CN103695508A

CN103695508A - 金黄色葡萄球菌hi重组蛋白的发酵和纯化工艺

Info

Publication number: CN103695508A
Application number: CN201310664256.8A
Authority: CN
Inventors: 敬海明; 董衍东; 刘唯; 邹全明; 曾浩; 章金勇; 吴翼
Original assignee: CHONGQING YUANLUN BIO-TECHNOLOGY Co Ltd; Third Military Medical University TMMU
Current assignee: Third Military Medical University TMMU; Chengdu Olymvax Biopharmaceuticals Inc
Priority date: 2013-12-09
Filing date: 2013-12-09
Publication date: 2014-04-02
Anticipated expiration: 2033-12-09
Also published as: CN103695508B

Abstract

本发明属于生物技术领域，提供一种制备金黄色葡萄球菌（SA）HI重组蛋白的发酵工艺和纯化工艺。本发明提供的发酵工艺能够大规模、高密度地生产HI重组蛋白基因工程菌体；本发明提供的纯化工艺针对HI重组蛋白的蛋白特性，能够高效地获得纯度好、得率高的精制蛋白原液。

Description

金黄色葡萄球菌HI重组蛋白的发酵和纯化工艺

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种制备金黄色葡萄球菌（SA）HI重组蛋白的发酵工艺和纯化工艺。

背景技术

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA)，以下简称金葡菌，有“嗜肉菌”的别称。作为革兰氏阳性菌的代表，它是引起医院感染和社区感染的一种重要致病菌。感染以急性、化脓性为特征，局部感染可引起皮肤和软组织等的化脓性感染，经久不愈；全身感染可导致骨髓炎、脓毒性关节炎、心内膜炎、肺炎、脓毒血症等严重感染及并发症，死亡率高达20％。同时，金葡菌的外毒素还可引起食物中毒、烫伤样皮肤综合征和中毒性休克综合征等全身致死性感染。因此，加强对金葡菌感染的免疫防治研究，研制安全、有效的新型金葡菌基因工程疫苗将对有效控制金葡菌耐药性蔓延和临床金葡菌广泛感染具有重要的战略及现实意义。

本申请发明人前期构建了一种金黄色葡萄球菌重组蛋白HI，由耐甲氧西林金黄色葡萄球菌α-溶血素无毒突变体与铁离子表面决定蛋白活性片段重组而成，并对该蛋白提交了中国专利申请（CN102993308A），该申请全部通过引用的方式结合至本文。

发明内容

本申请在上述内容的基础上，进一步提供所述HI重组蛋白基因工程菌的发酵、纯化及去内毒素工艺。

在本申请中，HI蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在第一个方面，本发明提供HI重组蛋白基因工程菌的发酵工艺，包括将一定量的种子菌接种于含有甘油和一定溶氧量的培养基中，经诱导剂诱导一定时间而表达重组蛋白。

优选地，所述工艺涉及培养基、种子菌接种量、培养基中的甘油量、溶氧量、诱导剂种类、诱导剂浓度、诱导温度及诱导时间几方面因素对大规模、高密度地生产HI重组蛋白基因工程菌的影响。

进一步优选地，所述培养基可以是动物源性TB、动物源性M9、植物源性TB、植物源性M9，优选为动物源性TB；所述种子菌的接种量是5%～15%，优选为10%；所述甘油量为5-15ml/L培养基，优选为10ml/L培养基；所述溶氧量是25%～65%，优选为45%；所述诱导剂可以是乳糖或IPTG，优选为IPTG；所述诱导剂的浓度是0.1～1mM，优选为0.2mM；所述诱导温度为16～37℃，优选为30℃；所述诱导时间为1～6小时，优选为5小时。

在所述发酵工艺的一种具体实施方式中，基础培养基选用动物源性TB培养基，其中甘油量是10ml/L；发酵开始时，种子菌的接种量比例是10%；在发酵过程中溶氧浓度保持在45%；诱导时，温度调为30℃、IPTG浓度为0.2mM、诱导5h。

本领域技术人员应当理解，所述种子菌是含有能够表达HI蛋白的载体的大肠杆菌；优选地，所述大肠杆菌是XL-1Blue；所述载体是pGEX-6p-2。根据CN102993308A以及本申请记载的内容，本领域技术人员可以知道如何制备本发明所需要的HI生产种子菌。

在第二方面，本发明还提供一种HI重组蛋白基因工程菌发酵后的蛋白纯化工艺，包括依次进行的GST-琼脂糖凝胶4B亲和层析、阳离子交换层析、置换缓冲液及去内毒素。

优选地，所述阳离子交换层析使用MMC层析柱，使用的缓冲液为，缓冲液A:25mMNaAC-HAc，pH4.5，缓冲液B:50mM PB+1M NH₄Cl，pH7.0；上样流速为4.7ml/min，洗脱流速：4.7ml/min；洗脱程序：0-100%B，20个柱体积（CV）；优选地，上样pH值为7.0-7.5，洗脱pH值为11.0。

优选地，所述置换缓冲液使用G25层析柱；使用缓冲液为疫苗稀释液。

优选地，去内毒素使用Q HP层析柱；使用缓冲液为，缓冲液A：疫苗稀释液；缓冲液B：1M NaOH；

在优选实施方案中，进行亲和层析之前，需要对基因工程菌进行菌体破碎，以将蛋白从菌体中释放出来。

本发明提供的发酵工艺能够大规模、高密度地生产HI重组蛋白基因工程菌体；本发明提供的纯化工艺针对HI重组蛋白的蛋白特性，能够高效地获得得率高、纯度好的精制蛋白原液。

附图说明

图1、工程菌pGEX-6P-2-HI/XL1-Blue细菌在四种培养基中的生长曲线。

图2、HI重组蛋白在M9和TB培养基中的表达情况。1：蛋白质分子量标准；2：M9；3：TB。

图3、不同IPTG浓度对HI重组蛋白表达的影响。1：蛋白质分子量标准；2：0.1mM；3：0.2mM；4：0.5mM；5：1mM。

图4、不同接种量pGEX-6P-2-HI/XL1-Blue细菌生长曲线。

图5、不同种子菌接种量对HI重组蛋白表达的影响。1：蛋白质分子量标准；2：5%；3：10%；4：15%

图6、不同氧浓度下pGEX-6P-2-HI/XL1-Blue细菌的生长曲线。

图7、不同pO₂浓度对HI重组蛋白表达的影响。1：蛋白质分子量标准；2：25%；3：45%；4：65%。

图8、不同甘油浓度对HI重组蛋白表达的影响。1：蛋白质分子量标准；2：5ml/L；3：10ml/L；4：15ml/L。

图9、pGEX-6P-2-HI/XL1-Blue细菌在不同诱导温度和时间对HI重组蛋白表达的影响。1：蛋白质分子量标准；2：诱导0h；3：诱导2h；4：诱导4h；5：诱导6h；6：诱导8h；7：诱导10h。

图10、pGEX-6P-2-HI/XL1-Blue细菌的发酵生长曲线。

图11、25L发酵时，HI重组蛋白表达情况。1：蛋白质分子量标准；2：诱导0h；3：诱导1h；4：诱导2h；5：诱导3h；6：诱导4h；7：诱导5h。

图12、HI重组蛋白GST亲和层析纯化SDS-PAGE结果。M：蛋白质分子量标准；1：纯化前结合于GST琼脂糖凝胶4B融合蛋白；2：酶切后残存于填料上的HI及GST；3：酶切后HI样品。

图13、MMC层析纯化HI蛋白色谱图。

图14、MMC层析纯化HI蛋白电泳图。M：蛋白质分子量标准；1；纯化前样品；2；洗脱管1；3；洗脱管2；4；洗脱管4；5；洗脱管8。

图15、Resource S层析纯化HI蛋白色谱图。

图16、Resource S层析纯化HI蛋白电泳图。M：蛋白质分子量标准；1：纯化前样品；2：洗脱管1；3：洗脱管3；4：洗脱管4；5：洗脱管5；6：洗脱管6；7：洗脱管7；8：洗脱管8；9：洗脱管9。

图17、SP HP层析纯化HI蛋白色谱图。

图18、SP HP层析纯化HI蛋白电泳图。M：蛋白质分子量标准；1：纯化前样品；2：洗脱管1；3：洗脱管2；4：洗脱管3；5：洗脱管4；6：洗脱管5；7：洗脱管6；8：洗脱管7；9：洗脱管8。

图19、Phenyl FF层析纯化HI蛋白色谱图。

图20、Phenyl FF层析纯化HI蛋白电泳图。1：洗脱管1；2；洗脱管2；3：洗脱管3；4：洗脱管4。

图21、Butyl FF层析纯化HI蛋白色谱图。

图22、Butyl FF层析纯化HI蛋白电泳图。M：蛋白质分子量标准；1：纯化前样品；2：流穿；3：洗脱管1；4：洗脱管2；5：洗脱管3。

图23、Octyl FF层析纯化HI蛋白色谱图。

图24、Octyl FF层析纯化HI蛋白电泳图。1：洗脱管1；2：洗脱管2；3：洗脱管3；4：洗脱管4。

图25、MMC层析(缓冲液①)纯化HI蛋白色谱图。

图26、MMC层析(缓冲液①)纯化HI蛋白电泳图。M：蛋白质分子量标准；1：纯化前样品；2：洗脱管1；3：洗脱管3；4：洗脱管7。

图27、MMC层析(缓冲液②)纯化HI蛋白色谱图。

图28、MMC层析(缓冲液②)纯化HI蛋白电泳图。M：蛋白质分子量标准；1：纯化前样品；2：洗脱管4；3：洗脱管5；4：洗脱管6；5：洗脱管7。

图29、MMC层析(缓冲液③)纯化HI蛋白色谱图。

图30、MMC层析(缓冲液③)纯化HI蛋白电泳图。1：洗脱管1；2：洗脱管2；3：洗脱管3。

图31、MMC层析(上样样品电导8.66ms/cm)纯化HI蛋白色谱图。

图32、MMC层析(上样样品电导8.66ms/cm)纯化HI蛋白电泳图。M：蛋白质分子量标准；1：第一峰；2：第二峰；3：第三峰。

图33、MMC层析(上样样品电导12.83ms/cm)纯化HI蛋白色谱图。

图34、MMC层析(上样样品电导12.83ms/cm)纯化HI蛋白电泳图。M：蛋白质分子量标准；1：第一峰。

图35、MMC层析(上样样品电导15.91ms/cm)纯化HI蛋白色谱图。

图36、MMC层析(上样样品电导15.91ms/cm)纯化HI蛋白电泳图。M：蛋白质分子量标准；1：第一峰；2：第二峰。

图37、Q HP层析纯化HI蛋白色谱图。

图38、Q HP层析纯化HI蛋白电泳图。M：蛋白质分子量标准；1：纯化前样品；2：MMC流穿；3：MMC洗脱样品；4：100%B洗脱样品；5：G25脱盐样品；6：Q HP流穿样品。

图39、放大后MMC层析（批次Ⅰ）纯化HI蛋白色谱图。

图40、放大后Q HP层析（批次Ⅰ）纯化HI蛋白色谱图。

图41、放大后MMC及Q HP层析（批次Ⅰ）纯化HI蛋白电泳图。M：蛋白质分子量标准；1：纯化前样品；2：MMC洗脱样品；3：G25脱盐样品；4：Q HP流穿样品。

图42、放大后MMC层析（批次Ⅱ）纯化HI蛋白色谱图。

图43、放大后Q HP层析（批次Ⅱ）纯化HI蛋白色谱图。

图44、放大后MMC及Q HP层析（批次Ⅱ）纯化HI蛋白电泳图。M：蛋白质分子量标准；1：纯化前样品；2：MMC洗脱样品；3：G25脱盐样品；4：Q HP流穿样品。

图45、放大后MMC层析（批次Ⅲ）纯化HI蛋白色谱图。

图46、放大后Q HP层析（批次Ⅲ）纯化HI蛋白色谱图。

图47、放大后MMC及Q HP层析（批次Ⅲ）纯化HI蛋白电泳图。M：蛋白质分子量标准；1：纯化前样品；2：MMC洗脱样品；3：G25脱盐样品；4：Q HP流穿样品。

图48、HI原液的HPLC检测结果；主峰保留时间13.913分；主峰比率100.0%。

图49、磷酸铝吸附HI前后的10%SDS-PAGE结果。M：蛋白质分子量标准；1：吸附前；2：吸附后。

具体实施方式

现结合具体实施方式说明本发明，但本发明的范围不限于以下内容。

以下实施例中所使用的菌株与各种试剂如下：

1.菌株

金黄色葡萄球菌MRSA-252国际标准株由美国ATCC提供；

菌株XL1-blue大肠杆菌为美国安捷伦公司产品。

2.质粒

质粒pGEX-6p-2为美国GE Healthcare公司产品。

3.试剂

primeSTAR HS DNA聚合酶、DNA分子量标准、限制性内切酶BamH I和Not I、蛋白分子量标准、DNA连接酶为大连TakaRa公司产品；

质粒提取试剂盒和凝胶回收试剂盒为美国Omega公司产品；

MH培养基：购自北京奥博星生物技术有限责任公司（牛肉粉2.0g，可溶性淀粉1.5g，酸水解酪蛋白17.5g），加水至1L，pH值7.4±0.2；

MH平板：MH培养基加入琼脂糖至终浓度为1.5g/100mL；

PBS（磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.2g（国产分析纯），磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)2.9g（国产分析纯），氯化钠(NaCl)8.0g（国产分析纯），氯化钾(KCl)0.2g，加水至1000mL，pH7.4）；

20mM PB缓冲液：磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.2g，磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)2.9g，氯化钾(KCl)0.2g，加水至1000mL，pH7.0；

氨苄西林、卡那霉素（华北制药）；

5×蛋白质上样缓冲液（250mM Tris-HCl（pH6.8），10％（W/V）SDS，0.5％（W/V）溴酚蓝，50％（V/V）甘油，5％（W/V）β-巯基乙醇）；

谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B（美国GE Healthcare公司）；

磷酸铝佐剂(20mg/ml)（美国GENERAL CHEMICAL公司）；

疫苗蛋白稀释溶液（组氨酸（美国Merck公司，药用级）10mM、NaCl0.9%（西南制药，注射用生理盐水）、泊洛沙姆188（美国Merck公司，药用级）0.01%、pH6.0），无热原；

琼脂粉、吐温-20等其余试剂均为国内市场购买。

实施例1：HI工程菌的发酵工艺

本实施例中使用的HI工程菌为含有表达HI重组蛋白的pGEX-6p-2载体（pGEX-6P-2-HI）的大肠杆菌XL1-Blue（pGEX-6P-2-HI/XL1-blue），其构建过程参见CN102993308A。

1、发酵条件的确定

1）培养基对工程菌生长与目的蛋白表达的影响：

在摇瓶中测试四种培养基对工程菌生长的影响：

植物源性改良TB（磷酸二氢钾2.3g、十二水磷酸氢二钠13g、甘油5ml、酵母提取物24g、大豆蛋白胨12g、硫酸镁1g，加水至1L）；

动物源性改良TB（磷酸二氢钾2.3g、十二水磷酸氢二钠13g、甘油5ml、酵母提取物24g、动物源胰蛋白胨12g、硫酸镁1g，加水至1L）；

植物源性M9-CAA（磷酸氢二钠15.6g、磷酸二氢钾4.3g、氯化铵1g、硫酸镁1g、氯化钠0.67g、葡萄糖5g、大豆蛋白胨3.6g、植物源酵母粉4g、酸水解酪蛋白6g，加水至1L）；

动物源性M9-CAA（磷酸氢二钠15.6g、磷酸二氢钾4.3g、氯化铵1g、硫酸镁1g、氯化钠0.67g、葡萄糖5g、动物胰蛋白胨3.6g、动物源酵母粉4g、酸水解酪蛋白6g，加水至1L）。

取pGEX-6P-2-HI/XL1-blue接种于Amp⁺（100μg/mL）L B平板内，37℃孵育16h-20h，挑取单菌落于10ml Amp⁺LB培养基里，置于摇床中37℃、200rpm摇到OD₆₀₀大约2左右时，按1:100分别接种于100ml四种培养基中，37℃、200rpm摇14h，每2h取样测OD₆₀₀，其结果见图1。

由图1可知：植物源性培养基均差于动物源性，工程菌都是大约8h时就生长减缓，而在动物源性培养基中就长势很好，一直处于对数期，且TB好于M9，故选用动物源培养基（动物源性改良TB和M9-CAA之后简称为TB、M9）。

将新鲜HI工程菌菌液（OD₆₀₀大约2）按1:100分别接种于100ml TB和M9培养基中，37℃、200rpm摇至OD₆₀₀大约0.8左右时，加入1mM IPTG，25℃诱导12h。取100ml菌液离心，弃上清，称重TB:2.4g、M9:1.5g。以1g:10ml加PBS超声（功率300瓦）裂解10min(工作6秒，休息9秒)破菌，结合GST-琼脂糖凝胶4B（参考实施例2），进行10%SDS-PAGE，结果如图2所示。

如图2所示：单位目的蛋白表达量TB好于M9，且单位菌湿重TB大于M9，故HI工程菌发酵选用TB培养基。

2）IPTG浓度对目的蛋白表达的影响：

考察不同终浓度的IPTG对目的蛋白表达水平的影响。IPTG的终浓度分别是0.1mM、0.2mM、0.5mM、1mM，对其进行比较选出最佳浓度。将新鲜HI工程菌菌液（OD₆₀₀大约2）按1:100分别接种于四个100ml TB中，37℃、200rpm摇至OD₆₀₀大约0.8左右时，分别加入IPTG，使其分别对应上述四个浓度（一瓶一个浓度），25℃诱导12h。将四瓶菌液分别离心，弃上清，以1g:10ml加入PBS，超声（功率300瓦）裂解10min(工作6秒，休息9秒)破菌，结合GST-琼脂糖凝胶4B（具体过程参考实施例2），进行10%SDS-PAGE，结果如图3所示。

由图3可知：IPTG终浓度为0.2mM时蛋白表达量明显好于0.1mM，与0.5mM、1mM时的蛋白表达量基本相同，故HI工程菌发酵时IPTG终浓度选为0.2mM。

3）种子菌的不同接种量对工程菌的生长和目的蛋白表达的影响

研究5%、10%、15%三种不同种子菌接种量对发酵的影响。通过细菌生长曲线、单位蛋白表达量来确定最佳接种量。当种子菌OD₆₀₀在2左右时，倒入发酵罐内开始计时，每1小时取样测OD₆₀₀，直到诱导前结束，绘制工程菌前期生长期曲线（图4），可判断细菌生长速度快慢。诱导结束后，按照之前方法处理，进行10%SDS-PAGE，判断单位目的蛋白表达量（图5）。

由图4可知，5%接种量细菌生长最慢而且最高OD₆₀₀较另两种接种量低很多。10%与15%接种量相差不大。由图5可知，不同接种量单位目的蛋白表达量不同，表达最好的是5%接种量，其次是10%，但相差不大，15%最差。

综上所述：5%接种量表达最好，但生长速度慢，最终细菌得率少；15%接种量生长速度快，但表达最差；10%接种量的蛋白表达量比5%相差不多，而且生长速度也比15%相差不多，故HI工程菌发酵时接种量选为10%。

4）氧浓度对工程菌生长和目的蛋白表达的影响

此工程菌是兼性厌氧菌，氧浓度的高低对细菌生长影响很大，所以在发酵过程中对溶氧的控制就显得特别重要，现分别考察溶氧在25%、45%、65%时细菌的生长情况（图6）和目的蛋白表达量（图7）。

从细菌生长情况可知：45%溶氧条件下，细菌长得最好；从单位蛋白表达量来看，45%溶氧条件下，表达量也是最好的，故HI工程菌发酵时溶氧浓度选为45%。

5）甘油用量对工程菌生长和目的蛋白表达的影响

在不同菌量时进行诱导，会影响HI重组蛋白的表达量，而发酵时培养基中甘油的量会直接影响菌量的多少。当罐内甘油消耗完时，细菌就会停止生长，在短时间内pH值和溶氧值迅速上升，此时应马上加IPTG开始诱导。所以甘油的多少直接决定诱导时机。通过研究5ml/L、10ml/L、15ml/L（培养基）的甘油量对目的蛋白表达量的影响和最终湿重得率来确定最佳诱导时机。结果如图8所示。

从图8可知：5ml/L甘油浓度时，表达量最高；10ml/L其次，但相差不多；15ml/L就差多了。但是5ml/L甘油浓度时，最后菌体湿重低很多；10ml/L与15ml/L相差不多，故HI工程菌发酵时甘油量选为10ml/L。

6）不同的诱导温度和时间对目的蛋白表达的影响

考察30℃、25℃、16℃三个不同诱导温度对蛋白表达量的影响，以及达到最大表达量时用的时间。在诱导后每2h取样，诱导10h，处理样品，进行10%SDS-PAGE，其结果如图9所示。

由图9可知：30℃时单位诱导表达量是最高的，且达到最大表达所用时间是最短的，4h-6h之间的表达差异不大。而25℃、16℃时单位表达量就不如30℃，且表达时间长。故HI工程菌发酵时诱导温度和时间选用30℃、5h。

根据上述研究，最终确定了本发明的HI工程菌的优选发酵工艺是：

（1）基础培养基选用动物源性TB培养基，其中甘油量是10ml/L；

（2）发酵开始时，种子菌的接种量比例是10%；

（3）在发酵过程中溶氧浓度始终保持在45%左右；

（4）诱导时，温度调为30℃、IPTG浓度为0.2mM、诱导时间5h。

2、工程菌发酵工艺放大

按照上述的优化条件对发酵规模进行扩大（25L），并得到HI工程菌生长曲线（图10）和单位蛋白表达量电泳图(图11)。

由图10可知，工艺放大后，整个生长曲线比较标准，前期细菌生长较快，后期诱导时曲线较平稳，最终获得菌密度（OD₆₀₀）达54，单位菌湿重56g/L。

由图11可知，从单位目的蛋白表达量看：表达量随时间的延长有明显增加，5h表达量最高。

综上所述：HI工程菌发酵工艺放大完全符合预期结果。本发明的发酵工艺可适用于大规模的工业生产。

实施例2：HI重组蛋白的纯化工艺

1、破菌制备上清：

向实施例1发酵生产的菌体200-500g加入20mmol/L PBS，pH7.0缓冲液，按重量：体积比1:10比例加入，混匀悬浮，4℃预冷。

高压破碎：使用蒸馏水冲洗高压匀质机（高压匀质机APV-1000，丹麦An Invernsys Group）管道，低温循环系统开启预冷至1-4℃备用。将预冷的悬浮菌液加入高压匀质机，压力维持在60-80Mpa破菌3-5次。

高速离心：破菌后的液体装入离心桶（Beckman，美国），4℃，10,000-15,000g离心15-30min，收集上清备用。

2、GST-琼脂糖凝胶4B亲和层析纯化

按每升HI破菌离心后上清液加入200ml GST填料，20～25℃结合4h以上，结合过程采用垂直旋转或搅拌的方法以促进HI蛋白与GST填料的结合。将上述结合HI蛋白的GST填料采用PBS洗涤5个体积以除去未与GST填料结合的杂蛋白。然后按每100ml GST填料加入20ml的PP酶（2mg/mL，IU/mg），在20～25℃条件下酶切6h后抽滤并收集滤液，即获得切除GST标签的HI蛋白，进行10%SDS-PAGE分析。结果如图12所示，实验显示，经过GST亲和后获得的HI蛋白的含量与纯度（>90%）有了显著的提高，且工艺具有很好的稳定性，可为后续进一步的精细层析纯化提供良好的样品。

3、阳离子交换层析

1）层析填料的选择

比较采用MMC、Resource S、SP HP、Phenyl FF、Butyl FF及Octyl FF，对HI蛋白的纯化效果。使用的样品为上述获得的GST亲和层析后样品。

仪器系统：AKTA-explorer100液相色谱系统（GE Healthcare）；

层析填料：①MMC、②Resource S、③SP HP、④Phenyl FF、⑤Butyl FF及⑥Octyl FF（GE Healthcare公司）；

柱规格：①(Φ)0.77cm×(H)10cm、②0.64cm×(H)3cm、③(Φ)1.6cm×(H)2.5cm、④⑤⑥(Φ)0.7cm×(H)2.5cm；

装柱体积：①4.7ml、②④⑤⑥1ml、③5ml；

缓冲液：

MMC缓冲液：缓冲液A:25mM NaAC-HAC，pH4.5；

缓冲液B:50mM PB+1M NH₄Cl，pH7.0；

Resource S缓冲液：缓冲液A:20mM PB，pH6.0；

缓冲液B:50mM PB+1M NaCl，pH6.0；

SP HP缓冲液：缓冲液A:20mM PB，pH6.0；

缓冲液B:50mM PB+1M NaCl,pH6.0

Phenyl FF缓冲液：缓冲液A:20mM PB+1.5M(NH₄)₂SO₄，pH6.0；

缓冲液B:20mM PB，pH6.0；

Butyl FF缓冲液：缓冲液A:20mM PB+1.5M(NH₄)₂SO₄，pH6.0；

缓冲液B:20mM PB，pH6.0；

Octyl FF缓冲液：缓冲液A:20mM PB+1.5M(NH₄)₂SO₄，pH6.0；

缓冲液B:20mM PB，pH6.0；

上样样品：GST亲和层析后样品调节pH与纯化填料相对应缓冲液A一致备用。

流速及洗脱程序：

MMC：上样流速：4.7ml/min，洗脱流速：4.7ml/min；

洗脱程序：0-100%B，20个柱体积（CV）；

Resource S：上样流速：2ml/min，洗脱流速：2ml/min；

洗脱程序：0-100%B，40个柱体积（CV）；

SP HP：上样流速：5ml/min，洗脱流速：5ml/min；

洗脱程序：0-50%B，20个柱体积（CV）；

Phenyl FF：上样流速：2ml/min，洗脱流速：1ml/min；

洗脱程序：0-100%B，20个柱体积（CV）；

Butyl FF：上样流速：2ml/min，洗脱流速：1ml/min；

洗脱程序：0-100%B，20个柱体积（CV）；

Octyl FF：上样流速：2ml/min，洗脱流速：1ml/min；

洗脱程序：0-100%B，20个柱体积（CV）。

各洗脱程序中其余份额的缓冲液是对应的缓冲液A。

收集：将目的蛋白各洗脱样品进行10%SDS-PAGE纯度分析，评价纯化效果。

从图13至图24可以看出，在不同层析填料条件下，MMC比Resource S、SP HP、PhenylFF、Butyl FF及Octyl FF洗脱目的蛋白的纯度更高，通过一步精细纯化就达到了很好的层析纯化效果，且纯度能够达到97%以上，因此，综合上述考虑，确定选择MMC作为第一步精细层析纯化的填料。

2）层析纯化工艺的优化

a、不同缓冲液条件下的纯化效果比较：

仪器系统：AKTA-explorer100液相色谱系统（GE Healthcare）；

层析填料：MMC；

柱规格：(Φ)0.77cm×(H)10cm；

装柱体积：4.7ml；

缓冲液：缓冲液A:①25mM NaAC-HAC,pH4.5，②25mM NaAC-HAC+1%吐温-20+20%甘油，pH4.5，③20mM PBS,pH7.2；

缓冲液B:①50mM PB+1M NH₄Cl,pH7.0，②50mM Tris+1%吐温-20+20%甘油，pH10.0，③100mM NaHCO₃-NaOH，pH11.0。

上样样品：GST亲和层析后样品调节pH与缓冲液A一致备用。

上样流速：4.7ml/min，洗脱流速：4.7ml/min；

洗脱程序：0-100%B，20个柱体积（CV）。

收集：将目的蛋白各洗脱样品收集，并进行10%SDS-PAGE纯度分析，评价纯化效果。

从图25和26可以看出，在洗脱缓冲液①的条件下，目的蛋白出峰比较晚，且峰不高，可能的原因是随着B液的增加，NH₄Cl的浓度也随之增加，由于MMC柱具有苯环疏水，目的蛋白会与MMC结合越来越牢固，但又因为B液中pH的不断升高，有小部分的目的蛋白被洗脱下来，从电泳图上可知纯度已达到要求；从图27和28可以看出，在洗脱缓冲液②的条件下，去除了NH₄Cl和提高pH至10.0，但目的蛋白仍在100%B液及pH10.0处出现高峰，蛋白得率提高了很多，说明去除NH₄Cl及提高pH的方法可行，但仍需进一步提高pH值。从图29和30可以看出，在洗脱缓冲液③的条件下，提高pH至11.0，目的蛋白很快就被洗脱下来，且峰很高。

因此，综合上述结果，选择pH7.0-7.5作为上样pH值，选在pH11.0作为洗脱pH值。

b、不同样品电导条件下的纯化效果比较

仪器系统：AKTA-explorer100液相色谱系统（GE Healthcare）；

层析填料：MMC；

柱规格：(Φ)1.6cm×(H)20cm；

装柱体积：24ml；

缓冲液：缓冲液A:20mM PBS,pH7.5；

缓冲液B:100mM NaHCO₃–NaOH，pH11.0；

上样样品：GST亲和层析后样品调节pH与缓冲液A一致备用；

上样流速：4.7ml/min，洗脱流速：4.7ml/min；

洗脱程序：0-100%B，20个柱体积（CV）；

收集：将目的蛋白各洗脱样品收集，并进行10%SDS-PAGE纯度分析，评价纯化效果（图31-36）。

从图31至图36可以看出，在上样样品电导在5-15ms/cm之间，目的蛋白没有明显的流穿峰；在图31中，样品电导突然提高到35ms/cm时，出现一蛋白峰，经电泳鉴定，是目的蛋白。

因此，综合上述考虑，选择上样样品电导应低于30ms/cm。

4、G25层析置换缓冲液

仪器系统：AKTA-explorer100液相色谱系统（GE Healthcare）；

层析填料：G25；

柱规格：(Φ)5cm×(H)30cm；

装柱体积：500ml；

缓冲液：缓冲液A:疫苗稀释液（组氨酸（Merck，美国，药用级）10mmol/L，泊洛沙姆188（Merck，美国，药用级）0.01%w/v，NaCl9g/L(西南制药)）

上样样品：MMC洗脱样品；

流速：20ml/min。

将上步纯化获得的样品通过G25层析柱置换缓冲液，收集蛋白峰。

5、第二步层析纯化及去内毒素

仪器系统：AKTA-explorer100液相色谱系统（GE Healthcare）；

层析填料：Q HP；

柱规格：(Φ)2.6cm×(H)20cm；

装柱体积：50ml；

缓冲液：缓冲液A:疫苗稀释液；缓冲液B:1M NaOH；

上样样品：G25置换缓冲液样品；

流速：8ml/min。

用缓冲液B(1mol/L NaOH)在位清洗消毒5个柱体积，放置半小时后，使用疫苗稀释液平衡系统至pH为6.0，然后上样。流速：8ml/min。收集穿透峰即HI重组蛋白原液。

将洗脱样品进行10%SDS-PAGE，结果见图37和38。

6、工艺放大

按照以上确定的条件进行工艺放大：所采用的MMC层析柱规模放大为(Φ)2.6cm×(H)20cm（装柱体积为70ml），流速为20ml/min；Q HP层析柱规模放大为(Φ)2.6cm×(H)20cm（装柱体积为50ml），流速为8ml/min。。重复三批次实验，10%SDS-PAGE分析HI蛋白纯化后的效果（图39-46），评价此工艺放大后的稳定性和可重复性。

从图39至图47可以看出，HI蛋白经MMC层析工艺放大后，放大层析纯化模式和小量试验层析纯化色谱图无明显变化，经纯化后的HI纯度仍然达到97%以上；Q HP去内毒素后，对样品进行检测均达到要求。说明HI蛋白纯化工艺稳定，可适用于大规模的工业生产。

7、HPLC纯度检测

HPLC仪Agilent1260（美国Agilent Technologies），分析柱ZorBax SB-300-C3，4.6x150mm3.5micron（美国Agilent Technologies）。

流动相：A：0.1%三氟乙酸（Tedia，美国），水（18.2MΩ）；B：0.1%三氟乙酸（Tedia，美国），乙腈（Tedia，美国）。

柱温60℃，流速0.5mL/min，上样10μl。

检测方法：0-30min：90%-0%A，10%-100B；30-35min：100%B；35-40min：90%A，10%B；40-45min：90%A，10%B。

检测结果如图48和表1。

表1：HI样品的HPLC检测结果数据

峰#	保留时间（min）	类型	峰宽（min）	峰面积（mAU*s）	峰面积%
						1	11.158	0.0000	0.00000	0.0000
2	13.913	VB	0.1333	2132.81860	100.0000
						3	32.252	0.0000	0.00000	0.0000

检测结果：HI主峰保留时间13.913分；主峰面积比率100.0%。

8、蛋白N端、C端测序、分子量测定及氨基酸组成分析

委托上海中科新生命生物科技有限公司对获得的HI蛋白进行测序分析，结果与理论设计完全一致。

实施例3：HI蛋白内毒素含量测定

1、将实施例2获得的样品用无热原水（湛江博康海洋生物有限公司）稀释至50μg/mL作为待测样品。根据内毒素检测试剂盒（湛江博康海洋生物有限公司）能检测到的最高范围0.25EU/mL，对待测样品进行稀释。即假定待测样品内毒素含量为5EU/mL，则用无热原水进一步稀释待测样品至2.5μg/mL(稀释20倍)；

2、按照试剂盒说明书配制内毒素标准品阳性对照溶液、待测样品工作液、待测样品检测溶液；

3、鲎试剂的准备：根据各待测样品及对照品的数量，取鲎试剂，酒精棉球消毒瓶颈，晾干后开启，每支加入检查用水0.1ml，轻轻摇匀备用；

4、加样：向配制好的鲎试剂中分别加入待测样品检测溶液、内毒素标准品阳性对照液、检查用水各0.1ml，轻摇混匀，封口膜封口，37℃水浴60±2分钟，期间严禁移动；检查用水为阴性对照；

5、检测：取出样品，轻轻垂直旋转180°，观察瓶底，液体凝固不流动为阳性，流动不凝固为阴性；

测定结果：阴性，小于5EU/ml。

实施例4：金黄色葡萄球菌HI重组亚单位疫苗的制备

磷酸铝为美国GENERAL CHEMICAL公司原装进口产品(20mg/ml)。

1、配制重组金黄色葡萄球菌HI疫苗

1）量取磷酸铝佐剂80μL，将其加入到配制瓶中，量取疫苗蛋白稀释液（组氨酸10mM、NaCl0.9%、泊洛沙姆1880.01%、pH6.0）220μL，总体积300μL，充分混匀；

2）用疫苗稀释液将实施例2获得的HI蛋白稀释至30μg/300μl，充分混匀；

3）将等体积的稀释后佐剂溶液与稀释后蛋白溶液加入至分装瓶中，温度范围4℃-32℃条件下，垂直混悬或水平搅拌吸附1小时后即得。

2、10%SDS-PAGE鉴定重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白磷酸铝佐剂吸附均一性与完全性

1）取HI疫苗1ml，4℃，6000rpm离心5分钟，小心吸取上清，并从上清取样40μl；

2）补入与上清等体积的解离液（1M Na₂CO₃），室温条件下，垂直混悬1小时，取样40μl；

3）按上述1的方法配制不含磷酸铝佐剂的蛋白溶液，磷酸铝所占体积以疫苗稀释液补足，充分混匀后取样40μl；

4）将所取样品加入10μl5×蛋白上样缓冲液，100℃加热5分钟，冷却并瞬时离心后，取10μl上样；

5）10%SDS-PAGE电泳，电压先80v电泳20分钟，再调至180v，电泳40分钟，然后将胶取出，置于考马斯亮蓝染色液中振荡染色，再置于脱色液中振荡脱色后，在成像系统下观察结果，结果示于图49，可见磷酸铝佐剂能充分吸附蛋白。

实施例5：HI疫苗免疫动物及抗体的检测

1、免疫动物

1）实验动物：6只6～8周龄BALB/c小鼠（北京华阜康），体重约为16～18g；

2）免疫程序：根据实施例4制备的疫苗制剂以30μg/600μl分三次在股四头肌肌注（0、14、21天）免疫。

2、第三次免疫后第7天，采集BALB/C小鼠的血清，用ELISA检测小鼠免疫后IgG应答水平。

3、ELISA

1）制备液体

①包被液的配制：称取NaHCO₃1.6g，Na₂CO₃2.9g，溶于1L ddH₂O，将pH调至9.6；

②封闭液的配制：1g牛血清Ⅴ(Sigma，美国)，溶于100mL抗体稀释液(1:100)；

③抗体稀释液的配制：在电子天平上称取NaCl8g，KH₂PO₄0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O2.9g，KCl0.2g，吐温200.5mL，调节pH至7.4，加蒸馏水定容至1000mL；

④洗涤液的制备：称取2.42g Tris溶于1L ddH₂O，再加入500μL吐温20，再将pH调至7.4；

⑤显色液（TMB），为天根公司产品；

⑥终止液（2M H₂SO₄）的制备：将22.2mL浓硫酸倾注入177.8mL ddH₂O中。

2）ELISA检测HI重组蛋白免疫小鼠产生的抗体效价

①包被：HI重组蛋白用包被液稀释至1μg/mL包被96孔板（Corning，美国），200μL/孔，4℃过夜后用洗涤液洗涤3遍，空干后用保鲜膜包上，置于4℃冰箱中备用；设置PBS对照孔。

③封闭：酶标板加封闭液100μL/孔，置于37℃孵育箱中2小时，洗涤3遍；

④将血清进行1:100、1:500、1:1000、1:2000、1:4000、1:8000等倍比稀释；

⑤取封闭好的酶标板，依次加入稀释血清，100μL/孔，置于37℃孵育箱30min，洗涤3遍，空干；

⑥将加HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体保存液，稀释1：5000，制成抗体工作液；

⑦加入稀释抗体工作液，100μL/孔，置于37℃孵育箱1h，洗涤三遍，空干；

⑧加入底物显色液（TMB）100μL/孔，室温避光反应5min；

⑨加入终止液（2mol/L H₂SO₄），立即置于酶标仪上以450nm波长处测定OD值；

⑩结果判断：A_样品/A_阴性值≥2.1为阳性（阴性对照为小鼠免疫前血清1:1000倍稀释）。

结果：检测HI疫苗免疫小鼠产生的抗体效价达到1:128000，说明本发明构建的HI重组亚单位疫苗能够免疫小鼠产生高效价抗体。

实施例6：通过HI疫苗免疫小鼠确定免疫动物的攻毒保护效果

同实施例5的免疫方案，第三次免疫小鼠后，在第14天采用致死剂量，尾静脉注射MRSA-252活菌进行攻毒实验，每只BALB/c小鼠注射菌液量为1.25×10⁹CFU，观察10天，统计各组小鼠的存活率。3轮动物保护试验（10只/轮）结果示于表2。

表2：HI疫苗免疫小鼠对动物的攻毒保护

组别	小鼠（只）	免疫组分	10天后存活数	3轮平均保护率（%）
					实验组	30	HI+AlPO₄佐剂	12	40
阴性对照组	30	疫苗稀释液	2	6.7

表2显示：阴性对照组的3轮平均免疫保护率分别为6.7%，HI加AlPO₄佐剂组的3轮平均免疫保护率为40%。因此，本发明的HI重组蛋白具有良好的免疫原性，并且能够对金葡菌株MRSA-252感染起到免疫保护作用，能够诱导机体产生保护性免疫应答，可以辅以铝佐剂制备亚单位疫苗用于预防金黄色葡萄球菌感染。

通过以上实施例可见，本发明的发酵和纯化方法能够大规模、高密度地制备HI重组蛋白，方法易于实施，得到的HI重组蛋白得率高、纯度好，免疫原性强。本领域技术人员利用本领域相关技术知识可以显而易见地应用本发明方法制备HI重组蛋白，并将其用于免疫防治及诊断金黄色葡萄球菌感染的应用。

Claims

1.一种HI重组蛋白基因工程菌的发酵工艺，包括将一定量的种子菌接种于含有甘油和一定溶氧量的培养基中，经诱导剂诱导一定时间而表达重组蛋白。

2.根据权利要求1所述的工艺，其中，所述培养基是动物源性TB、动物源性M9、植物源性TB或植物源性M9。

3.根据权利要求1所述的工艺，其中，所述种子菌的接种量是5%～15%，优选为10%。

4.根据权利要求1所述的工艺，其中，所述甘油量为5-15ml/L培养基，优选为10ml/L培养基。

5.根据权利要求1所述的工艺，其中，所述溶氧量是25%～65%，优选为45%。

6.根据权利要求1所述的工艺，其中，所述诱导剂可以是乳糖或IPTG，所述诱导剂的浓度是0.1～1mM，优选为0.2mM；诱导温度为16～37℃，优选为30℃；诱导时间为1～6小时，优选为5小时。

7.根据权利要求1-6任一项所述的工艺，其中，所述工程菌是含有能够表达HI蛋白的大肠杆菌；优选地，所述大肠杆菌是XL-1Blue；所述载体是pGEX-6p-2。

8.一种在如权利要求1-7任一项所述的HI重组蛋白工程菌发酵工艺之后纯化HI重组蛋白工艺，包括依次进行的GST-琼脂糖凝胶4B亲和层析、阳离子交换层析、置换缓冲液及去内毒素。

9.根据权利要求8所述的工艺，其中，所述阳离子交换层析使用MMC层析柱，使用的缓冲液为，缓冲液A:25mM NaAC-HAC，pH4.5，缓冲液B:50mM PB+1M NH₄Cl，pH7.0；上样流速为4.7ml/min，洗脱流速：4.7ml/min；洗脱程序：0-100%B，20个柱体积（CV）；优选地，上样pH值为7.0-7.5，洗脱pH值为11.0；所述置换缓冲液使用G25层析柱，使用缓冲液为疫苗稀释液；所述去内毒素使用Q HP层析柱，使用缓冲液为，缓冲液A：疫苗稀释液，缓冲液B:1M NaOH。

10.根据权利要求8或9所述工艺，在纯化之前，对HI工程菌进行菌体破碎，以将重组蛋白从菌体中释放出来。