KR101993839B1 - 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 사용 방법 - Google Patents

스타필로코커스 아우레우스 알파 독소에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 사용 방법 Download PDF

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Abstract

본원은 항-알파 독소 항체 및 단편에 관한 조성물, 제조 방법 및 사용 방법을 제공한다.

Description

스타필로코커스 아우레우스 알파 독소에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 사용 방법{ANTIBODIES THAT SPECIFICALLY BIND STAPHYLOCOCCUS AUREUS ALPHA TOXIN AND METHODS OF USE}
본 기술은 부분적으로 항체, 일부 실시양태에서 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 알파 독소에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다.
스타필로코커스 아우레우스는 통상적으로 건강한 인간의 코 및 피부에서 콜로니화하는 그람 양성 조건적 호기성 응괴 형성 구균이다. 인구의 대략 20% 내지 30%는 임의의 주어진 시점에서 스타필로코커스 아우레우스로 콜로니화된다. 종종 "스타프", "스타프. 아우레우스" 또는 "에스. 아우레우스"로서도 지칭되는 스타필로코커스 아우레우스 세균은 경미한 감염(예를 들면, 뾰루지, 종기) 및 전신 감염을 야기하는 기회감염성 병원체로서 간주된다.
점막 및 표피 장벽(피부)은 정상적으로 스타필로코커스 아우레우스 감염으로부터 보호한다. 손상(예를 들면, 화상, 외상, 수술 등)의 결과로서 일어나는 이들 천연 장벽의 파괴는 감염 위험을 급격히 증가시킨다. 면역 시스템을 손상시키는 질환(예를 들면, 당뇨병, 말기 신장 질환, 암 등)도 감염 위험을 증가시킨다. 기회감염성 스타필로코커스 아우레우스 감염은 심각해져 다양한 질환 또는 병태(condition)를 야기할 수 있고, 이들 질환 또는 병태의 비-한정적 예로는 세균혈증, 연조직염, 눈꺼풀 감염, 식중독, 관절 감염, 피부 감염, 열상 피부 증후군, 독성 쇼크 증후군, 폐렴, 골수염, 심내막염, 수막염 및 농양 형성이 있다.
스타필로코커스 아우레우스는 동물에서 감염 및 질환을 야기할 수도 있다. 예를 들면, 스타필로코커스 아우레우스는 종종 소 유방염과 관련된다.
스타필로코커스 아우레우스는 캡슐형 폴리사카라이드 및 단백질 독소를 포함하는 다수의 병독성 인자를 발현한다. 종종 스타필로코커스 아우레우스 감염과 관련된, 주요 세포독성제인 한 병독성 인자는 스타필로코커스 아우레우스의 대다수의 병독성 균주들에 의해 생성되는 공극 형성 용혈성 외부단백질인 알파 독소(알파 헤모라이신 또는 Hla로서도 공지되어 있음)이다. 상기 독소는 감수성 세포, 예컨대, 백혈구 세포, 혈소판, 적혈구, 말초혈 단핵구, 대식세포, 각질세포, 섬유모세포 및 내피세포의 막에서 칠량체 공극을 형성한다. 알파 독소 공극 형성은 종종 세포 기능장애 또는 용해를 초래한다.
개시내용의 간단한 요약
일부 실시양태에서, 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하는 정제된 또는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공된다. 용어 "알파 독소 폴리펩티드", "알파 독소 단량체" 및 "알파 독소 올리고머(예를 들면, 칠량체)"는 본원에서 각각 "AT", "AT 단량체" 및 "AT 올리고머"로서 지칭된다. 용어 "가변 중쇄"는 "VH"로서 지칭된다. 용어 "가변 경쇄"는 "VL"로서 지칭된다.
몇몇 실시양태에서, 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 (a) 서열번호 7, 10, 13 또는 69와 동일하거나 이들 서열들에 비해 상대적으로 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1; (b) 서열번호 8, 11, 14, 17, 70 또는 75와 동일하거나 이들 서열들에 비해 상대적으로 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; 및 (c) 서열번호 9, 12, 15, 18, 16, 65, 66, 67, 71, 72, 76 또는 78과 동일하거나 이들 서열들에 비해 상대적으로 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함한다.
특정 실시양태에서, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 7, 8 및 9; 서열번호 10, 11 및 12; 서열번호 13, 14 및 15; 서열번호 7, 17 및 18; 서열번호 7, 8 및 16; 서열번호 7, 8 및 65; 서열번호 7, 8 및 66; 서열번호 7, 8 및 67; 서열번호 7, 8 및 78; 서열번호 69, 70 및 71; 서열번호 7, 8 및 72; 서열번호 69, 75 및 71; 서열번호 69, 75 및 76; 또는 서열번호 69, 70 및 71과 동일하거나 이들 서열들에 비해 상대적으로 각각의 CDR 내에서 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 (a) 서열번호 1 또는 4와 동일하거나 이들 서열들에 비해 상대적으로 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1; (b) 서열번호 2, 5, 73 또는 77과 동일하거나 이들 서열들에 비해 상대적으로 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및 (c) 서열번호 3, 6, 64, 68 또는 74와 동일하거나 이들 서열들에 비해 상대적으로 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함한다.
특정 실시양태에서, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 1, 2 및 3; 서열번호 4, 5 및 6; 서열번호 1, 2 및 64; 서열번호 1, 2 및 68; 서열번호 1, 73 및 74; 또는 서열번호 1, 77 및 74와 동일하거나 이들 서열들에 비해 상대적으로 각각의 CDR 내에서 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기 (a) 내지 (f)와 동일하거나 하기 (a) 내지 (f)에 비해 상대적으로 각각의 CDR 내에서 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함한다: (a) 서열번호 7, 10, 13 또는 69의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1; (b) 서열번호 8, 11, 14, 17, 70 또는 75의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; (c) 서열번호 9, 12, 15, 18, 16, 65, 66, 67, 71, 72, 76 또는 78의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; (d) 서열번호 1 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1; (e) 서열번호 2, 5, 73 또는 77의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및 (f) 서열번호 3, 6, 64, 68 또는 74의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3.
특정 실시양태에서, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 7, 8, 9, 1, 2 및 3; 서열번호 10, 11, 12, 1, 2 및 3; 서열번호 13, 14, 15, 4, 5 및 6; 서열번호 7, 17, 18, 1, 2 및 3; 서열번호 7, 8, 16, 1, 2 및 64; 서열번호 7, 8, 65, 1, 2 및 64; 서열번호 7, 8, 66, 1, 2 및 64; 서열번호 7, 8, 67, 1, 2 및 68; 서열번호 7, 8, 67, 1, 2 및 64; 서열번호 7, 8, 78, 1, 2 및 64; 서열번호 7, 8, 65, 1, 2 및 68; 서열번호 69, 70, 71, 1, 2 및 68; 서열번호 7, 8, 72, 1, 73 및 74; 서열번호 69, 75, 71, 1, 2 및 68; 서열번호 69, 75, 76, 1, 2 및 68; 서열번호 69, 75, 76, 1, 77 및 74; 서열번호 69, 70, 71, 1, 77 및 74와 동일하거나 이들 서열들에 비해 상대적으로 각각의 CDR 내에서 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, (i) 3개의 CDR들을 포함하는 VH 쇄 도메인 및 3개의 CDR들을 포함하는 VL 쇄 도메인을 포함하고, (ii) 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물이 제공되고, 이때 VH 쇄 도메인의 3개 CDR들은 (a) 서열번호 7, 10, 13 또는 69의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1; (b) 서열번호 8, 11, 14, 17, 70 또는 75의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; 및 (c) 서열번호 9, 12, 15, 18, 16, 65, 66, 67, 71, 72, 76 또는 78의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3은 서열번호 7, 8 및 9; 서열번호 10, 11 및 12; 서열번호 13, 14 및 15; 서열번호 7, 17 및 18; 서열번호 7, 8 및 16; 서열번호 7, 8 및 65; 서열번호 7, 8 및 66; 서열번호 7, 8 및 67; 서열번호 7, 8 및 78; 서열번호 69, 70 및 71; 서열번호 7, 8 및 72; 서열번호 69, 75 및 71; 서열번호 69, 75 및 76; 또는 서열번호 69, 70 및 71에 상응한다.
일부 실시양태에서, (i) 3개의 CDR들을 포함하는 VH 쇄 도메인 및 3개의 CDR들을 포함하는 VL 쇄 도메인을 포함하고, (ii) 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물도 제공되고, 이때 VL 쇄 도메인의 3개 CDR들은 (a) 서열번호 1 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1; (b) 서열번호 2, 5, 73 또는 77의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및 (c) 서열번호 3, 6, 64, 68 또는 74의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3은 서열번호 1, 2 및 3; 서열번호 4, 5 및 6; 서열번호 1, 2 및 64; 서열번호 1, 2 및 68; 서열번호 1, 73 및 74; 또는 서열번호 1, 77 및 74에 상응한다.
몇몇 실시양태에서, (i) 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하고, (ii) 서열번호 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 또는 62의 아미노산 서열에 대해 90% 이상의 동일성을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하고, (iii) 서열번호 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 또는 63의 아미노산 서열에 대해 90% 이상의 동일성을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물도 제공된다.
몇몇 실시양태에서, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 또는 62의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 또는 63의 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
특정 실시양태에서, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 VH 및 VL을 포함하고, 이때 VH 및 VL은 서열번호 20 및 19; 서열번호 22 및 21; 서열번호 24 및 23; 서열번호 26 및 25; 서열번호 28 및 27; 서열번호 41 및 42; 서열번호 43 및 44; 서열번호 45 및 46; 서열번호 47 및 48; 서열번호 49 및 50; 서열번호 51 및 52; 서열번호 53 및 54; 서열번호 55 및 56; 서열번호 57 및 58; 서열번호 59 및 60; 서열번호 61 및 58; 서열번호 62 및 58; 서열번호 62 및 63; 또는 서열번호 79 및 63의 VH 및 VL 아미노산 서열들과 각각 동일하거나 이들 아미노산 서열들에 대해 90%, 95% 또는 98% 이상의 동일성을 각각 갖는다.
몇몇 실시양태에서, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하고 하기 (a) 내지 (c)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 특성을 갖고, 이때 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 스타필로코커스 아우레우스 독소는 약 1:1의 몰비로 존재한다: (a) 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드에 대한 약 13 nM 이하의 친화성 상수(KD); (b) 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드의 올리고머화를 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상까지 억제하는 특성; 및 (c) A549(폐 상피) 용해 또는 THP-1(단핵구) 및 적혈구 용해를 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상까지 감소시키는 특성.
몇몇 실시양태에서, 적혈구는 혈액으로부터 유래된 세포이다. 일부 실시양태에서, 혈액으로부터 유래된 세포는 적혈구(red blood cell)이다. 몇몇 실시양태에서, 용해는 시험관내 용혈 어세이에 의해 측정된다. 다른 실시양태에서, 용해는 시험관내 젖산 탈수소효소(lactate dehydrogenase) 방출 어세이에 의해 측정된다. 이들 어세이들은 더 후술되어 있거나 당분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 관용적으로 수행될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 진단제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 진단제는 조영제를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 진단제는 검출가능한 표지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 링커(linker)를 통해 진단제에 연결된다.
몇몇 실시양태에서, 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드는 천연(native) 독소 폴리펩티드이다. 몇몇 실시양태에서, 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드는 천연 독소 폴리펩티드에 비해 상대적으로 1개 이상의 아미노산 결실, 추가 및/또는 치환(예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환)을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드는 재조합 단백질이다. 일부 실시양태에서, 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드는 서열번호 39의 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 다른 실시양태에서, 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드의 약독화된 형태, 예를 들면, 서열번호 40으로 표시된 바와 같이 야생형 폴리펩티드의 위치 35에 있는 히스티딘이 예컨대, 류신으로 치환되어 있는 H35L이다.
일부 실시양태에서, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하고 서열번호 9, 12, 15, 18, 16, 65, 66, 67, 71, 72, 76 또는 78과 동일하거나 이들 서열들에 비해 상대적으로 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하고, 이때 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드를 중화시킨다. 몇몇 실시양태에서, 단리된 항체 또는 단리된 항체의 항원 결합 단편은 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하고 서열번호 3, 6, 64, 68 또는 74와 동일하거나 이들 서열들에 비해 상대적으로 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하고, 이때 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드를 중화시킨다.
일부 실시양태에서, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하고 서열번호 9, 12, 15, 18, 16, 65, 66, 67, 71, 72, 76 또는 78과 동일하거나 이들 서열들에 비해 상대적으로 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하고, 이때 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드의 올리고머화를 억제한다. 몇몇 실시양태에서, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하고 서열번호 3, 6, 64, 68 또는 74와 동일하거나 이들 서열들에 비해 상대적으로 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하고, 이때 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드의 올리고머화를 억제한다. 일부 실시양태에서, 올리고머화의 억제는 시험관내 결합 및 전기영동 이동성 어세이에 의해 측정된다.
본원은 (a) 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물, 및 (b) 상기 조성물의 사용 설명서 또는 상기 조성물의 사용 설명서를 수득하기 위한 지침서를 포함하는 키트도 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 조성물 중의 항체는 고체 지지체에 연결된다. 일부 실시양태에서, 고체 지지체는 비드이고, 몇몇 실시양태에서, 비드는 세파로스 비드이다. 몇몇 실시양태에서, 사용 설명서는 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드의 단리, 정제, 검출 및 정량 중 하나 이상을 포함한다.
일부 실시양태에서, 키트는 웨스턴 블롯에 적합한 완충제 및 막(membrane)을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 키트는 적재(loading) 완충제 및 용출 완충제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 효소 연결 면역흡착 어세이(ELISA)에 적합한 완충제를 포함한다.
또한, 본원은 대상체에서 폐렴을 예방하거나, 치료하거나 관리하는 방법으로서, 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물을 폐렴의 예방, 치료 또는 관리에 효과적인 양으로 폐렴의 예방, 치료 또는 관리가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 폐렴을 예방한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 스타필로코커스 알파 독소 폴리펩티드의 아미노산 1 내지 293 또는 아미노산 51 내지 293의 하나 이상의 잔기 또는 부분 또는 단편을 포함하는 선형 또는 입체구조형 에피토프에 면역특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 단편에 결합하고, 이때 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 39의 T261, T163, N264, K266 및 K271에서 접촉 잔기를 갖는다. 추가 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 알파 독소의 단편에 결합하고, 이때 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 39의 N177, W179, G180, P181, Y182, D183, D185, S186, W187, N188, P189, V190, Y191 및 R200에서 추가 접촉 잔기를 갖는다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 39의 N177, W179, G180, P181, Y182, D183, D185, S186, W187, N188, P189, V190, Y191, R200, T261, T163, N264, K266 및 K271에서 접촉 잔기를 갖는다. 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 39의 아미노산 261-272를 포함하는 단편에 결합한다. 추가 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 39의 아미노산 248-277을 포함하는 단편에 결합한다. 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 39의 아미노산 173-201을 포함하는 단편 및 서열번호 39의 아미노산 261-272를 포함하는 단편, 또는 서열번호 39의 아미노산 173-201을 포함하는 단편 및 서열번호 39의 아미노산 248-277을 포함하는 단편에 결합한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 단편에 결합하고, 이때 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 40의 T261, T163, N264, K266 및 K271에서 접촉 잔기를 갖는다. 추가 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 알파 독소의 단편에 결합하고, 이때 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 40의 N177, W179, G180, P181, Y182, D183, D185, S186, W187, N188, P189, V190, Y191 및 R200에서 추가 접촉 잔기를 갖는다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 40의 N177, W179, G180, P181, Y182, D183, D185, S186, W187, N188, P189, V190, Y191, R200, T261, T163, N264, K266 및 K271에서 접촉 잔기를 갖는다. 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 40의 아미노산 261-272를 포함하는 단편에 결합한다. 추가 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 40의 아미노산 248-277을 포함하는 단편에 결합한다. 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 40의 아미노산 173-201을 포함하는 단편 및 서열번호 40의 아미노산 261-272를 포함하는 단편에 결합한다.
다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 스타필로코커스 알파 독소 폴리펩티드 또는 스타필로코커스 알파 독소 폴리펩티드 변이체의 (1) 아미노산 261-272, (2) 아미노산 248-277 또는 (3) 아미노산 173-201 및 261-272를 포함하는 단편에 결합하고, 이때 아미노산 261-272, 아미노산 248-277 또는 아미노산 173-201은 서열번호 39의 상응하는 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열에 상응하거나 서열번호 39의 상응하는 영역을 갖는 단편 내에 치환을 함유하고, 이때 상기 치환은 상기 알파 독소 폴리펩티드에 결합하는 상기 항체 또는 항원 결합 단편의 능력을 변경시키지 않는다.
몇몇 실시양태에서, 대상체에서 피부 감염 병태를 예방하거나, 치료하거나 관리하는 방법으로서, 본 발명에 따른 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물을 상기 피부 감염 병태의 예방, 치료 또는 관리에 효과적인 양으로 상기 피부 감염 병태의 예방, 치료 또는 관리가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 피부 감염 병태는 피부괴사이다. 몇몇 실시양태에서, 피부 감염 병태는 피부의 스타필로코커스 아우레우스 감염을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 피부 감염 병태를 예방한다.
몇몇 실시양태에서, 스타필로코커스 아우레우스 감염과 관련된 병태를 예방하거나, 치료하거나 관리하는 방법으로서, 본 발명에 따른 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물을 상기 독소 폴리펩티드의 올리고머화의 감소에 효과적인 양으로 상기 병태의 예방, 치료 또는 관리가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 스타필로코커스 아우레우스 감염과 관련된 병태를 예방한다.
몇몇 실시양태에서, 투석 치료, 고위험 수술, 폐렴, 인공호흡기 관련 폐렴(VAP), 또는 선행 치료 또는 수술에 대한 조기 퇴원 후 재감염과 관련된 스타필로코커스 아우레우스 감염을 예방하거나, 치료하거나 관리하는 방법으로서, 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물을 상기 감염의 예방, 치료 또는 관리가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
또한, 몇몇 실시양태에서, 스타필로코커스 아우레우스 감염과 관련된 병태를 예방하거나, 치료하거나 관리하는 방법으로서, 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물을 세포용해의 감소에 효과적인 양으로 상기 병태의 예방, 치료 또는 관리가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 스타필로코커스 아우레우스 감염과 관련된 병태를 예방한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 세포는 혈액 또는 폐로부터 유래된 적혈구이다.
몇몇 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하나 이상의 잔기를 포함하는 선형 또는 입체구조형 에피토프에 면역특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 대상체에게 투여된 조성물은 본원에 기재된 조성물들 중 어느 한 조성물이다.
또한, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물을 세포에게 투여하는 단계; 및 상기 세포에게의 상기 조성물의 투여와 관련된 생물학적 효과의 존재, 부재 또는 양을 검출하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 몇몇 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물을 대상체에게 투여하는 단계; 및 상기 조성물의 투여와 관련된 상기 대상체 내의 생물학적 효과의 존재, 부재 또는 양을 검출하는 단계를 포함하는 방법도 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물을 대상체에게 투여하는 단계; 및 상기 대상체의 병태를 모니터링하는 단계를 포함하는 방법도 제공된다.
또한, 몇몇 실시양태에서, 유효량의 본원에 기재된 조성물들 중 어느 한 조성물을 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드의 중화가 필요한 대상체에게 투여하여 상기 독소 폴리펩티드를 중화시킴으로써 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드를 중화시키는 방법이 제공된다.
일부 실시양태에서, 스타필로코커스 아우레우스 감염에 의해 매개된 병태의 예방, 치료 또는 관리가 필요한 대상체에서 스타필로코커스 아우레우스 감염에 의해 매개된 병태를 예방하거나, 치료하거나 관리하는 방법으로서, 유효량의 본원에 기재된 조성물들 중 어느 한 조성물을 상기 대상체에게 투여하여 상기 병태를 예방하거나, 치료하거나 관리하는 단계를 포함하는 방법도 제공된다. 몇몇 실시양태에서, 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소에 의해 매개된 장애의 증상의 치료, 예방 또는 완화가 필요한 대상체에서 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소에 의해 매개된 장애의 증상을 치료하거나, 예방하거나 완화하는 방법으로서, 유효량의 본원에 기재된 조성물들 중 어느 한 조성물을 상기 대상체에게 투여하여 상기 증상을 치료하거나, 예방하거나 완화하는 단계를 포함하는 방법도 제공된다.
또한, 일부 실시양태에서, 대상체에서 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소에 의해 매개된 병태를 진단하는 방법으로서, 진단이 필요한 대상체를 선별하는 단계 및 진단 유효량의 본원에 기재된 조성물들 중 어느 한 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 몇몇 실시양태에서, 상기 대상체는 가축이고, 일부 실시양태에서, 상기 대상체는 인간이다.
일부 실시양태는 하기 설명, 실시예, 특허청구범위 및 도면에 더 기재되어 있다.
도면은 본원의 실시양태를 예시하고 비-한정적이다. 명료하고 용이한 예시를 위해, 도면은 일정한 비율로 작도되어 있지 않고, 몇몇 경우 특정 실시양태의 이해를 용이하게 하기 위해 다양한 양태들이 지나치게 강조 또는 확대 표시되어 있을 수 있다.
도 1a 및 1b는 항-알파 독소 항체에 의한 적혈구 세포용해의 퍼센트 억제를 그래프로 보여준다. 실험 세부설명 및 결과는 실시예 3에 기재되어 있다.
도 2a 및 2b는 항-알파 독소 항체에 의한 인간 A549 및 THP-1 세포용해의 퍼센트 억제를 그래프로 보여준다. 실험 세부설명 및 결과는 실시예 3에 기재되어 있다.
도 3a 및 3b는 피부괴사 모델에서 억제 항-스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 mAb를 사용한 수동 면역화의 결과를 보여준다. 5마리의 BALB/c 마우스들로 구성된 군을 5 mg/kg의 상기 억제 mAb로 수동적으로 면역화시킨 후 스타필로코커스 아우레우스 우드(Wood)로 감염시키고 병소 크기를 6일 동안 모니터링하였다. 도 3a는 감염으로부터 6일 후 병소 크기의 사진을 보여준다. 도 3b는 감염의 시간 경과에 따른 병소 크기의 감소를 그래프로 보여준다. 실험 세부설명 및 결과는 실시예 4에 기재되어 있다.
도 4 내지 7은 폐렴 모델에서 본원에 기재된 다양한 mAb로 수동적으로 면역화된 마우스의 생존을 그래프로 보여준다. 도 4는 스타필로코커스 아우레우스 USA300(3x108 cfu)으로 감염되기 24시간 전에 5 mg/kg, 15 mg/kg 및 45 mg/kg의 정제된 12B8.19로 수동적으로 면역화된 C57BL/6J 마우스의 결과를 보여준다.
도 5는 스타필로코커스 아우레우스 USA300(3x108 cfu)으로 감염되기 24시간 전에 5 mg/kg, 15 mg/kg 및 45 mg/kg의 정제된 2A3.1로 수동적으로 면역화된 C57BL/6J 마우스의 결과를 보여준다.
도 6은 스타필로코커스 아우레우스 USA300(3x108 cfu)으로 감염되기 24시간 전에 5 mg/kg, 15 mg/kg 및 45 mg/kg의 정제된 28F6.1로 수동적으로 면역화된 C57BL/6J 마우스의 결과를 보여준다.
도 7은 스타필로코커스 아우레우스 USA300(3x108 cfu)으로 감염되기 24시간 전에 5 mg/kg, 15 mg/kg 및 45 mg/kg의 정제된 10A7.5로 수동적으로 면역화된 C57BL/6J 마우스의 결과를 보여준다. 실험 세부설명 및 결과는 실시예 5에 기재되어 있다.
도 8a 및 8b는 mAb 2A3.1의 전체 인간 버전(예를 들면, 2A3hu) 또는 동종형(isotype) 대조군(R347)으로 수동적으로 면역화된 마우스의 폐(도 8a) 및 신장(도 8b)에서 세균의 분포를 그래프로 보여준다. C57BL/6J 마우스를 USA300으로 감염시키기 24시간 전에 2A3hu(15 mg/kg)로 수동적으로 면역화시켰다. 또한, 사이토카인 수준의 측정 및 조직병리학적 분석을 위해 샘플을 수집하였다. 실험 세부설명 및 결과는 실시예 5에 기재되어 있다.
도 9는 mAb 2A3hu를 사용한 수동 면역화 후 염증 사이토카인 생성의 감소를 그래프로 보여준다. 원으로 표시된 결과는 24시간 시점으로부터 수득된 결과이다. 실험 세부설명 및 결과는 실시예 6에 기재되어 있다.
도 10은 R347 대조군으로 치료된 마우스(도 10의 좌측 상의 상부 및 하부 사진 참조) 또는 2A3hu로 치료된 마우스(도 10의 우측 상의 상부 및 하부 사진 참조)의 폐 조직의 대표적인 사진을 보여준다. 실험 세부설명 및 결과는 실시예 6에 기재되어 있다.
도 11은 본원에 기재된 항-AT(스타필로코커스 아우레우스 알파 독소) mAb가 토끼 파열 적혈구(erythrocyte ghosts) 상에 존재하는 수용체와 천연 알파 독소(nAT)의 결합을 억제하지 않는다는 것을 그래프로 보여준다. 실험 세부설명 및 결과는 실시예 8에 기재되어 있다.
도 12는 본원에 기재된 항체에 의한 칠량체 형성의 억제를 보여주는 대표적인 웨스턴 블롯이다. 실험 세부설명 및 결과는 실시예 8에 기재되어 있다.
도 13a 및 13b는 본원에 기재된 항-AT mAb에 의한 올리고머화의 억제를 확인시켜주는 대표적인 웨스턴 블롯을 보여주고, 상기 억제가 적정될 수 있다는 것을 추가로 보여준다. 실험 세부설명 및 결과는 실시예 8에 기재되어 있다.
도 14 내지 16은 세포용해 억제 어세이에서 전체 인간 항-AT 항체의 효능을 그래프로 보여준다. 항-AT IgG 항체의 전체 인간 버전은 상응하는 키메라 항-AT IgG 항체와 유사한 효능을 나타낸다. 전체 인간 IgG 항체의 억제 활성은 토끼 RBC(적혈구) 용해(도 14), A549 세포용해(도 15) 및 THP-1 세포용해(도 16)에서 키메라 IgG 항체와 비교되었다. 실험 세부설명 및 결과는 실시예 9에 기재되어 있다.
도 17a 및 17b는 피부괴사 모델에서 항-스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 mAb QD20, QD37, LC10, QD33, 2A3 및 대조군 R347을 사용한 수동 면역화 후 감염의 시간 경과에 따른 병소 크기의 감소를 그래프로 보여준다. 5마리의 BALB/c 마우스로 구성된 군을 표시된 1 mg/kg(도 17a) 및 0.5 mg/kg(도 17b)의 억제 mAb로 수동적으로 면역화시킨 후 스타필로코커스 아우레우스 우드로 감염시키고 병소 크기를 6일 동안 모니터링하였다.
도 18은 폐렴 모델에서 mAb QD20, QD37, LC10, QD33, 2A3 및 대조군 R347로 수동적으로 면역화된 마우스의 생존을 그래프로 보여준다. 마우스를 스타필로코커스 아우레우스 USA300(약 2x108 cfu)으로 감염시키기 24시간 전에 5 mg/kg의 정제된 mAb로 수동적으로 면역화시켰다.
도 19는 LC10 YTE와 알파 독소 및 LukF-PV의 결합의 ELISA 특징규명을 그래프로 나타낸다. His-태깅된(tagged) 알파 독소 또는 LukF-PV를 함유하는 세균 용해물을 96웰의 표면 상에 코팅하였다. LC10 YTE 또는 마우스 항-His mAb를 코팅된 웰에 첨가하고 1시간 동안 항온처리하였다. 알파 독소의 발현 수준과 LukF-PV의 발현 수준은 항-His mAb의 결합 신호에 의해 표시된 바와 같이 유사하였지만, LC10 YTE는 알파 독소에만 유의하게 결합하였고 LukF-PV에는 결합하지 않았다.
도 20은 알파 독소와 LukF-PV 단백질의 서열 정렬을 보여준다. 알파 독소는 LukF-PV(UniProtKB/TrEMBL 기탁번호 B1Q018)와 25%의 아미노산 서열 동일성을 공유한다. 아미노산 넘버링은 성숙 단백질을 기초로 한 것이다. 클루스탈 더블유(Clustal W)의 방법을 이용하여 상기 정렬을 수행하였다. 절편 아미노산 248-277이 밑줄표시에 의해 강조되어 있다.
도 21은 알파 독소 구조의 밑그림 표현을 나타낸다. A) 알파 독소의 가용성 단량체의 모델링화된 구조의 밑그림 표현. LukF-PV의 결정 구조(단백질 데이터 은행 입력 1PVL)(Pedelacq, Maveyraud et al. 1999)를 주형으로서 사용하여 매스트로(Maestro) 9.1(슈로딩거 인코포레이티드(Schrodinger Inc))로 알파 독소의 모델링화된 단량체 구조를 구축하였다. B) 육량체로부터의 알파 독소 기본단위체(protomer)의 결정 구조(단백질 데이터 은행 입력 7AHL)(Song, Hobaugh et al. 1996)의 밑그림 표현. 아미노산 101-110은 청색으로 표시되어 있고, 아미노산 224-231은 주황색으로 표시되어 있고, 아미노산 248-277은 적색으로 표시되어 있다.
도 22는 LC10 YTE Fab - 알파 독소 복합체의 리본 도식(ribbon diagram)이다. 알파 독소 분자는 상기 도식의 상부에서 리본으로 표시되어 있다. 중쇄는 상기 도식의 하부에서 어두운 색 리본으로 표시되어 있고, 경쇄는 상기 도식의 하부에서 밝은 색 리본으로 표시되어 있다.
도 23은 알파 독소 분자의 칠량체 및 단량체 상태의 밑그림 표현이다. A. 숙주 세포의 표면 상에서 공극을 생성하는 알파 독소 분자의 버섯 유사 칠량체 조립. 회색 영역 및 흑색 영역은 모델에서 가려진 LC10 YTE 접촉 잔기에 상응한다. 가려진 위치에 존재하는 상기 접촉 잔기는 칠량체 형성을 차단하는 LC10과 일치한다. B. 공극 형성 전(밝은 회색) 및 후(어두운 회색) 알파 독소 분자의 중첩된 구조.
도 24는 뮤린 피부괴사 모델에서 LC10의 치료 효능을 그래프로 나타낸다. 5마리의 Balb/C 마우스로 구성된 군을 15 mg/kg의 LC10 또는 R347로 수동적으로 면역화시켰고 상기 Balb/C 마우스를 2x108개의 스타필로코커스 아우레우스 우드로 비강내로 감염시켰다. 그 다음, 감염으로부터 (A) 1시간, (B) 3시간 또는 (C) 6시간 후, 상기 마우스를 5 mg/kg, 15 mg/kg 또는 45 mg/kg의 LC10으로 치료하고 병소 크기를 6일 동안 모니터링하였다. 세균 챌린지(challenge) 24시간 전에 15 mg/kg의 LC10 또는 R347을 투여받은 5마리의 마우스로 구성된 군을 대조군으로서 포함시켰다.
도 25는 뮤린 폐렴 모델에서 LC10의 치료 효능을 그래프로 나타낸다. 2x108개의 스타필로코커스 아우레우스 USA300을 사용한 비강내 챌린지 24시간 전, 10마리의 C57BL/6 마우스로 구성된 군을 15 mg/kg의 LC10 또는 R347로 수동적으로 면역화시켰다. 10마리의 C57BL/6 마우스로 구성된 군을 2x108개의 스타필로코커스 아우레우스 USA300으로 비강내로 감염시켰다. 그 다음, 감염으로부터 (A) 1시간, (B) 3시간 또는 (C) 6시간 후, 상기 마우스를 5 mg/kg, 15 mg/kg 또는 45 mg/kg의 LC10으로 치료하고 생존을 7일 동안 모니터링하였다. 세균 챌린지 24시간 전에 15 mg/kg의 LC10 또는 R347을 투여받은 10마리의 마우스로 구성된 군을 대조군으로서 포함시켰다.
도 26은 뮤린 폐렴 모델에서 LC10의 치료 효능을 그래프로 나타낸다. 10마리의 C57BL/6 마우스로 구성된 군을 2x108개의 스타필로코커스 아우레우스 USA300으로 피내로 감염시켰다. 감염으로부터 1시간 후, (A) 15 mg/kg 또는 (B) 45 mg/kg의 LC10의 단회 복강내 주사를 동물들에게 제공하였다. 감염으로부터 1시간 후, 반코마이신(VAN)을 집단 동물 군에게 피하로 제공하였다. 총 6회의 치료를 위해 VAN의 추가 치료를 하루 당 2회씩 12시간 간격으로 제공하였다. 감염으로부터 1시간 후, 10마리의 마우스로 구성된 대조군을 15 mg/kg의 R347로 치료하였다. 생존을 7일 동안 모니터링하였다.
도 27은 상승작용의 아이소볼로그램(isobologram) 분석을 그래프로 표시한다(이때, N>1: 길항작용, N=1: 부가 효과, N<1: 상승작용).
본원은 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소에 결합하는 인간 형태, 인간화된 형태 및/또는 키메라 형태를 포함하는 항체뿐만 아니라 이의 단편, 유도체/접합체 및 조성물을 제공한다. 이러한 항체는 알파 독소의 검출 및/또는 가시화에 유용할 수 있으므로 어세이 및 진단 방법에서 유용할 수 있다. 또한, 본원에 기재된 항체는 알파 독소 칠량체 형성을 방해함으로써 활성 공극 형성 복합체의 형성을 억제하므로, 치료 방법 및 예방 방법에서 유용할 수 있다.
스타필로코커스 아우레우스는 어디에나 존재하는 병원체이고 종종 중증도에 있어서 경미한 병태부터 치명적인 병태까지 이르는 다양한 병태의 병인 물질이다. 스타필로코커스 아우레우스는 많은 수의 세포외 단백질 및 세포-결합된 단백질을 생성하는데, 이들 단백질들 중 많은 단백질들, 예컨대, 알파 독소, 베타 독소, 감마 독소, 델타 독소, 류코시딘(leukocidin), 독성 쇼크 증후군 독소(TSST), 장내독소, 응고효소(coagulase), 단백질 A, 피브리노겐, 피브로넥틴 결합 단백질 등이 발병기작에 관여한다. 알파 독소(예를 들면, hla 유전자에 의해 코딩됨)는 스타필로코커스 아우레우스의 병독성 인자들 중 하나이고 대다수의 병원성 스타필로코커스 아우레우스 균주들에 의해 생성된다.
스타필로코커스 아우레우스 감염은 상대적으로 치료하기 어렵고, 항생제 치료 후 침습성 질환 및 재발이 발생할 수 있다. 추가로, 스타필로코커스 아우레우스 감염의 치료를 더 복잡하게 하는 메티실린(methicillin) 내성 스타필로코커스 아우레우스 균주가 병원 환경(예를 들면, HA-MRSA 또는 건강관리 관련) 및 비-병원 환경(예를 들면, CA-MRSA 또는 지역사회 관련)에서 점점 더 유행하게 되었다. 많은 경우, 스타필로코커스 아우레우스의 메티실린 내성 균주는 아미노글리코사이드, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 마크롤라이드 및 린코스아미드(lincosamide)를 포함하는 하나 이상의 다른 항생제에 대해서도 내성을 나타낸다.
알파 독소는 공극 형성 독소이고 인간 및 동물에서 세포용해성, 용혈성, 피부괴사성 및 치명적 활성을 갖는다. 스타필로코커스 알파 독소는 293개의 아미노산으로 구성된 대략 34 킬로달톤(kDa)의 수용성 단일 쇄 폴리펩티드로서 분비된다. 이론에 의해 제한받고자 하는 것은 아니지만, 2가지 알파 독소/표적 세포 상호작용 방법이 존재하는 것으로 생각된다: (i) 알파 독소는 인간 혈소판, 단핵구, 내피세포, 백혈구 세포, 폐포 폐세포, 대식세포, 각질세포, 섬유모세포, 토끼 적혈구 및 다른 세포의 세포 표면 상의 특정 고친화성 수용체(ADAM 10)에 결합하거나(예를 들면, 문헌(Wilke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 107:13473-13478 (2010)) 참조); (ii) 알파 독소는 지질 이중층에 흡착됨으로써 비-특이적으로 상호작용한다. 독소/세포 상호작용의 방식에서, 7개의 알파 독소 단량체 분자들이 올리고머화되어 직경이 1 nm 내지 2 nm인 칠량체 경막 채널을 형성한다. 칼륨 및 뉴클레오티드의 후속 유출, 및 나트륨 및 칼슘의 유입이 삼투압 용해 및/또는 다수의 이차 작용(에이코사노이드 생성, 분비 과정, 수축 기능장애, 아폽토시스 및 사이토카인의 방출을 포함함)을 유발시킨다. 알파 독소에 의한 세포 활성의 파괴 및 세포의 용해는 스타필로코커스 아우레우스 감염과 관련된 병태 및 질환에 기여하는 것으로 생각된다.
스타필로코커스 아우레우스 감염에 의해 야기된 몇몇 흔한 병태들의 비-한정적 예로는 화상, 연조직염, 피부괴사, 눈꺼풀 감염, 식중독, 관절 감염, 폐렴, 피부 감염, 수술 상처 감염, 열상 피부 증후군 및 독성 쇼크 증후군이 있다. 추가로, 상기 병원체는 이물질, 예컨대, 혈관내 라인(line), 박동조율기(pacemaker), 인공 심장 판막 및 관절 이식재에 의한 감염에서 흔한 병원체이다. 스타필로코커스 아우레우스에 의해 야기되는 몇몇 병태들 또는 질환들은 더 후술되어 있다. 후술된 몇몇 또는 모든 병태들 및 질환들은 감염의 성분으로서 또는 병태 또는 질환 상태의 매개자로서 알파 독소의 직접적인 작용을 수반할 수 있거나, 몇몇 또는 모든 병태들은 알파 독소의 간접적 또는 이차 작용을 수반할 수 있다(예를 들면, 일차 병독성 인자는 상기 병태와 관련된 주요 증상 또는 대다수의 증상을 야기하고, 알파 독소는 그의 세포 기능 파괴 및 세포용해 활성을 통해 질환을 더 진행시키는 작용을 한다).
화상
화상 상처는 종종 초기에 멸균 상태이다. 그러나, 중등도 내지 중증 화상은 일반적으로 감염에 대한 물리적 장벽 및 면역 장벽을 손상시켜(예를 들면, 피부의 수포형성, 균열 또는 박피) 유체 및 전해질의 손실을 야기하고 국소 또는 일반 생리학적 기능장애를 초래한다. 손상된 피부와 생존가능한 세균의 접촉은 종종 손상 부위에서 혼합된 콜로니화를 초래할 수 있다. 감염은 화상 표면 상의 생존불가능한 데브리스(debris)("괴사딱지")로 제한될 수 있거나, 상기 콜로니화가 전체 피부 감염으로 진행하여 괴사딱지 아래의 생존가능한 조직을 침습할 수 있다. 보다 심각한 감염이 피부 아래에 도달하여 림프 시스템 및/또는 혈액 순환 내로 들어갈 수 있고 패혈증으로 발전할 수 있다. 스타필로코커스 아우레우스는 전형적으로 화상 상처 감염을 콜로니화하는 병원체들 중에서 발견된다. 스타필로코커스 아우레우스는 과립화 조직을 파괴할 수 있고 심각한 패혈증을 발생시킬 수 있다.
피부 및 연조직 감염
연조직염
연조직염은 피부층 아래로 확산될 수 있는 표재 감염으로서 종종 시작되는 피부의 급성 감염이다. 연조직염은 가장 통상적으로는 스트렙토코커스 피오게네스(S. pyogenes)와 함께 스타필로코커스 아우레우스의 혼합된 감염에 의해 야기된다. 연조직염은 전신 감염을 유발할 수 있다. 연조직염은 종종 상승작용적 세균 괴저의 한 양태이다. 상승작용적 세균 괴저는 전형적으로 스타필로코커스 아우레우스와 미세호기성(microaerophilic) 스트렙토코커스의 혼합물에 의해 야기된다. 상승작용적 세균 괴저는 괴사를 야기하고, 치료는 괴사 조직의 절개로 제한된다. 상기 병태는 종종 치명적이다.
피부괴사
피부괴사는 피하 조직 내의 근막층을 가로질러 용이하게 확산되는 피부 및 피하 조직의 감염이다. 상기 병태는 피부의 상층 및/또는 하층이 괴사되게 하고 기저 조직 및 주변 조직으로 확산될 수 있다.
괴사 근막염
괴사 근막염은 "살 파먹는 질환(flesh-eating disease)" 또는 "살 파먹는 세균 증후군"으로서 지칭된다. 괴사 근막염은 다균성 감염(예를 들면, 혼합된 세균 감염에 의해 야기된 I형) 또는 단균성 감염(예를 들면, 세균의 단일 병원성 균주에 의해 야기된 II형)에 의해 야기될 수 있다. 많은 종류의 세균이 괴사 근막염을 야기할 수 있고, 이들의 비-한정적 예로는 군 A 스트렙토코커스(예를 들면, 스트렙토코커스 피오게네스), 스타필로코커스 아우레우스, 비브리오 불니피커스(Vibrio vulnificus), 클로스트리디움 퍼프링겐스(Clostridium perfringens) 및 박테로이데스 프라길리스(Bacteroides fragilis)가 있다. 저하된 또는 손상된 면역 시스템을 갖는 개체는 피부괴사(예를 들면, 괴사 근막염)를 앓을 가능성이 더 높다.
역사적으로, 군 A 스트렙토코커스는 II형 피부괴사 감염 사례의 대다수의 원인으로서 진단되었다. 그러나, 2001년 이후, 메티실린 내성 스타필로코커스 아우레우스(MRSA)가 단균성 괴사 근막염의 원인으로서 증가하는 빈도로 관찰되었다. 상기 감염은 종종 (예컨대, 수술의 결과로서) 심각할 수 있거나 경미할 수 있거나 심지어 뚜렷이 보이지 않을 수 있는 외상 부위에서 국소적으로 시작된다. 환자들은 통상적으로 피부의 외관을 고려할 때 과도한 것처럼 보일 수 있는 강렬한 통증을 호소한다. 상기 질환이 진행됨에 따라, 조직은 종종 수시간 이내에 부어오르게 된다. 설사 및 구토도 공통된 증상이다.
세균이 조직 내부에 깊이 존재하는 경우 염증의 징후는 감염의 초기에 분명하지 않을 수 있다. 세균이 깊이 존재하지 않는 경우, 염증의 징후, 예컨대, 발적 및 부어오른 또는 뜨거운 피부가 매우 신속히 보인다. 피부 색채는 자색으로 변할 수 있고, 피하 조직의 후속 괴사(예를 들면, 사멸)와 함께 수포가 형성될 수 있다. 괴사 근막염을 갖는 환자는 전형적으로 발열을 갖고 매우 아픈 것처럼 보인다. 치료되지 않은 상태로 방치된 경우 사망률은 73%만큼 높은 것으로서 인지되었다. 적절한 의학적 보조가 없는 경우, 감염은 신속히 진행되고 궁극적으로 사망을 초래한다.
폐렴
스타필로코커스 아우레우스는 스타필로코커스 폐렴의 원인으로서 진단되었다. 스타필로코커스 폐렴은 유체가 폐 내에서 저류하게 하는 폐의 염증 및 종창을 야기한다. 폐 내에서의 유체 저류는 산소가 혈류로 들어가는 것을 방해할 수 있다. 인플루엔자를 갖는 환자는 세균 폐렴을 발달시킬 위험에 처해있다. 스타필로코커스 아우레우스는 인플루엔자를 이미 앓고 있는 환자에서 세균 폐렴의 가장 흔한 원인이다. 스타필로코커스 폐렴의 공통된 증상은 기침, 호흡 곤란 및 발열을 포함한다. 추가 증상은 피로, 황색 또는 핏빛 점액, 및 호흡을 악화시키는 흉부 통증을 포함한다. 메티실린 내성 스타필로코커스 아우레우스(MRSA)는 스타필로코커스 폐렴에서 확인된 균주로서 점점 더 진단되고 있다.
수술 상처 감염
수술 상처는 종종 체내로 깊이 침투한다. 따라서, 이러한 상처의 감염은 상기 상처가 감염되는 경우 환자에게 심각한 위험을 부가한다. 스타필로코커스 아우레우스는 종종 수술 상처에서 감염의 원인 물질이다. 스타필로코커스 아우레우스는 수술 상처를 침입하는 데에 있어서 비정상적으로 능숙하므로, 봉합된 상처는 정상 피부에서 감염을 야기하는 데에 필요한 스타필로코커스 아우레우스 세포보다 훨씬 더 적은 스타필로코커스 아우레우스 세포에 의해 감염될 수 있다. 수술 상처의 침입은 심각한 스타필로코커스 아우레우스 패혈증을 유발할 수 있다. 스타필로코커스 아우레우스의 혈류 내로의 침입은 전신 질환, 예컨대, 심내막염 및 골수염을 야기하는, 내부 장기, 특히 심장 판막 및 골의 시딩(seeding) 및 감염을 유발할 수 있다.
열상 피부 증후군
스타필로코커스 아우레우스는 "스타필로코커스 열상 피부 증후군", "독성 표피 괴사", "국소화된 수포농가진", "리터병" 및 "라이엘병"으로서도 지칭되는 "열상 피부 증후군"의 주요 원인 물질일 가능성이 있다(원인 물질이 없는 경우). 열상 피부 증후군은 종종 청소년에서 전형적으로 표피층 내에서 탈착을 야기하는 표피용해 외독소(예를 들면, 종종 열상 피부 증후군 독소로서 지칭되는 엑스폴리아틴(exfoliatin) A 및 B)를 생성하는 스타필로코커스 아우레우스 균주의 번식에 의해 야기된 발병에서 발생한다. 상기 외독소 중 하나는 세균 염색체에 의해 코딩되고, 나머지는 플라스미드에 의해 코딩된다. 상기 외독소는 정상적으로 피부의 과립층 및 유극층을 함께 유지하는 데스모글레인(desmoglein)-1을 절단하는 단백질분해효소이다.
상기 세균은 초기에 경미한 병소만을 감염시킬 수 있으나, 상기 독소는 세포간 연결을 파괴하고 표피층으로 확산되고 감염이 피부의 외부층을 침투하게 하여 상기 질환을 상징하는 표피탈락(desquamation)을 발생시킨다. 피부의 외부층의 탈락은 일반적으로 아래에 정상 피부를 보이지만, 상기 과정에서 손실된 유체는 적절하게 치료받지 않은 경우 어린 소아에서 심각한 손상을 발생시킬 수 있다.
독성 쇼크 증후군
독성 쇼크 증후군(TSS)은 소위 "독성 쇼크 증후군 독소"를 생성하는 스타필로코커스 아우레우스의 균주에 의해 야기된다. 상기 질환은 임의의 부위에서 스타필로코커스 아우레우스 감염에 의해 야기될 수 있으나 탐폰(tampon)을 사용하는 여성만의 질환으로서 종종 배타적으로 잘못 간주되어 있다. 상기 질환은 독소혈증 및 패혈증을 수반하고 치명적일 수 있다.
독성 쇼크 증후군의 증상은 근본 원인에 따라 상이하다. 세균 스타필로코커스 아우레우스에의 감염으로부터 비롯된 TSS는 전형적으로 혼미, 혼수 및 다발성 장기 부전으로 신속히 진행할 수 있는, 저혈압, 권태감 및 착란을 동반하는 고열과 함께 건강한 개체에서 나타난다. 질환의 경과에서 종종 초기에 보이는 특징적인 발진은 일광화상과 유사하고 입술, 구강, 눈, 손바닥 및 발바닥을 포함하는 신체의 임의의 영역을 수반할 수 있다. 감염의 초기 맹습에서 생존한 환자에서, 상기 발진은 10일 내지 14일 후 벗겨지거나 박리된다.
상기 인지된 바와 같이, 스타필로코커스 아우레우스의 다중약물 내성 균주의 증가로 인해, 스타필로코커스 아우레우스 감염을 치료하는 데에 통상적으로 사용되는 증가하는 수의 항생제들은 메티실린 및 다중약물 내성 스타필로코커스 아우레우스의 감염을 더 이상 제어하거나 제거하지 못한다. 본원에 기재된 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소에 대한 항체는 감염의 중증도를 감소시키는 데에 도움을 줄 수 있고 감염된 숙주로부터 병원성 스타필로코커스 아우레우스를 제거하거나, (예방적으로) 방지하거나 감소시키는 데에도 도움을 줄 수 있다.
항체
본원에서 사용된 용어 "항체", "항체들"(면역글로불린으로서도 공지되어 있음) 및 "항원 결합 단편"은 단일클론 항체(전장 단일클론 항체를 포함함), 다중클론 항체, 2개 이상의 상이한 에피토프 결합 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체(예를 들면, 이중특이적 항체), 인간 항체, 인간화된 항체, 낙타과 항체, 키메라 항체, 단일 쇄 Fvs(scFv), 단일 쇄 항체, 단일 도메인 항체, 도메인 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, 원하는 생물학적 활성을 나타내는 항체 단편(예를 들면, 항원 결합 부분), 이황화-연결된 Fvs(dsFv), 항-이디오타입(항-Id) 항체(예를 들면, 본원에서 제공된 항체에 대한 항-Id 항체를 포함함), 인트라바디, 및 전술된 항체들 중 임의의 항체의 에피토프 결합 단편을 포괄한다. 특히, 항체는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 단편, 즉 하나 이상의 항원 결합 부위를 함유하는 분자를 포함한다. 면역글로불린 분자는 임의의 동종형(예를 들면, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 하위동종형(예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 동종이형(allotype)(예를 들면, Gm, 예를 들면, G1m(f, z, a 또는 x), G2m(n), G3m(g, b 또는 c), Am, Em, 및 Km(1, 2 또는 3))의 면역글로불린 분자일 수 있다. 항체는 인간, 원숭이, 돼지, 말, 토끼, 개, 고양이, 마우스 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는 임의의 포유동물, 또는 다른 동물, 예컨대, 조류(예를 들면, 닭)로부터 유래될 수 있다.
천연 항체는 일반적으로 2개의 동일한 경쇄(L) 및 2개의 동일한 중쇄(H)로 구성된, 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. 각각의 경쇄는 1개의 공유 이황화 결합에 의해 중쇄에 연결되지만, 이황화 결합의 수는 상이한 면역글로불린 동종형의 중쇄들 사이에 상이하다. 또한, 각각의 중쇄 및 경쇄는 규칙적으로 이격된 쇄내 이황화 가교를 갖는다. 각각의 중쇄는 한 말단에서 가변 도메인(VH)에 이어서 다수의 불변 도메인(CH)을 갖는다. 각각의 경쇄는 한 말단에서 가변 도메인(VL)을 갖고 그의 다른 말단에서 불변 도메인(CL)을 갖는다. 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 경쇄는 경쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 기초로 람다 쇄 또는 카파 쇄로서 분류된다. 카파 경쇄의 가변 도메인은 본원에서 VK로서도 표시될 수 있다.
본원에서 제공된 항체는 전장 또는 온전한 항체, 항체 단편, 천연 서열 항체 또는 아미노산 변이체, 인간 항체, 인간화된 항체, 번역 후 변경된 항체, 키메라 또는 융합 항체, 면역접합체 및 이들의 기능성 단편을 포함한다. 항체는 Fc 영역에서 변경될 수 있고, 일부 변경들은 원하는 이펙터 기능 또는 혈청 반감기를 제공할 수 있다.
본 발명의 항-알파 독소 항체 및 단편의 하나 이상의 생물학적 특성(예를 들면, 효능, 알파 독소 친화성, 이펙터 기능, 오르톨로그(ortholog) 결합 친화성, 중화, 알파 독소 칠량체 형성의 억제 등)을 갖는 항체도 고려된다. 항-알파 독소 항체 및 단편은 전술된 바와 같이 포유동물에서 스타필로코커스 아우레우스 관련 질환의 하나 이상의 증상을 진단하고/하거나 치료하고/하거나 완화하고/하거나 예방하는 데에 사용될 수 있다.
본원은 항-알파 독소 항체 또는 단편 및 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 스타필로코커스 아우레우스 관련 질환을 치료할 목적으로, 조성물은 이러한 치료가 필요한 환자에게 투여될 수 있고, 이때 상기 조성물은 하나 이상의 항-알파 독소 항체 및/또는 이의 단편을 포함할 수 있다. 본원에서 제공된 항-알파 독소 항체 또는 이의 단편 및 담체를 포함하는 제제도 제공된다. 몇몇 실시양태에서, 상기 제제는 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 예방 또는 치료 제제이다.
일부 실시양태에서, 포유동물에서 스타필로코커스 아우레우스 관련 및/또는 알파 독소 관련 질환/병태를 치료하고/하거나 상기 질환 또는 병태의 하나 이상의 증상을 예방하고/하거나 완화하는 데에 유용한 방법으로서, 치료 유효량의 항-알파 독소 항체 또는 단편을 상기 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에서 제공된다. 항체 예방 또는 치료 조성물은 의사에 의해 지시된 바와 같이 단기간(급성) 또는 만성으로 투여될 수 있거나 간헐적으로 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 제품은 예컨대, 멸균 투약 제형 및/또는 키트 내에 하나 이상의 항-알파 독소 항체 또는 단편을 포함한다. 항-알파 독소 항체 또는 단편을 함유하는 키트는 예를 들면, 스타필로코커스 아우레우스 세포 사멸 어세이, 또는 세포로부터의 알파 독소의 정제 또는 면역침전을 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 알파 독소의 단리 및 정제를 위해, 키트는 비드(예를 들면, 세파로스 비드)에 커플링된 항-알파 독소 항체 또는 단편을 함유할 수 있다. 키트는 시험관내에서, 예를 들면, ELISA 또는 웨스턴 블롯에서 스타필로코커스 아우레우스 및/또는 알파 독소를 검출하고 정량하기 위한 항체를 함유할 수 있다. 검출에 유용한 이러한 항체는 표지, 예컨대, 형광 또는 방사성 표지를 구비할 수 있다.
용어
본원에서 제공된 방법은 그 자체로 달라질 수 있는 특정 조성물 또는 공정 단계로 한정되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 사용된 바와 같이, 문맥이 달리 명시하지 않은 한, 단수형 "1개", "하나" 및 "한"은 단수형 지시대상 및 복수형 지시대상을 포함한다.
알파 독소 폴리펩티드(예를 들면, 알파 독소 단량체)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 본원에서 단수형으로 "항-알파 독소 항체 또는 단편"으로서 지칭되고 복수형으로 "항-알파 독소 항체들 및 단편들"로서 지칭된다. 알파 독소 폴리펩티드는 종종 알파 헤모라이신(hemolysin)으로서 지칭된다. 알파 독소는 칠량체로 올리고머화한 후 세포막에서 공극을 형성하고, 이때 올리고머화된 폴리펩티드는 종종 "알파 독소 공극" 또는 "알파 독소 칠량체"로서 총칭된다.
아미노산은 종종 본원에서 통상적으로 공지된 3-문자 부호, 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회에 의해 권장된 1-문자 부호에 의해 지칭된다. 마찬가지로, 뉴클레오티드는 종종 통상적으로 인정된 1-문자 코드에 의해 지칭된다.
달리 표시되어 있지 않은 한, 항체의 가변 도메인, 상보성 결정 영역(CDR들) 및 골격 영역(FR) 내의 아미노산의 넘버링은 문헌(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland. (1991))에 기재된 카바트 정의를 따른다. 이 넘버링 시스템을 이용할 때, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 CDR의 단축, 또는 상기 FR 또는 CDR 내로의 삽입에 상응하는 보다 적은 수의 아미노산 또는 추가 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들면, 중쇄 가변 도메인은 H2의 잔기 52 다음에 단일 아미노산 삽입(카바트에 따라 잔기 52a), 및 중쇄 FR 잔기 82 다음에 삽입된 잔기(예를 들면, 카바트에 따라 잔기 82a, 82b 및 82c 등)를 포함할 수 있다. 주어진 항체에 대한 잔기의 카바트 넘버링은 상기 항체의 서열과 "표준" 카바트 넘버링된 서열의 상동성 영역에서의 정렬에 의해 결정될 수 있다. 골격 잔기의 최대 정렬은 Fv 영역을 위해 사용되기 위해 종종 넘버링 시스템에서 "스페이서(spacer)" 잔기의 삽입을 필요로 한다. 추가로, 임의의 주어진 카바트 부위 번호에서 일부 개별 잔기들의 본질은 종간 또는 대립형질 차이로 인해 항체 쇄마다 상이할 수 있다.
항-알파 독소 항체 및 단편
일부 실시양태에서, 항-알파 독소 항체 또는 단편은 단리되고/되거나 정제되고/되거나 발열원을 함유하지 않는다. 본원에서 사용된 용어 "정제된"은 그의 천연 환경의 성분으로부터 확인되고 분리되고/되거나 회수된 관심 있는 분자를 지칭한다. 따라서, 몇몇 실시양태에서, 제공된 항체는 정제된 항체이고, 이때 상기 항체는 그의 천연 환경의 하나 이상의 성분으로부터 분리되어 있다. 본원에서 사용된 용어 "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체 분자를 실질적으로 갖지 않는 항체를 지칭한다(예를 들면, 알파 독소에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 알파 독소 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 실질적으로 갖지 않는다). 이중특이적 또는 다중특이적 항체 분자는 다른 항체 분자를 실질적으로 갖지 않을 때 단리된 항체이다. 따라서, 몇몇 실시양태에서, 제공된 항체는 단리된 항체이고, 이때 이들은 상이한 특이성을 갖는 항체로부터 분리되어 있다. 단리된 항체는 단일클론 항체일 수 있다. 그러나, 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소의 에피토프, 동형체 또는 변이체에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 예를 들면, 다른 종(예를 들면, 스타필로코커스 종 상동체)으로부터의 다른 관련 항원에 대한 교차반응성을 가질 수 있다. 제공된 단리된 항체는 하나 이상의 다른 세포 물질을 실질적으로 갖지 않을 수 있다. 몇몇 실시양태에서, "단리된" 단일클론 항체들의 조합물이 제공되고, 상이한 특이성을 갖고 정의된 조성으로 조합된 항체들에 관한 것이다. 항-알파 독소 항체 또는 단편의 제조 및 정제/단리 방법은 본원에서 보다 상세히 기재된다.
제공된 단리된 항체는 임의의 적합한 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있는, 본원에 개시된 항체 아미노산 서열을 포함한다. 단리된 항체는 종종 제제화된 형태로 제공된다. 몇몇 실시양태에서, 항-알파 독소 항체 또는 단편은 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소에 결합하여 상기 알파 독소의 하나 이상의 생물학적 활성, 예를 들면, 활성 칠량체 복합체로의 올리고머화를 부분적으로 또는 실질적으로 변경시킨다.
항-알파 독소 항체 또는 단편은 알파 독소 단백질, 펩티드, 서브유닛, 단편, 부분, 올리고머 또는 이들의 임의의 조합물에 대해 특이적인 하나 이상의 에피토프에 종종 면역특이적으로 결합하고 일반적으로 다른 폴리펩티드에 특이적으로 결합하지 않는다. 용어 "올리고머" 또는 "알파 독소 올리고머"는 기능성 공극(예를 들면, 7개의 알파 독소 단량체)을 형성하기 위한 알파 독소 단량체(예를 들면, 2개의 단량체, 3개의 단량체, 4개의 단량체, 5개의 단량체, 6개의 단량체 또는 7개의 단량체)의 결합을 지칭한다. 에피토프는 알파 독소 단백질의 하나 이상의 부분을 포함하는 하나 이상의 항체 결합 영역을 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "에피토프"는 항체에 결합할 수 있는 단백질 결정인자를 지칭한다. 에피토프는 일반적으로 분자의 화학적 활성 표면 그룹핑(groupings), 예컨대, 아미노산 및/또는 당 측쇄를 포함하고 일반적으로 특정 삼차원적 구조적 특성뿐만 아니라 특정 화학적 특성(예를 들면, 전하, 극성, 염기성, 산성, 소수성 등)을 갖는다. 입체구조적(conformational) 에피토프와 비-입체구조적 에피토프는 입체구조적 에피토프와의 결합이 변성 용매의 존재 하에서 상실되지만 비-입체구조적 에피토프와의 결합은 그러하지 않다는 면에서 구별된다. 몇몇 실시양태에서, 인식된 에피토프는 활성 칠량체의 형성을 방해한다(예를 들면, 알파 독소 단량체가 활성 칠량체 복합체로 올리고머화되는 것을 억제한다).
일부 실시양태에서, 에피토프는 알파 독소 칠량체 복합체의 형성에 관여하는, 알파 독소 단백질의 하나 이상의 부분으로 구성된다. 특정된 에피토프는 알파 독소 단백질의 3개 이상의 아미노산 잔기 내지 인접 아미노산들의 전체 특정된 부분으로 구성된 하나 이상의 아미노산 서열의 임의의 조합물을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 에피토프는 알파 독소 단백질의 4개 이상의 아미노산 잔기, 5개 이상의 아미노산 잔기, 6개 이상의 아미노산 잔기, 7개 이상의 아미노산 잔기, 8개 이상의 아미노산 잔기, 9개 이상의 아미노산 잔기, 10개 이상의 아미노산 잔기, 11개 이상의 아미노산 잔기, 12개 이상의 아미노산 잔기, 13개 이상의 아미노산 잔기, 14개 이상의 아미노산 잔기 또는 15개 이상의 아미노산 잔기 내지 인접 아미노산들의 전체 특정된 부분이다. 일부 다른 실시양태에서, 에피토프는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개 또는 15개의 인접 또는 비-인접 아미노산 잔기를 포함한다. 추가 실시양태에서, 에피토프 내에 포함된 아미노산 잔기는 알파 독소 칠량체 복합체 형성에 관여한다. 일부 실시양태에서, 접촉 잔기는 T261, T263, N264, K266 및 K271을 포함한다. 다른 실시양태에서, 접촉 잔기는 서열번호 39의 N177, W179, G180, P181, Y182, D183, D185, S186, W187, N188, P189, V190, Y191 및 R200을 포함한다. 추가 실시양태에서, 접촉 잔기는 서열번호 39의 N177, W179, G180, P181, Y182, D183, D185, S186, W187, N188, P189, V190, Y191, R200, T261, T263, N264, K266 및 K271을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉하는 알파 독소의 부분은 서열번호 39의 아미노산 261-272를 포함한다. 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉하는 알파 독소의 부분은 서열번호 39의 아미노산 248-277을 포함한다. 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉하는 알파 독소의 부분은 서열번호 39의 아미노산 173-201 및 261-272를 포함한다.
따라서, 특정 실시양태에서, 단리된/정제된 항-알파 독소 항체 또는 단편은 서열번호 39에 따른 아미노산 서열을 포함하는 분자 및/또는 서열번호 40에 따른 아미노산 서열을 포함하는 분자에 면역특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-알파 독소 항체 및 단편은 상이한 종들로부터의 알파 독소 상동체 또는 오르톨로그, 또는 서열번호 39의 아미노산 서열의 변이체에도 결합하고, 이때 위치 35의 히스티딘은 류신으로 치환되거나 당분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 공지된 H35 돌연변이에 상응하는 다른 아미노산으로 치환된다.
가변 영역
일부 실시양태에서, 항-알파 독소 항체 또는 단편은 모 항체로부터 제조된다. 몇몇 실시양태에서, 항-알파 독소 항체 또는 단편은 모 항체에 포함된다. 본원에서 사용된 용어 "모 항체"는 본원에서 정의된 변이체 또는 유도체의 제조에 사용된 아미노산 서열에 의해 코딩된 항체를 지칭한다. 모 폴리펩티드는 천연 항체 서열(즉, 천연 발생 대립형질 변이체를 포함하는 천연 발생 항체 서열), 또는 천연 발생 서열의 기존 아미노산 서열 변경(예컨대, 다른 삽입, 결실 및/또는 치환)을 갖는 항체 서열을 포함할 수 있다. 모 항체는 인간화된 항체 또는 인간 항체일 수 있다. 특정 실시양태에서, 항-알파 독소 항체 및 단편은 모 항체의 변이체이다. 본원에 사용된 용어 "변이체"는 모 항체 서열의 하나 이상의 아미노산 잔기(들)의 추가, 결실 및/또는 치환에 의해 "모" 항-알파 독소 항체 또는 단편 아미노산 서열과 아미노산 서열 면에서 상이한 항-알파 독소 항체 또는 단편을 지칭한다.
항체의 항원 결합 부분은 항원(예를 들면, 알파 독소)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 포함한다. 항체의 항원 결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있다는 것이 밝혀져 있다. 용어 항체의 "항원 결합 부분"에 포함되는 결합 단편의 예로는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인들로 구성된 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지(hinge) 영역에서 이황화 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인들로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암(arm)의 VL 및 VH 도메인들로 구성된 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 구성된 dAb 단편; 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역(CDR)이 있다. Fv 단편의 2개 도메인인 VL 및 VH는 종종 별도의 유전자들에 의해 코딩되지만, 이들은 이들이 단일 단백질 쇄(VL 영역과 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자(단일 쇄 Fv(scFv)로서 공지되어 있음)를 형성함)로서 만들어지게 할 수 있는 합성 링커에 의해 재조합 방법의 이용을 통해 연결될 수 있다. 이러한 단일 쇄 항체도 용어 "항체" 및 항체의 "항원 결합 부분"에 포함된다. 이들 항체 단편들은 공지된 기법의 이용을 통해 수득될 수 있고, 상기 단편들은 온전한 항체와 동일한 방식으로 결합 활성에 대해 스크리닝될 수 있다. 항원 결합 부분은 재조합 DNA 기법, 또는 온전한 면역글로불린의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생성될 수 있다.
본 발명의 항-알파 독소 항체 및 단편은 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 항-알파 독소 항체 또는 단편은 서열번호 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 또는 62의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-알파 독소 항체 또는 단편은 서열번호 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 또는 63의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항-알파 독소 항체 또는 단편은 서열번호 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 또는 62의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 또는 63의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 항-알파 독소 항체 또는 단편을 형성하기 위해 임의의 조합물로 존재할 수 있거나 본 발명의 mAb를 형성하기 위해 조합물로 존재할 수 있는 본원에서 제공된 VH 및 VL 서열들의 표시에 대해서는 실시예 11의 표 7을 참조한다. 몇몇 실시양태에서, VH는 서열번호 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 및 62로부터 선택된다. 다양한 실시양태에서, VL은 서열번호 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 및 63으로부터 선택된다. 일부 VH 및 VL 뉴클레오티드 서열들은 실시예 11의 표 8에 제시되어 있다.
몇몇 실시양태에서, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 VH 및 VL을 포함하고, 이때 상기 VH 및 VL은 서열번호 20 및 19; 서열번호 22 및 21; 서열번호 24 및 23; 서열번호 26 및 25; 서열번호 28 및 27; 서열번호 41 및 42; 서열번호 43 및 44; 서열번호 45 및 46; 서열번호 47 및 48; 서열번호 49 및 50; 서열번호 51 및 52; 서열번호 53 및 54; 서열번호 55 및 56; 서열번호 57 및 58; 서열번호 59 및 60; 서열번호 61 및 58; 서열번호 62 및 58; 서열번호 62 및 63; 또는 서열번호 79 및 63으로 표시된 아미노산 서열을 갖는다.
실시예 11의 표 1 내지 7은 본원에서 제공된 항체 및 단편의 일부 실시양태에 대한 중쇄 가변 영역(VH), 경쇄 가변 영역(VL) 및 상보성 결정 영역(CDR들)을 제공한다. 일부 실시양태에서, 항-알파 독소 항체 및 단편은 표 7에 개시된 VH 및/또는 VL 서열들 중 하나 이상에 대해 주어진 퍼센트의 동일성을 갖는 VH 및/또는 VL을 포함한다. 본원에서 사용된 용어 "퍼센트(%) 서열 동일성"("상동성"도 포함함)은 서열들을 정렬하고 필요한 경우 갭을 도입하여 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하고 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로서 간주하지 않은 후 기준 서열, 예컨대, 모 항체 서열의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 백분율로서 정의된다. 비교될 서열들의 최적 정렬은 수동적 방법 이외에 당분야에서 공지된 국소 상동성 알고리즘에 의해, 또는 이들 알고리즘들을 이용하는 컴퓨터 프로그램(위스콘신 제네틱스 소프트웨어 팩키지(Wisconsin Genetics Software Package) 내의 GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N 및 TFASTA, 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group), 미국 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575 소재)에 의해 생성될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 항-알파 독소 항체 또는 단편은 서열번호 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 또는 62의 아미노산 서열에 대해 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상의 동일성을 포함하거나 100%의 동일성을 포함하는 VH 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 항-알파 독소 항체 또는 단편은 서열번호 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 또는 62의 아미노산 서열과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일하거나 100% 동일한 VH 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-알파 독소 항체 또는 단편은 서열번호 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 또는 62의 아미노산 서열 내에 1개 내지 10개의 보존적 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열번호 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 또는 62에 대해 주어진 퍼센트 동일성을 갖는 VH 아미노산 서열을 포함하는 항-알파 독소 항체 또는 단편은 하기 (a) 내지 (e)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 특성(더 상세히 후술되어 있음)을 갖는다:
(a) 알파 독소에 대한 약 13 nM 이하의 친화성 상수(KD);
(b) 알파 독소 단량체에 결합하지만, 알파 독소와 알파 독소 수용체의 결합을 억제하지 않는 특성;
(c) 알파 독소 올리고머의 형성을 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상까지 억제하는 특성;
(d) (예를 들면, 세포용해 및 용혈 어세이에 의해 측정되었을 때) 알파 독소 세포용해 활성을 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상까지 감소시키는 특성; 및
(e) (예를 들면, 동물 폐렴 모델에서) 세포 침윤 및 전구염증 사이토카인 방출을 감소시키는 특성.
몇몇 실시양태에서, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 약 0.01 nM 내지 약 50 nM, 0.05 nM, 0.1 nM, 0.5 nM, 1 nM, 5 nM, 10 nM, 20 nM, 30 nM 또는 40 nM 범위 내의 해리 상수(KD)를 특징으로 하는 친화성으로 항원(예를 들면, 알파 독소)에 결합한다.
일부 실시양태에서, 항-알파 독소 항체 또는 단편은 서열번호 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 또는 63의 아미노산 서열과 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상 동일하거나 100% 동일한 VL 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 항-알파 독소 항체 또는 단편은 서열번호 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 또는 63의 아미노산 서열과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일하거나 100% 동일한 VL 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 실시양태에서, 항-알파 독소 항체 또는 단편은 서열번호 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 또는 63의 아미노산 서열 내에 1개 내지 10개의 보존적 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-알파 독소 항체 또는 단편은 서열번호 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 또는 63에 대해 주어진 퍼센트 동일성을 갖는 VL 아미노산 서열을 포함하고 하기 (a) 내지 (e)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 특성(더 상세히 후술되어 있음)을 갖는다:
(a) 알파 독소에 대한 약 13 nM 이하의 친화성 상수(KD);
(b) 알파 독소 단량체에 결합하지만, 알파 독소와 알파 독소 수용체의 결합을 억제하지 않는 특성;
(c) 알파 독소 올리고머의 형성을 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상까지 억제하는 특성;
(d) (예를 들면, 세포용해 및 용혈 어세이에 의해 측정되었을 때) 알파 독소 세포용해 활성을 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상까지 감소시키는 특성; 및
(e) (예를 들면, 동물 폐렴 모델에서) 세포 침윤 및 전구염증 사이토카인 방출을 감소시키는 특성.
몇몇 실시양태에서, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 약 0.01 nM 내지 약 50 nM, 0.05 nM, 0.1 nM, 0.5 nM, 1 nM, 5 nM, 10 nM, 20 nM, 30 nM 또는 40 nM 범위 내의 해리 상수(KD)를 특징으로 하는 친화성으로 항원(예를 들면, 알파 독소)에 결합한다.
특정 실시양태에서, 항체 또는 항체 단편은 알파 독소에 면역특이적으로 결합하고 서열번호 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 또는 62의 아미노산 서열에 대해 90% 이상의 동일성을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하고 서열번호 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 또는 63의 아미노산 서열에 대해 90% 이상의 동일성을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 이때 상기 항체는 하나 이상의 알파 독소 단량체가 서로 결합하는 것을 억제하는(예를 들면, 올리고머화를 억제하는) 활성을 갖는다.
상보성 결정 영역
가변 도메인(VH 및 VL)은 항원 결합 영역을 포함하지만, 가변성은 항체의 가변 도메인 전체에 균일하게 분포되어 있지 않다. 가변성은 경쇄(VL 또는 VK) 가변 도메인 및 중쇄(VH) 가변 도메인 둘다에서 상보성 결정 영역(CDR들)으로서 지칭되는 절편 내에 집중되어 있다. 가변 도메인의 보다 더 고도로 보존된 부분은 골격 영역(FR)으로서 지칭된다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 루프 연결을 형성하는 3개의 CDR들에 의해 연결된 β-시트(sheet) 입체구조를 주로 채택하고 몇몇 경우 β-시트 구조의 일부를 형성하는 4개의 FR을 각각 포함한다. 각각 쇄 내의 CDR들은 FR에 의해 가깝게 인접하여 함께 유지되고 다른 쇄로부터의 CDR들과 함께 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다(상기 문헌(Kabat et al.) 참조). 중쇄의 3개 CDR들은 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR-3으로서 명명되고, 경쇄의 3개 CDR들은 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3으로서 명명된다. 본원에서 카바트 넘버링 시스템이 이용된다. 따라서, VH-CDR1은 대략 아미노산 31(즉, 제1 시스테인 잔기 다음에 대략 9개 잔기)에서 시작되고, 대략 5개 내지 7개의 아미노산을 포함하고, 다음 세린 잔기에서 종결된다. VH-CDR2는 CDR-H1의 말단 다음에 15번째 잔기에서 시작되고, 대략 16개 내지 19개의 아미노산을 포함하고, 다음 글리신 잔기에서 종결된다. VH-CDR3은 VH-CDR2의 말단 다음에 대략 30번째 아미노산 잔기에서 시작되고, 대략 13개 내지 15개의 아미노산을 포함하고, 서열 M-D-V에서 종결된다. VL-CDR1은 대략 잔기 24(즉, 시스테인 잔기 다음)에서 시작되고, 대략 10개 내지 15개의 잔기를 포함하고, 서열 Y-V-S로 종결된다. VL-CDR2는 VL-CDR1의 말단 다음에 대략 16번째 잔기에서 시작되고, 대략 7개의 잔기를 포함한다. VL-CDR3은 VH-CDR2의 말단 다음에 대략 33번째 잔기에서 시작되고, 대략 7개 내지 11개의 잔기를 포함하고, 서열 T-I-L에서 종결된다. CDR들은 항체마다 상당히 상이하다는 것(그리고 당연히 카바트 컨센서스 서열과의 상동성을 나타내지 않을 것이라는 것)을 주목한다.
본 발명의 항-알파 독소 항체 및 단편은 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR1, CDR2 또는 CDR3)을 포함하는 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 항-알파 독소 항체 또는 단편은 하나 이상의 VH CDR(예를 들면, CDR-H1, CDR-H2 또는 CDR-H3)을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-알파 독소 항체 또는 단편은 하나 이상의 VL CDR(예를 들면, CDR-L1, CDR-L2 또는 CDR-L3)을 포함하는 VH를 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 (a) 서열번호 7, 10, 13 또는 69와 동일하거나 이들 서열들에 비해 상대적으로 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1; (b) 서열번호 8, 11, 14, 17, 70 또는 75와 동일하거나 이들 서열들에 비해 상대적으로 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; 및 (c) 서열번호 9, 12, 15, 18, 16, 65, 66, 67, 71, 72, 76 또는 78과 동일하거나 이들 서열들에 비해 상대적으로 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함한다.
특정 실시양태에서, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 7, 8 및 9; 서열번호 10, 11 및 12; 서열번호 13, 14 및 15; 서열번호 7, 17 및 18; 서열번호 7, 8 및 16; 서열번호 7, 8 및 65; 서열번호 7, 8 및 66; 서열번호 7, 8, 및 67; 서열번호 7, 8 및 78; 서열번호 69, 70 및 71; 서열번호 7, 8 및 72; 서열번호 69, 75 및 71; 서열번호 69, 75 및 76; 또는 서열번호 69, 70 및 71과 동일하거나 이들 서열들에 비해 상대적으로 각각의 CDR 내에서 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 (a) 서열번호 1 또는 4와 동일하거나 이들 서열들에 비해 상대적으로 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1; (b) 서열번호 2, 5, 73 또는 77과 동일하거나 이들 서열들에 비해 상대적으로 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및 (c) 서열번호 3, 6, 64, 68 또는 74와 동일하거나 이들 서열들에 비해 상대적으로 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함한다.
특정 실시양태에서, 상기 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 1, 2 및 3; 서열번호 4, 5 및 6; 서열번호 1, 2 및 64; 서열번호 1, 2 및 68; 서열번호 1, 73 및 74; 또는 서열번호 1, 77 및 74와 동일하거나 이들 서열들에 비해 상대적으로 각각의 CDR 내에서 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기 (a) 내지 (f)와 동일하거나 하기 (a) 내지 (f)에 비해 상대적으로 각각의 CDR 내에서 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함한다: (a) 서열번호 7, 10, 13 또는 69의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1; (b) 서열번호 8, 11, 14, 17, 70 또는 75의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; (c) 서열번호 9, 12, 15, 18, 16, 65, 66, 67, 71, 72, 76 또는 78의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; (d) 서열번호 1 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1; (e) 서열번호 2, 5, 73 또는 77의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및 (f) 서열번호 3, 6, 64, 68 또는 74의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3.
특정 실시양태에서, 상기 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 7, 8, 9, 1, 2 및 3; 서열번호 10, 11, 12, 1, 2 및 3; 서열번호 13, 14, 15, 4, 5 및 6; 서열번호 7, 17, 18, 1, 2 및 3; 서열번호 7, 8, 16, 1, 2 및 64; 서열번호 7, 8, 65, 1, 2 및 64; 서열번호 7, 8, 66, 1, 2 및 64; 서열번호 7, 8, 67, 1, 2 및 68; 서열번호 7, 8, 67, 1, 2 및 64; 서열번호 7, 8, 78, 1, 2 및 64; 서열번호 7, 8, 65, 1, 2 및 68; 서열번호 69, 70, 71, 1, 2 및 68; 서열번호 7, 8, 72, 1, 73 및 74; 서열번호 69, 75, 71, 1, 2 및 68; 서열번호 69, 75, 76, 1, 2 및 68; 서열번호 69, 75, 76, 1, 77 및 74; 또는 서열번호 69, 70, 71, 1, 77 및 74와 동일하거나 이들 서열들에 비해 상대적으로 각각의 CDR 내에서 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, (i) 3개의 CDR들을 포함하는 VH 쇄 도메인 및 3개의 CDR들을 포함하는 VL 쇄 도메인을 포함하고, (ii) 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물이 제공되고, 이때 VH 쇄 도메인의 3개 CDR들은 (a) 서열번호 7, 10, 13 또는 69의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1; (b) 서열번호 8, 11, 14, 17, 70 또는 75의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; 및 (c) 서열번호 9, 12, 15, 18, 16, 65, 66, 67, 71, 72, 76 또는 78의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3은 서열번호 7, 8 및 9; 서열번호 10, 11 및 12; 서열번호 13, 14 및 15; 서열번호 7, 17 및 18; 서열번호 7, 8 및 16; 서열번호 7, 8 및 65; 서열번호 7, 8 및 66; 서열번호 7, 8 및 67; 서열번호 7, 8 및 78; 서열번호 69, 70 및 71; 서열번호 7, 8 및 72; 서열번호 69, 75 및 71; 서열번호 69, 75 및 76; 또는 서열번호 69, 70 및 71에 상응한다.
일부 실시양태에서, (i) 3개의 CDR들을 포함하는 VH 쇄 도메인 및 3개의 CDR들을 포함하는 VL 쇄 도메인을 포함하고, (ii) 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물도 제공되고, 이때 VL 쇄 도메인의 3개 CDR들은 (a) 서열번호 1 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1; (b) 서열번호 2, 5, 73 또는 77의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및 (c) 서열번호 3, 6, 64, 68 또는 74의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3은 서열번호 1, 2 및 3; 서열번호 4, 5 및 6; 서열번호 1, 2 및 64; 서열번호 1, 2 및 68; 서열번호 1, 73 및 74; 또는 서열번호 1, 77 및 74에 상응한다.
일부 실시양태에서, 항-알파 독소 항체 또는 단편은 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소에 면역특이적으로 결합하고, (a) 서열번호 7, 10, 13 또는 69와 동일하거나 이들 서열들에 비해 상대적으로 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1; (b) 서열번호 8, 11, 14, 17, 70 또는 75와 동일하거나 이들 서열들에 비해 상대적으로 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; (c) 서열번호 9, 12, 15, 18, 16, 65, 66, 67, 71, 72, 76 또는 78과 동일하거나 이들 서열들에 비해 상대적으로 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; (d) 서열번호 1 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1; (e) 서열번호 2, 5, 73 또는 77의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및 (f) 서열번호 3, 6, 64, 68 또는 74의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하고, 하기 (a) 내지 (e)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 특성(더 상세히 후술되어 있음)을 갖는다:
(a) 알파 독소에 대한 약 13 nM 이하의 친화성 상수(KD);
(b) 알파 독소 단량체에 결합하지만, 알파 독소와 알파 독소 수용체의 결합을 억제하지 않는 특성;
(c) 알파 독소 올리고머의 형성을 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상까지 억제하는 특성;
(d) (예를 들면, 세포용해 및 용혈 어세이에 의해 측정되었을 때) 알파 독소 세포용해 활성을 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상까지 감소시키는 특성; 및
(e) (예를 들면, 동물 폐렴 모델에서) 세포 침윤 및 전구염증 사이토카인 방출을 감소시키는 특성.
몇몇 실시양태에서, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 약 0.01 nM 내지 약 50 nM, 0.05 nM, 0.1 nM, 0.5 nM, 1 nM, 5 nM, 10 nM, 20 nM, 30 nM 또는 40 nM 범위 내의 해리 상수(KD)를 특징으로 하는 친화성으로 항원(예를 들면, 알파 독소)에 결합한다.
실시예 11의 표 1 내지 7은 본 발명의 항체에 대한 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3에 대한 서열을 제공한다. 표 9는 VH 및 VL CDR들의 요약을 제공한다. 이들 영역들은 각각의 CDR 영역이 주어진 항체에 대해 독립적으로 선택될 수 있기 때문에 다양한 조합으로 조합될 수 있다. 표 7은 각각의 영역에 대해 선택될 수 있는 상이한 서열들을 예시한다. 일부 실시양태에서, VL CDR3 서열은 본 발명의 항-알파 독소 항체 또는 단편을 형성하기 위해 임의의 조합으로 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표 9에 나타낸 바와 같이, VH CDR1은 서열번호 7, 10, 13 및 69로부터 선택되고, VH CDR2는 서열번호 8, 11, 14, 17, 70 및 75로부터 선택되고, VH CDR3은 서열번호 9, 12, 15, 18, 16, 65, 66, 67, 71, 72, 76 및 78로부터 선택된다. 몇몇 실시양태에서, 표 9에 나타낸 바와 같이, VL CDR1은 서열번호 1 및 4로부터 선택되고, VL CDR2는 서열번호 2, 5, 73 및 77로부터 선택되고, VL CDR3은 서열번호 3, 6, 64, 68 및 74로부터 선택된다.
VH CDR3 및 VL CDR3 도메인은 항원에 대한 항체의 결합 특이성/친화성에 있어서 일정한 역할을 수행한다. 따라서, 몇몇 실시양태에서, 항-알파 독소 항체, 또는 이의 단편 또는 항원 결합 단편은 서열번호 9, 12, 15, 18, 16, 65, 66, 67, 71, 72, 76 또는 78과 동일하거나 이들 서열들에 비해 상대적으로 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함한다. 다양한 실시양태에서, 항-알파 독소 항체 또는 단편은 서열번호 3, 6, 64, 68 또는 74와 동일하거나 이들 서열들에 비해 상대적으로 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함한다. 항-알파 독소 항체 및 단편의 남은 부분(예를 들면, CDR1, CDR2, VH, VL 등)은 본원에 개시된 특정 서열 또는 공지된 서열을 포함할 수 있되, 상기 항-알파 독소 항체 및 단편은 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소에 면역특이적으로 결합해야 한다.
몇몇 실시양태에서, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 알파 독소에 면역특이적으로 결합하고 서열번호 9, 12, 15, 18, 16, 65, 66, 67, 71, 72, 76 또는 78과 동일하거나 이들 서열들에 비해 상대적으로 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하고, 이때 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 알파 독소 올리고머화를 억제한다.
몇몇 실시양태에서, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 알파 독소에 면역특이적으로 결합하고 서열번호 3, 6, 64, 68 또는 74와 동일하거나 이들 서열들에 비해 상대적으로 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하고, 이때 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 알파 독소 올리고머화를 억제한다.
몇몇 실시양태에서, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 알파 독소에 면역특이적으로 결합하고 서열번호 9, 12, 15, 18, 16, 65, 66, 67, 71, 72, 76 또는 78과 동일하거나 이들 서열들에 비해 상대적으로 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하고, 이때 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 사이토카인의 방출을 감소시키거나 억제한다.
몇몇 실시양태에서, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 알파 독소에 면역특이적으로 결합하고 서열번호 3, 6, 64, 68 또는 74와 동일하거나 이들 서열들에 비해 상대적으로 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하고, 이때 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 사이토카인의 방출을 감소시키거나 억제한다.
몇몇 실시양태에서, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 알파 독소에 면역특이적으로 결합하고 서열번호 9, 12, 15, 18, 16, 65, 66, 67, 71, 72, 76 또는 78과 동일하거나 이들 서열들에 비해 상대적으로 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하고, 이때 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 피부괴사를 완화하거나 제거한다.
몇몇 실시양태에서, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 알파 독소에 면역특이적으로 결합하고 서열번호 3, 6, 64, 68 또는 74와 동일하거나 이들 서열들에 비해 상대적으로 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하고, 이때 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 피부괴사를 완화하거나 제거한다.
항-알파 독소 항체 및 단편은 본원에 기재된 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 하나 이상의 아미노산 서열을 종종 포함한다. 실질적으로 동일한 아미노산 서열은 보존적 아미노산 치환을 포함하는 서열뿐만 아니라 아미노산 결실 및/또는 삽입을 포함하는 서열도 포함한다. 보존적 아미노산 치환은 제1 아미노산의 화학적 및/또는 물리적 성질(예를 들면, 전하, 구조, 극성, 소수성/친수성)과 유사한 화학적 및/또는 물리적 성질을 갖는 제2 아미노산에 의한 제1 아미노산의 교체를 지칭한다. 보존적 치환은 하기 군 내의 또 다른 아미노산에 의한 한 아미노산의 교체를 포함한다: 라이신(K), 아르기닌(R) 및 히스티딘(H); 아스파르테이트(D) 및 글루타메이트(E); 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 세린(S), 쓰레오닌(T), 티로신(Y), K, R, H, D 및 E; 알라닌(A), 발린(V), 류신(L), 이소류신(I), 프롤린(P), 페닐알라닌(F), 트립토판(W), 메티오닌(M), 시스테인(C) 및 글리신(G); F, W 및 Y; C, S 및 T.
골격 영역
중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 가변 도메인의 보다 더 고도로 보존된 부분인 4개의 골격 영역(일반적으로 FR1, FR2, FR3 및 FR4, 또는 대안적으로 FW1, FW2, FW3 및 FW4)을 각각 포함한다. 중쇄의 4개 골격 영역은 본원에서 VH-FW1, VH-FW2, VH-FW3 및 VH-FW4로서 명명되고, 경쇄의 4개 골격 영역은 본원에서 VL-FW1, VL-FW2, VL-FW3 및 VH-FW4로서 명명된다. 카바트 넘버링 시스템이 본원에 이용되므로, VH-FW1은 위치 1에서 시작되고 대략 아미노산 30에서 종결되고, VH-FW2는 대략 아미노산 36 내지 49이고, VH-FW3은 대략 아미노산 66 내지 94이고, VH-FW4는 대략 아미노산 103 내지 113이다. VL-FW1은 아미노산 1에서 시작되고 대략 아미노산 23에서 종결되고, VL-FW2는 대략 아미노산 35 내지 49이고, VL-FW3은 대략 아미노산 57 내지 88이고, VL-FW4는 대략 아미노산 98 내지 107이다. 일부 실시양태에서, 골격 영역은 카바트 넘버링 시스템에 따른 치환, 예를 들면, VL-FW1 내의 106A에서의 삽입을 함유한다. 천연 발생 치환 이외에, FR 잔기의 하나 이상의 변경(예를 들면, 치환)도 항-알파 독소 항체 또는 단편 내에 도입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이들 변경은 항-알파 독소에 대한 항체의 결합 친화성을 개선하거나 최적화한다. 변경될 수 있는 골격 영역 잔기의 비-한정적 예로는 항원에 직접적으로 비-공유결합하는 골격 영역 잔기, CDR의 입체구조와 상호작용하거나 CDR의 입체구조에 영향을 미치는 골격 영역 잔기 및/또는 VL-VH 경계면에 참여하는 골격 영역 잔기가 있다.
일부 실시양태에서, 골격 영역은 "생식세포주화(germlining)"를 목적으로 하는 하나 이상의 아미노산 변화를 포함할 수 있다. 예를 들면, 선택된 항체 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열이 생식세포주 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열과 비교되고, 선택된 VL 및/또는 VH 쇄의 일부 골격 잔기들이 (예를 들면, 파지 라이브러리의 제조에 사용된 면역글로불린 유전자의 체세포 돌연변이의 결과로서) 생식세포주 배열과 상이한 경우, 선택된 항체의 변경된 골격 잔기를 생식세포주 배열로 "역돌연변이"시키는 것(즉, 선택된 항체의 골격 아미노산 서열이 생식세포주 골격 아미노산 서열과 동일하도록 상기 선택된 항체의 골격 아미노산 서열을 변화시키는 것)이 바람직할 수 있다. 골격 잔기의 이러한 "역돌연변이"(또는 "생식세포주화")는 특정 돌연변이를 도입하기 위한 표준 분자생물학 방법(예를 들면, 부위-지정된 돌연변이유발; PCR 매개 돌연변이유발 등)에 의해 달성될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 가변 경쇄 및/또는 중쇄 골격 잔기가 역돌연변이된다. 일부 실시양태에서, 제공된 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 가변 중쇄가 역돌연변이된다. 일부 실시양태에서, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 가변 중쇄가 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상 또는 4개 이상의 역돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 항-알파 독소 항체 또는 단편의 VH는 서열번호 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 또는 62 내의 상응하는 골격 영역(즉, 항체 Y의 FR1과 비교된 항체 X의 FR1)에 대해 약 65% 내지 약 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 FR1, FR2, FR3 및/또는 FR4를 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 항-알파 독소 항체 또는 단편은 VH 서열번호 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 또는 62의 상응하는 FR과 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상 동일하거나 100% 동일한 VH FR 아미노산 서열(FR1, FR2, FR3 및/또는 FR4)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-알파 독소 항체 또는 단편은 VH 서열번호 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 또는 62의 상응하는 FR과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일하거나 100% 동일한 VH FR 아미노산 서열(FR1, FR2, FR3 및/또는 FR4)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-알파 독소 항체 또는 단편은 VH 서열번호 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 또는 62의 상응하는 FR과 동일하거나 이 FR에 비해 상대적으로 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 VH FR(FR1, FR2, FR3 및/또는 FR4)을 포함할 수 있다. 특히, VH의 FR1, FR2, FR3 또는 FR4는 VH 서열번호 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 또는 62의 상응하는 FR1, FR2, FR3 또는 FR4와 동일하거나 이들 FR들에 비해 상대적으로 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환을 포함하는 아미노산 서열을 각각 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 항-알파 독소 항체 또는 단편의 VL은 VL 서열번호 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 또는 63의 FR 내의 상응하는 골격 영역(즉, 항체 Y의 FR1과 비교된 항체 X의 FR1)에 대해 아미노산 서열 동일성(예를 들면, 약 65% 내지 약 100%의 서열 동일성)을 갖는 FR1, FR2, FR3 및/또는 FR4를 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 항-알파 독소 항체 또는 단편은 VL 서열번호 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 또는 63의 상응하는 FR과 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상 동일하거나 100% 동일한 VL FR 아미노산 서열(FR1, FR2, FR3 및/또는 FR4)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-알파 독소 항체 또는 단편은 VL 서열번호 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 또는 63의 상응하는 FR과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일하거나 100% 동일한 VL FR 아미노산 서열(FR1, FR2, FR3 및/또는 FR4)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-알파 독소 항체 또는 단편은 VL 서열번호 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 또는 63의 상응하는 FR과 동일하거나 이 FR에 비해 상대적으로 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 VL FR(FR1, FR2, FR3 및/또는 FR4)을 포함한다. 특히, VL의 FR1, FR2, FR3 또는 FR4는 VH 서열번호 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 또는 63의 상응하는 FR1, FR2, FR3 또는 FR4와 동일하거나 이들 FR들에 비해 상대적으로 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환을 포함하는 아미노산 서열을 각각 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 알파 독소에 면역특이적으로 결합하고, VH 서열번호 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 또는 62의 상응하는 FR과 동일하거나 이 FR에 비해 상대적으로 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 VH FR(FR1, FR2, FR3 및/또는 FR4), 및/또는 VL 서열번호 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 또는 63의 상응하는 FR과 동일하거나 이 FR에 비해 상대적으로 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 VL FR(FR1, FR2, FR3 및/또는 FR4)을 포함하고, 이때 상기 항체는 하기 (a) 내지 (e)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 특성(더 상세히 후술되어 있음)을 갖는다:
(a) 알파 독소에 대한 약 13 nM 이하의 친화성 상수(KD);
(b) 알파 독소 단량체에 결합하지만, 알파 독소와 알파 독소 수용체의 결합을 억제하지 않는 특성;
(c) 알파 독소 올리고머의 형성을 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상까지 억제하는 특성;
(d) (예를 들면, 세포용해 및 용혈 어세이에 의해 측정되었을 때) 알파 독소 세포용해 활성을 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상까지 감소시키는 특성; 및
(e) (예를 들면, 동물 폐렴 모델에서) 세포 침윤 및 전구염증 사이토카인 방출을 감소시키는 특성.
몇몇 실시양태에서, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 약 0.01 nM 내지 약 50 nM, 0.05 nM, 0.1 nM, 0.5 nM, 1 nM, 5 nM, 10 nM, 20 nM, 30 nM 또는 40 nM 범위 내의 해리 상수(KD)를 특징으로 하는 친화성으로 항원(예를 들면, 알파 독소)에 결합한다.
항-알파 독소 항체 및 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열
전술된 아미노산 서열들 이외에, 상기 아미노산 서열들에 상응하고 본원에 개시된 인간 항체, 인간화된 항체 및/또는 키메라 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열들이 추가로 제공된다. 몇몇 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 본원에 기재된 항-알파 독소 항체 또는 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편을 포함한다. 이들은 상기 언급된 아미노산 서열들을 코딩하는 뉴클레오티드 서열들을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 상기 뉴클레오티드 서열들은 실시예 11의 표 8에서 제공되어 있다. 따라서, 본원에 기재된 항체의 CDR들 및 FR들을 포함하는 VH 및 VL 골격 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열들뿐만 아니라 세포(예를 들면, 포유동물 세포)에서의 이들의 효율적인 발현을 위한 발현 벡터도 제공된다. 폴리뉴클레오티드를 사용하여 항-알파 독소 항체 또는 단편을 제조하는 방법은 더 상세히 후술되어 있다.
예를 들면, 본원에서 정의된 바와 같은 엄격한 또는 낮은 엄격도 혼성화 조건 하에서 항-알파 독소 항체 또는 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드도 포함된다. 본원에서 사용된 용어 "엄격도"는 2개의 핵산들 사이의 상동성 정도를 표시하기 위한 혼성화 실험의 실험 조건(예를 들면, 온도 및 염 농도)을 지칭하고, 엄격도가 높을수록 2개의 핵산들 사이의 퍼센트 상동성은 높아진다.
엄격한 혼성화 조건은 약 45℃의 6X 염화나트륨/시트르산나트륨(SSC)에서 필터-결합된 DNA와의 혼성화 후 약 50℃ 내지 65℃의 0.2X SSC/0.1% SDS에서의 1회 이상의 세척; 고도로 엄격한 조건, 예컨대, 약 45℃의 6X SSC에서 필터-결합된 DNA와의 혼성화 후 약 65℃의 0.1X SSC/0.2% SDS에서의 1회 이상의 세척; 또는 공지된 임의의 다른 엄격한 혼성화 조건을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
일부 실시양태에서, 핵산 또는 이의 단편은 항-알파 독소 항체 또는 단편을 코딩할 수 있고 엄격한 조건 하에서 서열번호 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 또는 63의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 혼성화할 수 있다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 또는 63의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 약 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 이상 동일한 항-알파 독소 항체 또는 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 또는 38의 뉴클레오티드 서열과 약 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 이상 동일한 항-알파 독소 항체 또는 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 항-알파 독소 항체 또는 단편은 서열번호 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 또는 63의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 대해 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이상의 동일성을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 또는 62의 VH 아미노산 서열을 코딩하는 VH 뉴클레오티드 서열과 약 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 이상 동일한 항-알파 독소 항체 또는 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 30, 32, 34, 36 또는 38의 VH 뉴클레오티드 서열과 약 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 이상 동일한 항-알파 독소 항체 또는 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 항-알파 독소 항체 또는 단편은 서열번호 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 또는 62의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 대해 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이상의 동일성을 포함하는 VH 코딩 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 또는 63의 VL 아미노산 서열을 코딩하는 VL 뉴클레오티드 서열과 약 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 이상 동일한 항-알파 독소 항체 또는 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 29, 31, 33, 35 또는 37의 VL 뉴클레오티드 서열과 약 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 이상 동일한 항-알파 독소 항체 또는 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 항-알파 독소 항체 또는 단편은 서열번호 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 또는 63의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 대해 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이상의 동일성을 포함하는 VL 코딩 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다.
특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 VH 아미노산 서열과 약 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 이상 동일한 항-알파 독소 항체 또는 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 VL 아미노산 서열과 약 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 이상 동일한 항-알파 독소 항체 또는 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고, 이때 VH 및 VL 서열은 서열번호 20 및 19; 서열번호 22 및 21; 서열번호 24 및 23; 서열번호 26 및 25; 서열번호 28 및 27; 서열번호 41 및 42; 서열번호 43 및 44; 서열번호 45 및 46; 서열번호 47 및 48; 서열번호 49 및 50; 서열번호 51 및 52; 서열번호 53 및 54; 서열번호 55 및 56; 서열번호 57 및 58; 서열번호 59 및 60; 서열번호 61 및 58; 서열번호 62 및 58; 서열번호 62 및 63; 또는 서열번호 79 및 63으로 표시된다.
실질적으로 동일한 서열은 다형성 서열, 즉 집단 내의 대안적 서열 또는 대립형질일 수 있다. 대립형질 차이는 1개의 염기쌍만큼 작을 수 있다. 실질적으로 동일한 서열은 침묵 돌연변이를 포함하는 서열을 비롯한 돌연변이된 서열도 포함할 수 있다. 돌연변이는 하나 이상의 잔기 변화, 하나 이상의 잔기의 결실, 또는 하나 이상의 추가 잔기의 삽입을 포함할 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 당분야에서 공지된 임의의 방법에 의해 수득될 수 있고 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열도 당분야에서 공지된 임의의 방법에 의해 확인될 수 있다. 예를 들면, 항체의 뉴클레오티드 서열이 공지되어 있는 경우, 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드로부터 조립될 수 있는데, 요약하건대 이 과정은 항체를 코딩하는 서열의 일부를 함유하는 중첩 올리고뉴클레오티드들을 합성하는 단계, 이들 올리고뉴클레오티드들을 어닐링시키고 라이게이션시키는 단계, 및 이어서 라이게이션된 올리고뉴클레오티드를 PCR로 증폭하는 단계를 포함한다.
항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 적합한 공급원으로부터의 핵산으로부터 발생될 수도 있다. 특정 항체를 코딩하는 핵산을 함유하는 클론이 이용될 수 없지만, 항체 분자의 서열이 공지되어 있는 경우, 면역글로불린을 코딩하는 핵산은 서열의 3' 말단 및 5' 말단에 혼성화될 수 있는 합성 프라이머를 사용하는 PCR 증폭에 의해, 또는 예를 들면, cDNA 라이브러리로부터 항체를 코딩하는 cDNA 클론을 확인하기 위해 특정 유전자 서열에 대해 특이적인 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하는 클로닝에 의해 적합한 공급원(예를 들면, 항체 cDNA 라이브러리, 또는 항체를 발현하는 임의의 조직 또는 세포, 예컨대, 항체를 발현하도록 선택된 하이브리도마 세포로부터 단리된 핵산 또는 종종 폴리A+RNA로부터 발생된 cDNA 라이브러리)으로부터 화학적으로 합성될 수 있거나 수득될 수 있다. 그 다음, PCR에 의해 발생된 증폭된 핵산은 당분야에서 공지된 임의의 방법의 이용을 통해 복제가능한 클로닝 벡터 내로 클로닝될 수 있다.
일단 항체의 뉴클레오티드 서열 및 상응하는 아미노산 서열이 확인되면, 항체의 뉴클레오티드 서열은 당분야에서 공지된 뉴클레오티드 서열의 조작 방법, 예를 들면, 재조합 DNA 기법, 부위-지정된 돌연변이유발, PCR 등의 이용을 통해 예를 들면, 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 생성하도록 조작되어 상이한 아미노산 서열을 갖는 항체를 발생시킬 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "엄격한 조건"은 혼성화 및 세척을 위한 조건을 지칭한다. 혼성화 반응 온도 조건 최적화 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 수성 방법 및 비-수성 방법이 참고문헌에 기재되어 있고 이들 중 하나가 이용될 수 있다. 엄격한 혼성화 조건의 비-한정적 예는 약 45℃의 6X 염화나트륨/시트르산나트륨(SSC)에서의 혼성화 후 50℃의 0.2X SSC/0.1% SDS에서의 1회 이상의 세척이다. 엄격한 혼성화 조건의 또 다른 예는 약 45℃의 6X 염화나트륨/시트르산나트륨(SSC)에서의 혼성화 후 55℃의 0.2X SSC/0.1% SDS에서의 1회 이상의 세척이다. 엄격한 혼성화 조건의 추가 예는 약 45℃의 6X 염화나트륨/시트르산나트륨(SSC)에서의 혼성화 후 60℃의 0.2X SSC/0.1% SDS에서의 1회 이상의 세척이다. 종종, 엄격한 혼성화 조건은 약 45℃의 6X 염화나트륨/시트르산나트륨(SSC)에서의 혼성화 후 65℃의 0.2X SSC/0.1% SDS에서의 1회 이상의 세척이다. 보다 종종, 엄격한 조건은 65℃의 0.5 M 인산나트륨/7% SDS에서의 혼성화 후 65℃의 0.2X SSC/1% SDS에서의 1회 이상의 세척이다. 엄격한 혼성화 온도는 일부 유기 용매, 예를 들면, 포름아미드의 첨가에 의해 변경될(즉, 낮아질) 수도 있다. 유기 용매, 예컨대, 포름아미드는 여전히 엄격한 조건을 유지하고 열 불안정할 수 있는 핵산의 유용한 수명을 연장시키면서 혼성화가 보다 더 낮은 온도에서 수행될 수 있도록 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 열 안정성을 감소시킨다.
본원에서 사용된 어구 "혼성화하는" 또는 이의 문법적 어미변화는 낮은, 중간 또는 높은 엄격도 조건 하에서 또는 핵산 합성 조건 하에서 제1 핵산 분자와 제2 핵산 분자의 결합을 지칭한다. "혼성화하는"은 제1 핵산 분자가 제2 핵산 분자에 결합하는 경우 및 제1 핵산 분자와 제2 핵산 분자가 상보적인 경우를 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "특이적으로 혼성화한다"는 프라이머의 핵산 합성 조건 하에서 상보적 서열을 갖지 않는 핵산 분자와의 혼성화에 비해 상기 프라이머에 상보적인 서열을 갖는 핵산 분자와의 우선적인 혼성화를 지칭한다. 예를 들면, 특이적 혼성화는 프라이머와 이 프라이머에 상보적인 표적 핵산 서열의 혼성화를 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 프라이머는 고체상(solid phase) 핵산 프라이머 혼성화 서열에 상보적일 수 있거나 고체상 핵산 프라이머 혼성화 서열에 실질적으로 상보적일 수 있는(예를 들면, 정렬된 경우 프라이머 혼성화 서열 상보체와 약 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한) 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 프라이머는 (고체상 프라이머 혼성화 서열에 상보적이거나 실질적으로 상보적인 프라이머의 뉴클레오티드 서열의 3' 또는 5' 말단에서) 고체상 핵산 프라이머 혼성화 서열에 상보적이지 않거나 실질적으로 상보적이지 않는 뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있다.
일부 실시양태에서, 프라이머는 변경, 예컨대, 이노신, 탈염기 부위, 잠겨진 핵산, 작은 홈(minor groove) 결합제, 이중체 안정화제(예를 들면, 아크리딘, 스퍼미딘), Tm 변경제, 또는 프라이머 또는 프로브의 결합 성질을 변화시키는 임의의 변경제를 함유할 수 있다.
일부 실시양태에서, 프라이머는 검출가능한 분자 또는 물질(예를 들면, 형광단, 방사성 동위원소, 비색 물질, 입자, 효소 등)을 함유할 수 있다. 원하는 경우, 핵산은 당업자에게 공지된 임의의 방법의 이용을 통해 검출가능한 표지를 포함하도록 변경될 수 있다. 상기 표지는 합성의 일부로서 도입될 수 있거나 본원에 기재된 방법들 중 임의의 방법에서 프라이머를 사용하기 전에 첨가될 수 있다. 표지의 도입은 액체상(liquid phase) 또는 고체상에서 수행될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 검출가능한 표지는 표적의 검출에 유용할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 검출가능한 표지는 표적 핵산의 정량(예를 들면, 핵산의 특정 서열 또는 종의 카피 수의 측정)에 유용할 수 있다. 시스템에서 상호작용 또는 생물학적 활성의 검출에 적합한 임의의 검출가능한 표지는 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고 사용될 수 있다. 검출가능한 표지의 예는 형광 표지, 예컨대, 플루오레세인, 로다민 등(예를 들면, 문헌(Anantha, et al., Biochemistry (1998) 37:2709 2714); 및 문헌(Qu & Chaires, Methods Enzymol. (2000) 321:353 369)); 방사성 동위원소(예를 들면, 125I, 131I, 35S, 31P, 32P, 33P, 14C, 3H, 7Be, 28Mg, 57Co, 65Zn, 67Cu, 68Ge, 82Sr, 83Rb, 95Tc, 96Tc, 103Pd, 109Cd 및 127Xe); 광 산란 표지(예를 들면, 미국 특허 제6,214,560호, 제니콘 사이언시스 코포레이션(Genicon Sciences Corporation)(미국 캘리포니아주 소재)으로부터 상업적으로 입수가능함); 화학발광 표지 및 효소 기질(예를 들면, 디옥세탄 및 아크리디늄 에스테르); 효소 또는 단백질 표지(예를 들면, 녹색 형광 단백질(GFP) 또는 이의 색채 변이체, 루시퍼라제, 퍼록시다제); 다른 발색성 표지 또는 염료(예를 들면, 시아닌), 및 다른 보조인자 또는 생체분자, 예컨대, 디곡시제닌, 스트렙타비딘, 바이오틴(예를 들면, 결합쌍의 구성원, 예컨대, 바이오틴 및 아비딘); 친화성 포획 모이어티(moiety) 등이다. 몇몇 실시양태에서, 프라이머는 친화성 포획 모이어티로 표지될 수 있다. 질량 분광측정(예를 들면, 매트릭스-보조된 레이저 탈착 이온화(MALDI) 질량 분광측정 및 전기분무(ES) 질량 분광측정)을 이용한 검출을 위한 질량 변경에 유용한 표지도 검출가능한 표지에 포함된다.
또한, 프라이머는 표적 핵산 또는 또 다른 프라이머의 하위서열에 혼성화하고 예를 들면, 분자 비이콘(beacon)처럼 프라이머, 표적 핵산 또는 이들 둘다의 검출을 용이하게 하는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭할 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "분자 비이콘"은 분자의 검출가능한 성질이 일부 특정 조건 하에서만 검출됨으로써 상기 분자가 특정 정보제공 신호로서 작용할 수 있게 하는 검출가능한 분자를 지칭한다. 검출가능한 성질의 비-한정적 예는 광학적 성질, 전기적 성질, 자기적 성질, 화학적 성질, 및 공지된 크기의 개구(opening)를 통과하는 시간 또는 속도이다.
몇몇 실시양태에서, 분자 비이콘은 줄기-루프 구조를 형성할 수 있는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드일 수 있고, 이때 상기 루프 서열은 관심 있는 표적 핵산 서열에 상보적일 수 있고 줄기를 형성할 수 있는 짧은 상보적 아암에 의해 플랭킹된다. 상기 올리고뉴클레오티드는 한 말단에서 형광단으로 표지될 수 있고 다른 말단에서 소광제(quencher) 분자로 표지될 수 있다. 줄기-루프 입체구조에서, 여기된 형광단으로부터의 에너지는 형광 공명 에너지 전달 또는 FRET에서 관찰된 커플링과 유사한 긴 범위 쌍극자-쌍극자 커플링을 통해 소광제로 전달되고 광 대신에 열로서 방출된다. 상기 루프 서열이 특정 표적 서열에 혼성화되는 경우, 분자의 양 말단은 분리되고, 여기된 형광단으로부터의 에너지는 검출가능한 신호를 발생시키면서 광으로서 방사된다. 분자 비이콘은 과도한 프로브의 제거가 비-혼성화된 프로브의 자가 소광 성질로 인해 불필요하다는 추가된 장점을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 분자 비이콘 프로브는 루프-표적 혼성화 및 줄기 형성의 상대적 강도를 조절함으로써 루프 서열과 표적 서열 사이의 불일치를 구별하거나 견디도록 디자인될 수 있다. 본원에서 언급된 용어 "불일치된 뉴클레오티드" 또는 "불일치"는 해당 위치 또는 위치들에서 표적 서열에 상보적이지 않는 뉴클레오티드를 지칭한다. 프로브는 하나 이상의 불일치를 가질 수 있으나, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 7개 이상의 불일치된 뉴클레오티드도 가질 수 있다.
항-알파 독소 항체 및 단편의 생물학적 특성
항체는 본원에 기재된 항체와 동일하거나 유사한 하나 이상의 특성을 가질 수 있고, 이 항체를 동일한 항원, 즉 알파 독소에 결합하는 다른 항체와 구별시켜주는 하나 이상의 생물학적 특성을 종종 보유한다. 본원에서 사용된 용어 항체의 "생물학적 특성"은 치료, 연구 및 진단 용도를 위해 항체를 선별하는 데에 이용될 수 있는 임의의 하나 이상의 생화학적 특성, 결합 특성 및 기능적 특성을 지칭한다. 예를 들면, 항-알파 독소 항체 및 단편은 예를 들면, 에피토프 결합, 표적화, 친화성, 중화, 및 올리고머화 또는 칠량체 공극 복합체 형성의 억제 면에서 동일할 수 있거나 상이할 수 있다.
항-알파 독소 항체 또는 단편의 생화학적 특성은 등전점(pI) 및 용융 온도(Tm)를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 항-알파 독소 항체 또는 단편의 결합 특성은 결합 특이성; 해리 상수(Kd) 또는 이의 역수인 결합 상수(Ka), 또는 이의 성분인 kon 또는 koff 속도; 상기 항체 또는 단편이 결합하는 에피토프; 알파 독소의 다양한 형태들 및/또는 제제들(예를 들면, 재조합, 천연 또는 아세틸화된 형태)을 구별하는 능력; 및 가용성 항원 및/또는 고정된 항원에 결합하는 능력을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 본원에서 제공된 항체의 기능적 특성은 알파 독소 수용체 결합의 억제; 알파 독소 올리고머화의 억제; 알파 독소 발현 또는 활성에 반응하여 캐스케이드(cascade) 반응에 의해 유도된 유전자 발현의 억제; 알파 독소를 발현하는 세포의 고갈; 알파 독소를 발현하는 세포의 생장 억제; 알파 독소의 국소화의 억제; 및 하나 이상의 스타필로코커스 아우레우스, 알파 독소, 또는 스타필로코커스 아우레우스 및 알파 독소 관련 질환 또는 장애에서의 보호를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 항-알파 독소 항체 및 단편의 특성, 및 이들 특성을 변경시키고 섬세하게 조정하는 방법이 본원에 기재된다. 항체의 특성을 측정하는 방법(이들 중 일부는 상세히 후술되어 있음)은 당분야에서 공지되어 있다.
결합 특성
전술된 바와 같이, 항-알파 독소 항체 또는 단편은 배타적으로 또는 다른 폴리펩티드에 비해 우선적으로 단백질, 펩티드, 서브유닛, 단편, 부분 또는 이들의 임의의 조합물의 하나 이상의 특정된 에피토프 또는 항원성 결정인자에 면역특이적으로 결합한다. 본원에서 사용된 용어 "에피토프" 또는 "항원성 결정인자"는 항체에 결합할 수 있는 단백질 결정인자를 지칭하고, 이때 용어 "결합"은 본원에서 종종 특이적 결합에 관한 것이다. 이들 단백질 결정인자 또는 에피토프는 종종 특정 삼차원적 구조적 특성을 갖고 종종 특정 전하 특성을 갖는, 분자의 화학적 활성 표면 그룹핑, 예컨대, 아미노산 또는 당 측쇄를 종종 포함한다. 입체구조적 에피토프와 비-입체구조적 에피토프는 입체구조적 에피토프와의 결합이 변성 용매의 존재 하에서 상실되지만 비-입체구조적 에피토프와의 결합은 그러하지 않다는 면에서 구별된다. 본원에서 사용된 용어 "불연속 에피토프"는 단백질의 일차 서열에서 2개 이상의 분리된 영역들로부터 형성된 단백질 항원 상의 입체구조적 에피토프를 지칭한다.
일부 실시양태에서, 항-알파 독소 항체 또는 단편은 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 및 알파 독소 올리고머화와 관련된 이의 항원성 단편에 면역특이적으로 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 항-알파 독소 항체 또는 단편은 알파 독소, 또는 서열번호 39 또는 40의 3개 이상의 임의의 인접 아미노산들에 면역특이적으로 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 에피토프는 알파 독소 단백질의 4개 이상의 아미노산 잔기, 5개 이상의 아미노산 잔기, 6개 이상의 아미노산 잔기, 7개 이상의 아미노산 잔기, 8개 이상의 아미노산 잔기 또는 9개 이상의 아미노산 잔기 내지 인접 아미노산들의 전체 특정된 부분이다. 일부 실시양태에서, 접촉 잔기는 T261, T263, N264, K266 및 K271을 포함한다. 다른 실시양태에서, 접촉 잔기는 서열번호 39의 N177, W179, G180, P181, Y182, D183, D185, S186, W187, N188, P189, V190, Y191 및 R200을 포함한다. 추가 실시양태에서, 접촉 잔기는 서열번호 39의 N177, W179, G180, P181, Y182, D183, D185, S186, W187, N188, P189, V190, Y191, R200, T261, T263, N264, K266 및 K271을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉하는 알파 독소의 부분은 서열번호 39의 아미노산 261-272를 포함한다. 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉하는 알파 독소의 부분은 서열번호 39의 아미노산 248-277을 포함한다. 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉하는 알파 독소의 부분은 서열번호 39의 아미노산 173-201 및 261-272를 포함한다.
다양한 실시양태에서, 항-알파 독소 항체 또는 알파 독소 올리고머화와 관련된 이의 단편은 서열번호 39 또는 40의 아미노산 서열에 대해 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상의 동일성 또는 100%의 동일성을 갖는 알파 독소 폴리펩티드 또는 이의 항원성 단편에 면역특이적으로 결합한다. 항-알파 독소 항체 또는 단편은 종종 서열번호 39 또는 40의 아미노산 서열에 대해 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성 또는 100%의 동일성을 갖는 알파 독소 폴리펩티드 또는 이의 항원성 단편에 면역특이적으로 결합할 수 있다.
일부 실시양태에서, 항-알파 독소 항체 또는 단편은 종 사이에 보존된 에피토프에 결합할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 항-알파 독소 항체 또는 단편은 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 및 다른 세균 종으로부터의 알파 독소 상동체 또는 오르톨로그, 및 이들의 항원성 단편에 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 항-알파 독소 항체 또는 단편은 하나 이상의 알파 독소 오르톨로그 및/또는 동형체(isoform)에 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, 항-알파 독소 항체 또는 단편은 알파 독소 상동체 또는 오르톨로그를 보유하는 하나 이상의 세균 종으로부터의 알파 독소 및 알파 독소 올리고머화와 관련된 이의 항원성 단편에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-알파 독소 항체 또는 단편은 알파 독소 상동체 및/또는 동형체 및/또는 입체구조적 변이체 및/또는 하위형 전체에 걸쳐 스타필로코커스 또는 다른 밀접하게 관련된 세균 내의 에피토프에 결합할 수 있다.
항원과 항체 사이의 상호작용은 종종 다른 비-공유 단백질-단백질 상호작용과 동일하다. 일반적으로, 4종의 결합 상호작용이 항원과 항체 사이에 존재한다: (i) 수소결합, (ii) 분산력, (iii) 루이스 산과 루이스 염기 사이의 정전기력, 및 (iv) 소수성 상호작용. 소수성 상호작용은 항체-항원 상호작용에 대한 상당한 구동력이고, 분자의 인력보다는 오히려 비-극성 기에 의한 물의 반발을 기초로 한다. 그러나, 일부 물리적 힘, 예를 들면, 상이한 항체 결합 부위를 갖는 에피토프 모양의 맞춤 또는 보완도 항원-항체 결합에 기여한다. 다른 물질 및 항원이 항체와 교차반응하여 이용가능한 자유 항체에 대해 경쟁할 수 있다.
항원과 항체 사이의 친화성 상수 및 결합 특이성의 측정은 항-알파 독소 항체 및 단편을 사용하는 치료, 진단 및 연구 방법의 효능을 확인하는 데 있어서 한 요소이다. "결합 친화성"은 일반적으로 분자(예를 들면, 항체)의 단일 결합 부위와 이의 결합 파트너(예를 들면, 항원) 사이의 비-공유 상호작용의 총 합계의 강도를 지칭한다. 달리 표시되어 있지 않은 한, 본원에서 사용된 "결합 친화성"은 결합쌍의 구성원들(예를 들면, 항체와 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화성을 지칭한다. 분자 X의 그의 파트너 Y에 대한 친화성은 일반적으로 비 koff/kon으로서 계산되는 평형 해리 상수(Kd)로 표시될 수 있다. 친화성은 본원에 기재되고 예시된 방법을 포함하는, 당분야에서 공지된 통상의 방법(예를 들면, 비아코어(BiaCore) 방법)에 의해 측정될 수 있다. 저친화성 항체는 일반적으로 항원에 느리게 결합하고 용이하게 해리되는 경향을 나타내는 반면, 고친화성 항체는 일반적으로 항원에 더 신속히 결합하고 결합된 상태를 더 오래 유지하는 경향을 나타낸다. 결합 친화성을 측정하는 다양한 방법들이 당분야에서 공지되어 있고, 이들 중 임의의 방법이 본 기술의 목적을 위해 이용될 수 있다.
항-알파 독소 항체 또는 단편은 종종 1x10-2 M 이하, 1x10-3 M 이하, 1x10-4 M 이하, 1x10-5 M 이하, 1x10-6 M 이하, 1x10-7 M 이하, 1x10-8 M 이하, 1x10-9 M 이하, 1x10-10 M 이하, 1x10-11 M 이하, 1x10-12 M 이하, 1x10-13 M 이하, 1x10-14 M 이하 또는 1x10-15 M 이하의 해리 상수(Kd)를 특징으로 하는 알파 독소 에피토프에 대한 결합 친화성을 갖는다. 예를 들면, Kd는 1x10-15 M 내지 1x10-2 M, 1x10-14 M 내지 1x10-10 M, 1x10-9 M 내지 1x10-5 M 또는 1x10-4 M 내지 1x10-2 M일 수 있다.
일부 실시양태에서, 항-알파 독소 항체 및 단편은 고친화성 항체이다. "고친화성 항체"는 10-8 M 미만(예를 들면, 10-9 M, 10-10 M 등)의 친화성으로 알파 독소 에피토프에 결합하는 항체를 의미한다.
일부 실시양태에서, 항-알파 독소 항체 또는 단편은 특정 몰농도의 결합 친화성 또는 보다 더 우수한 결합 친화성을 갖는 것으로서 기재된다. 여기서 사용된 "보다 더 우수한"은 보다 더 작은 수치 Kd 값으로 표시된 보다 더 강한 결합을 지칭한다. 예를 들면, "0.6 nM 또는 보다 더 우수한" 항원에 대한 친화성을 갖는 항체의 경우, 상기 항원에 대한 항체의 친화성은 0.6 nM 미만, 즉 0.59 nM, 0.58 nM, 0.57 nM 등, 또는 0.6 nM 미만의 임의의 값이다.
몇몇 실시양태에서, 항-알파 독소 항체 또는 단편의 친화성은 비 kon/koff로서 계산되는 결합 상수(Ka)의 관점에서 기재된다. 이 경우, 본 발명의 항-알파 독소 항체 및 단편은 1x102 M-1 이상, 1x103 M-1 이상, 1x10 M-1 이상, 1x105 M-1 이상, 1x106 M-1 이상, 1x107 M-1 이상, 1x108 M-1 이상, 1x109 M-1 이상 , 1x1010 M-1 이상, 1x1011 M-1 이상, 1x1012 M-1 이상, 1x1013 M-1 이상, 1x1014 M-1 이상 또는 1x1015 M-1 이상의 결합 상수(Ka)를 포함하는 알파 독소 에피토프에 대한 결합 친화성을 갖는다. 예를 들면, Ka는 1x102 M-1 내지 1x107 M-1, 1x107 M-1 내지 1x1010 M-1, 또는 1x1010 M-1 내지 1x1015 M-1일 수 있다.
일부 실시양태에서, 항-알파 독소 항체 또는 단편이 알파 독소 에피토프로부터 해리되는 속도가 적절할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 항-알파 독소 항체 또는 단편은 10-3 s-1 미만, 5x10-3 s-1 미만, 10-4 s-1 미만, 5x10-4 s-1 미만 또는 10-5 s-1 미만의 koff로 알파 독소에 결합할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 항-알파 독소 항체 및 단편이 알파 독소 에피토프와 결합하는 속도가 Kd 또는 Ka의 값보다 더 적절할 수 있다. 이 경우, 본 발명의 항-알파 독소 항체 및 단편은 10-4 M-1s-1 이상, 5x10-4 M-1s-1 이상, 105 M-1s-1 이상, 5x105 M-1s-1 이상, 106 M-1s-1 이상, 5x106 M-1s-1 이상 또는 107 M-1s-1 이상의 kon 속도로 알파 독소에 결합한다.
결합 친화성의 측정은 실시예 단락(실시예 1 참조)에 더 기재된 특정 기법 및 당분야에서 공지된 방법의 이용을 통해 달성될 수 있다. 이러한 방법의 일례는 일련의 적정된 비-표지된 항원의 존재 하에서 Fab를 최소 농도의 (125I)-표지된 항원으로 평형화시킨 후 결합된 항원을 항-Fab 항체-코팅된 플레이트로 포획함으로써 항원에 대한 Fab의 용액 결합 친화성을 측정하는 하기 어세이에 의해 기재된 바와 같이 관심 있는 항체의 Fab 버전 및 이의 항원을 사용하여 수행한 방사성-표지된 항원 결합 어세이(RIA)로 해리 상수 "Kd"를 측정하는 단계를 포함한다. 상기 어세이에 대한 조건을 확립하기 위해, 마이크로타이터 플레이트(다이넥스(Dynex))를 50 mM 탄산나트륨(pH 9.6) 중의 5 ㎍/㎖의 포획 항-Fab 항체(카펠 랩스(Cappel Labs))로 밤새 코팅한 후, 실온(대략 23℃)에서 2시간 내지 5시간 동안 PBS 중의 2%(w/v) 소 혈청 알부민으로 차단한다. 비-흡착 플레이트(넌크(Nunc) #269620)에서, 100 pM 또는 26 pM의 [125I]-항원을 관심 있는 Fab의 연속 희석물과 혼합한다. 그 다음, 관심 있는 Fab를 밤새 항온처리하되, 평형에 도달하게 하기 위해 항온처리를 보다 더 오랜 시간(예를 들면, 65시간) 동안 계속 수행할 수 있다. 그 후, 혼합물을 실온에서 (예를 들면, 1시간 동안) 항온처리하기 위해 포획 플레이트로 옮긴다. 그 다음, 용액을 제거하고 플레이트를 PBS 중의 0.1% 트윈-20으로 8회 세척한다. 플레이트가 건조되면, 150 ㎕/웰의 신틸란트(scintillant)(마이크로신트(MicroScint)-20; 팩카드(Packard))를 첨가하고, 플레이트를 탑카운트(Topcount) 감마 카운터(팩카드) 상에서 10분 동안 카운팅한다. 최대 결합의 20% 이하의 결합을 제공하는 각각의 Fab의 농도를 경쟁 결합 어세이에서 사용하기 위해 선택한다.
또 다른 경우, 예를 들면, 약 10 반응 유닛(RU)의 고정된 항원 CM5 칩과 함께 25℃에서 비아코어™-2000 또는 비아코어™-3000(비아코어 인코포레이티드(BIAcore, Inc.), 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)을 이용하여 수행할 수 있는 표면 플라스몬 공명 어세이를 이용함으로써 Kd 값을 측정할 수 있다. 요약하건대, 이러한 방법의 일례에서, 카복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩(CM5, 비아코어 인코포레이티드)을 공급자의 설명서에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-하이드록시석신이미드(NHS)로 활성화시킨다. 5 ㎕/분의 유속으로 주입하기 전에 110 mM 아세트산나트륨(pH 4.8)을 사용하여 항원을 5 ㎍/㎕(약 0.2 μM)로 희석하여 대략 10 반응 유닛(RU)의 커플링된 단백질을 달성한다. 항원의 주입 후, 1 M 에탄올아민을 주입하여 비-반응된 기를 차단한다. 반응속도 측정을 위해, 0.05% 트윈-20을 갖는 PBS(PBST) 중의 Fab의 2배 연속 희석물(0.78 nM 내지 500 nM)을 25℃에서 대략 25 ㎕/분의 유속으로 주입한다. 결합 및 해리 센서그램을 동시에 피팅함으로써 단순 1-대-1 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델(비아코어 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 이용하여 결합 속도(kon) 및 해리 속도(koff)를 계산한다.
상기 표면 플라스몬 공명 어세이에 의해 측정된 결합-속도가 106 M-1s-1을 초과하는 경우, 예를 들면, 분광계, 예컨대, 정지-유동 장착 분광광도계(아비브 인스트루먼츠(Aviv Instruments)) 또는 교반 적색 큐벳을 갖는 8000-시리즈 SLM-아민코(Aminco) 분광광도계(써모스펙트로닉(ThermoSpectronic))에서 측정되는, 증가하는 농도의 항원의 존재 하에서 PBS(pH 7.2) 중의 20 nM 항-항원 항체(Fab 형태)의 25℃에서의 형광 방사 강도(여기 = 295 nm; 방사 = 340 nm, 16 nm 밴드-통과)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 소광 기법을 이용하여 상기 결합-속도를 측정할 수 있다. 이 기술에 따른 "결합-속도", "결합의 속도", "결합 속도" 또는 "kon"은 전술된 비아코어™-2000 또는 비아코어™-3000(비아코어 인코포레이티드, 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)을 이용하는 전술된 상기 표면 플라스몬 공명 기법에 의해 측정될 수도 있다.
제공된 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 이의 변경된/돌연변이 유도체(하기 논의되어 있음)의 결합 특성의 측정에 적합한 방법 및 시약은 당분야에서 공지되어 있고/있거나 상업적으로 입수가능하다. 이러한 반응속도 분석을 위해 디자인된 장치 및 소프트웨어는 상업적으로 입수가능하다(예를 들면, 비아코어® A100 및 비아코어® 2000 기기; 비아코어 인터네이셔날 아베(Biacore International AB), 스웨덴 업살라 소재).
몇몇 실시양태에서, 결합 어세이는 직접적인 결합 어세이 또는 경쟁 결합 어세이로서 수행될 수 있다. 결합은 표준 ELISA 또는 표준 유세포분석(Flow Cytometry) 어세이의 이용을 통해 검출될 수 있다. 직접적인 결합 어세이에서, 후보 항체는 알파 독소 항원과의 결합에 대해 시험된다. 다른 한편으로, 경쟁 결합 어세이는 공지된 항-알파 독소 항체 또는 단편, 또는 알파 독소에 결합하는 다른 화합물(예를 들면, 수용체, 억제제)과 경쟁하는 후보 항체의 능력을 평가한다. 일반적으로, 검출될 수 있는 항체와 알파 독소의 결합을 허용하는 임의의 방법이 항체의 결합 특성을 검출하고 측정하는 본 기술의 범위 내에 포함된다. 이들 방법들도 원하는 특성을 제공하는 항체에 대해 항체의 패널을 스크리닝하는 데에 이용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 알파 독소에 면역특이적으로 결합하고 하기 (a) 내지 (e)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 특성을 갖는다:
(a) 알파 독소에 대한 약 13 nM 이하의 친화성 상수(KD);
(b) 알파 독소 단량체에 결합하지만, 알파 독소와 알파 독소 수용체의 결합을 억제하지 않는 특성;
(c) 알파 독소 올리고머의 형성을 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상까지 억제하는 특성;
(d) (예를 들면, 세포용해 및 용혈 어세이에 의해 측정되었을 때) 알파 독소 세포용해 활성을 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상까지 감소시키는 특성; 및
(e) (예를 들면, 동물 폐렴 모델에서) 세포 침윤 및 전구염증 사이토카인 방출을 감소시키는 특성.
몇몇 실시양태에서, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 약 0.01 nM 내지 약 50 nM, 0.05 nM, 0.1 nM, 0.5 nM, 1 nM, 5 nM, 10 nM, 20 nM, 30 nM 또는 40 nM 범위 내의 해리 상수(KD)를 특징으로 하는 친화성으로 항원(예를 들면, 알파 독소)에 결합한다.
기능적 특성
일부 실시양태에서, 항-알파 독소 항체 또는 단편은 알파 독소 및/또는 알파 독소 발현 세포의 생물학적 성질을 변경시킨다. 몇몇 실시양태에서, 항-알파 독소 항체 또는 단편은 폴리펩티드에 결합하고 알파 독소 단량체가 경막 공극(예를 들면, 알파 독소 칠량체)으로 조립되는 것을 억제함으로써 알파 독소의 생물학적 활성을 중화시킨다. 중화 어세이는 몇몇 경우 상업적으로 입수가능한 시약을 사용하여 당분야에서 공지된 방법을 이용함으로써 수행될 수 있다. 알파 독소의 중화는 종종 1x10-6 M 이하, 1x10-7 M 이하, 1x10-8 M 이하, 1x10-9 M 이하, 1x10-10 M 이하 또는 1x10-11 M 이하의 IC50으로 측정된다. 일부 실시양태에서, 중화는 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소에 면역특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편이 실시예 3 내지 6에 기재된 농도로 존재하는 경우 일어난다. 일부 실시양태에서, 항-알파 독소 항체 또는 단편은 올리고머화하여 경막 공극을 형성하는 알파 독소의 능력을 중화시킨다. 용어 "억제 농도 50%"("IC50"으로서 약칭됨)는 억제제가 표적화하는 분자의 주어진 활성(예를 들면, 경막 공극 칠량체 복합체를 형성하는 알파 독소 올리고머화)의 50% 억제를 위해 필요한 억제제(예를 들면, 본원에서 제공된 항-알파 독소 항체 또는 단편)의 농도를 나타낸다. 보다 더 낮은 IC50 값은 일반적으로 보다 더 강력한 억제제에 상응한다.
일부 실시양태에서, 항-알파 독소 항체 또는 단편은 알파 독소의 하나 이상의 생물학적 활성을 억제한다. 본원에서 사용된 용어 "억제"는 활성의 전체 차단을 포함하는 생물학적 활성의 임의의 통계적으로 유의한 감소를 지칭한다. 예를 들면, "억제"는 생물학적 활성의 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%의 감소를 지칭할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-알파 독소 항체 또는 단편은 알파 독소의 하나 이상의 생물학적 활성을 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 이상까지 억제한다.
몇몇 실시양태에서, 항-알파 독소 항체 또는 단편은 병원성 스타필로코커스 아우레우스에 의해 분비된 알파 독소를 고갈시킬 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 항-알파 독소 항체 또는 단편은 스타필로코커스 아우레우스에 의해 분비된 알파 독소의 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상 또는 약 100%의 고갈을 달성할 수 있다. 특정 실시양태에서, 실제로 모든 검출가능한 분비된 알파 독소가 스타필로코커스 아우레우스로 감염된 세포로부터 고갈된다.
일부 실시양태에서, 항-알파 독소 항체 또는 단편은 시험관내 자극된 알파 독소 활성(예를 들면, 수용체 결합, 올리고머화) 및/또는 알파 독소를 발현하거나 분비하는 세포의 증식을 억제할 수 있다. 항-알파 독소 항체 또는 단편은 종종 시험관내 알파 독소 활성 및 스타필로코커스 아우레우스 병원성을 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상 또는 약 75% 이상까지 억제한다. 세포 증식, 병원성 및 알파 헤모라이신 활성을 측정하는 방법은 당분야에서 공지되어 있다.
일부 실시양태에서, 항-알파 독소 항체 또는 단편은 스타필로코커스 아우레우스 감염 및/또는 알파 독소 발현 및 기능에 의해 생성된 환경에 직접적으로 또는 간접적으로 반응하는 하나 이상의 유도성 유전자의 발현을 억제할 수 있다. 특정 실시양태에서, 항-알파 독소 항체 또는 단편은 스타필로코커스 아우레우스 감염 및/또는 알파 독소 발현 및 기능에 의해 생성된 환경에 직접적으로 또는 간접적으로 반응하는 하나 이상의 유도성 유전자의 발현을 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 100% 이상, 120% 이상, 140% 이상, 160% 이상, 180% 이상 또는 200% 이상까지 억제한다.
항-알파 독소 항체 및 단편의 생성
예시적 항체 제조 기법이 이하에 기술되어 있다. 항체의 제조에 사용된 알파 독소 항원은 예를 들면, 올리고머화에 관여하는 알파 독소 펩티드 서열의 영역을 포함하는 펩티드 단편일 수 있다. 서열번호 39를 포함하는 천연 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소, 또는 서열번호 40을 포함하는 돌연변이체 알파 독소, 변이체 또는 이의 항원성 단편을 사용하여 알파 독소에 대한 항체를 발생시킬 수 있다. 알파 독소를 발현하고 분비하는 스타필로코커스 아우레우스 세포를 사용하여 항체를 발생시킬 수도 있다. 알파 독소의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열의 예는 예를 들면, 표 10에서 제공된 바와 같이 이용가능하다. 알파 독소는 표준 재조합 DNA 방법의 이용을 통해 세균 또는 진핵세포로부터 단리된 형태로 재조합적으로 제조될 수 있다. 알파 독소는 단리뿐만 아니라 다양한 어세이에서의 확인을 용이하게 하기 위해 태깅된(예를 들면, 에피토프 태그) 또는 다른 융합 단백질(예를 들면, GST 융합체)로서 발현될 수 있다. 다양한 태그 및 융합 서열에 결합하는 항체 또는 결합 단백질은 하기 상술된 바와 같이 이용가능하다. 항체를 발생시키는 데에 유용한 알파 독소의 다른 형태도 사용될 수 있다.
다양한 태그 폴리펩티드들 및 이들의 각각의 항체들은 당분야에서 공지되어 있다. 예로는 폴리-히스티딘(폴리-his) 또는 폴리-히스티딘-글리신(폴리-his-gly) 태그; 플루(flu) HA 태그 폴리펩티드 및 이의 항체 12CA5; c-myc 태그 및 이에 대한 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 및 9E10 항체; 및 단순포진(Herpes Simplex) 바이러스 당단백질 D(gD) 태그 및 이의 항체가 있다. FLAG-펩티드는 항-FLAG M2 단일클론 항체에 의해 인식된다. FLAG 펩티드를 함유하는 단백질의 정제는 아가로스에 공유부착된 항-FLAG M2 단일클론 항체를 포함하는 친화성 매트릭스를 사용하는 면역친화성 크로마토그래피에 의해 수행될 수 있다. 다른 태그 폴리펩티드는 KT3 에피토프 펩티드; α-튜불린(tubulin) 에피토프 펩티드; 및 T7 유전자 10 단백질 펩티드 태그를 포함한다.
관심 있는 항원에 대한 다중클론 항체는 당분야에서 공지된 다양한 절차에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, 알파 독소 폴리펩티드 또는 이의 면역원성 단편을 다양한 숙주 동물(토끼, 마우스, 래트 등을 포함하나 이들로 한정되지 않음)에게 투여하여 상기 항원에 대해 특이적인 다중클론 항체를 함유하는 혈청의 생성을 유도할 수 있다. 다양한 항원보강제(adjuvant)가 숙주 종에 따라 면역학적 반응을 증가시키는 데에 사용될 수 있고, 프로인트(완전 및 불완전) 항원보강제, 미네랄 겔, 예컨대, 수산화알루미늄, 표면 활성 물질, 예컨대, 리소레시틴(lysolecithin), 플루로닉(pluronic) 폴리올, 다가음이온(polyanion), 펩티드, 오일 유화액, 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin), 디니트로페놀 및 잠재적으로 유용한 인간 항원보강제, 예컨대, BCG(바실 칼메테-구에린(bacille Calmette-Guerin)) 및 코리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum)을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 이러한 항원보강제들도 당분야에서 공지되어 있다.
다중클론 항체는 관련 항원 및 항원보강제의 다회 피하(sc) 또는 복강내(ip) 주사에 의해 동물에서 증가될 수 있다. 관련 항원(특히, 합성 펩티드가 사용되는 경우)을, 면역화될 종에서 면역원성을 나타내는 단백질에 접합시키는 것이 유용할 수 있다. 예를 들면, 이작용성 또는 유도체화 물질(반응성 기), 예컨대, 활성화된 에스테르(시스테인 또는 라이신 잔기를 통한 접합), 글루타르알데하이드, 석신산 무수물, SOCl2 또는 R1N=C=NR(이때, R 및 R1은 상이한 알킬 기임)을 사용하여 항원을 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), 혈청 알부민, 소 티로글로불린 또는 대두 트립신 억제제에 접합시킬 수 있다. 접합체는 재조합 세포 배양물에서 융합 단백질로서 만들어질 수도 있다.
전형적으로, 적절한 농도의 항원 또는 접합체를 항원보강제와 조합하고 용액을 다수의 부위에서 주사함으로써 항원, 면역원성 접합체 또는 유도체에 대해 동물을 면역화시킨다. 면역화는 실시예 1(면역화/하이브리도마 발생)에 기재된 바와 같이 수행될 수도 있다.
하이브리도마의 사용, 재조합 및 파지 디스플레이 기술 또는 이들의 병용을 포함하는, 당분야에서 공지된 매우 다양한 기법들을 이용하여 단일클론 항체를 제조할 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "단일클론 항체"는 실질적으로 균질한 또는 단리된 항체들의 집단(예를 들면, 상기 집단을 구성하는 개별 항체들은 소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생 돌연변이를 제외하고 동일함)으로부터 수득된 항체를 지칭한다. 단일클론 항체는 고도로 특이적이고, 단일 항원성 부위, 또는 다중특이적 조작된 항체의 경우 다수의 항원성 부위들에 대해 유도된다. 더욱이, 상이한 결정인자들(에피토프들)에 대해 유도된 상이한 항체들을 포함하는 다중클론 항체 제제와 대조적으로, 각각의 단일클론 항체는 항원 상의 동일한 결정인자에 대해 유도된다. 단일클론 항체는 그들의 특이성 이외에 그들이 다른 항체에 의해 오염되지 않은 상태로 합성될 수 있다는 점에서 유리하다. 수식어 "단일클론"은 임의의 특정 방법에 의한 항체의 제조를 필요로 하는 것으로서 해석되어서는 안 된다. 하기 설명은 한정하기 위한 것이 아닌 단일 클론 항체의 대표적인 제조 방법들의 설명이고, 이 방법들은 단일클론 포유동물 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 도메인 항체, 디아바디, 백시바디(vaccibody), 선형 항체 및 다중특이적 항체를 제조하는 데에 이용될 수 있다.
하이브리도마 기술을 이용하여 특정 항체를 제조하고 스크리닝하는 방법은 당분야에서 관용적으로 이용되고 공지되어 있다. 하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물, 예컨대, 햄스터를 전술된 바와 같이 면역화시켜, 면역화에 사용된 항원에 특이적으로 결합할 항체를 생성하거나 생성할 수 있는 림프구를 이끌어낸다. 대안적으로, 림프구를 시험관내에서 면역화시킬 수 있다. 면역화 후, 림프구를 단리한 다음, 적절한 융합 물질 또는 융합 파트너, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 골수종 세포주와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성한다. 일부 실시양태에서, 선별된 골수종 세포는 효율적으로 융합되고 선별된 항체 생성 세포에 의한 항체의 안정한 고수준 생성을 뒷받침하고 비-융합된 모 세포에 대해 선별하는 선별 배지에 대해 민감성을 나타내는 골수종 세포이다. 한 양태에서, 골수종 세포주는 뮤린 골수종 세포주, 예컨대, 살크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터(Salk Institute Cell Distribution Center)(미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)로부터 입수가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양으로부터 유래된 골수종 세포주, 및 SP-2 및 유도체, 예를 들면, 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)(미국 메릴랜드주 록빌 소재)으로부터 입수가능한 X63-Ag8-653 세포이다. 인간 단일클론 항체의 제조를 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주도 기재되어 있다.
일단 원하는 특이성, 친화성 및/또는 활성을 갖는 항체를 생성하는 하이브리도마 세포가 확인되면, 클론을 제한 희석 절차로 서브클로닝할 수 있고 표준 방법으로 생장시킬 수 있다. 이 목적에 적합한 배양 배지는 예를 들면, D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 추가로, 하이브리도마 세포는 예를 들면, 마우스 내로의 세포의 복강내 주사에 의해 동물에서 복수 종양으로서 생체내에서 생장될 수 있다.
서브클론에 의해 분비된 단일클론 항체는 통상적인 항체 정제 절차, 예컨대, (예를 들면, 단백질 A 또는 단백질 G-세파로스를 사용하는) 친화성 크로마토그래피 또는 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 태그, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 등에 의해 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 적절하게 분리된다. 예시적 정제 방법은 더 상세히 후술되어 있다.
재조합 DNA 기법
재조합 DNA 기술을 이용하여 특정 항체를 제조하고 스크리닝하는 방법은 당분야에서 관용적으로 이용되고 공지되어 있다. 통상적인 절차를 이용하여(예를 들면, 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 단일클론 항체를 코딩하는 DNA를 용이하게 단리할 수 있고/있거나 서열분석할 수 있다. 일단 단리되면, DNA를 발현 벡터 내에 배치할 수 있고, 그 후 상기 발현 벡터를, 항체 단백질을 달리 생성하지 않는 숙주 세포, 예컨대, 이. 콜라이(E. coli) 세포, 원숭이 COS 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 골수종 세포 내로 형질감염시켜 재조합 숙주 세포에서 단일클론 항체의 합성을 수득한다. 항체의 파지 디스플레이 및 인간화에 의해 발생된 항체에 대해 후술된 바와 같이, 하이브리도마 이외의 공급원(들)으로부터 재조합 항체에 대한 DNA 또는 유전 물질을 수득하여 항-알파 독소 항체 또는 단편을 발생시킬 수 있다.
항체 또는 이의 변이체의 재조합 발현은 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터의 구축을 종종 필요로 한다. 본원은 항체 분자, 항체의 중쇄 또는 경쇄, 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인 또는 이의 부분, 또는 중쇄 또는 경쇄 CDR을 코딩하는, 프로모터에 작동가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 복제가능한 벡터를 제공한다. 이러한 벡터는 항체 분자의 불변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고, 상기 항체의 가변 도메인은 전체 중쇄, 전체 경쇄, 또는 전체 중쇄 및 경쇄 둘다의 발현을 위해 이러한 벡터 내로 클로닝될 수 있다.
일단 발현 벡터가 통상적인 기법에 의해 숙주 세포로 전달되면, 형질감염된 세포는 통상적인 기법에 의해 배양되어 항체를 생성한다. 따라서, 본원은 제공된 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 이들의 단편, 또는 이들의 중쇄 또는 경쇄, 또는 이들의 부분, 또는 본원의 단일 쇄 항체를 코딩하는, 이종 프로모터에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 숙주 세포를 제공한다. 이중 쇄 항체의 발현에 대한 일부 실시양태에서, 상세히 후술된 바와 같이, 중쇄 및 경쇄 둘다를 코딩하는 벡터가 전체 면역글로불린 분자의 발현을 위해 숙주 세포 내에서 함께 발현될 수 있다.
재조합 항체의 발현을 위한 숙주로서 이용가능한 포유동물 세포주는 당분야에서 공지되어 있고, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, HeLa 세포, 새끼 햄스터 신장(BHK) 세포, 원숭이 신장 세포(COS), 인간 간세포암종 세포(예를 들면, Hep G2), 인간 상피 신장 293 세포 및 다수의 다른 세포주를 포함하나 이들로 한정되지 않는, 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)으로부터 입수가능한 많은 불멸화된 세포주를 포함한다. 상이한 숙주 세포들은 번역 후 프로세싱, 및 단백질 및 유전자 생성물의 변경을 위한 특징적이고 특이적인 기작을 갖는다. 발현된 항체 또는 이의 부분의 정확한 변경 및 프로세싱을 보장하도록 적절한 세포주 또는 숙주 시스템이 선택될 수 있다. 이를 위해, 일차 전사체의 적절한 프로세싱, 글리코실화 및 유전자 생성물의 인산화를 위한 세포 기구(machinery)를 보유하는 진핵 숙주 세포가 사용될 수 있다. 이러한 포유동물 숙주 세포는 CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT2O 및 T47D, NS0(임의의 기능성 면역글로불린 쇄를 내재적으로 생성하지 않는 뮤린 골수종 세포주), SP20, CRL7O3O 및 HsS78Bst 세포를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 인간 림프구의 불멸화에 의해 발생된 인간 세포주는 단일클론 항체를 재조합적으로 제조하는 데에 사용될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 인간 세포주 PER.C6.(크루셀(Crucell), 네덜란드 소재)이 단일클론 항체를 재조합적으로 제조하는 데에 사용될 수 있다.
재조합 항체의 발현을 위한 숙주로서 사용될 수 있는 추가 세포주는 곤충 세포(예를 들면, Sf21/Sf9, 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni) Bti-Tn5b1-4) 또는 효모 세포(예를 들면, 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae), 피키아(Pichia), 미국 특허 제7326681호 등), 식물 세포(미국 특허출원 공개 제20080066200호) 및 닭 세포를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 항체는 항체의 안정한 발현을 갖는 세포주에서 발현된다. 안정한 발현은 재조합 단백질의 장기간 고수율 제조에 이용될 수 있다. 예를 들면, 항체 분자를 안정하게 발현하는 세포주가 발생될 수 있다. 숙주 세포는 발현 조절 요소(예를 들면, 프로모터, 인핸서(enhancer), 전사 종결부위, 폴리아데닐화 부위 등) 및 선별 마커 유전자를 포함하는 적절하게 조작된 벡터로 형질전환될 수 있다. 외래 DNA 도입 후, 세포를 강화(enriched) 배지에서 1일 내지 2일 동안 생장시킬 수 있고, 그 후 선별 배지로 바꿀 수 있다. 재조합 플라스미드의 선별 마커는 선별에 대한 내성을 부여하고 상기 플라스미드를 그들의 염색체 내로 안정하게 삽입한 세포가 생장하여 군집(foci)을 형성하게 하고, 상기 군집은 클로닝될 수 있고 세포주로 증폭될 수 있다. 고수율로 안정한 세포주를 제조하는 방법은 당분야에서 공지되어 있고 시약은 일반적으로 상업적으로 입수가능하다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 항체는 항체의 일시적 발현을 갖는 세포주에서 발현된다. 일시적 형질감염은 세포 내로 도입된 핵산이 상기 세포의 게놈 또는 염색체 DNA 내로 삽입되지 않는 과정이다. 핵산은 종종 세포 내에서 염색체외 요소, 예를 들면, 에피좀(episome)으로서 유지된다. 에피좀의 핵산의 전사 과정은 영향받지 않고 에피좀의 핵산에 의해 코딩된 단백질이 생성된다.
안정하게 또는 일시적으로 형질감염될 수 있는 세포주는 단일클론 항체의 발현 및 생성을 야기하는, 당분야에서 공지된 세포 배양 배지 및 조건에서 유지된다. 일부 실시양태에서, 포유동물 세포 배양 배지는 예를 들면, DMEM 또는 햄스(Ham's) F12를 포함하는 상업적으로 입수가능한 배지 제제를 기초로 한다. 몇몇 실시양태에서, 세포 배양 배지는 세포 생장 및 생물학적 단백질 발현 둘다의 증가를 뒷받침하도록 변경된다. 본원에서 사용된 용어 "세포 배양 배지", "배양 배지" 및 "배지 제제"는 다세포 유기체 또는 조직 외부의 인공 시험관내 환경에서 세포를 유지하거나, 생장시키거나, 증식시키거나 증폭하기 위한 영양 용액을 지칭한다. 세포 배양 배지는 특정 세포 배양 용도를 위해 최적화될 수 있다(예를 들면, 세포 생장을 촉진하도록 제제화된 세포 배양 성장 배지, 또는 재조합 단백질 생성을 촉진하도록 제제화된 세포 배양 생성 배지를 포함함). 용어 "영양분", "구성요소" 및 "성분"은 세포 배양 배지를 구성하는 구성성분을 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
다양한 실시양태에서, 유가(fed batch) 방법을 이용하여 세포주를 유지한다. 본원에서 사용된 "유가 방법"은 먼저 기초 배지와 함께 항온처리한 후 추가 영양분을 유가 세포 배양에 공급하는 방법을 지칭한다. 예를 들면, 유가 방법은 주어진 기간 이내에 정해진 공급 일정에 따라 보충 배지를 추가하는 단계를 포함할 수 있다. 따라서, "유가 세포 배양"은 세포, 전형적으로 포유동물 세포 및 배양 배지를 먼저 배양 용기에 공급하고 배양의 종결 전에 주기적으로 세포 및/또는 생성물을 수거하거나 수거하지 않으면서 추가 배양 영양분을 배양 동안 배양물에 연속적으로 공급하거나 불연속적으로 증가시키면서 공급하는 세포 배양을 지칭한다.
사용된 세포 배양 배지 및 이 배지 내에 함유된 영양분은 당분야에서 공지되어 있다. 몇몇 실시양태에서, 세포 배양 배지는 기초 배지 및 하나 이상의 가수분해물, 예를 들면, 콩-기제 가수분해물, 효모-기제 가수분해, 또는 변경된 기초 배지를 발생시키는 2종의 가수분해물들의 조합물을 포함한다. 추가 영양분은 종종 기초 배지, 예컨대, 농축된 기초 배지만을 포함할 수 있거나, 가수분해물 또는 농축된 가수분해물만을 포함할 수 있다. 적합한 기초 배지는 둘베코 변경 이글 배지(DMEM), DME/F12, 최소 필수 배지(MEM), 기초 배지 이글(BME), RPMI 1640, F-10, F-12, α-최소 필수 배지(α-MEM), 글라스고우(Glasgow's) 최소 필수 배지(G-MEM), PF CHO(예를 들면, CHO 단백질 무함유 배지(시그마(Sigma)) 또는 CHO 세포 단백질 무함유를 위한 EX-CELL™ 325 PF CHO 혈청 무함유 배지(SAFC 바이오사이언시스(Bioscience)), 및 이스코브(Iscove's) 변경 둘베코 배지를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 본원의 기술에서 사용될 수 있는 기초 배지의 다른 예로는 BME 기초 배지 및 둘베코 변경 이글 배지(DMEM, 분말)(깁코-인비트로겐(Gibco-Invitrogen), # 31600)가 있다. 일부 실시양태에서, 기초 배지는 배지가 혈청(예를 들면, 태아 소 혈청(FBS), 말 혈청, 염소 혈청, 또는 당분야에서 공지된 임의의 다른 동물 유래의 혈청)을 함유하지 않는다는 것을 의미하는 혈청 무함유 배지, 동물 단백질 무함유 배지 또는 화학적으로 정의된 배지일 수 있다.
기초 배지는 표준 기초 배지에서 발견되는 일부 비-영양 성분, 예컨대, 다양한 무기 완충제 및 유기 완충제, 계면활성제(들) 및 염화나트륨을 제거하도록 변경될 수 있다. 기초 세포 배지로부터 이러한 성분들을 제거하는 것은 남은 영양 성분들의 증가된 농축을 가능하게 하고 전체 세포 생장 및 단백질 발현을 개선할 수 있다. 또한, 누락된 성분이 세포 배양 조건의 요건에 따라 변경된 기초 세포 배지를 함유하는 세포 배양 배지에 다시 첨가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 변경된 기초 세포 배지, 및 하기 영양분들 중 하나 이상의 영양분을 함유할 수 있다: 철 공급원; 재조합 성장인자; 완충제; 계면활성제; 오스몰농도(osmolarity) 조절제; 에너지 공급원; 및 비-동물 가수분해물. 추가로, 변경된 기초 세포 배지는 임의적으로 아미노산, 비타민, 또는 아미노산과 비타민의 조합물을 함유할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 변경된 기초 세포 배지는 글루타민, 예를 들면, L-글루타민 및/또는 메토트렉세이트를 추가로 함유한다.
몇몇 실시양태에서, 항체 제조는 당분야에서 공지된 유가, 회분, 관류 또는 연속 공급 생물반응기 방법을 이용하는 생물반응기 공정에 의해 대량으로 수행된다. 대규모 생물반응기는 1000 ℓ 이상의 용량, 종종 약 1,000 내지 100,000 ℓ의 용량을 갖는다. 이들 생물반응기는 산소 및 영양분을 분포시키기 위해 교반기 임펠러를 이용할 수 있다. 소규모 생물반응기는 일반적으로 부피 용량이 대략 100 ℓ를 초과하지 않는 세포 배양을 지칭하고 약 1 ℓ 내지 약 100 ℓ일 수 있다. 대안적으로, 단회 사용 생물반응기(SUB)가 대규모 또는 소규모 배양을 위해 이용될 수 있다.
온도, pH, 교반, 통기 및 접종물 밀도는 사용된 숙주 세포 및 발현될 재조합 단백질에 따라 상이할 수 있다. 예를 들면, 재조합 단백질 세포 배양은 30℃ 내지 45℃의 온도에서 유지될 수 있다. 배양 배지의 pH는 pH가 최적 수준(일부 숙주 세포들의 경우 6.0 내지 8.0의 pH 범위 내에 있을 수 있음)에서 유지되도록 배양 과정 동안 모니터링될 수 있다. 임펠러에 의해 구동된 혼합은 이러한 배양 방법에 있어서 교반을 위해 이용될 수 있다. 임펠러의 회전 속도는 대략 50 cm/초 내지 200 cm/초 선단(tip) 속도일 수 있으나, 배양되는 숙주 세포의 종류에 따라 당분야에서 공지된 다른 공수(airlift) 또는 다른 혼합/통기 시스템이 이용될 수 있다. 배양되는 선택된 숙주 세포에 따라 배양물 중의 대략 20% 내지 80% 공기 포화도의 용해된 산소 농도를 유지하기 위해 충분한 통기가 제공된다. 대안적으로, 생물반응기는 공기 또는 산소를 배양 배지 내로 직접적으로 살포할 수 있다. 중공 섬유막 통기장치(aerator)를 이용하는 기포 무함유 통기 시스템을 포함하는 다른 산소 공급 방법이 존재한다.
파지 디스플레이 기법
몇몇 실시양태에서, 단일클론 항체 또는 항체 단편은 당분야에서 공지된 기법을 이용하여 발생시킨 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 이러한 방법에서, 항-알파 독소 항체 또는 단편은 인간 림프구로부터 유래된 mRNA로부터 제조된 인간 VL 및 VH cDNA를 사용하여 제조한 재조합 조합 항체 라이브러리(종종 scFv 파지 디스플레이 라이브러리)의 스크리닝에 의해 단리될 수 있다. 이러한 라이브러리를 제조하고 스크리닝하는 방법은 당분야에서 공지되어 있다.
항체 정제 및 단리
일단 항체 분자가 재조합 또는 하이브리도마 발현에 의해 제조되면, 면역글로불린 분자의 정제를 위한 당분야에서 공지된 임의의 방법, 예를 들면, 크로마토그래피(예를 들면, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 특히 특정 항원 단백질 A 또는 단백질 G에 대한 친화성 크로마토그래피 및 사이징(sizing) 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 상이한 가용성, 또는 임의의 다른 표준 단백질 정제 기법에 의해 정제될 수 있다. 또한, 본 기술의 항체 또는 이의 단편은 정제를 용이하게 하기 위해 전술된 또는 당분야에서 공지된 이종 폴리펩티드 서열(본원에서 "태그"로서 지칭됨)에 융합될 수 있다.
인간화된 항체
일부 실시양태에서, 본 기술의 항체는 당분야에서 공지된 방법을 이용하여 발생시킨 인간화된 항체이다. 인간화된 항체는 키메라 항체일 수 있다. 키메라 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 부분이 특정 종으로부터 유래된 항체 또는 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 이 서열에 대해 상동성을 나타내는 반면, 상기 쇄(들)의 또 다른 부분이 또 다른 종으로부터 유래된 항체 또는 또 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 이 서열에 대해 상동성을 나타내는 항체일뿐만 아니라, 원하는 생물학적 활성을 나타내는 이러한 항체의 단편이기도 하다. 본원에서 관심 있는 키메라 항체는 비-인간 영장류(예를 들면, 구세계 원숭이, 예컨대, 개코 원숭이, 붉은털 원숭이 또는 사이노몰거스 원숭이)로부터 유래된 가변 도메인 항원 결합 서열 및 인간 불변 영역 서열을 포함하는 "영장류화된" 항체를 포함한다.
인간 항체
인간화에 대한 대안으로서, 당분야에서 공지된 방법을 이용하여 인간 항체를 발생시킬 수 있다. 인간 항체는 뮤린 또는 래트 가변 영역 및/또는 불변 영역을 보유하는 항체와 관련된 문제점들 중 일부를 피한다. 이러한 뮤린 또는 래트 유래의 단백질의 존재는 항체의 신속한 제거를 초래할 수 있거나 환자에 의한 항체에 대한 면역 반응의 발생을 초래할 수 있다. 뮤린 또는 래트 유래의 항체의 사용을 피하기 위해, 설치류, 다른 포유동물 또는 동물이 전체 인간 항체를 생성하도록 기능성 인간 항체 좌위를 설치류, 다른 포유동물 또는 동물 내로 도입함으로써 전체 인간 항체를 발생시킬 수 있다.
면역화 시 내인성 면역글로불린 생성의 부재 하에서 인간 항체의 전체 레파토리를 생성할 수 있는 형질전환 동물(예를 들면, 마우스)을 제조하는 것이 현재 가능하다. 예를 들면, 키메라 및 생식세포주 돌연변이체 마우스에서 항체 중쇄 연결 영역(JH) 유전자의 동형접합 결실이 내인성 항체 생성을 완전히 억제한다고 기재되어 있다. 이러한 생식세포주 돌연변이체 마우스 내로의 인간 생식세포주 면역글로불린 유전자 어레이의 전달은 항원 챌린지 시 인간 항체를 생성할 것이다. 실제로, 인간 중쇄 좌위 및 카파 경쇄 좌위의 1000 kb 이하 크기의 생식세포주 배열(configured) 단편을 함유하도록 조작된 제노마우스(XenoMouse)® 마우스 균주의 사용은 인간 항체를 생성한다. 제노마우스® 균주는 암젠 인코포레이티드(Amgen, Inc.)(미국 캘리포니아주 프레몬트 소재)로부터 입수가능하다.
제노마우스® 마우스 균주의 제조 및 이들 마우스에서 제조된 항체는 당분야에서 공지되어 있다. 본질적으로, 제노마우스® 계통의 마우스를 관심 있는 항원(예를 들면, 알파 독소)으로 면역화시키고, 림프 세포(예컨대, B 세포)를 과다면역화된 마우스로부터 회수하고, 당분야에서 공지된 상기 기법들을 이용하여 회수된 림프구를 골수형 세포주와 융합시켜 불멸 하이브리도마 세포주를 제조한다. 이들 하이브리도마 세포주를 스크리닝하고 선별하여 관심 있는 항원에 대해 특이적인 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주를 확인한다.
대안적 방법인 미니좌위(minilocus) 방법에서, 외인성 Ig 좌위는 Ig 좌위로부터의 조각(개별 유전자)의 포함을 통해 모방된다. 따라서, 하나 이상의 VH 유전자, 하나 이상의 DH 유전자, 하나 이상의 JH 유전자, mu 불변 영역 및 통상적으로 제2 불변 영역(예를 들면, 감마 불변 영역)이 동물 내로 삽입될 구축물로 형성된다.
미세세포 융합을 통해 염색체의 큰 조각 또는 전체 염색체가 도입되어 있는 마우스로부터 인간 항체를 발생시키는 것은 당분야에서 공지되어 있다. 추가로, 기린(Kirin)의 Tc 마우스와 메다렉스(Medarex)의 미니좌위(Humab) 마우스의 교배육종의 결과인 KM™-마우스가 발생되었다. 이들 마우스는 기린 마우스의 인간 IgH 트랜스염색체 및 젠팜(Genpharm) 마우스의 카파 쇄 트랜스유전자를 보유한다.
인간 항체는 시험관내 방법에 의해 유도될 수도 있다. 적합한 예는 파지 디스플레이(메디뮨(MedImmune)(이전 명칭 CAT)), 모포시스(Morphosys), 다이액스(Dyax), 바이오사이트(Biosite)/메다렉스, 조마(Xoma), 심포겐(Symphogen), 알렉시온(Alexion)(이전 명칭 프롤리페론(Proliferon)), 아피메드(Affimed), 리보좀 디스플레이(메디뮨(이전 명칭 CAT)), 효모 디스플레이 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 파지 디스플레이 기술을 이용하여 비-면역화된 공여자로부터의 면역글로불린 가변(V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 인간 항체 및 항체 단편을 시험관내에서 생성할 수 있다. 이 기법에 따라, 항체 V 도메인 유전자는 사상(filamentous) 박테리오파지, 예컨대, M13 또는 fd의 주(major) 또는 부(minor) 코트 단백질 유전자 내로 인-프레임(in-frame)으로 클로닝되고, 파지 입자의 표면 상에서 기능성 항체 단편으로서 디스플레이된다. 사상 입자가 파지 게놈의 단일 가닥 DNA 카피를 함유하기 때문에, 항체의 기능적 성질을 기초로 한 선별은 이들 성질을 나타내는 항체를 코딩하는 유전자의 선별이라는 결과도 제공한다. 따라서, 파지는 B 세포의 성질의 일부를 모방한다. 파지 디스플레이는 다양한 형식으로 수행될 수 있다. V 유전자 절편의 여러 공급원이 파지 디스플레이를 위해 사용될 수 있다. 다양한 어레이의 항-옥사졸론 항체들이 면역화된 마우스의 비장으로부터 유래된 V 유전자의 작은 무작위 조합 라이브러리로부터 단리되었다. 비-면역화된 인간 공여자로부터의 V 유전자의 레퍼토리가 구축될 수 있고, 다양한 어레이의 항원들(자가 항원을 포함함)에 대한 항체들이 본질적으로 당분야에서 공지된 기법에 따라 단리될 수 있다. 상기 논의된 바와 같이, 인간 항체는 시험관내 활성화된 B 세포에 의해 발생될 수도 있다.
면역글로불린 유전자는 면역 반응의 성숙 동안 V, D 및 J 유전자 절편 사이의 재조합, 동종형 전환 및 가변 영역 내의 과다돌연변이를 포함하는 다양한 변경을 겪는다. 재조합 및 체세포 과다돌연변이는 항체 다양성의 발생 및 친화 성숙을 위한 토대이지만, 이들은 이러한 면역글로불린을 치료제로서 상업적으로 제조하는 것을 어렵게 만들 수 있거나 항체의 면역원성 위험을 증가시킬 수 있는 서열 불안정성을 발생시킬 수도 있다. 일반적으로, CDR 영역 내의 돌연변이는 개선된 친화성 및 기능에 기여할 것이지만, 골격 영역 내의 돌연변이는 면역원성의 위험을 증가시킬 수 있다. 이 위험은 항체의 활성이 불리하게 영향받지 않도록 보장하면서 골격 돌연변이를 생식세포주 상태로 복귀시킴으로써 감소될 수 있다. 또한, 다양화 과정은 약간의 구조적 불안정성을 발생시킬 수 있거나, 이들 구조적 불안정성은 중쇄 및 경쇄 가변 도메인에 기여하는 생식세포주 서열 내에 존재할 수 있다. 공급원과 관계없이, 생성물의 불안정성, 응집 및 불균질성을 초래할 수 있거나 면역원성을 증가시킬 수 있는 잠재적 구조적 불안정성을 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 바람직하지 않은 불안정성의 예로는 쌍을 이루지 않은 시스테인(이황화 결합 스크램블링(scrambling) 또는 가변 설프하이드릴 부가물 형성을 초래할 수 있음), N-연결된 글리코실화 부위(구조 및 활성의 불균질성을 초래함), 탈아미드화(예를 들면, NG, NS), 이성질체화(DG), 산화(노출된 메티오닌), 및 가수분해(DP) 부위가 있다.
따라서, 면역원성의 위험을 감소시키고 실시예 11의 표 1 내지 8에 개시된 항체의 약학적 성질을 개선하기 위해, 골격 서열을 생식세포주 상태로 복귀시키고/시키거나, CDR을 생식세포주 상태로 복귀시키고/시키거나 구조적 불안정성을 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 몇몇 실시양태에서, 특정 항체가 아미노산 수준에서 그의 각각의 생식세포주 서열과 상이한 경우, 항체 서열은 생식세포주 서열로 역돌연변이될 수 있다. 이러한 보정 돌연변이는 표준 분자생물학적 기법의 이용을 통해 1개, 2개 또는 3개 이상의 위치, 또는 임의의 돌연변이된 위치들의 조합에서 일어날 수 있다.
추가 방법은 벨록이뮨(VelocImmune)® 기술(리제네론 파마슈티칼스(Regeneron Pharmaceuticals))을 포함한다. 벨록이뮨® 기술은 관심 있는 치료 표적에 대한 전체 인간 단일클론 항체를 발생시키는 데에 이용될 수 있고, 마우스가 항원 자극에 반응하여 인간 가변 영역 및 마우스 불변 영역을 포함하는 항체를 생성하도록 내인성 마우스 불변 영역 좌위에 작동가능하게 연결된 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 게놈을 갖는 형질전환 마우스를 발생시키는 단계를 포함한다. 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 DNA는 단리되고 인간 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된다. 그 다음, 상기 DNA는 전체 인간 항체를 발현할 수 있는 세포에서 발현된다. 예를 들면, 미국 특허 제6,596,541호를 참조한다.
항체 단편
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 항체 단편 또는 이들 단편을 포함하는 항체이다. 항체 단편은 일반적으로 전장 항체의 항원 결합 또는 가변 영역인, 전장 항체의 부분을 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2, Fd 및 Fv 단편이 있다. 디아바디, 선형 항체, 단일 쇄 항체 분자, 및 다중특이적 항체는 이들 항체 단편들로부터 형성된 항체이다.
전통적으로, 이들 단편들은 당분야에서 공지된 기법을 이용한 온전한 항체의 단백질분해성 절단을 통해 유도된다. 그러나, 이들 단편들은 현재 재조합 숙주 세포에 의해 직접적으로 제조될 수 있다. Fab, Fv 및 scFv 항체 단편은 모두 이. 콜라이에서 발현될 수 있고 이. 콜라이로부터 분비될 수 있으므로, 이들 단편들의 용이한 대량 제조가 가능하다. 몇몇 실시양태에서, 항체 단편은 상기 논의된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 대안적으로, Fab'-SH 단편도 이. 콜라이로부터 직접적으로 회수될 수 있고 화학적으로 커플링되어 F(ab')2 단편을 형성할 수 있다. 또 다른 방법에 따라, F(ab')2 단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접적으로 단리될 수 있다. 항체 단편의 다른 제조 기법이 공지되어 있다. 몇몇 실시양태에서, 선택된 항체는 단일 쇄 Fv 단편(scFv)이다. 일부 실시양태에서, 항체는 Fab 단편이 아니다. Fv 및 scFv는 온전한 조합 부위를 갖되 불변 영역을 결여하는 유일한 종이므로, 이들은 생체내 사용 동안 감소된 비-특이적 결합에 적합하다. scFv 융합 단백질은 scFv의 아미노 또는 카복시 말단에서 이펙터 단백질의 융합을 일으키도록 구축될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 도메인 항체, 예를 들면, 인간 항체의 중쇄(VH) 또는 경쇄(VL)의 가변 영역에 상응하는, 항체의 작은 기능성 결합 유닛을 함유하는 항체이다. 도메인 항체의 예로는 치료 표적에 대해 특이적인, 도만티스(Domantis)로부터 입수가능한 도메인 항체가 있으나 이것으로 한정되지 않는다. 도메인 항체의 상업적으로 입수가능한 라이브러리는 항-알파 독소 도메인 항체를 확인하는 데에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-알파 독소 항체 및 단편은 알파 독소 기능성 결합 유닛 및 Fc 감마 수용체 기능성 결합 유닛을 포함한다.
본원의 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 선형 항체이다. 선형 항체는 한 쌍의 항원 결합 영역을 형성하는 한 쌍의 직렬(tandem) Fd 절편(VH-CH1-VH-CH1)을 포함한다. 선형 항체는 이중특이적일 수 있거나 단일특이적일 수 있다.
일부 아미노산 서열 변경
전술된 인간 항체, 인간화된 항체 및/또는 키메라 항체 이외에, 본 발명의 기술은 하기 변경들 중 하나 이상의 변경을 포함하는 항-알파 독소 항체 또는 단편의 추가 변경물, 및 이들의 변이체 및 이들의 단편도 포괄한다: 가변 경쇄(VL) 도메인 및/또는 가변 중쇄(VH) 도메인 및/또는 Fc 영역에서의 아미노산 잔기 및/또는 폴리펩티드 치환, 추가 및/또는 결실, 및 번역 후 변경. 항체가 모이어티에 공유부착되어 있는 항체 접합체가 이들 변경물에 포함된다. 항체에 부착되기에 적합한 모이어티는 단백질, 펩티드, 약물, 표지 및 세포독소를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 항체에 대한 이들 변화는 스타필로코커스 아우레우스 관련 질환 및/또는 알파 독소 매개 질환의 치료 및/또는 진단에 적절한 경우 항체의 특성(예를 들면, 생화학적 특성, 결합 특성 및/또는 기능적 특성)을 변경시키거나 섬세하게 조정하도록 만들어질 수 있다. 접합체를 형성하는 방법 및 아미노산 및/또는 폴리펩티드 변화 및 번역 후 변경을 만드는 방법은 당분야에서 공지되어 있고, 이들 중 일부는 상세히 후술되어 있다. 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 최종 구축물에 도달하기 위해 만들어질 수 있되, 최종 구축물은 원하는 특성을 보유해야 한다.
항체에 대한 아미노산 변화는 본원에 기재된 항체 서열 또는 모 항체 서열과 100% 미만으로 동일한 서열을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 이와 관련하여 항체는 본원에 기재된 항-알파 독소 항체 또는 단편의 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열에 대해 약 25% 내지 약 95%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 따라서, 몇몇 실시양태에서, 변경된 항체는 본원에 기재된 항-알파 독소 항체 또는 단편의 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열에 대해 25%, 35%, 45%, 55%, 65%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상의 아미노산 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 변경된 항체는 본원에 기재된 항-알파 독소 항체 또는 단편의 중쇄 또는 경쇄 CDR1, CDR2 또는 CDR3의 아미노산 서열에 대해 25%, 35%, 45%, 55%, 65%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상의 아미노산 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 변경된 항체는 본원에 기재된 항-알파 독소 항체 또는 단편의 중쇄 또는 경쇄 FR1, FR2, FR3 또는 FR4의 아미노산 서열에 대해 25%, 35%, 45%, 55%, 65%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상의 아미노산 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 아미노산 서열을 종종 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 변경된 항체는 항체의 하나 이상의 가변 영역에 도입된 하나 이상의 아미노산 변경(예를 들면, 치환, 결실 및/또는 추가)에 의해 발생된다. 다양한 실시양태에서, 아미노산 변경은 골격 영역에 도입된다. 골격 영역 잔기의 하나 이상의 변경은 항원에 대한 항체의 결합 친화성을 개선할 수 있다. 이것은 특히 골격 영역이 CDR 영역과 상이한 종으로부터 유래될 수 있는 인간화된 항체에 이들 변화가 도입되는 경우 실현될 수 있다. 변경시킬 골격 영역 잔기의 예로는 직접적으로 항원에 비-공유결합하는 잔기, CDR의 입체구조와 상호작용하거나 CDR의 입체구조에 영향을 미치는 잔기, 및/또는 VL-VH 경계면에 참여하는 잔기가 있다. 몇몇 실시양태에서, 약 1개 내지 약 5개의 골격 잔기들이 변경될 수 있다. 종종, 이것은 초가변 영역 잔기들 중 어떠한 잔기도 변경되지 않은 경우조차도 임상전 시험에서 사용되기에 적합한 항체 돌연변이체를 발생시키기에 충분할 수 있다. 그러나, 통상적으로, 변경된 항체는 추가 초가변 영역 변경(들)을 포함할 것이다. 일부 실시양태에서, 특히 제2 포유동물 종으로부터의 항원에 대한 항-알파 독소 항체 또는 단편의 출발 결합 친화성이, 무작위적으로 생성된 항체가 용이하게 스크리닝될 수 있을 정도의 친화성인 경우 초가변 영역 잔기는 무작위적으로 변화될 수 있다.
변경된 항체를 발생시키는 한 유용한 절차는 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"로 지칭된다. 이 방법에서, 초가변 영역 잔기(들) 중 하나 이상이 알라닌 또는 폴리알라닌 잔기(들)로 치환되어 아미노산과 알파 독소의 상호작용을 변경시킨다. 그 다음, 치환에 대한 기능적 민감성을 나타내는 초가변 영역 잔기(들)는 치환 부위에서 또는 치환 부위에 대해 추가 또는 다른 돌연변이를 도입함으로써 개량된다. 따라서, 아미노산 서열 변경을 도입할 부위가 미리 결정되지만, 돌연변이의 성질 자체는 미리 결정될 필요가 없다. 이 방식으로 생성된 Ala 돌연변이체는 본원에 기재된 바와 같이 그들의 생물학적 활성에 대해 스크리닝된다.
일부 실시양태에서, 치환 변이체는 모 항체(예를 들면, 인간화된 항체 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환시키는 것을 포함한다. 일반적으로, 추가 개발을 위해 선별된 생성된 변이체(들)는 이들을 발생시키는 데에 사용된 모 항체에 비해 상대적으로 개선된 생물학적 성질을 가질 것이다. 이러한 치환 변이체를 발생시키는 편리한 방식은 파지를 사용하는 친화 성숙을 포함한다. 요약하건대, 여러 초가변 영역 부위(예를 들면, 6개 내지 7개 부위)가 각각의 부위에서 모든 가능한 아미노산 치환을 발생시키도록 돌연변이된다. 이로써 발생된 항체 돌연변이체는 각각의 입자 내에 팩키징된 M13의 유전자 III 생성물과의 융합체로서 사상 파지 입자로부터 1가 방식으로 디스플레이된다. 그 다음, 파지-디스플레이된 돌연변이체는 본원에 개시된 바와 같이 그들의 생물학적 활성(예를 들면, 결합 친화성)에 대해 스크리닝된다.
항체 서열의 돌연변이는 치환, 결실(내부 결실을 포함함), 추가(융합 단백질을 발생시키는 추가를 포함함), 또는 아미노산 서열 내에 있고/있거나 아미노산 서열에 인접한 아미노산 잔기의 보존적 치환(그러나, 변화가 기능적으로 동등한 항-알파 독소 항체 또는 단편을 생성한다는 점에서 "침묵" 변화를 야기함)을 포함할 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 관련된 잔기의 극성, 전하, 가용성, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성에서의 유사성을 기초로 하여 만들어질 수 있다. 예를 들면, 비-극성(소수성) 아미노산은 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 포함하고, 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 쓰레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함하고, 양으로 하전된(염기성) 아미노산은 아르기닌, 라이신 및 히스티딘을 포함하고, 음으로 하전된(산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 추가로, 글리신 및 프롤린은 쇄 배향에 영향을 미칠 수 있는 잔기이다. 비-보존적 치환은 이들 클래스들 중 한 클래스의 구성원을 또 다른 클래스의 구성원으로 교체하는 것을 수반할 것이다. 나아가, 원하는 경우, 비-고전적 아미노산 또는 화학적 아미노산 유사체가 치환 또는 추가로서 항체 서열 내로 도입될 수 있다. 비-고전적 아미노산은 일반 아미노산의 D-이성질체, 알파-아미노 이소부티르산, 4-아미노부티르산, Abu, 2-아미노부티르산, 감마-Abu, 엡실론-Ahx, 6-아미노 헥사노산, Aib, 2-아미노 이소부티르산, 3-아미노 프로피온산, 오르니틴, 노르류신, 노르발린, 하이드록시프롤린, 사르코신, 시트룰린, 시스테산, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 페닐글리신, 사이클로헥실알라닌, 베타-알라닌, 플루오로-아미노산, 디자이너 아미노산, 예컨대, 베타-메틸 아미노산, C-알파-메틸 아미노산, N-알파-메틸 아미노산 및 일반적인 아미노산 유사체를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
일부 실시양태에서, 항-알파 독소 항체 또는 단편의 적절한 입체구조를 유지하는 데에 관여하지 않는 임의의 시스테인 잔기가 일반적으로 세린으로 치환되어 분자의 산화적 안정성을 개선할 수 있고 비정상적인 가교연결을 방지할 수 있다. 대조적으로, 시스테인 결합(들)은 (특히, 항체가 항체 단편, 예컨대, Fv 단편인 경우) 항체에 추가되어 그의 안정성을 개선할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 항체는 융합 단백질, 즉 이종 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드에 융합된 항체 또는 이의 단편을 생성하도록 변경될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 항체의 부분에 융합된 단백질은 항체-지정된 효소 전구약물 치료법(ADEPT)의 효소 성분이다. 항체와의 융합 단백질로서 조작될 수 있는 다른 단백질 또는 폴리펩티드의 예로는 독소, 예컨대, 리신, 애브린, 리보뉴클레아제(ribonuclease), DNase I, 스타필로코커스 장내독소, 미국자리공(pokeweed) 항-바이러스 단백질, 겔로닌, 디프테리아 독소, 슈도모나스 외독소 및 슈도모나스 내독소가 있으나 이들로 한정되지 않는다. 사용될 수 있는 효소 활성 독소 및 이의 단편은 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비-결합 활성 단편, (슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터의) 외독소 A 쇄, 리신 A 쇄, 애브린 A 쇄, 모덱신 A 쇄, 알파-사르신, 유동나무(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 파이톨라카 어메리카나(Phytolaca americana) 단백질(PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함한다.
추가 융합 단백질은 유전자 셔플링, 모티프 셔플링, 엑손 셔플링 및/또는 코돈 셔플링("DNA 셔플링"으로서 총칭됨)이라는 공지된 기술을 통해 발생될 수 있다. DNA 셔플링은 항체 또는 이의 단편의 특성을 변경시키는 데에 이용될 수 있다(예를 들면, 보다 더 높은 친화성 및 보다 더 낮은 해리 속도를 갖는 항체 또는 이의 단편). 추가로, 항체는 당분야에서 공지된 바와 같이 결합 도메인 면역글로불린 융합 단백질일 수 있다.
변이체 Fc 영역
본 발명은 변경된 IgG 불변 도메인을 갖는 본 발명의 결합 구성원, 특히 본 발명의 항체도 포함한다. 기능적 특성, 예컨대, 혈청에서의 긴 반감기 및 다양한 이펙터 기능을 매개하는 능력을 갖는 인간 IgG 클래스의 항체들이 본 발명의 일부 실시양태에서 사용된다(Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Wiley-Liss, Inc., Chapter 1 (1995)). 인간 IgG 클래스 항체는 하기 4종의 하위클래스로 더 분류된다: IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4. IgG 클래스 항체의 이펙터 기능으로서의 ADCC 및 CDC에 대한 다수의 연구가 지금까지 수행되어 왔고, 인간 IgG 클래스의 항체들 중에서 IgG1 서브클래스가 인간에서 가장 높은 ADCC 활성 및 CDC 활성을 갖는다고 보고되어 있다(Chemical Immunology, 65, 88 (1997)).
"항체 의존적 세포 매개 세포독성" 및 "ADCC"는 비-특이적 세포독성 세포(예를 들면, 천연 살해(NK) 세포, 호중구 및 대식세포)가 표적 세포 상의 결합된 항체를 인식한 후 상기 표적 세포의 용해를 야기하는 세포 매개 반응을 지칭한다. 한 실시양태에서, 이러한 세포는 인간 세포이다. 임의의 특정 작용 기작으로 한정되고자 하는 것은 아니지만, ADCC를 매개하는 이들 세포독성 세포는 일반적으로 Fc 수용체(FcR)를 발현한다. ADCC를 매개하는 일차 세포인 NK 세포는 FcγRIII을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII, FcγRIII 및/또는 FcγRIV를 발현한다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현은 문헌(Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991))에 요약되어 있다. 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 시험관내 ADCC 어세이, 예컨대, 미국 특허 제5,500,362호 또는 제5,821,337호에 기재된 어세이를 수행할 수 있다. 이러한 어세이에 유용한 이펙터 세포는 말초혈 단핵세포(PBMC) 및 천연 살해(NK) 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로, 관심 있는 분자의 ADCC 활성을 생체내에서, 예를 들면, 동물 모델, 예컨대, 문헌(Clynes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 95:652-656 (1998))에 개시된 동물 모델에서 평가할 수 있다.
"보체 의존적 세포독성" 또는 "CDC"는 보체 활성화를 개시하여 보체의 존재 하에서 표적을 용해시키는 분자의 능력을 지칭한다. 보체 활성화 경로는 동족 항원과 복합체를 형성한 분자(예를 들면, 항체)와 보체 시스템의 제1 성분(C1q)의 결합에 의해 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 어세이, 예를 들면, 문헌(Gazzano-Santaro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996))에 기재된 CDC 어세이를 수행할 수 있다.
인간 IgG1 서브클래스 항체의 ADCC 활성 및 CDC 활성의 발현은 일반적으로 항체의 Fc 영역과, 이펙터 세포, 예컨대, 살해 세포, 천연 살해 세포 또는 활성화된 대식세포의 표면 상에 존재하는 항체에 대한 수용체(이하, "FcγR"로서 지칭됨)의 결합을 수반한다. 다양한 보체 성분들이 결합될 수 있다. 결합에 대하여, 항체의 힌지 영역 및 C 영역의 제2 도메인(이하, "Cγ2 도메인"으로서 지칭됨) 내의 여러 아미노산 잔기들이 중요하고(Eur. J. Immunol., 23, 1098 (1993), Immunology, 86, 319 (1995), Chemical Immunology, 65, 88 (1997)) Cγ2 도메인 내의 당쇄(Chemical Immunology, 65, 88 (1997))도 중요하다는 것이 암시되었다.
"이펙터 세포"는 하나 이상의 FcR을 발현하고 이펙터 기능을 수행하는 백혈구이다. 상기 세포는 적어도 FcγRI, FCγRII, FcγRIII 및/또는 FcγRIV를 발현하고 ADCC 이펙터 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예로는 말초혈 단핵세포(PBMC), 천연 살해(NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 호중구가 있다. 용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기술하는 데에 사용된다. 한 실시양태에서, FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 더욱이, 일부 실시양태에서, FcR은 IgG 항체(감마 수용체)에 결합하고 FcγRI, FcγRII, FcγRIII 및 FcγRIV 서브클래스의 수용체들(이들 수용체들의 대립형질 변이체 및 택일적으로 스플라이싱된 형태를 포함함)을 포함하는 FcR이다. FcγRII 수용체는 주로 그의 세포질 도메인에서 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는 FcγRIIA("활성화 수용체") 및 FcγRIIB("억제 수용체")를 포함한다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그의 세포질 도메인 내에 면역수용체 티로신-기초 활성화 모티프(ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 그의 세포질 도메인 내에 면역수용체 티로신-기초 억제 모티프(ITIM)를 함유한다(문헌(Daeron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234 (1997)) 참조). FcR은 문헌(Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991)), 문헌(Capel et al., Immunomethods, 4:25-34 (1994)) 및 문헌(de Haas et al., J. Lab. Clin. Med., 126:330-41 (1995))에서 검토되어 있다. 향후 확인될 FcR을 포함하는 다른 FcR도 본원에서 용어 "FcR"에 의해 포괄된다. 상기 용어는 모체 IgG를 태아에게 전달하는 것을 담당하는 신생아 수용체인 FcRn도 포함한다(Guyer et al., Immunol., 117:587 (1976) and Kim et al., J. Immunol., 24:249 (1994)).
일부 실시양태에서, 항-알파 독소 항체 또는 단편은 항체의 기능적 및/또는 약동학적 성질을 변화시키기 위해 하나 이상의 변경이 Fc 영역 내에 도입되어 있는 변경된 Fc 영역(본원에서 "변이체 Fc 영역"으로서도 지칭됨)을 포함한다. 이러한 변경은 C1q 결합 및 보체 의존적 세포독성(CDC), 또는 IgG에 대한 FcγR 결합을 감소시킬 수 있거나 증가시킬 수 있다. 본 기술은 이펙터 기능을 변경시켜 원하는 효과를 제공하기 위해 변화가 도입되어 있는 변이체 Fc 영역을 갖는 본원에 기재된 항체를 포괄한다. 따라서, 몇몇 실시양태에서, 항-알파 독소 항체 또는 단편은 변이체 Fc 영역(즉, 하기 논의된 바와 같이 변경된 Fc 영역)을 포함한다. 변이체 Fc 영역을 포함하는 본원의 항-알파 독소 항체 및 단편은 본원에서 "Fc 변이체 항체"로서도 지칭된다. 본원에서 사용된 바와 같이, "천연"은 비-변경된 모 서열을 지칭하고, 천연 Fc 영역을 포함하는 항체는 본원에서 "천연 Fc 항체"로서 지칭된다. 몇몇 실시양태에서, 변이체 Fc 영역은 천연 Fc 영역과 비교될 때 유사한 수준의 이펙터 기능 유도를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 변이체 Fc 영역은 천연 Fc와 비교될 때 보다 더 높은 이펙터 기능의 유도를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 변이체 Fc 영역은 천연 Fc와 비교될 때 보다 더 낮은 이펙터 기능의 유도를 나타낸다. 변이체 Fc 영역의 몇몇 특정 실시양태는 본원에서 상세히 기재되어 있다. 이펙터 기능을 측정하는 방법은 당분야에서 공지되어 있다.
항체의 이펙터 기능은 아미노산 치환, 아미노산 추가, 아미노산 결실 및 Fc 아미노산에 대한 번역 후 변경(예를 들면, 글리코실화)의 변화를 포함하나 이들로 한정되지 않는, Fc 영역에서의 변화를 통해 변경될 수 있다. 후술된 방법들은 본원에 기재된 단리된 항체 또는 항원 결합 단편의 이펙터 기능을 변경시켜 특정 스타필로코커스 아우레우스 관련 질환 또는 병태의 예방 또는 치료에 유리한 일부 성질을 갖는 항체 또는 항원 결합 단편을 발생시키는 데에 이용될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 천연 Fc 항체에 비해 Fc 리간드(예를 들면, Fc 수용체, C1q)에 대한 변경된 결합 성질을 갖는 Fc 변이체 항체가 제조된다. 결합 성질의 예로는 결합 특이성, 평형 해리 상수(Kd), 해리 속도 및 결합 속도(각각 koff 및 kon), 결합 친화성 및/또는 친화력(avidity)이 있으나 이들로 한정되지 않는다. 평형 해리 상수(Kd)가 koff/kon으로서 정의된다는 것은 당분야에서 공지되어 있다. 일부 양태에서, 낮은 Kd를 갖는 Fc 변이체 영역을 포함하는 항체는 높은 Kd를 갖는 항체보다 더 바람직할 수 있다. 그러나, 일부 경우, kon 또는 koff의 값은 Kd의 값보다 더 적절할 수 있다. 어떤 반응속도 파라미터가 주어진 항체 응용에 더 중요한지를 확인할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, Fc 변이체 항체는 천연 Fc 항체와 비교될 때 FcRn, FcγRI(CD64)(동형체 FcγRIA, FcγRIB 및 FcγRIC를 포함함), FcγRII(동형체 FcγRIIA, FcγRIIB 및 FcγRIIC를 포함하는 CD32) 및 FcγRIII(동형체 FcγRIIIA 및 FcγRIIIB를 포함하는 CD16)를 포함하나 이들로 한정되지 않는 하나 이상의 Fc 수용체에 대해 변경된 결합 친화성을 나타낸다.
일부 실시양태에서, Fc 변이체 항체는 천연 Fc 항체에 비해 상대적으로 하나 이상의 Fc 리간드와의 향상된 결합을 갖는다. 일부 실시양태에서, Fc 변이체 항체는 천연 Fc 항체보다 2배 이상, 3배 이상, 5배 이상, 7배 이상, 10배 이상, 20배 이상, 30배 이상, 40배 이상, 50배 이상, 60배 이상, 70배 이상, 80배 이상, 90배 이상, 100배 이상, 200배 이상, 2배 내지 10배, 5배 내지 50배, 25배 내지 100배, 75배 내지 200배, 또는 100배 내지 200배 더 많거나 더 적은 Fc 리간드에 대해 증가된 또는 감소된 친화성을 나타낸다. 다양한 실시양태에서, Fc 변이체 항체는 천연 Fc 항체보다 90% 이상, 80% 이상, 70% 이상, 60% 이상, 50% 이상, 40% 이상, 30% 이상, 20% 이상, 10% 이상 또는 5% 이상 더 많거나 더 적은 Fc 리간드에 대한 친화성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, Fc 변이체 항체는 Fc 리간드에 대한 증가된 친화성을 갖는다. Fc 변이체 항체는 종종 Fc 리간드에 대한 감소된 친화성을 가질 수 있다.
몇몇 실시양태에서, Fc 변이체 항체는 Fc 수용체 FcγRIIIA와의 향상된 결합을 갖는다. 몇몇 실시양태에서, Fc 변이체 항체는 Fc 수용체 FcγRIIB와의 향상된 결합을 갖는다. 일부 실시양태에서, Fc 변이체 항체는 Fc 수용체 FcγRIIIA 및 FcγRIIB 둘다와의 향상된 결합을 갖는다. 일부 실시양태에서, FcγRIIIA와의 향상된 결합을 갖는 Fc 변이체 항체는 천연 Fc 항체와 비교될 때 FcγRIIB 수용체와의 결합에 있어서 수반되는 증가를 갖지 않는다. 일부 실시양태에서, Fc 변이체 항체는 Fc 수용체 FcγRIIIA와의 감소된 결합을 갖는다. Fc 변이체 항체는 종종 Fc 수용체 FcγRIIB와의 감소된 결합을 가질 수 있다. 다양한 실시양태에서, FcγRIIIA 및/또는 FcγRIIB에 대한 변경된 친화성을 나타내는 Fc 변이체 항체는 Fc 수용체 FcRn과의 향상된 결합을 갖는다. 몇몇 실시양태에서, FcγRIIIA 및/또는 FcγRIIB에 대한 변경된 친화성을 나타내는 Fc 변이체 항체는 천연 Fc 항체에 비해 상대적으로 C1q와의 변경된 결합을 갖는다.
일부 실시양태에서, Fc 변이체 항체는 천연 Fc 항체보다 2배 이상, 3배 이상, 5배 이상, 7배 이상, 10배 이상, 20배 이상, 30배 이상, 40배 이상, 50배 이상, 60배 이상, 70배 이상, 80배 이상, 90배 이상, 100배 이상, 200배 이상, 2배 내지 10배, 5배 내지 50배, 25배 내지 100배, 75배 내지 200배, 또는 100배 내지 200배 더 많거나 더 적은 FcγRIIIA 수용체에 대한 친화성을 나타낸다. 다양한 실시양태에서, Fc 변이체 항체는 천연 Fc 수용체보다 90% 이상, 80% 이상, 70% 이상, 60% 이상, 50% 이상, 40% 이상, 30% 이상, 20% 이상, 10% 이상 또는 5% 이상 더 많거나 더 적은 FcγRIIIA에 대한 친화성을 나타낸다.
일부 실시양태에서, Fc 변이체 항체는 천연 Fc 항체보다 2배 이상, 3배 이상, 5배 이상, 7배 이상, 10배 이상, 20배 이상, 30배 이상, 40배 이상, 50배 이상, 60배 이상, 70배 이상, 80배 이상, 90배 이상, 100배 이상, 200배 이상, 2배 내지 10배, 5배 내지 50배, 25배 내지 100배, 75배 내지 200배, 또는 100배 내지 200배 더 많거나 더 적은 FcγRIIB 수용체에 대한 친화성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, Fc 변이체 항체는 천연 Fc 항체보다 90% 이상, 80% 이상, 70% 이상, 60% 이상, 50% 이상, 40% 이상, 30% 이상, 20% 이상, 10% 이상 또는 5% 이상 더 많거나 더 적은 FcγRIIB에 대한 친화성을 나타낸다.
몇몇 실시양태에서, Fc 변이체 항체는 천연 Fc 항체에 비해 상대적으로 C1q에 대한 증가된 또는 감소된 친화성을 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, Fc 변이체 항체는 천연 Fc 항체보다 2배 이상, 3배 이상, 5배 이상, 7배 이상, 10배 이상, 20배 이상, 30배 이상, 40배 이상, 50배 이상, 60배 이상, 70배 이상, 80배 이상, 90배 이상, 100배 이상, 200배 이상, 2배 내지 10배, 5배 내지 50배, 25배 내지 100배, 75배 내지 200배, 또는 100배 내지 200배 더 많거나 더 적은 C1q 수용체에 대한 친화성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, Fc 변이체 항체는 천연 Fc 항체보다 90% 이상, 80% 이상, 70% 이상, 60% 이상, 50% 이상, 40% 이상, 30% 이상, 20% 이상, 10% 이상 또는 5% 이상 더 많거나 더 적은 C1q에 대한 친화성을 나타낸다. 다양한 실시양태에서, C1q에 대한 변경된 친화성을 나타내는 Fc 변이체 항체는 Fc 수용체 FcRn과의 향상된 결합을 갖는다. 또 다른 특정 실시양태에서, C1q에 대한 변경된 친화성을 나타내는 Fc 변이체 항체는 천연 Fc 항체에 비해 상대적으로 FcγRIIIA 및/또는 FcγRIIB와의 변경된 결합을 갖는다.
Fc 변이체 항체는 하나 이상의 FcγR 매개 이펙터 세포 기능을 측정하는 시험관내 기능성 어세이에 의해 특징규명된다고 생각된다. 일부 실시양태에서, Fc 변이체 항체는 생체내 모델(예컨대, 본원에 기재되고 개시된 생체내 모델)에서 시험관내-기초 어세이에서의 결합 성질 및 이펙터 세포 기능과 유사한 결합 성질 및 이펙터 세포 기능을 갖는다. 본 기술은 시험관내-기초 어세이에서 원하는 표현형을 나타내지 않지만 생체내에서 원하는 표현형을 나타내는 Fc 변이체 항체를 배제하지 않는다.
Fc 영역을 포함하는 단백질의 혈청 반감기는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합 친화성을 증가시킴으로써 증가될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "항체 반감기"는 항체 투여 후 항체 분자의 평균 생존 시간의 측정치인 항체의 약동학적 성질을 의미한다. 항체 반감기는 예를 들면, 혈청(즉, 순환 반감기) 또는 다른 조직에서 측정될 때 환자의 신체(또는 다른 포유동물) 또는 이의 특정 구획으로부터 공지된 양의 면역글로불린의 50%를 제거하는 데에 필요한 시간으로서 표현될 수 있다. 반감기는 면역글로불린 또는 면역글로불린의 클래스마다 상이할 수 있다. 일반적으로, 항체 반감기의 증가는 투여된 항체에 대한 순환계에서의 평균 체류시간(MRT)을 증가시킨다.
반감기의 증가는 환자에게 제공된 약물의 양의 감소뿐만 아니라 투여 빈도의 감소를 가능하게 한다. 반감기의 증가는 예를 들면, 스타필로코커스 아우레우스 관련 질환 또는 병태를 예방하는 데에 유리할 수 있고 일단 환자가 병원으로부터 퇴원하면 종종 일어날 수 있는 감염의 재발을 방지하는 데에도 유리할 수 있다. 항체의 혈청 반감기를 증가시키기 위해, 당분야에서 공지된 바와 같이 살비지(salvage) 수용체 결합 에피토프를 항체(특히, 항체 단편) 내로 도입할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "살비지 수용체 결합 에피토프"는 IgG 분자의 생체내 혈청 반감기의 증가를 담당하는 IgG 분자(예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)의 Fc 영역의 에피토프를 지칭한다. 증가된 반감기를 갖는 항체는 Fc와 FcRn 수용체 사이의 상호작용에 관여하는 것으로서 확인된 아미노산 잔기를 변경시킴으로써 발생될 수도 있다. 또한, 항-알파 독소 항체 또는 단편의 반감기는 당분야에서 널리 이용되는 기법에 의한 PEG 또는 알부민과의 접합에 의해 증가될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 항-알파 독소 항체의 Fc 변이체 영역을 포함하는 항체는 천연 Fc 영역을 포함하는 항체와 비교될 때 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 100%, 약 125% 또는 약 150% 이상 증가된 반감기를 갖는다. 몇몇 실시양태에서, Fc 변이체 영역을 포함하는 항체는 천연 Fc 영역을 포함하는 항체와 비교될 때 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 10배, 약 20배 또는 약 50배 이상, 또는 2배 내지 10배, 5배 내지 25배 또는 15배 내지 50배 증가된 반감기를 갖는다.
몇몇 실시양태에서, 본원에서 제공된 기술은 Fc 변이체를 제공하고, 이때 Fc 영역은 카바트에 기재된 EU 지수에 의해 넘버링되었을 때 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 251, 252, 254, 255, 256, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 279, 280, 284, 292, 296, 297, 298, 299, 305, 313, 316, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 339, 341, 343, 370, 373, 378, 392, 416, 419, 421, 440 및 443으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에서 변경(예를 들면, 아미노산 치환, 아미노산 삽입, 아미노산 결실)을 포함한다. 임의적으로, 상기 Fc 영역은 당분야에서 공지된 추가 및/또는 대안적 위치에서 비-천연 발생 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원은 Fc 변이체를 제공하고, 이때 Fc 영역은 카바트에 기재된 EU 지수에 의해 넘버링되었을 때 234D, 234E, 234N, 234Q, 234T, 234H, 234Y, 234I, 234V, 234F, 235A, 235D, 235R, 235W, 235P, 235S, 235N, 235Q, 235T, 235H, 235Y, 235I, 235V, 235F, 236E, 239D, 239E, 239N, 239Q, 239F, 239T, 239H, 239Y, 240I, 240A, 240T, 240M, 241W, 241L, 241Y, 241E, 241R, 243W, 243L, 243Y, 243R, 243Q, 244H, 245A, 247L, 247V, 247G, 251F, 252Y, 254T, 255L, 256E, 256M, 262I, 262A, 262T, 262E, 263I, 263A, 263T, 263M, 264L, 264I, 264W, 264T, 264R, 264F, 264M, 264Y, 264E, 265G, 265N, 265Q, 265Y, 265F, 265V, 265I, 265L, 265H, 265T, 266I, 266A, 266T, 266M, 267Q, 267L, 268E, 269H, 269Y, 269F, 269R, 270E, 280A, 284M, 292P, 292L, 296E, 296Q, 296D, 296N, 296S, 296T, 296L, 296I, 296H, 269G, 297S, 297D, 297E, 298H, 298I, 298T, 298F, 299I, 299L, 299A, 299S, 299V, 299H, 299F, 299E, 305I, 313F, 316D, 325Q, 325L, 325I, 325D, 325E, 325A, 325T, 325V, 325H, 327G, 327W, 327N, 327L, 328S, 328M, 328D, 328E, 328N, 328Q, 328F, 328I, 328V, 328T, 328H, 328A, 329F, 329H, 329Q, 330K, 330G, 330T, 330C, 330L, 330Y, 330V, 330I, 330F, 330R, 330H, 331G, 331A, 331L, 331M, 331F, 331W, 331K, 331Q, 331E, 331S, 331V, 331I, 331C, 331Y, 331H, 331R, 331N, 331D, 331T, 332D, 332S, 332W, 332F, 332E, 332N, 332Q, 332T, 332H, 332Y, 332A, 339T, 370E, 370N, 378D, 392T, 396L, 416G, 419H, 421K, 440Y 및 434W로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환을 포함한다. 임의적으로, 상기 Fc 영역은 당분야에서 공지된 추가 및/또는 대안적 비-천연 발생 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
다양한 실시양태에서, 본원은 Fc 변이체를 제공하고, 이때 Fc 영역은 234, 235 및 331로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에서 하나 이상의 변경(예를 들면, 아미노산 치환, 아미노산 삽입, 아미노산 결실)을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 비-천연 발생 아미노산은 234F, 235F, 235Y 및 331S로 구성된 군으로부터 선택된다. 본원은 Fc 변이체를 제공하고, 이때 Fc 영역은 239, 330 및 332로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에서 하나 이상의 비-천연 발생 아미노산을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 비-천연 발생 아미노산은 239D, 330L 및 332E로 구성된 군으로부터 선택된다.
몇몇 실시양태에서, 본원은 Fc 변이체 항체를 제공하고, 이때 Fc 영역은 252, 254 및 256으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에서 하나 이상의 비-천연 발생 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-천연 발생 아미노산은 미국 특허 제7,083,784호(이의 내용은 전체적으로 본원에 참고로 도입됨)에 기재된 252Y, 254T 및 256E로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본원은 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 Fc 변이체 영역을 갖는 항-스타필로코커스 알파 독소 항체로서, 하기 중쇄 서열 및 경쇄 서열을 갖는 항체를 제공한다:
Figure 112013081238763-pct00001
Figure 112013081238763-pct00002
일부 실시양태에서, IgG 항체에 의해 이끌어내진 이펙터 기능은 단백질의 Fc 영역에 연결된 탄수화물 모이어티에 의해 주로 좌우된다. 따라서, Fc 영역의 글리코실화는 이펙터 기능을 증가시키거나 감소시키도록 변경될 수 있다. 따라서, 몇몇 실시양태에서, 본원에서 제공된 항-알파 독소 항체 및 단편의 Fc 영역은 아미노산 잔기의 변경된 글리코실화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아미노산 잔기의 변경된 글리코실화는 이펙터 기능을 낮춘다. 일부 실시양태에서, 아미노산 잔기의 변경된 글리코실화는 이펙터 기능을 증가시킨다. 몇몇 실시양태에서, Fc 영역은 감소된 푸코실화를 갖는다. 일부 실시양태에서, Fc 영역은 비-푸코실화되어 있다.
몇몇 실시양태에서, 본원의 Fc 변이체는 당분야에서 공지된 다른 공지된 Fc 변이체와 조합될 수 있다. Fc 도메인의 다른 변경 및/또는 치환 및/또는 추가 및/또는 결실이 도입될 수 있다.
글리코실화
항체의 이펙터 기능을 변경시키는 글리코실화의 능력 이외에, 가변 영역의 변경된 글리코실화는 표적 항원에 대한 항체의 친화성을 변경시킬 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 항체의 가변 영역의 글리코실화 패턴이 변경된다. 예를 들면, 비-글리코실화된 항체가 제조될 수 있다(즉, 항체가 글리코실화를 결여한다). 글리코실화는 예를 들면, 표적 항원에 대한 항체의 친화성을 증가시키도록 변경될 수 있다. 이러한 탄수화물 변경은 예를 들면, 항체 서열 내의 하나 이상의 글리코실화 부위를 변경시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 가변 영역 골격 글리코실화 부위를 제거하여 상기 부위에서 글리코실화를 제거하는 하나 이상의 아미노산 치환이 만들어질 수 있다. 이러한 비-글리코실화는 항원에 대한 항체의 친화성을 증가시킬 수 있다. Fc 영역에 존재하는 글리코실화 부위(예를 들면, IgG의 아스파라긴 297)를 제거하는 하나 이상의 아미노산 치환도 만들어질 수 있다. 나아가, 비-글리코실화된 항체는 필요한 글리코실화 기구를 결여하는 세균 세포에서 생성될 수 있다.
항체 접합체
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 항체는 당분야에서 공지된 방법의 이용을 통해 물질에 접합되거나 공유부착된다. 몇몇 실시양태에서, 부착된 물질은 검출가능한 표지(본원에서 레포터 분자로서도 지칭됨) 또는 고체 지지체이다. 항체에 부착시키기에 적합한 물질은 아미노산, 펩티드, 단백질, 폴리사카라이드, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 핵산, 햅텐, 약물, 호르몬, 지질, 지질 조립체, 합성 중합체, 중합체성 미세입자, 생물학적 세포, 바이러스, 형광단, 발색단, 염료, 독소, 햅텐, 효소, 항체, 항체 단편, 방사성 동위원소, 고체 매트릭스, 반고체 매트릭스 및 이들의 조합물을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 또 다른 물질을 항체에 접합시키거나 공유부착시키는 방법은 당분야에서 공지되어 있다.
사용 진단 방법
알파 독소는 통상적으로 스타필로코커스 아우레우스의 병원성 균주에서만 발견되는 병독성 인자이다. 알파 독소는 종종 활성 복합체의 형성의 일부로서 세포 표면 수용체에 결합한다. 그러나, 올리고머화 및 경막 공극(예를 들면, 알파 독소 칠량체)의 형성은 특정 수용체와의 결합의 부재 하에서 일어날 수 있다. 세포 기능장애 및 용해에 있어서 올리고머화된 알파 독소의 작용(예를 들면, 경막 공극의 형성)은 침입 스타필로코커스 아우레우스 세균의 콜로니화를 용이하게 한다. 본원에 기재된 항체는 알파 독소 단량체-단량체 상호작용에 직접적으로 또는 간접적으로 관여된 알파 독소 분자 상의 영역을 인식함으로써 알파 독소 단량체가 경막 공극으로 조립되거나 올리고머화되는 것을 억제한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 항-알파 독소 항체 및 단편, 및 조성물은 알파 독소 및/또는 알파 독소 관련 병태/질환을 발생시키는 스타필로코커스 아우레우스 균주를 진단하기 위해 생체내에서 및/또는 시험관내에서 사용될 수 있다. 이것은 예를 들면, 항체와 알파 독소 사이의 복합체의 형성을 가능하게 하는 조건 하에서 임의적으로 대조군 샘플과 함께 시험될 샘플을 항체와 접촉시킴으로써 달성될 수 있다. 그 다음, (예를 들면, ELISA를 이용하여) 복합체 형성을 검출한다. 시험 샘플과 함께 대조군 샘플을 사용할 때, 두 샘플들에서 복합체가 검출되고, 샘플들 사이에 복합체 형성의 임의의 통계적으로 유의한 차이는 시험 샘플 중의 스타필로코커스 아우레우스의 존재, 알파 독소의 존재 또는 스타필로코커스 아우레우스 및 알파 독소의 존재를 표시한다.
몇몇 실시양태에서, 본원의 기술은 스타필로코커스 아우레우스 및/또는 다른 알파 독소 상동체 생성 세균을 함유하는 것으로 의심되는 샘플에서 알파 독소를 생성하는 스타필로코커스 아우레우스 균주 및/또는 알파 독소의 존재를 확인하는 방법으로서, 상기 샘플을 항-알파 독소 항체 또는 단편에 노출시키는 단계, 및 상기 항체와 상기 샘플 중의 알파 독소의 결합을 확인하는 단계를 포함하는 방법을 제공하고, 이때 상기 항체와 샘플 중의 알파 독소의 결합은 샘플 중의 스타필로코커스 아우레우스 및/또는 알파 독소의 존재를 표시한다. 몇몇 실시양태에서, 샘플은 생물학적 샘플이다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 스타필로코커스 아우레우스 관련 질환/장애를 앓고 있거나 앓고 있는 것으로 의심되는 포유동물로부터 수득된다.
일부 실시양태에서, 항-알파 독소 항체 또는 단편은 생체내 진단 어세이를 이용하여 스타필로코커스 아우레우스의 생장 및/또는 알파 독소의 과다발현을 검출하는 데에 사용될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 항-알파 독소 항체 또는 단편은 샘플에 첨가되고, 이때 상기 항체는 검출될 알파 독소에 결합하고 검출가능한 표지(예를 들면, 방사성 동위원소 또는 형광 표지)로 태깅되고, 환자는 상기 표지의 국소화에 대해 외부적으로 스캐닝된다.
포르말린에 의해 고정되고 파라핀에 의해 포매된 조직에 대해 FISH 어세이, 예컨대, 인폼(INFORM)™(벤타나(Ventana)에 의해 시판됨, 미국 애리조나주 소재) 또는 패쓰비전(PATHVISION)™(비시스(Vysis), 미국 일리노이주 소재)을 수행하여 조직 샘플 중의 알파 독소 과다발현의 정도(존재하는 경우)를 측정할 수 있다.
일부 실시양태에서, 항-알파 독소 항체 및 단편은 조직 샘플, 혈액 또는 혈청 중의 알파 독소(예를 들면, 가용성 알파 독소)를 검출하는 방법에서 사용될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 매개 장애를 앓고 있는 것으로 의심되는 포유동물로부터 수득된 조직, 혈액 또는 혈청의 시험 샘플을 본원에서 제공된 항-알파 독소 항체 또는 단편과 접촉시키는 단계, 및 정상 포유동물로부터 수득된 혈액 또는 혈청의 대조군 샘플에 비해 상대적으로 시험 샘플 중의 알파 독소의 증가를 검출하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 검출 방법은 포유동물의 조직, 혈액 또는 혈청 중의 알파 독소의 증가와 관련된 스타필로코커스 아우레우스 및/또는 알파 독소 매개 장애를 진단하는 방법으로서 유용하다.
사용 치료 방법
일부 실시양태에서, 항-알파 독소 항체 또는 단편은 알파 독소 매개 병태의 예방 및/또는 치료를 위해 투여될 수 있다. 본원은 알파 독소 매개 질환 또는 장애를 예방하고/하거나, 치료하고/하거나, 유지하고/하거나, 호전시키고/시키거나 억제하는 방법으로서, 본원에서 제공된 항-알파 독소 항체 및 단편을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
병원성 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 매개 장애
일부 실시양태에서, 만성 병태 및 급성 병태, 예컨대, 세균혈증, 화상, 연조직염, 피부괴사, 눈꺼풀 감염, 식중독, 관절 감염, 신생아 결막염, 골수염, 폐렴, 피부 감염, 수술 상처 감염, 열상 피부 증후군, 심내막염, 수막염, 농양 형성 및 독성 쇼크 증후군을 포함하나 이들로 한정되지 않는 광범위한 병원성 스타필로코커스 아우레우스 매개 병태/질환을 치료하고 예방하기 위해 본원에서 제공된 조성물 및 항체를 투여하고 사용하는 방법을 제공한다.
CA-MRSA 및 HA-MRSA 둘다가 종래 항-스타필로코커스 베타-락탐 항생제, 예컨대, 세팔렉신에 대한 내성을 나타낸다. CA-MRSA는 설파 약물(예컨대, 코-트리목사졸/트리메토프림-설파메톡사졸), 테트라사이클린(예컨대, 독시사이클린 및 미노사이클린) 및 클린다마이신에 대한 감수성을 포함하는 보다 더 큰 범위의 항미생물 감수성을 갖지만, CA-MRSA를 치료하기 위해 선택된 약물은 현재 헨리 포드 병원(Henry Ford Hospital) 연구에 따르면 반코마이신인 것으로 생각된다. HA-MRSA는 이들 항생제들에 대해서도 내성을 나타내지만 종종 반코마이신에 대해서만 감수성을 나타낸다. 신규 약물, 예컨대, (신규 옥사졸리디논 클래스에 속하는) 리네졸리드 및 답토마이신은 CA-MRSA 및 HA-MRSA 둘다에 대해 효과적이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 예를 들면, 베타-락탐 항생제(예컨대, 세팔렉신), 설파 약물(예컨대, 코-트리목사졸/트리메토프림-설파메톡사졸), 테트라사이클린(예컨대, 독시사이클린 및 미노사이클린), 클린다마이신, 반코마이신, 리네졸리드, 답토마이신, 테이코플라닌, 퀴누프리스틴/달포프리스틴(시너시드(synercid)) 또는 티게사이클린에 상응하는 항생제와 함께 사용될 수 있다.
약학 제제
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 항-알파 독소 항체 또는 단편은 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 약학(치료) 조성물로서 제제화될 수 있고, 당분야에서 공지된 다양한 방법에 의해 투여될 수 있다. 투여 경로 및/또는 방식은 원하는 결과에 따라 상이할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 항-알파 독소 항체 또는 단편을 포함하는 약학 제제는 본 기술의 제제로서 지칭된다. 용어 "약학적으로 허용가능한 담체"는 활성 성분의 생물학적 활성의 효과를 방해하지 않는 하나 이상의 무독성 물질을 의미한다. 이러한 제제는 관용적으로 염, 완충제, 방부제, 상용가능한 담체 및 임의적으로 다른 치료제를 함유할 수 있다. 이러한 약학적으로 허용가능한 제제는 관용적으로 인간 내로의 투여에 적합한 상용가능한 고체 또는 액체 충전제, 희석제 또는 캡슐화 물질도 함유할 수 있다. 용어 "담체"는 활성 성분과 조합되어 적용을 용이하게 하는 유기 또는 무기 천연 또는 합성 성분을 표시한다. 또한, 약학 조성물의 성분들은 원하는 약학적 효능을 실질적으로 손상시킬 상호작용이 없는 방식으로 본 기술의 항체와 혼합될 수 있고 서로 혼합될 수 있다.
본 기술의 치료 조성물은 특정 투약용으로 제제화될 수 있다. 투약 요법은 최적 원하는 반응(예를 들면, 치료 반응)을 제공하도록 조절될 수 있다. 예를 들면, 단회 볼루스(bolus)가 투여될 수 있거나, 여러 분할된 용량이 일정 시간에 걸쳐 투여될 수 있거나, 용량이 치료 상황의 긴급성에 의해 표시된 바와 같이 비례적으로 감소될 수 있거나 증가될 수 있다. 투여 용이성 및 투약의 균일성을 위해 비경구 조성물을 투약 유닛 제형으로 제제화하는 것이 특히 유리하다. 본원에서 사용된 투약 유닛 제형은 치료될 대상체를 위한 단위 투약분으로서 적합한 물리적으로 이산된 유닛을 지칭하고, 각각의 유닛은 필요한 약학 담체와 함께 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 미리 결정된 양의 활성 화합물을 함유한다. 투약 유닛 제형에 대한 요건은 하기 (a) 및 (b)에 의해 결정되고 직접적으로 좌우된다: (a) 항-알파 독소 항체 또는 단편의 독특한 특성 및 달성될 구체적인 치료 효과, 및 (b) 개체에서 민감성의 치료를 위해 예컨대, 항-알파 독소 항체 또는 단편을 화합하는 분야에 내재된 한계점.
본 기술의 치료 조성물은 구체적인 투여 경로, 예컨대, 경구, 비강, 폐, 국소(협측 및 설하를 포함함), 직장, 질 및/또는 비경구 투여용으로 제제화될 수 있다. 상기 제제는 편리하게는 유닛 투약 제형으로 제공될 수 있고 약학 분야에서 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 담체 물질과 조합되어 단일 투약 제형을 생성할 수 있는 활성 성분의 양은 치료될 대상체 및 구체적인 투여 방식에 따라 상이할 것이다. 담체 물질과 조합되어 단일 투약 제형을 생성할 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 생성하는 조성물의 양일 것이다.
치료 유효량
본원에 기재된 항체 제제는 적합한 용량 및 투약 요법으로 투여될 수 있고, 이러한 용량 및 투약 요법은 치료될 질환 또는 병태에 의해 좌우될 수 있다. 치료 유효량은 용량 및 투약 요법이 치료 효과 또는 치료 종점을 발생시키는지를 확인함으로써 확인될 수 있다.
제품 및 키트
본원은 본원의 액체 제제 또는 동결건조된 제제로 충전된 하나 이상의 용기를 포함하는 약학 팩 또는 키트를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 본원의 액체 제제로 충전된 용기는 미리 충전된 주사기이다. 특정 실시양태에서, 본원의 제제는 이종 단백질, 이종 폴리펩티드, 이종 펩티드, 대분자, 소분자, 마커 서열, 진단 또는 검출가능한 물질, 치료 모이어티, 약물 모이어티, 방사성 금속 이온, 제2 항체 및 고체 지지체를 포함하나 이들로 한정되지 않는 또 다른 모이어티에 재조합적으로 융합되어 있거나 화학적으로 접합되어 있는 항-알파 독소 항체 및 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원의 제제는 단회 용량 바이알 내에 멸균 액체로서 제제화된다. 본원의 제제는 종종 미리 충전된 주사기 내에 공급된다.
일부 실시양태에서, 다양한 목적, 예를 들면, 세포로부터의 알파 독소의 정제 또는 면역침전, 알파 독소의 검출 등을 포함하는 연구 및 진단에 유용한, 항-알파 독소 항체 및 단편을 포함하는 키트도 제공된다. 알파 독소의 단리 및 정제를 위해, 상기 키트는 비드(예를 들면, 세파로스 비드)에 커플링된 항-알파 독소 항체 또는 단편을 함유할 수 있다. 시험관내, 예를 들면, ELISA 또는 웨스턴 블롯에서 알파 독소를 검출하고 정량하기 위한 항체를 함유하는 키트가 제공될 수 있다. 제품과 마찬가지로, 상기 키트는 용기, 및 이 용기 상에 존재하거나 용기와 결합되어 있는 표지 및 포장 삽입물을 포함한다. 상기 용기는 본원에 개시된 하나 이상의 항-알파 독소 항체 또는 단편을 포함하는 조성물을 보유한다. 대조군 항체, 예를 들면, 희석제 및 완충제를 함유하는 추가 용기도 포함될 수 있다. 상기 표지 또는 포장 삽입물은 조성물의 설명뿐만 아니라 의도된 시험관내 또는 진단 사용에 대한 설명서도 제공할 수 있다.
본 기술은 마감처리 포장되고 표지된 약품도 포괄한다. 이 제품은 적절한 관 또는 용기, 예컨대, 유리 바이알, 미리 충전된 주사기 또는 기밀 밀봉된 다른 용기 내에 적절한 유닛 투약 제형을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 유닛 투약 제형은 비경구 투여에 적합한, 항-알파 독소 항체 또는 단편을 포함하는 멸균 미립자 무함유 용액으로서 제공된다. 일부 실시양태에서, 유닛 투약 제형은 재구성에 적합한, 항-알파 독소 항체 또는 단편을 포함하는 멸균 동결건조된 분말로서 제공된다.
몇몇 실시양태에서, 유닛 투약 제형은 정맥내, 근육내, 비강내, 경구, 국소 또는 피하 전달에 적합하다. 따라서, 본 기술은 각각의 전달 경로에 적합한 멸균 용액을 포괄한다. 추가로, 본 기술은 재구성에 적합한 멸균 동결건조된 분말을 포괄한다.
임의의 약품과 마찬가지로, 포장재 및 용기는 저장 및 운반 동안 상기 제품의 안정성을 보호하도록 디자인된다. 또한, 본원의 제품은 의사, 기술자 또는 환자에게 해당 질환 또는 장애를 적절하게 예방하거나 치료하는 방법에 대해 알려주는 사용 설명서 또는 다른 정보자료를 포함한다. 즉, 제품은 실제 용량, 모니터링 절차 및 다른 모니터링 정보를 포함하나 이들로 한정되지 않는 투약 요법을 표시하거나 암시하는 설명 수단을 포함한다.
특히, 본 기술은 포장재, 예컨대, 상자, 병, 튜브, 바이알, 용기, 미리 충전된 주사기, 분무기, 취입기, 정맥내(i.v.) 백, 봉투 등; 및 상기 포장재 내에 함유된 약제의 하나 이상의 유닛 투약 제형을 포함하는 제품을 제공하고, 이때 상기 약제는 항체를 함유하는 액체 제제를 포함한다. 상기 포장재는 어떻게 항체가 질환 또는 장애와 관련된 하나 이상의 증상의 예방, 치료 및/또는 관리에 사용될 수 있는지를 표시하는 설명 수단을 포함한다.
실시예
하기 실시예는 일부 실시양태를 예시하고 본 기술을 한정하지 않는다.
실시예 1: 재료 및 방법
실시예 2 내지 9 및 실시예 11 내지 13을 위해 사용되는 재료 및 방법이 이하에 제공되어 있다.
야생형 스타필로코커스 아우레우스 AT 및 비-용혈 돌연변이체 H35L의 클로닝 및 발현
스타필로코커스 아우레우스 균주 ATCC BAA1556으로부터 수득된 게놈 DNA를 사용하여 PCR로 야생형 알파 독소(AT) 유전자를 증폭하였다. 반응액은 허큘라제(Herculase) II 중합효소(스트라타진(Stratagene))를 사용하는 50 ㎕ 반응액 중에 정방향 프라이머 atatatgagctcgcagattctgatattaatattaaaacc(서열번호 41), 역방향 프라이머 atatataagcttaatttgtcatttcttctttttccc(서열번호 42) 및 대략 10 ng의 게놈 DNA를 함유하였다. 생성된 단편을 SacI 및 HindIII로 절단하고 N 말단 6X His 태그와 인-프레임으로 pCold II DNA 벡터(타카라(TaKaRa)) 내로 라이게이션시켰다. 퀵체인지(QuikChange) II XL 부위-지정된 돌연변이유발 키트(스트라타진)를 제조자의 설명서에 따라 사용하여 야생형 유전자의 부위-지정된 돌연변이유발로 H35L 돌연변이체를 발생시켰다. 상기 돌연변이유발을 위해 사용된 돌연변이유발성 프라이머는 gataaagaaaatggcatgctcaaaaaagtattttatagttttatc(서열번호 43) 및 gataaaactataaaatacttttttgagcatgccattttctttatc(서열번호 44)이었다.
야생형 AT 및 ATH35L 돌연변이체의 서열을 자동화된 DNA 서열분석으로 확인하였다. 야생형 및 H35L 돌연변이체 알파 독소를 이. 콜라이 균주 BL21에서 발현시켰다. LB + 카베니실린에서 생장된 50 ㎖ 밤샘 배양물을 500 ㎖의 배양물로 1:10으로 희석하고 37℃에서 약 0.5의 A600까지 생장시켰다. 배양 조건을 30분 동안 15℃로 변동시킨 후 1 M IPTG를 첨가하여 약 100 mM의 최종 농도를 달성하였다. 배양물을 15℃에서 추가 24시간 동안 항온처리하였다. 세포를 원심분리하여 수거하였다.
재조합 his-태깅된 알파 독소((rAT-his)의 정제
세균 세포 펠렛을 얼음 상에서 해동시키고 Ni-NTA 완충제 A(20 mM 인산나트륨, pH 7.2, 300 mM NaCl)에서 재현탁하였다. 세포를 20,000 psi에서 미세유동화(마이크로플루이딕스(Microfluidics) 모델 M-110P)로 용해시켰고, 미정제 용해물을 4℃에서 27,000 x g로 10분 동안 원심분리하여 정화하였다. 0.2 ㎛ 여과 후, 상청액을 Ni-NTA 완충제 A로 평형화된 5 ㎖ Ni-NTA 수퍼플로우(Superflow) 컬럼(퀴아젠(Qiagen)) 상에 적재하였다. rAT-his를 300 mM 및 500 mM 이미다졸 단계 구배로 용출하였고, 1 mM의 최종 농도로 EDTA를 함유하는 튜브 내에 분획을 수집하고 SP 완충제 A(50 mM 인산나트륨, pH 7.0, 25 mM NaCl, 1 mM EDTA) 내로 투석하였다. SP 완충제 A 중의 투석물을 5 ㎖ 하이트랩(HiTrap) SP 세파로스 FF 컬럼(지이 헬쓰케어(GE Healthcare)) 상에 적재하였고 rAT-his를 1 M NaCl까지의 단계 구배로 용출하였다. rAT-his를 함유하는 분획을, 1 mM EDTA를 갖는 1X PBS(pH 7.2) 내로 투석하였고, 분취액을 -80℃에서 동결시켰다.
스타필로코커스 아우레우스로부터 천연 알파 독소의 정제
천연 알파 독소(nAT)를 스타필로코커스 아우레우스 우드 균주로부터 정제하였다. 스타필로코커스 아우레우스 우드 균주를 진탕하면서(예를 들면, 약 250 RPM) 37℃에서 트립신처리 콩 브로쓰(TSB)에서 밤새 생장시켰다. 배양물 상청액을 원심분리하여 수거한 후 고체 황산암모늄으로 75%까지 포화시켰다. 4℃에서 3시간 동안 교반한 후, 침전물을 12,000 x g로 45분 동안 원심분리하여 포획하고 SP 완충제 A(25 mM 아세트산나트륨, pH 5.2, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA)에서 재현탁하고 1회 교환하면서 4℃에서 SP 완충제 A에 대해 밤새 투석하였다. 불용성 물질을 4℃에서 27,000 x g로 30분 동안 원심분리하여 제거하였다. 가용성 투석물을 여과하고(0.2 ㎛) SP 완충제 A로 평형화된 10 ㎖ SP 세파로스 FF 컬럼(지이 헬쓰케어) 상에 적재하였다. 결합된 nAT를 300 mM NaCl까지의 선형 구배에 이어서 0.5 M 및 1 M NaCl에서의 단계 구배로 용출하였다. nAT를 함유하는 분획을 모아, 1 mM EDTA를 함유하는 PBS(pH 7.2) 내로 밤새 투석하였다. 최종 프로세싱 후, 1 mM EDTA를 갖는 1X PBS(pH 7.2) 중의 투석물을 1.3 ㎖/분의 유속으로 하이프렙 세파크릴 S-200 고해상 컬럼(지이 헬쓰케어) 상에 적재하였다. nAT를 함유하는 분획을 모아 분취하고 -80℃에서 동결시켰다.
면역화/하이브리도마 발생
RIMMS 면역화 요법(Kilpatrick et al (1997))에 따라 다수의 부위에서 rATH35L의 5회 피하 주사를 8주령의 벨록이뮨 마우스에게 제공하였다. 마우스를 2일 내지 3일의 간격으로 13일의 기간에 걸쳐 면역화시켰다. 매회 면역화를 위해, 마우스를 먼저 이소플루오란으로 마취시켰다. 면역원을 완전 또는 불완전 프로인트 항원보강제 및 타이터맥스 골드(TiterMax Gold) 항원보강제에서 유화시키고 목덜미, 겨드랑이, 종아리 및 사타구니에서 좌우양측으로 주사하였다. 시험 혈액을 13일째 날에 수집하여 항원 ELISA에서 분석하였다. 융합 전 부스트(pre-fusion boost)를 복강내로 마우스에게 제공하고 17일째 날에 희생시켰다. 림프절 림프구 및 비장세포를 골수종 파트너에 융합시켜 안정한 하이브리도마를 발생시켰다.
용혈 활성의 중화
50 ㎕의 각각의 B 세포 하이브리도마 배양 상청액을 96웰 플레이트에서 재조합 알파 독소-His(rAT-his, 0.1 ㎍/㎖ 최종 농도)와 혼합한 후, PBS 중의 5% 토끼 적혈구(RBC) 50 ㎕를 첨가하였다. 대조군 웰은 AT와 함께 또는 AT 없이 RBC 및 배양 배지만을 함유하였다. 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였고, 온전한 세포를 원심분리로 펠렛화하였다. 50 ㎕의 상청액을 새로운 96웰 플레이트로 옮겼고, A490을 분광광도계에서 측정하였다. RBC 및 rAT-his만을 사용한 용해에 비해 상대적으로 중화 활성을 다음과 같이 계산하였다: % 억제 = 100 x [100-(A490 nAT + Ab)/(A490 nAT(Ab 부재))].
정제된 mAb를 사용한 억제도 시험하였다. 항-AT mAb를 PBS 중의 약 80 ㎍/㎖의 농도로 96웰 플레이트에 첨가하였고, 샘플을 PBS로 50 ㎕의 최종 부피까지 연속적으로 (2배) 희석하였다. 비-특이적 IgG1(R347)을 동종형 대조군으로서 포함시켰다. 25 ㎕의 mAb 희석물을 96웰 환저 플레이트에서 25 ㎕의 nAT(천연 알파 독소)와 약 0.1 ㎍/㎖의 농도로 혼합한 후, 50 ㎕의 5% RBC를 첨가하였다. 용혈 활성의 억제를 상기와 같이 계산하였다.
키메라 항- AT mAb 의 발현 및 정제
정화된 뮤린 항-AT 상청액(대략 5 ℓ @ 30 mg/ℓ 내지 50 mg/ℓ)을 접선 유동 여과로 농축하였다. 그 다음, 농축된 상청액을 5개의 5 ㎖ 단백질 G 하이트랩 HP 컬럼에 순차적으로 통과시켰고, 결합된 IgG를 50 mM 중탄산나트륨(pH 11.0)으로 용출하고 1 M 인산으로 대략 pH 7.0까지 중화시켰다. 중화된 물질을 2개의 1 ㎖ 하이트랩 Q FF(지이 헬쓰케어) 컬럼 상에 순차적으로 적재하였다. IgG 함유 통과액을 수집하고 PBS(pH 7.2) 내로 투석하였다.
A549 용해의 중화
A549 세포를 5% CO2 37℃ 항온처리기 내에서 비-필수 아미노산, 글루타민 및 10% 태아 소 혈청으로 보충된 RPMI에서 유지하였다. 세포를 행크 균형(Hank's balanced) 배지로 1회 세척하고 RPMI(5% FBS) 중의 50 ㎕로 104/웰의 밀도로 플레이팅하고 5% CO2와 함께 37℃에서 20시간 동안 항온처리하였다. 항-AT mAb를 RPMI 중의 80 ㎍/㎖의 농도로 96웰 플레이트에 첨가하였고, 샘플을 RPMI로 연속적으로 (2배) 희석하였다. 관련 없는 IgG1(R347)을 동종형 대조군으로서 포함시켰다. 별도의 96웰 플레이트에서, 30 ㎕의 희석된 항체를 30 ㎕의 nAT(최종 농도, 5 ㎍/㎖)와 혼합하였다. 각각의 웰로부터 50 ㎕를, 부착된 A549 세포를 함유하는 플레이트로 옮겼다. nAT를 갖거나 갖지 않는 A549 세포의 대조군 웰을 포함시켰다. 플레이트를 5% CO2와 함께 37℃에서 3시간 동안 항온처리하고 원심분리하였고, 50 ㎕의 상청액을 새로운 96웰 플레이트로 옮겼다. 사이토톡스(Cytotox) 96 비-방사성 어세이 키트(프로메가(Promega))를 제조자의 프로토콜에 따라 사용하여 세포용해를 젖산 탈수소효소(LDH)의 방출로서 측정하였다. 배경 LDH를 각각의 웰로부터 차감하였고, LDH 방출의 억제를 계산하였다: % 억제 = 100 x [100-(A590 nAT + Ab)/(A590 nAT(Ab 부재))].
THP-1 용해의 중화
THP-1 세포를 5% CO2 37℃ 항온처리기 내에서 비-필수 아미노산(인비트로겐), 2 mM 글루타민(인비트로겐) 및 10% 태아 소 혈청(인비트로겐)으로 보충된 RPMI 배지에서 유지하였다. 항-AT mAb를 RPMI 중의 80 ㎍/㎖의 농도로 96웰 플레이트에 첨가하였고, 샘플을 RPMI로 50 ㎕의 최종 부피까지 연속적으로 (2배) 희석하였다. 관련 없는 IgG1(R347)을 동종형 대조군으로서 포함시켰다. 25 ㎕의 mAb 희석물을 25 ㎕의 천연 알파 독소(nAT)와 최종 1.5 ㎍/㎖ 농도로 혼합한 후, 50 ㎕의 RPMI를 첨가하여 96웰 플레이트에서 THP-1 세포(10% FBS를 갖는 RPMI 중의 106개 세포/㎖)를 세척하였다. 대조군 웰은 단독으로 또는 nAT와 함께 THP-1 세포로 구성되었다. 플레이트를 5% CO2 37℃ 항온처리기 내에서 3시간 동안 항온처리하고 원심분리하였고, 50 ㎕의 상청액을 새로운 96웰 플레이트로 옮겼다. 사이토톡스 96 비-방사성 어세이 키트(프로메가)를 제조자의 설명서에 따라 사용하여 세포용해를 젖산 탈수소효소(LDH)의 방출로서 측정하였다. LDH 방출의 억제를 전술된 바와 같이 계산하였다.
항- AT IgG mAb 의 클로닝 및 전체 인간 mAb 로서의 발현
다이나비드(Dynabeads) mRNA 다이렉트(Direct) 키트(인비트로겐)를 사용하여 5개의 하이브리도마 클론 2A3, 10A7, 12B8, 25E9 및 28F6의 mRNA를 단리하였다. 수퍼스크립트(SuperScript) III(인비트로겐) 역전사효소 및 무작위 칠량체 프라이머를 사용하여 cDNA의 제1 가닥을 합성하였다. Ig-프라이머 세트(노바겐(Novagen), 카달로그 # 69830)를 사용하여 인간 Ig VL(카파) 및 VH를 PCR로 증폭하였다. PCR에 의해 증폭된 VL 및 VH 생성물을 TOPO TA 벡터(인비트로겐 pCR2.1-TOPO) 내로 클로닝하고 서열분석하였다. 인간 IgG.카파.pOE 벡터 내로의 클로닝을 위한 제한효소 부위를 추가하는 PCR로 각각의 하이브리도마로부터의 VH 및 VL(카파)을 재증폭하였는데, 이때 VL은 인간 c-카파와 융합된 BssHII/BsiWI 부위에서 클로닝되었고, VH는 인간 IgG-1 중쇄 불변 영역과 융합된 BsrGI/SalI에서 클로닝되었다. 생성된 pOE 플라스미드를 DNA 서열분석으로 검증하였다.
항-알파 독소 mAb 발현 및 정제
엔도프리(Endofree) 플라스미드 맥시 키트(퀴아젠)를 사용하여 pOE 구축물의 플라스미드 DNA를 제조하였다. 프리스타일(Freestyle) 293 발현 배지(깁코(GIBCO)) 중의 293펙틴 시약(인비트로겐)을 사용하여 pOE 플라스미드를 293F 현탁 세포 내로 형질감염시켰다. 형질감염 후 6일째 날 및 9일째 날, 배양 배지를 수거하였고, 단백질 A-세파로스 컬럼(지이 헬쓰케어)을 이용하여 IgG를 정제하였다. IgG 함유 피크를 모아 PBS(pH 7.4) 내로 투석하고 -70℃에서 저장하였다. IgG 단백질의 순도를 SDS-PAGE로 검증하였다.
뮤린 폐렴 모델
감염 24시간 전, 복강내 주사를 통해 표시된 농도의 0.5 ㎖ mAb를 10마리의 7주령 내지 9주령의 C57BL/6J 마우스(할란(Harlan)) 군에게 제공하였다. 그 다음, 동물을 이소플루오란으로 마취시키고 수직으로 붙잡고 멸균 PBS 중의 스타필로코커스 아우레우스 세균 현탁액(1x108 CFU 내지 3x108 CFU) 0.05 ㎖를 좌측 및 우측 콧구멍 내로 접종하였다. 회복을 위해 동물을 누운 자세로 우리 내에 넣고 연구 기간 동안 매일 2회씩 관찰하였다. 동물 생존을 최대 6일 동안 모니터링하였다.
대안적으로, 세균 감염으로부터 48시간 후, 동물을 CO2 흡입으로 안락사시켰다. 폐 및 신장을 멸균 PBS 내로 분리하고 균질화하고 희석하고 세균 수 세기를 위해 플레이팅하였다. 로그-등급 검정을 이용하여 사망률 연구의 통계적 유의성을 측정하였다. 분산분석 및 던넷(Dunnett) 사후-검정을 이용하여 장기로부터의 세균 회수의 유의성을 계산하였다.
피부괴사의 뮤린 모델
5마리의 6주령 내지 8주령의 암컷 BALB/c 마우스들(할란)로 구성된 군의 마우스들의 등을 면도하고 그래프 상에 표시된 농도의 0.5 ㎖ IgG의 복강내 주사를 투여하였다. 24시간 후, 50 ㎕의 세균 현탁액(1x108 스타필로코커스 아우레우스)을 피하 주사하여 상기 마우스들을 감염시켰다. 동물들을 감염의 징후에 대해 매일 2회씩 모니터링하였고, 농양의 크기를 매일 동일한 시간에서 측정하였다. 식 A = L x W를 이용하여 병소 면적을 계산하였다. 분산분석 및 던넷 사후-검정을 이용하여 통계적 유의성을 측정하였다.
수용체 결합 어세이
500 ㎖의 용해 완충제(5 mM 인산염, 1 mM EDTA, pH 7.4) 중의 세척되고 팩킹된 토끼 적혈구(RBC) 5 ㎖를 일정하게 교반하면서 4℃에서 밤새 항온처리함으로써 파열 적혈구(ghosts)를 제조하였다. 그 다음, 상기 파열 적혈구를 15,000 x g로 원심분리하여 제거하고 용해 완충제로 3회 세척하였다. 그 다음, 상기 파열 적혈구를 PBS로 세척하고 3 ㎖의 최종 부피로 재현탁하였다.
nAT와 세포막의 결합을 평가하기 위해, 파열 RBC를 PBS로 대략 0.2의 OD600까지 희석하였고, 50 ㎕를 ½-웰 96웰 플레이트(코스타(Costar)) 상에 코팅하고 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 그 다음, 액체를 상기 플레이트로부터 제거하였고, 상기 웰을 4℃에서 PBS(pH 7.4) 중의 1% BSA 100 ㎕로 2시간 동안 차단하고 PBS로 3회 세척하였다. 20 몰 과량의 IgG를 3 ㎍/㎖의 nAT와 혼합하였고, 50 ㎕를 차단된 플레이트에 첨가하였다. 상기 플레이트를 4℃에서 2시간 동안 항온처리하고 PBS로 3회 세척하였다. 바이오틴으로 표지된 토끼 항-AT IgG를 1 mg/㎖의 농도로 상기 웰에 첨가하고 4℃에서 1시간 동안 항온처리하고 3회 세척하고 스트렙타비딘 퍼록시다제 접합체(1:30,000, 잭슨 이뮤노리서치(Jackson Immunoresearch))와 함께 항온처리하였다. 상기 웰을 3회 세척하고 슈어 블루 리저브(Sure Blue Reserve)(케이피엘 인코포레이티드(KPL, Inc.))로 현상하였다. 플레이트 판독기(몰레큘라 디바이시스(Molecular Devices))를 이용하여 A450을 판독하였고, 결합된 % AT를 계산하였다. 결합된 % AT = 100 x (A450 - AT + IgG/A450 - AT 단독).
올리고머화 어세이
리포소패스트(Liposofast) 압출기(아베스틴 인코포레이티드(Avestin, Inc.)) 및 공극 크기가 100 nm인 막을 사용하여 리포좀을 발생시켰다. 클로로포름 중의 난황 포스파티딜콜린(15 mg, 아반티 폴라 리피즈(Avanti Polar Lipids)), 난황 포스파티딜글리세롤(2.9 mg, 아반티 폴라 리피즈) 및 콜레스테롤(5.8 mg, 아반티 폴라 리피즈)의 혼합물(5:1:4, 몰비)을 질소 스트림 하에서 4℃에서 건조하였다. 그 다음, 건조된 지질 필름을 3 ㎖의 PBS(pH 7.4)(인비트로겐)로 재수화시키고 37℃에서 30분 동안 항온처리하였다. 그 다음, 샘플이 균일한 현탁액을 형성할 때까지 상기 샘플을 격렬히 볼텍싱한 후, 드라이 아이스 이소프로판올 배쓰(bath) 및 실온수를 사용하여 3회 동결-해동시켰다. 그 다음, 용액을 리포소패스트 압출기에 21회 통과시켰다.
AT(0.5 ㎍)를 정제된 IgG, 5 ㎕ 파열 RBC 및 PBS와 22 ㎕의 최종 부피로 혼합하고 37℃에서 45분 동안 항온처리하였다. 그 다음, 샘플을 37℃에서 5 ㎕의 SDS-PAGE 샘플 완충제에서 5분 동안 가용화시켰고, 10 ㎕를 4% 내지 12% 프리캐스트(precast) 폴리아크릴아미드 겔(인비트로겐)에서 SDS-PAGE로 분리하였다. 그 다음, 분리된 단백질을 니트로셀룰로스로 옮기고 PBS 중의 차단제 카세인(써모 사이언티픽(Thermo Scientific))으로 10분 동안 차단하고 일정하게 진탕하면서 실온에서 토끼 항-AT IgG(2 ㎍/㎖)로 2시간 동안 프로빙하였다. 알칼리성 포스파타제로 표지된 염소 항-토끼 2와 함께 1시간 동안 항온처리한 후 AT 밴드를 검출하고 BCIP/NBT 막 포스파타제 기질 시스템(케이피엘 인코포레이티드)을 사용하여 현상하였다.
반응속도 및 결합 상수(K D )의 측정
비아코어 3000 기기(비아코어 인코포레이티드) 상에서 IgG-포획 어세이 형식을 이용하여 항-AT IgG 항체와 정제된 nAT의 결합에 대한 반응속도 상수(kon, koff)를 측정하였다. 요약하건대, 래트 항-마우스-IgG를 제조자의 설명서에 따라 CM5 센서 칩 상에 고정시켰다. 센서 칩 상의 포획 시약의 최종 표면 밀도는 본원에 기재된 바와 같이 대략 2500 반응 유닛(RU)이었다. nAT를 사용하지 않는다는 점을 제외하고 동일한 면역화 프로토콜을 사용하여 이 센서 칩 상에서 기준 유동 세포 표면도 제조하였다. 기기 완충제(0.01 M HEPES를 함유하는 HBS-EP 완충제, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA 및 0.005% P-20) 중의 20 nM의 항-AT IgG 항체를 nAT의 2배 연속 희석물과 함께 제조하였다. 기기 완충제 중의 약 0.78 nM 내지 약 50 nM의 nAT 연속 희석물을 제조하였다.
반응 속도 측정을 위해 순차적인 방법을 이용하였다. 각각의 항-AT IgG를 먼저 포획 표면 및 기준 표면 상에 50 ㎕/분의 유속으로 주입하였다. 일단 포획된 IgG의 결합이 안정화되면, 단일 농도의 nAT 단백질을 상기 두 표면 상에 50 ㎕/분의 유속으로 주입하였다. 생성된 결합 반응 곡선을 이용하여 결합 상 데이터를 확인하였다. nAT의 주입 후, 유동을 기기 완충제 쪽으로 10분 동안 역전환시켜 해리 상 데이터가 수집되게 한 후, 10 mM 글리신(pH 1.5)을 1분 동안 펄스 주입하여 상기 칩 상의 IgG 포획 표면을 재생시켰다. 각각의 농도의 nAT의 이중 주입으로부터의 결합 반응을 모든 항-AT IgG들에 대해 기록하였다.
추가로, 여러 번의 완충제 주입을 일련의 주입 전체에 걸쳐 간헐적으로 수행하였다. 미처리된(raw) 데이터 세트를 주입 인공산물(artifact) 및/또는 비-특이적 결합 상호작용에 대해 보정하기 위해 기준 세포 반응과 함께 선택 완충제 주입을 이용하였다(통상적으로 "이중 기준"으로서 지칭됨)(D.G. Myszka, Improving biosensor analysis. J. Mol. Recognit. 12 (1999), pp. 279-284). 그 다음, 질량 수송-제한 결합이 검출되어야 하는 경우 이 결합을 보정하기 위한 항목을 포함하는 1:1 결합 모델(비아에발루에이션(BIAevaluation) 4.1 소프트웨어, 비아코어 인코포레이티드, 스웨덴 업살라 소재)에 전체적으로 보정된 결합 데이터를 전반적으로 피팅하였다. 이들 분석들은 반응속도(on, offf) 상수들을 측정하였고, 그 다음 이들 상수들로부터 겉보기 KD를 koff/kon으로서 계산하였다.
스타필로코커스 아우레우스에 감염된 폐에서 사이토카인 수준의 측정
1.5x108 cfu의 USA300(BAA-1556, ATCC)을 사용한 비강내 감염 24시간 전, 7주령 내지 9주령의 C57BL/6J 마우스를 복강내 주사로 2A3.1hu(전체 인간 2A3.1) 또는 R347(45 mg/kg)로 치료하였다. 감염으로부터 4시간 후 및 24시간 후, 마우스를 안락사시켰고, 폐를 1 ㎖의 PBS로 3회 씻어내었다. 기관지폐포 세척액(BAL)을 -70℃에서 저장하였다. 7 전구염증 II 마우스 사이토카인 키트(메소스케일(Mesoscale), 미국 메릴랜드주 게이더스버그 소재)를 제조자의 설명서에 따라 사용하여 전구염증 사이토카인을 정량하였다. 사이토카인 수준을 pg/㎖로서 표현하였다.
GST 융합 단백질의 클로닝 및 발현
AT1 -50 및 AT51 -293을 코딩하는 유전자 서열을 전술된 바와 같이 pColdII AT 클론으로부터 PCR로 증폭하였다. 반응액은 10 ng의 AT-pColdII DNA 및 각각 0.1 mg의 하기 정방향 프라이머 및 역방향 프라이를 함유하였고, **PCR 중합효소를 제조자(인비트로겐)의 설명서에 따라 사용하였다: (AT1 -50-F, atattggatccgcagattctgatattaatattaaaac(서열번호 45) 및 AT1 -50-R, atacttctcgagttatttattatgatttttatcatcgataaaac(서열번호 46); 또는 AT51 -293-F catagggatccaaactgctagttattagaacgaaag(서열번호 47) 및 AT51 -293-R, catagctcgagtcaatttgtcatttcttctttttcccaatc(서열번호 48)). 생성된 PCR 단편을 BamHI 및 XhoI으로 절단하고 N 말단 글루타티온 S 트랜스퍼라제(GST) 태그와 인-프레임으로 pGex 6P DNA 벡터(스트라타진) 내로 라이게이션시켰다. 클론의 서열을 자동화된 DNA 서열분석으로 확인하였다.
이. 콜라이의 BL21(DE3) 균주를 숙주로서 사용하여 단편의 발현을 달성하였다. 여러 개의 콜로니를 플레이트로부터 픽킹하여 100 ㎖ LB + 100 ㎍/㎖ 앰피실린(시그마 케미칼 컴파니(Sigma Chemical Company)) 내로 접종하고 37℃에서 밤새 생장시켰다. 밤샘 배양물을 LB + 100 ㎍/㎖ 앰피실린의 3 x 1 ℓ 배양물 내로 1:100으로 희석하고 대략 250 RPM에서 진탕하면서 대략 0.8의 OD600까지 생장시켰다. 그 다음, 1 mM의 IPTG를 첨가하여 단백질 발현을 유도하였다. 배양물을 진탕하면서 37℃에서 2시간 동안 계속 항온처리하였다. 세균 세포를 원심분리로 수거하고 -20℃에서 동결시켰다.
세포 펠렛을 100 ㎖ PBS(pH 7.4)(인비트로겐)에서 재현탁하고 20,000 psi에서 미세유동화(마이크로플루이딕스 모델 M-110P)로 용해시켰고, 미정제 용해물을 4℃에서 27,000 x g로 10분 동안 원심분리하여 정화하였다. 생성된 상청액을 GSTrap FF 컬럼(지이 헬쓰케어) 상에 적재하였고, GST-AT1 -50 및 GST-AT51 -293의 가용성 분획을 제조자의 설명서에 따라 정제하였다. 불용성 GST-AT51 -293 분획을 불용성 세포 펠렛으로부터 정제하였다. 25 mM 인산나트륨(pH 7.4) 중의 3 M 구아니딘-HCl에서 약하게 진동시키면서 불용성 물질을 실온에서 약 1시간 동안 가용화시켰다. 가용화된 물질을 재폴딩 완충제 A[2 M 구아니딘-HCl을 갖는 25 mM 인산나트륨(pH 7.4)]로 7배 희석하였다. GST-AT51 -293을 점진적인 투석으로 재폴딩시켰다. 4℃에서 대략 2 M, 1 M 및 이어서 0.5 M의 구아니딘 농도에 대해 매회 12시간 내지 15시간의 투석을 수행한 후, 동등한 부피의 재폴딩 완충제 B[25 mM 인산나트륨(pH 7.4)]를 투석 비이커에 첨가하였다. 그 다음, GST-AT51 -293을 재폴딩 완충제 B에 대해 24시간 동안 투석하였다. 최종 투석물을 원심분리로 정화하였고, 가용성 분획을 전술된 바와 같이 GSTrap 컬럼 상에서 정제하였다.
도트 블롯 어세이
아미노산 40 내지 293에 걸쳐 있는 중첩 펩티드를 화학적으로 합성하였다(뉴 잉글랜드 펩티드((New England Peptide)). AT1 -50의 합성을 시도하였으나 성공하지 못하였다. 알파 독소(AT), AT 펩티드 및 AT 단편(1 ㎍)을 니트로셀룰로스 상에 점찍고 PBS 중의 차단제 카세인으로 10분 동안 차단하였다. 그 다음, 블롯을 실온에서 2 ㎍/㎖의 개별 IgG로 프로빙하였다. 상기 블롯을 세척하고 알칼리성 포스파타제와 접합된 염소 항-마우스 또는 염소 항-토끼 IgG(1:1000, 칼태그 레이보레이토리스(Caltag Laboratories))와 함께 1시간 동안 항온처리하고 BCIP/NBT 막 포스파타제 기질 시스템(케이피엘 인코포레이티드)을 사용하여 현상하였다.
LC10 YTE와 알파 독소 및 LukF-PV의 결합의 ELISA 특징규명
His-태깅된 알파 독소 또는 LukF-PV를 함유하는 세균 용해물을 4℃에서 96웰 플레이트의 표면 상에 밤새 코팅하였다. 플레이트를 PBS/0.05% 트윈-20으로 6회 세척하고 37℃에서 10% 수퍼블록(Superblock) 차단 완충제(피어스(Pierce), 미국 일리노이주 록포드 소재)로 1시간 동안 차단하였다. 2 ㎍/㎖의 LC10 YTE 또는 마우스 항-His mAb(알앤드디 시스템스(R&D Systems), 미국 미네소타주 미네아폴리스 소재)를 웰에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 그 다음, 플레이트를 PBS/0.05% 트윈-20으로 6회 세척하였다. 각각 항-인간 또는 항-마우스 IgG HRP 접합체(잭슨 이뮤노리서치 레이보레이토리스 인코포레이티드(Jackson ImmunoResearch laboratories, Inc.), 미국 펜실베니아주 웨스트 그로브 소재)를 사용하여 결합된 LC10 YTE 또는 마우스 항-His mAb를 검출하였다.
알파 독소와 LukF-PV 사이의 키메라 변이체의 발생
알파 독소 및 LukF-PV의 부분으로 구성된 키메라 변이체를 발생시켜 알파 독소 상의 LC10 YTE의 결합 영역을 확인하였다. 아미노산 1-51, 아미노산 52-110, 아미노산 111-147, 아미노산 148-205, 아미노산 204-241 또는 아미노산 248-293에서 LukF-PV 영역을 코딩하는 6개의 알파 독소 키메라 변이체의 DNA 구축물을 유전자 합성으로 발생시켰다. 알파 독소 또는 LukF-PV를 코딩하는 pET3d 플라스미드(사내제작 플라스미드)를 주형으로서 사용하는 중첩 연장 PCR을 이용하여, 다른 키메라 변이체를 코딩하는 DNA 구축물을 생성하였다. 그 다음, 모든 DNA 구축물을 pET3d 세균 발현 벡터(이엠디 케미칼스 인코포레이티드(EMD Chemicals Inc), 미국 펜실베니아주 필라델피아 소재) 내로 클로닝하고 이. 콜라이 균주 BL21(DE3)(인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재) 내로 형질전환시켰다. 형질전환된 BL21(DE3) 세포를 매직메디아(MagicMedia) 이. 콜라이 발현 배지(인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)에서 생장시켜 표준 프로토콜을 이용하여 변이체 단백질을 발현시켰다.
프로테온(ProteOn)을 사용한, LC10 YTE와 키메라 변이체의 결합 특성의 특징규명
프로테온 XPR36 기기(바이오라드(BioRad), 미국 캘리포니아주 허큘레스 소재)를 이용하여 LC10 YTE와 알파 독소/LukF-PV 키메라 변이체의 결합 특성을 연구하였다. 표준 아민 커플링을 이용하여, 10 mM 아세트산나트륨(pH 5.0) 중의 항-알파 독소 다중클론 항체(사내제작에 의해 발생된 항체)를 각각의 채널에 대해 약 5000 공명 유닛(RU)의 양으로 GLC 바이오센서 칩의 표면에 고정시켰다. 약 200 RU의 포획 반응을 수득하기 위해 세균 용해물 상청액 중의 알파 독소/LukF-PV 키메라 단백질을 고정된 GLC 표면 상에 주입하였다. 비-형질전환된 세균 용해물 상청액도 기준 채널과 동일한 조건 하에서 주입하였다. LC10 YTE 샘플을 인산염 완충 식염수(PBS)(pH 7.4) 및 0.005% 트윈-20에서 제조하고 전형적으로 50 nM 내지 3.125 nM의 농도로 150초 또는 180초 동안 90 ㎕/분의 유속으로 주입하였다. 600초 또는 800초 해리 시간을 이용하였다. 다음과 같이 LC10 YTE을 주입한 후, 키메라 변이체의 발현 수준도 모니터링하였다: 600초 또는 800초 해리 시간을 이용하여 전형적으로 50 nM 내지 3.125 nM의 농도로 150초 또는 180초 동안 90 ㎕/분의 유속으로 항-알파 독소 다중클론 항체를 유동시켰다. 글리신(10 mM, pH 1.5)을 100 ㎕/분의 유속으로 30초 동안 주입하여 표면을 2회 재생시켰다. 모든 센서그램 데이터를 프로테온 매니저 3.0.1 소프트웨어로 프로세싱하였다.
실시예 2: 항-알파 독소 mAb 발생
뮤린 불변 도메인에 융합된 전체 인간 가변 영역을 갖는 항체 레파토리를 함유하도록 유전적으로 조작된 벨록이뮨 마우스에서 항-알파 독소(AT) 단일클론 항체(mAb)를 발생시켰다. 발생된 항체는 키메라 mAb로부터의 인간 가변 도메인을 클로닝된 인간 IgG-1로부터의 불변 도메인과 유전적으로 융합시킴으로써 전체 인간 IgG로 용이하게 전환되는 인간:마우스 키메라이다. 마우스를 본원에 기재된 바와 같이 비-용혈 AT 돌연변이체(ATH35L)로 면역화시켰고, 표준 방법을 이용하여 하이브리도마를 발생시켰다. 먼저, 1800개 초과의 하이브리도마 상청액이 항원 ELISA에 의해 재조합 AT(rAT-his)에 결합된 IgG를 함유한다는 것을 발견하였다. 그 다음, 용혈 어세이에서 토끼 적혈구 세포(RBC)의 rAT-his 매개 용해의 억제를 이용하여 rAT-his와의 결합을 나타낸 하이브리도마 상청액을 활성에 대해 스크리닝함으로써, 기능성 mAb들의 풀을 약 250까지 감소시켰다. 그 다음, 하이브리도마 상청액을 IgG 수준에 대해 표준화하였고, 그들의 억제 활성을 비교하였다. 13개의 가장 강력한 rAT-his 억제제들을 제한 희석 클로닝을 위해 선별하고 소규모 IgG 발현 및 정제를 위해 사용하였다. 후술된 바와 같이, 이들 클론들의 스크리닝 및 후속 생화학적 및 생체내 특징규명 후, 하기 표 7에 나열된 바와 같이, VH 및 VL 서열들을 더 최적화하여 추가 항체를 발생시켰다.
실시예 3: 세포용해 활성의 억제
13개의 정제된 항-AT IgG의 억제 활성을 용혈 어세이에서 비교하였다. 정제된 항-AT mAb를 일정량의 nAT 및 토끼 적혈구의 존재 하에서 용혈 어세이에서 적정하였다. mAb를 일정량의 천연 AT(nAT) 및 토끼 적혈구(RBC)의 존재 하에서 약 20 ㎍/㎖로부터 각각 적정하였다. 상청액 내로의 헤모글로빈 방출로 용혈을 측정하였다. 퍼센트(%) 용혈 억제를 다음과 같이 계산하였다: % 억제 = 100*[100-(A490 nAT + Ab)/(A490 nAT(Ab 부재))]. 13개의 가장 강력한 rAT-his 억제제를 입증하는 대표적인 용혈 어세이는 도 1a 및 1b에 제시되어 있다. 비-특이적 IgG 대조군(R347)은 음성 대조군으로서 포함되었다.
13개의 정제된 mAb 중 7개의 정제된 mAb(mAb; 2A3.1, 10A7.5, 11D12.1, 12B8.19, 15B6.3, 25E9.1 및 28F6.1)만이 nAT 매개 RBC 용해를 억제하였다(도 1a 및 1b 참조). 3개의 항체들(2A3.1, 10A7.5 및 12B8.19)이 강력한 억제제이었고 1:1(몰 IgG:몰 AT) 비로 nAT 매개 RBC 용해의 약 80% 억제를 나타내었다. 이들 결과들은 발생된 mAb가 토끼 RBC에서 공극 형성을 억제할 수 있다는 것을 암시하였다.
인간 적혈구는 AT에 대한 다수의 수용체들을 보유하지 않는다. 따라서, 인간 RBC는 nAT 매개 용해에 대해 토끼 RBC만큼 민감하지 않고 감염 동안 AT에 대한 일차 표적이 아닐 가능성이 있다. 다른 종류의 세포(예를 들면, 상피세포, 림프구, 단핵구 및 대식세포)가 스타필로코커스 감염 동안 nAT의 효과에 대한 보다 더 적절한 표적이다. 정제된 항체의 활성을 인간 세포주 A549(폐포 상피세포주) 및 THP-1(단핵구 세포주)의 nAT 매개 용해에서 조사하였다. 단일클론 항체(mAb)를 A549 또는 THP-1 세포의 존재 하에서 일정한 수준의 nAT에 대해 적정하였다. 세포용해를 젖산 탈수소효소(LDH)의 방출로 정량하였고, LDH 방출의 % 억제를 본원에 기재된 바와 같이 측정하였다. 결과는 도 2a 및 2b에 그래프로 제시되어 있다. A549 세포의 용해를 억제하고 THP-1 세포의 nAT 매개 용해에 대해 영향을 미치지 않는 11D12.1을 제외하고 토끼 RBC 용해를 억제한 mAb는 인간 A549 및 THP-1 세포(각각 도 2a 및 2b 참조) 둘다의 nAT 매개 용해도 억제하였다. 이들 mAb들에 의해 나타나는 강력한 항-AT 활성은 감염 동안 AT 활성을 억제하는 데에 있어서 이들 항체들의 잠재적 유용성을 강조함으로써, 스타필로코커스 관련 증상 및 질환의 진행을 제한한다.
실시예 4: 항- AT mAb 를 사용한 수동 면역화는 피부괴사 병소를 감소시킨다.
스타필로코커스 아우레우스는 종종 염증, 조직 손상 및 고름 형성을 특징으로 하는, 병원 및 지역사회 둘다에서의 피부 및 연조직 감염(SSTI)의 주요 원인이다. AT는 과다염증 반응 및 조직 손상을 유발하는 이들 감염에서 일정한 역할을 수행할 수 있으므로, AT 기능의 억제는 심각한 질환을 야기하는 상기 세균의 능력을 제한할 것이다. 스타필로코커스 아우레우스 감염의 효과를 최소화하거나, 감소시키거나 제거하는 데에 있어서 항-AT mAb의 유용성을 확인하기 위해, 스타필로코커스 아우레우스 우드를 사용한 피하 감염 24시간 전에 7개의 억제 mAb(예를 들면, 약 5 mg/kg) 및 IgG-1 동종형 대조군(R347) 각각을 5마리의 마우스들로 구성된 군에게 복강내(IP)로 주사하였다. 피부괴사 병소의 크기를 6일 동안 매일 측정하고 도 3a(도 3a에 나타낸 6일)에 나타낸 바와 같이 사진촬영으로 기록하였다. 도 3a 및 3b에 나타낸 바와 같이, 5개의 가장 강력한 시험관내 nAT 기능 억제제(2A3.1, 10A7.5, 12B8.19, 25E9.1 및 28F6.1)는 R347 대조군에 비해 상대적으로 병소 크기를 실질적으로 감소시킨 반면, 가장 덜 강력한 mAb(11D12.1, 15B6.3)는 시험관내에서 대조군에 비해 상대적으로 병소 크기에 대해 실질적인 영향을 미치지 않았다. 도 3b는 시간의 경과에 따른 병소 크기의 감소를 그래프로 보여준다. 2A3.1, 10A7.5, 12B8.19, 25E9.1 및 28F6.1은 시험관내에서 AT 기능의 강력한 억제제이고 SSTI의 뮤린 모델에서 강력한 예방 효과도 나타낸다. 추가 항체 LC10, QD20, QD33 및 QD37을 피부괴사 모델에서도 시험하였다. 전술된 바와 같이, 스타필로코커스 아우레우스 우드를 사용한 피하 감염 24시간 전에 이들 단일클론 항체들을 1 mg/kg 및 0.5 mg/kg의 양으로 군 당 5마리의 마우스들에게 복강내(IP)로 주사하였다. 결과는 도 17의 A 및 B에 제시되어 있다. 던넷 사후-검정을 이용하여 p-값을 계산하였다. 1 mg/kg 실험의 경우, 시험 Ab와 비교된 R347 대조군에 대한 p-값은 p<0.0001이었다. 0.5 mg/kg 실험의 경우, 시험 Ab와 비교된 R347 대조군에 대한 p-값은 p<0.05이었다.
실시예 5: 항- AT mAb 를 사용한 수동 면역화는 뮤린 폐렴에서 생존을 향상시킨다.
발생된 가장 강력한 항-AT mAb를 사용한 예방을 뮤린 폐렴 모델에서 시험하였다. 스타필로코커스 아우레우스 USA300(BAA-1556)을 사용한 비강내 감염 24시간 전에 C57BL/6J 마우스를 약 5 mg/kg, 약 15 mg/kg 및 약 45 mg/kg의 2A3.1, 10A7.5, 12B8.19 또는 28F6.1로 수동적으로 면역화시켰다. 그 다음, 도 4 내지 7에 나타낸 바와 같이, 생존을 6일 동안 모니터링하고 45 mg/kg의 동종형 대조군(R347)과 비교하였다. 로그-등급 검정을 이용하여 통계적 유의성을 계산하였다. 도 4는 다양한 양의 mAB 12B.19를 사용한 수동 면역화 후 스타필로코커스 아우레우스 감염의 경과에 따른 퍼센트 생존을 그래프로 보여준다. 도 5는 다양한 양의 mAB 2A3.1을 사용한 수동 면역화 후 스타필로코커스 아우레우스 감염의 경과에 따른 퍼센트 생존을 그래프로 보여준다. 도 6은 다양한 양의 mAB 28F6.1을 사용한 수동 면역화 후 스타필로코커스 아우레우스 감염의 경과에 따른 퍼센트 생존을 그래프로 보여준다. 도 7은 다양한 양의 mAB 10A7.5를 사용한 수동 면역화 후 스타필로코커스 아우레우스 감염의 경과에 따른 퍼센트 생존을 그래프로 보여준다.
나타낸 모든 항-AT 항체들이 대조군에 비해 상대적으로 생존을 유의하게 개선하여 45 mg/kg 용량에서 90% 이상의 생존에 이르게 하였다(도 4 내지 7 참조). 알파 독소는 스타필로코커스 폐렴에 있어서 핵심 병독성 결정인자인 것으로 생각된다. 본원에서 제공된 결과는 강력한 억제 mAb의 수동 투여가 질환 예방을 위한 유효한 방법이라는 것을 보여준다. 이와 더불어, 본원에서 제공된 동물 연구는 스타필로코커스 질환에 있어서 AT에 대한 역할을 뒷받침하고, AT 기능을 억제하여 스타필로코커스 아우레우스 감염과 관련된 질환 중증도 또는 심지어 사망을 제한하는 mAb의 용도에 대한 뒷받침증거를 제공한다.
감염 동안 세균 수에 대한 항-AT mAb의 영향을 더 특징규명하기 위해, 대략 1.3x108 cfu의 스타필로코커스 아우레우스 USA300을 사용한 비강내 감염 24시간 전에 mAb 2A3.1(예를 들면, 2A3hu)의 전체 인간 버전을 예방 목적으로 마우스에게 전달하였다. 감염으로부터 48시간 후, 상기 마우스를 안락사시켰고, 그들의 폐 및 신장을 수집하여 세균 수 세기를 위해 프로세싱하였다(도 8a 및 8b 참조). 감염으로부터 4시간 및 24시간 후, 마우스를 안락사시켰고, 사이토카인 생성의 측정(후술되어 있고 도 9 참조) 및 조직병리학적 분석(후술되어 있고 도 10 참조)을 위해 샘플을 채취하였다. 던넷 사후-검정을 이용하여 p-값을 계산하였다. 세균 수 세기의 대표적인 결과는 도 8a 및 8b에 제시되어 있다. 예방을 목적으로 하는 2A3hu의 투여는 R347 대조군에 비해 상대적으로 폐(도 8a 참조) 및 신장(도 8b 참조) 둘다에서 세균 수를 유의하게 감소시켰는데, 이것은 AT 기능의 억제가 질환 진행을 제한할 수 있고 제거를 향상시킬 수 있고 침입 유기체의 전신 확산도 제한할 수 있다는 것을 암시한다.
추가 항체 LC10, QD20, QD33 및 QD37도 폐렴 모델에서 시험하였다. 대략 2x108 cfu의 스타필로코커스 아우레우스 USA300을 사용한 비강내(IN) 감염 24시간 전에 이들 단일클론 항체들을 5 mg/kg의 양으로 군 당 10마리의 마우스들에게 복강내(IP)로 주사하였다. 이들 실험들의 결과들은 도 18에 제시되어 있다. 던넷 사후-검정을 이용하여 p-값을 계산하였다. OD37과 비교된 2A3 mAb에 대한 p-값은 p=0.0072이었고, LC10과 비교된 2A3 mAb에 대한 p-값은 p=0.0523이었고, QD33과 비교된 2A3 mAb에 대한 p-값은 p=0.0521이었다.
실시예 6: 폐렴 모델에서 AT 의 억제는 전구염증 사이토카인 생성을 감소시킨다.
스타필로코커스 아우레우스 폐렴 감염은 전형적으로 증가된 면역 세포 활성화 및 침윤을 초래하여 궁극적으로 증가된 울혈 및 조직 괴사를 초래하는 것으로 생각되는 전구염증 사이토카인의 과다생성을 동반한다(Bubeck Wardenburg,J. 2007). 스타필로코커스 아우레우스 AT 결실 돌연변이체는 뮤린 폐렴 모델에서 그의 동질유전자 야생형 스타필로코커스 아우레우스에 비해 상대적으로 감소된 병독성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. AT에 대한 능동 면역화 및 수동 면역화는 급성 폐 손상의 공지된 매개제인 IL-1β의 발현을 감소시켰고 중증 폐렴으로부터 마우스를 보호하였다는 것도 입증되었다(Bubeck Wardenburg,J. 2007; Bubeck Wardenburg, J. 2008). 이들 결과들은 스타필로코커스 아우레우스 감염 동안 AT의 억제가 전구염증 사이토카인의 생성을 감소시킬 수 있으므로 과도한 세포 침윤을 제한할 수 있고 결과적으로 상기 관찰된 바와 같이 폐렴의 증상을 감소시킬 수 있고 세균 제거를 향상시킬 수 있다는 것을 암시한다.
이 가설을 시험하기 위해, 대략 1.3x108 cfu의 스타필로코커스 아우레우스 USA300을 사용한 비강내 감염 24시간 전에 마우스를 2A3hu로 수동적으로 면역화시켰다. 감염으로부터 4시간 및 24시간 후, 상기 마우스를 안락사시켰고, 해마톡실린 및 에오신 염색 및 현미경 검사를 위해 폐의 절반을 고정시키고 준비한 반면, 기관지폐포 세척액을 폐의 나머지 절반으로부터 수집하고 프로세싱하여 사이토카인 수준을 측정하였다. 수동 면역화 후 사이토카인 생성의 대표적인 결과는 도 9에 제시되어 있다. 도 10은 본원에 기재된 mAb를 사용한 수동 면역화의 효능을 그래프로 보여준다.
도 9(24시간 시점에서 원으로 표시된 결과 참조)에 나타낸 바와 같이, 감염으로부터 4시간 후 사이토카인 수준은 R347로 치료된 마우스와 2A3hu로 치료된 마우스에서 유사하였으나, 감염으로부터 24시간 후 IL-6, TNF-α, KC 및 IL-1β의 수준은 2A3hu로 치료된 동물에서 모두 감소하였는데, 이것은 예방을 목적으로 하는 2A3hu의 투여가 대조군에 비해 검출된 사이토카인의 수준을 감소시켰다는 것을 암시한다. 이들 데이터는 R347로 치료된 마우스가 세균 콜로니의 존재와 함께 현저한 폐 염증, 괴사 및 폐포염을 가졌다는 것을 보여주는 폐의 조직병리학적 검사로부터의 결과에 의해 뒷받침된다(도 10에서 상부 좌측 및 하부 좌측 사진 참조). 대조적으로, 2A3hu로 치료된 동물은 가시적인 괴사, 폐포염 또는 세균 콜로니를 갖지 않으면서 제한된 폐 염증을 가졌다(도 10에서 상부 우측 및 하부 우측 사진 참조). 폐렴 모델에서 항-AT mAb의 보호 효과는 국소 조직 손상을 제한할 수 있고 세균 제거를 촉진할 수 있는 감소된 염증 반응과 관련되어 있다.
실시예 7: 결합 반응속도 및 경쟁
강력한 억제 활성을 나타낸 mAb를 더 특징규명하기 위해 표면 플라스몬 공명(SPR)을 이용하여 친화성 측정을 수행하였다. 래트 항-마우스 IgG를 사용하여 정제된 IgG를 센서 상에서 포획하였고, 칩을 상이한 농도의 nAT를 갖는 용액에 노출시켰다. 결합 속도 상수 및 해리 속도 상수를 측정하였고, 이들로부터 결합 상수를 결정하였다. 하기 표에 나타낸 바와 같이, 항체 2A3.1, 10A7.5, 25E9.1 및 12B8.19는 각각 601 pM, 504 pM, 337 pM 및 485 pM의 KD 값으로 유사한 친화성을 나타낸 반면, 28F6.1은 13 nM의 KD 값을 나타내었다. KD는 koff/kon로서 계산되었다.
Figure 112013081238763-pct00003
SPR을 이용하여 경쟁 실험도 수행하였고, 이의 결과는 항체 2A3.1, 10A7.5, 25E9.1 및 12B8.19가 동일한 또는 유사한 에피토프에 결합할 가능성이 있다는 것을 암시한다.
mAb QD20, LC10, QD33, QD37 및 2A3GL에 대한 IC50 및 Kd 값이 하기 표에 제시되어 있다.
Figure 112013081238763-pct00004
0.1 mg/㎖의 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소를 사용하는 RBC 용혈 어세이를 이용하여 IC50을 계산하였다.
실시예 8: 억제 mAb 는 SDS 내성 칠량체의 형성을 차단한다.
스타필로코커스 아우레우스 알파 독소(AT)는 분비된 가용성 단량체 AT 분자가 세포 표면 수용체에 결합하거나 세포막에 비-특이적으로 흡착하고 세포 표면 상에서 칠량체성 예비공극으로 올리고머화되고 후속 표적 세포용해를 매개하는 14-가닥 경막 β-배럴(barrel)의 형성을 초래하는 입체구조적 변화를 겪는 다단계 과정에서 세포를 용해하는 것으로 생각된다. 본원에 기재된 mAb에 의한 억제의 기작을 더 특징규명하여 억제 mAb가 어느 단계에서 AT 기능을 차단하는지를 확인하였다. AT와 96웰 조직 배양 플레이트에 부착된 토끼 파열 RBC의 결합을 방해하는 이들 mAb들의 능력을 조사하였다. 96웰 ELISA 플레이트를 파열 RBC로 코팅하고 2% BSA로 차단하였다. 그 다음, 상기 파열 RBC를 nAT +/- 20 몰 과량의 항-AT IgG와 함께 항온처리하였다. 그 다음, nAT의 결합을 토끼 항-AT IgG로 검출하였고 % 결합을 계산하였다: % 결합 = 100 x [100-(A490 nAT + mAb)/(A490 nAT(mAb 부재))]. 도 11에 나타낸 바와 같이, 20 몰 IgG 과량에서 nAT와 토끼 RBC 막의 결합의 억제가 없었는데, 이것은 이들 억제 mAb가 수용체 결합의 단계에서 작용하지 않았다는 것을 암시한다.
AT 및 다른 공극 형성 독소는 세포막 이외에 리포좀 막에서 용이하게 조립되어 공극을 형성하는 것으로 밝혀졌다. 먼저, AT 칠량체 형성에 대한 항-AT IgG의 효과를 리포좀 상에서 시험하였다. 도 12에 나타낸 바와 같이, IgG의 존재 하에서 AT를 10배 몰 과량의 리포좀(지질:AT, 야생형:야생형)과 함께 항온처리한 후, 웨스턴 블롯 분석으로 칠량체 형성을 조사하였다. 그 다음, 샘플을 37℃의 SDS-PAGE 샘플 완충제에서 가용화시켰고, 웨스턴 블롯 분석으로 칠량체 형성을 검출하였다. SDS 내성 칠량체의 존재는 도 12의 레인 6 및 7(예를 들면, 각각 mAb9D7.3 및 IgG 부재 대조군 레인)에서 나타낸 겔의 상부에서 용이하게 뚜렷이 보인다. 모든 억제 mAb들이 칠량체 형성을 제거한 반면, 관련 없는 동종형 대조군(예를 들면, 레인 6; 9D7.3)은 효과를 나타내지 않았다. 도 13a 및 13b에 나타낸 대표적인 웨스턴 블롯에서 보이는 바와 같이, 토끼 파열 RBC에 대한 올리고머화 어세이에서 mAb 2A3.1, 10A7.5 및 12B8.19를 사용하여 올리고머화 활성의 억제를 확인하였다. 토끼 파열 적혈구와의 항온처리 및 SDS-PAGE에 의한 칠량체 형성의 검출 전에 AT를 IgG의 적정물과 함께 항온처리하였다. mAb 2A3.1, 10A7.5 및 12B8.19는 1:1 IgG:독소 비(몰:몰)에서조차도 AT 칠량체 형성을 효과적으로 억제하였고, 올리고머화 억제 효과는 mAb 수준이 감소됨에 따라 적정되었다(도 13a 및 13b 참조; 0.5:1 및 0.25:1의 몰비에서 칠량체의 출현). 이들 결과들은 mAb 2A3.1, 10A7.5 및 12B8.19가 SDS 내성 칠량체 형성의 억제를 통해 AT 매개 세포용해를 방해한다는 것을 암시한다.
실시예 9: 전체 인간 IgG 로의 전환
전체 인간 IgG는 인간 IgG-1의 불변 도메인에 유전적으로 융합된, 본원에 기재된 키메라 mAb로부터의 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 가변 도메인을 포함한다. 각각의 키메라 mAb로부터의 VH 및 VL을 클로닝하고 서열분석하고 각각 인간 IgG-1 VH 및 인간 카파 불변 도메인에 융합시켰다. 생성된 전체 인간 IgG-1은 결합을 담당하는 인간 가변 영역 및 관심 있는 mAb의 결합 성질을 보유하는 것으로 밝혀졌다. 전체 인간 항체들을 발현시키고 정제하였고, 그들의 활성을 벨록이뮨 마우스 하이브리도마로부터 단리된 키메라 mAb와 비교하였다. 원래의 25E9.1 키메라보다 실질적으로 더 강력해진 25E9.1hu를 제외하고 전체 인간 mAb는 RBC, A549 및 THP-1 세포용해의 억제제 있어서 원래의 키메라와 유사한 효능을 나타내었다. 도 14 내지 16은 적혈구(RBC; 도 14 참조), A549 세포(도 15 참조) 및 THP-1 세포(도 16 참조)에서 세포용해의 특징인 LDH 방출의 억제를 그래프로 보여준다. 인간 25E9.1 mAb(예를 들면, 25E9.1hu)의 효능의 증가는 2개의 상이한 항-AT IgG 분자들(이들 중 하나만이 nAT 기능을 억제하는 활성을 보유하였을 수 있음)을 함유하는, 원래의 하이브리도마 내의 혼합된 세포 집단으로부터 비롯되었을 수 있다. 따라서, 원래의 키메라 mAb에 대한 몰농도 계산과 활성 측정은 직접적인 상관관계를 갖지 않을 수 있다.
실시예 10: 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소에 특이적으로 결합하는 항체에 대한 대표적인 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열
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Figure 112013081238763-pct00006
Figure 112013081238763-pct00007
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Figure 112013081238763-pct00009
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[표 7]
Figure 112013081238763-pct00011
Figure 112013081238763-pct00012
Figure 112013081238763-pct00013
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Figure 112013081238763-pct00017
[표 8]
Figure 112013081238763-pct00018
Figure 112013081238763-pct00019
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Figure 112013081238763-pct00022
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실시예 11: 항- 스타필로코커스 알파 독소 항체 결합 영역의 맵핑
Fc 변이체를 함유하는 mAb LC10(LC10 YTE)에 상응하는 항체가 결합하는 알파 독소의 단편을 확인하기 위해 알파 독소 및 LukF-PV의 부분으로 구성된 키메라 변이체를 구축하였다. LukF-PV는 LC10 YTE에 의해 인식되지 않지만(도 19) 알파 독소와의 높은 구조적 유사성(Gouaux, E., M. Hobaugh, et al. "alpha-Hemolysin, γ-hemolysin, and leukocidin from Staphylococcus aureus: distant in sequence but similar in structure." Protein Sci 6(12): 2631-5 (1997); Meesters, C., A. Brack, et al. "Structural characterization of the alpha-hemolysin monomer from Staphylococcus aureus." Proteins 75(1): 118-26 (2009)) 및 25% 서열 동일성(도 20)을 공유하기 때문에 LukF-PV를 키메라 파트너로서 선택하였다. 50개의 알파 독소 아미노산(aa)을 그들의 상응하는 LukF-PV 대응물로 체계적으로 치환시킴으로써 일련의 키메라 변이체를 구축하였다. 관심 있는 선택된 50개 아미노산 절편 내의 보다 짧은 영역도 치환시켰다(표 11). 프로테온 기기를 이용하여 이들 변이체들에 대한 LC10 YTE의 결합 친화성을 분석하였다. LC10 YTE와 변이체의 결합 결과는 표 11에 요약되어 있다.
Figure 112013081238763-pct00024
KO_73-81을 제외한 모든 키메라 구축물들은 일정 수준으로 발현될 수 있었다(표 11). LC10 YTE는 알파 독소의 아미노산 101-110(KO_52-110 및 KO_101-110) 또는 아미노산 224-231(KO_204-241, KO_204-231 및 KO_224-231) 대신에 LukF-PV를 코딩하는 변이체에 결합하지 못하였다. 아미노산 248-277(KO_248-277) 또는 이의 보다 더 큰 절편 아미노산 248-293(KO_248-293) 각각을 치환시켰을 때 LC10 YTE의 결합은 유의하게 손상되었거나 완전히 파괴되었다.
일부 경우, LC10 YTE와의 결합의 명확한 결여는 부정확한 폴딩을 나타내는 개별 알파 독소/LukF-PV 변이체에 의해 설명될 수 있다. 또한, 정확하게 폴딩하는 능력의 전체적인 결여는 KO 73-81 발현의 명확한 결여를 설명할 수 있다. 추가로, 알파 독소와 LukF-PV 사이의 아미노산 서열 상동성은 상이한 영역들에서 실질적으로 상이하다. 예를 들면, 알파 독소의 아미노산 179-193에 상응하는 절편은 LukF-PV와 67% 동일성을 공유하는 반면, 전체 서열은 25% 동일성을 공유한다. 따라서, 높은 서열 상동성을 갖는 영역들을 교환하였을 때 LC10 YTE 결합에 대한 영향이 없다는 것이 관찰되었지만, 이들 영역들은 LC10 YTE 항체가 결합하는 추가 서열을 잠재적으로 함유할 수 있었다.
상기 돌연변이유발 분석으로부터의 결과는 알파 독소의 3개 영역들, 즉 아미노산 101-110, 아미노산 224-231 및 아미노산 248-293 중 임의의 영역을 LukF-PV 잔기들로 치환시킨 것이 LC10 YTE 결합을 손상시켰지만 나머지 아미노산 영역들의 치환은 유의한 영향을 미치지 않았다는 것을 암시한다.
이들 3개 영역들은 알파 독소의 삼차원적 구조에서 2개의 상이한 위치를 나타낸다. 아미노산 101-110 및 224-231에 상응하는 절편은 공간적으로 인접하여 존재하고 베타-샌드위치 도메인의 한 측면 상에 위치하는 반면, 아미노산 248-277에 상응하는 절편은 주로 "림" 도메인 상에 위치한다(Song, L., M. R. Hobaugh, et al., "Structure of staphylococcal alpha-hemolysin, a heptameric transmembrane pore." Science 274(5294): 1859-66 (1996))(도 21).
아미노산 248-277에 상응하는 절편은 결합에 대한 영향을 보였고 아미노산 261-272를 포함하는 것으로서 확인된 X-선 구조 접촉 잔기도 함유하였다(이때, T263, N264 및 K266은 실제 접촉 잔기임)(도 20). 또한, 결정 구조는 D183, W187 및 N188이 실제 접촉 잔기인 아미노산 173-201에 상응하는 또 다른 절편을 보여주었다(도 20). 이 특정 절편(KO_148-205)을 함유하는 키메라 변이체는 LC10 YTE와의 우수한 결합을 여전히 나타내었다. 이것은 알파 독소와 LukF-PV 사이의 이 특정 영역의 높은 서열 상동성(52% 동일성 및 63% 유사성)에 기인할 가능성이 있다. 접촉 잔기 주변의 아미노산(아미노산 179-193)은 훨씬 더 높은 상동성(67% 동일성)을 공유하지만, 대조적으로 전체 서열은 25% 동일성만을 공유한다.
돌연변이유발-기초 방법을 이용하여, 아미노산 248-277에 상응하는 절편이 LC10 YTE에 대한 결합에 중요하다는 것을 확인하였다. 이것은 LC10 YTE/알파 독소 복합체 구조의 구조적 분석에 의해서도 확인되었다. 구조적 분석은 아미노산 261-272 내에 존재하는, 아미노산 248-277 단편 내의 일부 접촉 잔기들도 보여주었다.
상기 논의된 바와 같이, LC10 YTE mAb의 접촉 잔기를 확인하기 위한 X-선 결정학 실험을 수행하였다. 정제된 알파 독소(잔기 1 내지 293) 및 LC10 YTE Fab를 별도로 농축하였다. 거의 등몰량의 이들 단백질들을 함께 혼합하였고, 용액을 세파덱스 S75(지이 헬쓰케어) 컬럼 상에서 겔-여과 크로마토그래피로 분석하였다. 용출된 피크는 서로 결합된 두 단백질 분자들을 함유하였다. 추가 농축 및 결정화는 2.5 Å까지 회절된 결정을 발생시켰다.
분자 치환 방법을 이용하여 복합체의 구조를 해석하였다. 상보성 결정 영역이 제거되어 있는 미리 확인된 Fab 구조(D25)를 LC10 YTE Fab에 대한 주형으로서 사용하였다. 일부 절두(truncation)를 갖는 칠량체 복합체(PDB Id. 7AHL)로부터 유래된 알파 독소 분자의 단량체를 알파 독소 분자의 주형으로서 사용하였다. 결정학 연구에 사용된 알파 독소 분자의 서열은 서열번호 39의 서열에 상응한다. CCP4 프로그램 스위트(suite)로부터의 파서(Phaser) 프로그램을 이용하여 LC10 YTE-알파 독소 복합체의 비대칭 유닛 당 2개의 복합체를 확인하였다. CCP4 프로그램 스위트로부터의 레프맥(Refmac) 프로그램을 이용하여 상기 구조의 모델을 더 개량하였다. 특정 결정학 프로그램 "O"를 이용하여 매뉴얼 구축 및 반복적 모델 개선을 수행하였다.
Fab의 중쇄 및 경쇄 둘다가 알파 독소 분자와 접촉한다는 것을 발견하였다(도 22). 구체적으로, 결정학 연구는 중쇄 및 경쇄 둘다에 대한 하기 잔기들에 상응하는, 알파 독소 분자 내의 접촉 잔기들을 확인하였다: N177, W179, G180, P181, Y182, D183, D185, S186, W187, N188, P189, V190, Y191 및 R200. 또한, 경쇄는 T261, T263, N264, K266 및 K271과 접촉한다는 것을 확인하였다. 파라토프(Paratope)는 다음과 같다는 것을 확인하였다: LC - W32(CDR1), K50(CDR2), Y91, A92, N93, Y94, W95 (CDR3); HC - D33(CDR1), T53, A54, D56, Y58(CDR2), D98, Y100, P102, T103, G104, H105, Y106(CDR3).
결정학 분석으로부터의 구조 데이터를 도입하는 분자 모델링은 알파 독소 구조의 대부분이 단량체 상태로부터 칠량체 상태로 전이되는 동안 변화되지 않은 상태로 유지된다는 것을 보여주었다. 그러나, 핵심 결합 영역(이때, 접촉 잔기는 T261, T263, N264, K266 및 K271로서 확인되었음)은 칠량체 형성에 참여하는 알파 독소 분자의 부분에 상응하는 것으로 밝혀졌다. 알파 독소 분자가 단량체 상태로 존재할 때 조밀하게 폴딩되고 숙주 세포막 내로의 삽입 전에 루프로서 확장되고(도 23b) 궁극적으로 칠량체 상태로 조립된 후 버섯 유사 구조의 줄기를 형성하는(도 23a) 것은 이 핵심 영역이다. 칠량체 상태에서, 도 24a에 나타낸 바와 같이, 이 영역은 LC10 YTE 항체 분자에 의한 결합으로부터 가려질 것으로 예측된다.
실시예 12: 항- 스타필로코커스 알파 독소 항체의 치료 효능
상기 논의된 결과는 예방에 사용된 항-AT mAb의 효능을 기술한다. 이들 mAb들도 치료적으로 작용할 수 있을 가능성을 조사하기 위해, 피부괴사 모델 및 폐렴 모델 둘다에서 치료 환경 하에서 LC10의 효능을 시험하였다. 피부괴사 모델에서, 세균 챌린지 24시간 전(예방) 및 피내 감염 1시간, 3시간 또는 6시간 후(치료)에 LC10을 정맥내로 투여하였다. 동물의 병소 크기를 6일 동안 모니터링하였다. 예방(24시간 전) 및 감염으로부터 1시간 또는 3시간 후 치료는 음성 대조군(R347)에 비해 상대적으로 병소 크기를 감소시켰다(도 24). 이 모델에서 LC10을 감염으로부터 6시간 후 전달하였을 때 강한 치료 이점이 상실되었다. 이들 결과들은 LC10이 스타필로코커스 피부 및 연조직 감염을 위한 효과적인 치료법으로서 작용할 수 있다는 것을 암시한다.
LC10이 예방 목적으로 또는 비강내 감염으로부터 1시간, 3시간 또는 6시간 후 마우스에게 (정맥내로) 전달된 폐렴 모델에서 유사한 실험을 수행하였다. 예측된 바와 같이, 예방을 목적으로 하는 mAb 투여는 완전한 생존이라는 결과를 제공하였다(도 25). LC10이 감염으로부터 1시간, 3시간 또는 6시간 후 투여되었을 때 완전한 생존이라는 결과가 제공되지 않았지만, 가장 높은 LC10 용량의 LC10이 감염으로부터 1시간 후 치료에 사용되었을 때 음성 대조군에 비해 상대적으로 사망에 이르는 시간에서의 이점이 있었다. 높은 감염 용량 및 빠른 사망 발생에 대한 상기 모델의 요건에 비추어 볼 때, 이들 생존 개선은 인간 감염 동안 치료 개선이 일어날 수 있다는 것을 암시한다.
실시예 13: 항-알파 독소 mAb LC -10과 병용된 반코마이신의 효능
항-알파 독소 mAb 및 반코마이신 단독치료법을 병용치료법과 비교함으로써 뮤린 폐렴 모델에서 반코마이신과 함께 보조 치료법에서 사용될 항-알파 독소 mAb LC10의 잠재력을 평가하기 위한 연구를 착수하였다.
7주령의 암컷 C57BL/6J 마우스를 2e8 cfu(LD100)의 메티실린 내성 스타필로코커스 아우레우스 USA300으로 비강내로 감염시켰다. 최적 용량 및 미효능(sub-efficacious) 용량을 확인하기 위해 반코마이신 및 LC10을 개별적으로 적정하였다. 단일치료법 또는 반코마이신을 함께 사용하는 이중치료법에서 mAb를 평가하기 위해, 감염으로부터 1시간 후 마우스를 단회 복강내 용량의 LC10 또는 음성 대조군 항체 R347(15 mg/kg)로 치료하였다. 단일치료법 또는 이중치료법에서 반코마이신 치료를 감염으로부터 1시간 후에 개시하였고 3일 동안 하루 당 2회씩 피하 투여하였다. 모든 치료군들에 대한 퍼센트 생존을 7일의 말기에서 측정하였다. 맨델-콕스(Mandel-Cox) 로그-등급 검정을 이용하여 생존 곡선을 분석하였다.
200 mg/kg/일 또는 40 mg/kg/일의 반코마이신을 사용한 치료는 각각 90% 및 43%의 생존이라는 결과를 제공하였다. 감염 후, 45 mg/kg 또는 15 mg/kg의 LC10을 사용한 단일치료법은 50% 및 33%의 마우스를 보호하였다(도 26의 A 및 B). 단회 미효능 용량의 LC10(15 mg/kg)을 사용하고 40 mg/kg의 반코마이신의 하루 당 2회 투약을 이용하는 병용치료법은 75%의 동물의 생존이라는 결과를 제공하였다. 40 mg/kg/일의 반코마이신과 45 mg/kg LC10을 병용하였을 때 90%의 마우스들이 생존하였다. 반코마이신을 사용한 단일치료법과 15 mg/kg 또는 45 mg/kg의 LC10을 함께 사용한 병용치료법 사이의 생존 차이는 통계적으로 유의하였다(각각 p=0.026 및 p=0.015). 반코마이신과 LC10의 공-투여는 이이소볼로그램 분석으로 확인하였을 때 상승작용적 효과를 발생시켰다(도 27).
실시예 14: 특정 실시양태들의 예
일부 실시양태들의 비-한정적 예가 이하에 제공되어 있다.
A1. 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하고 하기 (a) 내지 (c)를 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
(a) 서열번호 7, 10, 13 또는 69와 동일하거나 이들 서열들에 비해 상대적으로 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1;
(b) 서열번호 8, 11, 14, 17, 70 또는 75와 동일하거나 이들 서열들에 비해 상대적으로 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; 및
(c) 서열번호 9, 12, 15, 18, 16, 65, 66, 67, 71, 72, 76 또는 78과 동일하거나 이들 서열들에 비해 상대적으로 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3.
A2. 실시양태 A1에 있어서, VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3이 서열번호 7, 8 및 9; 서열번호 10, 11 및 12; 서열번호 13, 14 및 15; 서열번호 7, 17 및 18; 서열번호 7, 8 및 16; 서열번호 7, 8 및 65; 서열번호 7, 8 및 66; 서열번호 7, 8 및 67; 서열번호 7, 8 및 78; 서열번호 69, 70 및 71; 서열번호 7, 8 및 72; 서열번호 69, 75 및 71; 서열번호 69, 75 및 76; 또는 서열번호 69, 70 및 71로 표시되는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
A3. 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하고 하기 (a) 내지 (f)를 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
(a) 서열번호 7, 10, 13 또는 69의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1;
(b) 서열번호 8, 11, 14, 17, 70 또는 75의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2;
(c) 서열번호 9, 12, 15, 18, 16, 65, 66, 67, 71, 72, 76 또는 78의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3;
(d) 서열번호 1 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1;
(e) 서열번호 2, 5, 73 또는 77의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및
(f) 서열번호 3, 6, 64, 68 또는 74의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3.
A4. 실시양태 A3에 있어서, VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3이 서열번호 7, 8, 9, 1, 2 및 3; 서열번호 10, 11, 12, 1, 2 및 3; 서열번호 13, 14, 15, 4, 5 및 6; 서열번호 7, 17, 18, 1, 2 및 3; 서열번호 7, 8, 16, 1, 2 및 64; 서열번호 7, 8, 65, 1, 2 및 64; 서열번호 7, 8, 66, 1, 2 및 64; 서열번호 7, 8, 67, 1, 2 및 68; 서열번호 7, 8, 67, 1, 2 및 64; 서열번호 7, 8, 78, 1, 2 및 64; 서열번호 7, 8, 65, 1, 2 및 68; 서열번호 69, 70, 71, 1, 2 및 68; 서열번호 7, 8, 72, 1, 73 및 74; 서열번호 69, 75, 71, 1, 2 및 68; 서열번호 69, 75, 76, 1, 2 및 68; 서열번호 69, 75, 76, 1, 77 및 74; 또는 서열번호 69, 70, 71, 1, 77 및 74의 아미노산 서열에 상응하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
A5. 실시양태 A1에 있어서, (i) 3개의 CDR들을 포함하는 VH 쇄 도메인 및 3개의 CDR들을 포함하는 VL 쇄 도메인을 포함하고, (ii) 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 이때 VH 쇄 도메인의 3개 CDR들이 하기 (a) 내지 (c)를 포함하는 것인 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
(a) 서열번호 7, 10, 13 또는 69의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1;
(b) 서열번호 8, 11, 14, 17, 70 또는 75의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; 및
(c) 서열번호 9, 12, 15, 18, 16, 65, 66, 67, 71, 72, 76 또는 78의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3.
A6. 실시양태 A5에 있어서, VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3이 서열번호 7, 8 및 9; 서열번호 10, 11 및 12; 서열번호 13, 14 및 15; 서열번호 7, 17 및 18; 서열번호 7, 8 및 16; 서열번호 7, 8 및 65; 서열번호 7, 8 및 66; 서열번호 7, 8 및 67; 서열번호 7, 8 및 78; 서열번호 69, 70 및 71; 서열번호 7, 8 및 72; 서열번호 69, 75 및 71; 서열번호 69, 75 및 76; 또는 서열번호 69, 70 및 71의 아미노산 서열에 상응하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
A7. 실시양태 A1에 있어서, (i) 3개의 CDR들을 포함하는 VH 쇄 도메인 및 3개의 CDR들을 포함하는 VL 쇄 도메인을 포함하고, (ii) 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 이때 VL 쇄 도메인의 3개 CDR들이 하기 (a) 내지 (c)를 포함하는 것인 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
(a) 서열번호 1 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1;
(b) 서열번호 2, 5, 73 또는 77의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및
(c) 서열번호 3, 6, 64, 68 또는 74의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3.
A8. 실시양태 A7에 있어서, VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3이 서열번호 1, 2 및 3; 서열번호 4, 5 및 6; 서열번호 1, 2 및 64; 서열번호 1, 2 및 68; 서열번호 1, 73 및 74; 또는 서열번호 1, 77 및 74의 아미노산 서열에 상응하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
A9. (i) 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하고, (ii) 서열번호 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 또는 62의 아미노산 서열에 대해 90% 이상의 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인을 포함하고, (iii) 서열번호 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 또는 63의 아미노산 서열에 대해 90% 이상의 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
A10. 실시양태 A9에 있어서, VH 및 VL이 서열번호 20 및 19; 서열번호 22 및 21; 서열번호 24 및 23; 서열번호 26 및 25; 서열번호 28 및 27; 서열번호 41 및 42; 서열번호 43 및 44; 서열번호 45 및 46; 서열번호 47 및 48; 서열번호 49 및 50; 서열번호 51 및 52; 서열번호 53 및 54; 서열번호 55 및 56; 서열번호 57 및 58; 서열번호 59 및 60; 서열번호 61 및 58; 서열번호 62 및 58; 서열번호 62 및 63; 또는 서열번호 79 및 63의 아미노산 서열에 상응하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
A11. 서열번호 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 또는 62의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 또는 63의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
A12. 실시양태 A11에 있어서, VH 및 VL이 서열번호 20 및 19; 서열번호 22 및 21; 서열번호 24 및 23; 서열번호 26 및 25; 서열번호 28 및 27; 서열번호 41 및 42; 서열번호 43 및 44; 서열번호 45 및 46; 서열번호 47 및 48; 서열번호 49 및 50; 서열번호 51 및 52; 서열번호 53 및 54; 서열번호 55 및 56; 서열번호 57 및 58; 서열번호 59 및 60; 서열번호 61 및 58; 서열번호 62 및 58; 서열번호 62 및 63; 또는 서열번호 79 및 63의 아미노산 서열에 상응하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
A13. 실시양태 A1 내지 A12 중 어느 한 실시양태에 있어서, 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하고 하기 (a) 내지 (e)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 특성을 갖는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
(a) 알파 독소에 대한 약 13 nM 이하의 친화성 상수(KD);
(b) 알파 독소 단량체에 결합하지만, 알파 독소와 알파 독소 수용체의 결합을 억제하지 않는 특성;
(c) 알파 독소 올리고머의 형성을 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상까지 억제하는 특성;
(d) (예를 들면, 세포용해 및 용혈 어세이에 의해 측정되었을 때) 알파 독소 세포용해 활성을 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상까지 감소시키는 특성; 및
(e) (예를 들면, 동물 폐렴 모델에서) 세포 침윤 및 전구염증 사이토카인 방출을 감소시키는 특성.
A14. 실시양태 A1 내지 A13 중 어느 한 실시양태에 있어서, 추가 물질(agent)을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
A15. 실시양태 A14에 있어서, 추가 물질이 항생제인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
A16. 실시양태 A14에 있어서, 링커를 통해 치료제에 연결되어 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
A17. 실시양태 A1 내지 A13 중 어느 한 실시양태에 있어서, 진단제를 추가로 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
A18. 실시양태 A17에 있어서, 진단제가 조영제를 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
A19. 실시양태 A17에 있어서, 진단제가 검출가능한 표지를 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
A20. 실시양태 A17에 있어서, 링커를 통해 진단제에 연결되어 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
A21. 실시양태 A1 내지 A20 중 어느 한 실시양태에 있어서, 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드가 천연 독소 폴리펩티드인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
A22. 실시양태 A1 내지 A20 중 어느 한 실시양태에 있어서, 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드가 서열번호 39 또는 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
A23. 실시양태 A13에 있어서, 세포가 혈액 또는 폐로부터 유래된 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
A24. 실시양태 A23에 있어서, 혈액으로부터 유래된 세포가 적혈구인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
A25. 실시양태 A13, A23 및 A24 중 어느 한 실시양태에 있어서, 세포용해가 용혈 시험관내 어세이 또는 젖산 탈수소효소 시험관내 어세이에 의해 측정되는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
A26. 실시양태 A1 내지 A25 중 어느 한 실시양태에 있어서, 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하고 서열번호 9, 12, 15, 18, 16, 65, 66, 67, 71, 72, 76 또는 78과 동일하거나 이들 서열들에 비해 상대적으로 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드를 중화시키는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
A27. 실시양태 A1 내지 A26 중 어느 한 실시양태에 있어서, 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하고 서열번호 3, 6, 64, 68 또는 74와 동일하거나 이들 서열들에 비해 상대적으로 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드를 중화시키는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
A28. 실시양태 A1 내지 A27 중 어느 한 실시양태에 있어서, 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하고 서열번호 9, 12, 15, 18, 16, 65, 66, 67, 71, 72, 76 또는 78과 동일하거나 이들 서열들에 비해 상대적으로 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드의 올리고머화를 억제하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
A29. 실시양태 A1 내지 A28 중 어느 한 실시양태에 있어서, 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하고 서열번호 3, 6, 64, 68 또는 74와 동일하거나 이들 서열들에 비해 상대적으로 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드의 올리고머화를 억제하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
A30. 실시양태 A13, A28 및 A29 중 어느 한 실시양태에 있어서, 올리고머화의 억제가 시험관내 결합 및/또는 전기영동 이동성 어세이에 의해 측정되는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
D1. 실시양태 A1 내지 A30 중 어느 한 실시양태의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물.
B1. (a) 실시양태 A1 내지 A30 중 어느 한 실시양태의 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 실시양태 D1의 조성물; 및 (b) 상기 조성물의 사용 설명서 또는 상기 조성물의 사용 설명서를 수득하기 위한 지침서를 포함하는 키트.
B2. 실시양태 B1에 있어서, 조성물 중의 항체가 고체 지지체에 연결되어 있는 것인 키트.
B3. 실시양태 B2에 있어서, 고체 지지체가 비드인 키트.
B4. 실시양태 B3에 있어서, 비드가 세파로스 비드인 키트.
B5. 실시양태 B1 내지 B4 중 어느 한 실시양태에 있어서, 사용 설명서가 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드의 단리, 정제, 검출 및 정량 중 하나 이상을 포함하는 것인 키트.
B6. 실시양태 B1 내지 B5 중 어느 한 실시양태에 있어서, 완충제, 고체 지지체, 또는 완충제 및 고체 지지체를 포함하는 키트.
B7. 실시양태 B6에 있어서, 고체 지지체가 비드, 필터, 막 및 다중웰(multiwall) 플레이트 중 하나 이상인 키트.
B8. 실시양태 B6에 있어서, 웨스턴 블롯에 적합한 완충제 및 막을 포함하는 키트.
B9. 실시양태 B6에 있어서, 적재 완충제 및 용출 완충제를 포함하는 키트.
B10. 실시양태 B6에 있어서, 효소 연결 면역흡착 어세이(ELISA)에 적합한 완충제를 포함하는 키트.
C1. 대상체에서 폐렴을 예방하거나, 치료하거나 관리하는 방법으로서, 실시양태 A1 내지 A30 중 어느 한 실시양태의 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 실시양태 D1의 조성물을 폐렴의 예방, 치료 또는 관리에 효과적인 양으로 폐렴의 예방, 치료 또는 관리가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
C2. 실시양태 C1에 있어서, 폐렴을 예방하는 방법인 방법.
C3. 실시양태 C1 또는 C2에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 서열번호 39 내의 입체구조적 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 것인 방법.
C4. 대상체에서 피부 감염 병태를 예방하거나, 치료하거나 관리하는 방법으로서, 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 피부 감염 병태의 예방, 치료 또는 관리에 효과적인 양으로 상기 병태의 예방, 치료 또는 관리가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
C5. 실시양태 C4에 있어서, 피부 감염 병태가 피부괴사인 방법.
C6. 실시양태 C4 또는 C5에 있어서, 피부 감염 병태가 피부의 스타필로코커스 아우레우스 감염을 포함하는 것인 방법.
C7. 실시양태 C4 내지 C6 중 어느 한 실시양태에 있어서, 피부 감염 병태를 예방하는 방법인 방법.
C8. 스타필로코커스 아우레우스 감염과 관련된 병태를 예방하거나, 치료하거나 관리하는 방법으로서, 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 상기 독소 폴리펩티드의 올리고머화의 감소에 효과적인 양으로 상기 병태의 예방, 치료 또는 관리가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
C9. 실시양태 C8에 있어서, 스타필로코커스 아우레우스 감염과 관련된 병태를 예방하는 방법인 방법.
C10. 스타필로코커스 아우레우스 감염과 관련된 병태를 예방하거나, 치료하거나 관리하는 방법으로서, 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 적혈구 용해의 감소에 효과적인 양으로 상기 병태의 예방, 치료 또는 관리가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
C11. 실시양태 C10에 있어서, 스타필로코커스 아우레우스 감염과 관련된 병태를 예방하는 방법인 방법.
C12. 실시양태 C10 또는 C11에 있어서, 적혈구가 혈액 또는 폐로부터 유래된 세포인 방법.
C13. 실시양태 C4 내지 C12 중 어느 한 실시양태에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 하기 (a) 내지 (e)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 특성을 갖는 것인 방법:
(a) 알파 독소에 대한 약 13 nM 이하의 친화성 상수(KD);
(b) 알파 독소 단량체에 결합하지만, 알파 독소와 알파 독소 수용체의 결합을 억제하지 않는 특성;
(c) 알파 독소 올리고머의 형성을 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상까지 억제하는 특성;
(d) (예를 들면, 세포용해 및 용혈 어세이에 의해 측정되었을 때) 알파 독소 세포용해 활성을 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상까지 감소시키는 특성; 및
(e) (예를 들면, 동물 폐렴 모델에서) 세포 침윤 및 전구염증 사이토카인 방출을 감소시키는 특성.
C14. 실시양태 C13에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 서열번호 39 내의 입체구조적 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 것인 방법.
C15. 실시양태 C1 내지 C14 중 어느 한 실시양태에 있어서, 대상체에게 투여되는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 조성물이 실시양태 A1 내지 A30 및 D1 중 어느 한 실시양태에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 조성물인 방법.
C16. 실시양태 A1 내지 A30 중 어느 한 실시양태의 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 실시양태 D1의 조성물을 세포에게 투여하는 단계; 및 상기 세포에게의 상기 조성물의 투여와 관련된 생물학적 효과의 존재, 부재 또는 양을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
C17. 실시양태 A1 내지 A30 중 어느 한 실시양태의 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 실시양태 D1의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계; 및 상기 조성물의 투여와 관련된 생물학적 효과의 존재, 부재 또는 양을 상기 대상체에서 검출하는 단계를 포함하는 방법.
C18. 실시양태 A1 내지 A30 중 어느 한 실시양태의 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 실시양태 D1의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계; 및 상기 대상체의 병태를 모니터링하는 단계를 포함하는 방법.
C19. 유효량의 실시양태 A1 내지 A30 중 어느 한 실시양태의 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 실시양태 D1의 조성물을 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드의 중화가 필요한 대상체에게 투여하여 상기 독소 폴리펩티드를 중화시킴으로써 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 폴리펩티드를 중화시키는 방법.
C20. 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소에 의해 매개된 병태의 예방, 치료 또는 관리가 필요한 대상체에서 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소에 의해 매개된 병태를 예방하거나, 치료하거나 관리하는 방법으로서, 유효량의 실시양태 A1 내지 A30 중 어느 한 실시양태의 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 실시양태 D1의 조성물을 상기 대상체에게 투여하여 상기 병태를 예방하거나, 치료하거나 관리하는 단계를 포함하는 방법.
C21. 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소에 의해 매개된 장애의 증상의 치료, 예방 또는 완화가 필요한 대상체에서 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소에 의해 매개된 장애의 증상을 치료하거나, 예방하거나 완화하는 방법으로서, 유효량의 실시양태 A1 내지 A30 중 어느 한 실시양태의 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 실시양태 D1의 조성물을 상기 대상체에게 투여하여 상기 증상을 치료하거나, 예방하거나 완화하는 단계를 포함하는 방법.
C22. 대상체에서 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소에 의해 매개된 병태를 진단하는 방법으로서, 진단이 필요한 대상체를 선별하는 단계, 및 진단 유효량의 실시양태 A1 내지 A30 중 어느 한 실시양태의 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 실시양태 D1의 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
C23. 실시양태 C1 내지 C22 중 어느 한 실시양태에 있어서, 대상체가 가축인 방법.
C24. 실시양태 C1 내지 C22 중 어느 한 실시양태에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
C25. 실시양태 A1 내지 A30 중 어느 한 실시양태의 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 실시양태 D1의 조성물을 사용하여 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 올리고머의 형성을 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상까지 억제하는 방법.
C26. 실시양태 C25에 있어서, 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 올리고머의 형성의 억제가 활성 공극 형성 복합체의 형성을 억제하는 것인 방법.
C27. 실시양태 A1 내지 A30 중 어느 한 실시양태의 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 실시양태 D1의 조성물을 사용하여 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 세포용해 활성을 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상까지 감소시키는 방법으로서, 이때 상기 세포용해 활성이 세포용해 및/또는 용혈 어세이에 의해 측정되는 것인 방법.
본원에서 인용된 각각의 특허, 특허출원, 공개문헌 및 문서의 전체내용은 참고로 도입된다. 상기 특허, 특허출원, 공개문헌 및 문서의 인용은 이들 문헌들 중 임의의 문헌이 관련 종래 기술이라는 것을 인정하는 것이 아니고 이들 공개문헌 또는 문서의 내용 또는 날짜에 대한 임의의 인정을 구성하는 것도 아니다.
본원의 기본 양태를 벗어나지 않으면서 전술된 것들을 변경할 수 있다. 본 기술이 하나 이상의 특정 실시양태와 관련하여 상당히 상세히 기재되어 있지만, 당분야에서 통상의 기술을 가진 자는 본원에 구체적으로 개시된 실시양태들을 변경시킬 수 있고, 이들 변경 및 개선이 본 기술의 범위 및 사상 내에 있다는 것을 인식할 것이다.
본원에 예시적으로 기재된 기술은 적절하게는 본원에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 구성요소(들)의 부재 하에서 실시될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 각각의 경우 본원에서 용어 "포함하는", "로 본질적으로 구성된" 및 "로 구성된" 중 임의의 용어는 나머지 2개 용어들로 대체될 수 있다. 사용된 용어 및 표현은 제한의 용어로서 사용된 것이 아니라 설명의 용어로서 사용되고, 이러한 용어 및 표현의 사용은 제시되고 기재된 특징들 및 이들의 일부의 임의의 등가물을 배제하지 않고, 다양한 변경이 청구된 본 기술의 범위 내에서 가능하다. 하나의 구성요소가 기재되어 있는지 아니면 하나 초과의 구성요소가 기재되어 있는지가 문맥상 명확하지 않은 한, 용어 "하나" 또는 "한"은 이 용어가 수식하는 구성요소들 중 하나 또는 복수의 구성요소를 지칭할 수 있다(예를 들면, "하나의 시약"은 하나 이상의 시약을 의미할 수 있다). 본 기술이 대표적인 실시양태 및 임의적 특징에 의해 구체적으로 개시되어 있지만, 본원에 개시된 개념의 변경 및 변이는 당업자에 의해 도출될 수 있고 이러한 변경 및 변이는 본 기술의 범위 내에 있는 것으로 간주된다는 것을 이해해야 한다.
본원의 일부 실시양태는 하기 특허청구범위에 기재되어 있다.
SEQUENCE LISTING <110> MEDIMMUNE, LLC <120> ANTIBODIES THAT SPECIFICALLY BIND STAPHYLOCOCCUS AUREUS ALPHA TOXIN AND METHODS OF USE <130> ATOX-100WO1 <140> <141> <150> 61/440,581 <151> 2011-02-08 <160> 92 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 2 Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser 1 5 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 3 Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Trp Thr 1 5 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 4 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp Leu Gly 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial 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acaggaaaag gtctggagtg ggtctcagtt attggtactg atggtgacac atactatcca 180 ggctccgtga agggccgatt catcatctcc agagaaaatg ccaagaactc cttgtatctt 240 gaaatgaaca gcctgagagc cggggacacg gctgtgtatt actgtgcaag agatcggtat 300 agcagctcga accactacaa cggtatggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 33 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 33 gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggccagtca gagtattagt agctggttgg cctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaaggtcct gatctataag gcgtctagtt tagaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gatgattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt attggacgtt cggccaaggg 300 accaaggtgg aaatcaaa 318 <210> 34 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 34 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt aggtacgaca tgcactgggt ccgccaagct 120 acaggaaaag gtctggagtg ggtctcagtt attggtactg atggtgacac atactatcca 180 ggctccgtga agggccgatt catcatctcc agagaaaatg ccaagaactc cttgtatctt 240 gaaatgaaca gcctgagagc cggggacacg gctgtgtatt actgtgcaag agatcggtat 300 agcagctcga accactacaa cggtatggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 35 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 35 gccatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gggcattaga aatgatttag gctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgat gcatccagtt tacaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tggcacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgtctacaa gattacaatt acccgtggac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa a 321 <210> 36 <211> 375 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 36 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgacctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggaatg ggtctcagtt attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccgtc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagatggg 300 aggcaggtcg aggattacta ctactactac ggtatggacg tctggggcca agggaccacg 360 gtcaccgtct cctca 375 <210> 37 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 37 gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggccagtca gagtattagt agctggttgg cctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctataag gcgtctagtt tagaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gatgattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt attggacgtt cggccaaggg 300 accaaggtgg aaatcaaa 318 <210> 38 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 38 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtacag cctctggatt caccttcagt agttacgaca tgcactgggt ccgccaagct 120 acaggaaaag gtctggagtg ggtctcagtt attgatactg ctggtgacac atactatcca 180 ggctccgtga agggccgatt caccatctcc agagaaaatg ccaagaactc cttgtatctt 240 caaatgaaca gcctgagagc cggggacacg gctgtgtatt actgtgtaag agataggtat 300 agtgggaact tccactacaa cggtatggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 39 <211> 293 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 39 Ala Asp Ser Asp Ile Asn Ile Lys Thr Gly Thr Thr Asp Ile Gly Ser 1 5 10 15 Asn Thr Thr Val Lys Thr Gly Asp Leu Val Thr Tyr Asp Lys Glu Asn 20 25 30 Gly Met His Lys Lys Val Phe Tyr Ser Phe Ile Asp Asp Lys Asn His 35 40 45 Asn Lys Lys Leu Leu Val Ile Arg Thr Lys Gly Thr Ile Ala Gly Gln 50 55 60 Tyr Arg Val Tyr Ser Glu Glu Gly Ala Asn Lys Ser Gly Leu Ala Trp 65 70 75 80 Pro Ser Ala 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Arg Gln Ala Thr Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Gly Thr Arg Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Arg Tyr Ser Pro Thr Gly His Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 62 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 62 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His 20 25 30 Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Gly Thr Arg Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Lys Tyr Ser Pro 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peptide <400> 65 Asp Arg Tyr Ser Arg Thr Gly His Tyr Met Gly Met Asp Val 1 5 10 <210> 66 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 66 Asp Arg Tyr Ser Arg Thr Gly His Tyr Met Gly Met Ser Leu 1 5 10 <210> 67 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 67 Asp Asn Tyr Ser Arg Thr Gly His Tyr Met Gly Met Asp Val 1 5 10 <210> 68 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 68 Lys Gln Tyr Ala Asp Tyr Trp Thr 1 5 <210> 69 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 69 Ser His Asp Met His 1 5 <210> 70 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 70 Gly Ile Gly Thr Ala Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 71 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 71 Asp Arg Tyr Ser Pro Thr Gly His Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 <210> 72 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 72 Asp Asn Tyr Ser Pro Thr Gly Gly Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 <210> 73 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 73 Lys Ala Ser Ser Leu Lys Ser 1 5 <210> 74 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 74 Gln Gln Tyr Glu Ser Tyr Trp Thr 1 5 <210> 75 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 75 Gly Ile Gly Thr Arg Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 76 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 76 Asp Lys Tyr Ser Pro Thr Gly His Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 <210> 77 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 77 Lys Ala Ser Ser Leu Val Lys 1 5 <210> 78 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 78 Asp Arg Tyr Ser Pro Thr Gly His Tyr Met Gly Met Ser Leu 1 5 10 <210> 79 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 79 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His 20 25 30 Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Gly Thr Ala Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Arg Tyr Ser Pro Thr Gly His Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 80 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 80 atatatgagc tcgcagattc tgatattaat attaaaacc 39 <210> 81 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 81 atatataagc ttaatttgtc atttcttctt tttccc 36 <210> 82 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 6xHis tag <400> 82 His His His His His His 1 5 <210> 83 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 83 gataaagaaa atggcatgct caaaaaagta ttttatagtt ttatc 45 <210> 84 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 84 gataaaacta taaaatactt ttttgagcat gccattttct ttatc 45 <210> 85 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 85 atattggatc cgcagattct gatattaata ttaaaac 37 <210> 86 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 86 atacttctcg agttatttat tatgattttt atcatcgata aaac 44 <210> 87 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 87 catagggatc caaactgcta gttattagaa cgaaag 36 <210> 88 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 88 catagctcga gtcaatttgt catttcttct ttttcccaat c 41 <210> 89 <211> 293 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 89 Ala Asp Ser Asp Ile Asn Ile Lys Thr Gly Thr Thr Asp Ile Gly Ser 1 5 10 15 Asn Thr Thr Val Lys Thr Gly Asp Leu Val Thr Tyr Asp Lys Glu Asn 20 25 30 Gly Met His Lys Lys Val Phe Tyr Ser Phe Ile Asp Asp Lys Asn His 35 40 45 Asn Lys Lys Leu Leu Val Ile Arg Thr Lys Gly Thr Ile Ala Gly Gln 50 55 60 Tyr Arg Val Tyr Ser Glu Glu Gly Ala Asn Lys Ser Gly Leu Ala Trp 65 70 75 80 Pro Ser Ala Phe Lys Val Gln Leu Gln Leu Pro Asp Asn Glu Val Ala 85 90 95 Gln Ile Ser Asp Tyr Tyr Pro Arg Asn Ser Ile Asp Thr Lys Glu Tyr 100 105 110 Met Ser Thr Leu Thr Tyr Gly Phe Asn Gly Asn Val Thr Gly Asp Asp 115 120 125 Thr Gly Lys Ile Gly Gly Leu Ile Gly Ala Asn Val Ser Ile Gly His 130 135 140 Thr Leu Lys Tyr Val Gln Pro Asp Phe Lys Thr Ile Leu Glu Ser Pro 145 150 155 160 Thr Asp Lys Lys Val Gly Trp Lys Val Ile Phe Asn Asn Met Val Asn 165 170 175 Gln Asn Trp Gly Pro Tyr Asp Arg Asp Ser Trp Asn Pro Val Tyr Gly 180 185 190 Asn Gln Leu Phe Met Lys Thr Arg Asn Gly Ser Met Lys Ala Ala Asp 195 200 205 Asn Phe Leu Asp Pro Asn Lys Ala Ser Ser Leu Leu Ser Ser Gly Phe 210 215 220 Ser Pro Asp Phe Ala Thr Val Ile Thr Met Asp Arg Lys Ala Ser Lys 225 230 235 240 Gln Gln Thr Asn Ile Asp Val Ile Tyr Glu Arg Val Arg Asp Asp Tyr 245 250 255 Gln Leu His 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Leu Asp Lys Arg Thr Asn Phe Lys 145 150 155 160 Lys Ile Gly Trp Asp Val Glu Ala His Lys Ile Met Asn Asn Gly Trp 165 170 175 Gly Pro Tyr Gly Arg Asp Ser Tyr His Ser Thr Tyr Gly Asn Glu Met 180 185 190 Phe Leu Gly Ser Arg Gln Ser Asn Leu Asn Ala Gly Gln Asn Phe Leu 195 200 205 Glu Tyr His Lys Met Pro Val Leu Ser Arg Gly Asn Phe Asn Pro Glu 210 215 220 Phe Ile Gly Val Leu Ser Arg Lys Gln Asn Ala Ala Lys Lys Ser Lys 225 230 235 240 Ile Thr Val Thr Tyr Gln Arg Glu Met Asp Arg Tyr Thr Asn Phe Trp 245 250 255 Asn Gln Leu His Trp Ile Gly Asn Asn Tyr Lys Asp Glu Asn Arg Ala 260 265 270 Thr His Thr Ser Ile Tyr Glu Val Asp Trp Glu Asn His Thr Val Lys 275 280 285 Leu Ile Asp Thr Gln Ser Lys Glu Lys Asn Pro 290 295 <210> 91 <211> 452 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 91 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His 20 25 30 Asp Met 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Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Glu 210

Claims (84)

  1. 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 알파 독소 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하고 하기 (a) 내지 (f)를 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    (a) 서열번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1;
    (b) 서열번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2;
    (c) 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3;
    (d) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1;
    (e) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및
    (f) 서열번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 57의 아미노산 서열에 대해 90% 이상의 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 58의 아미노산 서열에 대해 90% 이상의 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제2항에 있어서, VH는 서열번호 57의 아미노산 서열을 포함하고, VL은 서열번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 (a) 내지 (e)로 구성된 군으로부터 선택된 특성들 중 하나 이상을 갖는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    (a) 알파 독소에 대한 13 nM 이하의 친화성 상수(KD);
    (b) 알파 독소 단량체에 결합하지만, 알파 독소와 알파 독소 수용체의 결합을 억제하지 않는 특성;
    (c) 알파 독소 올리고머의 형성을 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 억제하는 특성;
    (d) 세포용해 및 용혈 어세이에 의해 측정되었을 때, 알파 독소 세포용해 활성을 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 감소시키는 특성; 및
    (e) 동물 폐렴 모델에서 세포 침윤 및 전구염증 사이토카인 방출을 감소시키는 특성.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 대상체에서 폐렴의 예방, 치료 또는 관리를 위한 조성물.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 대상체에서 폐렴의 예방, 치료 또는 관리를 위한 조성물로서, 조성물이 추가 물질을 포함하고, 여기서 추가 물질은 항생제인 조성물.
  7. (a) 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물; 및
    (b) 상기 항체 또는 항원 결합 단편 또는 조성물을 사용하기 위한 설명서, 또는 상기 항체 또는 항원 결합 단편 또는 조성물을 사용하기 위한 설명서를 얻기 위한 지침서
    를 포함하는, 대상체에서 폐렴의 예방, 치료 또는 관리를 위한 키트.
  8. 대상체에서 폐렴의 예방, 치료 또는 관리를 위한 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. 대상체에서 피부 감염 병태의 예방, 치료 또는 관리를 위한 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  10. 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소 올리고머의 형성을 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 억제하기 위한 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 39의 스타필로코커스 아우레우스 알파 독소의 단편에 면역특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  12. 제1항에 있어서,
    (a) 서열번호 39의 아미노산 261-272;
    (b) 서열번호 39의 아미노산 173-201;
    (c) 서열번호 39의 아미노산 261-272 및 서열번호 39의 아미노산 173-201; 또는
    (d) 서열번호 39의 아미노산 248-277
    을 포함하는 단편에 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  13. 제1항 또는 제12항에 있어서, 서열번호 39의 잔기 T261, T263, N264, K266 및 K271과 접촉하거나, 서열번호 39의 잔기 N177, W179, G180, P181, Y182, D183, D185, S186, W187, N188, P189, V190, Y191 및 R200과 접촉하거나, 또는 서열번호 39의 잔기 T261, T263, N264, K266, K271, N177, W179, G180, P181, Y182, D183, D185, S186, W187, N188, P189, V190, Y191 및 R200과 접촉하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  14. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 알파 독소 칠량체 형성을 방해하고, 서열번호 39의 T261, T263, N264, K266, K271, N177, W179, G180, P181, Y182, D183, D185, S186, W187, N188, P189, V190, Y191 및 R200으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 잔기와 접촉하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  15. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 대상체에서 폐렴의 예방, 치료 또는 관리를 위한 조성물로서, 조성물은 추가적으로 반코마이신을 포함하는 것인 조성물.
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  17. 제1항 내지 제3항 및 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이
    Figure 112019017868431-pct00059

    를 포함하는 Fc 변이체 영역을 갖는 것인 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  18. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 대상체에서 피부 감염 병태의 예방, 치료 또는 관리를 위한 조성물.
  19. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 화상, 연조직염, 피부괴사, 괴사 근막염, 눈꺼풀 감염, 식중독, 관절 감염, 수술 상처 감염, 열상 피부 증후군 또는 독성 쇼크 증후군의 예방, 치료 또는 관리를 위한 조성물.
  20. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 대상체에서 피부 감염 병태의 예방, 치료 또는 관리를 위한 조성물로서, 조성물은 추가 물질을 포함하고, 추가 물질은 항생제인 것인 조성물.
  21. (a) 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물; 및
    (b) 상기 항체 또는 항원 결합 단편 또는 조성물을 사용하기 위한 설명서, 또는 상기 항체 또는 항원 결합 단편 또는 조성물을 사용하기 위한 설명서를 얻기 위한 지침서
    를 포함하는, 대상체에서 피부 감염 병태의 예방, 치료 또는 관리를 위한 키트.
  22. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 대상체에서 피부 감염 병태의 예방, 치료 또는 관리를 위한 조성물로서, 조성물은 추가적으로 반코마이신을 포함하는 것인 조성물.
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