CN105949307B - 一种用于防治番鸭源小鹅瘟的卵黄抗体 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于防治番鸭源小鹅瘟的卵黄抗体,是用保藏编号为CCTCC NO:V201620的番鸭源小鹅瘟病毒作为抗原制备的。本发明用番鸭源小鹅瘟病毒YBGPV‑M株接种番鸭胚，分别收获死亡胚胚体和胚液，经研磨、冻融后收取病毒液，经超滤浓缩、甲醛溶液灭活后，加油佐剂混合乳化制成疫苗。用此疫苗接种产蛋鸡，收获鸡蛋，分离蛋黄，灭活、萃提精制得到抗体。制备的抗体能预防小鹅瘟病毒引起的雏番鸭小鹅瘟病毒感染，此卵黄抗体具有高效、安全性好、保护率高等优点。

Description

一种用于防治番鸭源小鹅瘟的卵黄抗体

技术领域

本发明属于兽用生物制品领域，具体涉及一种用于防治番鸭源小鹅瘟的卵黄抗体。

背景技术

鹅细小病毒病又称Derzsy氏病，俗称鹅流感、鹅或小鹅瘟、鹅肝炎、鹅肠炎等，是一种侵害幼鹅和番鸭的一种高度接触传染性疾病，病名的多样性反映了该病多个病理学特征。根据感染雏鹅、雏鸭的日龄不同，该病可表现为急性、亚急性和慢性型。急性型可引起10日龄以内的雏鹅100%死亡。许多国家也报道了一种抗原性完全不同的番鸭细小病毒感染，死亡率高达80%。该病主要发生于1～3周龄的雏鹅和雏番鸭，尤其是1周龄左右的更易感，4周龄以上的鹅或番鸭感染后，很少表现临床症状。本病最早于20世纪60年代中后期出现于中国和许多欧洲国家，直到1978年才将该病称为鹅细小病毒感染，但是通过病毒中和试验、分子生物学研究证明，从鹅和番鸭分离到的细小病毒有明显的差异。如果对死亡的番鸭处理不当，往往造成病毒的蔓延，产生更大的危害。目前市场上仅有番鸭细小病毒病活疫苗，还没有番鸭源鹅细小病毒病的活疫苗销售，且尚无快速有效的药物或方法来防治番鸭源鹅细小病毒病。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于防治番鸭源小鹅瘟的卵黄抗体，提供的卵黄抗体具有效价高、保护率高、安全性好等优点。

本发明所提供的用于预防、治疗番鸭源小鹅瘟（番鸭源鹅细小病毒病）的卵黄抗体，是用保藏编号为CCTCC NO:V201620的番鸭源小鹅瘟病毒作为抗原制备的。使用的番鸭源小鹅瘟病毒，为番鸭源小鹅瘟病毒YBGPV-M株，于2016年3月31日保藏在中国典型培养物保藏中心（地址：中国武汉武汉大学），保藏编号为CCTCC NO:V201620。

本发明的卵黄抗体，其制备包括如下的步骤

1）用番鸭源小鹅瘟病毒作为抗原，制成灭活疫苗；

2)将制备的灭活疫苗注射免疫产蛋鸡，来获得用番鸭源小鹅瘟病毒免疫后的鸡蛋；

3）将免疫后的鸡蛋收集卵黄用酸化水-辛酸的方法萃提、灭活制成卵黄抗体。

本发明制备的抗体在制备预防或治疗鹅细小病毒病的制品中的应用；

本发明用番鸭源小鹅瘟病毒YBGPV-M株接种番鸭胚，分别收获死亡胚胚体和胚液，经研磨、冻融后收取病毒液，经超滤浓缩、甲醛溶液灭活后，加油佐剂混合乳化制成疫苗。用此疫苗接种产蛋鸡，收获鸡蛋，分离蛋黄，灭活、萃提精制得到抗体。制备的抗体能预防小鹅瘟病毒引起的雏番鸭小鹅瘟病毒感染，此卵黄抗体具有高效、安全性好、保护率高等优点。

附图说明

图1：基于VP基因的YBGPV-M与国内外已公布的GPV毒株遗传进化树图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细的描述。本发明所应用的方法可以采用疫苗制备领域中常用的方法，而不仅限于本发明实施例的具体记载，本领域的普通技术人员可以其它常规方法来实现本发明。

实施例1、YBGPV-M株的筛选

2013年从福建省某鸭场的雏番鸭群中出现了以腹泻、部分鸭肠粘膜脱落形成栓塞为主要特征的疫病，发病率50%～80%，病死率45%～70%，临床上使用抗菌素、番鸭细小病毒病疫苗及番鸭细小高免卵黄抗体均不能控制病情。发明人无菌采集濒死鸭的肝脏、脾脏及胰腺，将肝脏、脾脏及胰腺用无菌生理盐水匀浆制成20%悬液，3000r/min离心15min，取上清除菌后经尿囊腔分别接种11日龄番鸭胚，孵化168小时，收集24小时后死亡胚的尿囊液及胚体组织，经匀浆后，反复冻融3次，取上清液冻存。收获的病毒液经纯化后进行了病毒含量、免疫原性、特异性及纯净性等方面的病毒特性的分析检测，结果表明该毒株病毒含量为10^6.50ELD₅₀/0.2ml,最小免疫剂量为10^2.0ELD₅₀/0.2ml，该病毒仅与小鹅瘟病毒发生特异性反应，无细菌、支原体及外源病毒污染，适合作为制苗用毒株。将筛选的病毒株于2016年3月31日保藏在中国典型培养物保藏中心（地址：中国武汉武汉大学），保藏编号为CCTCC NO:V201620。

对于本发明筛选的毒株的性状进行检测，结果表明，该株病毒属细小病毒，圆形无囊膜，直径在20～22nm左右、对理化因素的灭活作用有很强的抵抗力65℃加热处理30min病毒滴度不受影响，37℃作用1小时仍稳定，对乙醚、胰蛋白酶、酸不敏感，对红细胞无凝集现象。该病毒可引起雏番鸭发生以腹泻、部分鸭肠粘膜脱落形成栓塞为特征疫病。该毒株制备的疫苗免疫1日龄雏番鸭，10天就可产生抗体，免疫期可达6个月以上；免疫成年番鸭后，能保护免疫6个月内种番鸭所产子代免受流行毒株的攻击。该毒株作100倍稀释后，与等量番鸭源小鹅瘟病毒抗血清中和，接种11日龄番鸭胚，结果表明，中和组番鸭胚全部健活，而病毒对照组番鸭胚全部死亡。

对筛选鉴定的YBGPV-M株的结构蛋白基因VP进行了测序,VP基因全长2199bp，编码约732个氨基酸；将其与GenBank中收录的30个GPV VP基因序列进行遗传进化树（图1）及核苷酸序列同源性分析，发现本发明获得YBGPV-M株VP基因与另外30个GPV毒株的VP基因同源性介于85.9％～90.3％之间；结果表明筛选病毒的VP蛋白与已报道的小鹅瘟病毒VP基因存在着氨基酸差异。

实施例2、疫苗的制备

1制苗用病毒液的制备将生产用毒种YBGPV-M株用无菌生理盐水稀释100倍，尿囊腔接种11～12日龄易感番鸭胚，每胚0.2ml，37℃孵育，每日2次照胚检查。选择接种后48～168小时内死亡的鸭胚，置2～8℃4～12小时，无菌条件下打开气室，挑取胚体有广泛出血，毛囊出血，肝脏变性和坏死，绒毛尿囊膜有轻度水肿的胚，取其胚体（去掉头和四肢）放入组织捣碎机中粉碎，收取尿囊液、羊水，用胚液匀浆，取粉碎后的组织按1:3加入生理盐水混合，冻融3次，4000r/min离心30min，取上清混合于无菌容器中，置2～8℃保存。（参见表1）。

表1：毒液的制备

毒株名称	制苗材料	接种胚数（枚）	胚日龄	收获毒液（ml）
					YBGPV-M株	番鸭胚	100	11	3400

2.灭活将病毒液倒入灭活瓶内，计量加入10%甲醛溶液，使其充分混合，甲醛溶液的最终浓度为0.2%。加甲醛溶液后倒入另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活16小时后取出，置2～8℃保存。

3.疫苗半成品检验

（1）无菌检验取灭活的胚液，按现行《中国兽药典》附录进行，无菌生长。

（2）病毒含量测定将病毒液用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10^-3、10^-4、10^-5、10^-6 4个稀释度，分别尿囊腔接种11～12日龄易感番鸭胚，每胚0.2ml，同时设接种生理盐水对照5枚，每胚0.2ml。置37℃继续孵育，每日照胚2次，观察168小时。以鸭胚死亡并出现尿囊膜水肿增厚，头、颈、背部等全身出血性病变判为感染，计算ELD₅₀为10^6.67ELD₅₀/0.2ml。

（3）灭活检验将病毒液尿囊腔接种11～12日龄易感番鸭胚10枚，每胚0.2ml，置37℃继续孵育，连续观察168小时，鸭胚均无死亡。

二、灭活疫苗的制备：经过检验合格后的半成品抗原进行疫苗制备（以下配制中各液体成分按体积比计，参见表2）。

（1）油相制备取兽用白油95份，硬脂酸铝1份，置于油相制备罐中加热至80℃后，再加司本－80 5份，至温度达到115℃时，维持30min，冷却后备用。

（2）水相制备将灭活检验合格的病毒液混合，检测每0.2ml水相中含YBGPV-M株病毒含量不低于10^6.50ELD₅₀。取灭菌后的吐温-80 5份，加入配液罐中，同时加混合抗原液95份，开动搅拌电机搅拌20～30min，使吐温-80完全溶解。

（3）乳化取油相2份放于高速剪切机内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，以10000r/min，乳化5分钟。乳化后，取10ml，以3000r/min离心15分钟，管底无水相析出。

（4）分装定量分装，加盖密封。

表2：疫苗乳化和分装

三、疫苗成品检验

（1）性状

外观乳白色乳剂。

剂型油包水型，取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水，呈油滴状不扩散。

稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底无水相析出。

黏度按现行版《中国兽药典》附录进行，为58.6cp。

（2）装量检查按现行版《中国兽药典》附录进行,符合标准。

（3）无菌检验按现行版《中国兽药典》附录进行,无菌生长。

（4）安全检验用1日龄雏番鸭10只，每只颈部皮下注射疫苗2.0ml（左右各1.0ml），同时设对照5只，在相同的条件下饲养，连续观察20日，记录试验鸭采食、饮水及临床情况。应不出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。

（5）效力检验

①1日龄雏番鸭20只，随机分成两组，每组10只，其中一组每只颈部皮下注射疫苗，0.2ml/只，另一组10只同日龄雏番鸭不免疫作对照，隔离饲养。于免疫后15日免疫组和对照组同时攻击番鸭源小鹅瘟病毒YBGPV-M株，每只颈部皮下注射0.2ml/只（10^6.50ELD₅₀/0.2ml），连续观察15日，结果免疫组鸭9只保护，对照组鸭10只全部发病。（见表3）。

表3：疫苗效力检验结果

（6）甲醛残留量测定按现行版《中国兽药典》附录进行测定，甲醛残留量为0.07%。

实施例3：小鹅瘟病毒卵黄抗体制备

1.疫苗免疫蛋的制备

将上述制备的小鹅瘟灭活疫苗免疫蛋鸡，首次免疫每只鸡颈部皮下注射1羽份番鸭源小鹅瘟灭活疫苗，14天后进行第二次免疫，每只鸡颈部皮下注射2.0ml灭活疫苗，二免后14天进行第三次免疫，每只鸡颈部皮下注射2.0ml灭活疫苗，三免后14天进行第四次免疫,每只鸡颈部皮下注射2.0ml灭活疫苗，第四次免疫之后14天，采集卵黄测定小鹅瘟病毒AGP抗体效价应不低于1:64。

2卵黄抗体制造（参见表4）

（1）蛋壳消毒将10kg疫苗免疫蛋（高免蛋）浸入1%的TH4+溶液中浸泡消毒5min。取出消毒后的鸡蛋自然晾干或吹干，喷洒75%的酒精对蛋壳表面消毒后备用。

（2）卵黄分离采取机械打蛋。打蛋时应充分除去蛋清、胚盘和系带，收集卵黄。

（3）灭活Ⅰ将收集的蛋黄充分搅拌，使蛋黄呈均匀膏状，启动蠕动泵，将蛋黄液泵入夹层反应罐中，加入与蛋黄等体积的注射用水（注射用水先经100℃30min消毒，并冷却至65℃以下），搅拌混匀后，60～65℃保温（灭活）30min。

（4）酸化萃提先在隔离反应罐中加入相当于原蛋黄4倍体积冷却至4℃的注射用水,然后加入卵黄液，开启搅拌机搅拌,混匀后用1mol/L盐酸调pH值至5.4,2～8℃静置12小时。酸化完成后，6000r/min离心15min，离心后取上清液。

（5）灭活Ⅱ在分离的上清液中加入终浓度（V/V）为0.2%的辛酸作灭活剂和萃提剂，搅拌均匀，2～8℃放置4～8小时。

（6）粗滤用无菌滤布过滤后，再用柱芯滤器过滤至澄清。

（7）除菌过滤用0.22μm微孔芯过滤除菌。置2～8℃存放，应不超过14日。同时取样检测小鹅瘟AGP抗体效价。

（8）浓缩如检测的小鹅瘟AGP抗体效价低于1:64，应将除菌过滤后的卵黄抗体在2～8℃条件下，用30～50KD的浓缩膜包进行适当倍数的超滤浓缩，浓缩后的AGP抗体效价应均不低于1:64。

（9）灭活Ⅲ将过滤后的溶液导入灭活罐中，计量加入10%的甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛溶液的最终浓度（V/V）为0.1%，37℃灭活16小时。

（10）阻断灭活结束后，立即在灭活病毒液中加入过滤除菌的50%硫代硫酸钠溶液，使硫代硫酸钠溶液终含量（W/V）为2%，充分混合，取样后迅速置4℃保存。

表4：卵黄抗体制造及分装

实施例4：卵黄抗体成品检验

（1）性状本品为淡黄色的透明液体。pH值为7.1。

（2）装量检查按现行《中国兽药典》附录进行，符合规定。

（3）无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行，无菌生长。

（4）安全检验用1日龄雏番鸭10只，每只颈部皮下注射本品2.0ml（左右各1.0ml），同时设对照5只，在相同的条件下饲养，连续观察20日，记录试验鸭采食、饮水及临床情况，易感雏鸭全部健活。

（5）效力检验（参见表5）

1）血清学方法番鸭源小鹅瘟病毒AGP抗体效价均为1:64。

2）免疫攻毒法1日龄易感雏番鸭30只，随机分成A、B、C组，每组10只。A组为治疗组，B组为攻毒对照组，C组为空白对照组，A、B组以番鸭源小鹅瘟病毒YBGPV-M株强毒攻击，每只颈部皮下注射0.2ml/只（10^6.50ELD₅₀/0.2ml），攻毒24h，治疗组注射卵黄抗体1mL/只，攻毒对照组注射生理盐水1mL/只，观察15日，治疗组10/10正常；攻毒组9/10死亡；健康对照组10/10正常。（参见表5）由此可见，卵黄抗体治疗组全部保护，治疗效果很明显。此外，用YBGPV-M株的攻毒实验表明，相比于已有的小鹅瘟病毒疫苗制品本发明的抗体对YBGPV-M株的免疫效果最好，推测是由于YBGPV-M株基因发生变异导致的。

表5：卵黄抗体效力检验结果

注:攻毒保护为攻毒后健康存活鸭数/攻毒鸭总数。

Claims (4)

1.一种卵黄抗体，其特征在于，所述的卵黄抗体是用保藏编号为CCTCC NO:V201620的番鸭源小鹅瘟病毒YBGPV-M株作为抗原制备的。

2.权利要求1所述的卵黄抗体的制备方法，其特征在于，所述的卵黄抗体的制备方法如下：

1)用所述 番鸭源小鹅瘟病毒作为抗原，制成灭活疫苗；

2)将制备的灭活疫苗注射免疫产蛋鸡，来获得用番鸭源小鹅瘟病毒免疫后的鸡蛋；

3)将免疫后的鸡蛋收集卵黄，用酸化水-辛酸的方法萃提、灭活制成卵黄抗体。

3.权利要求1所述的卵黄抗体在制备预防或治疗鹅细小病毒病的制品中的应用。

4.一种预防或治疗鹅细小病毒病的制品，其特征在于，所述的制品包含有药理有效浓度的权利要求1所述的卵黄抗体。