CN112941136B - 一种重组金黄色葡萄球菌疫苗hi抗原蛋白的纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种重组金黄色葡萄球菌疫苗HI抗原蛋白的纯化方法，解决了现有技术中HI蛋白纯化工艺在放大过程中出现纯化收率低，蛋白收获量少的技术问题。它顺次包括下述步骤：（1）菌体破碎，（2）酶切，（3）澄清过滤，（4）SPFF柱层析，（5）SPHP柱层析，（6）Phenyl HP柱层析，（7）G25柱层析，（8）Q HP柱层析，（9）原液制备。本发明提供的重组金黄色葡萄球菌疫苗HI抗原蛋白的纯化方法，解决了HI蛋白纯化工艺在放大过程中纯化收率低的问题，蛋白收获量高。

Description

一种重组金黄色葡萄球菌疫苗HI抗原蛋白的纯化方法
技术领域
本发明涉及一种重组金黄色葡萄球菌疫苗HI抗原蛋白的纯化方法。
背景技术
HI蛋白，金葡菌Hla是细菌pore-forming barrel毒素家族最主要的成员，分子量大小为30kD，是金葡菌感染的最主要的致病因子。Hla是一种外毒素，通常由致病性金葡菌特别是MRSA产生。其可通过促使中性粒细胞裂解，以及对上皮细胞的损害而发挥生物学效应，引起菌血症等临床症状。Hla缺失的突变株在侵入性感染动物实验中毒力减弱，致病作用减小。Wardenburg等构建了无毒的缺乏裂解细胞活性的突变体Hla(H35L)，免疫小鼠后诱导产生了高效价的保护性抗体，能够有效中和Hla，从而降低了金葡菌感染后的致死率。表明无裂解特性的无毒Hla突变体可以作为金葡菌疫苗的候选抗原分子。
但是，现有技术中的HI蛋白纯化工艺是将破菌液直接经过亲和层析(Glutathione4 FF)进行融合蛋白的捕获和酶切，以达到初步纯化目的蛋白的目的，该工艺放大过程中出现纯化收率低，蛋白收获量少(HI抗原蛋白的收率为0.3mg蛋白/g菌左右)的情况。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重组金黄色葡萄球菌疫苗HI抗原蛋白的纯化方法，以解决现有技术中HI蛋白纯化工艺在放大过程中出现纯化收率低，蛋白收获量少的技术问题。本发明提供的诸多技术方案中的优选技术方案所能产生的诸多技术效果详见下文阐述。
为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供的一种重组金黄色葡萄球菌疫苗HI抗原蛋白的纯化方法，顺次包括下述步骤：
(1)菌体破碎
将HI菌体用缓冲液溶解，然后破菌、离心，收集上清液；
(2)酶切
应用PP酶溶液对步骤(1)中的收集的上清液进行酶切；
(3)澄清过滤
将步骤(2)酶切后的菌液调节pH至6.4-6.6，然后将上清使用Cobetter 0.6～0.8μm或Pall PDH4深层滤板进行澄清过滤，收集过滤液；
(4)SPFF柱层析
采用GE SPFF填料装填层析柱，对步骤(3)收集的过滤液进行初纯，得到HI蛋白SPFF洗脱液；
(5)SPHP柱层析
采用GE SPHP填料装填层析柱，对步骤(4)得到的HI蛋白SPFF洗脱液进行中度纯化，得到HI蛋白SPHP层析洗脱液；
(6)Phenyl HP柱层析
采用GE phenyl HP填料装填层析柱，对步骤(5)得到的HI蛋白SPHP层析洗脱液进行精细纯化，得到HI蛋白phenyl HP洗脱液；
(7)G25柱层析
采用G25层析柱对步骤(6)得到的HI蛋白phenyl HP洗脱液进行脱盐换液，得到HI蛋白G25层析液；
(8)Q HP柱层析
采用Q HP层析柱对步骤(7)得到的HI蛋白G25层析液进行层析，得到HI蛋白Q HP流穿液；
(9)原液制备
将步骤(8)得到的HI蛋白Q HP流穿液进行除菌过滤，得到HI蛋白原液。
进一步的，所述步骤(1)中，所述缓冲液为18-22mM的PB缓冲液，所述缓冲液的pH为5.8-6.2；所述菌体与缓冲液的比例为1:9-11，所述菌体以kg计，所述缓冲液以L计。
进一步的，所述步骤(2)中，所述上清液与PP酶溶液的体积比为55-65:1；将上清液与PP酶溶液混合均匀后在2～8℃保温酶切3～4h。
进一步的，所述PP酶溶液的浓度＞0.5mg/ml。
进一步的，所述步骤(4)中，采用的层析柱、缓冲液、上样流速、复平衡、中间清洗、洗脱以及收集标准分别为：
层析柱：柱高18-20cm、柱直径200mm、柱体积5.5-6.5L；
缓冲液：SPFF平衡液：20mM PB(pH 6.0)，SPFF洗脱液：20mM PB+1M NaCl(pH 6.0)；
上样流速：36-72L/h，RT＝5-10min；
复平衡：使用平衡缓冲液再次平衡柱子，平衡流速：36-72L/h，平衡体积：5～8CV，至UV值、电导平稳；
中间清洗：清洗流速36-72L/h，洗脱梯度6％B，清洗2CV；
洗脱：洗脱流速36-72L/h，洗脱梯度15％B；
收集标准：收集HI蛋白SPFF洗脱液，当UV280nm≥500mAU时开始收集峰，当UV280nm≤500mAU时停止收集，记录收集的HI蛋白SPFF洗脱液体积。
进一步的，所述步骤(5)中，采用GE SPHP填料装填层析柱，对步骤(4)得到的HI蛋白SPFF洗脱液进行中度纯化，得到HI蛋白SPHP层析洗脱液；具体包括下述步骤：
①使用20mM PB(pH 6.0)将步骤(4)得到的HI蛋白SPFF洗脱液稀释2-5倍，控制电导率≤6.0ms/cm，搅拌4-6min混合均匀，关闭搅拌；在2～8℃保温，静置状态下放置4～20h，然后将稀释液上清采用Cobetter 0.22μm滤膜进行减菌过滤，待上柱纯化；
②采用GE SPHP填料装填层析柱，对HI蛋白SPFF洗脱样品稀释液进行中度纯化，采用的层析柱、缓冲液、上样流速、复平衡、洗脱以及收集标准分别为：
层析柱：柱高18-20cm、柱直径200mm、柱体积5.5-6.5L；
缓冲液：SPHP平衡液：20mM PB(pH6.0)；SPHP洗脱液：20mM PB+1M NaCl(pH6.0)；
上样流速：12-24L/h，RT＝15-30min；
复平衡：使用平衡缓冲液复平衡层析柱，流速12-24L/h；平衡体积：2～5CV，至UV值、电导平稳；
洗脱：洗脱流速12-24L/h，洗脱梯度0～50％B，10CV；
收集标准：收集HI蛋白SPHP层析洗脱液，当UV280nm≥500mAU时开始收集峰，当UV280nm≤500mAU停止收集，记录收集的HI蛋白SPHP层析洗脱液体积。
进一步的，所述步骤(6)中，采用GE phenyl HP填料装填层析柱，对步骤(5)得到的HI蛋白SPHP层析洗脱液进行精细纯化，得到HI蛋白phenyl HP洗脱液；具体包括下述步骤：
①按照体积比HI蛋白SPHP层析洗脱液：硫酸铵溶液＝10-12：4，加入20mM PB+3M(NH4)2SO4(pH6.0)进行稀释，待进行下一步纯化；
②采用GE phenyl HP填料装填层析柱，对HI蛋白SPHP层析洗脱液进行精细纯化，采用的层析柱、缓冲液、上样流速、复平衡、洗脱以及收集标准分别为：
层析柱：柱高为9-11cm，柱直径140mm、柱体积1.2-1.8L；
缓冲液：Phenyl HP平衡液：20mM PB+0.8M(NH4)2SO4(pH6.0)；Phenyl HP洗脱液：20mM PB(pH6.0)；
上样流速：12-24L/h，RT＝3.75-7.5min；
复平衡：使用平衡缓冲液再次平衡柱子，平衡流速：12-24L/h，平衡体积：3-5CV，至UV值、pH、电导稳定；
洗脱：洗脱流速：12-24L/h，洗脱梯度：0-100％B，10CV；
收集标准：收集HI蛋白phenyl HP洗脱液，当UV280nm值到达峰顶端且开始下降时开始收集，当UV280nm≤200mAU停止收集，记录收集的HI蛋白phenyl HP洗脱液体积。
进一步的，所述步骤(7)中，采用G25层析柱对步骤(6)得到的HI蛋白phenyl HP洗脱液进行脱盐换液，得到HI蛋白G25层析液；采用的层析柱、平衡液、上样流速、上样量以及收集标准分别为：
层析柱：柱高28-30cm、柱直径300mm、柱体积为19.5-20.5L；
平衡液：10mM L-His+0.9％NaCl(pH6.0)；
上样流速：80L/h，RT＝15min；
上样量≤柱床体积的25％；
收集标准：收集HI蛋白G25层析液，当UV280nm≥50mAU时开始收集，当UV280nm≤50mAU停止收集；记录收集的HI蛋白G25层析液体积。
进一步的，所述步骤(8)中，采用Q HP层析柱对步骤(7)得到的HI蛋白G25层析液进行层析，得到HI蛋白Q HP流穿液；采用的层析柱、平衡液、上样流速、上样量以及收集标准分别为：
层析柱：柱高8-11cm、柱直径140mm、柱体积1.2-1.8L；
平衡液：10mM L-His+0.9％NaCl(pH6.0)；
上样流速：12-24L/h，RT＝3.75-7.5min；
收集标准：收集HI蛋白Q HP流穿液，当UV280nm≥50mAU时开始收集，当UV280nm≤50mAU停止收集，记录收集的HI蛋白Q HP流穿液的体积。
基于上述技术方案，本发明实施例至少可以产生如下技术效果：
(1)本发明提供的重组金黄色葡萄球菌疫苗HI抗原蛋白的纯化方法，增加澄清过滤步骤，提高了破碎后菌液的澄清度，去除破菌离心液中细小颗粒物以及大量核酸等杂质，降低层析填料的高柱压，增加了填料的寿命；
(2)本发明提供的重组金黄色葡萄球菌疫苗HI抗原蛋白的纯化方法，使用SP FF阳离子层析作为初纯步骤，可以快速捕获目的蛋白，使目的蛋白从成分复杂的破菌上清液中浓缩和稳定，避免了使用GST亲和层析捕获蛋白的效率低、蛋白收获量少且不稳定、后续步骤无法开展、放大困难的问题，同时降低了由于亲和填料昂贵、填料寿命短带来的高额成本；将SP HP阳离子层析定义为中纯步骤，并改进上样pH值进行该层析步骤，去除大肠杆菌细胞破碎液中含有的SPFF步骤中仍未去除的大量杂质，例如HCP、核酸、酶以及PP酶酶切产生的GST标签蛋白和添加的PP酶，同时优化梯度洗脱参数通过SPHP高分辨率填料达到提高蛋白纯度的目的；使用疏水层析作为精纯步骤，同时优化了操作参数，有效去除疏水性杂质提高蛋白纯度，使目的蛋白各项指标符合质量标准要求；后续采用G25层析进行缓冲液置换、Q HP层析进行内毒素的有效去除，与前述步骤进行有效的衔接，最终样品采用0.22μm滤膜除菌过滤后进行分装得到HI蛋白原液。
(3)本发明提供的重组金黄色葡萄球菌疫苗HI抗原蛋白的纯化方法，解决了HI蛋白纯化工艺在放大过程中纯化收率低的问题，蛋白收获量高，HI抗原蛋白的收率>0.6mg蛋白/g菌。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1中制备的HI原液电泳纯度测定结果图；
图2是本发明实施例2中制备的HI原液电泳纯度测定结果图；
图3是本发明实施例3中制备的HI原液电泳纯度测定结果图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
一、实施例：
实施例1：
一种重组金黄色葡萄球菌疫苗HI抗原蛋白的纯化方法，包括下述步骤：
(1)菌体破碎
将HI菌体用缓冲液溶解，缓冲液为20mM的PB(pH 6)缓冲液；菌体与缓冲液的比例为1:10，所述菌体以kg计，所述缓冲液以L计；溶解后采用高压匀质机破菌，调节压力为750bar，冷凝系统温度为6℃，破碎3次；然后采用高速冷冻离心机将破碎后的菌液进行离心，离心参数：12000g，6℃离心20min；收集上清；
(2)酶切
应用PP酶溶液(浓度为1mg/ml)对步骤(1)中的收集的上清液进行酶切，上清液与PP酶溶液的体积比为60:1；将PP酶溶液加入上清液后，以转速50RPM搅拌5min将上清液与PP酶溶液混合均匀，然后关闭搅拌，在6℃保温酶切3.5h；
(3)澄清过滤
将步骤(2)酶切后的菌液使用1M NaOH/3M HCl调节pH至6.5，然后将上清使用Cobetter 0.6～0.8μm或Pall PDH4深层滤板进行澄清过滤，收集过滤液；
(4)SPFF柱层析
采用GE SPFF填料装填层析柱对步骤(3)收集的过滤液进行初纯，得到HI蛋白SPFF洗脱液；采用的层析柱、缓冲液、上样流速、复平衡、中间清洗、洗脱以及收集标准分别为：
层析柱：柱高19cm、柱直径200mm、柱体积约6L；
缓冲液：SPFF平衡液：20mM PB(pH 6.0)，SPFF洗脱液：20mM PB+1M NaCl(pH 6.0)；
上样流速：48L/h，RT＝8min；
复平衡：使用平衡缓冲液再次平衡柱子，平衡流速：48L/h，平衡体积：7.5CV，至UV值、电导平稳；
中间清洗：清洗流速48L/h，洗脱梯度6％B，清洗2CV；
洗脱：洗脱流速48L/h，洗脱梯度15％B；
收集标准：收集HI蛋白SPFF洗脱液，当UV280nm≥500mAU时开始收集峰，当UV280nm≤500mAU时停止收集，记录收集的HI蛋白SPFF洗脱液体积；
再生：使用20mM PB+1M NaCl(pH 6.0)冲洗层析柱1-2CV进行再生；
CIP：使用1M NaOH溶液冲洗层析柱1-2CV进行CIP；
保存：使用0.01M NaOH或20％乙醇溶液对层析柱进行保存；
(5)SPHP柱层析
采用GE SPHP填料装填层析柱，对步骤(4)得到的HI蛋白SPFF洗脱液进行中度纯化，得到HI蛋白SPHP层析洗脱液；具体的包括下述步骤：
①使用20mM PB(pH 6.0)将步骤(4)得到的HI蛋白SPFF洗脱液稀释3.5倍，控制电导率≤6.0ms/cm，搅拌5min混合均匀，关闭搅拌；在6℃保温，静置状态下放置15h，然后将稀释液上清采用Cobetter 0.22μm滤膜进行减菌过滤，待上柱纯化；
②采用GE SPHP填料装填层析柱，对HI蛋白SPFF洗脱样品稀释液进行中度纯化，采用的层析柱、缓冲液、上样流速、复平衡、洗脱以及收集标准分别为：
层析柱：柱高19cm、柱直径200mm、柱体积约6L；
缓冲液：SPHP平衡液：20mM PB(pH6.0)；SPHP洗脱液：20mM PB+1M NaCl(pH6.0)；上样流速：18L/h，RT＝22min；
复平衡：使用平衡缓冲液复平衡层析柱，流速18L/h；平衡体积：3.5CV，至UV值、电导平稳；
洗脱：洗脱流速18L/h，洗脱梯度0～50％B，10CV；
收集标准：收集HI蛋白SPHP层析洗脱液，当UV280nm≥500mAU时开始收集峰，当UV280nm≤500mAU停止收集，记录收集的HI蛋白SPHP层析洗脱液体积；
再生：使用20mM PB+1M NaCl(pH 6.0)冲洗层析柱1-2CV进行再生；
CIP：使用1M NaOH溶液冲洗层析柱1-2CV进行CIP；
保存：使用0.01M NaOH或20％乙醇溶液对层析柱进行保存；
(6)Phenyl HP柱层析
采用GE phenyl HP填料装填层析柱，对步骤(5)得到的HI蛋白SPHP层析洗脱液进行精细纯化，得到HI蛋白phenyl HP洗脱液；具体包括下述步骤：
①按照体积比HI蛋白SPHP层析洗脱液：硫酸铵溶液＝11：4，加入20mM PB+3M(NH4)2SO4(pH6.0)进行稀释，待进行下一步纯化；
②采用GE phenyl HP填料装填层析柱，对HI蛋白SPHP层析洗脱液进行精细纯化，采用的层析柱、缓冲液、上样流速、复平衡、洗脱以及收集标准分别为：
层析柱：柱高为10cm，柱直径140mm、柱体积约1.5L。
缓冲液：Phenyl HP平衡液：20mM PB+0.8M(NH4)2SO4(pH6.0)；Phenyl HP洗脱液：20mM PB(pH6.0)；
上样流速：18L/h，RT＝5min。
复平衡：使用平衡缓冲液再次平衡柱子，平衡流速：18L/h，平衡体积：4CV，至UV值、pH、电导稳定。
洗脱：洗脱流速：18L/h，洗脱梯度：0-100％B，10CV。
收集标准：收集HI蛋白phenyl HP洗脱液，当UV280nm值到达峰顶端且开始下降时开始收集，当UV280nm≤200mAU停止收集，记录收集的HI蛋白phenyl HP洗脱液体积；
再生：使用20mM PB(pH 6.0)冲洗层析柱1-2CV进行再生；
CIP：使用1M NaOH溶液冲洗层析柱1-2CV进行CIP；
保存：使用0.01M NaOH或20％乙醇溶液对层析柱进行保存；
(7)G25柱层析
采用G25层析柱对步骤(6)得到的HI蛋白phenyl HP洗脱液进行脱盐换液，得到HI蛋白G25层析液；采用的层析柱、平衡液、上样流速、上样量以及收集标准分别为：
层析柱：柱高29cm、柱直径300mm、柱体积约为20L；
平衡液：10mM L-His+0.9％NaCl(pH6.0)；
上样流速：80L/h，RT＝15min；
上样量≤柱床体积的25％。
收集标准：收集HI蛋白G25层析液，当UV280nm≥50mAU时开始收集，当UV280nm≤50mAU停止收集；如分次层析，合并每次洗脱液并混合均匀；记录收集的HI蛋白G25层析液体积；
CIP：使用1M NaOH溶液冲洗层析柱1-2CV进行CIP；
保存：使用0.01M NaOH或20％乙醇溶液对层析柱进行保存；
(8)Q HP柱层析
采用Q HP层析柱对步骤(7)得到的HI蛋白G25层析液进行层析，得到HI蛋白Q HP流穿液；采用的层析柱、平衡液、上样流速、上样量以及收集标准分别为：
层析柱：柱高10cm、柱直径140mm、柱体积约1.5L；
平衡液：10mM L-His+0.9％NaCl(pH6.0)；
上样流速：18L/h，RT＝5min；
收集标准：收集HI蛋白Q HP流穿液，当UV280nm≥50mAU时开始收集，当UV280nm≤50mAU停止收集，记录收集的HI蛋白Q HP流穿液的体积；
CIP：使用1M NaOH溶液冲洗层析柱1-2CV进行CIP；
保存：使用0.01M NaOH或20％乙醇溶液对层析柱进行保存；
(9)原液制备
将步骤(8)得到的HI蛋白Q HP流穿液在生物安全柜中使用0.22μm滤器进行除菌过滤，得到HI蛋白原液。
实施例2：
与实施例1不同的是：
步骤(1)菌体破碎中，缓冲液为22mM的PB(pH 5.8)缓冲液；菌体与缓冲液的比例为1:11；高压匀质机破菌，调节压力为800bar，冷凝系统温度为8℃；离心：8℃离心；
步骤(2)酶切中，上清液与PP酶溶液(浓度为0.8mg/ml)的体积比为65:1；关闭搅拌后，在8℃保温酶切3h；
步骤(3)澄清过滤中，调节pH至6.6；
步骤(4)SPFF柱层析中，上样流速：72L/h，RT＝5min；复平衡：使用平衡缓冲液再次平衡柱子，平衡流速：72L/h，平衡体积：8CV，至UV值、电导平稳；中间清洗：清洗流速72L/h，洗脱梯度6％B，清洗2CV；洗脱：洗脱流速72L/h，洗脱梯度15％B；
步骤(5)SPHP柱层析中，步骤①中，搅拌4min混合均匀，关闭搅拌；在2℃保温，静置状态下放置20h；步骤②中，上样流速：24L/h，RT＝15min；复平衡：使用平衡缓冲液复平衡层析柱，流速24L/h；平衡体积：5CV，至UV值、电导平稳；洗脱：洗脱流速24L/h，洗脱梯度0～50％B，10CV；
步骤(6)Phenyl HP柱层析中，步骤①中，按照体积比HI蛋白SPHP层析洗脱液：硫酸铵溶液＝12：4；步骤②中，上样流速：24L/h，RT＝3.75min；复平衡：使用平衡缓冲液再次平衡柱子，平衡流速：24L/h，平衡体积：5CV，至UV值、pH、电导稳定；洗脱：洗脱流速：24L/h，洗脱梯度：0-100％B，10CV；
步骤(8)Q HP柱层析中，上样流速：24L/h，RT＝3.75min；
步骤(9)原液制备中，在生物安全柜中，使用0.22μm滤器进行除菌过滤。
其余同实施例1。
实施例3：
与实施例1不同的是：
步骤(1)菌体破碎中，缓冲液为18mM的PB(pH 6.2)缓冲液；菌体与缓冲液的比例为1:9；高压匀质机破菌，调节压力为700bar，冷凝系统温度为2℃；离心：2℃离心；
步骤(2)酶切中，上清液与PP酶溶液(浓度为1.2mg/ml)的体积比为55:1；关闭搅拌后，在2℃保温酶切4h；
步骤(3)澄清过滤中，调节pH至6.4；
步骤(4)SPFF柱层析中，上样流速：36L/h，RT＝10min；复平衡：使用平衡缓冲液再次平衡柱子，平衡流速：36L/h，平衡体积：5CV，至UV值、电导平稳；中间清洗：清洗流速36L/h，洗脱梯度6％B，清洗2CV；洗脱：洗脱流速36L/h，洗脱梯度15％B；
步骤(5)SPHP柱层析中，步骤①中，搅拌6min混合均匀，关闭搅拌；在8℃保温，静置状态下放置4h；步骤②中，上样流速：12L/h，RT＝30min；复平衡：使用平衡缓冲液复平衡层析柱，流速12L/h；平衡体积：2CV，至UV值、电导平稳；洗脱：洗脱流速12L/h，洗脱梯度0～50％B，10CV；
步骤(6)Phenyl HP柱层析中，步骤①中，按照体积比HI蛋白SPHP层析洗脱液：硫酸铵溶液＝10：4；步骤②中，上样流速：12L/h，RT＝7.5min；复平衡：使用平衡缓冲液再次平衡柱子，平衡流速：12L/h，平衡体积：3CV，至UV值、pH、电导稳定；洗脱：洗脱流速：12L/h，洗脱梯度：0-100％B，10CV；
步骤(8)Q HP柱层析中，上样流速：12L/h，RT＝7.5min；
步骤(9)原液制备中，在无菌隔离器中，使用0.22μm滤器进行除菌过滤。
其余同实施例1。
二、对实施例1-实施例3中制备的HI原液进行检测并进行纯度实验
1、将实施例1-实施例3中制备的HI蛋白原液(实施例1-实施例3中制备的HI原液顺次编号为HI原液-20191113、HI原液-20191119、HI原液-20191122)进行检测，检测结果如下表1所示：
表1实施例1-实施例3中HI原液检测结果
Figure BDA0002990862800000141
由表1可知，实施例1-3中制备的HI蛋白原液均符合质量标准要求，且收率大于0.6mg蛋白/g菌。
2、采用电泳实验测定HI原液的纯度，测定方法采用《中国药典》2020版中的SDS-PAGE法，实施例1的测定结果如图1所示，实施例2的测定结果如图2所示，实施例3的测定结果如图3所示。
采用本发明的纯化方法，在成都欧林生物科技股份有限公司金葡菌疫苗新车间，使用新的场地、设备设施和工业自动化管路系统进行了生产规模下的连续多批次试生产；所制备的HI蛋白原液样品的关键检测指标符合质量标准要求；同时我们将HI蛋白的连续三批次原液进行除关键指标外的其余杂质残留和微生物类检测(HCP、DNA、GST等杂质残留和无菌检查)指标均符合质量标准的要求。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种重组金黄色葡萄球菌疫苗 HI抗原蛋白的纯化方法，其特征在于：顺次包括下述步骤：
（1）菌体破碎
将HI菌体用缓冲液溶解，然后破菌、离心，收集上清液；
（2）酶切
应用PP酶溶液对步骤（1）中的收集的上清液进行酶切；
（3）澄清过滤
将步骤（2）酶切后的菌液调节pH至6.4-6.6，然后将上清使用Cobetter 0.6～0.8μm或Pall PDH4深层滤板进行澄清过滤，收集过滤液；
（4）SPFF柱层析
采用GE SPFF填料装填层析柱，对步骤（3）收集的过滤液进行初纯，采用的层析柱、缓冲液、上样流速、复平衡、中间清洗、洗脱以及收集标准分别为：
层析柱：柱高18-20cm、柱直径200mm、柱体积5.5-6.5L；
缓冲液： SPFF平衡液：20mM PB，pH为 6.0；SPFF洗脱液：20mM PB+1M NaCl，pH为 6.0；
上样流速：36-72L/h，RT=5-10min；
复平衡：使用平衡缓冲液再次平衡柱子，平衡流速：36-72L/h，平衡体积：5～8CV，至UV值、电导平稳；
中间清洗：清洗流速36-72L/h，洗脱梯度6%B，清洗2CV；
洗脱：洗脱流速36-72L/h，洗脱梯度15%B；
收集标准：收集HI蛋白SPFF洗脱液，当UV280nm≥500mAU时开始收集峰，当UV280nm≤500mAU时停止收集，记录收集的HI蛋白SPFF洗脱液体积；得到HI蛋白SPFF洗脱液；
（5）SPHP柱层析
采用GE SPHP填料装填层析柱，对步骤（4）得到的HI蛋白SPFF洗脱液进行中度纯化，具体包括下述步骤：
①使用pH 为6.0的20mM PB将步骤（4）得到的HI蛋白SPFF洗脱液稀释2-5倍，控制电导率≤6.0 ms/cm，搅拌4-6min混合均匀，关闭搅拌；在2～8℃保温，静置状态下放置4～20h，然后将稀释液上清采用Cobetter 0.22μm滤膜进行减菌过滤，待上柱纯化；
②采用GE SPHP填料装填层析柱，对HI蛋白SPFF洗脱样品稀释液进行中度纯化，采用的层析柱、缓冲液、上样流速、复平衡、洗脱以及收集标准分别为：
层析柱：柱高18-20cm、柱直径200mm、柱体积5.5-6.5L；
缓冲液： SPHP平衡液：20mM PB，pH为6.0；SPHP洗脱液：20mM PB+1M NaCl，pH为6.0；
上样流速：12-24L/h，RT=15-30min；
复平衡：使用平衡缓冲液复平衡层析柱，流速12-24L/h；平衡体积：2～5CV，至UV值、电导平稳；
洗脱：洗脱流速12-24L/h，洗脱梯度0～50%B，10CV；
收集标准：收集HI蛋白SPHP层析洗脱液，当UV280nm≥500mAU时开始收集峰，当UV280nm≤500mAU停止收集，记录收集的HI蛋白SPHP层析洗脱液体积；得到HI蛋白SPHP层析洗脱液；
（6）Phenyl HP柱层析
采用GE phenyl HP填料装填层析柱，对步骤（5）得到的HI蛋白SPHP层析洗脱液进行精细纯化，具体包括下述步骤：
①按照体积比HI蛋白SPHP层析洗脱液：硫酸铵溶液=10-12：4，加入20mM PB+3M（NH4）2SO4(pH6.0)进行稀释，待进行下一步纯化；
②采用GE phenyl HP填料装填层析柱，对HI蛋白SPHP层析洗脱液进行精细纯化，采用的层析柱、缓冲液、上样流速、复平衡、洗脱以及收集标准分别为：
层析柱：柱高为9-11cm，柱直径140mm、柱体积1.2-1.8L；
缓冲液： Phenyl HP平衡液：20mM PB+0.8M（NH4）2SO4，pH为6.0；Phenyl HP洗脱液：20mMPB，pH为6.0；
上样流速：12-24L/h，RT=3.75-7.5min；
复平衡：使用平衡缓冲液再次平衡柱子，平衡流速：12-24L/h，平衡体积：3-5CV，至UV值、pH、电导稳定；
洗脱：洗脱流速：12-24L/h，洗脱梯度：0-100%B，10CV；
收集标准：收集HI蛋白phenyl HP洗脱液，当UV280nm值到达峰顶端且开始下降时开始收集，当UV280nm≤200mAU停止收集，记录收集的HI蛋白phenyl HP洗脱液体积；得到HI蛋白phenyl HP洗脱液；
（7）G25柱层析
采用G25层析柱对步骤（6）得到的HI蛋白phenyl HP洗脱液进行脱盐换液，得到HI蛋白G25层析液；
（8）Q HP柱层析
采用Q HP层析柱对步骤（7）得到的HI蛋白G25层析液进行层析，得到HI蛋白Q HP流穿液；
（9）原液制备
将步骤（8）得到的HI蛋白Q HP流穿液进行除菌过滤，得到HI蛋白原液。
2.根据权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌疫苗 HI抗原蛋白的纯化方法，其特征在于：所述步骤（1）中，所述缓冲液为18-22mM 的PB缓冲液，所述缓冲液的pH为 5.8-6.2；所述菌体与缓冲液的比例为1:9-11，所述菌体以kg计，所述缓冲液以L计。
3.根据权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌疫苗 HI抗原蛋白的纯化方法，其特征在于：所述步骤（2）中，所述上清液与PP酶溶液的体积比为55-65:1；将上清液与PP酶溶液混合均匀后在2～8℃保温酶切3～4h。
4.根据权利要求3所述的重组金黄色葡萄球菌疫苗 HI抗原蛋白的纯化方法，其特征在于：所述PP酶溶液的浓度＞0.5mg/ml。
5.根据权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌疫苗 HI抗原蛋白的纯化方法，其特征在于：所述步骤（7）中，采用G25层析柱对步骤（6）得到的HI蛋白phenyl HP洗脱液进行脱盐换液，得到HI蛋白G25层析液；采用的层析柱、平衡液、上样流速、上样量以及收集标准分别为：
层析柱：柱高28-30 cm、柱直径300mm、柱体积为19.5-20.5L；
平衡液：10mM L-His+0.9%NaCl，pH为6.0；
上样流速：80L/h，RT＝15min；
上样量≤柱床体积的25%；
收集标准：收集HI蛋白G25层析液，当UV280nm≥50mAU时开始收集，当UV280nm≤50mAU停止收集；记录收集的HI蛋白G25层析液体积。
6.根据权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌疫苗 HI抗原蛋白的纯化方法，其特征在于：所述步骤（8）中，采用Q HP层析柱对步骤（7）得到的HI蛋白G25层析液进行层析，得到HI蛋白Q HP流穿液；采用的层析柱、平衡液、上样流速、上样量以及收集标准分别为：
层析柱：柱高8-11cm、柱直径140mm、柱体积1.2-1.8L；
平衡液：10mM L-His+0.9%NaCl，pH为6.0；
上样流速：12-24L/h，RT=3.75-7.5min；
收集标准：收集HI蛋白Q HP流穿液，当UV280nm≥50mAU时开始收集，当UV280nm≤50mAU停止收集，记录收集的HI蛋白Q HP流穿液的体积。
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