ES2912267T3 - Métodos de tratamiento de enfermedades asociadas a S. aureus - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo antitoxina α (anti-AT) de S. aureus aislado para su uso en la reducción de la intensidad de una neumonía asociada a S. aureus en un sujeto mamífero inmunodeprimido, en el que la CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH, CDR1 de VL, CDR2 de VL y CDR3 de VL comprenden las secuencias de aminoácidos de los SEQ ID NO: 69, 70, 71, 1, 2 y 68.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos de tratamiento de enfermedades asociadas a S. aureus

Antecedentes de la invención

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos para prevenir y/o para tratar la bacteriemia y la septicemia asociadas a S. aureus, y a métodos para prevenir y/o para tratar la neumonía asociada a S. aureus en pacientes inmunodeprimidos que utilizan anticuerpos antitoxina a (anti-AT, del inglés "anti-alpha-toxin") de S. aureus.

Antecedentes de la técnica

Staphylococcus aureus (S. aureus) es una de las principales causas de mortalidad y de morbilidad en todo el mundo, que provoca una amplia gama de infecciones que van desde infecciones leves de la piel y los tejidos blandos hasta enfermedades invasivas graves tales como la endocarditis, la osteomielitis y la neumonía necrosante (Lowy F. D., N Engl J Med, 339(8): 520-32 (1998); Klevens et al., JAMA 298(15): 1763-71 (2007). S. aureus se clasifica comúnmente como resistente a la meticilina (MRSA) o sensible a la meticilina (MSSA). Varios informes han demostrado que infecciones por S. aureus provocan resultados graves independientemente del estado de resistencia (Fowler et al., Arch Intern Med. 163(17):2066-72 (2003); de Kraker et al., PLoS Med. Octubre; 8(10):e1001104 (2011).

Los antibióticos son el tratamiento habitual para tratar una enfermedad provocada por S. aureus. A pesar de la introducción de nuevos antibióticos contra S. aureus, la aparición de nuevos mecanismos de resistencia necesita nuevos enfoques para prevenir o tratar enfermedades provocadas por S. aureus. Antes de la era de los antibióticos, la administración pasiva de sueros inmunitarios a pacientes infectados se utilizó clínicamente para tratar infecciones bacterianas (Keller y Stiehm, Clin Microbiol Rev 13(4):602-14 (2000)). Hoy en día, se utilizan métodos similares para tratar algunas enfermedades bacterianas mediadas por toxinas (por ejemplo, el botulismo, la difteria y el tétanos) (Keller y Stiehm, Clin Microbiol Rev 13(4):602-14 (2000); Arnon et al., N. Engl. J. Med. 354: 462-471 (2006). Se ha demostrado que la toxina a (AT, del inglés "alpha toxin") de S. aureus es un determinante clave de la virulencia (entre muchos otros factores extracelulares) en varios modelos de enfermedades provocados por S. aureus (por ejemplo, dermonecrosis, neumonía, septicemia, endocarditis y mastitis) mediante la comparación de cepas de S. aureus deficientes para la expresión de AT con cepas originales isogénicas de tipo silvestre (Bramley et al., Infect Immun.

57(8):2489-94 (1989); Bayer et al., Infect. Immun. 65: 4652-4660 (1997); Kernodle et al., Infect. Immun. 65: 179-184 (1997); Bubeck Wardenburg et al., Infect Immun. 75(2): 1040-4 (2007); Bubeck Wardenburg et al., J Exp Med.

205(2):287-94 (2008); Kobayashi et al., J Infect Dis. 204(6):937-41 (2011)).

La AT es una toxina citolítica formadora de poros de 33 kDa producida por el 90 % de las cepas de S. aureus y se considera que es un factor de virulencia importante. Se secreta como monómero y se une al receptor específico ADAM-10 en las membranas de las células diana (Wilke y Bubeck Wardenburg, PNAS 107(30): 13473-8 (2010); Inoshima et al., Nat Med 17 (10): 1310-4 (2011). La AT se oligomeriza en un preporo heptamérico y sufre un cambio conformacional que da como resultado la formación de barriles p transmembrana y la posterior lisis celular (Bhakdi y Tranum-Jensen, 1991; Song et al., 1996). Las plaquetas, junto con las células epiteliales, endoteliales e inmunitarias (por ejemplo, linfocitos y macrófagos), son susceptibles a la lisis por la AT, lo que sugiere que la toxina tiene un impacto directo en el daño tisular y la evasión inmunitaria (Bhakdi y Tranum-Jensen, Microbiol Rev. 55(4):733-51 (1991); Ragle y Bubeck Wardenburg, Infect Immun. 77(7):2712-8 (2009); Tkaczyk et al., Clin Vaccine Immunol 19(3):377-85 (2012)). También se ha demostrado que a concentraciones sublíticas la AT ejerce efectos citotóxicos significativos (Grimminger et al., J Immunol. 159(4): 1909-16 (1997); Wilke y Bubeck Wardenburg, PNAS 107(30): 13473-8 (2010); Inoshima et al., Nat Med 17 (10): 1310-4 (2011)). La unión de la AT y la oligomerización en las membranas de los macrófagos activan el inflamosoma NLRP3 que, junto con otros patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP, del inglés "pathogenassociated molecular patterns") estafilocócicos, induce la secreción de IL-1p y promueve la muerte celular (Craven et al., PLoS One 4(10) (2009); Kebaier et al., J Infect Dis 205(5):807-17 (2012). El aumento de la expresión de citocinas proinflamatorias (por ejemplo, IL-1p) es un sello distintivo de la lesión pulmonar aguda (Goodman et al., Cytokine Growth Factor Rev. 14(6):523-35 (2003)).

La AT también activa la proteólisis mediada por ADAM-10 de E-cadherina presente en los contactos adhesivos célulacélula en concentraciones sublíticas, lo que conduce a una interrupción en la integridad del epitelio y contribuye al daño epitelial que se observa en la neumonía y en las infecciones de la piel y los tejidos blandos (Inoshima et al., Nat Med 17(10): 1310-4 (2011); Maretzky et al., PNAS 102(26):9182-7 (2005); Inoshima et al., J Invest Dermatol. 132(5): 1513-6 (2012). La AT ejerce sus efectos citotóxicos a través de actividades directas e indirectas para crear un entorno propicio para el crecimiento bacteriano y la enfermedad invasiva. En consecuencia, la inhibición dirigida de la AT podría prevenir o limitar una enfermedad asociada a S. aureus. Esta hipótesis se apoya en otros estudios que demuestran reducciones en la intensidad de enfermedades provocadas por S. aureus en modelos de infección murina después de la inmunización activa o pasiva dirigida contra la AT (Menzies y Kernodle, Infect Immun 64(5): 1839-41(1996); Bubeck Wardenburg et al., J Exp Med. 205(2):287-94 (2008); Ragle y Bubeck Wardenburg, Infect Immun.

77(7):2712-8 (2009); Kennedy et al., J Infect Dis. 202(7):1050-8 (2010); Tkaczyk et al., Clin Vaccine Immunol 19(3):377-85 (2012)).

Un anticuerpo anti-AT que tiene una región variante Fc y su anticuerpo original LC10 son AcM humanos anti-AT de alta afinidad (anteriormente divulgados en el documento WO2012/109205) y en Tkaczyk et al., Clinical and Vaccine Immunology, 19(3): 377 (2012).

La bacteriemia y el choque séptico representan la mayoría de las enfermedades invasivas provocadas por Staphylococcus aureus (Klevens, et al., JAMA, 298(15): 1763-71 (2007). Se ha propuesto que la AT es un factor de virulencia importante durante la septicemia provocado por S. aureus y es responsable del daño endotelial durante la septicemia (Powers, et al., J. Infect Dis. 206(3):352-6 (2012). La interacción de la AT con su receptor en las células endoteliales permite que la toxina medie el daño vascular mediante la lisis celular directa o la activación de la proteólisis mediada por ADAM-10 de las uniones estrechas endoteliales (Id.). Ambos mecanismos aumentarían la permeabilidad vascular, un sello distintivo de la septicemia bacteriana.

Si bien se ha demostrado que la inmunización pasiva con anticuerpos monoclonales anti-AT da como resultado un aumento significativo de la supervivencia en un modelo murino de neumonía estafilocócica como se describe en el documento WO 2012/109285, no se sabe si los anticuerpos anti-AT son eficaces para aumentar la supervivencia en mamíferos inmunodeprimidos que tienen enfermedades asociadas a S. aureus. Esta es una pieza clave para entender como individuos inmunodeprimidos, en particular, aquellos que padecen de neutrocitopenia, están en mayor riesgo de infecciones por S. aureus (Andrews y Sullivan, Clin Microbiol Rev. 16(4):597-621 (2003); Bouma et al., Br J Haematol.

151(4):312-26 (2010)).

En el presente documento se divulga, por primera vez, una demostración de que los anticuerpos anti-AT son eficaces en la profilaxis de la septicemia y en la neumonía inmunodeprimida.

Breve sumario de la invención

En el presente documento se divulgan métodos para prevenir o reducir la intensidad de la septicemia asociada a S. aureus en un sujeto mamífero que comprenden administrar al sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo aislado antitoxina a (anti-AT) de S. aureus o fragmento de unión a antígeno del mismo. También se divulgan métodos para reducir la carga bacteriana de S. aureus en el torrente sanguíneo o en el corazón de un sujeto mamífero que comprenden administrar al sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo aislado antitoxina a (anti-AT) de S. aureus o fragmento de unión a antígeno del mismo. También se divulgan métodos para reducir la aglutinación bacteriana de S. aureus y/o la formación de lesiones tromboembólicas en un sujeto mamífero que comprenden administrar al sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo aislado antitoxina a (anti-AT) de S. aureus o fragmento de unión al antígeno del mismo. También se divulgan métodos para prevenir o reducir la intensidad de la neumonía asociada a S. aureus en un sujeto mamífero inmunodeprimido, que comprenden administrar al sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo aislado antitoxina a (anti-AT) de S. aureus o fragmento de unión a antígeno del mismo. Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico).

En los diversos métodos descritos en el presente documento, la carga bacteriana de S. aureus en el torrente sanguíneo o en el corazón del sujeto se reduce de manera adecuada, y en realizaciones adicionales, se reduce la aglutinación bacteriana de S. aureus y/o la formación de lesiones tromboembólicas en el sujeto.

De manera adecuada, el sujeto mamífero en los diversos métodos descritos en el presente documento es un ser humano.

En los distintos métodos, el anticuerpo aislado anti-AT es un anticuerpo de longitud completa. En realizaciones adicionales, el anticuerpo comprende una región variante Fc.

En realizaciones de los diversos métodos descritos en el presente documento, el anticuerpo aislado se une de manera inmunoespecífica a un polipéptido de la toxina a de Staphylococcus aureus e incluye:

(a) una CDR1 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 69;

(b) una CDR2 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 70;

(c) una CDR3 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 71;

(d) una CDR1 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1;

(e) una CDR2 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; y

(f) una CDR3 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 68.

En realizaciones, la CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH, CDR1 de VL, CDR2 de VL y CDR3 de VL para su uso en los diversos métodos descritos en el presente documento comprenden las secuencias de aminoácidos de los SEQ ID NO: 69, 70, 71, 1, 2 y 68.

En realizaciones adicionales, el anticuerpo aislado comprende un dominio variable de cadena pesada que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 57 y (iii) comprende un dominio variable de cadena ligera que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58. De manera adecuada, el anticuerpo aislado comprende un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 57 y un dominio variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 58.

En realizaciones adicionales de los diversos métodos descritos en el presente documento, las VH y VL comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 57 y 58.

En aún otras realizaciones de los diversos métodos, el anticuerpo aislado comprende un anticuerpo anti-AT que tiene un dominio variante Fc, en donde el anticuerpo comprende un VH-IgG1-YTE correspondiente al SEQ ID NO: 80 y/o un VL-Kappa correspondiente al SEQ ID NO: 81.

Breves descripciones de los dibujos

FIGURA 1. La profilaxis con LC10 mejora la supervivencia en un modelo de exposición letal i.v. Se inmunizaron ratones (10 por grupo) de manera pasiva con LC10 (45 y 15 mg/kg) o con un control de isotipo (R347, 45 mg/kg) 24 h antes de la exposición i.v. con SF8300 (3 * 108 ufc). La supervivencia se controló a lo largo de 14 días. Los datos son representativos de 4 experimentos independientes. La significación estadística se evaluó con una prueba de orden logarítmico (Martel-Cox): *valor de p = 0,0005; **valor de p = 0,0043).

FIGURA 2. La profilaxis LC10 reduce la carga bacteriana en el corazón. Se inmunizaron ratones de manera pasiva con LC10 (45 y 15 mg/kg) o con un control de isotipo (R347, 45 mg/kg) 24 h antes de la exposición i.v. con SF8300 (2,98 * 108 ufc). Catorce horas después de la infección, se recogieron corazones de animales infectados y se procesaron para la enumeración de las UFC. El análisis estadístico se realizó con una prueba de la t de Student bilateral para datos independientes: *valor de p = 0,0028; **valor de p = 0,0082).

FIGURA 3. La profilaxis con LC10 reduce la bacteriemia estafilocócica. Se inmunizaron ratones de manera pasiva con LC10 (45 y 15 mg/kg) o con un control de isotipo (R34745 mg/kg) 24 h antes de la exposición i.v. a SF8300 (3 * 108 ufc). En varios puntos temporales después de la infección, se recogió la sangre mediante punción cardíaca y se colocó en placas para la enumeración de las UFC. El análisis estadístico se realizó con una prueba de la t de Student. Los datos se consideraron estadísticamente diferentes frente a R347 si *valor de p <0,05.

FIGURA 4. Recuentos totales y diferenciales de glóbulos blancos. A los ratones C57BL6/J se les administraron 6 dosis diferentes de CPM (mg/kg) en el día 0 y el día 3. Se tomaron muestras de sangre de 5 ratones por punto temporal por grupo los días 0, 1, 4 y 6. Se analizaron los recuentos de glóbulos blancos totales y diferenciales (neutrófilos, linfocitos) con un analizador de hematología automatizado Sysmex.

FIGURA 5. Valoración de la dosis bacteriana. Se expusieron i.n. cinco ratones inmunodeprimidos a 50 pl de suspensión bacteriana en fase logarítmica (dosis que varía de 1 * 107 a 2 * 108 UFC) 24 horas después de la segunda dosis de CPM (Día 4). Se observó la supervivencia de los animales durante un período de 7 días. FIGURA 6. LC10 aumenta la supervivencia en animales inmunodeprimidos. A los animales inyectados con CPM se les administró LC10 (45 o 15 mg/kg) o R347 (45 mg/kg) 24 h antes de la infección i.n. con 50 pl de una suspensión bacteriana SF8300 (5 * 107 UFC). La supervivencia de los animales se controló durante 5 días. La significación estadística se determinó utilizando la prueba de orden logarítmico y * indica la diferencia estadística en relación con los animales tratados con R347 (p <0,0001).

FIGURA 7. Recuentos totales y diferenciales de glóbulos blancos. Los ratones C57BL/6 recibieron 2 dosis de CPM (150 mg/kg y 100 mg/kg) los días -4 y -1, de manera respetuosa. Se recogieron muestras de sangre de 5 ratones en los días -4, -3, -1, 0, 2 y 3. Los recuentos de glóbulos blancos totales y diferenciales (neutrófilos, linfocitos) se determinaron con un analizador de hematología automatizado Sysmex.

Descripción detallada de la invención

Los términos "polipéptido", "péptido", "proteína", y "fragmento de proteína" se utilizan indistintamente en el presente documento para referirse a un polímero de restos de aminoácidos. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en donde uno o más restos de aminoácidos son un mimético químico artificial de un aminoácido correspondiente de origen natural, así como a polímeros de aminoácidos de origen natural y a polímeros de aminoácidos de origen no natural.

El término "aminoácido" se refiere a aminoácidos de origen natural y sintético, así como a análogos de aminoácidos y miméticos de aminoácidos que funcionan de una manera similar a los aminoácidos de origen natural.

Como se utiliza en el presente documento, "recombinante" incluye la referencia a una proteína producida utilizando células que no tienen, en su estado natural, una copia endógena del ADN capaz de expresar la proteína. Las células producen la proteína recombinante porque se han modificado de manera genética mediante la introducción de la secuencia de ácido nucleico aislada adecuada.

Como se utiliza en el presente documento, "anticuerpo" e "inmunoglobulina" se utilizan indistintamente en el sentido más amplio e incluyen anticuerpos monoclonales (por ejemplo, anticuerpos monoclonales de longitud completa o inalterados), anticuerpos policlonales, anticuerpos multivalentes, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos siempre que muestren la actividad biológica deseada) y fragmentos de unión a antígeno, como se describe en el presente documento. Los anticuerpos e inmunoglobulinas naturales son generalmente glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 daltons, compuestas de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H, del inglés "heavy") idénticas. Cada cadena ligera está unida a una cadena pesada mediante un enlace disulfuro covalente, mientras que el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera tiene también puentes disulfuro intracatenarios a espacios regulares. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (V^h) seguido de varios dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (V^l) y un dominio constante en su otro extremo. Los términos "constante" y "variable" se utilizan de manera funcional.

El dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que restos de aminoácidos particulares forman una interfaz entre los dominios variables de cadena ligera y cadena pesada (Clothia et al., J. Mol. Biol. 186, 651-66 (1985); Novotny y Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 4592-4596 (1985)). Cinco clases de inmunoglobulina humana se definen en función de su composición de cadena pesada, y se denominan IgG, IgM, IgA, IgG e IgD. Los anticuerpos de clase IgG y de clase IgA se dividen además en subclases, en concreto, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, e IgA1 e IgA2. Las cadenas pesadas en los anticuerpos IgG, IgA e IgD tienen tres dominios de región constante, que se denominan CH1, CH2 y CH3, y las cadenas pesadas en los anticuerpos IgM e IgE tienen cuatro dominios de región constante, CH1, CH2, CH3 y CH4. Por lo tanto, las cadenas pesadas tienen una región variable y tres o cuatro regiones constantes. Se revisan la estructura y la función de las inmunoglobulinas, por ejemplo, en Harlow et al., Eds., Antibodies: A Laboratory Manual, Capítulo 14, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (1988).

Las referencias a "V^h" o "VH" se refieren a la región variable de una cadena pesada de inmunoglobulina, incluyendo un Fv, scFv, dsFv o Fab.

Las referencias a "V^l" o "VL" se refieren a la región variable de una cadena ligera de inmunoglobulina, incluyendo un Fv, scFv, dsFv o Fab.

La expresión "fragmento de unión a antígeno" se refiere a una porción de un anticuerpo inalterado y se refiere a las regiones variables determinantes antigénicas de un anticuerpo inalterado. Los ejemplos de fragmentos de unión a antígeno incluyen, pero sin limitación, Fab, Fab', F(ab')2, Fv y fragmentos de Fv monocatenarios, anticuerpos lineales, anticuerpos monocatenarios y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de unión a antígeno.

Los términos "Fv monocatenario" o "scFv" se refieren a un anticuerpo en el que los dominios variables de la cadena pesada y de la cadena ligera de un anticuerpo tradicional bicatenario se han unido para formar una cadena. Los términos incluyen moléculas de unión que consisten en un dominio variable de cadena ligera (V^l) o parte del mismo, y un dominio variable de cadena pesada (V^h) o parte del mismo, en donde cada dominio variable (o parte del mismo) procede del mismo o de diferentes anticuerpos. Las moléculas scFv normalmente comprenden un enlazador scFv interpuesto entre el dominio V^h y el dominio V^l dominio. Las moléculas scFv son conocidas en la materia y se describen, por ejemplo, en la patente de EE. UU. N.° 5.892.019, Ho, et al., Gene 77:51-59 (1989); Bird, et al., Science 242:423-426 (1988); Pantoliano, et al., Biochemistry 30:10117-10125 (1991); Milenic, et al., Cancer Research 51:6363-6371 (1991); Takkinen, et al., Protein Engineering 4:837-841 (1991)

ANTICUERPOS ANTITOXINA a DE S. AUREUS Y FRAGMENTOS DE UNIÓN A ANTÍGENO

Un anticuerpo antitoxina a de S. aureus (también conocido como anti-AT de S. aureus o anti-AT) o fragmento de unión a antígeno del mismo, como se utiliza en el presente documento, se une de manera inmunoespecífica a uno o más epítopos específicos de la proteína, péptido, subunidad, fragmento, porción, oligómeros o cualquier combinación de los mismos de toxina a y generalmente no se unen de manera específica a otros polipéptidos. El término "oligómeros" u "oligómeros de toxina a" se refiere a una asociación de monómeros de toxina a (por ejemplo, 2 monómeros, 3 monómeros, 4 monómeros, 5 monómeros, 6 monómeros o 7 monómeros) para formar un poro funcional (por ejemplo, 7 monómeros de toxina a). Un epítopo puede comprender al menos una región de unión a anticuerpo que comprende al menos una porción de la proteína toxina a. El término "epítopo", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un determinante de proteína capaz de unirse a un anticuerpo. Los epítopos incluyen generalmente agrupaciones de moléculas de superficie químicamente activas, tales como cadenas laterales de aminoácidos y/o glucídicas y, habitualmente, tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características químicas específicas (por ejemplo, carga, polaridad, basicidad, acidez, hidrofobicidad y similares). Los epítopos conformacionales y no conformacionales se distinguen en que se pierde la unión del primero pero no la del segundo en presencia de disolventes desnaturalizantes. En algunas realizaciones, el epítopo reconocido interfiere con la formación del heptámero activo (por ejemplo, inhibe la oligomerización de los monómeros de toxina a en un complejo heptámero activo).

En determinados casos, un epítopo se compone de al menos una parte de la proteína toxina a, que está implicada en la formación de un complejo heptamérico de toxina a. El epítopo especificado puede comprender cualquier combinación de al menos una secuencia de aminoácidos de al menos 3 restos de aminoácidos en la porción especificada completa de los aminoácidos contiguos de la proteína toxina a. En algunas realizaciones, el epítopo tiene al menos 4 restos de aminoácidos, al menos 5 restos de aminoácidos, al menos 6 restos de aminoácidos, al menos 7 restos de aminoácidos, al menos 8 restos de aminoácidos, al menos 9 restos de aminoácidos, al menos 10 restos de aminoácidos, al menos 11 restos de aminoácidos, al menos 12 restos de aminoácidos, al menos 13 restos de aminoácidos, al menos 14 restos de aminoácidos o al menos 15 restos de aminoácidos en la porción especificada completa de aminoácidos contiguos de la proteína toxina a. En otras realizaciones determinadas, el epítopo comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 restos de aminoácidos contiguos o no contiguos. En realizaciones adicionales, los restos de aminoácidos comprendidos dentro del epítopo están implicados en la formación del complejo heptámero de la toxina a.

Por lo tanto, en realizaciones específicas, los anticuerpos aislados/purificados antitoxina a y los fragmentos de unión a antígeno se unen de manera inmunoespecífica a una molécula que comprende la secuencia de aminoácidos de acuerdo con el SEW ID NO: 39 y/o a una molécula que comprende la secuencia de aminoácidos de acuerdo con el SEWID NO: 40. En determinadas realizaciones, los anticuerpos antitoxina a también se unen a homólogos u ortólogos de la toxina a de diferentes especies o a variantes de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39, donde la histidina en la posición 35 se reemplaza por leucina, o se reemplaza por otros aminoácidos correspondientes a mutaciones H35 conocidas por los expertos en la materia.

Regiones variables

En determinadas realizaciones, se prepara un anticuerpo antitoxina a a partir de un anticuerpo original. En algunas realizaciones, el anticuerpo antitoxina a está incluido dentro del anticuerpo original. Como se utiliza en el presente documento, la expresión "anticuerpo original" se refiere a un anticuerpo que está codificado por una secuencia de aminoácidos utilizada para la preparación de una variante o derivado, definido en el presente documento. Un polipéptido original puede comprender una secuencia de anticuerpo original (es decir, de origen natural, incluida una variante alélica de origen natural) o una secuencia de anticuerpo con modificaciones de secuencia de aminoácidos preexistentes (tales como otras inserciones, eliminaciones y/o sustituciones) de una secuencia de origen natural. El anticuerpo original puede ser un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano. En realizaciones específicas, los anticuerpos antitoxina a son variantes del anticuerpo original. Como se utiliza en el presente documento, el término "variante" se refiere a un anticuerpo antitoxina a que difiere en la secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo antitoxina a "original" en virtud de la adición, eliminación y/o sustitución de uno o más restos de aminoácidos en la secuencia del anticuerpo original.

La porción de unión a antígeno de un anticuerpo comprende uno o más fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad para unirse de manera específica a un antígeno (por ejemplo, la toxina a). Se ha demostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo puede realizarse mediante fragmentos de un anticuerpo de longitud completa (es decir, fragmentos de unión a antígeno). Los ejemplos de "fragmentos de unión a antígeno" abarcados en la "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de una sola rama del anticuerpo, (v) un fragmento dAb, que consiste en un dominio VH; y (vi) una región determinante de la complementariedad (CDR, del inglés "complementarity determining region") aislada. Aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, estén codificados por genes separados, pueden unirse, utilizando métodos recombinantes, mediante un enlazador sintético que les permite formarse como una sola cadena de proteína en la que las regiones VL y VH se aparean para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv monocatenarios (scFv)). Dichos anticuerpos monocatenarios también se incluyen dentro de los términos "anticuerpo" y "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de unión a antígeno se pueden obtener utilizando técnicas conocidas, y los fragmentos se pueden seleccionar para actividad de unión de la misma manera que los anticuerpos inalterados. Los fragmentos de unión a antígeno se pueden producir mediante técnicas de ADN recombinante o mediante escisión enzimática o química de inmunoglobulinas inalteradas.

Los presentes anticuerpos antitoxina a comprenden al menos un dominio de unión a antígeno. En algunas realizaciones, un anticuerpo antitoxina a o fragmento de unión a antígeno comprende una VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 57. En determinadas realizaciones, un anticuerpo antitoxina a comprende una VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58. En aún otra realización, un anticuerpo antitoxina a comprende una VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 57 y una VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58. Véase la tabla 7 para una representación de las secuencias VH y VL como se presenta en el presente documento que pueden estar presentes en cualquier combinación para formar un anticuerpo antitoxina a o presentes en una combinación para formar un AcM. En algunas realizaciones, la VH es el SEW ID NO: 57. En diversas realizaciones, la VL es el SEW ID NO: 58. Determinadas secuencias de nucleótidos de VH y VL se presentan en la tabla 8.

En algunas realizaciones, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una VH y una VL, donde la VH y la VL tienen secuencias de aminoácidos representadas por los SEQ ID NO: 57 y 58.

Las tablas 1 a 7 proporcionan regiones variables de cadena pesada (VH), regiones variables de cadena ligera (VL) y regiones determinantes de la complementariedad (CDR) para determinadas realizaciones de los anticuerpos presentados en el presente documento. En determinadas realizaciones, los anticuerpos antitoxina a comprenden una VH y/o VL que tiene un porcentaje determinado de identificación con al menos una de las secuencias de VH y/o VL divulgadas en la tabla 7. Como se utiliza en el presente documento, la expresión "porcentaje (%) de identidad de secuencia", que incluye también "homología", se define como el porcentaje de restos de aminoácidos o nucleótidos en una secuencia candidata que son idénticos a los restos de aminoácidos o nucleótidos en las secuencias de referencia, tal como la secuencia del anticuerpo original, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. Puede producirse un alineamiento óptimo de las secuencias para comparación, aparte de manualmente, mediante algoritmos de homología local conocidos en la materia o mediante programas informáticos que utilizan estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N y TFASTA en Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin).

En realizaciones específicas, un anticuerpo se une de manera inmunoespecífica a la toxina a y comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 57, y comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58, donde el anticuerpo tiene la actividad de inhibir la unión de uno o más monómeros de toxina a entre sí (por ejemplo, inhibe la oligomerización).

Regiones determinantes de la complementariedad

Mientras que el dominio variable (VH y VL) comprende la región de unión a antígeno, la variabilidad no está distribuida uniformemente en todos los dominios variables de anticuerpos. Se concentra en segmentos denominados regiones determinantes de la complementariedad (CDR), tanto en los dominios variables de cadena ligera (VL o VK) como de cadena pesada (VH). Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables se denominan regiones marco (FR, del inglés "framework regions"). Los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras naturales comprenden, cada uno, cuatro FR, que adoptan en gran medida una configuración en lámina p, conectadas por tres CDR, que forman bucles que conectan y, en algunos casos, forman parte de, la estructura de lámina p. Las CDR en cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad mediante las FR y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de los anticuerpos (véase Kabat et al., anteriormente citado). Las tres CDR de la cadena pesada se denominan CDR1 de VH, CDR2 de VH y CDR-3 de VH, y las tres CDR de la cadena ligera se denominan CDR1 de VL, CDR2 de VL y CDR3 de VL. En el presente documento se utiliza el sistema de numeración de Kabat. De este modo, CDR1 de VH comienza aproximadamente en el aminoácido 31 (es decir, aproximadamente 9 restos después del primer resto de cisteína), incluye aproximadamente de 5 a 7 aminoácidos y termina en el siguiente resto de serina. CDR2 de VH comienza en el decimoquinto resto después del final de CDR-H1, incluye aproximadamente de 16 a 19 aminoácidos y termina en el siguiente resto de glicina. CDR3 de VH comienza aproximadamente en el trigésimo resto de aminoácido después del final de CDR2 de VH; incluye aproximadamente de 13 a 15 aminoácidos; y termina en la secuencia M-D-V. CDR1 de VL comienza aproximadamente en el resto 24 (es decir, después de un resto de cisteína); incluye aproximadamente de 10 a 15 restos; y termina con la secuencia Y-V-S. CDR2 de VL comienza aproximadamente en el decimosexto resto después del final de CDR1 de VL e incluye aproximadamente 7 restos. CDR3 de VL comienza aproximadamente en el trigésimo tercer resto después del final de CDR2 de VH; incluye aproximadamente de 7 a 11 restos y termina en la secuencia T-I-L. Hay que tener en cuenta que las CDR varían de manera considerable de un anticuerpo a otro (y, por definición, no presentarán homología con las secuencias consenso de Kabat).

Los presentes anticuerpos antitoxina a divulgados en el presente documento comprenden al menos un dominio de unión a antígeno que incluye al menos una región determinante de la complementariedad (CDR1, CDR2 o CDR3). Como se divulga en el presente documento, un anticuerpo antitoxina a comprende una VH que incluye al menos una CDR de VH (por ejemplo, CDR-H1, CDR-H2 o CDR-H3). Como se divulga en el presente documento, un anticuerpo antitoxina a comprende una VL que incluye al menos una CDR de VL (por ejemplo, CDR-L1, CDR-L2 o CDR-L3).

En algunas realizaciones, el anticuerpo aislado que se une de manera inmunoespecífica a un polipéptido toxina a de Staphylococcus aureus incluye, (a) una CDR1 de VH que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica al SEQ ID NO: 69; (b) una CDR2 de VH que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica al SEQ ID NO: 70 y (c) una CDR3 de VH que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica al SEQ ID NO: 71.

En realizaciones particulares, el anticuerpo aislado comprende una CDR1 de VH, una CDR2 de VH y una CDR3 de VH que comprenden secuencias de aminoácidos idénticas a los SEQ ID NO: 69, 70 y 71.

En algunas realizaciones, el anticuerpo aislado que se une de manera inmunoespecífica a un polipéptido toxina a de Staphylococcus aureus incluye, (a) una CDR1 de VL que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica al SEQ ID NO: 1; (b) una CDR2 de VL que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica al SEQ ID NO: 2; y (c) una CDR3 de VL que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica al SEQ ID NO: 68.

En realizaciones particulares, el anticuerpo aislado comprende una CDR1 de VL, una CDR2 de VL y una CDR3 de VL que comprenden secuencias de aminoácidos idénticas a los SEQ ID NO: 1, 2 y 68.

En algunas realizaciones, el anticuerpo aislado que se une de manera inmunoespecífica a un polipéptido toxina a de Staphylococcus aureus comprende una CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH, CDR1 de VL, CDR2 de VL y CDR3 de Vl que comprenden secuencias de aminoácidos idénticas a (a) una CDR1 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 69; (b) una CDR2 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 70; (c) una CDR3 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 71; (d) una CDR1 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; (e) una CDR2 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; y (f) una CDR3 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 68.

En realizaciones particulares, el anticuerpo aislado o comprende una CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH, CDR1 de VL, CDR2 de VL y CDR3 de VL que comprenden secuencias de aminoácidos idénticas a los SEQ ID NO: 69, 70, 71, 1, 2 y 68.

En algunas realizaciones, se proporciona una composición que comprende un anticuerpo aislado que (i) incluye un dominio de cadena VH que comprende tres CDR y un dominio de cadena VL que comprende tres CDR; y (ii) se une de manera inmunoespecífica a un polipéptido toxina a de Staphylococcus aureus, donde las tres CDR del dominio de cadena VH incluyen (a) una CDR1 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 69; (b) una CDR2 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 70; y (c) una CDR3 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 71. En realizaciones particulares, la CDR1 de VH, la c DR2 de Vh y la CDR3 de VH comprenden los SEQ ID NO: 69, 70 y 71.

También se proporciona en determinadas realizaciones una composición que comprende un anticuerpo aislado que (i) incluye un dominio de cadena VH que comprende tres CDR y un dominio de cadena VL que comprende tres c DR; y (ii) se une de manera inmunoespecífica a un polipéptido toxina a de Staphylococcus aureus, donde las tres CDR del dominio de cadena VL incluyen (a) una CDR1 de Vl que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; (b) una CDR2 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; y (c) una CDR3 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 68. En realizaciones particulares, la CDR1 de VL, la CDR2 de VL y la CDR3 de VL comprenden los SEQ ID NO: 1, 2 y 68.

En algunas realizaciones, el anticuerpo aislado que se une de manera inmunoespecífica a un polipéptido toxina a de Staphylococcus aureus comprende una CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH, CDR1 de VL, CDR2 de VL y CDR3 de VL que comprenden secuencias de aminoácidos idénticas a, (a) una CDR1 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 69; (b) una CDR2 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 70; (c) una CDR3 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 71; (d) una CDR1 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; (e) una CDR2 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; y (f) una CDR3 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 68.

En realizaciones particulares, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH, CDR1 de VL, CDR2 de VL y CDR3 de VL que comprenden secuencias de aminoácidos idénticas a los SEQ ID NO: 69, 70, 71, 1, 2 y 68.

En algunas realizaciones, se proporciona una composición que comprende un anticuerpo aislado que (i) incluye un dominio de cadena VH que comprende tres CDR y un dominio de cadena VL que comprende tres CDR; y (ii) se une de manera inmunoespecífica a un polipéptido toxina a de Staphylococcus aureus, donde las tres CDR del dominio de cadena VH incluyen (a) una CDR1 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 69; (b) una CDR2 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 70; y (c) una CDR3 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 71. En realizaciones particulares, la CDR1 de VH, la c DR2 de Vh y la CDR3 de VH comprenden los SEQ ID NO: 69, 70 y 71.

También se proporcionan en algunas realizaciones composiciones que incluyen un anticuerpo aislado que (i) se une de manera inmunoespecífica a un polipéptido toxina a de Staphylococcus aureus, (ii) comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 57 y (iii) comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58.

En algunas realizaciones, el anticuerpo aislado incluye un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 57 y un dominio variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 58.

En realizaciones particulares, el anticuerpo aislado comprende una VH y una VL, donde la VH y la VL son idénticas o cada una tiene al menos un 90 %, 95 % o 98 % de identidad con las secuencias de aminoácidos VH y VL de los SEQ ID NO: 57 y 58.

Regiones Fc variantes

La presente invención también incluye anticuerpos de la invención, que tienen dominios constantes de IgG modificados. Los anticuerpos de la clase IgG humana, que tienen características funcionales tales como una semivida prolongada en suero y la capacidad de mediar en varias funciones efectoras, se utilizan en determinadas realizaciones de la invención (Monoclonal Antibodies: Principies and Applications, Wiley-Liss, Inc., Capítulo 1 (1995)). El anticuerpo de clase IgG humana se clasifica además en las siguientes 4 subclases: IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Hasta ahora se ha realizado un gran número de estudios para ADCC y CDC como funciones efectoras del anticuerpo de clase IgG, y se ha informado que entre los anticuerpos de la clase IgG humana, la subclase IgG1 tiene la actividad ADCC y CDC más elevada en seres humanos (Chemical Immunology, 65, 88 (1997)).

La "citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos" y "ADCC" (de inglés "Antibody-dependent cellmediated cytotoxicity") se refieren a una reacción mediada por células en la que las células citotóxicas no específicas (por ejemplo, linfocitos citolíticos naturales (NK, del inglés "Natural Killer"), neutrófilos y macrófagos) reconocen el anticuerpo unido en una célula diana y posteriormente provocan la lisis de la célula diana. En un ejemplo, dichas células son células humanas. Sin desear quedar ligado a ningún mecanismo de acción en particular, estas células citotóxicas que median en la ADCC expresan en general receptores de Fc (FcR, del inglés "Fc receptor"). Las células primarias para mediar en la ADCC, las células NK, expresan FcyRIII, mientras que los monocitos expresan FcyRI, FcyRII, FcyRIII y/o FcyRIV. La expresión del FcR en células hematopoyéticas se resume en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991). Para evaluar la actividad de la ADCC de una molécula, puede realizarse un ensayo de ADCC in vitro, tal como el descrito en la patente de EE. UU. N.° 5.500.362 o 5.821.337. Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC, del inglés "peripheral blood mononuclear cells") y linfocitos citolíticos naturales (NK). Como alternativa, o de manera adicional, la actividad de ADCC de la molécula de interés puede evaluarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el divulgado en Clynes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 95:652-656 (1998).

La "citotoxicidad dependiente de complemento" o "CDC" se refiere a la capacidad de una molécula para iniciar la activación del complemento y lisar una diana en presencia del complemento. La ruta de activación del complemento se inicia por la unión del primer componente del sistema del complemento (C1q) con una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) que forma un complejo con un antígeno análogo. Para evaluar la activación del complemento, puede realizarse un ensayo de CDC, por ejemplo, como se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996) .

La expresión de la actividad ADCC y CDC de los anticuerpos de la subclase IgG1 humana generalmente implica la unión de la región Fc del anticuerpo a un receptor para un anticuerpo (en lo sucesivo, "FcyR") que existe en la superficie de las células efectoras, tales como los linfocitos citolíticos, los linfocitos citolíticos naturales o los macrófagos activados. Se pueden unir varios componentes del complemento. En cuanto a la unión, se ha sugerido que varios restos de aminoácidos en la región bisagra y el segundo dominio de la región C (en lo sucesivo, "dominio Cy2") del anticuerpo son importantes (Eur. J. Immunol., 23, 1098 (1993), Immunology, 86, 319 (1995), Chemical Immunology, 65, 88 (1997)) y que una cadena glucídica en el dominio Cy2 (Chemical Immunology, 65, 88 (1997)) también es importante.

Las "células efectoras" son leucocitos que expresan uno o más FcR y realizan funciones efectoras. Las células expresan al menos FcyRI, FCyRII, FcyRIII y/o FcyRIV y realizan la función efectora de ADCC. Los ejemplos de leucocitos humanos que median la ADCC incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC), linfocitos citolíticos naturales (NK), monocitos, linfocitos T citotóxicos y neutrófilos.

Las expresiones "receptor de Fc" o "FcR" se utilizan para describir un receptor que se une con la región Fc de un anticuerpo. En una realización, el FcR es un FcR humano de secuencia natural. Por otra parte, en determinadas realizaciones, el FcR es uno que se une a un anticuerpo IgG (un receptor y) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FcyRII, FcyRIII y FcyRIV, incluyendo las variantes alélicas y las formas de corte y empalme alternativas de estos receptores. Los receptores FcyRII incluyen FcyRIIA (un "receptor activante") y FcyRIIB (un "receptor inhibidor"), que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en los dominios citoplasmáticos de las mismas. El receptor activador FcyRIIA contiene un motivo de activación inmunorreceptor basado en tirosina (ITAM; del inglés "immunoreceptor tyrosine-based activation motif') en su dominio citoplasmático. El receptor inhibidor FcyRIIB contiene un motivo de inhibición basado en tirosina inmunorreceptor (ITIM, del inglés "immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif') en su dominio citoplasmático. (Véase, Daeron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234 (1997) ). Los FcR se revisan en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods, 4:25-34 (1994); y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med., 126:330-41 (1995). Otros FcR, incluyendo los que se identifiquen en el futuro, están abarcados por el término "FcR" en el presente documento. El término también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de las IgG maternas al feto (Guyer et al., Immunol., 117:587 (1976) y Kim et al., J. Immunol., 24:249 (1994)).

En determinadas realizaciones, un anticuerpo antitoxina a comprende una región Fc alterada (también denominada en el presente documento "región Fc variante") en la que se han realizado una o más alteraciones en la región Fc para cambiar las propiedades funcionales y/o farmacocinéticas de los anticuerpos. Dichas alteraciones pueden dar como resultado una disminución o un aumento de la unión de C1q y de la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) o de la unión de FcyR, para la IgG. La presente tecnología abarca los anticuerpos descritos en el presente documento con regiones Fc variantes en las que se han realizado cambios para alterar la función efectora, proporcionando un efecto deseado. Por consiguiente, en algunas realizaciones, un anticuerpo antitoxina a o fragmento de unión a antígeno comprende una región Fc variante (es decir, regiones Fc que se han alterado como se explica a continuación). Los anticuerpos antitoxina a y los fragmentos de unión a antígeno del presente documento que comprenden una región Fc variante también se denominan aquí "anticuerpos variante Fc". Como se utiliza en el presente documento, natural se refiere a la secuencia original no modificada y el anticuerpo que comprende una región Fc natural se denomina en el presente documento "anticuerpo Fc natural". En algunos ejemplos, la región Fc variante presenta un nivel similar de función efectora inductora en comparación con la región Fc natural. En determinados ejemplos, la región Fc variante presenta una mayor inducción de la función efectora en comparación con la Fc natural. En determinados ejemplos, la región Fc variante presenta una menor inducción de la función efectora en comparación con la Fc natural. En el presente documento se detallan algunos ejemplos específicos de regiones Fc variantes. Los métodos para medir la función efectora son conocidos en la materia.

Se puede modificar la función efectora de un anticuerpo mediante cambios en la región Fc, que incluye, pero sin limitación, sustituciones de aminoácidos, adiciones de aminoácidos, eliminaciones de aminoácidos y cambios en las modificaciones postraduccionales en los aminoácidos de Fc (por ejemplo, glucosilación). Los métodos que se describen a continuación se pueden utilizar para alterar la función efectora de un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno como se describe en el presente documento, lo que da como resultado un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que tiene determinadas propiedades ventajosas para la profilaxis o el tratamiento de una enfermedad o afección asociada a Staphylococcal aureus determinada.

En algunos ejemplos, se prepara un anticuerpo variante Fc que tiene propiedades de unión alteradas para un ligando Fc (por ejemplo, un receptor Fc, C1q) con respecto a un anticuerpo Fc natural. Los ejemplos de propiedades de unión incluyen, pero sin limitación, especificidad de unión, constante de disociación en el equilibrio (Kd), constante de velocidad de disociación y asociación ( k f y kon respectivamente), afinidad de unión y/o avidez. Se sabe en la materia que la constante de disociación en el equilibrio (Kd) se define como koff/kon. En determinados aspectos, un anticuerpo que comprende una región variante Fc con una Kd baja puede ser más deseable para un anticuerpo con una Kd elevada. Sin embargo, en algunos casos, el valor de kon o k f puede ser más importante que el valor de Kd. Se puede determinar qué parámetro cinético es más importante para una aplicación de anticuerpo determinada.

En algunos ejemplos, los anticuerpos variante Fc presentan una afinidad de unión alterada por uno o más receptores Fc, incluidos, pero sin limitación, FcRn, FcyRI (CD64) que incluye las isoformas FcyRIA, FcyRIB y FcyRIC; FcyRII (CD32 que incluye las isoformas FcyRIIA, FcyRIIB y FcyRIIC); y FcyRIII (CD16, que incluye las isoformas FcyRIIIA y FcyRIIIB) en comparación con un anticuerpo Fc natural.

En determinados ejemplos, un anticuerpo variante Fc tiene una unión mejorada a uno o más ligandos Fc en relación con un anticuerpo Fc natural. En determinados ejemplos, el anticuerpo variante Fc presenta una afinidad aumentada o disminuida por un ligando Fc que es al menos 2 veces, o al menos 3 veces, o al menos 5 veces, o al menos 7 veces, o al menos 10 veces, o al menos 20 veces, o al menos 30 veces, o al menos 40 veces, o al menos 50 veces, o al menos 60 veces, o al menos 70 veces, o al menos 80 veces, o al menos 90 veces, o al menos 100 veces, o al menos 200 veces, o entre 2 veces y 10 veces, o entre 5 veces y 50 veces, o entre 25 veces y 100 veces, o entre 75 veces y 200 veces, o entre 100 y 200 veces, más o menos que un anticuerpo Fc natural. En diversos ejemplos, los anticuerpos variante Fc presentan afinidades por un ligando Fc que son al menos un 90 %, al menos un 80 %, al menos un 70 %, al menos un 60 %, al menos un 50 %, al menos un 40 %, al menos un 30 %, al menos un 20 %, al menos un 10 % o al menos un 5 % más o menos que un anticuerpo Fc natural. En determinados ejemplos, un anticuerpo variante Fc tiene mayor afinidad por un ligando Fc. En ocasiones, un anticuerpo variante Fc puede tener una afinidad reducida por un ligando Fc.

En algunos ejemplos, un anticuerpo variante Fc tiene una unión mejorada al receptor Fc FcyRIIIA. En algunos ejemplos, un anticuerpo variante Fc tiene una unión mejorada al receptor Fc FcyRIIB. En determinadas realizaciones, un anticuerpo variante Fc tiene una unión mejorada a los receptores Fc FcyRIIIA y FcyRIIB. En determinados ejemplos, Los anticuerpos variante Fc que tienen una unión mejorada a FcyRIIIA no tienen un aumento coincidente en la unión al receptor FcyRIIB en comparación con un anticuerpo Fc natural. En determinados ejemplos, un anticuerpo variante Fc tiene unión reducida al receptor Fc FcyRIIIA. En ocasiones, un anticuerpo variante Fc puede tener una unión reducida al receptor Fc FcyRIIB. En diversos ejemplos, un anticuerpo variante Fc que presenta una afinidad alterada por FcyRIIIA y/o FcyRIIB tiene una unión mejorada al receptor Fc FcRn. En algunos ejemplos, un anticuerpo variante Fc que presenta una afinidad alterada por FcyRIIIA y/o FcyRIIB tiene una unión alterada a C1q en relación con un anticuerpo Fc natural.

En determinados ejemplos, los anticuerpos variante Fc presentan afinidades por el receptor FcyRIIIA que son al menos 2 veces, o al menos 3 veces, o al menos 5 veces, o al menos 7 veces, o al menos 10 veces, o al menos 20 veces, o al menos 30 veces, o al menos 40 veces, o al menos 50 veces, o al menos 60 veces, o al menos 70 veces, o al menos 80 veces, o al menos 90 veces, o al menos 100 veces, o al menos 200 veces, o están entre 2 veces y 10 veces, o entre 5 veces y 50 veces, o entre 25 veces y 100 veces, o entre 75 veces y 200 veces, o entre 100 veces y 200 veces, más o menos que un anticuerpo Fc natural. En diversos ejemplos, los anticuerpos variante Fc presentan afinidades por FcyRIIIA que son al menos un 90 %, al menos un 80 %, al menos un 70 %, al menos un 60 %, al menos un 50 %, al menos un 40 %, al menos un 30 %, al menos un 20 %, al menos un 10 % o al menos un 5 % más o menos que un anticuerpo Fc natural.

En determinados ejemplos, los anticuerpos variante Fc presentan afinidades por el receptor FcyRIIB que son al menos 2 veces, o al menos 3 veces, o al menos 5 veces, o al menos 7 veces, o al menos 10 veces, o al menos 20 veces, o al menos 30 veces, o al menos 40 veces, o al menos 50 veces, o al menos 60 veces, o al menos 70 veces, o al menos 80 veces, o al menos 90 veces, o al menos 100 veces, o al menos 200 veces, o están entre 2 veces y 10 veces, o entre 5 veces y 50 veces, o entre 25 veces y 100 veces, o entre 75 veces y 200 veces, o entre 100 veces y 200 veces, más o menos que un anticuerpo Fc natural. En determinados ejemplos, los anticuerpos variantes Fc presentan afinidades por FcyRIIB que son al menos un 90 %, al menos un 80 %, al menos un 70 %, al menos un 60 %, al menos un 50 %, al menos un 40 %, al menos un 30 %, al menos un 20 %, al menos un 10 % o al menos un 5 % más o menos que un anticuerpo Fc natural.

En algunos ejemplos, los anticuerpos variantes Fc presentan afinidades aumentadas o disminuidas por C1q en relación con un anticuerpo Fc natural. En algunos ejemplos, los anticuerpos variante Fc presentan afinidades por el receptor C1q que son al menos 2 veces, o al menos 3 veces, o al menos 5 veces, o al menos 7 veces, o al menos 10 veces, o al menos 20 veces, o al menos 30 veces, o al menos 40 veces, o al menos 50 veces, o al menos 60 veces, o al menos 70 veces, o al menos 80 veces, o al menos 90 veces, o al menos 100 veces, o al menos 200 veces, o están entre 2 veces y 10 veces, o entre 5 veces y 50 veces, o entre 25 veces y 100 veces, o entre 75 veces y 200 veces, o entre 100 veces y 200 veces, más o menos que un anticuerpo Fc natural. En determinados ejemplos, los anticuerpos variante Fc presentan afinidades por C1q que son al menos un 90 %, al menos un 80 %, al menos un 70 %, al menos un 60 %, al menos un 50 %, al menos un 40 %, al menos un 30 %, al menos un 20 %, al menos un 10 % o al menos un 5 % más o menos que un anticuerpo Fc natural. En diversos ejemplos, un anticuerpo variante Fc que presenta una afinidad alterada por Ciq ha mejorado la unión ilustrativa al receptor Fc FcRn. En otra realización específica más, un anticuerpo variante Fc que presenta una afinidad alterada por C1q tiene una unión alterada a FcyRIIIA y/o FcyRIIB en relación con un anticuerpo Fc natural.

Se contempla que los anticuerpos variante Fc se caractericen por ensayos funcionales in vitro para determinar una o más funciones de células efectoras mediadas por FcyR. En determinados ejemplos, los anticuerpos variante Fc tienen propiedades de unión y funciones de células efectoras similares en modelos in vivo (tales como los descritos y divulgados en el presente documento) como los de ensayos basados in vitro. La presente tecnología no excluye anticuerpos variante Fc que no presenten el fenotipo deseado en los ensayos in vitro, pero que presenten el fenotipo deseado in vivo.

La semivida en suero de las proteínas que comprenden regiones Fc puede incrementarse mediante el aumento de la afinidad de unión de la región Fc por FcRn. La expresión "semivida del anticuerpo", como se utiliza en el presente documento, significa una propiedad farmacocinética de un anticuerpo que es una medida del tiempo medio de supervivencia de las moléculas de anticuerpo después de su administración. La semivida del anticuerpo se puede expresar como el tiempo necesario para eliminar el 50 por ciento de una cantidad conocida de inmunoglobulina del cuerpo del paciente (u otro mamífero) o de un compartimento específico del mismo, por ejemplo, medido en el suero, es decir, semivida circulante, o en otros tejidos. La semivida puede variar de una inmunoglobulina o clase de inmunoglobulina a otra. En general, un aumento en la semivida del anticuerpo da como resultado un aumento en el tiempo medio de residencia (MRT, del inglés "mean residence time") en circulación para el anticuerpo administrado.

Un aumento en la semivida permite reducir la cantidad de fármaco administrado a un paciente, así como reducir la frecuencia de administración. Un aumento en la semivida también puede ser beneficioso, por ejemplo, para prevenir una enfermedad o afección asociada a Staphylococcal aureus, y también para prevenir una recidiva de la infección que a menudo puede ocurrir una vez que un paciente ha sido dado de alta del hospital. Para aumentar la semivida en suero del anticuerpo, se puede incorporar un epítopo de unión al receptor de rescate en el anticuerpo (especialmente un fragmento de unión a antígeno) como se conoce en la materia. Como se utiliza en el presente documento, la expresión "epítopo de unión al receptor de rescate" se refiere a un epítopo de la región Fc de una molécula de IgG (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4) que es responsable de aumentar la semivida en suero de la molécula de IgG in vivo. También pueden generarse anticuerpos con semividas aumentadas mediante la modificación de restos de aminoácidos identificados como implicados en la interacción entre el Fc y el receptor FcRn. Además, la semivida de un anticuerpo antitoxina a o fragmento de unión a antígeno puede incrementarse mediante la conjugación con PEG o albúmina mediante técnicas ampliamente utilizadas en la materia. En algunos ejemplos, los anticuerpos que comprenden regiones variantes Fc de un anticuerpo antitoxina a tienen una semivida aumentada de aproximadamente un 5%, aproximadamente un 10%, aproximadamente un 15%, aproximadamente un 20%, aproximadamente un 25 %, aproximadamente un 30 %, aproximadamente un 35 %, aproximadamente un 40 %, aproximadamente un 45 %, aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 60 %, aproximadamente un 65 %, aproximadamente un 70 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 85 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 100 %, aproximadamente un 125 %, aproximadamente un 150 % o más en comparación con un anticuerpo que comprende una región Fc natural. En algunos ejemplos, los anticuerpos que comprenden regiones variantes Fc tienen una semivida aumentada de aproximadamente 2 veces, aproximadamente 3 veces, aproximadamente 4 veces, aproximadamente 5 veces, aproximadamente 10 veces, aproximadamente 20 veces, aproximadamente 50 veces o más, o está entre 2 veces y 10 veces, o entre 5 veces y 25 veces, o entre 15 veces y 50 veces, en comparación con un anticuerpo que comprende una región Fc natural.

En algunos ejemplos, la tecnología presentada en el presente documento divulga variantes Fc, donde la región Fc comprende una modificación (por ejemplo, sustituciones de aminoácidos, inserciones de aminoácidos, eliminaciones de aminoácidos) en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 251, 252, 254, 255, 256, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 279, 280, 284, 292, 296, 297, 298, 299, 305, 313, 316, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 339, 341, 343, 370, 373, 378, 392, 416, 419, 421, 440 y 443 según la numeración del índice de EU como se expone en Kabat. De manera opcional, la región Fc puede comprender un resto de aminoácido de origen no natural en posiciones adicionales y/o alternativas conocidas en la materia.

En determinados ejemplos, en el presente documento se divulga una variante Fc, donde la región Fc comprende al menos una sustitución seleccionada del grupo que consiste en 234D, 234E, 234N, 234Q, 234T, 234H, 234Y, 234I, 234V, 234F, 235A, 235D, 235R, 235W, 235P, 235S, 235N, 235Q, 235T, 235H, 235Y, 235I, 235V, 235F, 236E, 239D, 239E, 239N, 239Q, 239F, 239T, 239H, 239Y, 240I, 240A, 240T, 240M, 241W, 241L, 241Y, 241E, 241R, 243W, 243L, 243Y, 243R, 243Q, 244H, 245A, 247L, 247V, 247G, 251F, 252Y, 254T, 255L, 256E, 256M, 262I, 262A, 262T, 262E, 263I, 263A, 263T, 263M, 264L, 264I, 264W, 264T, 264R, 264F, 264M, 264Y, 264E, 265G, 265N, 265Q, 265Y, 265F, 265V, 265I, 265L, 265H, 265T, 266I, 266A, 266T, 266M, 267Q, 267L, 268E, 269H, 269Y, 269F, 269R, 270E, 280A, 284M, 292P, 292L, 296E, 296Q, 296D, 296N, 296S, 296T, 296L, 296I, 296H, 269G, 297S, 297D, 297E, 298H, 298I, 298T, 298F, 299I, 299L, 299A, 299S, 299V, 299H, 299F, 299E, 305I, 313F, 316D, 325Q, 325L, 325I, 325D, 325E, 325A, 325T, 325V, 325H, 327G, 327W, 327N, 327L, 328S, 328M, 328D, 328E, 328N, 328Q, 328F, 328I, 328V, 328T, 328H, 328A, 329F, 329H, 329Q, 330K, 330G, 330T, 330C, 330L, 330Y, 330V, 330I, 330F, 330R, 330H, 331G, 331A, 331L, 331M, 331F, 331W, 331K, 331Q, 331E, 331S, 331V, 331I, 331C, 331Y, 331H, 331R, 331N, 331D, 331T, 332D, 332S, 332W, 332F, 332E, 332N, 332Q, 332T, 332H, 332Y, 332A, 339T, 370E, 370N, 378D, 392T, 396L, 416G, 419H, 421K, 440Y y 434W numeradas según el índice de EU como se expone en Kabat. De manera opcional, la región Fc puede comprender restos de aminoácidos de origen no natural adicionales y/o alternativos conocidos en la materia.

En diversos ejemplos, en el presente documento se proporciona un anticuerpo variante Fc, donde la región Fc comprende al menos una modificación (por ejemplo, sustituciones de aminoácidos, inserciones de aminoácidos, eliminaciones de aminoácidos) en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 234, 235 y 331. En algunos ejemplos, los aminoácidos de origen no natural divulgados se seleccionan del grupo que consiste en 234F, 235F, 235Y y 331S. En el presente documento se divulga una variante Fc, donde la región Fc comprende al menos un aminoácido de origen no natural en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 239, 330 y 332. En algunos ejemplos, los aminoácidos de origen no natural se seleccionan del grupo que consiste en 239D, 330L e 332E.

En algunos ejemplos, en el presente documento se proporciona un anticuerpo variante Fc, donde la región Fc comprende al menos un aminoácido de origen no natural en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 252, 254 y 256. En determinados ejemplos, los aminoácidos de origen no natural se seleccionan del grupo que consiste en 252Y, 254T y 256E, descritos en la patente de EE. UU. N.° 7.083.784.

En determinados ejemplos, las funciones efectoras provocadas por los anticuerpos IgG dependen en gran medida del resto glucídico unido a la región Fc de la proteína. Por lo tanto, la glucosilación de la región Fc se puede modificar para aumentar o disminuir la función efectora. Por consiguiente, en algunos ejemplos, las regiones Fc de los anticuerpos antitoxina a y los fragmentos de unión a antígeno proporcionados en el presente documento comprenden una glucosilación alterada de los restos de aminoácidos. En determinados ejemplos, la glucosilación alterada de los restos de aminoácidos da como resultado una función efectora reducida. En determinados ejemplos, la glucosilación alterada de los restos de aminoácidos da como resultado una función efectora aumentada. En algunos ejemplos, la región Fc tiene fucosilación reducida. En determinados ejemplos, la región Fc está afucosilada.

En algunos ejemplos, las variantes Fc del presente documento pueden combinarse con otras variantes Fc conocidas en la materia. Se pueden introducir otras modificaciones y/o sustituciones y/o adiciones y/o eliminaciones del dominio Fc. En realizaciones particulares, un anticuerpo anti-AT de la invención que tiene un dominio variante Fc comprende un VH-IgG1-YTE correspondiente al SEQ ID NO: 80 y/o un VF-Kappa correspondiente al SEQ ID NO: 81.

SECUENCIAS REPRESENTATIVAS PARA ANTICUERPOS ANTI-AT DE S. AUREUS

T l 2: n i DR VL r l AM 2 F.1

T l 4: n i DR VH r l AM 1 A7. 12B .1

T l : n i DR VH r l A M 2 E .1

(continuación)

(continuación)

T l : T m ri l DR VL VH r l xin

Tabla 10 Secuencias de aminoácidos de la toxina a

FORMULACIONES FARMACEUTICAS QUE COMPRENDEN ANTICUERPOS ANTI-AT Y FRAGMENTOS DE UNIÓN A ANTÍGENO DE LOS MISMOS

También se divulgan formulaciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo antitoxina a o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe en el presente documento y un vehículo. Dichas formulaciones se pueden administrar de manera fácil en los distintos métodos descritos. En algunos ejemplos, la formulación comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Como se utiliza en el presente documento, las formulaciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo antitoxina a o fragmento de unión a antígeno del mismo se denominan formulaciones de la tecnología. La expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" significa uno o más materiales no tóxicos que no interfieren con la eficacia o la actividad biológica de los principios activos. Dichas preparaciones pueden contener de manera habitual sales, agentes tamponantes, conservantes, vehículos compatibles y, opcionalmente, otros agentes terapéuticos. Dichas preparaciones farmacéuticamente aceptables también pueden contener de manera rutinarias material de relleno, diluyentes o sustancias encapsulantes sólidas o líquidas compatibles que son adecuadas para su administración en un ser humano. El término "vehículo" indica un ingrediente orgánico o inorgánico, natural o sintético, con el que se combina el principio activo para facilitar la aplicación. Los componentes de las composiciones farmacéuticas también son capaces de mezclarse con los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno descritos en el presente documento, y entre sí, de tal manera que no haya interacción que perjudique de manera sustancial la eficacia farmacéutica deseada.

Las composiciones farmacéuticas que se describen en el presente documento pueden formularse para una dosificación particular. Las pautas posológicas se pueden ajustar para proporcionar la respuesta deseada óptima. Por ejemplo, se puede administrar un único bolo, pueden administrarse varias dosis divididas a lo largo del tiempo o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente según se indique por las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular las composiciones parenterales en una forma de dosificación unitaria para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. La forma de dosificación unitaria, como se usa en el presente documento, se refiere a unidades físicamente individuales adecuadas como dosis unitarias para los sujetos que se van a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo (es decir, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno) calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación al vehículo farmacéutico necesario. Las especificaciones para las formas unitarias de dosificación están dictadas y dependen directamente de (a) las características únicas del anticuerpo antitoxina a o del fragmento de unión a antígeno y el efecto terapéutico particular que se desea lograr, y (b) las limitaciones inherentes a la materia de componer dicho anticuerpo antitoxina a o fragmento de unión a antígeno para el tratamiento de la sensibilidad en los individuos.

Las composiciones terapéuticas de la presente tecnología se pueden formular para vías de administración particulares, tales como administración oral, nasal, pulmonar, tópica (que incluye bucal y sublingual), rectal, vaginal y/o parenteral. Las formulaciones se pueden presentar de manera conveniente en forma de dosificación unitaria y se pueden preparar mediante cualquiera de los métodos conocidos en la materia de farmacia. La cantidad de principio activo (es decir, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno) que se puede combinar con un material de vehículo para producir una forma de dosificación individual variará dependiendo del sujeto que se esté tratando y del modo de administración particular. La cantidad de principio activo que se puede combinar con un material de vehículo para producir una sola forma de dosificación, en general, será la cantidad de la composición que produzca un efecto terapéutico.

TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES ASOCIADAS A S. AUREUS

La presente invención también divulga métodos para prevenir y/o para tratar enfermedades y afecciones asociadas a S. aureus, que incluyen, por ejemplo, bacteriemia y septicemia, utilizando anticuerpos antitoxina a (anti-AT) de S. aureus y fragmentos de unión a antígeno de los mismos. También se divulgan métodos para prevenir y/o para tratar enfermedades y afecciones asociadas a S. aureus, que incluyen, por ejemplo, neumonía en pacientes inmunodeprimidos, utilizando anticuerpos antitoxina a (anti-AT) de S. aureus y fragmentos de unión a antígeno de los mismos.

Cualquiera de los anticuerpos anti-AT o fragmentos de unión a antígeno de los mismos descritos en todo el documento, así como mutantes, variantes y derivados de dichos anticuerpos, se pueden utilizar en los diversos métodos descritos en el presente documento. Si bien los anticuerpos anti-AT ilustrativos y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos se describen en el presente documento para su uso en los diversos métodos y en los ejemplos proporcionados, debe entenderse que cualquier anticuerpo anti-AT o fragmento de unión a antígeno del mismo conocido en la materia y, en particular, los descritos en el presente documento y divulgados en la solicitud de patente Internacional publicada N.° WO 2012/109285, se puede utilizar en los diversos métodos.

También conocida como envenenamiento de la sangre, la bacteriemia se produce cuando las bacterias S. aureus entran en el torrente sanguíneo de un mamífero, incluyendo los seres humanos. Una fiebre persistente es un signo de bacteriemia. Las bacterias pueden viajar a lugares profundos dentro del cuerpo para producir infecciones que afectan a los órganos internos, tales como el cerebro, el corazón, los pulmones, los huesos y los músculos, o a los dispositivos implantados quirúrgicamente, tales como articulaciones artificiales o marcapasos cardíacos. Un sello distintivo de la septicemia provocada por S. aureus es la aglutinación bacteriana y la formación de lesiones tromboembólicas que se mide como unidades formadoras de colonias (UFC) bacterianas en el corazón (McAdow et al., 2011).

En los ejemplos, se divulgan métodos para prevenir la septicemia asociada a S. aureus en un sujeto mamífero o para reducir la intensidad de la septicemia asociada a S. aureus en un sujeto mamífero. Dichos métodos comprenden la administración de manera adecuada al sujeto de una cantidad eficaz de un anticuerpo aislado antitoxina a (anti-AT) de S. aureus o fragmento de unión a antígeno del mismo, que incluye anticuerpos aislados antitoxina a (anti-AT) de S. aureus o fragmentos de unión a antígeno descritos en el presente documento o conocidos de otro modo en la materia.

Los métodos de prevención de la septicemia asociada a S. aureus en un sujeto mamífero comprenden administrar de manera adecuada una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-AT aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo al sujeto antes de un acontecimiento de infección. Como se utiliza en el presente documento, "acontecimiento infeccioso" se refiere a un acontecimiento durante el cual el sujeto está, o podría estar, expuesto a una infección por S. aureus. Los acontecimientos infecciosos ilustrativos incluyen, pero sin limitación, cirugía en cualquier parte del organismo, incluyendo la cabeza, la boca, las manos, los brazos, las piernas, el tronco, los órganos internos (por ejemplo, el corazón, el cerebro, los intestinos, los riñones, el estómago, los pulmones, el hígado, el bazo, el páncreas, etc.), los huesos, la piel. La cirugía provoca afecciones, tales como heridas quirúrgicas abiertas y órganos expuestos, que pueden infectarse fácilmente por S. aureus. Los acontecimientos de infección adicionales incluyen traumatismos en cualquier parte del organismo que provocan heridas abiertas o de otro modo facilitan el acceso al torrente sanguíneo, mediante lo que la infección por S. aureus puede entrar en el organismo. Los acontecimientos de infección adicionales incluyen transfusiones sanguíneas, inyecciones de medicamentos o de fármacos legales o ilegales, punciones por aguja, agujas para tatuar, inserción y mantenimiento de vías intravenosas (i.v.), inserción y mantenimiento de drenajes quirúrgicos y sitios de laceración de la piel, por ejemplo, escaras (úlceras de decúbito).

En los ejemplos en los que los métodos divulgan la prevención de la septicemia asociada a S. aureus, el anticuerpo anti-AT o el fragmento de unión a antígeno del mismo se administra de manera adecuada al menos 1 hora antes de un acontecimiento de infección. Por ejemplo, al menos 1 hora antes de la cirugía (el acontecimiento de infección). De manera adecuada, el anticuerpo anti-AT o el fragmento de unión a antígeno del mismo se administra al menos 6 horas, al menos 12 horas, al menos 18 horas, al menos 24 horas, al menos 30 horas, al menos 36 horas, al menos 42 horas, al menos 48 horas o más, antes del acontecimiento de infección. En realizaciones, el anticuerpo anti-AT o el fragmento de unión a antígeno del mismo se administra de manera adecuada de aproximadamente 6 horas a aproximadamente 36 horas, de aproximadamente 6 horas a aproximadamente 36 horas, de aproximadamente 12 horas a aproximadamente 36 horas, de aproximadamente 12 horas a aproximadamente 24 horas, de aproximadamente 24 horas a aproximadamente 36 horas, de aproximadamente 20 horas a aproximadamente 30 horas, de aproximadamente 20 horas a aproximadamente 28 horas, de aproximadamente 22 horas a aproximadamente 26 horas o aproximadamente 12 horas, aproximadamente 13 horas, aproximadamente 14 horas, aproximadamente 15 horas, aproximadamente 16 horas, aproximadamente 17 horas, aproximadamente 18 horas, aproximadamente 19 horas, aproximadamente 20 horas, aproximadamente 21 horas, aproximadamente 22 horas, aproximadamente 23 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 25 horas, aproximadamente 26 horas, aproximadamente 27 horas, aproximadamente 28 horas, aproximadamente 29 horas o aproximadamente 30 horas o aproximadamente 31 horas o aproximadamente 32 horas o aproximadamente 33 horas o aproximadamente 34 horas o aproximadamente 35 horas o aproximadamente 36 horas, antes del acontecimiento de infección.

Como se utiliza en el presente documento, la "prevención" de la septicemia asociada a S. aureus se refiere a reducir el riesgo de que un sujeto contraiga septicemia asociada con S. aureus en el momento del acontecimiento de infección. De manera adecuada, el riesgo de que un sujeto adquiera septicemia asociada a S. aureus se reduce en al menos un 30 % en comparación con un sujeto al que no se le ha administrado un anticuerpo anti-AT o un fragmento de unión a antígeno antes del acontecimiento de infección. De manera más adecuada, el riesgo se reduce en al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o el riesgo se elimina por completo en comparación con un sujeto al que no se le ha administrado un anticuerpo anti-AT o un fragmento de unión a antígeno antes del acontecimiento de infección.

En los métodos para reducir la intensidad de la septicemia asociada a S. aureus en un sujeto mamífero, dichos métodos comprenden la administración de manera adecuada de una cantidad eficaz de un anticuerpo aislado antitoxina a (anti-AT) de S. aureus o fragmento de unión a antígeno del mismo a un sujeto que presenta síntomas de septicemia asociada a S. aureus. Dichos síntomas pueden incluir, por ejemplo, escalofríos, confusión o delirio, fiebre o baja temperatura corporal (hipotermia), sensación de mareo leve causada por una bajada de tensión, pulso sanguíneo rápido, sacudidas, erupción cutánea y piel caliente.

Como se utiliza en el presente documento, "reducir la intensidad", como se utiliza en referencia a la septicemia, se refiere a la reducción de los síntomas que presenta un sujeto que ha contraído septicemia asociada a S. aureus. De manera adecuada, los síntomas se reducen en al menos un 30 % en comparación con los síntomas que presenta un sujeto que también ha contraído septicemia asociada a S. aureus, pero al que no se le ha administrado un anticuerpo anti-AT o un fragmento de unión al antígeno del mismo. De manera más adecuada, los síntomas se reducen en al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o los síntomas se eliminan por completo (es decir, el sujeto se cura de la infección y de la septicemia) en comparación con un sujeto al que no se le ha administrado un anticuerpo anti-AT o un fragmento de unión al antígeno del mismo antes del acontecimiento de infección.

Como se utiliza en el presente documento, los términos "tratar", "trata" o "tratamiento" se pueden referir al tratamiento terapéutico y a medidas profilácticas o preventivas, en donde el objetivo es prevenir o ralentizar (disminuir) un cambio o trastorno fisiológico no deseado, tal como la progresión de la enfermedad. Los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero sin limitación, el alivio de los síntomas, la disminución del grado de la enfermedad, el estado estabilizado (es decir, que no empeora) de la enfermedad, el retraso o ralentización de la progresión de la enfermedad, la mejora o la paliación de la patología. "Tratamiento" también puede significar prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento. Aquellos que necesitan tratamiento incluyen aquellos que ya padecen la afección o trastorno así como aquellos propensos a tener la afección o trastorno o aquellos en los que se quiera prevenir la afección o trastorno.

De manera adecuada, los sujetos a los que se les pueden administrar los anticuerpos anti-AT o fragmentos de unión a antígeno de los mismos en los diversos métodos descritos en el presente documento son mamíferos, tal como, por ejemplo, seres humanos, perros, gatos, primates, ganado, ovejas, caballos, cerdos, etc.

Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento se puede administrar en una dosificación y régimen de dosificación adecuados, y dicha dosificación y régimen de dosificación pueden depender de la enfermedad o afección. Se puede identificar una "dosis eficaz" mediante la determinación de si una dosis y un régimen de dosificación dan lugar a un efecto terapéutico o a un criterio de valoración terapéutico (por ejemplo, prevención). La dosificación del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se puede proporcionar en una sola administración o en múltiples administraciones espaciadas de acuerdo con los efectos deseados y otras consideraciones clínicas.

Los métodos ilustrativos mediante los cuales el anticuerpo anti-AT o el fragmento de unión a antígeno del mismo se puede administrar al sujeto en cualquiera de los diversos métodos descritos en el presente documento incluyen, pero sin limitación, intravenoso (i.v.), intratumoral (i.t.), intralesional (i.l.), aerosoles, percutánea, endoscópico, tópico, intramuscular (i.m.), intradérmico (i.d.), intraocular (i.o.), intraperitoneal (i.p.), transdérmico (t.d.), intranasal (i.n.), intracerebral (i.c.), intraórgano (por ejemplo, intrahepático), implante de liberación lenta, o administración subcutánea, o mediante administración utilizando una bomba osmótica o mecánica.

En ejemplos adicionales, se divulgan métodos de reducción de la carga bacteriana de S. aureus en el torrente sanguíneo o en el corazón de un sujeto mamífero. Dichos métodos comprenden la administración de manera adecuada al sujeto de una cantidad eficaz de un anticuerpo aislado antitoxina a (anti-AT) de S. aureus o fragmento de unión a antígeno del mismo.

La carga bacteriana en el torrente sanguíneo o en el corazón de un sujeto mamífero se mide de manera adecuada mediante métodos conocidos en la materia para determinar la cantidad de bacterias, de manera conveniente colonias bacterianas de S. aureus, en el torrente sanguíneo o en el corazón. Por ejemplo, la carga bacteriana se mide de manera adecuada mediante la colocación de una muestra de un organismo en una placa de agar, la incubación de la placa y después la cuantificación del número de unidades formadoras de colonias (UFC) en la placa. Dichos métodos son bien conocidos en la materia. También se pueden utilizar métodos adecuados adicionales para determinar la carga bacteriana. La muestra recogida es adecuadamente de una muestra de sangre de un organismo tomado en general, o de manera específica, de un órgano en particular.

De manera adecuada, la carga bacteriana (es decir, la cantidad de bacterias medida mediante unidades formadoras de colonias) de un sujeto infectado por S. aureus se reduce en al menos un 30 % en sujetos tratados con anticuerpos anti-AT o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, en comparación con sujetos que también se han infectado por S. aureus, pero a los que no se les ha administrado un anticuerpo anti-AT o un fragmento de unión al antígeno del mismo. De manera más adecuada, la cantidad de bacterias se reduce en al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o la carga bacteriana se elimina por completo en comparación con un sujeto al que no se le ha administrado un anticuerpo anti-AT o un fragmento de unión a antígeno.

De manera adecuada, los anticuerpos anti-AT o fragmentos de unión a antígeno del mismo se administren lo antes posible después del diagnóstico de la infección por S. aureus, por ejemplo, dentro de horas o días. La duración y la cantidad de anticuerpos anti-AT o fragmentos de unión a antígeno que se van a administrar se determinan fácilmente por los expertos en la materia.

También se divulgan métodos para reducir la aglutinación bacteriana de S. aureus y/o la formación de lesiones tromboembólicas en un sujeto mamífero. Dichos métodos comprenden administrar de manera adecuada a dicho sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo aislado antitoxina a (anti-AT) de S. aureus o fragmento de unión a antígeno del mismo, que incluye anticuerpos antitoxina a (anti-AT) de S. aureus o fragmentos de unión a antígeno de los mismos descritos en el presente documento o conocidos de otro modo en la materia.

Como se describe en el presente documento, los métodos para reducir la aglutinación bacteriana de S. aureus se refiere a la reducción de la cantidad de formación de cúmulos entre bacterias S. aureus cuando entran en contacto con la sangre y/o en un órgano. Se conocen en la materia métodos ilustrativos para medir la aglutinación bacteriana que incluyen, por ejemplo, como los descritos en McAdow et al., PLos Pathogens 7:e1002307 (2011), De manera adecuada, los métodos divulgados en el presente documento también reducen la formación de lesiones tromboembólicas en el torrente sanguíneo y/u órganos de un sujeto. Los métodos para medir la formación de lesiones tromboembólicas son conocidos en la materia e incluyen, por ejemplo, la formación de imágenes mediante resonancia magnética (RM), la exploración por tomografía computarizada (TC) o tomografía axial computarizada (TAC), u otros métodos de imagen adecuados.

Los métodos para reducir la aglutinación bacteriana de S. aureus y/o la formación de lesiones tromboembólicas en un sujeto mamífero dan como resultado de manera adecuada una reducción de la aglutinación bacteriana y/o de la formación de lesiones tromboembólicas en al menos un 30 % en sujetos tratados con anticuerpos anti-AT o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, en comparación con sujetos que también se han infectado por S. aureus, pero a los que no se les ha administrado un anticuerpo anti-AT o un fragmento de unión al antígeno del mismo. De manera más adecuada, la aglutinación bacteriana y/o la formación de lesiones tromboembólicas se reduce en al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o la aglutinación bacteriana y/o la formación de lesiones tromboembólicas se elimina por completo en comparación con un sujeto al que no se le ha administrado un anticuerpo anti-AT o un fragmento de unión al antígeno del mismo.

De manera adecuada, los métodos para prevenir la septicemia asociada a S. aureus en un sujeto mamífero o para reducir la intensidad de la septicemia asociada a S. aureus en un sujeto mamífero también da como resultado una reducción de la carga bacteriana en el torrente sanguíneo o en el corazón del sujeto. En otros ejemplos, los métodos para prevenir la septicemia asociada a S. aureus en un sujeto mamífero o para reducir la intensidad de la septicemia asociada a S. aureus en un sujeto mamífero también da como resultado una reducción de la aglutinación bacteriana y/o de la formación de lesiones tromboembólicas en el sujeto.

En ejemplos adicionales, se divulgan métodos para prevenir o reducir la intensidad de la neumonía asociada a S. aureus en un sujeto mamífero inmunodeprimido. Dichos métodos comprenden la administración de manera adecuada al sujeto de una cantidad eficaz de un anticuerpo aislado antitoxina a (anti-AT) de S. aureus o fragmento de unión a antígeno del mismo.

Como se describe en el presente documento, se ha descubierto de manera sorprendente que a los sujetos mamíferos inmunodeprimidos se les pueden administrar anticuerpos anti-AT o fragmentos de unión a antígeno de los mismos para prevenir la neumonía asociada a S. aureus o para reducir la intensidad de la neumonía asociada a S. aureus en sujetos que ya han contraído la neumonía.

Como se utiliza en el presente documento, "inmunodeprimido" se refiere a sujetos mamíferos que son incapaces de desarrollar una respuesta inmunitaria normal y, en general, dichos sujetos padecen neutrocitopenia, que se refiere a un número anormalmente bajo de neutrófilos. La intensidad de la neutrocitopenia está determinada por el recuento absoluto de neutrófilos (ANC, del inglés "absolute neutrophil count") medido en células por microlitro de sangre. Neutrocitopenia leve (1000< ANC <1500); neutrocitopenia moderada (500< ANC <1000); y neutrocitopenia intensa (ANC <500) son niveles comunes determinados por los expertos en la materia.

Como se utiliza en el presente documento, "prevención" de la neumonía asociada a S. aureus en un sujeto mamífero inmunodeprimido se refiere a la reducción del riesgo de que un sujeto inmunodeprimido adquiera neumonía asociada a S. aureus en el momento de un acontecimiento de infección. De manera adecuada, el riesgo de que un sujeto inmunodeprimido adquiera la neumonía asociada a S. aureus se reduce en al menos un 30 % en comparación con un inmunodeprimido al que no se le ha administrado un anticuerpo anti-AT o fragmento de unión a antígeno antes del acontecimiento de infección. De manera más adecuada, el riesgo se reduce en al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o el riesgo se elimina por completo en comparación con un sujeto inmunodeprimido al que no se le ha administrado un anticuerpo anti-AT o fragmento de unión a antígeno del mismo antes del acontecimiento de infección.

En los métodos para reducir la intensidad de la neumonía asociada a S. aureus un sujeto mamífero, dichos métodos comprenden la administración de manera adecuada de una cantidad eficaz de un anticuerpo aislado antitoxina a (anti-AT) de S. aureus o fragmento de unión a antígeno del mismo a un sujeto que presenta síntomas de neumonía asociada a S. aureus. Dichos síntomas pueden incluir, por ejemplo, tos, dolor en el pecho, fiebre y dificultad para respirar.

Como se utiliza en el presente documento, "reducir la intensidad", como se utiliza en referencia a la neumonía, se refiere a la reducción de los síntomas que presenta un sujeto (de manera adecuada, un sujeto inmunodeprimido) que ha contraído neumonía asociada a S. aureus. De manera adecuada, los síntomas se reducen en al menos un 30 % en comparación con los síntomas que presenta un sujeto que también ha contraído neumonía asociada a S. aureus, pero al que no se le ha administrado un anticuerpo anti-AT o un fragmento de unión al antígeno del mismo. De manera más adecuada, los síntomas se reducen en al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o los síntomas se eliminan por completo (es decir, el sujeto se cura de la infección y, por lo tanto, de la neumonía) en comparación con un sujeto inmunodeprimido al que no se le ha administrado un anticuerpo anti-AT o fragmento de unión al antígeno del mismo antes del acontecimiento de infección.

Como se describe en el presente documento, de manera conveniente, los diversos métodos se llevan a cabo en sujetos mamíferos que son seres humanos, que incluyen adultos de cualquier edad y niños.

De manera adecuada, en los métodos descritos en el presente documento, los anticuerpos que se administran son fragmentos de unión a antígeno aislados Fv, Fab, Fab' y F(ab')2. El anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa, como se describe en el presente documento. De manera adecuada, el anticuerpo comprende una región variante Fc como se describe en detalle en todo el documento. Los métodos descritos a lo largo del documento utilizan de manera adecuada anticuerpos aislados que se unen de manera inmunoespecífica a un polipéptido toxina a de Staphylococcus aureus. Dichos anticuerpos comprenden de manera adecuada:

(a) una CDR1 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 69;

(b) una CDR2 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 70;

(c) una CDR3 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 71;

(d) una CDR1 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1;

(e) una CDR2 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; y

(f) una CDR3 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 68.

En realizaciones adicionales, los diversos métodos descritos en el presente documento utilizan anticuerpos que comprenden CDR que incluyen, por ejemplo, CDR1 de VH, CDR2 de Vh , CDR3 de VH, CDR1 de VL, CDR2 de VL y CDR3 de VL que comprenden las secuencias de aminoácidos de los SEQ ID NO: 69, 70, 71, 1, 2 y 68.

En realizaciones, el anticuerpo anti-AT aislado utilizado en los diversos métodos descritos en el presente documento comprende un dominio variable de cadena pesada que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 57 y comprende un dominio variable de cadena ligera que tiene al menos un 90 % de identidad a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58.

En aún otras realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el anticuerpo anti-AT aislado utilizado comprende un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO 57 y un dominio variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 58.

En realizaciones adicionales, los métodos descritos en el presente documento utilizan anticuerpos anti-AT que tienen VH y VL que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 57 y 58.

En realizaciones adecuadas, el anticuerpo anti-AT aislado comprende un anticuerpo anti-AT aislado que tiene un dominio variante Fc, en donde el anticuerpo comprende un VH-IgG1-YTE correspondiente al SEQ ID NO: 80 y/o un VL-Kappa correspondiente al SEQ ID NO: 81.

Ejemplos

Ejemplo 1: Establecimiento del modelo de septicemia

Preparación de la dosis de exposición de bacterias

SF8300 de S. aureus (USA300) fue proporcionado por Binh Diep (Universidad de California, San Francisco). Las bacterias se cultivaron durante una noche a 37 °C en 50 ml de caldo de soja tríptica (TBS) con agitación a 250 rpm. Se añadieron diez mililitros de cultivo de una noche a 1 l de TBS fresco y se cultivaron las bacterias a 37 °C con agitación hasta una densidad óptica a 600 nm (DO600) de 0,8. Las bacterias se recogieron mediante centrifugación a 8000 rpm durante 15min a 4 °C y se lavaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Las bacterias se recogieron mediante centrifugación y se resuspendieron en PBS con glicerol al 10 % hasta una concentración madre bacteriana final de ~2 * 1010 ufc/ml.

Exposición de los ratones y supervivencia

Se inyectaron por vía intraperitoneal (i.p.) a grupos de diez ratones BALB/c hembra de 8 a 9 semanas de edad los AcM LC10 a las concentraciones indicadas o r 347 (45 mg/kg) en 500 pl de PBS. Después, se expuso a los ratones por vía intravenosa (i.v.) en la vena caudal 24 h después con 200 pl de una suspensión bacteriana (5 * 107 ufc diluidas en PBS, pH 7,2, a partir de la solución madre congelada). Se controló la supervivencia de los ratones durante 14 días después de la exposición. El análisis estadístico se evaluó con una prueba de orden logarítmico: animales inmunizados con R347 (control) frente a LC10 (Ac anti-AT).

Carga bacteriana en el corazón

Se sacrificaron a los ratones infectados con CO² 14 h después de la infección. Se extrajo el corazón, se homogeneizó en tubos de matriz de lisado A en 1 ml de PBS frío y se sembraron en placas de TSA para la enumeración de bacterias. Se analizó la carga bacteriana en el tejido cardíaco en una comparación emparejada entre los AcM R347 y LC10 con una prueba de la t de Student bilateral para datos independientes. Los datos se consideraron significativos en caso de que p <0,05.

Carga bacteriana en la sangre

Se sacrificó a los animales con CO² a las 8, 24, 48, 72 y 144 h después de la infección. La sangre se recogió mediante punción cardíaca e inmediatamente se sembraron 100 pl en una placa de TBS para enumerar las ufc. Los datos se analizaron con una prueba de la t de Student para datos independientes. Los valores se consideraron estadísticamente diferentes entre los AcM LC10 y R347 en caso de que p <0,05. Ejemplo 2: Efecto profiláctico de los anticuerpos anti-AT en la septicemia

Para determinar si la inhibición de la AT mediada por anticuerpos anti-AT afectaría la progresión de la septicemia, se inmunizaron de manera pasiva grupos de 10 ratones con LC10 (45 y 15 mg/kg) o con un control de isotipo (R347, 45 mg/kg) 24 h antes de la exposición i.v. con SF8300 de S. aureus (USA300) y se controló la supervivencia durante 14 días. La profilaxis con LC10 aumentó de manera significativa la supervivencia, lo que indica que la AT juega un papel clave en la enfermedad sistémica provocada por S. aureus y que su inhibición con LC10 protege a los animales de la muerte (Figura 1).

Un sello distintivo de la septicemia provocada por S. aureus es la aglutinación bacteriana y la formación de lesiones tromboembólicas que se mide como UFC bacterianas en el corazón (McAdow et al., 2011). Para determinar si la profilaxis con LC10 redujo la carga bacteriana en el corazón, se inmunizaron de manera pasiva ratones con LC10 (15 y 45 mg/kg) o R347 (45 mg/kg) 24 h antes de la infección i.v. con SF8300. Catorce horas después de la infección, se sacrificaron los animales y se procesaron sus corazones para la enumeración de las UFC. Los ratones inmunizados de manera pasiva con LC10 presentaron una reducción significativa en las UFC en el corazón en relación con los ratones que recibieron el control R347 (Figura 2).

El efecto de la profilaxis con LC10 sobre los recuentos bacterianos en la sangre también se evaluó 24 a 72 h después de la infección i.v. Los recuentos bacterianos en el torrente sanguíneo de los ratones infectados permanecieron en ~103 ufc para los ratones tratados con R347 durante 72 h. Sin embargo, la profilaxis con LC10 dio como resultado una carga bacteriana reducida en todos los puntos temporales analizados con una reducción máxima de 2 órdenes de magnitud a las 72 h (Figura 3). Estos resultados indican que la AT es importante para la progresión de la septicemia y la inhibición de la AT con LC10 reduce las ufc bacterianas en el torrente sanguíneo y en el corazón y promueve la supervivencia después de la exposición i.v. con una dosis letal de S. aureus.

Ejemplo 3. Establecimiento de un modelo de neumonía inmunodeprimida

Los individuos inmunodeprimidos, en particular, aquellos que padecen de neutrocitopenia, están en mayor riesgo de infecciones por S. aureus (Andrews y Sullivan, 2003; Bouma et al., 2010). Para estudiar la eficacia de los anticuerpos anti-AT para su uso en la prevención de la neumonía provocada por S. aureus en personas inmunodeprimidas, se desarrolló y utilizó un modelo de neumonía murina inmunodeprimida. Para simular una infección en una población de individuos inmunodeprimidos, los ratones se volvieron neutropénicos mediante la administración de ciclofosfamida, un agente alquilante conocido por agotar los glóbulos blancos en ratones, incluidos los neutrófilos, los linfocitos y las plaquetas (Zuluaga, et al. 2006).

Se realizaron experimentos para determinar el régimen de dosificación óptimo de ciclofosfamida (CPM) necesario para reducir las células inmunitarias circulantes en ratones C57BL/6 en >90 %. El polvo de CPM se disolvió en agua estéril para inyección hasta una concentración final de 20 mg/ml. Se trataron grupos de 20 ratones mediante inyección intraperitoneal los días 0 y 3 con diferentes regímenes de dosificación de CPM. Se sacrificaron grupos de 5 animales los días 0, 1, 4 y 6 y se recogió sangre mediante punción cardíaca en tubos Vacutainer EDTA. A continuación, se obtuvieron recuentos diferenciales de glóbulos blancos (WBC, del inglés "white blood cell") (neutrófilos y linfocitos) con un analizador de hematología automatizado Sysmex.

Modelo de neumonía en ratones

Preparación de la dosis de exposición de bacterias

Se cultivó SF8300 de S. aureus durante la noche a 37 °C en 50 ml de caldo de soja tríptico (TSB) con agitación a 250 rpm. Se añadieron diez mililitros de cultivo de una noche a 1 l de TBS fresco y se cultivaron las bacterias a 37 °C con agitación hasta una densidad óptica de 0,8 a 600 nm (DO600). Las bacterias se recogieron mediante centrifugación a 8000 rpm durante 15 min a 4 °C y se lavaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Las bacterias se recogieron de nuevo mediante centrifugación y se resuspendieron en PBS con glicerol al 10 % hasta una concentración madre bacteriana de ~2 * 1010 UFC/ml.

Modelo de neumonía en ratones inmunodeprimidos

Inicialmente, la dosis mínima letal de S. aureus en ratones inmunodeprimidos se identificó en un experimento de valoración de la dosis de exposición. Veinticuatro horas después de la segunda dosis de CPM, los ratones inmunodeprimidos se anestesiaron con isofluorano antes de la inoculación con 50 pl de una suspensión de S. aureus (1 * 107 a 2 * 108 UFC) en las fosas nasales izquierda y derecha. Los animales se colocaron en una jaula en posición supina para su recuperación y se observó la letalidad durante un período de 7 días.

Ejemplo 4. Efecto profiláctico de los anticuerpos anti-AT estafilocócica en la neumonía neutropénica

Estudio de eficacia de AcM anti-AT en modelo de neumonía inmunodeprimida

Se utilizaron 30 animales en este experimento, asignados al azar en 3 grupos. A los animales se les administró CPM 4 días y 1 día antes de la infección. A cada grupo también se le administró LC10 (45 o 15 mg/kg) o R347 (45 mg/kg) 24 h antes (día -1) de la exposición intranasal (i.n.) con SF8300 de S. aureus (5 * 107) y se observó la supervivencia de hasta 7 días. La significación estadística se determinó utilizando una prueba de orden logarítmico.

Verificación de la inmunodeficiencia

Se realizaron experimentos para determinar el régimen de dosis óptimo de CPM para reducir el recuento total de glóbulos blancos, incluidos los neutrófilos, en un 90 %. Se trataron grupos de 20 ratones con 6 regímenes de dosificación de CPM diferentes en los días 0 y 3. Se recogieron muestras de sangre de 5 ratones en cada grupo de dosis los días 0, 1, 4 y 6, y se realizaron recuentos de glóbulos blancos totales y diferenciales con un analizador de hematología Sysmex. En los días 4 y 6, los animales del grupo 6 (primera dosis de CPM 150 mg/kg; segunda dosis de CPM de 100 mg/kg [CPM150/100] presentaron una reducción del 90% en el total de los glóbulos blancos en relación con los animales no tratados. Hubo una reducción del 90 % en los neutrófilos y los linfocitos en los días 4 y 6 en este grupo (Figura 4). Los leucocitos comenzaron a recuperarse en el día 7. Estos resultados son coherentes con los informados previamente (Zuluaga et al., 2006). Por tanto, se seleccionó una dosis de CPM 150/100 para evaluar la profilaxis de LC10 en animales inmunodeprimidos.

Determinación de la dosis de exposición bacteriana en el modelo de neumonía inmunodeprimida

Para determinar la dosis de exposición letal mínima en animales inmunodeprimidos, se valoró SF8300 de S. aureus (de 2 x ^{1 0 8} a 1 x 107 UFC) mediante exposición i.v. en grupos de 5 ratones. Se observó la letalidad durante 7 días (Figura 5). La dosis letal más baja fue de 5 x 107 UFC y se seleccionó como la dosis para probar la profilaxis con LC10.

LC10 aumenta la supervivencia en animales con neumonía inmunodeprimidos

Para comprender el efecto de la profilaxis con LC10 en ratones inmunodeprimidos, a los animales inyectados con CPM se les administró LC10 (45 o 15 mg/kg) o R347 a 45 mg/kg 24 horas antes de la exposición i.v. con 50 pl de una suspensión bacteriana (SF8300 a 5 x 107 UFC) y se observó la letalidad como se describe anteriormente.

La inmunización pasiva con LC10 a 45 o 15 mg/kg dio como resultado un aumento significativo en la supervivencia en relación con el control R347 (p <0,0001) (Figura 6). Para confirmar que los animales estaban inmunodeprimidos en este estudio, se recogieron muestras de sangre de grupos de 5 ratones no infectados en los días -4, -3, 1, 0, 2 y 3. Se realizaron recuentos de glóbulos blancos totales y diferenciales, y hubo una reducción del 90 % en el total de glóbulos blancos, así como de neutrófilos y linfocitos, entre los días -4 y -2 para estos animales. Los animales presentaron neutrocitopenia intensa (<10 neutrófilos/pl de sangre) en los días 0 a 2 (Figura 7). Por tanto, la profilaxis con LC10 puede reducir la intensidad de la enfermedad en un modelo de neumonía neutropénica en ratones provocada por S. aureus.

Conclusiones

Se desarrolló un modelo de neumonía en ratones inmunodeprimidos provocada por S. aureus utilizando ciclofosfamida, lo que dio como resultado una reducción >90 % de los glóbulos blancos circulantes, incluidos los neutrófilos y los linfocitos. Los ratones presentaron neutrocitopenia intensa con <10 neutrófilos/pl de sangre. La profilaxis con LC10 mejoró de manera significativa la supervivencia en un modelo de neumonía neutropénica en ratones provocada por S. aureus. Estos resultados indican que la inmunización pasiva con LC1024 horas antes de una infección por S. aureus de ratones neutropénicos mediante la administración de ciclofosfamida mejora de manera significativa la supervivencia. Por lo tanto, esto demuestra que los anticuerpos anti-AT pueden prevenir la enfermedad en pacientes inmunodeprimidos.

Claims (5)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo antitoxina a (anti-AT) de S. aureus aislado para su uso en la reducción de la intensidad de una neumonía asociada a S. aureus en un sujeto mamífero inmunodeprimido, en el que la CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH, CDR1 de VL, CDR2 de VL y CDR3 de VL comprenden las secuencias de aminoácidos de los SEQ ID NO: 69, 70, 71, 1, 2 y 68.

2. El anticuerpo antitoxina a (anti-AT) de S. aureus aislado para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho sujeto mamífero es un ser humano.

3. El anticuerpo antitoxina a (anti-AT) de S. aureus aislado para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en donde el anticuerpo aislado comprende (i) un dominio variable de cadena pesada (VH), que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 57; y (ii) comprende un dominio variable de cadena ligera (VL), que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58.

4. El anticuerpo antitoxina a (anti-AT) de S. aureus aislado para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el VH y VL comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 57 y 58.

5. El anticuerpo antitoxina a (anti-AT) de S. aureus aislado para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el anticuerpo aislado comprende además un dominio variante Fc, en donde el anticuerpo comprende un VH-IgG1-YTE, que comprende el SEQ ID NO: 80, y/o un VL-Kappa, que comprende el SEQ ID NO: 81.