CN113248588B

CN113248588B - 一种胭脂红人工抗原及其应用

Info

Publication number: CN113248588B
Application number: CN202110418786.9A
Authority: CN
Inventors: 徐振林; 朱琳; 孙远明; 陈殿; 雷红涛; 罗林; 王弘; 沈玉栋
Original assignee: GUANGZHOU WANLIAN BIOTECHNOLOGY CO Ltd; South China Agricultural University
Current assignee: GUANGZHOU WANLIAN BIOTECHNOLOGY CO Ltd; South China Agricultural University
Priority date: 2021-04-19
Filing date: 2021-04-19
Publication date: 2022-11-08
Anticipated expiration: 2041-04-19
Also published as: CN113248588A

Abstract

本发明公开了一种胭脂红人工抗原及其应用。通过本发明提供的胭脂红人工抗原和胭脂红抗体，建立了胭脂红的间接竞争酶联免疫检测方法，本检测方法对胭脂红的检测范围达到2～50ng/mL，检测限为0.98ng/mL，灵敏度可达10.1ng/mL。本发明所制备的人工抗原、特异性抗体以及以此为基础建立的免疫分析法线性范围广，灵敏度高，可满足快速筛查诊断需求。

Description

一种胭脂红人工抗原及其应用

技术领域

本发明涉及免疫检测技术领域，更具体地，涉及一种胭脂红人工抗原及其应用。

背景技术

胭脂红(Ponceau 4R)又名丽春红4R，是一种典型的单偶氮类人工合成色素。由于其成本低廉、色泽鲜艳、着色力强，在我国食品加工生产过程中被广泛应用。然而，曾盈等人曾于2007年研究过胭脂红毒性，其结果表明，胭脂红对细胞DNA有损伤作用，具有遗传毒性。自2008年起，欧洲、北美等多个国家已陆续禁止在食品中添加胭脂红，我国虽然对胭脂红的使用范围和使用限量有严格规定，但2016年至2019年期间，食药监督对部分食品抽检，每年均存在胭脂红超标情况，具体情况见附表1(来源见下列网址)。

表1 2016年至2019年部分抽检食品胭脂红超标情况表

http://news.foodmate.net/2018/08/480632.html；

http://www.cntvsp.cn/shipingnews/hy/2019/0308/15491.html；

http://www.myzaker.com/article/5a7d9d981bc8e0d535000025/；

http://www.goufenxiang.cn/news/aq/201703/3164.html；

http://news.hsw.cn/system/2017/0314/690049.shtml.

目前检测胭脂红的主要方法有高效液相色谱、高效液相色谱-质谱连用等大型仪器方法，虽然仪器方法能对样品中胭脂红含量进行准确定量，但该些仪器需要专业人员的操作，且仪器购买费用及维护费用及其昂贵，并且检测时间较长无法现场快速出结果。免疫分析方法是基于抗原抗体特异性识别的分析技术，该分析方法的特点是操作简单、灵敏度高、结合特异性强，而且易于现场快速检测。

现有技术中，2013年发表的《日落黄和胭脂红酶联免疫吸附测定法的建立》(邢玥；南开大学)，以及《胭脂红单克隆抗体的制备及ELISA检测方法的建立》(王兴；2016；扬州大学)中，都公开了对胭脂红进行免疫检测的方法。在《日落黄和胭脂红酶联免疫吸附测定法的建立》中的检测方法效果为：灵敏度IC50＝36.82ng/mL；在《胭脂红单克隆抗体的制备及ELISA检测方法的建立》中的检测效果为：IC50＝172.97ng/m。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有高效和高灵敏度的用于检测胭脂红的人工抗原及其在检测胭脂红中的应用。

本发明的第一个目的是提供一种胭脂红人工抗原。

本发明的第二个目的是提供一种胭脂红人工抗原组合。

本发明的第三个目的是提供胭脂红人工抗原组合在胭脂红的免疫检测中的应用和/或制备胭脂红检测试剂盒中的应用。

本发明的第四个目的是提供一种胭脂红特异性抗体。

本发明的第五个目的是提供胭脂红特异性抗体在胭脂红的免疫检测中的应用和/或在制备胭脂红检测试剂盒中的应用。

本发明的第六个目的是提供一种检测胭脂红的试剂盒。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

本发明通过人工方法将胭脂红结构类似物与载体蛋白偶联制备出新的胭脂红人工抗原，并使用此人工抗原作为免疫原对动物进行免疫制备出特异性识别胭脂红的抗体，建立了高效、灵敏、精确的胭脂红间接竞争酶联免疫检测方法。

因此，本发明要求保护以下内容：

一种胭脂红人工抗原，其结构式如式(II)所示

优选地，式(II)所示胭脂红人工抗原，载体蛋白选自牛血清白蛋白、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白、甲状腺蛋白、牛乳铁蛋白的一种或几种

最优选地，式(II)所示胭脂红人工抗原作为免疫原，载体蛋白为牛乳铁蛋白。

式(II)所示胭脂红人工抗原在制备胭脂红特异性抗体中的应用。

式(II)所示胭脂红人工抗原在胭脂红的免疫检测中的应用。

一种胭脂红人工抗原组合，包括式(II)所示和/或式(III)所述胭脂红人工抗原，

优选地，式(III)所述胭脂红人工抗原，其载体蛋白选自牛血清白蛋白、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白、甲状腺蛋白、牛乳铁蛋白的一种或几种。

最优选地，所述式(III)胭脂红完全抗原的载体蛋白为牛血清白蛋白。

胭脂红人工抗原组合在胭脂红的免疫检测中的应用和/或制备胭脂红检测试剂盒中的应用。

一种胭脂红特异性抗体，由式(II)所示的胭脂红人工抗原制备而得。

优选地，胭脂红特异性抗体可以为单克隆抗体、多克隆抗体或基因工程抗体。

更优选地，胭脂红特异性抗体为单克隆抗体。

胭脂红特异性抗体在胭脂红的免疫检测中的应用和/或在制备胭脂红检测试剂盒中的应用。

一种检测胭脂红的试剂盒，含有所述的胭脂红特异性抗体。

优选地，含有所述胭脂红人工抗原组合。

优选地，式(III)所示的人工抗原作为包被原。

优选地，所述试剂盒，还包括酶标抗体、显色剂和终止剂。

酶标抗体：HRP标记anti-HA二抗，显色剂：TMB显色液，终止液：10％H₂SO₄(v/v)。

更优选地，所述检测试剂盒的使用方法为：

S1.用pH 9.6碳酸缓冲溶液将包被原(式(III))稀释至1μg/mL，加到酶标板中，每孔加入100μL，37℃水浴箱中过夜；倾去孔内液体，洗板机洗板2次，每孔加含0.02％吐温-20的PBS 50μL，甩干孔中液体；每孔加入120μL 5％脱脂奶粉作为封闭液，37℃封闭3h，甩干孔内液体，倒置于37℃烘箱中1h，备用；

S2.在S1中的酶标板中，每孔加50μL待测样品(同时做空白、阴性及阳性孔对照)；用0.01mol/L，pH7.4磷酸缓冲溶液将所述特异性抗体稀释至6.25ng/mL，将50μL所述胭脂红特异性抗体的稀释液加入，37℃水浴箱中反应40min后，洗板机洗板5次，每孔加入洗涤液250μL，甩干孔中液体；

S3.在S2中的酶标板中，每孔加入100μL稀释5000倍的HRP-羊抗鼠，37℃水浴箱中反应30min后，洗板同S2；

S4.TMB显色液和0.1％过氧化氢溶液(v/v)等体积混合，在S3中的酶标板中，每孔加入混合液100μL，置于37℃水浴箱中显色10min后，每孔加入50μL 10％H₂SO₄(v/v)终止液。

S5.用酶联免疫检测仪测定S4中各孔A450nm的吸光值。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明所提供的胭脂红人工抗原是通过将胭脂红结构类似物与载体蛋白偶联所得，利用该胭脂红人工抗原免疫动物，可以得到效价高、灵敏度高的特异性抗体。通过本发明提供的胭脂红完全抗原和胭脂红抗体，建立了胭脂红的间接竞争酶联免疫检测方法，本检测方法对胭脂红的检测范围达到2～50ng/mL，检测限为0.98ng/mL，灵敏度可达10.1ng/mL。本发明所制备的人工抗原、特异性抗体以及以此为基础的说建立的免疫分析法线性范围广，灵敏度高，可满足快速筛查诊断需求。

附图说明

图1胭脂红类似物合成路线。

图2胭脂红半抗原HPLC-MS/MS鉴定图

图3胭脂红完全抗原紫外吸收图谱(免疫原)。

图4胭脂红检测抗原紫外吸收图谱(包被原)。

图5胭脂红抗体的ELISA竞争标准曲线。

具体实施方式

下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1胭脂红半抗原的制备

一、实验方法

1、胭脂红半抗原/胭脂红类似物的制备

胭脂红半抗原的合成路线图如图1所示，其结构式如式(I)所示：

具体制备步骤如下：

1mmol 4-氨基-1-萘磺酸钠四水合物溶解于1mol/L盐酸中，加入1mmol NaNO₂，置于冰浴中反应1h，测pH值，若pH值不到1，用盐酸调节pH值到1。反应结束后，加入1mmol 7-氨基-1,3-萘二磺酸(提前用1mol/L碳酸钠溶解)，测pH值，若pH值不到8，用1mol/L碳酸钠调pH值到8，继续在冰浴条件下反应7h。反应结束后，将产物混合液转移至50ml离心管中，将pH调回6.5～7，向产物中加入大量NaCl进行盐析。盐析后离心分层，取中间细密层，烘干即得胭脂红半抗原。

二、实验结果

如式(I)所示的胭脂红半抗原HPLC-MS/MS鉴定结果如图2所示，所合成的胭脂红半抗原分子式为C₂₀H₁₅N₃O₉S₃，其精准质量为537.5，图2中有明显的峰，说明胭脂红半抗原合成成功。

实施例2胭脂红人工完全抗原的制备

一、实验方法

1、胭脂红免疫原结构如式(II)所示：

具体制备步骤如下：

将30mg胭脂红半抗原(结构如式(I)所示)溶于1mL 0.1M HCl(0.1mmol)溶解，调pH为2.0，再加入100μL 0.1mmol/L的亚硝酸钠溶液，4℃避光反应1h称为A液。

将10mg牛乳铁蛋白溶于2ml硼砂缓冲溶液(0.05M，pH8.5)中，称为B液。

在冰浴搅拌下将上述A液滴加到B液中，滴加后，用3M NaOH将pH调节至9.5～9.6。避光反应过夜，并经过透析纯化后，即得免疫原(II)所示的胭脂红完全抗原。

2、胭脂红包被原结构如式(III)所示：

具体制备步骤如下：

将10mg胭脂红半抗原(结构如式(I)所示)溶于1ml硼砂缓冲溶液(0.05M，pH8.5)，加入100μL 5％戊二醛溶液(v/v)，常温下反应1h，称为A液。

将20mg牛血清蛋白溶于2ml硼砂缓冲溶液(0.05M，pH8.5)中，称为B液。

在冰浴搅拌下将上述A液滴加到B液中，滴加后，用用3M NaOH将pH调节至9.5～9.6。避光反应过夜，并经过透析纯化后，即得式(III)所示的胭脂红完全抗原(包被原)。

二、实验结果

通过分别扫描半抗原、偶联物及载体蛋白溶液在紫外区(200～400nm)的吸收光。免疫原结果如图3所示、包被原结果如图4所示，偶联物的紫外吸收特征峰相对于原载体蛋白，均具有一定程度红移或蓝移，证明人工抗原制备成功。

实施例2胭脂红单克隆抗体的制备

一、实验方法

取6～8周龄Bal b/c小鼠(广东省实验动物中心)，将制备的浓度为1mg/mL式(II)所示胭脂红完全抗原与弗氏完全佐剂等量混合，完全乳化后，注射小鼠腹部和背部，每只小鼠注射100μL。第一次免疫采用弗氏完全佐剂，后加强免疫采用弗氏不完全佐剂，每隔3周免疫一次，一共加强免疫4次。第二次加强免疫后一周从尾部静脉取血检效价和抑制。第四次加强免疫后，选取效价和抑制率都较高的小鼠进行细胞融合，融合前3天加倍剂量强化免疫一次。

免疫结果如表2所示。从表中结果可以看出，经式(II)所示免疫原免疫过的小鼠，其抗血清效价为2k～8k，抑制率在55.1％～80.5％。其中3号小鼠效价最高抑制最好，选择3号小鼠进行下一步实验。

表2小鼠抗血清表征

将小鼠骨髓瘤SP2/0细胞与脾细胞以5：1(细胞数量)的比例混合，在PEG下融合，洗涤、离心后以HAT培养基悬浮，置于96孔培养板中，在37℃含5％的CO₂培养箱中培养3天后以HAT培养基换液，第10天换成HT培养基。待板内细胞长至培养孔面积的1/3时，间接ELISA法筛选细胞阳性孔，筛选时以结构式为如式(III)所示的检测抗原作为包被抗原，具体操作如下：

S1用pH9.6碳酸缓冲溶液将包被原(式(III))稀释至1μg/mL，加到酶标板中，每孔加入100μL，37℃水浴箱中过夜；倾去孔内液体，洗板机洗板2次，每孔加洗涤液250μL，甩干孔中液体；每孔加入120μL封闭液，37℃封闭3h，甩干孔内液体，倒置于37℃烘箱中1h，备用；

S2在S1中的酶标板中，每孔加50μL用PBS(0.01M，pH7.4)稀释至1μg/mL的胭脂红药物(同时做空白、阴性及阳性孔对照)，加入50μL细胞上清液(若直接加细胞上清液测出来的吸光度＞1.5，此步骤可先用PBS(0.01M，pH7.4)稀释细胞上清液，具体稀释倍数根据所测得的吸光值进行调整)，37℃水浴箱中反应40min后，洗板机洗板5次，每孔加入洗涤液250μL，甩干孔中液体；

S3在S2中的酶标板中，每孔加入100μL稀释5000倍的HRP-羊抗鼠，37℃水浴箱中反应30min后，洗板同S2；

S4 TMB显色液和0.1％过氧化氢溶液(v/v)等体积混合，在S3中的酶标板中，每孔加入混合液100μL，置于37℃水浴箱中显色10min后，每孔加入50μL 10％H₂SO₄(v/v)终止液。

S5用酶联免疫检测仪测定S4中各孔A450nm的吸光值。

筛选出的细胞阳性孔进一步用间接ELISA法鉴定筛选，有限稀释法克隆至大约每孔<1个细胞，10天后检测为阳性且竞争较好的单克隆孔所得细胞株即为分泌单克隆抗体的细胞株。杂交瘤细胞扩大培养后，用于单克隆抗体制备。

实施例3用于检测胭脂红的酶联免疫试剂盒

一、胭脂红酶联免疫试剂盒的组成

胭脂红酶联免疫试剂盒中包含：酶标板、胭脂红特异性抗体(由实施例2中的3号小鼠所得)、检测抗原(如式(III)所示)、TMB显色液、HRP-羊抗鼠、10％H₂SO₄(v/v)终止液、封闭液(5％脱脂奶粉)、稀释液(PBS即0.01mol/L，pH7.4磷酸缓冲溶液)、洗涤液(含0.02％吐温-20的PBS)、底物缓冲液(0.1％过氧化氢溶液(v/v))。

二、胭脂红酶联免疫试剂盒的使用

酶联免疫试剂盒的使用方法为：

S1用pH9.6碳酸缓冲溶液将检测抗原(式(III))稀释至1μg/mL，加到酶标板中，每孔加入100μL，37℃水浴箱中过夜；倾去孔内液体，洗板机洗板2次，每孔加洗涤液250μL，甩干孔中液体；每孔加入120μL封闭液，37℃封闭3h，甩干孔内液体，倒置于37℃烘箱中1h，备用；

S2在S1中的酶标板中，每孔加50μL待测样品(同时做空白、阴性及阳性孔对照)，任何加入稀释至6.25ng/mL的所述胭脂红特异性抗体的稀释液50μL，37℃水浴箱中反应40min后，洗板机洗板5次，每孔加入洗涤液250μL，甩干孔中液体；

S4 TMB显色液和底物缓冲液等体积混合，在S3中的酶标板中，每孔加入混合液100μL，置于37℃水浴箱中显色10min后，每孔加入50μL 10％H₂SO₄(v/v)终止液。

S5用酶联免疫检测仪测定S4中各孔A450nm的吸光值。

实施例4胭脂红的酶联免疫试剂盒的标准曲线的建立

一、实验方法

将胭脂红稀释成系列梯度标准液，分别稀释为1000ng/mL、500ng/mL、250ng/mL、125ng/mL、62.5ng/mL、31.25ng/mL、15.625ng/mL、7.81ng/mL、3.91ng/mL、1.95ng/mL、0.98ng/mL、0.49ng/mL、0.24ng/mL、0.12ng/mL、0.06ng/mL；使用实施例3中的胭脂红试剂盒进行检测，用酶联免疫检测仪测定各孔A450nm的吸光值。

用Origin8.5的四参数拟合模块计算抑制曲线的IC10、IC20、IC50、IC80值。以胭脂红药物浓度为横坐标，B/B₀比值为纵坐标，在Origin软件中绘制散点图并进行logistic函数拟合，得到标准曲线。

二、实验结果

标准曲线见图5。所得标准曲线IC50值为10.1ng/mL，说明实施例3中的胭脂红检测试剂盒对胭脂红的检测灵敏度为10.1ng/mL，检测限IC10值为0.98ng/mL，线性检测范围为2～50ng/mL。

实施例5胭脂红检测试剂盒的特异性探究

一、实验方法

使用实施例4中的胭脂红检测试剂盒对胭脂红结构类似物苋菜红、洋酸红、柠檬黄、日落黄和靛蓝进行检测，具体的检测步骤为如实施例3中酶联免疫试剂盒的使用方法相同。

交叉反应率R的计算如下所示：

R(％)＝IC50(胭脂红)/IC50(胭脂红结构类似物)×100％。

二、实验结果

特异性检测如表3所示，胭脂红IC₅₀值为10.1ng/mL，以抗血清与胭脂红的交叉反应率为100％，抗血清与苋菜红、洋酸红、日落黄、柠檬黄、亮蓝等结构类似物不存在交叉反应，即本研究所制备的胭脂红单克隆抗体特异性良好。

表3胭脂红单克隆抗体特异性检验结果

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims

1.一种胭脂红人工抗原组合，其特征在于，包括式（II）所示和式（III）所示的胭脂红人工抗原，

（Ⅱ）；

（III）；

所述式（Ⅱ）的载体蛋白为牛乳铁蛋白；所述式（Ⅲ）的载体蛋白为牛血清白蛋白；其中，式（II）所示的胭脂红人工抗原作为免疫原，式（III）所示的胭脂红人工抗原作为包被原。

2.权利要求1所述胭脂红人工抗原组合在胭脂红的非疾病治疗诊断的免疫检测中的应用。

3.权利要求1所述胭脂红人工抗原组合在制备胭脂红检测试剂盒中的应用。

4.一种检测胭脂红的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述胭脂红人工抗原组合。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还含有酶标抗体、显色剂和终止剂。