CN109762062B - 一种鹅痛风病卵黄抗体的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种鹅痛风病卵黄抗体的制备方法。本发明从临床感染的雏鹅病变肝脏及肾脏中分离得到鹅星状病毒RPVA1061株，利用RPVA1061株制备成卵黄抗体用于临床雏鹅痛风病的防治，在解决现有临床鹅痛风病无药物用的问题的同时，提供了一种新的鹅痛风病的临床防治方案，经临床验证，本发明的制备的卵黄抗体对鹅痛风病的防治效果显著。

Description

一种鹅痛风病卵黄抗体的制备方法

技术领域

本发明属于卵黄抗体制备技术领域，具体涉及一种治疗由星状病毒引起的鹅痛风病的卵黄抗体的制备方法。

背景技术

从2017年初至今，我国山东、江苏、广东、广西、湖南、河南及安徽等地的雏鹅群中发生一种以内脏和关节痛风为主要症状的传染性疾病，给我国养鹅业造成严重经济损失。该病主要发生于1-20日龄的雏鹅，死亡率最高可达60％。患病雏鹅精神沉郁，卧地倦动，采食减少。剖检表现为内脏器官及关节腔的严重尿酸盐沉积，不同品种、使用不同饲料、不同药物的鹅群均有发生，降低饲料中的蛋白含量、减少饲喂量均无效。该病发生后，我们从广东、湖南、安徽、河南等省份发生痛风的鹅场采集病料100余份，对采集的病料进行了病原分离和动物回归试验，确定导致该病的病原为新型鹅星状病毒。

在此之前，行业内将鹅痛风病因主要归结于饲料营养成分失衡和药物滥用，对于鹅痛风病毒的预防和治疗，目前除了加强消毒和提高鹅场养殖条件外，并没有其他有效的手段。在探明病因的基础上，结合现有养殖行业针对病毒病的防治手段，疫苗免疫和抗体注射治疗是最有效和最经济的防治手段，由于疫苗免疫存在免疫空白期，不适合鹅痛风病的发病特点，因此抗体治疗成为防治鹅痛风病唯一可行的防治措施。卵黄抗体因具有抗体制备经济、易操作、产量大、效价高等优点，因此制备出针对鹅星状病毒的卵黄抗体成为目前防治该病的亟需和首选。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的鹅痛风病的临床防治方案。

本发明的还在于提供一种防治鹅痛风病的卵黄抗体，以解决现有临床中针对鹅痛风病无药可用的问题。

本发明的还在于提供一种防治鹅痛风病的卵黄抗体的制备方法。

为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：

一种鹅痛风病卵黄抗体的制备方法，采用灭活的保藏编号为CCTCCNo.V201839的鹅星状病毒免疫蛋鸡，然后从鸡蛋蛋黄中提取纯化卵黄抗体。

鹅痛风病卵黄抗体具体的制备工艺在于包括以下步骤：

1)从鹅痛风临床病例中分离鹅星状病毒，通过PCR鉴定和血清学检测确定其为星状病毒；

2)将上述分离得到的鹅星状病毒经绒毛尿囊膜接种易感鹅胚制备生产用毒；

3)用甲醛灭活生产用毒后，制备成灭活疫苗；

4)用灭活疫苗免疫蛋鸡，收集高免鸡蛋蛋黄分离得到鹅星状病毒卵黄抗体。

所述的鹅星状病毒是从临床感染的雏鹅病变肝脏及肾脏中分离得到的，将其命名为RPVA1061株，该病毒株于2018年6月28日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为：CCTCC No.V201839，保藏单位地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号。

所述生产用毒是从接种后死亡的易感鹅胚的尿囊液、羊水及胚体中，匀浆、冻融、离心收集、超滤浓缩后得到的。

所述生产用毒的甲醛灭活是指：在生产用毒中加入终浓度为0.08-0.25％的甲醛，30-42℃灭活18-24小时。

更进一步的，利用终浓度0.1％的甲醛，在37℃灭活生产用毒18小时。

所述的灭活疫苗为油乳剂灭活疫苗。

更进一步，所述的灭活疫苗的油相为白油。

所述免疫蛋鸡，至少需要进行一次基础免疫和两次加强免疫。

更进一步的，所述免疫蛋鸡进行三次加强免疫。

所述高免鸡蛋是指最后一次加强免疫后14天开始收集的。

所述鹅星状病毒卵黄抗体的分离应具体包含以下步骤：

(1)蛋壳消毒：将高免蛋浸入0.1％的新洁尔灭溶液中浸泡消毒15min，取出消毒后的鸡蛋自然晾干或吹干，喷洒75％的酒精对蛋壳表面消毒后备用。

(2)卵黄分离采取机械打蛋：打蛋时充分除去蛋清、胚盘和系带，收集卵黄。

(3)灭活Ⅰ：将收集的蛋黄充分搅拌，使蛋黄呈均匀膏状，启动蠕动泵，将蛋黄液泵入夹层反应罐中，加入与蛋黄等体积的注射用水，搅拌混匀后，60～65℃保温(灭活)30min。

(4)酸化萃提：先在隔离反应罐中加入相当于原蛋黄3倍体积的PH值5.0的醋酸缓冲液，然后加入卵黄液，开启搅拌机搅，充分拌搅30分钟。

(5)灭活Ⅱ：卵黄液液中加入终浓度(V/V)为4％的辛酸作灭活剂和萃提剂，剧烈搅拌90分钟，2～8℃放置4～8小时。

(6)粗滤：用丙纶750B滤布过滤后，再用柱芯滤器过滤至澄清。

(7)除菌过滤：用0.22μm微孔芯过滤除菌，置2～8℃存放，应不超过14日。

(8)灭活Ⅲ：将过滤后的溶液导入灭活罐中，计量加入10％的甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛溶液的最终浓度(V/V)为0.1％，37℃灭活16小时即得。

一种用于制备鹅痛风病卵黄抗体的抗原，所述抗原为鹅星状病毒RPVA1061株，保藏编号为：CCTCC No.V201839。

更进一步的，所述抗原是保藏编号为：CCTCC No.V201839，是经PCR和血清学检测后确定为星状病毒。

本发明带来的有益效果是：

1)克服了现有临床中将鹅痛风病的病因归结为饲料营养成分失衡和药物滥用的技术偏见，明确指出鹅痛风病发病与鹅星状病毒有关；

2)保藏编号为CCTCC No.V201839的鹅星状病毒株是申请人自己分离得到的，并将其制备成卵黄抗体解决了现有临床中无药可用的问题；

3)制备的鹅星状病毒卵黄抗体效价高、免疫效果好，能有效防治鹅痛风病，增强机体免疫功能，为健康养殖保驾护航；

4)鹅痛风病卵黄抗体制备工艺简单、效率高、生产成本低。

附图说明

图1.PCR鉴定鹅痛风凝胶电泳分析图

图2.鹅星状病毒动物回归剖检结果

图1说明：从marker标记右1为阳性对照，右2为所鉴定的鹅痛风病料，右3为阴性对照。

图2说明：左上胆囊肿大，胆汁充盈呈翠绿色，胆汁中有尿酸盐颗粒，右上心脏表面有尿酸盐沉淀，左下肾脏苍白肿大，右下心脏有尿酸盐包裹。

具体实施方式

以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有说明，本文使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。

实施例1 野生鹅星状病毒的分离鉴定

将来自临床感染的雏鹅病变肝脏及肾脏用抗生素在病毒传输介质中均质化，将该均质化组织通过0.45微米针筒式滤器过滤。将0.1ml病毒液匀浆在原代鹅胚肾细胞上用0.1-2％血清连续培养4代，摸索到合适病毒血清培养浓度，约0.5-1％。随着70％-80％细胞病变效应的发展，将细胞培养物冷冻并在-80℃下贮存。

(1)RNA提取。使用RNA/DNA病毒提取试剂盒(Takara)，对临床感染的雏鹅病变肝脏及原代鹅胚肾细胞培养物进行病毒RNA提取。

(2)引物设计。利用已公开的鹅星状病毒序列，根据星状病毒保守的ORF1b序列，用Primer5.0软件进行引物设计。引物序列设计如下：

F：GACTGGACAAGCTACGATGGCACTATTCC(SEQ ID No.1)

R：CTTAACCCACATGCCGAA(SEQ ID No.2)

ORF1b序列参见序列表：SEQ ID No.3。

(3)RT-PCR。使用病毒RNA提取试剂盒(Takara)进行病毒RNA提取，使用反转录酶(Takara)进行反转录。

反转录具体步骤如下：

1)Microtube管中配制下列模板RNA/引物混合液，全量6μl

模板RNA 1ng～1μg

Oligo(dT)12-18Primer(50μM) 1μl

RNase free H2O up to 6μl

2)70℃保温10min后冰上极冷5min，短离。

3)在上述Microtube管中加入下列反应液

4)42℃保温1h

5)70℃保温15min后冰上冷却，得到cDNA溶液。

使用taq酶(Takara)进行PCR，具体PCR反应条件如下：

进行DNA凝胶电泳分析(1％凝胶)，获得440bp的目标条带，与预期片段大小相符，结果见图1，将目的条带回收纯化后，送华大基因公司测序，并将测序结果与GenBank上公开的鹅星状病毒保守的ORF1b序列进行比对，同源性为99.6％，证实病料中存在鹅星状病毒。

鹅星状病毒鹅胚传代：

将病死雏鹅肝脏和肾脏组织，按照1:4的比例加入无菌磷酸缓冲液进行匀浆处理，将均浆液置于-20℃冰箱至室温反复冻融2次，8000rpm离心20min后取上清液，经0.22μm针式滤器过滤除菌后-20℃保存。

将获取的组织毒经绒毛尿囊膜途径接种10日龄鹅胚，0.2ml/枚，并用无菌磷酸缓冲液设置阴性对照，30℃孵育，每天检蛋2次，弃掉24小时之内死亡的鹅胚，连续观察7日，将死亡的鹅胚置4℃冷蛋后无菌收集尿囊液及病变明显胚胎，毒液盲传4代。

鹅星状病毒靶动物回归：

取30只1日龄的雏鹅，随机分为2组。I组20只经皮下接种病毒尿囊液接种剂量0.2ml/只；II组10只以同样的方式和剂量接种无菌生理盐水作为对照。每日观察雏鹅的临床症状和死亡情况。攻毒后3日死亡雏鹅剖检有典型雏鹅痛风症状：肾脏苍白肿大、心脏有尿酸盐沉积、胆囊充盈胆汁呈翠绿色有尿酸盐颗粒沉淀(见图2所示)。

上述分离鉴定的星状病毒即为鹅星状病毒RPVA1061株，保藏编号为：CCTCCNo.V201839。

实施例2 鹅星状病毒毒液及灭活疫苗的制备

1、扩毒：RPVA1601株毒种作100倍稀释，绒毛尿囊膜接种10日龄易感鹅胚100枚，每胚0.2ml，36～37℃孵育，每日2次照胚检查。接种后48～240小时内死亡的鹅胚，置2～8℃放置4～12小时后，收取尿囊液、羊水及胚体，胚体去掉头和四肢。用胚液匀浆后、冻融3次，8000r/min离心20min，取上清混合于无菌容器中，置2～8℃保存。(参见表1)。

表1 毒液的制备

毒株名称	胚品种	接种胚数(枚)	胚日龄	收获毒液(ml)
					RPVA1601	易感鹅胚	100	10	1480

2、浓缩：将收获的RPVA株病毒液在2～8℃条件下，用超滤浓缩机分别浓缩至原体积的1/4，按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验，无菌生长，并留样备测毒价。RPVA株病毒液每0.2ml病毒含量应≥10^5.5ELD₅₀，浓缩后的胚液随即进行灭活。(参见表2)。

表2 毒液浓缩

3、灭活：将浓缩后的RPVA1601株病毒液导入灭活罐内，加入10％甲醛溶液，使其充分混合，甲醛溶液的最终浓度为0.1％。加甲醛溶液后导入另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃密封灭活18小时(以罐内温度达到37℃开始计)，其间每隔4～6小时搅拌一次，灭活后置2～8℃保存。

4、灭活苗制备：

(1)油相制备：取兽用白油94份，硬脂酸铝2份，置于油相制备罐中加热至80℃后，再加司本-80 6份，至温度达到115℃时，维持30min，冷却后备用。

(2)水相制备：将灭活检验合格的RPVA1601株96份加入4份灭菌吐温-80，开动搅拌电机搅拌20～30min，使吐温-80完全溶解。

(3)乳化：水相与油相混合乳化比例为2:3(V/V)，先将油相导入胶体磨，2500转/分钟搅拌，缓慢加入水相，加完后10000转/分钟乳化5分钟。在终止乳化前按疫苗总量0.01％加入硫柳汞，充分振荡混匀。乳化后，取10ml，以3000r/min离心15分钟，管底无水相析出。

(4)无菌分装后，轧盖后在2～8℃保存。(参见表3)

表3 疫苗乳化和分装

实施例3 鹅星状病毒卵黄抗体制备

1、高免蛋的制备：将上述制备的鹅星状病毒灭活疫苗免疫蛋鸡，首次免疫每只鸡颈部皮下注射2.0ml灭活疫苗，21天后进行第二次免疫，每只鸡颈部皮下注射2.0ml灭活疫苗，二免后21天进行第三次免疫，每只鸡颈部皮下注射2.0ml灭活疫苗，三免后21天进行加强免疫,每只鸡颈部皮下注射2.0ml灭活疫苗，加强免疫之后14天，采集卵黄进行攻毒保护实验。

2、卵黄抗体制造：

(1)蛋壳消毒：将18公斤高免蛋浸入0.1％的新洁尔灭溶液中浸泡消毒15min，取出消毒后的鸡蛋自然晾干或吹干，喷洒75％的酒精对蛋壳表面消毒后备用。

(2)卵黄分离采取机械打蛋：打蛋时充分除去蛋清、胚盘和系带，收集卵黄。

(3)灭活Ⅰ：将收集的蛋黄充分搅拌，使蛋黄呈均匀膏状，启动蠕动泵，将蛋黄液泵入夹层反应罐中，加入与蛋黄等体积的注射用水(注射用水先经80℃30min消毒，并冷却至65℃以下)，搅拌混匀后，60～65℃保温(灭活)30min。

(4)酸化萃提：先在隔离反应罐中加入相当于原蛋黄3倍体积的PH值5.0的醋酸缓冲液，然后加入卵黄液，开启搅拌机搅，充分拌搅30分钟。

(5)灭活Ⅱ：卵黄液液中加入终浓度(V/V)为4％的辛酸作灭活剂和萃提剂，剧烈搅拌90分钟，2～8℃放置4～8小时。

(6)粗滤：用丙纶750B滤布过滤后，再用柱芯滤器过滤至澄清。

(7)除菌过滤：用0.22μm微孔芯过滤除菌。置2～8℃存放，应不超过14日。

(8)灭活Ⅲ：将过滤后的溶液导入灭活罐中，计量加入10％的甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛溶液的最终浓度(V/V)为0.1％，37℃灭活16小时。

具体生产指标及结果见表4：

表4 卵黄抗体制造及分装

实施例4 鹅星状病毒卵黄抗体攻毒保护效果

用1～5日龄健康易感雏鹅30只，随机分成3组，每组10只。第1组为健康对照组，不注射任何药品，单独隔离饲养；第2组为攻毒对照组，每只皮下或肌肉注射生理盐水0.5ml；第3组为卵黄抗体组，每只皮下或肌肉注射卵黄抗体0.5ml。注射后第7日，用鹅星状病毒RPVA1601株病毒液皮下注射第2组和第3组，每只1.0ml(含100ID50)。观察10日。第1组应全部健活；第2组应至少发病8只实验方可成立。

攻毒组在攻毒后第三天开始发病，观察至实验结束共有9只发病，发病率90％，预防组在攻毒后第五天有1只发病，观察至实验结束共有1只发病，预防保护率为90％，与攻毒对照组有显著差异，说明雏鹅痛风卵黄抗体可以有效预防保护鹅星状病毒攻击。

以上所述，仅为本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术中的普通技术人员来说，在不脱离本发明的核心技术特征的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些润饰和改进也应属于本发明的专利保护范围。

Claims (9)

1.一种鹅痛风病卵黄抗体的制备方法，包括如下步骤：

1）从鹅痛风临床病例中分离、检测、鉴定鹅星状病毒，

2）将分离得到的鹅星状病毒经绒毛尿囊膜接种易感鹅胚制备生产用毒，

3）用甲醛灭活生产用毒后，制备成灭活疫苗，

4）用灭活疫苗免疫蛋鸡，收集高免鸡蛋蛋黄分离得到鹅星状病毒卵黄抗体；

其特征在于，所述的鹅星状病毒的保藏编号为：CCTCC No.V201839。

2.根据权利要求1所述的卵黄抗体制备方法，其特征在于：所述的甲醛灭活是指在生产用毒中加入终浓度为0.08-0.25%的甲醛，30-42℃灭活18-24小时。

3.根据权利要求1或2所述的卵黄抗体制备方法，其特征在于：所述的甲醛灭活是指在利用终浓度0.1%的甲醛，在37℃灭活生产用毒18小时。

4.根据权利要求1所述的卵黄抗体制备方法，其特征在于：所述免疫蛋鸡，至少需要进行一次基础免疫和两次加强免疫。

5.根据权利要求1或4所述的卵黄抗体制备方法，其特征在于：所述免疫蛋鸡需要进行三次加强免疫。

6.根据权利要求1所述的卵黄抗体制备方法，其特征在于：所述高免鸡蛋是指最后一次加强免疫后14天开始收集的鸡蛋。

7.根据权利要求1所述的卵黄抗体制备方法，其特征在于：分离得到鹅星状病毒卵黄抗体具体包含以下步骤：

对高免鸡蛋进行消毒；

分离蛋清与蛋黄；

去处蛋黄的卵黄膜以及系带后，用胶体磨破碎制备成卵黄液；

酸化萃提并灭活；

过滤收集澄清滤液即得卵黄抗体。

8.根据权利要求7所述的卵黄抗体制备方法，其特征在于：所述的灭活应包括60-65℃保温灭活和终浓度为0.1%的甲醛灭活。

9.一种用于制备卵黄抗体的鹅星状病毒，其特征在于：所述的星状病毒是从临床感染的雏鹅病变肝脏及肾脏中分离得到RPVA1061株，保藏编号为：CCTCC No.V201839。

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