CN102000329B - 一种改造的非致病细菌来源的鞭毛素粘膜佐剂及制备方法 - Google Patents

一种改造的非致病细菌来源的鞭毛素粘膜佐剂及制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102000329B
CN102000329B CN2009101942856A CN200910194285A CN102000329B CN 102000329 B CN102000329 B CN 102000329B CN 2009101942856 A CN2009101942856 A CN 2009101942856A CN 200910194285 A CN200910194285 A CN 200910194285A CN 102000329 B CN102000329 B CN 102000329B
Authority
CN
China
Prior art keywords
ala
leu
thr
ser
asn
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN2009101942856A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102000329A (zh
Inventor
鄢慧民
杨菁毅
刘芳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Aloshen Biotechnology (Suzhou) Co.,Ltd.
Original Assignee
Wuhan Institute of Virology of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuhan Institute of Virology of CAS filed Critical Wuhan Institute of Virology of CAS
Priority to CN2009101942856A priority Critical patent/CN102000329B/zh
Publication of CN102000329A publication Critical patent/CN102000329A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102000329B publication Critical patent/CN102000329B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明提供了一种优化改造的非致病细菌来源的鞭毛素粘膜佐剂及其制备方法，将鞭毛素粘膜佐剂去除鞭毛蛋白的主要抗原活性区，将其替换为目的抗原，加入免疫原性低的柔性结构，用这种方法得到的改造的鞭毛素粘膜佐剂的基因序列为SEQ ID NO：1-11，氨基酸序列为SEQ ID NO：22-32。本发明的佐剂降低了其可能具有的潜在的危险性、其自身的抗原性、免疫原性以及由其引发的炎症反应和毒性；提高了抗原递呈效果；通过添加低免疫原性的柔性结构，维持其三维结构与天然的鞭毛素蛋白相类似，从而维持其佐剂活性。

Description

一种改造的非致病细菌来源的鞭毛素粘膜佐剂及制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种优化改造的非致病细菌来源的鞭毛素粘膜佐剂及其制备方法。
背景技术
现在已知致病菌来源的鞭毛素蛋白具有免疫佐剂效果，它是通过鞭毛素蛋白与Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)5相结合，引发NF-κB途径引发先天性免疫，进而引发特异性免疫。通过鞭毛素蛋白与目的蛋白混合或融合后免疫，可以显著提高对目的抗原的免疫应答，并且可达到抵抗带有目的抗原的病原微生物的效果。但是因其来源于致病菌，可能具有潜在的危险性，并且它还可以引起炎症反应，产生大量针对鞭毛素自身的免疫反应，导致可能的耐受性以及其它可能的免疫副反应。
发明内容
本发明为克服上述技术缺陷，提供了一种优化改造的非致病细菌来源的鞭毛素粘膜佐剂，该佐剂是通过改造一种来源于正常共生菌株的鞭毛素蛋白并且在保证其佐剂活性的前提下降低它的抗原性、免疫原性以及由其引发的炎症反应。
为实现上述目的，采用如下技术方案：
本发明的一种改造的非致病细菌来源的鞭毛素粘膜佐剂去除了鞭毛蛋白的主要抗原活性区。
所述非致病细菌包括大肠杆菌K12株。
所述抗原活性区包括高变区。
所述鞭毛素粘膜佐剂还含有柔性结构，所述柔性结构免疫原性低。
所述柔性结构包括人IgG3铰链序列。
所述抗原活性区替换为目的抗原。
所述目的抗原包括p24抗原。
所述佐剂包括如下的佐剂，该佐剂的
基因序列如SEQ ID：1或氨基酸序列如SEQ ID：22，
基因序列如SEQ ID：2或氨基酸序列如SEQ ID：23，
基因序列如SEQ ID：3或氨基酸序列如SEQ ID：24，
基因序列如SEQ ID：4或氨基酸序列如SEQ ID：25，
基因序列如SEQ ID：5或氨基酸序列如SEQ ID：26，
基因序列如SEQID：6或氨基酸序列如SEQ ID：27，
基因序列如SEQ ID：7或氨基酸序列如SEQ ID：28，
基因序列如SEQ ID：8或氨基酸序列如SEQ ID：29，
基因序列如SEQ ID：9或氨基酸序列如SEQ ID：30，
基因序列如SEQ ID：10或氨基酸序列如SEQ ID：31，
基因序列如SEQ ID：11或氨基酸序列如SEQ ID：32。
本发明的一种改造的非致病细菌来源的鞭毛素粘膜佐剂的制备方法是去除鞭毛蛋白片段中的主要抗原活性区。
选择的非致病细菌包括大肠杆菌K12株。
所述抗原活性区包括高变区。
在所述鞭毛蛋白片段中增加柔性结构，所述柔性结构免疫原性低。
所述柔性结构包括人IgG3铰链序列。
将所述抗原活性区替换为目的抗原。
所述目的抗原包括p24抗原。
本发明的一个优选实施例为选择人正常共生菌株——大肠杆菌K12菌株MG1655亚株的鞭毛素蛋白(简称KF)为目标，确认其佐剂活性；通过构建不同的克隆，通过ELISA(酶联免疫吸附检测法)确定其主要的抗原性区为其内部的高变区；通过去除其高变区并且添加柔性结构，确认去除高变区免疫原性大大降低，即高变区也是主要的免疫原性区，并且柔性结构没有高的免疫原性；通过将目的抗原替换高变区，并添加低免疫原性的柔性结构，得到保留佐剂活性的目的蛋白。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
通过选择来源于正常共生菌株的鞭毛素蛋白，从而降低可能具有的潜在的危险性；并且通过去除其主要的免疫原性区及抗原活性区，降低它的抗原性、免疫原性以及由其引发的炎症反应；通过将目的抗原添加到鞭毛素蛋白内部，提高抗原递呈效果；通过添加低免疫原性的柔性结构，维持其三维结构与天然的鞭毛素蛋白相类似，从而维持其佐剂活性。
附图说明
图1是KF不同区段的克隆的构建及其抗原蛋白的表达，其中，图1-1是构建KF不同区段的克隆的方案，图1-2是KF不同区段的抗原蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)电泳图；
图2是通过酶联免疫吸附检测法(ELISA)确定主要的抗原性区段为其内部的高变区的结果图，其中，图2-1是柱状图，图2-2是点分布图；
图3是KF结构改造方案及其改造得到的片段的鉴定结果，其中，图3-1是KF片段改造方案示意图，图3-2是KF片段改造后得到的片段的示意图，
图3-3是KF D1、D2、D3的SDS-PAGE及Western blot的结果图；图3-4是KFD-p242A、2B、2C、2D、3A、3B、3C和3D的SDS-PAGE及Westernblot的结果图；
图4是KFD1、D2、D3的佐剂活性及抗原性鉴定的结果图；其中，图4-1是以Caco-2细胞为模式细胞通过IL-8分泌水平，比较KF、KFD与TLR5作用能力强弱，图4-2是KFD+p24的10周免疫实验结果的分析图；
图5是KFD-p24的佐剂活性及抗原性鉴定的结果图，其中，图5-1，图5-2以Caco 2细胞为模式细胞通过IL-8分泌水平，比较KF、KFD-p24与TLR5作用能力强弱，图5-3，图5-4，图5-5是KFD-p24免疫实验(0，4，8周免疫)相关结果图；图5-3，图5-4是改造前后免疫所产生的针对目的抗原的抗体(anti-p24IgG)与针对佐剂自身的抗体(anti-KF IgG)的比例；图5-5是全面比较全长KF与改造克隆的代表KFD-p243D的粘膜免疫效果，即不同部位的IgA抗体水平的比较；
图6是小鼠滴鼻免疫后短期内产生的细胞因子的实验数据分析图；其中，图6-1，图6-2，图6-3分别是小鼠滴鼻免疫后短期内产生的IL-6、TNF-α和KC的实验数据分析图；
图7是小鼠滴鼻免疫短期毒性效应数据分析图。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验手册中所述的条件。
实施例1：构建KF不同区段的克隆及其抗原蛋白的表达
构建KF不同区段的克隆片段如图1所示，其中，图1-1是构建KF不同区段的克隆的方案，包括KF1、KF2、KF3、KFD1和SF3。其中，KFD1是去掉了高变区并插入NheI酶切位点的片段，KF1是KF的高变区片段，KF2是KF高变区中心片段，KF3是在高变区插入KFD1中NheI酶切位点后形成的KF恢复克隆，SF3是将高变区替换为SF高变区并插入NheI酶切位点的片段。
KF是指大肠杆菌K12株MG1655亚株的鞭毛蛋白(E.coli K12 strainMG1655substrain flagellin)，其基因序列号为ID-949101。SF为沙门氏菌的鞭毛蛋白(Salmonalla flagellin)，其基因序列号为ID-1070204。
以抽提所得细菌基因组为模板，选择pET30a作为载体，KF和SF的引物分别如下，其中划线部位为酶切位点：
KF：上游引物：5’-TATACATATGGCACAAGTCATTAATAC-3’NdeI
下游引物：5’-ATATCTCGAGACCCTGCAGCAGAGACAG-3’XhoI
SF：上游引物：5’-CGCGCATATGGCACAAGTCATTAATACAAACA-3’NdeI
下游引物：5’-CGGTCTCGAGACGCAGTAAAGAGAGGACGTTTTG-3’XhoI
克隆表达后得到的蛋白通过Ni柱纯化，超滤浓缩8-10倍后加PBS再超滤浓缩，反复4次；Triton法去内毒素；考马斯亮蓝法确定蛋白浓度；鲎试剂检测内毒素含量＜0.005Eu/μg蛋白，最后SDS-PAGE鉴定，其结果如图1-2所示，图1-2是KF不同区段的抗原蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)图。该图的结果显示得到的蛋白与预期蛋白的大小一致。
实施例2：确定KF的主要抗原性区段
图2是通过酶联免疫吸附检测法(ELISA)确定主要的抗原性区段为其内部的高变区的结果图。其中，图2-1比较了不同免疫策略所免疫小鼠血清中针对KF不同区段的抗体的比例有何异同，该图的结果说明不同免疫策略所免疫小鼠血清中针对KF不同区段的抗体的比例基本相同。图2-2比较了免疫策略所免疫小鼠血清中针对KF不同区段的抗体的比例有何特征，该图的结果说明恢复性克隆KF3的抗原性与KF基本相同。高变区KF1的抗原性≈90％，高变区的中心部位(KF2)仅占其总抗原性的约1/3，保守区KFD1的抗原性≈10％。高变区替换为SF的抗原性与其缺失(KFD1)的抗原性相似。KF抗原性主要集中在高变区。由图2可知，KF抗原性主要集中在高变区，即高变区也是主要的免疫原性区。
实施例3：KF结构改造方案及其改造得到的片段的鉴定
先构造保守区KFD片段，即在KF片段的基础上，将KF高变区去掉，将KF的N端(KFN)及C端(KFC端)连接起来，得到pET28a-KFD片段；然后将p24片段插入pET28a-KFD中，得到pET28a-KFD-p24。设计了三组KFN和四组p24，选择了两组KFN和四组p24进行组合改造，得到八个改造片段。具体如下：
图3是KF结构改造方案及其改造得到的片段的鉴定结果，KF片段改造方案如图3-1所示，其中，KFN片段改造所用的引物如下：
KF N1段
上游引物(NcoI)
Up-N：5-GGCGTCCATGGCACAAGTCATTAATAC-3 27bp
下游引物(BamHI)：
Low-N1：
5-GGCAAGGATCCGTCGTCGTAGCGCTAGCATCAAGGCCAAGAGTTTTA
G-3 48bp
产物长度541bp；
KF N2段：
上游引物(NcoI)
Up-N：5-GGCGTCCATGGCACAAGTCATTAATAC-3 27bp
下游引物(BamHI)：
Low-N2：
5-TACTAGGATCCGTCGTTCCAGATGTGTGAGTTGTGTCACCAAGTGGAGTGCTAGCATCAAGGCCAAGAGTTTTAG-3 75bp
产物长度568bp；
KF N3段：
上游引物(NcoI)
U p-N：5-GGCGTCCATGGCACAAGTCATTAATAC-3 27bp
下游引物(BamHI)：
Low-N3：
5-TACTAGGATCCGTCGTGCTAGCTCCAGATGTGTGAGTTGTGTCACCAAGTGGAGTATCAAGGCCAAGAGTTTTAG-3 75bp
产物长度568bp；
KFC段：直接酶切KF，根据BamHI和XhoI酶切位点进行连接。
KFD的三个不同片段，简单来说，如下：
KFD1＝NcoI-N1-BamHI-C-XhoI；
KFD2＝NcoI-N2-BamHI-C-XhoI；
KFD3＝NcoI-N3-BamHI-C-XhoI。
进一步，p24的改造具体如下：
p24扩增的引物如下：
Up p24-1NheI：
5’GCATAGCTAGCCCTATAGTGCAGAACCTCCA-3’31bp；
Low-p24-1BamHI：
5’TATGCGGATCCGTCGTCAAAACTCTTGCTTTATGGC-3’36bp；
Up p24-2NheI：
5’ATCGAGCTAGCACACCTCTTGGTGATACTACACACACATCAGGACCTATAGTGCAGAACCTCCA-3’64bp  ；
Low-p24-2BamHI：
5’TATGCGGATCCGTCGTTCCAGATGTGTGAGTTGTGTCACCAAGTGGAGTCAAAACTCTTGCTTTATGGC-3’69bp
简单明了的来说，p24A、p24B、p24C、p24D的结构如下：
p24A：Up p24-1+Low-p24-1；
p24B：Up p24-1+Low-p24-2；
p24C：Up p24-2+Low-p24-2；
p24D：Up p24-2+Low-p24-1。
高变区替换改造为KFD-p24，总共有8个片段：KFD-p242A、KFD-p242B、KFD-p242C、KFD-p242D、KFD-p243A、KFD-p243B、KFD-p243C和KFD-p243D，其结构如下：
KFD-p242A：KFD2+p24A
KFD-p242B：KFD2+p24B
KFD-p242C：KFD2+p24C
KFD-p242D：KFD2+p24D
KFD-p243A：KFD3+p24A
KFD-p243B：KFD3+p24B
KFD-p243C：KFD3+p24C
KFD-p243D：KFD3+p24D
图3-2是KF片段改造后得到的片段的示意图所得改造后片段的序列见序列表。
KF D1、D2、D3的SDS-PAGE及Western blot的结果见图3-3；KFD-p242A、2B、2C、2D、3A、3B、3C和3D的SDS-PAGE及Western blot的结果图见图3-4，标号1-9依次代表KFD-p242A、2B、2C、2D、marker、3A、3B、3C、3D。其中，所用marker为Ferment SM0661。预期片段大小KFD-p242A、2B、2C、2D分别为：55KD、56KD、57KD、56KD；KFD-p243A、3B、3C、3D分别为：56KD、57KD、58KD、57KD。由图可知，所得片段与预期片段大小一致。
实施例4：KFD1、D2、D3的佐剂活性及抗原性鉴定
图4是KFD1、D2、D3的佐剂活性及抗原性鉴定的结果图，其中，图4-1是以Caco-2细胞为模式细胞通过IL-8分泌水平，比较KF、KFD1、D2、D3与TLR5作用能力强弱。即KF、KFD1、D2、D3的佐剂活性在细胞水平的鉴定的结果图；分别用KFD1、KFD2、KFD3和KF刺激Caco-2细胞，测量上清中IL-8含量。具体操作：Caco-2细胞于24孔板中培养6-8天至其细胞间界限分隔明显后，用无血清1640培养基饥饿12h后，加无血清1640培养基稀释样品0.5ml刺激6h后去细胞上清，2000rpm 10min离心取上清，-80C冻存备用。该图表明，KF高变区缺失影响到佐剂活性，在较低浓度(10ng/ml)时，全长的鞭毛素KF对Caco-2细胞刺激作用较强，但在较高浓度下(1000ng/ml)改造克隆的刺激作用已经超过KF。
如图所示，图4-2是KFD+p24的免疫实验(0，4，8周滴鼻免疫)第10周结果；即KFD1、D2、D3的佐剂活性及抗原性鉴定的结果图。实验结果说明在保留了佐剂活性的条件下KF自身抗原性明显下降，且不同改造降低的幅度基本相同，均降低了10倍以上。
实施例5：KFD-p242A，2B，2C，2D，3A，3B，3C，3D的佐剂活性及抗原性鉴定
图5是KFD-p24的佐剂活性及抗原性鉴定的结果图，其中，图5-1，图5-2以Caco-2细胞为模式细胞通过IL-8分泌水平，比较KF、KFD-p24与TLR5作用能力强弱，即KF、KFD-p24的佐剂活性在细胞水平的鉴定的结果图；分别用KF和KF-p24刺激Caco-2细胞，测量上清中IL-8含量。具体操作同实施例4。该结果说明：KF高变区替换影响到佐剂活性，在较低浓度(1ng/ml-100ng/ml)时，全长的鞭毛素KF对Caco-2细胞刺激作用较强，但在较高浓度下(1000ng/ml)改造克隆的刺激作用可以与KF相比较。
图5-3，图5-4，图5-5是KFD-p24免疫实验(0，4，8周滴鼻免疫)第10周结果。
图5-3，图5-4是改造前后免疫所产生的针对目的抗原的抗体(anti-p24IgG)与针对佐剂自身的抗体(anti-KF IgG)的比例。图5-3是观察KFD-p24佐剂效应及其佐剂活性部分的抗原性。由以上结果看出，所有的高变区替换的克隆免疫效果均不弱于利用全长KF与同样量的p24混合免疫。并且有些克隆的免疫活性可以与KF与p24直接融合的克隆KF-p24相比较。通过将KF高变区替换为p24，佐剂活性区域的自身抗原性大大降低。图5-4是具体比较KF+p24，KF-p24以及KFD-p24的免疫原性部位；对于KFD-p24来说，抗原活性部位主要在p24部位，对目的抗原p24的抗体是对佐剂活性区域的抗体滴度的约20-200倍。对于直接融合的蛋白KF-p24来说对目的抗原p24的抗体是对佐剂活性区域的抗体滴度的约0.5-1倍。对于混合免疫KF与p24来说对目的抗原p24的抗体是对佐剂活性区域的抗体滴度的约0.2倍。实验结果说明相对于混合免疫KF与p24来说，免疫KFD-p24产生的抗体中，对于佐剂活性区域的抗体减少了两个数量级，大大提高了免疫反应的特异性。
图5-5是全面比较全长KF与改造克隆的代表KFD-p243D的粘膜免疫效果，即不同部位的IgA抗体水平的比较；以KFD-p243D为代表比较不同免疫策略产生的对于目的抗原p24的IgA抗体水平；实验结果说明：从各部位的IgA水平来看，同样剂量的KFD-p243D均好于KF，而且可以同融合相媲美。
实施例6：小鼠细胞因子实验
小鼠提前12小时开始禁食不禁水，用戊巴比妥那麻醉后滴鼻免疫。取样时，拔眼球取血，脱颈处死后，解剖咽喉部，用PBS从气管处灌洗500μL两次，合并后8000rpm 5min离心取上清，-80C冻存备用。图6是小鼠滴鼻免疫后短期内产生的细胞因子的实验数据分析图；其中，图6-1，图6-2，图6-3分别是小鼠滴鼻免疫后短期内产生的IL-6、TNF-α和KC的实验数据分析图。KF高变区缺失及替换诱导产生TNF-α，IL-6，KC(IL-8)的能力比全长低，并且较快的恢复到静息水平(PBS组)，因此其潜在的炎症效应较弱。
实施例7：小鼠滴鼻免疫短期毒性效应
小鼠用戊巴比妥那麻醉后滴鼻免疫，免疫前及免疫后每天称重。体重指标是反映小鼠状态的敏感指标，通过体重反映了小鼠滴鼻免疫的短期毒性效应。图7是小鼠滴鼻免疫毒性炎症效应数据分析图；由图7可知，高变区缺失及替换与阴性对照组相似，对小鼠无显著影响。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
序列表
<110>中国科学院武汉病毒研究所
<160>32
<210>1
<211>827
<212>KFD1 DNA
<400>1
ccatggcaca agtcattaat accaacagcc tctcgctgat cactcaaaat aatatcaaca     60
agaaccagtc tgcgctgtcg agttctatcg agcgtctgtc ttctggcttg cgtattaaca    120
gcgcgaagga tgacgcagcg ggtcaggcga ttgctaaccg tttcacctct aacattaaag    180
gcctgactca ggcggcccgt aacgccaacg acggtatctc cgttgcgcag accaccgaag    240
gcgcgctgtc cgaaatcaac aacaacttac agcgtgtgcg tgaactgacg gtacaggcca    300
ctaccggtac taactctgag tctgatctgt cttctatcca ggacgaaatt aaatcccgtc    360
tggatgaaat tgaccgcgta tctggtcaga cccagttcaa cggcgtgaac gtgctggcaa    420
aaaatggctc catgaaaatc caggttggcg caaatgataa ccagactatc actatcgatc    480
tgaagcagat tgatgctaaa actcttggcc ttgatgctag cgctacgacg acggatccgc    540
tgaaagcgct ggacgatgct atcgcatctg tagacaaatt ccgttcttcc ctcggtgcgg    600
tgcaaaaccg tctggattcc gcggttacca acctgaacaa caccactacc aacctgtctg    660
aagcgcagtc ccgtattcag gacgccgact atgcgaccga agtgtccaat atgtcgaaag    720
cgcagatcat ccagcaggcc ggtaactccg tgttggcaaa agctaaccag gtaccgcagc    780
aggttctgtc tctgctgcag ggtctcgagc accaccacca ccaccac                  827
<210>1
<211>854
<212>KFD2 DNA
<400>2
ccatggcaca agtcattaat accaacagcc tctcgctgat cactcaaaat aatatcaaca     60
agaaccagtc tgcgctgtcg agttctatcg agcgtctgtc ttctggcttg cgtattaaca    120
gcgcgaagga tgacgcagcg ggtcaggcga ttgctaaccg tttcacctct aacattaaag    180
gcctgactca ggcggcccgt aacgccaacg acggtatctc cgttgcgcag accaccgaag    240
gcgcgctgtc cgaaatcaac aacaacttac agcgtgtgcg tgaactgacg gtacaggcca    300
ctaccggtac taactctgag tctgatctgt cttctatcca ggacgaaatt aaatcccgtc    360
tggatgaaat tgaccgcgta tctggtcaga cccagttcaa cggcgtgaac gtgctggcaa    420
aaaatggctc catgaaaatc caggttggcg caaatgataa ccagactatc actatcgatc    480
tgaagcagat tgatgctaaa actcttggcc ttgatgctag cactccactt ggtgacacaa    540
ctcacacatc tggaacgacg gatccgctga aagcgctgga cgatgctatc gcatctgtag    600
acaaattccg ttcttccctc ggtgcggtgc aaaaccgtct ggattccgcg gttaccaacc    660
tgaacaacac cactaccaac ctgtctgaag cgcagtcccg tattcaggac gccgactatg    720
cgaccgaagt gtccaatatg tcgaaagcgc agatcatcca gcaggccggt aactccgtgt    780
tggcaaaagc taaccaggta ccgcagcagg ttctgtctct gctgcagggt ctcgagcacc    840
accaccacca ccac                                                      854
<210>1
<211>854
<212>KFD3 DNA
<400>3
ccatggcaca agtcattaat accaacagcc tctcgctgat cactcaaaat aatatcaaca     60
agaaccagtc tgcgctgtcg agttctatcg agcgtctgtc ttctggcttg cgtattaaca    120
gcgcgaagga tgacgcagcg ggtcaggcga ttgctaaccg tttcacctct aacattaaag    180
gcctgactca ggcggcccgt aacgccaacg acggtatctc cgttgcgcag accaccgaag    240
gcgcgctgtc cgaaatcaac aacaacttac agcgtgtgcg tgaactgacg gtacaggcca    300
ctaccggtac taactctgag tctgatctgt cttctatcca ggacgaaatt aaatcccgtc    360
tggatgaaat tgaccgcgta tctggtcaga cccagttcaa cggcgtgaac gtgctggcaa    420
aaaatggctc catgaaaatc caggttggcg caaatgataa ccagactatc actatcgatc    480
tgaagcagat tgatgctaaa actcttggcc ttgatactcc acttggtgac acaactcaca    540
catctggagc tagcacgacg gatccgctga aagcgctgga cgatgctatc gcatctgtag    600
acaaattccg ttcttccctc ggtgcggtgc aaaaccgtct ggattccgcg gttaccaacc    660
tgaacaacac cactaccaac ctgtctgaag cgcagtcccg tattcaggac gccgactatg    720
cgaccgaagt gtccaatatg tcgaaagcgc agatcatcca gcaggccggt aactccgtgt    780
tggcaaaagc taaccaggta ccgcagcagg ttctgtctct gctgcagggt ctcgagcacc    840
accaccacca  ccac                                                     854
<210>1
<211>1514
<212>KFD-p24 2A DNA
<400>4
ccatggcaca agtcattaat accaacagcc tctcgctgat cactcaaaat aatatcaaca     60
agaaccagtc tgcgctgtcg agttctatcg agcgtctgtc ttctggcttg cgtattaaca    120
gcgcgaagga tgacgcagcg ggtcaggcga ttgctaaccg tttcacctct aacattaaag    180
gcctgactca ggcggcccgt aacgccaacg acggtatctc cgttgcgcag accaccgaag    240
gcgcgctgtc cgaaatcaac aacaacttac agcgtgtgcg tgaactgacg gtacaggcca    300
ctaccggtac taactctgag tctgatctgt cttctatcca ggacgaaatt aaatcccgtc    360
tggatgaaat tgaccgcgta tctggtcaga cccagttcaa cggcgtgaac gtgctggcaa    420
aaaatggctc catgaaaatc caggttggcg caaatgataa ccagactatc actatcgatc    480
tgaagcagat tgatgctaaa actcttggcc ttgatgctag ccctatagtg cagaacctcc    540
aggggcaaat ggtacatcag gccatatcac ctagaacttt aaatgcatgg gtaaaagtag    600
tagaagagaa ggctttcagc ccagaagtaa tacccatgtt ttcagcatta tcagaaggag    660
ccaccccaca agatttaaat accatgctaa acacagtggg gggacatcaa gcagccatgc    720
aaatgttaaa agagaccatc aatgaggaag ctgcagaatg ggatagattg catccagtgc    780
atgcagggcc tattgcacca ggccagatga gagaaccaag gggaagtgac atagcaggaa    840
ctactagtac ccttcaggaa caaataggat ggatgacaca taatccacct atcccagtag    900
gagaaatcta taaaagatgg ataatcctgg gattaaataa aatagtaaga atgtatagcc    960
ctaccagcat tctggacata agacaaggac caaaggaacc ctttagagac tatgtagacc   1020
gattctataa aactctaaga gccgagcaag cttcacaaga ggtaaaaaat tggatgacag   1080
aaaccttgtt ggtccaaaat gcgaacccag attgtaagac tattttaaaa gcattgggac   1140
caggagcgac actagaagaa atgatgacag catgtcaggg agtgggggga cccggccata   1200
aagcaagagt tttgacgacg gatccgctga aagcgctgga cgatgctatc gcatctgtag   1260
acaaattccg ttcttccctc ggtgcggtgc aaaaccgtct ggattccgcg gttaccaacc   1320
tgaacaacac cactaccaac ctgtctgaag cgcagtcccg tattcaggac gccgactatg   1380
cgaccgaagt gtccaatatg tcgaaagcgc agatcatcca gcaggccggt aactccgtgt   1440
tggcaaaagc taaccaggta ccgcagcagg ttctgtctct gctgcagggt ctcgagcacc   1500
accaccacca ccac                                                     1514
<210>1
<211>1547
<212>KFD-p24 2B DNA
<400>5
ccatggcaca agtcattaat accaacagcc tctcgctgat cactcaaaat aatatcaaca     60
agaaccagtc tgcgctgtcg agttctatcg agcgtctgtc ttctggcttg cgtattaaca    120
gcgcgaagga tgacgcagcg ggtcaggcga ttgctaaccg tttcacctct aacattaaag    180
gcctgactca ggcggcccgt aacgccaacg acggtatctc cgttgcgcag accaccgaag    240
gcgcgctgtc cgaaatcaac aacaacttac agcgtgtgcg tgaactgacg gtacaggcca    300
ctaccggtac taactctgag tctgatctgt cttctatcca ggacgaaatt aaatcccgtc    360
tggatgaaat tgaccgcgta tctggtcaga cccagttcaa cggcgtgaac gtgctggcaa    420
aaaatggctc catgaaaatc caggttggcg caaatgataa ccagactatc actatcgatc    480
tgaagcagat tgatgctaaa actcttggcc ttgatgctag ccctatagtg cagaacctcc    540
aggggcaaat ggtacatcag gccatatcac ctagaacttt aaatgcatgg gtaaaagtag    600
tagaagagaa ggctttcagc ccagaagtaa tacccatgtt ttcagcatta tcagaaggag    660
ccaccccaca agatttaaat accatgctaa acacagtggg gggacatcaa gcagccatgc    720
aaatgttaaa agagaccatc aatgaggaag ctgcagaatg ggatagattg catccagtgc    780
atgcagggcc tattgcacca ggccagatga gagaaccaag gggaagtgac atagcaggaa    840
ctactagtac ccttcaggaa caaataggat ggatgacaca taatccacct atcccagtag    900
gagaaatcta taaaagatgg ataatcctgg gattaaataa aatagtaaga atgtatagcc    960
ctaccagcat tctggacata agacaaggac caaaggaacc ctttagagac tatgtagacc   1020
gattctataa aactctaaga gccgagcaag cttcacaaga ggtaaaaaat tggatgacag   1080
aaaccttgtt ggtccaaaat gcgaacccag attgtaagac tattttaaaa gcattgggac   1140
caggagcgac actagaagaa atgatgacag catgtcaggg agtgggggga cccggccata   1200
aagcaagagt tttgactcca cttggtgaca caactcacac atctggaacg acggatccgc   1260
tgaaagcgct ggacgatgct atcgcatctg tagacaaatt ccgttcttcc ctcggtgcgg   1320
tgcaaaaccg tctggattcc gcggttacca acctgaacaa caccactacc aacctgtctg   1380
aagcgcagtc ccgtattcag gacgccgact atgcgaccga agtgtccaat atgtcgaaag   1440
cgcagatcat ccagcaggcc ggtaactccg tgttggcaaa agctaaccag gtaccgcagc   1500
aggttctgtc tctgctgcag ggtctcgagc accaccacca ccaccac                 1547
<210>1
<211>1580
<212>KFD-p24 2C DNA
<400>6
ccatggcaca agtcattaat accaacagcc tctcgctgat cactcaaaat aatatcaaca     60
agaaccagtc tgcgctgtcg agttctatcg agcgtctgtc ttctggcttg cgtattaaca    120
gcgcgaagga tgacgcagcg ggtcaggcga ttgctaaccg tttcacctct aacattaaag    180
gcctgactca ggcggcccgt aacgccaacg acggtatctc cgttgcgcag accaccgaag    240
gcgcgctgtc cgaaatcaac aacaacttac agcgtgtgcg tgaactgacg gtacaggcca    300
ctaccggtac taactctgag tctgatctgt cttctatcca ggacgaaatt aaatcccgtc    360
tggatgaaat tgaccgcgta tctggtcaga cccagttcaa cggcgtgaac gtgctggcaa    420
aaaatggctc catgaaaatc caggttggcg caaatgataa ccagactatc actatcgatc    480
tgaagcagat tgatgctaaa actcttggcc ttgatgctag cacacctctt ggtgatacta    540
cacacacatc aggacctata gtgcagaacc tccaggggca aatggtacat caggccatat    600
cacctagaac tttaaatgca tgggtaaaag tagtagaaga gaaggctttc agcccagaag    660
taatacccat gttttcagca ttatcagaag gagccacccc acaagattta aataccatgc    720
taaacacagt ggggggacat caagcagcca tgcaaatgtt aaaagagacc atcaatgagg    780
aagctgcaga atgggataga ttgcatccag tgcatgcagg gcctattgca ccaggccaga    840
tgagagaacc aaggggaagt gacatagcag gaactactag tacccttcag gaacaaatag    900
gatggatgac acataatcca cctatcccag taggagaaat ctataaaaga tggataatcc    960
tgggattaaa taaaatagta agaatgtata gccctaccag cattctggac ataagacaag    1020
gaccaaagga accctttaga gactatgtag accgattcta taaaactcta agagccgagc    1080
aagcttcaca agaggtaaaa aattggatga cagaaacctt gttggtccaa aatgcgaacc    1140
cagattgtaa gactatttta aaagcattgg gaccaggagc gacactagaa gaaatgatga    1200
cagcatgtca gggagtgggg ggacccggcc ataaagcaag agttttgact ccacttggtg    1260
acacaactca cacatctgga acgacggatc cgctgaaagc gctggacgat gctatcgcat    1320
ctgtagacaa attccgttct tccctcggtg cggtgcaaaa ccgtctggat tccgcggtta    1380
ccaacctgaa caacaccact accaacctgt ctgaagcgca gtcccgtatt caggacgccg    1440
actatgcgac cgaagtgtcc aatatgtcga aagcgcagat catccagcag gccggtaact    1500
ccgtgttggc aaaagctaac caggtaccgc agcaggttct gtctctgctg cagggtctcg    1560
agcaccacca ccaccaccac                                                1580
<210>1
<211>1547
<212>KFD-p24 2D DNA
<400>7
ccatggcaca agtcattaat accaacagcc tctcgctgat cactcaaaat aatatcaaca     60
agaaccagtc tgcgctgtcg agttctatcg agcgtctgtc ttctggcttg cgtattaaca    120
gcgcgaagga tgacgcagcg ggtcaggcga ttgctaaccg tttcacctct aacattaaag    180
gcctgactca ggcggcccgt aacgccaacg acggtatctc cgttgcgcag accaccgaag    240
gcgcgctgtc cgaaatcaac aacaacttac agcgtgtgcg tgaactgacg gtacaggcca    300
ctaccggtac taactctgag tctgatctgt cttctatcca ggacgaaatt aaatcccgtc    360
tggatgaaat tgaccgcgta tctggtcaga cccagttcaa cggcgtgaac gtgctggcaa    420
aaaatggctc catgaaaatc caggttggcg caaatgataa ccagactatc actatcgatc    480
tgaagcagat tgatgctaaa actcttggcc ttgatgctag cacacctctt ggtgatacta    540
cacacacatc aggacctata gtgcagaacc tccaggggca aatggtacat caggccatat    600
cacctagaac tttaaatgca tgggtaaaag tagtagaaga gaaggctttc agcccagaag    660
taatacccat gttttcagca ttatcagaag gagccacccc acaagattta aataccatgc    720
taaacacagt ggggggacat caagcagcca tgcaaatgtt aaaagagacc atcaatgagg    780
aagctgcaga atgggataga ttgcatccag tgcatgcagg gcctattgca ccaggccaga    840
tgagagaacc aaggggaagt gacatagcag gaactactag tacccttcag gaacaaatag    900
gatggatgac acataatcca cctatcccag taggagaaat ctataaaaga tggataatcc    960
tgggattaaa taaaatagta agaatgtata gccctaccag cattctggac ataagacaag   1020
gaccaaagga accctttaga gactatgtag accgattcta taaaactcta agagccgagc   1080
aagcttcaca agaggtaaaa aattggatga cagaaacctt gttggtccaa aatgcgaacc   1140
cagattgtaa gactatttta aaagcattgg gaccaggagc gacactagaa gaaatgatga   1200
cagcatgtca gggagtgggg ggacccggcc ataaagcaag agttttgacg acggatccgc   1260
tgaaagcgct ggacgatgct atcgcatctg tagacaaatt ccgttcttcc ctcggtgcgg   1320
tgcaaaaccg tctggattcc gcggttacca acctgaacaa caccactacc aacctgtctg   1380
aagcgcagtc ccgtattcag gacgccgact atgcgaccga agtgtccaat atgtcgaaag   1440
cgcagatcat ccagcaggcc ggtaactccg tgttggcaaa agctaaccag gtaccgcagc   1500
aggttctgtc tctgctgcag ggtctcgagc accaccacca ccaccac                 1547
<210>1
<211>1547
<212>KFD-p24 3A DNA
<400>8
ccatggcaca agtcattaat accaacagcc tctcgctgat cactcaaaat aatatcaaca    60
agaaccagtc tgcgctgtcg agttctatcg agcgtctgtc ttctggcttg cgtattaaca    120
gcgcgaagga tgacgcagcg ggtcaggcga ttgctaaccg tttcacctct aacattaaag    180
gcctgactca ggcggcccgt aacgccaacg acggtatctc cgttgcgcag accaccgaag    240
gcgcgctgtc cgaaatcaac aacaacttac agcgtgtgcg tgaactgacg gtacaggcca    300
ctaccggtac taactctgag tctgatctgt cttctatcca ggacgaaatt aaatcccgtc    360
tggatgaaat tgaccgcgta tctggtcaga cccagttcaa cggcgtgaac gtgctggcaa    420
aaaatggctc catgaaaatc caggttggcg caaatgataa ccagactatc actatcgatc    480
tgaagcagat tgatgctaaa actcttggcc ttgatactcc acttggtgac acaactcaca    540
catctggagc tagccctata gtgcagaacc tccaggggca aatggtacat caggccatat    600
cacctagaac tttaaatgca tgggtaaaag tagtagaaga gaaggctttc agcccagaag    660
taatacccat gttttcagca ttatcagaag gagccacccc acaagattta aataccatgc    720
taaacacagt ggggggacat caagcagcca tgcaaatgtt aaaagagacc atcaatgagg    780
aagctgcaga atgggataga ttgcatccag tgcatgcagg gcctattgca ccaggccaga    840
tgagagaacc aaggggaagt gacatagcag gaactactag tacccttcag gaacaaatag    900
gatggatgac acataatcca cctatcccag taggagaaat ctataaaaga tggataatcc    960
tgggattaaa taaaatagta agaatgtata gccctaccag cattctggac ataagacaag   1020
gaccaaagga accctttaga gactatgtag accgattcta taaaactcta agagccgagc   1080
aagcttcaca agaggtaaaa aattggatga cagaaacctt gttggtccaa aatgcgaacc   1140
cagattgtaa gactatttta aaagcattgg gaccaggagc gacactagaa gaaatgatga   1200
cagcatgtca gggagtgggg ggacccggcc ataaagcaag agttttgacg acggatccgc   1260
tgaaagcgct ggacgatgct atcgcatctg tagacaaatt ccgttcttcc ctcggtgcgg   1320
tgcaaaaccg tctggattcc gcggttacca acctgaacaa caccactacc aacctgtctg   1380
aagcgcagtc ccgtattcag gacgccgact atgcgaccga agtgtccaat atgtcgaaag   1440
cgcagatcat ccagcaggcc ggtaactccg tgttggcaaa agctaaccag gtaccgcagc   1500
aggttctgtc tctgctgcag ggtctcgagc accaccacca ccaccac                 1547
<210>1
<211>1580
<212>KFD-p24 3B DNA
<400>9
ccatggcaca agtcattaat accaacagcc tctcgctgat cactcaaaat aatatcaaca     60
agaaccagtc tgcgctgtcg agttctatcg agcgtctgtc ttctggcttg cgtattaaca    120
gcgcgaagga tgacgcagcg ggtcaggcga ttgctaaccg tttcacctct aacattaaag    180
gcctgactca ggcggcccgt aacgccaacg acggtatctc cgttgcgcag accaccgaag    240
gcgcgctgtc cgaaatcaac aacaacttac agcgtgtgcg tgaactgacg gtacaggcca    300
ctaccggtac taactctgag tctgatctgt cttctatcca ggacgaaatt aaatcccgtc    360
tggatgaaat tgaccgcgta tctggtcaga cccagttcaa cggcgtgaac gtgctggcaa    420
aaaatggctc catgaaaatc caggttggcg caaatgataa ccagactatc actatcgatc    480
tgaagcagat tgatgctaaa actcttggcc ttgatactcc acttggtgac acaactcaca    540
catctggagc tagccctata gtgcagaacc tccaggggca aatggtacat caggccatat    600
cacctagaac tttaaatgca tgggtaaaag tagtagaaga gaaggctttc agcccagaag    660
taatacccat gttttcagca ttatcagaag gagccacccc acaagattta aataccatgc    720
taaacacagt ggggggacat caagcagcca tgcaaatgtt aaaagagacc atcaatgagg    780
aagctgcaga atgggataga ttgcatccag tgcatgcagg gcctattgca ccaggccaga    840
tgagagaacc aaggggaagt gacatagcag gaactactag tacccttcag gaacaaatag    900
gatggatgac acataatcca cctatcccag taggagaaat ctataaaaga tggataatcc    960
tgggattaaa taaaatagta agaatgtata gccctaccag cattctggac ataagacaag   1020
gaccaaagga accctttaga gactatgtag accgattcta taaaactcta agagccgagc   1080
aagcttcaca agaggtaaaa aattggatga cagaaacctt gttggtccaa aatgcgaacc    1140
cagattgtaa gactatttta aaagcattgg gaccaggagc gacactagaa gaaatgatga    1200
cagcatgtca gggagtgggg ggacccggcc ataaagcaag agttttgact ccacttggtg    1260
acacaactca cacatctgga acgacggatc cgctgaaagc gctggacgat gctatcgcat    1320
ctgtagacaa attccgttct tccctcggtg cggtgcaaaa ccgtctggat tccgcggtta    1380
ccaacctgaa caacaccact accaacctgt ctgaagcgca gtcccgtatt caggacgccg    1440
actatgcgac cgaagtgtcc aatatgtcga aagcgcagat catccagcag gccggtaact    1500
ccgtgttggc aaaagctaac caggtaccgc agcaggttct gtctctgctg cagggtctcg    1560
agcaccacca ccaccaccac                                                1580
<210>1
<211>1613
<212>KFD-p24 3C  DNA
<400>10
ccatggcaca agtcattaat accaacagcc tctcgctgat cactcaaaat aatatcaaca     60
agaaccagtc tgcgctgtcg agttctatcg agcgtctgtc ttctggcttg cgtattaaca    120
gcgcgaagga tgacgcagcg ggtcaggcga ttgctaaccg tttcacctct aacattaaag    180
gcctgactca ggcggcccgt aacgccaacg acggtatctc cgttgcgcag accaccgaag    240
gcgcgctgtc cgaaatcaac aacaacttac agcgtgtgcg tgaactgacg gtacaggcca    300
ctaccggtac taactctgag tctgatctgt cttctatcca ggacgaaatt aaatcccgtc    360
tggatgaaat tgaccgcgta tctggtcaga cccagttcaa cggcgtgaac gtgctggcaa    420
aaaatggctc catgaaaatc caggttggcg caaatgataa ccagactatc actatcgatc    480
tgaagcagat tgatgctaaa actcttggcc ttgatactcc acttggtgac acaactcaca    540
catctggagc tagcacacct cttggtgata ctacacacac atcaggacct atagtgcaga    600
acctccaggg gcaaatggta catcaggcca tatcacctag aactttaaat gcatgggtaa    660
aagtagtaga agagaaggct ttcagcccag aagtaatacc catgttttca gcattatcag    720
aaggagccac cccacaagat ttaaatacca tgctaaacac agtgggggga catcaagcag    780
ccatgcaaat gttaaaagag accatcaatg aggaagctgc agaatgggat agattgcatc    840
cagtgcatgc agggcctatt gcaccaggcc agatgagaga accaagggga agtgacatag    900
caggaactac tagtaccctt caggaacaaa taggatggat gacacataat ccacctatcc    960
cagtaggaga aatctataaa agatggataa tcctgggatt aaataaaata gtaagaatgt   1020
atagccctac cagcattctg gacataagac aaggaccaaa ggaacccttt agagactatg   1080
tagaccgatt ctataaaact ctaagagccg agcaagcttc acaagaggta aaaaattgga   1140
tgacagaaac cttgttggtc caaaatgcga acccagattg taagactatt ttaaaagcat   1200
tgggaccagg agcgacacta gaagaaatga tgacagcatg tcagggagtg gggggacccg   1260
gccataaagc aagagttttg actccacttg gtgacacaac tcacacatct ggaacgacgg   1320
atccgctgaa agcgctggac gatgctatcg catctgtaga caaattccgt tcttccctcg   1380
gtgcggtgca aaaccgtctg gattccgcgg ttaccaacct gaacaacacc actaccaacc   1440
tgtctgaagc gcagtcccgt attcaggacg ccgactatgc gaccgaagtg tccaatatgt   1500
cgaaagcgca gatcatccag caggccggta actccgtgtt ggcaaaagct aaccaggtac   1560
cgcagcaggt tctgtctctg ctgcagggtc tcgagcacca ccaccaccac cac          1613
<210>1
<211>1580
<212>KFD-p24 3D DNA
<400>11
ccatggcaca agtcattaat accaacagcc tctcgctgat cactcaaaat aatatcaaca     60
agaaccagtc tgcgctgtcg agttctatcg agcgtctgtc ttctggcttg cgtattaaca    120
gcgcgaagga tgacgcagcg ggtcaggcga ttgctaaccg tttcacctct aacattaaag   180
gcctgactca ggcggcccgt aacgccaacg acggtatctc cgttgcgcag accaccgaag   240
gcgcgctgtc cgaaatcaac aacaacttac agcgtgtgcg tgaactgacg gtacaggcca   300
ctaccggtac taactctgag tctgatctgt cttctatcca ggacgaaatt aaatcccgtc   360
tggatgaaat tgaccgcgta tctggtcaga cccagttcaa cggcgtgaac gtgctggcaa   420
aaaatggctc catgaaaatc caggttggcg caaatgataa ccagactatc actatcgatc   480
tgaagcagat tgatgctaaa actcttggcc ttgatactcc acttggtgac acaactcaca   540
catctggagc tagcacacct cttggtgata ctacacacac atcaggacct atagtgcaga   600
acctccaggg gcaaatggta catcaggcca tatcacctag aactttaaat gcatgggtaa   660
aagtagtaga agagaaggct ttcagcccag aagtaatacc catgttttca gcattatcag   720
aaggagccac cccacaagat ttaaatacca tgctaaacac agtgggggga catcaagcag   780
ccatgcaaat gttaaaagag accatcaatg aggaagctgc agaatgggat agattgcatc   840
cagtgcatgc agggcctatt gcaccaggcc agatgagaga accaagggga agtgacatag   900
caggaactac tagtaccctt caggaacaaa taggatggat gacacataat ccacctatcc   960
cagtaggaga aatctataaa agatggataa tcctgggatt aaataaaata gtaagaatgt  1020
atagccctac cagcattctg gacataagac aaggaccaaa ggaacccttt agagactatg  1080
tagaccgatt ctataaaact ctaagagccg agcaagcttc acaagaggta aaaaattgga  1140
tgacagaaac cttgttggtc caaaatgcga acccagattg taagactatt ttaaaagcat  1200
tgggaccagg agcgacacta gaagaaatga tgacagcatg tcagggagtg gggggacccg  1260
gccataaagc aagagttttg acgacggatc cgctgaaagc gctggacgat gctatcgcat  1320
ctgtagacaa attccgttct tccctcggtg cggtgcaaaa ccgtctggat tccgcggtta  1380
ccaacctgaa caacaccact accaacctgt ctgaagcgca gtcccgtatt caggacgccg  1440
actatgcgac cgaagtgtcc aatatgtcga aagcgcagat catccagcag gccggtaact  1500
ccgtgttggc aaaagctaac caggtaccgc agcaggttct gtctctgctg cagggtctcg  1560
agcaccacca ccaccaccac                                              1580
<210>1
<211>27
<212>KF N1(NcoI)人工序列
<400>12
ggcgtccatg gcacaagtca ttaatac    27
<210>1
<211>48
<212>KF Low-N1(BamHI)人工序列
<400>13
ggcaaggatc cgtcgtcgta gcgctagcat caaggccaag agttttag    48
<210>1
<211>27
<212>KF N2(NcoI)人工序列
<400>14
ggcgtccatg gcacaagtca ttaatac    27
<210>1
<211>75
<212>KF Low-N2(BamHI)人工序列
<400>15
tactaggatc cgtcgttcca gatgtgtgag ttgtgtcacc aagtggagtg ctagcatcaa    60
ggccaagagt tttag                                                     75
<210>1
<211>27
<212>KF N3(NcoI)人工序列
<400>16
ggcgtccatg gcacaagtca ttaatac              27
<210>1
<211>75
<212>KF Low-N3(BamHI)人工序列
<400>17
tactaggatc cgtcgtgcta gctccagatg tgtgagttgt gtcaccaagt ggagtatcaa    60
ggccaagagt tttag                                                     75
<210>1
<211>31
<212>Up p24-1(NheI)人工序列
<400>18
gcatagctag ccctatagtg cagaacctcc a         31
<210>1
<211>36
<212>Low-p24-1(BamHI)人工序列
<400>19
tatgcggatc cgtcgtcaaa actcttgctt tatggc    36
<210>1
<211>64
<212>Up p24-2(NheI)人工序列
<400>20
atcgagctag cacacctctt ggtgatacta cacacacatc aggacctata gtgcagaacc    60
tcca                                                                 64
<210>1
<211>69
<212>Low-p24-2(BamHI)人工序列
<400>21
tatgcggatc cgtcgttcca gatgtgtgag ttgtgtcacc aagtggagtc aaaactcttg    60
ctttatggc                                                            69
<210>1
<211>274
<212>PRT KFD1
<400>22
Ala Gln Val Ile Asn Thr Asn Ser Leu Ser Leu Ile Thr Gln Asn Asn
1               5                   10                  15
Ile Asn Lys Asn Gln Ser Ala Leu Ser Ser Ser Ile Glu Arg Leu Ser
            20                  25                  30
Ser Gly Leu Arg Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Gln Ala
        35                  40                  45
Ile Ala Asn Arg Phe Thr Ser Asn Ile Lys Gly Leu Thr Gln Ala Ala
    50                  55                  60
Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Val Ala Gln Thr Thr Glu Gly Ala
65                  70                  75                  80
Leu Ser Glu Ile Asn Asn Asn Leu Gln Arg Val Arg Glu Leu Thr Val
                85                  90                  95
Gln Ala Thr Thr Gly Thr Asn Ser Glu Ser Asp Leu Ser Ser Ile Gln
            100                 105                 110
Asp Glu Ile Lys Ser Arg Leu Asp Glu Ile Asp Arg Val Ser Gly Gln
        115                 120                 125
Thr Gln Phe Asn Gly Val Asn Val Leu Ala Lys Asn Gly Ser Met Lys
    130                 135                 140
Ile Gln Val Gly Ala Asn Asp Asn Gln Thr Ile Thr Ile Asp Leu Lys
145                 150                 155                 160
Gln Ile Asp Ala Lys Thr Leu Gly Leu Asp Ala Ser Ala Thr Thr Thr
                165                 170                 175
Asp Pro Leu Lys Ala Leu Asp Asp Ala Ile Ala Ser Val Asp Lys Phe
            180                 185                 190
Arg Ser Ser Leu Gly Ala Val Gln Asn Arg Leu Asp Ser Ala Val Thr
        195                 200                 205
Asn Leu Asn Asn Thr Thr Thr Asn Leu Ser Glu Ala Gln Ser Arg Ile
    210                 215                 220
Gln Asp Ala Asp Tyr Ala Thr Glu Val Ser Asn Met Ser Lys Ala Gln
225                 230                 235                 240
Ile Ile Gln Gln Ala Gly Asn Ser Val Leu Ala Lys Ala Asn Gln Val
                245                 250                 255
Pro Gln Gln Val Leu Ser Leu Leu Gln Gly Leu Glu His His His His
            260                 265                 270
His His
<210>1
<211>274
<212>PRT KFD2
<400>23
Ala Gln Val Ile Asn Thr Asn Ser Leu Ser Leu Ile Thr Gln Asn Asn
1               5                   10                  15
Ile Asn Lys Asn Gln Ser Ala Leu Ser Ser Ser Ile Glu Arg Leu Ser
            20                  25                  30
Ser Gly Leu Arg Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Gln Ala
        35                  40                  45
Ile Ala Asn Arg Phe Thr Ser Asn Ile Lys Gly Leu Thr Gln Ala Ala
    50                  55                  60
Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Val Ala Gln Thr Thr Glu Gly Ala
65                  70                  75                  80
Leu Ser Glu Ile Asn Asn Asn Leu Gln Arg Val Arg Glu Leu Thr Val
                85                  90                  95
Gln Ala Thr Thr Gly Thr Asn Ser Glu Ser Asp Leu Ser Ser Ile Gln
            100                 105                 110
Asp Glu Ile Lys Ser Arg Leu Asp Glu Ile Asp Arg Val Ser Gly Gln
        115                 120                 125
Thr Gln Phe Asn Gly Val Asn Val Leu Ala Lys Asn Gly Ser Met Lys
    130                 135                 140
Ile Gln Val Gly Ala Asn Asp Asn Gln Thr Ile Thr Ile Asp Leu Lys
145                 150                 155                 160
Gln Ile Asp Ala Lys Thr Leu Gly Leu Asp Ala Ser Thr Pro Leu Gly
                165                 170                 175
Asp Thr Thr His Thr Ser Gly Thr Thr Asp Pro Leu Lys Ala Leu Asp
            180                 185                 190
Asp Ala Ile Ala Ser Val Asp Lys Phe Arg Ser Ser Leu Gly Ala Val
        195                 200                 205
Gln Asn Arg Leu Asp Ser Ala Val Thr Asn Leu Asn Asn Thr Thr Thr
    210                 215                 220
Asn Leu Ser Glu Ala Gln Ser Arg Ile Gln Asp Ala Asp Tyr Ala Thr
225                 230                 235                 240
Glu Val Ser Asn Met Ser Lys Ala Gln Ile Ile Gln Gln Ala Gly Asn
                245                 250                 255
Ser Val Leu Ala Lys Ala Asn Gln Val Pro Gln Gln Val Leu Ser Leu
            260                 265                 270
Leu Gln Gly Leu Glu His His His His His His
        275                 280
<210>1
<211>283
<212>PRT KFD3
<400>24
Ala Gln Val Ile Asn Thr Asn Ser Leu Ser Leu Ile Thr Gln Asn Asn
1               5                  10                  15
Ile Asn Lys Asn Gln Ser Ala Leu Ser Ser Ser Ile Glu Arg Leu Ser
            20                  25                  30
Ser Gly Leu Arg Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Gln Ala
        35                  40                  45
Ile Ala Asn Arg Phe Thr Ser Asn Ile Lys Gly Leu Thr Gln Ala Ala
    50                  55                  60
Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Val Ala Gln Thr Thr Glu Gly Ala
65                  70                  75                  80
Leu Ser Glu Ile Asn Asn Asn Leu Gln Arg Val Arg Glu Leu Thr Val
                85                  90                  95
Gln Ala Thr Thr Gly Thr Asn Ser Glu Ser Asp Leu Ser Ser Ile Gln
            100                 105                 110
Asp Glu Ile Lys Ser Arg Leu Asp Glu Ile Asp Arg Val Ser Gly Gln
115                 120                 125
Thr Gln Phe Asn Gly Val Asn Val Leu Ala Lys Asn Gly Ser Met Lys
    130                 135                 140
Ile Gln Val Gly Ala Asn Asp Asn Gln Thr Ile Thr Ile Asp Leu Lys
145                 150                 155                 160
Gln Ile Asp Ala Lys Thr Leu Gly Leu Asp Thr Pro Leu Gly Asp Thr
                165                 170                 175
Thr His Thr Ser Gly Ala Ser Thr Thr Asp Pro Leu Lys Ala Leu Asp
            180                 185                 190
Asp Ala Ile Ala Ser Val Asp Lys Phe Arg Ser Ser Leu Gly Ala Val
        195                 200                 205
Gln Asn Arg Leu Asp Ser Ala Val Thr Asn Leu Asn Asn Thr Thr Thr
    210                 215                 220
Asn Leu Ser Glu Ala Gln Ser Arg Ile Gln Asp Ala Asp Tyr Ala Thr
225                 230                 235                 240
Glu Val Ser Asn Met Ser Lys Ala Gln Ile Ile Gln Gln Ala Gly Asn
                245                 250                 255
Ser Val Leu Ala Lys Ala Asn Gln Val Pro Gln Gln Val Leu Ser Leu
            260                 265                 270
Leu Gln Gly Leu Glu His His His His His His
        275                 280
<210>1
<211>503
<212>PRT KFD-p24 2A
<400>25
Ala Gln Val Ile Asn Thr Asn Ser Leu Ser Leu Ile Thr Gln Asn Asn
1               5                  10                  15
Ile Asn Lys Asn Gln Ser Ala Leu Ser Ser Ser Ile Glu Arg Leu Ser
            20                  25                  30
Ser Gly Leu Arg Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Gln Ala
        35                  40                  45
Ile Ala Asn Arg Phe Thr Ser Asn Ile Lys Gly Leu Thr Gln Ala Ala
    50                  55                  60
Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Val Ala Gln Thr Thr Glu Gly Ala
65                  70                  75                  80
Leu Ser Glu Ile Asn Asn Asn Leu Gln Arg Val Arg Glu Leu Thr Val
                85                  90                  95
Gln Ala Thr Thr Gly Thr Asn Ser Glu Ser Asp Leu Ser Ser Ile Gln
            100                 105                 110
Asp Glu Ile Lys Ser Arg Leu Asp Glu Ile Asp Arg Val Ser Gly Gln
        115                 120                 125
Thr Gln Phe Asn Gly Val Asn Val Leu Ala Lys Asn Gly Ser Met Lys
    130                 135                 140
Ile Gln Val Gly Ala Asn Asp Asn Gln Thr Ile Thr Ile Asp Leu Lys
145                 150                 155                 160
Gln Ile Asp Ala Lys Thr Leu Gly Leu Asp Ala Ser Pro Ile Val Gln
                165                 170                 175
Asn Leu Gln Gly Gln Met Val His Gln Ala Ile Ser Pro Arg Thr Leu
            180                 185                 190
Asn Ala Trp Val Lys Val Val Glu Glu Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val
        195                 200                 205
Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser Glu Gly Ala Thr Pro Gln Asp Leu
    210                 215                 220
Asn Thr Met Leu Asn Thr Val Gly Gly His Gln Ala Ala Met Gln Met
225                 230                 235                 240
Leu Lys Glu Thr Ile Asn Glu Glu Ala Ala Glu Trp Asp Arg Leu His
                245                 250                 255
Pro Val His Ala Gly Pro Ile Ala Pro Gly Gln Met Arg Glu Pro Arg
            260                 265                 270
Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr Ser Thr Leu Gln Glu Gln Ile Gly
        275                 280                 285
Trp Met Thr His Asn Pro Pro Ile Pro Val Gly Glu Ile Tyr Lys Arg
    290                 295                 300
Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys Ile Val Arg Met Tyr Ser Pro Thr
305                 310                 315                 320
Ser Ile Leu Asp Ile Arg Gln Gly Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr
                325                 330                 335
Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu Arg Ala Glu Gln Ala Ser Gln Glu
            340                 345                 350
Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr Leu Leu Val Gln Asn Ala Asn Pro
        355                 360                 365
Asp Cys Lys Thr Ile Leu Lys Ala Leu Gly Pro Gly Ala Thr Leu Glu
    370                 375                 380
Glu Met Met Thr Ala Cys Gln Gly Val Gly Gly Pro Gly His Lys Ala
385                 390                 395                 400
Arg Val Leu Thr Thr Asp Pro Leu Lys Ala Leu Asp Asp Ala Ile Ala
                405                 410                 415
Ser Val Asp Lys Phe Arg Ser Ser Leu Gly Ala Val Gln Asn Arg Leu
            420                 425                 430
Asp Ser Ala Val Thr Asn Leu Asn Asn Thr Thr Thr Asn Leu Ser Glu
        435                 440                 445
Ala Gln Ser Arg Ile Gln Asp Ala Asp Tyr Ala Thr Glu Val Ser Asn
    450                 455                 460
Met Ser Lys Ala Gln Ile Ile Gln Gln Ala Gly Asn Ser Val Leu Ala
465                 470                 475                 480
Lys Ala Asn Gln Val Pro Gln Gln Val Leu Ser Leu Leu Gln Gly Leu
                485                 490                 495
Glu His His His His His His
            500
<210>1
<211>514
<212>PRT KFD-p24 2B
<400>26
Ala Gln Val Ile Asn Thr Asn Ser Leu Ser Leu Ile Thr Gln Asn Asn
1               5                   10                  15
Ile Asn Lys Asn Gln Ser Ala Leu Ser Ser Ser Ile Glu Arg Leu Ser
            20                  25                  30
Ser Gly Leu Arg Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Gln Ala
        35                  40                  45
Ile Ala Asn Arg Phe Thr Ser Asn Ile Lys Gly Leu Thr Gln Ala Ala
    50                  55                  60
Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Val Ala Gln Thr Thr Glu Gly Ala
65                  70                  75                  80
Leu Ser Glu Ile Asn Asn Asn Leu Gln Arg Val Arg Glu Leu Thr Val
                85                  90                  95
Gln Ala Thr Thr Gly Thr Asn Ser Glu Ser Asp Leu Ser Ser Ile Gln
            100                 105                 110
Asp Glu Ile Lys Ser Arg Leu Asp Glu Ile Asp Arg Val Ser Gly Gln
        115                 120                 125
Thr Gln Phe Asn Gly Val Asn Val Leu Ala Lys Asn Gly Ser Met Lys
    130                 135                 140
Ile Gln Val Gly Ala Asn Asp Asn Gln Thr Ile Thr Ile Asp Leu Lys
145                 150                 155                 160
Gln Ile Asp Ala Lys Thr Leu Gly Leu Asp Ala Ser Pro Ile Val Gln
                165                 170                 175
Asn Leu Gln Gly Gln Met Val His Gln Ala Ile Ser Pro Arg Thr Leu
            180                 185                 190
Asn Ala Trp Val Lys Val Val Glu Glu Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val
        195                 200                 205
Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser Glu Gly Ala Thr Pro Gln Asp Leu
    210                 215                 220
Asn Thr Met Leu Asn Thr Val Gly Gly His Gln Ala Ala Met Gln Met
225                 230                 235                 240
Leu Lys Glu Thr Ile Asn Glu Glu Ala Ala Glu Trp Asp Arg Leu His
                245                 250                 255
Pro Val His Ala Gly Pro Ile Ala Pro Gly Gln Met Arg Glu Pro Arg
            260                 265                 270
Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr Ser Thr Leu Gln Glu Gln Ile Gly
        275                 280                 285
Trp Met Thr His Asn Pro Pro Ile Pro Val Gly Glu Ile Tyr Lys Arg
    290                 295                 300
Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys Ile Val Arg Met Tyr Ser Pro Thr
305                 310                 315                 320
Ser Ile Leu Asp Ile Arg Gln Gly Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr
                325                 330                 335
Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu Arg Ala Glu Gln Ala Ser Gln Glu
            340                 345                 350
Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr Leu Leu Val Gln Asn Ala Asn Pro
        355                 360                 365
Asp Cys Lys Thr Ile Leu Lys Ala Leu Gly Pro Gly Ala Thr Leu Glu
    370                 375                 380
Glu Met Met Thr Ala Cys Gln Gly Val Gly Gly Pro Gly His Lys Ala
385                 390                 395                 400
Arg Val Leu Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Ser Gly Thr Thr
                405                 410                 415
Asp Pro Leu Lys Ala Leu Asp Asp Ala Ile Ala Ser Val Asp Lys Phe
            420                 425                 430
Arg Ser Ser Leu Gly Ala Val Gln Asn Arg Leu Asp Ser Ala Val Thr
        435                 440                 445
Asn Leu Asn Asn Thr Thr Thr Asn Leu Ser Glu Ala Gln Ser Arg Ile
    450                 455                 460
Gln Asp Ala Asp Tyr Ala Thr Glu Val Ser Asn Met Ser Lys Ala Gln
465                 470                 475                 480
Ile Ile Gln Gln Ala Gly Asn Ser Val Leu Ala Lys Ala Asn Gln Val
485                 490                 495
Pro Gln Gln Val Leu Ser Leu Leu Gln Gly Leu Glu His His His His
                500                 505                 510
His His
<210>1
<211>525
<212>PRT KFD-p24 2C
<400>27
Ala Gln Val Ile Asn Thr Asn Ser Leu Ser Leu Ile Thr Gln Asn Asn
1               5                  10                  15
Ile Asn Lys Asn Gln Ser Ala Leu Ser Ser Ser Ile Glu Arg Leu Ser
            20                  25                  30
Ser Gly Leu Arg Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Gln Ala
        35                  40                  45
Ile Ala Asn Arg Phe Thr Ser Asn Ile Lys Gly Leu Thr Gln Ala Ala
    50                  55                  60
Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Val Ala Gln Thr Thr Glu Gly Ala
65                  70                  75                  80
Leu Ser Glu Ile Asn Asn Asn Leu Gln Arg Val Arg Glu Leu Thr Val
                85                  90                  95
Gln Ala Thr Thr Gly Thr Asn Ser Glu Ser Asp Leu Ser Ser Ile Gln
            100                 105                 110
Asp Glu Ile Lys Ser Arg Leu Asp Glu Ile Asp Arg Val Ser Gly Gln
        115                 120                 125
Thr Gln Phe Asn Gly Val Asn Val Leu Ala Lys Asn Gly Ser Met Lys
    130                 135                 140
Ile Gln Val Gly Ala Asn Asp Asn Gln Thr Ile Thr Ile Asp Leu Lys
145                 150                 155                 160
Gln Ile Asp Ala Lys Thr Leu Gly Leu Asp Ala Ser Thr Pro Leu Gly
                165                 170                 175
Asp Thr Thr His Thr Ser Gly Pro Ile Val Gln Asn Leu Gln Gly Gln
            180                 185                 190
Met Val His Gln Ala Ile Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys
        195                 200                 205
Val Val Glu Glu Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser
    210                 215                 220
Ala Leu Ser Glu Gly Ala Thr Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn
225                 230                 235                 240
Thr Val Gly Gly His Gln Ala Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile
                245                 250                 255
Asn Glu Glu Ala Ala Glu Trp Asp Arg Leu His Pro Val His Ala Gly
            260                 265                 270
Pro Ile Ala Pro Gly Gln Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala
        275                 280                 285
Gly Thr Thr Ser Thr Leu Gln Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr His Asn
    290                 295                 300
Pro Pro Ile Pro Val Gly Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly
305                 310                 315                 320
Leu Asn Lys Ile Val Arg Met Tyr Ser Pro Thr Ser Ile Leu Asp Ile
                325                 330                 335
Arg Gln Gly Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr
            340                 345                 350
Lys Thr Leu Arg Ala Glu Gln Ala Ser Gln Glu Val Lys Asn Trp Met
        355                 360                 365
Thr Glu Thr Leu Leu Val Gln Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile
    370                 375                 380
Leu Lys Ala Leu Gly Pro Gly Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala
385                 390                 395                 400
Cys Gln Gly Val Gly Gly Pro Gly His Lys Ala Arg Val Leu Thr Pro
                405                 410                 415
Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Ser Gly Thr Thr Asp Pro Leu Lys Ala
            420                 425                 430
Leu Asp Asp Ala Ile Ala Ser Val Asp Lys Phe Arg Ser Ser Leu Gly
        435                 440                 445
Ala Val Gln Asn Arg Leu Asp Ser Ala Val Thr Asn Leu Asn Asn Thr
    450                 455                 460
Thr Thr Asn Leu Ser Glu Ala Gln Ser Arg Ile Gln Asp Ala Asp Tyr
465                 470                 475                 480
Ala Thr Glu Val Ser Asn Met Ser Lys Ala Gln Ile Ile Gln Gln Ala
                485                 490                 495
Gly Asn Ser Val Leu Ala Lys Ala Asn Gln Val Pro Gln Gln Val Leu
            500                 505                 510
Ser Leu Leu Gln Gly Leu Glu His His His His His His
        515                 520                 525
<210>1
<211>514
<212>PRT KFD-p24 2D
<400>28
Ala Gln Val Ile Asn Thr Asn Ser Leu Ser Leu Ile Thr Gln Asn Asn
1               5                  10                  15
Ile Asn Lys Asn Gln Ser Ala Leu Ser Ser Ser Ile Glu Arg Leu Ser
            20                  25                  30
Ser Gly Leu Arg Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Gln Ala
        35                  40                  45
Ile Ala Asn Arg Phe Thr Ser Asn Ile Lys Gly Leu Thr Gln Ala Ala
    50                  55                  60
Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Val Ala Gln Thr Thr Glu Gly Ala
65                  70                  75                  80
Leu Ser Glu Ile Asn Asn Asn Leu Gln Arg Val Arg Glu Leu Thr Val
                85                  90                  95
Gln Ala Thr Thr Gly Thr Asn Ser Glu Ser Asp Leu Ser Ser Ile Gln
            100                 105                 110
Asp Glu Ile Lys Ser Arg Leu Asp Glu Ile Asp Arg Val Ser Gly Gln
        115                 120                 125
Thr Gln Phe Asn Gly Val Asn Val Leu Ala Lys Asn Gly Ser Met Lys
    130                 135                 140
Ile Gln Val Gly Ala Asn Asp Asn Gln Thr Ile Thr Ile Asp Leu Lys
145                 150                 155                 160
Gln Ile Asp Ala Lys Thr Leu Gly Leu Asp Ala Ser Thr Pro Leu Gly
                165                 170                 175
Asp Thr Thr His Thr Ser Gly Pro Ile Val Gln Asn Leu Gln Gly Gln
            180                 185                 190
Met Val His Gln Ala Ile Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys
        195                 200                 205
Val Val Glu Glu Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser
    210                 215                 220
Ala Leu Ser Glu Gly Ala Thr Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn
225                 230                 235                 240
Thr Val Gly Gly His Gln Ala Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile
                245                 250                 255
Asn Glu Glu Ala Ala Glu Trp Asp Arg Leu His Pro Val His Ala Gly
            260                 265                 270
Pro Ile Ala Pro Gly Gln Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala
        275                 280                 285
Gly Thr Thr Ser Thr Leu Gln Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr His Asn
    290                 295                 300
Pro Pro Ile Pro Val Gly Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly
305                 310                 315                 320
Leu Asn Lys Ile Val Arg Met Tyr Ser Pro Thr Ser Ile Leu Asp Ile
                325                 330                 335
Arg Gln Gly Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr
            340                 345                 350
Lys Thr Leu Arg Ala Glu Gln Ala Ser Gln Glu Val Lys Asn Trp Met
        355                 360                 365
Thr Glu Thr Leu Leu Val Gln Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile
    370                 375                 380
Leu Lys Ala Leu Gly Pro Gly Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala
385                 390                 395                 400
Cys Gln Gly Val Gly Gly Pro Gly His Lys Ala Arg Val Leu Thr Thr
                405                 410                 415
Asp Pro Leu Lys Ala Leu Asp Asp Ala Ile Ala Ser Val Asp Lys Phe
            420                 425                 430
Arg Ser Ser Leu Gly Ala Val Gln Asn Arg Leu Asp Ser Ala Val Thr
        435                 440                 445
Asn Leu Asn Asn Thr Thr Thr Asn Leu Ser Glu Ala Gln Ser Arg Ile
    450                 455                 460
Gln Asp Ala Asp Tyr Ala Thr Glu Val Ser Asn Met Ser Lys Ala Gln
465                 470                 475                 480
Ile Ile Gln Gln Ala Gly Asn Ser Val Leu Ala Lys Ala Asn Gln Val
                485                 490                 495
Pro Gln Gln Val Leu Ser Leu Leu Gln Gly Leu Glu His His His His
            500                 505                 510
His His
<210>1
<211>514
<212>PRT KFD-p24 3A
<400>29
Ala Gln Val Ile Asn Thr Asn Ser Leu Ser Leu Ile Thr Gln Asn Asn
1               5                   10                  15
Ile Asn Lys Asn Gln Ser Ala Leu Ser Ser Ser Ile Glu Arg Leu Ser
            20                  25                  30
Ser Gly Leu Arg Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Gln Ala
        35                  40                  45
Ile Ala Asn Arg Phe Thr Ser Asn Ile Lys Gly Leu Thr Gln Ala Ala
    50                  55                  60
Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Val Ala Gln Thr Thr Glu Gly Ala
65                  70                  75                  80
Leu Ser Glu Ile Asn Asn Asn Leu Gln Arg Val Arg Glu Leu Thr Val
                85                  90                  95
Gln Ala Thr Thr Gly Thr Asn Ser Glu Ser Asp Leu Ser Ser Ile Gln
            100                 105                 110
Asp Glu Ile Lys Ser Arg Leu Asp Glu Ile Asp Arg Val Ser Gly Gln
        115                 120                 125
Thr Gln Phe Asn Gly Val Asn Val Leu Ala Lys Asn Gly Ser Met Lys
    130                 135                 140
Ile Gln Val Gly Ala Asn Asp Asn Gln Thr Ile Thr Ile Asp Leu Lys
145                 150                 155                 160
Gln Ile Asp Ala Lys Thr Leu Gly Leu Asp Thr Pro Leu Gly Asp Thr
                165                 170                 175
Thr His Thr Ser Gly Ala Ser Pro Ile Val Gln Asn Leu Gln Gly Gln
            180                 185                 190
Met Val His Gln Ala Ile Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys
        195                 200                 205
Val Val Glu Glu Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser
    210                 215                 220
Ala Leu Ser Glu Gly Ala Thr Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn
225                 230                 235                 240
Thr Val Gly Gly His Gln Ala Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile
                245                 250                 255
Asn Glu Glu Ala Ala Glu Trp Asp Arg Leu His Pro Val His Ala Gly
            260                 265                 270
Pro Ile Ala Pro Gly Gln Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala
        275                 280                 285
Gly Thr Thr Ser Thr Leu Gln Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr His Asn
    290                 295                 300
Pro Pro Ile Pro Val Gly Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly
305                 310                 315                 320
Leu Asn Lys Ile Val Arg Met Tyr Ser Pro Thr Ser Ile Leu Asp Ile
                325                 330                 335
Arg Gln Gly Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr
            340                 345                 350
Lys Thr Leu Arg Ala Glu Gln Ala Ser Gln Glu Val  Lys Asn Trp Met
        355                 360                 365
Thr Glu Thr Leu Leu Val Gln Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile
    370                 375                 380
Leu Lys Ala Leu Gly Pro Gly Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala
385                 390                 395                 400
Cys Gln Gly Val Gly Gly Pro Gly His Lys Ala Arg Val Leu Thr Thr
                405                 410                 415
Asp Pro Leu Lys Ala Leu Asp Asp Ala Ile Ala Ser Val Asp Lys Phe
            420                 425                 430
Arg Ser Ser Leu Gly Ala Val Gln Asn Arg Leu Asp Ser Ala Val Thr
        435                 440                 445
Asn Leu Asn Asn Thr Thr Thr Asn Leu Ser Glu Ala Gln Ser Arg Ile
    450                 455                 460
Gln Asp Ala Asp Tyr Ala Thr Glu Val Ser Asn Met Ser Lys Ala Gln
465                 470                 475                 480
Ile Ile Gln Gln Ala Gly Asn Ser Val Leu Ala Lys Ala Asn Gln Val
                485                 490                 495
Pro Gln Gln Val Leu Ser Leu Leu Gln Gly Leu Glu His His His His
            500                 505                 510
His His
<210>1
<211>525
<212>PRT KFD-p24 3B
<400>30
Ala Gln Val Ile Asn Thr Asn Ser Leu Ser Leu Ile Thr Gln Asn Asn
1               5                   10                  15
Ile Asn Lys Asn Gln Ser Ala Leu Ser Ser Ser Ile Glu Arg Leu Ser
            20                  25                  30
Ser Gly Leu Arg Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Gln Ala
        35                  40                  45
Ile Ala Asn Arg Phe Thr Ser Asn Ile Lys Gly Leu Thr Gln Ala Ala
    50                  55                  60
Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Val Ala Gln Thr Thr Glu Gly Ala
65                  70                  75                  80
Leu Ser Glu Ile Asn Asn Asn Leu Gln Arg Val Arg Glu Leu Thr Val
                85                  90                  95
Gln Ala Thr Thr Gly Thr Asn Ser Glu Ser Asp Leu Ser Ser Ile Gln
            100                 105                 110
Asp Glu Ile Lys Ser Arg Leu Asp Glu Ile Asp Arg Val Ser Gly Gln
        115                 120                 125
Thr Gln Phe Asn Gly Val Asn Val Leu Ala Lys Asn Gly Ser Met Lys
    130                 135                 140
Ile Gln Val Gly Ala Asn Asp Asn Gln Thr Ile Thr Ile Asp Leu Lys
145                 150                 155                 160
Gln Ile Asp Ala Lys Thr Leu Gly Leu Asp Thr Pro Leu Gly Asp Thr
                165                 170                 175
Thr His Thr Ser Gly Ala Ser Pro Ile Val Gln Asn Leu Gln Gly Gln
            180                 185                 190
Met Val His Gln Ala Ile Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys
        195                 200                 205
Val Val Glu Glu Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser
    210                 215                 220
Ala Leu Ser Glu Gly Ala Thr Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn
225                 230                 235                 240
Thr Val Gly Gly His Gln Ala Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile
                245                 250                 255
Asn Glu Glu Ala Ala Glu Trp Asp Arg Leu His Pro Val His Ala Gly
            260                 265                 270
Pro Ile Ala Pro Gly Gln Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala
        275                 280                 285
Gly Thr Thr Ser Thr Leu Gln Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr His Asn
    290                 295                 300
Pro Pro Ile Pro Val Gly Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly
305                 310                 315                 320
Leu Asn Lys Ile Val Arg Met Tyr Ser Pro Thr Ser Ile Leu Asp Ile
                325                 330                 335
Arg Gln Gly Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr
            340                 345                 350
Lys Thr Leu Arg Ala Glu Gln Ala Ser Gln Glu Val Lys Asn Trp Met
        355                 360                 365
Thr Glu Thr Leu Leu Val Gln Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile
    370                 375                 380
Leu Lys Ala Leu Gly Pro Gly Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala
385                 390                 395                 400
Cys Gln Gly Val Gly Gly Pro Gly His Lys Ala Arg Val Leu Thr Pro
                405                 410                 415
Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Ser Gly Thr Thr Asp Pro Leu Lys Ala
            420                 425                 430
Leu Asp Asp Ala Ile Ala Ser Val Asp Lys Phe Arg Ser Ser Leu Gly
        435                 440                 445
Ala Val Gln Asn Arg Leu Asp Ser Ala Val Thr Asn Leu Asn Asn Thr
    450                 455                 460
Thr Thr Asn Leu Ser Glu Ala Gln Ser Arg Ile Gln Asp Ala Asp Tyr
465                 470                 475                 480
Ala Thr Glu Val Ser Asn Met Ser Lys Ala Gln Ile Ile Gln Gln Ala
                485                 490                 495
Gly Asn Ser Val Leu Ala Lys Ala Asn Gln Val Pro Gln Gln Val Leu
            500                 505                 510
Ser Leu Leu Gln Gly Leu Glu His His His His His His
        515                 520                 525
<210>1
<211>536
<212>PRT KFD-p24 3C
<400>31
Ala Gln Val Ile Asn Thr Asn Ser Leu Ser Leu Ile Thr Gln Asn Asn
1               5                   10                  15
Ile Asn Lys Asn Gln Ser Ala Leu Ser Ser Ser Ile Glu Arg Leu Ser
            20                  25                  30
Ser Gly Leu Arg Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Gln Ala
        35                  40                  45
Ile Ala Asn Arg Phe Thr Ser Asn Ile Lys Gly Leu Thr Gln Ala Ala
    50                  55                  60
Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Val Ala Gln Thr Thr Glu Gly Ala
65                  70                  75                  80
Leu Ser Glu Ile Asn Asn Asn Leu Gln Arg Val Arg Glu Leu Thr Val
                85                  90                  95
Gln Ala Thr Thr Gly Thr Asn Ser Glu Ser Asp Leu Ser Ser Ile Gln
            100                 105                 110
Asp Glu Ile Lys Ser Arg Leu Asp Glu Ile Asp Arg Val Ser Gly Gln
        115                 120                 125
Thr Gln Phe Asn Gly Val Asn Val Leu Ala Lys Asn Gly Ser Met Lys
    130                 135                 140
Ile Gln Val Gly Ala Asn Asp Asn Gln Thr Ile Thr Ile Asp Leu Lys
145                 150                 155                 160
Gln Ile Asp Ala Lys Thr Leu Gly Leu Asp Thr Pro Leu Gly Asp Thr
                165                 170                 175
Thr His Thr Ser Gly Ala Ser Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr
            180                 185                 190
Ser Gly Pro Ile Val Gln Asn Leu Gln Gly Gln Met Val His Gln Ala
        195                 200                 205
Ile Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Val Glu Glu Lys
    210                 215                 220
Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser Glu Gly
225                 230                 235                 240
Ala Thr Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr Val Gly Gly His
                245                 250                 255
Gln Ala Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile Asn Glu Glu Ala Ala
            260                 265                 270
Glu Trp Asp Arg Leu His Pro Val His Ala Gly Pro Ile Ala Pro Gly
        275                 280                 285
Gln Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr Ser Thr
    290                 295                 300
Leu Gln Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr His Asn Pro Pro Ile Pro Val
305                 310                 315                 320
Gly Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys Ile Val
                325                 330                 335
Arg Met Tyr Ser Pro Thr Ser Ile Leu Asp Ile Arg Gln Gly Pro Lys
            340                 345                 350
Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu Arg Ala
        355                 360                 365
Glu Gln Ala Ser Gln Glu Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr Leu Leu
    370                 375                 380
Val Gln Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile Leu Lys Ala Leu Gly
385                 390                 395                 400
Pro Gly Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys Gln Gly Val Gly
                405                 410                 415
Gly Pro Gly His Lys Ala Arg Val Leu Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr
            420                 425                 430
His Thr Ser Gly Thr Thr Asp Pro Leu Lys Ala Leu Asp Asp Ala Ile
        435                 440                 445
Ala Ser Val Asp Lys Phe Arg Ser Ser Leu Gly Ala Val Gln Asn Arg
    450                 455                 460
Leu Asp Ser Ala Val Thr Asn Leu Asn Asn Thr Thr Thr Asn Leu Ser
465                 470                 475                 480
Glu Ala Gln Ser Arg Ile Gln Asp Ala Asp Tyr Ala Thr Glu Val Ser
                485                 490                 495
Asn Met Ser Lys Ala Gln Ile Ile Gln Gln Ala Gly Asn Ser Val Leu
            500                 505                 510
Ala Lys Ala Asn Gln Val Pro Gln Gln Val Leu Ser Leu Leu Gln Gly
        515                 520                 525
Leu Glu His His His His His His
    530                 535
<210>1
<211>525
<212>PRT KFD-p24 3D
<400>32
Ala Gln Val Ile Asn Thr Asn Ser Leu Ser Leu Ile Thr Gln Asn Asn
1               5                   10                  15
Ile Asn Lys Asn Gln Ser Ala Leu Ser Ser Ser Ile Glu Arg Leu Ser
            20                  25                  30
Ser Gly Leu Arg Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Gln Ala
        35                  40                  45
Ile Ala Asn Arg Phe Thr Ser Asn Ile Lys Gly Leu Thr Gln Ala Ala
    50                  55                  60
Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Val Ala Gln Thr Thr Glu Gly Ala
65                  70                  75                  80
Leu Ser Glu Ile Asn Asn Asn Leu Gln Arg Val Arg Glu Leu Thr Val
                85                  90                  95
Gln Ala Thr Thr Gly Thr Asn Ser Glu Ser Asp Leu Ser Ser Ile Gln
            100                 105                 110
Asp Glu Ile Lys Ser Arg Leu Asp Glu Ile Asp Arg Val Ser Gly Gln
        115                 120                 125
Thr Gln Phe Asn Gly Val Asn Val Leu Ala Lys Asn Gly Ser Met Lys
    130                 135                 140
Ile Gln Val Gly Ala Asn Asp Asn Gln Thr Ile Thr Ile Asp Leu Lys
145                 150                 155                 160
Gln Ile Asp Ala Lys Thr Leu Gly Leu Asp Thr Pro Leu Gly Asp Thr
                165                 170                 175
Thr His Thr Ser Gly Ala Ser Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr
            180                 185                 190
Ser Gly Pro Ile Val Gln Asn Leu Gln Gly Gln Met Val His Gln Ala
        195                 200                 205
Ile Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Val Glu Glu Lys
    210                 215                 220
Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser Glu Gly
225                 230                 235                 240
Ala Thr Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr Val Gly Gly His
                245                 250                 255
Gln Ala Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile Asn Glu Glu Ala Ala
            260                 265                 270
Glu Trp Asp Arg Leu His Pro Val His Ala Gly Pro Ile Ala Pro Gly
        275                 280                 285
Gln Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr Ser Thr
    290                 295                 300
Leu Gln Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr His Asn Pro Pro Ile Pro Val
305                 310                 315                 320
Gly Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys Ile Val
                325                 330                 335
Arg Met Tyr Ser Pro Thr Ser Ile Leu Asp Ile Arg Gln Gly Pro Lys
            340                 345                 350
Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu Arg Ala
        355                 360                 365
Glu Gln Ala Ser Gln Glu Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr Leu Leu
    370                 375                 380
Val Gln Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile Leu Lys Ala Leu Gly
385                 390                 395                 400
Pro Gly Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys Gln Gly Val Gly
                405                 410                 415
Gly Pro Gly His Lys Ala Arg Val Leu Thr Thr Asp Pro Leu Lys Ala
            420                 425                 430
Leu Asp Asp Ala Ile Ala Ser Val Asp Lys Phe Arg Ser Ser Leu Gly
        435                 440                 445
Ala Val Gln Asn Arg Leu Asp Ser Ala Val Thr Asn Leu Asn Asn Thr
    450                 455                 460
Thr Thr Asn Leu Ser Glu Ala Gln Ser Arg Ile Gln Asp Ala Asp Tyr
465                 470                 475                 480
Ala Thr Glu Val Ser Asn Met Ser Lys Ala Gln Ile Ile Gln Gln Ala
                485                 490                 495
Gly Asn Ser Val Leu Ala Lys Ala Asn Gln Val Pro Gln Gln Val Leu
            500                 505                 510
Ser Leu Leu Gln Gly Leu Glu His His His His His His
        515                 520                 525

Claims (6)

1.一种改造的大肠杆菌来源的鞭毛素粘膜佐剂，其特征在于，所述鞭毛素粘膜佐剂去除了鞭毛蛋白的主要抗原活性区，并将主要抗原活性区替换为目的抗原，所述主要抗原活性区为高变区，所述高变区为鞭毛蛋白的172-406位氨基酸序列，所述鞭毛蛋白的基因序列为基因序列号ID-949101所示的序列。
2.根据权利要求1所述的鞭毛素粘膜佐剂，其特征在于，所述鞭毛素粘膜佐剂还含有柔性结构，所述柔性结构位于融合表达的蛋白之间。
3.根据权利要求2所述的鞭毛素粘膜佐剂，其特征在于，所述柔性结构为人IgG3铰链序列。
4.根据权利要求1所述的鞭毛素粘膜佐剂，其特征在于，所述目的抗原为p24抗原。
5.根据权利要求1所述的鞭毛素粘膜佐剂，其特征在于，该佐剂的
基因序列如SEQ ID:1或氨基酸序列如SEQ ID:22所示，或
基因序列如SEQ ID:2或氨基酸序列如SEQ ID:23所示，或
基因序列如SEQ ID:3或氨基酸序列如SEQ ID:24所示，或
基因序列如SEQ ID:4或氨基酸序列如SEQ ID:25所示，或
基因序列如SEQ ID:5或氨基酸序列如SEQ ID:26所示，或
基因序列如SEQ ID:6或氨基酸序列如SEQ ID:27所示，或
基因序列如SEQ ID:7或氨基酸序列如SEQ ID:28所示，或
基因序列如SEQ ID:8或氨基酸序列如SEQ ID:29所示，或
基因序列如SEQ ID:9或氨基酸序列如SEQ ID:30所示，或
基因序列如SEQ ID:10或氨基酸序列如SEQ ID:31所示，或
基因序列如SEQ ID:11或氨基酸序列如SEQ ID:32所示。
6.根据权利要求1所述的改造的大肠杆菌来源的鞭毛素粘膜佐剂的制备方法，其特征在于，去除鞭毛蛋白片段中的主要抗原活性区，并将主要抗原活性区替换为目的抗原，所述主要抗原活性区为高变区，所述高变区为鞭毛蛋白的172-406位氨基酸序列，所述鞭毛蛋白的基因序列为基因序列号ID-949101所示的序列。
CN2009101942856A 2009-11-27 2009-11-27 一种改造的非致病细菌来源的鞭毛素粘膜佐剂及制备方法 Active CN102000329B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2009101942856A CN102000329B (zh) 2009-11-27 2009-11-27 一种改造的非致病细菌来源的鞭毛素粘膜佐剂及制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2009101942856A CN102000329B (zh) 2009-11-27 2009-11-27 一种改造的非致病细菌来源的鞭毛素粘膜佐剂及制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102000329A CN102000329A (zh) 2011-04-06
CN102000329B true CN102000329B (zh) 2013-03-13

Family

ID=43808199

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2009101942856A Active CN102000329B (zh) 2009-11-27 2009-11-27 一种改造的非致病细菌来源的鞭毛素粘膜佐剂及制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN102000329B (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102816246B (zh) * 2012-09-04 2014-07-23 成都蓉生药业有限责任公司 一种人巨细胞病毒免疫原融合蛋白及其制备方法和用途
CN103041386B (zh) * 2012-11-08 2013-11-13 中国科学院海洋研究所 一种鳗弧菌重组蛋白的应用
CN103055311B (zh) * 2012-12-28 2014-05-21 中山大学 一种传染性喉气管炎粘膜疫苗及其制备方法和应用
WO2018076342A1 (en) * 2016-10-31 2018-05-03 Wuhan Sanli Biotechnology Co., Ltd. Respiratory syncytial virus vaccine
CN117582492A (zh) * 2022-08-12 2024-02-23 上海市公共卫生临床中心 重组多价疫苗

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101094685A (zh) * 2004-12-16 2007-12-26 韦克福里斯特大学健康科学院 鞭毛蛋白在鼠疫耶尔森氏菌的免疫疗法中的用途
CN101111514A (zh) * 2005-01-19 2008-01-23 法克斯因内特公司 包含病原体关联性分子模式与抗原的组合物及其刺激免疫反应的用途
WO2009002372A2 (en) * 2007-03-26 2008-12-31 The University Of Tennessee Research Foundation Prevention and treatment of gram negative, flagellated bacterial infections

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101094685A (zh) * 2004-12-16 2007-12-26 韦克福里斯特大学健康科学院 鞭毛蛋白在鼠疫耶尔森氏菌的免疫疗法中的用途
CN101111514A (zh) * 2005-01-19 2008-01-23 法克斯因内特公司 包含病原体关联性分子模式与抗原的组合物及其刺激免疫反应的用途
WO2009002372A2 (en) * 2007-03-26 2008-12-31 The University Of Tennessee Research Foundation Prevention and treatment of gram negative, flagellated bacterial infections

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
王栋等.人IgG3 上游铰链区/ p53四价功能域融合基因的构建及空间构象分析.《细胞与分子免疫学杂志》.2001, *

Also Published As

Publication number Publication date
CN102000329A (zh) 2011-04-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107602676B (zh) OspA的突变片段以及其相关方法和用途
CN102000329B (zh) 一种改造的非致病细菌来源的鞭毛素粘膜佐剂及制备方法
EA007409B1 (ru) Антигенные полипептиды стрептококков, способы их получения и применения
Yang et al. Multi-epitope schistosome vaccine candidates tested for protective immunogenicity in mice
JP2003529319A (ja) ＨＩＶ−１ｇｐ４１を標的化する広範に中和する抗体を誘発する方法
CN104844712B (zh) 肺炎链球菌蛋白抗原及其制备方法和应用
PT90727B (pt) Processo para a preparacao de uma proteina possuindo um ou mais determinantes imuno-reactivos e/ou antigenicos de um antigenio de superficie eimeria e de vacinas contra a coccidiose que a contem
CN102276730B (zh) 金黄色葡萄球菌IsdBid-TRAP融合蛋白制备方法及其应用
CN113354717B (zh) 一种新冠病毒SARS-CoV-2广谱多肽抗原及其特异性中和抗体和应用
CN108025050A (zh) 昆虫叮咬高敏症的治疗
JP2002511492A (ja) 抗 原
CN109575142B (zh) 一种cd4辅助性t细胞表位融合肽及其疫苗
EP2532363A1 (en) Use of flagellins from the genus marinobacter as vaccination adjuvants
TW202208400A (zh) 來自ｓａｒｓ–ｃｏｖ–２之保守肽抗原決定基於開發廣泛型ｃｏｖｉｄ–１９疫苗之用途
CN113234654B (zh) 一种重组枯草芽孢杆菌及其应用
KR101832610B1 (ko) 돼지 유행성 설사 바이러스 유래 수용성 재조합 항원 단백질 및 이를 포함하는 돼지 유행성 설사 예방 또는 치료용 백신 조성물
KR101652060B1 (ko) 재조합 닭 전염성 코라이자 백신 및 그 제조방법
CN111295200A (zh) 作为疫苗中的佐剂的包含合成的神经节苷脂gm3变体的纳米颗粒
ES2551699T3 (es) Composiciones, procedimientos y kits
Ferru et al. Analysis of the immune response elicited by a multiple antigen peptide (MAP) composed of two distinct protective antigens derived from the parasite Schistosoma mansoni
EP3892298A1 (en) Epitopes having sequence homology to coronavirus spike protein subunit and uses thereof
Rafati et al. Leishmania infantum: prime boost vaccination with C-terminal extension of cysteine proteinase type I displays both type 1 and 2 immune signatures in BALB/c mice
KR20200046059A (ko) 그룹 a 스트렙토코쿠스에 대한 면역원성 펩티드
KR100217809B1 (ko) 재조합 bcg 백신
US6254869B1 (en) Cryptopain vaccines, antibodies, proteins, peptides, DNA and RNA for prophylaxis, treatment and diagnosis and for detection of cryptosporidium species

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20240729

Address after: Unit E630, 5th Floor, Lecheng Plaza, Phase II, Biomedical Industry Park, No. 218 Sangtian Street, Suzhou Industrial Park, Suzhou City, Jiangsu Province 215025

Patentee after: Aloshen Biotechnology (Suzhou) Co.,Ltd.

Country or region after: China

Address before: 430071 No. 44, Middle District, little Wuchang, Wuhan, Hubei, Hongshan

Patentee before: Wuhan Institute of Virology, Chinese Academy of Sciences

Country or region before: China