CN113214388B - 一种鹅星状病毒卵黄抗体及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明基于在先分离得到的纯度和毒力较强的毒株鹅星状病毒N‑GoAstV‑190123，将其制成灭活疫苗，免疫蛋鸡获得了抗体浓度和中和指数较高的卵黄抗体溶液，并通过将其与保护剂混合，制备得到了稳定性较好的卵黄抗体冻干制剂，该卵黄抗体冻干制剂对于鹅星状病毒N‑GoAstV‑190123具有较好的保护效力，其被动保护期长达8天。

Description

一种鹅星状病毒卵黄抗体及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鹅星状病毒卵黄抗体及其制备方法。
背景技术：
鹅星状病毒是禽星状病毒属成员，属于ＲNA病毒，鹅感染星状病毒后表现为腹泻、关节炎及生长障碍，发生较重的致死性肝炎、胆囊炎及肾炎等疾病。2~25日龄雏鹅发病率较高，15日龄以内雏鹅最易感，死亡率一般为15%~36%，最高可达50%。由于禽星状病毒可拥有多个宿主，能够水平、垂直、跨种传播；同时禽星状病毒基因重组、适应新宿主的能力和新型禽星状病毒强毒株的不断发现，使得感染禽星状病毒的禽群净化异常困难。此外，禽星状病毒较强的理化因子抵抗力，对被禽星状病毒污染的环境消毒十分困难。目前，针对禽星状病毒还没有市场化的特异性药物和疫苗，体外适宜增殖细胞系的缺乏，导致可防控禽星状病毒感染的弱毒或灭活疫苗相对较少，更未有商品化的鹅星状病毒疫苗类产品。卵黄抗体是指从免疫禽蛋中提取的针对特定抗原的抗体，当机体受到外来抗原刺激后，法氏囊内的B细胞分化成为浆细胞，分泌特异性抗体进入血液循环，当血液流经卵巢时，特异性抗体(主要是IgG)在卵细胞中逐渐蓄积，形成卵黄抗体。实验室条件下进行攻毒后治疗的试验表明：鹅星状病毒卵黄抗体对发病早期（个别鹅出现精神沉郁、采食量下降）的鹅有大于等于80%治愈率。
基于目前鹅星状病毒在养殖场不断蔓延，导致的经济损失越来越大，因而，亟需研制安全有效的疫苗以及预防和治疗鹅星状病毒用的卵黄抗体和药物等，以对鹅星状病毒疫情进行有效的控制，避免养殖业的经济损失。
发明内容：
为了解决现有技术中鹅星状病毒感染的治疗手段有限的问题，本发明旨在提供一种鹅星状病毒卵黄抗体及其制备方法，基于发明人分离得到的一株免疫原性良好的鹅星状病毒分离毒株，制备得到抗体效价高的卵黄抗体，能够有效的抵御强毒的攻击，形成有效的免疫保护。
为解决以上技术问题，本发明采用如下技术手段：
一种鹅星状病毒卵黄抗体，其特征在于，所述卵黄抗体是采用保藏编号为CCTCCNo：V202068的鹅星状病毒N-GoAstV-190123株制备的灭活疫苗作为抗原制备得到的。
所述鹅星状病毒N-GoAstV-190123株在中国典型培养物保藏中心CCTCC进行用于专利程序的培养物的保藏，其保存号为：CCTCC No：V202068，分类命名为鹅星状病毒N-GoAstV-190123株；保藏日期为2020年10月14日；保藏地址为：湖北省武汉市武汉大学保藏中心。
本发明所涉及的鹅星状病毒N-GoAstV-190123株已在2021年03月23日申请的发明专利申请中进行了详细记载，其申请号为202110306942.2，发明名称为“一株鹅星状病毒及其应用”，本发明中通过引用的方式，将该专利申请中公开的内容引入到本发明中。
本发明还涉及鹅星状病毒卵黄抗体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
步骤一，采用鹅星状病毒N-GoAstV-190123株制备的灭活疫苗作为免疫原对产蛋鸡进行免疫，收集高免蛋；
步骤二，将高免蛋的蛋壳消毒后，收集卵黄；
步骤三，从卵黄中提取鹅星状病毒卵黄抗体。
其中步骤一中的免疫的程序为：
（1）基础免疫：将鹅星状病毒N-GoAstV-190123株灭活疫苗皮下注射健康产蛋鸡，每羽注射灭活疫苗1.0mL；
（2）第二次免疫：在基础免疫后第14天进行第二次免疫接种，每羽产蛋鸡皮下注射灭活疫苗1.5mL；
（3）第三次免疫：在第二次免疫接种后第14天进行第三次免疫接种，每羽产蛋鸡皮下注射灭活疫苗1.5mL；
（4）维持免疫，当卵黄中鹅星状病毒卵黄抗体的琼扩抗体效价达到1:96时，维持接种1次，每羽产蛋鸡的皮下注射灭活疫苗1.5mL。
步骤二中的蛋壳消毒是将将高免蛋浸入37℃的0.1%新洁尔灭水溶液中消毒20min，随后采用75％酒精棉球擦拭表面，并置于超净工作台内晾干，备用，对于蛋壳污染较为严重的高免蛋，单独用消毒水冲洗干净后，再进行浸泡消毒。
步骤二中的收集卵黄是手工或机械打蛋，充分除去蛋清、胚盘和卵黄系带，收集卵黄。
步骤三中从卵黄中提取鹅星状病毒卵黄抗体采用如下方法：量取卵黄体积，按1:8比例加入pH 5.2醋酸缓冲液，充分搅拌，于0-4℃静置12-24小时，10000r/min离心10min，取上清液。将等体积的饱和度为100%的饱和硫酸铵溶液缓慢加入离心收集的上清液中，使其饱和度达到50％，4℃静置过夜后，在4℃ 8000r/min的条件下离心20min，弃上清，留沉淀；将所得的沉淀用0.1mol/L的PBS溶液溶解至原卵黄液体积，再次加入硫酸铵使硫酸铵浓度为66.7％，混合后室温沉淀24h后，4℃8000r/min的条件下离心20min，弃上清，留沉淀，用0.1mol/L的PBS溶液加至原卵黄液体积的1/2，置于透析袋中，置0.85%的NaCl溶液中，透析过夜直至除去残余的硫酸铵，而后继续加入0.1mol/L的PBS溶液，加至原卵黄液体积。
所述制备方法进一步包括浓缩与灭活，具体采用截留分子量为1000kD的超滤膜过滤除病毒，而后采用截留分子量为100kD的中空纤维超滤柱进行10倍浓缩，按照终浓度0.05%向卵黄抗体溶液中加入甲醛溶液，充分搅拌混匀，室温灭活24h，得到鹅星状病毒卵黄抗体半成品溶液。
本发明还请求保护一种鹅星状病毒卵黄抗体冻干制剂，其是将鹅星状病毒卵黄抗体半成品溶液与保护剂按照1:1的比例混合，分装后于冷冻干燥机内进行冷冻干燥，至水分含量≤4%。
所述保护剂将海藻糖、蔗糖、甘露醇、甘氨酸、精氨酸加入纯净水中配置成保护剂，所述保护剂中含有3.0%（w/v）的海藻糖、2.0%（w/v）的蔗糖、1.0%（w/v）的甘露醇、0.5%（w/v）的甘氨酸和0.5%（w/v）的精氨酸。
基于以上技术方案，本发明具有如下优点和有益效果：
本发明基于在先分离得到的纯度和毒力较强的毒株鹅星状病毒N-GoAstV-190123，将其制成灭活疫苗，免疫蛋鸡获得了抗体浓度和中和指数较高的卵黄抗体溶液，并通过将其与保护剂混合，制备得到了稳定性较好的卵黄抗体冻干制剂，该卵黄抗体冻干制剂对于鹅星状病毒N-GoAstV-190123株具有较好的保护效力，其被动保护期长达8天。
附图说明：
图1.卵黄抗体 SDS-PAGE 电泳鉴定结果，其中M：蛋白分子质量标准；1、2 提纯的卵黄抗体。
具体实施方式：
实施例1：鹅星状病毒灭活疫苗的制备
基于发明人在先获得的一株高致病性的鹅星状病毒N-GoAstV-190123株，将其在中国典型培养物保藏中心（CCTCC）进行用于专利程序的培养物的保藏，其保存号为：CCTCCNo：V202068，命名为鹅星状病毒N-GoAstV-190123株；保藏日期为2020年10月14日；保藏地址为：湖北省武汉市武汉大学保藏中心。所涉及的鹅星状病毒N-GoAstV-190123株已在2021年03月23日申请的发明专利申请中进行了详细记载，其申请号为202110306942.2，发明名称为“一株鹅星状病毒及其应用”，本发明中通过引用的方式，将该专利申请中公开的内容引入到本发明中。
所述灭活疫苗的制备包括如下步骤：
步骤一，取第15-20代次的鹅星状病毒N-GoAstV-190123毒种用稀释液进行稀释，稀释至ELD50为5×105.00/mL，经绒毛尿囊膜途径接种8～10日龄SPF鹅胚，每胚0.2ml，接种后置37℃继续孵育，不必翻蛋；
步骤二，SPF鹅胚接种后，每日照蛋3次，将在24小时前死亡的鹅胚弃去，24小时以后死亡的鹅胚随时取出，至72小时，将活胚全部取出，气室向上直立，置于4℃冷却12小时；
步骤三，将冷却12小时的鹅胚取出，表面消毒后，吸取鹅胚液，每20个鹅胚的胚液混合为一组，在收获胚液的同时，应逐个检查鹅胚，将胚液混浊不清、胎儿腐败及有任何污染可疑的鹅胚弃去不用；
步骤四，收获后的胚液置于灭菌瓶中，通过离心机离心后，混合于一个储存罐内，在无菌条件下用灭菌的二级预过滤柱滤过，除去病毒液的残渣和其他杂质，同时取样测定毒价，并采用生理盐水稀释调整胚液的ELD50为5×105.00；
步骤六，准确量取甲醛，用注射用水配制成10%的甲醛溶液，混合均匀，然后往鹅胚液加入甲醛溶液，随加随搅拌，充分混合，甲醛最终浓度为0.2%，而后将其倒到已灭菌的灭活罐内，37℃灭活24小时，期间不停搅拌，灭活24小时后取样做无菌检验和灭活检验；
步骤七，取灭活的病毒液加热至30℃保温，取等体积的MontanideISA206佐剂，倒入双层夹套容器并将温度保持在30℃，低速（200r/min）搅拌并逐渐将灭活病毒液加入，流速5L/min，待灭活病毒液全部加入后，提高搅拌速度至300r/min，30℃持续搅拌15分钟，而后在持续300r/min高速搅拌的情况下冷却至10℃以下，停止搅拌，将乳液在10℃以下静置24小时，分装并加盖密封，4℃左右保存备用，制得鹅星状病毒N-GoAstV-190123灭活疫苗。
实施例2：鹅星状病毒卵黄抗体的制备
2.1高免蛋的生产
2.1.1产蛋鸡的选择：
选择100-120日龄的健康产蛋鸡，产蛋鸡经检测应无禽白血病病毒、禽流感感染，且鸡白痢和鸡支原体检测应为阴性，采用常规饲料进行饲喂。
产蛋鸡的免疫：
（1）基础免疫：将实施例1制备的鹅星状病毒N-GoAstV-190123株灭活疫苗皮下注射健康产蛋鸡，每羽注射灭活疫苗1.0mL；
（2）第二次免疫：在基础免疫后第14天进行第二次免疫接种，每羽产蛋鸡皮下注射灭活疫苗1.5mL；
（3）第三次免疫：在第二次免疫接种后第14天进行第三次免疫接种，每羽产蛋鸡皮下注射灭活疫苗1.5mL；
（4）维持免疫，当卵黄中鹅星状病毒卵黄抗体的琼扩抗体效价达到1:96时，维持接种1次，每羽产蛋鸡的皮下注射灭活疫苗1.5mL。
将高免蛋的蛋壳消毒后，收集卵黄
蛋壳消毒：将高免蛋浸入37℃的0.1%新洁尔灭水溶液中消毒20min，随后采用75％酒精棉球擦拭表面，并置于超净工作台内晾干，备用，对于蛋壳污染较为严重的高免蛋，单独用消毒水冲洗干净后，再进行浸泡消毒。
收集卵黄：手工或机械打蛋，充分除去蛋清、胚盘和卵黄系带，收集卵黄。
从卵黄中提取鹅星状病毒卵黄抗体
量取卵黄体积，按1:8比例加入pH 5.2醋酸缓冲液，充分搅拌，于0-4℃静置12-24小时，10000r/min离心10min，取上清液。将等体积的饱和度为100%的饱和硫酸铵溶液缓慢加入离心收集的上清液中，使其饱和度达到50％，4℃静置过夜后，在4℃ 8000r/min的条件下离心20min，弃上清，留沉淀；将所得的沉淀用0.1mol/L的PBS溶液溶解至原卵黄液体积，再次加入硫酸铵使硫酸铵浓度为66.7％，混合后室温沉淀24h后，4℃8000r/min的条件下离心20min，弃上清，留沉淀，用0.1mol/L的PBS溶液加至原卵黄液体积的1/2，置于透析袋中，置0.85%的NaCl溶液中，透析过夜直至除去残余的硫酸铵，而后继续加入0.1mol/L的PBS溶液，加至原卵黄液体积；
2.4浓缩与灭活
采用截留分子量为1000kD的超滤膜过滤除病毒，而后采用截留分子量为100kD的中空纤维超滤柱进行10倍浓缩，按照终浓度0.05%向卵黄抗体溶液中加入甲醛溶液，充分搅拌混匀，室温灭活24h，得到鹅星状病毒卵黄抗体半成品溶液。
卵黄抗体的检测
2.5.1 蛋白含量的测定
取三个批次鹅星状病毒卵黄抗体半成品溶液，用 BAC 蛋白检测试剂盒，参照使用说明书，测定样品的蛋白质浓度。经测定，鹅星状病毒卵黄抗体溶液上清液中的浓度为57.5±0.25mg/mL。
采用SDS-PAGE电泳法测定 IgY 纯度，分别配制 10%分离胶、5%浓缩胶，加样后，以80V电压起始，待样品到达分离胶时电压升至120V，直到样品跑至胶底，取胶置于考马斯亮蓝染色液中浸染1 h，再脱色液充分脱色，至呈现出清晰条带。如图1所示，经SDS-PAGE电泳分离鉴定，提纯后的 IgY 有两条着色带在约66kDa(重链)和40kDa(轻链)处，薄层扫描鉴定纯度达到 93.5%左右。
半成品检验
2.5.2.1 无菌检验：按照现行的《中国兽药典》附录进行检验，无菌生长。
安全性检验：取3日龄健康易感雏鹅15只，随机分为三组，分别为高、中、低剂量组，每只皮下注射鹅星状病毒卵黄抗体半成品溶液3.0mL、2.0mL和0.5mL，连续观察20天，雏鹅全部保持健康，观察期间采食正常，体重增加正常，表明本发明的鹅星状病毒卵黄抗体半成品溶液安全无毒。
琼扩效价测定：采用琼脂糖扩散试验测定鹅星状病毒卵黄抗体半成品溶液的抗体效价，经测定，鹅星状病毒卵黄抗体半成品溶液每mL的抗体效价≥1:512。
琼扩抗体效价与攻毒保护的平行关系试验
抗体半成品溶液稀释为每mL含抗体效价分别为1:16、1:8、1:4、1:2 共4个稀释度后，每个稀释度肌肉注射7日龄易感雏鹅10 只，1.0ml/只，注射后24h分别用鹅星状病毒N-GoAstV-190123株0.5ml/只（含 105 ELD50）进行攻毒。7日后记录攻毒保护的结果，结果如下：
表1 琼扩抗体效价与攻毒保护的平行关系试验结果
Figure 73010DEST_PATH_IMAGE001
基于以上表1的结果可知，琼扩效价为1:4以上时，雏鹅保护率为100%，而琼扩效价为1:2时，雏鹅保护率为40%，因此，卵黄抗体使用时应保证每mL含抗体效价≥1:4。
中和指数测定：将鹅星状病毒卵黄抗体半成品溶液用生理盐水进行稀释后得到卵黄抗体稀释液，每mL含抗体效价为1:4，采用生理盐水对鹅星状病毒N-GoAstV-190123株毒种进行10倍系列梯度稀释，分装到2列无菌西林瓶中，第1列加等量生理盐水(对照组)，第2列加被检卵黄抗体稀释液(试验组)，吹打混合后加塞、室温下静置反应12小时，对照组取10-4～10-7稀释度和试验组取10-1～10-7稀释度，每个稀释度分别经绒毛尿囊膜途径接种8～10日龄SPF鹅胚6枚，0.2ml/胚，用蜡封孔，于37℃静置孵育，24小时以前死亡鹅胚弃去不计，24～120小时死亡鹅胚随时取出，按Reed-Muench法计算2组的ELD50，中和指数＝试验组ELD50/对照组ELD50，中和指数为425。
实施例3. 鹅星状病毒冻干卵黄抗体的制备
3.1 卵黄抗体冻干保护剂的选择
将海藻糖、蔗糖、甘露醇、甘氨酸、精氨酸按照下表1的比例（质量体积百分比，w/v）加入纯净水中配置成保护剂，分别标记为保护剂1、保护剂2、保护剂3和保护剂4，调整pH至7.0-7.2，经灭菌处理后，0-4℃保存备用。
表2 卵黄抗体冻干保护剂的配制
Figure 662254DEST_PATH_IMAGE002
3.2 冻干卵黄抗体的配制及冷冻干燥
将实施例2制备得到的鹅星状病毒卵黄抗体半成品溶液，与保护剂按照1:1的比例混合，分装后于冷冻干燥机内进行冷冻干燥，至水分含量≤4%。
卵黄抗体冻干成品的稳定性试验
将冻干的鹅星状病毒卵黄抗体置于37℃保存，于7天、14天、21天和2-8℃下保存，于1个月、3个月、6个月，等体积复溶后测定琼扩抗体效价，结果见下表3。
表3卵黄抗体冻干成品的稳定性试验结果
Figure 707570DEST_PATH_IMAGE004
基于以上试验可知，通过保护剂的筛选可知，本发明采用3.0%（w/v）的海藻糖、2.0%（w/v）的蔗糖、1.0%（w/v）的甘露醇、0.5%（w/v）的甘氨酸和0.5%（w/v）的精氨酸的保护剂1相比保护剂2-4所制备得到的卵黄抗体具有更好的稳定性，37℃高温保存试验表明，保护剂1能够使得卵黄抗体在21天甚至更长时间内保持稳定、较高的琼扩效价，而保护剂2-4分别在21天时出现了抗体效价的下降，最低的保护剂3和4，其抗体效价降至1:64；低温保存试验表明，在6个月内，保护剂1能够使得卵黄抗体的效价保持稳定、较高的琼扩效价。由此可见，在保护剂中同时加入甘氨酸和精氨酸相比单独加入某一类氨基酸具有更好的保护效果。
实施例4：鹅星状病毒冻干卵黄抗体的评价
基于以上试验结果，确定卵黄抗体冻干制剂的最佳保护剂由3.0%（w/v）的海藻糖、2.0%（w/v）的蔗糖、1.0%（w/v）的甘露醇、0.5%（w/v）的甘氨酸和0.5%（w/v）的精氨酸组成，鹅星状病毒卵黄抗体半成品溶液与保护剂按照1:1的比例混合，分装后于冷冻干燥机内进行冷冻干燥，至水分含量≤4%。
安全性评价
采用生理盐水将鹅星状病毒冻干卵黄抗体制剂复溶后，稀释至每mL含抗体效价为1:4，皮下注射 18～22g 清洁级小白鼠 10 只，1ml/只（含 1 羽份），并设置注射生理盐水的对照组，观察24日。注射小白鼠后，在试验期间，所有小白鼠均健活，临床观察未见异常，与对照组无明显差异；注射局部未见红肿、硬结；剖检注射部位，未见有结节、吸收不全等现象，内脏器官均未见异常。
被动免疫期试验结果
采用生理盐水将鹅星状病毒冻干卵黄抗体制剂复溶后，稀释至每mL含抗体效价为1:4，即1 羽份/ml，肌肉注射7日龄雏鹅 1.0ml/只，并于注射后 1、3、5、6、7、8、9、10天，随机抽取 10 只，分别用鹅星状病毒N-GoAstV-190123株0.5ml/只（含 105 ELD50）进行攻毒，作为试验组，计算保护数和保护率。同时，每个时间点另设10只同批雏鹅不注射抗体，分别皮下注射用鹅星状病毒N-GoAstV-190123株0.5ml/只（含 105 ELD50）进行攻毒作为攻毒对照，记录其发病数和死亡率，另设 10 只为空白对照组。具体结果如下表4所示。
表4 雏鹅被动免疫期试验结果
Figure 509304DEST_PATH_IMAGE005
基于以上表4的试验结果可知，冻干卵黄抗体注射7日龄雏鹅被动免疫期攻毒保护试验，各时间点的攻毒对照组 80%～100%死亡；空白对照组 100%健活；注射抗体组1-6日攻毒保护率为100%，第7-8日的保护率为90%，9日后雏攻毒保护率低于60%，说明注射抗体后6日能够实现完全保护，而注射8日内仍能保持较好的保护效果，注射9日后，抗体不能达到良好的保护效果，因此，确定所述卵黄抗体的被动免疫期为8天。
治疗效果试验
取7日龄的雏鹅100只，随机分为治疗组和非治疗组两组，均皮下注射用鹅星状病毒N-GoAstV-190123株稀释液0.5ml/只（含 103ELD50），在攻毒2日后，雏鹅均发病，表现出典型的症状,倦动厌食，精神不振，排灰白色稀便。此时治疗组采用鹅星状病毒冻干卵黄抗体制剂进行治疗，非治疗组不进行治疗，持续观察14天，结果表明，治疗组在注射抗体后4-5天，雏鹅症状基本消失，观察期结束，存活44只，存活率高达88%，而非治疗组的症状持续时间较长，最终存活22只，存活率为44%。以上结果表明，本发明的鹅星状病毒冻干卵黄抗体制剂对于鹅星状病毒感染具有良好的治疗作用。
以上实施例仅是对本发明技术方案的详细阐述，在此基础上所进行的常规调整都落入本发明的保护范围内。

Claims (4)

1.一种鹅星状病毒卵黄抗体，其特征在于，所述卵黄抗体是采用保藏编号为CCTCC No：V202068的高致病性鹅星状病毒N-GoAstV-190123株制备的灭活疫苗作为抗原制备得到的，所述鹅星状病毒N-GoAstV-190123株在中国典型培养物保藏中心CCTCC进行用于专利程序的培养物的保藏，其保存号为：CCTCC No：V202068，分类命名为鹅星状病毒Goose astrovirus；保藏日期为2020年10月14日；保藏地址为：湖北省武汉市武汉大学保藏中心；
所述的鹅星状病毒卵黄抗体的制备方法包括如下步骤：步骤一，采用鹅星状病毒N-GoAstV-190123株制备的灭活疫苗作为免疫原对产蛋鸡进行免疫，收集高免蛋；步骤二，将高免蛋的蛋壳消毒后，收集卵黄；步骤三，从卵黄中提取鹅星状病毒卵黄抗体。
2.根据权利要求1所述的鹅星状病毒卵黄抗体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：步骤一，采用鹅星状病毒N-GoAstV-190123株制备的灭活疫苗作为免疫原对产蛋鸡进行免疫，收集高免蛋；步骤二，将高免蛋的蛋壳消毒后，收集卵黄；步骤三，从卵黄中提取鹅星状病毒卵黄抗体；
步骤一中的免疫的程序为：（1）基础免疫：将鹅星状病毒N-GoAstV-190123株灭活疫苗皮下注射健康产蛋鸡，每羽注射灭活疫苗1.0mL；（2）第二次免疫：在基础免疫后第14天进行第二次免疫接种，每羽产蛋鸡皮下注射灭活疫苗1.5mL；（3）第三次免疫：在第二次免疫接种后第14天进行第三次免疫接种，每羽产蛋鸡皮下注射灭活疫苗1.5mL；（4）维持免疫，当卵黄中鹅星状病毒卵黄抗体的琼扩抗体效价达到1:96时，维持接种1次，每羽产蛋鸡的皮下注射灭活疫苗1.5mL；
步骤二中的蛋壳消毒是将高免蛋浸入37℃的0.1%新洁尔灭水溶液中消毒20min，随后采用75％酒精棉球擦拭表面，并置于超净工作台内晾干，备用，对于蛋壳污染较为严重的高免蛋，单独用消毒水冲洗干净后，再进行浸泡消毒；
步骤三中从卵黄中提取鹅星状病毒卵黄抗体采用如下方法：量取卵黄体积，按1:8比例加入pH 5.2醋酸缓冲液，充分搅拌，于0-4℃静置12-24小时，10000r/min离心10min，取上清液；将等体积的饱和度为100%的饱和硫酸铵溶液缓慢加入离心收集的上清液中，使其饱和度达到50％，4℃静置过夜后，在4℃ 8000r/min的条件下离心20min，弃上清，留沉淀；将所得的沉淀用0.1mol/L的PBS溶液溶解至原卵黄液体积，再次加入硫酸铵使硫酸铵浓度为66.7％，混合后室温沉淀24h后，4℃8000r/min的条件下离心20min，弃上清，留沉淀，用0.1mol/L的PBS溶液加至原卵黄液体积的1/2，置于透析袋中，置0.85%的NaCl溶液中，透析过夜直至除去残余的硫酸铵，而后继续加入0.1mol/L的PBS溶液，加至原卵黄液体积。
3.根据权利要求2所述的鹅星状病毒卵黄抗体的制备方法，其特征在于，所述制备方法进一步包括浓缩与灭活，具体采用截留分子量为1000kD的超滤膜过滤除病毒，而后采用截留分子量为100kD的中空纤维超滤柱进行10倍浓缩，按照终浓度0.05%向卵黄抗体溶液中加入甲醛溶液，充分搅拌混匀，室温灭活24h，得到鹅星状病毒卵黄抗体半成品溶液。
4.一种鹅星状病毒卵黄抗体冻干制剂，其是将权利要求3中所述的鹅星状病毒卵黄抗体半成品溶液与保护剂按照1:1的比例混合，分装后于冷冻干燥机内进行冷冻干燥，至水分含量≤4%；所述保护剂的配制方法是将海藻糖、蔗糖、甘露醇、甘氨酸、精氨酸加入纯净水中配制成保护剂，所述保护剂中含有3.0%（w/v）的海藻糖、2.0%（w/v）的蔗糖、1.0%（w/v）的甘露醇、0.5%（w/v）的甘氨酸和0.5%（w/v）的精氨酸。
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