CN108794627A - 一种鸭呼肠孤病毒精制卵黄抗体的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明适用于生物技术领域，提供了一种鸭呼肠孤病毒精制卵黄抗体的制备方法，包括以下步骤：步骤S1，按照毒种标准生产和挑选毒种；步骤S2，将毒种进行稀释后接种，经过检验后后提取抗原；按使用说明方法，用于鸭“肝脾坏死症”的预防保护率99.79％；用于鸭“肝脾坏死症”的早期、中期和后期治疗，与常规治疗方法比较，存活率分别提高了7.28％、5.82％和2.21％，本发明制备的鸭呼肠孤病毒精制卵黄抗体为临床预防、治疗鸭呼肠孤病毒导致的鸭“肝脾坏死症”提供了有效手段，与常规治疗方法比较，本发明制备的鸭呼肠孤病毒精制卵黄抗体，能显著减少该病给肉鸭养殖业带来的经济损失，具有显著的经济效益和社会效益。

Description

一种鸭呼肠孤病毒精制卵黄抗体的制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种鸭呼肠孤病毒精制卵黄抗体的制备方法。
背景技术
2017年3月以来，国内大型肉鸭养殖集团的养殖场流行一种雏鸭临床症状为脚软、拉稀和病理变化为肝脏有微黄色坏死灶并偶见伴有出血点、脾脏有灰白色坏死灶或脾脏肿大呈紫黑色的疾病，临床称为鸭“肝脾坏死症”，致病病原为鸭呼肠孤病毒。各品种鸭如麻鸭、白羽肉鸭、杂交鸭等均易发生，但以樱桃谷鸭更易发生，发病日龄以9日龄以内居多，发病率30％以内，发病后7日内死亡率10％左右
目前，临床上无鸭“肝脾坏死症”的抗体或疫苗用于预防该病。治疗时多采用抗病毒中药如黄芪多糖、鱼腥草等加抗生素控制继发细菌感染，但基本无效。以江苏某肉鸭养殖集团为例，2017年6月13日该集团下属的一个养殖场进了2万只雏鸭，在同一栋舍的两个网床上饲养，每个网床上各1万只，4日龄时发现该栋雏鸭出现鸭“肝脾坏死症”的临床症状时，左边的网床上的鸭子就开始治疗，连用3天药物，停药药后连续观察5天，共计死亡率；右边网床上的发病鸭子不进行任何治疗；治疗组观察期结束后，治疗组的死亡率为8.73％，不治疗组死亡率9.52％，从死亡率结果看，常规的治疗方法效果基本无效。
发明内容
本发明提供一种鸭呼肠孤病毒精制卵黄抗体的制备方法，旨在解决常规的治疗方法效果基本无效的问题。
本发明是这样实现的，一种鸭呼肠孤病毒精制卵黄抗体的制备方法，包括以下步骤：
步骤S1，按照毒种标准生产和挑选毒种；
步骤S2，将毒种进行稀释后接种，经过检验后后提取抗原；
步骤S3，将抗原检验后，经过浓缩、油相制备和水相制备后变成免疫抗原，免疫抗原经过检验合格后，将免疫抗原注射给合格的蛋鸡中；
步骤S4，将蛋鸡产的鸡蛋经过消毒、分离卵黄、稀释、酸化和萃取后提取抗体原液；
步骤S5，将抗体原液进行过滤、浓缩、灭活、分装后获得精制卵黄抗体；
步骤S6，将精制卵黄抗体的性状和装量检验合格后，对精制卵黄抗体的性状和装量检验，然后对精制卵黄抗体进行无菌检验、支原体检验、外源病毒检验和安全检验合格后，进行效力检验，检验合格后获得合格的鸭呼肠孤病毒精制卵黄抗体。
优选的，所述步骤S1中生产和检验用毒种均为鸭呼肠孤病毒JS株。
优选的，所述步骤S2的具体操作步骤如下：将毒种用灭菌生理盐水进行稀释，然后将稀释后的毒中接种到鸭胚中，鸭胚用碘酊消毒蛋壳表面气室部，无菌操作除去气室部蛋壳，收获胚液，置于灭菌容器内，标记，即为抗原。
优选的，所述步骤S3的具体操作步骤如下：将检验合格的抗原后进行解冻，然后将抗体原液进行灭活，灭活的浓缩抗原接种SPF鸭胚中，通过油相制备的方法制得灭菌的吐温-80备用，然后将灭菌的吐温-80和灭活的浓缩抗原进行水相制备，将乳化后的原液标记为免疫抗原，免疫抗原经过检验后，注射到合格的产蛋鸡中。
优选的，所述步骤S4的具体操作步骤如下：将蛋壳有粪污的高免鸡蛋单独挑出，用纯化水清洗干净，连同蛋壳洁净的高免鸡蛋一起摆入洁净的塑料蛋托，然后手工或机械打蛋，除去蛋清、胚盘和系带，收集卵黄，将卵黄转入夹层反应罐中，搅拌呈膏状，加入注射用水，搅拌均匀，加入酸化水，搅拌均匀后降温至4℃，静置至少12小时，吸取上清液，转入搅拌罐中，加入终浓度为1.0％的辛酸，搅拌均匀，作用至少5小时，此时上层为卵黄固态物、下层为澄清的抗体液，收集约80～90％的下层抗体液，用孔径为1μm的筒式滤芯过滤，收集滤液；将罐内剩余物搅拌均匀，用连续管式离心机离心，收集离心液，合并滤液和离心液。
优选的，步骤S5的具体操作步骤如下：将抗体原液用1～2M的氢氧化钠溶液调节pH值为5.50～7.50，用孔径为0.45μm的筒式滤芯过滤澄清，用孔径为0.22μm筒式滤芯过滤除菌，根据高免鸡蛋的鸭呼肠孤病毒中和抗体效价，滤液用截留分子量为50KD的中空纤维超滤器进行适当倍数的浓缩，预计使浓缩液的鸭呼肠孤病毒中和抗体效价≥1:128，浓缩液加入终浓度为0.05％的甲醛溶液，搅拌均匀，用孔径为0.22μm筒式滤芯过滤除菌、分装、轧盖，于2～8℃保存，进而获得精制卵黄抗体。
优选的，所述油相制备的操作步骤如下：取94份注射用白油，加入2份硬脂酸铝，边加边搅拌，加热直至完全透明，再加入6份司本-80，充分混匀，115℃高压灭菌30min，冷却至室温，备用。
优选的，所述注射用水的体积和卵黄体积相等，加入所述酸化水的体积为所述卵黄体积的7倍。
优选的，所述水相制备的具体操作步骤如下：灭活的浓缩抗原96份加入4份灭菌的吐温-80，充分振摇后使吐温-80完全溶解。
优选的，在接种过程中选取的鸭胚为发育良好的11日龄易感鸭胚。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的一种鸭呼肠孤病毒精制卵黄抗体的制备方法，在鸭呼肠孤病毒精制卵黄抗体临床应用的试验方案中，鸭呼肠孤病毒精制卵黄抗体用于鸭呼肠孤病毒的预防效果良好，本发明制备的鸭呼肠孤病毒精制卵黄抗体，按使用说明方法，用于鸭“肝脾坏死症”的预防保护率99.79％；用于鸭“肝脾坏死症”的早期、中期和后期治疗，与常规治疗方法比较，存活率分别提高了7.28％、5.82％和2.21％，本发明制备的鸭呼肠孤病毒精制卵黄抗体为临床预防、治疗鸭呼肠孤病毒导致的鸭“肝脾坏死症”提供了有效手段，能显著减少该病给肉鸭养殖业带来的经济损失，具有显著的经济效益和社会效益。
附图说明
图1为本发明的制备流程示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
请参阅图1，本发明提供一种技术方案：一种鸭呼肠孤病毒精制卵黄抗体的制备方法，包括以下步骤：
步骤S1，按照毒种标准生产和挑选毒种；
步骤S2，将毒种进行稀释后接种，经过检验后后提取抗原；
步骤S3，将抗原检验后，经过浓缩、油相制备和水相制备后变成免疫抗原，免疫抗原经过检验合格后，将免疫抗原注射给合格的蛋鸡中；
步骤S4，将蛋鸡产的鸡蛋经过消毒、分离卵黄、稀释、酸化和萃取后提取抗体原液；
步骤S5，将抗体原液进行过滤、浓缩、灭活、分装后获得精制卵黄抗体；
步骤S6，将精制卵黄抗体的性状和装量检验合格后，对精制卵黄抗体的性状和装量检验，然后对精制卵黄抗体进行无菌检验、支原体检验、外源病毒检验和安全检验合格后，进行效力检验，检验合格后获得合格的鸭呼肠孤病毒精制卵黄抗体。
结合实例，与现有技术方案比较，本发明技术方案的优点举例说明如下：2017年8月-11月，鸭呼肠孤病毒精制卵黄抗体在上述三个肉鸭养殖集团进行了200万只雏鸭的预防、治疗试验(其中，江苏某集团100万只、安徽某集团56万只、某集团江苏分公司44万只)。具体试验方案见表1。
表1鸭呼肠孤病毒精制卵黄抗体临床应用的试验方案
用于预防：对照组鸭发生“肝脾坏死症”的死亡率为10.75％，接种抗体组死亡率为0.21％；用于“肝脾坏死症”的发病早期治疗，对照组死亡率为9.95％，抗体治疗组死亡率为2.66％；用于“肝脾坏死症”的发病中期治疗，对照组死亡率为9.83％，抗体治疗组死亡率为4.01％；用于“肝脾坏死症”的发病后期治疗，对照组死亡率为6.22％，抗体治疗组死亡率为8.43％。结果说明鸭呼肠孤病毒精制卵黄抗体用于鸭呼肠孤病毒的预防效果良好；与常规治疗方法比较，抗体的治疗效果在雏鸭发生“肝脾坏死症”的早期、中期和后期均优于常规治疗方法。鸭呼肠孤病毒精制卵黄抗体的临床预防治疗效果见表2。
表2鸭呼肠孤病毒精制卵黄抗体的预防、治疗效果
在本实施方式中，在鸭呼肠孤病毒精制卵黄抗体临床应用的试验方案中，鸭呼肠孤病毒精制卵黄抗体用于鸭呼肠孤病毒的预防效果良好；与常规治疗方法比较，抗体的治疗效果在雏鸭发生“肝脾坏死症”的早期、中期和后期均优于常规治疗方法，本发明制备的鸭呼肠孤病毒精制卵黄抗体，按使用说明方法，用于鸭“肝脾坏死症”的预防保护率99.79％；用于鸭“肝脾坏死症”的早期、中期和后期治疗，与常规治疗方法比较，存活率分别提高了7.28％、5.82％和2.21％，本发明制备的鸭呼肠孤病毒精制卵黄抗体为临床预防、治疗鸭呼肠孤病毒导致的鸭“肝脾坏死症”提供了有效手段，能显著减少该病给肉鸭养殖业带来的经济损失，具有显著的经济效益和社会效益。
进一步的，步骤S1中生产和检验用毒种均为鸭呼肠孤病毒JS株。
在本实施方式中，生产和检验用毒种，均为鸭呼肠孤病毒JS株。毒种在中国典型培养物保藏中心保存，保藏号：CCTCC No：V201816。
毒种标准为基础毒种标准，
对鸭胚半数致死量，将毒种用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10-3、10-4和10-5 3个稀释度各经尿囊腔接种11日龄SPF鸭胚6枚，每胚0.1ml，用蜡封孔，于37℃静置孵育，24小时以前死亡鸭胚弃去不计，24～168小时死亡鸭胚随时取出，计算对鸭胚半数致死量应≥10-3.0ELD50/0.1ml。
对鸭胚毒力，将毒种用灭菌生理盐水10倍稀释,经尿囊腔接种11日龄SPF鸭胚10枚，每胚0.1ml，用蜡封孔，置37℃继续孵育，观察至168小时。鸭胚应全部死亡,死亡鸭胚有鸭呼肠孤病毒感染导致的典型病变。
特异性，将毒种用灭菌生理盐水稀释至100ELD50/0.1ml，与等量鸭呼肠孤病毒阳性血清混合，置37℃中和1小时，经尿囊腔接种11日龄SPF鸭胚10枚，每胚0.2ml；设病毒对照10枚，每枚接种同条件处理的病毒与灭菌生理盐水等量混合液0.2ml,上述鸭胚用蜡封孔，于37℃静置孵化，观察至120小时。中和组鸭胚应全部健活，对照组鸭胚应全部死亡。死亡鸭胚有鸭呼肠孤病毒感染的典型病变。
免疫原性，按本试行规程制备鸭呼肠孤病毒精制卵黄抗体,鸭呼肠孤病毒中和抗体效价应≥1:128。
纯净，按现行《中国兽药典》三部附录3306、3308和3305检验，应无菌、支原体生长和外源病毒污染。其中,外源病毒检测中的鸡胚检查法改为SPF鸭胚检查法；细胞检查法中的鸡胚成纤维细胞改为SPF鸭胚成纤维细胞。
基础种子代数，为E1～E5代。
检验用强毒标准，
毒种标准，同基础毒种标准。
对雏鸭毒力，1日龄健康易感雏鸭20只，随机分为两组，每组10只，分别在同条件下隔离饲养。一组为攻毒组，毒种用生理盐水10倍稀释，肌肉注射接种1ml/只；另外一组为对照组，不做任何处理，连续观察5日。对照组鸭应全部健活，观察期结束后全部扑杀，检查肝脏和脾脏均应无异常。观察期结束后扑杀攻毒组鸭，检查肝脏和脾脏病变，至少8只有鸭呼肠孤病毒感染导致的肝脏或脾脏坏死症状。，
毒种代数，E1～E5代。
毒种保存，-70℃及以下保存，冻干毒有效期至少为12个月。
具体的，毒种繁殖，将鸭呼肠孤病毒JS株基础毒种用生理盐水20倍稀释，经尿囊腔接种11日龄SPF鸭胚，每胚0.1ml，用蜡封孔，于37℃静置孵化，收集48～168小时死亡鸭胚，于4℃冷却6～12小时，收获胚液(羊水和尿囊液)，分装，注明收获日期、毒种代次及装量，于-70℃以下保存。
毒种保存，-70℃及以下保存，有效期暂定12个月。
毒种继代，应不超过3代。
制备抗原材料的选择，应选择发育良好的11日龄易感鸭胚作为制备抗原用材料。
进一步的，步骤S2的具体操作步骤如下：将毒种用灭菌生理盐水进行稀释，然后将稀释后的毒中接种到鸭胚中，鸭胚用碘酊消毒蛋壳表面气室部，无菌操作除去气室部蛋壳，收获胚液，置于灭菌容器内，标记，即为抗原。
具体的，抗原制备如下：
接种，用灭菌生理盐水将生产用毒种作20倍稀释，经尿囊腔接种11日龄易感鸭胚，每胚0.1ml，用蜡封孔，于37℃静置孵育。
孵育和观察，弃去48小时前死亡的鸭胚，以后每隔6小时照蛋1次，收集48～120小时死亡鸭胚，于4℃冷却6～12小时。
收获，鸭胚用碘酊消毒蛋壳表面气室部，无菌操作除去气室部蛋壳，收获胚液，置于灭菌容器内，标记，即为抗原，置-20℃保存，同时取样用于检验。在收获的同时，检查胎儿病变，将鸭胚体无典型病变、胎儿腐败、鸭胚尿囊液浑浊及疑似污染者弃去不用。
抗原检验操作如下：
无菌，按现行《中国兽药典》三部附录3306检验，应无菌生长。
对鸭胚的半数致死量，将无菌检验合格的抗原样品等量混合，按1.2.1.1检测，对鸭胚的半数致死量应≥10-3.0ELD50/0.1ml。
抗原浓缩与灭活，将检验合格的抗原于2～8℃条件下解冻、混合，于4℃条件下4000rpm离心30min，取上清液用4层灭菌纱布过滤，收集滤液用截留分子量为6KD的中空纤维超滤器浓缩10倍，浓缩液加入终浓度为0.2％的甲醛溶液(含量：HCHO为37.0～40.0％)，密闭后置37℃温箱中灭活24小时(其间4～6小时振摇1次，每次3分钟)，于4℃保存备用，同时取样用于检验。
进一步的，步骤S3的具体操作步骤如下：将检验合格的抗原后进行解冻，然后将抗体原液进行灭活，灭活的浓缩抗原接种SPF鸭胚中，通过油相制备的方法制得灭菌的吐温-80备用，然后将灭菌的吐温-80和灭活的浓缩抗原进行水相制备，将乳化后的原液标记为免疫抗原，免疫抗原经过检验后，注射到合格的产蛋鸡中。
进一步的，步骤S4的具体操作步骤如下：将蛋壳有粪污的高免鸡蛋单独挑出，用纯化水清洗干净，连同蛋壳洁净的高免鸡蛋一起摆入洁净的塑料蛋托，然后手工或机械打蛋，除去蛋清、胚盘和系带，收集卵黄，将卵黄转入夹层反应罐中，搅拌呈膏状，加入注射用水，搅拌均匀，加入酸化水，搅拌均匀后降温至4℃，静置至少12小时，吸取上清液，转入搅拌罐中，加入终浓度为1.0％的辛酸，搅拌均匀，作用至少5小时，此时上层为卵黄固态物、下层为澄清的抗体液，收集约80～90％的下层抗体液，用孔径为1μm的筒式滤芯过滤，收集滤液；将罐内剩余物搅拌均匀，用连续管式离心机离心，收集离心液，合并滤液和离心液。
进一步的，所述水相制备的具体操作步骤如下：灭活的浓缩抗原96份加入4份灭菌的吐温-80，充分振摇后使吐温-80完全溶解。
进一步的，在接种过程中选取的鸭胚为发育良好的11日龄易感鸭胚
具体的，灭活检验操作如下；
无菌，灭活的浓缩抗原按现行《中国兽药典》三部附录3306检验，应无菌生长。
灭活检验，灭活的浓缩抗原经尿囊腔接种11日龄SPF鸭胚5枚，每胚0.1ml，用蜡封孔，于37℃静置孵育，观察至120小时，鸭胚应全部健活。
具体的，免疫抗原的制备，
油相制备，取94份注射用白油，加入2份硬脂酸铝，边加边搅拌，加热直至完全透明，再加入6份司本-80，充分混匀，115℃高压灭菌30min，冷却至室温，备用。
水相制备，灭活的浓缩抗原96份加入4份灭菌的吐温-80，充分振摇后使吐温-80完全溶解。
乳化，水相与油相按体积比1:1的比例，将油相导入胶体磨，2500rpm搅拌，缓慢加入75％的水相，约90s内加完，停机后加入剩余25％的水相，10000rpm乳化3～5min。在终止乳化前加入1.0％的硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01％。
分装保存，无菌操作分装，加盖密封，标记为免疫抗原，于2～8℃避光保存，保存期为6个月。
具体的，免疫抗原的检验过程如下，
检验，性状，外观，为乳白色均匀乳剂。
剂型，水包油包水型。取一清洁吸管，吸取少量免疫抗原滴于清洁冷水表面，应呈云雾状扩散。
稳定性，取10ml免疫抗原加入离心管中，3000rpm离心15min，管底析出的水相应≤0.5ml。
黏度，按现行《中国兽药典》三部附录3102检验，黏度应不超过200cP。
甲醛残留量，按现行《中国兽药典》三部附录3203检验，应不超过0.20％甲醛溶液(含40％甲醛)量。
无菌检验，按现行《中国兽药典》三部附录3306检验，应无菌生长。
安全检验，取3～5周龄SPF鸡10只，在隔离器内饲养，每只皮下注射免疫抗原2.0ml，观察14日，应全部健活。
进一步的，步骤S5的具体操作步骤如下：将抗体原液用1～2M的氢氧化钠溶液调节pH值为5.50～7.50，用孔径为0.45μm的筒式滤芯过滤澄清，用孔径为0.22μm筒式滤芯过滤除菌，根据高免鸡蛋的鸭呼肠孤病毒中和抗体效价，滤液用截留分子量为50KD的中空纤维超滤器进行适当倍数的浓缩，预计使浓缩液的鸭呼肠孤病毒中和抗体效价≥1:128，浓缩液加入终浓度为0.05％的甲醛溶液，搅拌均匀，用孔径为0.22μm筒式滤芯过滤除菌、分装、轧盖，于2～8℃保存，进而获得精制卵黄抗体。
具体的，高免鸡蛋的生产标准如下，
产蛋鸡，符合以下条件的商品蛋鸡。
无禽白血病病毒和禽网状内皮增生症病毒，鸡群抽样采血，按现行《中国兽药典》三部附录3302和3304检验，应全部为阴性。
鸡白痢和鸡支原体，按NY/T 536-2002《鸡伤寒和鸡白痢诊断技术》和NY/T553-2002《禽支原体病诊断技术》进行检测，鸡白痢和鸡支原体感染阳性率应≤0.1％。
饲养管理，鸡场建设必须符合兽医卫生防疫规范要求。鸡场应离交通要道500米以上，进、出口道路应分开。场内料、粪道路分开。鸡场进出口应设有消毒池。育雏舍与成鸡舍应设隔离带。此外，鸡场应具备粪污处理设施，实施全进全出制，鸡场饮水应达到卫生标准，饲养人员应卫生健康。
疫病防治，鸡群根据当地疫病发生的实际情况，按科学免疫程序适时接种相关疫苗，根据情况需要，适时、适量投喂抗生素和抗球虫药品等。
其他，在进行基础免疫时，鸡群的初产蛋率以5％～10％为最佳。
具体的，免疫程序操作过程如下，
基础免疫，鸡皮下注射免疫抗原0.5ml/只。
加强免疫，基础免疫后14日，鸡皮下注射免疫抗原1.0ml/只。
强化免疫，加强免疫后21日，鸡皮下注射免疫抗原1.5ml/只。
维持免疫，当高免鸡蛋卵黄中的鸭呼肠孤病毒中和抗体效价临界1:256时，维持接种1次，鸡皮下注射免疫抗原2.0ml/只。
收蛋，强化免疫后14～21日，抽样检测高免鸡蛋卵黄中鸭呼肠孤病毒中和抗体效价≥1:256为合格，收集高免鸡蛋，于湿度30～60％、温度10～15℃条件下储存，应不超过7日。
具体的，鸭呼肠孤病毒精制卵黄抗体制造过程如下，
消毒，将蛋壳有粪污的高免鸡蛋单独挑出，用纯化水清洗干净，连同蛋壳洁净的高免鸡蛋一起摆入洁净的塑料蛋托，高免鸡蛋浸入40℃的0.1％苯扎溴铵水溶液中15min，而后在95℃纯化水中浸泡5s。
分离卵黄，手工或机械打蛋，除去蛋清、胚盘和系带，收集卵黄。
稀释，卵黄转入夹层反应罐中，搅拌呈膏状，加入与卵黄体积相等的注射用水(25℃左右)，搅拌均匀。
酸化，加入7倍于卵黄体积的酸化水(用醋酸-醋酸钠缓冲液调pH值至5.2的注射用水)，搅拌均匀后降温至4℃，静置至少12小时。
萃取，吸取上清液，转入搅拌罐中，加入终浓度为1.0％的辛酸，搅拌均匀，作用至少5小时，此时上层为卵黄固态物、下层为澄清的抗体液。
抗体原液，收集约80～90％的下层抗体液，用孔径为1μm的筒式滤芯过滤，收集滤液；将罐内剩余物搅拌均匀，用连续管式离心机离心，收集离心液，合并滤液和离心液。
过滤，抗体原液用1～2M的氢氧化钠溶液调节pH值为5.50～7.50，用孔径为0.45μm的筒式滤芯过滤澄清，用孔径为0.22μm筒式滤芯过滤除菌。
浓缩，根据高免鸡蛋的鸭呼肠孤病毒中和抗体效价，滤液用截留分子量为50KD的中空纤维超滤器进行适当倍数的浓缩，预计使浓缩液的鸭呼肠孤病毒中和抗体效价≥1:128。
灭活、分装，浓缩液加入终浓度为0.05％的甲醛溶液(含量：HCHO为37.0～40.0％)，搅拌均匀，用孔径为0.22μm筒式滤芯过滤除菌、分装、轧盖，于2～8℃保存。
进一步的，所述油相制备的操作步骤如下：取94份注射用白油，加入2份硬脂酸铝，边加边搅拌，加热直至完全透明，再加入6份司本-80，充分混匀，115℃高压灭菌30min，冷却至室温，备用。
进一步的，所述注射用水的体积和卵黄体积相等，加入所述酸化水的体积为所述卵黄体积的7倍。
具体的，稀释，卵黄转入夹层反应罐中，搅拌呈膏状，加入与卵黄体积相等的注射用水(25℃左右)，搅拌均匀，酸化，加入7倍于卵黄体积的酸化水(用醋酸-醋酸钠缓冲液调pH值至5.2的注射用水)，搅拌均匀后降温至4℃，静置至少12小时。
具体的，成品检验操作如下，
性状、外观，无色至微黄色澄明液体，久置可有少许白色沉淀。
pH值，按现行《中国兽药典》三部附录3101检验，应为5.50～7.50。
装量，按现行《中国兽药典》三部附录3104检验，应符合规定。
无菌检验，按现行《中国兽药典》三部附录3306检验，应无菌生长。
支原体检验，按现行《中国兽药典》三部附录3308检验，应无支原体生长。，
外源病毒检验，取抗体3～5瓶转入灭菌容器内，再加入10倍于抗体体积的灭菌生理盐水，用截留分子量为6KD的中空纤维超滤器(中空纤维超滤器处理、使用方法见附注6)浓缩至原抗体体积(±5ml)，取样30ml用孔径为0.22μm的针孔过滤器过滤，收集滤液，分装，于2～8℃保存作为检品。检品取样按现行《中国兽药典》三部附录3306检验，应无菌生长。无菌检验合格的检品按现行《中华人民共和国兽药典》三部附录3305检验，其中鸡胚检查法改为SPF鸭胚检查法，细胞检查法中的鸡胚成纤维细胞改为SPF鸭胚成纤维细胞，应无外源病毒污染。
安全检验，用1日龄健康易感雏鸭10只，每只皮下注射抗体2.0ml；用体重18～22g清洁级小白鼠5只，每只皮下注射抗体0.5ml。连续观察14日，雏鸭和小白鼠均应全部健活。
效力检验，下列方法任选其一。
中和抗体效价测定，抗体用灭菌生理盐水2倍比稀释，取1:64、1:128和1:256稀释度分别与等量鸭呼肠孤病毒JS株(100ELD50/0.1ml)混合，置37℃中和1小时，每个稀释度经尿囊腔接种11日龄SPF鸭胚5枚，每胚0.2ml；设病毒对照SPF鸭胚5枚，每胚经尿囊腔接种同条件处理的鸭呼肠孤病毒JS株(100ELD50/0.1ml)与灭菌生理盐水等量混合液0.2ml；空白对照SPF鸭胚5枚，每胚经尿囊腔接种灭菌生理盐水0.2ml。鸭胚用蜡封孔，于37℃静置孵化，观察至120小时，记录每组鸭胚死亡情况。24小时前死亡鸭胚弃去不计，24～120小时死亡鸭胚随时取出，计算抗体的半数保护量(PD50)。病毒对照鸭胚应全部死亡，空白对照鸭胚应全部健活，能使50％鸭胚保护的最高稀释倍数即为抗体的中和效价。中和抗体效价应不低于1:128。
雏鸭效检，1日龄健康易感雏鸭30只，随机分成3组，每组10只，分别隔离饲养。第1组为健康对照组，不注射任何药品；第2组为接种抗体组，皮下注射抗体0.5ml/只；第3组为生理盐水对照组，皮下注射生理盐水0.5ml/只。注射抗体后24小时，第2组和第3组雏鸭各肌肉注射检验用强毒鸭呼肠孤病毒JS株(用生理盐水10倍稀释)1.0ml/只，连续观察5日。第1组鸭观察期结束后全部扑杀，检查肝脏和脾脏均应无异常；第2组鸭观察期结束后全部扑杀，检查肝脏和脾脏，至少有8只均无鸭呼肠孤病毒感染导致的肝脏或脾脏坏死症状；第3组鸭观察期结束后扑杀，检查肝脏和脾脏，至少8只有鸭呼肠孤病毒感染导致的肝脏或脾脏坏死症状。
辛酸残留，按附注7测定，待检样品A440－卵黄氯仿提取液A440＜0.1％辛酸溶液A440，判为合格。
甲醛残留，按现行《中国兽药典》三部附录3203检测，应不超过0.20％甲醛溶液(含40％甲醛)量。
本发明的作用与用途：用于鸭呼肠孤病毒感染导致的鸭“肝脾坏死症”预防和早期治疗。
用法用量：皮下或肌肉注射。用于预防：1～3日龄雏鸭，每只0.5ml；4日龄及以上雏鸭，每只1.0ml。用于治疗：5日龄以下雏鸭1ml/只，6日龄及以上雏鸭1.5ml/只。
注意事项如下：本品一次注射被动免疫保护期为5日，本品久置瓶底可有少许白色沉淀，不影响效果，用过的器具和包材应无害化处理。
规格：(1)100ml/瓶，(2)250ml/瓶，(3)500ml/瓶。，
贮藏与有效期：2～8℃保存，有效期为12个月。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种鸭呼肠孤病毒精制卵黄抗体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤S1，按照毒种标准生产和挑选毒种；
步骤S2，将毒种进行稀释后接种，经过检验后后提取抗原；
步骤S3，将抗原检验后，经过浓缩、油相制备和水相制备后变成免疫抗原，免疫抗原经过检验合格后，将免疫抗原注射给合格的蛋鸡；
步骤S4，将蛋鸡产的鸡蛋经过消毒、分离卵黄、稀释、酸化和萃取后提取抗体原液；
步骤S5，将抗体原液进行过滤、浓缩、灭活、分装后获得精制卵黄抗体；
步骤S6，将精制卵黄抗体的性状和装量检验合格后，对精制卵黄抗体的性状和装量检验，然后对精制卵黄抗体进行无菌检验、支原体检验、外源病毒检验和安全检验合格后，进行效力检验，检验合格后获得合格的鸭呼肠孤病毒精制卵黄抗体。
2.如权利要求1所述的一种鸭呼肠孤病毒精制卵黄抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中生产和检验用毒种均为鸭呼肠孤病毒JS株。
3.如权利要求1所述的一种鸭呼肠孤病毒精制卵黄抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤S2的具体操作步骤如下：将毒种用灭菌生理盐水进行稀释，然后将稀释后的毒中接种到鸭胚中，鸭胚用碘酊消毒蛋壳表面气室部，无菌操作除去气室部蛋壳，收获胚液，置于灭菌容器内，标记，即为抗原。
4.如权利要求1所述的一种鸭呼肠孤病毒精制卵黄抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤S3的具体操作步骤如下：将检验合格的抗原后进行解冻，然后将抗体原液进行灭活，灭活的浓缩抗原接种SPF鸭胚中，通过油相制备的方法制得灭菌的吐温-80备用，然后将灭菌的吐温-80和灭活的浓缩抗原进行水相制备，将乳化后的原液标记为免疫抗原，免疫抗原经过检验后，注射到合格的产蛋鸡中。
5.如权利要求1所述的一种鸭呼肠孤病毒精制卵黄抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤S4的具体操作步骤如下：将蛋壳有粪污的高免鸡蛋单独挑出，用纯化水清洗干净，连同蛋壳洁净的高免鸡蛋一起摆入洁净的塑料蛋托，然后手工或机械打蛋，除去蛋清、胚盘和系带，收集卵黄，将卵黄转入夹层反应罐中，搅拌呈膏状，加入注射用水，搅拌均匀，加入酸化水，搅拌均匀后降温至4℃，静置至少12小时，吸取上清液，转入搅拌罐中，加入终浓度为1.0％的辛酸，搅拌均匀，作用至少5小时，此时上层为卵黄固态物、下层为澄清的抗体液，收集约80～90％的下层抗体液，用孔径为1μm的筒式滤芯过滤，收集滤液；将罐内剩余物搅拌均匀，用连续管式离心机离心，收集离心液，合并滤液和离心液。
6.如权利要求1所述的一种鸭呼肠孤病毒精制卵黄抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤S5的具体操作步骤如下：将抗体原液用1～2M的氢氧化钠溶液调节pH值为5.50～7.50，用孔径为0.45μm的筒式滤芯过滤澄清，用孔径为0.22μm筒式滤芯过滤除菌，根据高免鸡蛋的鸭呼肠孤病毒中和抗体效价，滤液用截留分子量为50KD的中空纤维超滤器进行适当倍数的浓缩，预计使浓缩液的鸭呼肠孤病毒中和抗体效价≥1:128，浓缩液加入终浓度为0.05％的甲醛溶液，搅拌均匀，用孔径为0.22μm筒式滤芯过滤除菌、分装、轧盖，于2～8℃保存，进而获得精制卵黄抗体。
7.如权利要求1所述的一种鸭呼肠孤病毒精制卵黄抗体的制备方法，其特征在于：所述油相制备的操作步骤如下：取94份注射用白油，加入2份硬脂酸铝，边加边搅拌，加热直至完全透明，再加入6份司本-80，充分混匀，115℃高压灭菌30min，冷却至室温，备用。
8.如权利要求5所述的一种鸭呼肠孤病毒精制卵黄抗体的制备方法，其特征在于：所述注射用水的体积和卵黄体积相等，加入所述酸化水的体积为所述卵黄体积的7倍。
9.如权利要求4所述的一种鸭呼肠孤病毒精制卵黄抗体的制备方法，其特征在于：所述水相制备的具体操作步骤如下：灭活的浓缩抗原96份加入4份灭菌的吐温-80，充分振摇后使吐温-80完全溶解。
10.如权利要求4所述的一种鸭呼肠孤病毒精制卵黄抗体的制备方法，其特征在于：在接种过程中选取的鸭胚为发育良好的11日龄易感鸭胚。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110590946A (zh) * 2019-08-29 2019-12-20 广东渔跃生物技术有限公司 一种鸭呼肠孤病毒卵黄抗体的制备方法
CN110627899A (zh) * 2019-10-09 2019-12-31 山东天牧生物科技有限公司 一种呼肠孤病毒和细小病毒卵黄抗体锭及其制备方法
CN111320689A (zh) * 2020-01-09 2020-06-23 广州渔跃生物技术有限公司 一种鸭呼肠孤病毒、鸭细小病毒和鸭星状病毒三价卵黄抗体的制备方法
CN111440815A (zh) * 2020-03-12 2020-07-24 潍坊华英生物科技有限公司 一种新型鸭呼肠孤病毒的复合疫苗及卵黄抗体制备方法
CN112080477A (zh) * 2020-05-09 2020-12-15 重庆三杰众鑫生物工程有限公司 鸭呼肠孤病毒及其抗原抗体复合物的制备方法和应用
CN112608382A (zh) * 2020-12-28 2021-04-06 哈药集团生物疫苗有限公司 鸭呼肠孤病毒病、鸭病毒性肝炎二联卵黄抗体及其制备方法
CN113493507A (zh) * 2020-12-31 2021-10-12 哈药集团生物疫苗有限公司 新型鸭呼肠弧病毒卵黄抗体及其制备方法和应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000295986A (ja) * 1999-01-29 2000-10-24 Akzo Nobel Nv トリレオウイルスの新規抗原クラス
CN1927884A (zh) * 2005-09-09 2007-03-14 重庆永健生物技术有限责任公司 防治鸭病毒性肝炎的异源蛋黄抗体的制备方法
CN102492661A (zh) * 2011-12-29 2012-06-13 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 防治新型鸭呼肠孤病毒病免疫制剂的制备方法及应用
CN103833848A (zh) * 2014-03-07 2014-06-04 青岛易邦生物工程有限公司 一种用于预防治疗番鸭细小病毒病的卵黄抗体
CN105950564A (zh) * 2016-05-03 2016-09-21 重庆三杰众鑫生物工程有限公司 番鸭肝炎病毒及应用该病毒制备番鸭肝炎病毒精制卵黄抗体的方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000295986A (ja) * 1999-01-29 2000-10-24 Akzo Nobel Nv トリレオウイルスの新規抗原クラス
CN1927884A (zh) * 2005-09-09 2007-03-14 重庆永健生物技术有限责任公司 防治鸭病毒性肝炎的异源蛋黄抗体的制备方法
CN102492661A (zh) * 2011-12-29 2012-06-13 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 防治新型鸭呼肠孤病毒病免疫制剂的制备方法及应用
CN103833848A (zh) * 2014-03-07 2014-06-04 青岛易邦生物工程有限公司 一种用于预防治疗番鸭细小病毒病的卵黄抗体
CN105950564A (zh) * 2016-05-03 2016-09-21 重庆三杰众鑫生物工程有限公司 番鸭肝炎病毒及应用该病毒制备番鸭肝炎病毒精制卵黄抗体的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
5M EDITOR: "Major Viral Diseases of Waterfowl and Their Control", 《THE POULTRY SITE》 *
范领斌等: "雏番鸭呼肠孤病毒病的诊治", 《水禽世界》 *

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110590946A (zh) * 2019-08-29 2019-12-20 广东渔跃生物技术有限公司 一种鸭呼肠孤病毒卵黄抗体的制备方法
CN110627899A (zh) * 2019-10-09 2019-12-31 山东天牧生物科技有限公司 一种呼肠孤病毒和细小病毒卵黄抗体锭及其制备方法
CN111320689A (zh) * 2020-01-09 2020-06-23 广州渔跃生物技术有限公司 一种鸭呼肠孤病毒、鸭细小病毒和鸭星状病毒三价卵黄抗体的制备方法
CN111440815A (zh) * 2020-03-12 2020-07-24 潍坊华英生物科技有限公司 一种新型鸭呼肠孤病毒的复合疫苗及卵黄抗体制备方法
CN111440815B (zh) * 2020-03-12 2022-12-16 潍坊华英生物科技有限公司 一种新型鸭呼肠孤病毒的复合疫苗及卵黄抗体制备方法
CN112080477A (zh) * 2020-05-09 2020-12-15 重庆三杰众鑫生物工程有限公司 鸭呼肠孤病毒及其抗原抗体复合物的制备方法和应用
CN112080477B (zh) * 2020-05-09 2023-05-16 重庆三杰众鑫生物工程有限公司 鸭呼肠孤病毒及其抗原抗体复合物的制备方法和应用
CN112608382A (zh) * 2020-12-28 2021-04-06 哈药集团生物疫苗有限公司 鸭呼肠孤病毒病、鸭病毒性肝炎二联卵黄抗体及其制备方法
CN112608382B (zh) * 2020-12-28 2023-08-18 哈药集团生物疫苗有限公司 鸭呼肠孤病毒病、鸭病毒性肝炎二联卵黄抗体及其制备方法
CN113493507A (zh) * 2020-12-31 2021-10-12 哈药集团生物疫苗有限公司 新型鸭呼肠弧病毒卵黄抗体及其制备方法和应用
CN113493507B (zh) * 2020-12-31 2023-04-21 哈药集团生物疫苗有限公司 新型鸭呼肠孤病毒卵黄抗体及其制备方法和应用

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