JP4316025B2 - 組換えビルナウイルスワクチン - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、ビルナウイルス(birnavirus)変異体、この変異体を含むワクチン、動物のビルナウイルス感染を測定する方法およびこの方法を行うためのテストキットに関する。
【0002】
【従来の技術】
伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス(Infectious Bursal Disease Virus,IBDV)および伝染性膵臓壊死ウイルス(Infectious Pancreatic Necrosis Virus,IPNV)は、ビルナウイルスファミリーのメンバーである。このファミリーのウイルスは、非常に類似したゲノム構成および同様の複製サイクルを有する。これらのウイルスのゲノムは、2セグメント(AおよびB)の二本鎖(ds)RNAから成る。大きい方のセグメントAは、自己タンパク質分解によって開裂して成熟ウイルスタンパク質VP2、VP3およびVP4を生成するポリタンパク質をコードする(Hudson, P.J. ら、Nucleic Acids Res., 14, 5001-50012, 1986; Dobos P., Annual review of fish diseases 5, 25-54, 1995)。VP2およびVP3は、ビリオンの主な構造タンパク質である。VP2は、ビルナウイルスの主な宿主保護免疫原であり、中和抗体の誘導に寄与する抗原領域を含む。VP4タンパク質は、VP2、VP3およびVP4タンパク質の前駆体ポリタンパク質の処理に関与する、ウイルスによってコードされるプロテアーゼであると考えられる。大きい方のセグメントAはまた、そのポリタンパク質遺伝子の前、および部分的に重複して、第二のオープンリーディングフレーム(ORF)も有する。この第二のオープンリーディングフレームは、IBDV感染細胞に存在する、機能が未知のタンパク質VP5をコードする(Mundt, E.ら、J. Gen. Virol., 76, 437-443, 1995)。
【0003】
小さい方のセグメントBは、ポリメラーゼおよびキャップ形成酵素活性を有する90 kDaの多機能タンパク質であるVP1をコードする(Spies, U.ら、Virus Res., 8, 127-140, 1987および Spies, U.ら、J. Gen. Virol., 71, 977-981, 1990; Duncan R. ら、Virology 181, 541-552, 1991)。
【0004】
IBDVの場合、2個の血清型(血清型1および2)が存在する。2個の血清型は、ウイルス中和(VN)検定によって区別することができる。さらに、血清型1のサブタイプが単離されている。血清型1のこれらのいわゆる「バリアント」ウイルスは、交差中和検定(Diseases of Poultry, 第9版、1991, Wolfe Publishing Ltd, ISBN 0 7234 1706 7, Chapter 28, P.D. Lukert および Y.M. Saif, 648-663)、モノクローナル抗体のパネル(Snyder, D.B. ら、Arch. Virol., 127, 89-101, 1992)またはRT−PCR(Jackwood, D.J., Proceedings of the International symposium on infectious bursal disease and infectious anaemia, Rauischholzhausen, ドイツ、155-161, 1994)によって同定できる。IBDVの血清型1のこれらのサブタイプのいくつかは文献に記載されており、例えば、古典的、変異−E、GLS、RS593 および DS326株(Van Loon,ら、Proceedings of the Intenational symposium on infectious bursal disease and chicken infectiouos anaemia, Rauischholzhausen,ドイツ、179-187, 1994)が挙げられる。
【0005】
伝染性ファブリキウス嚢病(IBD)は、ガンボロ(Gumboro)病とも言われ、ニワトリの急性高伝染性ウイルス感染であり、リンパ系組織をその主要標的とし、ファブリキウス嚢の細胞に対して選択的向性を有する。感染しやすい群れの罹患率は高く、体重が急激に減少し、死亡率は中程度である。ニワトリの防御機構に必須であるファブリキウス嚢が破壊するため、その病気から回復したニワトリは、免疫欠乏を有する可能性がある。IBDウイルスは、3週齢より若いニワトリに重い免疫抑制を引き起し、3月齢までのニワトリにファブリキウス嚢の損傷を誘起する。
【0006】
長年、その病気は、弱毒化したIBDV生ワクチンで前処置しておいたニワトリに不活化ワクチンを適用することにより、繁殖のために飼育している群れに高レベルの抗体を誘導することによって予防することができた。こうして、IBDによって引き起こされる経済的損失を最小限に保っている。ワクチン接種した繁殖群のニワトリの母から受け継いだ抗体は、IBDVによる早期感染を予防し、免疫抑制に係る問題を少なくする。さらに、弱毒化生ワクチンは、母からの抗体が減少した後の商業用のニワトリ群においても十分使用されている。
【0007】
最近、IBDVの非常に病原性の強い株が、ヨーロッパで死亡率の高い病気の大発生を引き起こした。現在のワクチン接種プログラムでは、ニワトリを十分保護することができなかった。ワクチン予防の失敗は、主に、現場の病原性の強いウイルスによる誘発(免疫誘発、challenge)の前に、鳥類を生ワクチンによって感染させることができなかったことによる。
【0008】
ワクチン接種以外の予防手段による病気の撲滅は、ウイルスが広く蔓延しているし、現在投与されている弱毒化もしくは不活化IBDV生ワクチンでは、特定の動物が現場のIBDVウイルスに感染しているかどうか、またはその動物がIBDVワクチンの接種を受けたかどうかを調べることができないため、実行の可能性はない。IBDVに対する撲滅制御プログラムの開始を可能にするためには、IBDVワクチン接種した動物と現場のウイルスに感染した動物とを区別して、現場のビルレントウイルスの蔓延を減少させるための適切な手段(例えば感染群の除外)を行うことができるような可能性が存在することが強く望まれている。例えば、血清学的に同定可能なマーカーの導入は、IBDVの必須でない(糖)タンパク質をコードする遺伝子に変異を導入し、感染した宿主動物での抗体の産生は依然として生じるようにすることにより達成できる。アウエスキー(Aujeszky)病に対するマーカーワクチンおよびそれに伴う診断テストは、この病気の制御において実際に有効であることが証明されている。動物の他のウイルス感染病に対するそのような制御プログラムは開発中であるが、本発明以前には、IBDV制御プログラムに適するであろうIBDVワクチン株をベースとするワクチンは記載されていない。この主な理由は、そのようなIBDVマーカーワクチンの開発に対する必要条件が満たされなかったということである。ゲノムIBDV配列の許容位置または領域、すなわち感染および複製に必要な機能などのIBDVの必須機能を壊すことなく変異の挿入に使用できる位置または領域はまだ確認されていない。さらに、IBDVゲノムのそのような必須でない領域は、野生型IBDVに感染した動物の主な血清学的応答を誘起する(糖)タンパク質をコードすべきであり、そのような領域は以前には確認されていない。
【0009】
本発明は、予期しなかったことに、変異を行うことができるビルナウイルスのセグメントA内の必須でない遺伝子を見いだした。得られるビルナウイルス変異体は、その遺伝子の天然の(本来の、native)発現産物を産生しない。さらに、このビルナウイルス変異体は、野生型ビルナウイルスに感染した動物とこのビルナウイルス変異体をベースとしたワクチンで免疫感作した動物との間の血清学的区別を行うことができるマーカーワクチンウイルスとして使用できる。
【0010】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ビルナウイルスゲノムのVP5遺伝子における変異の結果として天然のVP5タンパク質を産生することができないビルナウイルス変異体を提供する。
【0011】
好ましくは、ビルナウイルス変異体がIBDV変異体またはIPNV変異体であり、IBDV変異体が最も好ましく、特に血清型1のIBDウイルス由来のIBDV変異体が本発明によって提供される。
【0012】
本発明は、天然のVP5タンパク質を産生することができないIBDV変異体が、依然として細胞を感染させ、これらの細胞でin vitro複製することができることを見いだした。本発明に係るIBDV変異体は細胞培養において複製可能であることを例証する(実施例2)。VP5-IBDVは、VP5+親ウイルスと比較して、ニワトリの胚細胞における複製の遅延を示すが、ウイルスの最終的な収量は同じである。すなわち、約107.5TCID50/mlである(実施例1)。さらに、IBDV変異体は、家禽を感染させ、感染した宿主動物で in vivo複製することができることを例証する。すなわち、VP5タンパク質をコードする遺伝子が必須でない遺伝子であるという証拠を示す。実施例3は、VP5-IBDVがIBDV変異体に感染した動物の臓器から再単離でき、IBDV変異体が感染動物での保護免疫応答を誘導することを示す。
【0013】
さらに、家禽での正常な抗−IBDV免疫応答の一部がVP5領域に向けられていることを本明細書で証明した。これは、VP5タンパク質が非構造ウイルスタンパク質である(Mundtら、J. Gen. Virol. 76, 437-443, 1995) と考えられていて、動物におけるウイルス性病原体に対する免疫応答は、通常は、ウイルスの構造(糖)タンパク質に対して惹起されるので、かなり驚くべきことである。これらの発見が、本発明に係るIBDV変異体および他のビルナウイルス変異体をマーカーワクチンに適するワクチン候補にしている。そのようなマーカーワクチンは、動物が野生型ビルナウイルス、例えばIBDV、またはワクチンウイルスに感染しているかどうかを決定するための可能性を提供する。
【0014】
さらに、VP5タンパク質は、ビルナウイルス、特にIBDVの病原性の発現に関与し、また、ウイルス変異体の天然VP5タンパク質産生不能によりウイルスが弱毒化されることが見いだされた。
【0015】
【課題を解決するための手段】
「天然のVP5タンパク質を産生することができない」とは、ビルナウイルス変異体が、血清学的テストによって天然のVP5タンパク質と区別することができるポリペプチドを産生し、またはVP5タンパク質を全く産生しないことを意味する。例えば、前者の場合、ビルナウイルス変異体は、1以上の免疫原エピトープに欠ける天然のビルナウイルスVP5タンパク質断片のみを産生する。
【0016】
好ましくは、本発明に係るビルナウイルス変異体は、宿主細胞の感染時にVP5タンパク質を産生しない。
【0017】
上記したように、ビルナウイルスのゲノム構成は十分確立されている。IBDVおよびIPNVゲノムは、大きいセグメントAおよび小さいセグメントBを含む。IBDVのセグメントAは、約110 kDa のポリタンパク質(VP2−VP4−VP3)をコードする大きいオープンリーディングフレーム(ORF)を含む。VP5タンパク質をコードする遺伝子は、そのポリタンパク質をコードするORFの前にあり、部分的に重複するビルナウイルスゲノムのセグメントA上の小さいORFとして、公知文献で同定され、本明細書に規定する(Baylissら、J. Gen. Virol. 71, 1303-1312, 1990; Spies ら、J. Gen. Virol. 71, 977-981, 1990; Havarstein L.S. ら、J. Gen. Virology 71, 299-308, 1990; Dobos ら、1995、前出; 本明細書の図1〜3および配列番号1〜7)。VP5遺伝子に導入される変異は、ポリタンパク質の発現を妨げないような変異である。
【0018】
配列番号1は、IBDVP2株のセグメントBの全長cDNAヌクレオチド配列およびセグメントBによってコードされるVP1タンパク質のアミノ酸配列を含む(配列番号2も参照)。配列番号3および5は、各々、IBDVD78株のセグメントAの全長cDNA配列ならびにVP5タンパク質およびポリタンパク質のコード領域を示す。配列番号3および4は、D78VP5タンパク質のアミノ酸配列も示す。配列番号5および6は、D78のポリタンパク質VP2−VP4−VP3のアミノ酸配列を示す。配列番号7は、VP5コード領域に導入された変異を含む、D78株のセグメントAの5’−端を示す。配列番号8は、D78株のセグメントBのヌクレオチド配列およびD78VP1タンパク質のアミノ酸配列を示す。両セグメントのゲノム構成は、図1にも示す。
【0019】
VP5をコードするORFは、今まで発表されたセグメントAの配列全てにおいて保存されている。IBDV ORFは145 個のアミノ酸をコードし、分子量の計算値は16.5 kDaとなる。本明細書で使用するIBDVD78株のVP5タンパク質をコードするORFのヌクレオチド配列は、配列番号3および4に示す。個々のIBDV単離物の間には天然の変異が存在する可能性がある。これらの天然の変異は、これらのウイルスのゲノムの小さい相違から生じる。多くのIBDV単離物についてのVP5遺伝子のヌクレオチド配列を含むセグメントAのヌクレオチド配列は、公知文献に記載されている(Vakharia ら、Avian Diseases 36, 736-742, 1992; Bayliss ら、J. Gen. Virol. 71, 1303-1314, 1990; Hudsonら、Nuc. Acid Res. 14, 5001-5012, 1986; Schnitzlerら、J. Gen. Virol. 47, 1563-1571, 1993; Kibenge ら、J. Gen. Virol. 71, 569-577, 1990および Virology 184, 437-440, 1991; Mundt ら、Virology 209, 10-18, 1995; Lana ら、Virus Genes 6, 247-259, 1992; Vakhariaら、Virus Res. 31, 265-273, 1994; Brown ら、Virus Res. 40, 1-15, 1996)。血清型IのIBDV株由来のVP5タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号3および4に示すVP5アミノ酸配列と少なくとも95%の相同性を示すが、血清型IIのVP5配列と配列番号3および4に示すアミノ酸配列との間の相同性は、少なくとも75%である。従って、本発明に係る好ましいIBDV変異体は、変異が、本明細書に示すVP5アミノ酸配列とのアミノ酸配列レベルに関する相同性が少なくとも75%、特に少なくとも95 %であるようにVP5遺伝子に導入されたIBDV変異体である。
【0020】
好ましくは、本発明に係るIBDV変異体が、その分野で現在使用されているような、古典的または変異(例えば、変異EまたはGLS)IBDVワクチン株から誘導される。そのような適切なIBDV株としては、市販のワクチンに存在するIBDVワクチン株:D78、PBG98、LZ228E、89−03(Intervet International B.V.), Bursine 2 (Fort Dodge Animal Health)およびS706(Rhone Merieux )が挙げられる。
【0021】
本発明に係る特に好ましいIBDV変異体は、配列番号3および4に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするVP5遺伝子を含むD78株から誘導される。
【0022】
あるいは、本発明に係るウイルス変異体の親ビルナウイルス株が、現場のビルレントビルナウイルス株である。本明細書では、VP5タンパク質が、伝染力に関連する因子であり、ビルナウイルスにおける天然のVP5タンパク質の不在により、ウイルスの弱毒形が生じることを示す。
【0023】
好ましくは、本発明は、VP5遺伝子のポリタンパク質をコードする大きいORFと重複しない部分における変異の結果として、天然のVP5タンパク質を産生することができないビルナウイルス変異体を提供する。
【0024】
特に、本発明に係るビルナウイルス変異体は、ヌクレオチド1〜30、好ましくは1〜20、より好ましくは1〜10にわたるVP5遺伝子の5’−端に変異を含む。最も好ましくは、VP5遺伝子のヌクレオチド1〜3に変異を有するビルナウイルス変異体である。
【0025】
変異は、天然のVP5タンパク質を産生する天然のビルナウイルスのゲノムのこの領域に存在する遺伝情報に関するVP5遺伝子における遺伝情報の変化であると理解される。変異は、例えば、核酸の置換、欠失、挿入もしくは逆位またはそれらの組み合わせである。
【0026】
本発明の好ましい実施態様では、変異が1以上のヌクレオチドの置換であるビルナウイルス変異体を提供する。特に、核酸の置換を開始コドンに導入し、その結果、新しいコドンがメチオニンとは異なるアミノ酸をコードするか、終結コドンを表し、好ましくは、核酸の置換が、開始コドンのヌクレオチドの少なくとも2個を含む。
【0027】
本発明に係るさらに別のビルナウイルス変異体は、開始コドンとは異なるコドンに、望ましくは上記した開始コドンにおける置換の他に、1以上のヌクレオチドの置換を含み、その結果、1以上の終結コドン、好ましくは、上記で定義したVP5遺伝子の5’−端を生じる。好ましくは、ビルナウイルス変異体が、3個のリーディングフレームの各々におけるVP5遺伝子のこの領域に終結コドンを含む。
【0028】
そのような好ましいビルナウイルス変異体は、VP5遺伝子の開始コドン、第四および第六コドンに変異を有し、その結果、好ましくは配列番号7および図3に示す変異コドンを生じるIBDV変異体であってもよい。
【0029】
あるいは、変異が欠失であるビルナウイルス変異体が提供される。特に、欠失は、20未満、10未満または5未満のヌクレオチドを含む。好ましくは、欠失が、3で割り切れないヌクレオチド総数を含み、その結果、リーディングフレームのシフトが生じる。
【0030】
好ましくは、欠失がVP5遺伝子の開始コドンの1以上のヌクレオチドを含む。
【0031】
本発明の別の実施態様では、変異がビルナウイルスゲノムにおける異種核酸配列の挿入を含むビルナウイルス変異体が提供される。異種核酸配列は、特定のウイルス種の特定の挿入部位に通常は存在しない核酸配列である。
【0032】
ビルナウイルスゲノムに挿入できる異種核酸配列は、ポリペプチドをコードするか、非コード配列である核酸断片である。核酸断片は、例えばウイルス、真核生物、原核生物または合成源などあらゆる源から誘導することができ、VP5遺伝子の発現の妨害に適するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【0033】
VP5発現の妨害に適するオリゴヌクレオチドは、第二の異種核酸配列の挿入に有用な1以上の適切な制限酵素開裂部位の他に、可能なリーディングフレームの各々の両方向に3個の翻訳終結コドンを含むことができる。そのような非コード異種核酸配列の長さおよびヌクレオチド配列は決定的ではないが、好ましくは、8〜50個のヌクレオチドである。
【0034】
本発明のさらに別の実施態様では、特定のビルナウイルスによる感染に対するワクチンの調製だけでなく、他の家禽または魚の感染病に対するワクチンの調製にも使用できるビルナウイルス変異体が提供される。例えば、そのようなIBDV変異体をベースとするベクターワクチンは、免疫感作した宿主の感染細胞内でのこれらの鳥類病原体の抗原の発現により、他のトリ病原体に対する免疫感作の可能性を提供する。本発明に係るそのようなIBDVベクターは、本明細書で定義するように、VP5遺伝子にIBDVに対して異種のポリペプチドをコードする異種核酸配列を挿入することによって得ることができる。
【0035】
異種核酸配列は、ニューカッスル(Newcastle)病ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、マレク(Marek)病ウイルス、鳥類脳脊髄炎ウイルス、鳥類レオウイルス、鳥類インフルエンザウイルス、ニワトリ貧血ウイルス、サルネネラ種(Salmonella spp.) 、大腸菌(E. coli) およびアイメリア種(Eimeria spp.)などの鳥類病原体の抗原をコードすることができる。
【0036】
さらに、本発明に係るIBDV変異体は、VP5遺伝子における変異の他に、VP2遺伝子における変異を含み、この遺伝子は、2以上の抗原型のIBDV(例えば、古典的、バリアント−Eおよび/またはGLS)の中和エピトープを含むキメラタンパク質を発現する。好ましくは、そのような変異体は、変異GLS株および古典的株の関係する保護VP2エピトープを含む。特に、変異したVP2遺伝子は、B69エピトープをコードする核酸配列断片を含むGLS VP2遺伝子である。そのような変異したVP2遺伝子の構築は、Snyderら、Avian Diseases 38, 701-707, 1994に記載されている。
【0037】
さらに、薬剤または診断用途用ポリペプチド、特にリンホカイン、インターフェロンまたはサイトカインなどの免疫調節剤をコードする核酸配列をVP5遺伝子に挿入することができる。異種核酸配列は、大腸菌β−ガラクトシダーゼまたは大腸菌β−グルクロニダーゼなどのスクリーニング可能なマーカーをコードすることもできる。
【0038】
ビルナウイルス変異体、特に本発明に係るIBDV変異体の構築は、IBDVに対して最近確立された感染性cRNA系によって達成できる(Mundtおよび Vakharia, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 11131-11136, 1996)。この逆遺伝子系は、IBDウイルスのRNAゲノム、特にVP5遺伝子への変異導入の可能性の道を開いている。この逆遺伝子系における最も重要な工程は、IBDウイルスのセグメントAおよびBの全長cDNAクローンを提供することである。セグメントAまたはBを含むcDNA構築体は、これらの両セグメントの5’−および3’−端のヌクレオチドを含めて、Mundt および Vakharia (1996 、前出) に記載の方法に従って作製できる。さらに、これらの構築体は、セグメントのどちらかに機能を発揮するように連結したRNAポリメラーゼプロモーターを含む。プロモターは、T7、SP6またはT3ポリメラーゼに対するプロモーターであり、T7プロモーターが好ましい。変異は、この目的に対して当技術分野で一般に公知の方法によってVP5遺伝子に導入することができる。特に、変異は、部位特異的変異誘発によって導入される。
【0039】
例えば、第一工程では、少なくともVP5遺伝子の実質的な部分を含むcDNA断片が提供される。次の工程では、適切なプライマー対を設計し、VP5配列を含む断片とハイブリダイズさせる。5’−プライマーは、VP5配列に相補的な配列の他に、所望の変異、例えばATG開始コドンをAGG(アルギニン)コドンに変える変異を有するヌクレオチドを含む。さらに、5’−プライマーには、完全な5’−端非コード配列の修復を可能にする適切な制限酵素開裂部位を表す上流ヌクレオチド配列を付与する。続いて、変異した新しい断片をPCRによって増幅し、その新しい断片を、適切な制限酵素を使用して天然の核酸配列と置き換えることにより、出発配列に導入する。次の工程で、セグメントAおよびBのプラスセンス転写産物が、(T7)RNAポリメラーゼにより in vitro で生成し、その後、合成転写産物を、通常のRNA精製法を使用して精製する。本発明に係る組換えIBDV変異体が、所望ならばトランスフェクションを高める組成物(リポフェクチンなど)の存在下で、IBDVゲノムの両セグメントの合成RNA転写産物により適切な細胞(例えば、VERO細胞、QM−7細胞またはCEC細胞)をトランスフェクションした後に得られる。最後に、組換えIBDVを、形質転換した細胞の上清から採取する。
【0040】
ビルナウイルスゲノムに変異を導入する方法を本明細書に記載するが、当技術分野でも一般に使用されている(Mundtおよび Vakharia, 1996 、前出; Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubelら編、Wiley N.Y., 1995版、pages 8.5.1.-8.5.9.)。
【0041】
IBDVのVP5 ORFがIBDVゲノムの必須でない領域であるという本発明者らによる予期せぬ発見の他に、本発明に係るIBDV変異体が保護的免疫応答を誘導することができる、すなわち、IBDV変異体を含むワクチンで免疫感作した動物は、病原性誘発に対して保護されることも見いだされた。さらに、天然のIBDVに感染した動物の抗血清は、非構造VP5タンパク質に特異的な抗体を含み、これらの抗血清は、本発明に係るIBDV変異体に感染した動物由来の抗血清と区別することができることが見いだされた。さらに、上記したIBDV変異体は、天然のVP5タンパク質を産生することができる親IBDウイルスと比較して弱毒化されていることが見いだされた。
【0042】
従って、本発明の別の側面は、上記した特徴を有するビルナウイルス変異体を薬剤的に許容され得る担体または希釈剤とともに含む、動物をビルナウイルス感染に対して保護するのに使用されるワクチンである。特に、本発明に係るワクチンは、上記したIBDV変異体を含む、家禽を伝染性ファブリキウス嚢病に対して保護するために使用されるワクチンである。
【0043】
本発明に係るビルナウイルス変異体は、生きた、または不活化ウイルスとしてワクチンに混入することができる。
【0044】
本発明に係るワクチンは、例えば市販のIBDV生または不活化ワクチンに対して通常使用されるような常法によって調製できる。簡単に述べると、感染しやすいサブストレートに、本発明に係るIBDV変異体を接種し、ウイルスが所望の感染力価に複製するまで増殖した後、IBDV含有物質を採取する。
【0045】
IBDウイルスの複製を支持することができるどのサブストレートも本発明で使用することができ、例えば、ニワトリ胚繊維芽細胞(CEF)もしくはニワトリ腎細胞(CK)などの一次(鳥類)細胞培養、VEROセルラインもしくはBGM−70セルラインなどの哺乳類セルライン、またはQT−35、QM−7もしくはLMHなどの鳥類セルラインが挙げられる。通常は、細胞をインキュベートした後、ウイルスを3〜10日間増殖させ、その後、細胞培養上清を採取し、所望ならば、細胞壊死組織片を除去するために、濾過または遠心分離する。
【0046】
あるいは、IBDV変異体を、胚含有鶏卵で増殖させる。特に、これらのIBDウイルスの増殖を行うサブストレートは、SPF胚含有卵である。胚含有卵は、例えば、少なくとも102TCID50/卵を含む、0.2 mlのIBDV変異体を含む上清またはホモジネートを接種し、次いで37℃でインキュベートすることができる。約2〜5日後に、胚および/または膜および/またはアラントイン液を集めた後、この物質を適切にホモジネートすることにより、IBDウイルス産物を採取することができる。ホモジネートは、その後、2500 x gで10分間遠心分離し、次いで、上清をフィルター(100 μm)で濾過することができる。
【0047】
生きたウイルスを含む本発明に係るワクチンは、懸濁物または凍結乾燥形で作り、市販することができ、さらに、そのような組成物に対して通常使用される薬剤的に許容され得る担体または希釈剤を含む。担体としては、安定剤、保存剤および緩衝剤が挙げられる。適切な安定剤としては、例えば、SPGA、炭水化物(ソルビトール、マンニトール、澱粉、ショ糖、デキストラン、グルタミン酸塩またはグルコースなど)、タンパク質(乾燥乳血清、アルブミンまたはカゼインなど)またはその分解産物が挙げられる。適切な緩衝剤としては、例えば、アルカリ金属リン酸塩が挙げられる。適切な保存剤しては、チメロサール、メルチオレートおよびゲンタマイシンが挙げられる。希釈剤としては、水、水性緩衝剤(緩衝食塩水など)、アルコールおよびポリオール(グリセロールなど)が挙げられる。
【0048】
所望ならば、本発明に係る生ワクチンは、アジュバントを含むことができる。アジュバント活性を有する適切な化合物および組成物の例は、下記に挙げるものと同じである。
【0049】
注射による投与、例えば本発明に係る生ワクチンの筋肉内、皮下投与が可能であるが、ワクチンは、好ましくは、IBDVワクチン接種に対して通常使用される安価なマス投与法によって投与する。IBDVワクチン接種の場合、これらの方法としては、飲料水および噴霧ワクチン接種が挙げられる。
【0050】
生ワクチンの別の投与法としては、in ovo、点眼およびビーク浸漬投与が挙げられる。
【0051】
本発明の別の側面では、不活形のビルナウイルス変異体を含むワクチンが提供される。不活化ワクチンの大きい利点は、長い期間、極めて高レベルの保護抗体が達成できることである。
【0052】
増殖ステップ後に採取したウイルスの不活化の目的は、そのウイルスの繁殖を排除することである。一般に、これは、化学的または物理的手段によって達成できる。化学的不活化は、ウイルスを例えば酵素、ホルムアルデヒド、β−プロピオラクトン、エチレン−イミンまたはそれらの誘導体で処理することによって行うことができる。必要であれば、不活化化合物をあとで中和する。ホルムアルデヒドで不活化した物質は、例えば、チオスルフェートで中和できる。物理的不活化は、好ましくは、ウイルスをエネルギーに富む照射、例えば紫外線またはγ−線にかけることにより行うことができる。所望ならば、処理後、pHを約7の値に調整することができる。
【0053】
不活化ビルナウイルス変異体を含むワクチンは、例えば、この目的に適する1以上の上記した薬剤的に許容され得る担体または希釈剤を含むことができる。
【0054】
好ましくは、本発明に係る不活化ワクチンは、アジュバント活性を有する1以上の化合物を含む。この目的に適する化合物または組成物としては、水酸化、リン酸もしくは酸化アルミニウム、または、例えば鉱物油(Bayol F(登録商標)または Marcol 52(登録商標)など)もしくは植物油(ビタミンE酢酸塩およびサポニンなど)をベースとする油/水もしくは水/油エマルジョンが挙げられる。
【0055】
本発明に係るワクチンは、有効量のビルナウイルス変異体、すなわち、ワクチン接種した鳥類にビルレントウイルスによる誘発に対する免疫を誘導する量の免疫感作ビルナウイルス物質を活性成分として含む。免疫は、本明細書では、ワクチン接種した後の鳥集団における、ワクチン接種していない群と比較してかなり高いレベルの保護の誘発として定義する。
【0056】
典型的には、本発明に係る生ワクチンは、動物1匹に対して102〜109TCID50感染用量50(TCID50)の用量、好ましくは105.0〜107.0TCID50の範囲の用量で投与することができ、不活化ワクチンは、動物1匹に対して105〜109TCID50と同等の抗原量を含むと考えられる。
【0057】
不活化ワクチンは、通常は非経口投与、例えば筋肉内または皮下投与する。
【0058】
本発明に係るIBDVワクチンは、ニワトリにおいて有効に使用できるが、七面鳥、ホロホロチョウおよびヤマウズラなどの他の家禽もそのワクチンによって十分ワクチン接種することができる。ニワトリには、ブロイラー、生殖群および産卵群が含まれる。
【0059】
本発明に係る生ワクチンまたは不活化ワクチンを受ける動物の年齢は、通常の生または不活化IBDVワクチンを受ける動物の年齢と同じである。例えば、ブロイラー(母に由来する抗体−MDAを含まない)は、1日齢でワクチン接種するが、MDAのレベルが高いブロイラーは、好ましくは、2〜3週齢でワクチン接種する。MDAレベルの低い産卵群または生殖群は、1〜10日齢でワクチン接種した後、6〜8および16〜20週齢で不活化ワクチンの追加接種を行うことができる。
【0060】
本発明はまた、本発明に係るIBDVまたはIPNV変異体の他に、各々、家禽または魚に対して感染性である他の病原体由来の1以上の免疫原を含む混合ワクチンも含む。
【0061】
好ましくは、混合ワクチンは、さらに伝染性気管支炎ウイルス(IBV)、ニューカッスル病ウイルス(NDV)、egg drop症候群(EDS)ウイルス、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス(TRTV)またはレオウイルスの1以上のワクチン株を含む。
【0062】
ビルナウイルスに対するマーカーワクチンの他に、適切な診断テストの利用可能性は、ビルナウイルス撲滅制御プログラムの適用に対する必須要件である。そのような診断テストは本明細書で提供するが、家禽におけるIBDV感染および魚におけるIPNV感染の測定法を含む。すなわち、上記したワクチンを接種した現場の動物を、天然のIBDVまたはIPNVに感染した動物から区別する方法を提供する。
【0063】
従って、本発明は、ビルナウイルス感染を検出する方法、特に、動物サンプルのVP5抗体または抗原の有無を調べる工程を含む、動物のIBDV感染を検出する方法を提供する。動物は、現場の動物であり、特に鳥類、好ましくはニワトリである。動物から得るサンプルは、IBDV抗体または抗原が存在するサンプルであればいずれでもよく、例えば血液、血清または組織サンプルが挙げられ、血清サンプルが好ましい。
【0064】
動物におけるビルナウイルス感染の好ましい測定法は、VP5タンパク質に対する抗体を検出する方法であり、
(i)抗−ビルナウイルス抗体を含む疑いのあるサンプルをVP5抗原とインキュベートする工程、
(ii)抗体−抗原複合体を形成させる工程、および
(iii)抗体−抗原複合体の存在を検出する工程
を含む。
【0065】
このイムノアッセイの設計は変わり得る。例えば、イムノアッセイは、競合または直接反応をベースとしてもよい。さらに、プロトコールは固体支持体を使用してもよく、または細胞物質を使用してもよい。抗体−抗原複合体の検出は、標識抗体の使用を含むことができ、標識は、例えば、酵素、蛍光分子、化学ルミネセンス分子、放射性分子または染料分子である。
【0066】
サンプル中のVP5抗体の適切な検出法としては、固相酵素免疫検定法(ELISA)、免疫蛍光試験(IFT)およびウェスタンブロット分析が挙げられる。
【0067】
ELISAを例にとると、ポリスチレンマイクロ滴定プレートのウェルをVP5抗原で被覆する。次に、被覆したプレートのウェルにニワトリ血清を充填し、順次希釈を行う。インキュベートした後、ニワトリ抗−VP5タンパク質血清抗体を、被覆したものと特異性が同じであるが、標識されている(例えば、ビオチンで標識)抗体(モノクローナルまたはポリクローナル)を検出することにより測定する。標識した抗体は、ニワトリ血清中の抗−VP5抗体によって占領されていない遊離の抗原を占領する。例えば、アビジンに結合したホースラディッシュペルオキシダーゼを添加し、ペルオキシダーゼの量を酵素反応によって測定する。VP5に対する抗体がニワトリ血清サンプルに存在しない場合は、最大の吸光度が得られる。血清がVP5に対して多くの抗体を含む場合は、低い吸光度が予想される。あるいは、ニワトリ血清とともにインキュベートした後、VP5抗原に結合した、血清中に存在する抗体の量は、抗−ニワトリコンジュゲート、次いで酵素反応を使用して直接測定できる。
【0068】
サンドイッチELISAでは、ポリスチレンマイクロ滴定プレートのウェルをVP5タンパク質に特異的なモノクローナル抗体で被覆することができる。次に、これらの被覆したプレートのウェルは、VP5抗原とともにインキュベートする。抗原を捕獲した後、ウェルにニワトリ血清を充填し、順次希釈を行う。次いで、上記したプロトコールを行うことができる。このテストは、被覆したモノクローナル抗体の代わりにVP5に対するポリクローナル血清を使用することによっても行うことができる。
【0069】
別の診断テスト(ウェスタンブロット分析)では、VP5抗原(含有)物質をSDS−PAGEにかける。次に、分離したタンパク質をニトロセルロース膜上に電気ブロットする。その後、膜をレーンに切り分け、それらのレーンをニワトリ血清とともにインキュベートする。サンプル中のVP5抗体の存在は、抗体がVP5抗原に結合したかどうかを、例えば抗−ニワトリコンジュゲート、次いで酵素反応を使用して調べることにより測定できる。VP5に対する抗体が存在する場合は、約17 kDaのバンドが確認できる。
【0070】
VP5抗原は、VP5抗原−VP5抗体複合体の形成を可能にする物質を含むどのVP5タンパク質(断片)でもよい。好ましくは、VP5抗原が通常の組換え宿主細胞またはウイルスの発現産物、例えば、大腸菌発現VP5(Mundtら、J. Gen. Virol. 76, 437-443, 1995) またはバキュロウイルス発現タンパク質(Vakharia ら、Vaccine 12, 452-456, 1994; Vakharia ら、J. Gen Virol. 74, 1201-1206, 1993)などを含む。本発明のさらに別の実施態様によれば、上記した本発明に係る診断テストを行うのに適した診断テストキットが提供される。
【0071】
特に、通常存在する成分の他に、免疫学的試薬としてVP5抗原(所望ならば固相上に被覆)を含む診断テストキットが提供される。そのようなテストキットに通常存在する他の成分としては、ビオチンまたはホースラディッシュペルオキシダーゼが結合した抗体、酵素基質、洗浄緩衝剤などが挙げられる。
【0072】
現場の動物のテストサンプルにおけるビルナウイルスVP5抗原を測定するために、VP5特異的抗体を免疫学的試薬として使用し、好ましくは、固相に固定する。テストサンプルを添加し、抗体−抗原複合体を形成させるべくインキュベートした後、標識した第二の抗体を添加してその複合体を検出することができる。
【0073】
【実施例】
実施例1
組換えVP5 - IBDウイルスの構築および分析
IBDVセグメントAの全長VP5-クローンの構築:
VP5陰性IBDVを構築するために、D78株セグメントA(pUC19FLAD78; Mundt および Vakharia, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 11131-11136, 1996)の全長cDNAの3’−端のすぐ後ろのEcoRI 部位を欠失させた。T7ポリメラーゼ結合部位および続くセグメントAの完全な配列を含むEcoRI-KpnI断片を切り出してEcoRI-KpnI開裂ベクターpUC18 に挿入した後、そのベクター配列内のユニークなNdeIを不活化して、プラスミドpAD78/EKを得た。その後、VP5に対する開始コドンを含むゲノム領域を、各々、プライマーA1F5' およびVP5MutR 、ならびにVP5MutF およびA2R を使用して2片で増幅した(プライマーの配列および位置に対しては表1を参照)。PCR断片を別々にクローン化し、次いで、各々のプライマー内の変異によって作ったユニークなAflII 部位によって融合した(図2参照)。T7ポリメラーゼ結合部位を含むEcoRI-NdeI断片および導入した変異を含むセグメントAの5’−部分を切り出して、pAD78/EKにおける野生型EcoRI-NdeI断片との置換に使用し、プラスミドpAD78/VP5-を得た。導入した3個の変異のうち、一つはVP5に対する開始メチオニンコドンをアルギニンコドンに変えた(図2)。
【0074】
表1:変異体構築物の生成に使用したオリゴヌクレオチドプライマーの配列
【0075】
【表1】
【0076】
a)下線部のヌクレオチドは、ウイルス特異的ヌクレオチドを示す。T7プロモーター配列は、イタリック体で示す。変異したヌクレオチドは太字であり、プライマーの方向は、センス(+)およびアンチセンス(−)に対して示す。プライマーの位置は、血清型IP2株の発表された配列に従って示す(Mundt ら、Virology 209, 209-218, 1995)。
【0077】
cRNAからのウイルス回収:RNAプラスミドを in vitro 転写するために、pAD78/EK、pAD78/VP5-および pBP2 (図2)を、各々、BsrGI およびPstIによる開裂によって線状化した。線状化DNAの処理、RNAの転写および精製、ならびにトランスフエクションは、Mundt およびVakharia(1996 、前出) の記載に従って行ったが、トランスフェクションの実験については、二次CECを使用した。トランスフェクションの3日後、CPEをCEC中に見ることができた。細胞を凍結/解凍し、700 x g で遠心分離して細胞の壊死組織片を除去し、得られた上清を0.45μm のフィルターで濾過して、−20℃で保存した。トランスフェクション実験のために、VP5を発現することができるD78株のセグメントAの全長cDNAクローン(pAD78/EK)または発現できないクローン(pAD78/VP5-)を合成RNAに転写し、セグメントB全長cRNAとともにCECに共トランスフェクションした。得られたウイルスの子孫IBDV/EKおよびIBDV/VP5-を、さらに解析した。
【0078】
免疫蛍光および放射線免疫沈殿アッセイ(RIPA)によるトランスフェクション子孫の分析:VP5を、Mundt ら (J. Gen. Virol. 76, 437-443, 1995) の記載に従って、大腸菌で発現させた。VP5に対するウサギモノ特異的ポリクローナル抗血清およびマウスモノクローナル抗体を、標準的プロトコールに従って調製した。IBDV/VP5-感染ベロ細胞、IBDV/EK感染ベロ細胞および非感染細胞を、各々、ウサギ抗−IBDV血清、ウサギ抗−VP5血清および抗−VP5 mAb DIE 7とともにインキュベートし、蛍光−結合二次抗体で染色した。抗血清およびモノクローナル抗体の両方が、IBDV/EK感染細胞の細胞質におけるIBDV抗原を認識した。これに対して、抗−IBDV血清は、IBDV/VP5-感染細胞におけるウイルス抗原を容易に検出したが、モノ特異的抗VP5血清もモノクローナル抗−VP5抗体も特異的反応性を示さなかった。これらの免疫学的試薬はどれも、感染していない対照とは反応しなかった。
【0079】
複製中に発現されるウイルスタンパク質を分析するために、IBDV/VP5-(図4、レーン1〜3)およびIBDV/EK(図4、レーン4〜6)を感染させた放射能標識したCECの溶解産物を、ウサギ抗−IBDV血清、ウサギ抗−VP5血清および mAb DIE 7 によって免疫沈殿させた。感染していないCECを対照として使用した(図4、レーン7〜9)。IBDV/EK(レーン4)およびIBDV/VP5-(レーン1)感染CECは、ウサギ抗−IBDV血清による免疫沈殿により、ウイルスタンパク質VP2、VP3およびVP4を示した。ウサギ抗−VP5血清(レーン5)および mAb DIE 7(レーン6)は、IBDV/EK感染細胞のみに由来する分子量21 kDaのVP5を沈殿させた。ウサギ抗−VP5(レーン2)およびVP5特異的 mAb DIE 7(レーン3)による沈殿においては、IBDV/VP5-感染CECは、特異的反応性を示さなかった。感染していないCECは、特異的反応性を示さなかった(レーン7〜9)。
【0080】
CECにおけるIBDV/VP5-の複製:IBDV/VP5-の複製をさらに詳細に分析するために、一ステップ増殖を分析した(図5)。コンフルエント二次CECを、各々、107.2TCID50を有するIBDV/EKおよびIBDV/VP5-で感染させた。感染細胞を5 mlの増殖培地で覆った直後に、各ウイルスの1個の感染CEC組織プレートの上清を取り出して、−20℃で保存した(0 h p.i.)。残りの組織培養プレートはさらにインキュベートし、4h、8h、16h 、24h および48h p.i.上清を取り出して、−20℃で保存した。上清を遠心分離し、標準的方法に従って力価測定した。感染後の種々の時点でのTCID50は、VP5発現ウイルス(IBDV/EK)が、VP5に欠けるウイルス変異体(IBDV/VP5-)よりも速く複製することを示した。感染の16時間後、IBDV/EKは、IBDV/VP5-よりも100 倍高いことを示した(図5)。しかし、48h p.i.では、IBDV/VP5-は、107.2TCID50/ml に達し、これは、IBDV/EK(107.45TCID50/ml )と同じであった。
【0081】
組換えIBDV VP5-−2の調製:プラスミド pAD78/VP5--2を、上記した方法と同様の方法で調製した。変異誘発したVP5遺伝子の一部のヌクレオチド配列を配列番号7および図3に示す。変異を含む制限酵素断片を使用して、pAD78/EKにおける野生型EcoRI-NdeI断片と置き換えた。組換えプラスミドの調製に対するプロトコールの概略を図3に示す。pBD78 の構成も図3に示す。組換えウイルスは、上記と同様に作製したが、D78株のセグメントB(配列番号8)を使用し、QM−7細胞をトランスフェクション実験に使用した。
【0082】
実施例2
種々のIBDV株におけるVP5タンパク質の同定
種々のIBDV株を、VP5遺伝子の発現について調べた。これは、免疫蛍光法(IFT)を使用して行った。マイクロタイタープレートで増殖させたニワトリ胚繊維芽細胞に種々のIBDV株を感染させた。37℃でのインキュベートの3〜5日後に細胞を70 %エタノールで固定し、次いで、各々、ポリクローナルウサギ抗IBDV血清(R1928)、ポリクローナルウサギ抗VP5血清(RαVP5)またはVP5に対して特異的なモノクローナル抗体(DIE7)で処理した。種々のIBDV株に対するポリ−またはモノクローナル抗体の結合を、蛍光標識コンジュゲート(ヤギ−抗−ウサギまたはヤギ−抗−マウス)を使用することにより可視化した。結果を表2に示す。
【0083】
表2:種々の血清型およびサブタイプのIBDV株の同定:VP5タンパク質の存在の測定
【0084】
【表2】
【0085】
これらのデータから、種々の血清型およびサブタイプに属するIBDVの種々の株は、VP5遺伝子を発現すると結論付けることができる。さらに、組換えVP5-IBDVワクチン株は、現場およびワクチンウイルスと区別することができ、従って、組換えVP5-ウイルスはマーカーワクチンとして使用することができる
実施例3
組換えVP5 + およびVP5 - IBDVワクチンの、市販のIBDV生ワクチンとの比較のための in vivo テスト
IBDVワクチンの調製:一次ニワトリ胚繊維芽細胞(CEF)を 2 × 106/ml の最終濃度で調製した。細胞は、5 %のウシ胎児血清を含むイーグル最少必須培地で培養した。この細胞懸濁物25 ml に、0.1 mlのIBDV/EKまたはIBDV/VP5-ウイルス(約3.0 log 10 TCID50/mlの感染力価を有する)を添加した。37℃の高湿度インキュベーターで5日間インキュベートした後、懸濁物全体をさらに精製することなく動物実験に使用した。上清の感染力価は、107.1TCID50/ml であった。
【0086】
動物実験:この実験では、種々のワクチン(VP5陽性株IBDV/EKおよびVP5陰性株IBDV/VP5-ならびに市販のIBDVワクチン NobilisD78株 (Intervet International B.V., NL))の効力を調べた。3週齢のSPFニワトリを、処理計画に示すように処理した。
【0087】
処理計画:
【0088】
【表3】
【0089】
VP5+ VP5陽性ワクチンクローンによる嚢病(bursal disease)ワクチン接種、点眼法、用量は動物1匹につき104.6TCID50、0.1 ml
VP5- VP5陰性ワクチンクローンによる嚢病ワクチン接種、点眼法、用量は動物1匹につき105.9TCID50、0.1 ml
D78 IBDVワクチン NobilisD78株による嚢病ワクチン接種、点眼法、1フィールド用量
ch 嚢病ウイルス Farragher F52/70株 による誘発、点眼法、用量は動物1匹につき102.0TCID50、0.1 ml
bl 血清学的実験;VN−検定/ウェスタンブロット
x 嚢(bursae)に対する組織学的実験(H.E.染色)およびMCA−8 ELISA
xl 嚢に対する組織学的実験(H.E.染色)およびMCA−8 ELISAならびにファブリキウス嚢由来のウイルスの再単離
+ 嚢の臨床実験および10日後の組織学的実験
ファブリキウス嚢におけるウイルスの検出:
点眼によるワクチン接種の3、7、14および20日後、動物を屠殺し、血液および嚢を得た。嚢中のウイルスの存在を、モノクローナル抗体8(MAB−8)の使用による固相酵素免疫検定法(ELISA)によって測定した。MAB−8は、IBDVに対して特異的である。データを表3に示す。
【0090】
さらに、ワクチン接種の3および7日後、第2群の動物の嚢を、組換えVP5-ウイルスの存在について調べた。その目的のために、嚢をモジネートし、ニワトリ胚繊維芽細胞上で培養した。VP5-ウイルスの存在は、IBDVもしくはVP5に対するポリクローナルウサギ血清またはVP5に対するモノクローナル抗体を使用して、IFTにより測定した。調べた15の嚢のうち13(87 %)からVP5-ウイルスを再単離し、同定することができた(R1928 に対して陽性であり、 RαVP5 およびDIE 7 に対して陰性である)。このことは、動物の継代後のウイルスがなおもVP5-であることを示し、これは、そのウイルスが安定であって、VP5+に戻らないことを示している。さらに、種々のポリ−およびモノクローナル抗体の使用により、VP5-ワクチンウイルスを、他の全てのワクチンおよび/または現場のIBDVウイルスと区別することができる。従って、VP5-ワクチンは、マーカーワクチンとして使用できる。
【0091】
誘発(challenge)の3日後、第1、2および3群では、ウイルスが検出されなかった(MCA−8 ELISA)。これに対して、第4群(ワクチン接種していない対照群)の全動物は、誘発の3日後にファブリキウス嚢に誘発ウイルスを含んでいた。それらの結果は、組換えVP5+でワクチン接種した動物(第1群)、組換えVP5-でワクチン接種した動物(第2群)およびIBDVワクチン NobilisD78でワクチン接種した動物(第3群)が、過酷な誘発に対して保護されたことを示している。
【0092】
表3:ワクチン接種または誘発後の異なる時点(日数)でのファブリキウス嚢におけるMCA−8 ELISAによる個々のウイルス検出データ
【0093】
【表4】
【0094】
ファブリキウス嚢における病変の検出:
種々のIBDV(組換え)ワクチンまたは誘発ウイルスにより誘起される病変の顕微鏡による平均得点を表4に示す。
【0095】
誘発前は、組換えVP5+IBDVワクチンでワクチン接種した(第1群)またはIBDVワクチン NobilisD78でワクチン接種した(第3群)動物の嚢の病変は小〜中程度であった。誘発の3日後に、慢性の病変のみがファブリキウス嚢で確認された。これは、第1および3群の動物が誘発に対して保護されたことを示す。さらに、誘発の10日後には、非常に小さい病変( 0〜20%のリンパ球の消耗)のみがVP5+組換えIBDVワクチンまたは NobilisワクチンD78でワクチン接種した動物の嚢で確認された。これに対して、ワクチン接種または誘発を行わなかった動物は、誘発の10日後に重い病変を示した。言い換えると、VP5+組換えIBDVワクチンまたは NobilisワクチンD78でワクチン接種した第1および3群の全動物(100%)が、過酷な誘発に対して保護された。
【0096】
組換えVP5-IBDVワクチンによるワクチン接種の3、7、14および20日後、ならびに誘発の3および10日後に、第2群の動物は、嚢の病変をほとんど示さなかった( 0〜20 %のリンパ球の消耗)。VP5-組換えIBDVワクチンを接種した第2群の全動物を第1または3群の動物(組換えVP5+または市販のワクチンを接種)と比較すると、組換えVP5-ワクチンは、病変の誘起が小さく、従って、この実験でテストしたワクチンよりも安全で刺激が少ない。
【0097】
誘発の3日後、第4群のワクチン接種しなかった全動物は、嚢に急性の重い病変を示した(全リンパ球の消耗、得点 5.0)。誘発の10日後には、全動物(17匹中17匹)が全リンパ球の消耗を示した。これは、これらの動物が、過酷な誘発に対して保護されなかったことを示す。誘発後に死亡した動物は、全部がファブリキウス嚢に重い病変を示した。対照の第4群は、過酷な誘発に対して保護されず、これは、テスト条件が最適であったことを示すとの結論を下した。
【0098】
表4:ワクチン接種または誘発後の種々の時点(日数)での嚢の病変の平均得点:病変の平均得点は、次のように計算する。すなわち、ある一定の日に、群毎に動物の全ての病変の得点を加える。この数値を次いで、その日にその群で調べた動物の総数で割る。個々の得点は1〜5の範囲である。得点0=リンパ球の消耗なし、得点1=リンパ球の消耗が 0〜20%、得点2=20〜40 %、得点3=40〜60%、得点4=60〜80%および得点5=80〜100%(全リンパ球の消耗)
【0099】
【表5】
【0100】
血清学的応答:
動物の血清学的応答を、血清による古典的伝染性嚢病ウイルス株の中和能をウイルス中和(VN)検定で測定することにより求めた。血清は、ワクチン接種の3、7、14および20日後に調べた。中和力価の平均を表5に示す。
【0101】
結果は、第1群のニワトリに適用した組換えIBDVワクチンVP5+が、ワクチン接種の20日後に良好で高い血清学的応答を誘起したことを示している。これは、市販のIBDVワクチン NobilisD78株を接種したニワトリ(第3群)の血清学的応答に匹敵する。第2群のニワトリに適用した組換えIBDVワクチンVP5-も、良好な血清学的応答を誘起した。ワクチン接種の20日後に9.4 log 2 の力価が確認された。組換えVP5-IBDVワクチンによって誘起される血清学的応答は、組換えIBDV VP5+ワクチンまたは市販のIBDVワクチン NobilisD78株によって誘起される血清学的応答と比較して遅かった。
【0102】
ワクチン接種しなかった第4群は、IBDVに対する血清学的応答を示さなかった。
【0103】
表5:ワクチン接種後の異なる時点(日数)での第1〜4群のIBDV−VN平均力価(希釈度の log 2として表す)
【0104】
【表6】
【0105】
抗血清間の血清学的差異の認識:
VP5に対する血清学的応答を、ウェスタンブロット分析を使用することにより調べた。この目的のために、VP5タンパク質を大腸菌またはバキュロ発現系で発現させた。発現したタンパク質をSDS PAGEで分離した。次に、タンパク質をニトロセルロース膜上に電気ブロットした。その後、膜をレーンに切り分け、それらのレーンをウサギ抗−VP5血清、VP5+組換えワクチンに対して特異的なニワトリ血清、VP5-組換えワクチンに対して特異的なニワトリ血清またはSPFニワトリ由来の陰性血清とともにインキュベートした。データを表6にまとめる。表6から分かるように、VP5-血清は、VP5に対する血清学的応答を誘起しない。これに対して、ウサギ抗−VP5血清およびVP5+組換えワクチンに対して特異的なニワトリ血清は、VP5タンパク質を認識し、従って、VP5に対する血清学的応答を誘起する。これは、ニワトリ血清が、動物がVP5タンパク質を発現するウイルス(例えば、現場のウイルス)またはVP5-組換えワクチンに動物がさらされたかどうかを調べるために使用できることを示している。
【0106】
表6:ウェスタンブロット分析:VP5+またはVP5-組換えワクチンを接種した動物由来の血清ならびにSPFニワトリ血清および抗VP5−ウサギ血清のVP5−タンパク質との反応を調べた。
【0107】
【表7】
【0108】
死亡率および臨床上の徴候:
VP5+IBDVワクチンを接種した動物(第1群)、組換えVP5-IBDVワクチンを接種した動物(第2群)または市販のIBDVワクチン NobilisD78株を接種した動物(第3群)はいずれも、誘発後、死亡しなかったし、あるいは、伝染性嚢病の臨床上の徴候を示さなかった。これは、それらの動物が、過酷な誘発に対して保護されたことを示す。ワクチン接種していない対照群の動物は全て、過酷な誘発に対して保護されなかった。
【0109】
実施例4
組換えVP5 - −2ワクチンの in vivo テスト
IBDVワクチンの調製:一次ニワトリ胚繊維芽細胞(CEF)を、2 × 106/ml の最終濃度で調製した。細胞は、5%のウシ胎児血清を含むイーグル最少必須培地で培養した。この細胞懸濁物の15 ml に、0.1 mlのIBDV/VP5-−2(D78/D78/VP5-)ウイルスを添加した。高湿度のインキュベーター(37℃)で6日間インキュベートした後、上清を力価測定した。上清の感染力価は、108.2TCID50/ml であった。第二の動物実験に対しては、上清を希釈して、ワクチン用量を 105.5TCID50/動物とし、第一の動物実験の場合は、上清を希釈して、104.0TCID50/動物または105.0TCID50/卵とした。
【0110】
第一の動物実験:ワクチンの効果を、14日齢での誘発ウイルスの投与によって得られる血清学的応答および誘発耐性を測定することにより評価した。ワクチン(105.0TCID50/卵または104.0TCID50/動物のD78/D78/VP5-)は、 in ovo または1日齢では筋肉内に投与した。誘発の3および10日後の嚢の病変を顕微鏡により調べた。誘発に対する保護を測定し、14日齢での血清学的応答をVN−検定によって測定した。
【0111】
1.誘発の3および10日後の嚢の病変の顕微鏡による平均得点
【0112】
【表8】
【0113】
2.誘発後の保護
【0114】
【表9】
【0115】
3.IBDVに対する血清学的応答
【0116】
【表10】
【0117】
結論:
1.D78/D78/VP5-株は、かなり弱毒化されたIBD−ウイルスである。
【0118】
2.そのウイルス株は非常にマイルドである。
【0119】
3.そのウイルスは、血清学的応答を誘起することができる。
【0120】
4.そのウイルスは、保護を誘起することができる。
【0121】
5.そのウイルス株は、1日齢のSPFニワトリに筋肉内注射によって投与することができ、18日齢の胚含有SPF卵には in ovo で投与することができる。
【0122】
第二の動物実験:ワクチンの効果を、ガンボロワクチン投与の21日後に誘発ウイルスを投与することによって得られるIBDVに対する血清学的応答および誘発耐性を測定することにより評価した。ワクチン(105.5TCID50/動物のD78/D78/VP5-)は、14日齢のSPFニワトリに筋肉内投与した。ワクチン接種の3、7、14および20日後ならびに誘発の3日後に、嚢、脾臓、胸腺、肝臓、十二指腸、膵臓、ceacal tonsilsおよび harderian腺の病変を顕微鏡で調べた。誘発の10日後に、嚢の病変を顕微鏡で調べた。血清をVN−検定でテストし、誘発後の死亡率を記録した。
【0123】
1.誘発後の死亡率(%):
【0124】
【表11】
【0125】
2.誘発の前後のワクチン接種群の顕微鏡による病変の調査:
【0126】
【表12】
【0127】
ND=調査していない
3.ワクチン接種後の血清学的応答
【0128】
【表13】
【0129】
結論
1.D78/D78/VP5-株は、かなり弱毒化されたIBD−ウイルスである。
【0130】
2.そのウイルス株は非常にマイルドであり、臓器の病変を誘起しない。
【0131】
3.そのウイルスは、血清学的応答を誘起することができる。
【0132】
4.そのウイルスは、保護を誘起することができる。
【0133】
【配列表】
【0134】
【化1】
【0135】
【化2】
【0136】
【化3】
【0137】
【化4】
【0138】
【化5】
【0139】
【0140】
【化6】
【0141】
【化7】
【0142】
【化8】
【0143】
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【0144】
【0145】
【化10】
【0146】
【化11】
【0147】
【化12】
【0148】
【0149】
【化13】
【0150】
【0151】
【化14】
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【化16】
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【化27】
【0168】
【化28】
【0169】
【化29】
【0170】
【化30】
【図面の簡単な説明】
【図1】IBDVのセグメントAおよびセグメントBのゲノム構成。数字は、セグメント上の開始、末端およびコード領域のヌクレオチドの位置を示す。
【図2】IBDV/VP5-を調製するためのゲノムcDNAの構築。プラスミド pAD78/EK は、ポリタンパク質(VP2−VP4−VP3)およびVP5をコードする完全なD78セグメントA cDNAを含む。プラスミド pBP2 は、VP1をコードする完全株P2セグメントBを含む。変異をプラスミド pAD78/VP5-に導入して、VP5に対するメチオニン開始コドンをアルギニンに変え、人工の Afl II 開裂部位を作った。組換えプラスミドを、下線を引いた制限酵素で線状化し、次いでT7ポリメラーゼ転写を行った。
【図3】IBDV/VP5-−2を調製するためのゲノムcDNAの構築。プラスミド pAD78/EK は、ポリタンパク質(VP2−VP4−VP3)およびVP5をコードする完全なD78セグメントA cDNAを含む。プラスミド pBD78は、VP1をコードする完全D78株セグメントBを含む。変異をプラスミド pAD78/VP5-に導入して、VP5に対するメチオニン開始コドンをグルタミン酸に変え、人工の BstBI開裂部位を作った。さらに変異をアルギニンおよびグルタミンコドンに導入した。組換えプラスミドを、下線を引いた制限酵素で線状化し、次いでT7ポリメラーゼ転写を行った。
【図4】組換えIBDV感染CEC細胞由来のタンパク質の放射線免疫沈殿。IBDV/VP5-感染CEC細胞(レーン1〜3)、IBDV/EK感染CEC細胞(レーン4〜6)および未感染の対照のウサギ抗−IBDV血清(レーン1、4、7)、ウサギ抗−VP5血清(レーン2、5、8)および mAb DIE7 (レーン3、6、9)による免疫沈殿を行った。分子量マーカー(M)の位置を示す。ウイルスタンパク質VP2、VP3、VP4およびVP5の位置に印を付ける。
【図5】IBDV/EKおよびIBDV/VP5-の複製動力学。上清の感染力価(縦軸)を、指示した時間に測定した。
Claims (13)
- ビルナウイルスゲノムのVP5遺伝子における変異の結果、天然のVP5タンパク質を製造することができないビルナウイルス変異体であって、前記変異が、
(i)VP5遺伝子の開始コドンの少なくとも2個のヌクレオチドの置換;および
(ii)VP5遺伝子のヌクレオチド1−30にわたる5’末端の3個のリーディングフレームの各々に終結コドン;
を含み、当該ビルナウイルスが伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス(IBDV)であることを特徴とする、ビルナウイルス変異体。 - 変異が病原性の現場のウィルスのゲノム中にあることを特徴とする、請求項1に記載のビルナウイルス変異体。
- 変異がワクチン株のゲノム中にあることを特徴とする、請求項1に記載のビルナウイルス変異体。
- 前記ワクチン株がD78株であることを特徴とする請求項3に記載のビルナウイルス変異体。
- 配列番号3に示される塩基配列からなるVP5遺伝子の開始コドンがGAAに変異し、開始コドンを基準にして第10位と17位のヌクレオチドAがTに変異していることを特徴とする請求項1〜4に記載のビルナウイルス変異体。
- 請求項1〜5に記載のビルナウイルス変異体および薬剤的に許容され得る担体を含むことを特徴とする、鳥類のビルナウイルス感染に対するワクチン。
- VP5遺伝子に変異を導入し、その結果、ビルナウイルスがVP5タンパク質を製造することができなくなる工程を含む、鳥類に対するビルナウイルスの病原性を弱毒化する方法であって、当該ビルナウイルスが伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス(IBDV)であることを特徴とする前記方法。
- 変異が置換であることを特徴とする、請求項7に記載の方法。
- 変異が病原性の現場のウィルスのゲノム中にあることを特徴とする、請求項7または8に記載の方法。
- 変異がVP5遺伝子の開始コドンの少なくとも2個のヌクレオチドの置換を含むことを特徴とする、請求項7〜9に記載の方法。
- 変異がVP5遺伝子のヌクレオチド1−30にわたる5’末端中で更に1個以上の終結コドンを含むことを特徴とする、請求項10に記載の方法。
- 変異が3個のリーディングフレームの各々において終結コドンを含むことを特徴とする、請求項11に記載の方法。
- 配列番号3に示される塩基配列からなるVP5遺伝子の開始コドンがGAAに変異し、開始コドンを基準にして第10位と17位のヌクレオチドAがTに変異していることを特徴とする請求項12に記載の方法。
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