CN101111514A - 包含病原体关联性分子模式与抗原的组合物及其刺激免疫反应的用途 - Google Patents

Abstract

本发明揭示一种组合物，其包括一种抗原的至少一部分以及一种缺少铰链区域的鞭毛蛋白的至少一部分。本发明还揭示一种组合物、融合蛋白质及多肽，其包括至少一种病原体关联性分子模式的至少一部分以及至少一种病毒蛋白质的至少一部分。本发明组合物、融合蛋白质及多肽的病毒蛋白质，是黄病毒蛋白质，其包括西尼罗黄病毒蛋白质、登革黄病毒蛋白质、冷岳黄病毒蛋白质、昆津黄病毒蛋白质、墨累谷脑炎黄病毒蛋白质、日本脑炎黄病毒蛋白质、壁虱性脑炎黄病毒蛋白质、黄热黄病毒蛋白质以及C型肝炎黄病毒蛋白质。本发明的组合物、融合蛋白质及多肽是用于在个体中刺激免疫反应。

Description

包含病原体关联性分子模式与抗原的组合物及其刺激免疫反应的用途

相关申请

本申请要求美国临时申请案第60/645,170号，提交日期2005年1月19日；第60/653,405，提交日期2005年2月15日；第60/704,160号，提交日期2005年7月29日；第60/723,409号，提交日期2005年10月4日；以及第60/725,919号，提交日期2005年10月11日的利益。以上申请的教示以引用方式纳入本文中。

背景技术

被包括黄病毒属的病毒感染，例如，西尼罗(West Nile)黄病毒、登革(Dengue)黄病毒、日本脑炎黄病毒、冷岳(Langat)黄病毒、昆津(Kunjin)黄病毒、墨累谷(Murray Valley)脑炎黄病毒、壁虱性黄病毒及黄热黄病毒，可能导致严重的疾病，并且可能导致死亡。蚊子及壁虱传送许多种的黄病毒。例如，西尼罗病毒感染的严重症状包括高热、头痛、颈部僵硬、恍惚、迷失方向、昏睡、颤抖、抽搐、肌肉无力、视力丧失、麻木、脑膜脑脊髓炎以及瘫痪。这些症状可持续数周，以及对神经的影响可能是永久性的。在具有较温和症状(例如，发热、头痛及身体疼痛、恶心、呕吐，以及有时淋巴结肿大，或在胸部、胃部及背部上的皮肤出疹)的例子中，特定的症状(例如，发热及疼痛)可能会自己复原。在较严重的例子中，人们通常需要住院治疗，例如，静脉内液体给药以及呼吸协助。

预防黄病毒感染的方法包括活性减毒及失活性病毒的组合物。然而，所述组合物可能不如最适的免疫原性、如果不适当地制备的话可能导致未知的危害以及可能具有不利的副作用。开发新的组合物及方法以预防黄病毒感染，仍有其需求。

发明内容

本发明是有关于抗原及缺少铰链区域的鞭毛蛋白的至少一部分的组合物、融合蛋白质及多肽；以及至少一种病原体关联性分子模式(PAMP)的至少一部分及至少一种黄病毒的至少一部分的组合物、融合蛋白质及多肽。本发明的组合物、融合蛋白质及多肽可用于在个体中刺激免疫反应的方法。

在一具体实例中，本发明是组合物，其包括至少一种抗原的至少一部分以及至少一种鞭毛蛋白的至少一部分，其中至少一种鞭毛蛋白缺少铰链区域的至少一部分。

在另一具体实例中，本发明是融合蛋白质，其包括至少一种抗原的至少一部分以及至少一种鞭毛蛋白的至少一部分，其中至少一种鞭毛蛋白缺少铰链区域的至少一部分。

在另一具体实例中，本发明是组合物，其包括至少一种病原体关联性分子模式的至少一部分以及至少一种病毒蛋白质的至少一部分，该病毒蛋白质选自由西尼罗病毒蛋白质、冷岳病毒蛋白质、昆津病毒蛋白质、墨累谷脑炎病毒蛋白质、日本脑炎病毒蛋白质、壁虱性脑炎病毒蛋白质以及黄热病毒蛋白质所组成的组中。

在另一具体实例中，本发明是组合物，其包括至少一种病原体关联性分子模式的至少一部分以及至少一种Den2病毒包膜蛋白质的至少一部分，其中Den2病毒包膜蛋白质选自由序列识别号22以及序列识别号40所组成的组中的至少一员。

在另一具体实例中，本发明是组合物，其包括至少一种病原体关联性分子模式的至少一部分，以及选自由Den1病毒包膜蛋白质、Den2病毒包膜蛋白质、Den3病毒包膜蛋白质以及Den4病毒包膜蛋白质所组成的组中的至少一员的至少一部分。

在另一具体实例中，本发明是融合蛋白质，其包括至少一种病原体关联性分子模式的至少一部分以及至少一种病毒蛋白质的至少一部分，该病毒蛋白质选自由西尼罗病毒蛋白质、冷岳病毒蛋白质、昆津病毒蛋白质、墨累谷脑炎病毒蛋白质、日本脑炎病毒蛋白质、壁虱性脑炎病毒蛋白质以及黄热病毒蛋白质所组成的组中。

在另一具体实例中，本发明是融合蛋白质，其包括选自由鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhimurium)鞭毛蛋白第2型(fljB/STF2)、大肠杆菌(E.coli)fliC以及慕尼黑沙门氏杆菌(S.muenchen)fliC所组成的组中的至少一员的至少一部分，以及选自由Den1病毒包膜蛋白质、Den2病毒包膜蛋白质、Den3病毒包膜蛋白质以及Den4病毒包膜蛋白质所组成的组中的至少一员的至少一部分。

在另一具体实例中，本发明是融合蛋白质，其包括至少一种病原体关联性分子模式的至少一部分，以及选自由Den1病毒包膜蛋白质、Den2病毒包膜蛋白质、Den3病毒包膜蛋白质以及Den4病毒包膜蛋白质所组成的组中的至少一员的至少一部分。

本发明的另一具体实例是多肽，其由序列识别号29所编码。

在另一具体实例中，本发明是多肽，其包括序列识别号30。

在另一具体实例中，本发明是多肽，其与序列识别号30具有至少约85％的相同性。

在另一具体实例中，本发明是多肽，其由序列识别号31所编码。

在另一具体实例中，本发明是多肽，其包括序列识别号32。

在另一具体实例中，本发明是多肽，其与序列识别号32具有至少约70％的相同性。

在另一具体实例中，本发明是多肽，其由序列识别号33所编码。

在另一具体实例中，本发明是多肽，其包括序列识别号34。

在另一具体实例中，本发明是多肽，其与序列识别号34具有至少约70％的相同性。

在另一具体实例中，本发明是多肽，其由序列识别号35所编码。

在另一具体实例中，本发明是多肽，其包括序列识别号36。

在另一具体实例中，本发明是多肽，其与序列识别号36具有至少80％的相同性。

在另一具体实例中，本发明是多肽，其由序列识别号37所编码。

在另一具体实例中，本发明是多肽，其包括序列识别号38。

在另一具体实例中，本发明是多肽，其与序列识别号38具有至少70％的相同性。

在另一具体实例中，本发明是多肽，其由序列识别号54所编码。

在另一具体实例中，本发明是多肽，其包括序列识别号55。

在另一具体实例中，本发明是多肽，其与序列识别号55具有至少约70％的相同性。

在另一具体实例中，本发明是多肽，其包括选自由序列识别号71以及序列识别号72所组成的组中的至少一员。

在另一具体实例中，本发明是多肽，其由选自由序列识别号70以及序列识别号73所组成的组中的至少一员所编码。

在另一具体实例中，本发明是多肽，其与选自由序列识别号71以及序列识别号72所组成的组中的至少一员具有至少约70％的相同性。

在另一具体实例中，本发明是多肽，其包括选自由序列识别号76以及序列识别号6所组成的组中的至少一员。

在另一具体实例中，本发明是多肽，其由选自由序列识别号77以及序列识别号5所组成的组中的至少一员所编码。

在另一具体实例中，本发明是多肽，其与选自由序列识别号76以及序列识别号6所组成的组中的至少一员具有至少约70％的相同性。

在另一具体实例中，本发明是多肽，其包括选自由序列识别号80、序列识别号82、序列识别号84以及序列识别号86所组成的组中的至少一员。

在另一具体实例中，本发明是多肽，其由选自由序列识别号81、序列识别号83、序列识别号85以及序列识别号87所组成的组中的至少一员所编码。

在另一具体实例中，本发明是多肽，其与选自由序列识别号80、序列识别号82、序列识别号84以及序列识别号86所组成的组中的至少一员具有至少约70％的相同性。

在另一具体实例中，本发明是多肽，其包括序列识别号159。

在另一具体实例中，本发明是多肽，其由序列识别号158所编码。

在另一具体实例中，本发明是多肽，其与序列识别号159具有至少约70％的相同性。

在另一具体实例中，本发明是组合物，其包括至少一种Pam3Cys以及至少一种黄病毒蛋白质的至少一部分。

在另一具体实例中，本发明是组合物，其包括至少一种Pam2Cys以及至少一种黄病毒蛋白质的至少一部分。

在另一具体实例中，本发明是一种在个体中刺激免疫反应的方法，其包括将组合物给药至个体的步骤，该组合物包括至少一种病原体关联性分子模式的至少一部分以及至少一种病毒蛋白质的至少一部分，该病毒蛋白质选自由西尼罗病毒蛋白质、冷岳病毒蛋白质、昆津病毒蛋白质、墨累谷脑炎病毒蛋白质、日本脑炎病毒蛋白质、壁虱性脑炎病毒蛋白质以及黄热病毒蛋白质所组成的组中。

在另一具体实例中，本发明是一种在个体中刺激免疫反应的方法，其包括将组合物给药至个体的步骤，该组合物包括至少一种病原体关联性分子模式的至少一部分以及至少一种Den2包膜蛋白质的至少一部分，其中Den2包膜蛋白质是选自由序列识别号20以及序列识别号40所组成的组中。

在另一具体实例中，本发明是一种在个体中刺激免疫反应的方法，其包括将融合蛋白质给药至个体的步骤，该融合蛋白质包括至少一种病原体关联性分子模式的至少一部分以及至少一种病毒蛋白质的至少一部分，该病毒蛋白质选自由西尼罗病毒蛋白质、冷岳病毒蛋白质、昆津病毒蛋白质、墨累谷脑炎病毒蛋白质、日本脑炎病毒蛋白质、壁虱性脑炎病毒蛋白质以及黄热病毒蛋白质所组成的组中。

在另一具体实例中，本发明是一种在个体中刺激免疫反应的方法，其包括将组合物给药至个体的步骤，该组合物包括至少一种病原体关联性分子模式的至少一部分，以及选自由Den1病毒包膜蛋白质、Den2病毒包膜蛋白质、Den3病毒包膜蛋白质以及Den4病毒包膜蛋白质所组成的组中的至少一员的至少一部分。

在另一具体实例中，本发明是一种在个体中刺激免疫反应的方法，其包括将融合蛋白质给药至个体的步骤，该融合蛋白质包括选自由鼠伤寒沙门氏杆菌鞭毛蛋白第2型(fljB/STF2)、大肠杆菌fliC以及慕尼黑沙门氏杆菌fliC所组成的组中的至少一员的至少一部分，以及选自由Den1病毒包膜蛋白质、Den2病毒包膜蛋白质、Den3病毒包膜蛋白质以及Den4病毒包膜蛋白质所组成的组中的至少一员的至少一部分。

在另一具体实例中，本发明是一种在个体中刺激免疫反应的方法，其包括将融合蛋白质给药至个体的步骤，该融合蛋白质包括至少一种病原体关联性分子模式的至少一部分，以及选自由Den1病毒包膜蛋白质、Den2病毒包膜蛋白质、Den3病毒包膜蛋白质以及Den4病毒包膜蛋白质所组成的组中的至少一员的至少一部分。

在另一具体实例中，本发明是一种在个体中刺激免疫反应的方法，其包括将组合物给药至个体的步骤，该组合物包括至少一种抗原的至少一部分以及至少一种鞭毛蛋白的至少一部分，其中至少一种鞭毛蛋白缺少铰链区域的至少一部分。

在另一具体实例中，本发明是一种在个体中刺激免疫反应的方法，其包括将融合蛋白质给药至个体的步骤，该融合蛋白质包括至少一种抗原的至少一部分以及至少一种鞭毛蛋白的至少一部分，其中至少一种鞭毛蛋白缺少铰链区域的至少一部分。

本发明的组合物、融合蛋白质及多肽可用于在个体中刺激免疫反应。本发明的优点可包括，例如，以特异于特定抗原或病毒的方式(例如，黄病毒蛋白质)预防黄病毒在个体内感染，其具有有效的免疫原性及减少的副作用。本发明的组合物、融合蛋白质、多肽及方法可用于预防或治疗感染，并且因此可避免因抗原或病毒感染引起的严重疾病。

附图说明

图1描述鼠伤寒沙门氏杆菌鞭毛蛋白第2型(fljB/STF2，此处也称为“STF2”)的氨基酸序列(序列识别号1)。铰链区域(此处也称为“高度可变异”或“高度可变异的铰链区域”)以画下划线表示；

图2描述编码序列识别号1的核酸序列(序列识别号2)。编码铰链区域的核酸序列以画下划线表示；

图3描述fljB/STF2Δ(此处也称为“fljB/STF2Δ”或“STF2Δ”)的氨基酸序列(序列识别号3)。STF2Δ是缺少至少一部分铰链区域的STF2。人工铰链区域以画下划线表示；

图4描述编码序列识别号3的核酸序列(序列识别号4)。编码人工铰链区域的核酸序列以画下划线表示；

图5描述编码pET/STF2Δ.JEIII+融合蛋白质的核酸序列(序列识别号5)。编码人工铰链区域的核酸序列以双下划线表示。编码STF2Δ及JEIII+间的连接子的核酸序列以画下划线表示。编码JEIII+的核酸序列以粗体表示；

图6描述由序列识别号5所编码的氨基酸序列(序列识别号6)。人工铰链是以双下划线表示。STF2Δ及JEIII+间的连接子以画下划线表示。JEIII+的氨基酸序列以粗体表示；

图7描述编码STF2.EIII+融合蛋白质的核酸序列(序列识别号29)。编码STF2的铰链区域的核酸序列以画下划线表示；

图8描述由序列识别号29所编码的氨基酸序列(序列识别号30)。STF2的铰链区域以画下划线表示；

图9描述编码STF2Δ.EIII+融合蛋白质的核酸序列(序列识别号31)。STF2的天然存在的铰链区域已被移除，并以人工铰链区域取代。编码人工铰链区域的核酸序列以画下划线表示。编码EIII+的核酸序列以粗体表示；

图10描述由序列识别号31所编码的氨基酸序列(序列识别号32)。人工铰链区域以画下划线表示。EIII+氨基酸序列以粗体表示；

图11描述编码STF2Δ.EIII+融合蛋白质的核酸序列(序列识别号33)。编码人工铰链区域的核酸序列以双下划线表示。编码STF2Δ及EIII+间的连接子的核酸序列以画下划线表示。编码EIII+的核酸序列以粗体表示。载体序列在核酸序列的3’端处未以粗体表示；

图12描述由序列识别号33所编码的氨基酸序列(序列识别号34)。人工铰链区域以双下划线表示。STF2Δ及EIII+间的连接子以画下划线表示。EIII+的氨基酸序列以粗体表示。西尼罗病毒蛋白质的功能部位I以粗体及斜体表示(MEKLQ，序列识别号172)。粗体序列的其它部分(LKGTTYGVCSKAFKFLGTPADTGHGTVVLELQYTGTDGPCKVPISSVASLNDLTPVGRLVTVNPFVSVATANAKVLIELEPPFGDSYIVVGRGEQQINHHWHKSGSSIGK，序列识别号176)是西尼罗病毒包膜蛋白质的功能部位III。在羧基端的载体序列未以粗体表示；

图13描述编码STF2.EIII+融合蛋白质的核酸序列(序列识别号35)。编码STF2的铰链区域的核酸序列以画下划线表示。编码STF2及EIII+间的连接子的核酸序列以粗体及画下划线表示。编码EIII+的核酸序列以粗体表示；

图14描述由序列识别号35所编码的氨基酸序列(序列识别号36)。铰链区域以画下划线表示。STF2及EIII+间的连接子以粗体及画下划线表示。EIII+的氨基酸序列以粗体表示；

图15描述编码fljB/STF2Δ.EIII+融合蛋白质的核酸序列(序列识别号37)。在STF2Δ及EIII+间没有连接子；

图16描述由序列识别号37所编码的氨基酸序列(序列识别号38)。EIII+的氨基酸序列以粗体表示；

图17描述fljB/STF2.EIII+融合蛋白质的核酸序列(序列识别号54)。编码STF2的铰链区域的核酸序列以画下划线表示。编码STF2及EIII+间的连接子的核酸序列以粗体及画下划线表示。编码EIII+的核酸序列以粗体表示；

图18描述由序列识别号54所编码的氨基酸序列(序列识别号55)。STF2的铰链区域的氨基酸序列以画下划线表示。STF2及EIII+间的连接子的氨基酸序列以粗体及画下划线表示。EIII+的氨基酸序列以粗体表示；

图19描述慕尼黑沙门氏杆菌鞭毛蛋白fliC的氨基酸序列(序列识别号58)。铰链区域的氨基酸序列以画下划线表示；

图20描述编码序列识别号58的核酸序列(序列识别号59)。编码铰链区域的核酸序列以画下划线表示；

图21描述连接子的核酸序列(序列识别号63)；

图22描述C型肝炎E1的氨基酸序列(序列识别号64)；

图23描述C型肝炎E2的氨基酸序列(序列识别号65)；

图24描述编码序列识别号64的核酸序列(序列识别号66)；

图25描述编码序列识别号65的核酸序列(序列识别号67)；

图26描述大肠杆菌fliC的氨基酸序列(序列识别号68)。铰链区域的氨基酸序列以画下划线表示；

图27描述编码序列识别号68的核酸序列(序列识别号69)。编码铰链区域的核酸序列以画下划线表示；

图28描述编码fljB/STF2Δ.EIII+融合蛋白质的核酸序列(序列识别号70)。编码人工铰链区域的核酸序列以双下划线表示。编码STF2Δ及EIII+间的连接子的核酸序列以画下划线表示。编码EIII+的核酸序列以粗体表示。在序列3’端的载体序列未以粗体表示；

图29描述由序列识别号70所编码的氨基酸序列(序列识别号71)。人工铰链区域以双下划线表示。STF2Δ及EIII+间的连接子的氨基酸序列以画下划线表示。EIII+的氨基酸序列以粗体表示。在羧基端的载体序列未以粗体表示；

图30描述fljB/STF2Δ.EIIIs+融合蛋白质的氨基酸序列(序列识别号72)。人工铰链区域以双下划线表示。STF2Δ及EIII+间的连接子的氨基酸序列以画下划线表示。西尼罗病毒蛋白质的功能部位I以粗体及斜体表示(序列识别号172)。粗体序列的其它部分是西尼罗病毒包膜蛋白质的功能部位III(序列识别号176)。功能部位I及III的部分称为EIII+。在蛋白质羧基端处的载体序列未以粗体表示。连接子区域的丝氨酸残基以粗体表示，并且是在图29序列识别号71的连接子的相同区域中的半胱氨酸残基的取代；

图31描述编码序列识别号72的核酸序列(序列识别号73)。编码人工铰链区域的核酸序列以双下划线表示。编码STF2Δ及EIII+间的连接子的核酸序列以画下划线表示，编码丝氨酸残基的密码子以粗体表示。编码EIII+的核酸序列通过粗体字而显示。在3’端的连接子序列未以粗体字表示；

图32描述pET/STF2Δ.JEIII+融合蛋白质的氨基酸序列(序列识别号76)。人工铰链区域以双下划线表示。STF2Δ及JEIII+间的连接子的氨基酸序列以画下划线表示。日本脑炎病毒的功能部位I的一部分的氨基酸序列以粗体及斜体表示(MDKLAL，序列识别号173)。日本脑炎病毒的功能部位III的一部分的氨基酸序列以粗体表示(KGTTYGMCTEKFSFAKNPVDTGHGTVVIELSYSGSDGPCKIPIVSVASLNDMTPVGRLVTVNPFVATSSANSKVLVEMEPPFGDSYIVVGRGDKQINHHWHKAGSTLGKA，序列识别号177)。功能部位I及III的部分称为“JEIII+”；

图33描述编码序列识别号76的核酸序列(序列识别号77)。编码人工铰链区域的核酸序列以双下划线表示。编码STF2Δ及JEIII+间的连接子的核酸序列以画下划线表示。编码日本脑炎病毒的功能部位I的一部分的核酸序列以粗体及斜体表示。编码日本脑炎病毒的功能部位III的一部分的核酸序列以粗体表示。功能部位I及III的部分称为“JEIII+”；

图34描述编码JEIII+的核酸序列(序列识别号78)。编码包膜蛋白质功能部位I的至少一部分的核酸序列以画下划线表示。其余的核酸序列编码包膜蛋白质功能部位III的至少一部分；

图35描述由序列识别号78所编码的氨基酸序列(序列识别号79)。包膜蛋白质功能部位I的至少一部分以粗体及斜体表示。其余的序列是包膜蛋白质功能部位III的至少一部分；

图36描述pET/STF2Δ.Den1 EIII融合蛋白质的氨基酸序列(序列识别号80)。人工铰链区域以双下划线表示。STF2Δ及Den1 EIII间的连接子以画下划线表示；

图37描述编码序列识别号80的核酸序列(序列识别号81)。编码人工铰链区域的核酸序列以双下划线表示。编码STF2Δ及Den1 EIII间的连接子的核酸序列以画下划线表示；

图38描述pET/STF2Δ.Den2 EIII融合蛋白质的氨基酸序列(序列识别号82)。人工铰链区域以双下划线表示。STF2Δ及Den2 EIII间的连接子的氨基酸序列以画下划线表示；

图39描述编码序列识别号82的核酸序列(序列识别号83)。编码人工铰链区域的核酸序列以双下划线表示。编码STF2Δ及Den2 EIII间的连接子的核酸序列以画下划线表示；

图40描述pET/STF2Δ.Den3 EIII融合蛋白质的氨基酸序列(序列识别号84)。人工铰链区域以双下划线表示。STF2Δ及Den3 EIII间的连接子的氨基酸序列以画下划线表示；

图41描述编码序列识别号84的核酸序列(序列识别号85)。编码人工铰链区域的核酸序列以双下划线表示。编码STF2Δ及Den3 EIII间的连接子的核酸序列以画下划线表示；

图42描述pET/STF2Δ.Den4 EIII融合蛋白质的氨基酸序列(序列识别号86)。人工铰链区域以双下划线表示。STF2Δ及Den4 EIII间的连接子的氨基酸序列以画下划线表示；

图43描述编码序列识别号86的核酸序列(序列识别号87)。编码人工铰链区域的核酸序列以双下划线表示。编码STF2Δ及Den4 EIII间的连接子的核酸序列以画下划线表示；

图44描述壁虱性脑炎包膜蛋白质的包膜蛋白质的氨基酸序列(序列识别号174)；

图45描述西尼罗病毒包膜蛋白质(WNE)(氨基酸1-406)的氨基酸序列(序列识别号39)。并入至EIII+构建体的氨基酸序列以画下划线表示(氨基酸292-406)。氨基酸292-297对应于功能部位I的部分；氨基酸298-406对应于功能部位III的部分。序列识别号39是由序列识别号57所编码(图67)；

图46描述pET24载体的融合构建体。T7：T7启动子；lacO：乳糖操纵子；STF2：鼠伤寒沙门氏杆菌鞭毛蛋白；STF2Δ：具有铰链区域被删除的STF2；EIII⁺是具有6个功能部位I的氨基酸的西尼罗病毒包膜蛋白质的功能部位III；

图47A及图47B描述STF2.EIII+(序列识别号54、55)及STF2Δ.EIII+(序列识别号70、71)融合蛋白质的TLR-5生物活性。将纯化蛋白质的连续稀释物加到HEK293(TLR-5+)细胞隔夜，并且通过酶联免疫吸附分析而测量上清液的IL-8含量。使用纯化的STF2.OVA作为阳性对照组(图47A)。使用TLR-2激动剂Pam3CSK4作为阴性对照组(图47B)；

图48描述由酶联免疫吸附分析所评估的STF2Δ.EIII+抗原性抗原决定部位。将培养盘以全长的西尼罗病毒包膜蛋白质(空心条柱)(序列识别号39)或STF2Δ.EIII+(序列识别号70、71)覆盖，并且以指定的抗体(单株抗体)探测。Poly＝对西尼罗病毒包膜蛋白质的多株抗血清；3D9至7H2＝对西尼罗病毒包膜蛋白质抗原决定部位的中和单株抗体；抗-鞭毛蛋白＝对鞭毛蛋白的单株抗体；

图49A、图49B、图49C及图49D描述STF2.E(序列识别号158、159)、STF2.EIII+(序列识别号54、55)及STF2Δ.EIII+(序列识别号70、71)与对西尼罗病毒包膜蛋白质及鞭毛蛋白的抗体的反应性。将培养盘以融合蛋白质覆盖、阻断并且与对西尼罗病毒包膜蛋白质及鞭毛蛋白的抗体一起培养。抗体反应性是在与辣根过氧化酶-标示的物种特异性IgG培养的后而测量。使培养盘在TMB底物的存在下发育，并且利用TECAN培养盘判读器及Magellian软件测量O.D.450/650；

图50描述以融合蛋白质注射之后的IgG血清。将小鼠以磷酸盐缓冲溶液、包含STF2.E的果蝇条件培养液(CM，阳性对照组)、25微克的STF2Δ.EIII+(序列识别号70、71)(腹膜内)、25微克的STF2Δ.EIII+(皮下)、25微克的STF2.EIII+(序列识别号54、55)(腹膜内)、25微克的STF2.EIII+(序列识别号54、55)或25微克的STF2.E(序列识别号158、159)而进行致免疫。在第35天，将致免疫的动物以西尼罗病毒包膜蛋白质激发。将个别小鼠鼠的血清(第35天)通过直接型酶联免疫吸附分析而定性，以测定IgG水平。在这个分析中使用纯化的西尼罗病毒包膜蛋白质(序列识别号39)作为抗原。这个抗原(60)是在果蝇中以组氨酸标记的蛋白质形式而制造；

图51描述STF2Δ.EIII+(序列识别号70、71)及STF2.EIII+(序列识别号54、55)对于西尼罗病毒激发的保护免疫力。将小鼠进行致免疫，并且在第35天以致死剂量的西尼罗病毒品系2741激发。监测21天的存活率；

图52描述在以融合蛋白质致免疫之后的IgG血清效价。STF2Δ.EIII+蛋白质诱发西尼罗病毒特异性的IgG抗体。在第0、14及28天，将小鼠以单独的磷酸盐缓冲溶液或约25微克的STF2Δ.EIII+(序列识别号70、71)(045[阳性对照组])、STF2Δ.EIII+(067，三聚体)、STF2Δ.EIII+(070，单体)或STF2Δ.EIIIs+(序列识别号72、73)(069)，进行皮下致免疫。在第35天，将个别小鼠的血清通过直接型酶联免疫吸附分析而定性，以测定IgG水平。在这个分析中，使用纯化的西尼罗病毒包膜蛋白质(060，在果蝇中以组氨酸标记的蛋白质形式而制造)作为抗原；

图53描述STF2Δ.EIII+(序列识别号70、71)及STF2Δ.EIIIs+(序列识别号72、73)对于西尼罗病毒致死激发的保护免疫力。在第38天以融合蛋白质进行致免疫之后，将所有的组别都以致死剂量的西尼罗病毒品系2741而激发，并且监测21天的存活率。各组的存活率(10只小鼠/组)是以百分比表示；

图54描述竞争型分析。将来自致免疫动物的抗血清的连续稀释物(5倍，开始于1∶25)，与生物素化的西尼罗病毒包膜蛋白质(序列识别号39)培养，然后以约2毫克/毫升加到以单株抗体7H2覆盖的酶联免疫吸附分析盘的槽孔。将槽孔利用抗生物素蛋白-辣根过氧化酶而显影，以测量西尼罗病毒蛋白质结合的抑制，为与单株抗体7H2竞争的结果；

图55描述由STF2Δ.EIIIs+(序列识别号72、73)融合蛋白质所诱发的抗体反应的抗原决定部位图谱。评估来自指定的STF2Δ-融合蛋白质(E2-21、E27-E52，图60)致免疫的动物的免疫血清，检验其可辨认对应于西尼罗病毒包膜蛋白质的功能部位I及III的接合处的重迭肽(overlaping peptide)的能力；

图56描述由STF2Δ.EIIIs+(序列识别号72、73)E-21(包膜蛋白质)抗原决定部位融合蛋白质所诱发的抗体反应的抗原决定部位图谱。评估来自指定的STF2Δ-融合蛋白质(E2-21、E2-21-1(S、C)、E2-21-2(C、S)、E2-21-2(C、S)及E2-21-4，经由E2-21-24，参见图57)免疫的动物的免疫血清，以鉴定定义西尼罗病毒包膜蛋白质的E-21抗原决定部位的残基。数据反映出血清对于E-21在丝氨酸取代半胱氨酸(以C、S表示)；以及后续以丙氨酸替换氨基酸之后的反应。所测试的肽列于图57；

图57描述EIII+肽阵列。序列包括西尼罗病毒包膜蛋白质的功能部位I及III。对应于功能部位III的氨基酸以画下划线表示。未画下划线的氨基酸对应于功能部位I；

图58描述诱发EIII特异性IgG抗体的Pam3Cys.WNV001(序列识别号168)。在第0、14及28天，将小鼠以单独的磷酸盐缓冲溶液、22毫克未修饰的WNV001(序列识别号168)或30微克Pam3Cys.WNV001的进行皮下致免疫。在第35天，将个别小鼠的血清通过直接型酶联免疫吸附分析而定性，以测定对WNV001肽的IgG水平；

图59描述西尼罗、日本脑炎及登革(血清型1至4)病毒的EI/EIII接合处的氨基酸序列(序列识别号88-95)。利用来自STF2Δ.EIIIs+致免疫动物的抗血清所鉴定的西尼罗病毒抗原决定部位以画下划线表示。这个序列对应于肽E2-21(序列识别号125)；

图60描述E2-21肽(序列识别号125-151)丙氨酸扫瞄阵列。对应于西尼罗病毒包膜蛋白质的功能部位III的氨基酸以画下划线表示。未画下划线的氨基酸对应于西尼罗病毒的功能部位I；

图61描述STF2.OVA核酸序列(序列识别号152)。编码STF2及卵白蛋白(OVA)间的连接子的核酸序列以画下划线表示。在3’端的载体序列以粗体及画下划线表示；

图62描述由序列识别号152所编码的氨基酸序列(序列识别号153)。在STF2及卵白蛋白间的连接子序列以画下划线表示。载体序列以粗体及画下划线表示；

图63描述卵白蛋白的氨基酸序列(序列识别号154)；

图64描述卵白蛋白的核酸序列(序列识别号155)；

图65描述编码STF2.E融合蛋白质的核酸序列(序列识别号158)。编码全长西尼罗病毒包膜蛋白质(E)的核酸序列以画下划线表示；

图66描述由序列识别号158所编码的氨基酸序列(序列识别号159)。西尼罗病毒包膜蛋白质的氨基酸序列以画下划线表示；

图67描述编码序列识别39(图45)的核酸序列(序列识别号57)。西尼罗病毒包膜蛋白质的全长序列被描述；

图68描述登革1病毒(此处也称为“Den-1”、“Den1”或“Den1”)的氨基酸序列(序列识别号160)；

图69描述编码序列识别160的核酸序列(序列识别号161)；

图70描述登革2病毒(此处也称为“Den-2”、“Den2”或“Den2”)的氨基酸序列(序列识别号162)；

图71描述编码序列识别162的核酸序列(序列识别号163)；

图72描述登革3病毒(此处也称为“Den-3”、“Den 3”或“Den3”)的氨基酸序列(序列识别号164)；

图73描述编码序列识别164的核酸序列(序列识别号165)；

图74描述登革4病毒(此处也称为“Den-4”、“Den 4”或“Den4”)的氨基酸序列(序列识别号166)；

图75描述编码序列识别166的核酸序列(序列识别号167)；

图76描述编码日本脑炎病毒的核酸序列(序列识别号170)；

图77描述由序列识别号170所编码的氨基酸序列(序列识别号171)；

图78描述编码序列识别号174(描述于图44)的核酸序列(序列识别号175)；

图79描述编码EIII+(序列识别号39的氨基酸292-406，描述于图45及序列识别号7)的核酸序列(序列识别号178)；

图80描述三棕榈酰化的肽。

具体实施方式

本发明的特征及其它细节，无论是本发明的步骤或本发明的部分的组合，现在将更特定地说明并且在权利要求中指出。应理解的是，本发明的特定具体实例是以说明的方式显示，并非作为本发明的限制。在不脱离本发明的范畴之外，本发明的主要特征可用于各种具体实例。

本发明是有关于至少一种抗原的至少一部分及至少一种缺少铰链区域的鞭毛蛋白的至少一部分的组合物、融合蛋白质及多肽；以及至少一种病原体关联性分子模式(PAMP)的至少一部分及至少一种黄病毒的至少一部分的组合物、融合蛋白质及多肽。组合物、融合蛋白质及多肽可用于在个体中刺激免疫反应的方法。

在一具体实例中，本发明是组合物，其包括至少一种抗原的至少一部分以及至少一种鞭毛蛋白的至少一部分，其中至少一种鞭毛蛋白缺少铰链区域的至少一部分。

病原体关联性分子模式(PAMP)，例如，鞭毛蛋白或细菌脂蛋白，是指当结合至模式识别受体(PRR)时，可引起先天性免疫反应的在微生物中所发现的一种分子类型(例如，蛋白质、肽、碳水化合物、脂质、脂肽、核酸)。模式识别受体可以是类-Toll受体(TLR)。类-Toll(Toll-like)受体是指与黑腹果蝇(Drosophila melangogaster)Toll蛋白质同源的受体蛋白质家族。类-Toll受体是第1型跨膜信号传递受体蛋白质，其特征在于细胞外富含亮氨酸重复的功能部位以及与介百素1受体同源的细胞内功能部位。类-Toll受体包括TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11及TLR12。

病原体关联性分子模式可以是类-Toll受体的激动剂，例如，TLR2激动剂(也就是，Pam2Cys、Pam3Cys、细菌脂蛋白)或TLR5激动剂(例如，鞭毛蛋白)。此处所使用表示TLR的“激动剂”是指可活化TLR信号传递途径的分子。TLR信号传递途径是由可被TLR配体或TLR激动剂活化的特定TLR所使用的细胞内的信号传导途径。TLR使用通常的细胞内途径，并且包括，例如，NF-κB、Jun氨基端激酶及致裂原活化的蛋白质激酶。病原体关联性分子模式可包括选自由TLR1激动剂、TLR2激动剂(例如，Pam2Cys、Pam3Cys、细菌脂蛋白)、TLR3激动剂(例如，双链RNA)、TLR4激动剂(例如，细菌脂多糖)、TLR5激动剂(例如，鞭毛蛋白)、TLR6激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂、TLR9激动剂(例如，未甲基化的DNA主体结构)、TLR10激动剂、TLR11激动剂以及TLR12激动剂所组成的组中的至少一员。

在一特定具体实例中，TLR2激动剂是细菌脂蛋白，例如，Pam2Cys、Pam3Cys或绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)OprI脂蛋白(OprI)。例示性的OprI脂蛋白包括MNNVLKFSALALAAVLATGCSSH(序列识别号179)，其由ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCTGGGTTCTACTCTGCTGGCAGGTTGCTCCAGCAAC(序列识别号180)所编码。用于此处所说明的本发明的例示性大肠杆菌细菌脂蛋白是MKATKLVLGAVILGSTLLAGCSSN(序列识别号181)，其由ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCTGGGTTCTACTCTGCTGGCAGGTTGCTCCAGCAAC(序列识别号182)所编码。会活化TLR2信号传递途径(TLR2激动剂)的细菌脂蛋白，是包括棕榈油酸的细菌蛋白质(Omueti K.O.，等人，J.Biol.Chem.280：36616-36625(2005))。例如，序列识别号180及182在细菌表达系统(例如，大肠杆菌)中的表达，导致将棕榈油酸的分子部分加到所得蛋白质的半胱氨酸残基(例如，序列识别号179、181)，由此产生用于本发明组合物、融合蛋白质及多肽的TLR2激动剂。在细菌中，三棕榈酰化脂蛋白(也称为三酰基脂蛋白)的制备，经由将二酰基甘油基加到半胱氨酸(序列识别号181的半胱氨酸21)的巯基，接着切割讯号序列，并将第三个酰基链加到相同半胱氨酸(序列识别号181的半胱氨酸21)的游离氨基端基团而发生(Sankaran K.等人，J.Biol.Chem.269：19706(1994))，以产生例如图80所示的三棕榈基化肽(TLR2激动剂)。

抗原是当与病原体关联性分子模式(例如，鞭毛蛋白、Pam2Cys、Pam3Cys)并用或不含病原体关联性分子模式而使用时，可在个体中产生免疫反应的任何分子(例如，蛋白质、肽、糖蛋白、糖肽、碳水化合物、脂质、脂肽、多糖)。抗原可以是片段或部分的天然存在的抗原或合成的分子，其模拟天然存在的抗原或部分天然存在的抗原。

抗原可以是病毒抗原。此处所使用的“病毒抗原”是指病毒(例如，黄病毒)的任何部分，当与病原体关联性分子模式(例如，鞭毛蛋白、Pam2Cys、Pam3Cys)并用或不含病原体关联性分子模式而使用时，其可在个体中产生免疫反应。病毒抗原可以是部分或片段的天然存在的病毒或合成的分子，其仿真天然存在的病毒，例如，可在个体中产生免疫反应的重组或合成蛋白质(例如，黄病毒)、肽、脂质、碳水化合物。此处所使用关于至少一部分的抗原(例如，病毒抗原)的“至少一部分”是指抗原的任何部分或完整的抗原。例如，黄病毒抗原的至少一部分可以是黄病毒抗原的包膜蛋白质或包膜蛋白质的功能部位(例如，功能部位I、II、III)。

用于本发明的组合物、融合蛋白质及多肽中的鞭毛蛋白，可缺少铰链区域的至少一部分。铰链区域是鞭毛蛋白的高度可变异区域，其连结鞭毛蛋白的氨基端及羧基端。鞭毛蛋白的铰链区域在此也称为“高度可变异区域”或“高度可变异的铰链区域”。此处所使用关于鞭毛蛋白的铰链区域的“缺少”，是指包括鞭毛蛋白的铰链区域的至少一个氨基酸或编码至少一个氨基酸的至少一个核酸密码子，在鞭毛蛋白中是不存在的。铰链区域的例子包括序列识别号1的氨基酸176-415，由序列识别号2的核酸528-1245所编码；序列识别号68的氨基酸174-422，由序列识别号69的核酸522-1266所编码；或序列识别号58的氨基酸173-464，由序列识别号59的核酸519-1392所编码。因此，如果序列识别号1的鞭毛蛋白中氨基酸176-415是不存在的话，则鞭毛蛋白将缺少铰链区域。缺少铰链区域的至少一部分的鞭毛蛋白，在此也称为鞭毛蛋白的“截断形式”。

此处所使用的“铰链区域的至少一部分”是指病原体关联性分子模式(例如，鞭毛蛋白)的铰链区域的任何部分或完整的铰链区域。“铰链区域的至少一部分”此处也指“铰链区域的片段”。例如，鼠伤寒沙门氏杆菌鞭毛蛋白B(fljB，此处也称为fljB/STF2或STF2)的铰链区域，是序列识别号1的氨基酸176-416，其是由序列识别号2的核酸位置528-1245所编码。fljB/STF2的铰链区域的至少一部分可以是，例如，序列识别号1的氨基酸200-300。因此，如果序列识别号1的氨基酸200-300是不存在的话，则所得的STF2的氨基酸序列将缺少铰链区域的至少一部分。

天然存在的鞭毛蛋白的至少一部分，可以人工铰链区域的至少一部分而取代。此处所使用关于鞭毛蛋白的铰链区域的“天然存在的”是指在天然鞭毛蛋白中存在的铰链区域。例如，序列识别号1的氨基酸176-415、序列识别号68的氨基酸174-422以及序列识别号58的氨基酸173-464，分别是对应到STF2、大肠杆菌fliC以及慕尼黑沙门氏杆菌鞭毛蛋白fliC的天然铰链区域的氨基酸。此处所使用关于鞭毛蛋白的铰链区域的“人工的”是指在包含或曾包含天然铰链区域的鞭毛蛋白的任何区域中，插入到天然鞭毛蛋白的铰链区域。例如，序列识别号32缺少天然存在的铰链区域，其已被氨基酸176-186人工的铰链区域所取代。

人工的铰链区域可用于缺少铰链区域的至少一部分的鞭毛蛋白中，以促进鞭毛蛋白用于结合至TLR5的羧基端及氨基端的交互作用，并且因此活化TLR5固有的信号传导途径。缺少铰链区域的至少一部分的鞭毛蛋白是以鞭毛蛋白接着“Δ”的名称而命名。例如，缺少铰链区域的至少一部分的STF2(例如，序列识别号1)是称为“STF2Δ”或“fljB/STF2Δ”(例如，序列识别号3)。

用于本发明的组合物、融合蛋白质及多肽中的鞭毛蛋白，可以是选自由fljB/STF2(鼠伤寒沙门氏杆菌鞭毛蛋白B，Genbank登录号AF045151)、fljB/STF2的片段、大肠杆菌鞭毛蛋白fliC(此处也称为大肠杆菌fliC)(Genbank登录号AB028476)、大肠杆菌鞭毛蛋白fliC的片段、慕尼黑沙门氏杆菌鞭毛蛋白fliC(此处也称为慕尼黑沙门氏杆菌fliC)以及慕尼黑沙门氏杆菌鞭毛蛋白fliC的片段所组成的组中的至少一员。

用于本发明的组合物、融合蛋白质及多肽中的鞭毛蛋白，包括序列识别号1、序列识别号3、序列识别号58及序列识别号68的多肽；序列识别号1的至少一部分、序列识别号3的至少一部分、序列识别号58的至少一部分及序列识别号68的至少一部分；以及由序列识别号2、序列识别号4、序列识别号59及序列识别号69所编码的多肽；或由序列识别号2、序列识别号4、序列识别号59及序列识别号69所编码的多肽的至少一部分。

在另一具体实例中，本发明是融合蛋白质，其包括至少一种抗原的至少一部分以及至少一种鞭毛蛋白的至少一部分，其中至少一种鞭毛蛋白缺少铰链区域的至少一部分。

此处所使用的“融合蛋白质”是指从至少两个共价或非共价连结的相似或不同的成分(例如，Pam2Cys、Pam3Cys、病原体关联性分子模式、抗原的至少一部分、病毒蛋白质的至少一部分)所产生的蛋白质。融合蛋白质的成分可例如由合成而制得(例如，Pam3Cys、Pam2Cys)或通过重组核酸技术而制得(例如，以编码融合蛋白质的成分(例如，病原体关联性分子模式的至少一部分或抗原或病毒蛋白质的至少一部分)的核酸序列转染宿主细胞)。可将融合蛋白质的一种成分(例如，Pam2Cys、Pam3Cys、病原体关联性分子模式、抗原的至少一部分、病毒蛋白质的至少一部分)利用化学结合技术(包括肽结合)或利用分子生物学技术(包括重组技术，例如，产生融合蛋白质构建体)，而连结到融合蛋白质的另一成分(例如，Pam2Cys、Pam3Cys、病原体关联性分子模式、抗原的至少一部分、病毒蛋白质的至少一部分)。化学结合(此处也称为“化学偶联”)可包括通过反应基团(硫醇基，例如，半胱氨酸残基)或通过初级(例如，氨基端)或二级(例如，赖氨酸)基团的衍生化作用而结合。本发明例示性的融合蛋白质包括由序列识别号6、71、72、76、80、82、84、86及159(图6、图29、图30、图32、图36、图38、图40及图42)，其由序列识别号5、70、73、77、81、83、85、87及158(图5、图28、图31、图33、图37、图39、图41及图43)所编码。

本发明的融合蛋白质可通过“.”或“-”所分开融合蛋白质的成分而标明。例如，“STF2.EIII”是指包括一个fljB/STF2蛋白质以及至少一个西尼罗病毒包膜蛋白质的功能部位III(参见以下说明)的至少一部分的融合蛋白质；以及“STF2Δ.EIII”是指包括一个缺少其铰链区域的至少一部分的fljB/STF2蛋白质以及具有至少一个西尼罗病毒包膜蛋白质的功能部位III的至少一部分的融合蛋白质。

在另一具体实例中，本发明是组合物，其包括至少一种病原体关联性分子模式的至少一部分以及至少一种病毒蛋白质的至少一部分，该病毒蛋白质选自由西尼罗病毒蛋白质、冷岳病毒蛋白质、昆津病毒蛋白质、墨累谷脑炎病毒蛋白质、日本脑炎病毒蛋白质、壁虱性脑炎病毒蛋白质以及黄热病毒蛋白质所组成的组中，其为黄病毒蛋白质。病原体关联性分子模式以及病毒蛋白质可以是融合蛋白质的成分。

黄病毒属是在黄病毒科(Flaviviridae)之内，并且是由约70种病毒所组成。蚊子或壁虱传送大部分的这些病毒。许多黄病毒是明显的人类病原体，包括四种登革病毒(Den1、Den2、Den3及Den4)、黄热(YF)、日本脑炎(JE)、西尼罗(WN，此处也称为“WNV”)以及壁虱性脑炎(TBE)(Weaver S.C.等人，Nat.Rev.Microbiol.10：789-801(2004))。黄病毒属是根据交叉中和试验而区分成数种血清型，包括登革血清型，其包含四种血清学及遗传学上不同的病毒，称为DEN-1、DEN-2、DEN-3及DEN-4。

黄病毒是小的、包膜的病毒，具有二十面体的衣壳。黄病毒的基因体是单链正义的RNA(约11仟碱基)，其是在感染之后由宿主细胞的体系而直接转译。病毒的基因体被转译成单一多肽，其通过病毒及细胞的酶而经历转译同时切割及转译后切割，以产生黄病毒的三个结构性蛋白质(衣壳(C)、膜(M)以及包膜(E)蛋白质)；以及七个非结构性蛋白质(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B及NS5)(Weaver等人，Annu.Rev.Microbiol.1990：44-649(2004))。黄病毒的基因体组织是描绘在图44。病毒的衣壳是由衣壳蛋白质所组成，而膜蛋白质以及包膜蛋白质则是位于病毒粒子的包膜表面上(WeaverS.C.等人，Nat.Rev.Microbiol.10：789-801(2004)；Chambers等人，Annu.Rev.Microbiol.44：649-688(1990))。黄病毒的主要免疫原是膜包膜蛋白质。

黄病毒包膜蛋白质在病毒组合中扮演重要角色。这些蛋白质形成围绕病毒的保护外壳，其可作为内部遗传物质的围笼，保护病毒直到它在宿主细胞中被释出为止。虽然简单的病毒是仅由蛋白质外壳及遗传信号所组成，但较复杂的病毒(例如，黄病毒)，在蛋白质外壳及病毒基因体之间也包含脂质双层。当病毒包膜蛋白质结合至受体并且通过构形重组以对于减少的内囊胞的pH反应时，黄病毒可进入宿主细胞。构形的改变诱发病毒及宿主细胞膜的融合。

黄病毒的包膜可扮演受体结合蛋白质的功能，并且促进病毒及宿主细胞膜的融合。作为受体结合蛋白质，包膜蛋白质是宿主范围、宿主趋性、毒性的决定因子，并且在免疫反应期间诱发中和抗体(Roehrig，Adv.Virus Res.59：141-175(2003))。包膜蛋白质负责融合病毒及宿主的细胞膜(Chu，等人，J.Virol 78：10543-10555(2004)；Heinz，等人，Adv Virus Res 59：63-97(2003)；Chu，等人，J.Gen Virol86：405-412(2005))。壁虱性脑炎病毒包膜蛋白质及登革-2(Den2)病毒包膜蛋白质的结晶学结构已被决定(Rey，等人，Nature375：291-298(1995)；Modis，等人，Proc Natl Acad Sci USA100：6986-6991(2003))。黄病毒的包膜蛋白质具有共同的结构性(功能部位I、II及III)以及功能性特征(病毒及宿主细胞的受体结合以及融合功能)，并且是第II型的融合糖蛋白(Lescar等人，Cell 105：137-148(2001))。

在融合前的构形中，包膜蛋白质在病毒颗粒的外表面形成同二聚体(Rey等人，Nature 375：291-298Rey，等人，Nature 375：291-298)；Kuhn，等人，Cell108：717-725(2002)；Mukhopadhyay，等人，Science 302：248(2003))。每个包膜蛋白质单体都折叠成三个主要由β-链所组成的结构功能部位(功能部位I、II及III)。功能部位I(此处也称为“I”或“DI”)是位于结构中央，并且在糖基化的包膜蛋白质中具有N-糖基化作用的位置。包膜蛋白质的功能部位II(此处也称为“II”或“DII”)可促进二聚体化作用，并且具有在病毒的pH依赖型融合期间可插入至标的宿主细胞膜的融合圈(fusion loop)(Modis，等人，Nature427：313-319(2004)；Bressanelli，等人，EMBO J 23：728-738(2004))。功能部位III(此处也称为“III”或“DIII”)是在包膜蛋白质的羧基端。在早期的抗原性图谱研究中，功能部位III也称为“功能部位B”。功能部位III具有数个抗原决定部位，其可诱发中和病毒的抗体(Roehrig，Adv Virus Res 59：141-175(2003))。此外，许多黄病毒的研究，包括壁虱性脑炎(Mandle，等人，J.Virol75：5627-5637(2001))，显示具有免疫球蛋白恒定功能部位特征的折叠的功能部位III，可介导黄病毒附着至宿主细胞(Anderson，Adv Virus Res 59：229-274(2003))，并且因此是结合受体的功能部位。

壁虱性脑炎黄病毒及登革2黄病毒的包膜蛋白质的功能部位I、II及III的结晶学结构已被决定(分别是Rey，F.A.，等人，Nature 375：291-298(1995)；Modis，Y.，等人，Nature 427：313-319(2004))。壁虱性脑炎包膜蛋白质的功能部位I对应到序列识别号174的氨基酸1-51、137-189及285-302；壁虱性脑炎包膜蛋白质的功能部位II对应到序列识别号174的氨基酸52-136及190-284；以及功能部位III对应到序列识别号174的氨基酸303-395(Rey，F.A.，等人，Nature 375：291-298(1995))。序列识别号174(图44)是由序列识别号175(图78)所编码。登革2黄病毒的包膜蛋白质的功能部位I对应到序列识别号160的氨基酸1-52、132-193及280-296(图70)；功能部位II对应到序列识别号160的氨基酸53-131及194-279；以及功能部位III对应到序列识别号160的氨基酸297-495(Modis，Y.，等人，Nature 427：313-319(2004))。其它黄病毒(例如，西尼罗病毒、日本脑炎病毒、登革1病毒、登革3病毒及登革4病毒)的功能部位I、II及III的位置，是取决于壁虱性脑炎包膜蛋白质功能部位及登革2包膜蛋白质功能部位的同源性而定。因此，此处有关于黄病毒蛋白质的功能部位，特别是除了壁虱性脑炎黄病毒包膜蛋白质及登革2黄病毒包膜蛋白质以外的黄病毒，是取决于对壁虱性脑炎黄病毒包膜蛋白质及登革2黄病毒包膜蛋白质的功能部位的同源性而定。

DEN黄病毒的包膜蛋白质的功能部位III，编码大部分的黄病毒类型特异性连续性关键/显性的中和抗原决定部位(type-specific contiguouscritical/dominant neutralizing epitope)(Roehring，J.T.，Adv.Virus Res.59：141(2003))，包括四种DEN(DEN1、DEN2、DEN3及DEN4)病毒。黄病毒包膜蛋白质是高度同源性的。例示性的包膜蛋白质序列是显示在图45、图68、图70、图72、图74及图77(分别是序列识别号39、160、162、164、166及171)。

黄病毒包膜蛋白质的七个非结构性蛋白质是涉及到病毒的复制。NS3是多功能性的酶，其在氨基端区域编码丝氨酸蛋白酶；以及在羧基端区域编码解螺旋酶、RNA三磷酸酶及NTP酶的活性。NS5编码甲基移转酶以及RNA依赖性的RNA聚合酶。NS2A、NS2B、NS4A及NS4B是四种极少被描述特征的蛋白质。NS2B的中央功能部位是NS3丝氨酸蛋白酶的辅因子，而NS2A及NS4A则已知是复制复合体的成分。NS1是位于被病毒感染的细胞的浆膜及细胞内小泡的腔室内。NS1是多功能性的酶，其与负链RNA合成的前或早期的复制周期的早期步骤有关，并且也被认为涉及到病毒的成熟及/或释放(Brinton，M.A.，Annu Rev Microbiol56：371(2002))。

西尼罗病毒(WNV)是单链的正义RNA包膜病毒。它是在1937年于乌干达的西尼罗河区域，从一名发热的成年女性中首次被分离及鉴定(Smithburn，等人，Am J Trop Med Hyg 3：9-18(1954))。利用与多株抗血清的交叉中和试验，西尼罗病毒已被分类为黄病毒科的一员(Boctor，等人，J.Virol Methods26：305-311(1989))。西尼罗病毒是神经侵入性的(George，等人，Bull W H O62：879-882(1984))；以及严重的人类脑膜脑脊髓炎可能因为受到西尼罗病毒的感染而发生，如同在北美的爆发中所观察到的(CDC，最新报导：West Nile VirusEncephalitis-New York 1999，MMWR Morbid Mortal Wkly Rep 48：994-946；CDC，Update：West Nile Virus Encephalitis-New York 1999.MMWR MorbidMortal Wkly Rep 51：1135-1136)。在1999-2002期间，西尼罗病毒延伸其范围遍布大部分的美国东部，并且预期它在西半球内的范围会持续扩展。鸟类是天然的储存宿主，以及西尼罗病毒是天然地维持在主要涉及库蚊(Culex)品种蚊子的蚊子-鸟类-蚊子传送周期中。

最近，西尼罗病毒已在欧洲及北美的温带区域中出现，呈现对于大众及动物健康的威胁。西尼罗病毒感染的最严重形式是在人类及马中的致死性脑炎(脑部发炎)，以及在特定驯养及野生鸟类中的死亡。在美国，西尼罗病毒的感染也已经是人类疾病的一个主因。西尼罗病毒的包膜糖蛋白(WNV-E)以及其它黄病毒的包膜糖蛋白，在调配可刺激免疫反应以产生中和及保护抗体的组合物中，可能是重要的。目前，并没有可预防西尼罗病毒感染的组合物，例如，通过刺激在个体中的免疫反应的组合物。

日本脑炎(JE)病毒是位于亚洲及北澳洲的地区(每年约50,000个病例及约10,000人死亡)。包括失活性病毒的组合物，最近是与急性散播性脑脊髓炎的病例有关，引起日本厚生劳动省建议全国暂停使用包括失活性病毒的组合物。

登革(DEN)疾病是由四种蚊子输送、血清学相关的黄病毒所引起，已知为DEN-1(此处也称为“Den1”或“Den1”)、DEN-2(此处也称为“Den2”或“Den2”)、DEN-3(此处也称为“Den3”或“Den3”)以及DEN-4(此处也称为“Den4”或“Den4”)，并且也是人类重要的虫媒病毒疾病。在世界的所有热带区域中，DEN是主要的公共卫生问题。每年约有三十亿人是处于DEN的危险中，以及约五千万至约一亿的登革热(DF)病例及数十万的登革出血热(DHF)病例在热带发生，包括墨西哥、加勒比海及部分的亚洲及南太平洋(Gubler，D.J.，AnnAcadMedSingapore 27：227-34(1998))。登革病毒是通过栖息于热带的本土性斑蚊而传送，而使登革热在这些区域的地方性成为可能。被一种病毒感染会引起登革热(DF)，一种发热疾病，其通常不会威胁生命，并且会产生一生的保护性免疫力以对抗感染的DEN血清型/病毒。然而，被一种血清型/病毒感染的个体，仍然容易受到其它三种DEN血清型/病毒的感染。被其它DEN血清型/病毒之一的后续感染，可导致登革出血热(DHF)或登革休克症候群(DSS)，其为威胁生命的疾病。

登革出血热可能是抗体依赖性增强作用(ADE)的结果，其中由原始DEN感染所诱发的非中和抗体，在第二次感染中形成病毒-抗体复合体，其被巨噬细胞通过Fc受体摄入，因此而增强病毒感染。每年约有500,000个登革出血热病例发生，大部分是孩童，具有约5％的致死率。每年约六亿个孩童是处于DEN感染的风险下，约六千万个孩童可能得到DEN感染，以及约60,000个孩童可能要住院治疗。除了公共卫生问题之外，军事人员也经常被海外地送到世界上发现登革病毒的热带区域。当在海外执行勤务时，例如，索马利亚、格瑞那达、越南及波斯湾冲突，许多士兵因DEN而死亡。想要开发DEN疫苗的尝试已证明是困难的，因为这需要开发可避免所有四种DEN血清型/病毒的四价疫苗。

预防黄病毒疾病的方法包括对黄病毒的疫苗(Barrett，A.D.，Ann.N.Y.Acad.Sci 951：262(2001)。这些组合物可分成两种类型：活性减毒及失活性。包括活性黄病毒的组合物已针对黄热及日本脑炎，分别根据品系17D及SA14-14-2而开发，并且是分别通过鸡及仓鼠组织的经验通路而衍生。SA14-14-2是在中华人民共和国制造，生长于初级仓鼠肾脏细胞培养物中，并且最近已被核准于中国以外使用。两种组合物都是有效的，并且分别需要一或两次剂量以发展保护性的免疫力。对于日本脑炎及壁虱性脑炎，已有失活性病毒的组合物。失活性的日本脑炎组合物是以中山(Nakayama)、北京-1或P3品系为基础，而失活性的壁虱性脑炎组合物则是以中欧壁虱性脑炎Neudorfl及K23，以及俄罗斯春夏脑炎品系Sofjin及205为基础。这些非活性的黄病毒组合物需要约两次的剂量(约一周至约两个月分开给予)、在约一年时的一次增强剂量，以及约每三至约四年的周期性增强。抗体调节的免疫力，特别是中和抗体，在预防黄病毒的疾病中可能是重要的。在给予治疗黄病毒疾病或预防黄病毒疾病的组合物后的长期存活的中和抗体，也可能是重要的。

许多不同的方法已被采用以开发预防黄病毒感染的组合物，但有许多已经是不成功的。关于四种病毒(DEN1、DEN2、DEN3、DEN4)所造成的疾病DEN，可能需要开发针对一或多种DEN黄病毒的组合物。例如，四价(DEN1、DEN2、DEN3及DEN4)的组合物可刺激同时对抗所有四种登革病毒的免疫反应，并且藉此排除抗体依赖性增强作用的可能性。

目前并无有效的组合物以预防多种黄病毒的感染，包括西尼罗病毒、登革病毒、壁虱性病毒、昆津病毒、墨累谷脑炎病毒及黄热病毒(Chang，G.J.，等人，Expert Rev.Vaccine 3：199(2004))。减弱及免疫原性可能会在具有活性减毒的黄病毒的组合物中发生。此外，具有四价活性登革黄病毒的组合物，可能具有干扰及失衡的免疫反应的问题，导致许多测试的组合物在四种登革病毒的每一个的质量上产生改变。包括失活性的黄病毒的组合物，可能具有免疫原性及需要多次剂量的问题。此外，失活性黄病毒组合物在感染的小鼠脑部或细胞培养物中的制备，可能是复杂的、冗长的、如果没有适当地使其失去活性的话可能导致未知的危险、以及当给药至个体时可能导致不利的影响。因此，开发新的组合物以用于在个体中预防黄病毒的感染，仍有其需求。

本发明的组合物、融合蛋白质及多肽是利用病原体关联性分子模式，其可诱发导致共同刺激分子的表达、关键细胞激素及趋化素的分泌的细胞事件；并将抗原有效的加工及呈现给T细胞。如以上的讨论，TLR辨认病原体关联性分子模式，其包括细菌细胞壁成分(例如，细菌脂蛋白及脂多糖)、细菌DNA序列(其包含未甲基化的CpG残基)以及细菌鞭毛蛋白。TLRs扮演先天性免疫反应的启动者及后天性免疫反应的守门者(Medzhitov，R.，等人，ColdSprings Harb.Symp.Quant.Biol.64：429(1999)；Pasare，C.，等人，Semin，Immunol 16：23(2004)；Medzhitov，R.，等人，Nature 388：394(1997)；Barton，G.M.，等人，Curr.Opin.Immunol 14：380(2002)；Bendelac，A.，等人，J.Exp.Med.195：F19(2002))。

如以上的讨论，病原体关联性分子模式结合至TLR，活化了用于本发明组合物、融合蛋白质及多肽的免疫途径，其可用于在个体中刺激免疫反应。本发明的组合物、融合蛋白质及多肽可诱发对于抗原(例如，病毒蛋白质，例如，黄病毒蛋白质)的免疫反应，并且诱发个体的先天性及后天性免疫系统的信号传导途径，由此刺激个体的免疫系统。个体免疫系统的刺激，可预防被抗原或病毒(例如，黄病毒)感染，并且藉此治疗个体或避免个体受到疾病、不适以及可能的死亡。

本发明的组合物、融合蛋白质及多肽可包括，例如，一、二、三、四、五、六或多个病原体关联性分子模式(例如，Pam2Cys、Pam3Cys、鞭毛蛋白)以及一、二、三、四、五、六或多个抗原。当二或多个病原体关联性分子模式及/或二或多个抗原及/或病毒蛋白质构成本发明的组合物、融合蛋白质及多肽时，它们也可称为“多聚体”。

病原体关联性分子模式可以是TLR5激动剂(例如，至少一种鞭毛蛋白的至少一部分)。鞭毛蛋白可以是选自由fljB/STF2、大肠杆菌fliC以及慕尼黑沙门氏杆菌fliC所组成的组中的至少一员。鞭毛蛋白可包括fljB/STF2(例如，序列识别号1)或缺少铰链区域的鞭毛蛋白(例如，序列识别号3)。

病原体关联性分子模式可以是TLR2激动剂。TLR2激动剂包括选自由Pam2Cys以及Pam3Cys所组成的组中的至少一员。Pam3Cys是[棕榈酰]-半胱氨酸((RS)-2，3-二(棕榈酰氧基)丙基半胱氨酸)。Pam3Cys在此处也称为“P2”。Pam2Cys是S-[2，3-二(棕榈酰氧基)丙基]半胱氨酸。

用于本发明的组合物、融合蛋白质及多肽中的病毒蛋白质，可以是选自由西尼罗病毒包膜蛋白质、冷岳病毒包膜蛋白质、昆津病毒包膜蛋白质、墨累谷脑炎病毒包膜蛋白质、日本脑炎病毒包膜蛋白质、壁虱性脑炎病毒包膜蛋白质、黄热病毒包膜蛋白质以及登革病毒包膜蛋白质所组成的组中的至少一员的包膜蛋白质。

本发明的组合物、融合蛋白质及多肽可使用黄病毒的包膜蛋白质的任何部分。本发明的组合物、融合蛋白质及多肽可包括选自由黄病毒的包膜蛋白质的功能部位I、功能部位II以及功能部位III所组成的组中的至少一员的至少一部分。此处所使用关于包膜蛋白质的功能部位的“至少一部分”，是指包膜蛋白质功能部位的任何部分或完整的包膜蛋白质。例如，序列识别号88及100-151，包括西尼罗病毒包膜蛋白质的功能部位III的至少一部分。

此处所使用的“EI”、“EII”及“EIII”，分别是指西尼罗黄病毒包膜蛋白质的功能部位I、II及III。此处所使用的“JEI”、“JEII”及“JEIII”，分别是指日本脑炎黄病毒包膜蛋白质的功能部位I、II及III。此处所使用的“Den1I”、“Den1II”及“Den1III”，分别是指登革1黄病毒包膜蛋白质的功能部位I、II及III。同样地，对于其它黄病毒包膜蛋白质的功能部位的命名，是参考黄病毒的名称，后面接着功能部位编号(例如，壁虱性(TBI)、TBII、TBIII、Den2I、Den2II、Den2III)。

用于本发明组合物、融合蛋白质及多肽的黄病毒包膜蛋白质的部分，可包括选自由功能部位I的至少一部分、功能部位II的至少一部分以及功能部位III的至少一部分所组成的组中的至少一员。当功能部位以“+”命名时，例如，“EIII+”或“JEIII+”，称作“III”的包膜蛋白质部分，是该功能部位整体的一种成分，加上至少一种功能部位I及II的任一或两者的至少一部分。例如，此处所使用的“EIII+”是指本发明的组合物、融合蛋白质及多肽包括功能部位III以及至少一部分的功能部位I。“EIII+”也称作“EI/III”。“JEIII+”也指“JEI/III”。同样地，当本发明的组合物、融合蛋白质及多肽包括黄病毒包膜蛋白质的功能部位时，所述功能部位可以是功能部位I、II及III的任何组合，并且可以根据功能部位而命名。例如，EI/II包括西尼罗黄病毒的功能部位I及II。关于使用在本发明的组合物、融合蛋白质及多肽中的包膜蛋白质的功能部位缺少“+”(例如，EIII、JEIII、Den1III)，是指组合物、融合蛋白质及多肽包括参考的功能部位。例如，“Den1III”是指组合物、融合蛋白质及多肽包括登革1病毒的功能部位III，而非功能部位I及II。

用于本发明的组合物、融合蛋白质及多肽中的西尼罗病毒包膜蛋白质，可包括选自由MEKLQLKGTTYGVCSKAFKFLGTPADTGHGTVVLELQYTGTDGPCKVPISSVASLNDHPVGRLVTVNPFVSVATANAKVLIELEPPFGDSYIVVGRGEQQINHHWHKSGSSIGK(序列识别号7，其为EIII+氨基酸序列，斜体的氨基酸是包膜蛋白的功能部位I，以及其余的序列是包膜蛋白的功能部位III)；GTTYGVCSKAFKFARTPADTGHGTVVLELQYTGKDGPCKVPISSVASLNDLTPVGRLVTVNPFVSVATANSKVLIELEPPFGDSYIVVGRGEQQINHHWHKSG(序列识别号8，西尼罗病毒，史丹福，康乃迪克州，也称为“西尼罗S”)；GTTYGVCSKAFKFLGTPADTGHGTVVLELQYTGTDGPCKVPISSVASLNDLTPVGRLVTVNPFVSVATANAKVLIELEPPFGDSYVVGRGEQQINHHWHKSG(序列识别号9，西尼罗病毒，纽约，纽约州，也称为“西尼罗NY”)；以及ELEPPFGDSYIVVGRGEQQINHHWHKS(序列识别号10)所组成的组中的至少一员的至少一部分。序列识别号7是由ATGGAAAAATTGCAGTTGAAGGGAACAACCTATGGCGTCTGTTCAAAGGCTTTCAAGTTTCTTGGGACTCCCGCAGACACAGGTCACGGCACTGTGGTGTTGGAATTGCAGTACACTGGCACGGATGGACCTTGCAAAGTTCCTATCTCGTCAGTGGCTTCATTGAACGACCTAACGCCAGTGGGCAGATTGGTCACTGTCAACCCTTTTGTTTCAGTGGCCACGGCCAACGCTAAGGTCCTGATTGAATTGGAACCACCCTTTGGAGACTCATACATAGTGGTGGGCAGAGGAGAACAACAGATCAATCACCATTGGCACAAGTCTGGAAGCAGCATTGGCAAA(序列识别号11)所编码。西尼罗病毒包膜蛋白质可包括与含有序列识别号7的多肽具有至少约70％相同性、至少约75％相同性、至少约80％相同性、至少约85％相同性、至少约90％相同性、至少约95％相同性以及至少约99％相同性的蛋白质，序列识别号7是包括西尼罗病毒的功能部位I及II的部分(此处也称为“EIII+”)。

用于本发明的组合物、融合蛋白质及多肽中的冷岳病毒包膜蛋白质，可包括GLTYTVCDKTKFTWKRAPTDSGHDTVVMEVGF SGTRPCRIPVRAVAHGVPEVNVAMLITPNPTMENNGGGFIEMQLPPGDNIIYVGDLNHQWFQKG(序列识别号12)的至少一部分。昆津病毒包膜蛋白质可包括GTTYGVCSKAFRFLGTPADTGHGTVVLELQYTGTDGPCKIPIS SVASLNDLTPVGRLVTVNPFVSVSTANAKVLIELEPPFGDSYIVVGRGEQQINHHWHKSG(序列识别号13)的至少一部分。墨累谷脑炎包膜蛋白质可包括GTTYGMCTEKFTFSKNPADTGHGTVVLELQYTGSDGPCKIPISSVASLNDMTPVGRMVTANPYVASSTANAKVLVEIEPPFGDSYIVVGRGDKQINHHWHKEG(序列识别号14)的至少一部分。日本脑炎包膜蛋白质可包括选自由GTTYGMCTEKFSFAKNPADTGHGTVVIELSYSGSDGPCKIPIVSVASLNDMTPVGRLVTVNPFVATSSANSKVLVEMEPPFGSDYIVVGMGDKQINHHWHKAG(序列识别号15)以及EMEPPFGDSYIVVMGDKQINHHWHKA(序列识别号16)的至少一部分所组成的组中的至少一员。壁虱性脑炎包膜蛋白质可包括GLTYTMCDKTKFTWKRAPTDSGHDTVVMEVTFSGTKPCRIPVRAVAHGSPDVNVAMLITPNPTIENNGGGFIEMQLPPGDNIIYVGELSHQWFQK(序列识别号17)的至少一部分。黄热病毒包膜蛋白质可包括GLTYTMCDKTFTWKRAPTDSGHDTVVMEVTFSGTKPCRIPVRAVAHGSPDVNVAMLITPNPTIENNGGGFIEMQLPPGDNIIYVGELSHQWFQK(序列识别号18)的至少一部分。黄病毒的包膜蛋白质可包括选自由GTTYGMCSKKFTFRPADTGHGTVVLELQYSGDGPCKIPISVASKNDLTPVGRLVTVNPFVSSTANAKVLIEMEPPFGDSYIVVGGEQINHHWHKG(序列识别号19)以及GMSYSMCTGKFKVVKEIAETQHGTIVIRVQYEGDGSPCKIPFEIMDLEKRHVLGRLITVNPIVTEKDSPVNIEAEPPFGDSYIIIGVEPGQLKLNWFKK(序列识别号40)所组成的组中的至少一员的至少一部分。序列识别号12、13、14、15、16、17、18、19及40是病毒包膜蛋白质的功能部位III的部分。

在另一具体实例中，本发明是组合物，其包括至少一种病原体关联性分子模式的至少一部分以及至少一种Den2病毒包膜蛋白质的至少一部分，其中Den2病毒包膜蛋白质选自由EAEPPFGDSYIIIGVEPQQLKLNWFKK(序列识别号22)、序列识别号40以及序列识别号97所组成的组中的至少一员。

本发明的组合物、融合蛋白质及多肽可包括Den1(EAEPPFGESYIVVGAGEKALKLSWFKK(序列识别号20)；Den1 PR 94(波多黎各，1994)(ETEPPFGESYIVVGAGEKALKLSWFKK(序列识别号21))；Den3(EAEPPFGESNIVIGIGDKALKINWYKK(序列识别号23))；以及Den4(ELEPPFGESYIVIGVGNSAITLHWFRK(序列识别号24))。序列识别号20、21、22、23及24是Den1、Den2、Den3及Den4黄病毒的功能部位III的部分。四种登革病毒的功能部位III的至少一部分，在本发明的组合物、融合蛋白质或多肽中可一起或分开使用。例如，Den1(品系16007)、Den2(品系516803)、Den3(品系H53489)及Den4(品系703)的功能部位III，可分别或组合地使用。病原体关联性分子模式及Den2包膜病毒蛋白质，可以是融合蛋白质的成分。

在另一具体实例中，本发明是组合物，其包括至少一种病原体关联性分子模式的至少一部分，以及选自由Den1病毒包膜蛋白质、Den2病毒包膜蛋白质、Den3病毒包膜蛋白质以及Den4病毒包膜蛋白质所组成的组中的至少一员的至少一部分。

在另一具体实例中，本发明是融合蛋白质，其包括至少一种病原体关联性分子模式的至少一部分以及至少一种病毒蛋白质的至少一部分，该病毒蛋白质选自由西尼罗病毒蛋白质、冷岳病毒蛋白质、昆津病毒蛋白质、墨累谷脑炎病毒蛋白质、日本脑炎病毒蛋白质、壁虱性脑炎病毒蛋白质、黄热病毒蛋白质以及C型肝炎病毒蛋白质所组成的组中。用于本发明的组合物、融合蛋白质及多肽中的C型肝炎病毒蛋白质，选自由可包括序列识别号64(图22)以及序列识别号65(图23)所组成的组中的至少一员的多肽，其分别由序列识别号66(图24)以及序列识别号67(图25)所编码。

在另一具体实例中，本发明是融合蛋白质，其包括至少一种病原体关联性分子模式的至少一部分，以及选自由Den1病毒包膜蛋白质、Den2病毒包膜蛋白质、Den3病毒包膜蛋白质以及Den4病毒包膜蛋白质所组成的组中的至少一员的至少一部分。

本发明的融合蛋白质可进一步包括在病原体关联性分子模式及病毒蛋白质之间的连接子。连接子可以是氨基酸连接子。氨基酸连接子可包括合成或天然存在的氨基酸残基。用于本发明融合蛋白质中的氨基酸连接子，可包括选自由赖氨酸残基、谷氨酸残基、丝氨酸残基、半胱氨酸以及精氨酸残基所组成的组中的至少一员。此处所使用的“氨基酸连接子”也指“肽连接子”。氨基酸连接子可包括选自由KGNSKLEGQLEFPRTS(序列识别号：26)；EFCRYPAQWRPL(序列识别号：28)；EFSRYPAQWRPL(序列识别号：60)；KGNSKLEGQLEFPRTSPVWWNSADIQHSGGRQCDGYLQNSPLRPL(序列识别号：62)；EFSRYPAQWRPL(序列识别号：75)的肽所组成的组中的至少一员；其由  AAGGGCAATTCGAAGCTTGAAGGTCAATTGGAATTCCCTAGGACTAGT(序列识别号：25)；GAATTCTGCAGATATCCAGCACAGTGGCGGCCGCTC(序列识别号：27)；GAATTCTCTAGATATCCAGCACAGTGGCGGCCGCTC(序列识别号：61)；AAGGGCAATTCGAAGCTTGAAGGTCAATTGGAATTCCCTAGGACTAGTCCAGTGTGGTGGAATTCTGCAGATATCCAGCACAGTGGCGGCCGCCAGTGTGATGGATATCTGCAGAATTCGCCCTTGCGGCCGCTC(序列识别号：63)；与GAATTCTCTAGATATCCAGCACAGTGGCGGCCGCT(序列识别号：74)所编码。

本发明的融合蛋白质可进一步包括在组合物的融合蛋白质的至少一种成分(例如，Pam3Cys、Pam2Cys、鞭毛蛋白、病原体关联性分子模式)及融合蛋白质的至少一种其它成分(例如，抗原的至少一部分、病毒蛋白质的至少一部分)间的连接子、在至少两种融合蛋白质的相似成分(例如，Pam3Cys、Pam2Cys、鞭毛蛋白、病原体关联性分子模式)间的连接子或其任何组合间的连接子。

此处所使用有关于本发明融合蛋白质的“连接子”是指在融合蛋白质成分间，使融合蛋白质成分不直接结合的方式的连接子。例如，可将融合蛋白质的一种成分(例如，Pam3Cys、Pam2Cys、病原体关联性分子模式)连结到融合蛋白质的不同成分(例如，抗原的至少一部分、病毒蛋白质的至少一部分)。同样地，也可连结融合蛋白质的至少两种或多种相似或类似成分(例如，两个病原体关联性分子模式可在每个病原体关联性分子模式之间进一步包括连接子，或两个抗原可在每个抗原之间进一步包括连接子，或两个病毒蛋白质可在每个病毒蛋白质之间进一步包括连接子)。

此外或另一种选择，本发明的融合蛋白质可在融合蛋白质的不同成分以及融合蛋白质的相似或类似成分之间包括连接子的组合。例如，融合蛋白质可包括至少两个PAMP、Pam3Cys及/或Pam2Cys成分，在例如两个或多个病原体关联性分子模式之间进一步包括连接子；至少两个抗原或至少两个病毒蛋白质，在它们之间进一步包括连接子；在融合蛋白质的一种成分(例如，病原体关联性分子模式)及融合蛋白质的另一种不同成分(例如，抗原的至少一部分、病毒蛋白质的至少一部分)之间的连接子，或其任何组合。因此，本发明的融合蛋白质可在至少两种病原体关联性分子模式之间进一步包括连接子、在至少两种抗原之间进一步包括连接子、在至少两种病毒蛋白质之间进一步包括连接子、或其任何组合。

本发明的融合蛋白质的病原体关联性分子模式，可融合至抗原或至少一部分的病毒蛋白质(例如，黄病毒蛋白质，例如西尼罗包膜蛋白质的功能部位III的至少一部分，称为“EIII”；登革1包膜蛋白质的功能部位III的至少一部分，称为“Den1 III”)的羧基端、氨基端或羧基及氨基端两者。此处所使用的“融合至”是指共价或非共价连结或一起重组制造。

本发明的融合蛋白质可在至少两种抗原或至少两种病毒蛋白质之间，包括至少一种病原体关联性分子模式，其可视需要地在病原体关联性分子模式及抗原或病毒蛋白质之间包括连接子。本发明的融合蛋白质可包括融合在至少两种病毒蛋白质之间的病原体关联性分子模式(例如，命名为“病毒蛋白质.病原体关联性分子模式.病毒蛋白质”)。本发明的融合蛋白质可包括融合在至少两种病原体关联性分子模式之间的抗原或病毒蛋白质(例如，命名为“病原体关联性分子模式.病毒蛋白质.病原体关联性分子模式”)。

本发明的融合蛋白质的病原体关联性分子模式可以是TLR5激动剂，例如，鞭毛蛋白。本发明的融合蛋白质的抗原或病毒蛋白质，可在缺少鞭毛蛋白的铰链区域的至少一部分的鞭毛蛋白区域内，融合至鞭毛蛋白。例如，可删除序列识别号1的fljB/STF2鞭毛蛋白的铰链区域的至少一部分(图1)，并且可将抗原或病毒蛋白质融合至鞭毛蛋白的删除区域中。

本发明的融合蛋白质的抗原或病毒蛋白质，可在包含鞭毛蛋白的铰链区域的鞭毛蛋白区域内，融合至鞭毛蛋白。例如，抗原或病毒蛋白质可在铰链区域的任何位置，融合至序列识别号1的fljB/STF2鞭毛蛋白(图1)，例如，在序列识别号1的氨基酸176-415的任何位置。

本发明的融合蛋白质的抗原或病毒蛋白质，可在缺少鞭毛蛋白的铰链区域的鞭毛蛋白区域内，融合至鞭毛蛋白，其中铰链区域已被人工铰链区域(例如，氨基酸连接子)所取代。例如，抗原或病毒蛋白质可通过如描绘地取代氨基连接子(此处也称为“人工铰链”或“人工铰链区域”或“人工高度可变异区域”)，而融合至序列识别号3的fljB/STF2Δ鞭毛蛋白(图3)，例如，以在序列识别号3的氨基175至186间的氨基连接子(HGAPVDPASPW，序列识别号183)的取代。

在另一具体实例中，本发明是融合蛋白质，其包括选自由fljB/STF2、大肠杆菌fliC以及慕尼黑沙门氏杆菌fliC所组成的组中的至少一员的至少一部分，以及选自由Den1病毒包膜蛋白质、Den2病毒包膜蛋白质、Den3病毒包膜蛋白质以及Den4病毒包膜蛋白质所组成的组中的至少一员的至少一部分。包膜蛋白质的部分可以是选自由包膜蛋白质的功能部位I、功能部位II及功能部位III所组成的组中的至少一员的至少一部分。

在另一具体实例中，本发明包括多肽，其包括序列识别号71、72、30、32、34、36、38、55、76、6、80、82、84、86、及159，以及由序列识别号70、73、29、31、33、35、37、54、77、5、81、83、85、87、及158所编码的多肽。

在另一具体实例中，本发明包括多肽，其与序列识别号71、72、30、32、34、36、38、55、75、6、80、82、84、86、及159的多肽以及序列识别号70、73、29、31、33、35、37、54、77、5、81、83、85、87及158的核酸，具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％及至少约99％的序列相同性。

在另一具体实例中，本发明包括具有鞭毛蛋白的多肽的组合物、融合蛋白质及多肽，该鞭毛蛋白的多肽包括与序列识别号1、3、58及68的多肽以及序列识别号2、4、59及69的核酸具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％及至少约99％的序列相同性的多肽。

两个氨基酸序列(或两个核酸序列)的相同性的百分比，可通过校准序列以最适比较目的而测定(例如，可将空隙导入至第一序列的序列中)。接着比较在对应位置处的氨基酸序列或核酸序列，而在两个序列间的相同性的百分比，是两序列间相同位置的数目的函数(也就是，％相同性＝相同位置的数目/位置的总数×100)。用于比较目的而校准的蛋白质或编码病原体关联性分子模式、本发明的融合蛋白质、病毒蛋白质或多肽的至少一部分的核酸长度，是至少30％，较佳是至少40％，更佳是至少60％，以及还要更佳是至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的参考序列的长度，参考序列例如为病原体关联性分子模式、病毒蛋白质的至少一部分或多肽或融合蛋白质的核酸序列，例如，如序列识别号71、72、30、32、34、36、38、55、75、6、80、82、84、86及159所描绘。

两个序列的确实比较可通过熟知的方法而完成，例如，利用数学算法。所述数学算法的较佳、非限制性的例子是说明于Karlin等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：5873-5877(1993)，其教示特此以引用方式完整地纳入本文中)。这样的算法被纳入到BLASTN及BLASTX程序中(2.2版)，如Schaffer等人(Nucleic Acids Res.，29：2994-3005(2001)的说明，其教示特此以引用方式完整地纳入本文中)。当利用BLAST及有空隙的BLAST程序时，可使用个别程序的预设参数(例如，BLASTN；可得自国家生物技术信息中心的因特网位置)。在一具体实例中，所搜寻的数据库是非冗余(NR)数据库，以及用于序列比较的参数可设定在：无过滤(filter)；期望值10；序列长度(Word Size)3；矩阵(Matrix)是BLOSUM62；以及空隙成本具有存在值(existence)11及延伸值(extension)1。

另一个用于比较序列的数学算法是Myers及Miller算法，CABIOS(1989)，其教示特此以引用方式完整地纳入本文中。这样的算法被纳入到ALIGN程序中(2.0版)，其为GCG(Accelrys，圣地亚哥，加州)序列比对软件包的一部分。当利用ALIGN程序以比较氨基酸序列时，使用PAM120重量残基表、空隙长度罚分(gap length penalty)12以及空隙罚分4。其它用于序列分析的算法是在此技艺中已知的，并且包括ADVANCE及ADAM，如Torellis及Robotti(Comput.Appl.Biosci.，10：3-5(1994)的说明，其教示特此以引用方式完整地纳入本文中)；以及FASTA，说明于Pearson及Lipman(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：2444-2448(1988)，其教示特此以引用方式完整地纳入本文中)。

在另一具体实例中，本发明是宿主细胞以及载体，其包括本发明的核酸序列。宿主细胞可以是原核生物(例如，大肠杆菌)或真核生物(例如，昆虫细胞，例如，果蝇Dme12细胞；杆状病毒；中国仓鼠卵巢(CHO)细胞；酵母菌细胞，例如，毕氏酵母(Pichia))的宿主细胞。

在两个氨基酸序列间的相同性的百分比，也可利用在GCG软件包中的GAP程序而完成(Accelrys，圣地亚哥，加州)，其利用Blossom 63矩阵或PAM250矩阵，以及空隙值12、10、8、6或4，以及长度值2、3或4。在另一具体实例中，在两个核酸序列间的相同性的百分比，可利用在GCG软件包中的GAP程序而完成(Accelrys，圣地亚哥，加州)，其利用空隙值50以及长度值3。

编码病原体关联性分子模式、病毒蛋白质的至少一部分、本发明的融合蛋白质及本发明的多肽的核酸序列，可包括在选择性杂合条件下(例如，高度严格杂合条件)，可杂合至例如fljB/STF2(例如，序列识别号2、4)、fliC(例如，序列识别号59、69)、至少一部分的病毒蛋白质(例如，序列识别号39、160、162、164、166及177)以及本发明的融合蛋白质(例如，序列识别号71、72、30、32、34、36、38、55、75、6、80、82、84及86)的核酸序列。此处所使用的名词“在低度严格性下杂合”、“在中度严格性下杂合”、“在高度严格性下杂合”或“在非常高度严格性下杂合”，说明用于杂合及清洗核酸序列的条件。进行包括水溶性及非水溶性方法的杂合反应的指导，可参见AubuselF.M.等人，现代分子生物学方法，John Wiley & Sons，纽约(2001)，其教示特此以引用方式完整地纳入本文中。

对于需要高度选择性的应用，可使用相对高度严格性的条件以形成杂合物。在用于部分膜为基底的杂合溶液中，添加有机溶剂(例如，甲酰胺)可使反应在较低的温度下发生。高度严格性条件是，例如，相对低盐及/或高温的条件。高度严格性是由约0.02M至约0.10M氯化钠，在约50℃至约70℃的温度所提供。高度严格性条件容许在两个序列的间有限数目的错配。为了达到较低严格性的条件，可以增加盐浓度及/或降低温度。中度严格性条件是在约0.1至0.25M氯化钠的盐浓度以及约37℃至约55℃的温度达成，而低度严格性条件则是在约0.15至约0.9M氯化钠的盐浓度以及范围从约20℃至约55℃的温度达成。对于杂合，成分及条件的选择是在此技艺中的人士所熟知的，并且可回顾Aubusel等人(1997，分子生物学的简短方法，John Wiley&Sons，纽约，单元2.8-2.11、3.18-3.19及4-64.9)。

在另一具体实例中，本发明是组合物，其包括至少一种Pam3Cys以及至少一种黄病毒蛋白质的至少一部分(例如，选自由西尼罗病毒蛋白质、登革病毒蛋白质、冷岳病毒蛋白质、昆津病毒蛋白质、墨累谷脑炎病毒蛋白质、日本脑炎病毒蛋白质、壁虱性脑炎病毒蛋白质、黄热病毒蛋白质以及C型肝炎病毒蛋白质所组成的组中的至少一员)。登革病毒蛋白质可以是选自由Den1病毒蛋白质、Den2病毒蛋白质、Den3病毒蛋白质以及Den4病毒蛋白质所组成的组中的至少一员。Pam3Cys及黄病毒蛋白质可以是融合蛋白质的成分。

本发明的另一具体实例是组合物，其包括至少一种Pam2Cys以及至少一种黄病毒蛋白质的至少一部分(例如，选自由西尼罗病毒蛋白质、登革病毒蛋白质、冷岳病毒蛋白质、昆津病毒蛋白质、墨累谷脑炎病毒蛋白质、日本脑炎病毒蛋白质、壁虱性脑炎病毒蛋白质、黄热病毒蛋白质以及C型肝炎病毒蛋白质所组成的组中的至少一员)。登革病毒蛋白质可以是选自由Den1病毒蛋白质、Den2病毒蛋白质、Den3病毒蛋白质以及Den4病毒蛋白质所组成的组中的至少一员。Pam2Cys及黄病毒蛋白质可以是融合蛋白质的成分。

在另一具体实例中，本发明是一种在个体中刺激免疫反应的方法，其包括将组合物给药至个体的步骤，该组合物包括本发明的组合物、融合蛋白质及多肽。

此处所使用的“刺激免疫反应”是指对于抗原或病毒蛋白质(例如，西尼罗病毒蛋白质、登革病毒蛋白质、冷岳病毒蛋白质、昆津病毒蛋白质、墨累谷脑炎病毒蛋白质、日本脑炎病毒蛋白质、壁虱性脑炎病毒蛋白质、黄热病毒蛋白质以及C型肝炎病毒蛋白质)的至少一部分产生抗体。在个体中刺激免疫反应可包括产生对抗原或病毒蛋白质具反应性的体液及/或细胞免疫反应。在个体中刺激免疫反应，可保护个体免受抗原或病毒感染或被抗原或病毒感染相关的症状，可减少或停止感染或症状，是在个体中刺激免疫反应的结果。

本发明用于在个体中刺激免疫反应的方法的组合物、融合蛋白质及多肽，可利用已完整建立的方法而评估在个体中刺激免疫反应的能力。测定本发明的组合物、融合蛋白质及多肽是否可在个体中刺激免疫反应的例示方法，包括通过适当的技术(例如，酶联免疫吸附分析法(ELISA))测量对抗原或病毒蛋白质有特异性的抗体(例如，IgG抗体)的产生；诱发二次感染的抗体依赖性增强作用(ADE)的能力；类-巨噬细胞分析；利用溶菌斑减少中和试验(PRNT₈₀)评估中和作用；在非人类模式中(例如，小鼠、兔、猴)产生血清抗体的能力(Putnak等人，Vaccine 23：4442-4452(2005))；利用非人类动物(例如，小鼠及猴)，在暴露至抗原(特别是病毒抗原)的挑战下可存活的能力。

此处所使用的“个体”，可以是哺乳动物，例如，灵长类动物或啮齿目动物(例如，大鼠、小鼠)。在一特定具体实例中，个体是人类。

在另一具体实例中，本发明是一种在个体中刺激免疫反应的方法，其包括将组合物给药至个体的步骤，该组合物包括至少一种病原体关联性分子模式的至少一部分以及至少一种病毒蛋白质的至少一部分，该病毒蛋白质选自由西尼罗病毒蛋白质、冷岳病毒蛋白质、昆津病毒蛋白质、墨累谷脑炎病毒蛋白质、日本脑炎病毒蛋白质、壁虱性脑炎病毒蛋白质以及黄热病毒蛋白质所组成的组中。

在另一具体实例中，本发明是一种在个体中刺激免疫反应的方法，其包括将组合物给药至个体的步骤，该组合物包括至少一种病原体关联性分子模式的至少一部分以及至少一种Den2包膜蛋白质的至少一部分，其中Den2包膜蛋白质选自由序列识别号22、序列识别号40以及序列识别号97所组成的组中。

在另一具体实例中，本发明是一种在个体中刺激免疫反应的方法，其包括将融合蛋白质给药至个体的步骤，该融合蛋白质包括至少一种病原体关联性分子模式的至少一部分以及至少一种病毒蛋白质的至少一部分，该病毒蛋白质选自由西尼罗病毒蛋白质、冷岳病毒蛋白质、昆津病毒蛋白质、墨累谷脑炎病毒蛋白质、日本脑炎病毒蛋白质、壁虱性脑炎病毒蛋白质以及黄热病毒蛋白质所组成的组中。

在另一具体实例中，本发明是一种在个体中刺激免疫反应的方法，其包括将组合物给药至个体的步骤，该组合物包括至少一种病原体关联性分子模式的至少一部分，以及选自由Den1病毒包膜蛋白质、Den2病毒包膜蛋白质、Den3病毒包膜蛋白质以及Den4病毒包膜蛋白质所组成的组中的至少一员的至少一部分。

在另一具体实例中，本发明是一种在个体中刺激免疫反应的方法，其包括将融合蛋白质给药至个体的步骤，该融合蛋白质包括选自由fljB/STF2、大肠杆菌fliC以及慕尼黑沙门氏杆菌fliC所组成的组中的至少一员的至少一部分，以及选自由Den1病毒包膜蛋白质(例如，KGMSYVMCTGSFKLEKEVAETQHGTVLVQVKYEGTDAPCKIPFSTQDEKGVTQNGRLITANPIVTDKEKPVNIEAEPPFGENYIVVGAGEKALKLSWFKK(序列识别号21及96))、Den2病毒包膜蛋白质(例如，序列识别号22、40及KGMSYSMCTGKFKVVKEIAETQHGTIVIRVQYEGDGSPCKTPFEIMDLEKRHVLGRLTTVNPIVTEKDSPVNIEAEPPFGDSYIIIGVEPGQLKLDWFKK(序列识别号97))、Den3病毒包膜蛋白质(例如，序列识别号23及KGMSYAMCLNTFVLKKEVSETQHGTILIKVEYKGEDAPCKIPFSTEDGQGKAHNGRLITANPVVTKKEEPVNIEAEPPFGESNIVIGIGDKALKINWYRK(序列识别号98))以及Den4病毒包膜蛋白质(例如，序列识别号24及KGMSYTMCSGKFSIDKEMAETQHGTTVVKVKYEGAGAPCKVPIEIRDVNKEKVVGRIISPTPFAENTNSVTNIELERPLDSYIVIGVGDSALTLHWFRK(序列识别号99))所组成的组中的至少一员的至少一部分。

在另一具体实例中，本发明是一种在个体中刺激免疫反应的方法，其包括将融合蛋白质给药至个体的步骤，该融合蛋白质包括至少一种病原体关联性分子模式的至少一部分，以及选自由Den1病毒包膜蛋白质、Den2病毒包膜蛋白质、Den3病毒包膜蛋白质以及Den4病毒包膜蛋白质所组成的组中的至少一员的至少一部分。

在另一具体实例中，本发明是一种在个体中刺激免疫反应的方法，其包括将组合物给药至个体的步骤，该组合物包括至少一种抗原的至少一部分以及至少一种鞭毛蛋白的至少一部分，其中至少一种鞭毛蛋白缺少铰链区域的至少一部分。

在另一具体实例中，本发明是一种在个体中刺激免疫反应的方法，其包括将融合蛋白质给药至个体的步骤，该融合蛋白质包括至少一种抗原的至少一部分以及至少一种鞭毛蛋白的至少一部分，其中至少一种鞭毛蛋白缺少铰链区域的至少一部分。

当提到本发明组合物、融合蛋白质或多肽的量时，“有效量”是指当给药至个体时，组合物、融合蛋白质或多肽的量或剂量，其为充分于治疗功效的量(例如，足以在个体中刺激免疫反应的量)。本发明的组合物、融合蛋白质或多肽可以单一剂量或多次剂量而给予。

本发明的方法可通过将本发明的组合物、融合蛋白质或多肽，以肠道或非肠胃道的方式给予而完成。特别地，给药途径是通过口服摄取(例如，饮料、锭剂、胶囊形式)或肌肉内注射组合物、融合蛋白质或多肽。其它的给药形式也为本发明所涵盖，包括静脉内、皮内、动脉内、腹膜内或皮下途径以及经鼻给药。也可使用栓剂或经皮贴片。

本发明的组合物、融合蛋白质或多肽可活体外地给药至个体的自体移植树状细胞。在将树状细胞暴露至本发明的组合物、融合蛋白质或多肽之后，可将树状细胞给药至个体。

本发明的组合物、融合蛋白质或多肽可单独给药或共同给药至患者。共同给药是指包括个别或组合地同时或依序给予本发明的组合物、融合蛋白质或多肽。当组合物、融合蛋白质或多肽个别地给予时，给药的模式可在彼此时间充分接近下进行(例如，给予组合物的时间接近给予融合蛋白质的时间)，使得在个体中刺激免疫反应的效果最大。也预期可使用多种给药途径(例如，肌肉内、口服、经皮)，以给予本发明的组合物及融合蛋白质。

本发明的组合物、融合蛋白质或多肽可单独给药或以与传统赋形剂的混合物给药，例如，适合于肠道或非肠胃道施用的医药上或生理上可接受的有机或无机载剂物质，其不会有害地与萃取物反应。适合的医药上可接受的载剂包括水、盐溶液(例如，林格氏溶液)、醇、油、明胶以及碳水化合物，例如，乳糖、淀粉糖或淀粉、脂肪酸酯、羟甲基纤维素以及聚乙烯基吡咯烷。这样的制备物可以是无菌的，以及如果需要的话，可与辅助作用剂混合，例如，润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、影响渗透压的盐类、缓冲剂、色剂及/或芳香物质等，其不会有害地与本发明的组合物、融合蛋白质或多肽反应。当需要时，制备物也可与其它活性物质组合，以减少代谢降解。本发明的组合物、融合蛋白质或多肽可通过口服给药(例如，饮料)、肌肉内或腹膜内注射而给药。单独的组合物、融合蛋白质或多肽，或当与混合物组合时，可以单一或在一段期间内以超过一个剂量而给予，以提供所要的效果(例如，减缓或预防病毒感染、减缓病毒感染的症状)。

当需要或想要非肠胃道施用时，特别适合用于组合物、融合蛋白质或多肽的混合物是可注射的无菌溶液，较佳是油性或水溶性溶液，以及悬浮液、乳液或植入物(包括栓剂)。特别地，用于非肠胃道给药的载剂包括葡萄糖水溶液、盐溶液、纯水、乙醇、甘油、丙二醇、花生油、芝麻油、聚氧乙烯-嵌段聚合物等等。安瓿是方便的单位剂量。也可将组合物、融合蛋白质或多肽纳入至微脂体，或经由经皮帮浦(pump)或贴片而给予。适合用于本发明的医药混合物是在此技艺中的人士所熟知的，并且是说明于，例如，制药科学(第17版，Mack出版公司，伊士顿，宾州)以及WO 96/05309，其教示特此以引用方式纳入本文中。

本发明的组合物、融合蛋白质及多肽可在载剂上给药至个体。此处所使用的“载剂”是指可将本发明的组合物、融合蛋白质及多肽呈现到个体的免疫系统以在个体中产生免疫反应的任何组合物。本发明组合物、融合蛋白质及多肽的呈现，较佳将包括暴露病毒蛋白质的抗原部分以产生抗体。本发明的组合物、融合蛋白质及多肽的成分(病原体关联性分子模式及病毒蛋白质)，彼此在载剂上是物理上紧密接近。本发明的组合物、融合蛋白质及多肽可通过共价或非共价的连结而附着至载剂。较佳地，载剂是生物可相容的。此处所使用的“生物可兼容的”是指载剂不会在个体中产生免疫反应(例如，产生抗体)。载剂可以是生物可降解的基质载剂，例如，聚合物珠或微脂体。载剂可进一步包括明矾或其它适合的佐剂。载剂可以是病毒(例如，腺病毒、痘病毒、阿伐病毒)、细菌(例如，沙门氏杆菌)或核酸(例如，质粒DNA)。

给药至个体的剂量及频率(单一或多次剂量)可根据各种因素而改变，包括先前暴露至抗原、病毒蛋白质；病毒感染的期间；病毒感染的先前治疗；组合物、融合蛋白质或多肽的给予途径；个体的大小、年龄、性别、健康、体重、体质指数及饮食；黄病毒暴露、黄病毒感染以及感染原因的特定黄病毒(例如，西尼罗黄病毒、登革黄病毒、冷岳黄病毒、昆津黄病毒、墨累谷脑炎黄病毒、日本脑炎黄病毒、壁虱性黄病毒、黄热黄病毒及C型肝炎黄病毒)的症状的特性及程度；同时发生的治疗种类；黄病毒暴露、黄病毒感染的并发症或其它与健康相关的问题。其它的治疗疗程或作用剂，可结合本发明的方法以及组合物、融合蛋白质或多肽而使用。例如，组合物、融合蛋白质或多肽的给药，可伴随其它的病毒治疗剂或作用剂的使用，以治疗黄病毒感染的症状(例如，高热、麻木、登革出血热、脑膜脑脊髓炎)。调整及运用已建立的剂量(例如，频率及期间)，是在熟悉于此技艺者的能力范围内。

本发明将通过以下的实施例而进一步说明，这些实施例并非要以任何方式限定本发明。

实施例

材料及方法

PCR扩增及DNA引物：

所有的PCR扩增都是利用得自Stratagene(拉荷拉，加州)的Pfu UltraHotstart PCR主要混合物(目录编号600630)，根据制造商的建议而进行。DNA引物是购自Sigma Genosys，并且说明如下：

STF28BGF-1：

CTCGGGAGATCTGCACAAGTAATCAACACTAACAGTCT(序列识别号：41)

STF28MCR-1：

CCATGGGCTAGCAGGATCCACCGGCGCTCCCTGCACGTTCA(序列识别号：42)

STF28MCF-2：

GGAGCGCCGGTGGATCCTGCTAGCCCATGGACCGAAAACCCG(序列识别号：43)

STF28ECR-2：

TCTGCAGAATTCACGTAACAGAGACAGCACGTTCTGCGGGACGTCCCGCAGAACGTGCTGTCTCTGTTACGTGAATTCTGCAGA(序列识别号：44)

pET24AR：5TCCGGCGTAGAGGATCGAGA(序列识别号：45)

STF2-E3R3：

CAATTGACCTTCAAGCTTCGAATTGCCCTTACGTAACAGAGACAGCACGTTCTG(序列识别号：46)

AX-E3F3：

AAGCTTGAAGGTCAATTGGAATTCCCTAGGACTAGTATGGAAAAATTGCAGTTGAAG(序列识别号：47)

pET24AF：GCTTAATGCGCCGCTACAGG(序列识别号：48)

5’WNE28：

GCGGCCGCTCATGGAAAAATTGCAGTTGAAGGGAACAACC(序列识别号：49)

3’WNE28：CCGCGGTTTGCCAATGCTGCTTCCAGACTTGT(序列识别号：50)

NdeI-STF2：

CCGGCATGCCATATGGCACAAGTAATCAACACTAACAGTCTGTCGCTGC(序列识别号：51)

BlpI-EdIII：

GCATGCTCAGCTTATTAAGGGTTTGCCAATGCTGCTTCCCAGACTTGTG(序列识别号：52)

JEEIIIprimer：TACGTGAATTCAGCAGATATCCAGCAC(序列识别号：53)

pET/STF2Δ.EIII的克隆：

鼠伤寒沙门氏杆菌fljb第2型的全长鞭毛蛋白(鞭毛蛋白第2型)(此处也称为“STF2”)是由1.5仟碱基对的基因所编码。STF2的截断变体(STF2Δ，序列识别号3，由序列识别号4所编码)是通过删除横跨序列识别号1的氨基酸170至415的高度可变异区域而产生。删除的区域是以短的弹性连接子而取代(GAPVDPASPW，序列识别号56)，其设计用于促进TLR5信号传递所需的氨基端及羧基端序列的交互作用。使用两步骤的聚合酶链锁反应(PCR)以产生这个构建。在第一个反应中，STF2.OVA((图61)序列识别号152编码图62的序列识别号153氨基酸序列)用作DNA模版，以及STF28BGF-1及STF28MCR-1使用作为引物对。在另一个反应中，相同的DNA模版与引物STF28MCF-2及STF28ECR-2结合。

PCR扩增反应分别产生约500碱基对及约270碱基对的片段。利用STF28BGF-1及STF28ECR-2作为引物，而将这些PCR产物结合在最后的PCR反应中。这个反应的增殖PCR产物(约0.77仟碱基对)是以BglII及EcoRI限制酶消化，并且黏接到pMTBiP/V5-His B(Invitrogen，卡司贝，加州)，其先前已以bGLII及EcoRI消化并以碱性磷酸酶处理。将黏接混合物的分装物用于转化TOP10细胞(InVitrogen，卡司贝，加州)。PCR筛选是利用载体特异性的引物pMTFOR(甲硫氨酸启动子)(CATCTCAGTGCAACTAAA，序列识别号156)及BGHREV(牛生长激素聚腺)(TAGAAGGCACAGTCGAGG，序列识别号157)而进行，以鉴定数种阳性克隆株。所有的阳性克隆株都进一步通过限制图谱而分析，并且通过DNA测序而证实。将所得的构建体pMT/STF2用于产生pMT/STF2Δ.EIII+。

pET/STF2Δ.EIII+(序列识别号70、71)的西尼罗病毒包膜蛋白质(图45及图46)的功能部位III，是衍生自果蝇(Drosophila)表达质粒pMT/STF2.E。这个质粒包含融合至西尼罗病毒包膜蛋白质(氨基酸1-406，序列识别号39，图45)的全长STF2(氨基酸1-506，序列识别号1)。pMT/STF2.E(序列识别号158)克隆株AX-1是使用作为DNA模版，以及5’WNE28(序列识别号49)及3’WNE28(序列识别号50)作为PCR扩增的引物。为了促进限制分析及后续的克隆步骤，使5’引物编码新颖的NotI位置(新英格兰生物实验室，贝弗利，麻州)并使3’引物包含独特的SacII位置。将增殖的EIII+DNA片段(345碱基对；序列识别号178，其编码序列识别号39的氨基酸292-406)次克隆到pCR-Blunt II-TOPO克隆载体内(InVitrogen，卡司贝，加州)，以产生质粒TOPOEIII。终止密码子是利用T4 DNA聚合酶使SacII及SpeI限制位置变成平头末端，而后续地导入至EIII+序列的下游。

为了产生pMT/STF2Δ.EIII+(序列识别号70、71)，将EIII+片段利用NotI及BamHI限制位置而从TOPOEIII+中分离出来，并且黏接至pMT/STF2Δ的NotI及SacII限制酶切位置。将EIII+DNA片段的BamHI位置及pMT/STF2Δ的SacII位置，在黏接之前以T4 DNA聚合酶变成平头末端。pMT/STF2Δ.EIII+的STF2Δ.EIII+序列(序列识别号70、71)，是利用引物NdeI-STF2及BlpI-EdIII，通过PCR扩增而分离。为了产生pET/STF2Δ.EIII+(序列识别号71)，将PCR产物以NdeI及BlpI消化，并且黏接至已以NdeI及BlpI预先消化的pET24a质粒内。将黏接混合物转化至Mach-1细胞内(InVitrogen，卡司贝，加州)，并且使细胞生长在补充50微克/毫升康那霉素的LB上。通过限制酶切图谱而筛选数个菌落，并以DNA测序而证明。

pET/STF2.EIII+的克隆：

pET/STF2.EIII+(序列识别号54、55)的西尼罗病毒EIII+序列是衍生自pETSTF2.E(序列识别号158、159)。这个大肠杆菌表达质粒包含融合至西尼罗病毒包膜蛋白质(序列识别号39的氨基酸292-406，其为序列识别号7)的全长STF2(氨基酸1-506)。在两个独立的PCR反应中，pET/STF2.E是使用作为DNA模版。一个反应使用引物pET24AR：5(序列识别号45)及STF2-E3R3：(序列识别号46)以及另一个使用AX-E3F3(序列识别号47)及pET24AF(序列识别号48)。这些PCR反应产生1.5仟碱基对的片段，其由全长的STF2及340碱基对的片段所组成，后者包括EIII功能部位加上延伸到包膜蛋白质的功能部位I的额外的氨基酸。结合这些PCR扩增反应的分装物，及两个产物作为使用外部引物pET24AR(序列识别号45)及pET24AF(序列识别号48)的PCR反应的模版。这导致产生约1.8仟碱基对的DNA片段，其将EIII+序列(序列识别号178，一种编码序列识别号39的氨基酸292-406的核酸序列，其为序列识别号7)融合至STF2。PCR产物是以NdeI及BlpI消化以及凝胶纯化，并且通过与pET24a载体(其先前已以兼容的酶消化以及去磷酸化)的兼容末端而黏接。将黏接混合物转化至如上述用于pET/STF2Δ.EIII+的Mach-1细胞内(InVitrogen，卡司贝，加州)。通过限制图谱而筛选数个菌落，并将两个克隆株通过DNA测序而证明。

pET/STF2Δ.JEIII的克隆：

目前用于日本脑炎病毒疫苗，由功能部位III所编码的日本脑炎病毒(JEV)(品系SA-14-14-2(Jai L.等人，Chin.Med.J.(英文)116：941-943(2003))包膜蛋白质的部分，是由DNA2公司(孟罗公园，加州)定制合成。利用围绕在插入物两侧的NotI及BlpI位置，而将功能部位III的部分从pJ2：LG01510中切下。将DNA插入物以凝胶分离，并且通过与pET24A/STF2.EIII+(序列识别号70、71，其先前已以适当的酶消化，以释放出西尼罗病毒EIII+的插入物)相容的末端而克隆。然后将经删除的载体以凝胶纯化，并且黏接至JE EIII+的分装物。将黏接混合物用于转化TOP-10细胞(Invitrogen，卡司贝，加州)，并且使细胞生长在补充50微克/毫升康那霉素的LB上。通过限制图谱而筛选数个菌落，并以DNA测序而证明。

所得的构建体pET24A/STF2.JEIII(序列识别号5、6)被转型入BLR(DE3)品系(Novagen)，以及在许多克隆株中的表达是利用考马斯蓝染色而监控，其通过利用抗-鞭毛蛋白抗体的西方墨渍分析而证实。利用pET24A/STF2.JEIII+作为DNA模版以及JE EIII+寡核苷酸作为引物(序列识别号53)，将STF2Δand JEIII+之间的连接子区域中的半胱氨酸残基，利用QuikChange点致突变试剂盒(kit)(Stratagene，拉荷拉，加州)，根据制造商的使用说明而换成丝氨酸残基。克隆株是通过测序而证实，并且以上述pET24A/STF2.JEIII+的说明而分析其表达。

当在连接子中的半胱氨酸残基换成丝氨酸残基时，在此所称的融合蛋白质也将“s”纳入至融合蛋白质的命名中。例如，“STF2Δ.EIII+”包括在连接子中的半胱氨酸残基(图29，序列识别号71)，而“STF2Δ.EIIIs+”则包括在连接子中的丝氨酸残基取代半胱氨酸残基(图30，序列识别号72)。

克隆融合至鞭毛蛋白羧基端(STF2Δ)的每个登革病毒的EIII功能部位：

一开始，从西尼罗病毒的完整包膜蛋白质的融合处获得生物活性的材料是困难的，可能是由于在包膜蛋白质中存在多个半胱氨酸残基(12个半胱氨酸)所致(参见序列识别号39，图45)。然而，当编码蛋白质的功能部位III(EIII)的区域被亚克隆时，融合蛋白质是大量表达在大肠杆菌中，并且在小鼠中是高度有功效的。虽然在四个不同登革病毒之间有整体的序列不相同性(Den1、Den2、Den3、Den4，序列识别号160-167，图67-74)，但在黄病毒之间，包膜蛋白质的功能部位III内的三维结构是相似的。在DEN及其它黄病毒中的这个功能部位，编码大部分种类特异型连续性关键/显性的中和抗原决定部位。登革病毒(Den1、Den2、Den3及Den4)的功能部位III已在细菌中表达，并且显示是免疫原性的，可在实验动物中诱发中和抗体(Simmons M.等人，Am.J.Trop.Med.Hyg.65：159(2001))。对应于四种不同登革病毒的残基约295至约399(正确的编码取决于，例如，序列识别号160、162、164、166的特定登革病毒)的功能部位III，已被密码子最适化以在大肠杆菌中表达。合成的基因是利用PCR而扩增，并且次克隆到载体pET/STF2Δ的NotI位置，产生pET/STF2Δ.DEN1EIII、pET/STF2Δ.DEN2EIII、pET/STF2Δ.DEN3EIII及pET/STF2Δ.DEN4EIII(序列识别号80、82、84及86)。

STF2.EIII+、STF2Δ.EIII+、STF2Δ.EIIIs+及STF2Δ.JEIII+的大肠杆 菌生产：

使含有pETSTF2.EIII+(序列识别号54、55)、pETSTF2Δ.EIII+(序列识别号70、71)、pETSTF2Δ.EIIIs+(序列识别号72、73)或pETSTF2Δ.JEIII+(序列识别号5、6)的BLR(DE3)pLysS的细胞培养物(6公升)，生长于包含15微克/毫升康那霉素、12.5微克/毫升四环霉素及24微克/毫升氯霉素的LB培养液中。在OD₆₀₀约0.6时，蛋白质的表达是以1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在约37℃诱发约3小时。在诱发之后，将细胞通过离心而回收(7000转/分钟×7分钟，于Sorvall RC5C离心机中)，并且再次悬浮于2×磷酸盐缓冲溶液、1％甘油、DNA酶、1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)、蛋白酶抑制剂混合物以及1毫克/毫升溶菌酶。使悬浮液通过微量流化仪以溶解细胞，并将溶胞产物离心(45,000g共1小时，于Beckman Optima L超离心机中)以分离可溶性流份及包涵体。在这些生长及诱发条件下，STF2.EIII+是表达为可溶性蛋白质，以及pETSTF2Δ.EIII+(序列识别号70、71)、pETSTF2Δ.EIIIs+(序列识别号72、73)及pETSTF2Δ.JEIII+(序列识别号5、6)形成包涵体。

STF2.EIII+的纯化：

将包含可溶性STF2.EIII+(序列识别号54、55)的溶胞产物加到含有0.5M氯化钠的琼脂糖(Sepharose)Q树脂(Amersham生物科学，匹盖特威，纽泽西)，以减少DNA、内毒素及其它污染物。收集未结合的流通液(flow-through)流份，并且通过以缓冲液A(缓冲液A：100mM三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸盐，pH8.0)的10倍稀释而调整导电度。将稀释的材料再次装载到Q琼脂糖上，并将结合的蛋白质以20％至60％缓冲液B(缓冲液A：100mM三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸盐，1M氯化钠，pH8.0)的线性梯度而洗脱。将包含STF2.EIII+的流份集合在一起，并且进一步通过Superdex-200凝胶(SD200)过滤层析，在脱氧胆酸钠的存在下处理，以移除残留的内毒素(流动缓冲液：1％脱氧胆酸钠，100mM氯化钠，100mM三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸盐，1％甘油，pH8.0)。在SD200层析之后，将洗脱出的蛋白质直接装载到Q琼脂糖，并以缓冲液A广泛清洗，以除去清洁剂。将结合的蛋白质再次以20％至60％缓冲液B的线性梯度而洗脱。在一种制备物中(批次057)，这个步骤是以利用Extract-D清洁剂移除凝胶(Pierce生物科技，洛克福特，伊利诺伊州)的清洁剂除去程序代替。将纯化的蛋白质以对抗含有50mM三(羟甲基)氨基甲烷、100mM氯化钠及1％甘油的缓冲液而透析，并且储存在-80℃。

STF2Δ.EIII+的纯化：

STF2Δ.EIII+包涵体是通过低速离心而收集(7000转/分钟×7分钟，于Sorvall RC5C离心机中)，并且以包含8M尿素、100mM三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸盐、5mM乙二胺四乙酸(pH8.0)的缓冲液而溶解。将溶解的蛋白质的尿素浓度调整至1M，并将样品装载到Q琼脂糖上。将结合的蛋白质利用0％至100％缓冲液B(缓冲液A：100mM三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸盐，5mM乙二胺四乙酸，1M尿素，pH8.0。缓冲液B：100mM三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸盐，5mM乙二胺四乙酸，1M氯化钠，1M尿素，pH8.0)的线性梯度而洗脱。由于在洗脱后蛋白质凝集物的形成，因此将Q琼脂糖材料的尿素浓度调整至8M。将蛋白质进一步利用SD200，以凝胶过滤层析而纯化。将管柱以100mM三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸盐，pH8.0，100mM氯化钠，1％甘油，8M尿素加上1％脱氧胆酸钠而预先平衡。将洗脱出的蛋白质利用Source Q进行第二次IEX层析步骤，以移除1％脱氧胆酸钠。将结合的蛋白质利用20％至60％缓冲液B的线性梯度而洗脱(缓冲液A：100mM三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸盐，pH8.0，8M尿素，5mM乙二胺四乙酸。缓冲液B：100mM三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸盐，pH8.0，5mM乙二胺四乙酸，8M尿素，1M氯化钠)。蛋白质的最终精炼是利用SD200，通过凝胶过滤层析而完成(流动缓冲液：100mM三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸盐，pH8.0，8M尿素，100mM氯化钠及1％甘油)。将还原剂加入SD200流份中(2.5mM DTT)，并使蛋白质通过对抗减少浓度的尿素的逐步透析而再次折叠。将尿素浓度以对抗包含100mM三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸盐，pH8.0，100mM氯化钠，1％由及6M、4M、2M或无尿素的缓冲液而依序减少。

STF2Δ.EIII+三聚体的再次折叠及纯化：

使得自尿素溶解的包涵体中的STF2Δ.EIII+(序列识别号70、71)，通过上述的简单透析而有效地再次折叠，以形成三聚体产物。三聚体(三个STF2Δ.EIII融合蛋白质)是根据在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中分子量而推论。在透析之后，内毒素是通过以Triton X-114的多次萃取而移除。将三聚体通过S200大小区别层析，而从单体及凝集物中纯化及分离。在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳上，最终的产物移动成为单一条带，具有明显约130仟道尔顿的分子量。

STF2Δ.EIII+单体的再次折叠及纯化：

STF2Δ.EIII+(序列识别号70、71)的单体形式是利用快速稀释，通过再次折叠而一贯地及有效地制造，其可避免个别的STF2Δ.EIII+融合蛋白质彼此交互作用以形成多聚体，例如，三聚体(上述)。将来自包涵体并溶解于4M的STF2Δ.EIII+，在无还原剂的情况下增加到8M尿素。接着将蛋白质快速稀释于三(羟甲基)氨基甲烷/氯化钠/甘油缓冲液(pH8.0)至约0.1毫克/毫升，以及至在室温中0.1M的最终尿素浓度。单体是通过S200大小区别层析，而从凝集物中进一步纯化及分离。在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳上，最终的产物移动成为单一条带，具有明显约43仟道尔顿的分子量。

STF2Δ.EIIIs+(丝氨酸取代STF2Δ及EIII+间的连接子，序列识别号72) 的纯化：

来自溶解的包涵体的STF2Δ.EIIIs+(序列识别号72、73)，利用类似用于再次折叠STF2Δ.EIII+单体的快速稀释方法再次折叠。再次折叠的蛋白质是在丁基琼脂糖管柱被捉住并且洗脱，同时移除大部分的内毒素污染。将丁基琼脂糖纯化作用中的洗脱液浓缩，并且使其经过四次循环的Triton X-114萃取，以在SD200凝胶过滤的最终纯化步骤之前，减少内毒素的水平低至约小于0.1内毒素单位/微克。在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳上，最终收集的产物移动成为单一条带，具有明显约43仟道尔顿的分子量，并且包含微量的Triton X-114(约0.000015％)。

STF2Δ.JEIII+(序列识别号5、6)的纯化：

将蛋白质在变性条件下从包涵体中分离。包涵体是以清洁剂清洗(0.5％Triton X 100)，并且溶解于8M尿素中，导致标的蛋白质的部分纯化。对于内毒素的移除，将蛋白质加到在低pH(约3.5)的Source S阳离子交换管柱上，并以盐梯度洗脱(0至约1M氯化钠)。利用如STF2Δ.EIII+单体所说明的快速稀释，而使蛋白质再次折叠。接着将蛋白质浓缩并利用SD200而进一步纯化，以从凝集物中分离蛋白质的单体形式。在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳上，纯化的物质移动，具有明显约43仟道尔顿的分子量，并且包含可接受水平的内毒素(约0.03内毒素单位/微克)。

融合蛋白质的馈料批次生产：

STF2Δ.EIIIs+是在有氧的生物反应器中，利用馈料批次方法而生产。置入三种控制圈环以通过添加酸(2N盐酸)或碱(3N NH₄OH)而控制pH；通过加热(加热层)或冷却(定时循环的冷却圈环)而控制温度；以及通过于联级中压缩空气流动(手动控制)、搅动(混合速度)以及氧气流动(定时循环)而溶解氧气。使含有STF2Δ.EIIIs+的细胞[BLR(DE3)pLysS]适应于MRSF培养液并在MRSF培养液堆积(参见后述)，并且冷冻于25％甘油中。通过将1毫升堆积的细胞加到1公升MRSF培养液，并在约37℃搅动约15.5至约16.5小时，而使细胞的规模放大以用于生物反应器。将来自规模放大步骤的细胞，在约37℃及约0.5vvm空气流动中，以约1∶10比例加到MRSF或MRBR合成培养液中。

这个步骤是于批次模式中在约37℃时进行，直到细胞氧气消耗使得压缩的空气流动是约1.5vvm以及搅动是在最大(约6小时)为止，当温度降至约25℃及约33℃之间时。馈料可以在培养物被诱发之前开始，或在达到约1及约1/2小时之后开始。馈料速率可以保持固定，或根据步骤的可变因素而调整(溶解的氧气、葡萄糖浓度)。培养物是在批次葡萄糖耗尽后，以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)而诱发。使培养物维持最少约2小时，以及最多约20小时。

MRBR培养液                      微量金属溶液1000×

组成成分      公克/公升      组成成分       公克/公升

葡萄糖          20         乙二胺四乙酸二      5

                                 钠

KH₂PO₄          2.2         FeSO₄(7H₂O)        10

(NH₄)₂SO₄        4.5         ZnSO₄(7H₂O)        2

柠檬酸          1.0         MnSO₄(H₂O)         2

MgSO₄(7H₂0)     1.0         CoCl₂(6H₂O)        0.2

CaCl₂           0.04        CuSO₄(5H₂O)        0.1

微量金属        1毫升       Na₂MoO₄(2H₂O)      0.2

硫胺素盐酸      0.01        H₃BO₃              0.1

消泡剂           0.05

    MRSF培养液                     馈料培养液

组成成分    公克/公升         组成成分    公克/公升

 葡萄糖    10(20于生物反应器中)  NaCl        0.5

 KH₂PO₄        7.8             FeSO₄(7H₂O)   2

(NH₄)₂SO₄      2.33              CaCl₂       3.5

 柠檬酸        1.0              MgSO₄(7H₂O)  12

MgSO₄(7H₂0)    1.0             硫胺素盐酸    1

 CaCl₂         0.04             微量金属     1毫升

微量金属       1毫升             葡萄糖      100

硫胺素盐酸     0.01

康那霉素       0.0075(仅摇晃锥形瓶)

STF2Δ.EIIIs+是以包涵体的形式生产。在回收之后，将细胞从条件培养液中通过离心而分离(Beckman Avanti J-20 XP，JLA 8.1000转子，10,000×g，在约4℃共离心约20分钟)，并且再悬浮于等体积的50mM三(羟甲基)氨基甲烷，100mM氯化钠，1mM乙二胺四乙酸(pH8.0)。在相同条件下重复离心，而细胞再悬浮于最小体积的相同缓冲液中。使悬浮液在大于10,000psi的压力下通过均质器(APV-1000)，至少操作两次。

可通过三种方法之一将固体分离并将STF2/Δ.EIIIs溶解：离心、过滤或流化床层析。

方法1：

固体是通过离心而分离(Beckman Avanti J-20XP，JA20转子，20,000×g，在约4℃共离心约20分钟)，并且再悬浮于等体积的50mM三(羟甲基)氨基甲烷，1M氯化钠，1mM乙二胺四乙酸，1％甘油，0.5％Triton X-100(pH8.0)。以增加的速度及时间(最大约40,000×g，共约20分钟)，将这个方法重复达6次(总共)。在最终的沉淀物回收之后，将沉淀物再悬浮于50mM三(羟甲基)氨基甲烷，0.1M氯化钠，1mM乙二胺四乙酸(pH8.0)，并且通过离心使澄清(Beckman Avanti J-20 XP，JA 20转子，40,000×g，在约4℃共离心约20分钟)。将沉淀物再悬浮并且溶解在50mM三(羟甲基)氨基甲烷，0.1M氯化钠，1mM乙二胺四乙酸，4M尿素(pH8.0)。将不溶物通过离心移除BeckmanAvanti J-20 XP，JA 20转子，40,000×g，在约4℃共离心约50分钟)，保留上清液以用于进一步处理。

在上述多次清洗之后，STF2Δ.EIIIs也可溶解于50mM醋酸，10mM氯化钠，8M尿素(pH约4.1至约5.3)，并且通过离心使澄清(Beckman AvantiJ-20 XP，JA 20转子，20,000×g，在约4℃共离心约20分钟)。

方法2：

在均质化之后，溶胞产物是在主体馈料(body feed)中被捉住，并以包含尿素的缓冲液萃取STF2Δ.EIIIs+。主体馈料是一种过滤器辅助器，设计用于捕捉在深层过滤器(depth filter)上的块状物中的颗粒。主体馈料(先进公司CelPure 65)是一种硅藻土(二氧化硅粉末)，具有高表面积以及低通透性，以保留小于0.2微米的颗粒。将过滤器辅助器与溶胞产物预先混合，并且抽到深层过滤器上(Ertel 703)，以增进包含主体馈料及溶胞产物颗粒的块状物的建立。当颗粒沉淀在过滤器垫上时，悬浮液产生了深层过滤器。进行50mM三(羟甲基)氨基甲烷，100mM氯化钠(pH8.0)的清洗，以移除可溶性蛋白质及核酸。后续以50mM三(羟甲基)氨基甲烷，100mM氯化钠，4M尿素(pH8)的清洗，从主体馈料溶解并移出STF2Δ.EIIIs，以用于进一步处理。

方法3：

在细胞一开始再悬浮于缓冲液之后，将它们再悬浮于包含氯化钠及尿素的缓冲液中(pH约6至约8)，并且均质化。将溶胞产物加到流线型CST流化床管柱(GE保健公司)，其中STF2Δ.EIIIs+结合至树脂，并且微粒状物质未结合地流过。STF2Δ.EIIIs+可在低盐条件下，在高于装载pH的pH时，于清洁剂(例如，Triton X-100或聚山梨酸80)存在或不存在的情况下洗脱。

十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳：

将蛋白质(通常约5微克)稀释于含有及不含β-巯基乙醇的SDS-PAGE样品缓冲液中。将样品煮沸5分钟，并且装载到4-20％的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上。在电泳之后，将凝胶以考马斯蓝染色，以使蛋白质条带显现。

内毒素分析：

内毒素的水平是利用QCL-1000定量色原LAL试验试剂盒(BioWhittaker编号50-648U，沃克维尔，马里兰州)，根据制造商用于微量盘方法的使用说明而测量。

蛋白质分析：

蛋白质浓度是以96槽孔的形式，利用MicroBCA蛋白质分析试剂盒，以牛血清白蛋白作为标准品而测定(Pierce生物科技，洛克福特，伊利诺伊州)。

TLR5生物活性分析：

HEK293细胞(ATCC，目录编号CRL-1573，马那萨斯，维吉尼亚州)组成性地表达TLR5，并且对TLR5信号传递反应而分泌许多可溶性因子，包括IL-8。将细胞接种于96槽孔微量培养盘中(约50,000个细胞/槽孔)、加入融合蛋白质并且培养隔夜。次日，收集条件培养液，转移到干净的96槽孔微量培养盘中，并且冷冻在-20℃。在解冻之后，于三明治型的酶联免疫吸附分析中，利用抗-人类IL-8配对的抗体对(Pierce，编号M801E及编号M802B，洛克福特，伊利诺伊州)，根据制造商的使用说明，而分析条件培养液是否存在IL-8。光学密度是利用微量盘分光光度计而测量(FARCyte，Amersham生物科学，匹盖特威，纽泽西)。

溶菌斑减少中和试验(PRNT)：

溶菌斑减少中和试验是根据Wang等人，J.Immunol.167：5273-5277(2001)而进行。简言之，血清样品通过培养在56℃的水浴约30分钟而加热失活，并且在含有5％明胶的磷酸盐缓冲溶液中，从1/10至1/2560连续稀释。将西尼罗病毒稀释于含有5％明胶的磷酸盐缓冲溶液中，使得最终的浓度是约100溶菌斑形成单位/槽孔。在96槽孔盘中，将病毒与约75微升的血清，在约37℃混合约1小时。将血清-病毒混合物的分装物，于6槽孔组织培养盘中，培养在汇合单层的Vero细胞上。将细胞在约37℃下培养约1小时，并且每15分钟摇晃培养盘。接着加入琼脂糖覆盖物。覆盖物是通过将100毫升2×MEM(Life科技)所组成的溶液，与无菌的2％琼脂糖等体积混合而制备。在加入覆盖物之前，将两个溶液都置于40℃的水浴达1小时。将细胞在湿润的5％二氧化碳-空气混合物中，于37℃培养4天。在第5天，加入含有另外4％中性红的第二覆盖物。约12小时之后计数病毒溶菌斑。

STF2Δ-融合蛋白质的抗原性：

将酶联免疫吸附分析盘(96槽孔)以纯化的STF2Δ-融合蛋白质(序列识别号158、159、54、55、70、71)于磷酸盐缓冲溶液(约2微克/毫升)中的连续稀释物(100微升/槽孔)，于4℃覆盖隔夜。将培养盘以200微升/槽孔的分析稀释缓冲液(ADB；BD Pharmingen)，于室温中阻断1小时。将培养盘于PBS-Tween中清洗三次，然后以对鞭毛蛋白或构建体的E功能部位反应的抗体而培养。鞭毛蛋白的表达是利用单株抗体6H11(Intotek)而侦测，而WNV-E的抗原性则是利用一组单株抗体(5C5、7H2、5H10、3A3及3D9)而监测(BeasleyD.W.等人，J.Virol.76：13097-13100(2002))，其购自Bioreliance(洛得洛克斐力，马里兰州)。稀释于ADB的抗体(约100微升/槽孔)是于4℃培养隔夜。将培养盘以PBS-T清洗三次。加入稀释于ADB的辣根过氧化酶-标示的山羊抗-鼠IgG抗体(Jackson免疫化学，西园，宾州)(100微升/槽孔)，并将培养盘于室温中培养1小时。将培养盘以PBS-T清洗三次。在加入TMB(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺)超底物(Pierce生物科技，洛克福特，伊利诺伊州)并且监测颜色发展之后，在Tecan Farcyte微量分光光度计上测量O.D.₄₅₀。

致免疫小鼠：

将C3H/HeN小鼠(每组10只)以指定浓度的融合蛋白质或合成肽，于第0、14及28天以腹膜内或皮下进行致免疫。在第21及35天，将被致免疫的动物通过眼眶后穿刺而抽血。血清是通过无肝素血液样品的凝集及离心而收集。在第35天，将小鼠以致死剂量的西尼罗病毒品系2741而激发(Wang T.等人，J.Immunol.167：5273-5277(2001))。监测激发后21天的存活率。

血清抗体测定：

西尼罗包膜蛋白质特异性的IgG水平，是通过酶联免疫吸附分析而测定。将ELISA盘(96槽孔)以100微升/槽孔的西尼罗包膜糖蛋白质单株抗体5C5、7H2、5H10、3A3及3D9(Beasley D.W.等人，J.Viro.76：13097-13100(2002))(Bioreliance，洛得洛克斐力，马里兰州)，于磷酸盐缓冲溶液中，以2微克/毫升的浓度，在约4℃覆盖隔夜。将培养盘以200微升/槽孔的分析稀释缓冲液(ADB；BD Pharmingen，圣地亚哥，加州)，于室温中阻断1小时。将培养盘于PBS-T中清洗三次。加入在ADB中的血清稀释物(100微升/槽孔)，并将培养盘于4℃培养隔夜。将培养盘以PBS-T清洗三次。加入稀释于ADB的辣根过氧化酶-标示的山羊抗-鼠IgG抗体(Jackson免疫化学，西园，宾州)(100微升/槽孔)，并将培养盘于室温中培养1小时。将培养盘以PBS-T清洗三次。在加入TMB(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺)超底物(Pierce生物科技，洛克福特，伊利诺伊州)并且监测颜色发展之后，在Tecan Farcyte微量分光光度计上测量O.D.₄₅₀。

Pam3Cys.WNV001肽合成的制造

Pam3Cys.WNV001是由Bachem生物科学公司(普鲁士王市，宾州)而合成。WNV001是西尼罗病毒包膜蛋白质的20个氨基酸的肽(序列识别号168)，其经由肽的氨基端的丝氨酸残基而化学偶联至三-棕榈酰半胱氨酸(Pam3Cys)的分子部分。Pam3Cys.WNV001的化学名称是[棕榈酰-半胱氨酸((RS)-2，3-二(棕榈酰氧基)-丙基)-LTSGHLKCRVKMEKLQLKGT(序列识别号168)醋酸盐]。Pam3Cys.WNV001的分子量是3163.3道尔顿。肽是由Bachem公司利用固相合成方法及FMOC化学而合成。Pam3Cys.WNV001的氨基酸序列是通过固相肽合成，而集合在H-Pro-2-氯三苯甲基氯树脂上。肽链是通过氨基酸衍生物的连续偶联而延伸。每个偶联步骤都是通过Fmoc-去保护步骤并伴随重复清洗树脂而进行。在偶联最后一个氨基酸衍生物后，进行最后的去保护步骤。最后，清洗肽树脂并且在减压下干燥。在固相肽合成期间，对每个步骤进行颜色指示剂测试，以监控Fmoc-切割的完成以及氨基酸衍生物的后续偶联。为了将Pam3Cys-OH偶联至延伸的肽，将脂质分子部分以N，N’-二环己基-碳化二亚胺(DCCI)在1-羟基苯并三唑(HOBt)的存在下预先活化。将所得的溶液过滤，并且加到肽树脂中。在反应时间终结时，清洗肽树脂并且在减压下干燥。进行颜色指示剂测试，以控制Pam3Cys-OH的偶联。通过与三氟醋酸(TFA)培养，而将完成的肽从树脂中切割。将释出的产物(粗肽物质)从反应混合物中沉淀，并且冷冻干燥。将粗产物用于一开始的免疫原性研究。

WNV-E肽阵列的合成：

肽阵列(图57及图60)由Sigma Genosys公司(伍德兰，德州)而合成。

结果：

西尼罗融合蛋白质：

在近几年，西尼罗病毒(WNV)已在欧洲及北美的温带区域中出现，呈现对于大众及动物健康的威胁。西尼罗病毒感染的最严重形式是在人类及马中的致死性脑炎(脑部发炎)，以及在特定驯养及野生鸟类中的死亡率。在美国，西尼罗病毒也已经是人类疾病的主因。西尼罗病毒的包膜糖蛋白(WNV-E)以及其它黄病毒的包膜糖蛋白，可产生中和及保护性抗体。通过将这个抗原连接到类-Toll受体配体，此处所说明的组合物、融合蛋白质及多肽，可标定适合的抗原呈现细胞，而不需要佐剂或其它免疫调节剂调配物。

如此处的说明，许多的策略已被执行，以促进西尼罗病毒包膜(WNV-E)融合蛋白质在大肠杆菌中的制造。一种方法是通过将功能部位III(EIII)，以及视需要地西尼罗病毒包膜蛋白质的功能部位II的氨基酸，融合至全长的STF2(例如，STF2.E、STF2.EIII+)，而工程化较小的西尼罗病毒包膜蛋白质抗原。功能部位III是对病毒-宿主的交互作用而反应，并且保留许多西尼罗病毒中和抗体的抗原决定部位。它仅包含存在于全长的包膜蛋白质内的12个半胱氨酸残基中的2个，使得在大肠杆菌中的表达是更可行的。第二种方法已删除鞭毛蛋白的高度可变异铰链区域(例如，STF2Δ)，藉此产生较小的融合蛋白质(STF2Δ.EIII+)。鞭毛蛋白的高度可变异区域对于TLR5的信号传递并不是必要的，以及其移除也可减少鞭毛蛋白的免疫原可能性。STF2.EIII+及STF2Δ.EIII+两者都已在大肠杆菌中表达并且纯化。纯化的蛋白质已在生物分析中对于TLR5的信号传递活性定性，并且已在ELISA分析中，利用一组西尼罗病毒包膜蛋白质多株抗体及中和单株抗体，对于E抗原决定部位定性。这些研究的结果显示，STF2Δ.EIII+具有比STF2.EIII+更高的病原体关联性分子模式活性，以及更构形敏感性的中和西尼罗病毒包膜蛋白质抗原决定部位。

STF2.EIII+及STF2Δ.EIII+的纯度：

许多批次的STF2.EIII+及STF2Δ.EIII+已在大肠杆菌中制造并且纯化(表1)。STF2.EIII+被表达为可溶性的蛋白质，并且是在非变性的条件下，利用上述四个步骤而纯化，其包括阴离子交换层析以及凝胶过滤。6公升培养物的最终产量，范围从约0.9毫克至约3.8毫克，以及所有的制备物都包含低水平的内毒素，通过标准的LAL方法测量(约小于0.1内毒素单位/微克蛋白质，参见上述)。相反地，STF2Δ.EIII+在大肠杆菌中形成包涵体，并且是在变性条件下纯化。所有用于纯化STF2Δ.EIII+的层析步骤都需要使用8M尿素。在纯化之后，通过逐步的透析而使变性的蛋白质再次折叠，以逐渐地移除尿素。再次折叠通常是在约0.3毫克/毫升的蛋白质浓度时进行，而不会有因蛋白质沉淀所造成的任何损失。从单一6公升培养物所得的两个STF2Δ.EIII+制备物，产生约1.2及约6.7毫克的蛋白质，两者都具有可接受的内毒素水平。如同预期的，在还原条件下的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳，纯化的STF2.EIII+及STF2Δ.EIII+分别移动成为约65仟道尔顿及约43仟道尔顿的蛋白质。特别明显地，STF2Δ.EIII+在非还原条件下移动稍微较快。这个改变的移动可能是由于在包膜蛋白质的功能部位III中涉及两个半胱氨酸的双硫键形成所致。同时，较大种类的STF2Δ.EIII+是通过西方墨渍分析而侦测，其分子量是与蛋白质的三聚体形式一致(“(STF2Δ.EIII+)×3或三个单位的STF2Δ.EIII+”)。

表1：STF2.EIII+(序列识别号55)及STF2Δ.EIII+(序列识别号71)融合蛋白质的内毒素水平及TLR-5活性：

批次编号	蛋白质	产量(毫克)	内毒素水平(内毒素单位/微克)	TLR-5 EC50
					052	STF2.EIII+	3.8	0.03	＞5000.00ng/ml
054	STF2.EIII+	0.9	0.02	1195.00ng/ml
					057	STF2.EIII+	1.6	0.07	197.92ng/ml
044	STF2Δ.EIII+	1.2	0.07	1.13ng/ml
					045	STF2Δ.EIII+	6.7	0.07	4.34ng/ml

在HEK293IL-8分析中的TLR5活性：

进行TLR5生物分析以比较两种融合蛋白质的病原体关联性分子模式活性。将HEK293IL-8细胞以两种独立的蛋白质批次的连续稀释物处理(图47A及图47B)。将培养物培养24小时的期间，回收条件培养液，并且通过酶联免疫吸附分析法而分析IL-8的生产。如图47A所示，STF2Δ.EIII+显示有效的TLR-5活性。滴定曲线的回归分析，测定批次2004-044及2004-045的EC₅₀分别是1.13奈克/毫升以及4.34奈克/毫升(表1，上述)。在两个例子中，TLR5的比活性是比对照组蛋白质STF2.OVA高至少约10倍。相反地，STF2.EIII+的两个制备物则显示比STF2.OVA明显较弱TLR5活性。STF2.EIII+批次054及057的EC₅₀是约1195.00奈克/毫升以及约197.92奈克/毫升。

STF2.EIII+及STF2Δ.EIII+的抗原性：

STF2.EIII+及STF2Δ.EIII+的抗原性是利用对STF2的氨基端区域具有特异性的鞭毛蛋白单株抗体(6H11，Inotek制药公司，贝弗利，麻州)以及一组先前显示可在活体外中和西尼罗病毒的WNV-E特异性抗体(5C5、5H10、3A3、7H2及3D9，Bioreliance，洛得洛克斐力，马里兰州)，通过直接型酶联免疫吸附分析法而检验。如图48所示，全长的西尼罗病毒包膜蛋白质与STF2Δ.EIII+的反应性的比较，显示出西尼罗病毒单株抗体5C5、5H10、3A3及7H2，但非3D9，可辨认融合蛋白质。这个反应性的模式是与在EIII内的所提出的5C5、5H10、3A3及7H2抗原决定部位的位置一致。3D9的抗原决定部位位于西尼罗病毒包膜蛋白质的功能部位III的外侧。如同预期的，所有的西尼罗病毒单株抗体都与全长的西尼罗病毒包膜蛋白质反应，以及鞭毛蛋白单株抗体仅与STF2Δ.EIII+反应。两种蛋白质都与多株的西尼罗病毒包膜抗血清反应，但STF2Δ.EIII+的反应性是稍微减少，可能是由于存在于较小的功能部位的减少数目的有效抗原决定部位所致。

利用5C5及7H10西尼罗病毒单株抗体，直接的抗原性比较是在STF2.EIII+及STF2Δ.EIII+之间进行(图49A、图49B、图49C及图49D)。在这些研究中，将培养盘以指定的蛋白质覆盖，然后以多株兔抗-包膜蛋白质或上述的小鼠单株抗体而侦测。如图49A、图49B、图49C及图49D所示，STF2.EIII+及STF2Δ.EIII+都易于被鞭毛蛋白单株抗体侦测，反应性并没有显著的差异。然而，却观察到与抗-包膜蛋白质单株抗体的不同反应性。STF2Δ.EIII+与5C5或7H2的反应性，是明显大于与STF2.EIII+所观察到的反应性。整体而言，这些结果显示STF2Δ.EIII+的鞭毛蛋白6H11抗原决定部位是不妥协的，并且可比得上STF2.EIII+的鞭毛蛋白序列。它们也凸显在这些蛋白质的EIII功能部位的抗原性的明显差异，并且显示STF2Δ.EIII+比STF2.EIII+包含更多关键构形依赖性的中和抗原决定部位。

功效及免疫原性：

许多设计用于检验在以西尼罗病毒激发后的C3H/HeN小鼠中候选物的保护功效的功效研究已经完成。研究通常包含五组小鼠(每组十只小鼠)，在第0、14及28天腹膜内(i.p.)或皮下(s.c)进行致免疫。在第21及35天，收集血清，并且测试西尼罗病毒包膜蛋白质-IgG抗体(酶联免疫吸附分析)，以及可在活体外中和西尼罗病毒的能力(溶菌斑减少中和试验分析)。在第35天，将小鼠以致死剂量的西尼罗病毒品系2741而激发。监测激发后21天的存活率。

将小鼠以磷酸盐缓冲溶液、包含STF2.E的果蝇条件培养液(CM，阳性对照组)、25微克的STF2Δ.EIII+(腹膜内)、25微克的STF2Δ.EIII+(皮下)、25微克的STF2.EIII+(腹膜内)及25微克的STF2.EIII+(皮下)而进行致免疫。西尼罗病毒包膜蛋白质抗体反应以及存活率的数据，是显示在图50及图51。在第35天之前，接受STF2Δ.EIII+的所有组别都具有明显的西尼罗病毒包膜蛋白质IgG水平。相反地，接受STF2.EIII+的小鼠则不具有可测量的西尼罗病毒包膜蛋白质抗体反应。腹膜内或皮下给予STF2Δ.EIII+，在西尼罗病毒激发之后导致100％的存活率。与STF2.EIII+的不良免疫原性一致的是，相较于磷酸盐缓冲溶液对照组，这个候选物几乎没有或没有提供保护作用。在这个研究中，STF2.EIII+的不良免疫原性及功效，是归因于这个蛋白质减少的TLR5活性及/或弱的EIII抗原决定部位反应性。

溶菌斑减少中和效价：

进行溶菌斑减少中和试验(PRNT)以进一步评估由STF2Δ.EIII+所诱发的西尼罗病毒包膜蛋白质抗体反应，以及保护功效与中和抗体效价的潜在关连。在第35天，将上述功效研究中的血清样品，用于测试它们可在培养的Vero细胞中阻断西尼罗病毒感染的能力。简言之，将收集在一起的小鼠血清样品加热失活，并且两倍连续稀释于含有0.5％明胶的磷酸盐缓冲溶液中。开始于1∶10的稀释物是与约100溶菌斑形成单位(pfu)的西尼罗病毒品系2741一起培养。将病毒/血清混合物在约37℃培养1小时，然后在6槽孔的组织培养盘中，以二重复槽孔接种至汇合的单层Vero细胞上(ATCC，目录编号CRL-81，马那萨斯，维吉尼亚州)。在加入1％琼脂糖覆盖物之前，使病毒吸附至细胞单层。感染的细胞培养物是在37℃培养4天，然后加入含有4％中性红的第二琼脂糖覆盖物。12小时之后计数病毒溶菌斑。纪录在病毒溶菌斑数目中导致80％减少的血清效价(PRNT₈₀)。

有关STF2.EIII+及STF2Δ.EIII+的功效研究中的PRNT₈₀数据的摘要，是呈现在以下的表2中。在两个涉及STF2.EIII+的独立研究中(其中约50％或更少的存活率被报导)，所收集的血清无法抑制溶菌斑的形成。这个发现并不令人惊讶，如果这个构建体诱发弱的抗体反应的话。在三个涉及STF2Δ.EIII+的功效研究中(其中存活率是约70％或更高)，所收集的血清具有1∶40或较佳的中和效价。1∶40或更大的中和效价通常是与活体内的保护作用有关。

表2：STF2.EIII+(序列识别号55)、STF2Δ.EIII+(序列识别号71)及STF2.E(序列识别号159)对照组培养液(CM)融合蛋白质的存活率及PRNT₈₀

结果：

批次	候选物	途径	研究编号	存活率(％)	PRNT80(稀释)
						054	STF2.EIII+	腹膜内	3	50	阴性
057	STF2.EIII+	腹膜内	4	11	阴性
						057	STF2.EIII+	皮下	4	20	阴性
044	STF2Δ.EIII+	腹膜内	2	70	1∶40
						045	STF2Δ.EIII+	腹膜内	3	90	1∶40
045	STF2Δ.EIII+	皮下	3	100	1∶160
						045	STF2Δ.EIII+	腹膜内	4	100	1∶80
045	STF2Δ.EIII+	皮下	4	100	1∶40
						--	STF2.E CM	腹膜内	3	90	1∶640
--	STF2.E CM	腹膜内	4	--	1∶1280

STF2Δ.EIIIs+，一种STF2Δ.EIII+的修饰变体：

在上述小鼠功效研究中测试的STF2Δ.EIII+的蛋白质制备物，是利用在变性条件下进行的阴离子交换及大小区别层析步骤，接着通过逐步透析的再次折叠而纯化。利用这个方法，产生对应于STF2Δ.EIII+的单体及三聚体形式的两个主要的物种，并且在最终产物中以混合物的形式呈现。为了将最终产物的异质性减到最小，已有开发新的再次折叠及纯化方法，其有利于单体或三聚体的产生。因为不清楚何种形式的STF2Δ.EIII+是活性成分或两者是否都是相等的效能，因此，将两个物种都以微克的量而制造，并且在小鼠中测试功效。

一开始不清楚为何STF2Δ.EIII+的再次折叠会导致三聚体物种的形成。然而，当再次检验STF2Δ.EIII+表达构建体的序列时，我们鉴定了在将STF2Δ与EIII+分离的连接子序列内的半胱氨酸残基。这个半胱氨酸的存在将可能干扰再次折叠期间适当双硫键的形成，并且可能造成STF2Δ.EIII+的三聚体形式。利用点突变法而将这个不必要的半胱氨酸换成丝氨酸，并且制造及纯化修饰的蛋白质(STF2Δ.EIIIs+)。应注意的是，再次折叠丝氨酸取代的构建体，仅产生单体的蛋白质。

STF2Δ.EIII+(单体)及STF2Δ.EIIIs+(三聚体)的保护功效，是在以西尼罗病毒激发后的C3H/HeN小鼠中评估。在第0、14及28天，将五组小鼠(每组十只)以约25微克的蛋白质皮下进行致免疫。在第21及35天，收集血清，并且测试西尼罗病毒包膜蛋白质-IgG抗体(酶联免疫吸附分析)。在第38天，将小鼠以致死剂量的西尼罗病毒品是2741而激发，并且监测21天的存活率。增强2的酶联免疫吸附分析结果(第35天，第52图)以及存活率数据(图53)，显示在病毒激发之前，所有的构建体都诱发明显水平的西尼罗病毒包膜蛋白质反应性-IgG，并且对于致死的感染提供约90％至约100％的保护。这些发现显示STF2Δ.EIII+的单体或多聚体(例如，三聚体)形式是有功效的，以及从构建体中移除额外的半胱氨酸并不会明显影响效能。在连接子序列内移除半胱氨酸，可通过减少蛋白质再次折叠后的异质性，而简化蛋白质的纯化。

结论：

两种包含融合至西尼罗病毒包膜蛋白质的EIII+功能部位的鼠伤寒沙门氏杆菌鞭毛蛋白(STF2)的重组融合蛋白质已被产生。一种包括全长的STF2序列(STF2.EIII+)，另一种则包含缺少STF2的内部高度可变异区域的STF2的修饰变体(STF2Δ.EIII+)。两种蛋白质都已在大肠杆菌中表达，并且通过传统方法，利用阴离子交换层析及凝胶过滤而纯化。STF2.EIII+是以可溶性蛋白质的形式而制造，并且在非变性的条件下纯化。相反地，STF2Δ.EIII+则是以不溶性蛋白质的形式而表达，并且是在变性的条件下纯化，以及通过逐步的透析而再次折叠以移除尿素。在EK293 IL8分析中，STF2Δ.EIII+的制备物显示具有比STF2.EIII+更大的TLR-5活性。

在利用酶联免疫吸附分析及西尼罗病毒包膜蛋白质抗体的包膜蛋白质抗原决定部位显示分析中，STF2Δ.EIII+显示更多关键构形依赖性的中和抗原决定部位。与STF2Δ.EIII+所观察到的有效TLR-5活性及包膜蛋白质抗原决定部位抗原性一致的是，STF2Δ.EIII+在以致死剂量的西尼罗病毒激发的小鼠中，具有高度的免疫原性及功效。因为STF2Δ.EIII+的单体及三聚体物种是在这个蛋白质的纯化期间过程中所产生，因此，将表达构建体的连接子序列内的半胱氨酸换成丝氨酸。移除这个半胱氨酸可消除再次折叠期间蛋白质的三聚体形式的产生，并且导致可在活体内显示有效功效的单体产物的产生。

日本脑炎融合蛋白质：

日本脑炎病毒是位于亚洲及北澳洲的地区(每年约50,000个病例及约10,000人死亡)。一种核准的失活性病毒疫苗，最近是与急性散播性脑脊髓炎的病例有关，引起日本厚生劳动省建议全国暂停使用该疫苗。由于在感染的小鼠脑部或甚至在细胞培养物中提供制造失活性病毒的复杂性，以及与失活性病毒有关的不利事件的可能性，以重组为基础的日本脑炎疫苗的机会将有吸引力的。

建构STF2Δ.JEIII+融合构建体。JE EIII+DNA片段是合成地产生，以及密码子是最适化于在大肠杆菌中的表达。将序列黏接到pET24STF2Δ以产生pETSTF2Δ.JEIII+。表达构建体已通过限制酶切分析，以及通过异丙基-β-D-硫代半乳糖诱发在大肠杆菌BLR(DE3)中表达而筛选。每个构建体的DNA序列都已被证实，以及蛋白质的制造规模也已经放大。已产生一个批次的物质。总共约24毫克的物质被纯化。这个物质具有有效的TLR5活性、可接受的内毒素水平(约0.03内毒素单位/微克)以及约1.3的A280/A260比例。

黄病毒肽：

西尼罗病毒包膜蛋白质特异性抗体抗原决定部位的鉴定：

产生数个合成肽阵列以鉴定在西尼罗病毒包膜蛋白质内被来自STF2Δ.EIIIs+致免疫的小鼠的抗血清所辨认的线性抗原决定部位。一个阵列由20个氨基酸长度的重迭肽所组成，其跨越完整的西尼罗病毒功能部位III以及部分的功能部位II(图60)。这个阵列的酶联免疫吸附分析结果，鉴定了高度反应性的20个氨基酸序列，其被定位在功能部位III的氨基端区域，并且包括部分的功能部位I功能部位CRVKMEKLQLKGTTYGVCSK(序列识别号125)。为了精细定位这个抗原决定部位，因此产生另外的阵列，其集中在功能部位I及II的接合处(图57及图60)。这些阵列包括丙氨酸取代扫瞄，以鉴定对于抗体结合是关键性的氨基酸(图60)。如图54及图55所示，得自STF2Δ.EIII(单体及三聚体)及STF2Δ.EIIIs+致免疫的小鼠的抗血清，与跨越EI/EIII接合处的肽反应(肽E-30至E-42)，并且包括E2-21肽CRVKMEKLQLKGTTYGVCSK(序列识别号125)。当特定氨基酸(E6、K7、L10及K11)被换成丙氨酸时，这个反应性是严重地减少(图56)。虽然并不清楚可辨认这个抗原决定部位的抗体是否为具有中和性的，但仍继续努力以设计及测试以这个西尼罗病毒包膜蛋白质区域为基础的肽疫苗。

Pam3Cys WNV001肽疫苗的免疫原性：

利用20个氨基酸序列LTSGHLKCRVKMEKLQLKGT(序列识别号169)，而合成融合至氨基端上的Pam3Cys的脂化西尼罗病毒包膜蛋白质(Putnak R.等人，Vaccine 23：4442-4452(2005))。这个肽的免疫原性是在C3H/HeN小鼠中测试，并且比较没有Pam3Cys的肽(图58)。得自致免疫动物的抗血清的反应性，是利用如图例说明的直接型酶联免疫吸附分析而测试，以及结果显示，Pam3Cys.WNV001肽是比没有TLR2修饰的肽，具有明显更多的免疫原性。这些研究的抗血清将在病毒中和分析(PRNT)中测试，以测定所诱发的抗体是否将在活体外中和西尼罗病毒。脂化的肽也将在西尼罗病毒激发模式中测试，以评估对抗致死病毒激发的保护功效。

分析发展：

竞争型酶联免疫吸附分析的开发：

为了评估衍生自致免疫小鼠中的抗血清的中和能力，利用已经定性的单株抗体(7H2)，而开发出竞争型酶联免疫吸附分析，该单株抗体是可中和培养中的西尼罗病毒，并且与西尼罗病毒包膜蛋白质抗原的EIII功能部位内的构形敏感性抗原决定部位反应。该分析可设计成捕捉型酶联免疫吸附分析，其测量得自致免疫动物的血清可预防7H2结合西尼罗病毒包膜蛋白质的能力。将功效研究4的第35天的小鼠抗血清(图50及图51，表2)，范围从1∶10至1∶5000的连续稀释物，与生物素化的西尼罗病毒包膜蛋白质培养，然后加到预先以7H2单株抗体(Bioreliance，洛得洛克斐力，马里兰州)覆盖的酶联免疫吸附分析盘。在数次清洗以移除未结合的物质之后，将结合的西尼罗病毒包膜蛋白质利用抗生物素蛋白-辣根过氧化酶而侦测。代表性实验的结果显示于图54。在1∶25的稀释物，当衍生自以测试的STF2Δ.EIIIs所致免疫的动物的抗血清时，观察到西尼罗病毒包膜蛋白质结合至7H2-覆盖的培养盘的可测量的损失。衍生自以模拟物致免疫的动物(其接受磷酸盐缓冲溶液以取代抗原)的抗血清，并没有侦测到竞争。这些初步的结果显示，STF2Δ.EIII+所诱发的抗体会与7H2竞争，以结合西尼罗病毒包膜蛋白质。这些发现是与STF2Δ.EIII+致免疫的动物中所观察到避免西尼罗病毒感染的保护作用一致，并可协助建立活体外抗体的抗原决定部位反应性及活体内功效的间的关连性。

等同物：

虽然本发明已参考其较佳具体实例而特别显示及说明，但熟悉于此技艺者将理解的是，各种形式及细节的改变都可在不脱离本发明所附权利要求涵盖的范畴外完成。

Claims (82)

1.一种组合物，其包括至少一种抗原的至少一部分以及至少一种鞭毛蛋白的至少一部分，其中至少一种鞭毛蛋白缺少铰链区域的至少一部分。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中鞭毛蛋白选自由鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhimurium)鞭毛蛋白第2型(fljB/STF2)、大肠杆菌fliC以及慕尼黑沙门氏杆菌(S.muenchen)fliC所组成的组中的至少一员。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中抗原及鞭毛蛋白是融合蛋白质的成分。

4.一种融合蛋白质，其包括至少一种抗原的至少一部分以及至少一种鞭毛蛋白的至少一部分，其中至少一种鞭毛蛋白缺少铰链区域的至少一部分。

5.一种组合物，其包括至少一种病原体关联性分子模式的至少一部分以及至少一种病毒蛋白质的至少一部分，该病毒蛋白质选自由西尼罗病毒蛋白质、冷岳病毒蛋白质、昆津病毒蛋白质、墨累谷脑炎病毒蛋白质、日本脑炎病毒蛋白质、壁虱性脑炎病毒蛋白质以及黄热病毒蛋白质所组成的组中。

6.根据权利要求5所述的组合物，其中病原体关联性分子模式是TLR5激动剂。

7.根据权利要求6所述的组合物，其中TLR5激动剂是鞭毛蛋白的至少一部分。

8.根据权利要求7所述的组合物，其中鞭毛蛋白选自由fljB/STF2、大肠杆菌fliC以及慕尼黑沙门氏杆菌fliC所组成的组中的至少一员。

9.根据权利要求8所述的组合物，其中鞭毛蛋白包括fljB/STF2。

10.根据权利要求9所述的组合物，其中fljB/STF2包括序列识别号1。

11.根据权利要求9所述的组合物，其中fljB/STF2包括序列识别号3。

12.根据权利要求5所述的组合物，其中病原体关联性分子模式是TLR2激动剂。

13.根据权利要求12所述的组合物，其中TLR2激动剂包括选自由Pam2Cys以及Pam3Cys所组成的组中的至少一员。

14.根据权利要求5所述的组合物，其中病毒蛋白质是西尼罗病毒蛋白质。

15.根据权利要求14所述的组合物，其中西尼罗病毒蛋白质是包膜蛋白质。

16.根据权利要求15所述的组合物，其中包膜蛋白质包括选自由序列识别号7、序列识别号8、序列识别号9、序列识别号10以及序列识别号11所组成的组中的至少一员的至少一部分。

17.根据权利要求16所述的组合物，其中包膜蛋白质与包括序列识别号7的多肽具有至少约70％的相同性。

18.根据权利要求5所述的组合物，其中病毒蛋白质是包膜蛋白质。

19.根据权利要求5所述的组合物，其中病原体关联性分子模式选自由TLR激动剂9、TLR7激动剂、TLR3激动剂、TLR4激动剂以及TLR8激动剂所组成的组中的至少一员。

20.根据权利要求5所述的组合物，其中病原体关联性分子模式及病毒蛋白质是融合蛋白质的成分。

21.一种组合物，其包括至少一种病原体关联性分子模式的至少一部分以及至少一种Den2病毒包膜蛋白质的至少一部分，其中Den2病毒包膜蛋白质选自由序列识别号22、序列识别号40以及序列识别号97所组成的组中的至少一员。

22.根据权利要求21所述的组合物，其中病原体关联性分子模式及Den2病毒包膜蛋白质是融合蛋白质的成分。

23.一种组合物，其包括至少一种病原体关联性分子模式的至少一部分，以及选自由Den1病毒包膜蛋白质、Den2病毒包膜蛋白质、Den3病毒包膜蛋白质以及Den4病毒包膜蛋白质所组成的组中的至少一员的至少一部分。

24.一种融合蛋白质，其包括至少一种病原体关联性分子模式的至少一部分以及至少一种病毒蛋白质的至少一部分，该病毒蛋白质选自由西尼罗病毒蛋白质、冷岳病毒蛋白质、昆津病毒蛋白质、墨累谷脑炎病毒蛋白质、日本脑炎病毒蛋白质、壁虱性脑炎病毒蛋白质以及黄热病毒蛋白质所组成的组中。

25.根据权利要求24所述的融合蛋白质，还包括在病原体关联性分子模式及病毒蛋白质之间的连接子。

26.根据权利要求25所述的融合蛋白质，其中连接子是氨基酸连接子。

27.根据权利要求26所述的融合蛋白质，其中氨基酸连接子包括序列识别号26、序列识别号28、序列识别号60或序列识别号62。

28.根据权利要求24所述的融合蛋白质，还包括在至少两种病原体关联性分子模式之间的连接子。

29.根据权利要求24所述的融合蛋白质，还包括在至少两种病毒蛋白质之间的连接子。

30.根据权利要求24所述的融合蛋白质，其中病原体关联性分子模式是融合至病毒蛋白质的羧基端。

31.根据权利要求24所述的融合蛋白质，其中病原体关联性分子模式是融合至病毒蛋白质的氨基端。

32.根据权利要求24所述的融合蛋白质，其中病原体关联性分子模式是融合在至少两种病毒蛋白质之间。

33.根据权利要求24所述的融合蛋白质，其中病毒蛋白质是融合在至少两种病原体关联性分子模式之间。

34.根据权利要求24所述的融合蛋白质，其中病原体关联性分子模式是TLR5激动剂。

35.根据权利要求24所述的融合蛋白质，其中TLR5激动剂是鞭毛蛋白。

36.根据权利要求35所述的融合蛋白质，其中病毒蛋白质是在缺少鞭毛蛋白的铰链区域的至少一部分的鞭毛蛋白区域内融合至鞭毛蛋白。

37.一种融合蛋白质，其包括选自由鼠伤寒沙门氏杆菌鞭毛蛋白第2型(fljB/STF2)、大肠杆菌fliC以及慕尼黑沙门氏杆菌fliC所组成的组中的至少一员的至少一部分，以及选自由Den1病毒包膜蛋白质、Den2病毒包膜蛋白质、Den3病毒包膜蛋白质以及Den4病毒包膜蛋白质所组成的组中的至少一员的至少一部分。

38.一种融合蛋白质，其包括至少一种病原体关联性分子模式的至少一部分，以及选自由Den1病毒包膜蛋白质、Den2病毒包膜蛋白质、Den3病毒包膜蛋白质以及Den4病毒包膜蛋白质所组成的组中的至少一员的至少一部分。

39.一种多肽，该多肽由序列识别号29所编码。

40.一种多肽，该多肽由序列识别号30所编码。

41.一种多肽，该多肽与序列识别号30具有至少约85％的相同性。

42.一种多肽，该多肽由序列识别号31所编码。

43.一种多肽，该多肽由序列识别号32所编码。

44.一种多肽，该多肽与序列识别号32具有至少约70％的相同性。

45.一种多肽，该多肽由序列识别号33所编码。

46.一种多肽，该多肽由序列识别号34所编码。

47.一种多肽，该多肽与序列识别号34具有至少约70％的相同性。

48.一种多肽，该多肽由序列识别号35所编码。

49.一种多肽，该多肽由序列识别号36所编码。

50.一种多肽，该多肽与序列识别号36具有至少80％的相同性。

51.一种多肽，该多肽由序列识别号37所编码。

52.一种多肽，该多肽由序列识别号38所编码。

53.一种多肽，该多肽与序列识别号38具有至少70％的相同性。

54.一种多肽，该多肽由序列识别号54所编码。

55.一种多肽，该多肽包括序列识别号55。

56.一种多肽，该多肽与序列识别号55具有至少约70％的相同性。

57.一种多肽，该多肽包括选自由序列识别号71以及序列识别号72所组成的组中的至少一员。

58.一种多肽，该多肽由选自由序列识别号70以及序列识别号73所组成的组中的至少一员所编码。

59.一种多肽，该多肽与选自由序列识别号71以及序列识别号72所组成的组中的至少一员具有至少约70％的相同性。

60.一种多肽，该多肽包括选自由序列识别号76以及序列识别号6所组成的组中的至少一员。

61.一种多肽，该多肽由选自由序列识别号77以及序列识别号5所组成的组中的至少一员所编码。

62.一种多肽，该多肽与选自由序列识别号76以及序列识别号6所组成的组中的至少一员具有至少约70％的相同性。

63.一种多肽，该多肽包括选自由序列识别号80、序列识别号82、序列识别号84以及序列识别号86所组成的组中的至少一员。

64.一种多肽，该多肽由选自由序列识别号81、序列识别号83、序列识别号85以及序列识别号87所组成的组中的至少一员所编码。

65.一种多肽，该多肽与选自由序列识别号80、序列识别号82、序列识别号84以及序列识别号86所组成的组中的至少一员具有至少约70％的相同性。

66.一种多肽，该多肽包括序列识别号159。

67.一种多肽，该多肽由序列识别号158所编码。

68.一种多肽，该多肽与序列识别号159具有至少约70％的相同性。

69.一种组合物，该多肽包括至少一种Pam3Cys以及至少一种黄病毒蛋白质的至少一部分。

70.根据权利要求69所述的组合物，其中Pam3Cys以及黄病毒蛋白质是融合蛋白质的成分。

71.根据权利要求69所述的组合物，其中黄病毒蛋白质选自由西尼罗病毒蛋白质、登革病毒蛋白质、冷岳病毒蛋白质、昆津病毒蛋白质、墨累谷脑炎病毒蛋白质、日本脑炎病毒蛋白质、壁虱性脑炎病毒蛋白质、黄热病毒蛋白质以及C型肝炎病毒蛋白质所组成的组中的至少一员。

72.一种组合物，其包括至少一种Pam2Cys以及至少一种黄病毒蛋白质的至少一部分。

73.根据权利要求72所述的组合物，其中Pam2Cys以及黄病毒蛋白质是融合蛋白质的成分。

74.根据权利要求72所述的组合物，其中黄病毒蛋白质选自由西尼罗病毒蛋白质、登革病毒蛋白质、冷岳病毒蛋白质、昆津病毒蛋白质、墨累谷脑炎病毒蛋白质、日本脑炎病毒蛋白质、壁虱性脑炎病毒蛋白质、黄热病毒蛋白质以及C型肝炎病毒蛋白质所组成的组中的至少一员。

75.一种在被试者中刺激免疫反应的方法，其包括将一组合物给药至该被试者的步骤，该组合物包括至少一种病原体关联性分子模式的至少一部分以及至少一种病毒蛋白质的至少一部分，该病毒蛋白质选自由西尼罗病毒蛋白质、冷岳病毒蛋白质、昆津病毒蛋白质、墨累谷脑炎病毒蛋白质、日本脑炎病毒蛋白质、壁虱性脑炎病毒蛋白质以及黄热病毒蛋白质所组成的组中。

76.一种在被试者中刺激免疫反应的方法，其包括将一组合物给药至该被试者的步骤，该组合物包括至少一种病原体关联性分子模式的至少一部分以及至少一种Den2包膜蛋白质的至少一部分，其中Den2包膜蛋白质选自由序列识别号22、序列识别号40、以及序列识别号97所组成的组中的至少一员。

77.一种在被试者中刺激免疫反应的方法，其包括将一融合蛋白质给药至该被试者的步骤，该融合蛋白质包括至少一种病原体关联性分子模式的至少一部分以及至少一种病毒蛋白质的至少一部分，该病毒蛋白质选自由西尼罗病毒蛋白质、冷岳病毒蛋白质、昆津病毒蛋白质、墨累谷脑炎病毒蛋白质、日本脑炎病毒蛋白质、壁虱性脑炎病毒蛋白质以及黄热病毒蛋白质所组成的组中。

78.一种在被试者中刺激免疫反应的方法，其包括将一组合物给药至该被试者的步骤，该组合物包括至少一种病原体关联性分子模式的至少一部分以及选自由Den1病毒包膜蛋白质、Den2病毒包膜蛋白质、Den3病毒包膜蛋白质以及Den4病毒包膜蛋白质所组成的组中的至少一员的至少一部分。

79.一种在被试者中刺激免疫反应的方法，其包括将一融合蛋白质给药至该被试者的步骤，该融合蛋白质包括选自由鼠伤寒沙门氏杆菌鞭毛蛋白第2型(fljB/STF2)、大肠杆菌fliC以及慕尼黑沙门氏杆菌fliC所组成的组中的至少一员的至少一部分，以及选自由Den1病毒包膜蛋白质、Den2病毒包膜蛋白质、Den3病毒包膜蛋白质以及Den4病毒包膜蛋白质所组成的组中的至少一员的至少一部分。

80.一种在被试者中刺激免疫反应的方法，其包括将一融合蛋白质给药至该被试者的步骤，该融合蛋白质包括至少一种病原体关联性分子模式的至少一部分，以及选自由Den1病毒包膜蛋白质、Den2病毒包膜蛋白质、Den3病毒包膜蛋白质以及Den4病毒包膜蛋白质所组成的组中的至少一员的至少一部分。

81.一种在被试者中刺激免疫反的方法，其包括将一组合物给药至该被试者的步骤，该组合物包括至少一种抗原的至少一部分以及至少一种鞭毛蛋白的至少一部分，其中至少一种鞭毛蛋白缺少铰链区域的至少一部分。

82.一种在被试者中刺激免疫反应的方法，其包括将一融合蛋白质给药至该被试者的步骤，该融合蛋白质包括至少一种抗原的至少一部分以及至少一种鞭毛蛋白的至少一部分，其中至少一种鞭毛蛋白缺少铰链区域的至少一部分。

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