CN106755087B - 稳定表达猪瘟病毒e2蛋白的重组细胞系、制备方法、应用、及猪瘟病毒亚单位疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及制备稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系的方法，包括以下步骤：提供重组表达质粒，其包含彼此有效连接的猪瘟病毒E2蛋白编码序列和绿色荧光蛋白编码序列；将所述重组表达质粒与辅助质粒转染入真核细胞；通过荧光检测法筛选出表达所述重组表达质粒的单细胞，并对该单克隆细胞进行多次传代培养，获得经传代培养的细胞克隆；检测该细胞克隆中猪瘟病毒E2蛋白的表达量，筛选出经多次传代培养后仍能表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系，其中所述猪瘟病毒E2蛋白的核苷酸序列如序列1所示，所述编码猪瘟病毒E2蛋白的氨基酸序列如序列2所示。本发明还涉及稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系、应用及猪瘟病毒亚单位疫苗。

Description

稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系、制备方法、应用、及 猪瘟病毒亚单位疫苗
技术领域
本发明属于分子生物学与兽用生物制品技术领域。具体而言，本发明涉及一种稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系及制备方法、所述重组细胞系在制备猪瘟病毒亚单位疫苗中的应用、包含所述重组细胞系的猪瘟病毒亚单位疫苗以及猪瘟病毒亚单位疫苗的制备方法。
背景技术
猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fevervirus，CSFV)引起的猪的一种急性高度致死性疾病，强毒株可导致易感猪100％发病，并导致50％以上的死亡率，国际兽疫局(OIE)将其定为必须通报的疫病，我国将其列为一类动物疫病。由于不同日龄、性别和品种的猪均可感染发病，因此猪瘟给养猪业造成巨大地经济损失。该病呈世界性分布，在各养猪国家都有不同程度的流行。目前在中国，猪瘟是影响养猪业的最重要的疾病。当前我国猪瘟发病状况具有多样性，流行范围较广，呈散发流行趋势。从感染情况看，发病日龄小，成年猪带毒现象严重，非典型和繁殖障碍型猪瘟增多。猪瘟经常与猪蓝耳病、猪圆环病毒病、猪伪狂犬病、猪链球菌病、猪肺疫等混合感染，导致猪的死亡率增加。由于我国大多数生猪养殖企业规模较小，养殖技术和管理水平相对落后，猪的死亡率较高达近12％，由此造成的损失近百亿元，这也是导致近些年来猪肉价格不断升高的原因之一。
采用免疫接种是目前我国控制猪瘟的主要措施，疫苗质量的好坏直接影响疫病的免疫防治效果。现有技术中的猪瘟弱毒疫苗(C株)对世界范围内猪瘟防控发挥了卓著贡献。该疫苗目前仍被全世界多个国家所使用。猪瘟弱毒疫苗分为乳兔苗、免脾淋苗、原代细胞苗及传代细胞苗等。乳兔苗和脾淋苗又称为组织苗，是采用健康家兔生产制备的。组织苗的生产需要大量动物，且工艺复杂，成本高；原代细胞苗及传代细胞苗的生产也受到诸多因素困扰，如细胞培养用血清中的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)及抗体会干扰病毒生长，病毒生产滴度低、产量不稳定等。而且母源抗体干扰弱毒疫苗的免疫效果，这也是导致猪瘟疫苗免疫失败的因素之一。
CSFV为有囊膜病毒，病毒粒子大小约为40nm至60nm。病毒基因组为单股正链RNA，长约12.3kb，包含一个大的开放性阅读框(ORF)，编码一个大的具有3898个氨基酸残基的多聚蛋白，该多聚蛋白的分子量约为438kDa。猪瘟病毒含有结构蛋白和非结构蛋白，其中结构蛋白包括C、E0、E1和E2蛋白。E2蛋白为CSFV的一种重要的囊膜糖蛋白，又称为gp55，是病毒主要的抗原蛋白。E2蛋白诱导产生病毒的中和抗体，是猪瘟病毒主要的免疫保护性抗原，也是研究猪瘟基因工程疫苗的重要靶蛋白。鉴于现有猪瘟疫苗的种种缺陷与不足，以及随着现代基因工程技术与细胞生物工程技术的发展，许多科研人员试图以现代分子生物学手段研制出可以克服现有疫苗缺陷的新型猪瘟疫苗。
这些新型的猪瘟疫苗有病毒活载体疫苗、合成肽疫苗、DNA疫苗、大肠杆菌和昆虫杆状病毒表达的E2蛋白亚单位疫苗。目前得到应用的有欧洲科研人员研制的以昆虫杆状病毒表达的E2蛋白亚单位疫苗，该疫苗免疫不受母源抗体影响，而且可以与病毒感染进行抗体检测鉴别诊断。已有研究表明，用20μg昆虫细胞表达的E2油佐剂疫苗免疫猪，能抵抗CSFV强毒株的攻击。该疫苗已于上世纪九十年代在欧洲批准上市，在欧洲国家的猪瘟根除计划发挥了重要作用。
但该疫苗是通过昆虫杆状病毒表达系统表达的，相对原核表达系统而言，该表达系统表达蛋白后可以在一定程度上进行翻译后加工与修饰。但与病毒天然抗原蛋白结构仍有一定差异，蛋白表达后折叠与修饰不如哺乳动物细胞表达系统。而且该系统生产制备抗原时，细胞经病毒感染后细胞会裂解与死亡，对下游纯化等生产工艺增加难度。
发明内容
本发明探索了利用慢病毒载体介导在不同的哺乳动物细胞系中表达猪瘟病毒E2蛋白，并最终找到了合适的稳定表达细胞系，克服了表达猪瘟病毒E2囊膜糖蛋白对细胞毒性作用，并且建立了大规模筛选等技术。结果成功制备了稳定表达猪瘟病毒结构蛋白E2蛋白的重组细胞系。该重组细胞系表达E2蛋白的表达量高。
根据本发明的第一方面，提供了一种制备稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系的方法，包括以下步骤：
1)提供重组表达质粒，该重组表达质粒包含彼此有效连接的猪瘟病毒E2蛋白编码序列和绿色荧光蛋白编码序列；
2)通过脂质体转染法将所述重组表达质粒与辅助质粒转染入真核细胞；
3)通过荧光检测法筛选出表达所述重组表达质粒的单细胞，并对该单克隆细胞进行多次传代培养，获得经传代培养后的细胞克隆；
4)检测所述细胞克隆中猪瘟病毒E2蛋白的表达量，筛选出经所述多次传代培养后仍然能够表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系，
其中所述猪瘟病毒E2蛋白的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示，所述编码猪瘟病毒E2蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。
根据本发明的第二方面，在根据本发明第一方面所述的方法中，所述猪瘟病毒E2蛋白为猪瘟病毒C株E2蛋白。
根据本发明的第三方面，在根据本发明第一方面所述的方法中，所述方法还包括利用悬浮培养法或静置培养法培养所得重组细胞系。
根据本发明的第四方面，在根据本发明第一方面所述的方法中，将所述重组表达质粒与辅助质粒转染入HEK-293T细胞。
根据本发明的第五方面，在根据本发明第一方面所述的方法中，所述通过荧光检测法筛选出表达所述重组表达质粒的单细胞的步骤包括：通过荧光显微镜观察经所述脂质体转染法转染的细胞，将表现出绿色荧光的细胞群体进行有限稀释，从而筛选出表达所述重组表达质粒的单细胞。
根据本发明的第六方面，在根据本发明第一方面所述的方法中，所述多次传代培养为进行2-50次传代培养。
根据本发明的第七方面，在根据本发明的第一方面或第六方面所述的方法中，在步骤4)中，筛选出经所述多次传代培养后能够表达至少100ug/ml的猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系。
根据本发明的第八方面，提供了一种根据本发明第一至第七方面任一方面所述的方法获得的稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系。
根据本发明的第九方面，提供了一种猪瘟病毒亚单位疫苗，其包含有效剂量的由根据本发明第六方面所述的重组细胞系表达的猪瘟病毒E2蛋白和佐剂。
根据本发明的第十方面，在根据本发明第九方面所述的猪瘟病毒亚单位疫苗中，所述佐剂为矿物油佐剂。
根据本发明的第十一方面，在根据本发明第九方面所述的猪瘟病毒亚单位疫苗中，所述含猪瘟病毒E2蛋白的抗原液与佐剂的重量比为1:1至1:2。
根据本发明的第十二方面，在根据本发明第九方面所述的猪瘟病毒亚单位疫苗中，所述猪瘟病毒亚单位疫苗每头份包含浓度为30ug至50ug的猪瘟病毒E2蛋白。
根据本发明的第十三方面为根据本发明第八方面所述重组细胞系在制备猪瘟病毒亚单位疫苗中的应用。
根据本发明的第十四方面，提供了一种制备猪瘟亚单位疫苗的方法，包括以下步骤：
将根据第八方面所述的重组细胞系逐级放大培养至细胞密度为107个以上时，连续收集培养上清液；
将所述上清液与佐剂按重量比1:1～1:2进行混合。
根据本发明的第十五方面，在根据本发明第十四方面所述的方法中，所述佐剂为矿物油佐剂。
本发明的有益效果如下：
1.将本发明的表达猪瘟病毒E2蛋白制备成疫苗，免疫动物后可以诱导产生针对CSFV的高效价抗体，抗体产生早且持续时间长，并能抵抗强毒的攻击与感染。
2.本发明所选用的表达系统为真核(例如HEK-293T)细胞，得到的重组细胞系(例如HEK-293T-CE2)具有与亲本细胞相似的生物特性，有利于抗原蛋白的规模生产；表达蛋白在表达细胞内能得到接近病毒蛋白的天然构象与修饰加工，抗原性好。
3.本发明的重组细胞系可以悬浮或静止培养，适合于规模化大生产；细胞培养过程中不涉及到猪瘟病毒，具有良好的生物安全性。
4.本发明构建的重组细胞系蛋白表达量高，最低产量可达200mg/L，生产成本低。
5.本发明构建的重组细胞系含有绿色荧光蛋白，有利于细胞的筛选和克隆。
6.本发明的E2表达蛋白可以含有组氨酸标签，利于后期纯化。
7.利用本发明蛋白制备的疫苗免疫动物后，不产生猪瘟病毒E0蛋白抗体以及非结构蛋白抗体，可以利用检测猪瘟病毒E0蛋白抗体或非结构蛋白抗体来对疫苗免疫与病毒感染动物进行鉴别。
8本发明所制备的猪瘟疫苗为亚单位疫苗，不受母源抗体干扰，临床使用方便。
9.本发明表达的E2蛋白抗原能对免疫猪诱导产生良好的免疫反应，免疫猪可以完全抵抗猪瘟强毒标准株即石门株的攻击。该细胞系表达抗原所制备的疫苗可为猪瘟的预防提供新型、高效的预防制剂。对我国乃至世界范围内猪瘟的预防控制可以发挥重要作用。
附图说明
图1为重组真核细胞表达质粒构建示意图；
图2为不同细胞克隆表达目的基因的RT-PCR检测结果，其中M:Marker DL2000，大小依次为2000bp,1000bp,750bp,500bp,200bp和100bp；泳道1-5分别为：C1、C5、C7、C8和C9克隆细胞(C表示不同细胞克隆编号)；6：293T对照细胞；
图3为不同代次细胞克隆表达的E2蛋白的SDS-PAGE结果，其中M：Marker，大小依次为98KDa,62KDa,49KDa,38KDa,28KDa；泳道1-4分别为：C5F19、C5F25、C5F29和C5F39代克隆细胞培养上清液(C表示细胞克隆编号，F表示细胞传代代次，例如C5F19表示C5克隆细胞第19代，如此类推)；
图4为不同代次细胞克隆表达的E2蛋白的Western Blot结果，其中M：Marker，大小依次为198KDa,98KDa,62KDa,49KDa,38KDa,28KDa；泳道1-4分别为：C5F19、C5F25、C5F29和C5F39代克隆细胞培养上清液(C表示细胞克隆编号，F表示细胞传代代次，例如C5F19表示C5克隆细胞第19代，如此类推)；
图5为家兔免疫后攻毒的体温检测结果；
图6为2周龄仔猪免疫后血清猪瘟病毒ELISA抗体检测结果，其中阻断率≥40％为抗体阳性。
图7为60日龄猪免疫后血清猪瘟病毒ELISA抗体检测结果，其中阻断率≥40％为抗体阳性。
具体实施方式
下文将参考实施例详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均在本发明的保护范围之内。
本发明提供了一种制备稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系的方法，其特征在于，包括以下步骤：
提供重组表达质粒，该重组表达质粒包含彼此有效连接的猪瘟病毒E2蛋白编码序列和绿色荧光蛋白编码序列；
通过脂质体转染法将所述重组表达质粒与辅助质粒转染入真核细胞；
通过荧光检测法筛选出表达所述重组表达质粒的单细胞，并对该单克隆细胞进行多次传代培养，获得经传代培养后的细胞克隆；
检测所述细胞克隆中猪瘟病毒E2蛋白的表达量，筛选出经所述多次传代培养后仍然能够表达(优选表达量不低于100ug/ml)猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系，
其中所述猪瘟病毒E2蛋白的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示，所述编码猪瘟病毒E2蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。
在一个具体的实施方案中，所述方法包括以下步骤：
(1)构建重组表达质粒，将猪瘟病毒PCR产物回收后，与载体连接构建重组表达质粒，该质粒包含彼此有效连接的猪瘟病毒E2蛋白编码序列和绿色荧光蛋白编码序列；
(2)通过脂质体转染法将所述重组表达质粒与辅助质粒转染入HEK-293T细胞；
(3)通过荧光检测筛选表达重组表达质粒的HEK-293T细胞，利用有限稀释法对该细胞进行克隆；
(4)收获克隆细胞培养上清液，检测并比较猪瘟病毒E2蛋白表达量，获得稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系，
其中，所述猪瘟病毒E2蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述编码猪瘟病毒E2蛋白的氨基酸基因序列如SEQ ID No.2所示。
在本发明中，术语“稳定表达”是指细胞系在经过连续传代(例如50代)后仍然能够表达外源猪瘟病毒E2蛋白，优选所述表达的表达量不低于100ug/ml。
在本发明中，术语“有效连接”是指所述猪瘟病毒E2蛋白编码序列和所述绿色荧光蛋白编码序列位于同一个编码框中，能够被通读，从而被表达为重组蛋白。
在本发明中，猪瘟病毒E2蛋白优选为具有良好免疫原性的猪瘟病毒C株E2蛋白，该毒株制备的疫苗为全世界公认的最优猪瘟活疫苗。
在本发明中，本发明制备的稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系可悬浮培养或静止培养，优选悬浮培养。采用悬浮培养工艺培养重组细胞系，上清中的表达蛋白浓度可以提高十倍，且便于企业规模化生产猪瘟E2蛋白亚单位疫苗。
在本发明中，能够稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系，命名为HEK-293T-CE2，分类命名为人胚胎肾细胞(human kidney epithelial cells)。
在一个具体的实施方案中，所述通过荧光检测法筛选出表达所述重组表达质粒的单细胞的步骤包括：通过荧光显微镜观察经所述脂质体转染法转染的细胞，将表现出绿色荧光的细胞群体进行有限稀释，从而筛选出表达所述重组表达质粒的单细胞。
在一个具体的实施方案中，本发明提供了本发明的所述的方法获得的稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系。
在一个具体的实施方案中，本发明提供了一种安全、高效的猪瘟病毒亚单位疫苗，其包含有效剂量的经所述重组细胞系表达的猪瘟病毒E2蛋白和佐剂。在优选的实施方案中，所述佐剂为矿物油佐剂。在进一步的实施方案中，所述猪瘟病毒E2蛋白与佐剂的重量比为1:1。
在本发明中，所述猪瘟病毒亚单位疫苗每头份包含30-50ug的猪瘟病毒E2蛋白。
在一个具体的实施方案中，本发明提供了所述重组细胞系及其培养物在制备猪瘟病毒亚单位疫苗中的应用。
在一个具体的实施方案中，本发明提供了一种制备猪瘟亚单位疫苗的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将本发明所述的重组细胞系逐级放大培养至细胞密度为107以上时，连续收集培养上清，经离心取上清贮存于-40℃度以下保存；
(2)将培养液上清与佐剂按重量比1:1～1:2进行乳化，制备双项油佐剂疫苗。
在本发明中，所述佐剂优选为矿物油佐剂。
本发明制备的稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系可悬浮或静止培养，细胞增殖速度快，细胞连续传代后蛋白分泌稳定，表达量高，蛋白与佐剂制备成疫苗后免疫猪能诱导动物机体产生高效价猪瘟病毒抗体，可抵抗猪瘟病毒强毒攻击。
实施例
实施例1稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系的构建与检测
1.1材料和方法
1.1.1菌株、载体和主要试剂
转移质粒：pHBLV-CMVIE-IRES-ZSGreen购自汉恒生物。
JM109感受态细胞、RNA提取试剂盒、PrimeStar高保真聚合酶、DNA Marker为Takara产品；Reverse Transcription System、4-12％Bis-Tris Gel、SeeBlue Plus2pre-stained strandard为ThermoFisher公司产品；PGEM-T为Promega公司产品；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒为Omega产品；XbaI为NEB产品；DMEM/F12(1:1)、Foetal BovineSerum为GIBCO产品；Anti-Mouse IgG(Fc Specific)-peroxidase antibody produced ingoat为Sigma产品；Vector VIP Peroxidase(HRP)substrate kit为Vector Laboratories产品；Plasmid maxi Kit为QIAGEN产品；猪瘟病毒E2蛋白抗体ELISA试剂盒为IDEXX公司产品；HEK293T细胞购自汉恒公司。
1.1.2目的片段的扩增和纯化
根据Genebank中CSFV C株E2序列(登录号AY663656.1)，利用引物设计软件Primer5.0，设计两对引物(见表1)，由上海立菲生物科技有限公司合成。
表1 E2扩增引物
根据反转录试剂盒说明，用随机引物作为反转录引物，对提取的RNA进行反转录。以反转录产物为模板，以F1/R1为引物进行PCR扩增。将PCR产物回收记为E2-1，以E2-1为模板，F1/R2为引物再次进行PCR，将PCR产物回收记为E2。
将PCR产物回收后，与pGEM-T载体连接，转化到JM109细胞，取100μl涂布含有氨苄的LB琼脂，37℃过夜培养。利用菌落PCR的方法鉴定重组子，挑选阳性克隆送往上海立菲生物技术有限公司测序。
1.1.3重组表达质粒的构建
CSFV-E2基因大小为1050bp，在起始密码子前加有kozak序列和XbaI酶切位点与保护性碱基；在E2蛋白基因编码末端加有终止密码子、His标签和BamHI酶切位点与保护性碱基，完整的编码序列如SEQ NO.1所示。辅助质粒pHBLV-CMVIE-IRES-ZSGreen用XbaI、BamHI双酶切处理，然后与经XbaI、BamHI双酶切回收的CSFV-E2基因在T4DNA连接酶作用下连接，得到重组质粒，将该重组质粒转化到DH5α感受态细胞，过夜培养后挑选单菌落扩增培养并提取质粒，用XbaI、BamHI双酶切对其进行鉴定；酶切鉴定阳性质粒命名为pHBLV-CSFV-E2，同时送生物公司进行测序验证。质粒构建示意图见图1.
1.1.4细胞转染与筛选
选生长良好的HEK293T细胞消化传代至T25细胞瓶中，待细胞融合度达到60％至80％时，将包装所需质粒pHBLV-E2按LipoFiter转染试剂说明转染进HEK293T细胞，培养3天后将细胞用胰酶消化，有限稀释法将细胞传代于96孔板中继续培养，10至15天后在荧光显微镜下观察每孔细胞的克隆数，挑选含有一个细胞团块并且有明亮荧光的孔相继在24孔细胞板、6孔细胞板)、细胞培养瓶中扩大培养，同时收集各个克隆细胞上清用SDS-PAGE检测蛋白的表达水平。
1.2结果
1.2.1重组表达质粒的构建
构建的重组表达质粒pHBLV-CSFV-E2结构图见图1。提取的重组质粒经XbaI、BamHI双酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳分析，发现有两条带，酶切产物电泳带型与预期结果一致，同时测序结果表明重组质粒中XbaI、BamHI酶切位点间的序列和设计的编码E2蛋白的基因完全一致。
1.2.2 E2基因稳定表达细胞系的建立
1.2.2.1转染细胞株的筛选
转染后3天，通过有限稀释法将不同稀释度细胞置于96孔板中继续培养，每天在荧光显微镜下观察每孔细胞，对出现有单个荧光细胞的培养孔进行标记，筛选出5个阳性细胞克隆扩大培养。
1.2.2.2克隆细胞的RT-PCR鉴定
取5个不同克隆细胞和亲本293T细胞各一支，离心后取沉淀，用RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，取6μL进行反转录，加入Oligo dT 1μL,Annealing Buffer 1uL,2X First-Strand Reaction Mix 10μL和2μL的SuperScript III/RNaseOUT Enzyme Mix，充分混匀，50℃加热50分钟，85℃、5分钟终止反应，获得cDNA。然后以获得的cDNA为模板，利用CSFV-E2基因特应性引物(F1,R1)，PCR扩增目的基因，均能检测到目的基因片段。结果参见图2。
1.2.3 E2表达细胞系的筛选
1.2.3.1收取C1、C5、C7、C8和C9这5个克隆细胞在相同条件下的培养上清进行SDS-PAGE，比较不同克隆细胞E2蛋白的表达量，结果表明C5细胞克隆蛋白表达量最高，选取C5细胞克隆进行传代培养与进一步特性分析。C5克隆细胞经过不同代次传代后，对培养上清液中CSFV-E2含量进行检测，如图3所示，结果表明筛选出的克隆细胞系在多次传代后仍保持很好的蛋白表达水平。由上述结果可以看出构建的重组细胞系能够稳定表达目的蛋白。
1.2.3.2表达E2蛋白的Western Blot检测
细胞培养上清E2蛋白经SDS-PAGE，再用特异性单抗进行Western Blot检测，结果表明筛选出的克隆细胞系在连续传代后表达的蛋白均与单抗产生特异性反应，表明表达蛋白的活性没有发生变化(图4)。
将得到的能够稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的细胞克隆，命名为HEK293T-CE2。
实施例2猪瘟E2亚单位疫苗对家兔的免疫效力试验
2.1试验方法
2.1.1疫苗制备及免疫
将含量为50ug/ml的E2蛋白细胞培养上清液与油佐剂按重量比1:1混合后，在室温条件下以300RPM搅拌5分钟制备成疫苗。将6只日本大耳白家兔随机分为2组，其中4只为免疫组，每只经肌肉注射1ml疫苗(含有20ug E2蛋白)，另外2只不免疫作为对照组。
2.1.2抗体检测
免疫后，在第14天及21天采血，血清用商品化ELISA试剂盒检测猪瘟抗体。
2.1.3攻毒
免疫后21天，免疫组和对照组同时经耳静脉接种1ml兔化弱毒(含5000家兔感染量)。接种后，定时测量体温。
2.2结果
2.2.1血清学检测结果
家兔接种后第14天及21天猪瘟ELISA抗体均为阳性，阻断率详细见下表1。
表1家兔免疫后的猪瘟抗体检测结果
注：按试剂盒说明进行计算，阻断率≥40％为抗体阳性。
其中表示阴性对照平均
2.2.2攻毒试验结果
家兔免疫后第21天，用猪瘟兔化弱毒攻击，对照组均出现猪瘟兔化弱毒所导致的定型热反应，而免疫组家兔体温均正常，表明家兔接种后可产生中和抗体，能中和猪瘟兔化弱毒。体温结果参见图5。
实施例3猪瘟E2亚单位疫苗对猪的免疫效力试验
3.1.1.1对2周龄仔猪的免疫效力
(1)分组：将15头CSFV抗体检测为阴性的2周龄仔猪随机分为3组，每组5头猪，第一组为弱猪瘟活疫苗免疫组，第二组为猪瘟亚单位疫苗免疫组，第三组为空白对照组。
(2)免疫：第一组按使用说明书每头猪免疫1头份商品化的猪瘟活疫苗；第二组每头猪经肌肉注射接种1ml的实施例2制备的猪瘟E2蛋白亚单位疫苗；第三组不免疫作为空白对照组。
(3)抗体检测：猪瘟活疫苗免疫组、猪瘟E2蛋白亚单位疫苗免疫组和对照组均在接种后第14天、第28天、第42天采血，采集的血清用商品化ELISA抗体检测试剂盒进行抗体检测。
3.1.1.2对60日龄猪的免疫效力
(1)分组：将15头CSFV抗体检测为阴性的60日龄猪随机分为3组，每组5头猪，第一组为免疫组(一免组)，第二组为加强免疫组(二免组)，第三组为空白对照组。
(2)免疫：第一组每头猪经颈部肌肉接种2ml实施例2制备的猪瘟E2蛋白亚单位疫苗；第二组每头猪经颈部肌肉注射接种2ml实施例2制备的猪瘟E2蛋白亚单位疫苗，一免后21天每头猪再经颈部肌肉注射接种2ml实施例2制备的猪瘟E2蛋白亚单位疫苗；第三组不免疫作为空白对照。
(3)抗体检测：一次免疫(一免)组在接种后第14天、第21天和第28天采血；二次免疫(二免)组在一免后第14天及第21天，二免后第7天(即一免后28天)及第14天(即一免后第35天)采血；对照组与二次免疫组同时间采血采集的血清用商品化ELISA抗体检测试剂盒进行抗体检测。
(4)攻毒：一次免疫组在免疫后第28天，二次免疫组在加强免疫后14天(即首免后35天)按《中国兽药典》方法用猪瘟病毒标准强毒株进行攻击，攻毒后每日观察试验猪的精神状态、食欲与体温等指标。
3.2结果
3.2.1血清学结果
(1)2周龄仔猪血清学结果：用猪瘟E2蛋白亚单位疫苗免疫2周龄仔猪后14天，5头猪的ELISA抗体平均阻断率为43.85％，28天升高至67.3％，而42天进一步升高至74.96％，其抗体水平与猪瘟活疫苗免疫后相似，详细结果参见图5。
(2)60日龄猪的血清学结果：用猪瘟E2蛋白亚单位疫苗免疫60日龄仔猪后14天，两个免疫组猪瘟ELISA抗体均为阳性。一次免疫组接种后抗体继续升高至28天的77.15％；二次免疫组首免后21天的抗体变化与一次免疫组相似，但21天加强免疫后7天(即首免后28天)抗体迅速上升到较高水平，14天(首免后35天)与7天抗体相似，维持在高水平。详细结果参见图6。
3.2.2攻毒试验结果
攻毒后，两个免疫组猪均未出现任何猪瘟临床症状，剖检时淋巴结、脏器均无任何肉眼可见病理变化；而未免疫对照组猪攻毒后48小时体温均开始升高，精神沉郁，食欲减退或废绝，5头猪分别于攻毒后9-15天内死亡，死亡猪剖检均呈现典型的猪瘟症状。
血清学和免疫攻毒试验结果表明，本发明疫苗免疫猪后能诱导产生较高水平的保护性抗体，且对强毒攻击可提供100％的保护。

Claims (12)

1.一种制备稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提供重组表达质粒，该重组表达质粒包含彼此有效连接的猪瘟病毒E2蛋白编码序列和绿色荧光蛋白编码序列；
2)通过脂质体转染法将所述重组表达质粒与辅助质粒转染入真核细胞；
3)通过荧光检测法筛选出表达所述重组表达质粒的单细胞，并对该单克隆细胞利用悬浮培养法或静置培养法进行多次传代培养，获得经传代培养后的细胞克隆；
4)检测所述细胞克隆中猪瘟病毒E2蛋白的表达量，筛选出经所述多次传代培养后仍然能够表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系，其中猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系能够表达至少100ug/ml,
其中所述猪瘟病毒E2蛋白的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示，所述编码猪瘟病毒E2蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述猪瘟病毒E2蛋白为猪瘟病毒C株E2蛋白。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述重组表达质粒与辅助质粒转染入HEK-293T细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述通过荧光检测法筛选出表达所述重组表达质粒的单细胞的步骤包括：通过荧光显微镜观察经所述脂质体转染法转染的细胞，将表现出绿色荧光的细胞群体进行有限稀释，从而筛选出表达所述重组表达质粒的单细胞。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多次传代培养为进行2-50次传代培养。
6.一种根据权利要求1至5中任一项所述的方法获得的稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系。
7.一种猪瘟病毒亚单位疫苗，其包含有效剂量的由根据权利要求6所述的重组细胞系表达的猪瘟病毒E2蛋白和佐剂。
8.根据权利要求7所述的猪瘟病毒亚单位疫苗，其特征在于，所述佐剂为矿物油佐剂。
9.根据权利要求7所述的猪瘟病毒亚单位疫苗，其特征在于，所述含猪瘟病毒E2蛋白的抗原液与佐剂的重量比为1:1至1:2。
10.根据权利要求9所述的猪瘟病毒亚单位疫苗，其特征在于，所述猪瘟病毒亚单位疫苗每头份包含浓度为30ug至50ug的猪瘟病毒E2蛋白。
11.根据权利要求6所述重组细胞系在制备猪瘟病毒亚单位疫苗中的应用。
12.一种制备猪瘟亚单位疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将根据权利要求6所述的重组细胞系逐级放大培养至细胞密度为107个以上时，连续收集培养上清液；
将所述上清液与佐剂按重量比1:1～1:2进行混合，所述佐剂为矿物油佐剂。
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