JPH11510373A - インフルエンザ菌由来のｏｍｐ２６抗原 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 インフルエンザ菌の外膜由来の新規な抗原性タンパク質を提供する。このようなタンパク質をコード化するＤＮＡ配列、さらにはこのタンパク質からなるワクチンやインフルエンザ菌による感染に対する被験者の免疫方法もまた提供される。本発明はまた、呼吸器感染症または中耳炎の予防または処置方法、さらにはインフルエンザ菌の検出方法、およびこのような方法に使用されるキットをも含むものである。

Description

【発明の詳細な説明】 インフルエンザ菌由来のＯＭＰ２６抗原 本発明は、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)の新規な抗原、これよ りなるワクチンおよび治療や診断におけるこの使用に関するものである。 インフルエンザ菌(H．influenzae)は、桿状のグラム陰性の好気性の従属栄養 細菌である（クリーグ(Krieg)及びホルツ(Holt)（著）、バージーズ マニュア ル オブ システミック バクテリオロジー(Bergey’s Manual of Systemic Ba cteriology)、頁５６３（１９８４年））。また、インフルエンザ菌は、急性呼 吸器感染症の病原体であり、慢性気管支炎や中耳炎の患者中にも検出される。 我々は、ＮＴＨＩ由来の単一の２６ｋＤａの外膜タンパク質（ＯＭＰ２６と称 する）を同定、単離し、さらに、驚くべきことに、このタンパク質は、免疫原と して使用されると、ＮＴＨｉの同種及び異種株による感染に対して防御免疫反応 を誘導できることを発見した。このタンパク質は、Ｐ５と同様のＳＤＳ−ＰＡＧ Ｅによる分子量を有するが、 Ｐ５タンパク質とは明らかに異なることが分かっ た。 外膜タンパク質Ｐ５は、インフルエンザ菌株をサブタイプに分けるのに使用さ れるＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の２本の低分子量バンドのうちの１本であり、２５ 〜２７ｋＤａの見かけ上の分子量を有する。このＰ５タンパク質は熱可変性(hea t-modifiable)であることから、β−メルカプトエタノールの存在下で１００℃ で３０分間加熱した後は３０ｋＤａの見かけ上の分子量を示す。近年、フィンブ リンタンパク質と称する、ＮＴＨｉによって発現される他のタンパク質の特性が 明らかにされ、前 記Ｐ５と同様の分子量特性、熱可変性及び９２％の配列の相同性を有することが 示された。タンパク質、ＯＭＰ２６は、Ｐ５またはフィンブリンタンパク質につ いて説明したような配列の相同性または熱可変特性を示さない。 したがって、第一の概念によると、本発明は、インフルエンザ菌の外膜タンパ ク質である、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定される際の分子量が２６ｋＤａであ るタンパク質を提供するものである。このタンパク質を、ＯＭＰ２６と称する。 特に、本発明のタンパク質は、図１に示されるアミノ酸配列、またはそれと実 質的に相同性のある配列を有する。別の実施態様によると、本発明のタンパク質 は、２４番目のアミノ酸から始まる図１に示されるアミノ酸配列、またはそれと 実質的に相同性のある配列を有する。初めの２３アミノ酸は、「シグナル」配列 を構成し、この配列を排除したタンパク質も同様に使用できると考えられる。本 発明のタンパク質は、免疫原であり、このため、インフルエンザ菌による感染に 対して保護する免疫反応を誘導することが可能である。 本発明の明細書において、ＯＭＰ２６と「実質的に相同性のある」タンパク質 とは、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％ の相同性を有することである。好ましくは、タンパク質は、少なくとも７０％の 相同性を有し、より好ましくは少なくとも８０％の相同性を有し、さらにより好 ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、および最も好ましくは少なくとも９ ５％の相同性を有する。当業者は、相同性を表す割合（％）は一つの因子でしか ないと考えるであろう。重要なのは、タンパク質がその抗原性効果を維持するこ とである。したがって、本明細書でいう抗原活性を維持していれば、例えば、４ ０％という比較的低い相同性を有するタンパク質であってもよい。 加えて、「保存的(conservative)」または「半保存的(semi-conservative)」 変更はその基本的な活性を変えずにタンパク質のアミノ酸配列になされることは 当該分野で既知である。例えば、グリシン、バリン、ロイシン及びイソロイシン 等のアミノ酸は、すべて脂肪族側鎖を有するものであるが、これらのアミノ酸は しばしばタンパク質の生物学的な活性を実質的に変化させずに相互に置換される 。同様にして、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン等のアミノ酸は 、すべて芳香族側鎖を有するものであるが、これらのアミノ酸が相互に置換され てもよい。本明細書で記載される抗原性効果を保持するこのようなタンパク質は 本発明の概念に含まれる。 また、ＯＭＰ２６の抗原性部分または領域を用いることによって、インフルエ ンザ菌に対する保護効果を誘導することも可能である。このような抗原性部分ま たは領域もまた、本発明の概念に含まれる。 第二の概念によると、本発明は、本発明のタンパク質、上記したようなその変 異体または抗原性部分若しくは領域をコードする核酸配列、好ましくはＤＮＡを 提供するものである。特に、本発明は、ＯＭＰ２６をコードする図１に示される ＤＮＡ配列を提供するものである。当業者は、遺伝コードの縮重により、タンパ ク質のアミノ酸配列には変化を起こさずにＤＮＡ配列に保存的変更を行うことが 可能であることを認識するであろう。したがって、このようなＤＮＡ配列もまた 、本発明の概念に含まれる。好ましくは、本発明の核酸は、プラスミド等のベク ターの一部を形成してもよい。 本明細書において、本発明のタンパク質はインフルエンザ菌に対する免疫反応 を刺激する。したがって、第三の概念によると、本発明は、本明細書に記載され る本発明のタンパク質、および必要であれば一以上の担体および／またはアジュ バントからなるワクチン配合物を提供するも のである。 第四の概念によると、本発明は、インフルエンザ菌に対するワクチンの調製に おける、本明細書に記載される本発明のタンパク質の使用を提供するものである 。 本発明のワクチン組成物は、インフルエンザ菌による感染に対して被験者を免 疫するのに使用できる。したがって、第五の概念によると、本発明は、本発明の ワクチン組成物を被験者に投与することからなる、インフルエンザ菌による感染 に対して被験者を免疫する方法を提供するものである。本発明のワクチン組成物 は、全身性免疫(systemic immunity)および／または粘膜性免疫(mucosal immuni ty)を生じさせるのに使用できる。 第六の概念によると、本発明は、本発明のワクチン組成物を被験者に投与する 段階からなる呼吸器感染症または中耳炎の予防または処置方法を提供するもので ある。 他の概念によると、本発明は、以下を提供するものである： （ａ）インフルエンザ菌による感染の診断における、本明細書で定義される本発 明のタンパク質の使用；および （ｂ）本明細書で定義される本発明のタンパク質からなるインフルエンザ菌によ る感染の診断に使用されるキット。 本発明の各概念の好ましい態様は、必要であれば変更を加えて(mutatis mutan dis)、各他の概念について同様に好ましい。 本発明を以下の実施例を参照しながら説明するが、本発明は下記実施例に何等 制限されるものではない。 下記実施例は以下の図面を参照する： 図１は、ＯＭＰ２６をコードするＤＮＡ配列および上記ＤＮＡ配列から誘導さ れるアミノ酸配列を示すものである； 図２は、ＯＭＰ２６およびより高分子量の他の２種のタンパク質のＳＤＳ−Ｐ ＡＧＥ分析を示すものである； 図３は、ＯＭＰ２６（ａ）の初めの２５アミノ酸残基のＮ−末端配列を示すも のであり、また、この配列とパスツレラ ムルトシダ(P．multocida)及びエルシ ニア シュードツベルクローシス(Y．pseudotuberculosis)のタンパク質との比 較をも示す； 図４は、生菌で感染させてから４時間後の気管支洗浄液中に回収されたＮＴＨ Ｉ−Ｉ菌を示すものである； 図５は、ＯＭＰ２６で免疫されたラットの血清中のＩｇＧサブクラスのＯＭＰ ２６に特異的なレベルを示すものである； 図６は、血清におけるＯＭＰ２６に特異的な抗体の検出用の免疫ブロット(Imm unoblot)を示すものである；および 図７は、ＯＭＰ２６−免疫および非免疫ラットのＭＬＮから単離されたリンパ 球の抗原に特異的な増殖を示すものである。 下記実施例において、データは、平均±平均の標準誤差として表わした。肺の クリアランスデータ、全食細胞数、及び微分細胞数データ(differential cell c ount data)は、分散分析の一方向分析(one-way analysis of variance)によって グループ間を統計学的な有意性で比較した後、多重比較分析(multiple-comparis on analysis)を目的としてタッキー試験(Tuckey's test)（マッキントッシュシ スタット(Macintosh Systat)）を行った。抗体データは非対ｔ−検定(unpaired t-test)によってグループ間の有意性を評価し、リンパ球の増殖データは変動(va riance)の完全要因分析(fully factorial analysis)（マッキントッシュシスタ ット(Macintosh Systat)）によって評価した。２個の変数(variable)間の直線的 な相関は、ピヤソン相関計数(Pearson correlation coefficient)を用いて測定 した（マッキントッシュシスタット(Macintosh Systa t)）。実施例１ （ｉ）タンパク質の精製 ２６ｋＤａのタンパク質（ＯＭＰ２６）を、分離用電気泳動によってＮＴＨＩ −Ｉ株から精製した。１００寒天培地の一晩培養したものからの細菌をプレート を掻き取ることによって集めて、１０，０００×ｇで４℃で１０分間遠心するこ とにより２回洗浄した。この外膜成分を緩衝化ツィッタージェント３−１４界面 活性剤(buffered Zwittergent 3-14 detergent)で抽出し、さらにエタノール沈 殿することにより、未精製の外膜調製物を得た。この外膜抽出物を凍結乾燥し、 最小量の蒸留水中に再懸濁し、さらに、４倍容のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤ Ｓ）還元緩衝液（６２．５ｍＭ トリス(Tris)，［ｐＨ６．８］、１０％［ｖｏ ｌ／ｖｏｌ］ グリセロール、２％［ｗｔ／ｖｏｌ］ ＳＤＳ、５％［ｖｏｌ／ ｖｏｌ］ β−メルカプトエタノール、１．２×１０^-3％［ｗｔ／ｖｏｌ］ ブ ロモフェノブルー(bromophenoblue)）中に溶解した。このＳＤＳ−調製物を、電 気泳動カラムの濃縮用ゲル上にのせる前に、少なくとも３０分間、３７℃でイン キュベートした。ＯＭＰ２６を分離用(preparative)ポリアクリルアミド電気泳 動（ＰＡＧＥ）を用いて精製した。３７ｍｍ（内径［ｉ．ｄ．］）カラム内で１ ０ｍｌ４％ Ｔ−０．３６％ Ｃ アクリルアミド／ＢＩＳ（4% T-0.36% C acr ylamide/BIS）（Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド）濃縮用ゲルが重合さ れた６０ｍｌ １４ Ｔ−１．４２％ Ｃ アクリルアミド／ＢＩＳ(14 T-1.42 % C acrylamide/BIS)分離用ゲルを用いたバイオーラッド モデル ４９１ プ レップ セル(Blo-Rad Model 491 Prep Cell)を使用して、分離用ＳＤＳ−ＰＡ ＧＥを行い、ＯＭＰ２６を精製した。カラムから溶出させた画分を凍結乾燥によ って濃縮し、分析用ＳＤ Ｓ−ＰＡＧＥによってタンパク質含量を分析した。このような条件を用いて単離 された、ＯＭＰ２６は、ＳＤＳを含んでいたので、次に、このＳＤＳをリン酸カ リウム及び沈殿によって除去した。ＯＭＰ２６を含む画分を溜め、透析した後、 タンパク質濃度を測定した。 １０〜１５％勾配(gradient 10-15% acrylamide gel)または１２．５％均質ア クリルアミドゲル(homogenous 12.5% acrylamide gel)のいずれかを用いた分析 用ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、タンパク質の分析同定を行い、銀染色した。タン パク質濃度を、ピアスミクロＢＣＡアッセイ(Pierce micro BCA assay)を用いて 測定した。ＬＯＳの存在を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥミニゲルの銀染色およびＥ−ＴＯ ＸＡＴＥカブトガニ細胞分解産物試験(E-TOXATE Limulus lysate test)によるア ッセイによって評価した。結果 ＯＭＰ２６は、２６〜３０ｋＤａの間の分子量を有する３種のタンパク質の群 から良好に分離された。図２は、このタンパク質と他の２つのタンパク質との位 置関係を示すものであり、銀染色されたゲルから、得られた調製物が高純度を有 することが示される。このタンパク質の熱可変特性の評価を、タンパク質サンプ ルをβ−メルカプトエタノールの存在下で１００℃で３０分間加熱することによ って、行った。３０分後、煮沸されたタンパク質サンプルは同様の分子量を有し たまま移動することが分かった（図２）。他の近隣のタンパク質バンドの一つが 熱可変性Ｐ５であるかどうかを決定するために、この分子量範囲を有する３種の タンパク質すべてをβ−メルカプトエタノールの存在下で３０分間煮沸したとこ ろ、熱可変特性を示すタンパク質は存在しなかった（図２）。ＬＯＳ混入物の存 在に関するタンパク質の評価をＥ−ＴＯＸＡＴＥアッセイキット(E-TOXATE assa y kit)を用いて行ったところ、１ｍｇタンパ ク質当たり０．６μｇ未満のエンドトキシンが存在することが分かった。 （ｉｉ）Ｎ−末端アミノ酸配列決定用のＯＭＰ２６の調製 ＯＭＰ２６を、タンパク質バンドをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルからＰＶＤＦ膜に移 すことによって、Ｎ−末端アミノ酸配列分析用に調製した。このタンパク質サン プルを、配列を分析してもらうために、英国，クルウィド，ディーサイド，ニュ ーテック スクェアー，テクベース １(Techbase 1，Newtech Square，Deeside ，Clwyd，United Kingdom)所在のコーテックス ダイアグノスティック(Cortecs Diagnostic)に送った。 アミノ酸配列の同定 Ｎ−末端アミノ酸配列をＰＶＤＦに移したタンパク質バンドから得た。初めの ２５ペプチドに関するアミノ酸配列分析を図３に示す。この配列分析から、Ｈｉ ｂ Ｐ５またはフィンブリンタンパク質のＮ−末端配列との配列の相同性は見ら れない。このＮ−末端アミノ酸配列は、パスツレラ ムルトシダ(Pasteurella m ultocida)由来の２１．４ｋＤａのタンパク質とは５６％の相同性をおよびエル シニア シュードツベルクローシス(Yersinia pseudotuberculosis)由来の１９ ｋＤａの外膜タンパク質とは４４％の配列の相同性を示した。 （ｉｉｉ）免疫化および細菌の感染(challenge) 特定の病原体フリーの(pathogen-free)オスのラットを、１日目にパイエル板 内(intra-Peyer's patch)（ＩＰＰ）に免疫化し、１４日目に気管内に（ＩＴ） ブーストし(boost)、さらに最後に２１日目に生菌を感染させた(challenge)。動 物をハロタンで鎮静化させ、尾静脈を介した抱水クロラールによる静脈内麻酔を 容易にした。小腸を腹部の正中線を切開することにより露出させ、抗原を２７ゲ ージの針を用いて各パイエル板に漿膜下に注入した。免疫化タンパク質（ＯＭＰ ２６）を、１：１の割合の不完全フロインドアジュバント（ＩＦＡ）及びリン酸 緩衝溶 液（ＰＢＳ）中に１ｍｌ当たり２００または８００μｇのタンパク質を乳化させ ることにより調製し、１０または４０μｇのタンパク質の全接種量をそれぞれ各 動物に投与した。ラットの２コントロール群は、（ｉ）未処理及び偽免疫化(sha m-immunised)群（ＩＦＡ及びＰＢＳで免疫）の混合、および（ｉｉ）同種のＮＴ ＨＩ株の死菌で免疫したポジティブ群から構成された。ラットを、ＩＰＰ免疫化 してから１４日目にＩＴブーストした(IT boost)。ＯＭＰ２６を免疫したラット に、１０μｇのＯＭＰ２６をＩＴブーストした。非免疫群には５０μｌのＰＢＳ を投与し、また、死菌免疫群には５０μｌの死菌（菌数：１０¹⁰／ｍｌ）を投与 した。動物に、１回目の免疫化から２１日目に生菌（菌数：５×１０⁸／ｍｌ） を４時間感染させた(challenge)。異種株である、ＮＴＨＩ−ＩＩもまた、菌の 感染に使用した。菌を、１リットル寒天培地当たり５０ｍｌ脱線維素ウマ血液を 添加した脳−心臓浸出物寒天培地上で５％ＣＯ₂中で３７℃で一晩生育させ、回 収し、洗浄し、所定の濃度までＰＢＳ中に再懸濁した。菌を気管内カニューレを 介して肺中に導入し、４時間後、ラットを安楽死させた。血液を収集し、血清の アリコートを抗体分析用に−２０℃で貯蔵した。肺を５×２ｍｌのＰＢＳでフラ ッシュすることによって洗浄し、集めた洗浄液（ＢＡＬ）について菌数を測定し た。肺洗浄後、肺を除去し、均質化し、菌数を測定した。サイトスピンスライド (cytospin slide)を、肺の洗浄液における微分細胞数(differential cell count )の測定用に調製した。肺の洗浄液中に存在する全細胞数を、メチレンブルーで 染色し血球計算器を用いてカウントすることによって、算出した。結果 ＯＭＰ２６で免疫し２１日目にＮＴＨＩ−Ｉ同種株の生菌で感染させたラット は、有意な細菌のクリアランスを示した（Ｐ＜０．００５）。 １０μｇのＯＭＰ２６で免疫しかつブーストした(boost)ラットは、４時間後で は非免疫群に比べて肺中に９２％細菌が少なく、また、ＩＰＰ免疫により４０μ ｇのＯＭＰ２６が投与されさらに１０μｇのＯＭＰ２６をブーストされたラット は９６％細菌が少なく、これは死菌を免疫したラットで観察された９５％のクリ アランスと同等であった（図４）。 また、ＯＭＰ２６で免疫したラットに、異種の型別不能な株である、ＮＴＨＩ −ＩＩ由来の生菌を感染させた。表１の結果から、ＯＭＰ２６による免疫は異な る株による肺への感染においても有意に（Ｐ＜０．００５）菌を浄化した(clear )が示される。免疫群は、４時間後ではＢＡＬにおいて非免疫群に比べて９３％ 細菌が少ないことから、細菌のクリアランス速度は同種株による感染の場合の速 度に匹敵することが示された。また、ＯＭＰ２６による免疫により、非免疫群と 比較した場合、免疫群の肺のホモジネート中に存在する菌数も減少した。ＮＴＨ Ｉ−ＩＩ（異種株）を感染させたラット由来の肺のホモジネートは、非免疫肺に 比べて有意に細菌が少なかった。しかしながら、差の度合いは、肺で８０％であ り、肺では８９％のクリアランスであるのに比べてＢＡＬでは９３％のクリアラ ンスであり、さらに、ＮＴＨＩ−Ｉ（同種株）を感染させた群ではＢＡＬにおい て８７％のクリアランスであった。ＮＴＨＩ−Ｉに関する本実験におけるクリア ランスの割合（％）は、一般（一般的な接種材料は０．６〜１．４×１０¹⁰ＣＦ Ｕ／ｍｌの範囲であった）よりもかなりより多くの菌を含む生菌の接種材料のた め、従来の実験とは異なるものであった。 より数多くの食細胞がＯＭＰ２６で免疫された動物のＢＡＬ中に存在し、これ はこれらの動物における向上した菌のクリアランスと相関していた（表２）。免 疫群における細胞のレクリートメント(recruitment)の増加は、同種及び異種菌 による感染の場合で同様であった。しかしな がら、感染してから４時間後では、微分細胞数は免疫群と非免疫群で有意に異な っておらず（表２）、この際、双方の群ともマクロファージに対するＰＭＮの割 合は同様の割合を示した： （ｉｖ）ＯＭＰＳ２６に特異的なＥＬＩＳＡ ポリソルブマイクロタイターウェル(polysorb microtiter well)を、ＩｇＧ、 ＩｇＧ_2a、ＩｇＡ及びＩｇＭのアッセイを目的とした場合１μｇ／ｍｌの濃度の ；およびＩｇＧ₁、ＩｇＧ_2b、ＩｇＧ_2c、及びＩｇＥのアッセイを目的とした場 合１０μｇ／ｍｌの濃度の、精製したＯＭＰ２６で被覆した。プレートをインキ ュベーション段階間に０．０５％ツィーン２０(Tween 20)を含むＰＢＳで５回洗 浄した。ウェルを、６０分間、ＰＢＳ−０．０５％ツィーン２０(Tween 20)にお ける５％スキムミルクで遮断した。ウェルを血清（１／２５〜１／３２００）と 共に９０分間インキュベートした、またはＢＡＬ（１／２〜１／６）サンプルを 分析用遮断緩衝液で連続的に希釈した。使用した複合免疫グロブリン(conjugate d immunoglublin)は、ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１／２０００）、ＩｇＡ（１／１０ ００）、及びＩｇＭ（１／４０００）（Ｆｃ特異的）；マウス抗ウサギＩｇＧ₁ （１／５００）、ＩｇＧ_2a（１／１０００）、ＩｇＧ_2b（１／５００）、及びＩ ｇＧ_2c（１／５００）であった。さらに、ウェルを９０分間複合免疫グロブリン と共にインキュベートした。次に、プレートを発色させた。結果 ＯＭＰ２６で免疫したラットの、さらには４種の異なるインフルエンザ菌株由 来の死菌で予め免疫したラットの、血清及びＢＡＬサンプル中の、ＯＭＰ２６に 特異的な抗体を測定した。ＯＭＰ２６で免疫したラットの血清では、ＩｇＧ、Ｉ ｇＡ及びＩｇＭに関する高いＯＭＰ２６に特異的な抗体力価が、およびＯＭＰ２ ６で免疫したラットのＢＡＬでは、ＩｇＧ及びＩｇＡに関する高いＯＭＰ２６に 特異的な抗体力価が、それぞれ、検出され、さらに、４０μｇのより高い免疫投 与量を投与した群で最高レベルが観察された（表３）。血清中のＯＭＰ２６に特 異的なＩ ｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＭ、およびＢＡＬ中のＩｇＧ及びＩｇＡの検出可能なレベ ルもまた、異なるインフルエンザ菌株で予め免疫したラットで観察された（表３ ）が、これらの群で観察されたレベルはＯＭＰ２６で免疫された群のレベルに比 べて有意に低かった。ＯＭＰ２６ラット群の血清について、ＩｇＥのＥＬＩＳＡ もまた行ったが、ＯＭＰ２６に特異的なＩｇＥのレベルは検出されなかった（デ ータは示さず）。 ＯＭＰ２６に特異的なＩｇＧのサブクラス(subclass)を測定した結果、ＯＭＰ ２６に特異的なＩｇＧ₁は４０μｇの免疫化以降のみ検出可能であったが、有意 なレベルのＩｇＧ_2a及びＩｇＧ_2bのサブクラスが１０μｇ及び４０μｇのＯＭＰ ２６免疫群双方で検出されたことが示された（図５）。ＩｇＧ_2a及びＩｇＧ_2bの レベルは双方とも、ＩＰＰ接種材料中のＯＭＰ２６の濃度が１０μｇ〜４０μｇ と増加するに従って有意に（Ｐ＜０．０５）増加した。ＩｇＧ_2cもまた測定した が、有意なレベルのこのサブクラスのＯＭＰ２６に特異的な抗体は検出できなか った。（データ示さず）。 （ｖ）免疫ブロット ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離したタンパク質を電気泳動によりニトロセルロース（ ０．２μｍポアサイズ）に移した。ＯＭＰ２６、ＮＴＨＩ−Ｉ、ＮＴＨＩ−ＩＩ 、さらにはＨＩ−ＣＤ、及びＨｉｂ−ＩＩで免疫した群由来のラットの血清をＴ ＴＢＳ−５％（ｗ／ｖ）スキムミルク粉末で１０倍に希釈し、１次抗体として使 用した。ＴＴＢＳ−５％スキムミルクにおける西洋ワサビペルオキシダーゼ複合 ヤギ抗ウサギＩｇＧ(horseradish peroxidase conjugated goat anti-rat IgG) （Ｆｃに特異的）の５００倍希釈液を２次抗体として使用した。結果 非免疫、ＯＭＰ２６−免疫及びインフルエンザ菌−（４株）免疫ラットの血清 中に存在する抗体によるＯＭＰ２６の認識に関する免疫ブロット分析から、この タンパク質は、各免疫群の血清中に存在する抗体によっては認識されるが、非免 疫群の血清中に存在する抗体によっては認識されないことが示された（図６）。 これから、抗体反応の交差反応性がＮＴＨＩ−Ｉ株から精製されたＯＭＰ２６に よる研究に使用されたインフルエンザ菌株による免疫化によって生じることが示 される。 （ｖｉ）抗原に特異的なリンパ球アッセイ 腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）から得られたリンパ球を１０⁶細胞／ｍｌの濃度で 培養した。抗原（ＯＭＰ２６）を連続して１０倍希釈率で培養液中に懸濁し、瀘 過滅菌した。細胞懸濁液及び抗原を、最終容積を０．２ｍｌ／ウェルになるよう に、平底マルチウェル(flat-bottomed multiwell)プレートに３連で添加した。 リンパ球の増殖を４日間の培養の最後の８時間の［³Ｈ］チミジンの取り込みに よって評価した。結果を３連のウェルの幾何平均からバックグラウンドを引くこ とによって算出し、全処置群の幾何平均＋／−標準誤差とした。結果 ＯＭＰ２６−免疫及び非免疫ラットのＭＬＮ由来のリンパ球について抗原に特 異的な増殖反応を評価した。ＯＭＰ２６−免疫群由来の細胞はインビトロにおい て培養物中のＯＭＰ２６に対して有意に応答したが、非免疫ラット由来の細胞は 有意な増殖を示さなかった（図７Ａ）。また、ＯＭＰ２６で免疫したラットのリ ンパ球をインフルエンザ菌株のＯＭＰ抽出物と共に培養し、交差反応の応答性を 評価した。有意な増殖応答性がＮＴＨＩ−Ｉ、ＮＴＨＩ−ＩＩ及びＨＩ−ＣＤ株 由来のＯＭＰ抽出物ではＯＭＰ２６免疫群由来のリンパ球において検出されたが 、Ｈｉｂ−ＩＩ株由来の抽出物では有意な増殖が観察されなかった（図７Ｂ〜Ｅ ）。実施例２−ＯＭＰ２６のクローニング及び配列決定 ＤＮＡをＮＴＨｉから抽出した。ＯＭＰ２６をコード化するＤＮＡの領域を同 定し、遺伝子（バイオモレキュラー レソース ファシリティー(Biomolecular Resource Facility)、ジョン カーティン スクール オブ メディカル リサ ーチ(John Curtin School of Medical Research)、キャンベラ、エーティーシー (Canberra，ACT)、オーストラリアで合成）を認識するように設計されたプライ マーを用いた標準的なＰＣＲ法によって増幅した。分析して正確な産物を良好に 認識した後、ＰＣＲ ＤＮＡ産物を抽出した。 ２個のプラスミドを調製した。一方のＤＮＡ産物はシグナルペプチド及び成熟 ＯＭＰ２６産物をコード化する領域を含み、他方は最終的な成熟ＯＭＰ２６（リ ーダーシグナルペプチドを含まない）をコード化する領域を含んだ。これらのＰ ＣＲ ＤＮＡ産物を、ＯＭＰ２６＋シグナルペプチドでは制限酵素ＨｉｎｄＩＩ Ｉでおよび成熟ＯＭＰ２６ではＮｓｐＢＩＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩで消化した。消化 されたＤＮＡを回収し、これを、ＯＭＰ２６＋シグナルペプチドまたはＯＭＰ２ ６成熟タンパク質 で、それぞれ、プラスミドｐＱＥ３０またはｐＱＥ３１（ギアゲン ジーエムビ ーエッチ(Giagen GmbH)、ヒルデン(Hilden)，ドイツ）中にＳｍａｌ及びＨｉｎ ｄＩＩＩで連結した。次に、これらのプラスミドを精製し、沈殿させて、バイオ モレキュラー レソース ファシリティー(Biomolecular Resource Facility)、 ジョン カーティン スクール オブ メディカル リサーチ(John Curtin Sch ool of Medical Research)、キャンベラ(Canberra)、オーストラリアのダイ デ オキシーターミネーター法(dye deoxy-terminator procedure)によって配列決定 を行った。結果 図１に示される配列は、成熟ＯＭＰ２６＋シグナルペプチドを表すものである 。このシグナルペプチド配列は、初めの２３個のアミノ酸を含む。外膜上のＮＴ Ｈｉによって発現される最終産物は２４番目のアミノ酸で始まる。

【手続補正書】 【提出日】１９９８年１月１２日 【補正内容】 請求の範囲 １．インフルエンザ菌の外膜タンパク質である、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測 定される際の分子量が２６ｋＤａであるタンパク質、および必要であれば一以上 の担体および／またはアジュバントからなるワクチン配合物。 ２．該タンパク質が図１に示されるアミノ酸配列、またはこれと実質的に相同 性のある配列を有する、請求の範囲第１項に記載のワクチン配合物。 ３．該タンパク質がＮ−末端アミノ酸としての２４番目のアミノ酸から始まる 図１に示されるアミノ酸配列、またはこれと実質的に相同性のある配列を有する 、請求の範囲第１項に記載のワクチン配合物。 ４．該タンパク質が図１に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性 を有するアミノ酸配列を有する、請求の範囲第２項または第３項に記載のワクチ ン配合物。 ５．請求の範囲第１項から第４項のいずれかに記載のタンパク質の抗原性部分 または領域であるタンパク質またはペプチドからなるワクチン配合物。 ６．請求の範囲第１項から第４項のいずれかに記載のタンパク質の抗原性部分 または領域からなるタンパク質からなるタンパク質からなるワクチン配合物。 ７．該タンパク質が融合タンパク質である、請求の範囲第６項に記載のワクチ ン配合物。 ８．インフルエンザ菌に対するワクチンの調製における請求の範囲第１項から 第７項のいずれかに記載のタンパク質の使用。 ９．請求の範囲第１項から第７項のいずれかに記載のワクチン配合物 を被検者に投与することからなる、インフルエンザ菌による感染に対する被検者 の免疫方法。 １０．請求の範囲第１項から第７項のいずれかに記載のワクチン配合物を被検者 に投与する段階からなる、呼吸器感染症または中耳炎の予防または処置方法。 １１．インフルエンザ菌による感染の診断における請求の範囲第１項から第７項 のいずれかに記載のタンパク質の使用。 １２．請求の範囲第１項から第７項のいずれかに記載のタンパク質からなるイン フルエンザ菌による感染の診断に使用されるキット。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:01） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｌ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 クリップス，アラン オーストラリア国，エーシーティー 2605，カーティン，ジェニング ストリー ト 25 (72)発明者 スミス，クリストファー，ジョン イギリス国，クルウィド エルエル77 ０ ティーイー，ルアルト，トレイメイアーチ オン レイン，イスフリン

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．インフルエンザ菌の外膜タンパク質である、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測 定される際の分子量が２６ｋＤａであるタンパク質。 ２．図１に示されるアミノ酸配列、またはこれと実質的に相同性のある配列を 有する、請求の範囲第１項に記載のタンパク質。 ３．Ｎ−末端アミノ酸としての２４番目のアミノ酸から始まる図１に示される アミノ酸配列、またはこれと実質的に相同性のある配列を有する、請求の範囲第 １項に記載のタンパク質。 ４．図１に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性を有するアミノ 酸配列を有する、請求の範囲第２項または第３項に記載のタンパク質。 ５．請求の範囲第１項から第４項のいずれかに記載のタンパク質の抗原性部分 または領域であるタンパク質またはペプチド。 ６．請求の範囲第１項から第４項のいずれかに記載のタンパク質の抗原性部分 または領域からなるタンパク。 ７．融合タンパク質である、請求の範囲第６項に記載のタンパク質。 ８．請求の範囲第１項から第７項のいずれかに記載のタンパク質をコードする 核酸配列。 ９．ＤＮＡ配列である、請求の範囲第８項に記載の核酸配列。 １０．図１に示される配列である、請求の範囲第９項に記載のＤＮＡ配列。 １１．請求の範囲第１項から第７項のいずれかに記載のタンパク質、および必要 であれば一以上の担体および／またはアジュバントからなるワクチン配合物。 １２．インフルエンザ菌に対するワクチンの調製における請求の範囲第 １項から第７項のいずれかに記載のタンパク質の使用。 １３．請求の範囲第１１項に記載のワクチンを被験者に投与することからなる、 インフルエンザ菌による感染に対する被験者の免疫方法。 １４．請求の範囲第１１項に記載のワクチンを被験者に投与する段階からなる、 呼吸器感染症または中耳炎の予防または処置方法。 １５．インフルエンザ菌による感染の診断における請求の範囲第１項から第７項 のいずれかに記載のタンパク質の使用。 １６．請求の範囲第１項から第７項のいずれかに記載のタンパク質からなるイン フルエンザ菌による感染の診断に使用されるキット。