CN114853906B - 一种重组森林脑炎病毒的融合蛋白和重组森林脑炎病毒细菌样颗粒疫苗及它们的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种重组森林脑炎病毒的融合蛋白和重组森林脑炎病毒细菌样颗粒疫苗及它们的应用，属于疫苗技术领域。为了提供一种免疫效力更好的森林脑炎病毒疫苗。本发明提供一种重组森林脑炎病毒的融合蛋白，所述融合蛋白是森林脑炎病毒包膜蛋白E蛋白，利用Linker将锚钩蛋白PA3和抗原蛋白串联获得融合蛋白，融合蛋白与GEM颗粒结合，将抗原蛋白展示在GEM颗粒表面制备获得的重组森林脑炎病毒细菌样颗粒疫苗。GEM颗粒具有良好的抗原表面展示性质，可诱导小鼠产生特异性免疫应答。

Description

一种重组森林脑炎病毒的融合蛋白和重组森林脑炎病毒细菌 样颗粒疫苗及它们的应用
技术领域
本发明属于疫苗技术领域，具体涉及一种重组森林脑炎病毒的融合蛋白和重组森林脑炎病毒细菌样颗粒疫苗及它们的应用。
背景技术
森林脑炎(Tick-borne encephalitis，TBE)又称蜱传脑炎，是在欧亚大陆上普遍存在的由蜱传脑炎病毒引起一种嗜神经性疾病。近年来，该病的发病率和流行范围不断增加。可造成严重的急性临床病程和长期病状，在人类中引起轻度或中度发热性疾病，并伴随致死性脑炎等后遗症，病死率高达30％。目前还没有针对森林脑炎的具体治疗方法，但免疫可以有效预防森林脑炎。
森林脑炎病毒(Tick-borne encephalitis virus，TBEV)为黄病毒科黄病毒属的单股正链 RNA病毒，长约11kb，包含一个开放阅读框，编码三个结构蛋白(C、prM和E)和七个非结构蛋白(NS1,、NS2A,、NS2B,、NS3,、NS4A、NS4B和NS5)。其中E蛋白为包膜蛋白，含有中和表位，在免疫预防中发挥重要作用。2005年，国际病毒命名委员会根据基因型将 TBEV分为三种亚型：欧洲亚型(Eu-TBEV)、西伯利亚亚型(Sib-TBEV)和远东亚型 (FE-TBEV)，每一种亚型都可导致不同严重程度的临床疾病。近年来，在此基础上又分离出了贝加尔亚型(Bkl-TBEV)和喜马拉雅亚型(Him-TBEV)，目前并未发现相应病例，其致病性有待进一步研究。其中FE-TBEV毒力最强，可造成严重的神经系统疾病，病死率高达30％，极易出现神经系统后遗症。目前蜱传脑炎尚无治疗的特效药，临床上只能采取对症治疗，目前获批的几种灭活疫苗尽管表现了良好的安全性和免疫原性，但需多次免疫且成本较高，可能会出现灭活不完全的情况，因此市场上亟需安全性高、成本低、能够刺激机体产生高的免疫力的新型TBEV疫苗。
传统灭活疫苗(这些传统疫苗都是灭活疫苗)FSME-Immun和Encepur，基础免疫程序需要3剂，接种程序为第1、2剂次间隔1-3个月，第2、3剂次间隔5-12个月(Encepur需要9-12个月)，Encepur可在0、7、21d接种，之后12-18个月接种第4剂。
传统灭活疫苗TBE-Moscow和Ence Vir，2剂次，Ence Vir不推荐用于3-17岁的人群可能会引起≤19％受种者的高热和过敏性反应，安全性低。
发明内容
本发明的目的是为了有提供一种安全性高、成本低且免疫效力好的森林脑炎病毒疫苗。
本发明提供一种重组森林脑炎病毒的融合蛋白，所述融合蛋白是森林脑炎病毒包膜蛋白 E蛋白，利用Linker将锚钩蛋白PA3和森林脑炎病毒包膜蛋白E蛋白串联获得融合蛋白。
进一步地限定，所述Linker的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
进一步地限定，所述锚钩蛋白PA3的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
进一步地限定，森林脑炎病毒包膜蛋白E蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步地限定，所述融合蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO.8所示。
本发明提供一种编码上述的融合蛋白的基因。
本发明提供一种森林脑炎病毒包膜蛋白E蛋白在制备森林脑炎病毒疫苗中应用。
进一步地限定，森林脑炎病毒包膜蛋白E蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明提供了一种重组森林脑炎病毒细菌样颗粒疫苗，所述重组森林脑炎病毒细菌样颗粒疫苗是将上述的森林脑炎病毒包膜蛋白E蛋白展示在GEM颗粒表面制备获得的。
本发明提供一种上述的融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法如下：
(1)将编码锚钩蛋白PA3蛋白的基因与编码森林脑炎病毒包膜蛋白E蛋白的基因通过编码Linker的基因连接获得重组基因；
(2)将步骤(1)获得的重组基因与表达载体pFastBac Dual连接获得重组质粒；
(3)将步骤(2)获得的重组质粒转化到DH10Bac感受态细胞中，获得重组工程菌，提取重组工程菌中的重组杆粒；
(4)将步骤(3)获得的重组杆粒转染Sf9细胞中，获得重组病毒，培养重组病毒获得取细胞悬液，融合蛋白即在细胞悬液中。
本发明提供上述的融合蛋白或者上述的重组森林脑炎病毒细菌样颗粒疫苗在制备治疗或预防感染森林脑炎病毒的疾病的药物中的应用。
有益效果：本申请提供的森林脑炎病毒GEM颗粒疫苗，主要是用Linker将锚钩蛋白PA3 和森林脑炎病毒包膜蛋白E蛋白串联，使用昆虫细胞-杆状病毒表达系统对E-Linker-PA3进行表达，将Bac-to-Bac表达系统制备的重组抗原E-Linker-PA3展示在GEM颗粒表面制备而成，GEM颗粒具有良好的抗原表面展示性质，可诱导小鼠产生特异性免疫应答，经肌肉注射免疫小鼠，2次免疫后可产生免疫记忆，能刺激机体产生较强细胞免疫和体液免疫，诱导小鼠产生较高的特异性IgG抗体(最高1：106.9)，末次免疫后24周IgG水平1：106.0。
附图说明
图1为重组质粒pFBD-E-Linker-PA3-E-Linker-PA3示意图。
图2为E-Linker-PA3基因的PCR扩增结果；其中，A：TBEV E和Linker-PA3基因扩增结果； B：E-Linker-PA3(PH)基因PCR扩增结果；C：E-Linker-PA3(P10)基因PCR扩增结果。1：TBEV E基因的PCR扩增产物；2：Linker-PA3基因的PCR扩增产物；3：E-Linker-PA3 (PH)的PCR扩增产物；4：E-Linker-PA3(P10)的PCR扩增产物。
图3为重组质粒pFBD-E-Linker-PA3-E-Linker-PA3的鉴定；其中，A：pFBD-E-Linker-PA3 双酶切鉴定结果；B：pFBD-E-Linker-PA3-E-Linker-PA3双酶切鉴定结果。1：pFBD-E-Linker-PA3酶切产物；2：pFBD-E-Linker-PA3-E-Linker-PA3酶切产物。
图4为重组杆粒rBacmid-E-Linker-PA3的PCR鉴定图；其中，1:rBacmid-E-Linker-PA3 PH 端鉴定结果；2:rBacmid-E-Linker-PA3 P10端鉴定结果。
图5为感染重组杆状病毒后Sf9细胞的形态变化；其中，A：正常的Sf9细胞；B：重组杆状病毒rBV-E-Linker-PA3感染Sf9细胞。
图6为重组杆状病毒rBV-E-Linker-PA3的鉴定；其中，A：间接免疫荧光鉴定(A-a:正常的 Sf9细胞；A-b:重组杆状病毒rBV-E-Linker-PA3感染Sf9细胞)；B：Western Blot鉴定(1: rBV-E-Linker-PA3的细胞悬液；2:rBV-E-Linker-PA3培养上清；3:rBV-E-Linker-PA3细胞沉淀悬液)。
图7为TBEV BLPs的鉴定；其中，A：Western Blot鉴定(1:GEM颗粒对照；2:TBEVBLPs)； B：间接免疫荧光鉴定(B-a:GEM颗粒；B-b:TBEV BLPs)；C：电镜观察(C-a:GEM颗粒；C-b:TBEV BLPs)。
图8为小鼠血清TBEV IgG抗体的检测。
图9为首免后腹股沟淋巴结中免疫细胞的流式细胞术分析；其中，A：小鼠淋巴结DC细胞的活化(A-a:CD11c+CD80+双阳性细胞比例；A-b:CD11c+MHCⅠ+双阳性细胞比例；A-c:CD11c+MHCⅡ+双阳性细胞比例)；B：小鼠淋巴结B细胞的募集和活化(B-a:CD19+CD40+双阳性细胞比例；B-b:CD19+CD69+双阳性细胞比例)。
图10为脾细胞IFN-γ与IL-4的ELISpot检测；其中，A：脾细胞IFN-γ的ELISpot检测；B：脾细胞IL-4的ELISpot检测。
图11为脾细胞增殖试验。
图12为细胞因子检测；其中，A：Th1型细胞因子；B：Th2型细胞因子。
图13为加强免疫后小鼠脾细胞的流式细胞术分析；其中，A：小鼠脾脏T细胞的募集和活化(A-a:CD4+CD69+双阳性细胞比例；A-b:CD8+CD69+双阳性细胞比例)；B：小鼠脾脏记忆T细胞的产生(B-a:CD4+/CD44+CD62L+双阳性细胞比例；B-b:CD8+/CD44+CD62L+双阳性细胞比例)。
具体实施方式
pFastBac Dual是商业购买载体。
实施例1.重组杆状病毒rBV-E-Linker-PA3的构建与鉴定
1、引物设计与合成
设计特异性扩增引物(表1)。参考TBEV远东亚型毒株WH2012(GenBank：KJ755186)包膜蛋白E基因，设计上游引物E-PH-F(添加NotⅠ酶切位点)、下游引物E-R(在3’端加入21bp的Linker基因)。WH2012-TBEV-E(无跨膜域)，DNA，1251bp，基因序列如SEQ ID NO.1所示。WH2012-TBEV-E(无跨膜域)，氨基酸，417aa，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
根据实验室保存的Linker-PA3基因设计上游引物Linker-PA3-F(在5’端加入22bp的 TBEV包膜蛋白E的C端基因)、下游引物Linker-PA3-R(添加HindⅢ酶切位点)。Linker，DNA，24bp，基因序列如SEQ ID NO.3所示，4Linker，氨基酸，8aa，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
PA3基因序列，DNA，672bp，如SEQ ID NO.5所示。PA3，氨基酸，224aa，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
将E基因、Linker基因和PA3基因连接得到E-Linker-PA3，DNA，1947bp，序列如SEQID NO.7所示。E-Linker-PA3，氨基酸，649aa，序列如SEQ ID NO.8所示。
构建pFBD-E-Linker-PA3载体的过程：将包膜蛋白E基因与Linker-PA3基因连接，并间接到pFastBac Dual载体上获得pFBD-E-Linker-PA3。
以PH端构建完成的重组质粒pFBD-E-Linker-PA3为模板设计上游引物E-P10-F(添加 SmaⅠ酶切位点)、下游引物Linker-PA3-P10-R(添加NheⅠ酶切位点)。
根据昆虫细胞-杆状病毒表达载体pFastBac Dual设计PH端鉴定引物PHF和M13R、P10 端鉴定引物M13F和P10R。
表1引物信息
Figure SMS_1
Figure SMS_2
注：下划线为酶切位点。
构建pFBD-E-Linker-PA3-E-Linker-PA3重组质粒的方法：E-Linker-PA3和 pFBD-E-Linker-PA3连接，获得pFBD-E-Linker-PA3-E-Linker-PA3重组质粒。
pFBD-E-Linker-PA3-E-Linker-PA3重组质粒的示意图的如图1所示，
2、重组质粒pFBD-E-Linker-PA3-E-Linker-PA3的构建与鉴定
(1)目的基因E-Linker-PA3(PH)的扩增
以TBEV E基因为模板，E-PH-F和E-R为引物扩增TBEV-E基因(图2A)。以含Linker-PA3 基因的质粒为模板，Linker-PA3-F和Linker-PA3-R为引物扩增Linker-PA3基因(图2A)，反应条件如表2所示，经1％琼脂糖凝胶电泳分离回收两个目的片段。以扩增的TBEV-E和 Linker-PA3基因为模板，E-PH-F和Linker-PA3-R为引物，以overlap的方法扩增E-Linker-PA3 (PH)基因，将两个目的片段串联起来。扩增产物与目的片段大小一致(图2B)，E-Linker-PA3(PH)基因成功扩增。
表2 PCR反应条件
Figure SMS_3
(2)重组质粒pFBD-E-Linker-PA3的构建与鉴定
回收的E-Linker-PA3(PH)基因和pFastBac Dual载体经NotⅠ和HindⅢ双酶切，将酶切后的产物连接并转化Stellar感受态细胞，涂布于氨苄抗性的固体LB平板上，37℃倒置培养12h后，挑取单克隆菌株至氨苄抗性的液体LB中震荡培养12h，提取质粒用NotⅠ和HindⅢ进行双酶切鉴定(图3A)，鉴定正确的质粒进行序列测定分析，结果显示其序列与合成的TBEV-E-PA3基因序列同源性为100％，含E-Linker-PA3基因的重组质粒构建成功，将该质粒命名为pFBD-E-Linker-PA3。
(3)目的基因E-Linker-PA3(P10)的扩增
以重组质粒pFBD-E-Linker-PA3为模板，E-P10-F和Linker-PA3-P10-R为引物扩增TBEV-E-PA3(P10)基因(图2C)。经琼脂糖凝胶电泳分析，扩增产物与目的基因片段大小相符，TBEV-E-PA3(P10)基因扩增成功。
(4)重组质粒pFBD-E-Linker-PA3-E-Linker-PA3的构建与鉴定
回收的E-Linker-PA3(P10)基因和重组质粒pFBD-E-Linker-PA3经SmaⅠ和NheⅠ双酶切，将酶切后的产物连接并转化Stellar感受态细胞，挑取单克隆菌株，提取质粒后用SmaⅠ和NheⅠ进行双酶切鉴定(图3B)，酶切产物与与E-Linker-PA3基因大小一致，成功构建了含E-Linker-PA3基因的重组质粒，将其命名为pFBD-E-Linker-PA3-E-Linker-PA3。
3、重组杆粒rBacmid-E-Linker-PA3的制备与鉴定
将重组质粒pFBD-E-Linker-PA3-E-Linker-PA3转化到DH10Bac感受态细胞中，并涂布于含有四环素(10μg/mL)、硫酸卡那霉素(50μg/mL)、庆大霉素(7μg/mL)、IPTG和X-Gal的三抗性固体LB平板上，37℃倒置培养40h。挑取白斑，37℃200rpm震荡培养16h，提取杆粒进行PCR鉴定。以杆粒为模板，以PHF和M13R为引物鉴定PH启动子下目的基因；以M13F和P10R为上、下游引物鉴定P10启动子下目的基因，PCR反应如表3所示。结果显示，扩增产物与目的片段大小相符(图4)，说明重组杆粒制备成功，将鉴定正确的杆粒命名为rBacmid-E-Linker-PA3。
表3 PCR反应条件
Figure SMS_4
4、重组杆状病毒rBV-E-Linker-PA3的拯救
将Sf9细胞接种至六孔板中，27℃培养12h，待细胞长至80％以上，更换为双无Grace’s 培养基，分别使用双无Grace’s培养基稀释阳性重组杆粒rBacmid-E-Linker-PA3(4μg)与 CellfectinⅡReagent(8μL)，轻轻混匀，静置20min后均匀加入6孔板中，27℃静置培养5h，换液为Grace’s完全培养基，27℃静置培养5天，每天观察细胞状态。与正常贴壁Sf9细胞相比，重组杆粒rBacmid-E-Linker-PA3转染后的贴壁Sf9细胞出现膨大变圆、大量脱落等明显的细胞病变现象(图5)。待第5天60％细胞出现病变时，收取上清为第一代重组杆状病毒，命名为rBV-E-Linker-PA3，继续盲传3代。
5、重组杆状病毒rBV-E-Linker-PA3的鉴定
(1)间接免疫荧光鉴定
取生长状态良好的Sf9细胞均匀铺入六孔板，待细胞长至70％，接种重组杆状病毒，每孔10μL，27℃培养48h后弃掉培养基。用70％乙醇溶液固定30min，100倍稀释抗TBEVE-D Ⅲ鼠血清(1％BSA稀释)作为一抗，37℃孵育1h，200倍稀释FITC-标记的山羊抗鼠IgG作为二抗，避光37℃孵育1h。每步操作结束均使用PBS清洗3次。在倒置荧光显微镜下观察细胞。结果显示(图6A)，与正常细胞对照相比，感染重组杆状病毒的贴壁Sf9细胞在荧光显微镜下呈明显的绿色荧光，表明重组杆状病毒感染细胞后可成功表达TBEV E蛋白。
(2)Western Blot鉴定
取重组杆状病毒感染悬浮培养的Sf9细胞，27℃120rpm培养96h后，低速离心收集细胞和培养上清，取细胞悬液、培养上清和细胞沉淀悬液制备样品，以1:300稀释的抗TBEVE-D Ⅲ鼠血清为一抗，1:20000稀释的HRP标记的山羊抗鼠IgG为二抗，进行Western Blot鉴定。结果显示(图6B)，重组杆状病毒培养上清中可以检测到约70kD的特异性蛋白条带，与软件预测的蛋白大小一致。综上表明，重组杆状病毒感染Sf9细胞后，可成功表达TBEV-E-PA3蛋白，且可分泌表达到上清中。
实施例2.TBEV BLPs的制备及鉴定
1、TBEV BLPs的制备
通过三氯乙酸制备GEM颗粒，将制备好的GEM颗粒与实施例1获得的TBEV-E-PA3 蛋白在室温下旋转结合1h。PA3与GEM颗粒锚定结合后，经8000g，4℃离心10min，用无菌PBS洗涤5遍，获得的沉淀用PBS悬浮，制备TBEV BLPs。
2、Western Blot鉴定
取GEM颗粒、TBEV BLPs为样品，以1:300稀释的抗TBEV E-DⅢ鼠血清为一抗， 1:20000稀释的HRP标记的山羊抗鼠IgG为二抗，进行Western Blot鉴定。结果显示(图7A)，在70kD处出现特异性蛋白条带，表明融合蛋白TBEV-E-Linker-PA3成功锚定在GEM颗粒上。
3、间接免疫荧光鉴定
取GEM颗粒、TBEV BLPs为样品，用3％BSA室温封闭30min，以1:200稀释的TBEV E-DⅢ鼠血清作为一抗，室温孵育1h。用PBS清洗3次，以1:200稀释FITC-标记的山羊抗鼠IgG为二抗，室温避光孵育1h。然后用PBS洗涤3次，用去离子水重悬沉淀，滴加在载玻片上，用荧光显微镜观察，结果显示(图7B)，TBEV BLPs在荧光显微镜下可见亮绿色颗粒，表明融合蛋白TBEV-E-Linker-PA3成功锚定在GEM颗粒上。
4、TBEV BLPs的透射电镜观察
取新鲜制备的GEM颗粒和TBEV BLPs各1U，8000g离心2min后，小心吸弃上清，用固定液固定沉淀，包埋，切片，在透射电镜下观察颗粒的形态结构。结果发现(图7C)，GEM 颗粒结构完整，内容物少，表面干净；与融合蛋白TBEV-E-PA3结合后的GEM颗粒表面有大量絮状物。综上，融合蛋白TBEV-E-Linker-PA3锚定在GEM颗粒表面，TBEV BLPs制备成功。
实施例3.TBEV BLPs免疫效果评价
1、小鼠免疫
为评价TBEV BLPs免疫效果，将27只16-18g健康的雌性BALB/c小鼠随机分为3组，实验组小鼠以纯化的TBEV BLPs作为抗原辅以复合佐剂Poly(I:C)&Montanide ISA 201VG。按抗原：Poly(I:C)：Montanide ISA 201VG＝35：10：55的比例，先将抗原与Poly(I:C)混合后，与Montanide ISA 201VG(31℃预热)一起乳化，在涡旋振荡器上震荡10min，待乳化完全后，21℃静置1h后备用。每只小鼠肌肉注射100μL免疫原，分组方案如下表4所示：
表4 BALB/c小鼠免疫及分组方案
Figure SMS_5
2、小鼠血清TBEV IgG抗体的检测
以PBS组小鼠血清作为阴性对照，用TBEV抗体间接ELISA检测方法，检测TBEV BLPs免疫后第1(首免后1周)、3、4(二免后1周)、6、8、10、12、16、20和24周小鼠血清 IgG抗体水平。步骤如下：以终浓度1μg/mL的原核表达纯化的重组蛋白TBEV E-DⅢ作为包被抗原，4℃包被过夜。以5％脱脂奶粉作为封闭液；从1：100开始2倍倍比稀释待检小鼠血清作为一抗；以1：40000倍稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG抗体作为二抗。TMB显色3 min后用0.5M H2SO4终止显色。于酶标仪450nm波长处读取各孔OD值，将待检血清OD450/ 阴性血清OD450≥2.1时的最高血清稀释度作为ELISA抗体效价。
结果显示(图8)：首免后1周小鼠血清中即可检测到TBEV特异性IgG抗体(1:101.7)；二免后小鼠血清IgG抗体水平显著提高，最高可达1:106.9(均值为1:106.3)；小鼠血清TBEVIgG抗体水平在第8周开始缓慢下降，二免后5个月仍能保持在1:106。
3、腹股沟淋巴结中免疫细胞的流式细胞术分析
首次免疫后第1周，随机选取TBEV BLPs、Adjuvant和PBS组小鼠各3只，分别取小鼠腹股沟淋巴结制备淋巴细胞悬液，细胞染色，在流式细胞仪上检测荧光信号。
(1)小鼠淋巴结DC细胞的活化分析
小鼠腹股沟淋巴结细胞经CD80+、MHCⅠ+、MHCⅡ+和CD11c+荧光抗体染色后，检测CD11c+CD80+、CD11c+MHCⅠ+和CD11c+MHCⅡ+双阳性细胞比例。结果显示：免疫组小鼠CD11c+CD80+双阳性细胞比例显著高于PBS对照组和Adjuvant对照组(P＜0.001)(图 9A-a)；免疫组小鼠CD11c+MHCⅠ+双阳性细胞比例显著高于PBS对照组(P＜0.001)和Adjuvant对照组(P＜0.01)(图9A-b)；免疫组小鼠CD11c+MHCⅡ+双阳性细胞比例显著高于PBS对照组(P＜0.0001)和Adjuvant对照组(P＜0.001)(图9A-c)。综上，小鼠首次免疫TBEV BLPs后促进了淋巴结DC细胞的活化(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****P ＜0.0001)。
(2)小鼠淋巴结B细胞的募集和活化
小鼠腹股沟淋巴结细胞，经CD19+、CD40+和CD69+荧光抗体染色后，检测CD19+CD40+和CD19+CD69+双阳性细胞比例(图9B)。结果显示：免疫组小鼠CD19+CD40+双阳性细胞比例显著高于PBS对照组和Adjuvant对照组(P＜0.001)(图9B-a)；免疫组小鼠CD19+CD69+双阳性细胞比例显著高于PBS对照组和Adjuvant对照组(P＜0.0001)(图9B-b)。综上，小鼠首次免疫TBEV BLPs后淋巴结中B细胞有显著的募集和/或活化。
4、脾细胞活化分析
分离小鼠脾细胞，根据实验需要调整脾细胞浓度至2.5×106个/mL，备用。
(1)ELISpot检测
根据鼠IFN-γ和IL-4ELISpot检测试剂盒说明书进行检测，步骤如下：每孔加入5×105个脾细胞，同时加入终浓度为10μg/mL的TBEV E-DⅢ作为刺激物，用锡箔纸包好ELISpot 板，37℃、5％CO2细胞培养箱中培养38h，用1:1000稀释的生物素标记的检测抗体(BVD6-24G2-biotin)作为一抗；1:1000稀释的Streptavidin-HRP作为二抗，室温孵育后加入TMB显色液，避光显色至出现清晰斑点，自来水冲洗ELISpot板终止显色。避光自然风干ELISpot板，利用AID酶联斑点图像自动分析仪进行全自动斑点图像采集和计数，保存每孔斑点形成细胞(Spot-Forming Cells，SFCs)数及斑点图像。取刺激物存在时免疫组和对照组的细胞斑点数作图，结果显示，经TBEV特异性抗原刺激后，免疫组小鼠脾细胞中分泌IFN-γ的细胞斑点数显著高于PBS对照组(P＜0.01)和Adjuvant对照组(P＜0.05，图10A)，分泌IL-4的细胞斑点数显著高于PBS对照组和Adjuvant对照组(P＜0.0001，图10B)。IFN-γ和IL-4分别为Th1型细胞免疫和Th2型体液免疫的代表性细胞因子，TBEV BLPs免疫小鼠后可诱导机体分泌Th1型和Th2型细胞因子，且Th2型细胞因子差异更显著。综上，TBEV BLPs免疫后，可诱导机体产生Th1型细胞免疫应答和Th2型体液免疫应答。
(2)脾淋巴细胞增殖试验
用CCK-8方法检测脾淋巴细胞在体外的增殖能力。调整细胞密度至2.5×106个/mL，并以100μL/孔接种于96孔细胞培养板中，用重组蛋白TBEV E-DⅢ对脾淋巴细胞进行刺激(终浓度为10μg/mL)，另设不刺激孔。在37℃，5％CO2细胞培养箱培养44h，每孔加入10μL的CCK-8溶液，继续在细胞培养箱培养4h。在酶标仪上检测OD450nm数值，计算增殖指数。结果显示(图11)，免疫组小鼠脾淋巴细胞增殖指数显著高于PBS对照组和Adjuvant对照组 (P＜0.0001)。综上，TBEV BLPs免疫后，在特异性抗原刺激下，小鼠脾淋巴细胞增殖显著。
(3)细胞因子检测
利用MSD检测技术，检测在TBEV特异性刺激物作用下脾淋巴细胞中Th1和Th2型细胞因子IFN-γ、IL-12p70、TNF-α、IL-2、KC/GRO、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-1β的分泌情况。调整细胞浓度为2.5×106个/mL，并以5×105个/孔接种于U型96孔板中，用重组蛋白 TBEVE-DⅢ对脾淋巴细胞进行刺激(终浓度为10μg/mL)。在37℃，5％CO2的细胞培养箱培养48h。4℃避光2500rpm离心10min，取50μL上清置于干冰中保存，送到上海优宁维公司，检测样品中各细胞因子的含量。结果显示(图12)：脾细胞经TBEV特异性刺激物刺激后，免疫组小鼠脾细胞培养液中Th1型细胞因子TNF-α显著高于PBS对照组(P＜0.01)和 Adjuvant对照组(P＜0.0001)；免疫组小鼠脾细胞培养液中Th2型细胞因子IL-5和IL-6显著高于Adjuvant对照组(P＜0.05)，IL-10和IL-1β显著高于PBS对照组和Adjuvant对照组 (P＜0.0001)。综上，小鼠免疫TBEV BLPs后可产生Th1型细胞免疫和Th2型体液免疫，且以Th2型体液免疫为主，这与脾细胞IFN-γ与IL-4的ELISpot检测结果一致。
(4)脾淋巴细胞检测
收集上一步骤离心后的脾淋巴细胞，加入荧光抗体预混液，使用流式细胞仪检测淋巴细胞荧光信号。
1)小鼠脾脏T细胞的募集和/或活化
脾淋巴细胞经CD4+、CD8+和CD69+荧光抗体染色，检测CD4+CD69+和CD8+CD69+双阳性细胞比例。结果显示：免疫组小鼠CD4+CD69+双阳性细胞比例与两个对照组均无显著性差异(图13A-a))；免疫组小鼠CD8+CD69+双阳性细胞比例显著高于PBS对照组和 Adjuvant对照组(P＜0.01)(图13A-b)。综上，TBEV BLPs免疫后，脾脏T细胞在特异性抗原刺激下发生募集和/或活化。
2)小鼠脾脏记忆性T细胞的产生
脾淋巴细胞经CD4+、CD8+、CD44+和CD62L+荧光抗体染色，检测CD4+和CD8+阳性细胞中CD44+CD62L+双阳性细胞比例。结果显示：免疫组小鼠CD4+/CD44+CD62L+双阳性细胞比例显著高于PBS对照组和Adjuvant对照组(P＜0.0001)(图13B-a)；免疫组小鼠 CD8+/CD44+CD62L+细胞比例显著高于PBS对照组和Adjuvant对照组(P＜0.0001)(图 13B-b)。综上，TBEVBLPs免疫后小鼠脾脏产生了CD4+和CD8+中心记忆性T细胞。
5、安全性实验：
免疫10只4-6周的BALB/c小鼠，2次免疫后的小鼠均无副反应，安全性实验分组方案如表5所示。
表5安全性实验分组方案
Figure SMS_6
对比例1.
TBEV BLPs：实施例2获得的TBEV BLPs，经肌肉注射免疫小鼠，2次免疫后可产生免疫记忆，能刺激机体产生较强细胞免疫和体液免疫，诱导小鼠产生较高的特异性IgG抗体(最高1：106.9，末次免疫后24周IgG水平1：106.0)
原核表达TBEV E蛋白，经镍柱纯化后，使用铝佐剂，腹腔注射免疫小鼠(500μL/只)， IgG抗体效价：最高为1：6 400，末次免疫后7周IgG水平已降至1：400。
SEQUENCE LISTING
<110> 吉林大学
<120> 一种重组森林脑炎病毒的融合蛋白和重组森林脑炎病毒细菌样颗粒疫苗及它
们的应用
<160> 18
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1251
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
ggaggaaatg aaggctcaat catgtggctc gcgagcttgg cagttgtcat agcttgtgca 60
ggagccagcc gttgcacaca cctcgaaaac cgcgacttcg tgaccggcac acaaggaact 120
acacgcgtca ctctcgtcct ggagttggga ggttgcgtga ccatcaccgc tgagggcaag 180
ccaagcatgg acgtgtggct ggactccatc taccaggaga accccgctaa gacacgtgaa 240
tactgcctcc acgccaagct cagcgacaca aaggttgccg ctcgctgtcc tacaatgggc 300
ccagccaccc tggctgagga gcaccagagc ggtaccgtct gtaagcgcga ccagagcgac 360
cgcggttggg gcaatcactg cggcctcttc ggcaagggta gcatcgtgac ctgtgtgaag 420
gccagctgcg gagccaagaa gaaggccact ggccacgtgt acgacgctaa caagatcgtg 480
tacaccgtga aggtggagcc tcacaccggt gactacgtgg ctgctaacga gacccacagc 540
ggacgtaaga ccgccagctt caccgtcagc tccgaaaaga ctatcctcac tatgggcgac 600
tacggcgacg tgagcctgtt gtgtcgtgtt gccagcggcg tggacctcgc ccagacagtg 660
atcctggaac tggataagac atccgagcac ctgcccaccg cttggcaggt gcaccgtgac 720
tggttcaacg acctcgctct cccctggaag cacgaaggtg ctcagaactg gaacaacgct 780
gagcgtctgg tggagttcgg tgcccctcac gctgtgaaga tggacgttta caacttgggt 840
gaccagaccg gtgttctgct gaagtccctc gccggtgtgc ccgtcgctca cattgacggc 900
actaagtacc acctgaaaag cggccacgtg acttgtgagg ttggactgga gaagctgaag 960
atgaagggac tgacctacac aatgtgtgac aagactaagt tcacctggaa gcgtatccct 1020
acagactccg gacacgacac tgtcgtgatg gaggtggcct tcagcggtac taagccttgt 1080
cgtatcccag tgcgcgctgt ggctcacggc tcccctgacg tgaacgtggc tatgctgatc 1140
acccctaacc ctactatcga aaccaacggt ggcggcttca tcgagatgca gctgccaccc 1200
ggtgacaaca tcatctacgt tggtgaactg agccaccaat ggttccagaa g 1251
<210> 2
<211> 417
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 2
Gly Gly Asn Glu Gly Ser Ile Met Trp Leu Ala Ser Leu Ala Val Val
1 5 10 15
Ile Ala Cys Ala Gly Ala Ser Arg Cys Thr His Leu Glu Asn Arg Asp
20 25 30
Phe Val Thr Gly Thr Gln Gly Thr Thr Arg Val Thr Leu Val Leu Glu
35 40 45
Leu Gly Gly Cys Val Thr Ile Thr Ala Glu Gly Lys Pro Ser Met Asp
50 55 60
Val Trp Leu Asp Ser Ile Tyr Gln Glu Asn Pro Ala Lys Thr Arg Glu
65 70 75 80
Tyr Cys Leu His Ala Lys Leu Ser Asp Thr Lys Val Ala Ala Arg Cys
85 90 95
Pro Thr Met Gly Pro Ala Thr Leu Ala Glu Glu His Gln Ser Gly Thr
100 105 110
Val Cys Lys Arg Asp Gln Ser Asp Arg Gly Trp Gly Asn His Cys Gly
115 120 125
Leu Phe Gly Lys Gly Ser Ile Val Thr Cys Val Lys Ala Ser Cys Gly
130 135 140
Ala Lys Lys Lys Ala Thr Gly His Val Tyr Asp Ala Asn Lys Ile Val
145 150 155 160
Tyr Thr Val Lys Val Glu Pro His Thr Gly Asp Tyr Val Ala Ala Asn
165 170 175
Glu Thr His Ser Gly Arg Lys Thr Ala Ser Phe Thr Val Ser Ser Glu
180 185 190
Lys Thr Ile Leu Thr Met Gly Asp Tyr Gly Asp Val Ser Leu Leu Cys
195 200 205
Arg Val Ala Ser Gly Val Asp Leu Ala Gln Thr Val Ile Leu Glu Leu
210 215 220
Asp Lys Thr Ser Glu His Leu Pro Thr Ala Trp Gln Val His Arg Asp
225 230 235 240
Trp Phe Asn Asp Leu Ala Leu Pro Trp Lys His Glu Gly Ala Gln Asn
245 250 255
Trp Asn Asn Ala Glu Arg Leu Val Glu Phe Gly Ala Pro His Ala Val
260 265 270
Lys Met Asp Val Tyr Asn Leu Gly Asp Gln Thr Gly Val Leu Leu Lys
275 280 285
Ser Leu Ala Gly Val Pro Val Ala His Ile Asp Gly Thr Lys Tyr His
290 295 300
Leu Lys Ser Gly His Val Thr Cys Glu Val Gly Leu Glu Lys Leu Lys
305 310 315 320
Met Lys Gly Leu Thr Tyr Thr Met Cys Asp Lys Thr Lys Phe Thr Trp
325 330 335
Lys Arg Ile Pro Thr Asp Ser Gly His Asp Thr Val Val Met Glu Val
340 345 350
Ala Phe Ser Gly Thr Lys Pro Cys Arg Ile Pro Val Arg Ala Val Ala
355 360 365
His Gly Ser Pro Asp Val Asn Val Ala Met Leu Ile Thr Pro Asn Pro
370 375 380
Thr Ile Glu Thr Asn Gly Gly Gly Phe Ile Glu Met Gln Leu Pro Pro
385 390 395 400
Gly Asp Asn Ile Ile Tyr Val Gly Glu Leu Ser His Gln Trp Phe Gln
405 410 415
Lys
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
ggtggttctg gtggtggttc tggt 24
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 4
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly
1 5
<210> 5
<211> 672
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
gatggtgctt cttcagctgg taacaccaac tctggtggtt ccactacaac tatcactaac 60
aacaactctg gtactaactc ctcttctacc acctacaccg tgaagtctgg cgacactctg 120
tggggtatct cccaacgtta cggtatctct gttgctcaaa tccaatcagc taacaacctg 180
aagtctacta tcatctacat cggtcagaag ctggtgctga ccggttctgc ttcttctaca 240
aactctggag gttccaacaa ctccgcttcc actaccccta ccacttccgt gactcctgct 300
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gtgaagtaca agacctccat cgctcagctg aagagctgga accacctgtc ctctgacact 420
atctacatcg gtcagaacct gatcgtgtcc cagtctgctg ctgcttccaa cccttcaaca 480
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atccacaagg tggtgaaggg tgacaccttg tggggtctgt cacagaagtc aggttccccc 600
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ctgcgtatca ag 672
<210> 6
<211> 224
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 6
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1 5 10 15
Thr Ile Thr Asn Asn Asn Ser Gly Thr Asn Ser Ser Ser Thr Thr Tyr
20 25 30
Thr Val Lys Ser Gly Asp Thr Leu Trp Gly Ile Ser Gln Arg Tyr Gly
35 40 45
Ile Ser Val Ala Gln Ile Gln Ser Ala Asn Asn Leu Lys Ser Thr Ile
50 55 60
Ile Tyr Ile Gly Gln Lys Leu Val Leu Thr Gly Ser Ala Ser Ser Thr
65 70 75 80
Asn Ser Gly Gly Ser Asn Asn Ser Ala Ser Thr Thr Pro Thr Thr Ser
85 90 95
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Gly Asp Thr Leu Trp Ala Leu Ser Val Lys Tyr Lys Thr Ser Ile Ala
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Gln Leu Lys Ser Trp Asn His Leu Ser Ser Asp Thr Ile Tyr Ile Gly
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Gln Asn Leu Ile Val Ser Gln Ser Ala Ala Ala Ser Asn Pro Ser Thr
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Gly Ser Gly Ser Thr Ala Thr Asn Asn Ser Asn Ser Thr Ser Ser Asn
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180 185 190
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<210> 7
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210 215 220
Asp Lys Thr Ser Glu His Leu Pro Thr Ala Trp Gln Val His Arg Asp
225 230 235 240
Trp Phe Asn Asp Leu Ala Leu Pro Trp Lys His Glu Gly Ala Gln Asn
245 250 255
Trp Asn Asn Ala Glu Arg Leu Val Glu Phe Gly Ala Pro His Ala Val
260 265 270
Lys Met Asp Val Tyr Asn Leu Gly Asp Gln Thr Gly Val Leu Leu Lys
275 280 285
Ser Leu Ala Gly Val Pro Val Ala His Ile Asp Gly Thr Lys Tyr His
290 295 300
Leu Lys Ser Gly His Val Thr Cys Glu Val Gly Leu Glu Lys Leu Lys
305 310 315 320
Met Lys Gly Leu Thr Tyr Thr Met Cys Asp Lys Thr Lys Phe Thr Trp
325 330 335
Lys Arg Ile Pro Thr Asp Ser Gly His Asp Thr Val Val Met Glu Val
340 345 350
Ala Phe Ser Gly Thr Lys Pro Cys Arg Ile Pro Val Arg Ala Val Ala
355 360 365
His Gly Ser Pro Asp Val Asn Val Ala Met Leu Ile Thr Pro Asn Pro
370 375 380
Thr Ile Glu Thr Asn Gly Gly Gly Phe Ile Glu Met Gln Leu Pro Pro
385 390 395 400
Gly Asp Asn Ile Ile Tyr Val Gly Glu Leu Ser His Gln Trp Phe Gln
405 410 415
Lys Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Asp Gly Ala Ser Ser Ala Gly
420 425 430
Asn Thr Asn Ser Gly Gly Ser Thr Thr Thr Ile Thr Asn Asn Asn Ser
435 440 445
Gly Thr Asn Ser Ser Ser Thr Thr Tyr Thr Val Lys Ser Gly Asp Thr
450 455 460
Leu Trp Gly Ile Ser Gln Arg Tyr Gly Ile Ser Val Ala Gln Ile Gln
465 470 475 480
Ser Ala Asn Asn Leu Lys Ser Thr Ile Ile Tyr Ile Gly Gln Lys Leu
485 490 495
Val Leu Thr Gly Ser Ala Ser Ser Thr Asn Ser Gly Gly Ser Asn Asn
500 505 510
Ser Ala Ser Thr Thr Pro Thr Thr Ser Val Thr Pro Ala Lys Pro Thr
515 520 525
Ser Gln Thr Thr Val Lys Val Lys Ser Gly Asp Thr Leu Trp Ala Leu
530 535 540
Ser Val Lys Tyr Lys Thr Ser Ile Ala Gln Leu Lys Ser Trp Asn His
545 550 555 560
Leu Ser Ser Asp Thr Ile Tyr Ile Gly Gln Asn Leu Ile Val Ser Gln
565 570 575
Ser Ala Ala Ala Ser Asn Pro Ser Thr Gly Ser Gly Ser Thr Ala Thr
580 585 590
Asn Asn Ser Asn Ser Thr Ser Ser Asn Ser Asn Ala Ser Ile His Lys
595 600 605
Val Val Lys Gly Asp Thr Leu Trp Gly Leu Ser Gln Lys Ser Gly Ser
610 615 620
Pro Ile Ala Ser Ile Lys Ala Trp Asn His Leu Ser Ser Asp Thr Ile
625 630 635 640
Leu Ile Gly Gln Tyr Leu Arg Ile Lys
645
<210> 9
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
taagcggccg catgggagga aatgaaggct caatcatgtg gctcgcgagc ttggcagtt 59
<210> 10
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 10
agaaccacca ccagaaccac cggcgccgac acccagggtc atag 44
<210> 11
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 11
tatgaccctg ggtgtcggcg ccggtggttc tggtggtggt tct 43
<210> 12
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 12
tataagcttt tacttgatac gcaggtattg acc 33
<210> 13
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 13
acgaagactt gatcacccgg gatgggagga aatgaaggct caatca 46
<210> 14
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 14
tgctatgcat cagctgctag cttacttgat acgcaggtat tgacc 45
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 15
cccagtcacg acgttgtaaa acg 23
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 16
cggaccttta attcaaccc 19
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 17
ttcataccgt cccaccat 18
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 18
agcggataac aatttcacac agg 23

Claims (9)

1.一种重组森林脑炎病毒的融合蛋白，其特征在于，利用Linker将锚钩蛋白PA3和森林脑炎病毒包膜蛋白E蛋白串联获得融合蛋白；所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述Linker的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。
3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述锚钩蛋白PA3的氨基酸序列如SEQID NO.6所示。
4.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述森林脑炎病毒包膜蛋白E蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
5.编码权利要求1-4任一项所述的融合蛋白的基因。
6.森林脑炎病毒包膜蛋白E蛋白在制备森林脑炎病毒疫苗中的应用，其特征在于，所述森林脑炎病毒包膜蛋白E蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
7.一种重组森林脑炎病毒细菌样颗粒疫苗，其特征在于，所述重组森林脑炎病毒细菌样颗粒疫苗是将权利要求1-4任一项所述的融合蛋白展示在GEM颗粒表面制备获得的。
8.一种权利要求1-4任一项所述的融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法如下：
(1)将编码锚钩蛋白PA3蛋白的基因与编码森林脑炎病毒包膜蛋白E蛋白的基因通过编码Linker的基因连接获得重组基因；
(2)将步骤(1)获得的重组基因与表达载体pFastBac Dual连接获得重组质粒；
(3)将步骤(2)获得的重组质粒转化到DH10Bac感受态细胞中，获得重组工程菌，提取重组工程菌中的重组杆粒；
(4)将步骤(3)获得的重组杆粒转染Sf9细胞中，获得重组病毒，培养重组病毒获得细胞悬液，融合蛋白即在细胞悬液中。
9.权利要求1-4任一项所述的融合蛋白或者权利要求7所述的重组森林脑炎病毒细菌样颗粒疫苗在制备治疗或预防感染森林脑炎病毒的疾病的药物中的应用。
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