KR20210083389A - 에스.아우레우스 연관 질병의 치료 방법 - Google Patents

에스.아우레우스 연관 질병의 치료 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 면역 약화된 환자에서 항 에스.아우레우스 알파 독소(항 AT) 항체를 사용하여 에스.아우레우스 연관 균혈증과 패혈증을 예방 및/또는 치료하는 방법과, 에스.아우레우스 연관 폐렴을 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공한다. 또한 본원에는 포유동물 피험체의 혈류 또는 심장 내 에스.아우레우스 세균량을 감소시키는 방법으로서, 분리된 항 에스.아우레우스 알파 독소(항 AT) 항체 또는 이의 항원 결합 단편 유효량을 피험체에 투여하는 단계를 포함하는 방법도 제공된다. 포유동물 피험체 내 에스.아우레우스 세균 응집 반응 및/또는 혈전색전성 병변 형성을 감소시키는 방법으로서, 분리된 항 에스.아우레우스 알파 독소(항 AT) 항체 또는 이의 항원 결합 단편 유효량을 피험체에 투여하는 단계를 포함하는 방법도 제공된다. 또한 면역 약화된 포유동물 피험체 내 에스.아우레우스 연관 폐렴을 예방하거나 이 폐렴의 중증도를 감소시키는 방법도 제공된다.

Description

에스.아우레우스 연관 질병의 치료 방법{METHODS OF TREATING S. AUREUS-ASSOCIATED DISEASES}
본 발명은 항 에스.아우레우스 알파 독소(항 AT) 항체를 사용하여 면역 약화된 환자들에서 에스.아우레우스 연관 균혈증 및 패혈증을 예방 및/또는 치료하는 방법과, 에스.아우레우스 연관 폐렴을 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공한다.
스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)(에스.아우레우스; S.aureus)는 경증의 피부 감염 및 연 조직 감염으로부터 중증의 침습성 질병, 예를 들어 심내막염, 골수염 및 괴사성 폐렴에 이르기까지 다양한 조합의 감염들을 유발하는 것으로서, 전 세계 사망 및 이환의 주요 원인이다(Lowy FD, N Engl J Med, 339(8): 520-32 (1998); Klevens et al, JAMA 298(15): 1763-71 (2007)). 에스.아우레우스는 통상적으로 메티실린 내성(MRSA)인 것 또는 메티실린 감수성(MSSA)인 것으로 분류된다. 몇몇 보고서는, 에스.아우레우스 감염은 내성 상태와는 상관 없이 심각한 결과를 초래한다고 보고한 바 있다(Fowler et al, Arch Intern Med. 163(17):2066-72 (2003); de Kraker et al, PLoS Med. Oct;8(10):e1001104 (2011)).
항생제는 에스.아우레우스 질병 치료에 대한 관리의 기준이다. 에스.아우레우스에 대한 신규 항생제들의 도입에도 불구, 새로운 내성 기작들이 생겨남에 따라서 에스.아우레우스 질병을 예방 또는 치료하는 신규 접근법이 필요하다. 항생제가 사용되던 시기 이전에는 박테리아 감염을 치료하기 위해 감염된 환자들에게 면역 혈청을 임상학적으로 수동 투여하는 방법이 사용되었다(Keller 및 Stiehm, Clin Microbiol Rev 13(4):602-14 (2000)). 오늘날, 독소 매개 세균성 질병들 중 일부(예를 들어 보툴리누스 중독증, 디프테리아, 파상풍)를 치료하기 위해 유사한 방법들이 사용되고 있다(Keller and Stiehm, Clin Microbiol Rev 13(4):602-14 (2000); Arnon et al, N. Engl. J. Med. 354: 462-471 (2006)). 에스.아우레우스 알파 독소(AT)가 발현되지 않는 에스.아우레우스 균주들과 동질 유전자 야생형 모 균주들의 비교를 통하여, 상기 AT는 몇몇 에스.아우레우스 질병 모델(예를 들어 피부 괴사, 폐렴, 패혈증, 심근염 및 유방염)에 있어 (다수의 기타 세포 외 인자들 중에서) 중요한 독성(virulence) 결정 인자인 것으로 파악되었다(Bramley et al, Infect Immun. 57(8):2489-94 (1989); Bayer et al, Infect. Immun. 65: 4652-4660 (1997); Kernodle et al, Infect. Immun. 65: 179-184 (1997); Bubeck Wardenburg et al, Infect Immun. 75(2):1040-4 (2007); Bubeck Wardenburg et al, J Exp Med. 205(2):287-94 (2008); Kobayashi et al, J Infect Dis. 204(6):937-41 (2011)).
AT는 에스.아우레우스 균주들의 90%에 의해 생산되는 33kDa의 세포 용해성 공극 형성 독소로서, 주요 독성 인자인 것으로 간주되고 있다. 상기 AT는 단량체로서 분비되고, 표적 세포막 상 특이 수용체인 ADAM-10과 결합한다(Wilke and Bubeck Wardenburg, PNAS 107(30):13473-8 (2010); Inoshima et al, Nat Med 17(10):1310-4 (2011)). AT는 올리고머화되어 7량체 예비 공극(heptameric prepore)을 형성한 후, 구조적 변화를 거쳐 경막 β-배럴(transmembrane β-barrel)을 형성하고, 궁극적으로는 세포를 용해시킨다(Bhakdi and Tranum-Jensen, 1991; Song et al, 1996). 상피 세포, 내피 세포 및 면역 세포(예를 들어 림프구 및 대식 세포)와 함께, 혈소판은 AT 용해에 취약한데, 이는 이 독소가 조직 손상과 면역 회피에 직접적인 영향을 미친다는 것을 암시한다(Bhakdi and Tranum-Jensen, Microbiol Rev. 55(4):733-51 (1991); Ragle and Bubeck Wardenburg, Infect Immun. 77(7):2712-8 (2009); Tkaczyk et al, Clin Vaccine Immunol 19(3):377-85 (2012)). AT가 아 용해 농도(sub-lytic concentration)로 존재할 때, 이 AT는 또한 유의적인 세포 독성 효과들을 나타내는 것으로 입증된 바 있다(Grimminger et al, J Immunol. 159(4):1909-16 (1997); Wilke and Bubeck Wardenburg, PNAS 107(30):13473-8 (2010); Inoshima et al, Nat Med 17(10):1310-4 (2011)). 대식 세포막 상 AT 결합 및 올리고머화는, 기타 스타필로코커스 병원균 연관 분자 패턴(PAMP)들과 함께 IL-1β 분비를 유도하고 세포 사멸을 촉진하는, NLRP3 인플라마솜을 활성화한다(Craven et al, PLoS One 4(10) (2009); Kebaier et al, J Infect Dis 205(5):807-17 (2012)). 전 염증성 시토킨(예를 들어 IL-1β) 발현의 증가는 급성 폐 손상의 전형적인 특징이다(Goodman et al, Cytokine Growth Factor Rev.14(6):523-35(2003)).
AT는 또한 아 용해 농도에서 세포-세포 흡착 접촉에 관여하는 E-카데린의 ADAM-10 매개 단백 분해를 활성화하여 상피의 일체성을 파괴하고, 폐렴, 그리고 피부 및 연 조직 감염에서 관찰되는 상피 손상을 초래하기도 한다(Inoshima et al, Nat Med 17(10):1310-4 (2011); Maretzky et al, PNAS 102(26):9182-7 (2005); Inoshima et al, J Invest Dermatol. 132(5):1513-6 (2012)). AT는 직접 활성 및 간접 활성을 통하여 세포 독성 효과를 발휘함으로써 세균 생육 및 침습성 질병에 대해 전도성인 환경을 조성한다. 결과적으로 AT의 표적화된 억제는 에스.아우레우스 연관 질병을 예방 또는 제한할 수 있었다. 이와 같은 가설은, 쥣과 동물 감염 모델에서 AT에 대해 능동 또는 수동 면역화가 유도된 후 에스.아우레우스 질병의 중증도가 감소되는 것을 입증하는 다른 연구들에 의해 뒷받침된다(Menzies 및 Kernodle, Infect Immun 64(5):1839-41(1996); Bubeck Wardenburg et al, J Exp Med. 205(2):287-94 (2008); Ragle 및 Bubeck Wardenburg, Infect Immun. 77(7):2712-8 (2009); Kennedy et al, J Infect Dis. 202(7):1050-8 (2010); Tkaczyk et al, Clin Vaccine Immunol 19(3):377-85 (2012)).
Fc 변이체 부분을 가지는 항 AT 항체와 이의 모 항체인 LC10은 인간의 고 친화성 항 AT mAb이다[그 내용들이 각각 본원에 참고 문헌으로서 인용되어 있는 미국 가 명세서 특허 출원 제61/440,581호 및 국제 특허 출원 공보 제PCT/US2012/024201호(제WO2012/109205호로서 공개됨)와, 문헌(Tkaczyk et al., Clinical 및 Vaccine Immunology, 19(3): 377 (2012))에 이미 개시됨].
균혈증 및 패혈성 쇼크는 스타필로코커스 아우레우스 침습성 질병의 대다수를 차지한다(Klevens, et al, JAMA, 298(15): 1763-71 (2007)). AT는 에스.아우레우스 패혈증 진행중 중요한 독성 인자이면서, 패혈증 진행중 내피 손상에 관여하는 것으로 제시된 바 있다(Powers, et al, J. Infect Dis. 206(3):352-6 (2012)). AT와 이의 내피 세포 상 수용체의 상호 작용은, 내피 밀착 연접의 ADAM-10 매개 단백 분해 활성화 또는 직접적인 세포 용해를 통하여 상기 독소가 혈관 손상을 매개할 수 있도록 해준다(상동). 상기 두 기작은 세균성 패혈증의 전형적인 특징인 혈관 투과성의 증가를 초래할 것이다.
항 AT 모노클로날 항체가 이용되는 수동 면역화는 스타필로코커스에 의한 폐렴의 쥣과 동물 모델에서 생존율을 유의적으로 증가시키는 것으로 파악된 바 있지만(미국 가 명세서 특허 출원 제61/440,581호 및 국제 특허 출원 제PCT/US2012/024201호에 기술됨), 상기 항 AT 항체가 에스.아우레우스 연관 질병들이 발병한 면역 약화 포유동물들에서도 생존율을 증가시키는데 효과적인지 여부는 알려져 있지 않다. 이는, 면역 약화된 개체들, 특히 호중구 감소증이 발병한 개체들에서 에스.아우레우스 감염의 위험성이 증가하는 것으로 이해되는데 있어서 중요한 견해이다(Andrews and Sullivan, Clin Microbiol Rev. 16(4):597-621 (2003); Bouma et al., Br J Haematol. 151(4):312-26 (2010)).
본 발명은 항 AT 항체들이 패혈증 및 면역 약화 폐렴의 예방에 있어서 효과적이라는 것을 처음으로 입증하는 것이다.
본원에는 포유동물 피험체 내에서 에스.아우레우스 연관 패혈증을 예방하거나 이의 중증도를 감소시키는 방법으로서, 상기 피험체에 분리된 항 에스.아우레우스 알파 독소(항 AT) 항체 또는 이의 항원 결합 단편 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공되어 있다. 본원에는 또한 포유동물 피험체의 혈류 또는 심장에서 에스.아우레우스 세균량(bacterial load)을 감소시키는 방법으로서, 상기 피험체에 분리된 항 에스.아우레우스 알파 독소(항 AT) 항체 또는 이의 항원 결합 단편 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법도 제공되어 있다. 포유동물 피험체에서 에스.아우레우스 세균 응집 반응 및/또는 혈전색전성 병변의 형성을 감소시키는 방법으로서, 상기 피험체에 분리된 항 에스.아우레우스 알파 독소(항 AT) 항체 또는 이의 항원 결합 단편 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법도 제공되어 있다. 뿐만 아니라, 면역 약화된 포유동물 피험체에서 에스.아우레우스 연관 폐렴을 예방하거나 이의 중증도를 감소시키는 방법으로서, 상기 피험체에 분리된 항 에스.아우레우스 알파 독소(항 AT) 항체 또는 이의 항원 결합 단편 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법도 제공되어 있다.
본원에 기술된 여러 가지 방법들에 있어서, 피험체의 혈류 또는 심장 내 에스.아우레우스 세균량이 적당히 감소하고, 추가의 구체예에서, 피험체 내 에스.아우레우스 세균 응집 반응 및/또는 혈전색전성 병변 형성은 감소한다.
적당하게 본원에 기술된 여러 가지 방법들에 있어서 포유동물 피험체는 인간이다.
여러 가지 방법들에서, 분리된 항 AT 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Fv, Fab, Fab' 및 F(ab')2로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 구체예에서, 항체는 전장 항체이다. 또 다른 구체예에서, 항체는 Fc 변이체 부분을 포함한다.
본원에 기술된 여러 가지 방법들에 관한 구체예들에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드와 면역 특이적으로 결합하고, 다음과 같은 것들을 포함한다:
(a) 서열 번호 7, 10, 13 또는 69의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1;
(b) 서열 번호 8, 11, 14, 17. 70 또는 75의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2;
(c) 서열 번호 9, 12, 15, 18, 16, 65, 66, 67, 71, 72, 76 또는 78의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3;
(d) 서열 번호 1 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1;
(e) 서열 번호 2, 5, 73 또는 77의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 그리고
(f) 서열 번호 3, 6, 64, 68 또는 74의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3.
구체예들에 있어서, 본원에 기술된 여러 가지 방법들에 사용될 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3는 서열 번호 7, 8, 9, 1, 2 및 3; 서열 번호 10, 11, 12, 1, 2 및 3; 서열 번호 13, 14, 15, 4, 5 및 6; 서열 번호 7, 17, 18, 1, 2 및 3; 서열 번호 7, 8, 16, 1, 2 및 64; 서열 번호 7, 8, 65, 1, 2 및 64; 서열 번호 7, 8, 66, 1, 2 및 64; 서열 번호 7, 8, 67, 1, 2 및 68; 서열 번호 7, 8, 67, 1, 2 및 64; 서열 번호 7, 8, 78, 1, 2 및 64; 서열 번호 7, 8, 65, 1, 2 및 68; 서열 번호 69, 70, 71, 1, 2 및 68; 서열 번호 7, 8, 72, 1, 73 및 74; 서열 번호 69, 75, 71, 1, 2 및 68; 서열 번호 69, 75, 76, 1, 2 및 68; 서열 번호 69, 75, 76, 1, 77 및 74; 서열 번호 69, 70, 71, 1, 77 및 74의 아미노산 서열들에 상응한다.
추가의 구체예에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 또는 62의 아미노산 서열에 대하여 90% 이상의 동일성을 가지는 중쇄 가변 도메인을 포함하고, (iii) 서열 번호 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 또는 63의 아미노산 서열에 대하여 90% 이상의 동일성을 가지는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 적당하게, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 또는 62의 중쇄 가변 도메인과, 서열 번호 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 또는 63의 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
본원에 기술된 다양한 방법들에 관한 추가의 구체예들에서, VH 및 VL은 서열 번호 20 및 19; 서열 번호 22 및 21; 서열 번호 24 및 23; 서열 번호 26 및 25; 서열 번호 28 및 27; 서열 번호 41 및 42; 서열 번호 43 및 44; 서열 번호 45 및 46; 서열 번호 47 및 48; 서열 번호 47 및 48; 서열 번호 49 및 50; 서열 번호 51 및 52; 서열 번호 51 및 52; 서열 번호 53 및 54; 서열 번호 55 및 56; 서열 번호 57 및 58; 서열 번호 59 및 60; 서열 번호 61 및 58; 서열 번호 62 및 58; 서열 번호 62 및 63; 서열 번호 79 및 63의 아미노산 서열들에 상응한다.
다양한 방법들에 관한 또 다른 구체예에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Fc 변이체 도메인을 가지는 항 AT 항체를 포함하는데, 이 경우, 상기 항체는 서열 번호 80에 상응하는 VH-IgG1-YTE 및/또는 서열 번호 81에 상응하는 VL-카파를 포함한다.
도 1은, LC10이 사용되는 예방법이 IV 치사 공격 모델의 생존율을 개선함을 보여주는 것이다. 마우스(군당 10마리)는 SF8300(3×108cfu)로 IV 공격하기 24시간 전에 LC10(45 및 15㎎/㎏) 또는 이소타입 대조군(R347, 45㎎/㎏)으로 수동 면역화되었다. 생존율은 14일 동안 모니터되었다. 데이터는 4회의 독립 실험들을 대표하는 것이다. 통계학상 유의성은 로그 순위(마텔-콕스(Martel-Cox)) 검정으로 평가되었다(*p값 = 0.0005; **p값 = 0.0043).
도 2는, LC10이 사용되는 예방법이 심장 내 세균량을 감소시킴을 보여주는 것이다. 마우스는 SF8300(2.988cfu)로 IV 공격되기 24시간 전에 LC10(45 및 15㎎/㎏) 또는 이소타입 대조군(R347, 45㎎/㎏)으로 수동 면역화되었다. 감염 후 14시간 경과시, 감염된 동물들로부터 심장들을 수집하고 나서, 이를 대상으로 CFU 계수(CFU enumeration)가 수행되었다. 짝을 이루지 않는(unpaired) 양측 스튜던트 t-검정을 통하여 통계학적 분석이 수행되었다(*p값 = 0.0028; **p값 = 0.0082).
도 3은, LC10이 사용되는 예방법이 스타필로코커스 균혈증을 완화함을 보여주는 것이다. 마우스는 SF8300(3×108cfu)로 IV 공격하기 24시간 전에 LC10(45 및 15㎎/㎏) 또는 이소타입 대조군(R347, 45㎎/㎏)으로 수동 면역화되었다. 감염 후 여러 시점에서 심장 천자를 통해 혈액이 채취되었으며, 이 혈액은 CFU 계수를 위해 도말되었다. 스튜던트 t-검정으로 통계학적 분석이 수행되었다. 만일 *p값이 0.05 미만이면 데이터는 R347에 대한 데이터와 통계학상 상이한 것으로 간주되었다.
도 4는, 총 백혈구 수 및 백혈구 백분율을 보여주는 것이다. 제0일 및 제3일 경과시 C57BL6/J 마우스에 6가지의 상이한 투여량(㎎/㎏)으로 CPM이 투여되었다. 제0일, 제1일, 제4일 및 제6일 경과시 각각의 시점에 군당 5마리의 마우스 혈액 샘플을 채취하였다. 시스멕스(Sysmex) 자동화 혈액학 분석 장치를 사용하여 총 백혈구(호중구, 림프구) 수 및 백혈구(호중구, 림프구) 백분율이 분석되었다.
도 5는, 세균 투여량 적정 결과를 보여주는 것이다. 5마리의 면역 약화 마우스는 CPM이 2차로 투여된 후 24시간 경과시(제4일)에 대수기 세균 현탁액 50㎕로 IN 공격되었다(이때의 투여량 범위는 1×107~2×108CFU이었음). 동물의 생존율은 7일의 기간 동안 관찰되었다.
도 6은, LC10이 면역 약화된 동물들에 있어서 생존율을 증가시킴을 보여주는 것이다. 세균 현탁액 SF8300(5×107CFU) 50㎕로 IN 감염이 수행되기 24시간 전에 CPM이 주사된 동물들에게 LC10(45 또는 15㎎/㎏) 또는 R347(45㎎/㎏)이 투여되었다. 동물 생존율은 5일 동안 모니터되었다. 통계학적 유의성은 로그 순위 검정을 이용하여 평가되었으며, 이때 *는 R347로 처리된 동물들에 상대적인 통계학적 차이를 나타낸다(p < 0.0001).
도 7은, 총 백혈구 수 및 백혈구 백분율을 보여주는 것이다. 세균 현탁액이 주사되기 4일 전 및 1일 전, C57BL/6 마우스에 2가지의 투여량(150㎎/㎏ 및 100㎎/㎏)으로 CPM이 조심스럽게 투여되었다. 세균 현탁액이 주사되기 4일 전, 3일 전, 1일 전, 당일, 2일 경과시 및 3일 경과시에 5마리의 마우스로부터 혈액 샘플들을 채취하였다. 시스멕스 자동화 혈액학 분석 장치를 사용하여 총 백혈구(호중구, 림프구) 수 및 백혈구(호중구, 림프구) 백분율이 분석되었다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드", "단백질" 및 "단백질 단편"은 본원에서 호환되어 사용되고 있는 것으로서, 아미노산 잔기들의 중합체를 말하는 것이다. 상기 용어들은 하나 이상의 아미노산 잔기가 자연 발생 아미노산에 상응하는 화학적 인공 모의체인 아미노산 중합체들과, 자연 발생 아미노산 중합체들 및 비 자연 발생 아미노산 중합체들에 적용된다.
용어 "아미노산"이란, 자연 발생 및 합성 아미노산과, 자연 발생 아미노산과 유사하게 작용을 하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모의체를 말한다.
본원에 사용된 바와 같은 "재조합체"는, 천연 상태에서는 단백질을 발현할 수 있는 DNA의 내인성 복사체를 가지지 않는 세포를 사용하여 생산된, 해당 단백질을 일컫는 말을 포함한다. 상기 세포들을 적당한 분리 핵산 서열의 도입을 통하여 유전적으로 변형되었기 때문에, 이 세포들은 재조합체 단백질을 생산한다.
본원에 사용된 바와 같은 "항체" 및 "면역 글로불린"은 가장 넓은 의미에서 호환되어 사용되고 있는 것으로서, 본원에 기술된 바와 같이 모노클로날 항체(예를 들어 전장 또는 비 변형 모노클로날 항체), 폴리클로날 항체, 다가 항체, 다중 특이적 항체(예를 들어 이중 특이적 항체가 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 해당 이중 특이적 항체) 및 항원 결합 단편을 포함한다. 천연 항체 및 면역 글로불린은 일반적으로 약 150,000 달톤의 이종 4량체 당단백질로서, 동일한 경쇄(L) 2개와 동일한 중쇄(H) 2개로 이루어져 있다. 각각의 경쇄는 하나의 공유 이황화물 결합에 의해 중쇄에 결합하고 있는데, 이때 상기 이황화물 결합의 수는 상이한 면역 글로불린 이소타입들의 중쇄들 간에 다양하다. 각각의 중쇄와 경쇄는 또한 일정한 간격을 두고 떨어져 있는 사슬 내 이황화물 가교들을 가진다. 각각의 중쇄는 한쪽 말단부에 가변 도메인(VH)을 가지며, 이 가변 도메인 뒤에는 다수의 불변 도메인들이 따른다. 각각의 경쇄는 한쪽 말단부에 가변 도메인(VL)을 가지며, 다른 쪽 말단부에는 불변 도메인을 가진다. 용어 "불변" 및 "가변"은 기능상 사용된다.
경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 나란히 배열되어 있으며, 경쇄의 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 나란히 배열되어 있다. 특정 아미노산 잔기들은 경쇄 가변 도메인들 및 중쇄 가변 도메인들 간 계면을 형성하는 것으로 생각된다(Clothia, et al., J. Mol. Biol. 186, 651-66 (1985); Novotny 및 Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 4592-4596 (1985)). 5개의 인간 면역 글로불린 군은 자체의 중쇄 조성을 바탕으로 정의되며, IgG, IgM, IgA, IgE 및 IgD라 칭하여진다. IgG 군 항체들과 IgA 군 항체들은 하위 군, 즉 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4와, IgA1 및 IgA2로 세분된다. IgG, IgA 및 IgD 항체들의 중쇄들은 CH1, CH2 및 CH3이라 명명되는 불변부 도메인 3개를 가지고, IgM 및 IgE 항체들의 중쇄들은 4개의 불변부 도메인들, 즉 CH1, CH2, CH3 및 CH4를 가진다. 즉 중쇄는 가변부 1개와 불변부 3개 또는 4개를 가진다. 면역 글로불린 구조와 기능은, 예를 들어 문헌(Harlow et al., Eds., Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 14, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (1988))에 논의되어 있다.
"VH" 또는 "VH"에 관한 기호들은, Fv, scFv, dsFv 또는 Fab을 비롯한 면역 글로불린 중쇄의 가변부를 말한다.
"VL" 또는 "VL"에 관한 기호들은, Fv, scFv, dsFv 또는 Fab을 비롯한 면역 글로불린 경쇄의 가변부를 말한다.
용어 "항원 결합 단편"이란, 비 변형 항체의 일부분을 말하고, 또한 비 변형 항체의 항원 결정성 가변부를 말하기도 한다. 항원 결합 단편의 예로서는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 및 단일 사슬 Fv 단편, 선형 항체, 단일 사슬 항체와, 항원 결합 단편들로 형성된 다중 특이적 항체를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
용어 "단일 사슬 Fv" 또는 "scFv"란, 통상의 2 사슬 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인들이 연결되어 하나의 사슬을 형성하고 있는 항체를 말한다. 상기 용어들은 하나의 경쇄 가변 도메인(VL) 또는 이의 일부분과, 하나의 중쇄 가변 도메인(VH) 및 이의 일부분으로 이루어진 결합 분자들을 포함하는데, 여기서 각각의 가변 도메인(또는 이의 일부분)은 동일하거나 상이한 항체들로부터 유래한다. scFv 분자는 통상적으로 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 위치하는 scFv 링커를 포함한다. scFv 분자는 당 업계에 알려져 있으며, 모두가 그 자체로서 본원에 참고 문헌으로서 인용되어 있는 문헌들[예를 들어 미국 특허 제5,892,019호(Ho외 다수), Gene 77:51-59 (1989); Bird, et al., Science 242:423-426 (1988); Pantoliano, et al., Biochemistry 30:10117-10125 (1991); Milenic, et al., Cancer Research 51:6363-6371 (1991); Takkinen, et al., Protein Engineering 4:837-841 (1991)]에 기술되어 있다.
항 에스.아우레우스 알파 독소 항체 및 항원 결합 단편들
본원에 사용되는 바와 같은 항 에스.아우레우스 알파 독소(항 에스.아우레우스 AT 또는 항 AT라고도 칭하여짐) 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 알파 독소 단백질, 펩티드, 서브유닛, 단편, 일부분, 올리고머 또는 이것들의 임의의 조합에 특이적인 에피토프 하나 이상에 면역 특이적으로 결합하며, 일반적으로는 다른 폴리펩티드들과는 특이적으로 결합하지 않는다. 용어 "올리고머" 또는 "알파 독소 올리고머"란, 기능성 공극(예를 들어 7개의 알파 독소 단량체로 이루어진 공극)을 형성하는 알파 독소 단량체들(예를 들어 2개의 단량체, 3개의 단량체, 4개의 단량체, 5개의 단량체, 6개의 단량체 또는 7개의 단량체)의 집합체를 말한다. 에피토프는 알파 독소 단백질의 일부분 하나 이상을 포함하는 항체 결합부 하나 이상을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "에피토프"란, 항체에 결합할 수 있는 단백질 결정기를 말한다. 에피토프는 일반적으로 분자들의 화학 활성 표면 기들, 예를 들어 아미노산 및/또는 당 측쇄를 포함하고, 일반적으로 특이적인 3차원 구조적 특징들과 특이적인 화학적 특징들(예를 들어 전하, 극성, 염기성, 산성 및 소수성 등)을 가진다. 구조적 에피토프들 및 비 구조적 에피토프들은, 변성 용매들이 존재할 때 구조적 에피토프들의 결합은 파괴되지만 비 구조적 에피토프들의 결합은 그렇지 않다는 점에서 구별된다. 몇몇 구체예에서, 인지된 에피토프는 활성 7량체의 형성을 방해한다(예를 들어 알파 독소 단량체들이 활성 7량 복합체로 올리고머화되는 것을 억제한다.
임의의 구체예에서, 에피토프는 알파 독소 단백질의 적어도 일부분(알파 독소 7량 복합체의 형성에 관여하는 부분)으로 이루어져 있다. 알파 독소 단백질의 연속 아미노산들 중 특정된 일부분 전체에 대한 특정 에피토프는, 3개 이상의 아미노산 잔기들로 이루어진 하나 이상의 아미노산 서열의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 알파 독소 단백질의 연속 아미노산들 중 특정된 일부분 전체에 대한 에피토프는 4개 이상의 아미노산 잔기, 5개 이상의 아미노산 잔기, 6개 이상의 아미노산 잔기, 7개 이상의 아미노산 잔기, 8개 이상의 아미노산 잔기, 9개 이상의 아미노산 잔기, 10개 이상의 아미노산 잔기, 11개 이상의 아미노산 잔기, 12개 이상의 아미노산 잔기, 13개 이상의 아미노산 잔기, 14개 이상의 아미노산 잔기 또는 15개 이상의 아미노산 잔기이다. 기타 임의의 구체예에서, 에피토프는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 연속 또는 불연속 아미노산 잔기들을 포함한다. 추가의 구체예에서, 에피토프 내에 포함되어 있는 아미노산 잔기들은 알파 독소 7량 복합체 형성에 관여한다.
그러므로 특정 구체예에서, 분리/정제된 항 알파 독소 항체 및 항원 결합 단편은 서열 번호 39에 의한 아미노산 서열을 포함하는 분자 및/또는 서열 번호 40에 의한 아미노산 서열을 포함하는 분자와 면역 특이적으로 결합한다. 임의의 구체예에서, 항 알파 독소 항체들과 항원 결합 단편들은 또한 상이한 종들로부터 유래하는 알파 독소 동족체(homolog)나 오솔로그(ortholog), 또는 서열 번호 39의 아미노산 서열의 변이체와도 결합하는데, 이 경우, 35번 위치의 히스티딘은 루신으로 치환되거나, 또는 당 업자에게 알려진 H35 돌연 변이들에 상응하는 다른 아미노산들로 치환된다.
가변부
임의의 구체예에서, 항 알파 독소 항체 또는 항원 결합 단편은 모 항체로부터 제조된다. 몇몇 구체예에서, 항 알파 독소 항체 또는 항원 결합 단편은 모 항체에 포함된다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "모 항체"란, 본원에 정의된 변이체 또는 유도체의 제조에 사용되는 아미노산 서열에 의해 암호화되는 항체를 말한다. 모 폴리펩티드는 천연 항체 서열(즉 자연 발생 대립 형질 변이체를 비롯한 자연 발생 서열)이나, 자연 발생 서열에 아미노산 서열 변형(예를 들어 기타 삽입, 결실 및/또는 치환)이 이미 발생한 항체 서열을 포함할 수 있다. 모 항체는 인간화된 항체 또는 인간 항체일 수 있다. 특정 구체예에서, 항 알파 독소 항체 및 항원 결합 단편은 모 항체의 변이체이다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "변이체"란, 모 항체 서열의 아미노산 잔기(들) 하나 이상의 부분이, 결실 및/또는 치환에 의해서 아미노산 서열이 "모" 항 알파 독소 항체 또는 항원 결합 단편 아미노산 서열과 상이해진 항 알파 독소 항체 또는 항원 결합 단편을 말한다.
항체의 항원 결합 일부분은 항원(예를 들어 알파 독소)와 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 단편 하나 이상을 포함한다. 항체의 항원 결합 기능은 전장 항체의 단편(즉 항원 결합 단편)에 의해 발휘될 수 있음이 파악되었다. 항체의 "항원 결합 일부분"에 포함되는 "항원 결합 단편"의 예들로서는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인들로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지부에서 이황화물 가교를 통해 결합되어 있는 Fab 단편 2개를 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인들로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 팔(arm)의 VL 및 VH 도메인들로 이루어진 Fv 단편; (v) 하나의 VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편; 그리고 (vi) 분리된 상보성 결정부(CDR)를 포함한다. Fv 단편의 2개의 도메인, 즉 VL 및 VH는 종종 별도의 유전자들에 의해 암호화되지만, 이 도메인들은 상기 별도의 유전자들이, VL부들과 VH부들이 짝을 형성하여 1가 분자들을 형성하는 단일 단백질 사슬(단일 사슬 Fv(scFv)라고도 알려짐)로 합성될 수 있도록 만들어 주는 합성 링커를 통한 재조합 방법들에 의하여 연결될 수 있다. 이와 같은 단일 사슬 항체들은 또한 용어 "항체" 및 항체의 "항원 결합 단편"에 포함된다. 이와 같은 항원 결합 단편은 공지된 기술에 의해 제조될 수 있으며, 이 단편은 비 변형 항체의 경우와 동일한 방식으로 결합 활성에 대해 스크린될 수 있다. 항원 결합 단편은 재조합체 DNA 기술에 의해 제조될 수 있거나, 또는 비 변형 면역 글로불린의 효소에 의한 분해나 화학적 분해에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 항 알파 독소 항체와 항원 결합 단편은 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 항 알파 독소 항체 또는 항원 결합 단편은 서열 번호 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61, 또는 62의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다. 임의의 구체예에서, 항 알파 독소 항체 또는 항원 결합 단편은 서열 번호 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 또는 63의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 항 알파 독소 항체 또는 항원 결합 단편은 서열 번호 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 또는 62의 아미노산 서열을 포함하는 VH와, 서열 번호 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 또는 63의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 항 알파 독소 항체 또는 항원 결합 단편을 형성하도록 임의의 조합으로 존재할 수 있거나, 또는 본 발명의 mAb을 형성하도록 조합하여 존재할 수 있는, 본원에 제시된 바와 같은 VH 및 VL 서열들이 표시되어 있는 표 7을 참조하시오. 몇몇 구체예에서, VH는 서열 번호 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 또는 62로부터 선택된다. 다양한 구체예에서, VL은 서열 번호 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 또는 63으로부터 선택된다. 임의의 VH 및 VL 뉴클레오티드 서열들은 표 8에 제시되어 있다.
몇몇 구체예에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 VH 및 VL을 포함하는데, 여기서 이 VH 및 VL은 서열 번호 20 및 19; 서열 번호 22 및 21; 서열 번호 24 및 23; 서열 번호 26 및 25; 서열 번호 28 및 27; 서열 번호 41 및 42; 서열 번호 43 및 44; 서열 번호 45 및 46; 서열 번호 47 및 48; 서열 번호 47 및 48; 서열 번호 49 및 50; 서열 번호 51 및 52; 서열 번호 51 및 52; 서열 번호 53 및 54; 서열 번호 55 및 56; 서열 번호 57 및 58; 서열 번호 59 및 60; 서열 번호 61 및 58; 서열 번호 62 및 58; 서열 번호 62 및 63; 서열 번호 79 및 63에 의해 표시되는 아미노산 서열들을 가진다.
표 1~7은 본원에 제공된 항체들과 항원 결합 단편들의 임의의 구체예에 관한 중쇄 가변부(VH), 경쇄 가변부(VL) 및 상보성 결정부(CDR)를 제공한다. 임의의 구체예에서, 항 알파 독소 항체들과 항원 결합 단편들은 표 7에 개시된 VH 및/또는 VL 서열들 중 하나 이상에 대하여 소정의 동일성%를 가지는 VH 및/또는 VL을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "서열 동일성 퍼센트(%)"("상동성"의 경우도 포함)는, 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환들이 고려되지 않으면서 최대 서열 동일성%를 달성하기 위해 서열들을 배열하고, 필요에 따라서는 갭들이 도입된 후의, 모 항체 서열과 같은 참조 서열 내 아미노산 잔기들이나 뉴클레오티드들과 동일한, 후보 서열 내 아미노산 잔기들이나 뉴클레오티드들의 백분율로서 정의된다. 비교를 위한 서열들의 최적 배열은 수동으로 얻어지는 이외에도, 당 업계에 알려져 있는 국소 상동성 알고리즘, 또는 알고리즘 GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N 및 TFASTA(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin)가 사용되는 컴퓨터 프로그램에 의해서도 얻어질 수 있다.
특정 구체예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 알파 독소와 면역 특이적으로 결합하고, 서열 번호 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 또는 62의 아미노산 서열에 대하여 90% 이상의 동일성을 포함하는 중쇄 가변 도메인과, 서열 번호 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 또는 63의 아미노산 서열에 대하여 90% 이상의 동일성을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 이 경우 항체는 하나 이상의 알파 독소 단량체들이 서로 결합하는 것을 억제하는(예를 들어 올리고머화를 억제하는) 활성을 가진다.
상보성 결정부
가변 도메인(VH 및 VL)은 항원 결합부를 포함하지만, 가변성은 항체의 가변 도메인들을 통해 고르게 분포되어 있지 않다. 상기 가변 도메인은 경쇄의 가변 도메인(VL 또는 VK)과 중쇄의 가변 도메인(VH) 둘 다에 있는, 상보성 결정부(CDR)라고 불리는 분절들에 집중되어 존재한다. 가변 도메인들의 더욱 고도로 보존된 일부분들은 골격 부분(framework region; FR)이라고 칭하여진다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인들은 각각, 베타-시트 구조를 연결하고, 몇몇 경우에는 이 베타-시트 구조의 일부를 이루는 루프를 형성하는 CDR 3개에 의해 연결되어 있는 β-시트 형태를 주로 취하는 FR 4개를 포함한다. 각각의 사슬에 있는 CDR들은 FR에 의해 가까이 근접하여 모이게 되는데, 이 경우 다른 사슬의 CDR들은 항체의 항원 결합 위치 형성에 기여한다(Kabat외 다수, 상동). 중쇄의 CDR 3개는 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3라고 명명되고, 경쇄의 CDR 3개는 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3라고 명명된다. 본원에서는 캐벗 번호 매김 체계(Kabat numbering system)가 사용된다. 그러므로 VH-CDR1은 대략 31번째 아미노산(즉 제1 시스테인 잔기로부터 약 9개 잔기 다음)에서 시작되고, 약 5~7개의 아미노산을 포함하며, 그 다음 세린 잔기에서 종결된다. VH-CDR2는 CDR-H1 말단부 다음 15번째 잔기에서 시작되고, 약 16~19개의 아미노산을 포함하며, 그 다음 글리신 잔기에서 종결된다. VH-CDR3은 VH-CDR2 말단부 다음 대략 30번째 잔기에서 시작되고; 약 13~15개의 아미노산을 포함하며; 서열 M-D-V에서 종결된다. VL-CDR1은 대략 24번째 잔기(즉 시스테인 잔기 다음)에서 시작되고; 약 10~15개의 잔기를 포함하며; 서열 Y-V-S로 종결된다. VL-CDR2는 VL-CDR1의 말단부 다음 대략 16번째 잔기에서 시작되고 약 7개의 잔기를 포함한다. VL-CDR3은 VH-CDR2의 말단부 다음 대략 33번째 잔기에서 시작되고; 약 7~11개의 잔기를 포함하며 서열 T-I-L에서 종결된다. CDR은 항체마다 상당히 다르다는 점이 주목된다(또한 정의에 따라서 캐벗 공통 서열들과의 상동성을 보이지 않을 것이라는 점도 주목된다).
본 발명의 항 알파 독소 항체와 항원 결합 단편은 하나 이상의 상보성 결정부(CDR1, CDR2 또는 CDR3)를 포함하는 항원 결합 도메인을 하나 이상 포함한다. 몇몇 구체예에서, 항 알파 독소 항체 또는 항원 결합 단편은 하나 이상의 VH CDR(예를 들어 CDR-H1, CDR-H2 또는 CDR-H3)을 포함하는 VH를 포함한다. 임의의 구체예에서, 항 알파 독소 항체 또는 항원 결합 단편은 하나 이상의 VL CDR(예를 들어 CDR-L1, CDR-L2 또는 CDR-L3)을 포함하는 VL을 포함한다.
몇몇 구체예에서, 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드와 면역 특이적으로 결합하는, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 (a) 서열 번호 7, 10, 13 또는 69와 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 상기 서열 번호들에 의한 서열들과 비교되게 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 VH CDR1; (b) 서열 번호 8, 11, 14, 17, 70 또는 75와 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 상기 서열 번호들에 의한 서열들과 비교되게 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 VH CDR2; 그리고 (c) 서열 번호 9, 12, 15, 18, 16, 65, 66, 67, 71, 72, 76 또는 78과 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 상기 서열 번호들에 의한 서열들과 비교되게 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 VH CDR3를 포함한다.
특정 구체예에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 7, 8 및 9; 서열 번호 10, 11 및 12; 서열 번호 13, 14 및 15; 서열 번호 7, 17 및 18; 서열 번호 7, 8 및 16; 서열 번호 7, 8 및 65; 서열 번호 7, 8 및 66; 서열 번호 7, 8, 및 67; 서열 번호 7, 8 및 78; 서열 번호 69, 70 및 71; 서열 번호 7, 8 및 72; 서열 번호 69, 75 및 71; 서열 번호 69, 75 및 76; 또는 서열 번호 69, 70 및 71과 동일한 아미노산 서열들을 포함하거나, 또는 각각의 CDR에 상기 서열 번호들에 의한 서열들과 비교되게 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3를 포함한다.
몇몇 구체예에서, 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드와 면역 특이적으로 결합하는, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 (a) 서열 번호 1 또는 4와 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 상기 서열 번호들에 의한 서열들과 비교되게 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 VL CDR1; (b) 서열 번호 2, 5, 73 또는 77과 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 상기 서열 번호들에 의한 서열들과 비교되게 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 VL CDR2; 그리고 (c) 서열 번호 3, 6, 64, 68 또는 74와 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 상기 서열 번호들에 의한 서열들과 비교되게 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 VL CDR3를 포함한다.
특정 구체예에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 1, 2 및 3; 서열 번호 4, 5 및 6; 서열 번호 1, 2 및 64; 서열 번호 1, 2 및 68; 서열 번호 1, 73 및 74; 또는 서열 번호 1, 77 및 74와 동일한 아미노산 서열들을 포함하거나, 또는 각각의 CDR에 서열 번호들에 의한 서열들과 비교되게 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3를 포함한다.
몇몇 구체예에서, 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드와 면역 특이적으로 결합하는, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 (a) 서열 번호 7, 10, 13 또는 69의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1; (b) 서열 번호 8, 11, 14, 17, 70 또는 75의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; (c) 서열 번호 9, 12, 15, 18, 16, 65, 66, 67, 71, 72, 76 또는 78의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; (d) 서열 번호 1 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1; (e) 서열 번호 2, 5, 73 또는 77의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 그리고 (f) 서열 번호 3, 6, 64, 68 또는 74의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3와 동일한 아미노산 서열들을 포함하거나, 또는 각각의 CDR에 상기 (a)~(f)와 비교되게 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3를 포함한다.
특정 구체예에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 7, 8, 9, 1, 2 및 3; 서열 번호 10, 11, 12, 1, 2 및 3; 서열 번호 13, 14, 15, 4, 5 및 6; 서열 번호 7, 17, 18, 1, 2 및 3; 서열 번호 7, 8, 16, 1, 2 및 64; 서열 번호 7, 8, 65, 1, 2 및 64; 서열 번호 7, 8, 66, 1, 2 및 64; 서열 번호 7, 8, 67, 1, 2 및 68; 서열 번호 7, 8, 67, 1, 2 및 64; 서열 번호 7, 8, 78, 1, 2 및 64; 서열 번호 7, 8, 65, 1, 2 및 68; 서열 번호 69, 70, 71, 1, 2 및 68; 서열 번호 7, 8, 72, 1, 73 및 74; 서열 번호 69, 75, 71, 1, 2 및 68; 서열 번호 69, 75, 76, 1, 2 및 68; 서열 번호 69, 75, 76, 1, 77 및 74; 서열 번호 69, 70, 71, 1, 77 및 74와 동일한 아미노산 서열들을 포함하거나, 또는 각각의 CDR에 상기 서열 번호들에 의한 서열들과 비교되게 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함한다.
몇몇 구체예에서, (i) CDR 3개를 포함하는 VH 사슬 도메인과 CDR 3개를 포함하는 VL 사슬 도메인을 포함하고; (ii) 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드와 면역 특이적으로 결합하는, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물이 제공되는데, 여기서 상기 VH 사슬 도메인의 CDR 3개는 (a) 서열 번호 7, 10, 13 또는 69의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1; (b) 서열 번호 8, 11, 14, 17, 70 또는 75의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; 그리고 (c) 서열 번호 9, 12, 15, 18, 16, 65, 66, 67, 71, 72, 76 또는 78의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3를 포함한다. 특정 구체예에서, VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3은 서열 번호 7, 8 및 9; 서열 번호 10, 11 및 12; 서열 번호 13, 14 및 15; 서열 번호 7, 17 및 18; 서열 번호 7, 8 및 16; 서열 번호 7, 8 및 65; 서열 번호 7, 8 및 66; SEQ ID NOs 7, 8, 및 67; 서열 번호 7, 8 및 78; 서열 번호 69, 70 및 71; 서열 번호 7, 8 및 72; 서열 번호 69, 75 및 71; 서열 번호 69, 75 및 76; 또는 서열 번호 69, 70 및 71에 상응한다.
임의의 구체예에서, (i) CDR 3개를 포함하는 VH 사슬 도메인과 CDR 3개를 포함하는 VL 사슬 도메인을 포함하고; (ii) 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드와 면역 특이적으로 결합하는, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물도 제공되는데, 여기서 VL 사슬 도메인의 CDR 3개는 (a) 서열 번호 1 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1; (b) 서열 번호 2, 5, 73 또는 77의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 그리고 (c) 서열 번호 3, 6, 64, 68 또는 74의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3를 포함한다. 특정 구체예에서, VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3는 서열 번호 1, 2 및 3; 서열 번호 4, 5 및 6; 서열 번호 1, 2 및 64; 서열 번호 1, 2 및 68; 서열 번호 1, 73 및 74; 또는 서열 번호 1, 77 및 74에 상응한다.
몇몇 구체예에서, 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드와 면역 특이적으로 결합하는, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 (a) 서열 번호 7, 10, 13 또는 69의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1; (b) 서열 번호 8, 11, 14, 17, 70 또는 75의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; (c) 서열 번호 9, 12, 15, 18, 16, 65, 66, 67, 71, 72, 76 또는 78의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; (d) 서열 번호 1 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1; (e) 서열 번호 2, 5, 73 또는 77의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 그리고 (f) 서열 번호 3, 6, 64, 68 또는 74의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3와 동일한 아미노산 서열들을 포함하거나, 또는 각각의 CDR에 상기 (a)~(f)와 비교되게 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3를 포함한다.
특정 구체예에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 서열 번호 7, 8, 9, 1, 2 및 3; 서열 번호 10, 11, 12, 1, 2 및 3; 서열 번호 13, 14, 15, 4, 5 및 6; 서열 번호 7, 17, 18, 1, 2 및 3; 서열 번호 7, 8, 16, 1, 2 및 64; 서열 번호 7, 8, 65, 1, 2 및 64; 서열 번호 7, 8, 66, 1, 2 및 64; 서열 번호 7, 8, 67, 1, 2 및 68; 서열 번호 7, 8, 67, 1, 2 및 64; 서열 번호 7, 8, 78, 1, 2 및 64; 서열 번호 7, 8, 65, 1, 2 및 68; 서열 번호 69, 70, 71, 1, 2 및 68; 서열 번호 7, 8, 72, 1, 73 및 74; 서열 번호 69, 75, 71, 1, 2 및 68; 서열 번호 69, 75, 76, 1, 2 및 68; 서열 번호 69, 75, 76, 1, 77 및 74; 서열 번호 69, 70, 71, 1, 77 및 74와 동일한 아미노산 서열들을 포함하거나, 또는 각각의 CDR에 상기 서열 번호들에 의한 서열들과 비교되게 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3를 포함한다.
몇몇 구체예에서, (i) CDR 3개를 포함하는 VH 사슬 도메인과 CDR 3개를 포함하는 VL 사슬 도메인을 포함하고; (ii) 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드와 면역 특이적으로 결합하는, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물이 제공되는데, 여기서 VH 사슬 도메인의 CDR 3개는 (a) 서열 번호 7, 10, 13 또는 69의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1; (b) 서열 번호 8, 11, 14, 17, 70 또는 75의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; 그리고 (c) 서열 번호 9, 12, 15, 18, 16, 65, 66, 67, 71, 72, 76 또는 78의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3를 포함한다. 특정 구체예에서, VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3는 서열 번호 7, 8 및 9; 서열 번호 10, 11 및 12; 서열 번호 13, 14 및 15; 서열 번호 7, 17 및 18; 서열 번호 7, 8 및 16; 서열 번호 7, 8 및 65; 서열 번호 7, 8 및 66; 서열 번호 7, 8, 및 67; 서열 번호 7, 8 및 78; 서열 번호 69, 70 및 71; 서열 번호 7, 8 및 72; 서열 번호 69, 75 및 71; 서열 번호 69, 75 및 76; 또는 서열 번호 69, 70 및 71에 상응한다.
몇몇 구체예에서, (i) 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드와 면역 특이적으로 결합하고, (ii) 서열 번호 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 또는 62의 아미노산 서열에 대하여 90% 이상의 동일성을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하며, (iii) 서열 번호 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 또는 63의 아미노산 서열에 대하여 90% 이상의 동일성을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물이 제공된다.
몇몇 구체예에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 또는 62의 중쇄 가변 도메인과, 서열 번호 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 또는 63의 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
특정 구체예에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 VH 및 VL을 포함하는데, 여기서 VH 및 VL은 각각 동일하거나 이것들 각각은 서열 번호 20 및 19; 서열 번호 22 및 21; 서열 번호 24 및 23; 서열 번호 26 및 25; 서열 번호 28 및 27; 서열 번호 41 및 42; 서열 번호 43 및 44; 서열 번호 45 및 46; 서열 번호 47 및 48; 서열 번호 47 및 48; 서열 번호 49 및 50; 서열 번호 51 및 52; 서열 번호 51 및 52; 서열 번호 53 및 54; 서열 번호 55 및 56; 서열 번호 57 및 58; 서열 번호 59 및 60; 서열 번호 61 및 58; 서열 번호 62 및 58; 서열 번호 62 및 63; 서열 번호 79 및 63의 VH 및 VL 아미노산 서열들에 대하여 90% 이상, 95% 이상 또는 98% 이상의 동일성을 가진다.
변이체 Fc부
본 발명은 또한 변형된 IgG 불변 도메인들을 가지는 본 발명의 결합 일원들, 특히 본 발명의 항체들을 포함하기도 한다. 기능상 특징들, 예를 들어 혈청 중 긴 반감기와, 다양한 효과기 기능들을 매개하는 능력을 가지는 인간 IgG 군의 항체는 본 발명의 임의의 구체예에서 사용된다[Monoclonal Antibodies: Principles 및 Applications, Wiley-Liss, Inc., Chapter 1 (1995)]. 인간 IgG 군 항체는 다음과 같은 4개의 하위 군들로 세분된다: IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4. 지금까지 IgG 군 항체의 효과기 기능으로서의 ADCC 및 CDC에 대한 다수의 연구가 수행된 바 있으며, 이와 같은 연구들로부터 인간 IgG 군 항체들 중 IgG1 하위 군은 인간에서 ADCC 활성과 CDC 활성이 가장 크다는 것이 보고되었다(Chemical Immunology, 65, 88 (1997)).
"항체 의존성 세포 매개 세포 독성" 및 "ADCC"란, 비 특이적 세포 독성 세포들(예를 들어 자연 살해(NK) 세포, 호중구 및 대식 세포)이 표적 세포 상에 결합하고 있는 항체를 인지하고, 궁극적으로는 표적 세포의 용해를 유발하는 세포 매개 반응을 말한다. 하나의 구체예에서, 이와 같은 세포는 인간 세포이다. 작용에 관한 임의의 특정 기작에 제한되기를 바라지는 않지만, 이와 같이 ADCC를 매개하는 세포 독성 세포는 일반적으로 Fc 수용체(FcR)를 발현한다. ADCC를 매개하는 1차 세포, 즉 NK 세포는 FcγRIII를 발현하는 반면에, 단핵구는 FcγRI, FcγRII, FcγRIII 및/또는 FcγRIV를 발현한다. 조혈 세포 상 FcR 발현에 관하여는 문헌(Ravetch 및 Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991))에 요약되어 있다. 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해서, 예를 들어 미국 특허 제5,500,362호 또는 동 제5,821,337호에 개시된 시험관 내 ADCC 분석법이 수행될 수 있다. 이와 같은 분석법에 유용한 효과기 세포들로서는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 자연 살해(NK) 세포를 포함한다. 대안적으로나 추가적으로, 관심있는 분자들의 ADCC 활성은 생체 내, 예를 들어 문헌(Clynes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 95:652-656 (1998))에 개시된 바와 같은 동물 모델 내에서 평가될 수 있다.
"보체 의존적 세포 독성" 또는 "CDC"란, 보체의 활성화를 개시하고 보체의 존재하에서 표적을 용해하는 분자의 능력을 말한다. 보체 활성화 경로는, 보체계의 제1 성분(C1q)이, 동족 항원과 복합체를 형성한 분자(예를 들어 항체)와 결합함으로써 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해서, 예를 들어 문헌(Gazzano-Santaro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996))에 기술된 바와 같은 CDC 분석법이 수행될 수 있다.
인간 IgG1 하위 군 항체의 ADCC 활성과 CDC 활성의 발현은 일반적으로 항체의 Fc부가, 효과기 세포, 예를 들어 살해 세포, 자연 살해 세포 또는 활성화된 대식 세포의 표면상에 존재하는, 이 항체에 대한 수용체(이하 "FcγR"이라 칭하여짐)에 결합하는 단계를 포함한다. 다양한 보체 성분들이 결합할 수 있다. 결합과 관련하여, 항체의 C부의 제2 도메인(이하 "Cγ2 도메인"이라 칭하여짐)과 힌지 부분 내의 몇몇 아미노산 잔기들이 중요하고(Eur. J. Immunol., 23, 1098 (1993), Immunology, 86, 319 (1995), Chemical Immunology, 65, 88 (1997)), Cγ2 도메인 내의 당 사슬(Chemical Immunology, 65, 88 (1997))도 중요하다는 사실이 제안된 바 있다.
"효과기 세포"는 하나 이상의 FcR을 발현하고 효과기 기능들을 수행하는 백혈구이다. 이 세포는 적어도 FcγRI, FcγRII, FcγRIII 및/또는 FcγRIV를 발현하고, ADCC 효과기 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예로서는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 자연 살해(NK) 세포, 단핵구, 세포 독성 T 세포 및 호중구를 포함한다.
용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc부와 결합하는 수용체를 기술하기 위해 사용된다. 하나의 구체예에서, FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 뿐만 아니라, 임의의 구체예에서, FcR은 IgG 항체와 결합하는 수용체(감마 수용체)로서, FcγRI, FcγRII, FcγRIII 및 FcγRIV 하위 군들의 수용체들, 예를 들어 이와 같은 수용체들의 대립 형질 변이체와 대안적으로 스플라이싱(splicing)된 형태의 것들을 포함한다. FcγRII 수용체는 주로 자체의 세포질 도메인에서 차이가 있는 유사 아미노산 서열들을 가지는 FcγRIIA("활성화 수용체")와 FcγRIIB("억제 수용체")를 포함한다. 활성화 수용체인 FcγRIIA는 자체의 세포질 도메인 내에 면역 수용체 티로신계 활성화 모티프(ITAM)를 함유한다. 억제 수용체인 FcγRIIB는 자체의 세포질 도메인 내에 면역 수용체 티로신계 억제 모티프(ITIM)를 함유한다[문헌(Daёron, Annu.Rev.Immunol.,15:203-234(1997) 참조]. FcR은 문헌[Ravetch 및 Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods, 4:25-34 (1994); 및 de Haas et al., J. Lab. Clin. Med., 126:330-41 (1995)]에 논의되어 있다. 미래에 동정될 수용체들을 비롯한 기타 FcR들도 본원의 상기 용어 "FcR"에 포함된다. 상기 용어는 또한 모체의 IgG들을 태아에 운반하는데 관여하는 신생아 수용체 FcRn도 포함한다(Guyer et al., Immunol., 117:587 (1976) 및 Kim et al., J. Immunol., 24:249 (1994)).
임의의 구체예에서, 항 알파 독소 항체 또는 항원 결합 단편은, 항체의 기능상 특성 및/또는 약동학적 특성을 변경하기 위한 변형 하나 이상이 Fc부에 발생된 변형 Fc부(본원에서는 "변이체 Fc부"라고도 칭하여짐)를 포함한다. 이와 같은 변형들은 IgG에 대한 C1q 결합 및 보체 의존적 세포 독성(CDC), 또는 IgG에 대한 FcγR 결합의 감소 또는 증가를 초래할 수 있다. 본 발명의 기술은 본원에 기술된 변이체 Fc부들을 가지는 항체들을 포함하는데, 이 경우 효과기 기능을 변경하는 변화들이 일어나 원하는 효과가 제공된다. 그러므로 몇몇 구체예에서, 항 알파 독소 항체 또는 항원 결합 단편은 변이체 Fc부(즉 이하에 논의된 바와 같이 변형된 Fc부)를 포함한다. 변이체 Fc부를 포함하는 본원의 항 알파 독소 항체와 항원 결합 단편은 또한 본원에서 "Fc 변이체 항체"라고도 칭하여진다. 본원에서 천연 서열이란 비 변형 모 서열임을 말하는 것 같이, 본원에서 천연 Fc부를 포함하는 항체는 "천연 Fc 항체"라고 칭하여진다. 몇몇 구체예에서, 변이체 Fc부는 천연 Fc부와 비교되었을 때 유사한 수준의 효과기 기능 유도를 나타낸다. 임의의 구체예에서, 변이체 Fc부는 천연 Fc부와 비교되었을 때 더욱 높은 효과기 기능 유도를 보인다. 임의의 구체예에서, 변이체 Fc부는 천연 Fc부와 비교되었을 때 더욱 낮은 효과기 기능 유도를 보인다. 변이체 Fc부에 관한 일부 특정 구체예는 본원에 상세히 기술되어 있다. 효과기 기능을 측정하기 위한 방법들은 당 업계에 알려져 있다.
항체의 효과기 기능은 Fc부에 일어난 변화들, 예를 들어 아미노산 치환, 아미노산 부분이, 아미노산 결실 및 Fc부 아미노산에 대한 번역 후 변형(예를 들어 당화)에 있어서의 변화(이에 한정되는 것은 아님)를 통하여 변경될 수 있다. 이하에 기술된 방법들은 본원에 기술된 바와 같은 분리 항체 또는 항원 결합 단편의 효과기 기능을 변경하여, 특정 스타필로코커스 아우레우스 연관 질병 또는 병태의 예방 또는 치료에 유리한 임의의 특성들을 가지는 항체 또는 항원 결합 단편을 제조하는데 사용될 수 있다.
몇몇 구체예에서, Fc 리간드(예를 들어 Fc 수용체, C1q)에 대한 결합 특성들이 천연 Fc 항체의 Fc 리간드에 대한 결합 특성들과 비교되게 변경된 Fc 변이체 항체가 제조된다. 결합 특성들의 예로서는 결합 특이성, 평형 해리 상수(Kd), 해리 상수 및 결합 상수(각각 koff 및 kon), 결합 친화성 및/또는 결합 활성을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 평형 해리 상수(Kd)는 koff/kon로서 정의된다는 것은 당 업계에 알려져 있다. 임의의 양태들에서, Fc 변이체 부분을 포함하고 Kd가 낮은 항체는 Kd가 높은 항체보다 더욱 요망될 수 있다. 그러나 몇몇 경우에 있어서, kon 또는 koff의 값은 Kd의 값보다 더욱 관련성이 클 수 있다. 주어진 항체 적용에 대해서 어떤 역학적 매개 변수가 더욱 중요한지가 확인될 수 있다.
몇몇 구체예에서, Fc 변이체 항체는, 천연 Fc 항체와 비교되었을 때, 하나 이상의 Fc 수용체, 예를 들어 FcRn, FγRI(CD64, 동형체인 FγRIA, FγRIB 및 FγRIC 포함); FγRII(CD32, 동형체인 FγRIIA, FγRIIB 및 FγRIIC 포함); 그리고 FγRIII(CD16, 동형체인 FγRIIIA 및 FγRIIIB 포함)(이에 한정되는 것은 아님)에 대해 변경된 결합 친화성을 보인다.
임의의 구체예에서, Fc 변이체 항체는, 천연 Fc 항체과 비교되게, Fc 리간드 하나 이상에 대한 결합이 증가한다. 임의의 구체예에서, Fc 변이체 항체는, 천연 Fc 항체의 Fc 리간드에 대한 친화성보다 약 2배 이상, 또는 약 3배 이상, 또는 약 5배 이상, 또는 약 7배 이상, 또는 약 10배 이상, 또는 약 20배 이상, 또는 약 30배 이상, 또는 약 40배 이상, 또는 약 50배 이상, 또는 약 60배 이상, 또는 약 70배 이상, 또는 약 80배 이상, 또는 약 90배 이상, 또는 약 100배 이상, 또는 약 200배 이상, 또는 약 2~10배, 또는 약 5~50배, 또는 약 25~100배, 또는 약 75~200배, 또는 약 100~200배 증가 또는 감소한, Fc 리간드에 대한 친화성을 보인다. 다양한 구체예에서, Fc 변이체 항체는, 천연 Fc 항체의 Fc 리간드에 대한 친화성보다 약 90% 이상, 약 80% 이상, 약 70% 이상, 약 60% 이상, 약 50% 이상, 약 40% 이상, 약 30% 이상, 약 20% 이상, 약 10% 이상, 또는 약 5% 이상인, Fc 리간드에 대한 친화성을 보인다. 임의의 구체예에서, Fc 변이체 항체는 Fc 리간드에 대한 친화성이 증가하였다. Fc 변이체 항체는 때때로 Fc 리간드에 대한 친화성이 감소할 수 있었다.
몇몇 구체예에서, Fc 변이체 항체는 Fc 수용체인 FcγRIIIA에 대한 결합이 증가하였다. 몇몇 구체예에서, Fc 변이체 항체는 Fc 수용체인 FcγRIIB에 대한 결합이 증가하였다. 임의의 구체예에서, Fc 변이체 항체는 Fc 수용체인 FcγRIIIA와 FcγRIIB 둘 다에 대한 결합이 증가하였다. 임의의 구체예에서, FcγRIIIA에 대한 결합이 증가한 Fc 변이체 항체는, 천연 Fc 항체와 비교되었을 때, FcγRIIIA에 대한 결합이 증가함에 동반하여 FcγRIIB 수용체와의 결합도 증가하지는 않는다. 임의의 구체예에서, Fc 변이체 항체는 Fc 수용체인 FcγRIIIA와의 결합이 감소하였다. Fc 변이체 항체는 때때로 Fc 수용체인 FcγRIIB에 대한 결합이 감소할 수도 있었다. 다양한 구체예에서, FcγRIIIA 및/또는 FcγRIIB에 대한, 변경된 친화성을 보이는 Fc 변이체 항체는 Fc 수용체인 FcRn에 대한 결합이 증가하였다. 몇몇 구체예에서, FcγRIIIA 및/또는 FcγRIIB에 대한, 변경된 친화성을 보이는 Fc 변이체 항체는, 천연 Fc 항체와 비교되게 C1q에 대한 결합이 변경되었다.
임의의 구체예에서, Fc 변이체 항체는, 천연 Fc 항체의 FcγRIIIA 수용체에 대한 친화성보다 약 2배 이상, 또는 약 3배 이상, 또는 약 5배 이상, 또는 약 7배 이상, 또는 약 10배 이상, 또는 약 20배 이상, 또는 약 30배 이상, 또는 약 40배 이상, 또는 약 50배 이상, 또는 약 60배 이상, 또는 약 70배 이상, 또는 약 80배 이상, 또는 약 90배 이상, 또는 약 100배 이상, 또는 약 200배 이상, 또는 상기 친화성의 약 2~10배, 또는 약 5~50배, 또는 약 25~100배, 또는 약 75~200배, 또는 약 100~200배인, FcγRIIIA 수용체에 대한 친화성을 보인다. 다양한 구체예에서, Fc 변이체 항체는, 천연 Fc 항체의 FcγRIIIA에 대한 친화성보다 약 90% 이상, 약 80% 이상, 약 70% 이상, 약 60% 이상, 약 50% 이상, 약 40% 이상, 약 30% 이상, 약 20% 이상, 약 10% 이상, 또는 약 5% 이상인, FcγRIIIA에 대한 친화성을 보인다.
임의의 구체예에서, Fc 변이체 항체는, 천연 Fc 항체의 FcγRIIB 수용체에 대한 친화성보다 약 2배 이상, 또는 약 3배 이상, 또는 약 5배 이상, 또는 약 7배 이상, 또는 약 10배 이상, 또는 약 20배 이상, 또는 약 30배 이상, 또는 약 40배 이상, 또는 약 50배 이상, 또는 약 60배 이상, 또는 약 70배 이상, 또는 약 80배 이상, 또는 약 90배 이상, 또는 약 100배 이상, 또는 약 200배 이상, 또는 상기 친화성의 약 2~10배, 또는 약 5~50배, 또는 약 25~100배, 또는 약 75~200배, 또는 약 100~200배인, FcγRIIB 수용체에 대한 친화성을 보인다. 임의의 구체예에서, Fc 변이체 항체는, 천연 Fc 항체의 FcγRIIB에 대한 친화성보다 약 90% 이상, 약 80% 이상, 약 70% 이상, 약 60% 이상, 약 50% 이상, 약 40% 이상, 약 30% 이상, 약 20% 이상, 약 10% 이상, 또는 약 5% 이상인, FcγRIIB에 대한 친화성을 보인다.
몇몇 구체예에서, Fc 변이체 항체는, 천연 Fc 항체와 비교되게 C1q에 대한 증가 또는 감소한 친화성을 보인다. 몇몇 구체예에서, Fc 변이체 항체는, 천연 Fc 항체의 C1q 수용체에 대한 친화성보다 약 2배 이상, 또는 약 3배 이상, 또는 약 5배 이상, 또는 약 7배 이상, 또는 약 10배 이상, 또는 약 20배 이상, 또는 약 30배 이상, 또는 약 40배 이상, 또는 약 50배 이상, 또는 약 60배 이상, 또는 약 70배 이상, 또는 약 80배 이상, 또는 약 90배 이상, 또는 약 100배 이상, 또는 약 200배 이상, 또는 상기 친화성의 약 2~10배, 또는 약 5~50배, 또는 약 25~100배, 또는 약 75~200배, 또는 약 100~200배인, C1q 수용체에 대한 친화성을 보인다. 임의의 구체예에서, Fc 변이체 항체는, 천연 Fc 항체의 C1q 수용체에 대한 친화성보다 약 90% 이상, 약 80% 이상, 약 70% 이상, 약 60% 이상, 약 50% 이상, 약 40% 이상, 약 30% 이상, 약 20% 이상, 약 10% 이상, 또는 약 5% 이상인, C1q 수용체에 대한 친화성을 보인다. 다양한 구체예에서, C1q에 대하여 변경된 친화성을 보이는 Fc 변이체 항체는 Fc 수용체인 FcRn에 대한 결합이 증가하였다. 또 다른 특정 구체예에서, C1q에 대하여 변경된 친화성을 보이는 Fc 변이체 항체는, 천연 Fc 항체와 비교되게 FcγRIIIA 및/또는 FcγRIIB에에 대한 결합이 변경되었다.
Fc 변이체 항체는 FcγR 매개 효과기 세포 기능 하나 이상을 측정하기 위한 시험관 내 기능 분석법들에 의해 특성 규명되는 것으로 고찰된다. 임의의 구체예에서, Fc 변이체 항체들은, 시험관 내 분석법에서 분석된 결합 특성들 및 효과기 세포 기능들(예를 들어 본원에 기술 및 개시된 결합 특성들 및 효과기 세포 기능들)과 유사한, 생체 내 모델에서의 결합 특성들 및 효과기 세포 기능들을 가진다. 본 발명의 기술은 시험관 내 분석법에서는 원하는 표현형을 보이지 않지만, 생체 내에서는 원하는 표현형을 보이는 Fc 변이체 항체들을 배제하지 않는다.
Fc부들을 포함하는 단백질의 혈청 반감기는, FcRn에 대한 Fc부의 결합 친화성을 증가시킴으로써 증가할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "항체 반감기"란, 항체 분자가 투여된 후 이 항체 분자들의 평균 생존 시간의 척도가 되는, 항체의 약동학적 특성을 의미한다. 항체 반감기는 환자(또는 기타 포유동물)의 체내 또는 이의 특정 구획 내에서 알려진 양만큼의 면역 글로불린의 50%가 사라지는데 필요한 시간으로서, 예를 들어 혈청 중에서 측정되거나(즉 순환 반감기) 또는 다른 조직들에서 측정되는 시간으로서 표현될 수 있다. 반감기는 하나의 면역 글로불린일지라도 달라질 수 있거나, 또는 하나의 면역 글로불린 군 내에서도 각 구성원 간에 달라질 수 있다. 일반적으로 항체의 반감기 증가는 투여된 항체에 대한 순환 중 평균 체류 시간(MRT)의 증가를 초래한다.
반감기가 증가하면 환자에게 투여되는 약물의 양은 감소할 수 있을뿐더러, 투여 횟수도 감소할 수 있다. 반감기가 증가하면, 예를 들어 스타필로코커스 아우레우스 연관 질병 또는 병태를 예방하는데 유리할 수 있을 뿐만 아니라, 환자가 병원에서 퇴원하고나서 종종 발생할 수 있는 감염의 재발을 예방하는데 유리할 수도 있다. 항체의 혈청 반감기가 증가하기 위해서는, 당 업계에 공지된 바와 같이 구조 수용체 결합 에피토프(salvage receptor binding epitope)가 항체(특히 항원 결합 단편)에 통합될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "구조 수용체 결합 에피토프"란, IgG 분자의 생체 내 혈청 반감기를 증가시키는데 관여하는 IgG 분자(예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)의 Fc부의 에피토프를 말한다. Fc 및 FcRn 수용체 간 상호 작용에 연루되어 있는 것으로 확인된 아미노산 잔기들을 변형시킴으로써 반감기가 증가한 항체도 생산될 수 있다. 뿐만 아니라, 항 알파 독소 항체 또는 항원 결합 단편의 반감기는 당 업계에서 널리 활용되고 있는 기술들을 통하여 PEG 또는 알부민에 상기 항 알파 독소 항체 또는 항원 결합 단편을 접합함으로써 증가할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 항 알파 독소 항체의 Fc 변이체 부분들을 포함하는 항체는, 천연 Fc부를 포함하는 항체의 반감기와 비교되었을 때, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 100%, 약 125%, 약 150% 이상 증가한 반감기를 가진다. 몇몇 구체예에서, Fc 변이체 부분들을 포함하는 항체는, 천연 Fc부를 포함하는 항체의 반감기와 비교되었을 때, 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 10배, 약 20배, 약 50배 또는 그 이상, 또는 2~10배, 또는 5~25배, 또는 15~50배 증가한 반감기를 가진다.
몇몇 구체예에서, 본원에 제시된 기술은 Fc부가 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 251, 252, 254, 255, 256, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 279, 280, 284, 292, 296, 297, 298, 299, 305, 313, 316, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 339, 341, 343, 370, 373, 378, 392, 416, 419, 421, 440 및 443(캐벗의 문헌에 제시된 바와 같이 EU 지수에 따라서 번호가 매겨짐)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치 하나 이상에 변형(예를 들어 아미노산 치환, 아미노산 삽입, 아미노산 결실)을 포함하는 Fc 변이체를 제공한다. 임의로 Fc부는 당 업계에 공지된 추가적 및/또는 대안적 위치들에 비 자연 발생 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
임의의 구체예에서, 본원에는 Fc부가 234D, 234E, 234N, 234Q, 234T, 234H, 234Y, 234I, 234V, 234F, 235A, 235D, 235R, 235W, 235P, 235S, 235N, 235Q, 235T, 235H, 235Y, 235I, 235V, 235F, 236E, 239D, 239E, 239N, 239Q, 239F, 239T, 239H, 239Y, 240I, 240A, 240T, 240M, 241W, 241 L, 241Y, 241E, 241 R. 243W, 243L 243Y, 243R, 243Q, 244H, 245A, 247L, 247V, 247G, 251F, 252Y, 254T, 255L, 256E, 256M, 262I, 262A, 262T, 262E, 263I, 263A, 263T, 263M, 264L, 264I, 264W, 264T, 264R, 264F, 264M, 264Y, 264E, 265G, 265N, 265Q, 265Y, 265F, 265V, 265I, 265L, 265H, 265T, 266I, 266A, 266T, 266M, 267Q, 267L, 268E, 269H, 269Y, 269F, 269R, 270E, 280A, 284M, 292P, 292L, 296E, 296Q, 296D, 296N, 296S, 296T, 296L, 296I, 296H, 269G, 297S, 297D, 297E, 298H, 298I, 298T, 298F, 299I, 299L, 299A, 299S, 299V, 299H, 299F, 299E, 305I, 313F, 316D, 325Q, 325L, 325I, 325D, 325E, 325A, 325T, 325V, 325H, 327G, 327W, 327N, 327L, 328S, 328M, 328D, 328E, 328N, 328Q, 328F, 328I, 328V, 328T, 328H, 328A, 329F, 329H, 329Q, 330K, 330G, 330T, 330C, 330L, 330Y, 330V, 330I, 330F, 330R, 330H, 331G, 331A, 331L, 331M, 331F, 331W, 331K, 331Q, 331E, 331S, 331V, 331I, 331C, 331Y, 331H, 331R, 331N, 331D, 331T, 332D, 332S, 332W, 332F, 332E, 332N, 332Q, 332T, 332H, 332Y, 332A, 339T, 370E, 370N, 378D, 392T, 396L, 416G, 419H, 421K, 440Y 및 434W(캐벗의 문헌에 제시된 바와 같이 EU 지수에 따라서 번호가 매겨짐)로 이루어진 군으로부터 선택되는 치환 하나 이상을 포함하는 Fc 변이체가 제공된다. 임의로 Fc부는 당 업계에 공지된 추가적 및/또는 대안적 비 자연 발생 아미노산 잔기들을 포함할 수 있다.
다양한 구체예에서, 본원에는 Fc부가 234, 235 및 331번으로 이루어진 군으로부터 선택된 위치 하나 이상에 변형(예를 들어 아미노산 치환, 아미노산 삽입, 아미노산 결실) 하나 이상을 포함하는 Fc 변이체 항체가 제공된다. 몇몇 구체예에서, 비 자연 발생 아미노산은 234F, 235F, 235Y 및 331S로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본원에는 Fc부가 239, 330 및 332로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치 하나 이상에 비 자연 발생 아미노산 하나 이상을 포함하는 Fc 변이체가 제공된다. 몇몇 구체예에서, 비 자연 발생 아미노산은 239D, 330L 및 332E로 이루어진 군으로부터 선택된다.
몇몇 구체예에서, 본원에는 Fc부가 252, 254 및 256으로 이루어진 군으로부터 선택된 위치 하나 이상에 비 자연 발생 아미노산 하나 이상을 포함하는 Fc 변이체 항체가 제공된다. 임의의 구체예에서, 비 자연 발생 아미노산은, 내용이 그 자체로서 본원에 참고 문헌으로 인용되어 있는 미국 특허 제7,083,784호에 기술된 바와 같이, 252Y, 254T 및 256E로 이루어진 군으로부터 선택된다.
임의의 구체예에서, IgG 항체들에 의해 유도되는 효과기 기능들은 단백질의 Fc부에 결합된 탄수화물 부분에 전적으로 의존한다. 그러므로 Fc부의 당화는 효과기 기능을 증가 또는 감소시키도록 변경될 수 있다. 그러므로 몇몇 구체예에서, 본원에 제공된 항 알파 독소 항체와 항원 결합 단편의 Fc부는 아미노산 잔기들의 변경된 당화를 포함한다. 임의의 구체예에서, 아미노산 잔기들의 변경된 당화를 통하여 효과기 기능은 저하된다. 임의의 구체예에서, 아미노산 잔기들의 변경된 당화를 통하여 효과기 기능은 증가한다. 몇몇 구체예에서, Fc부는 푸코실화가 감소하였다. 임의의 구체예에서, Fc부는 푸코실화가 일어나지 않았다.
몇몇 구체예에서, 본원의 Fc 변이체는 당 업계에 알려진 바와 같은 기타 공지의 Fc 변이체들과 합하여질 수 있다. 기타 Fc 도메인의 변형 및/또는 치환 및/또는 부분이 및/또는 결실이 도입될 수 있다. 특정 구체예에서, Fc 변이체 도메인을 가지는 본 발명의 항 AT 항체는 서열 번호 80에 상응하는 VH-IgG1-YTE 및/또는 서열 번호 81에 상응하는 VL-카파를 포함한다.
항 에스.아우레우스 항체들을 표시하는 서열들
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알파 독소 VL 및 VH CDR 요약 표
설 명 서열 번호
VL CDR1 1, 4
VL CDR2 2, 5, 73, 77
VL CDR3 3, 6, 64, 68, 74
VH CDR1 7, 10, 13, 69
VH CDR2 8, 11, 14, 17, 70, 75
VH CDR3 9, 12, 15, 18, 16, 65, 66, 67, 71, 72, 76, 78
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Figure pat00019
항 AT 항체들과 이의 항원 결합 단편들을 포함하는 약학 제제
본원에 기술된 바와 같은 항 알파 독소 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 캐리어를 포함하는 약학 제제도 제공된다. 이와 같은 제제들은 본원 전반에 걸쳐 기술되어 있는 다양한 방법으로 용이하게 투여될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 제제는 약학적으로 허용 가능한 캐리어를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 항 알파 독소 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약학 제제는 본 발명의 기술에 의한 제제인 것으로 칭하여진다. 용어 "약학적으로 허용 가능한 캐리어"란, 활성 성분들의 생물 활성의 유효성을 방해하지 않는 무독성 물질 하나 이상을 의미한다. 이와 같은 제제는 통상적으로 염, 완충제, 보존제, 혼화성 캐리어를 포함할 수 있으며, 임의로는 다른 치료제도 포함할 수 있다. 이와 같은 약학적으로 허용 가능한 제제는 또한 통상적으로 인간에 투여되기 적당한 혼화성 고체 또는 액체 충전제, 희석제 또는 피포화 물질을 포함할 수도 있다. 용어 "캐리어"란, 활성 성분과 합하여졌을 때 적용을 촉진하는 자연 또는 합성 유기 또는 무기 성분을 말한다. 약학 조성물의 성분들은 또한 요망되는 약학 효능을 실질적으로 손상시킬 상호 작용이 일어나지 않는 방식으로 본원에 기술된 항체 및 항원 결합 단편과 혼합될 수 있으며, 상호 간에도 혼합될 수 있다.
본원에 기술된 약학 조성물은 특정 투여량으로 제조될 수 있다. 투여 계획들은 원하던 반응이 최적으로 제공되도록 조정될 수 있다. 예를 들어 단일 볼루스가 투여될 수 있으며, 수 회 나누어진 투여량이 경시적으로 투여될 수 있거나, 또는 투여량은 치료 상황의 위급성이 알려주는 바에 따라서 비례하여 감소 또는 증가할 수 있다. 투여의 용이성과 투여량의 균일성을 도모하기 위해서 비 경구 투여용 조성물을 단위 제형으로 제조하는 것이 특히 유리하다. 본원에 사용된 바와 같은 단위 제형이란, 치료될 피험체들에 대해 단위 투여량으로서 맞추어진, 물리적으로 분별되는 단위들을 말하는데; 각각의 단위는 필요한 약학 캐리어와 함께, 원하는 치료 효과를 보이도록 산정된 소정 량의 활성 화합물(즉 항체 또는 항원 결합 단편)을 포함한다. 단위 제형에 관한 명세는 (a) 항 알파 독소 항체 또는 항원 결합 단편의 독특한 특징들과 달성될 구체적인 치료 효과, 그리고 (b) 항 알파 독소 항체 또는 항원 결합 단편을 합성하는 해당 업계 고유의, 개체 내 감수성 치료에 대한 한계점들에 의해 기술되고 이것들에 직접적으로 의존한다.
본 발명의 기술에 따른 치료 조성물은 특정 투여 경로, 예를 들어 경구, 비 내, 폐 내, 국소(협측 및 설하 포함), 직장, 질 내 및/또는 비 경구 투여에 맞추어 제조될 수 있다. 본 발명의 제제는 단위 제형으로 편리하게 제공될 수 있으며, 약업계에 공지된 임의의 방법들에 의해 제조될 수 있다. 캐리어 물질과 혼합되어 단일 제형으로 제조될 수 있는 활성 성분(즉 항체 또는 항원 결합 단편)의 양은 치료 대상인 피험체와 특정 투여 방식에 따라서 달라질 것이다. 캐리어 물질과 혼합되어 단일 제형으로 제조될 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 보이는 조성물의 양일 것이다.
에스.아우레우스 연관 질병의 치료
본 발명은 또한 항 에스.아우레우스 알파 독소(항 AT) 항체와 이의 항원 결합 단편을 사용하여 에스.아우레우스 연관 질병과 병태, 예를 들어 균혈증 및 패혈증을 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공하기도 한다. 또한 항 에스.아우레우스 알파 독소(항 AT) 항체와 이의 항원 결합 단편을 사용하여 면역 약화된 환자에 있어서 에스.아우레우스 연관 질병과 병태, 예를 들어 폐렴을 예방 및/또는 치료하는 방법도 제공된다.
본원 전반에 걸쳐서 기술되어 있는 항 AT 항체 또는 이의 항원 결합 단편 중 임의의 것과, 이와 같은 항체의 돌연 변이체, 변이체 및 유도체는 본원에 기술된 다양한 방법들에서 활용될 수 있다. 예시적인 항 AT 항체와 이의 항원 결합 단편은 다양한 방법과 본원에 제공된 실시예들에서 사용되는 것으로 본원에 기술되어 있지만, 당 업계에 알려져 있는 임의의 항 AT 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 특히 본원에 기술된 것들과, 개시된 사항이 그 자체로서 본원에 참고 문헌으로 인용되어 있는 공개 국제 특허 출원 제WO2012/109285호에 개시된 것들은 다양한 방법들에서 사용될 수 있다.
패혈증(blood poisoning)이라고도 알려져 있는 균혈증은 에스.아우레우스 세균이 인간을 비롯한 포유동물의 혈류에 도입될 때 발병한다. 지속적인 발열은 균혈증의 하나의 징후이다. 세균은 신체 내 심부 위치로 이동하여 내부 장기들, 예를 들어 뇌, 심장, 폐, 뼈 및 근육, 또는 외과적으로 이식된 장치들, 예를 들어 인공 관절이나 심장 박동기에 나쁜 영향을 미치는 감염을 유발할 수도 있다. 에스.아우레우스 패혈증의 하나의 전형적 특징으로서는 심장 내 세균 집락 형성 단위(CFU)로서 측정되는 세균성 응집 반응 및 혈전색전성 병변 형성이 있다(McAdow et al., 2011).
구체예들에 있어서, 포유동물 피험체 내에서 에스.아우레우스 연관 패혈증을 예방하거나 포유동물 피험체 내에서 에스.아우레우스 연관 패혈증의 중증도를 감소시키는 방법들이 제공된다. 이와 같은 방법들은, 분리된 항 에스.아우레우스 알파 독소(항 AT) 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 예를 들어 본원에 기술되어 있거나 아니면 당 업계에 알려져 있는, 분리된 항 에스.아우레우스 알파 독소(항 AT) 항체 또는 항원 결합 단편 유효량을 피험체에 투여하는 단계를 포함하는 것이 적당하다.
포유동물 피험체 내에서 에스.아우레우스 연관 패혈증을 예방하는 방법은, 감염 이벤트(infection event) 이전에 분리된 항 AT 항체 또는 이의 항원 결합 단편 유효량을 피험체에 투여하는 단계를 포함하는 것이 적당하다. 본원에 사용된 바와 같은 "감염 이벤트"란, 피험체가 에스.아우레우스 감염에 노출되거나 노출될 수 있었을 동안의 이벤트를 말한다. 예시적인 감염 이벤트로서는 신체 중 임의의 부분, 예를 들어 머리, 입, 손, 팔, 다리, 몸통, 내부 장기들(예를 들어 심장, 뇌, 대장, 신장, 위, 폐, 간, 비장 및 췌장 등), 뼈, 피부를 대상으로 한 수술을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 수술은 에스.아우레우스에 쉽게 감염될 수 있는 환경, 예를 들어 개방된 수술 상처 및 장기를 제공한다. 추가의 감염 이벤트로서는 개방된 상처를 제공하거나 또는 에스.아우레우스 감염이 체내에 들어갈 수 있었던 것을 통하여 혈류로의 접근 경로를 제공하는, 신체의 임의의 부분에 대한 외상을 포함한다. 추가의 감염 이벤트로서는 수혈, 의약품 또는 불법이나 합법 약물의 주사, 바늘 찔림, 문신 바늘, 정맥 내(IV) 라인의 삽입 및 유지, 외과용 드레인의 삽입 및 유지, 그리고 피부 손상 위치, 예를 들어 욕창(욕창성 궤양)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
방법들이 에스.아우레우스 연관 패혈증의 예방을 제공하는 구체예들에 있어서, 항 AT 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 감염 이벤트가 일어나기 1시간 이상 전에 적당히 투여된다. 예를 들어 수술(감염 이벤트)하기 1시간 이상 전에 투여될 수 있다. 적당하게 항 AT 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 감염 이벤트가 일어나기 6시간 이상, 12시간 이상, 18시간 이상, 24시간 이상, 30시간 이상, 36시간 이상, 42시간 이상, 48시간 이상 또는 이보다 훨씬 전에 투여된다. 구체예들에 있어서, 항 AT 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 감염 이벤트가 일어나기 약 6~약 36시간, 약 6~약 36시간, 약 12~약 36시간, 약 12~약 24시간, 약 24~약 36시간, 약 20~약 30시간, 약 20~약 28시간, 약 22~약 26시간, 또는 약 12시간, 약 13시간, 약 14시간, 약 15시간, 약 16시간, 약 17시간, 약 18시간, 약 19시간, 약 20시간, 약 21시간, 약 22시간, 약 23시간, 약 24시간, 약 25시간, 약 26시간, 약 27시간, 약 28시간, 약 29시간 또는 약 30시간, 또는 약 31시간, 또는 약 32시간, 또는 약 33시간, 또는 약 34시간, 또는 약 35시간, 또는 약 36시간 전에 적당히 투여된다.
본원에 사용된 바와 같이 에스.아우레우스 연관 패혈증의 "예방"이란, 감염 이벤트가 일어났을 때 피험체가 에스.아우레우스 연관 패혈증에 걸릴 위험을 줄이는 것을 말한다. 적당하게, 피험체가 에스.아우레우스 연관 패혈증에 걸릴 위험은, 감염 이벤트가 일어나기 전 항 AT 항체 또는 항원 결합 단편이 투여되지 않은 피험체의 상기 위험과 비교되었을 때, 30% 이상까지 감소한다. 더욱 적당하게, 위험은, 감염 이벤트가 일어나기 전 항 AT 항체 또는 항원 결합 단편이 투여되지 않은 피험체의 상기 위험과 비교되었을 때, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 감소하거나, 또는 상기 위험은 아예 없어진다.
포유동물 피험체 내에서 에스.아우레우스 연관 패혈증의 중증도를 감소시키기 위한 방법에 있어서, 이와 같은 방법들은 에스.아우레우스 연관 패혈증 증상들을 보이는 피험체에, 분리된 항 에스.아우레우스 알파 독소(항 AT) 항체 또는 이의 항원 결합 단편 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 이와 같은 증상들로서는, 예를 들어 오한, 착란 또는 섬망, 발열 또는 저체온(저체온증), 저혈압으로 인한 몽롱함, 가쁜 심장박동, 진탕, 피부 발진 및 피부 발열(warm skin)을 포함할 수 있다.
본원에서 패혈증에 관하여 언급될 때 사용되는 "중증도를 감소시키는 것"이란, 에스.아우레우스 연관 패혈증에 걸린 피험체가 보이는 증상들을 감소시키는 것을 말한다. 적당하게, 증상들은, 에스.아우레우스 연관 패혈증에 걸렸으되 항 AT 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 투여되지 않은 피험체가 보이는 증상들과 비교되었을 때, 30% 이상 감소한다. 더욱 적당하게, 증상들은, 감염 이벤트가 일어나기 전 항 AT 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 투여되지 않은 피험체가 보이는 증상들과 비교되었을 때, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 감소하거나, 증상들은 아예 없어진다(즉 피험체는 감염과 패혈증이 치유된다).
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료하다", "치료하는 것" 또는 "치료"는, 원치않는 생리적 변화 또는 질환, 예를 들어 질병의 진행을 예방하거나 지연(경감)시키는 것에 목적을 둔, 치료 차원의 치료와, 예방 또는 보호 차원의 수단들을 말하는 것일 수 있다. 유리하거나 원하던 임상 결과들로서는 증상들의 경감, 질병 범위의 축소, 질병 상태의 안정화(즉 악화되지 않는 상태), 질병 진행의 지연 또는 늦춤, 질병 상태의 개선 또는 완화를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. "치료"는 또한 치료를 받지 않은 개체의 예상 생존기간과 비교되었을 때 생존기간을 연장시키는 것을 의미할 수도 있다. 치료를 필요로 하는 개체들로서는 이미 병태 또는 질환이 발생한 개체와, 병태 또는 질환이 발병할 가능성이 있는 개체, 또는 병태 또는 질환이 예방되어야 하는 개체를 포함한다.
적당하게, 본원에 기술된 다양한 방법들에서 항 AT 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 투여될 수 있는 피험체로서는 포유동물, 예를 들어 인간, 개, 고양이, 영장류, 소, 양, 말, 돼지 등이 있다.
본원에 기술된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 적당한 투여량과 투여 계획에 따라서 투여될 수 있으며, 이와 같은 투여량과 투여 계획은 질병 또는 병태에 따라서 달라질 수 있다. "유효 투여량"은, 투여량이나 투여 계획이 치료 효과 또는 치료 종점(예를 들어 예방)을 달성하는지 여부를 확인함으로써 정해질 수 있다. 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 투여하는 것은 단일 투여 방식, 또는 원하는 효과들과 기타 임상학적 고려 사항들에 따라서 간격을 두고 다수 회 투여하는 방식으로 이루어질 수 있다.
항 AT 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 기술된 다양한 방법들 중 임의의 방법에서 피험체에 투여될 수 있게 되는 예시적인 방법들로서는 정맥 내(IV), 종양 내(IT), 병변 내(IL), 에어로살(aerosal), 경피, 내시경, 국소, 근육 내(IM), 진피 내(ID), 안 내(IO), 복막 내(IP), 경 진피(TD), 비 내(IN), 뇌 내(IC), 장기 내(예를 들어 간 내) 투여, 서방형 임플란트, 또는 피하 투여, 또는 삼투압 펌프나 기계적 펌프를 사용한 투여를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
추가의 구체예에서, 포유동물 피험체의 혈류 또는 심장 내 에스.아우레우스 세균량을 감소시키는 방법이 제공된다. 이와 같은 방법들은 분리된 항 에스.아우레우스 알파 독소(항 AT) 항체 또는 이의 항원 결합 단편 유효량을 피험체에 투여하는 단계를 포함하는 것이 적당하다.
포유동물 피험체의 혈류 또는 심장 내 세균량은 혈류 또는 심장 내 세균, 적당하게는 에스.아우레우스 세균 집락의 양을 측정하기 위한 것으로 당 업계에 공지된 방법들을 통해 적당히 측정된다. 예를 들어 세균량은 유기체로부터 유래하는 샘플을 아가 평판에 도말하고, 이 평판을 배양한 다음, 평판 상 집락 형성 단위(CFU)의 수를 정량함으로써 적당히 측정된다. 이와 같은 방법들은 당 업계에 널리 공지되어 있다. 세균량을 측정하는데 적당한 추가 방법들도 이용될 수 있다. 수집된 샘플은 일반적으로나 구체적으로 특정 장기로부터 취하여진 유기체로부터 유래하는 혈액 샘플인 것이 적당하다.
적당하게, 항 AT 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로 치료된 피험체의 경우 에스.아우레우스로 감염된 피험체의 세균량(즉 집락 형성 단위에 의해 측정되는 세균의 양)은, 에스.아우레우스에 감염되었으나 항 AT 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 투여되지 않은 피험체의 세균량과 비교되었을 때, 30% 이상으로 감소한다. 더욱 적당하게, 세균의 양은, 항 AT 항체 또는 항원 결합 단편이 투여되지 않은 피험체의 세균의 양과 비교되었을 때, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 감소하거나, 또는 세균량은 완전히 없어진다.
적당하게, 항 AT 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 에스.아우레우스에 감염된 것으로 진단된 후 가능한 한 빨리, 예를 들어 수 시간 또는 수일 이내에 투여된다. 항 AT 항체 또는 항원 결합 단편의 투여 지속 기간과 투여될 양은 당 업자들에 의해 용이하게 결정된다.
포유동물 피험체 내에서 에스.아우레우스 세균 응집 반응 및/또는 혈전색전성 병변 형성을 감소시키는 방법도 제공된다. 이와 같은 방법들은 분리된 항 에스.아우레우스 알파 독소(항 AT) 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 예를 들어 본원에 기술되어 있거나 당 업계에 알려져 있는 항 에스.아우레우스 알파 독소(항 AT) 항체 또는 이의 항원 결합 단편 유효량을 상기 피험체에 투여하는 단계를 포함하는 것이 적당하다.
본원에 기술된 바와 같이, 에스.아우레우스 세균 응집 반응을 감소시키는 방법이란, 에스.아우레우스 세균이 혈액과 접촉하게 되고/되거나 장기 속에 침투할 때 이 세균들이 이루는 덩어리의 양을 낮추는 것을 말한다. 세균 응집 반응을 측정하는 예시적인 방법은 당 업계에 알려져 있는데, 예를 들어 개시된 사항이 본원에 그 자체로서 참고 문헌으로 인용되어 있는 문헌[McAdow et al., PLos Pathogens 7:e1002307 (2011)]에 개시되어 있다. 적당하게, 본원에 제공된 방법들은 또한 피험체의 혈류 및/또는 장기 내 혈전색전성 병변 형성을 낮추기도 한다. 혈전색전성 병변 형성을 확인하는 방법들은 당 업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 자기 공명 영상 촬영(MRI), 컴퓨터 단층 촬영(CT) 또는 컴퓨터 축 단층 촬영(CAT) 스캔 또는 기타 적당한 영상 촬영 방법들을 포함한다.
적당하게, 포유동물 피험체에서 에스.아우레우스 세균 응집 반응 및/또는 혈전색전성 병변 형성을 감소시키는 방법은, 항 AT 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로 치료된 피험체에서의 경우, 에스.아우레우스로 감염되었으나 항 AT 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 투여되지 않은 피험체에서의 경우와 비교되었을 때, 세균 응집 반응 및/또는 혈전색전성 병변 형성을 30% 이상 감소시킨다. 더욱 적당하게, 세균 응집 반응 및/또는 혈전색전성 병변 형성은, 항 AT 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 투여되지 않은 피험체에서의 세균 응집 반응 및/또는 혈전색전성 병변 형성과 비교되었을 때, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 감소하거나, 이 세균 응집 반응 및/또는 혈전색전성 병변 형성은 완전히 없어진다.
적당하게, 포유동물 피험체에서 에스.아우레우스 연관 패혈증을 예방하거나, 또는 포유동물 피험체에서 에스.아우레우스 연관 패혈증의 중증도를 감소시키는 방법은 또한 피험체의 혈류 또는 심장에서의 세균량 감소를 초래하기도 한다. 다른 구체예들에서, 포유동물 피험체에서 에스.아우레우스 연관 패혈증을 예방하거나, 또는 포유동물 피험체에서 에스.아우레우스 연관 패혈증의 중증도를 감소시키는 방법은 또한 피험체 내 세균 응집 반응 및/또는 혈전색전성 병변 형성의 감소를 초래하기도 한다.
추가의 구체예들에서, 면역 약화된 포유동물 피험체 내에서 에스.아우레우스 연관 폐렴을 예방하거나 이 폐렴의 중증도를 감소시키는 방법이 제공된다. 이와 같은 방법은 분리된 항 에스.아우레우스 알파 독소(항 AT) 항체 또는 이의 항원 결합 단편 유효량을 피험체에 투여하는 단계를 포함하는 것이 적당하다.
본원에 기술된 바와 같이, 놀랍게도 면역 약화된 포유동물 피험체들에는, 에스.아우레우스 연관 폐렴을 예방하거나 또는 이미 폐렴이 발병한 피험체 내에서 에스.아우레우스 연관 폐렴의 중증도를 감소시키기 위해서 항 AT 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 투여될 수 있음이 발견되었다.
본원에 사용된 바와 같은 "면역 약화된"이란, 포유동물 피험체가 정상적인 면역 반응을 진행시키지 못하고, 일반적으로 이와 같은 피험체가 호중구 감소증(즉 호중구 수가 비정상적으로 낮은 병증)을 앓고있는 경우를 말한다. 호중구 감소증의 중증도는 혈액 1㎕당 세포 수로서 측정되는 절대 호중구 수(ANC)에 의해 결정된다. 경도의 호중구 감소증(1000≤ANC≤1500); 중등도의 호중구 감소증(500≤ANC≤1000); 중증 호중구 감소증(ANC<500)이 당 업자들에 의해 결정되는 통상적인 수준들이다.
본원에 사용된 바와 같이, 면역 약화된 포유동물 피험체 내에서 에스.아우레우스 연관 폐렴의 "예방"이란, 감염 이벤트가 일어날 때 면역 약화된 피험체가 에스.아우레우스 연관 폐렴에 걸릴 위험을 감소시키는 것을 말한다. 적당하게, 면역 약화 피험체가 에스.아우레우스 연관 폐렴에 걸릴 위험은, 감염 이벤트가 일어나기 전에 항 AT 항체 또는 항원 결합 단편이 투여되지 않은 면역 약화 피험체가 에스.아우레우스 연관 폐렴에 걸릴 위험과 비교되었을 때, 30% 이상 감소한다. 더욱 적당하게, 상기 위험은, 감염 이벤트가 일어나기 전에 항 AT 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 투여되지 않은 면역 약화 피험체의 위험과 비교되었을 때, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 감소하거나 또는 상기 위험은 완전히 없어진다.
포유동물 피험체 내 에스.아우레우스 연관 폐렴의 중증도를 감소시키는 방법들에 있어서, 이와 같은 방법들은 에스. 아우레우스 연관 폐렴의 증상들을 보이는 피험체에 분리된 항 에스.아우레우스 알파 독소(항 AT) 항체 또는 이의 항원 결합 단편 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 것이 적당하다. 이러한 증상들로서는, 예를 들어 기침, 가슴 통증, 발열 및 호흡 곤란을 포함할 수 있다.
본원에서 폐렴과 관련하여 사용된 "중증도를 감소시키는 것"이란 어구는, 에스. 아우레우스 연관 폐렴에 걸린 피험체(적당하게는 면역 약화된 피험체)가 보이는 증상들을 감소시키는 것을 말한다. 적당하게, 증상들은, 이미 에스. 아우레우스 연관 폐렴에 걸렸지만, 항 AT 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 투여되지 않은 피험체가 보이는 증상들과 비교되었을 때, 30% 이상 감소한다. 더욱 적당하게, 증상들은, 감염 이벤트가 일어나기 전에 항 AT 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 투여되지 않은 면역 약화 피험체의 증상들과 비교되었을 때, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 감소하거나 또는 상기 증상들은 완전히 없어진다.
본원에 기술된 바와 같이, 다양한 방법들은 인간, 예를 들어 임의의 연령의 성인 및 어린이인 포유동물 피험체를 대상으로 수행된다.
적당하게, 본원에 기술된 방법들에 있어서, 투여되는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 분리된 Fv, Fab, Fab' 및 F(ab')2 항원 결합 단편들이다. 추가의 구체예들에 있어서, 항체는 본원에 기술된 바와 같은 전장 항체이다. 적당하게, 항체는 본원 전반에 걸쳐 상세히 기술된 바와 같은 Fc 변이체 부분을 포함한다.
본원 전반에 걸쳐 기술되어 있는 방법들은 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드와 면역 특이적으로 결합하는 분리 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 이용하는 것이 적당하다. 이와 같은 항체 및 이의 항원 결합 단편은 다음과 같은 것들을 포함하는 것이 적당하다:
(a) 서열 번호 7, 10, 13 또는 69의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1;
(b) 서열 번호 8, 11, 14, 17, 70 또는 75의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2;
(c) 서열 번호 9, 12, 15, 18, 16, 65, 66, 67, 71, 72, 76 또는 78의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3;
(d) 서열 번호 1~4의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1;
(e) 서열 번호 2, 5, 73 또는 77의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및
(f) 서열 번호 3, 6, 64, 68 또는 74의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3.
뿐만 아니라, 이와 같은 항체 또는 항원 결합 단편의 돌연 변이체, 변이체 및 유도체뿐만 아니라, 상기 언급된 아미노산 서열들에 대하여 90% 이상의 동일성을 보이는 항체 또는 이의 항원 결합 단편도 사용될 수 있다.
추가의 구체예에서, 본원에 기술된 다양한 방법들은 CDR, 예를 들어 서열 번호 7, 8, 9, 1, 2 및 3; 서열 번호 10, 11, 12, 1, 2 및 3; 서열 번호 13, 14, 15, 4, 5 및 6; 서열 번호 7, 17, 18, 1, 2 및 3; 서열 번호 7, 8, 16, 1, 2 및 64; 서열 번호 7, 8, 65, 1, 2 및 64; 서열 번호 7, 8, 66, 1, 2 및 64; 서열 번호 7, 8, 67, 1, 2 및 68; 서열 번호 7, 8, 67, 1, 2 및 64; 서열 번호 7, 8, 78, 1, 2 및 64; 서열 번호 7, 8, 65, 1, 2 및 68; 서열 번호 69, 70, 71, 1, 2 및 68; 서열 번호 7, 8, 72, 1, 73 및 74; 서열 번호 69, 75, 71, 1, 2 및 68; 서열 번호 69, 75, 76, 1, 2 및 68; 서열 번호 69, 75, 76, 1, 77 및 74; 서열 번호 69, 70, 71, 1, 77 및 74의 아미노산 서열들에 상응하는 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 이용한다.
구체예들에 있어서, 본원에 기술된 다양한 방법들에서 사용되는, 분리된 항 AT 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 또는 62의 아미노산 서열에 대하여 90% 이상의 동일성을 가지는 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 서열 번호 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 또는 63의 아미노산 서열에 대하여 90% 이상의 동일성을 가지는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
본원에 기술된 방법들에 관한 또 다른 구체예에 있어서, 본원에서 사용되는 분리 항 AT 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 또는 62의 중쇄 가변 도메인과, 서열 번호 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 또는 63의 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
추가의 구체예들에 있어서, 본원에 기술된 방법들은 서열 번호 20 및 19; 서열 번호 22 및 21; 서열 번호 24 및 23; 서열 번호 26 및 25; 서열 번호 28 및 27; 서열 번호 41 및 42; 서열 번호 43 및 44; 서열 번호 45 및 46; 서열 번호 47 및 48; 서열 번호 47 및 48; 서열 번호 49 및 50; 서열 번호 51 및 52; 서열 번호 51 및 52; 서열 번호 53 및 54; 서열 번호 55 및 56; 서열 번호 57 및 58; 서열 번호 59 및 60; 서열 번호 61 및 58; 서열 번호 62 및 58; 서열 번호 62 및 63; 서열 번호 79 및 63의 아미노산 서열들에 상응하는 VH 및 VL을 가지는 항 AT 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 이용한다.
적당한 구체예들에 있어서, 분리된 항 AT 항체는 Fc 변이체 도메인을 가지는, 분리된 항 AT 항체를 포함하는데, 여기서 이 항체는 서열 번호 80에 상응하는 VH-IgG1-YTE 및/또는 서열 번호 81에 상응하는 VL-카파를 포함한다.
실시예
실시예 1: 패혈증 모델의 확립
세균 공격 투여량의 준비
에스.아우레우스 SF8300(USA300)을 빈 디엡(Binh Diep)(캘리포니아 대학교 샌 프란시스코 분교)로부터 공급받았다. 37℃에서 세균을 트립신 처리 대두 발효액(TSB) 50㎖ 중에 넣어 밤새도록 250rpm으로 진탕하며 배양하였다. 밤새도록 배앙한 배양액 중 10㎖를 새로 준비한 TSB 1ℓ에 첨가한 후 37℃에서 세균을 생육하였는데, 이때 600㎚에서의 광학 밀도(OD600)가 0.8이 될 때까지 상기 배양액을 진탕하였다. 4℃에서 15분 동안 원심 분리(8000rpm)하여 세균을 회수한 후, 이를 인산염 완충 염수(PBS) 중에서 세정하였다. 원심 분리로 세균을 수집한 다음, 이를 글리세롤 10%와 함께 PBS 중에 재현탁하여 최종 세균 스톡 농도가 약 2×1010cfu/㎖가 되도록 만들었다.
마우스 공격 및 생존
8~9주령 암컷 BALB/c 마우스 10마리로 이루어진 군들에, 500㎕ PBS 중 소정 농도의 LC10 mAb 또는 R347(45㎎/㎖) mAb을 복막 내(IP) 경로로 주사하였다. 이로부터 24시간 경과 후 세균 현탁액(PBS 중 5×107cfu로 희석, pH7.2, 동결 스톡 유래) 200㎕를 사용하여 동물들의 꼬리 정맥을 통해 동물들을 정맥 내 공격하였다. 공격 후로부터 14일 동안 마우스 생존 여부에 대해 모니터하였다. 로그 순위 검정법으로 통계학적 분석 결과를 평가하였다: R347(대조군) 투여 동물 대 LC10(항 AT Ab) 면역화된 동물.
심장 내 세균량
감염 후 14시간 경과시 CO2를 사용하여 감염된 마우스를 안락사시켰다. 심장을 꺼내고 나서, 이를 용해 기질 A 튜브(냉각 PBS 1㎖) 내에서 균질화시킨 다음, TSA 평판상에 도말하여 세균을 계수하였다. R347 mAb과 LC10 mAb 사이의 쌍별 비교(짝을 이루지 않는 양측 스튜던트 t-검정 이용)를 통하여 심장 조직 내 세균량을 분석하였다. 만일 p<0.05이면 데이터는 유의적인 것으로 간주하였다.
혈중 세균량
감염 후 8시간, 24시간, 48시간, 72시간 및 144시간 경과시 CO2를 사용하여 동물들을 안락사시켰다. 심장 천자로 혈액을 채취하고 나서 바로 혈액 100㎕를 TSB 평판 상에 도말하여 cfu를 계수하였다. 짝을 이루지 않는 스튜던트 t 검정으로 데이터를 분석하였다. 만일 p<0.05이면 LC10 mAb 및 R347 mAb 간 수치들은 통계학적으로 상이한 것으로 간주하였다.
실시예 2: 패혈증에 있어서 항 AT 항체의 예방 효과
AT의 항 AT 항체 매개 억제가 패혈증 진행에 영향을 미칠 것인지 여부를 확인하기 위해서, 에스.아우레우스 SF8300(USA300)으로 IV 공격을 수행하기 24시간 전에 10마리 마우스로 이루어진 군들을 LC10(45 및 15㎎/㎏) 또는 이소타입 대조군(R347, 45㎎/㎏)으로 수동 면역화한 다음, 14일 동안 생존 여부를 모니터하였다. LC10이 사용되는 예방법은 생존율을 유의적으로 증가시켰는데, 이는 AT가 전신 에스.아우레우스 질병에 중요한 역할을 하며, LC10을 사용하는 억제는 동물들이 폐사하지 않도록 보호함을 말해준다(도 1).
에스.아우레우스 패혈증의 한 가지 전형적 특징으로서는 세균 응집 반응 및 혈전색전성 병변 형성(심장 내 세균 CFU로서 측정됨)이 있다(McAdow et al, 2011). LC10이 사용되는 예방법이 심장 내 세균량을 감소시키는지 여부를 확인하기 위해서, SF8300으로 IV 감염을 수행하기 24시간 전 마우스들을 LC10(15 및 45㎎/㎏) 또는 R347(45㎎/㎏)으로 수동 면역화하였다. 감염 후 14시간 경과시 동물들을 안락사시키고 나서, 이 동물들의 심장을 처리하여 CFU를 계수하였다. LC10으로 수동 면역화된 마우스는, R347 대조군이 투여된 마우스와 비교되게, 심장 CFU의 유의적 감소를 보였다(도 2).
IV 감염 후 24~72시간 경과시 혈중 세균 수에 대한 LC10 예방법의 효과도 평가하였다. 감염된 마우스의 혈류 중 세균의 수는, 72시간에 걸쳐 R347로 처리된 마우스의 경우 약 103cfu로 유지되었다. 그러나, LC10 예방법은 모든 검정 시점에서의 세균량을, 72시간 경과시의 크기의 최대 2 순위까지 감소시키는 결과를 초래하였다(도 3a~3c). 이와 같은 결과들은, AT가 패혈증 진행에 중요하고, LC10을 사용하여 AT를 억제하면 혈류 및 심장 중 세균 cfu도 감소할 뿐만 아니라, 치사 투여량의 에스.아우레우스로 IV 공격한 후의 생존률도 증가함을 말해준다.
실시예 3. 면역 약화된 폐렴 모델의 확립
면역 약화된 개체들, 특히 호중구 감소증이 발병한 개체들은 에스.아우레우스 감염 위험이 증가한다(Andrews and Sullivan, 2003; Bouma et. al., 2010). 면역 약화된 개체들 내에서 에스.아우레우스 폐렴의 예방에 사용될 항 AT 항체의 효능을 연구하기 위해서, 면역 약화된 쥣과 동물 폐렴 모델을 개발 및 이용하였다. 개체들의 면역 약화된 모집단 내 감염을 모의하기 위하여, 마우스 내에서 백혈구 세포, 예를 들어 호중구, 림프구 및 혈소판을 고갈시키는 것으로 알려진 알킬화제인 사이클로포스파미드를 투여함으로써 마우스를 호중구 감소증 마우스가 되도록 만들었다(Zuluaga, et. al. 2006).
C57BL/6 마우스 내 순환 면역 세포들을 90%를 초과하도록 감소시키는데 필요한 최적 사이클로포스파미드(CPM) 투여 계획을 결정하기 위해 실험들을 수행하였다. CPM 분말을 주사용 멸균 수 중에 용해하여 최종 농도가 20㎎/㎖가 되도록 만들었다. 제0일 및 제3일 경과시 20마리의 마우스로 이루어진 군들을 상이한 CPM 투여 계획으로 복막 내 주사 처리하였다. 제0일, 제1일, 제4일 및 제6일 경과시 5마리 동물들로 이루어진 군들의 동물들을 죽이고 나서, 심장 천자로 혈액을 채취하여 배큐테이너(Vacutainer) EDTA 튜브에 담았다. 그 다음, 시스맥스 자동화 혈액학 분석 장치를 이용하여 백혈구(WBC)(호중구, 림프구) 백분율을 구하였다.
마우스 폐렴 모델
세균 도전 투여량의 준비
에스.아우레우스 SF8300을 37℃에서 트립신 처리 대두 발효액(TSB) 50㎖ 중에서 밤새도록 250rpm으로 진탕하며 배양하였다. 밤새도록 배앙한 배양액 중 10㎖를 새로 준비한 TSB 1ℓ에 첨가한 후 37℃에서 세균을 생육하였는데, 이때 600㎚에서의 광학 밀도(OD600)가 0.8이 될 때까지 상기 배양액을 진탕하였다. 4℃에서 15분 동안 원심 분리(8000rpm)하여 세균을 회수한 후, 이를 인산염 완충 염수(PBS) 중에서 세정하였다. 원심 분리로 세균을 수집한 다음, 이를 글리세롤 10%와 함께 PBS 중에 재현탁하여 최종 세균 스톡 농도가 약 2×1010CFU/㎖가 되도록 만들었다.
면역 약화된 마우스 폐렴 모델
우선, 면역 약화된 마우스 내 최소 치사 에스.아우레우스 투여량을 공격 투여량 적정 실험을 통해 확인하였다. 2차 CPM 투여 후 24시간 경과시 면역 약화된 마우스를 이소플루오란으로 마취시키고 나서, 이 마우스의 왼쪽 및 오른쪽 콧구멍에 에스.아우레우스 현탁액(1×107∼2×108CFU) 50㎕를 접종하였다. 동물들을 케이지 안에 배와위로 넣어 회복시켰으며, 7일의 기간에 걸쳐 치사율에 대해 관찰하였다.
실시예 4. 백혈구 감소성 폐렴에 있어서 항 스타프 AT 항체의 예방 효과
면역 약화된 폐렴 모델에서 항 AT mAb의 효능 연구
본 실험에 사용된 동물들은 총 30 마리였으며, 이 동물들을 무작위로 3개의 군으로 나누었다. 감염시키기 4일 전과 1일 전, 동물들에 CPM을 투여하였다. 에스.아우레우스 SF8300(5×107)을 사용하여 비 내(IN) 공격을 수행하기 24시간 전, 각각의 군에도 LC10(45 또는 15㎎/㎏) 또는 R347(45㎎/㎏) 중 어느 하나를 투여하고 나서, 최대 7일 동안 생존율을 관찰하였다. 로그 순위 검정을 이용하여 통계학적 유의성을 측정하였다.
면역 결핍의 입증
총 WBC(호중구 포함) 수를 90%까지 감소시키기 위한 최적의 CPM 투여 계획을 결정하기 위해 실험들을 수행하였다. 제0일 및 제3일 경과시, 20마리의 마우스로 이루어진 군들을 6가지의 상이한 CPM 투여 계획으로 처리하였다. 제0일, 제1일, 제4일 및 제6일 경과시 각각의 투여군 내 마우스 5마리로부터 혈액 샘플을 채취하고, 시스멕스 혈액학 분석 장치를 사용하여 총 WBC 수와 WBC 백분율 측정을 수행하였다. 제4일 및 제6일 경과시, 제6군(1차 CPM 투여량 150㎎/㎏; 2차 CPM 투여량 100㎎/㎏[CPM150/100]) 내 동물들은, 미처리 동물들의 경우와 비교되게, 총 WBC 수에 있어서 90% 감소를 보였다. 제4일 및 제6일 경과시 이 군에서는 호중구 및 림프구가 90% 감소하였다(도 4a~4c). 제7일째 되는 날 백혈구들은 회복되기 시작하였다. 이와 같은 결과들은 이전에 보고되었던 결과들(Zuluaga et al., 2006)과 일치하는 것이다. 그러므로 CPM 150/100 투여량은 면역 약화 동물들에서 LC10 예방법을 평가하기 위해 선택된 양이었다.
면역 약화 폐렴 마우스에서의 세균 공격 투여량의 결정
면역 약화된 동물들에서 최소 치사 공격 투여량을 측정하기 위하여, 마우스 5마리로 이루어진 군들을 IN 공격함으로써 에스.아우레우스 SF8300을 적정하였다(2×108~1×107CFU). 7일 동안 치사율을 관찰하였다(도 5). 하한 치사 투여량은 5×107 CFU이었으며, 이는 LC 예방법을 검정하기 위한 투여량으로서 선택된 양이었다.
LC10은 면역 약화 폐렴 동물들에서 생존율을 증가시킴
면역 약화 마우스에서 LC10 예방법의 효과를 이해하기 위해서, 세균 현탁액(SF8300, 5×107CFU) 50㎕로 IN 공격하기 24시간 전에 CPM 주사된 동물들에 LC10(45 또는 15㎎/㎏) 또는 R347(45㎎/㎏)을 투여한 다음, 전술된 바와 같이 치사율을 관찰하였다.
LC10 45㎎/㎏ 또는 15㎎/㎏으로 수동 면역화를 수행한 결과, R347 대조군과 비교되게 생존율의 유의적 증가가 초래되었다(p<0.0001)(도 6). 본 연구에서 동물들이 면역 약화되었는지 여부를 확인하기 위해서, 실험 개시 4일 전, 3일 전, 1일 전, 실험 당일, 실험 개시 2일 후 및 3일 후에 비 감염 마우스 5마리로 이루어진 군으로부터 혈액 샘플들을 수집하였다. 총 WBC 수와 WBC 백분율 측정을 수행하였는데, 이때 상기 동물들에 있어서 실험 개시 4일 전과 2일 전 사이에 총 WBC 뿐만 아니라, 호중구와 림프구도 90% 감소하였다. 제0일~제2일에 동물들은 중증의 호중구 감소증(혈액 1㎕당 호중구 10개 이하)을 보였다(도 7). 따라서 LC10이 사용되는 예방법은 에스.아우레우스 호중구 감소증 마우스 폐렴 모델에서 질병 중증도를 감소시킬 수 있다.
결론
사이클로포스파미드를 사용하여 순환 백혈구 세포, 예를 들어 호중구 및 림프구가 90%를 초과하여 감소한, 에스.아우레우스 면역 약화 마우스 폐렴 모델을 개발하였다. 상기 마우스는 혈액 1㎕당 호중구 10개 이하를 보이는 중증 호중구 감소증을 보였다. LC10이 사용되는 예방법은 에스.아우레우스 호중구 감소증 마우스 폐렴 모델의 생존율을 유의적으로 개선하였다. 이와 같은 결과들은, 사이클로포스파미드를 투여함으로써 호중구 감소증이 된 마우스를 에스.아우레우스로 감염시키기 24시간 전에 LC10을 사용하여 행하여진 수동 면역화는 생존율을 유의적으로 개선함을 말해주는 것이다. 그러므로 이는, 항 AT 항체가 면역 약화된 환자에 있어서 질병을 예방할 수 있음을 입증하는 것이다.
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비록 본 발명은 첨부된 도면들을 참고로 하여 본 발명의 몇몇 구체예들과 함께 충분히 기술되었지만, 다양한 변화와 변형은 당 업자들에게 명백할 수 있음이 이해되어야 할 것이다. 이와 같은 변화와 변형은 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 한, 첨부된 청구항들에 의해 한정되는 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
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gctgtgtact tctgtgcaag agacaattat 300 agcagcaccg gggggtacta cggtatggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 31 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 31 gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggccagtca gagtattagt agctggttgg cctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaaactcct gatctataag gcgtctagtt tagaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gatgattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt attggacgtt cggccaaggg 300 accaaggtgg aaatcaaa 318 <210> 32 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 32 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt aggtacgaca tgcactgggt ccgccaagct 120 acaggaaaag gtctggagtg ggtctcagtt attggtactg atggtgacac atactatcca 180 ggctccgtga agggccgatt catcatctcc agagaaaatg ccaagaactc cttgtatctt 240 gaaatgaaca gcctgagagc cggggacacg gctgtgtatt actgtgcaag agatcggtat 300 agcagctcga accactacaa cggtatggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 33 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 33 gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggccagtca gagtattagt agctggttgg cctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaaggtcct gatctataag gcgtctagtt tagaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gatgattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt attggacgtt cggccaaggg 300 accaaggtgg aaatcaaa 318 <210> 34 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 34 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt aggtacgaca tgcactgggt ccgccaagct 120 acaggaaaag gtctggagtg ggtctcagtt attggtactg atggtgacac atactatcca 180 ggctccgtga agggccgatt catcatctcc agagaaaatg ccaagaactc cttgtatctt 240 gaaatgaaca gcctgagagc cggggacacg gctgtgtatt actgtgcaag agatcggtat 300 agcagctcga accactacaa cggtatggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 35 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 35 gccatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gggcattaga aatgatttag gctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgat gcatccagtt tacaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tggcacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgtctacaa gattacaatt acccgtggac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa a 321 <210> 36 <211> 375 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 36 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgacctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggaatg ggtctcagtt attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccgtc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagatggg 300 aggcaggtcg aggattacta ctactactac ggtatggacg tctggggcca agggaccacg 360 gtcaccgtct cctca 375 <210> 37 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 37 gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggccagtca gagtattagt agctggttgg cctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctataag gcgtctagtt tagaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gatgattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt attggacgtt cggccaaggg 300 accaaggtgg aaatcaaa 318 <210> 38 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 38 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtacag cctctggatt caccttcagt agttacgaca tgcactgggt ccgccaagct 120 acaggaaaag gtctggagtg ggtctcagtt attgatactg ctggtgacac atactatcca 180 ggctccgtga agggccgatt caccatctcc agagaaaatg ccaagaactc cttgtatctt 240 caaatgaaca gcctgagagc cggggacacg gctgtgtatt actgtgtaag agataggtat 300 agtgggaact tccactacaa cggtatggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 39 <211> 293 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 39 Ala Asp Ser Asp Ile Asn Ile Lys Thr Gly Thr Thr Asp Ile Gly Ser 1 5 10 15 Asn Thr Thr Val Lys Thr Gly Asp Leu Val Thr Tyr Asp Lys Glu Asn 20 25 30 Gly Met His Lys Lys Val Phe Tyr Ser Phe Ile Asp Asp Lys Asn His 35 40 45 Asn Lys Lys Leu Leu Val Ile Arg Thr Lys Gly Thr Ile Ala Gly Gln 50 55 60 Tyr Arg Val Tyr Ser Glu Glu Gly Ala Asn Lys Ser Gly Leu Ala Trp 65 70 75 80 Pro Ser Ala Phe Lys Val Gln Leu Gln Leu Pro Asp Asn Glu Val Ala 85 90 95 Gln Ile Ser Asp Tyr Tyr Pro Arg Asn 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Claims (6)

  1. 면역 약화된 포유동물 피험체에서 에스.아우레우스(S. aureus) 연관 폐렴을 예방하거나 이의 중증도를 감소시키기 위한 약학 조성물로서, 유효량의 분리된 항 에스.아우레우스 알파 독소(항 AT) 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고, 여기서 항 AT 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 서열 번호 69, 70, 71, 1, 2 및 68의 아미노산 서열에 의해 표시되는 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 것인 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 포유동물 피험체는 인간인 약학 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 분리된 항 AT 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Fv, Fab, Fab' 및 F(ab')2로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 약학 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체는 전장 항체인 약학 조성물.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 분리된 항체는 Fc 변이체 부분을 추가로 포함하고, 여기서 항체는 서열 번호 80에 의해 표시되는 VH-IgG1-YTE 및/또는 서열 번호 81에 의해 표시되는 VL-카파를 포함하는 것인 약학 조성물.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 분리된 항체의 VH 및 VL은 각각 서열 번호 57 및 58의 아미노산 서열을 포함하는 것인 약학 조성물.
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