CN111072777A - 抗mHIN2蛋白抗体及其应用和包含其的试剂盒 - Google Patents

抗mHIN2蛋白抗体及其应用和包含其的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，提供了抗mHIN2蛋白抗体及其应用和包含其的试剂盒，所述抗体包含重链和轻链，所述重链和轻链分别包含3个CDR区，其中所述重链CDR区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1～3或7～9所示，所述轻链CDR区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4～6或10～12所示。本发明的抗mHIN2蛋白抗体能够与mHIN2蛋白特异性结合，有效地检测出mHIN2蛋白的含量，灵敏度高，检测范围广。

Description

抗mHIN2蛋白抗体及其应用和包含其的试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种单克隆抗体及其应用。
背景技术
金黄色葡萄球菌α-溶血素(Hla)是一种外毒素，为金黄色葡萄球菌感染最主要的致病因子，常由致病性金黄色葡萄球菌特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)产生。铁离子表面决定因子B亚单位(IsdB)是金黄色葡萄球菌一个重要外膜锚定蛋白，在协助细菌吸收代谢血红素铁过程、细菌粘附与定植中发挥重要作用。mHIN2是采用分子融合及大肠杆菌基因工程表达技术，将金黄色葡萄球菌的α-溶血素无毒突变体(mHlaH35L)与铁离子表面决定因子B亚单位N2活性片段(IsdB-N2)进行分子融合及可溶性表达的重组融合蛋白。
采用重组mHIN2蛋白作为免疫原，经免疫、筛选、鉴定后获得的针对mHIN2多个活性表位的单克隆抗体，可应用于制备免疫防治金黄色葡萄球菌感染的特异治疗性抗体药物、检测重组金黄色葡萄球菌疫苗中mHIN2抗原含量的检测试剂盒。目前尚未有相应抗体存在。
发明内容
基于上述原因，本发明提供一种抗mHIN2蛋白的抗体，能够有效检测包含mHIN2蛋白的试剂，如疫苗中的mHIN2蛋白的含量，以解决上述问题。
第一个方面，本发明提供抗mHIN2蛋白的抗体，所述抗体包含重链和轻链，所述重链和轻链分别包含3个CDR区，其中：
所述重链CDR1区的氨基酸序列为GYTFTSYW(SEQ ID NO:1)；
所述重链CDR2区的氨基酸序列为INPTNGHT(SEQ ID NO:2)；
所述重链CDR3区的氨基酸序列为ARDGYDDGSWLAY(SEQ ID NO:3)；或者
所述重链CDR1区的氨基酸序列为GFTFSSFG(SEQ ID NO:7)；
所述重链CDR2区的氨基酸序列为INSDSSNI(SEQ ID NO:8)；
所述重链CDR3区的氨基酸序列为ARSGTTVVQDH(SEQ ID NO:9)；以及
所述轻链CDR1区的氨基酸序列为QRIGTN(SEQ ID NO:4)；
所述轻链CDR2区的氨基酸序列为YAS(SEQ ID NO:5)；
所述轻链CDR3区的氨基酸序列为QQSNSWPYS(SEQ ID NO:6)；或者
所述轻链CDR1区的氨基酸序列为QDISNY(SEQ ID NO:10)；
所述轻链CDR2区的氨基酸序列为YTS(SEQ ID NO:11)；
所述轻链CDR3区的氨基酸序列为QQGNTLPWT(SEQ ID NO:12)。
优选地，所述抗体包含重链和轻链，其中，
所述重链CDR1区的氨基酸序列为GYTFTSYW(SEQ ID NO:1)；
所述重链CDR2区的氨基酸序列为INPTNGHT(SEQ ID NO:2)；
所述重链CDR3区的氨基酸序列为ARDGYDDGSWLAY(SEQ ID NO:3)；
所述轻链CDR1区的氨基酸序列为QRIGTN(SEQ ID NO:4)；
所述轻链CDR2区的氨基酸序列为YAS(SEQ ID NO:5)；
所述轻链CDR3区的氨基酸序列为QQSNSWPYS(SEQ ID NO:6)；或者
所述重链CDR1区的氨基酸序列为GFTFSSFG(SEQ ID NO:7)；
所述重链CDR2区的氨基酸序列为INSDSSNI(SEQ ID NO:8)；
所述重链CDR3区的氨基酸序列为ARSGTTVVQDH(SEQ ID NO:9)；
所述轻链CDR1区的氨基酸序列为QDISNY(SEQ ID NO:10)；
所述轻链CDR2区的氨基酸序列为YTS(SEQ ID NO:11)；
所述轻链CDR3区的氨基酸序列为QQGNTLPWT(SEQ ID NO:12)。
进一步优选地，所述抗体为抗体5A8，其重链和轻链序列分别为：
重链：
VQLQESGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWIHWVKQRPGQGLEWIGEINPTNGHTNFNEKFKNRATLTVDKSSNTAYMQLSILTSEDSAVYYCARDGYDDGSWLAYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:13)；
轻链:
DILLTQSPAILSVSPGERVSFSCRASQRIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQSNSWPYSFGGGTKLEI(SEQ ID NO:14)；或者
所述抗体为抗体7G4，其重链和轻链序列分别为：
重链:
VKLQQSGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPEKGLEWVAYINSDSSNIYYADTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARSGTTVVQDHWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:15)；
轻链:
DIVLTQTPSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSKLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISSLEQEDIATYFCQQGNTLPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:16)。
优选地，所述抗体为IgG抗体。
第二个方面，本发明提供一种检测mHIN2蛋白含量的试剂盒，所述试剂盒包括本发明的抗体。优选地，所述抗体为抗体5A8和7G4。
优选地，所述试剂盒还包括人IgG、洗液、底物显色液A(EDTA-Na、柠檬酸、甘油、TMB)、底物显色液B(醋酸钠、柠檬酸、30％H2O2)、终止液(2M H2SO4)和BSA。
优选地，所述试剂盒还包括酶联板和封板膜。
优选地，所述试剂盒还包括mHIN2蛋白标准品。
更优选地，所述抗体5A8为检测抗体，所述抗体7G4为包被抗体。
第三个方面，本发明提供一种检测mHIN2蛋白含量的方法，包括使用抗体5A8和抗体7G4，利用双抗体夹心法进行ELISA检测。
优选地，所述方法包括：
1)使用抗体7G4包被酶联板；
2)将检测样品与抗体7G4反应；
3)使用抗体5A8进行检测和显色反应，测定450nm下吸光值；
4)利用mHIN2蛋白标准品制备标准曲线，根据标准曲线计算被测样品中mHIN2蛋白含量。
优选地，所述方法的检测的mHIN2蛋白含量范围是0.046875～3μg/ml。
第四个方面，提供本发明的抗mHIN2蛋白抗体在检测mHIN2蛋白含量中的应用。
在本发明中，所述mHIN2蛋白的序列为：
GPLGSMADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMLKKVFYSFIDDKNHNKKILVIRTKGTIAGQYRVYSEEGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQISDYYPRNSIDTKEYMSTLTYGFNGNVTGDDSGKIGGLIGANVSIGHTLKYVQPDFKTILESPTDKKVGWKVIFNNMVNQNWGPYDRDSWNPVYGNQLFMKTRNGSMKAAENFLDPNKASSLLSSGFSPDFATVITMDRKATKQQTNIDVIYERVRDDYQLHWTSTNWKGTNTKDKWTDRSSERYKIDWEKEEMTNGGGGSKMTDLQDTKYVVYESVENNESMMDAFVKHPIKTGMLNGKKYMVMETTNDDYWKDFMVEGQRVRTISKDAKNNTRTIIFPYVEGKTLYDAIVKVHVKTIDYDGQYHVRIVDKEAFTKANLE。mHIN2蛋白的具体信息，包括制备等内容，参见CN103695508A，mHIN2蛋白的氨基酸序列如该专利文件的SEQ ID NO:1所示。CN103695508A的全部内容通过引用的方式结合至本文。
本发明的抗mHIN2蛋白抗体能够与mHIN2蛋白特异性结合，有效地检测出mHIN2蛋白的含量，灵敏度高，达到0.046875μg/mL，检测范围广，0.046875～3μg/mL，能够满足疫苗定量检测的要求。
附图说明
图1：1#小鼠的单克隆杂交瘤细胞培养筛选结果；
图2：2#小鼠的单克隆杂交瘤细胞培养筛选结果；
图3：标准品线性拟合结果。
具体实施方式
以下将结合具体实施方式说明本发明内容，但本发明范围不限于此。
如果没有特殊说明，以下实施例中使用的试剂和仪器都是本领域常规试剂和仪器，可以通过商购方式获得；所使用的方法均为常规实验方法，本领域技术人员根据实施例内容可以毫无疑问地实施所述方案并获得相应结果。
本发明以mHIN2重组蛋白作为免疫原免疫小鼠，通过多次细胞融合和筛选，获得多株特异识别mHIN2蛋白的小鼠单克隆抗体，选择高亲和力的鼠单抗进行腹水制备，通过G蛋白纯化后，分别进行HRP标记。
经过配对检测，条件优化后，获得试剂盒的配对抗体(包被抗体7G4，检测抗体5A8)，并确定检测条件和标准曲线，检测灵敏度达到0.046875μg/mL，线性范围为0.046875-3μg/mL，满足疫苗定量检测的要求。
主要试剂
Figure BDA0002338843510000041
Figure BDA0002338843510000051
主要仪器
Figure BDA0002338843510000052
Figure BDA0002338843510000061
实验动物
Balb/C小鼠：SPF(Specific Pathogen Free)级别的Balb/C小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
缓冲液配制
Figure BDA0002338843510000062
底物显色液A(A液)的配制为：EDTA-Na 0.2g、柠檬酸0.95g、甘油50ml、TMB(用DMSO溶解为10mg/ml后再加)0.2g、dH2O 500ml。
底物显色液B(B液)的配制为：醋酸钠13.6g、柠檬酸1.6g、H2O2(30％)0.3ml，dH2O500ml。
20×洗液配方为：NaCl 818g，Na2HPO4.12H2O 358g，KCl 205g，H2O定容至5L，pH值7.4～7.6。
pH 2.7的甘氨酸洗脱液配方为：甘氨酸1.9g，H2O定容至500mL，pH值2.68～2.72。
pH 1.9的甘氨酸洗脱液配方为：甘氨酸1.9g，H2O定容至500mL，pH值1.88～1.92。
实施例1：特异识别mHIN2蛋白小鼠单克隆抗体的制备和筛选
将mHIN2重组蛋白(1.4mg/mL)分别与佐剂CFA和AD11.15混合，制备免疫原，即，重组蛋白先与CFA按体积比5：6混合，作为免疫原A，重组蛋白再与AD11.15按体积比1:1混合作为免疫原B。免疫原A是初次免疫，免疫原B是加强免疫。肌肉免疫小鼠3只，免疫后在第14天抽取小鼠尾血，使用间接ELISA方法进行尾血抗体效价的评价。
使用mHIN2重组蛋白包被酶标板(1μg/mL)，每孔加入100μL，4℃过夜反应；使用PBS溶液洗板3次，使用5％牛奶-PBS在室温封闭1hr；然后使用PBS溶液洗板1次后，加入使用5％牛奶-PBS溶液梯度稀释的小鼠尾血，室温反应1hr；然后使用PBS溶液洗板3次，并进行拍干后，加入1:2000稀释的HRP标记的羊抗小鼠IgG(Fc)二抗，室温反应1hr；PBS溶液洗板5次后，拍干，加入等体积的A液和B液，避光、室温条件下反应20min；然后加入50μL终止液(2MH2SO4)，混匀后在酶标仪上读取OD450值。免疫后第14天小鼠尾血间接ELISA评价结果见表1。
表1：免疫后第14天小鼠尾血抗体效价评价
Figure BDA0002338843510000071
从结果中看出，其中3#小鼠尾血识别HI重组蛋白的抗体滴度最高，达到1:50000，1#小鼠的抗体滴度次之。因此选择1#和3#小鼠分别与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合。融合后分别挑取564和752个单克隆杂交瘤细胞培养后，采用常规ELISA进行阳性克隆筛选，筛选标准为OD值是NC值的2.1倍，筛选结果分别为图1和图2。
从筛选结果中，挑选了35个阳性克隆进行筛选的确认实验，实验过程如下：包被mHIN2蛋白100ng/孔，分别加入各克隆上清液1：1稀释作为一抗，再加入羊抗鼠二抗，保留仍为阳性的克隆，结果见表2所示。
表2：阳性克隆的确认结果
克隆号 1D3 1E2 2A6 2A9 2B5 2B6 2G7 2H1 2H2 3C11 NC NC
OD<sub>450</sub> 1.485 0.708 0.411 0.282 0.387 0.679 0.814 0.277 1.777 0.706 0.12 0.179
克隆号 3F8 4G10 4A12 4C3 4D11 4D12 4H1 4H2 5A7 5A8 NC NC
OD<sub>450</sub> 1.013 0.722 0.187 0.28 3.38 0.545 0.129 999 0.714 3.238 0.104 0.11
克隆号 5A9 6A7 6E1 6E4 7F10 7F9 7G4 7G8 8C4 8D11 NC NC
OD<sub>450</sub> 0.458 1.567 0.306 1.657 0.383 0.278 3.143 0.441 0.812 1.667 0.098 0.099
克隆号 8E3 8E4 8E5 8E7 8E10 NC NC NC NC NC NC PC
OD<sub>450</sub> 0.69 0.401 0.596 1.577 0.79 0.107 0.106 0.1 0.096 0.09 0.101 2.312
注：NC为阴性对照，5％牛奶-PBS；PC为阳性对照，1#血清；OD450值为999表示OD450值大于3.5。
从表2列出的阳性克隆复筛结果可以看出，亲和力最高的4个阳性克隆为4D11、4H2、5A8、7G4。
实施例2：纯化抗体的制备
1、腹水制备
对上面获得的4株阳性克隆(4D11、4H2、5A8、7G4)进行腹水制备。分别将约107个细胞注射入2只预先注射了IFA佐剂的Balb/C小鼠的腹腔，然后约10天后，分别抽取每个阳性克隆产生的腹水，然后4℃、12000rpm离心15min，收取上清进行下一步的G蛋白纯化。
2、小鼠单克隆抗体的纯化
取1mL的偶联有G蛋白的柱料加入一根空柱子中，使用PBS溶液清洗后，将2mL腹水用8mL的PBS稀释后上柱，然后将流过液重新上柱一次；然后使用pH 2.7的甘氨酸洗脱液进行洗脱，每1mL洗脱液收集一管(预先加入100μL中和液，中和液成分为1M Tris-HCl，10mMEDTA，1.5M NaCl，pH8.0-8.38)，共收集5管；紧接着使用pH 1.9的甘氨酸洗脱液进行洗脱，每1mL洗脱液收集一管(预先加入300μL中和液)，共收集3管；然后分别对每一管洗脱液进行OD280读数，将OD280大于0.5的洗脱液进行混合，混合后再重新测定混合液的OD280，按照1.4的系数计算抗体浓度；抗体浓度＝OD280/1.4。
将G蛋白纯化的鼠单抗使用间接ELSIA方法进行评价，结果见表3。
表3：鼠单抗纯化抗体的评价
Figure BDA0002338843510000091
注：OD450值为999表示OD450值大于3.5；NC为阴性对照；PC为各自的细胞上清。
从表3的结果中看出，4个纯化抗体的检测灵敏度约在0.0005-0.005μg/mL之间。
实施例3：抗体配对筛选
使用高碘酸钠氧化法对4种纯化抗体分别进行HRP标记，然后通过ELISA评价标记后抗体与mHIN2重组蛋白的结合能力，结果见表4。
表4：HRP标记抗体的评价结果
Figure BDA0002338843510000092
Figure BDA0002338843510000101
从表4可以看出，HRP标记后的抗体与mHIN2蛋白的结合能力与标记前的抗体相比，均没有显著的降低，可以进行接下来的配对实验(见表5)，挑选可以用于mHIN2蛋白检测的配对抗体。
表5：抗体的两两配对实验
Figure BDA0002338843510000102
Figure BDA0002338843510000111
根据表5的配对结果，以及这4个鼠单抗纯化抗体的得率综合评价，选择鼠单抗7G4作为包被抗体、鼠单抗5A8作为检测抗体的配对结果最佳。
经测序分析，抗体5A8的重链序列如SEQ ID NO:13所示，轻链序列如SEQ ID NO:14所示；抗体7G4重链序列如SEQ ID NO:15所示，轻链序列如SEQ ID NO:16所示。
实施例4：mHIN2蛋白含量检测试剂盒的制备和使用
根据上述结果，选择5A8和7G4作为抗体制备试剂盒，试剂盒中的试剂和物品可以包括：
1、抗体5A8包被酶联板 8孔×12条
2.酶结合物(抗体7G4) 120μl×1管(1:100倍稀释用)
3.BSA 3g/袋×1袋
4.人IgG 10μg/ml，120μl×1管(1:100倍稀释用)
5.20×洗液 50ml×1瓶
6.底物显色液A(EDTA-Na，柠檬酸，甘油，TMB) 7ml×1瓶
7.底物显色液B(醋酸钠，柠檬酸，30％H2O2) 7ml×1瓶
8.终止液(2M H2SO4) 7ml×1瓶
9.封板膜 2张
10.说明书 1份
另以单组份mHIN2蛋白作为标准品。
试剂盒操作步骤
1.平衡：将所需试剂移到室温(18～25℃)平衡30分钟。
2.配液：
①.1×洗涤液：取1瓶20×洗液，用去离子水稀释至1000ml，混匀后备用。
②.酶结合物稀释液(3％BSA)：将BSA(3g/袋)完全溶解到100ml①配制的1×洗涤液中，充分混匀备用。
③.酶结合物工作液：取所需酶结合物用②配制的酶结合物稀释液稀释，充分混匀备用。
④.标准品及待检品稀释液：取适量人IgG，用②稀释液将人IgG 100倍稀释后备用。
3.加样:将用抗体5A8包被的酶联板从密封袋中取出，将标准品及待检样本稀释后，每孔加样100μl，同时设阴性对照。用封板膜封板后置37℃温育60分钟。
4.洗涤:弃去各孔内液体，用洗涤液注满微孔，静置30秒后弃去孔内液体；重复3次，最后一次洗板完成后在面巾纸上拍干。
5.加酶:每孔加酶结合物工作液100μl，用封板膜封板后置37℃温育60分钟。
6.洗涤:弃去各孔内液体，用洗涤液注满微孔，静置30秒后弃去孔内液体；重复3次，最后一次洗板完成后在面巾纸上拍干。
7.显色:每孔加底物显色液A 50μl，底物显色液B 50μl，轻微振荡混匀后置室温暗处显色10分钟。
8.测定:每孔加终止液50μl，轻微混匀。选择酶标仪波长450nm，测定各孔吸光值(OD值)。
以标准品的结果采用logX-LogY的拟合方式进行线性拟合，得到标准曲线。结果见表6和图3。
表6：标准曲线
Figure BDA0002338843510000121
Figure BDA0002338843510000131
由以上结果可以看出，该试剂盒的检测灵敏度达到0.046875μg/mL，线性范围为0.046875-3μg/mL。
实施例5：试剂盒检测实验
使用该试剂盒检测金葡菌疫苗20180903批成品中mHIN2抗原的蛋白含量，检测步骤：
1.样品预处理：取疫苗成品20支，每支混匀后吸取600μL于1.5mL EP管中，5000rpm离心10min，吸取上清300μL去掉，加入2mol/L的Na2CO3溶液300μL并混匀，待溶液清亮后离心取适量上清备用；
2.按照实施例4的操作步骤对样品进行检测；
3.标准品的结果采用logX-LogY的拟合方式进行线性拟合，得到标准曲线，将检测样品的吸光值(OD值)代入标准曲线计算出样品浓度，检测结果如下：
表7：试剂盒检测mHIN2蛋白含量结果
Figure BDA0002338843510000132
Figure BDA0002338843510000141
由以上结果可以看出，用该试剂盒检测的20份样品中mHIN2蛋白含量均大于标准规定42.75μg/mL，RSD为5.66％低于10％，说明该试剂盒可以用于mHIN2蛋白的定量检测，且适用性良好。

Claims (10)

1.抗mHIN2蛋白的抗体，所述抗体包含重链和轻链，所述重链和轻链分别包含3个CDR区，其中：
所述重链CDR1区的氨基酸序列为GYTFTSYW(SEQ ID NO:1)；
所述重链CDR2区的氨基酸序列为INPTNGHT(SEQ ID NO:2)；
所述重链CDR3区的氨基酸序列为ARDGYDDGSWLAY(SEQ ID NO:3)；或者
所述重链CDR1区的氨基酸序列为GFTFSSFG(SEQ ID NO:7)；
所述重链CDR2区的氨基酸序列为INSDSSNI(SEQ ID NO:8)；
所述重链CDR3区的氨基酸序列为ARSGTTVVQDH(SEQ ID NO:9)；以及
所述轻链CDR1区的氨基酸序列为QRIGTN(SEQ ID NO:4)；
所述轻链CDR2区的氨基酸序列为YAS(SEQ ID NO:5)；
所述轻链CDR3区的氨基酸序列为QQSNSWPYS(SEQ ID NO:6)；或者
所述轻链CDR1区的氨基酸序列为QDISNY(SEQ ID NO:10)；
所述轻链CDR2区的氨基酸序列为YTS(SEQ ID NO:11)；
所述轻链CDR3区的氨基酸序列为QQGNTLPWT(SEQ ID NO:12)。
2.根据权利要求1所述的抗体，所述抗体包含重链和轻链，其中，
所述重链CDR1区的氨基酸序列为GYTFTSYW(SEQ ID NO:1)；
所述重链CDR2区的氨基酸序列为INPTNGHT(SEQ ID NO:2)；
所述重链CDR3区的氨基酸序列为ARDGYDDGSWLAY(SEQ ID NO:3)；
所述轻链CDR1区的氨基酸序列为QRIGTN(SEQ ID NO:4)；
所述轻链CDR2区的氨基酸序列为YAS(SEQ ID NO:5)；
所述轻链CDR3区的氨基酸序列为QQSNSWPYS(SEQ ID NO:6)；或者
所述重链CDR1区的氨基酸序列为GFTFSSFG(SEQ ID NO:7)；
所述重链CDR2区的氨基酸序列为INSDSSNI(SEQ ID NO:8)；
所述重链CDR3区的氨基酸序列为ARSGTTVVQDH(SEQ ID NO:9)；
所述轻链CDR1区的氨基酸序列为QDISNY(SEQ ID NO:10)；
所述轻链CDR2区的氨基酸序列为YTS(SEQ ID NO:11)；
所述轻链CDR3区的氨基酸序列为QQGNTLPWT(SEQ ID NO:12)。
3.根据权利要求2所述的抗体，其中，
所述抗体为抗体5A8，其重链和轻链序列分别为：
重链：
VQLQESGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWIHWVKQRPGQGLEWI GEINPTNGHTNFNEKFKNRATLTVDKSSNTAYMQLSILTSEDSAVYYCARDG YDDGSWLAYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:13)；
轻链:
DILLTQSPAILSVSPGERVSFSCRASQRIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYA SESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQSNSWPYSFGGGTKLE I(SEQ ID NO:14)；或者
所述抗体为抗体7G4，其重链和轻链序列分别为：
重链:
VKLQQSGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPEKGLEWV AYINSDSSNIYYADTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARSG TTVVQDHWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:15)；
轻链:
DIVLTQTPSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIY YTSKLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISSLEQEDIATYFCQQGNTLPWTFGGG TKLEIK(SEQ ID NO:16)。
4.根据权利要求1～3任一项所述的抗体，其中，所述抗体为IgG抗体。
5.一种检测mHIN2蛋白含量的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1～4任一项所述的抗体。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，还包括人IgG、洗液、底物显色液A、底物显色液B、终止液和BSA。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括酶联板和封板膜和/或mHIN2蛋白标准品。
8.一种检测mHIN2蛋白含量的方法，包括使用抗体5A8和抗体7G4，利用双抗体夹心法进行ELISA检测。
9.根据权利要求8所述的方法，包括：
1)使用抗体7G4包被酶联板；
2)将检测样品与抗体7G4反应；
3)使用抗体5A8进行检测和显色反应，测定450nm下吸光值；
4)利用mHIN2蛋白标准品制备标准曲线，根据标准曲线计算被测样品中mHIN2蛋白含量；
优选地，所述方法检测的mHIN2蛋白含量范围是0.046875～3μg/ml。
10.权利要求1～4任一项所述的抗mHIN2蛋白抗体在检测mHIN2蛋白含量中的应用。
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