CN103974975A - 抗假单胞菌Psl结合分子及其用途 - Google Patents

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Abstract

本披露涉及一种抗假单胞菌Psl结合分子及其用途，特别是在预防和治疗假单胞菌感染中的用途。此外，本披露提供了用于预防和治疗假单胞菌感染的组合物和方法。

Description

抗假单胞菌Psl结合分子及其用途
背景
披露领域
本披露涉及抗假单胞菌Psl结合分子和其用途，具体地说在预防和治疗假单胞菌感染中的用途。此外，本披露提供了用于预防和治疗假单胞菌感染的组合物和方法。
披露背景
铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）（铜绿假单胞菌（P.aeruginosa））是导致受损个体的急性和慢性感染的革兰氏阴性机会病原体（马（Ma）等人，《细菌学杂志》（Journal of Bacteriology）189(22):8353-8356(2007)）。这部分是由于细菌对于临床使用的抗生素的高先天抗性，并且部分是由于高度抗生素抗性生物膜的形成（德伦柯克（Drenkard）E，《微生物与感染》（Microbes Infect）5:1213-1219(2003)；汉柯克（Hancokc）&斯伯特（Speert），《耐药性新资讯》（Drug Resist Update）3:247-255(2000)）。
铜绿假单胞菌是西方世界中的医院获得性感染的常见病因。它是烧伤受害者和免疫受损个体的菌血症的常见治病因子（莱克扎克（Lyczak）等人，《微生物与感染》2:1051-1060(2000)）。它还是医院性革兰氏阴性肺炎的最常见病因（克莱汶（Craven）等人，《呼吸道感染研讨会》（Semin Respir Infect）11:32-53(1996)），尤其是在机械通气患者中，并且是患有囊性纤维化的个体的肺中的最普遍病原体（皮埃尔（Pier）等人，《美国微生物学新闻杂志》（ASMNews）6:339-347(1998)）。严重铜绿假单胞菌感染可变成全身性的，从而导致败血症。败血症的特征是严重全身性炎症，经常导致多器官功能衰竭和死亡。
假单胞菌Psl外泌多糖据报告可锚定于铜绿假单胞菌的表面、并且被认为在促进定殖于宿主组织和建立/维持生物膜形成方面是重要的（杰克逊（Jackson）·K·D等人，《细菌学杂志》186，4466-4475(2004)）。它的结构包括富含甘露糖的重复五糖（伯德（Byrd）·M·S等人，《分子微生物学杂志》（MolMicrobiol）73，622-638(2009)）。
由于多药耐药性不断增加，在本领域中仍然需要开发用于鉴别新的假单胞菌特异性预防和治疗剂的新颖策略。
概述
一个实施例是针对一种分离的结合分子，例如，特异性结合至假单胞菌Psl的一种抗体或其抗原结合片段，其中该结合分子(a)可以抑制铜绿假单胞菌附着至上皮细胞上、(b)可以促进铜绿假单胞菌的OPK，或(c)可以抑制铜绿假单胞菌附着至上皮细胞上并且可以促进铜绿假单胞菌的OPK。
还披露了一种分离的结合分子，例如，特异性结合至与包含WapR-004、Cam-003、Cam-004或Cam-005的重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）的一种抗体或其抗原结合片段所结合的相同的假单胞菌Psl表位的一种抗体或其抗原结合片段。
还披露了一种分离的结合分子，例如，特异性结合至假单胞菌Psl，并且竞争性抑制包含WapR-004、Cam-003、Cam-004或Cam-005的VH和VL的一种抗体或其抗原结合片段与假单胞菌Psl结合的一种抗体或其抗原结合片段。
包括在本披露内的一些实施例包括结合分子，例如如上所述的一种抗体或其抗原结合片段，其中WapR-004的VH和VL对应地包含SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12，Cam-003的VH和VL对应地包含SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2，Cam-004的VH和VL对应地包含SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:2，并且Cam-005的VH和VL对应地包含SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:2。
还披露了一种分离的结合分子，例如，特异性结合至与包含WapR-001、WapR-002或WapR-003的VH和VL区的一种抗体或其抗原结合片段所结合的相同的假单胞菌Psl表位的一种抗体或其抗原结合片段。
进一步披露了一种分离的结合分子，例如，特异性结合至假单胞菌Psl，并且竞争性抑制包含WapR-001、WapR-002或WapR-003的VH和VL的一种抗体或其抗原结合片段与假单胞菌Psl结合的一种抗体或其抗原结合片段。
一些实施例包括结合分子，例如如上所述的一种抗体或其抗原结合片段，其中WapR-001的VH和VL对应地包含SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，WapR-002的VH和VL对应地包含SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8，并且WapR-003的VH和VL对应地包含SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10。
进一步提供了一种分离的结合分子，例如，特异性结合至与包含WapR-016的VH和VL区的一种抗体或其抗原结合片段所结合的相同的假单胞菌Psl表位的一种抗体或其抗原结合片段。
还提供了一种分离的结合分子，例如，特异性结合至假单胞菌Psl，并且竞争性抑制包含WapR-016的VH和VL的一种抗体或其抗原结合片段与假单胞菌Psl结合的一种抗体或其抗原结合片段。
一些实施例包括结合分子，例如如上所述的一种抗体或其片段，其中WapR-016的VH和VL对应地包含SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16。
还提供了一种分离的结合分子，例如，特异性结合至假单胞菌Psl的、包含一种抗体VH的一种抗体或其抗原结合片段，其中VH包含与SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15至少90%一致或与其一致的氨基酸序列。
一些实施例包括一种分离的结合分子，例如，特异性结合至假单胞菌Psl的、包含一种抗体VL的一种抗体或其抗原结合片段，其中VL包含与SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:16至少90%一致或与其一致的氨基酸序列。
还提供了一种特异性结合至假单胞菌psl的分离的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段所包含的VH和VL氨基酸序列与以下各项至少90%一致或与其一致：(a)对应地为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、(b)对应地为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:2、(c)对应地为SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:2、(d)对应地为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6、(e)对应地为SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:8、(f)对应地为SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10、(g)对应地为SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12、(h)对应地为SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14、或(i)对应地为SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16。在一个特定实施例中，上述抗体或其抗原结合片段包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:1的VH和具有氨基酸序列SEQ ID NO:2的VL。在其他实施例中，上述抗体或其抗原结合片段包含具有氨基酸序列SEQ IDNO:11的VH和具有氨基酸序列SEQ ID NO:12的VL。
还披露了一种分离的结合分子，例如，特异性结合至假单胞菌Psl的、包含一种抗体VH的一种抗体或其抗原结合片段，其中VH包含与以下各项一致的或除了四个、三个、两个或一个氨基酸取代以外与其一致的一个VH互补决定区-1（VHCDR1）氨基酸序列：SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:47、SEQ IDNO:53、或SEQ ID NO:59。
还提供了一种分离的结合分子，例如，特异性结合至假单胞菌Psl的、包含一种抗体VH的一种抗体或其抗原结合片段，其中VH包含与以下各项一致的或除了四个、三个、两个或一个氨基酸取代以外与其一致的一个VH互补决定区-2（VHCDR2）氨基酸序列：SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:48、SEQ IDNO:54、或SEQ ID NO:60。
进一步提供了一种分离的结合分子，例如，特异性结合至假单胞菌Psl的、包含一种抗体VH的一种抗体或其抗原结合片段，其中VH包含与以下各项一致的或除了四个、三个、两个或一个氨基酸取代以外与其一致的一个VH互补决定区-3（VHCDR3）氨基酸序列：SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:25、SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:49、SEQID NO:55、或SEQ ID NO:61。
还披露了一种分离的结合分子，例如，特异性结合至假单胞菌Psl的、包含一种抗体VL的一种抗体或其抗原结合片段，其中VL包含与以下各项一致的或除了四个、三个、两个或一个氨基酸取代以外与其一致的一个VL互补决定区-1（VLCDR1）氨基酸序列：SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:56、或SEQ ID NO:62。
进一步提供了一种分离的结合分子，例如，特异性结合至假单胞菌Psl的、包含一种抗体VL的一种抗体或其抗原结合片段，其中VL包含与以下各项一致的或除了四个、三个、两个或一个氨基酸取代以外与其一致的一个VL互补决定区-2（VLCDR2）氨基酸序列：SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:57、或SEQ ID NO:63。
一些实施例包括一种分离的结合分子，例如，特异性结合至假单胞菌Psl的、包含一种抗体VL的一种抗体或其抗原结合片段，其中VL包含与以下各项一致的或除了四个、三个、两个或一个氨基酸取代以外与其一致的一个VL互补决定区-3（VLCDR3）氨基酸序列：SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:34、SEQ IDNO:40、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:58、或SEQ ID NO:64。
还提供了一种分离的结合分子，例如，特异性结合至假单胞菌Psl的、包含一种抗体VH的一种抗体或其抗原结合片段，其中VH包含VHCDR1、VHCDR2、以及VHCDR3氨基酸序列，这些氨基酸序列对应地与以下各项一致，或除了这些VHCDR中的一个或多个中的四个、三个、两个或一个氨基酸取代以外与其一致：SEQ ID NO:17、18以及19，SEQ ID NO:23、24以及25，SEQ IDNO:26、27以及28，SEQ ID NO:29、30以及31，SEQ ID NO:35、36以及37，SEQ ID NO:41、42以及43，SEQ ID NO:47、48以及49，SEQ ID NO:53、54以及55，或SEQ ID NO:59、60以及61。
一些实施例包括一种分离的结合分子，例如，特异性结合至假单胞菌Psl的、包含一种抗体VL的一种抗体或其抗原结合片段，其中VL包含VLCDR1、VLCDR2以及VLCDR3氨基酸序列，这些氨基酸序列对应地与以下各项一致，或除了这些VHCDR中的一个或多个中的四个、三个、两个或一个氨基酸取代以外与其一致：SEQ ID NO:20、21以及22，SEQ ID NO:32、33以及34，SEQ ID NO:38、39以及40，SEQ ID NO:44、45以及46，SEQ ID NO:50、51以及52，SEQ ID NO:56、57以及58或SEQ ID NO:62、63以及64。
还披露了一种分离的结合分子，例如，特异性结合至假单胞菌Psl的、包含一种抗体VL的一种抗体或其抗原结合片段，其中VL包含VLCDR1、VLCDR2以及VLCDR3氨基酸序列，这些氨基酸序列对应地与以下各项一致，或除了这些VHCDR中的一个或多个中的四个、三个、两个或一个氨基酸取代以外与其一致：SEQ ID NO:20、21以及22，SEQ ID NO:32、33以及34，SEQ IDNO:38、39以及40，SEQ ID NO:44、45以及46，SEQ ID NO:50、51以及52，SEQ ID NO:56、57以及58或SEQ ID NO:62、63以及64。
一些实施例包括分离的结合分子，例如，如上所述的一种抗体或其片段，其(a)可抑制铜绿假单胞菌附着至上皮细胞上、(b)可促进铜绿假单胞菌的OPK，或(c)可抑制铜绿假单胞菌附着至上皮细胞上并且可促进铜绿假单胞菌的OPK。
其他实施例包括分离的结合分子，例如，如上所述的一种抗体或其片段，其中以约50μg/ml或更小、5.0μg/ml或更小、或约0.5μg/ml或更小的抗体浓度，或从约30μg/ml至约0.3μg/ml范围内的抗体浓度，或约1μg/ml的抗体浓度，或约0.3μg/ml的抗体浓度实现了铜绿假单胞菌附着至上皮细胞的最大抑制。
某些实施例包括分离的结合分子，例如，如上所述的一种抗体或其片段，其中OPK EC50小于约0.5μg/ml、小于约0.05μg/ml或小于约0.005μg/ml，或其中OPK EC50在从约0.001μg/ml至约0.5μg/ml的范围内，或其中OPK EC50小于约0.2μg/ml，或其中OPK EC50小于约0.02μg/ml。
还包括分离的结合分子，例如，如上所述的一种抗体或其片段，其以一种亲和力来特异性结合至铜绿假单胞菌Psl，这种亲和力的特征是解离常数（KD）不大于5×10-2M、10-2M、5×10-3M、10-3M、5×10-4M、10-4M、5×10-5M、10-5M、5×10-6M、10-6M、5×10-7M、10-7M、5×10-8M、10-8M、5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10-12M、5×10-13M、10-13M、5×10-14M、10-14M、5×10-15M或10-15M，或其中KD在约1×10-10至约1×10-6M的范围内。在一个实施例中，如在此描述的一种分离的抗体以一种亲和力来特异性结合至假单胞菌Psl，这种亲和力的特征是KD为约1.18×10-7M，如通过结合测定所确定。在另一个实施例中，如在此描述的分离的抗体以一种亲和力来特异性结合至假单胞菌Psl，这种亲和力的特征是KD为约1.44×10-7M，如通过结合测定所确定。
在不同实施例中，上述结合分子被人源化。
在不同实施例中，上述结合分子是嵌合的。
在不同实施例中，上述结合分子是完全人的。
在某些实施例中，上述结合分子是Fab片段、Fab'片段、F(ab)2片段或scFv片段。
在某些实施例中，上述结合分子包含由人κ恒定区或人λ恒定区组成的轻链恒定区。
在某些实施例中，上述结合分子包含重链恒定区或其片段。在另外的实施例中，重链恒定区或其片段是人IgG1。
在某些实施例中，上述结合分子是单克隆抗体。
在一些实施例中，上述结合分子例如一种抗体或其片段被轭合至选自下组的试剂，该组由以下各项组成：抗微生物剂、治疗剂、前药、肽、蛋白质、酶、脂质、生物应答调节剂、药剂、淋巴因子、异源抗体或其片段、可检测标记、聚乙二醇（PEG），以及任何所述试剂中的两种或更多种的组合。在另外的实施例中，可检测标记选自下组，该组由以下各项组成：酶、荧光标记、化学发光标记、生物发光标记、放射性标记，或任何所述可检测标记中的两种或更多种的组合。
另外的实施例包括组合物，这些组合物包含上述结合分子例如抗体或其片段，以及载体。
某些实施例包括一种分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸包含编码上述VH的一种核酸。在一些实施例中，该多核苷酸进一步包含编码上述VL的一种核酸，其中由这种多核苷酸表达的一种结合分子或其抗原结合片段特异性结合至假单胞菌Psl。在一些实施例中，如在此描述的多核苷酸编码包含VH和VL的一个scFv分子，包含核苷酸序列SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ IDNO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、或SEQ ID NO:70。在其他实施例中，本披露包括一种分离的多核苷酸，该多核苷酸包含编码上述VL的一种核酸。在另外的实施例中，该多核苷酸进一步包含编码上述VH的一种核酸，其中由这种多核苷酸表达的一种结合分子或其抗原结合片段特异性结合至假单胞菌Psl。
某些实施例提供包含上述多核苷酸的载体。在另外的实施例中，这些多核苷酸可操作地与启动子相关联。在另外的实施例中，本披露提供包含这类载体的宿主细胞。在另外的实施例中，本披露提供其中该多核苷酸可操作地与启动子相关联的载体，其中这些载体可以在一个合适的宿主细胞中表达一种结合分子，例如如上所述的、特异性结合至假单胞菌Psl的一种抗体或其片段。
一些实施例提供一种产生结合分子、例如如上所述的特异性结合至假单胞菌Psl的抗体或其片段的方法，该方法包括培养一种宿主细胞，该细胞含有包含上述多核苷酸的载体，并且回收所述抗体或其片段。另外的实施例提供一种通过上述方法来产生的分离的结合分子或其片段。
在一些实施例中，假单胞菌种是铜绿假单胞菌。
在另外的实施例中，上述结合分子或其片段、抗体或其片段、或组合物结合至两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种不同的铜绿假单胞菌血清型，或结合至至少80%、至少85%、至少90%、或至少95%的从受感染患者体内分离的铜绿假单胞菌菌株。在另外的实施例中，铜绿假单胞菌菌株是从肺、痰液、眼睛、脓汁、粪便、尿、窦（sinus）、伤口、皮肤、血液、骨骼或膝关节液（knee fluid）中的一种或多种中分离。铜绿假单胞菌血清型是根据最初描述于刘（Liu）·P·V等人，国际系统细菌学杂志（Int.J.Syst.Bacteriol.）33:256-264(1983)中的、如例如由刘·P·V、王（Wang）·S，《临床微生物学杂志》（J.Clin.Microbiol.）28:922-925(1990)来补充的国际抗原分型系统（IATS）来分类。
一些实施例是针对一种在有需要的受试者中预防或治疗假单胞菌感染的方法，该方法包括向该受试者给予有效量的在此描述的结合分子或其片段、抗体或其片段、组合物、多核苷酸、载体或宿主细胞。在另外的实施例中，假单胞菌感染是铜绿假单胞菌感染。在一些实施例中，受试者是人。在某些实施例中，感染是一种眼部感染、肺感染、烧伤感染、伤口感染、皮肤感染、血液感染、骨骼感染、或所述感染中的两种或更多种的组合。在另外的实施例中，受试者患有急性肺炎、烧伤、角膜感染、囊性纤维化、或其组合。
一些实施例是针对阻断或防止铜绿假单胞菌附着至上皮细胞上的方法，该方法包括使上皮细胞与铜绿假单胞菌的一种混合物与在此描述的结合分子或其片段、抗体或其片段、组合物、多核苷酸、载体或宿主细胞相接触。
还披露了一种促进铜绿假单胞菌的OPK的方法，该方法包括使吞噬细胞与铜绿假单胞菌的一种混合物与在此描述的结合分子或其片段、抗体或其片段、组合物、多核苷酸、载体或宿主细胞相接触。在另外的实施例中，吞噬细胞是分化的HL-60细胞或人多形核白细胞（PMN）。
附图简述
图1(A-F)：使用人抗体噬菌体文库来进行表型全细胞筛选鉴别了铜绿假单胞菌功能活性特异性抗体。(A)完整抗体选择策略的概述。(B)描述从最近暴露于铜绿假单胞菌的患者体内分离抗体可变区基因的过程的流程图。(C)scFv噬菌体展示文库的特征，其指示所克隆的抗体谱的大小和多样性。(D)在悬浮的铜绿假单胞菌3064ΔWapR（1）或铜绿假单胞菌PAO1MexAB OprMΔWapR（2）上选择时，对于使用患者抗体文库或天然抗体文库的噬菌体展示选择效率的比较。条形指示每一轮选择的输出滴度（以CFU为单位），并且圆形指示重复的VH CDR3序列的比例，是克隆富集的指示。(E)scFv从噬菌体展示的ELISA筛选，以用于测试与多种铜绿假单胞菌菌株的结合。示出了来自选择的八个单独噬菌体scFv和一个不相关的噬菌体scFv的ELISA数据（在450nm下的吸光率）。(F)铜绿假单胞菌特异性抗体与来自独特铜绿假单胞菌血清型的代表性菌株的FACS结合。对于所测试的每一种抗体，人IgG阴性对照抗体示出为带有阴影的峰。
图2(A-D)：促进铜绿假单胞菌的OPK的特异性mAb的评估。(A)使用从噬菌体淘筛中得到的纯化单克隆抗体的稀释物，对于发光铜绿假单胞菌血清组O5菌株（PAO1.lux）的调理吞噬测定。(B)使用从噬菌体淘筛中得到的纯化WapR-004和Cam-003单克隆抗体的稀释物，对于发光铜绿假单胞菌血清组O11菌株（9882-80.lux）的调理吞噬测定。在A与B两者中，将R347，一种不结合铜绿假单胞菌抗原的同种型匹配的人单克隆抗体用作阴性对照。(A，B)结果是来自针对每一种抗体执行的三个独立实验的代表性数据。(C-D)：对于促进铜绿假单胞菌的调理吞噬杀伤（OPK）的Cam-003的评估。对于来自临床相关O-抗原血清型（6294（O6ExoU-）、6077（O11ExoU+）、9882-80.lux（O11ExoU-）、33356（O9ExoU-）、2410.lux（O6）以及6206.lux（O11ExoU+））的代表性非类粘蛋白菌株的调理吞噬测定。(D)对于被工程化以便发光的代表性类粘蛋白菌株（A004.lux、A010.lux以及A015.lux）的调理吞噬测定。线代表了平均杀伤百分比，并且误差条线代表了标准偏差。杀伤百分比是相对于在不存在抗体时所进行的测定中获得的结果来进行计算。(C，D)在针对每一种菌株的单独测定中使用了R347对照。为了简单起见，R347对照未包括在附图之中。结果是来自针对每一种菌株执行的三个独立实验的代表性数据。
图3(A-K)：鉴别从表型筛选中得到的抗体的铜绿假单胞菌Psl外泌多糖靶标。抗体的反应性在用以下所指示的铜绿假单胞菌菌株涂布的板上通过间接ELISA来确定：(A)野生型PAO1、PAO1ΔwbpL、PAO1ΔrmlC、以及PAO1ΔgalU。(B)PAO1ΔpslA。基因纬（Genway）抗体对于铜绿假单胞菌外膜蛋白具有特异性并且用作阳性对照。(C)Cam-003与PAO1和PAO1ΔpslA的FACS结合分析。Cam-003由黑色实线和透明峰来指示；同种型匹配的非铜绿假单胞菌特异性人IgG1抗体用作阴性对照并且由灰线和带有阴影的峰来指示。(D)将从PAO1和PAO1ΔpslA纯化的LPS通过SDS-PAGE来解析并且使用从以PAO1ΔwapRΔalgD（在O-抗原运输至外膜和褐藻酸盐产生方面缺乏的一种突变菌株）接种的小鼠得到的抗血清来进行免疫印迹。(E)与PAO1的同基因突变体的Cam-003ELISA结合数据。泳道1：PAO1ΔwbpLΔalgD；泳道2：PAO1ΔwbpLΔalgDΔpslA；泳道3：PAO1ΔwbpLΔalgDΔpelA；泳道4：PAO1ΔwbpLΔalgDΔpslA+pUCP；泳道5：PAO1ΔwbpLΔalgDΔpslA+pPW145。pPW145是含有pslA的pUCP表达载体。*指示在将Cam-003与R347结合进行比较时，使用曼-惠特尼U检验（Mann-Whitney U-test），P<0.005。(F和G)调理吞噬测定指示Cam-003只介导对于能够产生Psl的菌株（野生型PAO1和PAO1ΔpslA，与pslA基因反式互补）的杀伤。(H和I)ELISA数据指示抗Psl抗体WapR-001、WapR-004以及WapR-016与PAO1ΔwbpLΔalgD和PAO1ΔwbpLΔalgDΔpslA的反应性。(J)抗体的反应性是在用以下所指示的铜绿假单胞菌菌株涂布的板上通过间接ELISA来确定：野生型PAO1、PAO1ΔwbpL、PAO1ΔwbpLΔalgD、PAO1ΔrmlC、以及PAO1ΔgalU。R347在所有实验中用作阴性对照。（A、B、C、F、G、H、I、J）。每个图是来自三个独立实验的代表数据集。(K)从完整铜绿假单胞菌细胞分离的富集的Psl的抗Psl抗体捕获，如在384仪器上所测量。R347用作阴性对照。结果是来自三个独立实验的代表性数据。
图4：抗Psl mAb抑制发光铜绿假单胞菌菌株PAO1.lux与A549细胞的细胞附着。将对数期PAO1.lux在10的MOI下添加至A549细胞的汇合单层，随后在重复洗涤以便去除未结合的铜绿假单胞菌之后进行RLU分析。结果代表针对每个抗体浓度重复两次执行的三个独立实验。
图5(A-U)：体内传代的铜绿假单胞菌菌株维持/增大Psl的表达。Cam-003抗体通过黑色实线和透明峰来示出；人IgG阴性对照抗体示出为灰线和带有阴影的峰。(A)对于阳性对照，测定Cam-003与从过夜培养物（约5×108/ml）生长至对数期的菌株的结合。(B)将每一种菌株的接种物从生长为菌苔的过夜TSA板制备成5×108CFU/ml并且通过流式细胞术来测试与Cam-003的反应性。(C)腹膜内激发四小时后，通过腹腔灌洗从小鼠体内采集细菌并且通过流式细胞术使用Cam-003来测定Psl的存在。鼻内激发(D)四小时和(E)二十四小时后，通过支气管肺泡灌洗（BAL）从小鼠体内采集细菌并且通过流式细胞术使用Cam-003来测定Psl的存在。每个流式细胞术图都是来自五个独立实验的代表数据集。(F-U)铜绿假单胞菌特异性抗体（Cam-003、Cam-004、以及Cam-005)与来自独特铜绿假单胞菌血清型的代表性菌株(F)PAO1（O5）、(G)2135（O1）、(H)2531（O1）、(I)2410（O6）、(J)2764（O11）、(K)2757（O11）、(L)33356（O9）、(M)33348（O1）、(N)3039（NT）、(O)3061（NT）、(P)3064（NT）、(Q)19660（NT）、(R)9882-80（O11）、(S)6073（O11）、(T)6077（O11）、以及(U)6206（O11）的结合。Cam-003、Cam-004、以及Cam-005抗体通过灰线和透明峰示出；人IgG阴性对照抗体示出为黑色实线和带有阴影的峰。
图6(A-G)：在铜绿假单胞菌急性肺炎模型中用抗Psl单克隆抗体Cam-003或WapR-004处理的动物的存活率。(A-D)在用以下各项来鼻内感染之前24小时，动物用45、15以及5mg/kg的Cam-003和45mg/kg的R347或PBS来处理：(A)PAO1（1.6×107CFU）、(B)33356（3×107CFU）、(C)6294（7×106CFU）、(D)6077（1×106CFU）。(E-F)如指示的，动物用5和1mg/kg的WapR-004来处理，随后用(E)（8×105CFU）或(F)（6×105CFU）的6077来感染。仔细监测动物的存活率长达72小时(A-D)或120小时(E-F)。(G)在用PAO1（4.4×107CFU）鼻内感染之前24小时，动物用15mg/kg或5mg/kg的Cam-003、或15mg/kg的R347进行处理，并且在用PAO1ΔpslA（3×107CFU）鼻内感染之前24小时用15mg/kg的Cam-003进行处理。在所有实验中，PBS和R347充当阴性对照。结果表示为卡普兰-迈耶（Kaplan-Meier）存活曲线；Cam-003相比于R347的存活的差异通过对数秩检验来计算。(A)Cam-003（45mg/kg-P<0.0001；15mg/kg-P=0.0003；5mg/kg-P=0.0033）。(B)Cam-003（45mg/kg-P=0.0012；15mg/kg-P=0.0012；5mg/kg-P=0.0373）。(C)Cam-003（45mg/kg-P=0.0007；15mg/kg-P=0.0019；5mg/kg-P=0.0212）。(D)Cam-003（45mg/kg-P<0.0001；15mg/kg-P<0.0001；5mg/kg-P=0.0001）。结果代表至少两个独立实验。(E)[Cam-003（5mg/kg）相比于R347（5mg/kg）：P=0.02；Cam-003（1mg/kg）相比于R347（5mg/kg）：P=0.4848；WapR-004（5mg/kg）相比于R347（5mg/kg）：P<0.0001；WapR-004（1mg/kg）相比于R347（5mg/kg）：P=0.0886；WapR-004（5mg/kg）相比于Cam-003（5mg/kg）：P=0.0017；WapR-004（1mg/kg）相比于Cam-003（1mg/kg）：P=0.2468；R347（5mg/kg）相比于PBS：P=0.6676]。(F)[Cam-003（5mg/kg）相比于R347（5mg/kg）：P=0.0004；Cam-003（1mg/kg）相比于R347（5mg/kg）：P<0.0001；WapR-004（5mg/kg）相比于R347（5mg/kg）：P<0.0001；WapR-004（1mg/kg）相比于R347（5mg/kg）：P<0.0001；WapR-004（5mg/kg）相比于Cam-003（5mg/kg）：P=0.0002；WapR-004（1mg/kg）相比于Cam-003（1mg/kg）：P=0.2628；R347（5mg/kg）相比于PBS：P=0.6676。(G)Cam-003（15mg/kg-P=0.0028；5mg/kg-P=0.0028)]。结果代表五个独立实验。
图7(A-F)：在诱导急性肺炎之后，抗Psl单克隆抗体Cam-003和WapR-004减少器官负荷。在用(A)PAO1（1.1×107CFU）、(B)33356（1×107CFU）、(C)6294（6.25×106CFU）、(D)6077（1×106CFU）感染之前24小时，小鼠用Cam-003抗体处理，并且在用(E)6294（约1×107CFU）和(F)6206（约1×106CFU）感染24之前小时，用WapR-004抗体处理。感染后24小时，将动物安乐死，随后收集器官以便鉴别有生存力的CFU。Cam-003或WapR-004相比于R347的有生存力的CFU的差异通过曼-惠特尼U检验来确定。(A)肺：Cam-003（45mg/kg-P=0.0015；15mg/kg-P=0.0021；5mg/kg-P=0.0015）；脾：Cam-003（45mg/kg-P=0.0120；15mg/kg-P=0.0367）；肾脏：Cam-003（45mg/kg-P=0.0092；15mg/kg-P=0.0056）；(B)肺：Cam-003（45mg/kg-P=0.0010；15mg/kg-P<0.0001；5mg/kg-P=0.0045）；(C)肺：Cam-003（45mg/kg-P=0.0003；15mg/kg-P=0.0039；5mg/kg-P=0.0068）；脾：Cam-003（45mg/kg-P=0.0057；15mg/kg-P=0.0230；5mg/kg-P=0.0012）；(D)肺：Cam-003（45mg/kg-P=0.0005；15mg/kg-P=0.0003；5mg/kg-P=0.0007）；脾：Cam-003（45mg/kg-P=0.0015；15mg/kg-P=0.0089；5mg/kg-P=0.0089）；肾脏：Cam-003（45mg/kg-P=0.0191；15mg/kg-P=0.0355；5mg/kg-P=0.0021）。(E)肺：WapR-004（15mg/kg-P=0.0011；5mg/kg-P=0.0004；1mg/kg-P=0.0002）；脾：WapR-004（15mg/kg-P<0.0001；5mg/kg-P=0.0014；1mg/kg-P<0.0001）；F)肺：WapR-004（15mg/kg-P<0.0001；5mg/kg-P=0.0006；1mg/kg-P=0.0079）；脾：WapR-004（15mg/kg-P=0.0059；5mg/kg-P=0.0261；1mg/kg-P=0.0047）；肾：WapR-004（15mg/kg-P=0.0208；5mg/kg-P=0.0268。
图8(A-G)：抗Psl单克隆抗体Cam-003和WapR-004在铜绿假单胞菌角膜炎模型和热损伤模型中有活性。在用6077（O11-细胞毒性-2×106CFU）感染之前24小时，小鼠用45mg/kg(A，B)或15mg/kg(C，D)的对照IgG1抗体或Cam-003、或PBS或45mg/kg的对照IgG1抗体或Cam-003、或45mg/kg或15mg/kg或5mg/kg的WapR-004(F，G)来处理。在感染之前不久，在每个动物的左角膜上作出三个1mm划痕，随后局部施用处于5μl接种物中的铜绿假单胞菌。在感染之后24小时，计算角膜病理学评分，随后去除眼睛以便确定有生存力的CFU。病理学评分和有生存力的CFU的差异是通过曼-惠特尼U检验来确定。(A)P=0.0001，(B)P<0.0001，(C)P=0.0003，(D)P=0.0015。(F)和(G)Cam-003（45mg/kg）相比于WapR-004（45mg/kg）：P=0.018；Cam-003（45mg/kg）相比于WapR-004（15mg/kg）：P=0.0025；WapR-004（45mg/kg）相比于WapR-004（15mg/kg）：P=0.1331；WapR-004（5mg/kg）相比于对照：P<0.0001。结果代表五个独立实验。(E)在6077感染（2×105CFU）之后，铜绿假单胞菌热损伤模型中的Cam-003和R347处理的CF-1小鼠的存活分析（对数秩：R347相比于Cam-00315mg/kg，P=0.0094；R347相比于Cam-0035mg/kg，P=0.0017）。结果代表至少三个独立实验。（n）是指每个组中的动物的数目。
图9(A-E)：Cam-003Fc突变型抗体Cam-003-TM具有降低的OPK和体内功效，但维持抗细胞附着活性。(A)使用Cam-003和Cam-003-TM进行的PAO1.lux OPK测定，Cam-003-TM在Fc域中具有突变以便防止Fc与Fcγ受体相互作用（奥加尼西安（Oganesyan）V.等人，《晶体学报D部分：生物晶体》（Acta Crystallogr D Biol Crystallogr）64,700-704(2008)）。R347用作阴性对照。结果是来自三个独立实验的代表性数据。(B)用Cam-003和Cam-003-TM进行的PAO1细胞附着测定。结果是来自两个独立实验的代表性数据。(C-E)将Cam-003与Cam-003-TM的功效进行比较的急性肺炎模型。铜绿假单胞菌菌株6077急性肺炎模型使用以(C)1.22×106(D)2.35×105、或(E)1.07×106接种的BALB/c小鼠，从而将Cam-003与Cam-003-TM的功效进行比较。在激发之前24小时，小鼠用抗体处理。(C-E)每个组中使用十只动物。结果是来自两个独立实验的代表性数据。
图10(A-B)：A：抗Psl单克隆抗体的相对结合亲和力的表位作图和鉴别。表位作图通过竞争ELISA来执行并且使用流动系统以得自铜绿假单胞菌菌株PAO1的过夜培养物的上清液的Psl来证实。相对结合亲和力是在384仪器上测量。还示出其中细胞附着被最大限度地抑制的抗体浓度和每一种抗体的OPK EC50值。B.如在384仪器上测量的不同WapR-004突变体的相对结合亲和力。还示出不同突变体的OPKEC50值。
图11：(A-M)：铜绿假单胞菌OPK测定(A-M)中的WapR-004（W4）突变体克隆的评估。使用scFv-Fc形式的不同W4突变型克隆的稀释物，对于发光铜绿假单胞菌血清组O5菌株（PAO1.lux）的调理吞噬测定。在一些情况下，W4IgG1包括于测定中并且以W4-IgG1来指示。W4-RAD-Cam和W4-RAD-GB代表在此描述的相同WapR-004RAD序列。“W4-RAD”是WapR-004Rad的简略名称，并且图D至图M中的W4-RAD-Cam和W4-RAD-GB名称代表WapR-004Rad的两种不同制剂。在所有实验中，R347，一种不结合铜绿假单胞菌抗原的人IgG1单克隆抗体用作阴性对照。
图12：多粘菌素B（PMB）与mAb的定点轭合的方法，其中异双功能SM-PEG12接头（皮尔斯公司（Pierce））在确定有利于单一接头轭合的条件下轭合至PMB上的伯胺。轭合效率和样品中的游离PMB-接头水平通过UPLC和质谱法来确定。
图13(A-B)：PMB-mAb定点轭合物。使用所开发的定点轭合方法，将PMB轭合至Cam-003和A7（hIgG1对照）mAb变异体，这些变异体具有一个（SM，ND10），两个（DM，ND10/19）或三个（TM，ND4/10/19）半胱氨酸工程化到Fc区之中。A：Cam-003和A7Fc区突变的残基。B：PMB-mAb轭合物中的PMB的平均数量（单一突变体（SM）>双重突变体1（DM1）>双重突变体2（DM2））。
图14(A-B)：通过FACS分析来评估PMB-mAb轭合物与野生型铜绿假单胞菌PAO1细胞的结合。A：Cam-003（Cam-003-SM-PMB、Cam-003-DM1-PMB、Cam-003-DM2-PMB、模拟品（mock）-轭合的野生型Cam-003（Cam-003-模拟品-PMB））。B：A7对照轭合物（A7-SM-PMB、A7-DM1-PMB、A7-DM2-PMB、模拟品-轭合的野生型A7（A7-模拟品-PMB））。R347在所有实验中用作阴性对照。
图15(A-B)：PMB-mab轭合物针对A：铜绿假单胞菌PAO1野生型菌株和B：针对不表达Psl靶标的ΔpslA铜绿假单胞菌菌株的OPK活性。
图16(A-B)：通过PMB-mab轭合物来对铜绿假单胞菌LPS进行中和。A：PMB-Cam-003轭合物和模拟品-轭合的野生型Cam-003和B：PMB-A7轭合物和模拟品-轭合的野生型A7。
图17：显示多粘菌素的结构，多粘菌素为中和LPS的促炎症作用并且可用于治疗革兰氏阴性MDR感染的环状抗细菌性脂肽（粘菌素/多粘菌素E）。多粘菌素具有5个带正电荷的二氨基丁酸（加圆圈），这些二氨基丁酸介导与LPS中的带负电荷的脂质A的相互作用并且中和其促炎症活性。
图18(A-B)：使用表达细菌荧光素酶的铜绿假单胞菌菌株PAO1来评估在存在兔补体的情况下人HL-60嗜中性粒细胞细胞系的OPK活性。A：Cam-003-PMB轭合物的杀伤%。B：A7-PMB轭合物的杀伤%。
图19(A-B)：A.给予45mg/kg Cam-TM-PMB轭合物的C57Bl/6小鼠的存活百分比。B：给予45mg/kg A7-TM-PMB轭合物的C57Bl/6小鼠的存活百分比。
图20(A-B)：A.给予45mg/kg、15mg/kg以及5mg/kg CAM-TM-PMB轭合物的C57Bl/6小鼠的存活百分比。B：给予45mg/kg、15mg/kg以及5mg/kgA7-TM-PMB轭合物的C57Bl/6小鼠的存活百分比。
图21(A-C)：腹膜内给予A:10mg/kg、B：1mg/kg、C：0.1mg/kg的mAb或PMB-mAb轭合物的C57Bl/6小鼠的存活百分比。
详细说明
I.定义
应指出的是术语“一个”或“一种”实体是指一个或多个所述实体；例如，“一种特异性结合至假单胞菌Psl的结合分子”应理解为代表特异性结合至假单胞菌Psl的一种或多种结合分子。因此，术语“一个”（或“一种”）、“一个或多个（一种或多种）”、以及“至少一个”在此可互换地使用。
如在此使用，术语“多肽”旨在包涵单数“多肽”和复数“多肽”，并且是指由通过酰胺键（也称为肽键）线性连接的单体（氨基酸）组成的分子。术语“多肽”是指具有两个或更多个氨基酸的任何一个或多个链，并且不是指产物的具体长度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指具有两个或更多个氨基酸的一个或多个链的任何其他术语包含在“多肽”的定义中，并且术语“多肽”可以代替这些术语中的任何一个、或可与其互换使用。术语“多肽”还旨在指多肽在表达后修饰的产物，包括而不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/阻断基团来进行的衍生、蛋白水解裂解或通过非天然存在的氨基酸来进行的修饰。多肽可得自天然生物来源或通过重组技术来产生，但是不必从一个指定的核酸序列翻译而来。它可以按任何方式、包括通过化学合成来产生。
如在此披露的多肽可以具有约3个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、25个或更多个、50个或更多个、75个或更多个、100个或更多个、200个或更多个、500个或更多个、1,000个或更多个，或2,000个或更多个氨基酸的大小。多肽可以具有一种限定的三维结构，但是它们不必具有这种结构。具有一种限定的三维结构的多肽被称为折叠，并且不具有一种限定的三维结构、而是可采用很多不同构象的多肽被称为未折叠的。如在此使用，术语糖蛋白是指联接至至少一个碳水化合物部分的蛋白质，该碳水化合物部分经由一个氨基酸残基（例如一个丝氨酸残基或一个天冬酰胺残基）的一个含氧或含氮侧链来附接至该蛋白质。
一种“分离的”多肽或其片段、变异体或衍生物意指不存在于其天然环境中的一种多肽。不要求特定水平的纯化。例如，一种分离的多肽可以从其天然或自然环境中去除。如同已经通过任何合适的技术来分离、份化或部分地或基本上纯化的天然或重组多肽一样，如在此披露的，在宿主细胞中表达的重组产生的多肽和蛋白质也被视为是分离的。
在此披露的其他多肽是前述多肽的片段、衍生物、类似物或变异体，以及其任何组合。在提及一种结合分子像如在此披露的特异性结合至假单胞菌Psl的一种抗体时，术语“片段”、“变异体”、“衍生物”、以及“类似物”包括保持对应的天然抗体或多肽的至少一些抗原结合特性的任何多肽。除了在此其他处所讨论的具体抗体片段以外，多肽片段包括例如蛋白水解片段连同缺失片段。结合分子（例如如在此披露的特异性结合至假单胞菌Psl的一种抗体）的变异体包括如上所述的片段，而且还有由于氨基酸取代、缺失或插入而具有改变的氨基酸序列的多肽。变异体可天然地存在或非天然地存在。非天然地存在的变异体可以使用本领域已知的诱变技术来产生。变异体多肽可以包括保守或非保守氨基酸取代、缺失或添加。结合分子（例如如在此披露的特异性结合至假单胞菌Psl的一种抗体）的衍生物是已经被改变以便展现在天然多肽上未发现的另外的特征的多肽。实例包括融合蛋白。变异体多肽在此还可以称为“多肽类似物”。如在此使用，结合分子（例如特异性结合至假单胞菌Psl的一种抗体）的“衍生物”是指具有通过官能侧基的反应来化学衍生的一个或多个残基的主题多肽。含有二十种标准氨基酸的一种或多种天然存在的氨基酸衍生物的那些肽也作为“衍生物”包括在内。例如，4-羟基脯氨酸可取代脯氨酸；5-羟基赖氨酸可取代赖氨酸；3-甲基组氨酸可取代组氨酸；高丝氨酸可取代丝氨酸；并且鸟氨酸可取代赖氨酸。
术语“多核苷酸”旨在包涵单数核酸连同复数核酸，并且是指一种分离的核酸分子或构建体，例如，信使RNA（mRNA）或质粒DNA（pDNA）。多核苷酸可包括常规磷酸二酯键或非常规键（例如酰胺键，如在肽核酸（PNA）中所发现）。术语“核酸”是指存在于多核苷酸中的任何一个或多个核酸节段，例如DNA或RNA片段。“分离的”核酸或多核苷酸意指已经从其天然环境中去除的核酸分子，即DNA或RNA。例如，在一个载体中所包含的编码结合分子（例如特异性结合至假单胞菌Psl的一种抗体）的重组多核苷酸被视为是分离的，如在此披露。分离的多核苷酸的另外实例包括维持在异源宿主细胞中的重组多核苷酸或溶液中的纯化（部分地或基本上）多核苷酸。分离的RNA分子包括多核苷酸的体内或体外RNA转录物。分离的多核苷酸或核酸进一步包括合成产生的这类分子。另外，多核苷酸或核酸可以是或可以包括调控元件如启动子、核糖体结合位点或转录终止子。
如在此使用，“编码区”是由翻译成氨基酸的密码子组成的核酸的一部分。虽然“终止密码子”（TAG、TGA或TAA）未被翻译成氨基酸，它可被认为是编码区的一部分，但是任何侧接序列（例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子、以及类似序列）并非编码区的一部分。两个或更多个编码区可以存在于单一多核苷酸构建体中，例如在单一载体上，或在单独的多核苷酸构建体中，例如在单独（不同）载体上。此外，任何载体可以含有单一编码区，或可以包括两个或更多个编码区，例如单一载体可以单独地编码一个免疫球蛋白重链可变区和一个免疫球蛋白轻链可变区。另外，一个载体、多核苷酸或核酸可以编码异源编码区，这些异源编码区融合或未融合至编码特异性结合至假单胞菌Psl的结合分子（例如一种抗体或其抗原结合片段、变异体或衍生物）的一种核酸。异源编码区包括但不限于特化的元件或基元，如分泌信号肽或异源功能域。
在某些实施例中，多核苷酸或核酸是DNA。在DNA的情况下，包含编码多肽的核酸的多核苷酸通常可以包含启动子和/或可操作地与一个或多个编码区相关联的其他转录或翻译控制元件。可操作相关联是针对基因产物（例如多肽）的编码区按以下这种方式与一个或多个调控序列相关联，该方式使得该基因产物的表达处于这种或这些调控序列的影响或控制之下。如果启动子功能的诱导导致编码所希望的基因产物的mRNA的转录，并且如果两个DNA片段之间的连接的性质不干扰表达调控序列引导基因产物的表达的能力或不干扰有待转录的DNA模板的能力，那么两个DNA片段（如多肽编码区和与其关联的启动子）“可操作地关联”。因此，启动子区将可操作地与编码多肽的核酸相关联，只要启动子能够实现所述核酸的转录。启动子可以是只在预定细胞中引导DNA的实质性转录的细胞特异性启动子。除了启动子以外，其他转录控制元件例如增强子、操纵子、阻遏子以及转录终止信号可以可操作地与多核苷酸相关联以便引导细胞特异性转录。在此披露了合适的启动子和其他转录控制区。
多种转录控制区是本领域技术人员已知的。这些转录控制区包括但不限于在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区，如但不限于来自巨细胞病毒的启动子和增强子片段（立即早期启动子，它与内含子A相结合）、猿病毒40（早期启动子）以及逆转录病毒（如劳斯（Rous）肉瘤病毒）。其他转录控制区包括得自脊椎动物基因如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素以及兔β-球蛋白的那些转录控制区域，连同能够控制真核细胞中的基因表达的其他序列。另外的合适转录控制区包括组织特异性启动子和增强子，连同淋巴因子可诱导的启动子（例如可由干扰素或白介素诱导的启动子）。
类似地，多种翻译控制元件是本领域普通技术人员已知的。这些翻译控制元件包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子，以及得自小核糖核酸病毒的元件（特别是内核糖体进入位点，或IRES，也称为CITE序列）。
在其他实施例中，多核苷酸可以是例如处于信使RNA（mRNA）形式的RNA。
多核苷酸和核酸编码区可与编码分泌肽或信号肽的另外的编码区相关联，这些另外的编码区引导由如在此披露的多核苷酸（例如编码特异性结合至假单胞菌Psl的结合分子，例如抗体或其抗原结合片段、变异体或衍生物的多核苷酸）所编码的多肽的分泌。根据信号假设，由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列，一旦已经开始将生长的蛋白质链输出横穿粗面内质网，该信号肽或分泌前导序列就从成熟蛋白质上裂解。本领域普通技术人员意识到由脊椎动物细胞分泌的多肽一般具有融合至多肽的N末端的信号肽，这种信号肽从完整或“全长”多肽上裂解以便产生分泌或“成熟”形式的多肽。在某些实施例中，使用天然信号肽，例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽，或保持引导与其可操作关联的多肽的分泌的能力的所述序列的功能衍生物。可替代地，可以使用异源哺乳动物信号肽，或其功能衍生物。例如，野生型前导序列可以用人组织纤溶酶原活化剂（TPA）或小鼠β-葡糖醛酸酶的前导序列来取代。
在此披露某些结合分子，或其抗原结合片段、变异体或衍生物。除非确切地提及全尺寸的抗体如天然存在的抗体，否则术语“结合分子”包涵全尺寸抗体连同这类抗体的抗原结合片段、变异体、类似物或衍生物，例如天然存在的抗体或免疫球蛋白分子或工程化的抗体分子或以与抗体分子类似的方式结合抗原的片段。
如在此使用，术语“结合分子”在其最广泛含义上是指特异性结合抗原决定簇的分子。抗原结合分子的非限制性实例是保持抗原特异性结合的抗体或其片段。
术语“抗体”和“免疫球蛋白”在此可互换地使用。如在此披露的抗体或其片段、变异体或衍生物包含至少重链的可变域和至少重链和轻链的可变域。脊椎动物系统的基本免疫球蛋白结构已得到相对充分地认识。参见例如哈洛（Harlow）等人，抗体：实验室手册（Antibodies:A Laboratory Manual）（冷泉港实验室出版社（Cold Spring Harbor Laboratory Press），第2版，1988）。
如以下更详细地讨论，术语“免疫球蛋白”包括可在生物化学上区分的不同广泛类别的多肽。本领域技术人员将了解重链分类为γ、μ、α、δ或ε（γ、μ、α、δ、ε），它们之中有一些子类（例如γ1-γ4）。此链的性质是将抗体的“类别”相应地确定为IgG、IgM、IgA IgG或IgE。免疫球蛋白子类（同种型）例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1等被充分表征并且已知可赋予功能特化。这些类别和同种型中的每一个的修饰形式在考虑本披露的情况下对于本领域技术人员来说是可容易地辨别的，并且因此在本披露的范围内。
轻链分类为κ或λ（κ、λ）。每个重链类别可以与κ或λ轻链结合。总体上，轻链和重链彼此共价键合，并且当免疫球蛋白由杂交瘤、B细胞或遗传工程化的宿主细胞来产生时，两个重链的“尾”部分通过共价二硫键或非共价键来彼此键合。在重链中，氨基酸序列从Y构型的分叉端的N末端延伸至每个链底部的C末端。
轻链与重链两者均划分到具有结构和功能同源性的区域之中。术语“恒定”和“可变”是在功能上使用。在这方面，应理解轻（VL）与重（VH）链部分的可变域决定抗原识别和特异性。相反地，轻链（CL）和重链（CH1、CH2或CH3）的恒定域赋予重要生物特性如分泌、经胎盘移动性（transplacentalmobility）、Fc受体结合、补体结合等。按照惯例，恒定区域的编号随着它们变得更远离抗体的抗原结合位点或氨基末端而增加。N末端部分是可变区并且C末端部分是恒定区；CH3和CL域实际上相应地包括重链和轻链的羧基末端。
如上所指示，可变区允许结合分子选择性地识别并且特异性结合抗原上的表位。即，结合分子（例如抗体）的VL域和VH域或互补决定区（CDR）的子集组合以便形成限定三维抗原结合位点的可变区。此四级结合分子结构形成存在于Y的每个臂的末端处的抗原结合位点。更确切地说，抗原结合位点由VH链和VL链中的每个链上的三个CDR来限定。
在天然存在的抗体中，存在于每个抗原结合域中的六个“互补决定区”或“CDR”是短的、非连续氨基酸序列，这些氨基酸被特别地定位以便当抗体在水性环境中呈现其三维构型时形成抗原结合域。被称为“框架”区的抗原结合域中的其余氨基酸展示较小分子间变化性。框架区大部分采用β折叠构象，并且CDR形成多个环，这些环连接并且在一些情况下形成β折叠结构的一部分。因此，框架区起作用以便形成支架，该支架提供通过链间、非共价相互作用将CDR以正确取向来进行定位。由所定位的CDR形成的抗原结合域限定了与免疫反应性抗原上的表位互补的表面。这种互补表面促进抗体与其同族表位的非共价结合。相应地构成CDR和框架区的氨基酸可由本领域普通技术人员针对任何给定的重链或轻链可变区来容易地加以鉴别，因为它们已经得到精确地定义（参见“免疫学上关注的蛋白质序列（Sequences of Proteins of Immunological Interest）”卡波特（Kabat）·E等人，美国卫生和公众服务部（U.S.Department of Health and HumanServices），(1983)；以及柯西亚（Chothia）&莱斯克（Lesk），《分子生物学杂志》（J.Mol.Biol.），196:901-917(1987)，这些文献是通过引用以其全部内部结合在此）。
在本领域内使用和/或接受的术语存在两个或更多个定义的情况下，如在此使用的术语的定义旨在包括所有这类含义，除非明确地说明相反情形。具体实例是使用术语“互补决定区”（“CDR”）来描述在重链与轻链多肽两者的可变区中所发现的非连续抗原组合位点。这一具体区已经由卡波特等人、美国卫生和公众服务部、“免疫学上关注的蛋白质序列”(1983)、以及柯西亚等人，《分子生物学杂志》196:901-917(1987)来描述，这些文献是通过引用结合在此，其中这些定义包括在彼此相比较时的重叠氨基酸残基或氨基酸残基的子集。然而，应用任一定义来指抗体或其变异体的CDR旨在处于如在此所定义并且使用的术语的范围内。构成由以上所引用的每一参考文献所定义的CDR的适当氨基酸残基在下表I中予以阐明以便进行比较。构成具体CDR的精确残基编号将取决于CDR的序列和大小而变化。在给定抗体的可变区氨基酸序列的情况下，本领域技术人员可常规地确定哪些残基构成了具体CDR。
表1：CDR定义1
卡波特 柯西亚
VH CDR1 31-35 26-32
VH CDR2 50-65 52-58
VH CDR3 95-102 95-102
VL CDR1 24-34 26-32
VL CDR2 50-56 50-52
VL CDR3 89-97 91-96
1表1中的所有CDR定义的编号是根据由卡波特等人阐明的编号规范。（参见下文）。
卡波特等人还定义了可变域序列的可适用于任何抗体的编号系统。本领域普通技术人员可明确地将此“卡波特编号”系统指派给任何可变域序列，而不需依赖超出序列本身的任何实验数据。如在此所使用，“卡波特编号”是指由卡波特等人、美国卫生和公众服务部、“免疫学上关注的蛋白序列”(1983)所阐明的编号系统。除非另外规定，否则提及特异性结合至假单胞菌Psl的结合分子（例如如在此披露的抗体或其抗原结合片段、变异体或衍生物）中的具体氨基酸残基位置的编号是根据卡波特编号系统。
结合分子，例如抗体或其抗原结合片段、变异体或衍生物，包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、人抗体、人源化抗体或嵌合抗体、单链抗体、表位结合片段，例如Fab、Fab'和F(ab')2、Fd、Fvs、单链Fvs（scFv）、单链抗体、二硫化物连接的Fvs（sdFv）、包含VL或VH域的片段、由Fab表达文库产生的片段。ScFv分子在本领域中是已知的并且描述于例如美国专利5,892,019之中。本披露涵盖的免疫球蛋白或抗体分子可以是免疫球蛋白分子的任何类型（例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、以及IgY）、类别（例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、以及IgA2）或子类。
“特异性结合”一般是指结合分子，例如抗体或其片段、变异体或衍生物经由其抗原结合域来结合至表位，并且这种结合需要抗原结合域与表位之间有某种互补性。根据此定义，当与结合分子将结合至随机、不相关的表位相比，该结合分子更容易经由其抗原结合域来结合至一个表位时，该结合分子被认为是“特异性结合至”该表位。术语“特异性”在此用于对某种结合分子结合至某种表位的相对亲和力进行定性。例如，与结合分子“B”相比，结合分子“A”可被视为针对给定的表位具有较高特异性，或与结合分子“A”针对相关表位“D”所具有的特异性相比，结合分子“A”可被认为以较高特异性结合至表位“C”。
“优先结合”是指与抗体结合至相关、相似、同源或类似表位相比，该抗体更容易特异性结合至一个表位。因此，与结合至相关表位相比，“优先结合”至给定表位的抗体将更可能结合至所述表位，即使这种抗体可以与相关表位交叉反应。
举非限制性实例来说，如果结合分子（例如抗体）结合第一表位的解离常数（KD）小于该抗体针对第二表位的KD，那么它可以被认为是优先结合该第一表位。在另一个非限制性实例中，如果结合分子（如抗体）结合第一表位的亲和力比该抗体针对第二表位的KD小至少一个数量级，那么它可被认为是优先结合第一抗原。在另一个非限制性实例中，如果结合分子结合第一表位的亲和力比该抗体针对第二表位的KD小至少两个数量级，那么它可被认为是优先结合该第一表位。
在另一个非限制性实例中，如果结合分子（例如抗体或其片段、变异体或衍生物）结合第一表位的解离速率（k(off)）小于该抗体针对第二表位的k(off)，那么它可被认为是优先结合该第一表位。在另一个非限制性实例中，如果结合分子结合第一表位的亲和力比该抗体针对第二表位的k(off)小至少一个数量级，那么它可被认为是优先结合该第一表位。在另一个非限制性实例中，如果结合分子结合第一表位的亲和力比该抗体针对第二表位的k(off)小至少两个数量级，那么它可被认为是优先结合第一表位。
结合分子（例如在此披露的抗体或其片段、变异体或衍生物）可被认为以小于或等于5×10-2sec-1、10-2sec-1，5×10-3sec-1或10-3sec-1的解离速率（k(off)）来结合靶标抗原，例如在此披露的多糖或其片段或变异体。如在此披露的结合分子可被认为以小于或等于5×10-4sec-1、10-4sec-1、5×10-5sec-1或10-5sec-1、5×10-6sec-1、10-6sec-1、5×10-7sec-1或10-7sec-1的解离速率（k(off)）来结合靶标抗原例如多糖。
结合分子(例如在此披露的抗体或抗原结合片段、变异体或衍生物)可被认为以大于或等于103M-1sec-1、5×103M-1sec-1、104M-1sec-1或5×104M-1sec-1的缔合速率（k(on)）来结合靶标抗原例如多糖。如在此披露的结合分子可被认为以大于或等于105M-1sec-1、5×105M-1sec-1、106M-1sec-1或5×106M-1sec-1或107M-1sec-1的缔合速率（k(on)）来结合靶标抗原例如多糖。
结合分子（例如抗体或其片段、变异体或衍生物）被认为竞争性抑制参考抗体或抗原结合片段与给定表位的结合，如果它优先结合至所述表位至它在某种程度上阻断参考抗体或抗原结合片段与该表位的结合的程度的话。竞争性抑制可以通过在本领域中已知的任何方法、例如竞争ELISA测定来确定。结合分子可被认为是竞争性抑制参考抗体或抗原结合片段与给定表位的结合达至少90%、至少80%、至少70%、至少60%、或至少50%。
如在此使用，术语“亲和力”是指单独表位与免疫球蛋白分子的CDR的结合强度的度量。参见例如哈洛等人，《抗体：实验室手册》（冷泉港实验室出版社，第2版，1988），第27-28页。如在此使用，术语“亲合力”是指免疫球蛋白群体与抗原之间的复合物的总体稳定性，即免疫球蛋白混合物与抗原的功能组合强度。参见例如哈洛，第29-34页。亲合力与群体中的单独免疫球蛋白分子与特定表位的的亲和力相关，并且还与免疫球蛋白和抗原的效价相关。例如，二价单克隆抗体与具有高度重复表位结构如聚合物的抗原之间的相互作用将是高亲合力的相互作用。
如在此披露的结合分子或其抗原结合片段、变异体或衍生物还可在它们的交叉反应性方面来描述或规定。如在此使用，术语“交叉反应性”是指对于一种抗原具有特异性的结合分子（例如抗体或其片段、变异体或衍生物）与第二种抗原反应的能力；它是两种不同抗原性物质之间的关联性的度量。因此，如果结合分子结合至除了诱导其形成的表位以外的表位，那么它具有交叉反应性。交叉反应性表位一般含有许多与诱导表位相同的互补结构特征，并且在一些情况下，可实际上比原始表位更合宜。
结合分子（例如抗体或其片段、变异体或衍生物）还可以在它们与抗原的结合亲和力方面来描述或规定。例如，结合分子可以按不大于5×10-2M、10-2M、5×10-3M、10-3M、5×10-4M、10-4M、5×10-5M、10-5M、5×10-6M、10-6M、5×10-7M、10-7M、5×10-8M、10-8M、5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10-12M、5×10-13M、10-13M、5×10- 14M、10-14M、5×10-15M、或10-15M的解离常数或KD来结合至抗原。
包括单链抗体的抗体片段可以包含单独的或与以下结构的全部或一部分相组合的一个或多个可变区：铰链区、CH1、CH2、以及CH3域。还包含一个或多个可变区与铰链区、CH1、CH2、以及CH3域的任何组合的抗原结合片段也包括在内。结合分子（例如在此披露的抗体或其抗原结合片段）可以来自任何动物来源，包括鸟类和哺乳动物。抗体可以是人、鼠类、驴、兔、山羊、豚鼠、骆驼、美洲驼、马或鸡抗体。在另一个实施例中，可变区可以是软骨类动物（condricthoid）来源（例如来自鲨鱼）。如在此使用，“人”抗体包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体、并且包括从人免疫球蛋白文库分离的抗体或来自针对一种或多种人免疫球蛋白转基因并且不表达内源性免疫球蛋白的动物，如下文和例如库彻拉帕提（Kucherlapati）等人的美国专利号5,939,598中所描述。
如在此使用，术语“重链部分”包括得自免疫球蛋白重链的氨基酸序列。结合分子（例如包含重链部分的抗体）包含以下各项中的至少一个：CH1域、铰链（例如上、中和/或下铰链区）域、CH2域、CH3域、或其变异体或片段。例如，结合分子（例如抗体或其片段、变异体或衍生物）可以包括：包含CH1域的多肽链；包含CH1域、铰链域的至少一部分、以及CH2域的多肽链；包含CH1域和CH3域的多肽链；包含CH1域、铰链域的至少一部分、以及CH3域的多肽链；或包含CH1域、铰链域的至少一部分、CH2域、以及CH3域的多肽链。在另一个实施例中，结合分子（例如抗体或其片段、变异体或衍生物）包括包含CH3域的多肽链。此外，用于在本披露中使用的结合分子可以缺乏CH2域的至少一部分（例如CH2域的全部或一部分）。如以上所阐明，本领域普通技术人员应了解这些域（例如重链部分）可被修饰成使得它们在氨基酸序列上不同于天然存在的免疫球蛋白分子。
结合分子（例如如在此披露的抗体）的重链部分可得自不同免疫球蛋白分子。例如，多肽的重链部分可包含得自IgG1分子的CH1域和得自IgG3分子的铰链区。在另一个实例中，重链部分可以包含部分地得自IgG1分子并且部分地得自IgG3分子的铰链区。在另一个实例中，重链部分可以包含部分地得自IgG1分子并且部分地得自IgG4分子的嵌合铰链。
如在此使用，术语“轻链部分”包括得自免疫球蛋白轻链的氨基酸序列。轻链部分包含VL或CL域中的至少一个。
结合分子（例如在此披露的抗体或其抗原结合片段、变异体或衍生物）可以在抗原的一个或多个表位或一个或多个部分（例如它们识别或特异性结合的靶标多糖）方面来描述或规定。与抗体的抗原结合域特异性相互作用的靶标多糖的部分是“表位”或“抗原决定簇”。靶标抗原例如多糖可以包含单一表位，但是典型地包含至少两个表位，并且取决于抗原的大小、构象以及类型，可以包含任何数目的表位。
如先前所指示，不同免疫球蛋白类别的恒定区的亚单位结构和三维构型是熟知的。如在此使用，术语“VH域”包含免疫球蛋白重链的氨基末端可变域并且术语“CH1域”包括免疫球蛋白重链的第一（最氨基末端的）恒定区域。CH1域与VH域相邻并且在免疫球蛋白重链分子的铰链区的氨基末端。
如在此使用，术语“CH2域”包括重链分子的、例如使用常规编号方案从抗体的约残基244延伸至残基360的那部分（残基244至360，卡波特编号系统；并且残基231-340，EU编号系统；参见卡波特EA等人的前述文献（op.cit.）。CH2域的独特性在于它不与另一个域紧密地配对。而是，两个N连接的分支碳水化合物链插入完整的天然IgG分子的两个CH2域之间。还被文献充分证明的是CH3域从CH2域延伸至IgG分子的的C末端并且包含近似108个残基。
如在此使用，术语“铰链区”包括重链分子的将CH1域接合至CH2域的那部分。这个铰链区包含近似25个残基并且是柔性的，由此允许两个N末端抗原结合区独立地移动。铰链区可细分成三个相异的域：上、中、以及下铰链域（鲁（Roux）等人，《免疫学杂志》（J.Immunol.）161:4083(1998)）。
如在此使用，术语“二硫键”包括在两个硫原子之间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸包含可以与第二硫醇基形成二硫键或二硫桥的硫醇基。在大多数天然存在的IgG分子中，CH1和CL区通过二硫键来连接并且两个重链通过使用卡波特编号系统在对应于239和242的位置（EU编号系统的位置226或229）处的两个二硫键来连接。
如在此使用，术语“嵌合抗体”将用来指其中免疫反应区或位点从第一种类获得或得到并且恒定区（可为完整的、部分的或修饰的）从第二种类获得的任何抗体。在一些实施例中，靶标结合区或位点将来自非人来源（例如小鼠或灵长类动物）并且恒定区是来自人。
如在此使用，术语“工程化的抗体”是指重链和轻链中任一者或两者中的可变域是通过至少部分替换来自具有已知特异性的抗体的一个或多个CDR并且如果有必要通过部分框架区替换和序列变化来改变的抗体。虽然CDR可得自与框架区所得自的抗体相同的类别或甚至子类别的抗体，但是设想CDR将得自不同类别的抗体并且优选来自不同种类的抗体。其中来自具有已知特异性的非人抗体的一个或多个“供体”CDR被移植至人重链或轻链框架区中的工程化的抗体在此称为“人源化抗体”。可能不必用来自供体可变区的完整CDR来替换所有CDR以便将一个可变域的抗原结合能力转移至另一个。而是，可能只需要转移维持靶标结合位点的活性所必需的那些残基。考虑到例如美国专利号5,585,089、5,693,761、5,693,762、以及6,180,370中所阐明的解释，本领域技术人员完全有能力通过进行常规实验或通过逐次逼近试验（trial and error testing）来获得功能工程化或人源化的抗体。
如在此使用，术语“正确折叠的多肽”包括其中包含多肽的所有功能域具有明显活性的多肽（例如，抗假单胞菌Psl抗体）。如在此使用，术语“不正确折叠的多肽”包括其中多肽的至少一个功能域不具有活性的多肽。在一个实施例中，正确折叠的多肽包含通过至少一个二硫键来连接的多肽链，并且相反地，不正确折叠的多肽包含未通过至少一个二硫键来连接的多肽链。
如在此使用，术语“工程化”包括通过合成手段（例如重组技术、体外肽合成、通过肽的酶促或化学偶合、或这些技术的某种组合）来操纵核酸或多肽分子。
如在此使用，术语“连接”、“融合（fused）”或“融合（fusion）”可互换使用。这些术语是指通过包括化学轭合或重组手段的任何手段将两个更多个元件或组分连接在一起。“框内融合”是指连接两个或更多个多核苷酸开放阅读框架（ORF）以便以维持原始ORF的正确翻译阅读框架的方式来形成连续更长的ORF。因此，重组融合蛋白是含有对应于由原始ORF编码的多肽的两个或更多个节段的单一蛋白质（这些节段在天然地通常并不这样连接。）虽然阅读框架由此在整个融合节段上被致使连续，但是这些节段可以被例如框内接头序列在物理上或空间上分离。例如，编码免疫球蛋白可变区的CDR的多核苷酸可框内融合，但是被编码至少一个免疫球蛋白框架区或另外的CDR区的多核苷酸分离，只要“融合的”CDR作为连续多肽的一部分来共翻译即可。
在多肽的情况下，“线性序列”或“序列”是多肽中的在氨基至羧基末端方向上的氨基酸顺序，其中在多肽的一级结构中，在序列上彼此邻接的残基是连续的。
如在此使用的术语“表达”是指基因产生生物化学物质例如多肽的过程。该过程包括基因在细胞内的功能性存在的任何表现，包括但不限于基因敲除和瞬态表达与稳定表达两者。它包括而不限于将基因转录成信使RNA（mRNA），和将这种mRNA翻译成多肽。如果最终所希望的产物是生物化学物质，那么表达包括所述生物化学物质和任何前体的产生。基因的表达产生“基因产物”。如在此使用，基因产物可以是核酸，例如通过基因转录来产生的信使RNA，或从转录物翻译的多肽。在此描述的基因产物进一步包括具有转录后修饰（例如多聚腺苷酸化）的核酸，或具有翻译后修饰（例如甲基化、糖基化、添加脂质、与其他蛋白质亚单位相关联、蛋白裂解等）的多肽。
如在此使用，术语“治疗（treat）”或“治疗（treatment）”是指治疗性治疗和预防（prophylactic）或预防（preventative）措施，其中目标是预防或减缓（减轻）不希望的生理变化、感染或病症。有益或所希望的临床结果包括但不限于缓解症状、减小疾病程度、疾病病况稳定化（即不恶化）、清除或减少受试者体内的感染剂如铜绿假单胞菌、延迟或减缓疾病进展、改善或缓和疾病病况、以及减轻（不论部分或完全），不论可检测到或不可检测到。“治疗”还可意指如与未接受治疗时的预期存活相比，延长存活。需要治疗的那些包括已经患有感染、病状或病症的那些，连同倾向于患有病状或病症的那些，或病状或病症有待预防的那些，例如在易患铜绿假单胞菌感染的烧伤患者或免疫抑制患者中。
“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物,”是指希望诊断、预后或治疗的任何受试者，特别是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括人、家畜、农畜，以及动物园、体育或宠物动物如犬、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛、熊等。
如在此使用，短语如“将受益于给予抗假单胞菌Psl抗体的受试者”和“需要治疗的动物”包括将受益于以下过程的受试者，如哺乳动物受试者：给予抗假单胞菌Psl抗体以用于例如检测假单胞菌Psl（例如用于诊断程序）、和/或用抗假单胞菌Psl抗体来治疗，即缓和或预防疾病。如在此更详细地描述，抗假单胞菌Psl抗体可以按未轭合的形式来使用或可以轭合至例如药物、前药或同位素。
II.结合分子
一个实施例是针对一种分离的结合分子，例如，特异性结合至假单胞菌Psl的抗体或其抗原结合片段，其中该结合分子(a)可以抑制铜绿假单胞菌附着至上皮细胞上、(b)可以促进、介导或增强铜绿假单胞菌的调理吞噬杀伤（OPK），或(c)可以抑制铜绿假单胞菌附着至上皮细胞上并且可以促进、介导或增强铜绿假单胞菌的OPK。在某些实施例中，如上所述的结合分子或其片段可以是抗体或其抗原结合片段如Cam-003或WapR-004。
如在此使用，术语“抗原结合域”包括特异性结合抗原上的表位（例如假单胞菌Psl的表位）的位点。抗体的抗原结合域典型地包括免疫球蛋白重链可变区的至少一部分和免疫球蛋白轻链可变区的至少一部分。由这些可变区形成的结合位点决定了抗体的特异性。
本披露更确切地说是针对一种分离的结合分子，例如，特异性结合至与包含WapR-004、Cam-003、Cam-004或Cam-005的重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）的抗体或其抗原结合片段所结合的相同的假单胞菌Psl表位的抗体或其抗原结合片段。
进一步包括一种分离的结合分子，例如，特异性结合至假单胞菌Psl，并且竞争性抑制包含WapR-004、Cam-003、Cam-004或Cam-005的VH和VL的抗体或其抗原结合片段与假单胞菌Psl结合的抗体或其片段。
一个实施例是针对一种分离的结合分子，例如，特异性结合至与包含WapR-001、WapR-002或WapR-003的VH和VL区的抗体或其抗原结合片段所结合的相同的假单胞菌Psl表位的抗体或其抗原结合片段。
还包括一种分离的结合分子，例如，特异性结合至假单胞菌Psl，并且竞争性抑制包含WapR-001、WapR-002或WapR-003的VH和VL的抗体或其抗原结合片段与假单胞菌Psl结合的抗体或其片段。
进一步包括一种分离的结合分子，例如，特异性结合至假单胞菌Psl，并且竞争性抑制包含WapR-016的VH和VL的抗体或其抗原结合片段与假单胞菌Psl结合的抗体或其片段。
还包括一种分离的结合分子，例如，特异性结合至假单胞菌Psl，并且竞争性抑制包含WapR-16的VH和VL的抗体或其抗原结合片段与假单胞菌Psl结合的抗体或其片段。
制作抗体的方法在本领域中是熟知的并且在此进行描述。一旦已经产生没有信号序列的针对不同片段或全长假单胞菌Psl的抗体，确定抗体或抗原结合片段结合假单胞菌Psl的哪些氨基酸或表位可以通过如在此描述的表位作图方案连同在本领域中已知的方法来确定（例如如在奥苏贝尔（Ausubel）等人编著的《当代分子生物学方案》（Current Protocols in Molecular Biology）第2版，约翰·威利父子公司（John Wiley&Sons,Inc.）(1996)的“第11章-免疫学”中描述的双抗体夹心ELISA）。另外的表位作图方案可见莫理斯（Morris）·G，《表位作图方案》（Epitope Mapping Protocols），新泽西州：Humana出版社(1996)中，这两者均通过引用以其全部内部结合在此。表位作图还可以通过可购得的装置（即ProtoPROBE公司（威斯康星州密尔沃基市（Milwaukee））来执行。
在某些方面，本披露是针对一种结合分子，例如以特征为解离常数（KD）小于针对所述参考单克隆抗体的KD的亲和力来特异性结合至假单胞菌Psl的抗体或其片段、变异体或衍生物。
在某些实施例中，抗假单胞菌Psl结合分子，例如如在此披露的抗体或其抗原结合片段、变异体或衍生物特异性地结合至Psl的至少一个表位，即，与它将结合至一种不相关的或随机表位相比，更容易地结合至这种表位；优先结合至Psl的至少一个表位，即，与它将结合至一种相关、相似、同源或类似表位相比，更容易地结合至这种表位；竞争性抑制本身特异性或优先结合至Psl的某种表位的参考抗体的结合；或以特征为解离常数KD小于约5×10-2M、约10-2M、约5×10-3M、约10-3M、约5×10-4M、约10-4M、约5×10-5M、约10-5M、约5×10-6M、约10-6M、约5×10-7M、约10-7M、约5×10-8M、约10-8M、约5×10-9M、约10-9M、约5×10-10M、约10-10M、约5×10-11M、约10-11M、约5×10-12M、约10-12M、约5×10-13M、约10-13M、约5×10-14M、约10-14M、约5×10-15M或约10-15M的亲和力结合至Psl的至少一个表位。
如在结合解离常数的情况下所使用，术语“约”允许在用于测量抗体亲和力的方法中的固有的变化性。例如，取决于所使用的仪器的精确度水平、基于所测量的样品数量的标准误差、以及舍入误差，术语“约10-2M”可以包括例如从0.05M至0.005M。
在具体实施例中，结合分子例如抗体或其抗原结合片段、变异体或衍生物以小于或等于5×10-2sec-1、10-2sec-1、5×10-3sec-1或10-3sec-1的解离速率（k(off)）来结合假单胞菌Psl。可替代地，抗体或其抗原结合片段、变异体或衍生物以小于或等于5×10-4sec-1、10-4sec-1、5×10-5sec-1、或10-5sec-1、5×10-6sec-1、10-6sec-1、5×10-7sec-1或10-7sec-1的解离速率（k(off)）结合假单胞菌Psl。
在其他实施例中，结合分子（例如如在此披露的抗体或其抗原结合片段、变异体或衍生物）以大于或等于103M-1sec-1、5×103M-1sec-1、104M-1sec-1或5×104M-1sec-1的缔合速率（k(on)）来结合假单胞菌Psl。可替代地，结合分子（例如如在此披露的抗体或其抗原结合片段、变异体或衍生物）以大于或等于105M-1sec-1、5×105M-1sec-1、106M-1sec-1或5×106M-1sec-1或107M-1sec-1的缔合速率（k(on)）来结合假单胞菌Psl。
在不同实施例中，抗假单胞菌Psl结合分子，例如如在此描述的抗体或其抗原结合片段、变异体或衍生物促进假单胞菌的调理吞噬杀伤，或抑制假单胞菌结合至上皮细胞上。在在此描述的某些实施例中，假单胞菌Psl靶标是铜绿假单胞菌Psl。在其他实施例中，在此描述的某些结合分子可以结合至在结构上相关的多糖分子，而不论其来源如何。此类Psl样分子将预期与铜绿假单胞菌Psl相同或具有足够的结构关联性，以便允许由所披露的一种或多种结合分子来特异性识别。例如，在此描述的某些结合分子可以结合至由其他细菌种类产生的Psl样分子，例如，由其他假单胞菌种类，例如荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌或产碱假单胞菌产生的Psl样分子。可替代地，如在此描述的某些结合分子可以结合至以合成方式或由被遗传修饰以便产生Psl样分子的宿主细胞所产生的Psl样分子。
除非确切地描述，否则如在此关于结合分子（例如抗体）所使用的“其片段”是指抗原结合片段，即，特异性结合至抗原的抗体的一部分。
抗假单胞菌Psl结合分子，例如抗体或其抗原结合片段、变异体或衍生物，可以包含介导一种或多种效应子功能的恒定区。例如，补体的C1组分与抗体恒定区的结合可以活化补体系统。补体的活化在病原体的调理作用和溶解方面是重要的。补体的活化还刺激炎症应答并且还可以涉及在自身免疫性超敏反应之中。此外，抗体经由Fc区来结合至不同细胞上的受体，其中抗体Fc区上的Fc受体结合位点结合至细胞上的Fc受体（FcR）。存在许多对于不同类别的抗体具有特异性的Fc受体，包括IgG（γ受体）、IgE（ε受体）、IgA（α受体）、以及IgM（μ受体）。抗体与细胞表面上的Fc受体的结合触发许多重要并且多样的生物应答，包括抗体包覆的颗粒的吞噬和破环、免疫复合物的清除、杀伤细胞溶解抗体包覆的靶标细胞（称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，或ADCC）、炎症介体的释放、胎盘转移、以及对免疫球蛋白产生的控制。
因此，在此披露的某些实施例包括一种抗假单胞菌Psl结合分子，例如抗体或其抗原结合片段、变异体或衍生物，其中一个或多个恒定区域的至少一部分已经缺失或以其他方式改变以便提供所希望的生物化学特性，如在与具有近似相同免疫原性的完整、未改变的抗体相比较时，效应子功能减小、非共价二聚化的能力、定位在肿瘤位点的能力增加、血清半衰期减小，或血清半衰期增加。例如，在此描述的某些结合分子是域缺失抗体，这些抗体包含与免疫球蛋白重链类似的多肽链，但是缺乏一个或多个重链域的至少一部分。例如，在某些抗体中，所修饰抗体的恒定区的一个完整域缺失，例如，CH2域的全部或一部分将缺失。
修饰形式的抗假单胞菌Psl结合分子，例如抗体或其抗原结合片段、变异体或衍生物，可以使用在本领域中已知的技术由完整前体或母体抗体来制得。示例性技术在此其他处讨论。
在某些实施例中，抗假单胞菌Psl结合分子（例如抗体或抗原结合片段）的可变区与恒定区两者是完全人的。完全人抗体可以使用本领域中已知并且如在此描述的技术来制得。例如，针对特定抗原的完全人抗体可以通过将抗原给予转基因动物来制备，该转基因动物已经被修饰以便应答于抗原性激发来产生这类抗体，但是其内源性基因座已经去能。可用于制作这类抗体的示例性技术被描述于美国专利6,150,584、6,458,592、6,420,140中。其他技术在本领域中是已知的。完全人抗体可同样地通过不同展示技术来产生，例如噬菌体展示或其他病毒展示系统，如在此其他处所更详细地描述。
抗假单胞菌Psl结合分子（例如如在此披露的抗体或其抗原结合片段、变异体或衍生物）可以使用本领域中已知的技术来制作或制造。在某些实施例中，结合分子或其片段是“重组产生”，即使用重组DNA技术来产生。制作抗体分子或其片段的示例性技术在此其他处更详细地讨论。
在某些抗假单胞菌Psl结合分子（例如在此描述的抗体或其抗原结合片段、变异体或衍生物）中，Fc部分可以使用在本领域中已知的技术来突变以便降低效应子功能。例如，恒定区的缺失或失活（经由点突变或其他手段）可减少循环的修饰抗体的Fc受体结合，从而增加肿瘤定位。在其他情况下，恒定区修饰可以缓和补体结合并且因而减少轭合的细胞毒素的血清半衰期和非特异性关联。恒定区的又其他修饰可以用于修饰二硫键或寡糖部分，从而允许由于抗原特异性或抗体灵活性增加而增强定位。这些修饰所产生的生理学轮廓、生物利用率、以及其他生物化学作用，如定位、生物分布、以及血清半衰期可在适当实验的情况下使用熟知免疫技术来容易地测量并且量化。
在某些实施例中，抗假单胞菌Psl结合分子（例如抗体或其抗原结合片段、变异体或衍生物）将不会在有待治疗的动物例如人体内引起有害免疫应答。在一个实施例中，抗假单胞菌Psl结合分子（例如抗体或其抗原结合片段、变异体或衍生物）使用本领域认识到的技术来修饰以便减少它们的免疫原性。例如，抗体可人源化、去免疫化或可制作嵌合抗体。这些类型的抗体得自非人抗体、典型地鼠类或灵长类动物抗体，保留或大致上保留母体抗体的抗原结合特性，但是在人体内免疫原性较小。这可以通过不同方法来实现，包括(a)将整个非人可变域移植至人恒定区上以便产生嵌合抗体；(b)在保留或不保留关键框架残基的情况下，将一个或多个非人互补决定区（CDR）的至少一部分移植至人框架和恒定区之中；或(c)移入整个非人可变域，但是通过替换表面残基来用人样部分“遮掩”这些可变域。这类方法被披露于莫里森（Morrison）等人，《美国国家科学院院刊》（Proc.Natl.Acad.Sci.）81:6851-6855(1984)；莫里森等人，《免疫学进展》（Adv.Immunol.）44:65-92(1988)；费尔海恩（Verhoeyen）等人，《科学》（Science）239:1534-1536(1988)；巴丹（Padlan），《分子免疫学杂志》（Molec.Immun.）28:489-498(1991)；巴丹，《分子免疫学杂志》31:169-217(1994)、以及美国专利号5,585,089、5,693,761、5,693,762以及6,190,370中，所有文献均通过引用以其全部内容结合在此。
去免疫化也可以用于降低抗体的免疫原性。如在此使用，术语“去免疫化”包括改变抗体以便修饰T细胞表位（参见，例如WO9852976A1、WO0034317A2）。例如，将来自起始抗体的VH和VL序列加以分析，并且来自每个V区的人T细胞表位“作图”显示表位相对于互补决定区（CDR）和序列内的其他关键残基的位置。将来自T细胞表位作图的单独T细胞表位加以分析以便鉴别具有改变最终抗体的活性的低风险的替代氨基酸取代。一系列替代VH和VL序列被设计成包含氨基酸取代的组合，并且这些序列随后并入一系列结合多肽，例如在此披露的假单胞菌Psl特异性抗体或其抗原结合片段中，然后对这些序列进行功能试验。然后，将包含修饰的V和人C区的完整重链和轻链基因克隆至表达载体中并且将后续质粒引入细胞系中以便产生完整抗体。然后在合适生物化学和生物测定中比较抗体，并且鉴别最佳变异体。
抗假单胞菌Psl结合分子，例如抗体或其抗原结合片段、变异体或衍生物可以通过在本领域中已知的任何合适方法来产生。针对所感兴趣的抗原的多克隆抗体可以通过本领域中熟知的不同程序来产生。例如，抗假单胞菌Psl抗体或其抗原结合片段可以给予不同宿主动物，包括但不限于兔、小鼠、大鼠、鸡、仓鼠、山羊、驴等，以便诱导含有对于抗原具有特异性的多克隆抗体的血清的产生。取决于宿主种类，可以使用不同的佐剂来增加免疫应答，并且这些佐剂包括但不限于弗氏佐剂（Freund's）（完全的和不完全的）、矿物胶（如，氢氧化铝）、表面活性物质（如溶血卵磷脂）、普卢兰尼克多元醇（pluronic polyol）、聚阴离子、肽、油乳剂、钥孔虫戚血蓝蛋白、二硝基苯酚、以及潜在有用的人用佐剂（如BCG（卡介苗））和短小棒状杆菌。此类佐剂在本领域也是已知的。
可以使用本领域已知的多种多样的技术来制备单克隆抗体，包括使用杂交瘤、重组、以及噬菌体展示技术、或其组合。例如，单克隆抗体可以使用杂交瘤技术来产生，包括在本领域中已知并且例如在哈洛等人，《抗体：实验室手册》（冷泉港实验室出版社，第2版（1988）中传授的那些杂交瘤技术。
DNA编码抗体或抗体片段（例如抗原结合位点）还可以得自抗体文库，如噬菌体展示文库。具体的说，这种噬菌体可用于展示从谱系或组合抗体文库（例如，人或鼠类）表达的抗原结合域。表达结合所感兴趣的抗原的抗原结合域的噬菌体可以用抗原来选择或鉴别，例如，使用标记的抗原或结合或捕获于固体表面或珠粒上的抗原。这些方法中所使用的噬菌体典型地是丝状噬菌体，该噬菌体包含从具有scFv、Fab、Fv OE DAB（来自轻链或重链的单独Fv区）的噬菌体表达的fd和M13结合域或重组融合至噬菌体基因III或基因VIII蛋白的二硫化物稳定的Fv抗体域。示例性方法阐明于例如EP368684B1；美国专利5,969,108；胡根伯姆（Hoogenboom）H.R.和查恩斯（Chames），《当代免疫学》（Immunol.Today）21:371(2000)；纳吉（Nagy）等人，《自然：医学》（Nat.Med.），8:801(2002)；休伊（Huie）等人，《美国国家科学院院刊》，98:2682(2001)；吕（Lui）等人，《分子生物学杂志》，315:1063(2002)，这些文献各自通过引用结合在此。一些出版物（例如迈克斯（Marks）等人，《生物技术》（Bio/Technology）10:779-783(1992)）已经描述高亲和力人抗体通过链改组的产生，连同作为构建大噬菌体文库的策略的组合感染与体内重组。在另一个实施例中，核糖体展示可以用于替换噬菌体作为展示平台（参见例如哈尼斯（Hanes）等人，《自然：生物技术》（Nat.Biotechnol.）18:1287(2000)；威尔逊（Wilson）等人，《美国国家科学院院刊》98:3750(2001)；或欧文（Irving）等人，《免疫学方法杂志》（J.Immunol.Methods）248:31(2001)）。在又另一个实施例中，可将细胞表面文库针对抗体加以筛选（博德（Boder）等人，《美国国家科学院院刊》97:10701(2000)；多尔蒂（Daugherty）等人，《免疫学方法杂志》243:211(2000)）。这类程序提供用于分离并且后续克隆单克隆抗体的传统杂交瘤细胞的替代方案。
在噬菌体展示方法中，将功能抗体域展示在噬菌体颗粒表面上，这些颗粒携带对其进行编码的多核苷酸序列。例如，编码VH和VL区的DNA序列是从动物cDNA文库（例如，淋巴组织的人或鼠类cDNA文库）或合成cDNA文库来扩增。在某些实施例中，编码VH和VL区的DNA通过PCR经由scFv接头来连接在一起并且克隆至噬菌粒载体（例如，p CANTAB6或pComb3HSS）之中。将载体电穿孔至大肠杆菌中并且大肠杆菌以辅助噬菌体来感染。这些方法中所使用的噬菌体典型地是包含fd和M13的丝状噬菌体并且VH或VL区通常重组融合至噬菌体基因III或基因VIII。表达结合所感兴趣的抗原（即假单胞菌Psl）的抗原结合域的噬菌体可以用抗原来选择或鉴别，例如，使用标记的抗原或结合或捕获于固体表面或珠粒的抗原。
可用于制作抗体的噬菌体展示方法的另外的实例包括在以下文献中披露的那些：布林克曼（Brinkman）等人，《免疫学方法杂志》182:41-50(1995)；艾姆斯（Ames）等人，《免疫学方法杂志》184:177-186(1995)；科托博洛（Kettleborough）等人，《欧洲免疫学杂志》（Eur.J.Immunol.）24:952-958(1994)；帕斯克（Persic）等人，《基因》（Gene）187:9-18(1997)；伯顿（Burton）等人，《免疫学进展》（Advances in Immunology）57:191-280(1994)；PCT申请号PCT/GB91/01134；PCT公开WO90/02809；WO91/10737；WO92/01047；WO92/18619；WO93/11236；WO95/15982；WO95/20401；以及美国专利号5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743以及5,969,108；这些文献各自通过引用以其全部内容结合在此。
如以上参考文献和以下实例中所描述，在噬菌体选择之后，来自噬菌体的抗体编码区可以被分离并且用于产生包括人抗体的完整抗体或任何其他所希望的抗原结合片段，并且表达在任何所希望的宿主之中，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母、以及细菌。例如，重组产生Fab、Fab'以及F(ab')2片段的技术还可以使用在本领域中已知的方法来加以利用，如在以下文献中披露的那些方法：PCT公开WO92/22324；马利纳克斯（Mullinax）等人，《生物技术》12(6):864-869(1992)；和泽井（Sawai）等人，AJRI34:26-34(1995)；以及贝特尔（Better）等人，《科学》（Science）240:1041-1043(1988)（所述参考文献通过引用以其全部内容结合在此）。
可用于产生单链Fvs和抗体的技术的实例包括在以下文献中描述的那些：美国专利号4,946,778和5,258,498；休斯顿（Huston）等人，《酶学方法》（Methods in Enzymology）203:46-88(1991)；舒（Shu）等人，PNAS90:7995-7999(1993)；以及斯盖拉（Skerra）等人，《科学》240:1038-1040(1988)。在某些实施例如治疗性给予中，可使用嵌合、人源化或人抗体。嵌合抗体是其中抗体的不同部分来自不同动物种类的分子，如抗体具有得自鼠类单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区。产生嵌合抗体的方法在本领域中是已知的。参见例如莫里森，科学229:1202(1985)；维伊（Oi）等人，《生物技术》4:214(1986)；吉利斯（Gillies）等人，《免疫学方法杂志》125:191-202(1989)；美国专利号5,807,715、4,816,567、以及4,816397，这些文献均通过引用以其全部内部结合在此。人源化抗体是来自非人种类抗体的、结合所希望的抗原的抗体分子，该抗体具有来自非人种类的一个或多个互补决定区（CDR）和来自人免疫球蛋白分子的框架区。人框架区中的框架残基将经常用来自CDR供体抗体的对应残基来取代以便改变、优选地改善抗原结合。这些框架取代是通过本领域中熟知的方法来鉴别，例如通过模拟CDR与框架残基的相互作用以便鉴别对于抗原结合重要的框架残基、和用于鉴别具体位置的不寻常框架残基的序列比较。（参见例如奎因（Queen）等人的美国专利号5,585,089；里奇曼（Riechmann）等人，《自然》（Nature）332:323(1988)，这些文献通过引用以其全部内部结合在此。）抗体可使用在本领域中已知的多种技术来人源化，这些技术包括例如CDR移植（EP239,400；PCT公开WO91/09967；美国专利号5,225,539；5,530,101；以及5,585,089）、饰面（veneering）或表面重修（resurfacing）（EP592,106；EP519,596；巴丹（Padlan），《分子免疫学杂志》28(4/5):489-498(1991)；斯图尼卡（Studnicka）等人，《蛋白质工程》（Protein Engineering）7(6):805-814(1994)；罗古斯卡（Roguska）等人，PNAS91:969-973(1994)）以及链改组（美国专利号5,565,332）。
完全人抗体对于人患者的治疗性治疗是特别希望的。人抗体可以通过在本领域中已知的多种方法来制作，包括使用来自人免疫球蛋白序列的抗体文库的上述的噬菌体展示方法。还参见美国专利号4,444,887和4,716,111；以及PCT公开WO98/46645、WO98/50433、WO98/24893、WO98/16654、WO96/34096、WO96/33735以及WO91/10741；这些文献各自通过引用以其全部内容结合在此。
人抗体还可以使用转基因小鼠来产生，这些转基因小鼠不能表达功能内源性免疫球蛋白，但是可以表达人免疫球蛋白基因。例如，可随机地或通过同源重组将人重链和轻链免疫球蛋白基因复合物引入到小鼠胚胎干细胞之中。另外，不同公司可参与以便使用与以上所述类似的技术来提供在转基因小鼠中产生的针对所选定抗原的人抗体。
识别所选定表位的完全人抗体可以使用被称为“引导选择”的技术来产生。在此方法中，将所选定的非人单克隆抗体例如小鼠抗体用于引导对于识别相同表位的完全人抗体的选择。（雅斯贝尔斯（Jespers）等人，《生物技术》12:899-903(1988)。还参见美国专利号5,565,332。）
在另一个实施例中，可以使用常规程序（例如，通过使用能够特异结合至编码鼠类抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针）将编码所希望的单克隆抗体的DNA容易地分离并且测序。分离并且亚克隆的杂交瘤细胞或分离的噬菌体例如可充当这类DNA的来源。一旦分离，可以将DNA放置于表达载体中，然后将这些表达载体转染到不以其他方式产生免疫球蛋白的原核或真核宿主细胞如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢（CHO）细胞或骨髓瘤细胞之中。更具体地说，所分离的DNA（可以如在此描述合成）可以用于克隆制造抗体的恒定和可变区序列，如1995年1月25日提交的纽曼（Newman）等人的美国专利号5,658,570中所述，该专利通过引用结合在此。表达所希望的抗体的转化细胞可以按相对较大数量来生长以便提供免疫球蛋白的临床和商业供应。
在一个实施例中，一种分离的结合分子例如抗体包含抗体分子的至少一个重链或轻链CDR。在另一个实施例中，一种分离的结合分子包含来自一种或多种抗体分子的至少两个CDR。在另一个实施例中，一种分离的结合分子包含来自一种或多种抗体分子的至少三个CDR。在另一个实施例中，一种分离的结合分子包含来自一种或多种抗体分子的至少四个CDR。在另一个实施例中，一种分离的结合分子包含来自一种或多种抗体分子的至少五个CDR。在另一个实施例中，本说明书的一种分离的结合分子包含来自一种或多种抗体分子的至少六个CDR。
在具体实施例中，可检查重链和/或轻链可变域的氨基酸序列以便通过在本领域中熟知的方法鉴别互补决定区（CDR）的序列，例如通过与其他重链和轻链可变区的已知氨基酸序列相比较以便确定具有序列高变性的区。使用常规重组DNA技术，可以将一个或多个CDR插入框架区中，例如插入人框架区中以便使非人抗体人源化。框架区可为天然存在的或共有框架区、并且优选地人框架区（参见例如柯西亚等人，《分子生物学杂志》278:457-479(1998)中的人框架区列表）。通过框架区与CDR的组合所产生的多核苷酸编码特异性结合至所希望的抗原例如Psl的至少一个表位的抗体。可以在框架区中进行一个或多个氨基酸取代，并且氨基酸取代改进抗体与其抗原的结合。另外，这类方法可用于进行参与链内二硫键的一个或多个可变区半胱氨酸残基的氨基酸取代或缺失，以便产生缺乏一个或多个链内二硫键的抗体分子。多核苷酸的其他改变由本披露所涵盖并且在本领域技术人员的能力范围内。
还提供包含在此描述的抗体分子（例如VH区和/或VL区）的变异体（包括衍生物）、基本上由其组成或由其组成的结合分子，这些结合分子或其片段特异性结合至假单胞菌Psl。可使用本领域技术人员已知的标准技术来将突变引入编码特异性结合至假单胞菌Psl的结合分子或其片段的核苷酸序列中，这些标准技术包括但不限于导致氨基酸取代的定点诱变和PCR介导的诱变。这些变异体（包括衍生物）编码的多肽相对于参考VH区、VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VL区、VLCDR1、VLCDR2或VLCDR3包含少于50个氨基酸取代、少于40个氨基酸取代、少于30个氨基酸取代、少于25个氨基酸取代、少于20个氨基酸取代、少于15个氨基酸取代、少于10个氨基酸取代、少于5个氨基酸取代、少于4个氨基酸取代、少于3个氨基酸取代、或少于2个氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是氨基酸残基被具有带有类似电荷的侧链的氨基酸残基替换的取代。具有带有类似电荷的侧链的氨基酸残基的家族已经在本领域中予以限定。这些家族包括具有以下各项的氨基酸：碱性侧链（例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸）、酸性侧链（例如，天门冬氨酸、谷氨酸），不带电荷的极性侧链（例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸）、非极性的侧链（例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸）、β分支侧链（例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸）、以及芳香族侧链（例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸）。可替代地，可沿着编码序列的全部或一部分，如通过饱和诱变来随机引入突变，并且所得突变体可针对生物活性来筛选以便鉴别保持活性（例如，结合至假单胞菌Psl的能力）的突变体。
例如，有可能只在抗体分子的框架区或只在CDR区引入突变。所引入的突变可为沉默的或中性错义突变，即，对抗体结合抗原的能力不具有或具有极少影响。这些类型的突变可用于优化密码子使用或改进杂交瘤的抗体产生。可替代地，非中性错义突变可以改变抗体结合抗原的能力。大多数沉默和中性错义突变的位置可能是在框架区中，而大多数非中性错义突变的位置可能是在CDR中，但这并非绝对要求。本领域技术人员将能够设计并且测试具有所希望的特性的突变分子，这些特性如没有抗原结合活性的改变或结合活性的改变（例如，抗原结合活性的改进或抗体特异性的改变）。在诱变之后，可常规地表达所编码的蛋白质，并且所编码的蛋白质的功能和/或生物活性（例如，结合假单胞菌Psl的至少一个表位的能力）可以使用在此描述的技术或通过常规修改在本领域中已知的技术来确定。
III.抗体多肽
本披露是进一步针对构成特异性结合至假单胞菌Psl的结合分子（例如抗体或其抗原结合片段）的分离的多肽和编码这类多肽的多核苷酸。结合分子（例如如在此披露的抗体或其片段）包含多肽，例如编码例如得自免疫球蛋白分子的Psl特异性抗原结合区的氨基酸序列。“得自”指定蛋白质的多肽或氨基酸序列是指多肽的来源。在某些情况下，得自特定起始多肽或氨基酸序列的多肽或氨基酸序列具有基本上与起始序列或其一部分一致的氨基酸序列，其中该部分由至少10-20个氨基酸、至少20-30个氨基酸、至少30-50个氨基酸组成，或该氨基酸序列可在其他方面被本领域普通技术人员鉴别为起源于起始序列。
还披露一种分离的结合分子，例如，特异性结合至假单胞菌Psl的抗体或其抗原结合片段，该结合分子包含的免疫球蛋白重链可变区（VH）氨基酸序列与以下各项中的一个或多个至少80%、85%、90%、95%或100%一致：SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、或SEQ ID NO:74，如表2所示。
进一步披露一种分离的结合分子，例如，特异性结合至假单胞菌Psl的抗体或其抗原结合片段，该结合分子包含的VH氨基酸序列与以下各项中的一个或多个一致或除了一个、两个、三个、四个、五个或更多个氨基酸取代以外与以下各项中的一个或多个一致：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:15、或SEQ ID NO:74，如表2所示。
一些实施例包括一种分离的结合分子，例如，特异性结合至假单胞菌Psl的抗体或其抗原结合片段，该结合分子包含VH，其中VH的VHCDR1、VHCDR2或VHCDR3区中的一个或多个与以下各项中的一个或多个的一个或多个参考重链VHCDR1、VHCDR2或VHCDR3氨基酸序列至少80%、85%、90%、95%或100%一致：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:15、或SEQ ID NO:74，如表2所示。
进一步披露一种分离的结合分子，例如，特异性结合至假单胞菌Psl的抗体或其抗原结合片段，该结合分子包含VH，其中VH的VHCDR1、VHCDR2或VHCDR3区中的一个或多个与以下各项中的一个或多个的一个或多个参考重链VHCDR1、VHCDR2和/或VHCDR3氨基酸序列一致或除了四个、三个、两个或一个氨基酸取代以外与其一致：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:74，如表2所示。因此，根据此实施例，VH包含的VHCDR1、VHCDR2或VHCDR3中的一个或多个与表3中所示的VHCDR1、VHCDR2或VHCDR3氨基酸序列中的一个或多个一致或除了四个、三个、两个或一个氨基酸取代以外与其一致。
还披露一种分离的结合分子，例如，特异性结合至假单胞菌Psl的抗体或其抗原结合片段，该结合分子包含的免疫球蛋白轻链可变区（VL）氨基酸序列与以下各项中的一个或多个至少80%、85%、90%、95%或100%一致：SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16，如表2所示。
一些实施例披露一种分离的结合分子，例如，特异性结合至假单胞菌Psl的抗体或其抗原结合片段，该结合分子包含的VL氨基酸序列与以下各项中的一个或多个一致或除了一个、两个、三个、四个、五个或更多个氨基酸取代以外与以下各项中的一个或多个一致：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ IDNO:16，如表2所示。
还提供一种分离的结合分子，例如，特异性结合至假单胞菌Psl的抗体或其抗原结合片段，该结合分子包含VL，其中VL的VLCDR1、VLCDR2或VLCDR3区中的一个或多个与以下各项中的一个或多个的一个或多个参考轻链VLCDR1、VLCDR2或VLCDR3氨基酸序列至少80%、85%、90%、95%或100%一致：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16，如表2所示。
进一步提供一种分离的结合分子，例如，特异性结合至假单胞菌Psl的抗体或其抗原结合片段，该结合分子包含VL，其中VL的VLCDR1、VLCDR2或VLCDR3区中的一个或多个与以下各项中的一个或多个的一个或多个参考重链VLCDR1、VLCDR2和/或VLCDR3氨基酸序列一致或除了四个、三个、两个或一个氨基酸取代以外与其一致：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ IDNO:16，如表2所示。因此，根据此实施例，VL包含的VLCDR1、VLCDR2或VLCDR3中的一个或多个与表3中所示的VLCDR1、VLCDR2或VLCDR3氨基酸序列中的一个或多个序列一致或除了四个、三个、两个或一个氨基酸取代以外与其一致。
在其他实施例中，一种特异性结合至假单胞菌Psl的分离的抗体或其抗原结合片段包含与以下序列至少80%、85%、90%、95%或100%一致的VH和VL氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成：
(a)对应地为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、(b)对应地为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:2、(c)对应地为SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:2、(d)对应地为SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:6、(e)对应地为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8、(f)对应地为SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10、(g)对应地为SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12、(h)对应地为SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14、(i)对应地为SEQ ID NO:15和SEQID NO:16或(j)对应地为SEQ ID NO:74和SEQ ID NO:12。在某些实施例中，上述抗体或其抗原结合片段包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:11的VH和具有氨基酸序列SEQ ID NO:12的VL。在一些实施例中，上述抗体或其抗原结合片段包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:1的VH和具有氨基酸序列SEQ ID NO:2的VL。在其他实施例中，上述抗体或其抗原结合片段包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:11的VH和具有氨基酸序列SEQ ID NO:12的VL。
在某些实施例中，一种分离的结合分子（例如如在此描述的抗体或其抗原结合片段）以一种亲和力来特异性结合至假单胞菌Psl，该亲和力的特征是解离常数（KD）不大于5×10-2M、10-2M、5×10-3M、10-3M、5×10-4M、10-4M、5×10-5M、10-5M、5×10-6M、10-6M、5×10-7M、10-7M、5×10-8M、10-8M、5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10-12M、5×10-13M、10-13M、5×10-14M、10-14M、5×10-15M或10-15M。
在具体实施例中，一种分离的结合分子（例如如在此描述的抗体或其抗原结合片段）以一种亲和力来特异性结合至假单胞菌Psl，该亲和力的特征是解离常数（KD）在约1×10-10至约1×10-6M的范围内。在一个实施例中，一种分离的结合分子（例如如在此描述的抗体或其抗原结合片段）以一种亲和力来特异性结合至假单胞菌Psl，该亲和力的特征是KD为约1.18×10-7M，如通过在此描述的结合测定所确定。在另一个实施例中，一种分离的结合分子（例如如在此描述的抗体或其抗原结合片段）以一种亲和力来特异性结合至假单胞菌Psl，该亲和力的特征是KD为约1.44×10-7M，如通过在此描述的结合测定所确定。
一些实施例包括分离的结合分子，例如，如上所述的抗体或其片段，该结合分子(a)可抑制铜绿假单胞菌附着至上皮细胞上、(b)可促进铜绿假单胞菌的OPK，或(c)可抑制铜绿假单胞菌附着至上皮细胞上并且可促进铜绿假单胞菌的OPK。
在一些实施例中，分离的结合分子，例如，如上所述的抗体或其片段，其中对铜绿假单胞菌附着至上皮细胞的最大抑制在约50μg/ml或更小、5.0μg/ml或更小或约0.5μg/ml或更小的抗体浓度下，或从约30μg/ml至约0.3μg/ml范围内的抗体浓度下，或约1μg/ml的抗体浓度，或约0.3μg/ml的抗体浓度下来实现。
某些实施例包括分离的结合分子，例如如上所述的抗体或其片段，其中OPK EC50小于约0.5μg/ml、小于约0.05μg/ml或小于约0.005μg/ml，或其中OPK EC50在从约0.001μg/ml至约0.5μg/ml范围内，或其中OPK EC50在从约0.02μg/ml至约0.08μg/ml范围内，或其中OPK EC50在从约0.002μg/ml至约0.01μg/ml范围内或其中OPK EC50小于约0.2μg/ml，或其中OPK EC50小于约0.02μg/ml。在某些实施例中，抗假单胞菌Psl结合分子（例如在此描述的抗体或其片段、变异体或衍生物）特异性结合至与单克隆抗体WapR-004、WapR-004RAD、Cam-003、Cam-004或Cam-005所结合的相同的Ps1表位，或将竞争性抑制这种单克隆抗体结合至假单胞菌Psl。除了SEQ ID NO:11的VH氨基酸序列的氨基酸取代G98A以外，WapR-004RAD与WapR-004相同。
一些实施例包括WapR-004（W4）突变体，这些突变体包含与以下各项中的一个或多个一致或除了一个、两个、三个、四个、五个或更多个氨基酸取代以外与以下各项中的一个或多个一致的scFv-Fc分子氨基酸序列：SEQ IDNO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ IDNO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ IDNO:106、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:114、SEQ IDNO:115、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123、SEQ IDNO:124、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:132、SEQ IDNO:133、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:141、SEQ IDNO:142、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145、或SEQ IDNO:146。
其他实施例包括WapR-004（W4）突变体，这些突变体包含与以下各项中的一个或多个至少80%、85%、90%、95%或100%一致的scFv-Fc分子氨基酸序列：SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ IDNO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ IDNO:105、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:113、SEQ IDNO:114、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:122、SEQ IDNO:123、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:131、SEQ IDNO:132、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140、SEQ IDNO:141、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145或SEQ ID NO:146。
在某些实施例中，抗假单胞菌Psl结合分子（例如在此描述的抗体或其片段、变异体或衍生物）特异性结合至与单克隆抗体WapR-001、WapR-002或WapR-003所结合的相同的表位，或将竞争性抑制这种单克隆抗体结合至假单胞菌Psl。
在某些实施例中，抗假单胞菌Psl结合分子（例如在此描述的抗体或其片段、变异体或衍生物）特异性结合至与单克隆抗体WapR-016所结合的相同的表位，或将竞争性抑制这种单克隆抗体结合至假单胞菌Psl。
表2：参考VH和VL氨基酸序列*
*VH和VL CDR1、CDR2以及CDR3氨基酸序列加下划线
表3：参考VH和VL CDR1、CDR2以及CDR3氨基酸序列
任何抗假单胞菌Psl结合分子（例如，在此描述的抗体或其片段、变异体或衍生物）可以进一步包含另外的多肽，例如，用于引导所编码的多肽分泌的信号肽、如在此描述的抗体恒定区，或如在此描述的其他异源多肽。另外，本说明书的结合分子或其片段包括如在其他处描述的多肽片段。另外，抗假单胞菌Psl结合分子（例如，在此描述的抗体或其片段、变异体或衍生物）可以是融合多肽、Fab片段、scFv、或其他衍生物，如在此所述。
另外，如在此其他处更详细地描述，本披露包括包含抗假单胞菌Psl结合分子（例如在此描述的抗体或其片段、变异体或衍生物）的组合物。
本领域普通技术人员还应了解抗假单胞菌Psl结合分子（例如，在此描述的抗体或其片段、变异体或衍生物）可以被修饰成使得它们在氨基酸序列上不同于得到其的天然存在的结合多肽。例如，得自指定蛋白质的多肽或氨基酸序列可为相似的，例如，具有与起始序列的一定百分比的一致性，例如，它可与起始序列60%、70%、75%、80%、85%、90%或95%一致。
术语两个多核苷酸或多肽序列之间的“序列一致性百分比”是指考虑到为了最佳比对两个序列而必须引入的添加或缺失（即，空隙），在比较窗口上由这些序列共用的相同匹配位置的数目。匹配位置是其中相同核苷酸或氨基酸呈现在靶标序列与参考序列两者中的任何位置。呈现在靶标序列中的空隙未计数，因为空隙并非核苷酸或氨基酸。同样地，呈现在参考序列中的空隙未计数，因为对靶标序列核苷酸或氨基酸进行计数，而不对来自参考序列的核苷酸或氨基酸进行计数。
序列一致性百分比的计算是通过确定相同氨基酸残基或核酸碱基出现在两个序列中的位置的数目以便产生匹配位置数目，将匹配位置数目除以比较窗口中的位置总数并且将结果乘以100，从而产生序列一致性百分比。序列的比较和两个序列之间的序列一致性百分比的确定可以使用供在线使用与下载两者的易于得到的软件来完成。合适的软件程序可从不同来源获得，并且用于比对蛋白质与核苷酸序列。用于确定序列一致性百分比的一种合适程序是bl2seq，该程序是可从美国政府的国家生物技术信息中心（National Center for BiotechnologyInformation）BLAST网站（blast.ncbi.nlm.nih.gov）获得的BLAST程序套件的一部分。Bl2seq使用BLASTN或BLASTP算法在两个序列之间执行比较。BLASTN用于比较核酸序列，而BLASTP用于比较氨基酸序列。其他合适程序是例如Needle、Stretcher、Water或Matcher，它们是EMBOSS生物信息学程序套件的一部分并且也可在www.ebi.ac.uk/Tools/psa上从欧洲生物信息学研究所（EuropeanBioinformatics Institute；EBI）获得。
与多核苷酸或多肽参考序列比对的单一多核苷酸或多肽靶标序列内的不同区域可各自具有其本身的序列一致性百分比。应指出的是序列一致性百分比值被四舍五入至最近的十分位。例如，80.11、80.12、80.13以及80.14向下舍入至80.1，而80.15、80.16、80.17、80.18以及80.19向上舍入至80.2。还应指出长度值将总是整数。
本领域技术人员应了解用于计算序列一致性百分比的序列比对的产生不局限于完全由基本序列数据驱动的二元序列-序列比较。序列比对可得自多重序列比对。产生多重序列比对的一种合适程序是可从www.CLUSTAL.org获得的ClustalW2。另一种合适程序是可从www.drive5.com/muscle/获得的MUSCLE。ClustalW2和MUSCLE可替代地从例如EBI获得。
还应理解序列比对可以通过将序列数据与来自异类来源的数据如结构数据（例如，结晶学蛋白质结构）、功能数据（例如，突变位置）或系统发生数据集成来产生。将异类数据集成以便产生多重序列比对的合适程序是T-Coffee，它可从www.tcoffee.org获得，并且替代地可从例如EBI获得。还应理解用于计算序列一致性百分比的最终比对可以自动或手动地管理（curated）。
任何具体多肽是否与另一个多肽至少约70%、75%、80%、85%、90%或95%一致还可使用在本领域中已知的方法和计算机程序/软件来确定，如但不限于BESTFIT程序（《威斯康星序列分析程序包》，第8版用于Unix，遗传学计算机组，大学科技园区，575科学路，麦迪逊，威斯康星州53711（WisconsinSequence Analysis Package,Version8for Unix,Genetics Computer Group,UniversityResearch Park,575Science Drive,Madison,WI53711））。BESTFIT使用局部同源性算法（史密斯（Smith）&沃特曼（Waterman），《应用数学进展》（Advancesin Applied Mathematics）2:482-489(1981)）来发现两个序列之间的最佳同源性片段。当使用BESTFIT或任何其他序列比对程序来确定一个具体序列是否与参考序列例如95%一致时，当然应将参数设定成使得在参考多肽序列的全部长度上计算一致性百分比并且允许多达参考序列中的氨基酸总数的5%的同源性空隙。
此外，可产生导致“非必需”氨基酸区的保守取代或变化的核苷酸或氨基酸取代、缺失或插入。例如，得自指定蛋白质的多肽或氨基酸序列可与起始序列一致，除了一个或多个单独氨基酸取代、插入或缺失以外，例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十五个、二十个或更多个单独氨基酸取代、插入或缺失。在某些实施例中，得自指定蛋白质的多肽或氨基酸序列相对于起始序列具有一个至五个、一个至十个、一个至十五个，或一个至二十个单独氨基酸取代、插入或缺失。
抗假单胞菌Psl结合分子（例如，在此描述的抗体或其片段、变异体或衍生物）可包含融合蛋白、基本上由其组成、或由其组成。融合蛋白是嵌合分子，包含例如具有至少一个靶标结合位点的免疫球蛋白抗原结合域，和至少一个异源部分，即，它在天然状态下未与其天然地连接的部分。氨基酸序列通常可以存在于单独蛋白质中，它们在融合多肽中结合在一起，或这些氨基酸序列通常可以存在于同一蛋白质中但是以新的安排来放置于融合多肽中。融合蛋白可以例如通过化学合成或通过产生并且翻译多核苷酸来产生，在该多核苷酸中，肽区以所希望的关系来编码。
如适用于多核苷酸、多肽或其他部分的术语“异源”是指多核苷酸、多肽或其他部分得自于与其正进行比较的实体的其余部分相异的实体。在一个非限制性实例中，有待融合至结合分子（例如抗体或其抗原结合片段、变异体或衍生物）的“异源多肽”得自于相同种类的非免疫球蛋白多肽，或不同种类的免疫球蛋白或非免疫球蛋白多肽。
IV.融合蛋白和抗体轭合物
在一些实施例中，抗假单胞菌Psl结合分子（例如，抗体或其片段、变异体或衍生物）可以按轭合形式多次给予。在仍另一个实施例中，抗假单胞菌Psl结合分子（例如，抗体或其片段、变异体或衍生物）可以按未轭合形式、然后按轭合形式给予，或反之亦然。
在具体实施例中，抗假单胞菌Psl结合分子（例如，抗体或其片段、变异体或衍生物）可以轭合至一种或多种抗微生物剂，例如多粘菌素B（PMB）。PMB是被批准用于治疗多重耐药性革兰氏阴性感染的小脂肽抗生素。除了杀菌活性以外，PMB结合脂多糖（LPS）并且中和其促炎症作用。（迪克松（Dixon）·R·A&乔普拉（Chopra）·I，《抗菌化学疗法杂志》（J Antimicrob Chemother）18,557-563(1986)）。LPS被认为显著造成炎症和革兰氏阴性败血症的发作。（吉戴特（Guidet）·B等人，《胸科杂志》（Chest）106,1194-1201(1994)）。中和和/或将LPS从循环中清除的疗法具有预防或延迟败血症发作和改进临床结果的潜力。多粘菌素B（PMB）是被批准用于治疗多重耐药性革兰氏阴性感染的脂肽抗生素。除了杀菌活性以外，PMB结合LPS并且中和其促炎症作用。PMB与载体分子的轭合物已经显示在内毒素血症和感染的动物模型中中和LPS并且介导保护。（德莱比克（Drabick）·J·J等人，《抗微生物制剂与化学疗法》（AntimicrobAgents Chemother）42,583-588(1998)）。还披露一种将一个或多个PMB分子附着至本披露的单克隆抗体（mAb）的Fc区中所引入的半胱氨酸残基上的方法。例如，Cam-003-PMB轭合物保持与铜绿假单胞菌的特异性、mAb介导的结合，并且还保持OPK活性。此外，mAb-PMB轭合物在体外结合并且中和LPS。
在某些实施例中，抗假单胞菌Psl结合分子（例如，在此描述的抗体或其片段、变异体或衍生物）可以包含一个异源氨基酸序列或通常不与抗体关联的一个或多个其他部分（例如，抗微生物剂、治疗剂、前药、肽、蛋白质、酶、脂质、生物应答调节剂、药剂、淋巴因子、异源抗体或其片段、可检测标记、聚乙二醇（PEG）、以及任何所述试剂中的两种或更多种的组合）。在另外的实施例中，抗假单胞菌Psl结合分子（例如，抗体或其片段、变异体或衍生物）可以包含选自下组的可检测标记，该组由以下各项组成：酶、荧光标记、化学发光标记、生物发光标记、放射性标记或任何所述可检测标记中的两种或更多种的组合。
V.编码结合分子的多核苷酸
在此还提供编码抗假单胞菌Psl结合分子（例如在此描述的抗体或其片段、变异体或衍生物）的核酸分子。
一个实施例提供一种分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸包含编码免疫球蛋白重链可变区（VH）氨基酸序列的核酸、基本上由其组成或由其组成，该氨基酸序列与以下各项中的一个或多个至少80%、85%、90%、95%或100%一致：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15或SEQ IDNO:74，如表2所示。
另一个实施例提供一种分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸包含编码VH氨基酸序列的核酸、基本上由其组成或由其组成，该氨基酸序列与以下各项中的一个或多个一致或除了一个、两个、三个、四个、五个或更多个氨基酸取代以外与其一致：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、或SEQ ID NO:74，如表2所示。
另外的实施例提供一种分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸包含编码VH的核酸、基本上由其组成或由其组成，其中VH的VHCDR1、VHCDR2或VHCDR3区中的一个或多个与以下各项中的一个或多个的一个或多个参考重链VHCDR1、VHCDR2和/或VHCDR3氨基酸序列一致或除了四个、三个、两个或一个氨基酸取代以外与其一致：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、或SEQ ID NO:74，如表2所示。
另一个实施例提供一种分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸包含编码一种分离的结合分子（例如特异性结合至假单胞菌Psl的抗体或其抗原结合片段）的核酸、基本上由其组成或由其组成，该结合分子包含VH，其中VH的VHCDR1、VHCDR2或VHCDR3区中的一个或多个与以下各项中的一个或多个的一个或多个参考重链VHCDR1、VHCDR2和/或VHCDR3氨基酸序列一致或除了四个、三个、两个或一个氨基酸取代以外与其一致：SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、或SEQ ID NO:74，如表2所示。
一个另外的实施例提供一种分离的结合分子，例如包含由多核苷酸编码的VH的、特异性或优先结合至假单胞菌Psl的抗体或抗原结合片段。
另一个实施例提供一种分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸包含编码免疫球蛋白轻链可变区（VL）氨基酸序列的核酸、基本上由其组成或由其组成，该氨基酸序列与以下各项中的一个或多个至少80%、85%、90%、95%或100%一致：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、或SEQ ID NO:16，如表2所示。
一个另外的实施例提供一种分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸包含编码VL氨基酸序列的核酸、基本上由其组成或由其组成，该氨基酸序列与以下各项中的一个或多个一致或除了一个、两个、三个、四个、五个或更多个氨基酸取代以外与其一致：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、或SEQ ID NO:16，如表2所示。
另一个实施例提供一种分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸包含编码VL的核酸、基本上由其组成或由其组成，其中VL的VLCDR1、VLCDR2或VLCDR3区中的一个或多个与以下各项中的一个或多个的一个或多个参考轻链VLCDR1、VLCDR2或VLCDR3氨基酸序列至少80%、85%、90%、95%或100%一致：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、或SEQ ID NO:16，如表2所示。
一个另外的实施例提供一种分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸包含编码一种分离的结合分子（例如特异性结合至假单胞菌Psl的抗体或其抗原结合片段）的核酸、基本上由其组成或由其组成，该分离的结合分子包含VL，其中VL的VLCDR1、VLCDR2或VLCDR3区中的一个或多个与以下各项中的一个或多个的一个或多个参考重链VLCDR1、VLCDR2和/或VLCDR3氨基酸序列一致或除了四个、三个、两个或一个氨基酸取代以外与其一致：SEQ ID NO:2、SEQID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:14或SEQ ID NO:16，如表2所示。
在另一个实施例中，一种分离的结合分子（例如包含由多核苷酸编码的VL的抗体或抗原结合片段）特异性或优先结合至假单胞菌Psl。
一个实施例提供一种分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸包含编码包括VH和VL的scFv分子的核酸、基本上由其组成或由其组成，其中scFv与以下各项中的一个或多个至少80%、85%、90%、95%或100%一致：SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69或SEQ IDNO:70，如表4所示。
表4：参考scFv核酸序列
在一些实施例中，特异性结合至假单胞菌Psl上的、由以上所述的一种或多种多核苷酸所编码的一种分离的抗体或其抗原结合片段包含与以下序列至少80%、85%、90%、95%或100%一致的VH和VL氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成：
(a)对应地为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、(b)对应地为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:2、(c)对应地为SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:2、(d)对应地为SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:6、(e)对应地为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8、(f)对应地为SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10、(g)对应地为SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12、(h)对应地为SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14、(i)对应地为SEQ ID NO:15和SEQID NO:16、或(j)对应地为SEQ ID NO:74和SEQ ID NO:12。
在某些实施例中，一种分离的结合分子（例如由以上所述的的一种或多种多核苷酸编码的抗体或其抗原结合片段）以一种亲和力来特异性结合至假单胞菌Psl，该亲和力的特征是解离常数（KD）不大于5×10-2M、10-2M、5×10-3M、10-3M、5×10-4M、10-4M、5×10-5M、10-5M、5×10-6M、10-6M、5×10-7M、10-7M、5×10-8M、10-8M、5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10-12M、5×10-13M、10-13M、5×10-14M、10-14M、5×10-15M或10-15M。
在具体实施例中，一种分离的结合分子（例如由以上所述的一种或多种多核苷酸编码的抗体或其抗原结合片段）以一种亲和力来特异性结合至假单胞菌Psl，该亲和力的特征是解离常数（KD）在约1×10-10至约1×10-6M的范围内。在一个实施例中，一种分离的结合分子（例如由以上所述的一种或多种多核苷酸编码的抗体或其抗原结合片段）以一种亲和力来特异性结合至假单胞菌Psl，该亲和力的特征是KD为约1.18×10-7M，如通过在此描述的结合测定所确定。在另一个实施例中，一种分离的结合分子（例如由以上所述的一种或多种多核苷酸编码的抗体或其抗原结合片段）以一种亲和力来特异性结合至假单胞菌Psl，该亲和力的特征是KD为约1.44×10-7M，如通过在此描述的结合测定所确定。
在某些实施例中，抗假单胞菌Psl结合分子（例如由以上所述的一种或多种多核苷酸编码的抗体或其片段、变异体或衍生物）特异性结合至与单克隆抗体WapR-004、WapR-004RAD、Cam-003、Cam-004或Cam-005所结合的相同的Ps1表位，或将竞争性抑制这种单克隆抗体结合至假单胞菌Psl。WapR-004RAD与WapR-004相同，除了编码SEQ ID NO:11的VH氨基酸序列的VH核酸序列的核酸取代G293C以外（SEQ ID NO:71的VH编码部分中的位置317处的核苷酸取代）。编码WapR-004RAD VH的核酸序列作为SEQ ID NO76来呈现。
一些实施例提供一种分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸包含编码W4突变型scFv-Fc分子氨基酸序列的核酸、基本上由其组成或由其组成，该氨基酸序列与以下各项中的一个或多个一致，或除了一个、两个、三个、四个、五个或更多个氨基酸取代以外与其一致：SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ IDNO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ IDNO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ IDNO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111、SEQ IDNO:112、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120、SEQ IDNO:121、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:129、SEQ IDNO:130、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:138、SEQ IDNO:139、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145或SEQ ID NO:146。
其他实施例提供一种分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸包含编码W4突变型scFv-Fc分子氨基酸序列的核酸、基本上由其组成或由其组成，该氨基酸序列与以下各项中的一个或多个至少80%、85%、90%、95%或100%一致：SEQID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ IDNO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ IDNO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109、SEQ IDNO:110、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:118、SEQ IDNO:119、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:127、SEQ IDNO:128、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136、SEQ IDNO:137、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145或SEQ IDNO:146。
一个实施例提供一种分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸包含编码W4突变型scFv-Fc分子的核酸、基本上由其组成或由其组成，其中该核酸与以下各项中的一个或多个至少80%、85%、90%、95%或100%一致：SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:151、or SEQ IDNO:152、SEQ IS NO:153、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:160、SEQ IDNO:161、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:169、SEQ IDNO:170、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:178、SEQ IDNO:179、SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:187、SEQ IDNO:188、SEQ ID NO:189、SEQ ID NO:190、SEQ ID NO:191、SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:193、SEQ ID NO:194、SEQ ID NO:195、SEQ ID NO:196、SEQ IDNO:197、SEQ ID NO:198、SEQ ID NO:199、SEQ ID NO:200、SEQ ID NO:201、SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:203、SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:205、SEQ IDNO:206、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:212、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:214或SEQ IDNO:215。
在其他实施例中，抗假单胞菌Psl结合分子（例如由以上所述的一种或多种多核苷酸编码的抗体或其片段、变异体或衍生物）特异性结合至与单克隆抗体WapR-001、WapR-002或WapR-003所结合的相同的表位，或将竞争性抑制这种单克隆抗体结合至假单胞菌Psl。
在某些实施例中，抗假单胞菌Psl结合分子（例如由以上所述的一种或多种多核苷酸编码的抗体或其片段、变异体或衍生物）特异性结合至与单克隆抗体WapR-016所结合的相同的表位，或将竞争性抑制这种单克隆抗体结合至假单胞菌Psl。
本披露还包括如在此其他处所描述的多核苷酸片段。另外，还提供编码如在此所描述的融合多核苷酸、Fab片段以及其他衍生物的多核苷酸。
多核苷酸可通过在本领域中已知的任何方法来产生或制造。例如，如果抗体的核苷酸序列是已知的，那么编码该抗体的多核苷酸可以从化学合成的寡核苷酸来组装（例如，如库特梅尔（Kutmeier）等人，《生物技术》（BioTechniques）17:242(1994)中所描述），简单地说，这涉及合成含有编码该抗体的序列的部分的重叠寡核苷酸，退火并且连接那些寡核苷酸，并且然后通过PCR来扩增所连接的寡核苷酸。
可替代地，编码抗假单胞菌Psl结合分子（例如，抗体或其片段、变异体或衍生物）的多核苷酸可从来自合适来源的核酸产生。如果包含编码一种具体抗体的核酸的克隆是不可获得的，但是抗体分子的序列是已知的，则编码该抗体的核酸可以化学合成，或使用可杂交至序列的3'和5'端的合成引物通过PCR扩增、或者通过使用对于具体基因序列具有特异性的寡核苷酸探针来进行克隆，以便从cDNA文库鉴定编码该抗体的cDNA克隆而从适合来源（例如，抗体cDNA文库、或产生自表达该抗体的任何组织或细胞、或者如选择来表达抗体的杂交瘤细胞的cDNA文库或从它们分离的核酸、优选多聚A+RNA）获得。然后可以使用本领域熟知的任何方法，将通过PCR产生的扩增的核酸克隆到可复制的克隆载体之中。
一旦确定抗假单胞菌Psl结合分子（例如抗体或其片段、变异体或衍生物）的核苷酸序列和对应氨基酸序列，它的核苷酸序列可以使用本领域中熟知的用于操纵核苷酸序列的方法来操纵，这些方法例如重组DNA技术、定位诱变、PCR等（参见例如萨布鲁克（Sambrook）等人，《分子克隆：实验手册》（Molecular Cloning,A Laboratory Manual），第2版，冷泉港实验室，冷泉港（Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor），纽约（1990）和奥苏贝尔等人编著的《当前分子生物学方案》，约翰·威利父子公司，纽约（1998）中描述的技术，这些文献均通过引用以其全部内容结合在此），以便产生具有不同氨基酸序列的抗体，例如产生氨基酸取代、缺失和/或插入。
编码抗假单胞菌Psl结合分子（例如抗体或其片段、变异体或衍生物）的多核苷酸可以由可为未修饰的RNA或DNA或修饰的RNA或DNA的任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸组成。例如，编码抗假单胞菌Psl结合分子（例如抗体或其片段、变异体或衍生物）的多核苷酸可以由以下各项组成：单链和双链DNA、是单链与双链区的混合物的DNA、单链和双链RNA，以及是单链与双链区的混合物的RNA、包含可以是单链或更典型地是双链或单链与双链区的混合物的DNA和RNA的杂交分子。另外，编码抗假单胞菌Psl结合分子（例如抗体或其片段、变异体或衍生物）的多核苷酸可以由包含RNA或DNA或RNA与DNA两者的三链区组成。编码抗假单胞菌Psl结合分子（例如抗体或其片段、变异体或衍生物）的多核苷酸还可以含有一个或多个修饰的碱基或出于稳定性或其他原因而修饰的DNA或RNA骨架。“修饰”的碱基包括例如三苯甲基化碱基和不常见碱基如肌苷。可对DNA和RNA进行多种修饰；因而，“多核苷酸”包涵化学、酶促或代谢修饰形式。
可通过以下方式产生编码得自免疫球蛋白（例如，免疫球蛋白重链部分或轻链部分）的多肽的非天然变异体的分离的多核苷酸：将一个或多个核苷酸取代、添加或缺失引入免疫球蛋白的核苷酸序列以使得将一个或多个氨基酸取代、添加或缺失引入到所编码的蛋白质之中。突变可通过标准技术、如定点诱变和PCR介导的诱变来引入。保守氨基酸取代在一个或多个非必需氨基酸残基处进行。
VI.抗体多肽的表达
如所熟知的，RNA可以通过标准技术从原始杂交瘤细胞或从其他转化的细胞分离，这些技术如异硫氰酸胍提取和沉淀之后离心或色谱法。在希望时，mRNA可通过标准技术如寡聚脱氧胸苷酸纤维素（oligo dT cellulose）上色谱法从总RNA上分离。合适的技术在本领域中是熟悉的。
在一个实施例中，编码抗假单胞菌Psl结合分子（例如抗体或其片段、变异体或衍生物）的轻链和重链的cDNA可以根据熟知方法使用逆转录酶和DNA聚合酶来同时或分别地制作。PCR可以通过共有恒定区引物或通过更具有特异性的引物基于公开的重链和轻链DNA和氨基酸序列来起始。如以上所讨论，PCR还可以用于分离编码抗体轻链和重链的DNA克隆。在这种情况下，文库可以通过共有引物或较大同源性探针（如小鼠恒定区探针）来筛选。
DNA、典型地质粒DNA可以使用在本领域中已知的技术从细胞中分离，根据例如在关于重组DNA技术的前述参考文献中详细阐明的标准、熟知技术来限制性作图并且测序。当然，DNA可以根据本披露在分离过程或后续分析过程中的任何时点合成。
在操纵所分离的遗传物质以便提供抗假单胞菌Psl结合分子（例如本披露的抗体或其片段、变异体或衍生物）之后，典型地将编码抗假单胞菌Psl结合分子的多核苷酸插入表达载体中以便引入宿主细胞中，这些宿主细胞可以用于产生所希望数量的抗假单胞菌Psl结合分子。
抗体或其片段、衍生物或类似物（例如结合至在此描述的靶标分子例如Psl的抗体的重链或轻链）的重组表达需要构建含有编码该抗体的多核苷酸的表达载体。一旦已经获得编码本披露的抗体分子、或抗体的重链或轻链、或其一部分（含有重链或轻链可变域）的多核苷酸，用于产生抗体分子的载体可以通过重组DNA技术使用本领域中熟知的技术来产生。因此，在此描述了通过表达含有编码抗体的核苷酸序列的多核苷酸来制备蛋白质的方法。可以使用本领域技术人员熟知的方法来构建含有编码抗体的序列和适当转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术、以及体内基因重组。因此，本披露提供可复制载体，这些载体包含编码本披露的抗体分子、或其重链或轻链、或重链或轻链可变域的核苷酸序列，该核苷酸序列可操作地连接至启动子。这类载体可以包括编码抗体分子的恒定区的核苷酸序列（参见例如PCT公开WO86/05807；PCT公开WO89/01036；以及美国专利号5,122,464）并且抗体的可变域可以克隆至这种载体中以便表达整个重链或轻链。
术语“载体”或“表达载体”在此用于指根据本披露用作媒介物以便将所希望的基因引入并且表达在宿主细胞中的载体。如本领域技术人员所已知，这类载体可以容易地选自下组，该组由以下各项组成：质粒、噬菌体、病毒、以及逆转录病毒。总体上，适合于本披露的载体将包括选择标记物、促进所希望的基因的克隆和进入和/或在真核或原核细胞中复制的能力的适当限制位点。
出于本披露的目的，可以使用许多表达载体系统。例如，一种类别的载体利用得自动物病毒的DNA元件，这些动物病毒如牛乳头瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、痘苗病毒、杆状病毒、逆转录病毒（RSV、MMTV或MOMLV）或SV40病毒。其他病毒涉及使用具有内部核糖体结合位点的多顺反子系统。另外，已经将DNA整合到染色体中的细胞可以通过引入一个或多个标记物来选择，该一种或多种标记物允许选择所转染的宿主细胞。标记物可以提供针对营养缺陷型宿主的原营养、杀生物剂抗性（例如抗生素）或对于重金属如铜的抗性。可选择的标记物基因可以直接连接至有待表达的DNA序列，或通过共转化来引入同一细胞中。mRNA的最佳合成还可能需要另外的元件。这些元件可以包括信号序列、剪接信号连同转录启动子、增强子以及终止信号。
在一些实施例中，将所克隆的可变区基因与如以上所讨论合成的重链和轻链恒定区基因（例如人）一起插入到表达载体之中。当然，能够在真核细胞中引出表达的任何表达载体可以用于本披露之中。合适载体的实例包括但不限于质粒pcDNA3、pHCMV/Zeo、pCR3.1、pEF1/His、pIND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5-His、pVAX1、以及pZeoSV2（可从加利福尼亚州圣迭戈市的英杰公司（Invitrogen）获得），和质粒PCI（可从威斯康星州麦迪逊市的普落麦格公司（Promega）获得）。总体上，针对表达适当较高水平的免疫球蛋白重链和轻链的那些细胞对大量的转化细胞进行筛选是可以例如通过机器人系统来执行的常规实验。
更一般来说，一旦编码抗假单胞菌Psl结合分子（例如本披露的抗体或其片段、变异体或衍生物）的单体亚单位的载体或DNA序列已经制备，可以将表达载体引入到合适宿主细胞之中。将质粒引入到宿主细胞之中可以通过本领域技术人员熟知的不同技术来完成。这些技术包括但不限于转染（包括电泳和电穿孔）、原生质体融合、磷酸钙沉淀、与包膜的DNA的细胞融合、显微注射以及以完整病毒来感染。参见李奇微（Ridgway）·A·A·G，“哺乳动物表达载体（Mammalian Expression Vectors）”载体，罗德里格斯（Rodriguez）和登哈特（Denhardt）编著，巴特沃斯出伴社（Butterworths），波士顿，麻萨诸塞州，第24.2章，第470-472页(1988)。典型地，质粒引入宿主中是经由电穿孔。使具有表达构建体的宿主细胞在适合于产生轻链和重链的条件下生长，并且测定重链和/或轻链蛋白质合成。示例性测定技术包括酶联免疫吸附测定（ELISA）、放射免疫测定（RIA）或荧光活化细胞分选仪分析（FACS）、免疫组织化学等。
通过常规技术将表达载体转移至宿主细胞中，并且然后通过常规技术来培养所转染的细胞以便产生用于在在此所述的方法中使用的抗体。因此，本披露包括宿主细胞，这些宿主细胞含有编码抗假单胞菌Psl结合分子（例如抗体或其片段、变异体或衍生物或其重链或轻链）的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至异源启动子。在某些用于表达双链抗体的实施例中，可以将编码重链与轻链两者的载体在宿主细胞中共表达，以用于表达整个免疫球蛋白分子，如下所详述。
某些实施例包括一种分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸包含编码上述VH和VL的核酸，其中由该多核苷酸表达的结合分子或其抗原结合片段特异性结合至假单胞菌Psl。在一些实施例中，如所描述的多核苷酸编码包含VH和VL的scFv分子，与以下各项中的一个或多个至少80%、85%、90%、95%或100%一致：SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:70，如表4中所示。
一些实施例包括包含上述多核苷酸的载体。在另外的实施例中，多核苷酸可操作地与启动子关联。在另外的实施例中，本披露提供包含这类载体的宿主细胞。在另外的实施例中，本披露提供其中多核苷酸可操作地与启动子相关联的载体，其中载体可以在合适的宿主细胞中表达特异性结合至假单胞菌Psl的结合分子。
还提供一种产生特异性结合至假单胞菌Psl的结合分子或其片段的方法，该方法包括培养含有包含上述多核苷酸的载体的宿主细胞，并且回收所述抗体或其片段。在另外的实施例中，本披露提供一种通过上述方法产生的分离的结合分子或其片段。
如在此使用，“宿主细胞”是指具有使用重组DNA技术构建的并且编码至少一个异源基因的载体的细胞。在从重组宿主分离抗体的过程的描述中，术语“细胞”和“细胞培养物”可互换使用以便表示抗体来源，除非另外明确规定。换句话说，从“细胞”回收多肽可指从旋转沉降的全细胞、或从含有培养基和悬浮细胞的细胞培养物回收。
多种宿主表达载体系统可用于表达用于在本文所述的方法中使用的抗体分子。此类宿主表达系统代表着可以产生并随后纯化感兴趣的编码序列的载体，而且还代表当用适当的核苷酸编码序列转化或转染时，原位表达本披露的一种抗体分子的细胞。这些宿主细胞包括但不限于：微生物，如用含有抗体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌（例如，大肠杆菌、枯草杆菌）；用含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母（例如，毕赤氏酵母）；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体（例如杆状病毒）感染的昆虫细胞系统；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体（例如，花椰菜花叶病毒CaMV；烟草花叶病毒TMV）感染的植物细胞系统或用含有抗体编码序列的重组质粒表达载体（例如Ti质粒）转化的植物细胞系统；或具有重组表达构建体的哺乳动物细胞系统（例如，COS、CHO、BLK、293、3T3细胞），这些建构体包含得生自哺乳动物细胞的基因组的启动子（例如，金属硫蛋白启动子）或得自哺乳动物病毒的启动子（例如，腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子）。尤其用于表达完整重组抗体分子的细菌细胞如大肠杆菌、或真核细胞用于表达重组抗体分子。例如，哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢细胞（CHO），与载体如来自人巨细胞病毒的主要立即早期基因启动子元件相结合是抗体的有效表达系统（福金（Foecking）等人，《基因》45:101（1986)；科克特（Cockett）等人，《生物技术》8:2（1990)）。
用于蛋白质表达的宿主细胞系经常具有哺乳动物来源；本领域技术人员被认为能够确定最适合于有待在其中表达的所希望的基因产物的具体宿主细胞系。示例性宿主细胞系包括但不限于CHO（中国仓鼠卵巢）、DG44和DUXB11（中国仓鼠卵巢细胞系，DHFR减）、HELA（人宫颈癌）、CVI（猴肾细胞系）、COS（具有SV40T抗原的CVI的衍生物）、VERY、BHK（幼仓鼠肾）、MDCK、293、WI38、R1610（中国仓鼠成纤维细胞）BALBC/3T3（小鼠成纤维细胞）、HAK（仓鼠肾细胞系）、SP2/O（小鼠骨髓瘤）、P3x63-Ag3.653（小鼠骨髓瘤）、BFA-1c1BPT（牛内皮细胞）、RAJI（人淋巴细胞）、以及293（人肾）。宿主细胞系典型地可从商业服务机构（美国组织培养物保藏中心）或从公开的文献获得。
另外，可选择调节所插入序列的表达，或以所希望的特定方式来修饰并且加工基因产物的宿主细胞株。蛋白质产物的这类修饰（例如糖基化）和加工（例如裂解）对于蛋白质的功能可以是重要的。不同的宿主细胞针对蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰具有特征性和特异性的机制。可选择适当细胞系或宿主系统以确保所表达的外源蛋白的正确修饰和加工。为此，可以使用具有用于初级转录物的正确加工、基因产物的糖基化和磷酸化的细胞机器（cellularmachinery）的真核宿主细胞。
为了长期、高产率的产生重组蛋白，稳定表达是优选的。例如，可以将稳定表达抗体分子的细胞系工程化。代替使用含有病毒复制起点的表达载体，宿主细胞可以使用由适当表达控制元件（例如启动子、增强子、序列、转录终止子、多聚腺苷酸化位点等）和可选择标记物来控制的DNA来转化。在引入外源DNA后，可以允许工程化的细胞在富集的培养基中生长1-2天，并且然后切换至选择性培养基。在重组质粒中的选择性标记物赋予对选择的抗性，并且允许细胞将质粒稳定地整合进它们的染色体中并且生长以形成集落（foci），进而可以将该集落克隆并且扩充成细胞系。这种方法可有利地用于将稳定表达抗体分子的细胞系工程化。
可以使用许多选择系统，包括但不限于单纯性疱疹病毒胸苷激酶（威格勒（Wigler）等人，《细胞》（Cell）11:223(1977)）、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（苏帕斯卡（Szybalska）&撒波斯基（Szybalski），《美国国家科学院院刊》48:202(1992)）、以及腺嘌呤磷酸核糖转移酶（洛伊（Lowy）等人，《细胞》22:8171980）基因可相应地用于tk-、hgprt-或aprt-细胞之中。另外，抗代谢物抗性可以用作选择以下基因的基础：dhfr，它赋予对甲氨喋呤的抗性（（威格勒等人，《美国国家科学院院刊》（Natl.Acad.Sci.USA）77:357(1980)；奥黑尔（O'Hare）等人，《美国国家科学院院刊》78:1527(1981)）；gpt，它赋予对霉酚酸的抗性（穆利根（Mulligan）&贝尔格（Berg），《美国国家科学院院刊》78:2072(1981)）；neo，它赋予对氨基葡糖苷G-418的抗性（《临床药学》（Clinical Pharmacy）12:488-505；吴（Wu）和吴，《生物疗法》（Biotherapy）3:87-95(1991)；托斯塔谢夫（Tolstoshev），《药理学与毒理学年鉴》（Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.）32:573-596(1993)；穆利根（Mulligan）《科学》260:926-932(1993)；以及摩根（Morgan）&安德森（Anderson），《生物化学年鉴》（Ann.Rev.Biochem.）62:191-217(1993)；TIB TECH11(5):155-215（1993年5月））、以及hygro，它赋予对潮霉素的抗性（圣德尔（Santerre）等人，《基因》30:147(1984)。可使用的在重组DNA技术领域中通常已知的方法被描述于奥苏贝尔等人（编著），《当代分子生物学方案》，约翰·威利父子公司，纽约（1993）；克里格勒尔（Kriegler），《基因转移和表达：实验手册》（Gene Transfer andExpression,A Laboratory Manual），斯托克顿出版社（Stockton Press），纽约（1990）；以及德拉柯波利（Dracopoli）等人（编著），《当前人类遗传学方案》（Current Protocols in Human Genetics），约翰·威利父子公司，纽约（1994）的第12和13章；库尔柏利-加拉平（Colberre-Garapin）等人，《分子生物学杂志》150:1(1981)，这些文献都通过引用以其全部内容结合在此。
抗体分子的表达水平可以通过载体扩增来增加（关于评论，参见贝宾顿（Bebbington）&汉切尔（Hentschel），使用基于基因扩增的载体来在DNA克隆中在哺乳动物细胞中表达克隆的基因（The use of vectors based on geneamplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNAcloning），学术出版社（Academic Press），纽约，第3卷（1987））。当表达抗体的载体系统中的标记物可扩增时，存在于宿主细胞培养物中的抑制剂的水平的增加将使标记物基因的副本数量增加。由于扩增的区与抗体基因相关联，因此抗体的产生将也增加（克劳斯（Crouse）等人，《分子细胞生物学杂志》（Mol.Cell.Biol.）3:257(1983)）。
体外产生允许按比例扩大以便给出大量所希望的多肽。在组织培养条件下的哺乳动物细胞培养技术在本领域中是已知的，并且包括均质悬浮培养，例如在气升式反应器中或在连续搅拌反应器中，或固定或截留细胞培养，例如在中空纤维、微胶囊中、在琼脂糖微珠粒或陶瓷筒上。在必要和/或希望时，多肽溶液可以通过常规色谱方法来纯化，例如凝胶过滤、离子交换色谱法、DEAE-纤维素上色谱法或（免疫）亲和色谱法，例如在合成铰链区多肽的优先生物合成之后或在在此描述的HIC色谱步骤之前或之后。
编码抗假单胞菌Psl结合分子（例如如在此披露的抗体或其片段、变异体或衍生物）的构建体还可表达于非哺乳动物细胞如细菌或酵母或植物细胞之中。容易吸收核酸的细菌包括以下成员：肠杆菌科（enterobacteriaceae），如大肠杆菌（Escherichia coli）或沙门氏菌（Salmonella）菌株；芽孢杆菌科（Bacillaceae），如枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）；肺炎球菌（Pneumococcus）；链球菌（Streptococcus），以及流感嗜血杆菌（Haemophilusinfluenzae）。应进一步理解在表达于细菌中时，异源多肽典型地成为包涵体的一部分。异源多肽必须被分离、纯化、然后组装成功能分子。当需要四价形式的抗体时，然后将亚单位自动组装成四价抗体（WO02/096948A2）。
在细菌系统中，取决于所表达的抗体分子的预定用途，可有利地选择许多表达载体。例如，在有待产生大量的这种蛋白质以便产生抗体分子的药物组合物时，引导容易纯化的较高水平的融合蛋白产物的表达的载体可以是令人希望的。这类载体包括但不限于大肠杆菌表达载体pUR278（罗塞（Ruther）等人，《欧洲分子生物学学会杂志》（EMBO J.）2:1791(1983)），其中抗体编码序列可单独地与lacZ编码区同框连接至载体中以使得产生融合蛋白；pIN载体（井上（Inouye）&井上，《核酸研究》（Nucleic Acids Res.）13:3101-3109(1985)；凡赫克（Van Heeke）&舒斯特（Schuster），《生物化学杂志》（J.Biol.Chem.）24:5503-5509(1989)）等。pGEX载体也可以用于表达作为与谷胱甘肽S-转移酶（GST）的融合蛋白的外源多肽。总体上，这类融合蛋白可溶并且可以通过吸附并且结合至基质谷胱甘肽-琼脂糖珠粒，随后在游离谷胱甘肽的存在下洗脱来容易地从溶解的细胞中纯化。pGEX载体被设计成包含凝血酶或因子Xa蛋白酶裂解位点以使得克隆的靶标基因产物可以从GST部分上释放。
除了原核生物以外，也可以使用真核微生物。酿酒酵母或常见面包酵母在真核微生物中是最常使用的，但是许多其他菌株通常可利用，例如毕赤氏酵母。
为了在酵母中表达，通常使用例如质粒YRp7（斯丁奇克布（Stinchcomb）等人，《自然》（Nature）282:39(1979)；金斯曼（Kingsman）等人，《基因》7:141(1979)；彻姆柏（Tschemper）等人，《基因》10:157(1980)）。此质粒已经含有TRP1基因，该基因提供缺乏在色氨酸中生长的能力的突变酵母菌株的选择标记物，该菌株例如ATCC编号44076或PEP4-1（琼斯（Jones），《遗传学》（Genetics）85:12（1977)）。然后，作为酵母宿主细胞基因组的特征的trpl缺陷区（lesion）的存在提供用于检测通过在不存在色氨酸的情况下的生长而进行的转化的有效环境。
在昆虫系统中，苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（Autographa californicanuclear polyhedrosis virus；AcNPV）典型地用作表达外源基因的载体。病毒在草地贪夜蛾细胞中生长。抗体编码序列可单独地克隆至病毒的非必需区（例如多角体蛋白基因）中并且置于AcNPV启动子（例如多角体蛋白启动子）的控制下。
一旦如在此披露的抗假单胞菌Psl结合分子（例如抗体或其片段、变异体或衍生物）已经重组表达，它可以通过在本领域中已知用于纯化免疫球蛋白分子的任何方法来纯化，例如通过色谱法（例如离子交换、亲和力、对于在蛋白质A之后的特定抗原特别是通过亲和力，以及尺寸分级柱色谱法（sizing columnchromatography））、离心、差别溶解度或通过用于纯化蛋白质的任何其他标准技术。增加本披露的抗体的亲和力的另一种方法被披露于US20020123057A1之中。
VII.鉴别与血清型无关的结合分子
本披露包括一种鉴别不依赖于血清型的治疗结合分子、例如具有优良或所希望的治疗活性的抗体或其片段的与靶标无关的全细胞方法。该方法可用于鉴别可以拮抗、中和、清除或阻断感染剂、例如细菌病原体的不希望的活性的结合分子。如在本领域中所已知，许多感染剂在其显性表面抗原中展现出显著变化，从而允许它们规避免疫监视。在此描述的鉴别方法可以鉴别靶向在许多不同假单胞菌种类或其他革兰氏阴性病原体之间共用的抗原的结合分子，由此提供可靶向来自多个种类的多种病原体的治疗剂。例如，该方法用于鉴别一系列结合分子，这些结合分子以一种不依赖于血清型的方式结合至铜绿假单胞菌的表面，并且在结合至细菌病原体时，介导、促进或增强针对细菌细胞如细菌病原体的调理吞噬（OPK）活性，这些细菌病原体例如机会假单胞菌种类（例如铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌、以及产碱假单胞菌）和/或抑制这类细菌细胞附着至上皮细胞。
某些实施例披露一种鉴别与血清型无关的结合分子的方法，该方法包括：(a)在噬菌体中制备天然和/或康复期抗体文库，(b)通过耗尽淘筛来从文库中去除血清型特异性抗体，(c)针对不依赖于血清型特异性结合至全细胞的抗体来筛选文库，并且(d)针对所希望的功能特性来筛选所得抗体。
某些实施例提供一种如在此披露的全细胞表型筛选方法，其中抗体噬菌体文库得自天然或铜绿假单胞菌感染的康复患者。使用初始针对血清型特异性反应性来选择的淘筛策略，分离结合铜绿假单胞菌全细胞的不同克隆。所选定的克隆被转化成人IgG1抗体并且被证实与铜绿假单胞菌临床分离物反应，不论血清型分类或组织分离位点如何（参见实例）。在此描述的功能活性筛选指示抗体可有效预防铜绿假单胞菌附着至哺乳动物细胞并且以一种浓度依赖性和不依赖于血清型的方式来介导调理吞噬（OPK）杀伤。
在另外的实施例中，上述结合分子或其片段、抗体或其片段或组合物结合至两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种不同的铜绿假单胞菌血清型，或结合至至少80%、至少85%、至少90%、或至少95%的从受感染患者体内分离的铜绿假单胞菌菌株。在另外的实施例中，铜绿假单胞菌菌株是从肺、痰液、眼睛、脓汁、粪便、尿、窦、伤口、皮肤、血液、骨骼或膝关节液中的一种或多种中分离。
VIII.包含抗假单胞菌Psl结合分子的药物组合物
用于本披露中的药物组合物包含本领域普通技术人员熟知的药学上可接受的载体。用于肠胃外给予的制剂包括无菌水性或非水性溶液、混悬液以及乳液。如在此披露的某些药物组合物可以按一种可接受的剂型（包括例如胶囊、片剂、水性混悬液或溶液）来口服给予。某些药物组合物也可以通过鼻气雾剂或吸入来给予。还可以存在防腐剂和其他添加剂，例如像抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、以及惰性气体等。用于在此披露的治疗方法中使用的合适配制品被描述于《雷明登氏药学全书》（Remington's Pharmaceutical Sciences），Mack出版公司，第16版（1980）。
可与载体材料相组合以便产生单一剂型的抗假单胞菌Psl结合分子（例如抗体或其片段、变异体或衍生物）的量将取决于所治疗的宿主和具体给予模式而变化。也可以调整剂量方案以便提供最佳所希望的应答（例如治疗性或预防性应答）。组合物还可以包含分散于生物相容性载体材料中的抗假单胞菌Psl结合分子（例如抗体或其片段、变异体或衍生物），该载体材料起化合物的合适递送或支撑系统的作用。
IX.使用治疗性结合分子的治疗方法
制备如在此披露的抗假单胞菌Psl结合分子（例如抗体或其片段、变异体或衍生物）并且它给予有需要的受试者的方法对于本领域技术人员来说是熟知的或容易由本领域技术人员其来确定。抗假单胞菌Psl结合分子（例如抗体或其片段、变异体或衍生物）的给予途径可以是例如口服、肠胃外、吸入或局部。如在此使用的术语肠胃外包括例如静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内或皮下给予。合适的给予形式将是注射用溶液，特别是用于静脉内或动脉内注射或滴注的溶液。然而，在与在此的传授内容相容的其他方法中，如在此披露的抗假单胞菌Psl结合分子（例如抗体或其片段、变异体或衍生物）可以直接递送至有害细胞群体的部位，例如感染部位，从而增加患病组织对治疗剂的暴露。例如，抗假单胞菌Psl结合分子可以直接给予眼部组织、烧伤或肺组织。
如在此披露的抗假单胞菌Psl结合分子（例如抗体或其片段、变异体或衍生物）可以按药学上有效量给予以便体内治疗假单胞菌感染。在这方面，应理解所披露的结合分子将被配制成有助于给予并且促进活性剂的稳定性。出于本申请的目的，药学上有效量应被认为是指足以实现有效结合至靶标并且实现益处，例如治疗、改善、减轻、清除或预防假单胞菌感染的量。
一些实施例是针对一种在有需要的受试者中预防或治疗假单胞菌感染的方法，该方法包括向受试者给予有效量的在此描述的结合分子或其片段、抗体或其片段、组合物、多核苷酸、载体或宿主细胞。在另外的实施例中，假单胞菌感染是铜绿假单胞菌感染。在一些实施例中，受试者是人。在某些实施例中，感染是眼部感染、肺感染、烧伤感染、伤口感染、皮肤感染、血液感染、骨骼感染、或所述感染中的两种或更多种的组合。在另外的实施例中，受试者患有急性肺炎、烧伤、角膜感染、囊性纤维化或其组合。
某些实施例是针对一种阻断或防止铜绿假单胞菌附着至上皮细胞的方法，该方法包括使上皮细胞与铜绿假单胞菌的混合物与在此描述的结合分子或其片段、抗体或其片段、组合物、多核苷酸、载体、或宿主细胞相接触。
还披露了一种增强铜绿假单胞菌的OPK的方法，该方法包括使吞噬细胞与铜绿假单胞菌的混合物与在此描述的结合分子或其片段、抗体或其片段、组合物、多核苷酸、载体、或宿主细胞相接触。在另外的实施例中，吞噬细胞是分化的HL-60细胞或人多形核白细胞（PMN）。
与本披露的范围相一致，抗假单胞菌Psl结合分子（例如抗体或其片段、变异体或衍生物）可以根据前述治疗方法以足以产生治疗效果的量来给予人或其他动物。在此披露的抗假单胞菌Psl结合分子（例如抗体或其片段、变异体或衍生物）可以按常规剂型来给予这种人或其他动物，该剂型是通过根据已知技术将本披露的抗体与常规药学上可接受的载体或稀释剂相组合来制备。
用于治疗假单胞菌感染的本披露的组合物的有效剂量取决于许多不同因素而变化，这些因素包括给予方式、靶标部位、患者的生理状态、患者是人还是动物、所给予的其他药剂，以及治疗是预防性还是治疗性的。通常，患者是人，但是也可以治疗非人哺乳动物包括转基因哺乳动物。治疗剂量可以使用本领域技术人员已知的常规方法来滴定，以最优化安全性和功效。
取决于本领域技术人员已知的不同因素，抗假单胞菌Psl结合分子（例如抗体或其片段、变异体或衍生物）可在多个时刻以不同频率来给予。可替代地，抗假单胞菌Psl结合分子（例如抗体或其片段、变异体或衍生物）可以作为持续释放配制品来给予，在此情况下需要较不频繁给予。剂量和频率取决于抗体在患者体内的半衰期而变化。
本披露的组合物可以通过任何合适方法来给予，例如肠胃外、心室内、口服、通过吸入喷雾剂、局部、直肠、经鼻、口腔、经阴道或经由植入的储槽。如在此使用的术语“肠胃外”包括皮下、静脉内、肌肉内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病变内以及颅内注射或输注技术。
X.免疫测定
抗假单胞菌Psl结合分子（例如抗体或其片段、变异体或衍生物）可以通过在本领域中已知的任何方法来针对免疫特异性结合进行测定。可使用的免疫测定包括但不限于使用如以下技术的竞争性和非竞争性测定系统：蛋白质印迹、放射免疫测定、ELISA（酶联免疫吸附测定）、“夹心”免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定、凝集测定、补体固定测定、免疫放射测定、荧光免疫测定、蛋白质A免疫测定，仅举几个例子。这类测定是常规的并且在本领域中是熟知的（参见例如奥苏贝尔等人编著的《当前分子生物学方案》，约翰·威利父子公司，纽约，第1卷（1994），其通过引用以其全部内容结合在此）。示例性免疫测定在下文简要地描述（但是不意图通过限制方式）。
有多种方法可供用于测量抗体-抗原相互作用的亲和力，但是用于确定速率常数的方法相对很少。大多数方法依赖于将抗体或抗原进行标记，这不可避免地使常规测量复杂化并且在所测量的数量中引入不确定性。抗体亲和力可以通过许多方法包括ELISA以及FACS来测量。
系统使用96孔板形式的生物传感器来报告动力学分析。蛋白质结合和解离事件可以通过测量溶解的一种蛋白质与固定于FortéBio生物传感器上的第二蛋白质的结合来监测。在测量抗Psl抗体与Psl结合的情况下，将Psl固定至尖端上，随后分析溶解的抗体的结合。抗体与固定的Psl的缔合以及解离然后通过仪器传感器来检测。然后收集数据并且输出至GraphPad Prism以便进行亲和力曲线拟合。
如在上执行的表面等离子体共振（SPR）提供优于测量抗体-抗原相互作用的亲和力的常规方法的许多优势：(i)不需要对抗体或抗原进行标记；(ii)抗体不需要提前纯化，可直接使用细胞培养物上清液；(iii)能够进行实时测量，从而允许对不同单克隆抗体相互作用进行快速半定量比较，并且对于许多评估目的来说是足够的；(iv)可使生物特异性表面再生以使得一系列不同单克隆抗体可在相同条件下容易地比较；(v)分析程序完全自动化，并且可在没有使用者干预的情况下执行一系列广泛的测量。BIA应用手册（BIAapplicationsHandbook），AB版（1998年再版）、代号BR-1001-86；BIA技术手册（BIAtechnology Handbook），AB版（1998年再版）、代号BR-1001-84。
基于SPR的结合研究需要将结合对的一个成员固定于传感器表面上。固定的结合搭配物被称为配体。溶解的结合搭配物被称为分析物。在一些情况下，配体经由结合至被称为捕获分子的另一个固定分子来间接地附着至表面。当分析物结合或解离时，SPR应答反映了检测器表面的质量浓度的变化。
基于SPR，实时测量直接在相互作用发生时对它们进行监测。该技术完全适合于确定动力学参数。比较性亲和力分级（ranking）可极为简单地执行，并且动力学与亲和力常数可从传感图数据得到。
当分析物以离散脉冲来注射至配体表面上时，所得传感图可划分成三个基本相：(i)样品注射过程中分析物与配体的缔合；(ii)样品注射过程中的平衡或稳态，其中分析物结合速率通过从复合物解离来平衡；(iii)缓冲液流动期间分析物从表面上的解离。
缔合和解离相提供关于分析物-配体相互作用的动力学的信息（ka和kd，复合物形成和解离速率，kd/ka=KD）。平衡相提供关于分析物-配体相互作用的亲和力的信息（KD）。
BIA评估（BIAevaluation）软件提供用于使用数值积分与全局拟合算法来进行曲线拟合的综合工具（facilities）。通过对数据进行适当分析，相互作用的单独速率和亲和力常数可以从简单的研究来获得。可通过此技术来测量的亲和力的范围非常广泛，在从mM到pM的范围内。
表位特异性是单克隆抗体的重要特性。与使用放射免疫测定、ELISA或其他表面吸附方法的常规技术相比，使用的表位作图不需要标记或纯化抗体，并且允许使用一系列多个单克隆抗体来进行多位点特异性试验。另外，大量分析可自动处理。
成对结合实验测试两个MAb同时结合至同一抗原的能力。针对单独表位的MAb将独立地结合，而针对相同或紧密相关表位的MAb干扰彼此的结合。使用进行的这些结合实验可简单地执行。
例如，可使用捕获分子来结合第一Mab，随后依序添加抗原和第二MAb。传感图解释：1.抗原结合至第一Mab的量，2.第二MAb结合至表面附着抗原的程度，3.如果第二MAb未结合，逆转成对试验的顺序是否会改变结果。
肽抑制是用于表位作图的另一种技术。这种方法可以对成对抗体结合研究进行补充，并且可在抗原的基本序列已知时，将功能表位与结构特征相关联。肽或抗原片段针对抑制不同MAb与固定抗原的结合来进行测试。干扰给定MAb的结合的肽被认为在结构上与由所述MAb限定的表位相关。
***
除非另外指示，否则本披露的实践将采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA以及免疫学的常规技术，这些技术在本领域的技能范围内。这类技术在文献中得到充分解释。参见例如《分子克隆：实验手册》，第2版，萨布鲁克等人编著，冷泉港实验室出版社，(1989)；《分子克隆：实验手册》，萨布鲁克等人编著，冷泉港实验室，纽约(1992)；《DNA克隆》（DNA Cloning），D·N·格洛夫（Glover）编著，第I卷和第II卷(1985)；《寡核苷酸合成》（Oligonucleotide Synthesis），M·J·盖特（Gait）编著(1984)；穆利斯（Mullis）等人，美国专利号：4,683,195；《核酸杂交》（Nucleic Acid Hybridization），B·D·黑姆斯（Hames）&S·J·希金斯（Higgins）编著(1984)；《转录与翻译》，B·D·黑姆斯&S·J·希金斯）编著(1984)；《动物细胞的培养》（Culture Of Animal Cells），R·I·弗莱士尼（Freshney），艾伦·艾·利斯公司（Alan R.Liss,Inc.）(1987)；《固定化细胞与酶》（Immobilized Cells And Enzymes），IRL出版社(1986)；B·帕柏尔（Perbal），《分子克隆实用指南》（A Practical Guide To Molecular Cloning）(1984)；专题论文：《酶学方法》（Methods In Enzymology），学术出版社公司，纽约；《哺乳动物细胞的基因转移载体》（Gene Transfer Vectors ForMammalian Cells），J·H·米勒（Miller）&M·P·卡洛斯（Calos）编著，冷泉港实验室(1987)；《酶学方法》（Methods In Enzymology），第154卷与第155卷（Wu（吴）等人编著）；《细胞与分子生物学中的免疫化学方法》（Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology），迈耶（Mayer）&沃克（Walker）编著，学术出版社，伦敦(1987)；《实验免疫学手册》（HandbookOf Experimental Immunology），第I-IV卷，D·M·韦尔（Weir）&C·C·布莱克韦尔（Blackwell）编著(1986)；《操纵小鼠胚胎》（Manipulating the MouseEmbryo），冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(1986)；以及奥苏贝尔等人，《当代分子生物学方案》，约翰·威利父子公司，巴尔的摩（Baltimore），马里兰州(1989)。
阐述免疫学一般原则的标准参考著作包括《当代分子生物学方案》，约翰·威利父子公司，纽约；克莱恩（Klein）·J，《免疫学：自我-非自身辨别的科学》（Immunology:The Science of Self-Nonself Discrimination），约翰·威利父子公司，纽约(1982)；罗义特（Roitt）·I、博劳斯托夫（Brostoff）·J以及迈尔（Male）·D，《免疫学》（Immunology），第6版，伦敦：莫斯比出版社（Mosby）(2001)；阿巴斯（Abbas）·A、阿布（Abul）·A、以及李奇曼（Lichtman）·A，《细胞与分子免疫学》（Cellular and Molecular Immunology）第5版，爱思唯尔健康科学部（Elsevier Health Sciences Division）(2005)；以及哈洛&莱恩，《抗体：实验手册》，冷泉港出版社(1988)。
现在已经详细地描述了本披露，参考以下实例可更清楚地了解本披露，这些实例包括在此只用于说明目的并且不意图限制本披露。本文提到的所有专利和公开都通过引用以其全部内容明确结合在此。
实例
实例1：人抗体噬菌体展示文库的构建和筛选
此实例描述与靶标无关的全细胞淘筛方法，该方法使用得自首次试验的和铜绿假单胞菌感染的康复患者的人抗体噬菌体文库，以便鉴别针对假单胞菌感染的新颖保护性抗原（图1A）。体外功能筛选中包括的测定包括调理吞噬（OPK）杀伤测定和使用上皮细胞系A549进行的细胞附着测定。基于优良体外活性的先导候选物在铜绿假单胞菌急性肺炎、角膜炎以及烧伤感染模型中进行测试。
图1B展示患者抗体噬菌体展示文库的构建。在诊断7-10天后，从6个恢复患者体内汇集全血，随后进行RNA提取和噬菌体文库构建，如先前所述（沃恩·T·J（Vaughan）等人，《自然：生物技术》（Nat Biotechnol）14,309-314(1996)；拉马特（Wrammert）·J等人，《自然》453,667-671(2008)）。图1C展示最终克隆的scFv文库包含5.4×108个转化株并且测序揭示79%的scFv基因是全长的并且是同框的。在文库选择之前，对于确定表位特异性来说经常重要的VH CDR3环在氨基酸水平上有84%的相异性。
除了患者文库以外，含有多达1×1011个结合成员的天然人scFv噬菌体展示文库（劳埃德（Lloyd）·C等人，《蛋白质工程的设计与选择》（Protein EngDes Sel）22,159-168(2009)）用于抗体分离（沃恩（Vaughan）·T·J等人，《自然：生物技术》14,309-314(1996)）。将热灭活的铜绿假单胞菌（1×109）固定于IMMUNOTM试管（能肯公司（Nunc）；MAXISORPTM）中随后如随描述地进行噬菌体展示选择（伏恩（Vaughan）·T·J等人，《自然：生物技术》14,309-314(1996)），除了三乙醇胺（100nM）用作洗脱缓冲液以外。为了在悬浮的铜绿假单胞菌上进行选择，将热灭活的细胞阻断，随后将阻断的噬菌体添加至细胞。在洗涤之后，如所描述地将洗脱的噬菌体用于感染大肠杆菌细胞（伏恩，1996）。如所描述地来执行从大肠杆菌中救援噬菌体并且通过ELISA来结合至热灭活的铜绿假单胞菌（伏恩，1996）。
遵循全细胞亲和力选择方法的开发和验证，新的康复患者文库与先前构建的天然文库（伏恩·T·J等人，《自然：生物技术》14，309-314(1996)）在具有完整O抗原的铜绿假单胞菌菌株3064连同缺乏O抗原的表面表达的同基因wapR突变株的悬浮液上进行亲和力选择。图1D示出与天然文库相比，对于患者文库来说，来自连续患者文库选择的输出滴度被发现以更大速率增加（在轮次3，相应地为1×107对比3×105）。另外，还发现VH CDR3环序列在文库中的重复（选择过程中克隆富集的度量）在患者文库中较高，在第3轮达到88%-92%，这与第3轮时天然文库中的15%-25%形成对比（图1D）。来自亲和力选择的单独scFv噬菌体接着通过ELISA针对与铜绿假单胞菌异源血清型菌株的反应性来筛选（图1E）。ELISA板（能肯公司；MAXISORPTM）如所描述地用来自过夜培养物的铜绿假单胞菌菌株涂布（迪干多梅里科（DiGiandomenico）·A等人，《感染与免疫》（Infect Immun）72，7012-7021（2004)）。将稀释抗体添加至阻断板持续1小时、洗涤并且用HRP轭合的抗人二级抗体处理1小时，随后如所描述地显影并且分析（阿尔布兰德特（Ulbrandt）·N·D等人，《病毒学杂志》（JVirol）80,7799-7806（2006)）。使用两种文库从全细胞选择获得的优势种噬菌体产生血清型特异性反应（数据未示出）。选择在不存在非特异性结合至大肠杆菌或牛血清清蛋白的情况下展现出不依赖于血清型的结合的克隆用于进一步评估。
对于IgG表达，如所描述地将所选定的抗体的VH和VL链克隆至人IgG1表达载体中、在HEK293细胞中共表达，并且通过蛋白质A亲和色谱法来纯化（帕斯克（Persic）·L等人，《基因》187，9-18(1997)）。所制得的具有来自这些选定的不依赖于血清型的噬菌体的可变区的人IgG1抗体被针对铜绿假单胞菌特异性来加以证实，并且优先用于通过FACS分析来进行的全细胞结合至显性临床相关的血清型（图1F）的后续分析，因为这种方法比ELISA更严格。对于基于流式细胞术的结合测定，将中间对数期铜绿假单胞菌菌株在PBS中浓缩至OD650为2.0。在4℃下伴以振荡来孵育抗体（10μg/mL）和细菌（约1×107个细胞）1小时之后，洗涤的细胞用ALEXA FLUOR山羊抗人IgG抗体（加利福尼亚州卡尔斯巴德市的英杰公司）在4℃下孵育0.5小时。洗涤的细胞如所推荐的用BACLIGHTTM绿色细菌染色剂来染色（Invitrogen，加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司）。样品在LSR II流式细胞仪（碧迪生物科学（BD Biosciences））上操作并且使用BD FacsDiva（6.1.3版）以及FlowJo（9.2版；TreeStar公司）来分析。通过FACS证实展现出结合的抗体进一步优先用于在调理吞噬杀伤（OPK）测定中进行功能活性测试。
实例2：mAb促进铜绿假单胞菌的OPK的评估
此实例描述优先的人IgG1抗体促进铜绿假单胞菌的OPK的评估。图2A示出除了WapR-007和阴性对照抗体R347以外，所有抗体均介导发光铜绿假单胞菌血清组O5菌株（PAO1.lux）的浓度依赖性杀伤。WapR-004和Cam-003展现出优良OPK活性。OPK测定如（迪干多梅里科·A等人，感染与免疫72,7012-7021(2004)）所描述、加以修改来执行。简单地说，测定是在96孔板中使用0.025ml的每一种OPK组分、铜绿假单胞菌菌株、稀释的幼兔血清、分化的HL-60细胞、以及单克隆抗体来执行。在一些OPK测定中，使用如（蔡（Choi）·K·H.等人，自然：方法2,443-448(2005)）所描述构建的发光铜绿假单胞菌株。发光OPK测定如上所述来执行，但是相对荧光素酶单位（RLU）的确定是使用珀金埃尔默（Perkin Elmer）ENVISION多标记板读取器（Perkin Elmer）来进行。
评估WapR-004和Cam-003抗体介导针对另一种临床相关O抗原血清型菌株9882-80.lux的OPK活性的能力。图2B示出增强的WapR-004和Cam-003OPK活性延伸至菌株9882-80（O11）。
评估了Cam-003介导针对来自临床相关O-抗原血清型的代表性非类粘蛋白菌株并且针对得自囊性纤维化患者的类粘蛋白铜绿假单胞菌菌株的OPK活性的能力。Cam-003介导所测试的所有非类粘蛋白临床分离物的有效OPK（图2C）。另外，Cam-003介导所测试的所有类粘蛋白铜绿假单胞菌分离物的有效杀伤（图2D）。
另外，此实例描述scFv-Fc形式的WapR-004（W4）突变体促进铜绿假单胞菌的OPK的评估。一种突变型Wap-004RAD（W4-RAD）经由定点诱变来特别地产生以便去除VH中的RGD基元。其他W4突变体制备如下。如（鲁·K·H，PCR方法和应用（PCR Methods Appl）4，S185-194（1995)）所描述，执行嵌套式PCR以从得自铜绿假单胞菌感染的康复患者的scFv文库扩增的W4变异体（得自体细胞高度突变），以便进行分析。这是产生WapR-004的文库。W4变异体片段使用在本领域中已知的标准程序来亚克隆并且测序。将W4突变体轻链（LC）与WapR-004重链（HC）重组以便产生scFv-Fc形式的W4突变体。另外，将WapR-004RAD重链（HC）突变体与scFv-Fc形式的M7和M8的母体LC重组。构建体使用在本领域中已知的标准程序来制备。图11(A-M)示出除了阴性对照抗体R347以外，所有WapR-004（W4）突变体介导发光铜绿假单胞菌血清组O5菌株（PAO1.lux）的浓度依赖性杀伤。
实例3：不依赖于血清型的抗铜绿假单胞菌抗体靶向Psl外泌多糖
这个实例描述得自表型筛选的抗铜绿假单胞菌抗体的靶标的鉴别。执行靶标分析以便测试是否不依赖于血清型的抗体靶向蛋白质或碳水化合物抗原。在ELISA中未观察到与用蛋白酶K彻底消化的PAO1全细胞提取物的结合的损失，这表明反应性靶向表面可及的碳水化合物残基（数据未示出）。在造成以下各项的基因中构建同基因突变体：O-抗原、褐藻酸盐以及LPS核心生物合成；wbpL（O-抗原缺陷）；wbpL/algD（O-抗原和褐藻酸盐缺陷）；rmlC（O-抗原缺陷和截短的外核）；以及galU（O-抗原缺陷和截短的内核）。铜绿假单胞菌突变体是基于施魏策尔（Schweizer）描述的等位基因替换策略来构建：（施魏策尔·H·P，《分子微生物学杂志》6,1195-1204(1992)；施魏策尔·H·D，《生物技术》15,831-834(1993)）。载体从大肠杆菌菌株S17.1动员至铜绿假单胞菌菌株PAO1之中；重组体如（黄（Hoang）·T·T等人，《基因》212,77-86(1998)）所描述来分离。基因缺失通过PCR来证实。铜绿假单胞菌突变体与具有野生型基因的、基于pUCP30T的构建体互补。抗体的反应性通过间接ELISA在用以上所指示的铜绿假单胞菌菌株涂布的板上确定：图3A和3J示出Cam-003与wbpL或wbpL/algD双重突变体的结合未受影响，然而与rmlC和galU突变体的结合被消除。虽然这些结果与结合至LPS核心一致，但是未观察到与从PAO1纯化的LPS的反应性。最近显示rmlC和galU基因是Psl外泌多糖、即由D-甘露糖、L-鼠李糖以及D-葡萄糖组成的一种重复五糖聚合物的生物合成所必需的。测试Cam-003与同基因剔除pslA的PAO1ΔpslA的结合，因为pslA为Psl生物合成所必需（伯德（Byrd）·M·S等人，《分子微生物学杂志》73,622-638(2009)）。当通过ELISA（图3B）和FACS（图3C）测试时，Cam-003与PAO1ΔpslA的结合被消除，而此突变体中的LPS分子未受影响（图3D）。Cam-003的结合在用pslA补充的PAO1ΔwbpL/algD/pslA三重突变体中得以恢复（图3E），这如同与突变型相对照，Cam-003介导针对补充的PAO1ΔpslA的调理杀伤的能力得以恢复一样（图3F和3G）。Cam-003抗体与Pel外泌多糖突变体的结合也未受影响，从而进一步证实Psl是抗体靶标（图3E）。结合测定证实剩余抗体也结合Psl（图3H和3I）。
为了证实所有抗体结合相同抗原，如上所述使用 84仪器来执行Psl捕获结合测定。抗原是蛋白酶K处理的、从PAO1ΔwbpL/algD/pelA（O-抗原、褐藻酸盐以及Pel外泌多糖缺陷）纯化的富集的碳水化合物。将单独抗体结合至氨基丙基硅烷生物传感器，随后阻断，并且添加富集的碳水化合物抗原。在洗涤以便去除未结合抗原之后，评价未标记的mAb与所捕获抗原的结合。除了对照mAbR347以外，所有结合的抗体（Cam-003、Cam-004、Cam-005、WapR-001、WapR-002、WapR-003、WapR-007以及WapR-016）都能够捕获与Cam-003、WapR-001、WapR-002、WapR-003以及WapR-016中的每一种反应的抗原（图3K）。对于Cam-004、Cam-005以及WapR-007观察到与所捕获的Psl的最小反应性，即便所有三种这些抗体都捕获足够Psl来有效地与Cam-003、WapR-001、WapR-002、WapR-003以及WapR-016反应（图3K）。这些结果表明通过表型筛选得到的不依赖于血清型地结合铜绿假单胞菌的所有mAb均靶向与Psl外泌多糖相关联的表位。
实例4：抗Psl mAb阻断铜绿假单胞菌附着至所培养的上皮细胞
此实例示出抗Psl抗体阻断铜绿假单胞菌与上皮细胞缔合。将抗Psl抗体添加至在不透明96孔板（能肯公司的Nunclonδ）中生长的A549细胞（腺癌人肺泡基底上皮细胞系）的汇合单层。在10的MOI下添加对数期发光铜绿假单胞菌PAO1菌株（PAO1.lux）。将PAO1.lux与A549细胞在37℃下孵育1小时之后，将A549细胞洗涤，随后添加LB+0.5%葡萄糖。在37℃下短暂孵育之后，将细菌量化，如在实例2描述的OPK测定中执行。来自不具有A549细胞的孔的测量结果用于校正非特异性结合。图4示出除了Cam-005和WapR-007以外，所有抗体均以剂量依赖性方式来减少PAO1.lux与A549细胞的缔合。在OPK测定中执行最好的mAb，WapR-004以及Cam-003（参见图2A-B，以及实例2）在抑制铜绿假单胞菌细胞附着至A549肺上皮细胞方面也是活性最大，与阴性对照相比，提供多达约80%的减少。WapR-016是第三种活性最大的抗体，示出与WapR-004和Cam-003相类似的抑制活性，但是是在高10倍的抗体浓度下。
图5：体内传代的铜绿假单胞菌菌株保持/增加Psl的表达
为了测试是否维持Psl的体内表达，腹膜内向小鼠注射铜绿假单胞菌分离物，随后在感染后四小时，通过腹腔灌洗来收集细菌。Psl的存在使用对照抗体和Cam-003通过流式细胞术来分析，因为抗体结合的条件更严格并且允许针对对于Psl表达呈阳性或阴性的细胞进行量化。对于离体结合，从过夜TSA板来制备细菌接种物（0.1ml）并且腹膜内递送至BALB/c小鼠。激发之后4小时，将细菌收集，将RBC溶解、超声处理并且重新悬浮于补充有0.1%吐温20和1%BSA的PBS之中。将样品染色并且分析，如先前在实例1中所述。图5展示在用三种野生型铜绿假单胞菌菌株腹腔灌洗之后收集的细菌显示出强Cam-003染色，这种情况与对数期培养的细菌是可比较的（比较图5A与5C）。当与接种物相比较时，体内传代的野生型细菌展现出增强的染色（比较图5B与5C）。在接种物内，Psl未针对菌株6077检测到并且针对菌株PAO1（O5）以及6206（O11-细胞毒性）最低限度地检测到。相对于接种物，Cam-003与细菌的结合增加，这指示Psl表达在体内得以维持或增加。在体内传代之后，野生型菌株6077、PAO1以及6206表达Psl，然而具有pslA缺失的菌株PAO1（PAO1ΔpslA）不能与Cam-003反应。这些结果进一步强调Psl是单克隆抗体的靶标。
还在急性肺炎模型中评价了铜绿假单胞菌菌株PAO1和6206表面上的Psl表达/可及性水平。如上所述，将从过夜孵育的汇合板制备的细菌鼻内给予BALB/c小鼠。在感染4和24小时之后，细菌通过支气管肺泡灌洗从肺中回收。将样品染色并且分析，如先前在实例1中所述。感染后4小时观察到PAO1的强Cam-003染色，但是在此时间点，6206的Cam-003染色最少（图5D）。然而，对于菌株PAO1与6206两者，在感染后24小时观察到强Cam-003染色（图5E）。
总体上如以上所述，通过流式细胞术来评估铜绿假单胞菌特异性抗体（Cam-003、Cam-004以及Cam-005）与来自以下独特铜绿假单胞菌血清型的代表性菌株的结合：PAO1（O5）（图5F）、2135（O1）（图5G）、2531（O1）（图5H）、2410（O6）（图5I）、2764（O11）（图5J）、2757（O11）（图5K）、33356（O9）（图5L）、33348（O1）（图5M）、3039（NT）（图5N）、3061（NT）（图5O）、3064（NT）（图5P）、19660（NT）（图5Q）、9882-80（O11）（图5R）、6073（O11）（图5S）、6077（O11）（图5T）、以及6206（O11）（图5U）。
图6：在铜绿假单胞菌急性肺炎模型中用抗Psl单克隆抗体Cam-003和WapR-004处理的动物的存活率
在每个模型中，抗体或PBS在感染之前24小时给予。铜绿假单胞菌急性肺炎、角膜炎以及热损伤感染模型如（迪干多梅里科（DiGiandomenico）·A等人，美国国家科学院院刊（Proc Natl Acad Sci U S A）104,4624-4629(2007)）所描述地、加以修改来执行。在急性肺炎模型中，将BALB/c小鼠（杰克逊实验室（The Jackson Laboratory））用悬浮于0.05ml接种物中的铜绿假单胞菌菌株来感染。在热损伤模型中，CF-1小鼠（查理斯河（Charles River））受到用加热至92℃的金属烙铁（brand）持续10秒产生的10%全身表面积烧伤。将动物用指示剂量的铜绿假单胞菌菌株6077来皮下感染。对于器官负荷实验，在小鼠体内诱导急性肺炎，随后在感染后24小时收集肺、脾以及肾脏以便确定CFU。
在急性致死肺炎模型中，针对代表与临床疾病相关联的最频繁血清型的铜绿假单胞菌菌株来评估单克隆抗体Cam-003和WapR-004。图6A和6C示出当与对照相比较时，用菌株PAO1和6294感染的Cam-003处理的小鼠的显著浓度依赖性存活率。图6B和6D示出45和15mg/kg的Cam-003提供抗33356和细胞毒性菌株607激发的完全保护，而在5mg/kg的33356和6077下相应地观察到80%和90%的存活率。图6E和6F示出在菌株6077（O11）（8×105CFU）（图6E），或6077（011）（6×105CFU）（图6F）的急性肺炎模型中，WapR-004处理的小鼠的显著浓度依赖性存活率。图6G示出在120小时，Cam-003提供用菌株PAO1感染之后的100%存活率。对于在PAO1急性肺炎研究中用作阴性对照的Psl突变菌株PAO1ΔpslA未观察到增加的存活率（图6G），证实针对Psl表达缺陷菌株的Cam-003活性缺乏。
接着检查Cam-003和WapR-004减少肺中的铜绿假单胞菌器官负荷和扩散至远端器官的能力，并且稍后动物用不同浓度的WapR-004、Cam-003或对照抗体在若干不同浓度下来进行处理。针对所测试的所有四个菌株，Cam-003有效减少铜绿假单胞菌肺负荷。Cam-003最有效地抵抗高度致病性细胞毒性菌株6077，其中低剂量与较高剂量一样有效（图7D）。在PAO1（图7A）、6294（图7C）以及6077（图7D）感染的小鼠中，Cam-003在减少传播至脾以及肾脏方面是显著效果的，而在33356感染的小鼠中，未观察到传播至这些器官（图7B）。图7E和7F示出类似地，在用6294（O6）和6206（O11）诱导急性肺炎之后，WapR-004可以减少器官负荷。确切地说，在受感染小鼠中，WapR-004可有效减少铜绿假单胞菌传播至脾和肾脏。
图7：在铜绿假单胞菌角膜感染模型中用抗Psl单克隆抗体Cam-003和WapR-004处理的动物的存活率
随后在强调病原体附着至并且定殖在受损组织处的能力的铜绿假单胞菌角膜感染模型中评估Cam-003和WapR-004的功效。图8A-D和图8F-G示出与在阴性对照处理的动物中所观察到的相比，接受Cam-003和WapR-004的小鼠有显著较小的病状，并且减少了总眼睛匀浆中的细菌计数。图8E示出在热损伤模型中测试时，Cam-003也是有效的，在与抗体处理的对照相比较时，在15和5mg/kg下提供显著的保护。
实例8：Cam-003Fc突变型抗体Cam-003-TM具有降低的OPK和体内功效，但是维持抗细胞附着活性。
考虑到双重作用机制的潜力，产生Cam-003Fc突变体Cam-003-TM，该突变体在Fc域中具有减少其与Fcγ受体的相互作用的突变（奥加尼西安（Oganesyan）·V等人，晶体学报D部分：生物晶体（Acta Crystallogr D BiolCrystallogr）64,700-704(2008)），以便鉴别保护是与抗细胞附着还是与OPK活性更大相关。铜绿假单胞菌突变体是基于施魏策尔（Schweizer）描述的等位基因替换策略来构建（施魏策尔·H·P，《分子微生物学杂志》6,1195-1204(1992)；施魏策尔·H·D，《生物技术》15,831-834(1993)）。载体从大肠杆菌菌株S17.1动员至铜绿假单胞菌菌株PAO1中；重组体如（黄（Hoang）·T·T等人，《基因》212,77-86(1998)）所描述的来分离。基因缺失通过PCR来证实。铜绿假单胞菌突变体与具有野生型基因的基于pUCP30T的构建体互补。图9A示出与Cam-003相比，Cam-003-TM展现出OPK活性的4倍降低（EC50相应地为0.06和0.24），但是在细胞附着测定中同样有效（图9B）。图9C示出Cam-003-TM抵抗肺炎的有效性也较小，表明最佳OPK活性是最佳保护所必需的。OPK和细胞附着测定相应地如实例2和4中先前所述来执行。当在小鼠急性肺炎模型中测试时，在6077的低感染性接种物（2.4×105CFU）的情况下，Cam-003-TM在效力方面与Cam-003类似（图9D）。然而，在进一步滴定抗体剂量之后用更大的感染性接种物（1.07×106）来激发揭示Cam-003活性优于Cam-003-TM，表明OPK活性显著有助于最佳体内保护（图9E）。
实例9：抗Psl抗体的表位作图和相对亲和力
表位作图通过竞争ELISA来执行并且使用流动系统以得自铜绿假单胞菌菌株PAO1的过夜培养物的上清液的Psl来证实。对于竞争ELISA，将抗体使用EZ-Link磺基-NHS-生物素和生物素化试剂盒（赛默飞世尔（ThermoScientific））来生物素化。将抗原涂布的板用与未标记抗体共孵育的EC50的生物素化抗体来处理。在与HRP-轭合的链霉抗生物素蛋白（赛默飞世尔）一起孵育之后，将板如上所述来显影。抗Psl mAb之间的竞争实验确定了抗体靶向至少三个独特表位，被称为第1类、第2类以及第3类抗体（图10A）。第1类和第2类抗体不竞争结合，然而第3类抗体WapR-016部分地抑制第1类和第2类抗体的结合。
抗体亲和力通过结合测定使用得自过夜PAO1培养物的上清液的Psl来确定。抗体KD通过将每种抗体七个浓度的结合动力学取平均值来确定。亲和力测量通过384仪器使用384倾斜孔板来进行。来自过夜PAO1培养物的上清液±pslA基因用作Psl来源。将样品负载至氨基丙基硅烷（AminoPropylSilane）（在PBS中加以水合）传感器上并且阻断，随后在若干浓度下测量抗Psl mAb结合和至PBS+1%BSA中的解离。所有程序如（王（Wang）·X等人，《免疫学方法杂志》（J Immunol Methods）362,151-160）所描述来执行。缔合和解离原始ΔnM数据使用GraphPad Prism来进行曲线拟合。图10A示出以上表征的抗Psl抗体的相对结合亲和力。第2类抗体在所有抗Psl抗体中具有最高亲和力。图10A还示出细胞附着和OPK数据实验的总结。图10B示出Wap-004RAD（W4RAD）突变体连同如实例1所描述来制备的其他W4突变体的相对结合亲和力和OPK EC50值。
实例10：通过FACS来评估多粘菌素B（PMB）-mAb轭合物与铜绿假单胞菌PAO1细胞的结合
在此实例中，对与能够介导细菌清除的调理单克隆抗体（mAb）轭合的PMB进行评估以便确定轭合物是否将改进和/或扩大mAb功能性，同时还降低PMB的毒性。CAM-003，在体内介导有效调理吞噬杀伤（OPK）活性和保护性的、靶向铜绿假单胞菌Psl表面外泌多糖的一种mAb，被选定用于进行轭合物评估。
这个实例评估了不同多粘菌素B（PMB）-mAb轭合物与铜绿假单胞菌PAO1细胞的结合。使用两步定点轭合方法（图12），将多粘菌素B（PMB）轭合至Cam-003和A7（hIgG1对照）mAb变异体，这些变异体具有单一或两个半胱氨酸工程化至Fc区之中。Cam-003和A7mAb Fc变异体如所描述地使用标准方案来制备（迪马西（Dimasi）·N等人，《分子生物学杂志》393(3):672-92(2009)）。异双功能SM(PEG)12连接子（皮尔斯公司）最初在被确定有利于单一连接子轭合的条件下经由接头中的NHS基团来轭合至PMB中的伯胺。将硫酸多粘菌素B（西格玛公司（Sigma））以2mg/ml溶解于PBS pH7.2中并且以4:1PMB:接头比率与SM(PEG)12接头反应。反应在室温下进行30min并且通过50mM甘氨酸来停止。SM(PEG)12接头轭合至PMB的效率是近似25%。然后，使PMB-PEG12的粗制剂与脱保护的Fc半胱氨酸mAb变异体反应并且经由PEG12接头中的马来酸二胺来轭合（参见例如WO2011/005481和WO2009/092011）。PMB-mAb轭合物通过广泛渗析来纯化。轭合物最初用四次缓冲液交换来渗析于具有0.7%的CHAPS的3.3×PBS pH7.2中，随后用额外四次缓冲液交换来渗析于1×PBS pH7.2中。轭合效率和样品中的游离PMB接头含量通过UPLC和质谱法来确定。
CAM-003对于铜绿假单胞菌Psl表面外泌多糖具有特异性并且在多个体内模型中介导有效OPK活性和保护性。图13A示出Cam-003和A7Fc区突变残基。SM（A339C）、DM1（T289C/A339C）、DM2（A339C/S442C）。PMB-mAb变异体的轭合效率是通过纯化的轭合物中的重链的质谱法分析来确定。（参见例如WO2011/005481和WO2009/092011）。总体轭合效率是75%-85%。相对于轭合与游离PMB接头，构建体的纯度>95%。图13B示出PMB-Cam-003和PMB-A7轭合物中的PMB的平均数量（双重突变体2（DM2）>双重突变体1（DM1）>单一突变体（SM））。与Cam-003轭合物相比，A7轭合物展现出更大轭合效率。纯化制剂中的游离PMB的污染被确定为是可以忽略的。通过FACS来评估PMB-Cam-003和PMB-A7轭合物与铜绿假单胞菌PAO1细胞的结合。R347在所有实验中用作阴性对照。将样品染色并且分析，如先前在实例1中所述。与未轭合或模拟品-轭合的Cam-003相比，Cam-003轭合物在结合方面未观察到显著差异（图14A）。A7对照轭合物的结合与每个轭合物的PMB分子的数量成比例（图14B）。此分析指示PMB与Cam-003的轭合不显著影响全细胞结合并且轭合的PMB可介导直接结合至细胞，大概是通过结合LPS来进行。
实例11：PMB-mAb轭合物促进铜绿假单胞菌的OPK的评估
此实例描述评估PMB-mAb轭合物促进铜绿假单胞菌的OPK的能力的两个系列的实验。在第一批实验（图15A-B）中，轭合物介导的通过人HL-60嗜中性粒细胞细胞系在存在兔补体的情况下实现的OPK活性使用表达细菌荧光素酶的铜绿假单胞菌菌株来评估，如实例2所描述。R347在这些实验中用作阴性对照。CAM-003轭合物保持有效OPK活性，但是这种活性随着每个轭合物的PMB数量增加而降低（SM>DM1>DM2）（图15A）。针对不表达Psl靶标的ΔpslA铜绿假单胞菌菌株，CAM-003轭合物未展现出OPK活性，这指示杀伤需要mAb介导的结合（图15B）。第在二系列实验中，在孵育2h之后，发光相对于缺乏mAb的对照的减少用于确定杀伤%。图18A示出CAM-003轭合物保持OPK活性，但是这种活性随着每个轭合物的PMB数量增加而降低，特别是在DM和TM构建体中（WT>SM>DM>TM）。CAM-003轭合物未展现出针对PAO1ΔpslA菌株的OPK活性，所述菌株不表达Psl靶标（未展示）。图18B示出A7-PMB轭合物不介导OPK，这指示杀伤需要mAb介导的结合。
实例12：PMB-mAb轭合物中和铜绿假单胞菌LPS
铜绿假单胞菌O10LPS活性的中和是通过以下来评估：将PMB-mAb轭合物或PMB单独与LPS一起预先孵育1h，随后刺激鼠类RAW264.7巨噬细胞并且将TNF分泌量化。LPS的最终浓度是2ng/ml。刺激6h之后，TNF通过基于FACS的BDTM流式细胞术珠粒阵列（Cytometric Bead Array；CBA）方法（碧迪生物科学）来量化。LPS中和是通过TNF产生相对于LPS最大应答的减少来测量。PMB-Cam-003轭合物，而非模拟品-轭合的野生型Cam-003展现出LPS中和。中和效率与轭合物中的PMB平均数量成正比例（DM2>DM1>SM)（图16A）。PMB-A7轭合物，而非模拟品-轭合的野生型A7展现出LPS中和（图16B）。与CAM-003轭合物相比，A7轭合物展现出更好中和。与CAM-003轭合物相比，A7轭合物展现出更好的中和，这可能是由于通过这些分子实现的轭合效率更大。需要大约2个轭合的PMB分子/mAb来中和由一个游离PMB分子所中和的LPS的量。
实例13：在鼠类模型中评估Cam-003-PMB定点轭合物
Cam-003-PMB轭合物的功效是在两种类型的鼠类模型中予以评估：1)内毒素血症（LPS）激发模型，用以确定轭合物在体内中和和/或使LPS解毒的能力；和2)铜绿假单胞菌败血症模型，用于评估除了抗体介导的细菌清除以外，Cam-003-PMB轭合物是否通过PMB介导的LPS中和和/或清除而相对于抗体单独来实现针对细菌激发的改进的保护。其他铜绿假单胞菌激发模型也可以用于测试Cam-003-PMB轭合物的功效（参见下文）。
A.内毒素血症模型
充分确立了PMB可以在体内结合并且中和LPS，并且介导针对LPS激发的保护（莫里森（Morrison）·D·C等人，《免疫化学杂志》13(10):813-818(1976)；德莱比克（Drabick）·J·J等人，《抗微生物制剂与化学疗法》42(3):583-588(1998)）。在内毒素血症模型中，将评估Cam-003-PMB轭合物保护动物免受LPS激发影响的能力。来自革兰氏阴性细菌（包括铜绿假单胞菌和大肠杆菌）的纯化LPS用于以所确立的最小致死剂量（LD100）来激发小鼠。因为小鼠对于LPS具有相对抗性，因此还可以共同给予D-半乳糖胺，因为它极大地将小鼠对于LPS的敏感性增加至大约人的敏感性（加拉诺斯（Galanos）·C等人，《美国国家科学院院刊》76(11):5939-5943(1979)）。这类模型已经广泛地用于LPS中和分子的临床前功效评估，这些中和分子包括抗体和多粘菌素-蛋白质轭合物（贝莱特（Bailat）·S等人，《感染与免疫》（Infect Immun.）65(2):811-814(1997)；博肯梅尔（Birkenmeier）·G等人，《药理学与实验治疗学杂志》（J Pharmacol ExpTher）318(2):762-771(2006)；德莱比克·J·J等人，《抗微生物制剂与化学疗法》42(3):583-588(1998)）。Cam-003-PMB轭合物、对照轭合物以及未轭合的Cam-003可以治疗性地或预防性地给予，并且可评估它们保护动物以免受LPS激发影响的能力。由PMB轭合物介导的保护程度可以与在血清或血浆中测量的促炎症细胞因子和趋化因子（包括TNF、KC以及IL-6）的水平相关联。
B.铜绿假单胞菌激发模型
铜绿假单胞菌感染的若干鼠类模型可以用于评估Cam-003-PMB轭合物介导保护的能力。铜绿假单胞菌可以按确定的LD100剂量来腹膜内（败血症模型）、静脉内（菌血症模型）或鼻内（肺炎模型）给予小鼠。这些模型以前已经用于被动或主动疫苗的临床前功效研究（法兰克（Frank）·DW等人，《传染病杂志》（J Infect Dis.）186(1):64-73(2002)；沙查（Secher）·T等人，《抗菌化学疗法杂志》66(5):1100-1109(2011)；宫崎（Miyazaki）·S等人，《医学微生物学杂志》（J Med Microbiol.）43(3):169-175(1995)；邓恩（Dunn）·DL等人，《外科》（Surgery）96(2):440-446(1984)）。
如同在内毒素血症模型中一样，在细菌激发之前还可能需要用D-半乳糖胺将小鼠敏化以便克服其对于LPS毒性的先天抗性并且能够评估LPS中和和/或清除对于PMB轭合物的体内功效的影响。已经证明D-半乳糖胺降低革兰氏阴性细菌的LD100，这可能是通过增加对于感染期间放出（shed）的LPS的敏感性来实现的（巴克林（Bucklin）·S·E等人，《传染病杂志》172(6):1519-27(1995)）。
Cam-003-PMB轭合物、对照轭合物以及未轭合的Cam-003可以治疗性或预防性给予。CAM-003轭合物通过经由轭合的PMB部分来中和和/或清除细菌LPS而实现超过Cam-003单独的增加的保护的能力可以在存活研究中确定。Cam-003-PMB轭合物在介导的细菌清除方面的功效还可以在感染之后将血清和器官（包括脾、肾脏以及肺）中的铜绿假单胞菌细菌量化来评估。还可以将血清或血浆LPS水平量化以便评估Cam-003-PMB轭合物的细菌清除以及LPS清除和/或中和的程度，并且将其与未轭合的Cam-003以及对照抗体-PMB轭合物的那些值相比较。
C.内毒素血症模型数据
具体地说，在用铜绿假单胞菌PAO10LPS（西格玛）以及D-半乳糖胺激发之前6h，将C57Bl/6小鼠（每组10只）腹膜内给予mAb或PMB-mAb轭合物。PMB对照在激发之前2h按0.2mg/kg腹膜内给予并且典型地提供80%-100%保护。给予未轭合的CAM-003对照的小鼠全部在18h内死亡。图19A和B示出在45mg/kg下，Cam-003和A7的DM和TM轭合物提供90%-100%保护，而SM轭合物不具有保护性。
TM轭合物以45、15以及5mg/kg来给予。如图20A以及B中所示，与A7-TM-PMB相比，使用CAM-003-TM-PMB时保护活性损失更快，A7-TM-PMB在5mg/kg下保持80%保护。这些差异表明mAb的独特结构特征可以影响轭合的PMB的LPS中和活性，如先前在体外所见。
D.败血症模型数据
在用LD80-100剂量的铜绿假单胞菌菌株6294（4E7CFU）腹膜内激发之前6h，向C57Bl/6小鼠（每组10只）腹膜内给予mAb或PMB-mAb轭合物（10、1以及0.1mg/kg）。在此分析中，将来自两个研究的数据组合。监测存活72h。两个研究的组合结果显示在图21A-C。给予A7或缓冲液的大多数对照小鼠在截至24h时死亡。未轭合的CAM-003示出50%-90%保护。保护活性显现出与剂量逆相关。在10mg/kg的高剂量下，CAM-003-PMB轭合物赋予比未轭合的mAb更好的保护，表明在感染过程中放出的LPS的中和有助于存活。在10mg/kg下，A7-DM-PMB对照轭合物展现出50%保护活性，表明LPS中和可提供存活益处。相反地，在0.1mg/kg的低剂量下，轭合物比CAM-003的保护性更少，并且保护活性与轭合物的体外OPK活性相关（WT>SM>DM>TM）。总之，这些结果指示轭合的PMB可将增加的保护活性赋予调理抗体，这是通过介导LPS的中和并且补充其细菌清除功能。
使用SM-PEG12异双功能接头来实现PMB与工程化Fc半胱氨酸残基的高轭合效率。在体外以及体内评估CAM-003（靶向铜绿假单胞菌Psl外泌多糖的一种有效调理和保护性mAb）的一系列定点PMB轭合物。CAM-003-PMB轭合物保持体外OPK活性。然而，OPK活性受到每个mAb的平均PMB数量增加的影响。在小鼠铜绿假单胞菌内毒素血症模型中，DM和TM PMB-mAb轭合物赋予保护，这证明PMB的LPS中和功能被赋予mAb。在铜绿假单胞菌败血症模型中，与未轭合的CAM-003mAb相比，CAM-003-PMB轭合物在高剂量（10mg/kg）下示出更大保护活性，并且在低剂量（0.1mg/kg）下示出降低的活性。这些数据表明轭合的PMB可以补充由调理CAM-003mAb介导的细菌清除并且通过LPS中和来改善保护。在败血症模型中，CAM-003-PMB轭合物的保护活性的改善在较低剂量下丧失，其中轭合的PMB水平太低以致于不能中和LPS，并且主要保护模式可能是mAb介导的细菌清除。CAM-003-PMB轭合物在较低剂量下的保护活性的丧失与由于PMB轭合所引起的体外OPK活性减少是一致的。这些研究示出在全身铜绿假单胞菌感染模型中，调理mAb上的轭合的PMB可赋予LPS中和活性并且产生增加的保护活性。减少对于OPK活性的负面影响的轭合位点的优化可进一步改善PMB轭合物相对于未轭合的调理mAb的保护活性。
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本披露在范围不受所描述的具体实施例的限制，这些实施例意欲作为本披露的单独方面的简单说明，并且在功能上等效的任何组合物或方法均处于本披露的范围内。事实上，除了在此示出并且描述的那些，本披露的各种改进从前述说明书和附图对于本领域技术人员来说将变得清楚。这类改进旨在落入附加权利要求书的范围内。
本说明书提到的所有公开和专利申请均通过引用结合在此，引用程度就如同每个单独公开或专利申请特定地并且单独地指示通过引用结合在此一般。

Claims (85)

1.一种分离的结合分子或其抗原结合片段，特异性结合至假单胞菌Psl，其中该结合分子(a)可以抑制铜绿假单胞菌附着至上皮细胞、(b)可以促进铜绿假单胞菌的调理吞噬杀伤（OPK）、或(c)可以抑制铜绿假单胞菌附着至上皮细胞并且可以促进铜绿假单胞菌的OPK。
2.如权利要求1所述的结合分子或其片段，包括一种抗体或其抗原结合片段。
3.一种分离的结合分子或其抗原结合片段，特异性结合至与包含WapR-004、Cam-003、Cam-004、或Cam-005的重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）的一种抗体或其抗原结合片段所结合的相同的假单胞菌Psl表位。
4.一种分离的结合分子或其抗原结合片段，特异性结合至假单胞菌Psl，并且竞争性抑制包含WapR-004、Cam-003、Cam-004、或Cam-005的VH和VL的一种抗体或其抗原结合片段与假单胞菌Psl的结合。
5.如权利要求3或权利要求4所述的结合分子或其片段，其中WapR-4的VH和VL对应地包含SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12，Cam-003的VH和VL对应地包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，Cam-004的VH和VL对应地包含SEQID NO:3和SEQ ID NO:2，并且Cam-005的VH和VL对应地包含SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:2。
6.一种分离的结合分子或其抗原结合片段，特异性结合至与包含WapR-001、WapR-002、或WapR-003的VH和VL区的一种抗体或其抗原结合片段所结合的相同的假单胞菌Psl表位。
7.一种分离的结合分子或其抗原结合片段，特异性结合至假单胞菌Psl，并且竞争性抑制包含WapR-001、WapR-002、或WapR-003的VH和VL的一种抗体或其抗原结合片段与假单胞菌Psl的结合。
8.如权利要求6或权利要求7所述的结合分子或其片段，其中WapR-001的VH和VL对应地包含SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，WapR-002的VH和VL对应地包含SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8，并且WapR-003的VH和VL对应地包含SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10。
9.一种分离的结合分子或其抗原结合片段，特异性结合至与包含WapR-016的VH和VL区的一种抗体或其抗原结合片段所结合的相同的假单胞菌Psl表位。
10.一种分离的结合分子或其抗原结合片段，特异性结合至假单胞菌Psl，并且竞争性抑制包含WapR-016的VH和VL的一种抗体或其抗原结合片段与假单胞菌Psl的结合。
11.如权利要求9或权利要求10所述的结合分子或其片段，其中WapR-016的VH和VL对应地包含SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16。
12.一种分离的结合分子或其抗原结合片段，特异性结合至假单胞菌Psl，并且包含一种抗体VH，其中该VH包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:13、或SEQ ID NO:15至少90%一致的一个氨基酸序列。
13.如权利要求12所述的结合分子或其片段，其中该VH包含SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、或SEQ ID NO:15。
14.一种分离的结合分子或其抗原结合片段，特异性结合至假单胞菌Psl，并且包含一种抗体VL，其中该VL包含与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、以及SEQID NO:16至少90%一致的一个氨基酸序列。
15.如权利要求14所述的结合分子或其片段，其中该VL包含SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:14、以及SEQ ID NO:16。
16.如权利要求3至15中任一项所述的结合分子或其片段，包括一种抗体或其抗原结合片段。
17.一种分离的抗体或其抗原结合片段，特异性结合至假单胞菌Psl，并且包含与以下各项至少90%一致的VH和VL氨基酸序列：
(a)对应地为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，
(b)对应地为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:2，
(c)对应地为SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:2，
(d)对应地为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，
(e)对应地为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8，
(f)对应地为SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10，
(g)对应地为SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12，
(h)对应地为SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14；或
(i)对应地为SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16。
18.如权利要求17所述的抗体或其片段，包含以下VH和VL氨基酸序列：
(a)对应地为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，
(b)对应地为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:2，
(c)对应地为SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:2，
(d)对应地为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，
(e)对应地为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8，
(f)对应地为SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10，
(g)对应地为SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12，
(h)对应地为SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14；或
(i)对应地为SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16。
19.一种分离的结合分子或其抗原结合片段，特异性结合至假单胞菌Psl，并且包含一种抗体VH，其中该VH包含与以下各项一致的或除了四个、三个、两个或一个氨基酸取代以外与以下各项一致的一个VH互补决定区-1（VHCDR1）氨基酸序列：SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:26、SEQID NO:29、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:53、或SEQ ID NO:59。
20.一种分离的结合分子或其抗原结合片段，特异性结合至假单胞菌Psl，并且包含一种抗体VH，其中该VH包含与以下各项一致或除了四个、三个、两个或一个氨基酸取代以外与以下各项一致的一个VH互补决定区-2（VHCDR2）氨基酸序列：SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:54、或SEQ IDNO:60。
21.一种分离的结合分子或其抗原结合片段，特异性结合至假单胞菌Psl，并且包含一种抗体VH，其中该VH包含与以下各项一致的或除了四个、三个、两个或一个氨基酸取代以外与以下各项一致的一个VH互补决定区-3（VHCDR3）氨基酸序列：SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:28、SEQID NO:31、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:55、或SEQ ID NO:61。
22.一种分离的结合分子或其抗原结合片段，特异性结合至假单胞菌Psl，并且包含一种抗体VL，其中该VL包含与以下各项一致的或除了四个、三个、两个或一个氨基酸取代以外与以下各项一致的一个VL互补决定区-1（VLCDR1）氨基酸序列：SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:56、或SEQ ID NO:62。
23.一种分离的结合分子或其抗原结合片段，特异性结合至假单胞菌Psl，并且包含一种抗体VL，其中该VL包含与以下各项一致的或除了四个、三个、两个或一个氨基酸取代以外与以下各项一致的一个VL互补决定区-2（VLCDR2）氨基酸序列：SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:57、或SEQ ID NO:63。
24.一种分离的结合分子或其抗原结合片段，特异性结合至假单胞菌Psl，并且包含一种抗体VL，其中该VL包含与以下各项一致的或除了四个、三个、两个或一个氨基酸取代以外与以下各项一致的一个VL互补决定区-3（VLCDR3）氨基酸序列：SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:58、或SEQ ID NO:64。
25.一种分离的结合分子或其抗原结合片段，特异性结合至假单胞菌Psl，并且包含一种抗体VH，其中该VH包含VHCDR1、VHCDR2、以及VHCDR3氨基酸序列，这些氨基酸序列对应地与以下各项一致，或除了这些VHCDR中的一个或多个中的四个、三个、两个或一个氨基酸取代以外与以下各项一致：SEQ IDNO:17、18以及19，SEQ ID NO:23、24以及25，SEQ ID NO:26、27以及28，SEQ ID NO:29、30以及31，SEQ ID NO:35、36以及37，SEQ ID NO:41、42以及43，SEQ ID NO:47、48以及49，SEQ ID NO:53、54以及55，或SEQ IDNO:59、60以及61。
26.一种分离的结合分子或其抗原结合片段，特异性结合至假单胞菌Psl，并且包含一种抗体VL，其中该VL包含VLCDR1、VLCDR2以及VLCDR3氨基酸序列，这些氨基酸序列对应地与以下各项一致，或除了这些VHCDR中的一个或多个中的四个、三个、两个或一个氨基酸取代以外与以下各项一致：SEQ IDNO:20、21以及22，SEQ ID NO:32、33以及34，SEQ ID NO:38、39以及40，SEQ ID NO:44、45以及46，SEQ ID NO:50、51以及52，SEQ ID NO:56、57以及58，或SEQ ID NO:62、63以及64。
27.如权利要求19至26中任一项所述的的结合分子，其中该结合分子或其片段包括一种抗体或其抗原结合片段。
28.一种分离的抗体或其抗原结合片段，特异性结合至假单胞菌Psl，并且包含一种VH和一种VL，该VH和VL所包含的VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2以及VLCDR3氨基酸序列对应地与以下各项一致或除了一个或多个CDR中的四个、三个、两个或一个氨基酸取代以外与以下各项一致：SEQ ID NO:17、18、19、20、21以及22，SEQ ID NO:23、24、25、20、21以及22，SEQ ID NO:26、27、28、20、21以及22，SEQ ID NO:29、30、31、32、33以及34，SEQ ID NO:35、36、37、38、39以及40，SEQ ID NO:41、42、43、44、45以及46，SEQ ID NO:47、48、49、50、51以及52，SEQ ID NO:53、54、55、56、57以及58，或SEQ ID NO:59、60、61、62、63以及64。
29.如权利要求2、16至18、27或28中任一项所述的抗体或其片段，(a)可以抑制铜绿假单胞菌附着至上皮细胞，(b)可以促进铜绿假单胞菌的OPK，或(c)可以抑制铜绿假单胞菌附着至上皮细胞并且可以促进铜绿假单胞菌的OPK。
30.如权利要求29所述的抗体或其片段，其中对铜绿假单胞菌附着至上皮细胞上的最大抑制是在约50μg/ml或更小、5.0μg/ml或更小、或约0.5μg/ml或更小的抗体浓度下实现。
31.如权利要求29所述的抗体或其片段，其中对铜绿假单胞菌附着至上皮细胞上的最大抑制是在从约30μg/ml至约0.3μg/ml范围内的抗体浓度下实现。
32.如权利要求29所述的抗体或其片段，其中OPK EC50小于约0.5μg/ml、小于约0.05μg/ml、或小于约0.005μg/ml。
33.如权利要求29所述的抗体或其片段，其中该OPK EC50在从约0.001μg/ml至约0.5μg/ml范围内。
34.如权利要求2、16至18、或27至33中任一项所述的抗体或其片段，以一定的亲和力来特异性结合至铜绿假单胞菌Psl，该亲和力的特征在于解离常数（KD）不大于5×10-2M、10-2M、5×10-3M、10-3M、5×10-4M、10-4M、5×10-5M、10-5M、5×10-6M、10-6M、5×10-7M、10-7M、5×10-8M、10-8M、5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10-12M、5×10-13M、10-13M、5×10-14M、10-14M、5×10-15M、或10-15M。
35.如权利要求2、16至18、或27至35中任一项所述的抗体或其片段，其中该亲和力的特征在于解离常数（KD）在约1×10-10至约1×10-6M范围内。
36.如权利要求2、16至18、或27至35中任一项所述的抗体或其片段，是人源化抗体或其片段。
37.如权利要求2、16至18、或27至35中任一项所述的抗体或其片段，是嵌合抗体或其片段。
38.如权利要求2、16至18、或27至35中任一项所述的抗体或其片段，是完全人抗体或其片段。
39.如权利要求2、16至18、或27至35中任一项所述的抗体或其片段，是一种Fab片段。
40.如权利要求2、16至18、或27至35中任一项所述的抗体或其片段，是一种Fab'片段。
41.如权利要求2、16至18、或27至35中任一项所述的抗体或其片段，是一种F(ab)2片段。
42.如权利要求2、16至18、或27至35中任一项所述的抗体或其片段，是一种单链Fv（scFv）片段。
43.如权利要求2、16至18、或27至41中任一项所述的抗体或其片段，包含选自下组的一个轻链恒定区，该组由以下各项组成：人κ恒定区和人λ恒定区。
44.如权利要求2、16至18、或27至41中任一项所述的抗体或其片段，包含一个重链恒定区或其片段。
45.如权利要求44所述的抗体或其片段，其中所述重链恒定区或其片段是人IgG1。
46.如权利要求2、16至18、或27至45中任一项所述的抗体或其片段，是单克隆抗体或其片段。
47.如权利要求18所述的抗体或其片段，包含具有氨基酸序列SEQ IDNO:11的一个VH和具有氨基酸序列SEQ ID NO:12的一个VL。
48.如权利要求47所述的抗体或其片段，进一步包含一个人κ轻链恒定区或其片段和一个人IgG1重链恒定区或其片段。
49.如权利要求47或权利要求48所述的抗体或其片段，以一定的亲和力来特异性结合至铜绿假单胞菌，该亲和力的特征在于KD为约1.18×10-7M，如通过结合测定所确定的。
50.如权利要求47至49中任一项所述的抗体或其片段，其中对附着至上皮细胞上的最大抑制是在约0.3μg/ml的抗体浓度下实现。
51.如权利要求47至50中任一项所述的抗体或其片段，其中OPK EC50小于约0.02μg/ml。
52.如权利要求18所述的抗体或其片段，包含具有氨基酸序列SEQ IDNO:1的一个VH和具有氨基酸序列SEQ ID NO:2的一个VL。
53.如权利要求52所述的抗体或其片段，进一步包含一种人λ轻链恒定区或其片段和一种人IgG1重链恒定区或其片段。
54.如权利要求51或权利要求52所述的抗体或其片段，以一定的亲和力来特异性结合至铜绿假单胞菌，该亲和力的特征在于KD为约1.44×10-7M的，如通过结合测定所确定的。
55.如权利要求51至54中任一项所述的抗体或其片段，其中对附着至上皮细胞上的最大抑制是在约1.0μg/ml的抗体浓度下实现。
56.如权利要求52至55中任一项所述的抗体或其片段，其中该OPK EC50小于约0.2μg/ml。
57.如权利要求2、16至18、或27至56中任一项所述的抗体或其片段，其中该抗体被轭合至一种试剂，该试剂选自下组，该组由以下各项组成：抗微生物剂、治疗剂、前药、肽、蛋白质、酶、脂质、生物应答调节剂、药剂、淋巴因子、异源抗体或其片段、可检测标记、聚乙二醇（PEG）、以及任何所述试剂中的两种或更多种的组合。
58.如权利要求57所述的抗体或其片段，其中所述可检测标记选自下组，该组由以下各项组成：酶、荧光标记、化学发光标记、生物发光标记、放射性标记、或任何所述可检测标记中的两种或更多种的组合。
59.一种组合物，包含如权利要求2、16至18、或27至58中任一项所述的抗体或其片段以及一种载体。
60.包含一种核酸的一种分离的多核苷酸，该核酸编码如权利要求3至13、16至21、25、或27至59中任一项所述的VH。
61.如权利要求60所述的多核苷酸，进一步包含编码如权利要求3至11、14至18、22至24、或26至59中任一项所述的VL的一种核酸，其中由该多核苷酸表达的一种结合分子或其抗原结合片段特异性结合至假单胞菌Psl。
62.如权利要求61所述的多核苷酸，编码包含VH和VL的一种scFv分子，该多核苷酸包含核苷酸序列SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ IDNO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、或SEQ ID NO:70。
63.包含一种核酸的一种分离的多核苷酸，该核酸编码如权利要求3至11、14至18、22至24、或26至59中任一项所述的VL。
64.如权利要求63所述的多核苷酸，进一步包含编码如权利要求3至13、16至21、25、或27至59中任一项所述的VH的一种核酸，其中由该多核苷酸表达的一种结合分子或其抗原结合片段特异性结合至假单胞菌Psl。
65.一种载体，包含如权利要求60所述的多核苷酸。
66.如权利要求65所述的载体，进一步包含与所述多核苷酸可操作地相关联的一个启动子。
67.一种载体，包含如权利要求63所述的多核苷酸。
68.如权利要求67所述的载体，进一步包含与所述多核苷酸可操作地相关联的一个启动子。
69.一种载体，包含如权利要求61、62或64中任一项所述的多核苷酸。
70.如权利要求69所述的载体，包含与所述多核苷酸可操作地相关联的一个或多个启动子，其中该载体可以在一种合适宿主细胞中表达特异性结合至假单胞菌Psl的一种结合分子。
71.一种宿主细胞，包含如权利要求60至64中任一项所述的多核苷酸或如权利要求65至70中任一项所述的载体。
72.一种产生特异性结合至假单胞菌Psl的一种结合分子或其抗原结合片段的方法，包括培养如权利要求71所述的宿主细胞，并且回收该结合分子或其片段。
73.一种特异性结合至假单胞菌Psl的结合分子或其抗原结合片段，通过如权利要求72所述的方法来产生。
74.如权利要求1至16、或19至27中任一项所述的结合分子或其片段，如权利要求2、16至18、或27至58中任一项所述的抗体或其片段，如权利要求59所述的组合物，如权利要求60至64中任一项所述的多核苷酸，如权利要求65至70中任一项所述的载体，或如权利要求71所述的宿主细胞，其中该假单胞菌物种是铜绿假单胞菌。
75.如权利要求74所述的结合分子或其片段、抗体或其片段、或组合物，结合至两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种不同铜绿假单胞菌血清型。
76.如权利要求74或权利要求75所述的结合分子或其片段、抗体或其片段、或组合物，结合至至少80%、至少85%、至少90%、或至少95%的从感染患者分离的铜绿假单胞菌菌株。
77.如权利要求76所述的结合分子或其片段、抗体或其片段、或组合物，其中这些铜绿假单胞菌菌株是从以下各项中的一种或多种中分离：肺、痰液、眼睛、脓汁、粪便、尿、窦、伤口、皮肤、血液、骨骼、或膝关节液。
78.一种在一位有需要的受试者中预防或治疗假单胞菌感染的方法，包括向该受试者给予一个有效量的如权利要求1至16、或19至27中任一项所述的结合分子或其片段，如权利要求2、16至18、或27至58中任一项所述的抗体或其片段，如权利要求59所述的组合物，如权利要求60至64中任一项所述的多核苷酸，如权利要求65至70中任一项所述的载体，或如权利要求71所述的宿主细胞。
79.如权利要求78所述的方法，其中该假单胞菌感染是一种铜绿假单胞菌感染。
80.如权利要求78或权利要求79所述的方法，其中该受试者是人。
81.如权利要求78至80中任一项所述的方法，其中该感染是眼部感染、肺感染、烧伤感染、伤口感染、皮肤感染、血液感染、骨骼感染、或所述感染中两种或更多种的组合。
82.如权利要求78至81中任一项所述的方法，其中该受试者患有急性肺炎、烧伤、角膜感染、囊性纤维化、或其组合。
83.一种阻断或预防铜绿假单胞菌附着至上皮细胞的方法，包括使上皮细胞与铜绿假单胞菌的一种混合物与以下各物相接触：如权利要求1至16、或19至27中任一项所述的结合分子或其片段，如权利要求2、16至18、或27至58中任一项所述的抗体或其片段，如权利要求59所述的组合物，如权利要求60至64中任一项所述的多核苷酸，如权利要求65至70中任一项所述的载体，或如权利要求71所述的宿主细胞。
84.一种增强铜绿假单胞菌的OPK的方法，包括使吞噬细胞与铜绿假单胞菌的一种混合物与以下各物相接触：如权利要求1至16、或19至27中任一项所述的结合分子或其片段，如权利要求2、16至18、或27至58中任一项所述的抗体或其片段，如权利要求59所述的组合物，如权利要求60至64中任一项所述的多核苷酸，如权利要求65至70中任一项所述的载体，或如权利要求71所述的宿主细胞。
85.如权利要求84所述的方法，其中这些吞噬细胞是分化的HL-60细胞或人多形核白细胞（PMN）。
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