JP2002511492A - 抗 原 - Google Patents
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Abstract
Description
する。
のらせん形の細菌である。世界の50%を超える人口がこの細菌を保有している
と考えられている。
胞形成細胞毒素(VacA)、および免疫的に優勢な細胞毒素関連抗原(Cag
A)の発現により特徴付けられ得る。I型株は、潰瘍または癌を有する患者にお
いて優勢であり、これらのタンパク質両方を発現するが、II型株は、どちらも
発現しない。
ば、参考文献1および2]、これには、H.pyloriのウレアーゼ、Vac
A、鞭毛タンパク質、および付着因子が含まれる。NAP(好中球活性化タンパ
ク質[3、4]として公知のタンパク質は、I型株およびII型株両方で見出さ
れ、H.pyloriマウスモデルで試験した場合に防御的であるようである[
5]。
量体複合体は環状形構造を有しており、この構造は自然に六角形準結晶構造を形
成すると提案されている。集合したタンパク質は、ヒト好中球のスフィンゴ糖脂
質レセプターと相互作用するようである[7]。
得ることが示唆されている[3]。しかし、鉄またはヘムいずれの存在も、現在
まで検出されていない。このタンパク質はまた、Na+/H+対向輸送体であると
も報告されている[8]。
中球の付着を促進する。この機能はその細胞内機能に関連していないようである
が、この親付着(proadhesive)活性は、抗血清により中和され得る
[6]。好中球の活性化および内皮細胞への付着は炎症機構を構成するので、そ
してH.oyloriは胃の炎症の原因であるので、NAPは、おそらく胃潰瘍
疾患の初期段階(このとき、胃粘膜表面で好中球の豊富な蓄積が観察される)で
、炎症の原因であるH.pyloriのまさにその要因、または一因を表すよう
であると思われる。
ており[6]、そのプロトコールには、アガロースクロマトグラフィー、分子ふ
るいおよびイオン交換クロマトグラフィーが含まれる。これにより、72%の収
量が得られる。E.coliにおける組換えNAP生成もまた報告されている[
7]。この遺伝子はプラスミドpTrxFusにクローニングされて、チオレド
キシン融合タンパク質を生成した。次いで、タンパク質が、ネイティブなタンパ
ク質と同じ方法で精製された。そのN末端チオレドキシンは、NAPの生物学的
活性に影響しないことが報告された。
Pについての需要が存在する。従って、ネイティブなNAPの精製のためのプロ
セスを提供することが、本発明の1つの目的である。このプロセスが簡単であり
、容易に拡張可能でありかつ経済的に実行可能であるべきであることが、さらな
る目的である。このプロセスが非常に純粋なタンパク質を提供すべきであること
はさらなる目的である。
ンモニウム飽和においてでさえ可溶性のままであることを、現在見出している。
濃縮するためのプロセスが存在し、このプロセスは他のタンパク質を塩析する工
程を包含する。
使用され得るが、硫酸アンモニウムを使用するのが好ましい。最終塩濃度は、好
ましくは50%飽和以上(例えば、60%、70%、80%以上)である。この
塩析工程は、好ましくは、その混合物中に存在するタンパク質の少なくとも50
%(例えば、60%、70%、80%以上)を沈殿させる。
、大多数のタンパク質が除去され、NAPの存在がかなり濃縮される。
で、さらなる濃縮に供され得る。しかし、この塩析工程で沈殿された物質を除去
するために、まずこの混合物を清澄化することが好ましい。これは、代表的には
、濾過によって、または好ましくは遠心分離によって達成される。
を利用する。任意の適切な固定化金属イオン(例えば、亜鉛、コバルト、銅)が
使用され得るが、ニッケルが好ましい。
pylori NAPの精製のためのプロセスを提供し、このプロセスは塩析工
程および金属キレートクロマトグラフィー工程を包含する。これは、NAPに関
する単純な2工程精製計画を提供する。
例えば、80%、85%、90%、95%、97%、99%以上)を形成するこ
とが意味される。
。例としては、H.pylori細菌自体、またはH.pylori NAPを
コードする遺伝子を発現する他の宿主(例えば、形質転換された細菌)が挙げら
れる。これらは、それらの細胞質成分を利用することを可能にするために、NA
P濃縮/精製の前に、好ましくは溶解または破壊される(例えば、超音波処理、
フレンチプレス、ヒューズプレス、酵素的溶解、すりつぶし、凍結/解凍など)
。
述べるものである(例えば、細菌株、ベクター、制限酵素、培養培地、温度、緩
衝液、分析方法など)。例えば、低分子量成分を除去するために、少なくとも1
つの透析工程を濃縮/精製プロセスの間に含めることが好ましい。
もまた提供される。ここで、このNAPは、H.pyloriに天然に存在する
NAPと同じ配列を有する。精製されたタンパク質または濃縮されたタンパク質
は、組換えプロセスの間または組換え発現プロセスの間に代表的に導入されるア
ミノ酸配列を有さない(例えば、ポリヒスチジンタグ、チオレドキシン融合物、
GST融合物、インテイン末端配列など)。
はワクチン)の調製のためのプロセスがさらに提供される。このプロセスには、
上記のNAPの濃縮/精製に続いて、適切な処方が含まれる。例えば、薬剤が動
物に投与されるために、このプロセスは生理学的に受容可能な緩衝液中にNAP
を処方する工程を包含し得る。免疫原性組成物またはワクチンのために、このプ
ロセスは、例えば,アジュバントの添加を含み得る。診断用薬剤のために、この
プロセスは、NAPへの検出可能な標識の添加を含み得る(例えば、放射活性標
識または蛍光標識)。これらの処方工程は、十分に当業者の能力内にある。
なNAPが提供される。
る。
メントは、以下の機能のうちの1つ以上を保持する:(a)好中球を活性化する
能力;(b)NAP特異的抗体に結合する能力(例えば、完全長NAPの1つ以
上のエピトープを保持するフラグメント)。
核酸(例えば、DNAまたはRNA)を提供する。
診断用薬剤もまた提供される。この薬剤は、好ましくは、免疫原性組成物(例え
ば、ワクチン)である。
るH.pyloriタンパク質または抗原を含む。例えば、これらの組成物は、
NAPに加えて、VacA(空胞形成細胞毒素)タンパク質および/またはCa
gA(細胞毒素関連抗原)タンパク質および/またはウレアーゼタンパク質を含
み得る。
(すなわち、感染後の疾患を処置するため)のいずれかであり得る。
容可能なキャリア」と組合せて含み、このようなキャリアは、この組成物を受け
る個体に有害な抗体の抗体の生成をそれ自体は誘導しない任意のキャリアを含む
。適切なキャリアは、代表的に大きく、ゆっくり代謝される高分子(例えば、タ
ンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ
酸コポリマー、脂質凝集体(例えば、油滴またはリポソーム)、および不活性ウ
イルス粒子)である。このようなキャリアは、当業者に周知である。さらに、こ
れらのキャリアは、免疫刺激薬剤(「アジュバント」)として機能し得る。さら
に、この抗原は、細菌性トキソイドに結合体化され得る。
らに限定されない:(1)アルミニウム塩(ミョウバン)(例えば、水酸化アル
ミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど;(2)水中油エマルジ
ョン処方物(ムラミルペプチドまたは細菌細胞壁成分のような他の特定の免疫刺
激薬剤を含むか、あるいは含まない)であって、例えば、以下のようなもの:(
a)MF59TM(WO 90/14837)(これは5%スクアレン、0.5%
TweenTM 80、および0.5% Span 85を含み(必要に応じて
種々の量のMTP−PEを含むが、欠かせないわけではない)、マイクロフリュ
ーダイザーを使用してミクロン以下の粒子へと処方されている)(b)SAF(
これは10%スクアレン、0.4% Tween 80、および5% プルロニ
ックブロックポリマーL121、およびthr−MDPを含み、微小流体化され
てミクロン以下のエマルジョンにされているか、またはボルテックスされてより
大きなサイズのエマルジョンを生成している)、ならびに(c)RibiTMアジ
ュバント系(RAS)(これは、2%スクアレン、0.2% Tween 80
、ならびに以下:モノリン脂質(monophosphorylipid)A(
MPL)、トレハロースジミコレート(TDM)、および細胞壁骨格(CWS)
からなる群由来の1つ以上の細菌細胞壁成分を含み、好ましくは、MPL+CW
S(DetoxTM)である);(3)サポニンアジュバント(例えば、Stim
ulonTMが使用され得る)またはそれらから生成された粒子(例えば、ISC
OM(免疫刺激性複合体):(4)フロイント完全アジュバントおよびフロイン
ト不完全アジュバント(CFAおよびIFA);(5)サイトカイン(例えば、
インターロイキン(例えば、IL−1、IL−2、IL−4、IL−5、IL−
6、IL−7、IL−12など)、インターフェロン(例えば、IFNγ)、マ
クロファージコロニー刺激因子(M−CSF)、腫瘍壊死因子(TNF)など)
;ならびに(6)この組成物の効力を増強する免疫刺激性薬剤として作用する他
の物質。ミョウバンおよびMF59TMが好ましい。
−アセチルムラミル−L−スレオニル−D−イソグルタミン(thr−MDP)
、N−アセチルノルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミン(nor−M
DP)、N−アセチルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミニル−L−ア
ラニン−2−(1’−2’−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ヒドロキシ
ホスホリルオキシ)−エチルアミン(MTP−PE)など。
バント)は、代表的に、希釈剤(例えば、水、生理食塩水、グリセロール、エタ
ノール、など)を含む。さらに、補助物質(例えば、湿潤剤または乳化剤、pH
緩衝化物質など)が、このようなビヒクル中に存在し得る。
たは懸濁液のいずれかとして)調製され;注射前に液体ビヒクルにおける溶液の
ために適切な固体形態または懸濁液のために適切な固体形態もまた調製され得る
。この調製物はまた、上述のように、アジュバント(adjyuvantici
ty)効果の増強のために、リポソーム中で乳化またはカプセル化され得る。
抗原性ポリペプチド、ならびに必要とされる場合は、任意の他の上述の成分を含
む。「免疫学的に有効な量」によって、個体へのこの量の投与が、単回用量でま
たは一続きのうちの一部としてのいずれであっても、処置または予防に有効であ
ることが意味される。この量は、処置される個体の健康および身体的条件、処置
される個体の分類学的群(例えば、非ヒト霊長類、霊長類など)、これらの個体
の免疫系が抗体を合成する能力、所望される防御の程度、そのワクチンの処方、
処置する医者による医学的状況の評価、ならびに他の関連の要素に依存して変化
する。この量は、慣用的試行を通じて決定され得る、比較的広い範囲にあること
が予期される。
肉内いずれかの注射により)投与される。これらはまた、粘膜表面に(例えば、
経口的にまたは経鼻的に)あるいは肺用処方物、坐剤または経皮適用の形態で投
与され得る。投薬処置は、単回用量スケジュールであってもよいし、または複数
回用量スケジュールであってもよい。このワクチンは、他の免疫調節薬剤と組合
せて投与され得る。
出し得る(あるいは、反対に、抗NAP抗体が使用されて抗原レベルを検出し得
る)。十分に規定された組換え抗原に基づく免疫アッセイが開発されて、侵襲性
の診断方法に取って代わり得る。生物学的サンプル(例えば、血液サンプルまた
は血清サンプルを含む)中のNAPに対する抗体が検出され得る。これらの免疫
アッセイの設計は、多くのバリエーションに供され、そして種々のこれらのもの
が、当該分野で公知である。この免疫アッセイに関するプロトコルは、例えば、
競合、または直接検出、またはサンドイッチ型アッセイに基づき得る。プロトコ
ールはまた、例えば、固体支持体を使用し得るし、あるいは免疫沈降によってで
あり得る。ほとんどのアッセイは、標識された抗体または標識されたポリペプチ
ドの使用を伴い;これらの標識は、例えば、蛍光分子、化学発光分子、放射活性
分子または色素分子であり得る。プローブからのシグナルを増幅するアッセイも
また公知であり;その例は、ビオチンおよびアビジンを利用するアッセイ、なら
びに酵素標識および媒介イムノアッセイ(例えば、ELISAアッセイ)である
。
された適切な試薬を含み、そして適切な物質(本発明の組成物を含む)を適切な
容器の中に、このアッセイの実施に必要な残りの試薬および物質(例えば、適切
な緩衝液、塩溶液など)、ならびにアッセイの指示書の適切なセットとともにパ
ッケージングすることにより構築される。
プロセスもまた提供され、このプロセスは、本発明に従うNAPを上記の生物学
的サンプルと接触させる工程を包含する。
に従うNAPの投与を包含する。このNAPは、好ましくはワクチン組成物の形
態である。
る[例えば、RobinsonおよびTorres(1997)Seminar
s in Immunology 9:271〜283;Donnellyら(
1997)Annu Rev Immunol 15:617〜648]。従っ
て、NAPを含むよりもむしろ、本発明のワクチンは、NAPをコードする核酸
を含み得る。
さらに提供する。このタンパク質は、本発明に従うNAPと同じ方法で使用され
得る。
および免疫学の従来技術を使用し、これらは当業者の範囲内である。このような
技術は、例えば、以下のような文献に完全に説明されている:Molecula
r Cloning;A Laboratory Manual、第2版(Sa
mbrook、1989);DNA Cloning、第I巻および第II巻(
Glover編 1985);Oligonucleotide Synthe
sis(Gait編 1984);Nucleic Acid Hybridi
zation(HamesおよびHiggins編 1984);Transc
ription and Translation(HamesおよびHigg
ins編 1984);Animal Cell Culture(Fresh
ney編 1986);Immobilized Cells and Enz
ymes(IRL Press、1986);A Practical Gui
de to Molecular Cloning(Perbal、1984)
;the Methods in Enzymologyシリーズ(Acade
mic Press、Inc.)特に第154巻および第155巻;Gene
Transfer Vectors for Mammalian Cells
(MillerおよびCalos編 1987、Cold Spring Ha
rbor Laboratory);Immunochemical Meth
ods in Cell and Molecular Biology(Ma
yerおよびWalker編、1987);Protein Purifica
tion:Principles and Practice(Scopes、
1987);Handbook of Experimental Immun
ology、第I〜IV巻(WeirおよびBlackwell編 1986)
。
から増幅した。これには、SacIおよびHindIIIの制限部位も導入した
:
2つの酵素を用いて消化しておいたプラスミドpSM214G[10]中に連結
した。このプラスミドは、E.coliとB.subtilisとの間のシャト
ル発現ベクターである。図1から理解され得るように、この組換え遺伝子は、構
成的プロモーターおよびリボソーム結合部位(これらはE.coliとB.su
btilisの両方で機能する)の制御下で発現される。
クローンをクロラムフェニコールプレート上で選択した。1つのポジティブクロ
ーンからのプラスミド(「pSM214−NAP」)を単離し、そして特徴付け
た。このクローンのグリセロールバッチを−80℃で保存した。
もまたグリセロールバッチとして−80℃で保存した。
を、4mlのLB−CAP培地(すなわち、LB培地+20μg/mlクロラム
フェニコール)中に接種し、そして37℃で14時間培養した。NAPインサー
トを含まない形質転換ベクターを含むコントロール株を増殖させた。
緩衝液中に再懸濁した。B.subtilis培養物を収集し、0.3mg/m
lリゾチームを用いて処理(37℃、30分間)し、次いで、3×SDS−PA
GEローディングサンプル緩衝液を添加した。これらのサンプルを95℃で5分
間インキュベートし、そしてSDS−PAGEにより分離し、その後、これらの
タンパク質をクマシーブルー染色およびウェスタンブロットにより分析した。こ
のブロットを、NAP−チオレドキシン融合物を用いてウサギを免疫することに
よって入手した抗血清で可視化した(図4)。
存在しない15kDaタンパク質を明らかに発現している。
5mlのLB−CAPに接種し、そして37℃で10時間インキュベートした。
次いで、5ml培養物を使用して、500ml LB−CAPを含む2リットル
フラスコに接種した。37℃で14時間の回転振盪器(250サイクル/分)上
でのインキュベーション後、これらの細胞を、4℃で6000g、20分間の遠
心分離により収集した。細胞ペレットを、超音波処理またはフレンチプレスのい
ずれかを使用して破砕した。
mlの緩衝液A(20mM Tris−HCl、pH7.8)に再懸濁した。氷
上(10分間)に次いで37℃で(7分間)のインキュベーション後、2mg/
mlのDNase I溶液(Sigma D−4263)35μlを添加した。
これらのサンプルを氷上に置き、そして粘性が消失するまで完全に超音波処理し
た(Branson sonifier450、中チップ、衝撃係数50、出力
制御5、2分間サイクル(超音波処理1分間/氷上1分間)約25回)。この溶
解物を、緩衝液Aで14mlにし、そして4℃で20000g、20分間遠心分
離した。上清(可溶性総抽出物)およびペレット(不溶性総抽出物)を分離し、
そしてすぐに使用するか、または−20℃で保存するかのいずれかを行った。
このプレス中の3つの通路により溶解した。可溶性タンパク質を、4℃で120
00g、30分間の遠心分離により収集し、そしてその上清を緩衝液Aで28m
lにした。
)は、NAPに対して惹起された血清が可溶性画分とのみ反応することを示し、
このことはNAPが完全に緩衝液Aに可溶性であることを示す。
質濃度8mg/ml(Bradford)にした。硫酸アンモニウムを最終濃度
60%飽和まで添加し、そして塩析プロセスを穏やかに撹拌しながら4℃で一晩
放置した。沈殿したタンパク質を、4℃で12000g、30分間の遠心分離に
より除去し、そして上清を緩衝液Aに対して一晩透析した。
ロースFFカラム(1×8cm)上にローディングした。このカラムを、緩衝液
A+200mM NaClで洗浄した。タンパク質溶出を、0〜40mMイミダ
ゾールの46ml直線勾配、続いて40〜100mMイミダゾールの第2の10
ml勾配(流速0.5ml/分)で実行した。次いで、25mlの100mMイ
ミダゾールで溶出を続けた。
そしてPBS緩衝液(pH7〜7.5)に対して透析した。
NAPを精製した。
の物質の方が、わずかにより純粋であるようである。デンシトメトリー分析によ
り、収量80%と評価した。
である。図7に示すように、NAPは、80%飽和においてでさえ可溶性のまま
である。このゲルのレーン4は、塩析のみで高い程度の精製が得られることを示
す。
トグラフィー(非還元、非変性)を使用して調べた。NAPを、緩衝液(25m
M Tris−HCl、150mM NaCl、pH7.8)で平衡化したSe
pharose 12 HR 10/30カラムにローディングし、そして0.
5ml/分で溶出した。そのNAPの供給源に関わらず、そのタンパク質は、酵
母のアルコールデヒドロゲナーゼ(分子量150kDa)と同じ保持時間を有す
る単一ピークで溶出した。このことは、十量体構造[6]を示す。
のRP−HPLC分析装置を備えたBeckmann LF 3000タンパク
質シークエンサーを使用して実行した。配列決定した10アミノ酸は、図1に示
す遺伝子配列から推定した10アミノ酸と同一であった。
冷したPBSで洗浄し、そして溶解緩衝液(20mM Tris−HCl、2.
5mM EDTA、0.3mg/mlリゾチーム、pH7.8)に再懸濁した。
この細胞懸濁液を、37℃で20分間インキュベートし、超音波処理し、そして
20000gで40分間遠心分離した。その上清(可溶性タンパク質)を、使用
するまで−20℃で保存した。
たNAPについての、ゲル濾過クロマトグラフィーでの保持時間は、H.pyl
ori可溶性タンパク質抽出物でのゲル濾過クロマトグラフィーでの保持時間と
同一であった。
び精神内にとどまりながら、改変がなされ得ることが理解される。
プラスミドpSM214G中にクローニングされてpSM214−NAPを生じ
た。この図はまた、この遺伝子の5’末端に隣接するプラスミドベクター中の配
列(小文字)および推定アミノ酸配列を示す。
Pのヌクレオチド配列の比較を示す。アミノ酸の差異(図3)をもたらす差異が
、残基8、58、および80(参考文献6との比較)ならびに残基8、73、9
7、101および140(参考文献8との比較。全ゲノム配列から推定)にて観
察され得る。
アミノ酸配列の比較を示す。
びウェスタンブロット(B)を示す。レーン1:形質転換された細胞からの総抽
出物;レーン2:ネガティブコントロール;レーン3:低分子量マーカー。
ェスタンブロット(B)を示す。レーン1:可溶性抽出物;レーン2:不溶性抽
出物;レーン3:低分子量マーカー。
およびウェスタンブロット(B)を示す。レーン1および2:それぞれSMS1
18株の可溶性抽出物および不溶性抽出物;レーン3および4:それぞれSMS
300株の可溶性抽出物および不溶性抽出物;レーン5:ネガティブコントロー
ル(NAPインサートを含まないpSM214で形質転換されたB.subti
lis)。
ぞれ60%飽和でのペレットおよび上清(E.coli由来);レーン3および
4:60%から80%に増加された飽和度(それぞれ、ペレットおよび上清);
レーン5:精製されたNAP;レーン6:マーカー。
精製された物質を含む;レーン5〜7はB.subtilis(SMS118)
から精製された物質を含む。左から右に、これらのレーンは、それぞれ1μg、
2μgおよび3μgのタンパク質を含む。レーン4および8はマーカーである。
Claims (10)
- 【請求項1】 タンパク質の混合物中のH.pylori NAPの存在を
濃縮するプロセスであって、該プロセスは、他のタンパク質を塩析する工程であ
って最終塩濃度が少なくとも50%飽和である、工程を包含する、プロセス。 - 【請求項2】 請求項1に記載のプロセスであって、金属キレートクロマト
グラフィーの工程をさらに包含する、プロセス。 - 【請求項3】 請求項2に記載のプロセスであって、前記金属がニッケルで
ある、プロセス。 - 【請求項4】 タンパク質混合物からのH.pylori NAPの精製の
ためのプロセスであって、該プロセスは塩析の工程および金属キレートクロマト
グラフィーの工程を包含する、プロセス。 - 【請求項5】 請求項1〜4のいずれかに記載のプロセスであって、ここで
前記NAPが組換え宿主により産生され、そして該NAPがH.pylori中
に天然に存在するNAPと同じ配列を有する、プロセス。 - 【請求項6】 診断用薬剤または治療用薬剤の調製のためのプロセスであっ
て、該プロセスは、請求項1〜5のいずれかに記載のプロセスに続いて適切な処
方の工程を包含する、プロセス。 - 【請求項7】 請求項6に記載のプロセスであって、ここで前記治療用薬剤
がワクチンであり、そして前記処方が前記NAPを生理学的に受容可能な緩衝液
および/またはアジュバントと混合する工程を包含する、プロセス。 - 【請求項8】 請求項1〜7のいずれか1つに記載のプロセスに従って入手
可能である、NAP。 - 【請求項9】 請求項8に記載のNAPであって、請求項5に記載のプロセ
スに従って、入手可能である、NAP。 - 【請求項10】 純粋なNAP。
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