CN112080477A - 鸭呼肠孤病毒及其抗原抗体复合物的制备方法和应用 - Google Patents

鸭呼肠孤病毒及其抗原抗体复合物的制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种鸭呼肠孤病毒SL株，保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No:V201970，以解决现有技术中的中兽药对鸭呼肠孤病毒的预防、治疗无明显效果的技术问题。鸭呼肠孤病毒抗原抗体复合物的使用能解决临床鸭呼肠孤病毒的防控难题，带动养殖户增收，为我国鸭养殖业健康发展保驾护航，具有显著的经济效益和社会效益。

Description

鸭呼肠孤病毒及其抗原抗体复合物的制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种鸭呼肠孤病毒及其抗原抗体复合物的制备方法和应用。
背景技术
2014年以来，在我国鸭养殖业中流行一种临床发病症状为精神沉郁，缩颈垂翅，脚软无力、喜蹲伏，腹泻排出白色或绿色稀便；死亡鸭病理变化主要为肝脏、脾脏有坏死灶的疾病，临床称为鸭“肝脾坏死症”，病原经确诊为鸭呼肠孤病毒。
自然临床疾病发生于鸭、鹅、番鸭和半番鸭[1]，麻鸭、鹅、番鸭和半番鸭的易感性相当，但樱桃谷鸭、北京鸭等肉用型鸭的易感性更高，如樱桃谷鸭和北京鸭一旦感染鸭呼肠孤病毒， 1周龄以内鸭发病率为50％以上，全群死亡率10％左右，1-2周龄鸭的发病率30％左右，死亡率5％左右，3-4周龄鸭发病率和死亡率分别低于30％和5％，4周龄以上鸭零散发病和死亡，耐过鸭发育不良，整齐度差，料肉比高[2]，2016年以来该病在国内主要鸭养殖区呈爆发流行趋势，给我国鸭养殖业造成了巨大经济损失，如重庆三杰众鑫生物工程有限公司研究人员 2018年7月通过对安徽某鸭业集团有限公司和江苏某集团有限公司的商品樱桃谷鸭养殖场的鸭“肝脾坏死症”流行病学调查统计发现，上述两个鸭养殖集团2018年上半年共计孵化樱桃谷雏鸭约3.76亿只，发生“肝脾坏死症”死亡鸭高达约1362.7万只，平均死亡率3.62％。
有研究表明[3]中药多糖对呼肠孤病毒有一定的预防效果，如与同居感染对照组番鸭死亡率24％比较，猴头菇多糖预防组和黄芪多糖预防组的番鸭发病死亡率分别为12％和4％，且番鸭的发病临床症状较缓和，剖检病变轻，尤为试验后期。
在2018年1-6月，上述两个养殖集团使用有正规批文的中兽药如“清瘟解毒口服液”、“鱼腥草芩蓝口服液”、“公英青蓝合剂”、“双黄连口服液”等在上批次养殖过程中发生过“肝脾坏死症”的16个商品鸭养殖场进行预防或治疗“鸭肝脾坏死症”试验，其中用于预防的试验场12个，用于治疗的试验场4个。预防方法：因该病的潜伏期为3-5日，高发日龄为6-10日龄，故在雏鸭1日龄开始，在饮水中按说明书中的用法用量添加中药至10日龄，与同批次不用中药预防的对照组比较，雏鸭的发病日龄、发病率和死亡率与均差异不显著(P>0.05)；治疗方法：在雏鸭出现临床症状后即按说明书中的用法用量进行治疗，连用 5日，疗程结束后再观察5日，而后统计全群死亡率，以该场上批次发生“肝脾坏死症”的同期死亡率为对照，结果显示用上述农业部批准生产的中兽药预防、治疗鸭呼肠孤病毒的效果差异不显著(P>0.05)。结论：的预防和治疗基本无效。
肝脏的主要功能是分泌胆汁、储藏糖原，调节蛋白质、脂肪和碳水化合物的新陈代谢等，还有解毒、造血和凝血作用；脾脏是最大的免疫器官和血液过滤器官，对调节机体免疫反应起到重要作用。中草药的防治疾病作用[4]主要依靠调动动物体内非特异性抗菌抗病毒积极因素如细胞吞噬、抗体、细胞因子、自然杀伤性细胞等来增强免疫功能而实现的。
导致某些中兽药对鸭呼肠孤病毒的预防治疗效果不明显的主要原因可能与该病毒的作用靶器官为肝脏和脾脏，病毒感染导致肝脏细胞变性坏死，肝细胞体积增加、细胞核固缩，细胞内充满空泡性变性，肝广泛性出血，肝窦间隙增大，淋巴细胞浸润和脾脏脾小体中央动脉扩张，脾小体和动脉周围淋巴组织鞘界限不清，结构疏松，巨噬细胞增多，脾出血充血严重有关[5]。病毒感染导致鸭主要免疫调节器官-肝脾坏死，进而影响机体代谢和免疫功能，导致某些中兽药这种间接抗病毒作用无法发挥。
鉴于农业部已禁止抗病毒西药如金刚烷胺、利巴韦林、病毒灵等在畜禽上的使用[6]和大多数的中兽药对鸭呼肠孤病毒的预防、治疗无明显效果，根据病毒病的有效预防方法为接种疫苗和特异性抗体、治疗的方法为紧急注射特异性抗体的已知手段，减少鸭呼肠孤病毒造成的损失应以预防为主，从而避免发病后因鸭死亡造成的直接经济损失和治疗用药成本、后续因疾病感染而导致的耐过鸭发育不良，整齐度差，料肉比高的间接损失，故研制一种能有效预防鸭呼肠孤病毒的疫苗或预防、治疗鸭呼肠孤病毒的特异性卵黄抗体迫在眉睫。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鸭呼肠孤病毒及其抗原抗体复合物的制备方法和应用，以解决现有技术中的中兽药对鸭呼肠孤病毒的预防、治疗无明显效果的技术问题。本发明提供的诸多技术方案中的优选技术方案所能产生的诸多技术效果详见下文阐述。
为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
一种鸭呼肠孤病毒SL株，该鸭呼肠孤病毒SL株的部分基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.1 所示，与Genbank上其他鸭呼肠孤病毒比较，基因序列同源性为89.97％-94.53％，处于一个独立的进化分支，为新毒株，该毒株免疫原性良好，保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No:V201970。
本发明的第二目的是提供一种鸭呼肠孤病毒SL株的鸭呼肠孤病毒抗原抗体复合物，其制备方法包括下述步骤：
A、将权利要求1中所述的鸭呼肠孤病毒SL株进行病毒繁殖，制备抗原，具体步骤为：
A1、接种：将权利要求1中所述的鸭呼肠孤病毒SL株用灭菌生理盐水1000倍稀释，按每胚0.2mL经尿囊腔接种11日龄易感鸭胚，然后用蜡封孔，于37～37.3℃静置孵育；
A2、孵育和观察：观察步骤①中进行静置孵育的鸭胚，弃去48h内死亡鸭胚，收集48～ 120h死亡鸭胚，然后于4℃冷却6～12h；
A3、收获：对步骤②中冷却鸭胚的用75％的酒精对蛋壳进行消毒，并用碘酊再次对蛋壳表面气室部消毒，无菌操作除去气室部蛋壳，收获胚液，置于灭菌容器内，标记，即为抗原，置-20℃保存；
其中，抗原的病毒含量≥10-5.0ELD50/0.2mL。
B、将步骤A中制备的抗原制备鸭呼肠孤病毒精制卵黄抗体，步骤包括：
B1、抗原浓缩与灭活：抗原于2～8℃条件下解冻、混合批组，加入终浓度为4.8％(V/V) 氯仿，振摇10min，于4℃条件下4000r/min离心30min，取上清液用截留分子量为6KD的中空纤维超滤柱浓缩5倍，浓缩液加入终浓度为0.2％(V/V)的甲醛溶液，置37～37.5℃温箱中灭活24h，其间4～6h振摇1次，每次3分钟，于2～4℃保存；
B2、免疫抗原的制备：油相制备，取94份注射用白油，加入2份硬脂酸铝，边加边搅拌，加热直至完全透明，再加入6份司本-80，充分混匀，121℃高压灭菌30min，冷却至室温；水相制备，灭活抗原96份加入4份灭菌的吐温-80，充分振摇后使吐温-80完全溶解；乳化、油相与水相按体积比2:1的比例初步混合、振摇3～5分钟，加入均质机料斗，调节压力为34～37MPa进行乳化，检验合格以后分装标记，于2～8℃保存；
B3、高免鸡蛋生产：产蛋鸡按基础免疫、加强免疫、强化免疫、维持免疫，强化免疫后 7日，抽样取蛋检测鸭呼肠孤病毒卵黄中和抗体效价≥1:512为合格，收集鸡蛋，于湿度30～ 60％、温度10～15℃条件下避光储存；
B4、鸭呼肠孤病毒精制卵黄抗体制造：将蛋壳有粪污的高免鸡蛋单独挑出，用自来水清洗干净，与蛋壳洁净的高免鸡蛋一起摆入塑料蛋盘中，浸入40℃的0.1％苯扎溴铵水溶液中 15min，而后在95℃自来水中浸泡5s；手工或机械打蛋，除去蛋清、胚盘和系带，收集卵黄；卵黄转入反应罐中，搅拌呈膏状，加入与卵黄等体积的注射用水25℃搅拌均匀；加入7倍于原卵黄体积的酸化水搅拌均匀，降温至2～4℃，静置12～15h；吸取上清液，转入搅拌罐中，加入终浓度为1.0％(V/V)的辛酸，搅拌均匀，20～25℃条件下作用4～6h；收集80～90％下层液，用孔径为1μm的筒式滤芯粗滤，收集滤液，将罐内剩余物搅拌均匀，用连续管式离心机离心，收集离心液，合并滤液和离心液；用1～2M氢氧化钠溶液调节pH值为5.5～7.5，用孔径为0.45μm的筒式滤芯过滤澄清，用孔径为0.22μm筒式滤芯过滤除菌；根据高免鸡蛋的鸭呼肠孤病毒卵黄中和抗体效价和卵黄稀释倍数，滤液用截留分子量为30KD的中空纤维超滤器进行适当倍数的浓缩，预期使鸭呼肠孤病毒中和抗体效价≥1:512；加入终浓度为0.05％的甲醛溶液搅拌均匀，20～25℃下灭活24h，即为抗体半成品，而后于2-8℃保存备用；
C1、蜂胶制备：市售食品级优质蜂胶粉，按1kg蜂胶粉加入2L分析纯级别酒精，用灭菌容器承装、密封，室温条件下放置2周，每天摇匀1次，每次5分钟，取上清于4℃条件下4000r/min离心30分钟，取上清液分装、标记品名和制备时间，于4℃保存备用；
C2、配苗：按蜂胶比灭菌生理盐水体积比1:4的比例混合，即为蜂胶佐剂。2.1.1中的浓缩灭活抗原与蜂胶佐剂按体积比1：4混合，充分摇匀，即为鸭呼肠孤蜂胶佐剂抗原，于2-8℃保存，备用；
D、以步骤B中制备的鸭呼肠孤病毒精制卵黄抗体和步骤C中制备的鸭呼肠孤病毒蜂胶佐剂抗原按1:1比例混合均匀，即得鸭呼肠孤病毒抗原抗体复合物成品。
本发明第三目的是提供一种鸭呼肠孤病毒SL株在治疗或预防鸭呼肠孤病毒中的应用，在雏鸭1日龄时，皮下或肌内按0.5mL/只进行注射。
基于上述技术方案，本发明实施例至少可以产生如下技术效果：
(1)既含有鸭呼肠孤病毒抗原，又含有鸭呼肠孤病毒卵黄抗体，兼具疫苗和卵黄抗体特点，既能预防又能治疗鸭呼肠孤病毒。
(2)蜂胶[7]能增强动物机体的非特异性免疫，已作为疫苗免疫佐剂[8]广泛使用，优化的蜂胶含量使抗原抗体复合物激发鸭特异性免疫反应好，无应激。
(3)优化的用法用量可有效保护肉鸭整个生长周期(一般肉鸭生长周期为42日)，如雏鸭在1日龄时皮下或肌内注射0.5mL/只，含有的鸭呼肠孤病毒卵黄抗体能特异性中和鸭体内垂直传播或后天感染而来的鸭呼肠孤病毒，卵黄抗体预防的有效期为6-7日；含有的鸭呼肠孤病毒抗原可刺激机体产生保护性抗体，鸭呼肠孤病毒抗原抗体复合物注射接种1次，预防保护期60日。
(4)预防鸭呼肠孤病毒效果良好，鸭呼肠孤病毒抗原抗体复合物在实验室条件下预防保护率100％，临床条件下预防保护率大于98％。与预防组健活鸭的肝脏和脾脏组织切片比较，攻毒对照组死亡鸭肝脏和脾脏组织切片病变明细(图11和图12)。
(5)鸭呼肠孤病毒抗原抗体复合物的使用能解决临床鸭呼肠孤病毒的防控难题，带动养殖户增收，为我国鸭养殖业健康发展保驾护航，具有显著的经济效益和社会效益。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1、本发明鸭呼肠孤病毒SL株PCR扩增结果图，M为DNA Marker DL2000，1泳道为引物1的PCR产物(320bp)，2泳道为引物2的PCR产物(380bp)；
图2、鸭胚体病理变化比较图。与健康对照鸭胚体比较(左)，死亡鸭胚体有点状出血斑(右)；
图3、死亡鸭胚体肝脏的病理变化图(肝脏有坏死灶(1.5倍放大拍摄))
图4、死亡鸭胚体脾脏的病理变化图(脾脏有坏死灶(2倍放大拍摄))
图5、SPF鸡胚检测法中胚液HA试验图；胚液对1％鸡红细胞均无血凝性，图中AS：尿囊腔接种胚液；CAM：绒毛尿囊膜接种胚液；1:2-1:256为胚液稀释倍数；ND对照为鸡新城疫LoSta株阳性对照；
图6、接种病毒组死亡鸭肝脏有坏死灶病理变化图；
图7、接种病毒组死亡鸭脾脏有坏死灶病理变化图；
图8、接种病毒组存活鸭病理变化对比图，左图：肝脏一般无坏死灶；中图和右图：脾脏稍微肿大，有坏死灶；
图9、健康对照组鸭肝脏图，图中肝脏正常，无病理变化；
图10、健康对照组鸭脾脏图，图中脾脏正常，无病理变化；
图11、鸭肝脏组织切片图。预防组健活鸭肝脏正常，肝细胞体积大，胞质丰富，胞内含有块状的嗜碱性物质，胞核大且明显，肝索排列正常，血窦内可见内皮细胞和肝巨噬细胞(A)；病毒对照组死亡鸭肝脏肝细胞正常结构模糊不清，少数肝细胞有明显的细胞形态，但肝细胞核固缩，肝广泛性出血，肝索基本消失，肝窦间隙扩大，窦间大量淋巴细胞浸润(B)。
图12、鸭脾脏脏组织切片图。预防组健活鸭脾脏正常，脾白髓结构清晰，脾小体结构清晰，可见扁平的中央动脉，脾小体和动脉周围淋巴组织鞘界限清楚，结构致密，内含丰富的淋巴细胞团，少量的巨噬细胞。脾红髓可见致密的脾索，脾窦内充满红细胞(A)；病毒对照组死亡鸭脾白髓中脾小体中央动脉扩大，脾小体和动脉周围淋巴组织鞘界界限不清，结构疏松，几乎无淋巴细胞，可见多量的巨噬细胞，且被大量红染类似结缔组织充盈，脾红髓的脾索不明显，脾窦增宽，内有少量的红细胞(B)。
图13、本发明中鸭呼肠孤病毒SL株核苷酸序列Blast比对结果图。该毒株与Genbank 上其他23株鸭呼肠孤病毒比较，同源性为89.97％-94.53％；
图14、本发明中鸭呼肠孤病毒SL株核苷酸序列系统进化树图。该毒株与Genbank上其他37株鸭呼肠孤病毒比较，该毒株处于一个单独的进化分支(Query 52363)。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
实施例1在实验室条件下预防鸭呼肠孤病毒效果
1.1试验地点和联系人
具体见表1。
表1呼肠孤病毒抗原抗体复合物实验室条件下试验场所信息
Figure RE-GDA0002762374000000061
1.2试验方案
健康雏鸭来源：由安徽强英鸭业集团有限公司某樱桃谷父母代种鸭场提供种蛋，由重庆三杰众鑫生物工程有限公司按鸭孵化程序孵化出雏，选择健康雏鸭用于试验。健康雏鸭特点：按时出壳，腹部柔软、脐部吸收良好、肛门清洁，绒毛粗、干燥有光泽，叫声洪亮、行动活泼、反应灵敏，初生体重符合该品种要求，无生理缺陷。
1日龄健康樱桃谷雏鸭60只，随机分为3组，20只/组，一组为预防组，二组为攻毒对照组，三组为健康对照组，上述三组鸭分别隔离饲养在免疫动物舍内、攻毒动物舍内和健康动物舍内，各组均按樱桃谷鸭饲养管理要求饲养，饲养条件一致。
预防组鸭在1日龄时皮下注射鸭呼肠孤病毒抗原抗体复合物接种0.5mL/只，攻毒对照组和健康对照组鸭皮下注射生理盐水0.5mL/只，接种后24h，预防组和攻毒对照组鸭肌内注射检验用毒种鸭呼肠孤病毒SL株1mL(含100ID50)/只，健康对照组鸭肌内注射生理盐水1mL/ 只，观察至35日，记录各组鸭的发病和死亡情况，观察期结束后统计各组鸭的成活率、料肉比和平均体重等。
1.3结果
观察期结束，各组鸭的统计结果见表2。
表2呼肠孤病毒抗原抗体复合物实验室条件下的预防效果统计
Figure RE-GDA0002762374000000062
Figure RE-GDA0002762374000000071
注：料肉比以该组鸭消耗饲料量(kg)除以该组存活鸭体重(kg)计算；平均体重以该组鸭总体重除以鸭的数量计算；鸭发病判定标准：精神沉郁，脚软、蹲伏、不喜运动，拉白色或绿色稀便，有上述症状中的两种及以上判定为发病。
1.4结论
预防组鸭和健康对照组鸭的存活率均为100％，组间料肉比和平均体重差异不显著 (P>0.05)；攻毒组鸭存活率为75％，与预防组和健康对照组鸭比较，组间料肉比差异及其显著(P<0.01)，平均体重差异显著(P<0.05)。
按农业部公告第683号[8]附件七：《兽用生物制品实验室效力试验技术指导原则》要求制品使动物获得较好保护率(通常应达到80％-100％)，呼肠孤病毒抗原抗体复合物在实验室条件下预防鸭呼肠孤病毒效果良好。
实施例2在临床条件下预防鸭呼肠孤病毒效果
2.1临床试验地点和联系人
具体见表3。
表3呼肠孤病毒抗原抗体复合物临床实际应用场所信息
Figure RE-GDA0002762374000000072
2.2试验方案
在隆昌县畜禽康兽药商贸有限公司的客户养殖场5个，用鸭呼肠孤病毒抗原抗体复合物进行临床预防鸭呼肠孤病毒试验，上述5个养殖场均在上批次饲养鸭过程中发生呼肠孤病毒感染导致的鸭“肝脾坏死症”。各养殖场在进雏鸭前3天由重庆三杰众鑫生物工程有限公司技术人员指导育雏舍和成鸭舍消毒，而后才购进雏鸭开始饲养、试验。
此次试验用鸭品种为花边鸭，花边鸭是四川、重庆地区养殖量最大的肉鸭品种，在每个养殖场将同一批次雏鸭分为预防组和对照组，预防组鸭和对照组鸭均按花边鸭的饲养管理要求饲养，饲料、饮水和养殖环境均相同，具体试验方案如下：
(1)鸭病毒性肝炎预防注射：鉴于在四川隆昌地区临床养殖中血清1型和3型鸭病毒性肝炎有一定发病率，雏鸭一旦感染后死亡率可达80％以上，故在开始试验前，每个试验场均在雏鸭1日龄时腿部肌肉注射有国家正规生产批文的鸭病毒性肝炎二价(血清1+3型)精制卵黄抗体，抗体注射剂量按说明书要求执行。
(2)2日龄雏鸭随机分为2组，一组为为预防组，颈部皮下注射鸭呼肠孤病毒抗原抗体复合物0.5mL/只；二组为对照组，不做任何处理。两组鸭在相同的饲养管理条件下按花边鸭的饲养管理程序饲养，观察至35日龄，统计各组鸭发生“肝脾坏死症”的情况。具体各试验场鸭分组等情况见表4。
表4各试验场鸭分组及饲养管理情况
Figure RE-GDA0002762374000000081
注：鉴于隆昌地区在7月温度已达到32℃以上，故在7月份所进鸭雏的育雏时间改为12天。
2.3结果
在5个试验场地预防鸭“肝脾坏死症”的具体结果见表5。
表5鸭鸭呼肠孤病毒抗原抗体复合物预防鸭“肝脾坏死症”结果统计
Figure RE-GDA0002762374000000082
Figure RE-GDA0002762374000000091
2.4结论
在实际临床条件下，肉鸭养殖场的饲养管理条件、生物安全防控措施、气候条件等对病毒性疾病和细菌性疾病感染发病情况影响较大，饲养管理精细、经常进行场地消毒、环境温度适宜等及结合特异性预防用药品使用对提高肉鸭成活率至关重要。
在本试验的5家养殖场中，通过重庆三杰众鑫生物工程有限公司技术人员现场指导场地消毒、日常饲养管理精细化等，第3家养殖场的对照组未发生鸭肝脾坏死症，其他4家养殖场的对照组均发生了鸭肝脾坏死症，结果说明在鸭呼肠孤病毒污染场加强生物安全防控对预防该病毒有一定效果。
在对照组发生鸭肝脾坏死症的4家养殖场，其中的预防组有2家未发病，2家发病，但与对照组比较，预防组鸭发病后的死亡率极低，造成预防组有及其少量鸭发生肝脾坏死症死亡病例的原因可能与预防注射鸭呼肠孤病毒抗原抗体复合物过程中针头穿刺过鸭皮肤导致的漏液，进而接种剂量不足有关。观察至35日龄，鸭呼肠孤病毒抗原抗体复合物接种预防组的鸭成活率均大于98％，与对照组的成活率66.14％-84.13％比较，预防保护效果明显。
按农业部公告第683号[8]附件七：《兽用生物制品实验室效力试验技术指导原则》要求制品使动物获得较好保护率(通常应达到80％-100％)，呼肠孤病毒抗原抗体复合物在临床实际条件下预防鸭呼肠孤病毒效果良好。
应用实施例1
(一)鸭呼肠孤病毒鉴定
1病料来源
2016年01月03日，四川省隆昌县某商品肉鸭养殖场的7日龄花边鸭发生临床症状为精神沉郁，脚软、运动障碍，发育不良，死亡鸭主要病理变化为肝脏有轻微坏死灶和脾脏肿大、有严重坏死灶的疾病，该批次鸭2600余只，发病后5日共计死亡576只，死亡率为22.15％，死亡率明显高于其他文献报道的、发生肝脾坏死症后10％左右死亡率。
重庆三杰众鑫生物工程有限公司的赵光伟博士根据病理变化初步诊断为鸭呼肠孤病毒，取2只濒临死亡鸭，颈静脉放血、扑杀，无菌操作采集鸭肝脏、脾脏和胰腺，用采样袋承装，标记为隆昌鸭肝脾坏死症病料，病料放入泡沫盒、加冰袋冷藏保存，尽快带回实验室，于-76℃保存备用。
2病原检测
2.1引物设计
根据Genbank上鸭呼肠孤病毒(TH11株)基因序列(Genbank登录号:JX826587.1)，设计 2对引物，由深圳华大基因科技有限公司合成。
2.1.1引物1
具体序列如下，预期目的片段大小约为320bp。
F：5’-GCATGAACATGCCAGTTGAG-3’；
R：5'-AAGCCATAACGATGGCAGTC-3。
2.1.2引物2
具体序列如下，预期目的片段大小约为380bp。
F：5’-TGAGACGCCTGACTACGATT-3’
R：5’-ATGCTTGGAGTGAGACGACT-3’
2.2RT-PCR
在1.5mL离心管中加入200uL隆昌鸭肝脾坏死症的肝脏组织病料匀浆液，再加入800uL Trizol Reagent RNA(TAKARA公司产品)提取液，混匀，室温放置15min。加入200uL氯仿，振荡混匀，室温静置10min。4℃,12000r/min离心15rain，取上清500uL至经DEPC 处理的1.5mL离心管中。加入500uL预冷的异丙醇，-20℃放置20min后12000r/min离心10min，弃上清。加入1mL 75％无水乙醇，8000r/min离心5min，弃液体。倒置于纸上干燥，将沉淀悬于30uL的DEPC水中。
反转录采用TAKARA公司的反转录试剂盒PrimeScriptTM RT Master Mix(RR036Q)进行，反转录体系为10uL，其中提取的RNA3uL，RNase Free dH2O5uL，5×PrimeScriptRTMaster Mix 2uL，混匀后短暂离心进行反转录程序：37℃15min(反转录反应)85℃5sec(反转录酶的失活反应)，其产物为PCR反应的模板，-20℃保存。
采用50μL反应体系进行PCR扩增，反应体系如下：25μL rTaq DNA聚合酶混合物、 2μL上游引物、2μL下游引物、6μL DNA模板、加15μL ddH2O补足至50μL。用引物1的PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性40s，56℃退火40s，72℃延伸60s；共33个循环；72℃延伸5min；4℃保存。用引物2的PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸45s，共33个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
PCR反应结束后，分别取扩增产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳，而后在凝胶成像系统下观察，两对引物均扩增出来了与预期大小一致的目的条带(图1)。
2.3基因测序
切下泳道1的PCR产物胶块，用Agarose Gel DNA Purification Kit(TaKaRa)按说明书方法回收、纯化DNA，送深圳华大基因科技有限公司进行测序结果如下：
GCTTCAATTGCGTCGGCGCACCCCCGATCGGTCTCGGCTGTAACTCGTCGCTGGAGATCATAAATCGCAGGAGAC TGGGATGAAACGGTTGATGTAAGATTCGTTTGAGTGGACGTCTGCGACGAGACTTGGGAGGAGAGAGAGGATAGCTCGG ACCGGACATTGTCAAGATTAGTGATCGTAGTTCCAATCACTGAATTTACACGGACTACCTCATCAGTCACTGTGCCCCA CGGGAACTAAGTCCTGCCACCTGTGAGGTCAACAATTCAGTTGTTGATTGTACATCCGCCCCCGCCGACGTAATCCAAG TCAGGCGTCTCAA
2.4基因同源性比对及进化分析
将测序获得的序列在NCBI中进行Blast比对(图11)，同时与Genbank中注册的序列进行系统进化树的构建(图12)。结果显示所测序毒株(用Query-52363黄色高亮表示)与鸭呼肠孤病毒的同源性在86％-95％之间，证明该病毒确为鸭呼肠孤病毒。同时该毒株在系统进化树上处于单独一个分支，说明该病毒与以往报道的序列具有显著的差异，结合该病毒所引致临床疾病高死亡率的特点，说明该毒株已经发生变异，其毒力、致病机理等值的进一步深入研究，在后续的研究中把该病毒命名为鸭呼肠孤病毒SL株。
(二)鸭呼肠孤病毒SL株培养、鉴定
1病料处理
2016年01月19日，隆昌鸭肝脾坏死症病料称重，用灭菌生理盐水冲洗3次，用灭菌剪刀剪碎，在灭菌的、加有钢丝网的研钵上充分研磨，按病料：生理盐水质量体积比1:2的比例加入灭菌生理盐水，继续研磨匀浆，匀浆液用灭菌玻璃瓶承装，于-20℃和4℃反复冻融2次，于4℃条件下12000r/min离心30min，取上清用孔径为0.22μm的针孔滤芯(MILLEX GP)过滤除菌，收集滤液，分装，标记为鸭呼肠孤病毒SL株病料滤液，于-70℃及以下保存，同时取样，按现行《中国兽药典》进行无菌检验，应无菌生长。
2病毒培养
取鸭呼肠孤病毒SL株病料滤液，加入终浓度为4.8％的氯仿，剧烈震摇10min，于4℃条件下12000r/min离心30min，取上清用孔径为0.22μm的针孔滤芯(MILLEX GP)过滤除菌，收集滤液，接种11日龄SPF鸭胚(SPF鸭种蛋购自中国农科院哈尔滨兽医研究所，由重庆三杰众鑫生物工程有限公司按鸭孵化程序孵化，取发育良好鸭胚用于接种，发育良好鸭胚特点：鸭胚照蛋时的特征为背面尿囊血管上部连在一起，并容易晃动，下部尿囊血管伸展越过卵黄。胚胎发育特征为尿囊向小头伸展，腹腔闭合，软骨开始骨化)，收集接种后48-120h死亡鸭胚，于4℃条件下冷藏12-24h，无菌操作收集羊水和尿囊液，分装、标记为鸭呼肠孤病毒SL 株E1，于-70℃及以下保存，同时取样，按现行《中国兽药典》进行无菌检验，应无菌生长。
按上述方法，根据鸭胚死亡情况，逐步用生理盐水稀释病毒接种鸭胚继续传代，直至鸭胚主要死亡高峰期的时间集中在接种后60-120h且死亡规律为止。
鸭呼肠孤病毒SL株用SPF鸭胚传代培养至E9时，病毒稀释倍数为10000倍，弃去接种后48h内死亡鸭胚，剩余鸭胚90％以上在接种后60-120h死亡，死亡鸭胚体病理变化为胚体出血(图2)，肝脏和脾脏有坏死灶(图3和图4)。无菌操作收集羊水和尿囊液，分装为 2mL/管，标记名称和日期，于-70℃及以下保存。
3鸭呼肠孤病毒SL株E9鉴定
3.1无菌检验
鸭呼肠孤病毒SL株E9按现行《中国兽药典》方法进行无菌检验合格(表6)。
表6鸭呼肠孤病毒SL株E9的无菌检验
Figure RE-GDA0002762374000000121
3.2病毒含量检测
鸭呼肠孤病毒SL株E9用灭菌生理盐水做10倍系列稀释，取10-4、10-5、10-6和10-7稀释度分别接种11日龄SPF鸭胚各5枚，0.2mL/胚，用蜡封孔，于37℃静止孵化，接种后 24h死亡鸭胚弃去不计，观察至120h，收集、记录各稀释度接种组死亡鸭胚数，按Reed-Muench法计算病毒含量。各组鸭胚死亡情况见表7，计算病毒含量为10-5.32ELD50/0.2mL。
表7鸭呼肠孤病毒SL株E9各稀释度接种组鸭胚死亡统计
Figure RE-GDA0002762374000000122
3.3支原体检验
鸭呼肠孤病毒SL株E9随机取样5管、混合进行检验。在阴阳性对照成立条件下，鸭呼肠孤病毒SL株E9无支原体生长(表8)。
表8鸭呼肠孤病毒SL株E9的支原体检验
Figure RE-GDA0002762374000000131
3.4外源病毒
鸭呼肠孤病毒SL株E9随机取样2管，混合，用鸭呼肠孤病毒阳性血清于37℃中和1h作为检品，按现行《中国兽药典》方法检测。
3.4.1鸡胚检查法
检品的尿囊腔(AS)接种组SPF鸡胚10/10存活，绒毛尿囊膜(CAM)接种组SPF鸡胚9/9存活。胎儿发育正常，绒毛尿囊膜无病变，胚液HA阴性(图5)。
3.4.2细胞检查法
检品接种SPF鸡胚成纤维细胞均2/2无CPE，无红细胞吸附现象。
3.4.3禽淋巴白血病(ALV)ELISA检查法
在试验结果成立条件下，检品的OD650均值小于0.3，ALV为阴性。具体判定标准和结果见表9。
表9检品的ALV检验
Figure RE-GDA0002762374000000132
3.4.4网状内皮组织增生症病毒(REV)间接免疫荧光法检测
阴性对照接种孔均未出现特异性绿色荧光，阳性对照接种的4个孔中全部出现特异性绿色荧光，检验结果成立。检品接种的4/4孔均未出现特异性绿色荧光，REV为阴性，具体结果见表10。
表10检品的REV检验
Figure RE-GDA0002762374000000141
3.4.5对雏鸭的半数感染量检测
鸭呼肠孤病毒SL株E9用灭菌生理盐水10倍系列稀释，取10-1、10-2、10-3、10-4、10-5 5个稀释度，每个稀释度肌内注射2日龄健康樱桃谷雏鸭各10只，1mL/只；同时设健康对照5只，肌内注射生理盐水1mL/只。接种病毒组鸭和健康对照鸭分别隔离饲养，接种后观察7日，记录各组鸭发病、死亡情况，观察期结束扑杀各组鸭，观察、统计肝脏和脾脏坏死情况。
具体结果见表11，计算半数感染量为10-4.2ID50/mL。接种病毒死亡鸭肝脏和脾脏坏死明显(图6和图7)，接种病毒存活鸭主要有脾脏坏死症状(图8)，健康对照组鸭均无肝脏和脾脏坏死症状(图9和图10)。
表11各组鸭肝脾坏死统计
Figure RE-GDA0002762374000000142
注：肝脾坏死数以每只鸭子有肝脏坏死或脾脏坏死以及肝脏和脾脏坏死兼具计算，每只鸭子有上述症状之一的计为1，均无的为0。
3.4.6特异性
鸭呼肠孤病毒SL株E9用灭菌生理盐水稀释为200ELD50/0.2mL，与等量的鸭呼肠孤病毒阳性血清混合，200ELD50/0.2mL鸭呼肠孤病毒SL株E9与等量生理盐水混合，均于37℃条件下作用1h，分别经尿囊腔接种11日龄SPF鸭胚各5枚，每胚0.2mL；设空白对照5枚，每胚接种生理盐水0.2mL,用蜡封孔，于37℃静置孵育120h。记录各组鸭胚死亡情况。
结果：中和组和空白对照组鸭胚均全部健活，接种病毒对照组鸭胚全部死亡，死亡胚体出血，肝脏和脾脏有坏死灶，结果说明鸭呼肠孤病毒SL株特异性良好。
3.4.7氯仿耐受性
鸭呼肠孤病毒SL株E9加入终浓度为4.8％的氯仿，于4℃条件下200r/min震荡10min，而后于4℃条件下10000r/min离心10min，取上清用孔径为0.22μm针孔滤器过滤，收集滤液，滤液与鸭呼肠孤病毒SL株E9分别按3.2病毒含量检测方法，比较病毒经氯仿处理后和相应未经氯仿处理的病毒含量差异性。以病毒含量下降2个滴度为标准，判断病毒对氯仿的耐受性。
结果：经氯仿处理后和相应未经氯仿处理的鸭呼肠孤病毒SL株E9的病毒含量均为10-5.32ELD50/0.2mL。结果说明该病毒具有氯仿耐受性。
4鸭呼肠孤病毒SL株保藏
毒种于2019年10月29日保藏在武汉大学中国典型培养物保藏中心，地址为：中国武汉武昌区八一路299号武汉大学校内(武汉大学第一附小对面)，武汉大学保藏中心，保藏号CCTCC No:V201970，分类命名为：鸭呼肠病毒SL株。
(三)鸭呼肠孤病毒抗原抗体复合物制备
1鸭呼肠孤病毒繁殖及鉴定
1.1病毒繁殖
1.1.1接种
鸭呼肠孤病毒SL株E9用灭菌生理盐水1000倍稀释，经尿囊腔接种11日龄易感鸭胚(鸭种蛋由安徽强英鸭业集团有限公司某樱桃谷父母代种鸭养殖场提供，取卵黄按中和试验法检测鸭呼肠孤病毒母源抗体为阴性，由重庆三杰众鑫生物工程有限公司按鸭孵化程序孵化的发育良好鸭胚)，每胚0.2mL，用蜡封孔，于37～37.3℃静置孵育。
1.1.2孵育和观察
弃去48h内死亡鸭胚，以后每隔6h照蛋1次，收集48～120h死亡鸭胚，于4℃冷却 6～12h。
1.1.3收获
用75％酒精喷雾消毒蛋壳，用碘酊消毒蛋壳表面气室部，无菌操作除去气室部蛋壳，收获胚液，置于灭菌容器内，标记，即为抗原，置-20℃保存。收集胚液时，逐个检查胎儿病变，将无典型病变、胎儿腐败、及疑似污染者弃去不用。
1.2抗原检验
1.2.1无菌 按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。
1.2.2病毒含量 应≥10-5.0ELD50/0.2mL。
1.2.3特异性 应能被鸭呼肠孤病毒阳性血清中和。
2鸭呼肠孤病毒卵黄抗体
2.1免疫抗原
2.1.1抗原浓缩与灭活
抗原于2～8℃条件下解冻、混合批组，加入终浓度(V/V)为4.8％氯仿，振摇10min，于4℃条件下4000r/min离心30min，取上清液用截留分子量为6KD的中空纤维超滤柱浓缩5倍，浓缩液加入终浓度(V/V)为0.2％的甲醛溶液(含量：HCHO为37.0～40.0％)，置37～37.5℃温箱中灭活24h(其间4～6h振摇1次，每次3min)，于2～4℃保存。
2.1.2灭活抗原检验
2.1.2.1无菌 按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。
2.1.2.2灭活检验 灭活抗原经尿囊腔接种11日龄SPF鸭胚5枚，每胚0.2mL，用蜡封孔，于37～37.3℃静置孵育，观察至120h，鸭胚应全部健活。
2.1.3免疫抗原的制备
2.1.3.1油相制备 取94份注射用白油，加入2份硬脂酸铝，边加边搅拌，加热直至完全透明，再加入6份司本-80，充分混匀，121℃高压灭菌30min，冷却至室温。
2.1.3.2水相制备 灭活抗原96份加入4份灭菌的吐温-80，充分振摇后使吐温-80完全溶解。
2.1.3.3乳化 油相与水相按体积比2:1的比例初步混合、振摇3～5min，加入均质机料斗，调节压力为34～37MPa进行乳化，取样按2.1.4.2检验，应符合规定，分装、标记名称、装量和制备时间，于2～8℃保存，有效期为6个月。
2.1.4免疫抗原检验
2.1.4.1外观 应为乳白色乳剂。
2.1.4.2剂型 油包水型。取少量免疫抗原滴于冷水中，除第一滴外，均应不扩散。
2.1.4.3稳定性 取10mL免疫抗原加入离心管中，以3000r/min离心15min，管底析出的水相应≤0.5mL。
2.1.4.4黏度 按现行《中国兽药典》附录进行检验，应符合规定。
2.1.4.5无菌检验 按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。
2.1.4.6安全检验 3～5周龄SPF鸡10只，每只颈背部皮下注射免疫抗原2.0mL，隔离器内饲养观察14日，应全部健活。
2.2产蛋鸡 符合以下条件的商品蛋鸡。
2.2.1无禽白血病病毒和禽网状内皮增生症病毒 鸡群按0.5％抽样采血，按现行《中国兽药典》附录检验，应全部为阴性。
2.2.2鸡白痢和鸡支原体 按NY/T 536-2002《鸡伤寒和鸡白痢诊断技术》和 NY/T553-2002《禽支原体病诊断技术》进行检测，鸡白痢和鸡支原体感染阳性率应≤0.1％。
2.2.3饲养管理 鸡场建设必须符合兽医卫生防疫规范要求。鸡场应离交通要道500米以上，进、出口道路应分开。场内料、粪道路分开。鸡场进出口应设有消毒池。育雏舍与成鸡舍应设隔离带。此外，鸡场应具备粪污处理设施，实施全进全出制，鸡场饮水应达到卫生标准，饲养人员应卫生健康。
2.2.4疫病防治 鸡群根据当地疫病发生的实际情况，按科学免疫程序适时接种相关疫苗，根据情况需要，适时、适量投喂抗生素和抗球虫药品等。
2.2.5其他 在进行基础免疫时，鸡群的初产蛋率以5～10％为最佳。
2.3高免鸡蛋生产
2.3.1免疫程序 产蛋鸡按如下免疫程序接种免疫抗原：
基础免疫 鸡皮下注射免疫抗原1.0mL/只。
加强免疫 基础免疫后14日，鸡皮下注射免疫抗原2.0mL/只。
强化免疫 加强免疫后21日，鸡皮下注射免疫抗原2.0mL/只。
维持免疫 当高免鸡蛋的鹅星状病毒卵黄中和抗体效价临界1:512时，维持接种1次，鸡皮下注射免疫抗原2.0mL/只。
2.3.2收蛋
强化免疫后7日，抽样取蛋检测鸭呼肠孤病毒卵黄中和抗体效价≥1:512为合格。收集鸡蛋，于湿度30～60％、温度10～15℃条件下避光储存，应不超过10日。
2.4鸭呼肠孤病毒精制卵黄抗体制造
2.4.1消毒 将蛋壳有粪污的高免鸡蛋单独挑出，用自来水清洗干净，与蛋壳洁净的高免鸡蛋一起摆入塑料蛋盘中，浸入40℃的0.1％苯扎溴铵水溶液中15min，而后在95℃自来水中浸泡5s。
2.4.2分离卵黄 手工或机械打蛋，除去蛋清、胚盘和系带，收集卵黄。
2.4.3稀释 卵黄转入反应罐中，搅拌呈膏状，加入与卵黄等体积的注射用水(25℃左右)，搅拌均匀。
2.4.4酸化 加入7倍于原卵黄体积的酸化水(用醋酸-醋酸钠缓冲液调pH值至5.2的注射用水)，搅拌均匀，降温至2～4℃，静置12～15h。
2.4.5萃取 吸取上清液，转入搅拌罐中，加入终浓度(V/V)为1.0％的辛酸，搅拌均匀，室温(20～25℃)条件下作用4～6h。
2.4.6抗体原液 收集80～90％下层液，用孔径为1μm的筒式滤芯粗滤，收集滤液。将罐内剩余物搅拌均匀，用连续管式离心机离心，收集离心液。合并滤液和离心液。
2.4.7过滤 用1～2M氢氧化钠溶液调节pH值为5.5～7.5，用孔径为0.45μm的筒式滤芯过滤澄清，用孔径为0.22μm筒式滤芯过滤除菌。
2.4.8浓缩 根据高免鸡蛋的鸭呼肠孤病毒卵黄中和抗体效价和卵黄稀释倍数，滤液用截留分子量为30KD的中空纤维超滤器进行适当倍数的浓缩，预期使鸭呼肠孤病毒中和抗体效价≥1:512。
2.4.9灭活 加入终浓度为0.05％的甲醛溶液(含量：HCHO为37.0～40.0％)，搅拌均匀，室温条件(20～25℃)下灭活24h，即为抗体半成品，而后于2-8℃保存备用。
2.4.10抗体半成品检验
2.4.10.1无菌检验 按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。
2.4.10.2支原体检验 按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无支原体生长。
2.4.10.3外源病毒检验 按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无外源病毒污染。
2.4.10.4安全检验 1日龄健康雏鸭10只，皮下注射2.0mL/只；体重18～22g的清洁级小鼠10只，皮下注射0.5mL/只。连续观察14日，雏鹅和小鼠均应全部健活。
2.4.10.5效力检验 下列方法任选其一。
(1)中和抗体效价测定抗体用灭菌生理盐水做2倍系列稀释，取1:256、1:512和 1:1024 3个稀释度，分别与200ELD50/0.2mL的检验用毒种鸭呼肠孤病毒SL株等量混合，置 37℃下作用1h，每个稀释度经尿囊腔接种11日龄SPF鸭胚5枚，每胚0.2mL；设病毒对照5 枚，每胚接种同条件处理的病毒与生理盐水等量混合液0.2mL；设空白对照5枚，每胚接种灭菌生理盐水0.2mL。鸭胚用蜡封孔，于37～37.3℃静置孵育，24h前死亡鸭胚弃去不计， 24～120h死亡鸭胚随时取出，计算其半数保护量(PD50)。病毒对照组鸭胚应全部死亡，空白对照组鸭胚应全部健活，能使50％鸭胚保护的最高稀释倍数即为抗体的中和效价。中和抗体效价应≥1:512。
(2)雏鸭效检 2日龄健康易感雏鸭30只，随机分成3组，每组10只，分别隔离饲养。第1组为空白对照组，不注射任何药品；第2组为接种抗体组，皮下或肌肉注射抗体 0.25mL/只；第3组为攻毒对照组，皮下注射生理盐水0.25mL/只。注射抗体后24h，第2组和第3组雏鸭各肌肉注射检验用毒种鸭呼肠孤病毒SL株1.0mL(含100ID50)/只，攻毒后观察7日。观察期结束，第1组鸭应全部健活，扑杀剖检肝脏和脾脏应全部正常；第2组鸭应全部存活，扑杀剖检肝脏和脾脏应至少8只正常、无肝脏和脾脏坏死症状；第3组应至少死亡1只，死亡鸭剖检观察应有肝脏或脾脏坏死症状，存活鸭扑杀、剖检检查肝脏或脾脏坏死症状，连同死亡鸭在内，该组鸭至少8只有肝脏或脾脏坏死症状。(鸭发病判定标准：精神沉郁，脚软、蹲伏、不喜运动，拉白色或绿色稀便，有上述症状中的两种及以上判定为发病)
2.4.10.6辛酸含量 按现行《中国兽药典》附录进行测定，应符合规定。
2.4.10.7甲醛残留量 按现行《中国兽药典》附录进行测定，应≤0.20％。
3鸭呼肠孤病毒蜂胶佐剂抗原
3.1蜂胶制备
市售食品级优质蜂胶粉(HPLC 99％)，按1kg蜂胶粉加入2L分析纯级别酒精，用灭菌容器承装、密封，室温条件下放置2周，每天摇匀1次，每次5分钟，取上清于4℃条件下4000r/min离心30min，取上清液分装、标记品名和制备时间，于4℃保存备用。
3.2配苗
按蜂胶比灭菌生理盐水体积比1:4的比例混合，即为蜂胶佐剂。2.1.1中的浓缩灭活抗原与蜂胶佐剂按体积比1：4混合，充分摇匀，即为鸭呼肠孤蜂胶佐剂抗原半成品，于2-8℃保存，备用。
3.3鸭呼肠孤蜂胶佐剂抗原半成品检验
3.3.1性状 外观为微棕红色澄明液体，剂型为水剂型。
3.3.2无菌检验 按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。
3.3.4安全检验 1日龄健康雏鸭10只，皮下注射2.0mL/只；体重18～22g的清洁级小鼠10只，皮下注射0.5mL/只。连续观察14日，雏鸭和小鼠均应全部健活。
3.3.5效力检验 用2日健康雏鸭15只，其中10只皮下或肌内注射抗原半成品0.25mL/ 只，另5只不接种，作为对照，接种后21日，采血，分离血清，按组混合，用灭菌生理盐水做2倍系列稀释，取1:64、1:128和1:256等3个稀释度，分别与200ELD50/0.2mL的检验用毒种鸭呼肠孤病毒SL株等量混合，置37℃下作用1h，每个稀释度经尿囊腔接种11日龄SPF鸭胚5枚，每胚0.2mL；设病毒对照5枚，每胚接种同条件处理的病毒与生理盐水等量混合液0.2mL；设空白对照5枚，每胚接种灭菌生理盐水0.2mL。鸭胚用蜡封孔，于37～ 37.3℃静置孵育，24h前死亡鸭胚弃去不计，24～120h死亡鸭胚随时取出，计算其半数保护量(PD50)。病毒对照组鸭胚应全部死亡，空白对照组鸭胚应全部健活，能使50％鸭胚保护的最高稀释倍数即为血清抗体的中和效价。免疫鸭血清中和抗体效价应≥1:128，对照鸭血清中和抗体效价应不超过1:4。
3.3.6甲醛残留量 按现行《中国兽药典》附录进行测定，应≤0.20％。
4鸭呼肠孤病毒抗原抗体复合物
4.1配苗、分装
鸭呼肠孤病毒蜂胶佐剂抗原半成品与鸭呼肠孤病毒卵黄抗体半成品按体积比1:1混合，充分摇匀，定量分装，加塞、轧盖，即为鸭呼肠孤病毒抗原抗体复合物，于2-8℃保存。
4.2检验
【性状】
外观 为略微棕红色澄明液体，久置瓶底可能有微量沉淀。
剂型 为水剂型。
【装量检查】按现行《中国兽药典》附录检验，应符合规定。
【无菌检验】按现行《中国兽药典》附录检验，应无菌生长。
【安全检验】1日龄健康雏鸭10只，皮下注射2.0mL/只；体重18～22g的清洁级小鼠10只，皮下注射0.5mL/只。连续观察14日，雏鸭和小鼠均应全部健活。
【效力检验】下述方法均需检验，应符合规定。
1、中和抗体效价测定 用灭菌生理盐水做2倍系列稀释，取1:128、1:256和1:512等3个稀释度，分别与200ELD50/0.2mL的检验用毒种鸭呼肠孤病毒SL株等量混合，置37℃下作用1h，每个稀释度经尿囊腔接种11日龄SPF鸭胚5枚，每胚0.2mL；设病毒对照5枚，每胚接种同条件处理的病毒与生理盐水等量混合液0.2mL；设空白对照5枚，每胚接种灭菌生理盐水0.2mL。鸭胚用蜡封孔，于37～37.3℃静置孵育，24h前死亡鸭胚弃去不计，24～ 120h死亡鸭胚随时取出，计算其半数保护量(PD50)。病毒对照组鸭胚应全部死亡，空白对照组鸭胚应全部健活，能使50％鸭胚保护的最高稀释倍数即为抗体的中和效价。中和抗体效价应≥1:256。
2、血清中和抗体效价测定 用2日健康雏鸭15只，其中10只皮下或肌内注射0.5mL/只，另5只不接种，作为对照，接种后21日，采血，分离血清，按组混合，用灭菌生理盐水做2倍系列稀释，取1:64、1:128和1:256等3个稀释度，分别与200ELD50/0.2mL的检验用毒种鸭呼肠孤病毒SL株等量混合，置37℃下作用1h，每个稀释度经尿囊腔接种11日龄SPF鸭胚5枚，每胚0.2mL；设病毒对照5枚，每胚接种同条件处理的病毒与生理盐水等量混合液0.2mL；设空白对照5枚，每胚接种灭菌生理盐水0.2mL。鸭胚用蜡封孔，于37～ 37.3℃静置孵育，24h前死亡鸭胚弃去不计，24～120h死亡鸭胚随时取出，计算其半数保护量(PD50)。病毒对照组鸭胚应全部死亡，空白对照组鸭胚应全部健活，能使50％鸭胚保护的最高稀释倍数即为血清抗体的中和效价。免疫鸭血清中和抗体效价应≥1:128，对照鸭血清中和抗体效价应不超过1:4。
【甲醛残留量】按现行《中国兽药典》附录进行测定，应≤0.20％。
【作用与用途】用于预防由鸭呼肠孤病毒引起的鸭“肝脾坏死症”。保护期为60日。
【用法与用量】颈部皮下或肌内注射。3日龄以内鸭0.5mL/只；4日龄及以上鸭0.8mL/ 只。
【注意事项】(1)久置瓶底可能有微量沉淀，用前摇匀，不影响使用效果。
(2)健康状况异常的(非鸭呼肠孤病毒感染导致的)鸭切忌注射本品。
(3)接种时，注射器具须经高压或煮沸消毒。
(4)开启后，限当日用完。用过的包装容器、器具和未用完的产品应无害化处理。
(5)鸭屠宰前14日内禁止使用。
【包装规格】(1)100mL/瓶 (2)250mL/瓶 (3)500mL/瓶
【贮藏与有效期】2-8℃保存，有效期12个月。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
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Claims (10)

1.一种鸭呼肠孤病毒SL株，保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No:V201970。
2.根据权利要求1所述鸭呼肠孤病毒SL株，其特征是，所述鸭呼肠孤病毒SL株的部分基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
3.一种含有权利要求1所述鸭呼肠孤病毒SL株的鸭呼肠孤病毒抗原抗体复合物。
4.根据权利要求3所述鸭呼肠孤病毒抗原抗体复合物的制备方法，其特征是，包括下述步骤：
A、将权利要求1中所述的鸭呼肠孤病毒SL株进行病毒繁殖，制备抗原；
B、将步骤A中制备的抗原制备鸭呼肠孤病毒精制卵黄抗体；
C、以蜂胶粉为原料制备鸭呼肠孤病毒蜂胶佐剂抗原；
D、以步骤B中制备的鸭呼肠孤病毒精制卵黄抗体和步骤C中制备的鸭呼肠孤病毒蜂胶佐剂抗原按1:1比例混合均匀，即得鸭呼肠孤病毒抗原抗体复合物成品。
5.根据权利要求4所述制备方法，其特征是，所述步骤A中抗原的制备步骤为：
A1、接种：将权利要求1中所述的鸭呼肠孤病毒SL株用灭菌生理盐水1000倍稀释，按每胚0.2mL经尿囊腔接种11日龄易感鸭胚，然后用蜡封孔，于37～37.3℃静置孵育；
A2、孵育和观察：观察步骤①中进行静置孵育的鸭胚，弃去48h内死亡鸭胚，收集48～120h死亡鸭胚，然后于4℃冷却6～12h；
A3、收获：对步骤②中冷却鸭胚的用75％的酒精对蛋壳进行消毒，并用碘酊再次对蛋壳表面气室部消毒，无菌操作除去气室部蛋壳，收获胚液，置于灭菌容器内，标记，即为抗原，置-20℃保存。
6.根据权利要求5所述制备方法，其特征是，所述步骤A1中制备的抗原的病毒含量≥10-5.0ELD50/0.2mL。
7.根据权利要求4所述制备方法，其特征是，所述步骤B中鸭呼肠孤病毒精制卵黄抗体的制备步骤为：
B1、抗原浓缩与灭活：抗原于2～8℃条件下解冻、混合批组，加入终浓度为4.8％(V/V)氯仿，振摇10min，于4℃条件下4000r/min离心30min，取上清液用截留分子量为6KD的中空纤维超滤柱浓缩5倍，浓缩液加入终浓度为0.2％(V/V)的甲醛溶液，置37～37.5℃温箱中灭活24h，其间4～6h振摇1次，每次3分钟，于2～4℃保存；
B2、免疫抗原的制备：油相制备，取94份注射用白油，加入2份硬脂酸铝，边加边搅拌，加热直至完全透明，再加入6份司本-80，充分混匀，121℃高压灭菌30min，冷却至室温；水相制备，灭活抗原96份加入4份灭菌的吐温-80，充分振摇后使吐温-80完全溶解；乳化、油相与水相按体积比2:1的比例初步混合、振摇3～5分钟，加入均质机料斗，调节压力为34～37MPa进行乳化，检验合格以后分装标记，于2～8℃保存；
B3、高免鸡蛋生产：产蛋鸡按基础免疫、加强免疫、强化免疫、维持免疫，强化免疫后7日，抽样取蛋检测鸭呼肠孤病毒卵黄中和抗体效价≥1:512为合格，收集鸡蛋，于湿度30～60％、温度10～15℃条件下避光储存；
B4、鸭呼肠孤病毒精制卵黄抗体制造：将蛋壳有粪污的高免鸡蛋单独挑出，用自来水清洗干净，与蛋壳洁净的高免鸡蛋一起摆入塑料蛋盘中，浸入40℃的0.1％苯扎溴铵水溶液中15min，而后在95℃自来水中浸泡5s；手工或机械打蛋，除去蛋清、胚盘和系带，收集卵黄；卵黄转入反应罐中，搅拌呈膏状，加入与卵黄等体积的注射用水25℃搅拌均匀；加入7倍于原卵黄体积的酸化水搅拌均匀，降温至2～4℃，静置12～15h；吸取上清液，转入搅拌罐中，加入终浓度为1.0％(V/V)的辛酸，搅拌均匀，20～25℃条件下作用4～6h；收集80～90％下层液，用孔径为1μm的筒式滤芯粗滤，收集滤液，将罐内剩余物搅拌均匀，用连续管式离心机离心，收集离心液，合并滤液和离心液；用1～2M氢氧化钠溶液调节pH值为5.5～7.5，用孔径为0.45μm的筒式滤芯过滤澄清，用孔径为0.22μm筒式滤芯过滤除菌；根据高免鸡蛋的鸭呼肠孤病毒卵黄中和抗体效价和卵黄稀释倍数，滤液用截留分子量为30KD的中空纤维超滤器进行适当倍数的浓缩，预期使鸭呼肠孤病毒中和抗体效价≥1:512；加入终浓度为0.05％的甲醛溶液搅拌均匀，20～25℃下灭活24h，即为抗体半成品，而后于2-8℃保存备用。
8.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，所述步骤C鸭呼肠孤病毒蜂胶佐剂抗原制备步骤为：
C1、蜂胶制备：市售食品级优质蜂胶粉，按1kg蜂胶粉加入2L分析纯级别酒精，用灭菌容器承装、密封，室温条件下放置2周，每天摇匀1次，每次5分钟，取上清于4℃条件下4000r/min离心30分钟，取上清液分装、标记品名和制备时间，于4℃保存备用；
C2、配苗：按蜂胶比灭菌生理盐水体积比1:4的比例混合，即为蜂胶佐剂。2.1.1中的浓缩灭活抗原与蜂胶佐剂按体积比1：4混合，充分摇匀，即为鸭呼肠孤蜂胶佐剂抗原，于2-8℃保存，备用。
9.根据权利要求1-8任一项所述鸭呼肠孤病毒SL株在治疗或预防鸭呼肠孤病毒中的应用。
10.根据权利要求9所述应用，其特征是，在雏鸭1日龄时，皮下或肌内按0.5mL/只进行注射。
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