CN111019000B - 铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白reFPO及制备方法和应用 - Google Patents

铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白reFPO及制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于细菌性抗原技术领域，公开了一种铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白reFPO及制备方法和应用，所述铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白reFPO的核苷酸序列为SEQ ID NO:1；氨基酸序列为SEQ ID NO:2；重组表达载体包含核苷酸序列SEQ ID NO:1。本发明采用pGEX‑6p‑1载体来构建重组表达质粒，表达重组蛋白reFPO，pGEX是表达融合蛋白的载体，所表达的融合蛋白中含有一个蛋白纯化的GST标签。与其他融合载体相比，pGEX系列载体具有纯化条件温和、步骤简单、不需要变性剂的加入，从而使纯化后的蛋白能最大限度保持其空间构象和免疫原性。

Description

铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白reFPO及制备方法和应用
技术领域
本发明属于细菌性抗原技术领域，尤其涉及一种铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白reFPO及制备方法和应用。
背景技术
目前，业内常用的现有技术是这样的：铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)是烧伤、战创伤、机械通气患者等院内感染最常见的病原菌，可导致重症肺炎、肺功能衰竭、脓毒血症乃至死亡。WHO在2017年发布的《新抗生素研究、发现和全球抗生素耐药细菌优先性列表》中将PA列为第二，由此表明，PA感染流行导致的健康问题十分严重。由于PA对抗生素产生多重耐药或泛耐药性，临床治疗效果十分有限。数据显示，2016年PA总分离率为8.69％，特别是机械通气性肺炎中PA的分离率高达22.9％。PA对亚胺培南和美罗培南的年度耐药率已达到23.6％和20.9％。由于PA在临床上的高感染率和耐药率的不断攀升，寻找新的“非抗生素疗法”迫在眉睫。
由于抗生素的滥用等原因，PA的耐药问题逐渐突出，出现了泛耐药铜绿假单胞菌(PDR-PA)和多重耐药铜绿假单胞菌(MDR-PA)，且耐药性PA的分离率逐年上升。从免疫学角度入手，研制开发出安全有效的疫苗成为最为理想的选择，但目前还未见有上市的铜绿假单胞菌疫苗。综上所述，现有技术存在的问题是：研究疫苗的关键是寻找到免疫原性和免疫保护效果好的抗原。研发基因工程疫苗的关键是如何从成千上万的病原体蛋白质组中筛选到良好的保护性抗原分子。
鞭毛是广泛存在于细菌表面的一种细长、弯曲波浪状的超大分子蛋白质机器。是细菌主要的运动器官(Haiko J等2013)。PA单端有1～3根鞭毛，除了负责细菌的运动外，还作为主要的毒力因子，在细菌的粘附与定植、生物膜的形成、激活TLR5并诱导炎症反应等致病过程中发挥关键作用(Klockgether J等2017)。鞭毛是由三十多种蛋白质组成的超大分子蛋白质机器，主要包括基体部(Basal body)、鞭毛钩(Hook)和鞭毛丝(Filament)三个部分，其中由鞭毛丝蛋白(FliC)组装而成的鞭毛丝，位于鞭毛的末端，是起主要的功能结构域。FliC是免疫调控PA感染的关键靶点之一，已经研究表明靶向FliC的疫苗和抗体具有显著的免疫保护效果(SahaSukumar等2017，TanomandAsghar等2013)。然而，天然的FliC制备困难，且易聚集和降解，还需要变性复性的步骤，操作繁琐(SobhanFaezi等2016)，难以满足疫苗抗原的应用。
PcrV是铜绿假单胞菌III型分泌系统的重要组件之一。铜绿假单胞菌的III型分泌系统是由20多个蛋白质组成的注射器样的大复合物，能够将一些毒力因子(如ExoU、ExoS、ExoY、ExoT等)及其它效应蛋白直接注入宿主细胞，引起宿主细胞损伤从而在细菌感染性疾病中发挥重要作用。PcrV能够形成同源多聚体，组装成分泌系统运输毒力因子和效应蛋白的“管道”，是铜绿假单胞菌III型分泌系统的关键组件(Teiji S.等，Critical Care2014)。鉴于PcrV在铜绿假单胞菌致病中的重要作用，该蛋白已成为铜绿假单胞菌感染治疗性抗体针对的重要靶标。抗PcrV的多克隆抗体、单克隆抗体都能够抑制III型分泌系统的分泌，保护机体受到铜绿假单胞菌的入侵(Sawa,T.等.Nat Med 1999，Milla,C.E.等PediatrPulmonol 2014，Frank,D.W.等J Infect Dis 2002，Baer,M.等Infect Immun2009。同样PcrV也是重要的候选疫苗分子，但由于其本身能够形成同源多聚体等原因，目前还未见有可溶性重组表达该蛋白单体的报道。
OprI蛋白为铜绿假单胞菌的外膜脂蛋白(outer membrane lipoprotein)，其位于铜绿假单胞菌的外膜，在细菌的生理和病理过程中发挥重要的作用。OrpL蛋白在铜绿假单胞菌中高度保守，已经有研究将其作为铜绿假单胞菌的诊断靶点(Saint-Onge A等J GenMicrobiol.1992，De Vos D等J ClinMicrobiol.1997，Qin X等J ClinMicrobiol.2003)。虽然OprI仅含有83个氨基酸，但是OprI具有良好的免疫原性和免疫保护性。OprI单独运用或与其它保护性抗原联合应用时能够诱导有效的免疫应答，有效抵抗铜绿假单胞菌的感染(Baumann,U.等Vaccine 2004，Knapp,B.等Vaccine 1999，Mansouri,E.等InfectImmun1999，Toth,A等.Vaccine 1994，von Specht,B.U等.,Infect Immun等1995，vonSpecht,B.U等.,Vaccine 1996，Weimer,E.T.等,Vaccine 2009,Weimer,E.T.等,InfectImmun 2009，Westritschnig,K等.Hum VaccinImmunother2014)。鉴于OprI的这些性质，该蛋白可以作为良好的基因工程疫苗候选抗原，但其分子量较小，免疫原性较弱限制了其进一步应用。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白reFPO及制备方法和应用。本发明所述疫苗具有工艺简单、成本低、可操作性强等优点。
本发明的技术方案是：
本发明第一方面提供了一种铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白reFPO，该疫苗重组蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
所述重组蛋白由FliC蛋白活性片段、PcrV蛋白活性片段和OprI蛋白活性片段通过Linker融合连接，优选地，所述Linker为GSGGSG。
本发明第二方面提供了编码如上述的疫苗重组蛋白的基因，所述基因的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明第三方面提供了一种表达载体，该表达载体插入有如上所述的蛋白。
所述表达载体为pGEX系列载体、pET系列载体及pQE系列载体，优选为pGex-6p-1。
本发明第四方面提供了一种宿主菌，该宿主菌含有如上所述的表达载体。
所述宿主菌为大肠杆菌XL1-blue、BL21系列或HMS174系列，优选为大肠杆菌XL1-blue。
本发明第五方面提供了如上所述的铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白reFPO，在制备用于预防和/或治疗铜绿假单胞菌感染的药物中的应用。
所述疫苗还包含佐剂，所述佐剂优选自氢氧化铝佐剂、磷酸铝佐剂、单硬脂酸铝佐剂、MF59佐剂、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂和分枝杆菌卡介苗佐剂。
本发明第六方面提供了一种铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白reFPO的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)培养上述的宿主菌，诱导所述疫苗重组蛋白的编码基因进行表达；
(2)分离提纯所表达的疫苗重组蛋白。
本发明通过理性设计融合片段的选择，优化了蛋白单体的排序方式和连接的Linker，充分分析蛋白的分子结构、表面电荷分布、结构易近性等基础上，从成百个上千的设计并中筛选到FliC、PcrV和OprI的可溶性融合方式：即reFPO。该蛋白由部分FliC蛋白(Ser21-Arg416)、部分PcrV蛋白(Glu28-Ile294)和部分OprI(Lys25-Phe62)通过柔性Linker(GSGGSG)分子融合连接而成，序列如SEQ ID NO:2所示。
通过理性设计，FliC、PcrV和OprI的片段通过柔性Linker，连接成为全新的蛋白reFPO，连接方式从N端到C端依次为：FliC(Ser21-Arg416)-GSGGSG-PcrV(Glu28-Ile294)-GSGGSG-OprI(Lys25-Phe62)。研究结果表明，reFPO具有独特的物理化学性质和构象，在大肠杆菌中以可溶的形式表达，在水相溶液中稳定存在，避免了FliC、PcrV单体易聚集、OprI单体免疫原性弱等问题，还具有较好的免疫原性和免疫保护效果，这为下一步开发铜绿假单胞菌疫苗等免疫调控手段具有重要的意义。
本发明采用基因工程技术克隆表达此重组蛋白，便于分离纯化，可直接与佐剂(如氢氧化铝佐剂、磷酸铝佐剂、单硬脂酸铝佐剂、MF59、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、分枝杆菌卡介苗佐剂等)配合使用，适用于注射免疫接种。
本发明采用pGEX-6p-1载体来构建重组表达质粒，表达重组蛋白reFPO。pGEX的主要特点是载体上接有一个分子量为26kDa的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，所表达的融合蛋白中就含有一个GST标签，此标签不仅可作为蛋白纯化的标记，还可以帮助融合蛋白的折叠，而使纯化后的蛋白能最大限度保持其空间构象和免疫原性。
本发明通过分子融合表达生产reFPO蛋白，一个分子中就含有三个保护性抗原：FliC、PcrV和OprI，不仅大大简化了生产工艺，还降低了生产成本。
本发明的基因工程重组reFPO蛋白具有以下优点：
1)重组reFPO蛋白能够诱导动物产生特异性的抗体和具有免疫保护效果；利用本发明重组reFPO蛋白制备的亚单位疫苗可通过皮下(肌肉)注射途径进行免疫接种，激发机体产生高滴度IgG抗体。并经动物实验证实，所述reFPO诱导的免疫应答具有良好的抗PA感染的保护效果。
2)重组reFPO蛋白可在原核表达系统－大肠杆菌中表达，与从天然的铜绿假单胞菌的菌体中提取FliC、PcrV、OprI和其它重组表达系统相比，本发明成本低，产量高；
3)重组reFPO蛋白为融合蛋白，一个分子中就含有三个保护性抗原：FliC、PcrV和OprI，。原生产方法需要分别制备抗原FliC、PcrV和OprI三个蛋白，而本发明只需要制备一个蛋白，就可以达到同样的效果。因此，本发明生产工艺简单，生产成本低。
3)选择pGEX载体系列时，reFPO重组蛋白以融合蛋白形式表达；表达载体上接有一个可作为蛋白纯化的标记，还可以帮助融合蛋白的折叠的GST标签，使纯化后的蛋白能最大限度保持其空间构象和免疫原性。
附图说明
图1：重组质粒pGex-6p-1-reFPO的双酶切鉴定结果，其中，泳道1：核酸(DNA)分子量标准(Marker)，从上到下大小分别为：4500、3000、2000、1200、800、500、200bp；泳道2：重组表达质粒pGEX-6p-1-reFPO经酶切后的鉴定结果，酶切后分离的片段约5000bp和约2000bp；
图2：蛋白reFPO诱导鉴定结果，其中，泳道1：蛋白分子量标准(Marker)，从上到下大小分别为：170Kd、130Kd、100Kd、70Kd、55Kd、40Kd、35Kd、25Kd、15Kd、10Kd；泳道2：诱导表达后的全菌超声上清；泳道3：结合诱导表达的超声上清的Glutathione Sepharose 4B填料；泳道4：经PP酶酶切后的上清；泳道5：经PP酶酶切后的Glutathione Sepharose 4B填料；
图3：纯化后的蛋白reFPO SDS-PAGE电泳结果，其中泳道1：蛋白分子量标准(Marker)，从上到下大小分别为：170Kd、130Kd、100Kd、70Kd、55Kd、40Kd、35Kd、25Kd、15Kd、10Kd；泳道2：纯化的reFPO蛋白。
具体实施方式
实施例1基因的合成和亚克隆
reFPO是由FliC蛋白(Ser21-Arg416)、PcrV蛋白(Glu28-Ile294)和OprI蛋白(Lys25-Phe62)通过柔性Linker—GSGGSG分子融合连接而成，连接方式从N端到C端依次为：FliC(Ser21-Arg416)-GSGGSG-PcrV(Glu28-Ile294)-GSGGSG-OprI(Lys25-Phe62)。
reFPO的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
SerSerAsnAspLeuAsnThrSerLeuGlnArgLeuThrThrGlyTyrArgIleAsnSerAlaLysAspAspAlaAlaGlyLeuGlnIleSerAsnArgLeuSerAsnGlnIleSerGlyLeuAsnValAlaThrArgAsnAlaAsnAspGlyIleSerLeuAlaGlnThrAlaGluGlyAlaLeuGlnGlnSerThrAsnIleLeuGlnArgIleArgAspLeuAlaLeuGlnSerAlaAsnGlySerAsnSerAspAlaAspArgAlaAlaLeuGlnLysGluValAlaAlaGlnGlnAlaGluLeuThrArgIleSerAspThrThrThrPheGlyGlyArgLysLeuLeuAspGlySerPheGlyThrThrSerPheGlnValGlySerAsnAlaTyrGluThrIleAspIleSerLeuGlnAsnAlaSerAlaSerAlaIleGlySerTyrGlnValGlySerAsnGlyAlaGlyThrValAlaSerValAlaGlyThrAlaThrAlaSerGlyIleAlaSerGlyThrValAsnLeuValGlyGlyGlyGlnValLysAsnIleAlaIleAlaAlaGlyAspSerAlaLysAlaIleAlaGluLysMetAspGlyAlaIleProAsnLeuSerAlaArgAlaArgThrValPheThrAlaAspValSerGlyValThrGlyGlySerLeuAsnPheAspValThrValGlySerAsnThrValSerLeuAlaGlyValThrSerThrGlnAspLeuAlaAspGlnLeuAsnSerAsnSerSerLysLeuGlyIleThrAlaSerIleAsnAspLysGlyValLeuThrIleThrSerAlaThrGlyGluAsnValLysPheGlyAlaGlnThrGlyThrAlaThrAlaGlyGlnValAlaValLysValGlnGlySerAspGlyLysPheGluAlaAlaAlaLysAsnValValAlaAlaGlyThrAlaAlaThrThrThrIleValThrGlyTyrValGlnLeuAsnSerProThrAlaTyrSerValSerGlyThrGlyThrGlnAlaSerGlnValPheGlyAsnAlaSerAlaAlaGlnLysSerSerValAlaSerValAspIleSerThrAlaAspGlyAlaGlnAsnAlaIleAlaValValAspAsnAlaLeuAlaAlaIleAspAlaGlnArgGlySerGlyGlySerGlyGlySerGluGlnGluGluLeuLeuAlaLeuLeuArgSerGluArgIleValLeuAlaHisAlaGlyGlnProLeuSerGluAlaGlnValLeuLysAlaLeuAlaTrpLeuLeuAlaAlaAsnProSerAlaProProGlyGlnGlyLeuGluValLeuArgGluValLeuGlnAlaArgArgGlnProGlyAlaGlnTrpAspLeuArgGluPheLeuValSerAlaTyrPheSerLeuHisGlyArgLeuAspGluAspValIleGlyValTyrLysAspValLeuGlnThrGlnAspGlyLysArgLysAlaLeuLeuAspGluLeuLysAlaLeuThrAlaGluLeuLysValTyrSerValIleGlnSerGlnIleAsnAlaAlaLeuSerAlaLysGlnGlyIleArgIleAspAlaGlyGlyIleAspLeuValAspProThrLeuTyrGlyTyrAlaValGlyAspProArgTrpLysAspSerProGluTyrAlaLeuLeuSerAsnLeuAspThrPheSerGlyLysLeuSerIleLysAspPheLeuSerGlySerProLysGlnSerGlyGluLeuLysGlyLeuSerAspGluTyrProPheGluLysAspAsnAsnProValGlyAsnPheAlaThrThrValSerAspArgSerArgProLeuAsnAspLysValAsnGluLysThrThrLeuLeuAsnAspThrSerSerArgTyrAsnSerAlaValGluAlaLeuAsnArgPheIleGlnLysTyrAspSerValLeuArgAspIleLeuSerAlaIleGlyGlyGlyGlySerLysGluThrGluAlaArgLeuThrAlaThrGluAspAlaAlaAlaArgAlaGlnAlaArgAlaAspGluAlaTyrArgLysAlaAspGluAlaLeuGlyAlaAlaGlnLysAlaGlnGlnThrAlaAspGluAlaAsnGluArgAlaLeuArgMetLeuGluLysAlaSerArgLysGluPhe
reFPO的DNA序列的合成和序列与pGEX-6p-1的连接由上海生工生物工程有限公司合成。在编码reFPO的5‘引入BamH I酶切位点，在其3’引入TGA终止密码子和Xhol酶切位点，通过BamHI和Xhol两个酶切位点连接至表达载体pGEX-6p-1，得到重组质粒pGEX-6p-1-reFPO。
reFPO的DNA序列如SEQ ID NO:1所述：
AGCAGCAATGATCTGAATACCAGCCTGCAGCGTCTGACCACCGGTTATCGTATTAATAGCGCAAAAGATGATGCAGCAGGTCTGCAGATTAGCAATCGTCTGAGCAATCAGATTAGCGGTCTGAATGTTGCAACCCGTAATGCAAATGATGGTATTAGCCTGGCACAGACCGCAGAAGGTGCACTGCAGCAGAGCACCAATATTCTGCAGCGTATTCGTGATCTGGCACTGCAGAGCGCAAATGGTAGCAATAGTGATGCAGATCGTGCAGCCCTGCAGAAAGAAGTTGCAGCACAGCAGGCAGAACTGACCCGTATTAGCGATACCACCACCTTTGGTGGTCGTAAACTGCTGGATGGTAGCTTTGGTACAACCAGCTTTCAGGTGGGTAGCAATGCCTATGAAACCATTGATATTAGTCTGCAGAATGCAAGCGCAAGCGCCATTGGTAGCTATCAGGTTGGTTCAAATGGTGCAGGCACCGTTGCAAGCGTTGCAGGTACAGCAACCGCAAGCGGTATTGCAAGCGGCACCGTTAATCTGGTTGGTGGTGGTCAGGTTAAAAACATTGCCATTGCAGCCGGTGATAGCGCCAAAGCAATTGCAGAAAAAATGGATGGTGCAATTCCGAATCTGAGCGCACGTGCCCGTACCGTTTTTACCGCAGATGTTAGCGGTGTTACCGGTGGTAGCCTGAATTTTGATGTTACCGTTGGCAGCAATACCGTGAGCCTGGCAGGCGTTACCAGCACACAGGATCTGGCAGATCAGCTGAATAGCAATAGCAGCAAACTGGGTATTACCGCCAGCATTAATGATAAAGGTGTTCTGACCATTACCAGCGCAACCGGTGAAAATGTTAAATTTGGTGCCCAGACCGGCACCGCAACCGCAGGTCAGGTTGCAGTTAAAGTTCAGGGTAGTGATGGTAAATTTGAAGCCGCAGCAAAAAATGTTGTTGCAGCGGGTACAGCAGCAACCACCACAATTGTTACCGGCTATGTGCAGCTGAACAGCCCGACCGCATATAGCGTTAGCGGTACAGGCACCCAGGCAAGCCAGGTTTTTGGTAATGCCAGCGCAGCACAGAAAAGCAGCGTTGCAAGTGTGGATATTAGCACAGCCGATGGTGCACAGAATGCGATTGCAGTTGTTGATAATGCACTGGCAGCCATTGATGCACAGCGTGGTAGCGGTGGTTCTGGTGGTTCAGAACAAGAAGAACTGCTGGCCCTGCTGCGTAGCGAACGTATTGTTCTGGCACATGCCGGTCAGCCGCTGAGCGAAGCACAGGTTCTGAAAGCACTGGCATGGCTGCTGGCAGCAAATCCGAGCGCACCGCCTGGTCAAGGTCTGGAAGTTCTGCGTGAAGTGCTGCAGGCACGTCGTCAGCCAGGTGCACAGTGGGATCTGCGCGAATTTCTGGTTAGCGCATATTTTAGCCTGCATGGTCGTCTGGATGAAGATGTTATTGGTGTGTATAAAGATGTGCTGCAGACCCAGGATGGTAAACGTAAAGCACTGCTGGACGAACTGAAAGCCCTGACAGCAGAGCTGAAAGTTTATAGCGTGATTCAGAGCCAGATTAATGCAGCACTGAGCGCAAAACAGGGTATTCGTATTGATGCCGGTGGTATTGATCTGGTTGATCCGACACTGTATGGTTATGCAGTTGGTGATCCGCGTTGGAAAGATAGTCCGGAATATGCACTGCTGAGTAATCTGGATACCTTTAGCGGTAAACTGAGCATCAAAGATTTTCTGAGCGGTAGCCCGAAACAGAGCGGTGAATTAAAAGGTCTGAGTGATGAATATCCGTTCGAGAAAGATAATAATCCGGTGGGTAATTTTGCAACCACCGTTAGCGATCGTAGCCGTCCGCTGAACGATAAAGTTAATGAAAAAACCACGCTGCTGAATGATACCAGCAGCCGTTATAATAGTGCAGTTGAAGCACTGAATCGCTTTATCCAGAAATATGATAGCGTGCTGCGTGATATTCTGAGCGCGATTGGTGGCGGTGGTAGTAAAGAAACCGAAGCACGTCTGACCGCCACCGAAGATGCAGCCGCACGTGCACAGGCACGTGCAGATGAAGCCTATCGTAAAGCCGATGAAGCCCTGGGTGCAGCCCAGAAAGCCCAGCAGACAGCGGATGAAGCAAATGAACGTGCACTGCGTATGCTGGAAAAAGCAAGCCGTAAAGAATTT
本发明所述铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白reFPO的制备方法包括以下步骤：
步骤一，取保存在4℃冰箱中备用的pGEX-6p-1-reFPO/XL-1blue菌液400μL加入到20mL含Amp抗性的LB培养基中进行一次活化，200rpm 37℃培养5～6h后，取10mL一次活化的菌液加入到1000mL含Amp抗性的LB培养基中进行二次活化，37℃培养3～4h至OD600为1.0时；
步骤二，加入200μLIPTG置于16℃摇床中过夜诱导后，12000rpm离心15min收集菌体，再加50mL lysis buffer重悬菌体后，将菌液进行超声裂解3min，收集上清与10ml用于结合GST融合蛋白的Glutathione Sepharose 4B凝胶珠结合处理；
步骤三，向余下约10mL已结合蛋白的Glutathione Sepharose 4B中加入10ml PBS和2ml PreScission protease，室温垂直旋转酶切5h后，离心吸取上清后取20μL样品变性处理，上样10μL进行蛋白电泳，在呈相系统下观察结果，酶切下来的reFPO蛋白分子量～80kDa，与预期蛋白分子量大小相符合。
具体为：
实施例2重组质粒的转化和双酶切鉴定
1.重组质粒的转化从-80℃冰箱取大肠杆菌XL1 blue感受态细胞(上海超研生物科技有限公司)，加入1μL pGEX-6p-1-reFPO合成质粒。冰浴50min，42℃金属浴中热击90s，迅速冰浴2min。加入600μl LB空白培养基，混匀，置于37℃摇床中220rpm振摇1h。
各管以5000rpm室温离心3min.，弃去300μl上清，再重悬菌体，取200μl涂布于，Amp抗性LB平板。平板倒置于37℃培养箱中培养24h。挑取转化平板上分隔良好的菌落，接种于Amp抗性LB培养基中，37℃振荡培养过夜。
2.双酶切鉴定
取37℃摇床培养过夜的重组菌，按照说明书的步骤，通过快速质粒小提试剂盒(天根生化科技有限公司)提取阳性克隆的质粒。使用BamHI(Takara公司)和Xhol(Takara公司)进行酶切，37℃水浴半小时。体系如下：
Figure BDA0002343372840000101
灌制1.0％琼脂糖凝胶，其中含EB(溴化乙锭，上海联迈生物工程有限公司)0.5μg/ml，将上述酶切反应体系中各加入1μl 6×Loading buffer，通过凝胶100V电泳10min后，UV扫描仪观察酶切的结果。结果过发现阳性克隆的质粒被切成2个片段，大片段约5000bp为表达载体pGEX-6P-1部分，小片段约1500bp，为插入的编码reFPO的片段(图1)。
实施例3重组融合蛋白reFPO在原核表达系统－大肠杆菌中诱导表达、纯化及表达形式的鉴定
1.reFPO诱导表达
1)取过夜培养的pGEX-6p-1-reFPO/XL-1blue菌液100μL加入10mL Amp+抗性的LB培养基中，180rpm 37℃过夜培养，分别取过夜培养的菌液400μL加入20mL Amp+抗性的LB培养基中(余下的菌液保存在4℃冰箱中备用)，37℃培养2～3h，转速200rpm，二次活化至OD600为0.8-1.0时，加入IPTG 4μL，使其终浓度为200μM，再置于摇床诱导表达30℃诱导表达3h。
2)将诱导表达后的菌液取出，以12000rpm离心5min，弃去上清，加入1mL lysisbuffer(20mM PB,pH 7.2,250mM Nacl)混匀，超声裂解3min(超声6次，30s/次)，再4℃14000rpm离心15min,分离上清和沉淀。
2.处理上清
取Glutathione Sepharose 4B 40μl，用PBS洗涤3次后，将准备好的上清加入Glutathione Sepharose 4B中，室温结合1h。在4℃下以14000rpm离心3min后，使用PBS-0.25％吐温20洗涤2次，PBS洗涤一次。取结合后目的蛋白的Glutathione Sepharose 4B填料20ul，加入20μL 2×蛋白质上样buffer，煮沸5min，14000rpm离心3min。
3.酶切样品的制备
向余下约20μL已结合蛋白的Glutathione Sepharose 4B填料中加入80μL PBS和20μLPreScission protease(PP酶，GE公司)，室温垂直旋转酶切5h后，离心吸取上清，加入20μL 6×蛋白质上样buffer进行制样；酶切后的填料使用200μL PBS洗涤3次，然后用20μLPBS重悬Glutathione Sepharose 4B酶切后填料，加入20μL 2×蛋白质上样buffer蛋白制样。
4.SDS-PAGE电泳
将5％浓缩胶灌入制胶版中，在加入蒸馏水将胶压平，室温放置30min使其凝固，将上层的蒸馏水倒干，再灌入10％分离胶，立即插上梳子，室温放置30min使其凝固备用。将处理好的上清和沉淀分别取10μL上样，进行SDS-PAGE电泳。电压先80v电泳30min，再调至180v，电泳1～2h后，将胶取出，置于考马斯亮蓝染色液中振荡染色，再置于脱色液中振荡脱色后，在成像系统下观察结果：reFPO与GST标签融合后在大肠杆菌中以可溶的形式表达，酶切祛除GST标签后该蛋白仍然稳定存在(图2)。
实施例4 reFPO抗原的制备
1.放大培养获取蛋白
取保存在4℃冰箱中备用的pGEX-6p-1-reFPO/XL-1blue菌液400μL加入到20mL含Amp抗性的LB培养基中进行一次活化，200rpm 37℃培养5～6h后，取8mL一次活化的菌液加入到400mL含Amp抗性的LB培养基中进行二次活化，37℃培养3～4h至OD600为1.0时，加入80μL IPTG(终浓度为200μM)置于16℃摇床中过夜诱导后，12000rpm离心15min收集菌体,再加20mL lysis buffer(同实施例3)重悬菌体后，将菌液进行超声裂解3min(200V)，收集上清与800μL用于结合GST融合蛋白的Glutathione Sepharose 4B(GE公司)凝胶珠(beads)结合处理；再进行SDS-PAGE凝胶电泳。
2.使用酶切方法，将目的蛋白和GST标签分开，获取reFPO目的蛋白
向余下约800μL已结合蛋白的Glutathione Sepharose 4B中加入800μL PBS和120μL PreScission protease(PP酶，GE公司)，室温垂直旋转酶切5h后，离心吸取上清后，分别用800μL PBS洗涤3次，各后取10μL样品变性处理后，上样5μL进行蛋白电泳(方法同上)，在呈相系统下观察结果，酶切下来的reFPO蛋白分子量在60-80kDa之间，与预期蛋白分子量大小相符合，见图3。
实施例5动物的免疫
1)SPF级BALB/C 6～8周龄雌性小鼠15只，分成实验组、佐剂对照组和阴性对照组，每组5只，购于北京华阜康公司。
2)首次免疫，用PBS稀释reFPO抗原，加入浓度为1mg/mL的Al(OH)3；用5号半型针头，双侧大腿肌肉注射。实验组每只BALB/C小鼠注射量为100μL，含有reFPO 50μg和Al(OH)3100μg；佐剂对照组每只BALB/C小鼠注射量为100μL，含有Al(OH)3 100μg；阴性对照组每只BALB/C小鼠注射量为100μL PBS,不含有蛋白和Al(OH)3佐剂。
2)第二次免疫，第14天进行第二次免疫，免疫组分同上，注射量蛋白抗原量与首次免疫相同，免疫途径同上；
3)第三次免疫，第21天进行第三次免疫，免疫组分同上，注射量蛋白抗原量与首次免疫相同，免疫途径同上；
实施例6抗体的检测
第三次免疫后第7天，采集BALB/C小鼠的血，用ELISA检测小鼠免疫后抗原特异性IgG应答水平。
1.制备液体
1)包被液的配制：称取Na2CO31.6 g，NaHCO3 2.9g，溶于1L ddH2O，用PH计将pH调至9.6；
2)封闭液的配制：1g牛血清Ⅴ，溶于100mL抗体稀释液(1:100)；
3)抗体稀释液的配制：将磷酸盐溶于1L ddH2O，再加入500μL Tween 20，再用PH计将pH调至7.4；
4)洗涤液的制备：同抗体稀释液
5)显色液(TMB)，为天根公司产品；
6)终止液(2MH2SO4)的制备：将22.2mL浓硫酸倾注入177.8mL ddH2O中。
2.ELISA检测reFPO重组蛋白免疫小鼠产生的抗体效价
1)用包被液将纯化后的reFPO重组蛋白稀释为2μg/mL。
2)包被：将重组蛋白稀释液加入酶标板，100μL/孔，4℃过夜后用洗涤液洗涤3遍，空干后用保鲜膜包上，置于4℃冰箱中备用；
3)封闭：酶标板加封闭液200μL/孔，置于37℃孵育箱中2小时，洗涤3遍；
4)将血清进行1:1000、1:2000、1:4000、1:8000等2倍倍比稀释；
5)取封闭好的酶标板，依次加入稀释血清，100μL/孔，置于37℃孵育箱1h，洗涤3遍，空干；
6)将加HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体保存液，稀释1：5000，制成抗体工作液；
7)加入稀释抗体工作液，100μL/孔，置于37℃孵育箱40min，洗涤三遍，空干；
8)加入底物显色液(TMB)100μL/孔，室温避光反应5min；
9)加入终止液(2M H2SO4)，立即置于酶标仪上以450nm波长处测定OD值；
10)结果判断：A样品/A阴性值≧2.1为阳性(阴性对照为小鼠免疫前血清1:1000倍稀释)。
结果：检测reFPO蛋白抗原免疫小鼠产生的抗体效价达到1:2048000；第三次免疫后第7天的抗体阳性率达到100％，说明本发明构建的reFPO重组蛋白能够使免疫小鼠体内产生抗体。而佐剂对照组和阴性对照组抗reFPO抗体效价未见明显变化。
实施例7 reFPO重组蛋白动物免疫的攻毒保护评价
reFPO重组蛋白动物免疫的攻毒保护评价按照参考文献：铜绿假单胞菌感染肺炎的动物模型的建立方法(国家发明专利201610117674.9)。简要地说，reFPO末次免疫后10～14天，用生理盐水将准备PA XN-1菌液并调节浓度至1.5×1010CFU/mL，用异氟烷麻醉小鼠后采用滴鼻的方式感染，每只小鼠感染量为20μL，采用同样剂量的生理盐水(NS)作为空白对照。感染结束后每隔1天观察小鼠死亡情况，观察周期为7天，观察期结束后剩余动物以CO2吸入法安乐处死。统计各组小鼠的存活率。结果示于表1。
表1 reFPO重组蛋白免疫小鼠后的攻毒保护效果
Figure BDA0002343372840000151
表1显示：阴性对照组和空白对照组的存活率为分别为16.7％和13.3％，重组融合蛋白reFPO加Al(OH)3佐剂组的存活率为93.3％，通过公式：保护率＝(对照组死亡率-实验组死亡率)/对照组死亡率×100％，计算得到reFPO的保护率为92.2％。因此，本发明的reFPO重组蛋白具有良好的免疫原性，能够诱导机体产生免疫应答，并且能够对PA XN-1的感染起到保护作用，可以辅以铝佐剂制备亚单位疫苗用于预防铜绿假单胞菌的感染。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 重庆艾力彼生物科技有限公司
<120> 铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白reFPO及制备方法和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2211
<212> DNA
<213> reFPO的DNA序列(The REFPO DNA sequence)
<400> 1
agcagcaatg atctgaatac cagcctgcag cgtctgacca ccggttatcg tattaatagc 60
gcaaaagatg atgcagcagg tctgcagatt agcaatcgtc tgagcaatca gattagcggt 120
ctgaatgttg caacccgtaa tgcaaatgat ggtattagcc tggcacagac cgcagaaggt 180
gcactgcagc agagcaccaa tattctgcag cgtattcgtg atctggcact gcagagcgca 240
aatggtagca atagtgatgc agatcgtgca gccctgcaga aagaagttgc agcacagcag 300
gcagaactga cccgtattag cgataccacc acctttggtg gtcgtaaact gctggatggt 360
agctttggta caaccagctt tcaggtgggt agcaatgcct atgaaaccat tgatattagt 420
ctgcagaatg caagcgcaag cgccattggt agctatcagg ttggttcaaa tggtgcaggc 480
accgttgcaa gcgttgcagg tacagcaacc gcaagcggta ttgcaagcgg caccgttaat 540
ctggttggtg gtggtcaggt taaaaacatt gccattgcag ccggtgatag cgccaaagca 600
attgcagaaa aaatggatgg tgcaattccg aatctgagcg cacgtgcccg taccgttttt 660
accgcagatg ttagcggtgt taccggtggt agcctgaatt ttgatgttac cgttggcagc 720
aataccgtga gcctggcagg cgttaccagc acacaggatc tggcagatca gctgaatagc 780
aatagcagca aactgggtat taccgccagc attaatgata aaggtgttct gaccattacc 840
agcgcaaccg gtgaaaatgt taaatttggt gcccagaccg gcaccgcaac cgcaggtcag 900
gttgcagtta aagttcaggg tagtgatggt aaatttgaag ccgcagcaaa aaatgttgtt 960
gcagcgggta cagcagcaac caccacaatt gttaccggct atgtgcagct gaacagcccg 1020
accgcatata gcgttagcgg tacaggcacc caggcaagcc aggtttttgg taatgccagc 1080
gcagcacaga aaagcagcgt tgcaagtgtg gatattagca cagccgatgg tgcacagaat 1140
gcgattgcag ttgttgataa tgcactggca gccattgatg cacagcgtgg tagcggtggt 1200
tctggtggtt cagaacaaga agaactgctg gccctgctgc gtagcgaacg tattgttctg 1260
gcacatgccg gtcagccgct gagcgaagca caggttctga aagcactggc atggctgctg 1320
gcagcaaatc cgagcgcacc gcctggtcaa ggtctggaag ttctgcgtga agtgctgcag 1380
gcacgtcgtc agccaggtgc acagtgggat ctgcgcgaat ttctggttag cgcatatttt 1440
agcctgcatg gtcgtctgga tgaagatgtt attggtgtgt ataaagatgt gctgcagacc 1500
caggatggta aacgtaaagc actgctggac gaactgaaag ccctgacagc agagctgaaa 1560
gtttatagcg tgattcagag ccagattaat gcagcactga gcgcaaaaca gggtattcgt 1620
attgatgccg gtggtattga tctggttgat ccgacactgt atggttatgc agttggtgat 1680
ccgcgttgga aagatagtcc ggaatatgca ctgctgagta atctggatac ctttagcggt 1740
aaactgagca tcaaagattt tctgagcggt agcccgaaac agagcggtga attaaaaggt 1800
ctgagtgatg aatatccgtt cgagaaagat aataatccgg tgggtaattt tgcaaccacc 1860
gttagcgatc gtagccgtcc gctgaacgat aaagttaatg aaaaaaccac gctgctgaat 1920
gataccagca gccgttataa tagtgcagtt gaagcactga atcgctttat ccagaaatat 1980
gatagcgtgc tgcgtgatat tctgagcgcg attggtggcg gtggtagtaa agaaaccgaa 2040
gcacgtctga ccgccaccga agatgcagcc gcacgtgcac aggcacgtgc agatgaagcc 2100
tatcgtaaag ccgatgaagc cctgggtgca gcccagaaag cccagcagac agcggatgaa 2160
gcaaatgaac gtgcactgcg tatgctggaa aaagcaagcc gtaaagaatt t 2211
<210> 2
<211> 737
<212> PRT
<213> reFPO的氨基酸序列(The amino acid sequence of REFPO)
<400> 2
Ser Ser Asn Asp Leu Asn Thr Ser Leu Gln Arg Leu Thr Thr Gly Tyr
1 5 10 15
Arg Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Leu Gln Ile Ser Asn
20 25 30
Arg Leu Ser Asn Gln Ile Ser Gly Leu Asn Val Ala Thr Arg Asn Ala
35 40 45
Asn Asp Gly Ile Ser Leu Ala Gln Thr Ala Glu Gly Ala Leu Gln Gln
50 55 60
Ser Thr Asn Ile Leu Gln Arg Ile Arg Asp Leu Ala Leu Gln Ser Ala
65 70 75 80
Asn Gly Ser Asn Ser Asp Ala Asp Arg Ala Ala Leu Gln Lys Glu Val
85 90 95
Ala Ala Gln Gln Ala Glu Leu Thr Arg Ile Ser Asp Thr Thr Thr Phe
100 105 110
Gly Gly Arg Lys Leu Leu Asp Gly Ser Phe Gly Thr Thr Ser Phe Gln
115 120 125
Val Gly Ser Asn Ala Tyr Glu Thr Ile Asp Ile Ser Leu Gln Asn Ala
130 135 140
Ser Ala Ser Ala Ile Gly Ser Tyr Gln Val Gly Ser Asn Gly Ala Gly
145 150 155 160
Thr Val Ala Ser Val Ala Gly Thr Ala Thr Ala Ser Gly Ile Ala Ser
165 170 175
Gly Thr Val Asn Leu Val Gly Gly Gly Gln Val Lys Asn Ile Ala Ile
180 185 190
Ala Ala Gly Asp Ser Ala Lys Ala Ile Ala Glu Lys Met Asp Gly Ala
195 200 205
Ile Pro Asn Leu Ser Ala Arg Ala Arg Thr Val Phe Thr Ala Asp Val
210 215 220
Ser Gly Val Thr Gly Gly Ser Leu Asn Phe Asp Val Thr Val Gly Ser
225 230 235 240
Asn Thr Val Ser Leu Ala Gly Val Thr Ser Thr Gln Asp Leu Ala Asp
245 250 255
Gln Leu Asn Ser Asn Ser Ser Lys Leu Gly Ile Thr Ala Ser Ile Asn
260 265 270
Asp Lys Gly Val Leu Thr Ile Thr Ser Ala Thr Gly Glu Asn Val Lys
275 280 285
Phe Gly Ala Gln Thr Gly Thr Ala Thr Ala Gly Gln Val Ala Val Lys
290 295 300
Val Gln Gly Ser Asp Gly Lys Phe Glu Ala Ala Ala Lys Asn Val Val
305 310 315 320
Ala Ala Gly Thr Ala Ala Thr Thr Thr Ile Val Thr Gly Tyr Val Gln
325 330 335
Leu Asn Ser Pro Thr Ala Tyr Ser Val Ser Gly Thr Gly Thr Gln Ala
340 345 350
Ser Gln Val Phe Gly Asn Ala Ser Ala Ala Gln Lys Ser Ser Val Ala
355 360 365
Ser Val Asp Ile Ser Thr Ala Asp Gly Ala Gln Asn Ala Ile Ala Val
370 375 380
Val Asp Asn Ala Leu Ala Ala Ile Asp Ala Gln Arg Gly Ser Gly Gly
385 390 395 400
Ser Gly Gly Ser Glu Gln Glu Glu Leu Leu Ala Leu Leu Arg Ser Glu
405 410 415
Arg Ile Val Leu Ala His Ala Gly Gln Pro Leu Ser Glu Ala Gln Val
420 425 430
Leu Lys Ala Leu Ala Trp Leu Leu Ala Ala Asn Pro Ser Ala Pro Pro
435 440 445
Gly Gln Gly Leu Glu Val Leu Arg Glu Val Leu Gln Ala Arg Arg Gln
450 455 460
Pro Gly Ala Gln Trp Asp Leu Arg Glu Phe Leu Val Ser Ala Tyr Phe
465 470 475 480
Ser Leu His Gly Arg Leu Asp Glu Asp Val Ile Gly Val Tyr Lys Asp
485 490 495
Val Leu Gln Thr Gln Asp Gly Lys Arg Lys Ala Leu Leu Asp Glu Leu
500 505 510
Lys Ala Leu Thr Ala Glu Leu Lys Val Tyr Ser Val Ile Gln Ser Gln
515 520 525
Ile Asn Ala Ala Leu Ser Ala Lys Gln Gly Ile Arg Ile Asp Ala Gly
530 535 540
Gly Ile Asp Leu Val Asp Pro Thr Leu Tyr Gly Tyr Ala Val Gly Asp
545 550 555 560
Pro Arg Trp Lys Asp Ser Pro Glu Tyr Ala Leu Leu Ser Asn Leu Asp
565 570 575
Thr Phe Ser Gly Lys Leu Ser Ile Lys Asp Phe Leu Ser Gly Ser Pro
580 585 590
Lys Gln Ser Gly Glu Leu Lys Gly Leu Ser Asp Glu Tyr Pro Phe Glu
595 600 605
Lys Asp Asn Asn Pro Val Gly Asn Phe Ala Thr Thr Val Ser Asp Arg
610 615 620
Ser Arg Pro Leu Asn Asp Lys Val Asn Glu Lys Thr Thr Leu Leu Asn
625 630 635 640
Asp Thr Ser Ser Arg Tyr Asn Ser Ala Val Glu Ala Leu Asn Arg Phe
645 650 655
Ile Gln Lys Tyr Asp Ser Val Leu Arg Asp Ile Leu Ser Ala Ile Gly
660 665 670
Gly Gly Gly Ser Lys Glu Thr Glu Ala Arg Leu Thr Ala Thr Glu Asp
675 680 685
Ala Ala Ala Arg Ala Gln Ala Arg Ala Asp Glu Ala Tyr Arg Lys Ala
690 695 700
Asp Glu Ala Leu Gly Ala Ala Gln Lys Ala Gln Gln Thr Ala Asp Glu
705 710 715 720
Ala Asn Glu Arg Ala Leu Arg Met Leu Glu Lys Ala Ser Arg Lys Glu
725 730 735
Phe

Claims (12)

1.一种铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白reFPO，其特征在于，该疫苗重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
2.编码权利要求1所述的铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白reFPO的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
3.一种表达载体，其特征在于，该表达载体插入权利要求2所述的基因。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为pGex系列载体、pET系列载体及pQE系列载体。
5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为pGex-6p-1。
6.一种表达如权利要求3-5任一所述表达载体的宿主菌。
7.权利要求6所述的宿主菌，其特征在于，所述宿主菌为大肠杆菌XL1-blue、BL21系列或HMS174系列。
8.根据权利要求7所述的宿主菌，其特征在于，所述宿主菌为大肠杆菌XL1-blue。
9.权利要求1所述的铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白reFPO在制备用于预防和/或治疗铜绿假单胞菌感染的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其中，所述疫苗还包含佐剂。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述佐剂选自氢氧化铝佐剂、磷酸铝佐剂、单硬脂酸铝佐剂、MF5佐剂9、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂或分枝杆菌卡介苗佐剂。
12.权利要求1所述的铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白reFPO的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
（1）培养权利要求6-8任一所述的宿主菌，诱导所述铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白reFPO的编码基因进行表达；
（2）分离提纯所表达的铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白reFPO。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105669844A (zh) * 2016-03-02 2016-06-15 中国人民解放军第三军医大学 一种铜绿假单胞菌重组蛋白Vac33的纯化方法
CN108778322A (zh) * 2015-10-21 2018-11-09 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 铜绿假单胞菌pcrv连接的抗原疫苗

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010107778A1 (en) * 2009-03-18 2010-09-23 Wake Forest University Health Sciences Flagellin fusion proteins and use thereof to induce immune responses against pseudomonas aeruginosa

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108778322A (zh) * 2015-10-21 2018-11-09 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 铜绿假单胞菌pcrv连接的抗原疫苗
CN105669844A (zh) * 2016-03-02 2016-06-15 中国人民解放军第三军医大学 一种铜绿假单胞菌重组蛋白Vac33的纯化方法

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