CN116836939B - 一种抗禽脑脊髓炎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株、单克隆抗体、试剂或试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术检测技术领域，具体涉及一种抗禽脑脊髓炎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株、单克隆抗体、试剂或试剂盒及其应用。本发明提供了一种抗禽脑脊髓炎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株AEMab‑VP1‑25，所述杂交瘤细胞株AEMab‑VP1‑25的保藏编号为CGMCCNO:45613。抗禽脑脊髓炎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体制备的间接免疫荧光试剂盒具有良好的特异性。该试剂盒不仅可用于禽病毒类活疫苗中AEV的外源病毒检测，还可用于AEV的临床检测和流行病学调查。

Description

一种抗禽脑脊髓炎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株、单克隆抗 体、试剂或试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于生物技术检测技术领域，具体涉及一种抗禽脑脊髓炎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株、单克隆抗体、试剂或试剂盒及其应用。

背景技术

禽脑脊髓炎(Avian Encephalomyelitis，AE)是由禽脑脊髓炎病毒(AvianEncephalomyelitis virus，AEV)引起的一种主要侵害幼禽中枢神经系统引起非化脓性脑炎的接触性传染病。AEV主要侵害1～4周龄的雏鸡，发病率一般为20％～60％，死亡率平均为25％。6周龄以上的鸡受感染AEV后一般不表现临床症状但有短期产蛋量下降的问题出现。AE可水平传播也可垂直传播，对养鸡业特别是种鸡饲养业造成了极大危害。

AEV为无囊膜的单股正链RNA病毒，目前分离到的AEV毒株均属于同一个血清型，但存在两种不同的病理型即嗜肠道型和嗜神经型。大多数自然野毒株属于嗜肠道型，早期经感染的易感雏鸡会出现典型的AE临床症状。嗜神经型AEV毒株致病性强，以脑内接种或非肠道途径如肌肉注射和皮下接种均会引起严重的神经症状。嗜神经型AEV毒株不经水平传播，经SPF鸡胚传代后可适应鸡胚。嗜神经型AEV毒株的典型代表为野毒株以脑内接种方式反复接种鸡胚而获得的鸡胚适应株VanReokel(VR)株。所以嗜神经型AEV毒株一般采用卵黄囊接种6日龄SPF鸡胚来增殖病毒。同时，AEV也可在鸡胚脑细胞，鸡胚成纤维细胞、鸡胚神经细胞和鸡原代法氏囊细胞上培养增殖。

针对AEV的检测方法的研究很多，如病原学检测方法、免疫学检测方法和分子生物学检测方法，不同检测方法的灵敏性也存在差异。《禽脑脊髓炎诊断技术》中记载了琼脂免疫扩散试验、中和试验和组织切片间接免疫荧光试验等诊断技术对AEV进行诊断。在禽源活疫苗成品检验环节，《中华人民共和国兽药典》(三部)二〇二〇年版鸡检查法，针对AEV检验的方法主要是ELISA方法或琼脂扩散试验检测病毒抗体。但上述法定方法均存在缺点，比如琼脂扩散试验存在敏感性低的缺点，中和试验存在费时耗力的缺点，组织切片间接免疫荧光试验用阳性血清作为一抗检测组织中的AEV，存在敏感性特异性差和只能检测组织切片的问题；进行AEV ELISA抗体检测必须通过鸡检查法获得鸡血清进行检测，又存在费时成本高的问题。而使用ELISA检测AEV的基础是得到对AEV具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体。因此，亟需一种高特异性和高灵敏度的抗禽脑脊髓炎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株，实现禽脑脊髓炎病毒的高灵敏度检测，建立稳定高效的检测AEV的IFA方法用于禽活疫苗的质量检测和AE疫病的诊断。

发明内容

本发明的目的提供一种抗禽脑脊髓炎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株、单克隆抗体、试剂或试剂盒及其应用，该杂交瘤细胞株分泌的抗禽脑脊髓炎病毒单克隆抗体，将所述单克隆抗体用于制备的间接免疫荧光试剂盒在检测禽脑脊髓炎病毒方面具有较高的特异性和灵敏度。

为了解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一株抗禽脑脊髓炎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株AE Mab-VP1-25，所述杂交瘤细胞株AE Mab-VP1-25的保藏编号为CGMCCNO:45613。

本发明提供了一株上述技术方案所述抗禽脑脊髓炎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌得到的单克隆抗体。

本发明提供了一种检测禽脑脊髓炎病毒的试剂或试剂盒，包括上述技术方案所述的单克隆抗体。

本发明提供了一种间接免疫荧光试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述的所述的单克隆抗体、FITC标记的山羊抗小鼠抗体、样品稀释液和样品洗涤液。

优选的，所述样品稀释液包括pH值为7.2～7.4的9～11mM磷酸缓冲液。

优选的，所述样品洗涤液包括pH值为7.2～7.4的9～11mM磷酸缓冲液。

本发明提供了一种上述技术方案所述的抗禽脑脊髓炎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株或上述技术方案所述的单克隆抗体或上述技术方案所述所述的试剂或试剂盒或上述技术方案所述的间接免疫荧光试剂盒在检测禽病毒活疫苗的安全性中的应用。

本发明提供了一种上述技术方案所述的抗禽脑脊髓炎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株或上述技术方案所述的单克隆抗体在制备检测禽脑脊髓炎病毒的试剂或试剂盒中的应用。

本发明的有益效果：本发明提供了一种抗禽脑脊髓炎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株AE Mab-VP1-25，所述杂交瘤细胞株AE Mab-VP1-25的保藏编号为CGMCC NO:45613。本发明中所述抗禽脑脊髓炎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株是基于VP1蛋白制备，VP1蛋白作为AEV重要的免疫原性蛋白，在AEV不同毒株之间高度保守所制备的单克隆抗体，可同时识别AEV不同毒株，而不与鸡减蛋综合征病毒(EDSV)等病毒发生交叉反应。利用本发明抗禽脑脊髓炎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体制备的间接免疫荧光试剂盒具有良好的特异性和灵敏性。该试剂盒不仅可用于禽病毒类活疫苗中AEV的外源病毒检测，还可用于AEV的临床检测和流行病学调查。

生物保藏证明

杂交瘤细胞株AE Mab-VP1-25，于2023年5月17日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO:45613，保藏单位地址：北京朝阳区北辰西路1号院3号。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为实施例2蛋白小量表达图；其中M：Marker；1：未诱导对照(BL21)；2-3：IPTG诱导(BL21)；

图2为实施例2蛋白大量表达图；M：Marker；1：超声后全菌；2：超声后上清；3：超声后沉淀；

图3为实施例2蛋白质纯化图；M：Marker；1：纯化后蛋白质5倍稀释；2：纯化后蛋白质10倍稀释；

图4为实施例4间接免疫荧光试剂盒AEV病毒VR株特异性检测结果图；

图5为实施例4间接免疫荧光试剂盒AEV病毒Neuva株特异性检测结果图；

图6为实施例4间接免疫荧光试剂盒EDSV(127株)特异性检测结果图；

图7为实施例4间接免疫荧光试剂盒ALV(RAV-1株)特异性检测结果图；

图8为实施例4间接免疫荧光试剂盒ILTV(ILT/13株)特异性检测结果图；

图9为实施例4间接免疫荧光试剂盒ARV(Reo1133株)特异性检测结果图。

具体实施方式

本发明提供了抗禽脑脊髓炎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株AE Mab-VP1-25，所述杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC NO:45613。

在本发明中，所述抗禽脑脊髓炎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选方法优选包括：将所述禽脑脊髓炎病毒VP1蛋白的编码基因构建重组表达质粒，得到VP1蛋白；所述VP1蛋白免疫小鼠后得到免疫后的小鼠脾细胞悬液；所述免疫后的小鼠脾细胞悬液与SP2/0细胞融合、培养和筛选后得到杂交瘤细胞株。

本发明优选将所述禽脑脊髓炎病毒VP1蛋白的编码基因构建重组表达质粒，得到VP1蛋白。在本发明中，禽脑脊髓炎病毒VP1蛋白重组表位的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明所述构建重组表达质粒时应用的原始载体包括pET30a。本发明优选在VP1蛋白的编码基因与酶切位点EcoRⅠ和Xho I的基因序列重组后利用限制性内切酶EcoRⅠ和Xho I进行酶切、纯化回收后得到第一酶切产物；优选利用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoI对原始载体pET30a进行酶切，得到第二酶切产物；本发明优选将第一酶切产物和第二酶切产物用DNALigation Kit连接后得到重组表达质粒。

得到重组表达质粒后，本发明优选将所述重组表达质粒转化至BL21菌株进行诱导表达，得到表达产物；将所述表达产物纯化后得到VP1蛋白。本发明对所述表达产物纯化方法没有特殊的限定，采用常规的方法即可。本发明制备得到的VP1蛋白的浓度大于0.5mg/mL，纯度大于85％，可以作为禽脑脊髓炎病毒单克隆抗体制备的免疫原。在本发明中，所述禽脑脊髓炎病毒VP1蛋白为免疫原，所述禽脑脊髓炎病毒VP1蛋白的编码基因的核苷酸序列长度为822bp，高度保守，提高了检测禽脑脊髓炎病毒的间接免疫荧光试剂盒检测的敏感性。

得到VP1蛋白后，本发明将所述VP1蛋白免疫小鼠后得到免疫后的小鼠脾细胞悬液。本发明所述VP1蛋白优选与弗氏完全佐剂乳化后免疫小鼠。本发明所述免疫小鼠优选包括对小鼠依次进行初次免疫、第二免疫、第三免疫、第四免疫和冲击免疫。本发明所述VP1蛋白免疫小鼠的剂量优选为每只小鼠55～65μg，更优选为60μg。在本发明中，所述初次免疫、第二免疫、第三免疫和第四免疫的时间间隔优选为14d，冲击免疫距离细胞融合的时间间隔优选为3～5d，更优选为3d。本发明所述冲击免疫优选为免疫原VP1蛋白腹腔注射免疫。

获得免疫小鼠之后，本发明从免疫小鼠体内分离脾细胞，制备脾细胞悬浮液。本发明将免疫小鼠的脾细胞悬浮液和骨髓瘤细胞(SP2/0细胞)进行融合，得到融合细胞。本发明所述脾细胞悬浮液和骨髓瘤细胞的细胞数的比例为(1～2)：(1～2)，更优选为1:1。本发明优选利用50％PEG法进行融合。本发明所述融合时脾细胞悬浮液与骨髓瘤细胞的细胞数比例设定可以提高细胞融合效率。

得到融合细胞后，本发明对所述融合细胞进行培养和筛选后得到杂交瘤细胞株。本发明所述融合细胞优选在HAT培养液中进行培养后利用ELISA板筛选分泌抗禽脑脊髓炎病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。获得分泌抗禽脑脊髓炎病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株后，本发明优选利用间接免疫荧光检测法筛选得到与AEV的不同毒株全病毒具有良好反应性的分泌抗禽脑脊髓炎病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，本发明优选与AEV的不同毒株具有良好反应性的杂交瘤细胞株分泌进行亚克隆培养和冻存。

本发明提供了上述技术方案所述抗禽脑脊髓炎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌得到的单克隆抗体。

得到杂交瘤细胞株后，本发明优选利用杂交瘤细胞株注射小鼠腹腔，收集腹水，用Protein-A亲和纯化，获得AEV单克隆抗体。本发明杂交瘤细胞株AE Mab-VP1-25分泌的单克隆抗体的效价最高，所述单克隆抗体的效价为1:4000。

本发明提供了一种检测禽脑脊髓炎病毒的试剂或试剂盒，包括上述技术方案所述的单克隆抗体。

本发明提供了一种间接免疫荧光试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案的所述的单克隆抗体、FITC标记的羊抗鼠抗体、样品稀释液和洗涤液。

在本发明中，对所述FITC标记的羊抗鼠抗体的来源没有特殊限定，采用常规的产品即可。在本发明实施例中，所述FITC标记的羊抗鼠抗体优选购自Sigma公司。

在本发明中，所述间接免疫荧光试剂盒检测禽脑脊髓炎病毒样品的最低检出限为5TCID50。

在本发明中，所述样品稀释液优选包括pH值为7.2～7.4的9～11mM磷酸缓冲液，更优选为pH值为7.2的10mM磷酸缓冲液。

在本发明中，所述样品洗涤液优选包括pH值为7.2～7.4的9～11mM磷酸缓冲液，更优选为pH值为7.2的10mM磷酸缓冲液。

在本发明中，抗禽脑脊髓炎病毒的单克隆抗体，是基于VP1蛋白作为禽脑脊髓炎病毒重要的免疫原性蛋白，在禽脑脊髓炎病毒不同毒株之间高度保守所制备的单克隆抗体，可识别禽脑脊髓炎病毒不同毒株，而不与鸡减蛋综合征病毒(EDSV)等病毒发生交叉反应。本发明试剂盒具有良好的特异性。

本发明提供了上述技术方案所述的抗禽脑脊髓炎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株或上述技术方案所述的单克隆抗体或上述技术方案所述的所述的试剂或试剂盒或上述技术方案所述的间接免疫荧光试剂盒在检测禽用病毒活疫苗的安全性中的应用。在本发明中，所述禽病毒活疫苗优选包括鸡痘活疫苗，鸡马立克氏病I型、III型二价活疫苗，鸡马立克氏病I、III型二价活疫苗，鸡新城疫活疫苗，禽脑脊髓炎、鸡痘二联活疫苗，鸡传染性支气管炎活疫苗，鸡传染性喉气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗和鸡新城疫活疫苗中的一种或几种；更优选为鸡痘活疫苗，鸡马立克氏病I型、III型二价活疫苗，鸡马立克氏病I、III型二价活疫苗，鸡新城疫活疫苗，禽脑脊髓炎、鸡痘二联活疫苗、鸡传染性支气管炎活疫苗、鸡传染性喉气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗和鸡新城疫活疫苗。本发明所述鸡痘活疫苗优选为鸡痘活疫苗鹌鹑化弱毒株。本发明所述鸡马立克氏病I型、III型二价活疫苗优选为鸡马立克氏病I型、III型二价活疫苗814株+HVT Fc-126克隆株或鸡马立克氏病I、III型二价活疫苗CVI988+FC126株。本发明所述鸡新城疫活疫苗优选为鸡新城疫活疫苗Clone30株。本发明所述禽脑脊髓炎、鸡痘二联活疫苗优选为禽脑脊髓炎、鸡痘二联活疫苗YBF02株+鹌鹑化弱毒株；本发明所述鸡传染性支气管炎活疫苗优选为鸡传染性支气管炎活疫苗H120株；本发明所述鸡新城疫活疫苗优选为鸡新城疫活疫苗CS2株。利用本发明所述试剂盒检测禽用病毒活疫苗的安全性时，如果不出现特异性绿色荧光，则说明禽用病毒活疫苗未感染AEV，是安全的。

在本发明中，所述间接免疫荧光试剂盒检测禽脑脊髓炎病毒的方法优选包括如下步骤：待检测样品接种、荧光染色和结果判定。在本发明中，所述待检测样品接种优选接种于鸡原代法氏囊细胞中进行吸附和培养。本发明所述吸附的时间优选为50～70min，更优选为60min。本发明培养的温度优选为37℃，所述培养的时间优选为5～7d，更优选为6d。本发明所述待检测样品接种的作用为促进AE病毒的孵育和增殖。在本发明中，所述荧光染色包括固定、加一抗、洗涤、荧光二抗染色和洗涤。本发明所述一抗为AEV单克隆抗体。本发明所述荧光二抗优选为FITC标记的山羊抗小鼠IgG。在本发明中，所述结果判定时当接种孔视野中出现特异性绿色荧光，放大到200～400倍时，可见被感染细胞的细胞核和与细胞质均有着色时，判定该孔AEV检测为阳性；当接种孔未出现特异性绿色荧光时，判定该孔AEV检测为阴性。

本发明提供的一种检测AEV的间接免疫荧光试剂盒，所述抗AEV的单克隆抗体，是基于核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示编码基因编码的AEV保守序列VP1蛋白所制备的单克隆抗体，可识别只有一个血清型的AEV不同毒株，而不与EDSV等病毒发生交叉反应；VP1蛋白作为AEV重要的免疫原性蛋白，在AEV不同毒株之间高度保守。该试剂盒不仅可用于禽病毒类活疫苗中禽脑脊髓炎病毒的外源病毒检测，还可用于禽脑脊髓炎的临床鉴定、病毒含量测定(病毒倍比稀释和IFA方法测定病毒含量)和流行病学调查。

本发明提供了上述技术方案所述的抗禽脑脊髓炎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株或上述技术方案所述的单克隆抗体在制备检测禽脑脊髓炎病毒的试剂或试剂盒中的应用。

本发明的原理和最核心的关键技术是针对只有一个血清型的AEV的保守序列VP1蛋白进行二级结构、亲疏水性、抗原性等分析，构建重组表达质粒转化至原核表达载体进行表达纯化，通过免疫原VP1蛋白实现单克隆抗体制备，通过抗原抗体特异性反应，同时一抗被带有荧光标记的抗鼠IgG识别，以达到对AEV进行特异性鉴定的目的。

用IFA方法测定AEV的病毒含量：AEV倍比稀释后接种鸡原代法氏囊细胞，加入单抗和FITC标价二抗，根据荧光数计算病毒含量

本发明建立的基于单克隆抗体技术的IFA检测方法可用于检测AEV病毒，而不对其他病毒产生交叉反应，便捷高效，可操作性强，具有较高的特异性和灵敏度。疫苗中污染AEV是引起AE传播和流行的潜在风险，推广和使用该方法有利于进一步保证我国禽用病毒类活疫苗的纯净性和安全性，进而提高疫苗质量，还可用于AEV的临床检测、病毒含量测定和流行病学调查。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1AEVVP1蛋白序列分析

不同AEV毒株只有一个血清型，从NCBI上下载不同AEV毒株参考序列，通过分析发现，VP1蛋白在不同毒株中具有较高同源性，可作为表达蛋白的备选片段。根据蛋白序列二级结构分析及抗原性等，选取VP1蛋白作为免疫原。根据蛋白结构分析，选取全长VP1蛋白的核苷酸片段(822bp)进行序列合成，加入酶切位点后的序列在北京六合华大蛋白研发中心有限公司进行合成(SEQ ID NO:1)。

AEVVP1蛋白重组表位SEQ ID NO:1：

GAATTCGAATTCGGGAAAGGAGATGAAGGAGGTTTTAGTTCAGTCCCGGAGGTTGAACAACACGTGGTGGAGGACAAAGAGCCGCAAGGTCCGCTGCATGTTACTCCATTTGGTGCCGTGAAAGCTATGGAAGATCCGCAGCTCGCGCGTAAGACGCCAGGCACCTTCCCGGAGTTAGCGCCTGGCAAACCGCGCCACACCGTTGATCACATGGACCTGTACAAATTCATGGGCCGTGCGCATTATCTTTGGGGTCATAAATTCACCAAGACTGATATGCAGTATACCTTCCAAATCCCGTTGAGTCCGATTAAAGAGGGCTTCGTGACCGGTACACTGCGTTGGTTTCTGTCTCTGTTTCAACTGTATCGTGGTTCTCTGGACATCACCATGACCTTTGCTGGCAAGACCAATGTTGATGGTATTGTTTATTTTGTTCCGGAAGGTGTTGCAATCGAAACCGAAAGAAAGGAGCAAACGCCGTTGCTGACCCTGAATTACAAGACCTCCGTTGGTGCGATTCGTTTTAACACCGGCCAGACCACGAACGTCCAGTTCCGCATTCCGTTCTACACCCCGTTGGAGCACATTGCAACCCACAGCAAAAACGCCATGGATTCCGTGCTGGGTGCGATCACCACCCAGATCACGAACTACAGCGCACAGGATGAATATCTGCAGGTGACGTACTACATCAGCTTCAATGAAGATAGCCAGTTCAGCGTACCGCGCGCGGTGCCGGTTGTGTCCAGCTTTACTGACACCAGCAGCAAGACGGTGATGAACACCTACTGGCTGGACGACGACGAGTTGGTCGAGGAACTCGAGCTCGAG。

注：加入酶切位点后的序列信息如下，下划线为外加的EcoRI和XhoI酶切位点。

实施例2重组表达质粒的构建和表达纯化

1.重组表达质粒载体的构建

在实施例1的SEQ ID NO:1的5’端和3’端加入EcoRⅠ和Xho I酶切位点，用于重组表达质粒载体的制备。

用限制性内切酶EcoRⅠ和Xho I分别对添加酶切位点EcoRⅠ和Xho I后的SEQ IDNO:1和质粒表达载体pET30a进行双酶切，将纯化回收的VP1蛋白核苷酸片段和表达载体pET30a酶切产物用DNALigation Kit连接后，转化至感受态细胞(BL21)。

2.重组蛋白的小量表达

挑取经PCR鉴定为阳性的步骤(1)得到的BL21，BL21克隆到1.5mL含卡那霉素抗性的LB液体培养基中，在温度为37℃，转速为200r/min的条件下培养。培养至OD₆₀₀值为0.6～0.8。LB液体培养基中卡那霉素的质量浓度为50μg/mL。培养所得菌液中加入IPTG进行诱导，IPTG在培养所得菌液中的终浓度为0.5mM，诱导的温度为37℃，诱导的转速为200r/min，诱导的时间为2h。取1mL诱导所得菌液，在转速为12000r/min的条件下离心1min，弃上清，沉淀用100μLTris-HCl(pH 8.0)缓冲液吹散，加入与缓冲液等体积的2×loadingbuffer，在温度为100℃的条件下保持5min后进行电泳检测。电泳检测结果见图1，根据图1可知，在大小约43KD处出现重组VP1蛋白的特定目的条带(此蛋白实际分子量较理论值偏大，再次质粒基因测序后正确)，说明VP1蛋白表达成功。

3.重组蛋白的大量表达

(1)培养和IPTG诱导

步骤1得到的BL21采用PCR进行鉴定，对鉴定为阳性的BL21进行培养，将培养所得的BL21菌液按照体积比1:50的比例转接到250mL卡那霉素抗性LB液体培养基中，在温度为37℃，转速为200r/min的条件下进行震荡培养。LB液体培养基中卡那霉素的质量浓度为50μg/mL。培养至LB液体培养基的OD₆₀₀值为0.6～0.8后，在震荡培养所得LB液体培养基中加入IPTG进行诱导。IPTG在培养所得LB液体培养基中的终浓度为0.5mM，诱导温度为37℃，诱导时间为3h。诱导所得物进行离心收菌，离心转速为8000r/min，离心时间为6min。离心后弃上清得菌体沉淀，对所得菌体进行超声破菌。超声破菌的具体过程为：所得菌体沉淀用20～30mL 10mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液溶液吹散后得菌悬液进行超声波破碎(功率500W，180次，每次5s，间隔5s)。

(2)电泳检测

超声波破碎完成后，取100μL超声后的菌悬液，在转速为12000r/min的条件下离心10min，离心后保留50μL上清液和所得沉淀，所得沉淀用50μL10 mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液溶液吹散。分别取保留的上清液和沉淀吹散后所得的溶液进行SDS-PAGE检测，结果在上清液和沉淀中均检测到目的蛋白，在沉淀中检测到大量的目的蛋白，说明该重组菌表达形式为包涵体表达，见图2。

(3)重组蛋白的纯化

对步骤(2)中菌体沉淀中表达好的VP1蛋白进行纯化，方法如下：20～30mL10mMTris-HCl(pH8.0)溶液重悬步骤(2)超声离心得到的沉淀，静置10min；在12000r/min的条件下离心10min，上清转入另一管中保存。对于沉淀，用20～30mL 10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液重悬离心所得沉淀，静置10min；在12000r/min的条件下离心10min，弃上清，得第一沉淀。所得第一沉淀重复上述重悬和离心的步骤一次，得第二沉淀；第二沉淀中先加入少量的10mMTris-HCl(pH8.0)溶液重悬沉淀，再加入5～10mL含8M尿素的10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液溶解蛋白，在12000r/min的条件下离心10min，收集上清，取50μL样品进行SDS-PAGE电泳检测(图3)。以BSA(牛血清白蛋白)为标准，通过SDS-PAGE凝胶扫描分析估计纯化蛋白浓度>0.5mg/mL，纯度>85％，命名为AEV-VP1。

实施例3单克隆抗体的制备

1.小鼠的免疫

用实施例2制备的AEV-VP1纯化蛋白与弗氏完全佐剂按照体积比1:1乳化后，按照每只小鼠60μg的AEV-VP1纯化蛋白的量，皮下注射4只SPF BALB/c雌性小鼠(即为初次免疫)。并于初次免疫后的2周、4周、6周，分别皮下注射加强免疫，免疫量为每只小鼠30μgAEV-VP1纯化蛋白，初次免疫和第一次加强免疫间隔14d，第一次加强免疫和第二次加强免疫间隔14d，第二次加强免疫和第三次加强免疫间隔14d。第三次加强免疫后10日，眼眶取血，用间接ELISA测血清效价。选择血清效价高(ELISA抗体效价为1：102400)的小鼠，用免疫原(AEV-VP1纯化蛋白)50μg进行腹腔注射免疫冲击一次，免疫后3日，进行细胞融合。

2.细胞融合实验

无菌取步骤1免疫后的小鼠脾脏，制备成脾细胞悬液，取等体积的免疫脾细胞悬液与SP2/0细胞进行细胞融合。细胞融合采用常规50％PEG法。将细胞融合后的细胞分置于5块96孔板中，以HAT培养液(购自Sigma公司)进行选择性培养。

3.杂交瘤细胞的克隆与筛选

将上述96孔板中培养物经AEV-VP1蛋白和His标签蛋白包被的ELISA板进行筛选。筛选方法如下：

(1)包被ELISA板。用pH值为9.6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液稀释实施例2纯化好的AEV-VP1蛋白，终浓度为2μg/mL。ELISA板中每孔添加100μL稀释纯化后的AEV-VP1蛋白溶液，在温度为4℃的条件下，过夜；后用PBST(含质量浓度为0.05％吐温-20的PBS缓冲液)洗涤3次。

(2)封闭。包被ELISA板后用含质量浓度为2％牛奶的PBS缓冲液进行封闭，200μL/孔，37℃孵箱，2h，后用PBST(含0.05％吐温-20的PBS)洗涤3次。

(3)孵育一抗。封闭后，分别加入步骤2细胞融合后获得的杂交瘤细胞培养上清液(处理组)、阴性对照(SP2/0培养上清)、空白对照(PBS缓冲液)、阳性对照(AEV阳性血清用PBS缓冲液做1000倍稀释)作为一抗，均为100μL/孔，37℃孵箱，1h。

(4)洗涤。孵育一抗后用PBST(含质量浓度为0.05％的吐温-20的PBS)洗涤步骤(3)ELISA板，共洗涤3次。

(5)孵育二抗。洗涤后，ELISA板中分别加入用PBS缓冲液稀释20000倍的山羊抗小鼠IgG/HRP作为二抗，100μL/孔，37℃孵箱，1h。

(6)洗涤。用PBST(含0.05％吐温-20的PBS)洗涤3次。

(7)显色。加入显色液(含1％A液和10％B液的柠檬酸缓冲液，A液：用DMSO将TMB配成1％质量浓度；B液：质量浓度为0.1％的H₂O₂水溶液)100μL/孔，显色时间为5min左右。

(8)每孔加入50μL终止液(含2M硫酸)终止。

(9)读数。在双波长(450nm，630nm)波长下测吸光值，记录保存数据。

经检测，筛选到4号，19号，25号共3株ELISA阳性的杂交瘤细胞株供进一步筛选。试验结果见表1。吸光度值对目的蛋白值高同时对标签蛋白值低说明杂交瘤细胞株效价高。根据表1可知，25号杂交瘤细胞株的效价最高。

表1杂交瘤细胞株ELISA筛选结果

4.间接免疫荧光检测(IFA方法)

分别将步骤3ELISA筛选获得的3株阳性杂交瘤细胞株(4号、19号和25号)的上清作为一抗，采用间接免疫荧光法筛选到一株25号与AEV不同毒株全病毒具有良好反应性的细胞株，该细胞株命名为AEV VP1蛋白杂交瘤细胞株AE Mab-VP1-25。选取免疫荧光检测为阳性的细胞株采用有限稀释法进行亚克隆，直至细胞克隆抗体阳性率达100％。将上述亚克隆后阳性率达100％的阳性细胞株扩大培养后，液氮中保存。间接免疫荧光检测方法如下：

(1)阳性病毒板的制备。将AEV不同毒株(表2)病毒液分别用含2％新生牛血清的DF12培养液稀释成100TCID50/0.1mL，接种已长成良好鸡原代法氏囊细胞单层的96孔板。表2中的每个毒株接种4孔，100μL/孔。同时设鸡原代法氏囊细胞空白对照，空白对照的鸡原代法氏囊细胞接种表2中的对照病毒，对照病毒液分别用含2％新生牛血清的DF12培养液稀释成100TCID₅₀/0.1mL，每个毒株接种4孔，100μL/孔。然后置于37℃，含5％CO₂的温箱中培养5d，进行荧光染色。

表2AEV不同毒株和对照用毒株信息表

以上病毒株来自国家兽医微生物菌(毒)种保藏中心，CVCC，(请见中国兽医药品监察所、中国微生物菌种保藏管理委员会兽医微生物中心编著，《中国兽医菌种目录》第一版，中英文合订本，1992年，中国科学技术出版社，132、135和143页)；禽脑脊髓炎病毒(AEV)Neuva株，AV189详见中国兽药信息网、菌种保藏、菌(毒)种检索；禽白血病病毒(ALV)RAV-1株来自中国兽医药品监察所(毛娅卿，王嘉，吴涛，王哲，蒋桃珍，《禽白血病病毒p27蛋白在大肠杆菌中的表达和多克隆抗体的制备》，《中国兽药杂志》2013年11期61-66)。

(2)染色

1)固定。阳性病毒板制备后弃去96孔板的细胞培养液，每孔约加250μL含2％新生牛血清的DF12培养液，轻洗细胞表面1次，尽量弃尽DF12培养液，然后每孔加入100μL冷甲醇，置室温固定10～15min，弃去甲醇，自然晾干2～5min。

2)加一抗(单克隆抗体)。用PBS缓冲液(pH 7.2)洗细胞面1次，分别将待检的产生单克隆抗体的杂交瘤细胞株4号，19号，25号上清用PBS缓冲液稀释10倍，加入AEV病毒阳性细胞板(使用前用PBS洗涤1次)中，每孔50μL，37℃避光作用1h。

3)洗涤。弃去板孔中的单克隆抗体，用PBS缓冲液洗涤5次，每孔每次加入BS缓冲液0.3mL，轻微振荡洗涤。

4)荧光二抗染色。尽量弃尽洗液，每孔加入用PBS缓冲液作适当稀释(1:100～1:200)的荧光标记的羊抗小鼠IgG 50μL，37℃避光作用1h。

5)洗涤。方法同3)。

6)观察和结果判定。在荧光倒置显微镜下用蓝色激发光(波长490nm)观察，细胞有完整的细胞形态。当接种孔视野中出现特异性绿色荧光，放大到200～400倍时，可见被感染细胞的细胞核和与细胞质均有着色时，判定该孔AEV检测为阳性。当接种孔未出现特异性绿色荧光时，视野发暗，证明细胞未被感染，判定该孔AEV检测为阴性。采用间接免疫荧光法筛选到一株25号与AEV不同毒株全病毒具有良好反应性的细胞株，该细胞株命名为AEV VP1蛋白杂交瘤细胞株AE Mab-VP1-25，保藏编号为CGMCC NO:45613。

5.杂交瘤细胞的鉴定

(1)培养特性

用含10％～15％胎牛血清的DF12培养液，在37℃，5％CO₂培养箱中培养，用显微镜检查杂交瘤细胞株的细胞形态，观察杂交瘤细胞形态应一致。杂交瘤细胞形态应一致说明杂交瘤细胞状态良好。

(2)纯净性检验

按现行《中国兽药典》(中国兽药典委员会编，中华人民共和国兽药典，2020版，中国农业出版社，2020，本发明简称《中国兽药典》)附录方法进行无菌检验、支原体检验和外源病毒检验，结果均符合规定。

(3)胞核学检查

将培养24h的杂交瘤细胞用秋水仙素法检查染色体数目，观察染色体特征是否符合杂交瘤细胞的染色特性，结果符合预期。

(4)腹水的制备。取8～10周龄BALB/C小鼠，腹腔注射降植烷，每只0.5mL。7～10日后小鼠腹腔注射杂交瘤细胞株AE Mab-VP1-25×10⁶个/0.5mL/只，7～10日后，观察小鼠状态，待小鼠腹部明显膨大、行动不便时，抽取小鼠腹水，腹水在转速为3000r/min的条件下离心10min，取上清，-40℃保存。间隔2～3日，若腹水再次产生，可再次采集，此腹水用Protein-A亲和纯化后即为鼠抗AEV单克隆抗体。

(5)腹水效价测定

将每株单抗的腹水从1:100开始倍比稀释至1:102400，按照实施例3中“4.间接免疫荧光检测方法”测定腹水的荧光抗体效价，AEVVP1蛋白杂交瘤细胞株AE Mab-VP1-25的荧光抗体效价为1:4000。

实施例4检测AEV的间接免疫荧光试剂盒组装及应用

该试剂盒成分为实施例3制备的杂交瘤细胞株AE Mab-VP1-25的抗AEV的单克隆抗体，商品化的FITC标记的山羊抗小鼠抗体(购自：Sigma公司，货号F9006)，待检样品稀释液及洗涤液；稀释液及洗涤液均是10mM pH 7.2的磷酸缓冲液(PBS)。

该试剂盒检测禽脑脊髓炎病毒的步骤及判定标准如下：

1.待检测样品接种

将待检测样品100μL接种于长满96孔板的鸡原代法氏囊细胞单层，置37℃，吸附1h，每孔补加100μL含3％牛血清的DF12培养液，37℃培养5d。

2.荧光染色及结果判定

(1)固定。弃去96孔板的细胞培养液，每孔约加0.3mLPBS缓冲液(pH 7.2)轻洗细胞表面1次，尽量弃尽PBS，然后每孔加入0.2mL冷甲醇，置室温固定15min，弃去甲醇，自然晾干(5min)。

(2)加一抗。自然晾干后，用PBS缓冲液(pH 7.2)洗细胞面1次，然后每孔加入50μL用PBS缓冲液(pH值7.2～7.4)进行适当稀释的AEV单克隆抗体，置于37℃条件下作用1h。

(3)洗涤。弃去AEV单克隆抗体，用PBS缓冲液(pH 7.2)洗5次，每次每孔加入洗液0.3mL，轻微振荡洗涤。

(4)荧光二抗染色。尽量弃尽洗液，每孔加入50μL用PBS缓冲液(pH7.2～7.4)进行适当稀释的FITC标记的山羊抗小鼠IgG，置37℃条件下作用1h。

(5)洗涤。方法同(3)。

(6)观察和判定。在荧光倒置显微镜下用蓝色激发光(波长490nm)观察，细胞有完整的细胞形态。当接种孔视野中出现特异性绿色荧光，放大到200～400倍时，可见被感染细胞的细胞核和与细胞质均有着色时，判定该孔AEV检测为阳性。当接种孔未出现特异性绿色荧光时，视野发暗，证明细胞未被感染，判定该孔AEV检测为阴性。

3.试剂盒的特异性试验

按照实施例4中“1.待检测样品接种”和“2.荧光染色及结果判定”的检测禽脑脊髓炎病毒的步骤及判定标准进行检测。利用本发明的间接免疫荧光试剂盒检测表2中的不同的AEV毒株、鸡减蛋综合征病毒(EDSV)、禽白血病病毒(ALV)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)、禽正呼肠孤病毒(ARV)，观察感染病毒的细胞着色情况，确定该间接免疫荧光方法的特异性。

检测结果表明(见图4～图9)，该方法可以特异性地识别检测不同AEV毒株(见图4～5)反应结果均显示为阳性，而与EDSV(见图6)，ALV(见图7)，ILTV(见图8)和ARV(见图9)反应均为阴性，证明建立的方法特异性良好，该间接免疫荧光试剂盒可应用于AEV的特异性检测。

4.试剂盒的敏感性试验

将AEV(VR株)稀释为80TCID₅₀/100μL，以此为基础进行二倍倍比稀释至40TCID₅₀/100μL、20TCID₅₀/100μL、10T CID₅₀/100μL、5TCID₅₀/100μL、2.5TCID₅₀/100μL、1.25TCID₅₀/100μL、0.625TCID₅₀/100μL。将以上8个稀释度的样品，分别接种长满单层的鸡原代法氏囊细胞，100μL/孔，每个样品4个重复。同时设置DF12组作为阴性对照。按照实施例4中“1.待检测样品接种”和“2.荧光染色及结果判定”的检测禽脑脊髓炎病毒的步骤及判定标准进行检测。

结果各剂量梯度的AEV检测结果为，当感染剂量大于等于5TCID₅₀病毒时结果为阳性。以上结果表明，该试剂盒AEV待检测病毒AEV样品的最低检出限为5TCID₅₀。

5.试剂盒的初步应用

将本试剂盒应用于禽病毒类活疫苗的外源病毒检验，本试验选取了10家国内生产企业生产的禽用活疫苗重点品种，按照本发明的试剂盒进行AEV检测，按照实施例4中“1.待检测样品接种”和“2.荧光染色及结果判定”的检测禽脑脊髓炎病毒的步骤及判定标准进行检测。并根据《中国兽药典》2020年版三部对选取的禽病活疫苗进行AEV污染的血清学检验。同时设置PBS组为阴性对照，感染AEV(VR株)组为阳性对照。结果如表3所示，血清学检验和应用本试剂盒检测的结果一致，所选取的禽用活疫苗均无AEV污染，阴性对照为AEV检测阴性，阳性对照为AEV检测阳性。

表3采用本发明试剂盒对国内外企业疫苗检测结果

/>

综上，本发明制备的间接免疫荧光试剂盒可用于检测AEV病毒，而不对其他病毒产生交叉反应，便捷高效，可操作性强，具有较高的特异性和灵敏度。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (8)

1.一株抗禽脑脊髓炎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株AE Mab-VP1-25，其特征在于，所述杂交瘤细胞株AE Mab-VP1-25的保藏编号为CGMCC NO:45613。

2.权利要求1所述抗禽脑脊髓炎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌得到的单克隆抗体。

3.一种检测禽脑脊髓炎病毒的试剂或试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述的单克隆抗体。

4.一种间接免疫荧光试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2所述的单克隆抗体、FITC标记的山羊抗小鼠抗体、样品稀释液和样品洗涤液。

5.根据权利要求4所述的间接免疫荧光试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液包括pH值为7.2～7.4的9～11mM磷酸缓冲液。

6.根据权利要求4所述的间接免疫荧光试剂盒，其特征在于，所述样品洗涤液包括pH值为7.2～7.4的9～11mM磷酸缓冲液。

7.权利要求1所述的抗禽脑脊髓炎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株或权利要求2所述的单克隆抗体或权利要求3所述的试剂或试剂盒或权利要求4～6任一项所述的间接免疫荧光试剂盒在检测禽病毒活疫苗的安全性中的应用；所述安全性指是否有禽脑脊髓炎病毒污染。

8.权利要求1所述的抗禽脑脊髓炎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株或权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测禽脑脊髓炎病毒的试剂或试剂盒中的应用。