ES2259443T3

ES2259443T3 - Antigeno omp26 de la bacteria haemophilus influenzae.

Info

Publication number: ES2259443T3
Application number: ES96920996T
Authority: ES
Inventors: Jennelle Kyd; Allan Cripps; Christopher John Smith
Original assignee: CORTECS INTERNAT Ltd; CORTECS INTERNATIONAL Ltd
Current assignee: CORTECS INTERNAT Ltd; CORTECS INTERNATIONAL Ltd
Priority date: 1995-06-27
Filing date: 1996-06-27
Publication date: 2006-10-01
Anticipated expiration: 2016-06-27
Also published as: US6313281B1; TW457247B; CN1144875C; CN1189186A; WO1997001638A1; AU6236396A; US6254875B1; KR19990028423A; JP2009034107A; ATE317013T1; ZA965482B; DE69635783T2; NO976119L; NZ311120A; CA2225405A1; EP0835313B1; AU708061B2; US6284477B1; US6245338B1; RU2221045C2

Abstract

SE PROPORCIONA UNA NUEVA PROTEINA ANTIGENICA DERIVADA DE LA MEMBRANA EXTERNA DE H. INFLUENZAE. SE PROPORCIONAN ASIMISMO SECUENCIAS DE DNA QUE CODIFICAN DICHA PROTEINA, ASI COMO VACUNAS QUE CONTIENEN LA PROTEINA Y METODOS PARA INMUNIZAR UN SUJETO CONTRA UNA INFECCION POR H. INFLUENZAE. LA INVENCION INCLUYE ASIMISMO METODOS PARA LA PROFILAXIS O TRATAMIENTO DE INFECCIONES DE LAS VIAS RESPIRATORIAS U OTITIS MEDIA, ASI COMO METODOS PARA LA DETECCION DE H. INFLUENZAE, Y KITS PARA SER UTILIZADOS EN DICHOS METODOS.

Description

Antígeno OMP26 de la bacteria Haemophilus influenzae.

La presente invención trata de un nuevo antígeno de la bacteria Haemophilus influenzae, de vacunas que lo contienen y de su aplicación en terapias y diagnosis.

La H. influenzae es una bacteria gramnegativa heterotrófica y aeróbica con forma de vara (Krieg y Holt (ed), Bergey's Manual of Systemic Bacteriology, pág. 563 (1984). Se trata de un patógeno que causa graves infecciones respiratorias y que se encuentra también en pacientes con bronquitis crónica y otitis media

Ahora hemos identificado, y purificado, una proteína particular de la membrana exterior de 26 kDa (llamada OMP26) del NTHI, y hemos averiguado, asombrosamente, que esta proteína puede, cuando se utiliza como inmunógeno, inducir inmuno-respuestas protectoras contra la infección con cepas homólogas y heterólogas de NTHi. Esta proteína posee una masa molecular en el SDS-PAGE similar a P5, pero se ha averiguado que es significativamente diferente a la proteína.

La proteína de la membrana exterior P5 es una de dos bandas de masa molecular inferiores en los geles SDS-PAGE usadas para subtipificar las cepas de H. influenzae, y poseen una masa molecular aparente de 25-27 kDa. La proteína P5 es modificable mediante calor, y demuestra una masa aparente de 35 kDa después de haber sido calentada durante 30 minutos a 100ºC en presencia de \beta-mercaptoetanol. Recientemente, otra proteína expresada por la NTHi, llamada proteína fimbrina, se ha caracterizado y ha mostrado poseer características similares de masa molecular, capacidad de modificación mediante calor y un 92% de homología de secuencia respecto al P5 previamente descrito. La proteína, OMP26, no muestra ni homología de secuencia ni características de modificación mediante calor, según lo definido para la P5 o la proteína fimbrina.

Así, en un primer aspecto, la presente invención proporciona una proteína aislada o recombinante con un peso molecular de 26 kDa, según lo determinado por la SDS-PAGE, cuya proteína es una proteína de la membrana exterior de la H. influenzae y presente la siguiente secuencia N-terminal:

NH_{2}EEKIAFINAGYIFQHHPDR-AV-K

Esta proteína se designa OMP26.

En una ejecución, la proteína del primer aspecto de la invención abarca la secuencia del aminoácido mostrada en la figura 1, que comienza con el aminoácido número 24 como el aminoácido N-terminal, o una secuencia que es de al menos un 70% o al menos un 90% homóloga a esta. Los primeros 23 aminoácidos constituyen una secuencia de "señal" y se apreciará que una proteína menos esta secuencia será igualmente aplicable.

En un segundo aspecto, la presente invención prevé una proteína de la H. influenzae de la membrana exterior aislada o recombinante, que abarca la la secuencia del aminoácido mostrada en la figura 1, o una secuencia que sea, al menos, un 99% homóloga a esta.

La proteína de la invención es un inmunógeno y, por lo tanto, es capaz de inducir una inmuno-respuesta que proteja contra la infección con H. influenzae.

Las proteínas que son "substancialmente homólogas" a la OMP26 pueden ser homólogas en un 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o, incluso, un 99%.

Además, se conoce en el estado de la técnica que se pueden realizar cambios "conservadores" o "semi-conservadores" en la secuencia del aminoácido de una proteína, que no alteren su actividad fundamental. Por ejemplo, los aminoácidos tales como la glicina, la valina, la leucina y la isoleucina, los cuales poseen cadenas laterales alifáticas, se pueden sustituir a menudo entre sí sin alterar substancialmente la actividad biológica de la proteína. Semejantemente, los aminoácidos como la fenilalanina, la tirosina y el triptofán, los cuales poseen cadenas laterales aromáticas, se pueden substituir entre sí. Tales proteínas, que conservan el efecto antigénico descrito en la presente, se encuentran en el ámbito de la presente invención.

También cabe la posibilidad de utilizar partes o regiones antigénicas de una proteína de la invención para inducir el efecto protector contra la H. influenzae. En otro aspecto, la invención prevé una proteína de fusión que comprende una parte o región antigénica de la proteína de la invención, cuya parte o región antigénica puede inducir un efecto protector contra la H. influenzae.

En un tercer aspecto, la presente invención proporciona un ácido nucleico aislado que consiste en una secuencia, preferiblemente de ADN, que cifra una proteína de la invención, variantes de estas como se describe anteriormente, partes o regiones antigénicas de esta o una proteína que comprende una parte o región antigénica de una proteína de la invención. En particular, la invención proporciona una secuencia de ADN como la que se muestra en la figura 1, que cifra la OMP26. En otra ejecución, la invención proporciona una secuencia de ADN como la que se muestra en la figura 1, que comienza en el ácido nucleico número 69. El hombre experto en la materia apreciará que, debido a la degeneración del código genético, resulta posible realizar cambios conservadores en la secuencia de ADN que no dará lugar a cambios en la secuencia del aminoácido de la proteína. Así, tales secuencias de ADN se encuentran también dentro del ámbito de la presente invención. Convenientemente, el ácido nucleico de la invención puede formar la parte de un vector como un plásmido.

Según lo discutido en la presente, las proteínas de la invención estimulan una inmuno-respuesta contra la H. influenzae y, de ese modo, en un cuarto aspecto, la presente invención proporciona una formulación de vacuna que abarca una proteína de la invención, según lo definido en la presente, junto con, opcionalmente, unos o más portadores y/o coadyuvantes.

En un quinto aspecto, la invención proporciona el uso de la proteína de la invención, según lo definido en la presente, en la preparación de una vacuna contra la H. influenzae.

La composición de vacuna de la invención se puede utilizar para inmunizar a un sujeto contra la infección de la H. influenzae y para producir tanto una inmunidad sistémica como una inmunidad mucosa.

En un sexto aspecto, la presente invención proporciona la utilización de la formulación de vacuna de la invención para la fabricación de medicamentos para la profilaxis o el tratamiento de infecciones de la zona respiratoria o de la otitis media.

En otros aspectos, la invención proporciona:

(a): El uso de una proteína de la invención, según lo definido en la presente, para la fabricación de un diagnóstico para la infección con H. influenzae; y

(b): un kit para su empleo en la diagnosis de la infección con H. influenzae que abarca una proteína de la invención, según lo definido en la presente.

Las características preferidas de cada aspecto de la invención, se prefieren igualmente para cada uno de los otros aspectos mutatis mutandis.

La invención se describirá a partir de ahora en referencia a los ejemplos siguientes, que no se deben interpretar de ninguna manera como limitativos para la invención.

Los ejemplos se refieren a las figuras, en las que:

la Figura 1: muestra la secuencia de ADN de la OMP26 y la secuencia del aminoácido que se deriva de esa secuencia de ADN;

la Figura 2: muestra el análisis SDS-PAGE de la OMP26 y de otras dos proteínas con una masa molecular más alta;

la Figura 3: muestra la secuencia N-terminal de los primeros 25 residuos de los aminoácidos de la OMP26 (a), así como una comparación con las proteínas de la P. multocida y la Y. pseudotuberculosis;

la Figura 4: muestra la bacterias NTHI-I recuperadas en lavados bronquiales 4 horas después de haberse enfrentado a bacterias vivas;

la Figura 5: muestra los niveles específicos de la OMP26 de las subclases IgG en suero de ratas inmunizadas con OMP26;

la Figura 6: muestra un immunoblot para la detección del anticuerpo especifico de la OMP26 en el suero; y

la Figura 7: muestra la proliferación específica de antígeno de los linfocitos aislados del MLN de la OMP26 de las ratas inmunizadas y no inmunizadas.

En el ejemplo siguiente, los datos se han expresado como medias +/- de errores estándares de las medias. Los datos de la separación pulmonar, el número total de células fagocíticas, y los datos diferenciales de la cuenta celular, se compararon con fines estadísticos entre los grupos mediante el análisis unidireccional de la variación, seguido por la prueba de Tuckey para el análisis multicomparativo (Macintosh Systat). Los datos del anticuerpo se evaluaron para la significación del grupo intermedio mediante un t-test desigual, y los datos de la proliferación de los linfocitos se analizaron mediante un análisis de la variación completamente factorial (Macintosh Systat). La correlación linear entre dos variables se determinó usando el coeficiente de correlación de Pearson (Macintosh
Systat).

Ejemplo 1 (i) Purificación de la proteína

Una proteína de 26 kDa (OMP26) se purificó a partir de una cepa de NTHI-I mediante electrofóresis preparativa. Las bacterias obtenidas tras una noche de cultivo en 100 placas, se cultivaron raspando las placas, y lavándolas dos veces mediante centrifugación a 10.000 x g durante 10 minutos a 4ºC. Se obtuvo una preparación bruta de membrana exterior mediante la extracción del componente de la membrana exterior con un detergente taponado Zwittergent 3-14 y una precipitación de etanol. El extracto de membrana exterior se liofilizó, se volvió a suspender en una cantidad mínima de agua destilada y se volvió a disolver en 4 veces el volumen de dodecil sulfato sódico (SDS), lo que reducía el tampón (62,5 mM Tris, [pH 6,8], 10% [vol./vol.] de glicerol, 2% [peso/vol.] de SDS, 5% [vol./vol.] \beta-mercaptoetanol, 1,2 x 10^{-3}% [peso/vol.] de azul de bromofenol). La preparación de SDS se incubó a 37ºC durante al menos 30 minutos antes de colocarse en el gel de la columna de electrofóresis. La OMP26 se purificó usando electrofóresis de poliacrilamida (PAGE). El preparado de SDS-PAGE para purificar la OMP26 se realizó usando el Bio-Rad Model 491 Prep Cell con gel de separación de 60 ml de 14 T-1,42% C acrilamida/BIS (N.N'-metilen-bis acrilamida) con un gel de pegado de 10 ml 4% T-0,36% C acrilamida/BIS polimerizado en una columna de 37 mm (diámetro interno [d.i.]). Las fracciones eluidas de la columna se concentraron mediante liofilización, y analizadas para determinar el contenido proteínico mediante la analítica SDS-PAGE. La OMP26, aislada usando estas condiciones, contenía SDS que se eliminó posteriormente mediante fosfato de potasio y precipitación. Las fracciones que contienen OMP26 se unieron y se dializaron antes de determinar la concentración proteínica.

La identificación analítica de la proteína se realizó mediante SDS-PAGE usando geles de acrilamida con variaciones del 10 al 15% o con una homogeneidad del 12,5% y se manchó con plata. La concentración de proteína se determinó mediante el análisis Pierce micro BCA. La presencia de LOS se determinó tanto mediante el teñido con plata de los minigeles del SDS-PAGE como con el test de lisato E-TOXATE Limulus.

Resultados

La OMP26 se separó con éxito de un grupo de tres proteínas con masas moleculares de entre 26 y 30 kDa. La figura 2 muestra la posición de esta proteína respecto a las otras dos, y el gel manchado de plata indica el alto grado de pureza de la preparación resultante. La evaluación de la característica de modificación mediante calor de esta proteína, se realizó calentando la muestra de la proteína hasta los 100ºC durante 30 minutos en presencia de \beta-mercaptoetanol. Se averiguó que después de 30 minutos, la muestra de proteína hervida la proteína migró con la misma masa molecular (figura 2). Para determinarse si una u otra de las bandas de proteína vecinas pueden haber sido la P5 modificable mediante calor, las tres proteínas dentro de este rango de masa se hirvieron durante 30 minutos en presencia de \beta-mercaptometanol, con lo que ninguna de las proteínas mostró características de modificación mediante calor (figura 2). La evaluación de la proteína para determinar la presencia de contaminación de LOS, se llevó a cabo utilizando el kit E-TOXATE, y se detecto una presencia de menos de 0,6 \mum de endotoxina por mg de proteína.

(ii) Preparación de la OMP26 para la secuenciación del aminoácido N-terminal

La OMP26 se preparó para el análisis de la secuencia del aminoácido N-terminal transfiriendo la banda de proteína desde un gel SDS-PAGE a la membrana PVDF. Esta muestra de la proteína se anvió para su análisis secuencial a Cortecs Diagnostic, Techbase 1, Newtech Square, Deeside, Clwyd, United Kingdom.

Identificación de la secuencia del aminoácido

Se obtuvo una secuencia del aminoácido N-terminal de la banda de la proteína transferida a PVDF. En la figura 3 se muestra el análisis de la secuencia del aminoácido para los primeros veinticinco péptidos. El análisis de la secuencia no indica ninguna homología de la secuencia con la secuencia N-terminal de la Hib P5 o de la proteína fimbrina. La secuencia del aminoácido N-terminal mostró una homología del 56% con una proteína de 21,4 kDa de la Pasteurella multocida y una homología de la secuencia del 44% con una proteína de la membrana exterior de 19 kDa de la Yersinia pseudotuberculosis.

(iii) Inmunización y desafío bacteriano

Ratas masculinas específicas libres de patógenos recibieron una intra placa Peyer de inmunización en el día 1, un asalto intratraqueal (IT) en el día 14 y el desafío bacteriano final en el día 21. Los animales fueron sedados con halotano para facilitar la anestesia intravenosa con hidrato de cloral a través de la vena de la cola. Se expuso el pequeño intestino a través de una incisión abdominal media y se inyectó en la capa subserosa respecto a cada placa Peyer usando una aguja del 27. La proteína de inmunización (OMP26) se preparó mediante la emulsificación de 200 o 800 \mug de proteína por ml en un cociente de 1:1 del adyuvante incompleto de Freund (IFA) y tampón fosfato salino (PBS), y un inoculum total de 10 o 40 \mug proteína se le administró respectivamente a cada animal. Dos grupos de control de ratas consistieron en (i) una mezcla de grupos no tratados y mal inmunizados (inmunizados con IFA y PBS), y (ii) un grupo positivo inmunizado con bacterias muertas de la cepa homóloga NTHI. Las ratas recibieron un asalto IT en el día 14, después de la inmunización IPP. Las ratas OMP26 inmunizadas recibieron un asalto IT de 10 \mug de OMP26. El grupo no-inmune recibió 50 \mul de PBS, mientras que el grupo inmunizado con bacterias muertas recibió 50 \mul de bacterias muertas (nivel de bacterias de 10^{10} por ml). Los animales fueron desafiados durante 4 horas con bacterias vivas (nivel de bacterias 5 x 10^{8}) 21 días después de la primera inmunización. Una cepa heteróloga, NTHI-II, se utilizó también para el desafío bacteriano. Las bacterias se incubaron durante una noche a 37ºC en un 5% de CO_{2} en placas de agar con infusión de cerebro y corazón con 50 ml de sangre desfibrinada de caballo por litro de agar, recubiertas, lavadas y resuspendidas en PBS hasta alcanzar la concentración requerida. Las bacterias se introdujeron en los pulmones a través de una cánula intratraqueal, y 4 horas más tardes se le aplicó eutanasia a las ratas. Se recogió la sangre y se almacenaron partes alícuotas del suero a -20ºC para el análisis de anticuerpos. Los pulmones se sometieron a un lavado limpiándolos con un chorro de 5 x 2 ml de PBS, y el lavado (BAL) se evaluó para determinar el número de bacterias. Después de lavado del pulmón, se extrajeron los pulmones, homogeneizados y evaluados para determinar el número de bacterias. Se prepararon láminas citocentrífugas para la determinación de las cuentas celulares diferenciales en el lavado pulmonar. El número total de células presentes en el lavado pulmonar se calculó mediante el teñid con azul de metileno y el recuento con un hemocitómetro.

Resultados

Las ratas inmunizadas con OMP26 y desafiadas con las bacterias vivas de la capa homóloga de NTHI-I el día 21, mostraron una significativa limpieza bacteriológica (P<0,005). Las ratas inmunizadas y asaltadas con 10 \mum de OMP26 presentaron un 92% menos de bacterias en el pulmón que el grupo no inmunizado después de 4 horas, mientras que las ratas que recibieron 40 \mum de OMP26S en la inmunización de IPP, y asaltadas con 10 \mum de OMP26S, tenían un 96% de menos bacterias y una equivalencia del 95% de liberación bacteriológica observada en las ratas inmunizadas con bacterias muertas (figura 4).

Las ratas inmunizadas con OMP26 también fueron desafiadas con las bacterias vivas de una cepa heteróloga no tipificable, NTHI-II. Los resultados en la tabla 1 muestran que la inmunización con OMP26 también despejó perceptiblemente las bacterias (P<0,005) en un desafío pulmonar con una cepa diferente. El grupo inmunizado tenía un 93% menos de bacterias que el grupo no inmunizado en el BAL después de 4 h, mostrando un índice de limpieza bacteriana comparable al del desafío homólogo. La inmunización con la OMP26 también redujo el número de bacterias presentes en los tejidos homogeneizados del pulmón de los grupos inmunizados comparados con los grupos no inmunizados. Los tejidos homogeneizados del pulmón de las ratas desafiadas con NTHI-II (cepa heteróloga) mostraban, perceptiblemente, menos bacterias que los pulmones no inmunizados. Sin embargo, la magnitud de la diferencia era del 80% en los pulmones, con un 93% de limpieza en el BAL, comparado con la limpieza del 89% en los pulmones, y el 87% de limpieza en el BAL de los grupos desafiados con NTHI-I (la cepa homóloga). El porcentaje de limpieza en este experimento con NTHI-I, se diferenció de los experimentos anteriores debido a que el inoculum bacteriano vivo contenía considerablemente más bacterias que por lo general (el inoculum normal variaba entre 0,6 y 1,4 x 10^{10} CFU por ml).

En la BAL de animales inmunizados con OPM26 se detectó un mayor número de células fagocitarias, lo que se correlaciona con la mayor limpieza bacteriana en tales anumales (tabla 2). El aumento en el reclutamiento celular en los grupos inmunizados era igual para el desafío bacteriano homólogo y no homólogo. Sin embargo, en el cuarto postdesafío, los recuentos diferenciales de células no resultó ser significativamente diferente entre los grupos inmunizados y no inmunizados (tabla 2), ya que ambos grupos mostraban unos cocientes similares de PMN al macrófago:

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(Tabla pasa a página siguiente)

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(iv) ELISA OMPS26 específica

Se recubrieron fuentes microtiter de polisorb con OMP26 purificado en una concentración de 1 \mug por ml para el análisis de IgG, de IgG_{2a}, de IgA, y de IgM; y 10 \mug por ml para IgG_{2}, IgG_{2b}, OgG_{2c} e IgE. Las placas se lavaron cinco veces en PBS que contenía un 0,05% de Tween 20 entre los pasos de incubación. Las fuentes fueron bloqueadas con un 5% de leche desnatada en PBS-0,05% de Tween 20 durante 60 minutos. Las fuentes se incubaron durante 90 minutos con suero (1/25 a 1/3200), o las muestras de BAL (1/2 a 1/16) se diluyeron en serie en tampones de bloqueo para el análisis. La inmunoglobina conjugada que se utilizó fue IgG anti-rata de cabra (1/2000), IgA (1/1000), e IgM (1/4000) (Fc específico); IgG_{1} anti-rata de ratón (1/500), IgG_{2a} (1/1000), IgG_{2b} (1/500), e IgG_{2c} (1/500), y las fuentes se incubaron con la inmunoglobulina conjugada durante 90 minutos. Luego se desarrollaron las placas.

Resultados

Se midieron anticuerpos específicos a la OPM26 en el suero y las muestras de BAL de las ratas inmunizadas con OMP26, así como de las ratas que habían sido inmunizadas con las bacterias muertas a partir de cuatro cepas diferentes de H. influenzae. Se encontraron títulos altos de anticuerpos OMP26 específicos para IgG, IgA e IgM en el suero, e IgG e IgA en el BAL de las ratas inmunizadas con OMP26, con los niveles más altos observados para el grupo que recibió la dosificación más alta de inmunización, de 40 \mug (tabla 3). Los niveles perceptibles de IgG OMP26 específico, IgA e IgM en el suero, e IgG e IgA en el BAL, también se encontraron en ratas que habían sido inmunizadas con diversas cepas de H. influenzae (tabla 3), aunque los niveles observados para estos grupos eran perceptiblemente menores que los de los grupos inmunizados con OMP26. Las IgE ELISAs también se realizaron en el suero de grupos de ratas OMP26; sin embargo, los niveles de IgE OMP26 específicos no se pudieron detectar (datos no mostrados).

La medición de las subclases IgG OMP26 específicas mostró que el IgG_{1} OMP26 específico solamente resultaba perceptible después de la inmunización con 40 \mug, mientras que se detectaron niveles significativos de las subclases IgG_{2a} e IgG_{2b} tanto para los grupos de inmunización OMP26 de 10 \mug y 40 \mug (figura 5). Los niveles de IgG_{2a} y de IgG_{2b} aumentaron perceptiblemente (P<0,05), con el aumento en la concentración de OMP26 de 10 \mug a 40 \mug en el inoculum de IPP. El IgG_{2c} también se midió, aunque no se pudieron detectar niveles de anticuerpos específicos de OMP26 a partir de esta subclase (datos no mostrados).

(v) Immunoblot

Las proteínas separadas mediante SDS-PAGE se transfirieron electroforéticamente a nitrocelulosa (0,2 \mum tamaño de poro). Se diluyó suero de rata de OMP26, NTHI-I, NTHI-II, así como cepas HI-CD, y a grupos inmunizados Hib-II diez veces en polvo de leche desnatada TTBS-5% (peso/volumen) y se utilizó como el anticuerpo primario. Una dilución de 500 veces de preoxidasa de IgG anti-rata de cabra conjugada con peroxidas de rábano (Fc específica) en leche desnatada TTBS-5% se utilizó como segundo anticuerpo.

Resultados

El análisis de Immunoblot para el reconocimiento de la OMP26 mediante los anticuerpos presentes en el suero de ratas no inmunizadas, OMP26 inmunizadas y H. influenzae - (cuatro cepas) inmunizadas, ha mostrado el reconocimiento de esta proteína por los anticuerpos presentes en el suero de cada uno de los grupos inmunizados, pero no el grupo no inmunizado (figura 6). Esto demuestra la reactividad cruzada de las respuestas de los anticuerpo generada por la inmunización con las cepas de H. influenzae usadas en este estudio con el OMP26 purificado de la cepa NTHI-I.

(vi) Análisis antígeno-específico del linfocito

Los linfocitos obtenidos de los nodos linfáticos mesentéricos (MLN) se cultivaron en una concentración de 10^{6} células por ml. El antígeno (OMP26) se suspendió en un medio de cultivo en 10 veces una serie de dilución y se filtró de manera estéril. La suspensión celular y el antígeno se agregó en triplicado en placas multifuente de fondo chato para dar lugar a un volumen final de 0,2 ml por fuente. La proliferación del linfocito se estimó mediante la incorporación de [^{3}H] timidita durante los últimos 8 a 4 días de cultivo. Los resultados se calcularon mediante la substracción del fondo de los medios geométricos de fuentes triplicadas, y luego con el cálculo de la media geométrica +/- el error estándar del grupo de tratamiento entero.

Resultados

Los linfocitos del MLN de las ratas OMP26 inmunizadas y no inmunizadas se determinaron mediante respuestas proliferativas antígeno espécíficas. Las células del grupo OMP26 inmunizado respondieron significativamente a la OMP26 en el cultivo in vitro, mientras que las células de las ratas no inmunizadas no mostraron una proliferación significativa (figura 7A). Los linfocitos de las ratas inmunizadas con OMP26 también se cultivaron con extractos de OMP de cuatro cepas de H. influenzae para determinar las respuestas reactivas cruzadas. Las respuestas proliferativas significativas se detectaron en los linfocitos del grupo OMP26 inmunizado para los extractos de OMP de las cepas NTHI-I, NTHI-II y HI-CD, pero no se observó ninguna proliferación significativa para el extracto de la cepa Hib-II (figuras 7B-E).

Ejemplo 2 Clonación y secuenciación de la OMP26

Se extrajo ADN de NTHi. La región del ADN que codificaba la OMP26 se identificó y se simplificó mediante métodos estándares de PCR usando capas de imprimación diseñadas para reconocer el gen (sintetizado en Biomolecular Resource Facility, John Curtin School of Medical Research, Canberra, ACT, Australia). Después de realizar el análisis para determinar el reconocimiento exitoso del producto correcto, se extrajo el producto PCR ADN.

Se prepararon dos plásmidos. Un producto del ADN contuvo la región que codificaba la señal del péptido y el producto maduro de la OMP26, y el segundo codificaba la OMP26 madura final (sin el péptido de la señal principal). Los productos de PCR ADN fueron digeridos con las endonucleasas Hindiii para la OMP26 más el péptido de señal y NspBII más HindIII para la OMP26 madura. El ADN digerido fue recuperado y ligado a las zonas SmaI e HindIII en los plásmidos pQE30 o pQE31 (Giagen GmbH, Hilden, Alemania) para la OMP26 más el péptido de señal o la proteína madura OMP26 respectivamente. Luego se purificaron y se precipitaron los plásmidos. La secuenciación se llevó a cabo mediante el procedimiento de secuenciación dye doxy-terminator en la Biomolecular Resource Facility (instalación de recursos biomoleculares), John Curtis School of Medical Research, Canberra, Australia.

Resultados

La secuencia mostrada en la figura 1 representa tanto la OMP26 madura, como el péptido de señal. La secuencia del péptido de señal comprende los primeros veintitrés aminoácidos. El producto final expresado por NTHi en la membrana exterior comienza en el aminoácido veinticuatro.

Claims

1. Una proteína aislada o recombinante que tiene un peso molecular de 26 kDa, según lo determinado por SDS-PAGE, cuya proteína es una proteína de la membrana exterior de la H. influenzae, y tiene la secuencia N-terminal siguiente:

NH_{2}EEKIAFINAGYIFQHHPDR-AV-K

2. Una proteína, según la reivindicación 1, que abarca la secuencia del aminoácido mostrada en la figura 1 y que comienza en el aminoácido 24 como el aminoácido N-terminal, o una secuencia que es, al menos, un 70% homóloga a esta.

3. Una proteína, según la reivindicación 2, que abarca una secuencia del aminoácido que es, al menos, un 90% homólogo a la secuencia del aminoácido mostrada en la figura 1 y que comienza con el aminoácido 24 como el aminoácido N-terminal.

4. Una proteína de la membrana exterior de la H. influenzae, aislada o recombinante, que abarca la secuencia del aminoácido que se muestra en la figura 1, o una secuencia que es, al menos, un 99% homólogo a esta.

5. Una parte o una región antigénica de una proteína, según lo definido en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, cuya parte o la región antigénica pueda inducir un efecto protector contra la H. influenzae.

6. Una proteína de fusión que abarca una parte o una región antigénica, según una de las reivindicaciones de la 1 a la 4, cuya parte o región antigénica puede inducir un efecto protector contra la H. influenzae.

7. Un ácido nucleico aislado que consiste en una secuencia que se cifra para una proteína según lo definido en cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

8. Un ácido nucleico, según la reivindicación 7, que es una secuencia de ADN.

9. Un ácido nucleico, según la reivindicación 8, que es el mostrado en la figura 1 y que comienza en el ácido nucleico número 69.

10. Un ácido nucleico, según la reivindicación 8, que es el mostrado en la figura 1.

11. Una formulación de vacuna que comprende una proteína según lo definido en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 6, opcionalmente junto con una o más portadores y/o adyuvantes.

12. El uso de una proteína, según lo definido en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 6, en la preparación de una vacuna contra la H. influenzae.

13. El uso de una formulación de vacuna, según lo definido en la reivindicación 11, en la fabricación de un medicamento para la profilaxis o el tratamiento de las infecciones de la zona respiratoria o de la otitis media.

14. El uso de una proteína, según lo definido en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 6, en la fabricación de un diagnóstico para la infección de H. influenzae.

15. Un kit para el uso en la diagnosis de la infección con la H. influenzae, que abarca una proteína según lo definido en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 6.