa de propagación es eliminar la reproducción de los virus. En general, esto puede ser obtenido mediante medios químicos o físicos . La desactivación química puede ser efectuada mediante tratamiento de los virus con por ejemplo enzimas, formaldehído, beta-propiolactona, etilen-imina o un derivado . de los mismos. Si es necesario, el compuesto desactivante es neutralizado después de esto. El material desactivado con formaldehído puede por ejemplo ser neutralizado con tiosulfato. La desactivación física puede preferiblemente ser llevada a cabo al someter los virus a radiación de alta energía tal como rayos ultravioleta o rayos gama. Si se desea, después del tratamiento, el pH puede ser ajustado a un valor de aproximadamente 7.

Una vacuna que contienen el aislado de astrovirus aviar desactivado AVS-1 revelado en la presente puede comprender por ejemplo uno o más de los portadores o diluyentes aceptables farmacéuticamente mencionados anteriormente apropiados para este propósito. Preferiblemente, una vacuna desactivada de acuerdo con la presente invención comprende uno o más compuestos con actividad adyuvante. Compuestos o composiciones apropiados para este propósito incluyen hidróxido de aluminio, fosfato u óxido, emulsión aceite en agua o agua en aceite a base de, por ejemplo un aceite mineral, tal como Bayol F® o Marcol 52® o un aceite vegetal tal como acetato de vitamina E y saponinas . En general, las vacunas desactivadas son administradas usualmente de manera parenteral, por ejemplo intramuscular o subcutáneamente.

La vacuna de acuerdo con la presente invención comprende una dosificación efectiva de los astrovirus AVS-1 revelados en la presente como el componente activo, esto es, una cantidad de material de astrovirus aviar inmunizante que inducirá inmunidad en las aves vacunadas o su progenie contra el ataque mediante un virus virulento . La inmunidad es definida en la presente como la inducción de un nivel de protección significativamente más alto en una población de aves después de la vacunación en comparación con un grupo sin vacunar. Las dosis y horarios típicos para vacunación son en general conocidos en el arte y toman en cuenta la edad y/o peso y/o condición física de las aves de corral .

Las vacunas de astrovirus de acuerdo con la presente invención pueden ser usadas efectivamente en aves de corral tales como pollos, también otras aves de corral tales como pavos, gallina de Guinea, gansos, avestruz, pavo real de la India, pichón, cisne, pingüino y codorniz. Los pollos incluyen pollos estabulado de cepa de, pollos de reproducción y pollos de sacrificio.

La presente invención también provee vacunas combinadas que comprende, además del astrovirus aviar de la presente invención, uno o más componentes de vacuna de otros patógenos infecciosos para aves de corral. En general, tales otros patógenos infecciosos para aves de corral son antigénicamente distintos de los astrovirus de la presente invención. En una modalidad, los componentes de vacuna en la vacuna combinada son formas atenuadas o desactivadas vivas de los patógenos infecciosos para aves de corral . En otra modalidad, la presente invención provee una vacuna combinada en donde todos los componentes están en forma desactivada.

En otra modalidad, se provee una vacuna para uso en la protección de aves de corral contra condiciones de enfermedad resultantes de una infección de astrovirus aviar, que comprende el aislado de astrovirus AVS-1, revelado en la presente y un portador aceptable farmacéuticamente. En general, la vacuna puede comprender el aislado de astrovirus aviar AVS-1 en forma atenuada o desactivada viva. La vacuna puede comprender además un adyuvante. En otra modalidad, la vacuna puede comprender además uno o más componentes de vacuna contra un segundo patógeno infeccioso para aves de corral . La vacuna combinada comprende uno o más virus además del nuevo serotipo de astrovirus, tal como un reovirus, un virus de bronquitis infecciosa (IBV) , virus de enfermedad de Newcastle (NDV) , virus de enfermedad bursal infecciosa (IBDV), adenovirus de gallina (FAV) , virus de EDS y virus de rinotraqueitis de pavo (TRTV) . Preferiblemente, la vacuna combinada comprende un reovirus como segundo patógeno.

En general, la vacuna puede comprender astrovirus y el reovirus y en formas atenuadas o desactivadas vivas. La vacuna puede comprender además un adyuvante.

La presente invención también provee vacunas de sub- unidad que comprenden el aislado de astrovirus AVS-1 de la presente invención. Los genes del aislado de astrovirus revelado en la presente que produce proteínas protectoras contra la enfermedad son clonados a vectores de expresión o portadores en general conocidos en el arte. La expresión de estas proteínas protectoras podría luego ser producida como vacuna de sub-unidad de acuerdo con procedimientos estándar bien conocidos en el arte.

La presente invención también provee vacunas recombinantes que comprenden los astrovirus de la presente invención. Los genes de los astrovirus revelados en la presente que producen proteínas protectoras contra enfermedad podrían ser clonados a vectores vivos o desactivados u otros portadores en general conocidos en el arte para expresión de estas proteínas como vacunas. Además, estos virus por sí mismos pueden ser usados como vacunas atenuadas vivas (vectores) para portar genes que producen proteínas protectoras de otros agentes que permiten protección contra el vector también como el gen insertado.

La presente invención también provee antisuero que es inducido en un animal por el astrovirus y reovirus aislados revelados en la presente. La presente invención también provee anticuerpos que se enlazan al astrovirus y reovirus revelados en la presente. En una modalidad, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales . Los métodos de inmunización para proveer anticuerpos monoclonales son bien conocidos en el arte. Estos pueden incluir por ejemplo, purificación e inoculación al animal con el aislado de astrovxrus AVS-1 y producción de los anticuerpos monoclonales mediante la técnica de hibridoma.

Anticuerpo se propone dar a entender cualquier molécula que tiene un dominio de enlace con la especificidad requerida. Un anticuerpo puede ser natural o producido parcialmente o por completo sintéticamente. El término también cubre cualquier polipéptido, proteína o péptido que tiene un dominio de enlace homólogo a un dominio de enlace de anticuerpo. Estos pueden ser derivados de fuentes naturales o pueden ser producidos parcial o completamente de manera sintética. Ejemplos de anticuerpos son los isotipos de inmunoglobulina y sub-clases y fragmentos que comprenden un dominio de enlace antígeno tales como FAb, scFv, Fv, Fd y diacuerpos . En una modalidad, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales , anticuerpos quiméricos o anticuerpos de una sola cadena, anticuerpos bisespecíficos , anticuerpos sintéticos, fragmentos de anticuerpos tales como Fab, F(ab)2, Fv o fragmentos de scFv o derivados modificados químicamente de los mismos .

Los anticuerpos monoclonales pueden ser preparados por ejemplo mediante las técnicas que son bien conocidas para la persona experimentada en el arte. Tales técnicas involucran .la fusión de células de mieloma de ratón a células de vaso derivadas de mamíferos inmunizados. Además, anticuerpos o fragmentos de los mismos pueden ser obtenidos al usar métodos que son descritos por ejemplo en Harlow and Lañe, Antibodies, A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988. Anticuerpos útiles o su(s) cadena (s) de inmunoglobulina correspondiente (s ) , pueden ser modificados adicionalmente utilizando técnicas convencionales conocidas en el arte, por ejemplo al usar cancelaciones, inserciones, sustituciones, adiciones de aminoácidos y/o recombinaciones y/o cualesguier otras modificaciones en el arte ya sea solas o en combinación. Métodos para introducir tales modificaciones a la secuencia de ADN subyacente a la secuencia de aminoácidos de una cadena de inmunoglobulina son bien conocidos por la persona experimentada en el arte (véase, por ejemplo Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N. Y.) La presente invención también provee un método para proteger aves de corral contra condiciones de enfermedad y particularmente síndrome de MAS o nefritis resultante de un astrovirus aviar y co-infección de reovirus, que comprende la etapa de administrar la vacuna revelada en la presente a las aves de corral. Ejemplos de aves de corral incluyen pero no están limitados a pollos, pavos, gallina de Guinea, gansos, avestruz, pavo real, pichón, cisne, pingüino y codorniz.

La presente invención también provee antisuero que es inducido en un animal por el aislado de astrovirus revelado en la presente. La presente invención también provee anticuerpos que se enlazan al aislado de astrovirus revelado en la presente. En una modalidad, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales .

La presente invención también provee un método para proteger aves de corral contra condiciones de enfermedad resultantes de una infección de astrovirus aviar, que comprenden la etapa de administrar la vacuna revelada en la presente a las aves de corral. Ejemplos de aves de corral incluyen pero no están limitados a pollos, pavos, gallinas de Guinea, gansos, avestruz, pavo real de la India, pichón, cisnes, pingüinos y codornices.

Tal vacunación incluye cualquier régimen y puede así tener efectos curativos, de alivio o profilácticos.

De acuerdo con otra modalidad, la presente invención también provee un método para detectar o un análisis de diagnóstico para la detección de aislado de astrovirus AVS-1 en aves de corral que se sospecha de estar infectados con el virus, que comprende las etapas de: obtener una muestra del ave de corral; poner en contacto la muestra aviar con una sonda que comprende una secuencia de nucleótidos escogida de entre (i) una secuencia de nucleótidos como se resume en SEQ ID NO: 1, (ii) una secuencia de nucleótidos capaz de hibridización a SEQ ID NO: 1 bajo condiciones severas, (iii) una secuencia de nucleótidos con por lo menos 85%, 90%, 93%, 95%, 98%, 99% o 100% de identidad con SEQ ID NO: 1 o un fragmento de cualquiera de las secuencias (i), (ii) o (iii) y detectar el enlace entre dicha sonda y el nucleotido purificado de las muestras de aves de corral. La detección de enlace puede ser efectuada utilizando un marcador apropiado asociado con la sonda tal como un marcador fluorescente, marcador de radio isótopo o cualquier otro marcador bien conocido en el arte.

El método para detectar y/o método para cuantificar aislado de astrovirus AVS-1 en aves de corral puede comprender las etapas de poner en contacto una muestra del ave de corral con un anticuerpo que se enlaza al aislado de astrovirus AVS-1 0 la secuencia de aminoácidos codificada por las secuencias de nucleótidos como se resume en SEQ ID NO: l o por una secuencia que tiene por lo menos 85%, 90%, 93%, 95% o 97% de homología con las secuencias de nucleótidos como se resumen en SEQ ID NO: 1 o por una secuencia apta de hibridización bajo condiciones severas con una o más secuencias de nucleótidos seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1 y medir la cantidad de enlaces del anticuerpo a un componente de la muestra.

A manera de ejemplo, la cantidad de nuevos aislados de reoviridae en aves de corral puede ser medida utilizando los análisis de ELISA. En la práctica, los estándares y muestras a ser probados son incubados a cavidades de micro título pre-recubiertas con anticuerpo que captura el reovirus. Los estándares y muestras son diluidos en una solución reguladora del H que contiene detergente por una hora a temperatura ambiente antes de la carga de las cavidades de micro título. Las partículas de reoviridae capturadas son luego detectadas por ejemplo con un segundo anticuerpo biotinilado que se enlaza a los reoviridae que es luego detectado por ejemplo al usar un conjugado de estreptavidina-peroxidasa y sustrato coloreado. La concentración de las partículas de reoviridae es luego determinada utilizando una curva estándar preparada a partir de cantidades conocidas de las partículas de reoviridae. Las técnicas de ELIS son bien conocidas para aquellos de habilidad ordinaria en el arte.

El kit de diagnóstico o análisis se lleva a cabo preferiblemente con los cebadores delantero e inverso apropiados mediante RT-PCR para amplificar una secuencia objetivo seleccionada de virus aviar dentro de la muestra de ave de corral. Cebadores delantero e inverso apropiado pueden comprender secuencias apropiadas de dentro del aislado de astrovirus AVS-1. Por ejemplo, tales cebadores pueden comprender cualquier secuencia de nucleótidos desde dentro de las secuencias escogidas de entre (i) una secuencia de nucleótidos como se resume .en SEQ ID NO: 1, (ii) una secuencia de nucléotidos apta de hibridización a SEQ ID NO: 1 bajo condiciones severas, (iii) una secuencia de nucleótidos con por lo menos 85%, 90%, 93%, 95%, 98%, 99% o 100% de identidad con SEQ ID NO: 1 o un fragmento de cualquiera de las secuencias (i), (ii) o (iii) . La persona experimentada diseñaría fácilmente tales cebadores utilizando la comparación de secuencias para determinar regiones conservadas de la secuencia a las cuales cebadores delanteros e inversos pueden ser designados. Preferiblemente, el análisis provee información cuantitativa en cuanto a la cantidad de astrovirus presente en la muestra. Los cebadores son así marcados fluorescentemente y el análisis comprende la etapa adicional de determinar si los cebadores se han enlazado a la secuencia de nucleótidos al determinar el nivel de emisiones fluorescentes de los cebadores . Tales marcadores fluorescentes son bien conocidos en el arte.

Cebadores apropiados pueden tener por ejemplo la siguiente secuencia 5 ' -ATT AGA ATG ATC TTG TGT ACA G-3 ' (SEQ ID NO: 2) y 5 ' -GAT AAG AGC CTA TCA TCA CC-3 ' (SEQ ID NO : 3) .

Alternativamente, el método para detectar la presencia de astrovirus aviar en aves de corral comprende las etapas de: obtener una muestra del ave de corral, tal como por ejemplo sangre o heces; poner en contacto la muestra con anticuerpos que se enlacen específicamente al aislado de astrovirus AVS-1 revelado en la presente o a por lo menos parte de tal aislado de astrovirus y detectar el enlace de los anticuerpos a la muestra, en donde el enlace detectado indicaría la presencia de aislado dé astrovirus aviar de la presente invención en el ave de corral.

En general, la muestra es preparada de intestino, hígado o heces del ave de corral. Ejemplos de ave de corral incluyen pero no están limitados a pollos, pavos, gallina de Guinea, ganso, avestruz, pavo real de la India, pichón, cisne, pingüino y codorniz. Aislado de astrovirus AVS-1 o anticuerpos que son usados para llevar a cabo tal análisis de diagnóstico pueden ser inmovilizados sobre un soporte o sustrato sólido, volviendo mediante eso más fácil la detección de cualesquier anticuerpos enlazados. El aislado de astrovirus capturado AVS-1 puede ser detectado adicionalmente al utilizar anticuerpos conjugados que son bien conocidos en el arte.

La presente invención provee además un kit de diagnóstico que comprende anticuerpos que se enlazan al aislado de astrovirus AVS-1 revelado en la presente, medios para detectar anticuerpos, permitiendo mediante esto seguir la presencia de astrovirus aviar y el nivel de infección de aves de corral .

La presente invención también es concerniente con una nueva línea celular de propagación que es derivada de las líneas de célula de LMH originales (número de acceso de ATCC CRL 2117), que ha sido adaptada como línea de célula no dependiente de colágeno y para crecer sobre placas de plástico. La nueva línea de célula de propagación L H-KJ ha sido depositada con la American Type Culture Collection ("ATCC" 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209 USA) bajo el Tratado de Budapest el 26 de junio de 2008 y tiene el número de acceso PTA-9299.

La presente invención es concerniente además con un método para la propagación de nuevo serotipo de astrovirus aislado que consiste en infectar las líneas de células no dependientes de colágeno LMH-KJ, cultivar las células bajo las mismas condiciones de cultivo como aquellas de las células LMH (número de acceso de ATCC CRL 2117) con gentamicina y cosechar astrovirus cuando el efecto citofático (CPE) es visible.

La edad de los animales que reciben una vacuna viva o desactivada de acuerdo con la invención es la misma como aquella de los animales que reciben las vacunas de virus aviar vivo o desactivado disponible comercialmente . Por ejemplo, pollos estabulados de ceba pueden ser vacunados directamente de un día en adelante con la vacunada atenuada viva de acuerdo con la invención. La vacunación de animales padres, tales como criadores de pollo estabulado de ceba, se puede hacer con una vacuna atenuada viva o desactivada de acuerdo con la invención o combinaciones de ambos. Las ventajas de este tipo de programa de inmunización incluyen la protección inmediata de progenie de un día provista por anticuerpos derivados maternalmente transmitidos verticalmente a las aves jóvenes. Un programa de vacunación de criador típico incluye la vacunación de todas las crías a 6 semanas de edad con una vacuna atenuada viva, seguida por una vacunación entre 14-18 semanas de edad con una vacuna desactivada. Alternativamente, la vacunación viva puede ser seguida por dos vacunaciones con vacunas desactivadas en 10-12 semanas y 16-18 semanas de edad.

Los tratamientos de acuerdo con la presente invención son útiles para modificar el sistema inmune de un aviar, beneficiando mediante esto a dicho aviar. El tratamiento puede ser profiláctico o curativo. El tratamiento puede ser provisto vía cualquier ruta apropiada y la dosis dependerá de la naturaleza del antígeno, ruta de administración y naturaleza de los adyuvantes .

La presente invención provee finalmente un recipiente que comprende por lo menos una dosis de la vacuna como se describe en la presente y un kit que comprende tal recipiente con un manual de instrucciones, que incluye información para la administración de por lo menos una dosis de la vacuna a aves de corral para disminuir la severidad del MAS o síndrome de nefritis .

La invención al ser descrita en general, será entendida más fácilmente por referencia a los siguientes ejemplos que son incluidos solamente por propósitos de ilustración de ciertos aspectos y modalidades de la presente invención y no pretenden limitar la invención.

Ejemplos Ejemplo 1: Aislamiento de astrovirus El nuevo serotipo de astrovirus revelado en la presente ha sido aislado de varios pollos infectados, West Virginia, Estados Unidos de América. Los astrovirus fueron cultivados en una línea de célula de carcinoma hepatocelular adaptada (CH-SAH, que es llamada alternativamente la línea de célula LMH) . La línea de célula LMH original fue obtenida de la American Type Culture Collection (ATCC) , número de acceso ATCC CRL 2117 y ha sido adaptada para ser no dependiente de colágeno.

Ejemplo 2: Amplificación de secuencia parcial de aislado de astrovirus AVS-1 y comparación con otros aislados de casos clínicos similares El AR viral fue extraído mediante reactivo de TRI (Sigma) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La transcripción inversa fue efectuada durante 60 minutos a 37°C en 25 microlitros de mezclas de reacción estándar que contienen transcriptasa MMLV-inversa (Promega) y hexámero aleatorio. Los cebadores cubrieron la reacción más conservada del gen de polimerasa (ORFlb) de 3544 a 4235nt como se muestra en la Figura 4. Los cebadores externos amplificaron un producto de PCR de 691 pares de bases (delantero AstPoll:5'- CCA CTT TGG TGG TGC TT-3' (SEQ ID NO : 2), inverso AstPol2 : 5 ' -GGT TTG ACC CAC ATC CCA A-3 ' (SEQ ID NO : 3 ) ) . La reacción de PCR se llevó a cabo en 5 microlitros de muestra de cADN con plantilla en presencia de 75 uM de cada d TPs, 0.2 micromolar de cada uno de los cebadores, 2U Taqpolymerase (Fermentas) and 2. 5 mM MgCl2. El programa de PCR fue: desnaturalización inicial a 94°C por 1 minuto, 35 ciclos a 94°C por 30 segundos, 50°C por 3 0 segundos, 72°C por un minuto y extensión final a 72°C por 5 minutos.

Utilizando los cebadores y procedimientos descritos anteriormente, el ADN fue amplificado de astrovirus aislados de casos clínicos similares en Delaware (designados ASTV, ASTLE, ASTPL, ASTEK) . Utilizando el programa de alineación de secuencias múltipleClustalW, la alineación de secuencia de nucleótidos reveló 99 . 3 - 99.7% de similaridad al aislado de ASV-1.

Ejemplo 3. Eficacia de vacuna de astrovirus desactivada Pollos de progenie de gallinas criadoras que fueron vacunadas 4 veces con una vacuna de astrovirus desactivado fueron atacadas con astrovirus para evaluar la eficacia de la vacuna. La vacuna fue fabricada al desactivar AVS-1 con formalina al 0.2% (concentración final) y como adyuvante un adyuvante a base de aceite. Los pollos libres de patógenos específicos (SPF) fueron vacunados subcutáneamente dos veces con 0 . 5 mililitros de la vacuna de astrovirus desactivada a 2 y 21 semanas de edad. Los pollos fueron sangrados a 2, 4 y 8 semanas después de la primera vacunación y a 3 semanas después de la segunda vacunación. Los sueros recolectados fueron usados para la prueba de VN utilizando antígeno de AVS-1 para monitorear el desarrollo de anticuerpos neutralizantes contra astrovirus. Los pollos de progenie de los pollos vacunados fueron también sangrados en el empo11amiento para monitorear los anticuerpos transferidos maternalmente en la progenie. Los huevos fueron recolectados dos veces entre 3 y 4 semanas después de la segunda vacunación y entre 4 y 5 semanas después de la segunda vacunación.

Pollos de progenie de huevos que fueron recolectados 3 a 4 semanas post-segunda vacunación de las gallinas, fueron empollados. Al día de edad, estos pollos de progenie fueron atacados con AVS-1 y subsecuentemente sometidos a necropsia. En el grupo de tratamiento 1, que contiene progenie de gallinas vacunadas, 2 de 14 (14%) pollos fueron susceptibles al ataque de astrovirus virulento (Tabla 3) . En el grupo de tratamiento 2, que contiene pollos SPF sin vacunar que fueron atacados con astrovirus, 9 de 15 (60%) de los pollos fueron susceptibles a ataque de astrovirus virulento, en otras palabras, 12 de 14 pollos (87%) de la progenie de gallinas vacunadas fueron protegidos contra el ataque mientras que el 40% del grupo de control positivo atacado con astrovirus sin vacunar fue protegido .

Tabla 1. Títulos medios geométricos de neutralización virus contra astrovirus en gallinas Tabla 2. Títulos medios geométricos de neutralización de contra astrovirus en pollos de progenie Tabla 3. Eficacia de pollos de progenie 3 a 4 semanas postsegunda vacunación contra ataque de astrovirus virulento Número de Grupo Grupo de Tratamiento Número positivo/total número de pollos en seguida de ataque de astrovirus virulento (% susceptible) 1 Progenie de gallinas 2/14 (14%) vacunadas con astrovirus 2 Testigos atacados sin vacunar 9/15 (60%)

Claims (33)

REIVINDICACIONES

1. Un serotipo de astrovirus aislado designado AVS-1, caracterizado una muestra del cual está depositado con la ATCC bajo el número de acceso PTA-9298.

2. Una secuencia de nucleótidos aislada caracterizada porque tienen por lo menos 85% o 90%, 93%, 95%, 98%, 99% o 100% de identidad a una secuencia de nucleótidos como se resume en SEQ ID NO: 1, que es apta de hibridización bajo condiciones severas con una secuencia de nucleótidos como se resume en SEQ ID NO: 1 o un fragmento de la misma.

3. Un constructo caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótidos . aislada de conformidad con la reivindicación 1 que es enlazado operativamente a una secuencia de promotor .

4. Un vector caracterizado porque comprende el constructo de conformidad con la reivindicación 3.

5. Una secuencia de polipéptidos caracterizada porque es codificada por una secuencia de nucleótidos aislada de conformidad con la reivindicación 2.

6. Una vacuna para proteger a aves de corral contra condiciones de enfermedad, caracterizada porque es resultante de una infección de astrovirus aviar que comprende el aislado de astrovirus de AVS-1 de conformidad con la reivindicación 1.

7. La vacuna de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el aislado de astrovirus AVS-1 está en forma atenuada viva o en forma desactivada.

8. La vacuna de conformidad con la reivindicación 6 o 7, caracterizada porque la vacuna comprende además un adyuvante .

9. La vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, caracterizada porque la vacuna comprende además uno o más componentes de vacuna contra un segundo patógeno infeccioso a aves de corral .

10. La vacuna de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque el segundo patógeno es un reovirus.

11. La vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, caracterizada porque las condiciones de enfermedad son síndrome de atrofia o impedimento de crecimiento de animales pequeños o MAS.

12. La vacuna de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque el ave de corral presenta formas de enfermedad aguda de síndrome de atrofia o impedimento de crecimiento de animal pequeño o MAS.

13. La vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12, caracterizada porgue el ave de corral es escogida de entré pollos, pavos, gallina de Guinea, ganso, avestruz, pavo real de la India, pichón, cisne, pingüino y codorniz .

14. Una composición de vacuna para inmunización de aves de corral contra síndrome de atrofia o impedimento de crecimiento de animales pequeños o MAS, caracterizada porgue comprende el uso del aislado de astrovirus AVS-1 de conformidad con la reivindicación 1, de una parte o sub-unidad de dicho aislado, de secuencia de nucleótidos de conformidad con la reivindicación 2 o de un polipéptido de conformidad con la reivindicación 5.

15. Un anti-suero aislado caracterizado porque es inducido en un animal por el aislado de astrovirus AVS-1 de conformidad con la reivindicación 1, por una parte o sub-unidad de dicho aislado, de secuencia de nucleótidos de conformidad con la reivindicación 2 o de un polipéptido de conformidad con la reivindicación 5.

16. Un anticuerpo aislado caracterizado porque se enlaza al aislado de astrovirus AVS-1 de conformidad con la reivindicación 1 o aparte o sub-unidad de dicho aislado, de secuencias de nucleótidos de conformidad con la reivindicación 2 o de un polipéptido de conformidad con la reivindicación 5.

17. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal .

18. Un método para proteger o de vacunación de aves de corral contra condiciones de enfermedad resultante de una infección de astrovirus aviar, caracterizado porque comprende la etapa de administrar a las aves de corral una cantidad efectiva inmunogénica de la vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 14.

19. Un método para proteger a aves de corral contra condiciones de enfermedad resultantes de co-infección de astrovirus aviar y reovirus, caracterizado porque comprende la etapa de administrar la vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 14 a las aves de corral .

20. El método de conformidad con la reivindicación 18 o 19, caracterizado porque el ave de corral es escogida de entre pollos, pavos, gallina de Guinea, gansos, avestruz, pavo real de la India, pichón, cisne, pingüino y codorniz.

21. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, caracterizado porque la enfermedad es síndrome de atrofia o impedimento de crecimiento de animal pequeño o MAS .

22. Un método de análisis de diagnóstico o método para detectar la presencia de astrovirus en aves de corral, · caracterizado porque comprende las etapas de: (a) obtener una muestra del ave de corral; (b) poner en contacto la muestra con anticuerpos que se enlazan al aislado de astrovirus de AVS-1 de conformidad con la reivindicación 1 o poner en contacto la muestra con una sonda que comprende una secuencia de nucleotidos de conformidad con la reivindicación 2 o una secuencia de polipéptidos de conformidad con la reivindicación 5 y (c) detéctar la presencia de anticuerpos enlazados a la muestra.

23. Un método de análisis de diagnóstico o método para detectar la presencia de astrovirus en aves de corral, caracterizado porque comprende las etapas de (a) obtener una muestra del ave de corral; (b) poner en contacto la muestra con la sonda que comprende una secuencia de nucleótidos de conformidad con la reivindicación 2 y (c) detectar el enlace entre la sonda y por lo menos un componente de la muestra.

24. Un método de análisis de diagnóstico o método para detectar la presencia de astrovirus en aves de corral, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) obtener una muestra del ave de corral; (b) poner en contacto la muestra con cebadores delanteros e inversos que comprenden una secuencia de nucleótidos de conformidad con la reivindicación 2 que son aptos de enlace y amplificar secuencias de nucleótidos dentro de las muestras mediante RT-PCR y (c) detectar los productos de PCR de amplificación.

25. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24, caracterizado porque la muestra es preparada de sangre, intestino, hígado o heces del ave de corral .

26. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la muestra comprende células o tejidos del ave de corral .

27. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 22 a 26, caracterizado porque el ave de corral es escogida de entre pollos, pavos, gallina de Guinea, gansos, avestruz, pavo real de la India, pichón, cisne, pingüino y codorniz .

28. Un recipiente para vacunación de aves de corral, caracterizado porque comprende por lo menos una dosis de la vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 14.

29. Un kit para vacunación de aves de corral caracterizado porque comprende el recipiente de conformidad con la reivindicación 28 y un manuál de instrucciones que incluye información para la administración de por lo menos una dosis de la vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 14 a aves de corral para disminuir la severidad del MAS o síndrome de atrofia o impedimento de crecimiento de animales pequeños .

30. Un kit de diagnóstico para uso en la diagnosis de aislado de astrovirus de AVS-1, caracterizado porque comprende: (i) una sonda o cebadores que comprenden una secuencia de nucleótidos de conformidad con la reivindicación 2, anticuerpos que se enlazan al serotipo de astrovirus de conformidad con la reivindicación 1 o polipéptidos de conformidad con la reivindicación 5.

31 . Un método para la propagación del astrovirus de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque comprende una línea de célula de LMH, cultivar las células bajo condiciones de crecimiento y cosecha de astrovirus cuando el efecto citopático es visible.

32 . El método de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizado porque la línea celular es una línea de célula no dependiente de colágeno designado LMH-KJ depositada con la ATCC bajo el número de acceso PTA-9299 .

33 . Una línea de célula para preparación de aislado de astrovirus de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada porque es depositada con la ATCC bajo el número de acceso PTA-9299 .