JP2002511492A

JP2002511492A - 抗原

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Publication number: JP2002511492A
Application number: JP2000543824A
Authority: JP
Inventors: グイドグランディ，
Original assignee: カイロンエセ．ピー．アー．
Priority date: 1998-04-08
Filing date: 1999-04-07
Publication date: 2002-04-16
Anticipated expiration: 2019-04-07
Also published as: US7038012B1; DE69940595D1; GB9807721D0; EP1068522A1; AU3048999A; JP2005097311A; WO1999053310A1; ATE426159T1; ES2322213T3; CA2326413C; EP1068522B1; CA2326413A1; PT1068522E; JP3626684B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、タンパク質混合物中のＨ．ｐｙｌｏｒｉのＮＡＰの存在を濃縮するプロセスに関する。このプロセスは、他のタンパク質を塩析する工程を包含する。ＮＡＰは、濃度８０％以上の硫酸アンモニウムに可溶性のままであることが見出された。このプロセスは、好ましくは、金属キレートクロマトグラフィーのさらなる工程を包含する。塩析および金属キレートクロマトグラフィーの組合せにより、非常に純粋なＮＡＰが生じる。このＮＡＰは、好ましくは、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉに天然に存在するＮＡＰと同じ配列を有し、そして組換えタンパク質生成に代表的に関係する配列が存在しない。本発明のプロセスおよびＮＡＰは、診断用および治療用の、製品およびプロセスに使用され得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、ＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉのＮＡＰタンパク質に関
する。

【０００２】（背景）Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉは、ヒトの胃に感染するグラム陰性
のらせん形の細菌である。世界の５０％を超える人口がこの細菌を保有している
と考えられている。

【０００３】Ｈ．ｐｙｌｏｒｉの臨床単離株は、上皮細胞における空胞の形成を誘導する空
胞形成細胞毒素（ＶａｃＡ）、および免疫的に優勢な細胞毒素関連抗原（Ｃａｇ
Ａ）の発現により特徴付けられ得る。Ｉ型株は、潰瘍または癌を有する患者にお
いて優勢であり、これらのタンパク質両方を発現するが、ＩＩ型株は、どちらも
発現しない。

【０００４】種々の抗原性タンパク質が、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉに関して記載されており［例え
ば、参考文献１および２］、これには、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉのウレアーゼ、Ｖａｃ
Ａ、鞭毛タンパク質、および付着因子が含まれる。ＮＡＰ（好中球活性化タンパ
ク質［３、４］として公知のタンパク質は、Ｉ型株およびＩＩ型株両方で見出さ
れ、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉマウスモデルで試験した場合に防御的であるようである［
５］。

【０００５】ＮＡＰは、１５ｋＤａサブユニットのホモ十量体であり［６］、そしてこの多
量体複合体は環状形構造を有しており、この構造は自然に六角形準結晶構造を形
成すると提案されている。集合したタンパク質は、ヒト好中球のスフィンゴ糖脂
質レセプターと相互作用するようである［７］。

【０００６】バクテリオフェリチンとの相同性に基づいて、ＮＡＰは鉄緩衝液として作用し
得ることが示唆されている［３］。しかし、鉄またはヘムいずれの存在も、現在
まで検出されていない。このタンパク質はまた、Ｎａ⁺／Ｈ⁺対向輸送体であると
も報告されている［８］。

【０００７】その名前が示唆するように、ＮＡＰは、好中球の活性化および内皮細胞への好
中球の付着を促進する。この機能はその細胞内機能に関連していないようである
が、この親付着（ｐｒｏａｄｈｅｓｉｖｅ）活性は、抗血清により中和され得る
［６］。好中球の活性化および内皮細胞への付着は炎症機構を構成するので、そ
してＨ．ｏｙｌｏｒｉは胃の炎症の原因であるので、ＮＡＰは、おそらく胃潰瘍
疾患の初期段階（このとき、胃粘膜表面で好中球の豊富な蓄積が観察される）で
、炎症の原因であるＨ．ｐｙｌｏｒｉのまさにその要因、または一因を表すよう
であると思われる。

【０００８】Ｈ．ｐｙｌｏｒｉからのＮＡＰ十量体の精製のためのプロトコールが記載され
ており［６］、そのプロトコールには、アガロースクロマトグラフィー、分子ふ
るいおよびイオン交換クロマトグラフィーが含まれる。これにより、７２％の収
量が得られる。Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換えＮＡＰ生成もまた報告されている［
７］。この遺伝子はプラスミドｐＴｒｘＦｕｓにクローニングされて、チオレド
キシン融合タンパク質を生成した。次いで、タンパク質が、ネイティブなタンパ
ク質と同じ方法で精製された。そのＮ末端チオレドキシンは、ＮＡＰの生物学的
活性に影響しないことが報告された。

【０００９】しかし、クローニング人工産物、融合ドメインなどが存在しない、純粋なＮＡ
Ｐについての需要が存在する。従って、ネイティブなＮＡＰの精製のためのプロ
セスを提供することが、本発明の１つの目的である。このプロセスが簡単であり
、容易に拡張可能でありかつ経済的に実行可能であるべきであることが、さらな
る目的である。このプロセスが非常に純粋なタンパク質を提供すべきであること
はさらなる目的である。

【００１０】本発明者らは、ＮＡＰが驚くべきほど高い水溶性を有しており、８０％硫酸ア
ンモニウム飽和においてでさえ可溶性のままであることを、現在見出している。

【００１１】（発明の説明）本発明に従って、タンパク質の混合物中でＨ．ｐｙｌｏｒｉＮＡＰの存在を
濃縮するためのプロセスが存在し、このプロセスは他のタンパク質を塩析する工
程を包含する。

【００１２】この塩析工程は、大部分のＮＡＰを可溶形態のままにする。任意の適切な塩が
使用され得るが、硫酸アンモニウムを使用するのが好ましい。最終塩濃度は、好
ましくは５０％飽和以上（例えば、６０％、７０％、８０％以上）である。この
塩析工程は、好ましくは、その混合物中に存在するタンパク質の少なくとも５０
％（例えば、６０％、７０％、８０％以上）を沈殿させる。

【００１３】ＮＡＰのこの驚くべきほどの高い溶解性が原因で、この塩析工程のみによって
、大多数のタンパク質が除去され、ＮＡＰの存在がかなり濃縮される。

【００１４】得られた可溶性タンパク質の混合物は、ＮＡＰについて濃縮されており、次い
で、さらなる濃縮に供され得る。しかし、この塩析工程で沈殿された物質を除去
するために、まずこの混合物を清澄化することが好ましい。これは、代表的には
、濾過によって、または好ましくは遠心分離によって達成される。

【００１５】さらなる濃縮のための適切な工程は、金属キレートクロマトグラフィー［９］
を利用する。任意の適切な固定化金属イオン（例えば、亜鉛、コバルト、銅）が
使用され得るが、ニッケルが好ましい。

【００１６】従って、好ましい実施態様において、本発明は、タンパク質混合物からのＨ．
ｐｙｌｏｒｉＮＡＰの精製のためのプロセスを提供し、このプロセスは塩析工
程および金属キレートクロマトグラフィー工程を包含する。これは、ＮＡＰに関
する単純な２工程精製計画を提供する。

【００１７】「精製」によって、ＮＡＰが、生じる混合物の少なくとも７５％（重量で）（
例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％以上）を形成するこ
とが意味される。

【００１８】このタンパク質混合物は、ＮＡＰタンパク質の任意の適切な供給源であり得る
。例としては、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ細菌自体、またはＨ．ｐｙｌｏｒｉＮＡＰを
コードする遺伝子を発現する他の宿主（例えば、形質転換された細菌）が挙げら
れる。これらは、それらの細胞質成分を利用することを可能にするために、ＮＡ
Ｐ濃縮／精製の前に、好ましくは溶解または破壊される（例えば、超音波処理、
フレンチプレス、ヒューズプレス、酵素的溶解、すりつぶし、凍結／解凍など）
。

【００１９】本発明のプロセスを実行するための好ましい条件及び試薬は、以下の実施例に
述べるものである（例えば、細菌株、ベクター、制限酵素、培養培地、温度、緩
衝液、分析方法など）。例えば、低分子量成分を除去するために、少なくとも１
つの透析工程を濃縮／精製プロセスの間に含めることが好ましい。

【００２０】本発明に従って、組換え宿主からのＮＡＰの濃縮または精製のためのプロセス
もまた提供される。ここで、このＮＡＰは、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉに天然に存在する
ＮＡＰと同じ配列を有する。精製されたタンパク質または濃縮されたタンパク質
は、組換えプロセスの間または組換え発現プロセスの間に代表的に導入されるア
ミノ酸配列を有さない（例えば、ポリヒスチジンタグ、チオレドキシン融合物、
ＧＳＴ融合物、インテイン末端配列など）。

【００２１】本発明に従って、診断用薬剤または治療用薬剤（例えば、免疫原性組成物また
はワクチン）の調製のためのプロセスがさらに提供される。このプロセスには、
上記のＮＡＰの濃縮／精製に続いて、適切な処方が含まれる。例えば、薬剤が動
物に投与されるために、このプロセスは生理学的に受容可能な緩衝液中にＮＡＰ
を処方する工程を包含し得る。免疫原性組成物またはワクチンのために、このプ
ロセスは、例えば，アジュバントの添加を含み得る。診断用薬剤のために、この
プロセスは、ＮＡＰへの検出可能な標識の添加を含み得る（例えば、放射活性標
識または蛍光標識）。これらの処方工程は、十分に当業者の能力内にある。

【００２２】本発明のさらなる局面に従って、上記のプロセスのいずれかに従って入手可能
なＮＡＰが提供される。

【００２３】図３で配列番号２として示されるアミノ酸配列を有するＮＡＰもまた提供され
る。

【００２４】さらに、本発明は、本発明に従うＮＡＰのフラグメントを提供し、このフラグ
メントは、以下の機能のうちの１つ以上を保持する：（ａ）好中球を活性化する
能力；（ｂ）ＮＡＰ特異的抗体に結合する能力（例えば、完全長ＮＡＰの１つ以
上のエピトープを保持するフラグメント）。

【００２５】さらに、本発明は、上記ＮＡＰまたは上記ＮＡＰのフラグメントをコードする
核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を提供する。

【００２６】本発明に従うＮＡＰ（またはＮＡＰのフラグメント）を含む治療用薬剤または
診断用薬剤もまた提供される。この薬剤は、好ましくは、免疫原性組成物（例え
ば、ワクチン）である。

【００２７】好ましい実施態様において、本発明の診断用薬剤または治療用薬剤は、さらな
るＨ．ｐｙｌｏｒｉタンパク質または抗原を含む。例えば、これらの組成物は、
ＮＡＰに加えて、ＶａｃＡ（空胞形成細胞毒素）タンパク質および／またはＣａ
ｇＡ（細胞毒素関連抗原）タンパク質および／またはウレアーゼタンパク質を含
み得る。

【００２８】本発明に従うワクチンは、予防用（すなわち、感染を防ぐため）または治療用
（すなわち、感染後の疾患を処置するため）のいずれかであり得る。

【００２９】このようなワクチンは、１つの抗原または複数の抗原を、通常は「薬学的に受
容可能なキャリア」と組合せて含み、このようなキャリアは、この組成物を受け
る個体に有害な抗体の抗体の生成をそれ自体は誘導しない任意のキャリアを含む
。適切なキャリアは、代表的に大きく、ゆっくり代謝される高分子（例えば、タ
ンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ
酸コポリマー、脂質凝集体（例えば、油滴またはリポソーム）、および不活性ウ
イルス粒子）である。このようなキャリアは、当業者に周知である。さらに、こ
れらのキャリアは、免疫刺激薬剤（「アジュバント」）として機能し得る。さら
に、この抗原は、細菌性トキソイドに結合体化され得る。

【００３０】この組成物の有効性を増強する好ましいアジュバントは、以下を含むが、これ
らに限定されない：（１）アルミニウム塩（ミョウバン）（例えば、水酸化アル
ミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど；（２）水中油エマルジ
ョン処方物（ムラミルペプチドまたは細菌細胞壁成分のような他の特定の免疫刺
激薬剤を含むか、あるいは含まない）であって、例えば、以下のようなもの：（
ａ）ＭＦ５９^TM（ＷＯ９０／１４８３７）（これは５％スクアレン、０．５％
Ｔｗｅｅｎ^TM ８０、および０．５％Ｓｐａｎ８５を含み（必要に応じて
種々の量のＭＴＰ−ＰＥを含むが、欠かせないわけではない）、マイクロフリュ
ーダイザーを使用してミクロン以下の粒子へと処方されている）（ｂ）ＳＡＦ（
これは１０％スクアレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、および５％プルロニ
ックブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含み、微小流体化され
てミクロン以下のエマルジョンにされているか、またはボルテックスされてより
大きなサイズのエマルジョンを生成している）、ならびに（ｃ）Ｒｉｂｉ^TMアジ
ュバント系（ＲＡＳ）（これは、２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０
、ならびに以下：モノリン脂質（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｉｐｉｄ）Ａ（
ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）
からなる群由来の１つ以上の細菌細胞壁成分を含み、好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷ
Ｓ（Ｄｅｔｏｘ^TM）である）；（３）サポニンアジュバント（例えば、Ｓｔｉｍ
ｕｌｏｎ^TMが使用され得る）またはそれらから生成された粒子（例えば、ＩＳＣ
ＯＭ（免疫刺激性複合体）：（４）フロイント完全アジュバントおよびフロイン
ト不完全アジュバント（ＣＦＡおよびＩＦＡ）；（５）サイトカイン（例えば、
インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−
６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２など）、インターフェロン（例えば、ＩＦＮγ）、マ
クロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）など）
；ならびに（６）この組成物の効力を増強する免疫刺激性薬剤として作用する他
の物質。ミョウバンおよびＭＦ５９^TMが好ましい。

【００３１】上記のように、ムラミルペプチドは以下を含むが、これらに限定されない：Ｎ
−アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）
、Ｎ−アセチルノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−Ｍ
ＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−ア
ラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシ
ホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）など。

【００３２】免疫原性組成物（例えば、抗原、薬学的に受容可能なキャリア、およびアジュ
バント）は、代表的に、希釈剤（例えば、水、生理食塩水、グリセロール、エタ
ノール、など）を含む。さらに、補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ
緩衝化物質など）が、このようなビヒクル中に存在し得る。

【００３３】代表的には、これらの免疫原性組成物は、注射可能なものとして（液体溶液ま
たは懸濁液のいずれかとして）調製され；注射前に液体ビヒクルにおける溶液の
ために適切な固体形態または懸濁液のために適切な固体形態もまた調製され得る
。この調製物はまた、上述のように、アジュバント（ａｄｊｙｕｖａｎｔｉｃｉ
ｔｙ）効果の増強のために、リポソーム中で乳化またはカプセル化され得る。

【００３４】ワクチンとして使用される免疫原性組成物は、免疫学的に有効な量のこれらの
抗原性ポリペプチド、ならびに必要とされる場合は、任意の他の上述の成分を含
む。「免疫学的に有効な量」によって、個体へのこの量の投与が、単回用量でま
たは一続きのうちの一部としてのいずれであっても、処置または予防に有効であ
ることが意味される。この量は、処置される個体の健康および身体的条件、処置
される個体の分類学的群（例えば、非ヒト霊長類、霊長類など）、これらの個体
の免疫系が抗体を合成する能力、所望される防御の程度、そのワクチンの処方、
処置する医者による医学的状況の評価、ならびに他の関連の要素に依存して変化
する。この量は、慣用的試行を通じて決定され得る、比較的広い範囲にあること
が予期される。

【００３５】これらの免疫原性組成物は、従来のように非経口的に（例えば、皮下または筋
肉内いずれかの注射により）投与される。これらはまた、粘膜表面に（例えば、
経口的にまたは経鼻的に）あるいは肺用処方物、坐剤または経皮適用の形態で投
与され得る。投薬処置は、単回用量スケジュールであってもよいし、または複数
回用量スケジュールであってもよい。このワクチンは、他の免疫調節薬剤と組合
せて投与され得る。

【００３６】本発明に従うＮＡＰはまた、免疫アッセイにおいて使用されて抗体レベルを検
出し得る（あるいは、反対に、抗ＮＡＰ抗体が使用されて抗原レベルを検出し得
る）。十分に規定された組換え抗原に基づく免疫アッセイが開発されて、侵襲性
の診断方法に取って代わり得る。生物学的サンプル（例えば、血液サンプルまた
は血清サンプルを含む）中のＮＡＰに対する抗体が検出され得る。これらの免疫
アッセイの設計は、多くのバリエーションに供され、そして種々のこれらのもの
が、当該分野で公知である。この免疫アッセイに関するプロトコルは、例えば、
競合、または直接検出、またはサンドイッチ型アッセイに基づき得る。プロトコ
ールはまた、例えば、固体支持体を使用し得るし、あるいは免疫沈降によってで
あり得る。ほとんどのアッセイは、標識された抗体または標識されたポリペプチ
ドの使用を伴い；これらの標識は、例えば、蛍光分子、化学発光分子、放射活性
分子または色素分子であり得る。プローブからのシグナルを増幅するアッセイも
また公知であり；その例は、ビオチンおよびアビジンを利用するアッセイ、なら
びに酵素標識および媒介イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ）である
。

【００３７】本発明はまた、免疫診断に適切なキットも提供する。これらのキットは、標識
された適切な試薬を含み、そして適切な物質（本発明の組成物を含む）を適切な
容器の中に、このアッセイの実施に必要な残りの試薬および物質（例えば、適切
な緩衝液、塩溶液など）、ならびにアッセイの指示書の適切なセットとともにパ
ッケージングすることにより構築される。

【００３８】本発明に従って、生物学的サンプル中のＮＡＰに対する抗体を検出するための
プロセスもまた提供され、このプロセスは、本発明に従うＮＡＰを上記の生物学
的サンプルと接触させる工程を包含する。

【００３９】本発明に従って、動物を免疫する方法がさらに提供され、この方法は、本発明
に従うＮＡＰの投与を包含する。このＮＡＰは、好ましくはワクチン組成物の形
態である。

【００４０】タンパク質に基づくワクチンの代替として、ＤＮＡワクチン接種が使用され得
る［例えば、ＲｏｂｉｎｓｏｎおよびＴｏｒｒｅｓ（１９９７）Ｓｅｍｉｎａｒ
ｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ９：２７１〜２８３；Ｄｏｎｎｅｌｌｙら（
１９９７）ＡｎｎｕＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ１５：６１７〜６４８］。従っ
て、ＮＡＰを含むよりもむしろ、本発明のワクチンは、ＮＡＰをコードする核酸
を含み得る。

【００４１】本発明は、配列番号２として図３に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を
さらに提供する。このタンパク質は、本発明に従うＮＡＰと同じ方法で使用され
得る。

【００４２】（実施例）本発明の実施は、他に示されない限り、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ
および免疫学の従来技術を使用し、これらは当業者の範囲内である。このような
技術は、例えば、以下のような文献に完全に説明されている：Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒＣｌｏｎｉｎｇ；ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、第２版（Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋ、１９８９）；ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ、第Ｉ巻および第ＩＩ巻（
Ｇｌｏｖｅｒ編１９８５）；ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅ
ｓｉｓ（Ｇａｉｔ編１９８４）；ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＨｙｂｒｉｄｉ
ｚａｔｉｏｎ（ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ編１９８４）；Ｔｒａｎｓｃ
ｒｉｐｔｉｏｎａｎｄＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇ
ｉｎｓ編１９８４）；ＡｎｉｍａｌＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅ（Ｆｒｅｓｈ
ｎｅｙ編１９８６）；ＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄＣｅｌｌｓａｎｄＥｎｚ
ｙｍｅｓ（ＩＲＬＰｒｅｓｓ、１９８６）；ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＧｕｉ
ｄｅｔｏＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ（Ｐｅｒｂａｌ、１９８４）
；ｔｈｅＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙシリーズ（Ａｃａｄｅ
ｍｉｃＰｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．）特に第１５４巻および第１５５巻；Ｇｅｎｅ
ＴｒａｎｓｆｅｒＶｅｃｔｏｒｓｆｏｒＭａｍｍａｌｉａｎＣｅｌｌｓ
（ＭｉｌｌｅｒおよびＣａｌｏｓ編１９８７、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａ
ｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）；ＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌＭｅｔｈ
ｏｄｓｉｎＣｅｌｌａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（Ｍａ
ｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編、１９８７）；ＰｒｏｔｅｉｎＰｕｒｉｆｉｃａ
ｔｉｏｎ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ（Ｓｃｏｐｅｓ、
１９８７）；ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｙ、第Ｉ〜ＩＶ巻（ＷｅｉｒおよびＢｌａｃｋｗｅｌｌ編１９８６）
。

【００４３】（ＮＡＰをコードする遺伝子のクローニング）図１に示す遺伝子を、以下のＰＣＲプライマーを使用して、ＣＣＵＧの染色体
から増幅した。これには、ＳａｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩの制限部位も導入した
：

【００４４】

【化１】この増幅産物を、ＳｃａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化し、そして同じ
２つの酵素を用いて消化しておいたプラスミドｐＳＭ２１４Ｇ［１０］中に連結
した。このプラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉとＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓとの間のシャト
ル発現ベクターである。図１から理解され得るように、この組換え遺伝子は、構
成的プロモーターおよびリボソーム結合部位（これらはＥ．ｃｏｌｉとＢ．ｓｕ
ｂｔｉｌｉｓの両方で機能する）の制御下で発現される。

【００４５】連結したプラスミドを使用してＥ．ｃｏｌｉを形質転換し、そしてポジティブ
クローンをクロラムフェニコールプレート上で選択した。１つのポジティブクロ
ーンからのプラスミド（「ｐＳＭ２１４−ＮＡＰ」）を単離し、そして特徴付け
た。このクローンのグリセロールバッチを−８０℃で保存した。

【００４６】さらに、このプラスミドを使用してＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓを形質転換し、これ
もまたグリセロールバッチとして−８０℃で保存した。

【００４７】（予備発現分析）形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ株またはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株の単一コロニー
を、４ｍｌのＬＢ−ＣＡＰ培地（すなわち、ＬＢ培地＋２０μｇ／ｍｌクロラム
フェニコール）中に接種し、そして３７℃で１４時間培養した。ＮＡＰインサー
トを含まない形質転換ベクターを含むコントロール株を増殖させた。

【００４８】Ｅ．ｃｏｌｉ培養物を収集し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングサンプル
緩衝液中に再懸濁した。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ培養物を収集し、０．３ｍｇ／ｍ
ｌリゾチームを用いて処理（３７℃、３０分間）し、次いで、３×ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥローディングサンプル緩衝液を添加した。これらのサンプルを９５℃で５分
間インキュベートし、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、その後、これらの
タンパク質をクマシーブルー染色およびウェスタンブロットにより分析した。こ
のブロットを、ＮＡＰ−チオレドキシン融合物を用いてウサギを免疫することに
よって入手した抗血清で可視化した（図４）。

【００４９】形質転換された細菌は、ウサギ抗血清により示されるように、非形質転換株に
存在しない１５ｋＤａタンパク質を明らかに発現している。

【００５０】（細胞培養および溶菌）形質転換されたＥ．ｃｏｌｉまたはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの単一コロニーを、
５ｍｌのＬＢ−ＣＡＰに接種し、そして３７℃で１０時間インキュベートした。
次いで、５ｍｌ培養物を使用して、５００ｍｌＬＢ−ＣＡＰを含む２リットル
フラスコに接種した。３７℃で１４時間の回転振盪器（２５０サイクル／分）上
でのインキュベーション後、これらの細胞を、４℃で６０００ｇ、２０分間の遠
心分離により収集した。細胞ペレットを、超音波処理またはフレンチプレスのい
ずれかを使用して破砕した。

【００５１】超音波処理について、ペレットを、０．３ｍｇ／ｍｌリゾチームを補充した８
ｍｌの緩衝液Ａ（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８）に再懸濁した。氷
上（１０分間）に次いで３７℃で（７分間）のインキュベーション後、２ｍｇ／
ｍｌのＤＮａｓｅＩ溶液（ＳｉｇｍａＤ−４２６３）３５μｌを添加した。
これらのサンプルを氷上に置き、そして粘性が消失するまで完全に超音波処理し
た（Ｂｒａｎｓｏｎｓｏｎｉｆｉｅｒ４５０、中チップ、衝撃係数５０、出力
制御５、２分間サイクル（超音波処理１分間／氷上１分間）約２５回）。この溶
解物を、緩衝液Ａで１４ｍｌにし、そして４℃で２００００ｇ、２０分間遠心分
離した。上清（可溶性総抽出物）およびペレット（不溶性総抽出物）を分離し、
そしてすぐに使用するか、または−２０℃で保存するかのいずれかを行った。

【００５２】フレンチプレス破砕について、細胞を１５ｍｌの緩衝液Ａに再懸濁し、そして
このプレス中の３つの通路により溶解した。可溶性タンパク質を、４℃で１２０
００ｇ、３０分間の遠心分離により収集し、そしてその上清を緩衝液Ａで２８ｍ
ｌにした。

【００５３】可溶性総抽出物および不溶性総抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図５および６
）は、ＮＡＰに対して惹起された血清が可溶性画分とのみ反応することを示し、
このことはＮＡＰが完全に緩衝液Ａに可溶性であることを示す。

【００５４】（タンパク質の精製）Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ総可溶性タンパク質を、緩衝液Ａで希釈し、総タンパク
質濃度８ｍｇ／ｍｌ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）にした。硫酸アンモニウムを最終濃度
６０％飽和まで添加し、そして塩析プロセスを穏やかに撹拌しながら４℃で一晩
放置した。沈殿したタンパク質を、４℃で１２０００ｇ、３０分間の遠心分離に
より除去し、そして上清を緩衝液Ａに対して一晩透析した。

【００５５】透析された溶液を、緩衝液Ａで平衡化されたニッケル活性化キレート化セファ
ロースＦＦカラム（１×８ｃｍ）上にローディングした。このカラムを、緩衝液
Ａ＋２００ｍＭＮａＣｌで洗浄した。タンパク質溶出を、０〜４０ｍＭイミダ
ゾールの４６ｍｌ直線勾配、続いて４０〜１００ｍＭイミダゾールの第２の１０
ｍｌ勾配（流速０．５ｍｌ／分）で実行した。次いで、２５ｍｌの１００ｍＭイ
ミダゾールで溶出を続けた。

【００５６】画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、そしてＮＡＰを含む画分をプールし、
そしてＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７〜７．５）に対して透析した。

【００５７】塩析手順に８０％飽和を使用したことを除いて、同じ方法でＥ．ｃｏｌｉから
ＮＡＰを精製した。

【００５８】（純度）１リットルの培養物からの、精製の結果は以下である：

【００５９】

【表１】純度の表示は、クマシーブルー染色によって、図８に示す。Ｅ．ｃｏｌｉ由来
の物質の方が、わずかにより純粋であるようである。デンシトメトリー分析によ
り、収量８０％と評価した。

【００６０】（塩析）ＮＡＰは、非常に高濃度の硫酸アンモニウムにおいてでさえ可溶性であるよう
である。図７に示すように、ＮＡＰは、８０％飽和においてでさえ可溶性のまま
である。このゲルのレーン４は、塩析のみで高い程度の精製が得られることを示
す。

【００６１】（多量体アセンブリー）精製されたＮＡＰが多量体形態へとアセンブルする能力を、サイズ排除クロマ
トグラフィー（非還元、非変性）を使用して調べた。ＮＡＰを、緩衝液（２５ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．８）で平衡化したＳｅ
ｐｈａｒｏｓｅ１２ＨＲ１０／３０カラムにローディングし、そして０．
５ｍｌ／分で溶出した。そのＮＡＰの供給源に関わらず、そのタンパク質は、酵
母のアルコールデヒドロゲナーゼ（分子量１５０ｋＤａ）と同じ保持時間を有す
る単一ピークで溶出した。このことは、十量体構造［６］を示す。

【００６２】（Ｎ末端配列決定）精製されたＮＡＰのＮ末端配列決定を、オンライン接続されたＰＴＨアミノ酸
のＲＰ−ＨＰＬＣ分析装置を備えたＢｅｃｋｍａｎｎＬＦ３０００タンパク
質シークエンサーを使用して実行した。配列決定した１０アミノ酸は、図１に示
す遺伝子配列から推定した１０アミノ酸と同一であった。

【００６３】（天然タンパク質との比較）Ｈ．ｐｙｌｏｒｉＣＣＵＧ細胞を、血液寒天プレートの表面から収集し、氷
冷したＰＢＳで洗浄し、そして溶解緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２．
５ｍＭＥＤＴＡ、０．３ｍｇ／ｍｌリゾチーム、ｐＨ７．８）に再懸濁した。
この細胞懸濁液を、３７℃で２０分間インキュベートし、超音波処理し、そして
２００００ｇで４０分間遠心分離した。その上清（可溶性タンパク質）を、使用
するまで−２０℃で保存した。

【００６４】Ｅ．ｃｏｌｉから精製されたＮＡＰまたはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓから精製され
たＮＡＰについての、ゲル濾過クロマトグラフィーでの保持時間は、Ｈ．ｐｙｌ
ｏｒｉ可溶性タンパク質抽出物でのゲル濾過クロマトグラフィーでの保持時間と
同一であった。

【００６５】本発明は、上記に例示のみのために記載されており、そして本発明の範囲およ
び精神内にとどまりながら、改変がなされ得ることが理解される。

【００６６】（参考文献）

【００６７】

【表２】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ＣＣＵＧ株のＮＡＰをコードする遺伝子の完全配列を示す。これは、
プラスミドｐＳＭ２１４Ｇ中にクローニングされてｐＳＭ２１４−ＮＡＰを生じ
た。この図はまた、この遺伝子の５’末端に隣接するプラスミドベクター中の配
列（小文字）および推定アミノ酸配列を示す。

【図２】図２は、参考文献６および８中のヌクレオチド配列とのクローン化されたＮＡ
Ｐのヌクレオチド配列の比較を示す。アミノ酸の差異（図３）をもたらす差異が
、残基８、５８、および８０（参考文献６との比較）ならびに残基８、７３、９
７、１０１および１４０（参考文献８との比較。全ゲノム配列から推定）にて観
察され得る。

【図３】図３は、参考文献６および８中のアミノ酸配列とのクローン化されたＮＡＰの
アミノ酸配列の比較を示す。

【図４】図４は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来の総細胞タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ）およ
びウェスタンブロット（Ｂ）を示す。レーン１：形質転換された細胞からの総抽
出物；レーン２：ネガティブコントロール；レーン３：低分子量マーカー。

【図５】図５は、形質転換されたＥ．ｃｏｌｉのＰｏｉｎｃｅａｕ染色（Ａ）およびウ
ェスタンブロット（Ｂ）を示す。レーン１：可溶性抽出物；レーン２：不溶性抽
出物；レーン３：低分子量マーカー。

【図６】図６は、形質転換されたＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのＰｏｉｎｃｅａｕ染色（Ａ）
およびウェスタンブロット（Ｂ）を示す。レーン１および２：それぞれＳＭＳ１
１８株の可溶性抽出物および不溶性抽出物；レーン３および４：それぞれＳＭＳ
３００株の可溶性抽出物および不溶性抽出物；レーン５：ネガティブコントロー
ル（ＮＡＰインサートを含まないｐＳＭ２１４で形質転換されたＢ．ｓｕｂｔｉ
ｌｉｓ）。

【図７】図７は、硫酸アンモニウムによる塩析の効果を示す。レーン１および２：それ
ぞれ６０％飽和でのペレットおよび上清（Ｅ．ｃｏｌｉ由来）；レーン３および
４：６０％から８０％に増加された飽和度（それぞれ、ペレットおよび上清）；
レーン５：精製されたＮＡＰ；レーン６：マーカー。

【図８】図８は、最終ＮＡＰ生成物の純度を示す。レーン１〜３は、Ｅ．ｃｏｌｉから
精製された物質を含む；レーン５〜７はＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＳＭＳ１１８）
から精製された物質を含む。左から右に、これらのレーンは、それぞれ１μｇ、
２μｇおよび３μｇのタンパク質を含む。レーン４および８はマーカーである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】タンパク質の混合物中のＨ．ｐｙｌｏｒｉＮＡＰの存在を
濃縮するプロセスであって、該プロセスは、他のタンパク質を塩析する工程であ
って最終塩濃度が少なくとも５０％飽和である、工程を包含する、プロセス。
【請求項２】請求項１に記載のプロセスであって、金属キレートクロマト
グラフィーの工程をさらに包含する、プロセス。
【請求項３】請求項２に記載のプロセスであって、前記金属がニッケルで
ある、プロセス。
【請求項４】タンパク質混合物からのＨ．ｐｙｌｏｒｉＮＡＰの精製の
ためのプロセスであって、該プロセスは塩析の工程および金属キレートクロマト
グラフィーの工程を包含する、プロセス。
【請求項５】請求項１〜４のいずれかに記載のプロセスであって、ここで
前記ＮＡＰが組換え宿主により産生され、そして該ＮＡＰがＨ．ｐｙｌｏｒｉ中
に天然に存在するＮＡＰと同じ配列を有する、プロセス。
【請求項６】診断用薬剤または治療用薬剤の調製のためのプロセスであっ
て、該プロセスは、請求項１〜５のいずれかに記載のプロセスに続いて適切な処
方の工程を包含する、プロセス。
【請求項７】請求項６に記載のプロセスであって、ここで前記治療用薬剤
がワクチンであり、そして前記処方が前記ＮＡＰを生理学的に受容可能な緩衝液
および／またはアジュバントと混合する工程を包含する、プロセス。
【請求項８】請求項１〜７のいずれか１つに記載のプロセスに従って入手
可能である、ＮＡＰ。
【請求項９】請求項８に記載のＮＡＰであって、請求項５に記載のプロセ
スに従って、入手可能である、ＮＡＰ。
【請求項１０】純粋なＮＡＰ。