CN108778322A - 铜绿假单胞菌pcrv连接的抗原疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了包含共价连接至铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PcrV载体蛋白的抗原(例如糖抗原)的缀合物,所述铜绿假单胞菌PcrV载体蛋白包含与SEQ ID NO:1‑4的序列具有至少80%同一性的氨基酸序列,其中所述抗原(直接或通过接头)连接至铜绿假单胞菌PcrV载体蛋白的氨基酸残基。本发明还公开了含有糖基化位点共有序列的铜绿假单胞菌PcrV蛋白。
Description
技术领域
本发明涉及以下领域:基于缀合物的免疫原性组合物和疫苗、其制备以及此类组合物在医学中的用途。更具体而言,其涉及PcrV作为来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的新的载体蛋白的用途。PcrV可以用作其他抗原的载体蛋白,特别是糖抗原或其他缺乏T细胞表位的抗原。PcrV载体蛋白可以作为载体蛋白和本身作为抗原。
背景
长久以来,已经建立了T非依赖性抗原与载体蛋白的缀合作为使T细胞帮助成为正常T非依赖性抗原的免疫应答的一部分的一种方式。以这种方式,可以通过允许免疫记忆的发展和应答的加强能力(boostability)来增强免疫应答。已经通过将细菌荚膜糖与载体蛋白缀合而开发出的成功的缀合疫苗是本领域已知的;载体蛋白具有将T非依赖性多糖抗原变成能够引发免疫记忆应答的T依赖性抗原的已知作用。例如,WO 02/58737公开了包含与载体蛋白缀合的来自脑膜炎奈瑟球菌(N. meningitidis)血清组A、C、W135和Y的纯化荚膜多糖的疫苗。
本领域已知几种载体蛋白,其中破伤风类毒素、白喉类毒素、CRM197和来自流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)的蛋白D在商品化疫苗中用作载体蛋白。白喉毒素和包括CRM197在内的突变体形式也已作为糖类安全有效的T细胞依赖性载体被用于疫苗中。CRM197目前用于流感嗜血杆菌b型寡糖CRM197缀合疫苗中(HibTitre®;Lederle PraxisBiologicals,Rochester,N.Y.)。
由假单胞菌的菌株(例如铜绿假单胞菌)感染引起的疾病是全世界的主要威胁。虽然正在开发针对这种感染的疫苗,但仍然非常需要能够大量安全生产的针对假单胞菌感染的有效疫苗。
本发明提供了一种新的载体蛋白。传统上,铜绿假单胞菌PcrV蛋白质不被用作载体蛋白。本文公开了这样的缀合物,其中PcrV蛋白作为糖抗原的载体蛋白且另外本身作为抗原,从而产生针对PcrR的中和免疫应答,并且产生对LPS的调理应答。
因此,在本发明的一个方面中,提供了包含共价连接至铜绿假单胞菌PcrV载体蛋白的抗原的缀合物,所述铜绿假单胞菌PcrV载体蛋白包含与SEQ ID NO:1-4的序列具有至少80%同一性的氨基酸序列,其中抗原(直接或通过接头)连接至铜绿假单胞菌PcrV载体蛋白的氨基酸残基。
根据本发明的第二方面,提供了具有与SEQ ID NO:1-4的序列具有至少80%同一性的氨基酸序列的PcrV蛋白,所述氨基酸序列包含D/E-X-N-X-S/T共有序列,其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸。
根据本发明的另一方面,提供了包含本发明的缀合物或PcrV蛋白和药学上可接受的赋形剂的免疫原性组合物。
根据本发明的另一方面,提供了制备本发明的免疫原性组合物的方法,其包括将本发明的缀合物或PcrV蛋白与药学上可接受的赋形剂混合的步骤。
根据本发明的另一方面,提供了用于治疗感染的根据本发明的缀合物或PcrV蛋白,并且使用根据本发明的PcrV蛋白的缀合物的治疗方法是本发明的另一方面。
根据本发明的另一方面,提供了编码根据本发明的铜绿假单胞菌PcrV蛋白的多核苷酸和编码PcrV蛋白的多核苷酸,所述多核苷酸具有编码具有与SEQ ID NO:1-4中任一者具有至少80%同一性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。
根据本发明的另一方面,提供了包含本发明的多核苷酸的载体。
根据本发明的另一方面,提供了宿主细胞,其包含:
i) 编码糖基转移酶的核酸;
ii) 编码寡糖基转移酶的核酸;和
iii) 编码根据本发明的铜绿假单胞菌PcrV蛋白的核酸。
根据本发明的另一方面,提供了产生包含与糖连接的铜绿假单胞菌PcrV蛋白的生物缀合物的方法,所述方法包括在适合于生产蛋白的条件下培养本发明的宿主细胞。
根据本发明的另一方面,提供了通过本发明方法产生的生物缀合物,其中所述生物缀合物包含与铜绿假单胞菌PcrV蛋白连接的糖。
附图说明
图1 来自产生生物缀合物的经修饰的宿主细胞的周质提取物的蛋白质印迹。示出如实施例中所述的菌株。“Int.”指整合的组分。“*”指使用转座子介导的方法的整合。
图2-描绘了铜绿假单胞菌的O6 O-抗原的重复单元结构。*表示根据亚血清型身份可以改变其化学组成的位置。可变性由酰胺酶的活性引入,所述酰胺酶将C6处的GalNAcA残基的酸官能团转化为酰胺,产生GalNAcAN(或GalNFmA至GalNFmAN;在一些亚血清型中乙酰基取代GalNAcAN *残基的C3)。GalNX残基之一的重复单元的聚合(wzy)、乙酰化、甲酰化和酰胺化的基因是未知的。L-Rha, L-鼠李糖;D-GalNAcAN, 6-氨基-2-N-乙酰基-D-半乳糖胺醛酸(galactosaminuronic acid);D-GalNFmAN, 2-N-甲酰基-D-半乳糖胺醛酸;D-QuiNAc,N-乙酰基-D-醌胺(quinosamine)。
图3.铜绿假单胞菌O6甲酰基转移酶的功能测试。
3A:通过蛋白质印迹检测结合脂质A核心的甲酰化的单一O6重复单元。将大肠杆菌W3110 Δwec用编码(不完整)rfbO6簇的黏粒和编码O6甲酰基转移酶的表达质粒(fmtO6;SEQ NO:2)转化。在37℃在LB培养基中生长期间过夜诱导后收集细胞提取物,用蛋白酶K消化,通过SDS PAGE分离,并在硝酸纤维素膜上电印迹。用O6特异性抗血清的免疫检测在存在fmtO6的情况下诱导信号,但在空载体对照中没有诱导信号。该结果强烈表明甲酰化是铜绿假单胞菌细胞上的相关抗原,并且是使用该抗血清进行检测的先决条件。
3B:从十一异戊烯基焦磷酸酯释放的单一O6重复单元上甲酰化的确认。将大肠杆菌W3110 Δwec ΔwaaL用如上相同质粒转化并在摇瓶中生长以产生O6 O抗原单一重复单元(wzy聚合酶在这些菌株中缺失)并分析糖脂。简而言之,重复单元从干的细胞中提取为糖脂,通过与C18筒的亲和力纯化,水解(以从O6 O抗原重复单元除去十一异戊二烯焦磷酸酯),用2氨基苯甲酰胺使用还原胺化标记,并通过正相HPLC分析。fmtO6的共表达在61'洗脱时间产生另外的信号,含有对应于标记的甲酰化O6重复单元的寡糖,而在不存在该基因的情况下,主要信号在58'处发现并且包含标记的N乙酰化O6重复单元。
图4.铜绿假单胞菌O6候选wzy聚合酶的功能测试。将含有编码(不完整)rfb簇(缺少fmtO6和wzy基因)的大肠杆菌W3110 Δwec细胞用编码fmtO6和wzy候选基因PAK_01823(SEQ ID NO:3)的质粒或相应的空载体转化。用蛋白酶K处理细胞提取物,并在SDS PAGE和电转移至硝酸纤维素膜之后通过免疫检测分析LPS。
图5.人工铜绿假单胞菌O6 O抗原表达簇的克隆。首先,使用标准技术通过PCR克隆将铜绿假单胞菌O6菌株stGVXN4017(铜绿假单胞菌O6“PAK”菌株)的rfb簇克隆到黏粒载体中。生物信息学支持的同源性搜索鉴定了甲酰基转移酶(FT)和O-抗原聚合酶(wzy),随后以逐步方式将其插入rfb簇的下游。所得到的基因簇能够在大肠杆菌W3110衍生物中进行完全铜绿假单胞菌O6 O抗原重复单元生物合成(rfbO6+,无聚合物)和多糖(rfbO6++,其中包含wzy)生物合成。
图6描绘了来自产生生物缀合物的经修饰的宿主细胞的周质提取物的蛋白质印迹。示出如实施例中所述的菌株。
6A:经修饰以包含来自铜绿假单胞菌O6的整合pglB和整合rfb簇的“St7343”大肠杆菌菌株的结果。
6B:经修饰以包含来自铜绿假单胞菌O6的质粒携带的pglB和整合的rfb簇的“St7209”大肠杆菌菌株的结果。
6C:经修饰以包含来自铜绿假单胞菌O6的质粒携带的pglB和质粒携带的rfb簇的“St2182”大肠杆菌菌株的结果。
图7.经纯化的EPA-O6糖缀合物。使用金属螯合亲和层析、阴离子交换层析和尺寸排阻层析(SEC)从经修饰的宿主细胞的周质提取物纯化EPA-O6。通过SDS-PAGE然后用考马斯蓝染色或使用所示抗体的蛋白质印迹对最终的SEC洗脱液进行表征。
图8.1和3质粒系统在存在和不存在抗生素选择压力下的质粒保留(PR)。PR以包含相应质粒的细胞的%表示。图A和B显示在存在(A)和不存在(B)卡那霉素的情况下,在具有整合的rfb簇和pglB的修饰的宿主细胞中的EPA质粒(卡那霉素,黑色)的PR。图C和D显示在存在(C)和不存在(D)所有三种抗生素的情况下,修饰的宿主细胞中的EPA质粒(卡那霉素,黑色)、pglB-质粒(壮观霉素,白色)和rfb簇质粒(四环素,点)的PR 。灰色显示保留所有三种质粒的细胞的百分比。Inoc=接种物;U=未诱导的细胞;I4=诱导后6小时的细胞;I6=过夜诱导后的细胞。
图9.疫苗诱导的抗O6抗血清的生物活性。
9A:第三次注射后来自不同接种组的合并的小鼠血清的ELISA中点效价。Non ads=无佐剂的, O/W:表示使用佐剂,水包油乳状液佐剂。单独的O/W是不含有糖缀合物的对照组。
9B:显示调理吞噬(Opsonophagocytotic)杀伤中点效价(与对照相比诱导cfu降低50%)。合并物pII和pIII是在第二次和第三次注射后收集的合并的血清。
图10.来自第14天PIII(第42天)的合并血清中PcrV溶血抑制效价。
图11.来自14天II后(第42天)的个别血清中的抗O6 IgG ELISA效价。
图12.对14天PIII(第24天)个别血清的抗O6调理吞噬效价。
图13.第14天PII(第28天)和14 III后(第42天)大鼠血清中的抗PcrV IgG ELISA效价。
图14.合并的第14天III后(第42天)大鼠血清中的抗O6 IgG ELISA效价。
发明详述
本发明公开了包含共价连接至铜绿假单胞菌PcrV载体蛋白的抗原的缀合物,所述铜绿假单胞菌PcrV载体蛋白包含与SEQ ID NO:1-4的序列具有至少70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列,其中抗原(直接或通过接头)连接至铜绿假单胞菌PcrV载体蛋白的氨基酸残基。
在一个实施方案中,抗原连接的氨基酸残基不是天冬酰胺残基,并且在这种情况下,缀合物通常通过化学缀合产生,为此许多方法是本领域众所周知的。例如,氨基酸选自:Ala、Arg、Asp、Cys、Gly、Glu、Gln、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val。任选地,所述氨基酸是:含有末端胺基团的氨基酸、赖氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、组氨酸、精氨酸或色氨酸。
在一个实施方案中,抗原通过使用化学缀合方法可获得的化学键与铜绿假单胞菌PcrV载体蛋白共价连接。
在一个实施方案中,化学缀合方法选自碳二亚胺化学作用、还原性胺化、氰化化学作用(例如CDAP化学作用)、马来酰亚胺化学作用、酰肼化学作用、酯化学作用和N-羟基琥珀酰亚胺化学作用。任选地,抗原与铜绿假单胞菌PcrV载体蛋白上的天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、组氨酸、精氨酸或色氨酸氨基酸共价连接。
在一个实施方案中,抗原直接连接至铜绿假单胞菌PcrV载体蛋白。
在一个实施方案中,抗原通过接头附接于铜绿假单胞菌PcrV载体蛋白。任选地,接头选自具有4-12个碳原子的接头、双官能接头、末端含有1或2个反应性氨基的接头、B-丙酰胺基、硝基苯基-乙胺、卤代酰基卤化物、6-氨基己酸和ADH。
通常,蛋白载体上以下类型的化学基可以用于偶联/缀合:
A)羧基(例如经天冬氨酸或谷氨酸)。在一个实施方案中,将该基团直接连接至糖上的氨基或用碳二亚胺化学作用例如用EDAC连接至接头上的氨基。
B)氨基(例如经赖氨酸)。在一个实施方案中,将该基团直接连接至糖上的羧基或用碳二亚胺化学作用例如用EDAC连接至接头上的羧基。在另一个实施方案中,该基团直接连接至糖上由CDAP或CNBr活化的羟基或者连接至接头上的此类基团;连接至具有醛基的糖或接头;连接至具有琥珀酰亚胺酯基团的糖或接头。
C)巯基(例如经半胱氨酸)。在一个实施方案中,用马来酰亚胺化学作用将该基团与溴或氯乙酰化的糖或接头连接。在一个实施方案中,该基团由双重氮联苯胺活化/修饰。
D)羟基(例如经由酪氨酸)。在一个实施方案中,该基团由双重氮联苯胺活化/修饰。
E)咪唑基(例如经由组氨酸)。在一个实施方案中,该基团由双重氮联苯胺活化/修饰。
F)胍基(例如经由精氨酸)。
G)吲哚基(例如经由色氨酸)。
在糖上,一般地,下述基团能够用于偶联:OH、COOH或NH2。醛基能够在本领域已知的不同处理后生成,所述处理例如:高碘酸、酸水解、过氧化氢等。
直接偶联方法:
糖-OH + CNBr或CDAP -----> 氰酸酯 + NH2-蛋白 ----> 缀合物
糖-醛 + NH2-蛋白 ----> 希夫碱+ NaCNBH3 ----> 缀合物
糖-COOH + NH2-蛋白 + EDAC ----> 缀合物
糖-NH2 + COOH-蛋白 + EDAC ----> 缀合物
经间隔物(接头)方法的间接偶联:
糖-OH + CNBr或CDAP ---> 氰酸酯 + NH2----NH2 ----> 糖----NH2 + COOH-蛋白 +EDAC -----> 缀合物
糖-OH + CNBr或CDAP ----> 氰酸酯 + NH2-----SH -----> 糖----SH + SH-蛋白(具有暴露的半胱氨酸的天然蛋白,或通过例如SPDP修饰蛋白的氨基后获得) -----> 糖-S-S-蛋白
糖-OH + CNBr或CDAP ---> 氰酸酯 + NH2----SH -------> 糖----SH + 马来酰亚胺-蛋白 (氨基的修饰) ----> 缀合物
糖-COOH + EDAC + NH2-----NH2 ---> 糖------NH2 + EDAC + COOH-蛋白 ----> 缀合物
糖-COOH + EDAC+ NH2----SH -----> 糖----SH + SH-蛋白 (具有暴露的半胱氨酸的天然蛋白,或通过例如SPDP修饰蛋白的氨基后获得) -----> 糖-S-S-蛋白
糖-COOH + EDAC+ NH2----SH -----> 糖----SH + 马来酰亚胺-蛋白 (氨基的修饰)----> 缀合物
糖-醛 + NH2-----NH2 ----> 糖---NH2 + EDAC + COOH-蛋白 ----> 缀合物
注意:可以用任何合适的碳二亚胺代替上文的EDAC。
在一个实施方案中,本发明的缀合物含有抗原连接的氨基酸残基,其中所述氨基酸残基是天冬酰胺残基。
在一个实施方案中,天冬酰胺残基不是引入与SEQ ID NO:1-4的序列具有至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列中的D/E-X-N-X-S/T共有序列的部分,其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸。
然而,在另一个实施方案中,天冬酰胺残基是引入与SEQ ID NO:1-4的序列具有至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列中的D/E-X-N-X-S/T共有序列的部分,其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸,其中天冬酰胺残基位于与SEQ ID NO:3的氨基酸23-166或氨基酸281-317等同的位置处或位于其氨基酸317处。例如,氨基酸24-100、氨基酸24-50、氨基酸310-317。
在一个实施方案中,天冬酰胺残基是引入与SEQ ID NO:1-4的序列具有至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列中的D/E-X-N-X-S/T共有序列的部分,其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸,其中天冬酰胺残基位于SEQ ID NO:4的氨基酸1-143或氨基酸258-294之间或位于其氨基酸294处。例如,在SEQ IDNO:4的氨基酸1-100或氨基酸1-50或氨基酸1-25或氨基酸290-294。
在一个实施方案中,天冬酰胺残基是D/E-X-N-X-S/T共有序列的部分,其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸,其中天冬酰胺残基没有通过突变引入SEQ ID NO:5或与SEQ IDNO:5具有至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的序列中。
在一个实施方案中,通过除去PcrV肽序列并用包含D/E-X-N-X-S/T共有序列的肽将其置换来将包含D/E-X-N-X-S/T共有序列的肽引入氨基酸序列中。在一个实施方案中,去除的PcrV肽序列含有1-7个氨基酸或7、6、7、4、3、2或一个氨基酸。
在一个实施方案中,将包含D/E-X-N-X-S/T共有序列的肽在SEQ ID NO:3的氨基酸残基23-166或SEQ ID NO:4的氨基酸残基1-143之间的位置或在SEQ ID NO:3的氨基酸残基23-100、23-50或SEQ ID NO:4的氨基酸残基1-100、1-50或1-24之间的位置处引入氨基酸序列中。
在一个实施方案中,将至少1、2、3、4或5个D/E-X-N-X-S/T共有序列引入SEQ IDNO:1-4任一者的序列或与其具有至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的序列中。
在一个实施方案中,PcrV载体蛋白具有包含SEQ ID NO:6-62中至少一种,例如SEQID NO:6-12和33的序列。
在一个实施方案中,PcrV载体蛋白具有包含SEQ ID NO:6-12和33的至少1、2、3、4或5个,任选SEQ ID NO:6-12和33的至少3个的序列。
在一个实施方案中,PcrV载体蛋白具有包含SEQ ID NO:6和/或SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO:11和/或SEQ ID NO:33的序列。
在一个实施方案中,抗原是糖例如细菌荚膜糖、细菌脂多糖或脂寡糖。
糖可以选自:脑膜炎奈瑟球菌(N. meningitidis)血清组A荚膜糖(MenA)、脑膜炎奈瑟球菌血清组C荚膜糖(MenC)、脑膜炎奈瑟球菌血清组Y荚膜糖(MenY)、脑膜炎奈瑟球菌血清组W荚膜糖(MenW)、流感嗜血杆菌(H. influenzae)b型荚膜糖(Hib)、组B链球菌组I荚膜糖、组B链球菌组II荚膜糖、组B链球菌组III荚膜糖、组B链球菌组IV荚膜糖、组B链球菌组V荚膜糖、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)5型荚膜糖、金黄色葡萄球菌8型荚膜糖、来自伤寒杆菌(Salmonella typhi)的Vi糖、脑膜炎奈瑟球菌 LPS (诸如L3和/或L2)、卡他莫拉菌(M. catarrhalis)LPS、流感嗜血杆菌LPS、志贺氏菌O抗原、铜绿假单胞菌O抗原、大肠杆菌O抗原和来自诸如来自以下血清型的任何荚膜肺炎球菌糖:1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F或33F。
在一个实施方案中,抗原是来自铜绿假单胞菌的脂多糖。任选地,抗原是来自铜绿假单胞菌的O抗原,任选O1、O2、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O11、O12、O13、O14、O15、O16、O17、O18、O19或O20,例如O6或O11。在一个实施方案中,提供了包含与铜绿假单胞菌O抗原连接的PcrV载体蛋白的生物缀合物,其中所述铜绿假单胞菌O抗原是Knirel等人,2006,Journal of Endotoxin Research 12(6):324-336中描述的血清型之一,其公开内容通过引用整体并入本文。在具体的实施方案中,铜绿假单胞菌O抗原来自O6或O11。
本发明的另一方面是具有与SEQ ID NO:1-4的序列具有至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列的PcrV蛋白,所述氨基酸序列包含D/E-X-N-X-S/T共有序列,其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸。
在一个实施方案中,D/E-X-N-X-S/T共有序列位于SEQ ID NO:3的氨基酸23-166或氨基酸281-317之间或氨基酸317的位置,其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸。
在一个实施方案中,D/E-X-N-X-S/T共有序列位于SEQ ID NO:4的氨基酸1-143或氨基酸258-294之间或氨基酸294,其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸。
在一个实施方案中,通过除去PcrV肽序列并用包含D/E-X-N-X-S/T共有序列的肽将其置换来将包含D/E-X-N-X-S/T共有序列的肽引入氨基酸序列中。在一个实施方案中,PcrV肽序列含有1-7个氨基酸,任选地7、6、5、4、3、2或一个氨基酸。
在一个实施方案中,将包含D/E-X-N-X-S/T共有序列的肽在SEQ ID NO:3的氨基酸残基23-166或SEQ ID NO:4的氨基酸残基1-143之间的位置引入氨基酸序列中。
在一个实施方案中,将包含D/E-X-N-X-S/T共有序列的肽在SEQ ID NO:3的氨基酸残基23-100或23-48或SEQ ID NO:4的氨基酸残基1-75或1-24之间的位置引入氨基酸序列中。
在一个实施方案中,将至少2、3或4个D/E-X-N-X-S/T共有序列或恰好1、2、3、4、5或6个D/E-X-N-X-S/T共有序列引入SEQ ID NO :1-4任一者的序列或与其具有至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的序列中。
在一个实施方案中,PcrV载体蛋白具有包含以下的氨基酸序列:SEQ ID NO:6-62,任选SEQ ID NO:6-12和33中至少一种,任选SEQ ID NO:6-12和33中至少3种。
在一个实施方案中,本发明的PcrV载体蛋白具有包含SEQ ID NO:6和/或SEQ IDNO:9和/或SEQ ID NO:11和/或SEQ ID NO:33的氨基酸序列。
在一个实施方案中,用于产生本文所述生物缀合物的PcrV载体蛋白包含“标签”,即允许分离和/或鉴定载体蛋白的氨基酸序列。例如,向本文描述的载体蛋白添加标签可用于纯化该蛋白质,并因此用于纯化包含标签化的载体蛋白的缀合物疫苗。可用于本文的示例性标签包括但不限于组氨酸(HIS)标签(例如,六组氨酸标签或6XHis标签)、FLAG-标签和HA标签。在某些实施方案中,本文使用的标签是可移除的,一旦其不再需要,例如在蛋白质已经纯化之后,例如通过化学试剂或通过酶促手段去除。
在某些实施方案中,本文所述的载体蛋白包含将载体蛋白靶向表达载体蛋白的宿主细胞的周质空间的信号序列。在一个具体实施方案中,信号序列来自大肠杆菌DsbA、大肠杆菌外膜孔蛋白A(OmpA)、大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(MalE)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwiniacarotovorans)果胶裂解酶(PelB)、FlgI、NikA或芽孢杆菌内切木聚糖酶(XynA)、热不稳定的大肠杆菌肠毒素LTIIb、芽孢杆菌内切木聚糖酶(XynA)或大肠杆菌鞭毛蛋白(FlgI)。在一个实施方案中,本发明的PcrV蛋白包含能够将PcrV蛋白导向细菌周质的前导序列。任选地,前导序列具有与SEQ ID NO:63具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中,在前导序列和成熟蛋白序列的起始之间添加丙氨酸残基。这样的丙氨酸残基具有导致更有效切割前导序列的优点。
在一个实施方案中,本发明的PcrV蛋白具有包含可用于纯化PcrV蛋白的肽标签的氨基酸序列。任选地,肽标签位于氨基酸序列的C端。任选地,肽标签包含六个组氨酸残基。
本发明的另一方面是制备本发明的免疫原性组合物的方法,其包括将缀合物或PcrV蛋白与药学上可接受的赋形剂混合的步骤。
本发明的PcrV蛋白质和缀合物特别适合包含在免疫原性组合物和疫苗中。因此,本发明的方法可以包括配制PcrV蛋白或缀合物作为免疫原性组合物或疫苗的步骤。本发明的另一方面是包含本发明的缀合物或本发明的PcrV蛋白和药学上可接受的赋形剂的免疫原性组合物。本发明的免疫原性组合物任选地还包含额外的抗原。这种额外的抗原的实例是:O-抗原和载体蛋白的缀合物、细菌荚膜多糖和载体蛋白的缀合物、LOS和载体蛋白的缀合物以及蛋白质。合适地,缀合物包含铜绿假单胞菌O1、O2、O3、O4、O5、O6 O7、O8、O9、O10、O11、O12、O13、O14、O15、O16、O17、O18、O19或O20中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种。合适的蛋白还包括铜绿假单胞菌蛋白诸如铜绿假单胞菌胞外蛋白A或其变体诸如描述于WO 13/36574中的那些、铜绿假单胞菌OmpI或OmpF或PopB (YpoB、YopD、FliC)或OprF-OmpI的杂种蛋白(参见US5955090或US6300102)。
本发明的免疫原性组合物和疫苗通常将包含“药学上可接受的赋形剂”,其包括任何本身不诱导产生对接受组合物的个体有害的抗体的任何赋形剂。该组合物通常还含有稀释剂例如水、盐水、甘油等。另外,可以存在辅助物质,例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质、多元醇等。
包含本文所述的缀合物或PcrV蛋白的组合物可包含适用于药物施用的任何其他组分。在具体的实施方案中,本文描述的组合物是单价制剂。在其他实施方案中,本文描述的组合物是多价制剂,例如二价、三价和四价制剂。例如,多价制剂包含多于一种抗原,例如多于一种缀合物。
在某些实施方案中,本文所述的组合物另外包含防腐剂,例如汞衍生物硫柳汞。在具体的实施方案中,本文所述的药物组合物包含0.001%至0.01%的硫柳汞。在其他实施方案中,本文所述的药物组合物不包含防腐剂。
在某些实施方案中,本文所述的组合物(例如免疫原性组合物)包含佐剂或与佐剂组合施用。与本文所述组合物组合施用的佐剂可以在施用所述组合物之前、同时或之后施用。在一些实施方案中,术语“佐剂”是指这样的化合物,所述化合物当与本文描述的组合物一起或作为其一部分施用时,增大、增强和/或加强对生物缀合物的免疫应答,但是当单独施用所述化合物时,不产生对生物缀合物的免疫应答。在一些实施方案中,佐剂对缀合物或PcrV蛋白质产生免疫应答并且不产生过敏或其他不利反应。佐剂可通过几种机制增强免疫应答,包括例如淋巴细胞募集、B和/或T细胞的刺激以及巨噬细胞的刺激。
佐剂的具体实例包括但不限于铝盐(明矾)(如氢氧化铝、磷酸铝和硫酸铝)、3 脱-O-酰化的单磷酰脂质A(MPL)(参见英国专利GB2220211)、MF59(Novartis)、AS03(GlaxoSmithKline)、AS04(GlaxoSmithKline)、聚山梨酸酯80(Tween 80;ICL Americas,Inc.)、咪唑并吡啶化合物(参见国际申请号PCT/US2007/064857,公开为国际公开号WO2007/109812)、咪唑并喹喔啉化合物(参见国际申请号PCT/US2007/064858,公开为国际公开号WO2007/109813)和皂苷例如QS21(参见Kensil等人, in Vaccine Design:TheSubunit and Adjuvant Approach (编辑Powell & Newman, Plenum Press, NY, 1995);美国专利号5,057,540)。在一些实施方案中,佐剂是弗氏佐剂(完全或不完全)。其他佐剂是水包油乳状液(例如角鲨烯或花生油),任选地与免疫刺激剂例如单磷酰脂质A组合(参见Stoute等人, N. Engl. J. Med.336, 86-91 (1997))。另一佐剂是CpG (Bioworld Today,Nov. 15, 1998)。
在某些实施方案中,本文所述的组合物被配制成适合于向主体的预期施用途径。例如,本文所述的组合物可以配制成适用于皮下、肠胃外、口服、真皮内、透皮、结肠直肠、腹膜内和直肠施用。在一个具体的实施方案中,药物组合物可以配制用于静脉内、口服、腹膜内、鼻内、气管内、皮下、肌内、局部、皮内、透皮或肺部施用。
在某些实施方案中,本文描述的组合物另外包含一种或多种缓冲剂,例如磷酸盐缓冲剂和蔗糖磷酸盐谷氨酸盐缓冲剂。在其他实施方案中,本文所述的药物组合物不包含缓冲剂。
在某些实施方案中,本文所述的组合物另外包含一种或多种盐,例如氯化钠、氯化钙、磷酸钠、谷氨酸一钠和铝盐(例如氢氧化铝、磷酸铝、明矾(硫酸铝钾)或这种铝盐的混合物)。在其他实施方案中,本文所述的组合物不包含盐。
本文所述的组合物可以与用于施用的说明书一起包含在容器、包装或分液器中。
本文所述的组合物可以在使用前储存,例如,组合物可以冷冻储存(例如在约-20℃或约-70℃);储存在冷藏条件下(例如约4℃);或在室温下储存。
用作疫苗的免疫原性组合物包含免疫有效量的本发明的PcrV蛋白或缀合物以及任何其他组分。“免疫有效量”是指将该量作为单一剂量或作为系列的一部分施用给个体对治疗或预防有效。该量取决于待治疗个体的健康和身体状况、年龄、所需保护程度、疫苗配制和其他相关因素而不同。预计该量将落入可以通过常规试验确定的相对宽的范围。
本发明的疫苗优选被佐剂化。合适的佐剂包括铝盐诸如氢氧化铝凝胶(明矾)或磷酸铝,但还可以是钙盐、镁盐、铁盐或锌盐,或者可以是酰化酪氨酸、或酰化糖类、阳离子或阴离子衍生的多糖、或聚磷腈的不溶性悬浮液。
优选将佐剂选择为TH1或TH2型应答的优先诱导物。高水平的Th1类型细胞因子趋于促进诱导针对给定抗原的细胞介导的免疫应答,而高水平的Th2类型细胞因子趋于促进诱导针对抗原的体液免疫应答。
重要的是要记住,Th1和Th2型免疫反应的区别并不是绝对的。事实上,个体会支持被描述为主要是Th1或主要是Th2的免疫应答。然而,通常方便的是考虑根据由Mosmann和Coffman的鼠 CD4 +ve T细胞克隆中所述的细胞因子家族(Mosmann, T.R.和Coffman,R.L.(1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion leadto different functional properties.Annual Review of Immunology, 7, p145-173)。常规上,Th1型应答与由T淋巴细胞产生INF-γ和IL-2细胞因子相关。其他通常与Th1型免疫应答的诱导直接相关的细胞因子不是由T细胞产生的,如IL-12。相反,Th2型应答与IL-4、IL-5、IL-6、IL-10的分泌有关。主要促进Th1应答的合适的佐剂系统包括:单磷酰脂质A或其衍生物,特别是3-脱-0-酰化单磷酰脂质A(3D-MPL)(对于其制备参见GB 2220211 A);和单磷酰脂质A、优选3-脱-0-酰化单磷酰脂质A、连同铝盐(例如磷酸铝或氢氧化铝)或水包油乳状液的组合。在此类组合中,抗原和3D-MPL包含在相同的微粒结构中,允许更有效递送抗原和免疫刺激性信号。研究已显示3D-MPL能够进一步增强明矾吸附的抗原的免疫原性[Thoelen等人Vaccine (1998) 16:708-14;EP 689454-B1]。
一种增强的系统涉及单磷酰脂质A和皂苷衍生物的组合,特别是如WO 94/00153中所公开的QS21和3D-MPL的组合,或者如同WO 96/33739中所公开的更低反应原性的组合物,其中用胆固醇将QS21猝灭。涉及水包油乳状液中的QS21、3D-MPL和生育酚的尤其有效能的佐剂制剂描述于W095/17210并且是优选的制剂。优选地,疫苗另外包含皂苷,更优选QS21。制剂还可以包含水包油乳状液和生育酚(WO 95/17210)。本发明还提供了生产疫苗制剂的方法,其包括将本发明的蛋白与药学上可接受的赋形剂如3D-MPL混合在一起。未甲基化的含CpG寡核苷酸(WO 96/02555)也是TH1应答的优先诱导物,并且适用于本发明。
本发明的组合物可含有水包油乳状液,因为这些已被认为可用作佐剂组合物(EP399843;WO 95/17210)。水包油乳状液诸如WO95/17210 (其公开了包含2-10%角鲨烯、2-10%α生育酚和0.3-3% tween 80,且其单独使用或与QS21和/或3D-MPL组合使用)、 WO99/12565(其公开了包含可代谢油、角鲨烯和甾醇和MPL的水包油乳状液组合物)或WO99/11241中描述的那些可以使用。另外的水包油乳状液如WO 09/127676和WO 09/127677中公开的那些也是合适的。
本发明的疫苗制剂可以用于通过经全身性或黏膜途径施用所述疫苗来保护或治疗易于感染的哺乳动物。这些施用可以包括经肌内、腹膜内、皮内或皮下途径注射;或经向口腔/消化道、呼吸道、生殖泌尿道的黏膜施用。疫苗的鼻内施用用于治疗肺炎或中耳炎是优选的(由于肺炎球菌的鼻咽运送可以被更有效地预防,因而在它最早阶段减弱感染)。尽管本发明的疫苗可以作为单一剂量施用,其组分也可以在同一时间或以不同次数一同共施用(例如,肺炎球菌多糖可以单独、在疫苗的任何细菌蛋白组分施用的同一时间或其后1-2周施用,以彼此相关的免疫应答的最适协调)。对于共同施用,任选的Th1佐剂可以存在于任何或所有不同的施用中,但是如果其与疫苗的细菌蛋白质组分组合存在,则是优选的。除了施用的单一途径之外,可以使用2种不同的施用途径。例如,多糖可以IM(或ID)施用,并且细菌蛋白可以IN(或ID)施用。此外,本发明的疫苗可以肌内施用为致敏剂量并且鼻内施用为加强剂量。
选择每一疫苗剂量中缀合物抗原的量为在典型疫苗中诱导免疫保护应答而不具有明显的不良副作用的量。这样的量将根据使用的具体免疫原以及它如何呈现而有所不同。通常,期望每一剂量将包含0.1-100 μg多糖,对于多糖缀合物优选0.1-50 μg、优选0.1-10 μg、更优选1-10 μg,其中1-5 μg是更优选范围。
疫苗中蛋白抗原的含量通常在1-100μg的范围内,优选5-50μg,最常见在5 - 25μg的范围内。初始接种后,主体可以接受一次或适当分隔开的几次加强免疫。
疫苗制剂通常描述于Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach"(Powell M. F.和Newman M.J.编辑)中(1995) Plenum Press New York)。在脂质体内封装由Fullerton, 美国专利4,235,877描述。
本发明的疫苗可以储存于溶液中或者是冷冻干燥的。优选地,将溶液在糖诸如蔗糖、海藻糖或乳糖存在的情况下冻干。还进一步优选的是将它们冻干并在使用前临时重构。
在一个实施方案中,本发明的缀合物或PcrV蛋白质用于治疗感染,特别是治疗铜绿假单胞菌感染,例如对于有需要的人主体。
本发明的另一方面是编码本发明的PcrV蛋白的多核苷酸。例如,编码PcrV蛋白的多核苷酸具有编码多肽的核苷酸序列,所述多肽具有与SEQ ID NO:1-4中的任一者具有至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。包含这种多核苷酸的载体是本发明的另一方面。
本发明的另一方面是宿主细胞,其包含:
i) 编码糖基转移酶的核酸;
ii) 编码寡糖基转移酶的核酸;和
iii) 编码本发明的铜绿假单胞菌PcrV蛋白的核酸。
这种修饰的原核宿主细胞包含编码能够产生含有抗原的生物缀合物(例如与PcrV蛋白质附接的糖抗原)的酶的核酸。这样的宿主细胞可以天然地表达对糖抗原的产生特异性的核酸,或者可以制备宿主细胞以表达这种核酸,即在某些实施方案中,所述核酸对于宿主细胞是异源的。在某些实施方案中,特异于糖抗原产生的一种或多种所述核酸对于宿主细胞是异源的并且整合到宿主细胞的基因组中。在某些实施方案中,本文提供的宿主细胞包含编码在蛋白质的N-糖基化中有活性的额外酶的核酸,例如,本文提供的宿主细胞还包含编码寡糖基转移酶的核酸和/或编码其他糖基转移酶的一种或多种核酸。在某些实施方案中,本文提供的宿主细胞包含编码载体蛋白(例如寡糖和/或多糖可以附着于其上以形成生物缀合物的蛋白)的核酸。在一个具体的实施方案中,宿主细胞是大肠杆菌。
包含可插入本文所述宿主细胞中的rfb基因簇的核酸序列是本领域已知的。在一个具体的实施方案中,插入本文所述的宿主细胞的rfb基因簇是来自大肠杆菌的rfb基因簇,例如,来自本领域已知的任何O血清组/O抗原的大肠杆菌rfb簇,例如,O1、O2、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O11、O12、O13、O14、O15、O16、O17、O18、O19、O20、O21、O22、O23、O24、O25、O26、O27、O28、O29、O30、O32、O33、O34、O35、O36、O37、O38、O39、O40、O41、O42、O43、O44、O45、O46、O48、O49、O50、O51、O52、O53、O54、O55、O56、O57、O58、O59、O60、O61、O62、O63、O64、O65、O66、O68、O69、O70、O71、O73、O74、O75、O76、O77、O78、O79、O80、O81、O82、O83、O84、O85、O86、O87、O88、O89、O90、O91、O92、O93、O95、O96、O97、O98、O99、O100、O101、O102、O103、O104、O105、O106、O107、O108、O109、O110、O111、O112、O113、O114、O115、O116、O117、O118、O119、O120、O121、O123、O124、O125、O126、O127、O128、O129、O130、O131、O132、O133、O134、O135、O136、O137、O138、O139、O140、O141、O142、O143、O144,O145、O146、O147、O148、O149、O150、O151、O152、O153、O154、O155、O156、O157、O158、O159、O160、O161、O162、O163、O164、O165、O166、O167、O168、O169、O170、O171、O172、O173、O174、O175、O176、O177、O178、O179、O180、O181、O182、O183、O184、O185、O186或O187及其亚血清型。在另一个具体的实施方案中,插入本文所述的宿主细胞中的rfb基因簇是来自以下的rfb基因簇:假单胞菌菌株(例如铜绿假单胞菌菌株)、沙门氏菌菌株(例如肠道沙门氏菌(S. enterica)菌株)、耶尔森菌属菌株、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)菌株、弗朗西斯氏菌菌株(例如土拉弗朗西斯菌菌株(F. tularensis))、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)菌株、伯克霍尔德氏菌菌株或志贺氏菌菌株。
包含可插入本文所述宿主细胞中的荚膜多糖基因簇的核酸序列是本领域已知的。在一个具体实施方案中,插入本文所述的宿主细胞中的荚膜多糖基因簇是来自以下的荚膜多糖基因簇:大肠杆菌菌株、链球菌菌株(例如肺炎链球菌、酿脓链球菌(S. pyrogenes)、无乳链球菌(S. agalacticae))、葡萄球菌菌株(例如金黄色葡萄球菌)或伯克霍尔德氏菌菌株(例如鼻疽伯克霍尔德氏菌(B.mallei)、类鼻疽伯克霍尔德氏菌(B. pseudomallei)、泰国伯克霍尔德氏菌(B.thailandensis))。制备能够产生缀合物的此类宿主细胞的方法的公开可见于WO 06/119987、WO 09/104074、WO 11/62615、WO 11/138361、WO 14/57109、WO14/72405。
在一个具体的实施方案中,本文提供了修饰的原核宿主细胞,其包含编码能够产生含有糖抗原的生物缀合物的酶的核酸,其中所述宿主细胞包含来自假单胞菌的rfb簇或来源于来自假单胞菌的rfb簇的糖基转移酶。在一个具体的实施方案中,来自假单胞菌的所述rfb簇来源于来自假单胞菌的rfb簇的糖基转移酶被整合到所述宿主细胞的基因组中。在另一个具体的实施方案中,来自假单胞菌的所述rfb簇或来源于来自假单胞菌的rfb簇的糖基转移酶是来自铜绿假单胞菌的rfb簇。在另一个具体的实施方案中,所述宿主细胞包含编码寡糖基转移酶的核酸(例如来自空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)的pglB)。在另一个具体实施方案中,将编码寡糖基转移酶(例如来自空肠弯曲杆菌的pglB)的所述核酸整合到宿主细胞的基因组中。在一个具体实施方案中,所述宿主细胞包含编码载体蛋白的核酸。在另一个具体实施方案中,宿主细胞是大肠杆菌。
在另一具体实施方案中,本文提供了经修饰的原核宿主细胞,其包含(i)来自假单胞菌的rfb簇,其中所述rfb簇被整合到所述宿主细胞的基因组中;(ii)编码寡糖基转移酶(例如来自空肠弯曲杆菌的pglB)的核酸,其中所述编码寡糖基转移酶的核酸被整合到宿主细胞的基因组中;和(iii)载体蛋白,其中所述载体蛋白是质粒携带的或被整合到宿主细胞的基因组中。在另一个具体的实施方案中,来自假单胞菌的所述rfb簇是来自铜绿假单胞菌的rfb簇。在另一个具体实施方案中,宿主细胞是大肠杆菌。
在另一具体实施方案中,本文提供了经修饰的原核宿主细胞,其包含(i)来源于来自假单胞菌的rfb簇的糖基转移酶,其中所述糖基转移酶被整合到所述宿主细胞的基因组中;(ii)编码寡糖基转移酶(例如来自空肠弯曲杆菌的pglB)的核酸,其中所述编码寡糖基转移酶的核酸被整合到宿主细胞的基因组中;和(iii)载体蛋白,其中所述载体蛋白是质粒携带的或被整合到宿主细胞的基因组中。在另一个具体的实施方案中,来源于来自假单胞菌的rfb簇的所述糖基转移酶是来自铜绿假单胞菌的rfb簇。在另一个具体实施方案中,宿主细胞是大肠杆菌。
在一个具体的实施方案中,来自假单胞菌的rfb簇或来源于来自假单胞菌的rfb簇的糖基转移酶是来自铜绿假单胞菌的rfb簇或糖基转移酶。在另一个具体的实施方案中,来自假单胞菌的所述rfb簇或来源于来自假单胞菌的rfb簇的糖基转移酶是来自铜绿假单胞菌血清型O1、O2、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O11、O12、O13、O14、O15、O16、O17、O18、O19或O20的rfb簇或糖基转移酶。在另一个具体的实施方案中,来自铜绿假单胞菌的所述rfb簇是来自Knirel等人, 2006, Journal of Endotoxin Research 12(6):324-336中所述的任一种血清型的rfb簇,所述文献的公开内容以其整体通过引用并入本文。在一个具体的实施方案中,来自假单胞菌的所述rfb簇或来源于来自假单胞菌的rfb簇的糖基转移酶是来自铜绿假单胞菌血清型O6 PAK菌株的rfb簇或糖基转移酶。在一个具体的实施方案中,来自假单胞菌的所述rfb簇或来源于来自假单胞菌的rfb簇的糖基转移酶是来自铜绿假单胞菌血清型O11(例如铜绿假单胞菌菌株PA103)的rfb簇或糖基转移酶(例如参见Genbank登录号KF364633.1)。在一个具体的实施方案中,除了来自铜绿假单胞菌血清型O6 PAK菌株的所述rfb簇之外,还将编码甲酰基转移酶(GenBank:EOT23134.1;NCBI蛋白ID:PAK_01412;SEQ IDNO:2)和wzy聚合酶(GenBank:EOT19368.1;NCBI蛋白ID:PAK_01823;SEQ ID NO:3)的基因引入,以功能上将其扩大。
在一个具体实施方案中,本文提供的经修饰的原核宿主细胞包含编码甲酰基转移酶的核酸。在另一个具体实施方案中,所述甲酰基转移酶是SEQ ID NO:65中所示的甲酰基转移酶或其同源物。在另一个具体的实施方案中,所述甲酰基转移酶作为假单胞菌rfb簇的一部分并入(例如,插入到所述宿主细胞的基因组中或由其表达的质粒中)所述宿主细胞中,其中所述假单胞菌rfb簇已经被修饰以包含甲酰基转移酶。在另一个具体的实施方案中,所述假单胞菌rfb簇是铜绿假单胞菌O6 rfb簇。
在另一个具体实施方案中,本文提供的经修饰的原核宿主细胞包含编码wzy聚合酶的核酸。在另一个具体实施方案中,所述wzy聚合酶是SEQ ID NO:66中所示的wzy聚合酶或其同源物。在另一个具体的实施方案中,所述wzy聚合酶作为假单胞菌rfb簇的一部分并入(例如,插入到所述宿主细胞的基因组中或由其表达的质粒中)所述宿主细胞中,其中所述假单胞菌rfb簇已经被修饰以包含wzy聚合酶。在另一个具体的实施方案中,所述假单胞菌rfb簇是铜绿假单胞菌O6 rfb簇。
在另一个具体实施方案中,本文提供的经修饰的原核宿主细胞包含(i)编码甲酰基转移酶的核酸和(ii)编码wzy聚合酶的核酸。在一个具体的实施方案中,所述甲酰基转移酶是SEQ ID NO:65中所示的甲酰基转移酶或其与SEQ ID NO:65具有至少85%、90%或95%同一性的同源物。在另一个具体的实施方案中,所述wzy聚合酶是SEQ ID NO:66中所示的wzy聚合酶或其与SEQ ID NO:66具有至少85%、90%或95%同一性的同源物。在一个具体的实施方案中,所述甲酰基转移酶和所述wzy聚合酶作为假单胞菌rfb簇的一部分并入(例如,插入到所述宿主细胞的基因组中或由其表达的质粒中)所述宿主细胞中,其中所述假单胞菌rfb簇已经被修饰以包含甲酰基转移酶和wzy聚合酶。在另一个具体的实施方案中,所述假单胞菌rfb簇是铜绿假单胞菌O6 rfb簇。
用于产生修饰的假单胞菌rfb簇(例如修饰的铜绿假单胞菌血清型O6 rfb簇)的编码甲酰基转移酶的核酸和编码wzy聚合酶的核酸,可以在多个位置和多个方向插入rfb簇中。
在一个具体的实施方案中,将编码所述甲酰基转移酶的基因和/或编码所述wzy聚合酶的基因插入假单胞菌rfb簇(例如铜绿假单胞菌血清型O6 rfb簇)的基因的下游。在一个具体实施方案中,将编码所述甲酰基转移酶的基因和/或编码所述wzy聚合酶的基因插入铜绿假单胞菌血清型O6 rfb簇的wbpM基因的下游。
在一个具体的实施方案中,将编码所述甲酰基转移酶的基因和/或编码所述wzy聚合酶的基因插入假单胞菌rfb簇(例如铜绿假单胞菌血清型O6 rfb簇)的基因的上游。在一个具体实施方案中,将编码所述甲酰基转移酶的基因和/或编码所述wzy聚合酶的基因插入铜绿假单胞菌血清型O6 rfb簇的wzz基因的下游。
在一个具体的实施方案中,将编码所述甲酰基转移酶的基因和/或编码所述wzy聚合酶的基因以相对于假单胞菌rfb簇(例如铜绿假单胞菌血清型O6 rfb簇)的基因顺时针方向插入。
在一个具体的实施方案中,将编码所述甲酰基转移酶的基因和/或编码所述wzy聚合酶的基因以相对于假单胞菌rfb簇(例如铜绿假单胞菌血清型O6 rfb簇)的基因逆时针方向插入。
在一个具体的实施方案中,本文提供了经修饰的原核宿主细胞,其包含编码能够产生包含假单胞菌O6抗原的生物缀合物的酶的核酸。在一个具体的实施方案中,所述宿主细胞包含铜绿假单胞菌血清型O6 rfb簇、编码wzy聚合酶和甲酰基转移酶的核酸。在一个具体的实施方案中,wzy聚合酶是铜绿假单胞菌O6 wzy聚合酶(SEQ ID NO:66)或其同源物(例如来自铜绿假单胞菌的PAK或LESB58菌株的wzy聚合酶)。在另一个具体的实施方案中,甲酰基转移酶是铜绿假单胞菌O6甲酰基转移酶(SEQ ID NO:65)或其同源物(例如来自铜绿假单胞菌的PAK或LESB58菌株的甲酰基转移酶)。在某些实施方案中,例如使用本文所述的方法将编码rfb簇、wzy聚合酶和/或甲酰基转移酶的一个或多个核酸插入宿主细胞的基因组中。在一个具体的实施方案中,例如使用本文所述的方法将编码rfb簇、wzy聚合酶和甲酰基转移酶的每一核酸插入宿主细胞的基因组中。在某些实施方案中,宿主细胞还包含:编码寡糖基转移酶(例如来自空肠弯曲杆菌的pglB)的核酸,其中所述编码寡糖基转移酶的核酸是质粒携带的或被整合到宿主细胞的基因组中;和编码载体蛋白的核酸,其中编码所述载体蛋白的所述核酸是质粒携带的或被整合到宿主细胞的基因组中。在一个具体实施方案中,将编码所述寡糖基转移酶的所述核酸整合到宿主细胞的基因组中。
遗传背景
可用于产生本文所述的经修饰的宿主细胞的示例性宿主细胞包括但不限于埃希氏菌属物种、志贺氏菌属物种、克雷伯氏菌属物种、黄单胞杆菌属物种、沙门氏菌属物种、耶尔森菌属物种、乳球菌属物种、乳杆菌属物种、假单胞菌属物种、棒杆菌属物种、链霉菌属物种、链球菌属物种、葡萄球菌属物种、芽孢杆菌属物种和梭菌属物种。在一个具体的实施方案中,本文使用的宿主细胞是大肠杆菌。
在某些实施方案中,通过例如缺失一个或多个基因来修饰宿主细胞遗传背景。可以在宿主细胞中缺失的示例性基因(并且在一些情况下,用其他期望的核酸序列取代)包括参与糖脂生物合成的宿主细胞的基因,例如waaL(参见例如Feldman等人, 2005, PNAS USA102:3016-3021)、O抗原簇(rfb或wb)、肠细菌共同抗原簇(wec)、脂质A核心生物合成簇(waa)和原噬菌体O抗原修饰簇如gtrABS簇。在一个具体的实施方案中,修饰本文所述的宿主细胞,使得它们不产生除例如来自O抗原假单胞菌的所需O抗原以外的任何O抗原。在一个具体的实施方案中,将一个或多个waaL基因、gtrA基因、gtrB基因、gtrS基因或来自wec簇的基因或来自rfb基因簇的一个或多个基因从本文提供的原核宿主细胞的基因组中缺失或功能性失活。在一个实施方案中,本文使用的宿主细胞是大肠杆菌,其中waaL基因、gtrA基因、gtrB基因、gtrS基因从宿主细胞的基因组中缺失或功能性失活。在另一个实施方案中,本文使用的宿主细胞是大肠杆菌,其中waaL基因和gtrS基因从宿主细胞的基因组中缺失或功能性失活。在另一个实施方案中,本文使用的宿主细胞是大肠杆菌,其中waaL基因和来自wec簇的基因从宿主细胞的基因组中缺失或功能性失活。
载体蛋白
适用于生产缀合物疫苗(例如用于疫苗的生物缀合物)的任何载体蛋白都可以在本文中使用,例如,编码载体蛋白的核酸可以引入本文提供的宿主中用于生产生物缀合物,所述生物缀合物包含与假单胞菌抗原连接的载体蛋白。示例性的载体蛋白包括但不限于铜绿假单胞菌的脱毒外毒素A(EPA;参见例如Ihssen等人,(2010)Microbial cell factories 9,61)、CRM197、麦芽糖结合蛋白(MBP)、白喉类毒素、破伤风类毒素、金黄色葡萄球菌的脱毒溶血素A、凝集因子A、凝集因子B、大肠杆菌FimH、大肠杆菌FimHC、大肠杆菌热不稳定肠毒素、大肠杆菌热不稳定肠毒素的脱毒变体、霍乱毒素B亚基(CTB)、霍乱毒素、霍乱毒素的脱毒变体、大肠杆菌Sat蛋白、大肠杆菌Sat蛋白的过客结构域、肺炎链球菌肺炎球菌溶血素及其脱毒变体、空肠弯曲杆菌AcrA、假单胞菌PcrV蛋白和空肠弯曲杆菌天然糖蛋白。将PcrV蛋白用于本发明的许多实施方案中。
在一个具体的实施方案中,由本文提供的经修饰的宿主细胞表达的载体蛋白从已整合到经修饰的宿主细胞的基因组中的核酸表达。也就是说,编码载体蛋白的核酸已被整合到宿主细胞基因组中。在某些实施方案中,由本文提供的经修饰的宿主细胞表达的载体蛋白从已经引入经修饰的宿主细胞中的质粒表达。
在某些实施方案中,将用于产生本文所述的生物缀合物的载体蛋白质修饰,例如以蛋白毒性较低和/或对糖基化更敏感的方式修饰。在一个具体的实施方案中,修饰用于产生本文所述的生物缀合物的载体蛋白,使得载体蛋白中糖基化位点的数目以允许较低浓度的待施用的蛋白方式最大化,例如在免疫原性组合物中以其生物缀合物形式。
在某些实施方案中,将本文所述的载体蛋白修饰以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或比通常与载体蛋白相关的更多个糖基化位点(例如,相对于与以其天然/自然例如“野生型”状态的载体蛋白相关的糖基化位点的数目)。在一个具体的实施方案中,糖基化位点的引入通过在蛋白的一级结构中任何位置插入糖基化共有序列(例如,Asn-X-Ser(Thr),其中X可以是除Pro以外的任何氨基酸;或Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr),其中X和Z独立地选自Pro以外的任何天然氨基酸(参见WO 2006/119987))来完成。可以通过例如向蛋白的一级结构中添加新的氨基酸(即,全部或部分地添加糖基化位点)或者通过将蛋白中存在的氨基酸突变以产生糖基化位点(即氨基酸不添加到蛋白中,但蛋白中的所选氨基酸被突变以形成糖基化位点)来完成这种糖基化位点的引入。本领域技术人员将认识到,可以使用本领域已知的方法,例如包括修饰编码蛋白的核酸序列的重组方法来容易地修饰蛋白的氨基酸序列。在一个具体的实施方案中,将糖基化共有序列引入载体蛋白的特定区域,例如蛋白的表面结构、蛋白的N或C末端和/或在蛋白的碱基处通过二硫键稳定的环中。在某些实施方案中,经典的5氨基酸糖基化共有序列可以通过赖氨酸残基延伸以进行更有效的糖基化,并且因此插入的共有序列可以编码应当插入的或者取代受体蛋白质氨基酸的5、6或7个氨基酸。
在某些实施方案中,用于产生本文所述生物缀合物的载体蛋白包含“标签”,即允许分离和/或鉴定载体蛋白的氨基酸序列。例如,向本文描述的载体蛋白添加标签可用于纯化该蛋白质,并因此用于纯化包含标签化的载体蛋白的缀合物疫苗。可用于本文的示例性标签包括但不限于组氨酸(HIS)标签(例如,六组氨酸标签或6XHis标签)、FLAG-标签和HA标签。在某些实施方案中,本文使用的标签是可移除的,一旦其不再需要,例如在蛋白质已经纯化之后,例如通过化学试剂或通过酶促手段去除。
在某些实施方案中,本文所述的载体蛋白包含将载体蛋白靶向表达载体蛋白的宿主细胞的周质空间的信号序列。在一个具体实施方案中,信号序列来自大肠杆菌DsbA、大肠杆菌外膜孔蛋白A(OmpA)、大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(MalE)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwiniacarotovorans)果胶裂解酶(PelB)、FlgI、NikA或芽孢杆菌内切木聚糖酶(XynA)、热不稳定的大肠杆菌肠毒素LTIIb、芽孢杆菌内切木聚糖酶XynA或大肠杆菌鞭毛蛋白(FlgI)。
糖基化手段
寡糖基转移酶
寡糖基转移酶将脂质连接的寡糖转移至新生多肽链的天冬酰胺残基,所述新生多肽链包含N-糖基化共有基序,例如Asn-X-Ser(Thr),其中X可以是Pro以外的任何氨基酸;或Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr),其中X和Z独立地选自Pro以外的任何天然氨基酸(参见WO 2006/119987)。参见例如WO 2003/074687和WO 2006/119987,其公开内容通过引用整体并入本文。
在某些实施方案中,本文提供的宿主细胞包含编码寡糖基转移酶的核酸。如上所述,编码寡糖基转移酶的核酸对于宿主细胞可以是天然的,或者可以使用遗传方法引入到宿主细胞中。寡糖基转移酶可以来自本领域已知的任何来源。在一个具体的实施方案中,寡糖基转移酶是来自弯曲杆菌的寡糖基转移酶。在另一个具体的实施方案中,寡糖基转移酶是来自空肠弯曲杆菌的寡糖基转移酶(即,pglB;参见例如Wacker 等人, 2002, Science298:1790-1793;还参见例如NCBI Gene ID:3231775, UniProt登录号O86154)。在另一个具体实施方案中,寡糖基转移酶是来自红嘴鸥弯曲杆菌(Campylobacter lari)的寡糖基转移酶(参见例如,NCBI Gene ID:7410986)。
在一个具体的实施方案中,本文提供的修饰的宿主细胞包含编码寡糖基转移酶的核酸序列,其中将所述编码寡糖基转移酶的核酸序列整合到宿主细胞的基因组中。
辅助酶
在某些实施方案中,将编码一种或多种辅助酶的核酸引入到本文所述的经修饰的宿主细胞中。编码一种或多种辅助酶的此类核酸可以是质粒携带的或被整合到本文所述的宿主细胞的基因组中。示例性辅助酶包括但不限于差向异构酶、支化酶、修饰酶、酰胺化酶、链长度调节酶、乙酰化酶、甲酰化酶、聚合酶。
编码可插入本文所述宿主细胞的差向异构酶的核酸序列是本领域已知的。在某些实施方案中,插入本文所述的宿主细胞中的差向异构酶是国际专利申请公开号WO2011/062615中描述的差向异构酶,其公开内容通过引用整体并入本文。在一个具体的实施方案中,差向异构酶是由大肠杆菌菌株O157的Z3206基因编码的差向异构酶。参见例如WO 2011/062615和Rush等人,2009,The Journal of Biological Chemistry 285:1671-1680,其通过引用整体并入本文。在一个具体的实施方案中,本文提供的经修饰的宿主细胞包含编码差向异构酶的核酸序列,其中将所述编码差向异构酶的核酸序列整合到宿主细胞的基因组中。
在某些实施方案中,将编码甲酰基转移酶的核酸序列插入本文所述的宿主细胞中或由其表达。甲酰基转移酶是催化甲酰基转移至受体分子的酶。在一个具体实施方案中,将编码铜绿假单胞菌O6甲酰基转移酶fmtO6(SEQ ID NO:65)或其同源物的核酸序列插入本文所述的宿主细胞中或由其表达。在另一个具体实施方案中,将编码与SEQ ID NO:65具有约或至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性或同源性的蛋白的核酸序列插入到本文所述的宿主细胞中或由其表达。
涉及多糖生物合成的某些甲酰基转移酶是已知的,并且可以插入本文所述的宿主细胞中或由其表达。例如,vioF是来自产碱普罗威登斯菌(P. alcalifaciens)血清型O30的酶,其与来自土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)的甲酰基转移酶具有48%的同一性(Nagaraja等人2005)。其将dTDP-D-Qui4N转化为dTDP-D-Qui4NFo并参与O抗原生物合成(Liu等人2012, Glycobiology 22(9):1236–1244)。涉及多糖生物合成的另一种甲酰基转移酶是arnA(例如来自大肠杆菌),它是其中N末端结构域将UDP-Ara4N转化为UDP-AraNFo而C末端结构域参与UDP-葡萄糖醛酸的氧化脱羧的双功能酶。两种酶活性都是脂质A和多粘菌素抗性的L-Ara4N修饰需要的(Breazeale等人, 2005, The Journal of BiologicalChemistry 280(14):14154-14167)。涉及多糖生物合成的另一种甲酰基转移酶是wekD,它是来自大肠杆菌血清型O119的参与TDP-DRhaNAc3NFo生物合成的酶(Anderson等人,1992,Carbohydr Res237:249-62)。
此外,已经表征了与甲酰基转移酶活性有关的结构域。所谓的FMT_核心结构域存在于大多数甲酰基转移酶中。实例包括甲硫氨酰基-tRNA甲酰基转移酶、磷酸核糖基甘氨酰胺甲酰基转移酶1、UDP-葡萄糖醛酸脱羧酶/UDP-4-氨基-4-脱氧-L-阿拉伯糖甲酰基转移酶、来自产碱普罗威登斯菌 O30的vioF和来自大肠杆菌的arnA。上述甲酰基转移酶使用FTHF(N-10-甲酰基四氢叶酸)作为甲酰基供体。而且,使用FTHF(10-甲酰基四氢叶酸)作为底物产生甲酸的酶含有该结构域。另外,AICARFT存在于磷酸核糖基氨基咪唑甲酰胺甲酰基转移酶/IMP环化水解酶中,并且FDH_GDH存在于磷酸核糖基甘氨酰胺甲酰基转移酶2中。
在某些实施方案中,将编码O抗原聚合酶(wzy基因)的核酸序列插入本文所述的宿主细胞中或由其表达。O抗原聚合酶是多次跨膜蛋白。它们使用十一异戊烯基焦磷酸结合的O抗原重复单元作为底物以产生由重复单元组成的直链聚合物。O抗原聚合酶(wzy)存在于通过wzy依赖性机制合成O抗原聚合物的革兰氏阴性细菌中。
在一个具体的实施方案中,将编码铜绿假单胞菌wzy聚合酶(SEQ ID NO:66)或其同源物(例如来自铜绿假单胞菌的PAK或LESB58菌株的wzy聚合酶)的核酸序列插入本文所述的宿主细胞中或由其表达。已知包含wzy聚合酶的细菌的实例包括大肠杆菌、铜绿假单胞菌、弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)。在另一个具体实施方案中,将编码与SEQ ID NO:66具有约或至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性或同源性的蛋白的核酸序列插入到本文所述的宿主细胞中或由其表达。
基因拷贝数
在某些实施方案中,整合入本文提供的经修饰的宿主细胞中的基因的拷贝数是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一个具体的实施方案中,整合入本文提供的经修饰的宿主细胞中的基因的拷贝数是1或2。
益处
本文描述的经修饰的宿主细胞具有特别的商业重要性和相关性,因为它们允许以更低风险大规模发酵包含糖的生物缀合物,例如可用作治疗剂(例如免疫原性组合物、疫苗)的假单胞菌抗原,这是由于染色体插入的DNA的稳定性增加以及因此在发酵过程中目的DNA的表达。本文所述的经修饰的宿主细胞优于依赖于生成本文所述的生物缀合物所需的核酸的质粒携带表达的宿主细胞,这是因为,尤其是,一旦异源DNA插入宿主细胞基因组中就不需要在发酵过程中进行抗生素选择。也就是说,当将插入DNA插入染色体中时,它不需要被选择,因为它随着宿主基因组的复制而传播。此外,质粒携带系统中的已知缺点是随着每一代(即宿主细胞复制周期)失去质粒的风险增加。这种质粒的丢失是由于在细胞分裂过程中的细胞分离阶段质粒有时不恰当地分布到子细胞。在大规模的情况下,细菌细胞培养物复制比较小发酵规模更频繁以达到高细胞密度。因此,更高的细胞稳定性和插入DNA表达导致更高的产物产量,提供了明显的优势。此外,细胞稳定性是监管部门批准的方法接受标准,而由于各种原因,在发酵过程中通常不希望抗生素选择,例如抗生素作为杂质存在于最终的医药产品中并且具有引起过敏反应的风险,并且抗生素可能促进抗生素抗性(例如,通过基因转移或选择抗性病原体)。
本申请提供了用于制备可用作治疗剂(例如免疫原性组合物、疫苗)的包含糖抗原的生物缀合物的经修饰的宿主细胞,其中驱动生物缀合物产生所需的某些遗传元件稳定整合到宿主细胞基因组中。因此,宿主细胞可含有减少数量的质粒,仅含有单一质粒或完全不含质粒。在一些实施方案中,单一质粒的存在可以导致生产菌株更大的灵活性和改变缀合性质(就其糖或载体蛋白含量而言)容易导致生产菌株更大的灵活性的能力。
通常,减少质粒的使用导致更适合用于生产药品的生产菌株。存在于质粒上的基本遗传物质的缺点是需要选择压力来维持宿主细胞中的游离元件。选择压力需要使用抗生素,由于例如对抗生素的过敏反应的危险和制造的额外成本,使用抗生素对于药品的生产是不希望的。此外,选择压力往往不完全,导致不均匀的细菌培养物,其中一些克隆已经失去质粒,因此不产生生物缀合物。因此本文描述的宿主细胞能够产生可以高产量获得的更安全的产物。
生物缀合物
本文所述的经修饰的宿主细胞可用于产生包含糖抗原的生物缀合物,例如与载体蛋白连接的假单胞菌抗原。使用宿主细胞生产生物缀合物的方法是本领域已知的。参见例如WO2003/074687和WO 2006/119987。如本文所述,生物缀合物相对于抗原-载体蛋白的化学缀合物具有有利的性质,因为它们在制造中需要更少的化学品并且在所生成的最终产物方面更加一致。
在一个具体的实施方案中,本文提供了包含与假单胞菌抗原连接的载体蛋白的生物缀合物。在一个具体的实施方案中,所述假单胞菌抗原是铜绿假单胞菌的O抗原。在具体的实施方案中,本文提供了包含铜绿假单胞菌O抗原和载体蛋白的生物缀合物,其中所述载体蛋白是EPA、PcrV(又称为LcrV、EspA、SseB)、PopB(YopB、YopD、FliC)或OprF、OprI。示例性实施方案使用EPA和PcrV作为载体蛋白。
在一个具体的实施方案中,本文提供了包含连接至铜绿假单胞菌O抗原的载体蛋白的生物缀合物,其中所述铜绿假单胞菌O抗原是来自铜绿假单胞菌血清型O1、O2、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O11、O12、O13、O14、O15、O16、O17、O18、O19或O20的O抗原。
在一个具体的实施方案中,本文提供了包含与铜绿假单胞菌O抗原连接的PcrV载体蛋白的生物缀合物,其中所述铜绿假单胞菌O抗原是Knirel等人,2006, Journal ofEndotoxin Research 12(6):324-336中描述的血清型之一,其公开内容通过引用整体并入本文。
在一个具体的实施方案中,本文提供了包含连接至铜绿假单胞菌O抗原的载体蛋白的生物缀合物,其中所述铜绿假单胞菌O抗原是来自铜绿假单胞菌血清型O6的O抗原。
在一个具体的实施方案中,本文提供了包含连接至铜绿假单胞菌O抗原的载体蛋白的生物缀合物,其中所述铜绿假单胞菌O抗原是来自铜绿假单胞菌血清型O11的O抗原。在一个具体的实施方案中,来自铜绿假单胞菌血清型O11的所述O抗原来自铜绿假单胞菌菌株PA103(参见例如Genbank登录号KF364633.1)。
本文所述的生物缀合物可通过本领域已知的任何用于纯化蛋白的方法纯化,例如通过色谱法(例如离子交换、阴离子交换、亲和力和大小柱色谱法)、离心、差异溶解度或通过任何其他用于纯化蛋白的标准技术。参见例如,Saraswat 等人, 2013,Biomed.Res.Int. ID#312709 (p. 1-18);还参见描述于WO 2009/104074中的方法。此外,生物缀合物可以与本文所述的或本领域以其他方式已知的异源多肽序列融合以促进纯化。用于纯化特定生物缀合物的实际条件将部分取决于合成策略和因素诸如生物缀合物的净电荷、疏水性和/或亲水性,并且对于本领域技术人员而言是显而易见的。
分析方法
可以使用各种方法分析本文所述的生物缀合物的结构组成和糖链长度。
在一个实施方案中,肼解可用于分析聚糖。首先,根据制造商的说明书(LudgerLiberate Hydrazinolysis Glycan Release Kit, Oxfordshire, UK),通过与肼一起孵育,多糖从其蛋白质载体释放。亲核试剂肼攻击多糖和载体蛋白之间的糖苷键,并且允许释放所附着的聚糖。在该处理过程中N-乙酰基团丢失并且必须通过重新N-乙酰化来重构。游离聚糖在碳柱上纯化并随后利用荧光团2-氨基苯甲酰胺在在还原末端进行标记。参见Bigge JC, Patel TP, Bruce JA, Goulding PN, Charles SM, Parekh RB:Nonselectiveand efficient fluorescent labeling of glycans using 2-amino benzamide andanthranilic acid.Anal Biochem 1995, 230(2):229-238。根据Royle等人的HPLC方案在GlycoSep-N 柱(GL Sciences)上分离标记的多糖。参见Royle L, Mattu TS, Hart E,Langridge JI, Merry AH, Murphy N, Harvey DJ, Dwek RA, Rudd PM:An analyticaland structural database provides a strategy for sequencing O-glycans frommicrogram quantities of glycoproteins.Anal Biochem 2002, 304(1):70-90。所得到的荧光色谱图表明多糖的长度和重复单元的数量。可以通过收集单独的峰并随后进行MS /MS分析来收集结构信息。因此可以确定重复单元的单糖组成和序列,并且另外可以鉴定多糖组合物的均匀性。
在另一个实施方案中,可以使用SDS-PAGE或毛细管凝胶电泳来评估聚糖和生物缀合物。O抗原聚糖的聚合物长度由线性组装的重复单元的数量限定。这意味着典型的梯形样式是组成聚糖的不同重复单元的结果。因此,SDS PAGE或按大小分开的其他技术中的彼此相邻的两个条带仅通过单个重复单元而不同。在分析糖蛋白的聚糖大小时发现了这些离散差异:非糖基化载体蛋白和具有不同聚合物链长度的生物缀合物根据其电泳迁移率分离。测量生物缀合物上存在的第一可检测重复单元数(n1)和平均重复单元数(n平均)。这些参数可用于证明批次间一致性或多糖稳定性。
在另一个实施方案中,可以应用高质量MS和尺寸排阻HPLC来测量完整生物缀合物的大小。
在另一个实施方案中,可以使用蒽酮 - 硫酸测定法来测量多糖产量。参见LeyvaA, Quintana A, Sanchez M, Rodriguez EN, Cremata J, Sanchez JC:Rapid andsensitive anthrone-sulfuric acid assay in microplate format to quantifycarbohydrate in biopharmaceutical products: method development andvalidation.Biologicals : journal of the International Association ofBiological Standardization 2008, 36(2):134-141。在另一个实施方案中,可以使用甲基戊糖测定法来测量多糖产量。参见例如,Dische等人, J Biol Chem.1948 Sep;175(2):595-603。
糖基化位点使用的变化
为了显示特定蛋白质中的位点使用在多重质粒系统而不是插入系统中被改变,必须量化糖基化位点的使用。在下文列出了如此所用的方法。
糖肽LC-MS / MS:用蛋白酶消化生物缀合物,并通过合适的色谱方法(C18,亲水性相互作用HPLC HILIC,GlycoSepN柱,SE HPLC,AE HPLC)分离肽,并使用MS / MS鉴定不同的肽。这种方法可以与我们的一起使用,而不需要通过化学(史密斯降解)或酶促方法缩短先前的糖链。使用在215-280nm处的UV检测对糖肽峰进行定量可以相对测定糖基化位点的使用。
尺寸排阻HPLC:较高的糖基化位点使用由从SE HPLC柱的较早的洗脱时间所反映。
同质性
可以使用测量聚糖长度和流体动力学半径的方法评估生物缀合物同质性(即,所附接的糖残基的同质性)。
其他可能的临床/实际应用
与三质粒系统相比,由于抗生素选择负担减少,整合菌株可以使生物缀合物的产量更高。另外,由于细胞的代谢负担减少,较少发生蛋白水解降解。
整合菌株使生物缀合物具有较短的、较少散布的多糖长度分布。因此,生物缀合物更容易表征并且更好地定义。另外,与三质粒系统相比,由于减少了抗生素选择负担,插入可以减少对细胞的周质应激程度,这可以导致在发酵过程期间产物的蛋白水解较少。
蛋白质糖基化系统需要生产宿主中的三种重组元件:载体蛋白表达DNA、寡糖基转移酶表达DNA和多糖表达DNA。现有技术的细菌生产系统在质粒上含有这三种元件。因此,在制备过程中存在由于质粒丢失的不稳定性风险,特别是因为在GMP材料的发酵过程中必须不能存在用于维持质粒的抗生素。由于插入的菌株含有少于一种质粒(one plasmidless),它们经许多世代更加稳定。这意味着更大规模的发酵和更长的培养时间(更高的世代数)是更可行的。此外,由于不存在可导致敏感主体中的过敏反应的微量抗生素,因此不存在用于选择的抗生素使得产品更安全。参见COMMITTEE WE, BIOLOGICAL O,STANDARDIZATION:WHO Technical Report Series 941.In:Fifty-sixth Report.Editedby Organization WH.Geneva:World Health Organization;2007.
由于固定的染色体插入,插入的菌株遗传上更稳定,因此导致在生产过程期间(例如在包含插入的异源DNA的宿主细胞的培养过程中)期望蛋白质产物的更高再现性。
用于测试益处的分析方法
产量. 将产量测量为在控制和优化的条件下从在生物反应器中生长的1升细菌生产培养物衍生的碳水化合物量。纯化生物缀合物后,碳水化合物产量可以通过蒽酮测定或使用碳水化合物特异性抗血清的ELISA直接测量。间接测量是可以的,这通过使用蛋白量(通过公知的BCA、Lowry或bardford测定测量)和聚糖长度和结构来计算每克蛋白的理论碳水化合物量。另外,还可以通过从挥发性缓冲液中干燥糖蛋白制剂并使用天平来测量重量来测量产量。
同质性.同质性意指聚糖长度的可变性和可能的糖基化位点的数量。上面列出的方法可用于此目的。SE-HPLC允许测量流体动力学半径。与具有较少糖基化位点的载体相比,载体中更高数量的糖基化位点导致流体动力学半径变化更大。然而,当分析单个聚糖链时,由于更受控的长度,它们可能更同质。聚糖长度通过肼解、SDS PAGE和CGE测量。此外,同质性也可能意味着某些糖基化位点的使用模式变为更宽/更窄的范围。这些因素可以通过糖肽LC-MS/MS来测量。
菌株稳定性和再现性.在没有选择压力的情况下细菌发酵期间的菌株稳定性通过直接和间接方法测量,所述方法证实生产培养细胞中存在或不存在重组DNA。培养体积的影响可以通过延长的培养时间(其意味着增加世代时间)来模拟。发酵的世代越多,重组元件丢失的可能性就越大。重组元件的丢失被认为是不稳定。间接方法依赖于选择盒与重组DNA的缔合,例如质粒中的抗生素抗性盒。将生产培养细胞铺板在选择性培养基上,例如,补充了与选择系统相关的抗生素或其他化学品的LB平板,并且抗性菌落被认为对于与相应选择化学品相关的重组DNA是阳性的。在多质粒系统的情况下,将多种抗生素的抗性菌落计数,并且含有所有三种抗性的细胞部分被认为是稳定群体。或者,可以使用定量PCR在存在、不存在选择的情况下和在发酵的不同时间点测量三种重组元件的重组DNA的量。因此,测量并比较重组DNA的相对量和绝对量。生产过程的再现性通过本申请中所述方法对一致性批次的完整分析来测量。
在一个实施方案中,提供了一种宿主细胞,其中编码糖基转移酶的核酸来源于假单胞菌的rfb簇,其中所述核酸任选稳定地插入到宿主细胞的基因组中。rfb簇任选地来自铜绿假单胞菌,任选来自血清型O6或O11。
在一个实施方案中,宿主细胞包含衍生自弯曲杆菌的寡糖基转移酶,例如其中所述寡糖基转移酶是空肠弯曲杆菌的PglB。
在一个实施方案中,宿主细胞包含在宿主细胞的质粒中编码铜绿假单胞菌PcrV蛋白的核酸。
在一个实施方案中,宿主细胞还包含甲酰基转移酶,其中所述核酸编码与SEQ IDNO:65具有约或至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性或同源性的蛋白,或者其中所述核酸编码SEQ ID NO:65。
在一个实施方案中,本发明的宿主细胞还包含编码wzy聚合酶的核酸,其中所述核酸编码与SEQ ID NO:66具有约或至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性或同源性的蛋白,或其中所述核酸编码SEQ ID NO:66。
在一个实施方案中,宿主细胞包含编码甲酰基转移酶的核酸和/或编码wzy聚合酶的核酸,所述核酸稳定地插入所述宿主细胞的基因组中。任选地,编码甲酰基转移酶的基因和/或编码wzy聚合酶的基因存在于所述宿主细胞的质粒上。
在一个实施方案中,宿主细胞是大肠杆菌。
本发明的另一方面是产生包含与糖连接的铜绿假单胞菌PcrV蛋白的生物缀合物的方法,所述方法包括在适合于生产蛋白的条件下培养本发明的宿主细胞。
本发明的另一方面是通过本发明方法产生的生物缀合物,其中所述生物缀合物包含与铜绿假单胞菌PcrV蛋白连接的糖。
在每一种情况下,发明人意在本文的术语“包含(comprising)”、“包含(comprise)”和“包含(comprises)”可以任选地分别由术语“组成(consisting of)”、“组成(consist of)”和“组成(consists of)”所替换。
术语 “其中天冬酰胺残基位于与SEQ ID NO:...的氨基酸...之间等同的位置”定义为将天冬酰胺残基在这样的位置处引入氨基酸序列中,如果将参考序列和突变序列排列起来以最大化两个序列之间的序列同一性,那么所述位置将等同于定义的位置。来自突变序列的氨基酸的添加或缺失可能导致突变序列中天冬酰胺残基的实际氨基酸位置中的不同,然而,通过将突变序列与参考序列排列,可以建立插入天冬酰胺氨基酸的合适位置。
术语“包含D/E-X-N-X-S/T共有序列的肽位于SEQ ID NO:...的氨基酸...之间的位置”定义为共有序列在这样的位置处被引入氨基酸序列中,如果将参考序列和突变序列排列起来以最大化两个序列之间的序列同一性,那么所述位置将等同于定义的位置。来自突变序列的氨基酸的添加或缺失可能导致突变序列中共有序列的实际氨基酸位置中的不同,然而,通过将突变序列与参考序列排列,可以建立插入共有序列的合适位置。
铜绿假单胞菌的O-抗原(O-1至O20)根据基于IATS命名法的血清型的分类。
本专利说明书中引用的所有参考文献或专利申请通过引用并入本文。
为了本发明可以更好地理解,描述以下实施例。这些实施例仅为说明目的,而不应以任何方式解释为限定本发明的范围。
蛋白和核酸的序列
SEQ ID NO:1 – PcrV蛋白野生型序列
SEQ ID NO:2 – PcrV
SEQ ID NO:3
SEQ ID NO:4 - 成熟的
SEQ ID NO:5 – 表位序列
SEQ ID NO:6
SEQ ID NO:65 - 甲酰基转移酶
SEQ ID NO:66 wzy聚合酶
SEQ ID NO:67 – PcrV的核苷酸序列
实施例
实施例1:具有插入的寡糖基转移酶和插入的rfb簇的细菌菌株是稳定的并且产生生物缀合物
该实施例证明可以通过细菌宿主菌株成功地产生生物缀合物,所述细菌宿主菌株已经通过插入(i)编码寡糖基转移酶的核酸和(ii)编码rfb簇的核酸而被遗传修饰。
通过将以下直接插入到宿主细胞基因组中来产生修饰的大肠杆菌宿主细胞:(i)编码空肠弯曲菌(C. jejuni)寡糖基转移酶(PglB)的核酸和(ii)编码来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)菌株PA103的rfb簇的核酸。该rfb簇编码铜绿假单胞菌血清群O11抗原的O-抗原合成所必需的基因。使用PCT/EP2013/071328(参见上面的第5.2节)或pUT微系统(Biomedal Lifescience)中描述的新插入方法进行插入。PCT/EP2013/071328中描述的插入方法是位点特异性的并且利用同源重组,而pUT微系统是随机的、转座子介导的方法,其导致目标核酸序列随机插入到宿主细胞基因组中。通过将表达解毒的假单胞菌外毒素A(EPA)作为载体蛋白质的质粒导入宿主细胞进一步修饰大肠杆菌宿主细胞。因此,本实施例中描述的经修饰的大肠杆菌宿主细胞(i)通过将编码寡糖基转移酶的核酸整合到宿主细胞基因组中来表达空肠弯曲菌寡糖基转移酶(PglB);(ii)通过将编码来自铜绿假单胞菌菌株PA103的rfb簇的核酸整合到宿主细胞基因组中来表达产生O11抗原的铜绿假单胞菌rfb簇的基因;和(iii)通过利用包含编码载体蛋白的核酸的质粒转化宿主细胞来表达EPA载体蛋白。
产生另外经修饰的大肠杆菌宿主细胞以允许比较包含双重整合(寡糖基转移酶的整合和rfb簇的整合)的经修饰的宿主细胞产生生物缀合物(EPA-O11)的能力与下述宿主细胞的生物缀合物产生,所述宿主细胞具有(i)仅寡糖基转移酶或rfb簇的单一整合和由宿主细胞质粒表达的剩余组分(载体蛋白和寡糖基转移酶或rfb簇);或(ii)没有整合的组分,所有组分(载体蛋白和寡糖基转移酶和rfb簇)由质粒表达。
在分析中使用三种不同的大肠杆菌背景菌株:(i)“St4167”(W3110 ∆waaL, ∆rfbO16::rfbP.a.O11),其包含大肠杆菌waaL基因的缺失,大肠杆菌O16 rfb簇的缺失和铜绿假单胞菌O11 rfb簇的插入(PCT/EP2013/071328);(ii)“St1128”(W3110 ∆waaL),其包含大肠杆菌waaL基因的缺失;和(iii)“St1935”(W3110 ∆waaL, ∆wzzE-wecG, ∆wbbIJK),其包含所示基因的缺失。为了在St4167中插入铜绿假单胞菌O11 rfb簇,将O11rfb簇克隆到pDOC质粒中,并使用根据PCT/EP2013/071328的方法。St4167菌株代表双重整合菌株。
用于将EPA引入宿主细胞菌株的特定质粒命名为“p1077”和“p150”。后者描述于Ihssen, 等人, (2010) Microbial cell factories 9, 61中,并且质粒是相同的,除了p1077用Kan盒取代p150的Amp盒的事实。
产生以下St4167变体:(i)St4167,其具有插入代替宿主细胞yahL基因的pglB(通过PCT/EP2013/071328的方法)和由质粒p1077表达的EPA;(ii)St4167,其具有插入代替宿主细胞ompT基因的pglB(使用pUT微系统)和由质粒p150表达的EPA;(iii)St4167,其具有由质粒p1769表达的pglB(pDOC中的pglB)和由质粒p1077表达的EPA;(iv)St4167,其具有由质粒p939表达的pglB(具有HA标签的用于PglB的基于pEXT21的表达质粒,密码子优化的)和由质粒p1077表达的EPA;和(v)St4167,其具有由质粒p1762表达的pglB(pDOC中的pglB)和由质粒p1077表达的EPA。
产生以下St1128变体:(i)St1128,其具有由质粒p939表达的pglB,由质粒p164表达的铜绿假单胞菌O11 rfb簇(经改造含有铜绿假单胞菌O11 rfb簇的pLAFR质粒)和由质粒p1077表达的EPA;和(ii)St1128,其具有插入代替宿主细胞yahL基因的pglB(通过PCT/EP2013/071328的方法),由质粒p164表达的铜绿假单胞菌O11 rfb簇和由质粒p1077表达的EPA。
产生以下St1935变体:(i)St1935,其具有插入代替宿主细胞ompT基因的pglB(通过PCT/EP2013/071328的方法),由质粒p164表达的铜绿假单胞菌O11 rfb簇和由质粒p1077表达的EPA;(ii)St1935,其具有插入代替宿主细胞yahL基因的pglB(通过PCT/EP2013/071328的方法),由质粒p164表达的铜绿假单胞菌O11 rfb簇和由质粒p1077表达的EPA;和St1935,其具有由质粒p939表达的pglB,由质粒p164表达的铜绿假单胞菌O11 rfb簇和由质粒p1077表达的EPA。
如图1所示,表达寡糖基转移酶、载体蛋白和rfb簇的所有菌株均产生生物缀合物。参见对应于EPA-O11的kDa标志物100和130之间描绘的印迹。重要的是,这种观察包括包含寡糖基转移酶和rfb簇的双重整合的菌株。特别参见St4167所示的结果。因此,该实施例不仅证明了在将基因/基因簇双重插入到宿主细胞基因组之后可以产生稳定的宿主细胞,而且还维持了该基因的功能。具体而言,保留了插入的寡糖基转移酶和插入的rfb簇的功能,导致生物缀合物的产生。
实施例2:鉴定有助于天然铜绿假单胞菌O6 O-抗原寡/多糖合成的甲酰基转移酶基因
该实施例描述了铜绿假单胞菌O6甲酰基转移酶的鉴定。
使用在www.supfam.org/SUPERFAMILY/提供的算法搜索基因组已知的铜绿假单胞菌O6菌株“LESB58”的蛋白质组数据其与原型查询结构域“甲酰基转移酶”和“FMT C-末端结构域样”结构域含有同源性的结构域。搜索鉴定了具有可能的相关结构域的9个蛋白质序列。
为了评估所鉴定的9种候选物中的任何一种是否对O6特异(并且由此对甲酰化O抗原重复单元特异),使用BLAST搜索(NCBI网站)分析了它们在另一种铜绿假单胞菌血清型(O5,菌株PAO1)的蛋白质组中的缺失。铜绿假单胞菌O5 O-抗原结构与铜绿假单胞菌O6无关。具体而言,在O5结构中不存在甲酰基。9种候选物中有8种在铜绿假单胞菌血清型O5中具有同源物,这表明这些蛋白质对于铜绿假单胞菌O6菌株LESB58是非特异性的。剩余的候选物(locus_tag=PLES_12061, GenBank: CAW25933.1;SEQ ID NO:2)在铜绿假单胞菌血清型O5中没有明显的同源物,并因此被分类为对LESB58/铜绿假单胞菌血清型O6特异。
为了验证O6的特异性,证实了所发现的铜绿假单胞菌血清型O6甲酰基转移酶(SEQID NO:2)在其他铜绿假单胞菌血清型菌株O6中的存在。在其他四种铜绿假单胞菌血清型O6菌株中鉴定了铜绿假单胞菌O6型甲酰基转移酶(SEQ ID NO:2)的蛋白质等同物,包括菌株“PAK”中的基因座标签:PAK_01412和菌株M18中的基因座标签:PAM18_1171。
在甲基杆菌属物种(Methylobacterium sp. )(33%同一性,ACCESSION WP_020093860), Thiothrix nivea (30%同一性,ACCESSION WP_002707142), Anaerophaga thermohalophila (28%同一性,ACCESSION WP_010422313), Halorubrum californiense(27%同一性,ACCESSION WP_008445073), 茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans )(25%同一性,ACCESSION WP_012170036)和格氏伯克霍尔德氏菌(Burkholderia glathei)(24%同一性,ACCESSION KDR39707)中也鉴定了与铜绿假单胞菌血清型O6甲酰基转移酶(SEQ ID NO:2)具有低氨基酸序列同一性的甲酰基转移酶。总之,这些同源性分析表明相关基因编码与甲酰化相关的O6特异性活性。
为了测试铜绿假单胞菌血清型O6甲酰基转移酶(SEQ ID NO:2)在非甲酰化O6重复单元结构上的功能活性,克隆编码SEQ ID NO:2的基因。该基因稀有的TTG START密码子被ATG取代。在图5中描绘了将铜绿假单胞菌血清型O6甲酰基转移酶(SEQ ID NO:2)克隆到铜绿假单胞菌O6 rfb簇中以及这些基因的相对组织的示意图。
一旦被鉴定,评估铜绿假单胞菌O6甲酰基转移酶的功能。通过在缺乏功能性ECA(wec)簇的大肠杆菌菌株中与铜绿假单胞菌O6的rfb簇基因共表达测试铜绿假单胞菌血清型O6甲酰基转移酶(SEQ ID NO:2)的功能性。为了显示甲酰化,分析与脂质a核(lipid acore)结合的单个抗原重复单元(在waaL阳性菌株中)。通过使用O6特异性抗体免疫检测鉴定甲酰化的O6 O-抗原重复单元(图3A),表明甲酰基是铜绿假单胞菌O6 O抗原结构的相关表位。
为了在分子水平上显示甲酰化,通过MALDI MSMS分析O6重复单元。纯化的和2AB标记的重复单元显示铜绿假单胞菌O6甲酰基转移酶(SEQ ID NO:2)与铜绿假单胞菌O6的rfb簇基因的共表达产生了主峰的荧光信号,其移动了2-3分钟(从58到61',图3B)。
包含在58'峰中的物质的MALDI-MSMS分析产生Y离子片段化系列,其与未甲酰化的N乙酰化2-AB标记的O6重复单元一致。质子化前体离子m/z = 905,片段化成905->759->543->326的显著离子系列,对应于146(脱氧己糖),216(酰胺化N-乙酰己糖胺糖酸),217(N-乙酰己糖胺糖酸)单元的缺失。从表达铜绿假单胞菌血清型O6甲酰基转移酶基因的细胞获得的61'处收集的物质包含891的显著前体离子,其在891->745->529->326处片段化,对应于146(如上),216(如上)和203(酰胺化N-甲酰己糖胺糖酸)的缺失。该数据证明甲酰化依赖于铜绿假单胞菌血清型O6甲酰基转移酶的表达,因此该基因编码甲酰基转移酶。因此,编码铜绿假单胞菌血清型O6甲酰基转移酶的基因被命名为fmtO6。酰胺化N-乙酰己糖胺糖酸的乙酰基被甲酰基取代的事实提示了两步机理,其中乙酰基在加入甲酰基之前首先被除去。该模型意味着在甲酰基转移酶结构域将甲酰基附着到单糖之前,游离胺基团将作为中间体存在于C2处。因此,脱乙酰化的和未甲酰化的O抗原可能是铜绿假单胞菌血清型O6的实质和免疫学相关的,亚化学计量学存在的多糖形式。
实施例3:鉴定和测试用于铜绿假单胞菌O6 O抗原聚合的wzy基因。
该实施例描述了铜绿假单胞菌O6 wzy聚合酶的鉴定。
O抗原多糖构成许多革兰氏阴性细菌的细胞外表面。负责O抗原生物合成的酶促机构通常在称为rfb簇的单个基因簇中编码。铜绿假单胞菌血清型O6菌株表达聚合的O-抗原(图2)。然而,在各O-抗原簇中,编码O抗原聚合酶(wzy)的基因不存在。这意味着为了在大肠杆菌中重组表达铜绿假单胞菌O6 O抗原,鉴定wzy基因是必要的。 O-抗原聚合酶(wzy)是完整的内膜蛋白,其在“整合”连接至脂质A核心寡糖以形成LPS之前催化周质空间中O-抗原重复单元的聚合。Wzy聚合酶对它们的重复单元寡聚体是高度特异性的,并且wzy基因之间的同源性差。
铜绿假单胞菌O19的O-抗原与铜绿假单胞菌O6共有结构相似性。据推测,识别两种结构的wzy蛋白也可以共有相似的性质,例如结构,序列,跨膜域的数目。铜绿假单胞菌O19(ACCESSION AAM27560)的O19 Wzy蛋白的序列是已知的,并且在使用铜绿假单胞菌O6 PAK菌株蛋白质组作为同源性搜索的主题的Blast分析中用作主要查询。
为了评估鉴定的候选物是否对铜绿假单胞菌O6具有特异性,分析了它们在另一种铜绿假单胞菌血清型(O5,菌株PAO1)的蛋白质组中的存在。O5 O-抗原结构与O6和O19的结构无关。使用blast分析单独分析前100个结果中的铜绿假单胞菌O5蛋白质组的存在。来自PAK蛋白质组的100个候选物中的97个在铜绿假单胞菌血清型O5蛋白质组中具有同源物,这表明这些蛋白质通常存在于铜绿假单胞菌菌株中并且可能与O6 O抗原生物合成无关。100名候选物中有3个在铜绿假单胞菌O5蛋白质组中没有明显的同源物,因此被确定为铜绿假单胞菌O6特异性的。
为了测试三种鉴定的候选蛋白质中的一种是否是铜绿假单胞菌O6 wzy,三种蛋白质在Blast分析中用作查询。三种候选物之一PAK_01823(O6wzy PAK_01823;SEQ ID NO:3)与其他已知的寡糖重复单元聚合酶共有氨基酸序列同一性,例如与血链球菌(Streptococcus sanguinis)寡糖重复单元聚合酶(ACCESSION WP_004192559)具有25%同一性,与大肠杆菌(Escherichia coli)O139寡糖重复单元聚合酶(ACCESSION AAZ85718)具有22%同一性。因此,PAK_01823(O6wzy PAK_01823;SEQ ID NO:3)被鉴定为铜绿假单胞菌O6 wzy。
为了进一步确认SEQ ID NO:3为由铜绿假单胞菌O6 wzy编码的蛋白质,使用PSORTb(www.psort.org/psortb/)在生物信息学上预测蛋白质的亚细胞定位。预测蛋白质定位于具有11个跨膜域的细胞质膜中,这是O-抗原聚合酶中常见的特征。
在其他O6阳性铜绿假单胞菌菌株中发现了等同于PAK_01823(O6wzy PAK_01823;SEQ ID NO:3)的蛋白质,包括LESB58菌株(其具有铜绿假单胞菌O6 wzy蛋白质,与PAK菌株和内部所测试的菌株相比仅有1个aa差异)。
接下来,进行铜绿假单胞菌O6 wzy的功能测试。铜绿假单胞菌O6 rfb簇,fmtO6基因(即编码SEQ ID NO:2的基因,在上面实施例2中讨论的)和编码铜绿假单胞菌O6 wzy的基因(即编码SEQ ID NO:3的基因)在大肠杆菌W3110Δwec细胞中共表达,并通过免疫印迹分析所形成的脂多糖(图4)。抗O6抗血清仅在源自含有全部三种转基因的细胞的样品中检测到类似信号的梯状分子,表明PAK_01823(O6wzy PAK_01823;SEQ ID NO:3)确实是铜绿假单胞菌O6的聚合酶。因此,编码PAK_01823的基因被命名为O6wzy。
为了产生含有使大肠杆菌能够重组表达铜绿假单胞菌O6 O抗原所需的全部遗传元件的单个基因簇,在铜绿假单胞菌O6 rfb簇的下游克隆了fmtO6和O6wzy基因(即分别编码SEQ ID NO:2和3的基因)。在图5中描述了将密码子使用优化的铜绿假单胞菌O6 O-抗原聚合酶O6wzy克隆到克隆的铜绿假单胞菌O6 rfb簇中以及O6甲酰基转移酶和该基因的相对组织的示意图。进一步确定fmtO6和O6wzy基因(即分别编码SEQ ID NO:2和3的基因)可以在多个位置插入铜绿假单胞菌O6 rfb簇中。具体而言,fmtO6基因可以在单独的启动子控制下相对于rfb簇下游或rfb簇上游的rfb簇以顺时针方向插入。另外,fmtO6基因可以相对于rfb簇上游或下游的rfb簇以逆时针方向插入。O6wzy基因可以相对于rfb簇上游或下游的顺时针方向插入,或者在单独启动子控制下的rfb簇上游顺时针方向插入。上述所有构建体在铜绿假单胞菌O6 O抗原生物合成方面都是有活性的(数据未显示)。
实施例4:具有插入的寡糖转移酶和插入的rfb的细菌菌株,完成的rfbO6簇是稳定的并且产生生物缀合物
实施例1证明生物缀合物可以成功地通过已经通过插入(i)编码寡糖基转移酶的核酸和(ii)编码rfb簇的核酸而被遗传修饰的细菌宿主菌株产生。在该实施例中,使用假单胞菌蛋白质PcrV作为载体蛋白质进行与实施例1中所述的那些相似的实验。
自然界中,PcrV的一级氨基酸序列(参见例如UniProt O30527)不包含N-糖基化共有序列(“糖基化位点(glycosite)”)。使用WO 2006/119987中描述的方法,改造了包含1、2、3、4或5个糖基化位点的PcrV的重组变体。具体而言,通过操纵编码PcrV的核酸序列,产生PcrV变体,其表达1、2、3、4或5个优化的N-糖基化共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr),其中X和Z独立地选自Pro以外的任何天然氨基酸。
通过将以下直接插入到宿主细胞基因组中来产生修饰的大肠杆菌宿主细胞:(i)编码空肠弯曲菌寡糖基转移酶(PglB)的核酸和(ii)编码来自铜绿假单胞菌血清型O6 PAK菌株的rfb簇的核酸。该rfb簇编码铜绿假单胞菌血清群O6抗原的O-抗原合成所必需的基因。使用PCT/EP2013/071328(参见上面的第5.2节)或pUT微系统(Biomedal Lifescience)中描述的新插入方法进行插入。如上所述,通过导入表达包含1至5个糖基化位点的PcrV的质粒进一步修饰大肠杆菌宿主细胞。因此,本实施例中描述的经修饰的大肠杆菌宿主细胞,通过将编码寡糖基转移酶的核酸整合到宿主细胞基因组中表达(i)空肠弯曲菌寡糖基转移酶(PglB) (ii)通过将编码来自铜绿假单胞菌PAK菌株的rfb簇的核酸整合到宿主细胞基因组中表达产生O6抗原的铜绿假单胞菌rfb簇的基因;(iii)通过用包含编码载体蛋白的修饰核酸的质粒(其中核酸已被修饰以使其编码1-5个糖基化位点,如上所述)转化宿主细胞来表达经修饰的PcrV载体蛋白。
产生另外的经修饰的大肠杆菌宿主细胞以允许比较包含双重整合(整合寡糖基转移酶和整合rfb簇)的经修饰的宿主细胞以产生生物缀合物(PcrV-O6),其中通过宿主产生生物缀合物,所述宿主细胞具有(i)仅寡糖基转移酶或rfb簇的单一整合和由宿主细胞质粒表达的其余组分(载体蛋白和寡糖基转移酶或rfb簇);或(ii)没有整合组分,所有组分(载体蛋白和寡糖基转移酶和rfb簇)由质粒表达。
在分析中使用三种不同的大肠杆菌菌株并进行比较:(i)“St7343”,其包含插入到宿主细胞基因组中的pglB和完整的O6 rfb簇(即,是双重整合菌株),和编码PcrV载体蛋白(具有一个、两个、三个、四个或五个糖基)的质粒;(ii)“St7209”,其包含质粒表达的pglB,插入到宿主细胞基因组中的O6 rfb簇和编码PcrV载体蛋白(具有1、2、3、4或5个糖基)的质粒;和(iii)“St2182”,其包含质粒表达的pglB,质粒表达的O6 rfb簇和编码PcrV载体蛋白(具有1、2、3、4或5个糖基)的质粒。图6描绘了每个菌株的特征(6A:St7343;6B:St7209;6C:St2182)。
如图6所示,表达寡糖基转移酶、载体蛋白和rfb簇的所有菌株均产生生物缀合物。参见对应于PcrV-O6的kDa标志物40-70(kDa 55标志物周围)之间描绘的印迹。重要的是,如实施例1中所示,该观察包括包含寡糖基转移酶和rfb簇双重整合的菌株。特别参见图6A所示的结果。因此,与实施例1一样,本实施例不仅证明了在将基因/基因簇双重插入宿主细胞基因组后可以产生稳定的宿主细胞,还维持了该基因的功能。具体而言,保留了插入的寡糖基转移酶和插入的rfb簇的功能,导致生物缀合物的产生。
实施例5:EPA-O6生物缀合物的产生和纯化
该实施例描述了包含铜绿假单胞菌O6抗原的生物缀合物的产生。
用包含铜绿假单胞菌O6 rfb簇,来自空肠弯曲杆菌的寡糖基转移酶pglB,编码解毒载体蛋白EPA的基因和QuiNAc生物合成/转移酶基因wbpVLM(来自铜绿假单胞菌O6菌株)的质粒转化大肠杆菌W3110 ΔwaaL Δwec Δrfb。图8描绘了质粒保留分析的结果。用含有全部四种质粒的宿主细胞接种补充有四环素、壮观霉素、卡那霉素和氨苄青霉素的培养基(LB培养液)。预培养物在37℃下过夜生长。第二天,通过将预培养物稀释至OD600 0.1来接种补充有MgCl2、四环素、壮观霉素、卡那霉素和氨苄青霉素的培养基(TB)。细胞在37℃生长直至达到约OD600 0.8-1.0,然后通过加入1mM IPTG和0.1%阿拉伯糖诱导pglb、epa和wbpVLM的表达。过夜诱导后通过离心收集细胞。
使用金属螯合物亲和层析(IMAC)、阴离子交换层析(Q源)和尺寸排阻层析(SEC)从修饰的宿主细胞的周质提取物纯化EPA-O6生物缀合物。合并含有糖缀合物的洗脱级分,随后进行下一个层析步骤。通过SDS-PAGE对最终的SEC洗脱液进行表征,然后进行考马斯蓝染色或使用图7中所示的抗体进行Western印迹。
使用一系列分析方法表征EPA-O6生物缀合物。使用LAL测定法测量内毒素的水平(13EU / ml)。通过SDS-PAGE和毛细管凝胶电泳(CGE,86%纯度)确定纯度。使用BCA测定法测量蛋白质的量(1.75mg / ml)。使用蒽酮(Anthrone)测定法测量多糖的量(Dubois等,1956;311.6ug / ml)。使用高分辨率的“糖基化度”(DOG)SDS-PAGE确定O6-聚合物的平均大小(每个聚合物平均7.9个重复单元)。通过等电聚焦(IEF)完成生物缀合物的电亚型的确定。最后,使用针对蛋白质(EPA)或多糖(O6)的抗体通过免疫印迹确认生物缀合物的身份。
实施例6:免疫研究
本实施例证明铜绿假单胞菌O6-EPA生物缀合物是免疫原性的。
在第0、14和28天,用非佐剂化或佐剂化的制剂(用水包油乳状液佐剂)中的0.2μg或2μg的O6-EPA缀合物(参见实施例5)经肌肉内免疫雌性6周龄BALB/c OlaHsd小鼠(以20只为一组)。单独用佐剂(O / W)接种10只小鼠的对照组。在第42天(III后14天)收集的个体血清中测定抗O6 ELISA,并且在合并的Post-II和Post-III血清上测定调理素效价。在图9中显示并在下面详细描述了结果。
图9A描述了抗O6 ELISA应答。在高结合微量滴定板(Nunc Maxisorp)上的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中以8μg/ ml包被纯化的O6 LPS-O6(PaO6a,6c),在4℃过夜。在室温下搅拌的情况下用PBS-BSA 1%封闭30分钟。将小鼠抗血清预稀释1/100或1/10,然后在微板中进一步稀释两倍,并在室温下搅拌的情况下温育30分钟。洗涤后,使用在PBS-tween 0.05%-BSA0.2%中稀释1/5000的Jackson ImmunoLaboratories Inc.过氧化物酶缀合的AffiniPure山羊抗-小鼠IgG(H+L)(ref:115-035-003)检测结合的鼠类抗体。将检测抗体在室温下搅拌的情况下温育30分钟。使用4mg OPD +5μl H2O2 / 10ml pH 4.5 0.1M柠檬酸盐缓冲液在室温下黑暗中显色15分钟。用50μl HCl终止反应,并在490nm处读取相对于620nm的光密度(OD)。
存在于血清中的抗O6抗体水平以中点效价表示。计算每个治疗组中20个样品的个体血清的GMT(对照组10个)。
在注射用佐剂配制的生物缀合物后,在小鼠中观察到免疫应答。剂量之间没有观察到差异。对血清转化的百分比也进行了类似的观察。利用非佐剂化的制剂没有观察到或观察到非常弱的应答。
图9B显示来自用或不用佐剂配制的O6-EPA生物缀合物免疫的小鼠的HL60细胞中的调理素效价。
在具有15μl HL-60吞噬细胞(调整至5 10e6细胞/ ml),15μl铜绿假单胞菌(在TSA琼脂平板上生长),15μl测试血清稀释液和15μl仔猪补体的圆底微孔板中进行调理吞噬(opsonophagocytosis)测定(OPA)。首先在HBSS-BSA 1%中稀释灭活的测试合并血清(1/16或1/50最终稀释)并将其加入到稀释的铜绿假单胞菌O6菌株中(菌株ID:HNCMB 170009,获自Hungarian National Collection of Medical Bacteria)以在测试结束时计数200-250CFU /孔。
然后在每个孔中加入HL-60细胞(调整至5.10e6 / ml)和仔猪补体(最终12.5%)。每个测试样品都包括具有灭活补体的对照。
在37℃搅拌的情况下将反应混合物温育90分钟。在1/200稀释后,然后将50μl体积转移到平底微孔板中。加入50μl MH琼脂,然后加入PBS-0.9%琼脂。在30℃温育过夜后进行自动化菌落计数。
将调理吞噬活性表示为血清稀释度的倒数,其产生至少50%的杀死。
数据证明了注射佐剂化基团后诱导的抗体的功能。
总之,该实施例证明铜绿假单胞菌O6-EPA生物缀合物既具有免疫原性又具有功能性(即诱导了体内杀死铜绿假单胞菌O6的抗体)。
实施例7
本实施例证明铜绿假单胞菌O6-PcrV生物缀合物是免疫原性的。
免疫
在第0、14和28天,用非佐剂化的或水包油乳状液佐剂化制剂中0.2μg的O6-PcrV生物缀合物IM免疫20只Balb / c 6周龄小鼠组和20只雌性6周龄OFA SD大鼠组。
通过ELISA(使用抗O6和抗PcrV ELISA)确定IgG免疫应答。在O6的调理吞噬测定中和PcrV的溶血测定中评估抗体的功能性。在第42天(III期后)和合并的II期后和III期后血清中收集的个体血清中评估免疫应答。
测试的缀合物
测试了三种铜绿假单胞菌O6-PcrV缀合物。在每种情况下,三个糖基化位点已经被改造成PcrV,并且短的、中等的或长的O6链被添加到糖基化位点。
缀合物 | 改造的糖基化位点的数量 | O6聚合物长度 | 蛋白浓度Mg/ml | 糖浓度Mg/ml | s/p比例 | 内毒素 | 纯度 |
O6-PcrV 短的 | 3 | 短 | 0.849 | 0.169 | 19.9% | <5 | 97.2% |
O6-PcrV 中等的 | 3 | 中等 | 0.154 | 0.072 | 46.8% | 9.425 | 97.7% |
O6-PcrV 长的 | 3 | 长 | 0.531 | 0.450 | 84.7% | <5 | 100% |
抗O6 ELISA(在大鼠血清上)
在4℃下,在高结合微量滴定板(Nunc Maxisorp)上磷酸盐缓冲盐水(PBS)中以8μg/ ml过夜包被纯化的O6-LPS。在室温搅拌的情况下用PBS-BSA 1%封闭平板30分钟。将大鼠抗血清预稀释1/100或1/10,然后在微孔板中进一步进行两倍稀释,并在室温搅拌的情况下温育30分钟。洗涤后,使用在PBS-tween 0.05%中1/2500稀释的Jackson ImmunoLaboratoriesInc.过氧化物酶缀合的AffiniPure山羊抗大鼠IgG(H + L)(ref:112-035-003)检测结合的大鼠抗体。将检测抗体在室温搅拌的情况下温育30分钟。使用4mg OPD +5μl H 2 O 2 /10ml pH 4.5 0.1M柠檬酸盐缓冲液在室温下黑暗中显色15分钟。用50μl HCl终止反应,并在490 nm处读取相对于620 nm的光密度(OD)。存在于血清中的抗O6抗体水平以中点效价表示。计算每个治疗组20个个体样品的GMT。
抗PcrV ELISA(在大鼠血清上)
在4℃下,在高结合微量滴定板(Nunc Maxisorp)上磷酸盐缓冲盐水(PBS)中以1μg/ ml过夜包被纯化的His标记的PcrV。在室温搅拌的情况下用PBS-BSA 1%封闭平板30分钟。将大鼠抗血清预稀释1/400,然后在微孔板中进一步进行两倍稀释,并在室温搅拌的情况下温育30分钟。洗涤后,使用在PBS-tween 0.05%中1/5000稀释的JacksonImmunoLaboratories Inc.过氧化物酶缀合的AffiniPure山羊抗大鼠IgG(H + L)(ref:112-035-003)检测结合的大鼠抗体。将检测抗体在室温搅拌的情况下温育30分钟。使用4mgOPD +5μl H 2 O 2 / 10ml pH 4.5 0.1M柠檬酸盐缓冲液在室温下黑暗中显色15分钟。用50μl HCl终止反应,并在490 nm处读取相对于620 nm的光密度(OD)。
存在于血清中的抗-PcrV抗体水平以中点效价表示。计算每个治疗组20个样本的GMT。
抗O6 ELISA(在小鼠血清上)
在4℃下,在高结合微量滴定板(Nunc Maxisorp)上磷酸盐缓冲盐水(PBS)中以8μg/ ml过夜包被纯化的O6-LPS。在室温搅拌的情况下用PBS-BSA 1%封闭平板30分钟。将小鼠抗血清预稀释1/100或1/10,然后在微孔板中进一步进行两倍稀释,并在室温搅拌的情况下温育30分钟。洗涤后,使用在PBS-tween 0.05%中1/2500稀释的Jackson ImmunoLaboratoriesInc.过氧化物酶缀合的AffiniPure山羊抗小鼠IgG(H + L)(ref: 115-035-003)检测结合的小鼠抗体。将检测抗体在室温搅拌的情况下温育30分钟。使用4mg OPD +5μl H 2 O 2 /10ml pH 4.5 0.1M柠檬酸盐缓冲液在室温下黑暗中显色15分钟。用50μl HCl终止反应,并在490 nm处读取相对于620 nm的光密度(OD)。存在于血清中的抗O6抗体水平以中点效价表示。计算每个治疗组20个个体样品的GMT。
抗PcrV ELISA(在小鼠血清上)
在4℃下,在高结合微量滴定板(Nunc Maxisorp)上磷酸盐缓冲盐水(PBS)中以1μg/ ml过夜包被纯化的His标记的PcrV。在室温搅拌的情况下用PBS-BSA 1%封闭平板30分钟。将小鼠抗血清预稀释1/400,然后在微孔板中进一步进行两倍稀释,并在室温搅拌的情况下温育30分钟。洗涤后,使用在PBS-tween 0.05%中1/5000稀释的JacksonImmunoLaboratories Inc.过氧化物酶缀合的AffiniPure山羊抗小鼠IgG(H + L)(ref:112-035-003)检测结合的小鼠抗体。将检测抗体在室温搅拌的情况下温育30分钟。使用4mgOPD +5μl H 2 O 2 / 10ml pH 4.5 0.1M柠檬酸盐缓冲液在室温下黑暗中显色15分钟。用50μl HCl终止反应,并在490 nm处读取相对于620 nm的光密度(OD)。
存在于血清中的抗-PcrV抗体水平以中点效价表示。计算每个治疗组20个样本的GMT。
抗O6 OPA应答
在具有15μl HL-60吞噬细胞(调整至5 10e6个细胞/ ml),15μl铜绿假单胞菌(在TSA琼脂平板上生长),15μl测试血清稀释液和15μl仔猪补体的圆底微孔板中进行调理吞噬测定(OPA)。
首先在HBSS-BSA 1%中稀释灭活的测试血清(1/4)并将其加入到铜绿假单胞菌菌株中(稀释的GVXN 5871以在测试结束时获得200-250 CFU /孔)。
然后在每个孔中加入HL-60细胞(调整至5.10e6 / ml)和仔猪补体(最终12.5%)。每个测试样品也包括具有灭活补体的对照。
在37℃搅拌的情况下将反应混合物温育90分钟。在1/200稀释后,然后将50μl体积转移到平底微孔板中。加入50μl MH琼脂,然后加入PBS-0.9%琼脂(为了安全原因,额外加入50µl)。在30℃温育过夜后进行自动化菌落计数。
将调理吞噬活性表示为血清稀释度的倒数,其产生至少50%的杀死。
抗-PcrV溶血抑制反应
在37℃,5%CO2下,在TSA琼脂平板上过夜培养ATCC 29260(PCRV +),并用5ml MinS液体培养基进行收集。将几微升接种在Wyame Fiole中并在4小时内生长。
在96孔U-底微孔板中的80μl磷酸盐缓冲液(DPBS)中进行测试血清的连续两倍稀释。
然后加入80μl 3X稀释的ATCC 29260(溶解100%兔红血球的稀释液)。然后将80μl纯化和稀释的兔红细胞加入到每个孔中。为了获得相同的溶血和标准化的溶血抑制,对每个测定确定兔红细胞的稀释度。将板在1000 rpm,4℃下离心10分钟并在37℃下温育2小时。
然后将平板在4℃以1000 rpm离心10分钟。将每孔150μl(上清液)转移至平底板并用微量滴定板读数器在405nm处读数。
溶血抑制活性由合并血清的中点效价(50%抑制)表示。
抗O6 IgG ELISA
在实验的所有组中,通过ELISA评估了II期后4只大鼠和III期后个体血清的5个集合。在图14中显示了结果。
从II期后到III期后合并血清中观察到促进作用。与在水包油乳状液佐剂中配制的所有O6生物缀合物(其更具免疫原性)相比,非佐剂化的O6生物缀合物具有低免疫原性。
抗PcrV免疫应答
在实验的所有PcrV组(G5到G9)上,通过ELISA评估了II期后4只大鼠和III期后个体血清的5个集合。。
在图13中呈现了对于II期后和III期后大鼠血清获得的中点效价的几何平均值。
在II期后和III期后合并的血清之间观察到促进作用。利用非佐剂化的O6-PcrV没有观察到或观察到非常弱的免疫应答抗-PcrV。相反,对于在水包油佐剂中配制的三种O6生物缀合物,观察到针对PcrV蛋白载体的良好免疫应答。
使用包含20%糖/蛋白质比例(较高蛋白质浓度)的第5组O6-PcrV生物缀合物观察到最高的抗体应答。
PcrV溶血抑制测定:
在图10中显示了PcrV溶血抑制测定的结果。在用O6-PcrV缀合物免疫的小鼠中,对于所有测试的缀合物都获得了良好的PcrV溶血抑制效价。对于在小鼠中测试的所有O6-PcrV生物缀合物,PcrV能够产生具有良好PcrV溶血抑制效价的功能性抗体。尽管具有20%的糖/蛋白质比例的较短糖链显示出比其他缀合物更好的效价的趋势,但提高不具有统计学显著性。
在小鼠和大鼠中,水包油乳状液的存在增强了针对PcrV的免疫应答。
调理吞噬结果
在图12中显示了调理吞噬测定的结果。在缀合物制剂含有水包油佐剂的样品中获得良好的调理吞噬应答。这在非佐剂化样品中未经测试。随后的研究已经显示了来自非佐剂化缀合物免疫的小鼠的血清中非常弱的调理素应答。
本公开内容的范围不受在此描述的具体实施例的限制。实际上,除了所描述的那些之外,本文提供的主题的各种修改对于本领域技术人员而言从前面的描述和附图将变得显而易见。这些修改旨在落入所附权利要求的范围内。
本文引用了各种出版物、专利和专利申请,其公开内容通过引用整体并入。
Claims (71)
1.包含共价连接至铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) PcrV载体蛋白的抗原的缀合物,所述铜绿假单胞菌PcrV载体蛋白包含与SEQ ID NO:1-4的序列具有至少70%或80%同一性的氨基酸序列,其中所述抗原(直接或通过接头)连接至铜绿假单胞菌PcrV载体蛋白的氨基酸残基。
2.权利要求1的缀合物,其中所述氨基酸残基不是天冬酰胺残基。
3.权利要求1的缀合物,其中所述氨基酸残基是天冬酰胺残基。
4.权利要求3的缀合物,其中所述天冬酰胺残基不是引入与SEQ ID NO:1-4的序列具有至少80%同一性的氨基酸序列中的D/E-X-N-X-S/T共有序列的部分,其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸。
5.权利要求3的缀合物,其中所述天冬酰胺残基是引入与SEQ ID NO:1-4的序列具有至少70%或80%同一性的氨基酸序列中的D/E-X-N-X-S/T共有序列的部分,其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸,其中天冬酰胺残基位于与SEQ ID NO:3的氨基酸24-166或氨基酸281-317之间等同的位置处或位于其氨基酸317处。
6.权利要求3的缀合物,其中所述天冬酰胺残基是引入与SEQ ID NO:1-4的序列具有至少70%或80%同一性的氨基酸序列中的D/E-X-N-X-S/T共有序列的部分,其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸,其中天冬酰胺残基位于与SEQ ID NO:4的氨基酸1-143或氨基酸258-294之间等同的位置处或位于其氨基酸294处。
7.权利要求3的缀合物,其中所述天冬酰胺残基是D/E-X-N-X-S/T共有序列的部分,其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸,其中天冬酰胺残基没有通过突变引入SEQ ID NO:5的序列或与SEQ ID NO:5具有至少80%同一性的序列中。
8.权利要求5-7中任一项的缀合物,其中通过除去PcrV肽序列并用包含D/E-X-N-X-S/T共有序列的肽将其置换来将包含D/E-X-N-X-S/T共有序列的肽引入氨基酸序列中。
9.权利要求8的缀合物,其中所述PcrV肽序列包含1-7个氨基酸。
10.权利要求8的缀合物,其中所述PcrV肽序列包含1个氨基酸。
11.权利要求5-10中任一项的缀合物,其中将包含D/E-X-N-X-S/T共有序列的肽在SEQID NO:3的氨基酸残基24-143或SEQ ID NO:4的氨基酸残基1-120之间的位置处引入氨基酸序列中。
12.权利要求11的缀合物,其中将包含D/E-X-N-X-S/T共有序列的肽在SEQ ID NO:3的氨基酸残基24-48或SEQ ID NO:4的氨基酸残基1-24之间的位置处引入氨基酸序列中。
13.权利要求1-12中任一项的缀合物,其中将至少2、3或4个D/E-X-N-X-S/T共有序列引入SEQ ID NO:1-4中任一者的序列或与其具有至少70%或80%同一性的序列中。
14.权利要求1-13中任一项的缀合物,其中所述PcrV载体蛋白具有包含SEQ ID NO:6-62中至少一种的序列。
15.权利要求14的缀合物,其中所述PcrV载体蛋白具有包含SEQ ID NO:6-12和33中至少一种的序列。
16.权利要求15的缀合物,其中所述PcrV载体蛋白具有包含SEQ ID NO:6-12和33中至少3种的序列。
17.权利要求15或16的缀合物,其中所述PcrV载体蛋白具有包含SEQ ID NO:6和/或SEQID NO:9和/或SEQ ID NO:11和/或SEQ ID NO:33的序列。
18.权利要求1-3中任一项的缀合物,其中所述抗原通过使用化学缀合方法可获得的化学键与铜绿假单胞菌PcrV载体蛋白共价连接。
19.权利要求18的缀合物,其中所述化学缀合方法选自碳二亚胺化学作用、还原性胺化、氰化化学作用(例如CDAP化学作用)、马来酰亚胺化学作用、酰肼化学作用、酯化学作用和N-羟基琥珀酰亚胺化学作用。
20.权利要求18或权利要求19的缀合物,其中所述抗原与铜绿假单胞菌PcrV载体蛋白上的天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、组氨酸、精氨酸或色氨酸氨基酸共价连接。
21.权利要求18-20中任一项的缀合物,其中将所述抗原直接连接至铜绿假单胞菌PcrV载体蛋白。
22.权利要求18-20中任一项的缀合物,其中将所述抗原经接头附接至铜绿假单胞菌PcrV载体蛋白。
23.权利要求22的缀合物,其中所述接头选自具有4-12个碳原子的接头、双官能接头、末端含有1或2个反应性氨基的接头、B-丙酰胺基、硝基苯基-乙胺、卤代酰基卤化物、6-氨基己酸和ADH。
24.权利要求1-23中任一项的缀合物,其中所述抗原是糖。
25.权利要求24的缀合物,其中所述抗原是细菌荚膜糖。
26.权利要求24的缀合物,其中所述抗原是细菌脂多糖或脂寡糖。
27.权利要求26的缀合物,其中所述抗原是来自铜绿假单胞菌的脂多糖。
28.权利要求27的缀合物,其中所述抗原是来自铜绿假单胞菌的O抗原,任选O1、O2、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O11、O12、O13、O14、O15、O16、O17、O18、O19或O20,例如O6或O11。
29.具有与SEQ ID NO:1-4的序列具有至少70%或80%同一性的氨基酸序列的PcrV蛋白,所述氨基酸序列包含D/E-X-N-X-S/T共有序列,其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸。
30.权利要求29的PcrV蛋白,D/E-X-N-X-S/T共有序列位于SEQ ID NO:3的氨基酸23-166或氨基酸281-317之间或氨基酸317的位置,其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸。
31.权利要求29的PcrV蛋白,D/E-X-N-X-S/T共有序列位于SEQ ID NO:4的氨基酸1-143或氨基酸258-294之间或氨基酸294,其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸。
32.权利要求29-31中任一项的PcrV蛋白,其中通过除去PcrV肽序列并用包含D/E-X-N-X-S/T共有序列的肽将其置换来将包含D/E-X-N-X-S/T共有序列的肽引入氨基酸序列中。
33.权利要求32的PcrV蛋白,其中所述PcrV肽序列包含1-7个氨基酸。
34.权利要求32的PcrV蛋白,其中所述PcrV肽序列包含1个氨基酸。
35.权利要求29-34中任一项的PcrV蛋白,其中将包含D/E-X-N-X-S/T共有序列的肽在SEQ ID NO:3的氨基酸残基24-143或SEQ ID NO:4的氨基酸残基1-120之间的位置处引入氨基酸序列中。
36.权利要求35的PcrV蛋白,其中将包含D/E-X-N-X-S/T共有序列的肽在SEQ ID NO:3的氨基酸残基24-48或SEQ ID NO:4的氨基酸残基1-24之间的位置处引入氨基酸序列中。
37.权利要求29-36中任一项的PcrV蛋白,其中将至少2、3或4个D/E-X-N-X-S/T共有序列引入SEQ ID NO:1-4中任一者的序列或与其具有至少80%同一性的序列中。
38.权利要求29-37中任一项的PcrV蛋白,其具有包含SEQ ID NO:6-62中至少一种的氨基酸序列。
39.权利要求38的PcrV蛋白,其具有包含SEQ ID NO:6-12和33中至少一种的氨基酸序列。
40.权利要求39的PcrV蛋白,其具有包含SEQ ID NO:6-12和33中至少3种的氨基酸序列。
41.权利要求39或40的PcrV蛋白,其具有包含SEQ ID NO:6和/或SEQ ID NO:9和/或SEQID NO:11和/或SEQ ID NO:33的氨基酸序列。
42.权利要求29-41中任一项的PcrV蛋白,其中所述氨基酸序列包含可用于纯化所述PcrV蛋白的肽标签。
43.权利要求42的PcrV蛋白,其中所述肽标签位于所述氨基酸序列的C末端。
44.权利要求29-43中任一项的PcrV蛋白,其中所述肽标签包含六个组氨酸残基。
45.权利要求29-44中任一项的PcrV蛋白,其中所述氨基酸序列包含前导序列,所述前导序列能够指导所述PcrV蛋白进入细菌周质。
46.权利要求45的PcrV蛋白,其中所述前导序列具有与SEQ ID NO:63具有至少80%同一性的氨基酸序列。
47.免疫原性组合物,其包含权利要求1-28中任一项的缀合物或权利要求29-46中任一项的PcrV蛋白和药学上可接受的赋形剂。
48.权利要求47的免疫原性组合物,其还包含额外的抗原。
49.权利要求48的免疫原性组合物,其中所述额外的抗原选自:O-抗原和载体蛋白的缀合物、细菌荚膜多糖和载体蛋白的缀合物、LOS和载体蛋白的缀合物以及蛋白质。
50.制备权利要求47-49中任一项的免疫原性组合物的方法,其包括将缀合物或PcrV蛋白与药学上可接受的赋形剂混合的步骤。
51.根据权利要求1-46中任一项的缀合物或PcrV蛋白,其用于治疗感染。
52.根据权利要求1-46中任一项的缀合物或PcrV蛋白,其用于治疗铜绿假单胞菌感染。
53.权利要求51或52所使用的缀合物或PcrV,其中所述治疗针对有需要的人主体。
54.治疗方法,其包括将根据权利要求1-46中任一项的缀合物或PcrV蛋白施用于有需要的患者的步骤。
55.权利要求54的方法,其中所述治疗是针对假单胞菌感染,例如铜绿假单胞菌感染,任选地在人患者中。
56.多核苷酸,其编码权利要求29-46中任一项的PcrV蛋白。
57.编码PcrV蛋白的多核苷酸,其具有编码多肽的核苷酸序列,所述多肽具有与SEQ IDNO:1-4中的任一者具有至少70%或80%同一性的氨基酸序列。
58.载体,其包含权利要求56或57的多核苷酸。
59.宿主细胞,其包含:
编码糖基转移酶的核酸;
编码寡糖基转移酶的核酸;和
编码根据权利要求29-46中任一项的铜绿假单胞菌PcrV蛋白的核酸。
60.权利要求59的宿主细胞,其中所述编码糖基转移酶的核酸来源于假单胞菌的rfb簇,其中所述核酸任选稳定地插入到宿主细胞的基因组中。
61.权利要求60的宿主细胞,其中所述假单胞菌是铜绿假单胞菌,任选为血清型O6或O11。
62.权利要求59-61中任一项的宿主细胞,其中所述寡糖基转移酶来源于弯曲杆菌。
63.权利要求62的宿主细胞,其中所述寡糖基转移酶是空肠弯曲杆菌的PglB。
64.权利要求59-63中任一项的宿主细胞,其中所述编码铜绿假单胞菌PcrV蛋白的核酸在宿主细胞中的质粒中。
65.权利要求59-63中任一项的宿主细胞,其还包含甲酰基转移酶,其中所述核酸编码与SEQ ID NO:65具有约或至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性或同源性的蛋白,或其中所述核酸编码SEQ ID NO:65。
66.权利要求59-65中任一项的宿主细胞,其还包含编码wzy聚合酶的核酸,其中所述核酸编码与SEQ ID NO:66具有约或至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性或同源性的蛋白,或其中所述核酸编码SEQ ID NO:66。
67.权利要求65-66中任一项的宿主细胞,其中编码甲酰基转移酶的所述核酸和/或编码wzy聚合酶的所述核酸已经稳定地插入所述宿主细胞的基因组中。
68.权利要求65-66中任一项的宿主细胞,其中编码甲酰基转移酶的基因和/或编码wzy聚合酶的基因存在于所述宿主细胞的质粒上。
69.权利要求59-68中任一项的宿主细胞,其中所述宿主细胞是大肠杆菌。
70.产生包含与糖连接的铜绿假单胞菌PcrV蛋白的生物缀合物的方法,所述方法包括在适合于生产所述蛋白的条件下培养权利要求59-69中任一项的宿主细胞。
71.通过权利要求70的方法产生的生物缀合物,其中所述生物缀合物包含连接至铜绿假单胞菌PcrV蛋白的糖。
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