JP2002511492A - 抗 原 - Google Patents

抗 原

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、タンパク質混合物中のH.pyloriのNAPの存在を濃縮するプロセスに関する。このプロセスは、他のタンパク質を塩析する工程を包含する。NAPは、濃度80%以上の硫酸アンモニウムに可溶性のままであることが見出された。このプロセスは、好ましくは、金属キレートクロマトグラフィーのさらなる工程を包含する。塩析および金属キレートクロマトグラフィーの組合せにより、非常に純粋なNAPが生じる。このNAPは、好ましくは、H.pyloriに天然に存在するNAPと同じ配列を有し、そして組換えタンパク質生成に代表的に関係する配列が存在しない。本発明のプロセスおよびNAPは、診断用および治療用の、製品およびプロセスに使用され得る。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】 本発明は、Helicobacter pyloriのNAPタンパク質に関
する。
【0002】 (背景) Helicobacter pyloriは、ヒトの胃に感染するグラム陰性
のらせん形の細菌である。世界の50%を超える人口がこの細菌を保有している
と考えられている。
【0003】 H.pyloriの臨床単離株は、上皮細胞における空胞の形成を誘導する空
胞形成細胞毒素(VacA)、および免疫的に優勢な細胞毒素関連抗原(Cag
A)の発現により特徴付けられ得る。I型株は、潰瘍または癌を有する患者にお
いて優勢であり、これらのタンパク質両方を発現するが、II型株は、どちらも
発現しない。
【0004】 種々の抗原性タンパク質が、H.pyloriに関して記載されており[例え
ば、参考文献1および2]、これには、H.pyloriのウレアーゼ、Vac
A、鞭毛タンパク質、および付着因子が含まれる。NAP(好中球活性化タンパ
ク質[3、4]として公知のタンパク質は、I型株およびII型株両方で見出さ
れ、H.pyloriマウスモデルで試験した場合に防御的であるようである[
5]。
【0005】 NAPは、15kDaサブユニットのホモ十量体であり[6]、そしてこの多
量体複合体は環状形構造を有しており、この構造は自然に六角形準結晶構造を形
成すると提案されている。集合したタンパク質は、ヒト好中球のスフィンゴ糖脂
質レセプターと相互作用するようである[7]。
【0006】 バクテリオフェリチンとの相同性に基づいて、NAPは鉄緩衝液として作用し
得ることが示唆されている[3]。しかし、鉄またはヘムいずれの存在も、現在
まで検出されていない。このタンパク質はまた、Na+/H+対向輸送体であると
も報告されている[8]。
【0007】 その名前が示唆するように、NAPは、好中球の活性化および内皮細胞への好
中球の付着を促進する。この機能はその細胞内機能に関連していないようである
が、この親付着(proadhesive)活性は、抗血清により中和され得る
[6]。好中球の活性化および内皮細胞への付着は炎症機構を構成するので、そ
してH.oyloriは胃の炎症の原因であるので、NAPは、おそらく胃潰瘍
疾患の初期段階(このとき、胃粘膜表面で好中球の豊富な蓄積が観察される)で
、炎症の原因であるH.pyloriのまさにその要因、または一因を表すよう
であると思われる。
【0008】 H.pyloriからのNAP十量体の精製のためのプロトコールが記載され
ており[6]、そのプロトコールには、アガロースクロマトグラフィー、分子ふ
るいおよびイオン交換クロマトグラフィーが含まれる。これにより、72%の収
量が得られる。E.coliにおける組換えNAP生成もまた報告されている[
7]。この遺伝子はプラスミドpTrxFusにクローニングされて、チオレド
キシン融合タンパク質を生成した。次いで、タンパク質が、ネイティブなタンパ
ク質と同じ方法で精製された。そのN末端チオレドキシンは、NAPの生物学的
活性に影響しないことが報告された。
【0009】 しかし、クローニング人工産物、融合ドメインなどが存在しない、純粋なNA
Pについての需要が存在する。従って、ネイティブなNAPの精製のためのプロ
セスを提供することが、本発明の1つの目的である。このプロセスが簡単であり
、容易に拡張可能でありかつ経済的に実行可能であるべきであることが、さらな
る目的である。このプロセスが非常に純粋なタンパク質を提供すべきであること
はさらなる目的である。
【0010】 本発明者らは、NAPが驚くべきほど高い水溶性を有しており、80%硫酸ア
ンモニウム飽和においてでさえ可溶性のままであることを、現在見出している。
【0011】 (発明の説明) 本発明に従って、タンパク質の混合物中でH.pylori NAPの存在を
濃縮するためのプロセスが存在し、このプロセスは他のタンパク質を塩析する工
程を包含する。
【0012】 この塩析工程は、大部分のNAPを可溶形態のままにする。任意の適切な塩が
使用され得るが、硫酸アンモニウムを使用するのが好ましい。最終塩濃度は、好
ましくは50%飽和以上(例えば、60%、70%、80%以上)である。この
塩析工程は、好ましくは、その混合物中に存在するタンパク質の少なくとも50
%(例えば、60%、70%、80%以上)を沈殿させる。
【0013】 NAPのこの驚くべきほどの高い溶解性が原因で、この塩析工程のみによって
、大多数のタンパク質が除去され、NAPの存在がかなり濃縮される。
【0014】 得られた可溶性タンパク質の混合物は、NAPについて濃縮されており、次い
で、さらなる濃縮に供され得る。しかし、この塩析工程で沈殿された物質を除去
するために、まずこの混合物を清澄化することが好ましい。これは、代表的には
、濾過によって、または好ましくは遠心分離によって達成される。
【0015】 さらなる濃縮のための適切な工程は、金属キレートクロマトグラフィー[9]
を利用する。任意の適切な固定化金属イオン(例えば、亜鉛、コバルト、銅)が
使用され得るが、ニッケルが好ましい。
【0016】 従って、好ましい実施態様において、本発明は、タンパク質混合物からのH.
pylori NAPの精製のためのプロセスを提供し、このプロセスは塩析工
程および金属キレートクロマトグラフィー工程を包含する。これは、NAPに関
する単純な2工程精製計画を提供する。
【0017】 「精製」によって、NAPが、生じる混合物の少なくとも75%(重量で)(
例えば、80%、85%、90%、95%、97%、99%以上)を形成するこ
とが意味される。
【0018】 このタンパク質混合物は、NAPタンパク質の任意の適切な供給源であり得る
。例としては、H.pylori細菌自体、またはH.pylori NAPを
コードする遺伝子を発現する他の宿主(例えば、形質転換された細菌)が挙げら
れる。これらは、それらの細胞質成分を利用することを可能にするために、NA
P濃縮/精製の前に、好ましくは溶解または破壊される(例えば、超音波処理、
フレンチプレス、ヒューズプレス、酵素的溶解、すりつぶし、凍結/解凍など)
【0019】 本発明のプロセスを実行するための好ましい条件及び試薬は、以下の実施例に
述べるものである(例えば、細菌株、ベクター、制限酵素、培養培地、温度、緩
衝液、分析方法など)。例えば、低分子量成分を除去するために、少なくとも1
つの透析工程を濃縮/精製プロセスの間に含めることが好ましい。
【0020】 本発明に従って、組換え宿主からのNAPの濃縮または精製のためのプロセス
もまた提供される。ここで、このNAPは、H.pyloriに天然に存在する
NAPと同じ配列を有する。精製されたタンパク質または濃縮されたタンパク質
は、組換えプロセスの間または組換え発現プロセスの間に代表的に導入されるア
ミノ酸配列を有さない(例えば、ポリヒスチジンタグ、チオレドキシン融合物、
GST融合物、インテイン末端配列など)。
【0021】 本発明に従って、診断用薬剤または治療用薬剤(例えば、免疫原性組成物また
はワクチン)の調製のためのプロセスがさらに提供される。このプロセスには、
上記のNAPの濃縮/精製に続いて、適切な処方が含まれる。例えば、薬剤が動
物に投与されるために、このプロセスは生理学的に受容可能な緩衝液中にNAP
を処方する工程を包含し得る。免疫原性組成物またはワクチンのために、このプ
ロセスは、例えば,アジュバントの添加を含み得る。診断用薬剤のために、この
プロセスは、NAPへの検出可能な標識の添加を含み得る(例えば、放射活性標
識または蛍光標識)。これらの処方工程は、十分に当業者の能力内にある。
【0022】 本発明のさらなる局面に従って、上記のプロセスのいずれかに従って入手可能
なNAPが提供される。
【0023】 図3で配列番号2として示されるアミノ酸配列を有するNAPもまた提供され
る。
【0024】 さらに、本発明は、本発明に従うNAPのフラグメントを提供し、このフラグ
メントは、以下の機能のうちの1つ以上を保持する:(a)好中球を活性化する
能力;(b)NAP特異的抗体に結合する能力(例えば、完全長NAPの1つ以
上のエピトープを保持するフラグメント)。
【0025】 さらに、本発明は、上記NAPまたは上記NAPのフラグメントをコードする
核酸(例えば、DNAまたはRNA)を提供する。
【0026】 本発明に従うNAP(またはNAPのフラグメント)を含む治療用薬剤または
診断用薬剤もまた提供される。この薬剤は、好ましくは、免疫原性組成物(例え
ば、ワクチン)である。
【0027】 好ましい実施態様において、本発明の診断用薬剤または治療用薬剤は、さらな
るH.pyloriタンパク質または抗原を含む。例えば、これらの組成物は、
NAPに加えて、VacA(空胞形成細胞毒素)タンパク質および/またはCa
gA(細胞毒素関連抗原)タンパク質および/またはウレアーゼタンパク質を含
み得る。
【0028】 本発明に従うワクチンは、予防用(すなわち、感染を防ぐため)または治療用
(すなわち、感染後の疾患を処置するため)のいずれかであり得る。
【0029】 このようなワクチンは、1つの抗原または複数の抗原を、通常は「薬学的に受
容可能なキャリア」と組合せて含み、このようなキャリアは、この組成物を受け
る個体に有害な抗体の抗体の生成をそれ自体は誘導しない任意のキャリアを含む
。適切なキャリアは、代表的に大きく、ゆっくり代謝される高分子(例えば、タ
ンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ
酸コポリマー、脂質凝集体(例えば、油滴またはリポソーム)、および不活性ウ
イルス粒子)である。このようなキャリアは、当業者に周知である。さらに、こ
れらのキャリアは、免疫刺激薬剤(「アジュバント」)として機能し得る。さら
に、この抗原は、細菌性トキソイドに結合体化され得る。
【0030】 この組成物の有効性を増強する好ましいアジュバントは、以下を含むが、これ
らに限定されない:(1)アルミニウム塩(ミョウバン)(例えば、水酸化アル
ミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど;(2)水中油エマルジ
ョン処方物(ムラミルペプチドまたは細菌細胞壁成分のような他の特定の免疫刺
激薬剤を含むか、あるいは含まない)であって、例えば、以下のようなもの:(
a)MF59TM(WO 90/14837)(これは5%スクアレン、0.5%
TweenTM 80、および0.5% Span 85を含み(必要に応じて
種々の量のMTP−PEを含むが、欠かせないわけではない)、マイクロフリュ
ーダイザーを使用してミクロン以下の粒子へと処方されている)(b)SAF(
これは10%スクアレン、0.4% Tween 80、および5% プルロニ
ックブロックポリマーL121、およびthr−MDPを含み、微小流体化され
てミクロン以下のエマルジョンにされているか、またはボルテックスされてより
大きなサイズのエマルジョンを生成している)、ならびに(c)RibiTMアジ
ュバント系(RAS)(これは、2%スクアレン、0.2% Tween 80
、ならびに以下:モノリン脂質(monophosphorylipid)A(
MPL)、トレハロースジミコレート(TDM)、および細胞壁骨格(CWS)
からなる群由来の1つ以上の細菌細胞壁成分を含み、好ましくは、MPL+CW
S(DetoxTM)である);(3)サポニンアジュバント(例えば、Stim
ulonTMが使用され得る)またはそれらから生成された粒子(例えば、ISC
OM(免疫刺激性複合体):(4)フロイント完全アジュバントおよびフロイン
ト不完全アジュバント(CFAおよびIFA);(5)サイトカイン(例えば、
インターロイキン(例えば、IL−1、IL−2、IL−4、IL−5、IL−
6、IL−7、IL−12など)、インターフェロン(例えば、IFNγ)、マ
クロファージコロニー刺激因子(M−CSF)、腫瘍壊死因子(TNF)など)
;ならびに(6)この組成物の効力を増強する免疫刺激性薬剤として作用する他
の物質。ミョウバンおよびMF59TMが好ましい。
【0031】 上記のように、ムラミルペプチドは以下を含むが、これらに限定されない:N
−アセチルムラミル−L−スレオニル−D−イソグルタミン(thr−MDP)
、N−アセチルノルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミン(nor−M
DP)、N−アセチルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミニル−L−ア
ラニン−2−(1’−2’−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ヒドロキシ
ホスホリルオキシ)−エチルアミン(MTP−PE)など。
【0032】 免疫原性組成物(例えば、抗原、薬学的に受容可能なキャリア、およびアジュ
バント)は、代表的に、希釈剤(例えば、水、生理食塩水、グリセロール、エタ
ノール、など)を含む。さらに、補助物質(例えば、湿潤剤または乳化剤、pH
緩衝化物質など)が、このようなビヒクル中に存在し得る。
【0033】 代表的には、これらの免疫原性組成物は、注射可能なものとして(液体溶液ま
たは懸濁液のいずれかとして)調製され;注射前に液体ビヒクルにおける溶液の
ために適切な固体形態または懸濁液のために適切な固体形態もまた調製され得る
。この調製物はまた、上述のように、アジュバント(adjyuvantici
ty)効果の増強のために、リポソーム中で乳化またはカプセル化され得る。
【0034】 ワクチンとして使用される免疫原性組成物は、免疫学的に有効な量のこれらの
抗原性ポリペプチド、ならびに必要とされる場合は、任意の他の上述の成分を含
む。「免疫学的に有効な量」によって、個体へのこの量の投与が、単回用量でま
たは一続きのうちの一部としてのいずれであっても、処置または予防に有効であ
ることが意味される。この量は、処置される個体の健康および身体的条件、処置
される個体の分類学的群(例えば、非ヒト霊長類、霊長類など)、これらの個体
の免疫系が抗体を合成する能力、所望される防御の程度、そのワクチンの処方、
処置する医者による医学的状況の評価、ならびに他の関連の要素に依存して変化
する。この量は、慣用的試行を通じて決定され得る、比較的広い範囲にあること
が予期される。
【0035】 これらの免疫原性組成物は、従来のように非経口的に(例えば、皮下または筋
肉内いずれかの注射により)投与される。これらはまた、粘膜表面に(例えば、
経口的にまたは経鼻的に)あるいは肺用処方物、坐剤または経皮適用の形態で投
与され得る。投薬処置は、単回用量スケジュールであってもよいし、または複数
回用量スケジュールであってもよい。このワクチンは、他の免疫調節薬剤と組合
せて投与され得る。
【0036】 本発明に従うNAPはまた、免疫アッセイにおいて使用されて抗体レベルを検
出し得る(あるいは、反対に、抗NAP抗体が使用されて抗原レベルを検出し得
る)。十分に規定された組換え抗原に基づく免疫アッセイが開発されて、侵襲性
の診断方法に取って代わり得る。生物学的サンプル(例えば、血液サンプルまた
は血清サンプルを含む)中のNAPに対する抗体が検出され得る。これらの免疫
アッセイの設計は、多くのバリエーションに供され、そして種々のこれらのもの
が、当該分野で公知である。この免疫アッセイに関するプロトコルは、例えば、
競合、または直接検出、またはサンドイッチ型アッセイに基づき得る。プロトコ
ールはまた、例えば、固体支持体を使用し得るし、あるいは免疫沈降によってで
あり得る。ほとんどのアッセイは、標識された抗体または標識されたポリペプチ
ドの使用を伴い;これらの標識は、例えば、蛍光分子、化学発光分子、放射活性
分子または色素分子であり得る。プローブからのシグナルを増幅するアッセイも
また公知であり;その例は、ビオチンおよびアビジンを利用するアッセイ、なら
びに酵素標識および媒介イムノアッセイ(例えば、ELISAアッセイ)である
【0037】 本発明はまた、免疫診断に適切なキットも提供する。これらのキットは、標識
された適切な試薬を含み、そして適切な物質(本発明の組成物を含む)を適切な
容器の中に、このアッセイの実施に必要な残りの試薬および物質(例えば、適切
な緩衝液、塩溶液など)、ならびにアッセイの指示書の適切なセットとともにパ
ッケージングすることにより構築される。
【0038】 本発明に従って、生物学的サンプル中のNAPに対する抗体を検出するための
プロセスもまた提供され、このプロセスは、本発明に従うNAPを上記の生物学
的サンプルと接触させる工程を包含する。
【0039】 本発明に従って、動物を免疫する方法がさらに提供され、この方法は、本発明
に従うNAPの投与を包含する。このNAPは、好ましくはワクチン組成物の形
態である。
【0040】 タンパク質に基づくワクチンの代替として、DNAワクチン接種が使用され得
る[例えば、RobinsonおよびTorres(1997)Seminar
s in Immunology 9:271〜283;Donnellyら(
1997)Annu Rev Immunol 15:617〜648]。従っ
て、NAPを含むよりもむしろ、本発明のワクチンは、NAPをコードする核酸
を含み得る。
【0041】 本発明は、配列番号2として図3に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を
さらに提供する。このタンパク質は、本発明に従うNAPと同じ方法で使用され
得る。
【0042】 (実施例) 本発明の実施は、他に示されない限り、分子生物学、微生物学、組換えDNA
および免疫学の従来技術を使用し、これらは当業者の範囲内である。このような
技術は、例えば、以下のような文献に完全に説明されている:Molecula
r Cloning;A Laboratory Manual、第2版(Sa
mbrook、1989);DNA Cloning、第I巻および第II巻(
Glover編 1985);Oligonucleotide Synthe
sis(Gait編 1984);Nucleic Acid Hybridi
zation(HamesおよびHiggins編 1984);Transc
ription and Translation(HamesおよびHigg
ins編 1984);Animal Cell Culture(Fresh
ney編 1986);Immobilized Cells and Enz
ymes(IRL Press、1986);A Practical Gui
de to Molecular Cloning(Perbal、1984)
;the Methods in Enzymologyシリーズ(Acade
mic Press、Inc.)特に第154巻および第155巻;Gene
Transfer Vectors for Mammalian Cells
(MillerおよびCalos編 1987、Cold Spring Ha
rbor Laboratory);Immunochemical Meth
ods in Cell and Molecular Biology(Ma
yerおよびWalker編、1987);Protein Purifica
tion:Principles and Practice(Scopes、
1987);Handbook of Experimental Immun
ology、第I〜IV巻(WeirおよびBlackwell編 1986)
【0043】 (NAPをコードする遺伝子のクローニング) 図1に示す遺伝子を、以下のPCRプライマーを使用して、CCUGの染色体
から増幅した。これには、SacIおよびHindIIIの制限部位も導入した
【0044】
【化1】 この増幅産物を、ScaIおよびHindIIIを用いて消化し、そして同じ
2つの酵素を用いて消化しておいたプラスミドpSM214G[10]中に連結
した。このプラスミドは、E.coliとB.subtilisとの間のシャト
ル発現ベクターである。図1から理解され得るように、この組換え遺伝子は、構
成的プロモーターおよびリボソーム結合部位(これらはE.coliとB.su
btilisの両方で機能する)の制御下で発現される。
【0045】 連結したプラスミドを使用してE.coliを形質転換し、そしてポジティブ
クローンをクロラムフェニコールプレート上で選択した。1つのポジティブクロ
ーンからのプラスミド(「pSM214−NAP」)を単離し、そして特徴付け
た。このクローンのグリセロールバッチを−80℃で保存した。
【0046】 さらに、このプラスミドを使用してB.subtilisを形質転換し、これ
もまたグリセロールバッチとして−80℃で保存した。
【0047】 (予備発現分析) 形質転換されたE.coli株またはB.subtilis株の単一コロニー
を、4mlのLB−CAP培地(すなわち、LB培地+20μg/mlクロラム
フェニコール)中に接種し、そして37℃で14時間培養した。NAPインサー
トを含まない形質転換ベクターを含むコントロール株を増殖させた。
【0048】 E.coli培養物を収集し、そしてSDS−PAGEローディングサンプル
緩衝液中に再懸濁した。B.subtilis培養物を収集し、0.3mg/m
lリゾチームを用いて処理(37℃、30分間)し、次いで、3×SDS−PA
GEローディングサンプル緩衝液を添加した。これらのサンプルを95℃で5分
間インキュベートし、そしてSDS−PAGEにより分離し、その後、これらの
タンパク質をクマシーブルー染色およびウェスタンブロットにより分析した。こ
のブロットを、NAP−チオレドキシン融合物を用いてウサギを免疫することに
よって入手した抗血清で可視化した(図4)。
【0049】 形質転換された細菌は、ウサギ抗血清により示されるように、非形質転換株に
存在しない15kDaタンパク質を明らかに発現している。
【0050】 (細胞培養および溶菌) 形質転換されたE.coliまたはB.subtilisの単一コロニーを、
5mlのLB−CAPに接種し、そして37℃で10時間インキュベートした。
次いで、5ml培養物を使用して、500ml LB−CAPを含む2リットル
フラスコに接種した。37℃で14時間の回転振盪器(250サイクル/分)上
でのインキュベーション後、これらの細胞を、4℃で6000g、20分間の遠
心分離により収集した。細胞ペレットを、超音波処理またはフレンチプレスのい
ずれかを使用して破砕した。
【0051】 超音波処理について、ペレットを、0.3mg/mlリゾチームを補充した8
mlの緩衝液A(20mM Tris−HCl、pH7.8)に再懸濁した。氷
上(10分間)に次いで37℃で(7分間)のインキュベーション後、2mg/
mlのDNase I溶液(Sigma D−4263)35μlを添加した。
これらのサンプルを氷上に置き、そして粘性が消失するまで完全に超音波処理し
た(Branson sonifier450、中チップ、衝撃係数50、出力
制御5、2分間サイクル(超音波処理1分間/氷上1分間)約25回)。この溶
解物を、緩衝液Aで14mlにし、そして4℃で20000g、20分間遠心分
離した。上清(可溶性総抽出物)およびペレット(不溶性総抽出物)を分離し、
そしてすぐに使用するか、または−20℃で保存するかのいずれかを行った。
【0052】 フレンチプレス破砕について、細胞を15mlの緩衝液Aに再懸濁し、そして
このプレス中の3つの通路により溶解した。可溶性タンパク質を、4℃で120
00g、30分間の遠心分離により収集し、そしてその上清を緩衝液Aで28m
lにした。
【0053】 可溶性総抽出物および不溶性総抽出物のSDS−PAGE分析(図5および6
)は、NAPに対して惹起された血清が可溶性画分とのみ反応することを示し、
このことはNAPが完全に緩衝液Aに可溶性であることを示す。
【0054】 (タンパク質の精製) B.subtilis総可溶性タンパク質を、緩衝液Aで希釈し、総タンパク
質濃度8mg/ml(Bradford)にした。硫酸アンモニウムを最終濃度
60%飽和まで添加し、そして塩析プロセスを穏やかに撹拌しながら4℃で一晩
放置した。沈殿したタンパク質を、4℃で12000g、30分間の遠心分離に
より除去し、そして上清を緩衝液Aに対して一晩透析した。
【0055】 透析された溶液を、緩衝液Aで平衡化されたニッケル活性化キレート化セファ
ロースFFカラム(1×8cm)上にローディングした。このカラムを、緩衝液
A+200mM NaClで洗浄した。タンパク質溶出を、0〜40mMイミダ
ゾールの46ml直線勾配、続いて40〜100mMイミダゾールの第2の10
ml勾配(流速0.5ml/分)で実行した。次いで、25mlの100mMイ
ミダゾールで溶出を続けた。
【0056】 画分をSDS−PAGEにより分析し、そしてNAPを含む画分をプールし、
そしてPBS緩衝液(pH7〜7.5)に対して透析した。
【0057】 塩析手順に80%飽和を使用したことを除いて、同じ方法でE.coliから
NAPを精製した。
【0058】 (純度) 1リットルの培養物からの、精製の結果は以下である:
【0059】
【表1】 純度の表示は、クマシーブルー染色によって、図8に示す。E.coli由来
の物質の方が、わずかにより純粋であるようである。デンシトメトリー分析によ
り、収量80%と評価した。
【0060】 (塩析) NAPは、非常に高濃度の硫酸アンモニウムにおいてでさえ可溶性であるよう
である。図7に示すように、NAPは、80%飽和においてでさえ可溶性のまま
である。このゲルのレーン4は、塩析のみで高い程度の精製が得られることを示
す。
【0061】 (多量体アセンブリー) 精製されたNAPが多量体形態へとアセンブルする能力を、サイズ排除クロマ
トグラフィー(非還元、非変性)を使用して調べた。NAPを、緩衝液(25m
M Tris−HCl、150mM NaCl、pH7.8)で平衡化したSe
pharose 12 HR 10/30カラムにローディングし、そして0.
5ml/分で溶出した。そのNAPの供給源に関わらず、そのタンパク質は、酵
母のアルコールデヒドロゲナーゼ(分子量150kDa)と同じ保持時間を有す
る単一ピークで溶出した。このことは、十量体構造[6]を示す。
【0062】 (N末端配列決定) 精製されたNAPのN末端配列決定を、オンライン接続されたPTHアミノ酸
のRP−HPLC分析装置を備えたBeckmann LF 3000タンパク
質シークエンサーを使用して実行した。配列決定した10アミノ酸は、図1に示
す遺伝子配列から推定した10アミノ酸と同一であった。
【0063】 (天然タンパク質との比較) H.pylori CCUG細胞を、血液寒天プレートの表面から収集し、氷
冷したPBSで洗浄し、そして溶解緩衝液(20mM Tris−HCl、2.
5mM EDTA、0.3mg/mlリゾチーム、pH7.8)に再懸濁した。
この細胞懸濁液を、37℃で20分間インキュベートし、超音波処理し、そして
20000gで40分間遠心分離した。その上清(可溶性タンパク質)を、使用
するまで−20℃で保存した。
【0064】 E.coliから精製されたNAPまたはB.subtilisから精製され
たNAPについての、ゲル濾過クロマトグラフィーでの保持時間は、H.pyl
ori可溶性タンパク質抽出物でのゲル濾過クロマトグラフィーでの保持時間と
同一であった。
【0065】 本発明は、上記に例示のみのために記載されており、そして本発明の範囲およ
び精神内にとどまりながら、改変がなされ得ることが理解される。
【0066】 (参考文献)
【0067】
【表2】
【図面の簡単な説明】
【図1】 図1は、CCUG株のNAPをコードする遺伝子の完全配列を示す。これは、
プラスミドpSM214G中にクローニングされてpSM214−NAPを生じ
た。この図はまた、この遺伝子の5’末端に隣接するプラスミドベクター中の配
列(小文字)および推定アミノ酸配列を示す。
【図2】 図2は、参考文献6および8中のヌクレオチド配列とのクローン化されたNA
Pのヌクレオチド配列の比較を示す。アミノ酸の差異(図3)をもたらす差異が
、残基8、58、および80(参考文献6との比較)ならびに残基8、73、9
7、101および140(参考文献8との比較。全ゲノム配列から推定)にて観
察され得る。
【図3】 図3は、参考文献6および8中のアミノ酸配列とのクローン化されたNAPの
アミノ酸配列の比較を示す。
【図4】 図4は、E.coli由来の総細胞タンパク質のSDS−PAGE(A)およ
びウェスタンブロット(B)を示す。レーン1:形質転換された細胞からの総抽
出物;レーン2:ネガティブコントロール;レーン3:低分子量マーカー。
【図5】 図5は、形質転換されたE.coliのPoinceau染色(A)およびウ
ェスタンブロット(B)を示す。レーン1:可溶性抽出物;レーン2:不溶性抽
出物;レーン3:低分子量マーカー。
【図6】 図6は、形質転換されたB.subtilisのPoinceau染色(A)
およびウェスタンブロット(B)を示す。レーン1および2:それぞれSMS1
18株の可溶性抽出物および不溶性抽出物;レーン3および4:それぞれSMS
300株の可溶性抽出物および不溶性抽出物;レーン5:ネガティブコントロー
ル(NAPインサートを含まないpSM214で形質転換されたB.subti
lis)。
【図7】 図7は、硫酸アンモニウムによる塩析の効果を示す。レーン1および2:それ
ぞれ60%飽和でのペレットおよび上清(E.coli由来);レーン3および
4:60%から80%に増加された飽和度(それぞれ、ペレットおよび上清);
レーン5:精製されたNAP;レーン6:マーカー。
【図8】 図8は、最終NAP生成物の純度を示す。レーン1〜3は、E.coliから
精製された物質を含む;レーン5〜7はB.subtilis(SMS118)
から精製された物質を含む。左から右に、これらのレーンは、それぞれ1μg、
2μgおよび3μgのタンパク質を含む。レーン4および8はマーカーである。
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Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 タンパク質の混合物中のH.pylori NAPの存在を
    濃縮するプロセスであって、該プロセスは、他のタンパク質を塩析する工程であ
    って最終塩濃度が少なくとも50%飽和である、工程を包含する、プロセス。
  2. 【請求項2】 請求項1に記載のプロセスであって、金属キレートクロマト
    グラフィーの工程をさらに包含する、プロセス。
  3. 【請求項3】 請求項2に記載のプロセスであって、前記金属がニッケルで
    ある、プロセス。
  4. 【請求項4】 タンパク質混合物からのH.pylori NAPの精製の
    ためのプロセスであって、該プロセスは塩析の工程および金属キレートクロマト
    グラフィーの工程を包含する、プロセス。
  5. 【請求項5】 請求項1〜4のいずれかに記載のプロセスであって、ここで
    前記NAPが組換え宿主により産生され、そして該NAPがH.pylori中
    に天然に存在するNAPと同じ配列を有する、プロセス。
  6. 【請求項6】 診断用薬剤または治療用薬剤の調製のためのプロセスであっ
    て、該プロセスは、請求項1〜5のいずれかに記載のプロセスに続いて適切な処
    方の工程を包含する、プロセス。
  7. 【請求項7】 請求項6に記載のプロセスであって、ここで前記治療用薬剤
    がワクチンであり、そして前記処方が前記NAPを生理学的に受容可能な緩衝液
    および/またはアジュバントと混合する工程を包含する、プロセス。
  8. 【請求項8】 請求項1〜7のいずれか1つに記載のプロセスに従って入手
    可能である、NAP。
  9. 【請求項9】 請求項8に記載のNAPであって、請求項5に記載のプロセ
    スに従って、入手可能である、NAP。
  10. 【請求項10】 純粋なNAP。
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