CN114292818B - 一种可同时检测甲基异柳磷和水胺硫磷的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可同时检测甲基异柳磷和水胺硫磷的单克隆抗体及其应用，该单克隆抗体是由于2019年5月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC No：C 2019107的杂交瘤细胞株分泌，基于该单克隆抗体，建立了一种基于间接竞争酶联免疫法的检测甲基异柳磷和水胺硫磷的检测方法。本检测方法检测甲基异柳磷和水胺硫磷农药残留具有快速、特异性强、灵敏度高的特点，检测甲基异柳磷的IC50值为0.47ng/mL，检出限(IC10)为0.052ng/mL，线性范围为0.12～1.90ng/mL；检测水胺硫磷的IC50值为0.96ng/mL，检测限(IC10)为0.112ng/mL，线性范围为0.25～3.75ng/mL。

Description

一种可同时检测甲基异柳磷和水胺硫磷的单克隆抗体及其 应用

技术领域

本发明涉及农药的检测技术领域，具体地，涉及一种可同时检测甲基异柳磷和水胺硫磷的单克隆抗体及其应用。

背景技术

我国是农药生产和使用大国，农药的使用给农业创造了经济效益，同时农药残留造成环境污染和食品安全等诸多问题。甲基异柳磷和水胺硫磷均属于有机磷杀虫剂，是目前我国限制使用的高毒性农药之一。有机磷农药对人体的危害主要是抑制体内的胆碱酯酶活性，导致乙酰胆碱蓄积，从而产生神经毒性。

目前针对甲基异柳磷和水胺硫磷的检测，仪器分析法是主要的检测方法，例如：(1)傅群，曾远，李华勇，等，Qu ECh ERS-气质法测定蔬菜水果中甲基异柳磷含量[J].食品工业，2020,41(09)：318-320.(2)陈立娇，王锐，姚东校，气质联用仪测定水果中的甲基异柳磷农药残留[J].现代农业科技，2019，(09)：92-93.(3)郑成荣，孙银峰，范艳红，等，高效液相色谱-串联质谱法测定豇豆中杀虫剂水胺硫磷残留量[J].理化检验(化学分册)，2012,48(01)：106-107.等。虽然仪器分析法可以进行精确定量检测，但该方法存在仪器昂贵、前处理复杂、对操作人员专业要求高、无法满足现场快速检测需求等缺点。而免疫分析法则可以弥补这些不足。

中国专利公开了一种抗三种有机磷农药的单克隆抗体及其应用，该单克隆抗体可用于农产品和农业生产环境中水胺硫磷、甲基异柳磷和乙基异柳磷的检测，是检测的灵敏度不高。

免疫分析法是基于抗原与抗体特异性、可逆性结合反应的分析技术。免疫反应涉及抗原与抗体分子间高度互补的立体结构、静电、氢键和范德华力等的综合作用，具有任何一种单独理化分析技术难以达到的选择性和灵敏度，因此具有灵敏度与常规的仪器分析一致、适合现场筛选、简单、快速、成本低、样品所需量少等优点，被认为是21世纪最具竞争性和挑战性的快速检测技术。世界粮农组织(FAO)已向许多国家推荐此项技术。美国化学学会(ACS)将免疫分析技术、色谱分析技术共同列为农药、兽药和渔药残留分析的主要技术。

目前尚无一种高灵敏度的同时检测甲基异柳磷和水胺硫磷的酶联免疫检测法。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种可同时检测甲基异柳磷和水胺硫磷的单克隆抗体及其应用。

本发明的第一个目的是提供一种分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

本发明的第二个目的是提供一种单克隆抗体。

本发明的第三个目的是提供所述的杂交瘤细胞株在建立甲基异柳磷和/或水胺硫磷的检测方法和/或制备甲基异柳磷和/或水胺硫磷的检测试剂盒中的应用。

本发明的第四个目的是提供所述的单克隆抗体在建立甲基异柳磷和/或水胺硫磷的检测方法和/或制备甲基异柳磷和/或水胺硫磷的检测试剂盒中的应用。

本发明的第五个目的是提供一种甲基异柳磷和/或水胺硫磷的检测方法。

本发明的第六个目的是提供一种检测甲基异柳磷和/或水胺硫磷的免疫学试剂盒。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

一种分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株于2019年5月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC No：C2019107，其分泌的单克隆抗体可同时检测甲基异柳磷和水胺硫磷。

一种单克隆抗体，所述单克隆抗体由所述的杂交瘤细胞株分泌，其可同时检测甲基异柳磷和水胺硫磷。

因此本发明进一步要求保护：

所述的杂交瘤细胞株在建立甲基异柳磷和/或水胺硫磷的检测方法和/或制备甲基异柳磷和/或水胺硫磷的检测试剂盒中的应用；

所述的单克隆抗体在建立甲基异柳磷和/或水胺硫磷的检测方法和/或制备甲基异柳磷和/或水胺硫磷的检测试剂盒中的应用。

本发明还要求保护一种甲基异柳磷和/或水胺硫磷的检测方法，使用所述的单克隆抗体作为检测抗体。

优选地，所述检测方法为间接竞争检测法检测抗原，以结构式如(V)所示化合物作为包被原，

更优选地，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、钥孔血蓝蛋白、乳铁蛋白或鸡卵清白蛋白任意一种或几种。

更优选地，所述检测方法为间接竞争检测法检测抗原，以结构式如(V-1)所示化合物作为包被原，

即结构式(V)所示化合物作为包被原，其载体蛋白为牛血清白蛋白。

本发明还要求保护一种检测甲基异柳磷和/或水胺硫磷的免疫学试剂盒，含有所述的单克隆抗体。

优选地，还含有结构式如(V)所示化合物作为包被原，

更优选地，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、钥孔血蓝蛋白、乳铁蛋白或鸡卵清白蛋白任意一种或几种。

更优选地，还含有结构式如(V-1)所示化合物作为包被原，

即结构式(V)所示化合物作为包被原，其载体蛋白为牛血清白蛋白。

更优选地，还含有pH9.6碳酸缓冲液、封闭液、洗涤液、甲基异柳磷标准液、水胺硫磷标准液、HRP-羊抗鼠、3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物显色液中的一种或几种。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明基于一种抗甲基异柳磷和水胺硫磷的单克隆抗体，建立了一种基于间接竞争酶联免疫法的检测甲基异柳磷和水胺硫磷的检测方法。本检测方法检测甲基异柳磷和水胺硫磷农药残留具有快速、特异性强、灵敏度高的特点，检测甲基异柳磷的IC50值为0.47ng/mL，检出限(IC10)为0.052ng/mL，线性范围为0.12～1.90ng/mL；检测水胺硫磷的IC50值为0.96ng/mL，检测限(IC10)为0.112ng/mL，线性范围为0.25～3.75ng/mL。

附图说明

图1为半抗原的合成流程图。

图2为半抗原(I)的质谱鉴定图。

图3为半抗原(II)的质谱鉴定图。

图4为人工抗原IV-1紫外扫描鉴定图。

图5为人工抗原V-1紫外扫描鉴定图。

图6为甲基异柳磷和水胺硫磷ic-ELISA检测标准曲线图。

具体实施方式

下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1甲基异柳磷和水胺硫磷半抗原合成

一、实验方法

合成甲基异柳磷和水胺硫磷半抗原，具体的合成流程见图1。

1、式(I)所示半抗原合成

取3.6g水杨酸异丙酯、3g O-甲基硫代磷酰二氯、0.5g TBAB溶解于10mL二氯甲烷(DCM)中搅拌，0.5g NaOH溶解于10mL三级水，加入上述DCM溶液中，剧烈搅拌，使有机-水相分层界面消失，搅拌过夜。转移到分液漏斗，待分层后取下层有机相，旋转蒸发，得到式(III)所示中间产物。经400目硅胶层析，流动相为石油醚，分离纯化后得到纯化的中间产物。取0.5g纯化后的式(III)所示中间产物和5g3-氨基丁酸加入到圆底烧瓶，加入10mL1,4-二氧六环和20mL水，低温搅拌。低温下加入5mLNaOH溶液(0.1mg/mL)，搅拌过夜。然后用HCl溶液调节pH至4-5，用乙酸乙酯萃取水相，旋蒸后得到式(I)所示化合物。

2、式(II)所示半抗原合成

取0.5g纯化后的式(III)所示中间产物和5g 6-氨基己酸加入到圆底烧瓶，加入10mL1,4-二氧六环和20mL水，低温搅拌。低温下加入5mLNaOH溶液(0.1mg/mL)，搅拌过夜。然后用HCl溶液调节pH至4～5，用乙酸乙酯萃取水相，旋蒸后得到式(II)所示化合物。

二、实验结果

式(I)和(II)所示半抗原的ESI-MS鉴定结果分别如图2和图3所示，式(I)和(II)所示化合物的分子量分别为375.38和403.43，EMI-MS鉴定结果与化合物的分子量相符。

实施例2人工抗原合成与鉴定

一、实验方法

1、式(IV)所示人工抗原合成

将9.4mg式(I)所示半抗原溶于600μL N，N-二甲基甲酰胺中，接着搅拌下加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，室温下避光搅拌4h，获得活化后的半抗原，称为A液。其中，式(I)所示半抗原、所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和所述N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1：1.5：1.5。将20mg牛乳铁蛋白(LF)溶解在pH9.6碳酸缓冲液中，其牛乳铁蛋白浓度为10mg/mL，称为B液。在冰浴搅拌下将上述A液体滴加到B液中，A液中的结构式如式(I)所示半抗原与所述B液中的所述载体蛋白的摩尔比为100：1。滴加后，用NaOH溶液将pH调节至9.5～9.6。避光反应过夜，并经过透析纯化后获得如式(IV)所示人工抗原：

其中，载体蛋白为乳铁蛋白，即人工抗原如式(IV-1)所示：

2、式(V)所示人工抗原合成

将3.67mg式(I)所示半抗原溶于600μL N，N-二甲基甲酰胺中，接着搅拌下加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，室温下避光搅拌4h，获得活化后的半抗原，称为A液。其中，式(I)所示半抗原、所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和所述N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1：1.5：1.5。将20mg牛血清白蛋白(BSA)溶解在pH9.6碳酸缓冲液中，其牛血清蛋白浓度为10mg/mL，称为B液。在冰浴搅拌下将上述A液体滴加到B液中，A液中的结构式如式(I)所示半抗原与所述B液中的所述载体蛋白的摩尔比为30：1。滴加后，用NaOH溶液将pH调节至9.5～9.6。避光反应过夜，并经过透析纯化后获得如式(V)所示完全抗原：

其中，载体蛋白为牛血清蛋白，即人工抗原如(V-1)所示：

二、实验结果

分别扫描半抗原、偶联物及载体蛋白溶液在紫外区(200～400nm)的吸收光。

式(I)所示半抗原、式(IV-1)所示人工抗原、和乳铁蛋白的扫描结果如图4所示，偶联物式(IV-1)所示人工抗原的紫外吸收特征峰相对于乳铁蛋白，具有一定程度红移，证明式(IV-1)所示人工抗原制备成功。

式(I)所示半抗原、式(V-1)所示人工抗原、和牛血清蛋白的扫描结果如图5所示，偶联物式(V-1)所示人工抗原的紫外吸收特征峰相对于牛血清蛋白，具有一定程度红移，证明式(V-1)所示人工抗原制备成功。

实施例3可同时检测甲基异柳磷和水胺硫磷的单克隆抗体制备

一、实验方法

取6～8周龄Balb/c小鼠(珠海百试通生物科技有限公司)，将实施例2制备的浓度为1mg/mL式(IV-1)所示人工抗原免疫抗原与弗氏完全佐剂等量混合，完全乳化后，注射小鼠腹部和背部，每只小鼠注射100μL。第一次免疫采用弗氏完全佐剂，后加强免疫采用弗氏不完全佐剂，每隔2周免疫一次，一共加强免疫3次。第二次加强免疫后一周从尾部静脉取血检效价和抑制。第三次加强免疫后，选取效价和抑制率都较高的小鼠进行细胞融合，融合前3天加倍剂量强化免疫一次。

将小鼠骨髓瘤SP2/0细胞与脾细胞以5：1的比例混合，在浓度为50％(w/v)的PEG溶液下融合，洗涤、离心后以HAT培养基悬浮，接种于含饲养细胞的96孔培养板中，在37℃5％的CO₂培养箱中培养3天后以HAT培养基换液，第10天换成HT培养基。待板内细胞长至培养孔面积的1/3时，间接ELISA法筛选细胞阳性孔。

筛选时以实施例2制备得到的结构式为如式(V-1)所示的人工抗原作为包被抗原，包被原浓度：1000ng/mL，每孔包被100μL。甲基异柳磷药物浓度：10ng/mL；水胺硫磷药物浓度：50ng/mL；阳性孔进一步用间接ELISA鉴定筛选，有限稀释法克隆至大约每孔0.5～1个细胞，7天后检测为阳性且竞争较好的单克隆孔所得细胞株即为分泌单克隆抗体的细胞株。杂交瘤细胞扩大培养后，用于单克隆抗体制备。

其中，筛选的步骤为：

S1.包被：用pH9.6碳酸缓冲液将包被原(实施例2制备的式(V-1)所示人工抗原)稀释至1μg/mL，加入酶标板孔中，100μL/孔，37℃水浴箱中过夜。

S2.洗涤：倾去孔内液体，洗板机洗板2次，每孔加洗涤液300μL，甩干孔中液体。

S3.封闭：每孔加入120μL封闭液(2％(w/v)的酪蛋白溶液)，37℃封闭3h，甩干孔内液体，倒置于37℃烘箱中1h备用。

S4.加样及孵育：效价孔加入50μL PBS缓冲液，抑制孔分别加入50μL甲基异柳磷和水胺硫磷药物，然后效价孔和抑制孔均加入50μL细胞上清液，后续37℃水浴箱中孵育40min后，洗板机洗板5次，每孔加入洗涤液300μL，甩干孔中液体。

S5.加二抗：以磷酸吐温缓冲液(PBST，0.01M)作为HRP-羊抗鼠二抗的稀释液，每孔加入100μL稀释5000倍的HRP-羊抗鼠，37℃水浴箱中反应30min后，洗板同S4。

S6.显色：H₂O₂显色A液与TMB底物显色B液等体积混合，每孔加入混合液100μL，置于37℃水浴箱中显色10min后，每孔加入50μL 10％H₂SO₄终止液。

S7.测定：用酶联免疫检测仪测定各孔A_450nm的吸光值。

S8.计算抑制率：抑制率＝(效价的OD值-抑制的OD值)/效价的OD值×100％)。

二、实验结果

小鼠免疫结果如表1所示，以结构式为如式(IV-1)所示的人工抗原为免疫原，结构式为如式(IV-1)所示的人工抗原为包被原，一号小鼠免疫效果最好，因此选择一号小鼠进行细胞融合，得到杂交瘤细胞株，制备单克隆抗体。该得到杂交瘤细胞株命名为杂交瘤细胞株CZJ-S，于2019年5月28日保藏于位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2019107。

表1小鼠抗血清表征：

实施例4基于间接竞争ELISA同时检测甲基异柳磷和水胺硫磷的检测方法建立

取实施例3制备得到的杂交瘤细胞株CZJ-S分泌的单克隆抗体建立标准曲线，包被原的工作浓度为1000ng/mL，采用三组平行试验(n＝3)。

间接竞争ELISA检测步骤如下：

S1.包被：用pH9.6碳酸缓冲液将包被原(实施例2制备的式(V-1)所示人工抗原)稀释至1μg/mL，加入酶标板孔中，100μL/孔，37℃水浴箱中过夜。

S2.洗涤：倾去孔内液体，洗板机洗板2次，每孔加洗涤液300μL，甩干孔中液体。

S3.封闭：每孔加入120μL封闭液(2％(w/v)的酪蛋白溶液)，37℃封闭3h，甩干孔内液体，倒置于37℃烘箱中1h备用。

S4.加样及孵育：以磷酸缓冲液(PBS，0.01M，pH＝7.4)作为抗体和药物标准品的稀释液，将甲基异柳磷、水胺硫磷分别稀释成系列梯度标准液，从药物浓度为270ng/mL开始三倍梯度稀释，共稀释11个点(270、90、30、10、3.333、1.111、0.3704、0.1234、0.0412、0.0137、0.0046ng/mL)，第十二个点为对照点(药物浓度为0ng/mL)，将梯度稀释好的两种药物标准液分别每孔加50μL，然后加入30ng/mL单克隆抗体(实施例3中杂交瘤细胞株CZJ-S分泌的)的稀释液50μL，37℃水浴箱中反应40min后，洗板机洗板5次，每孔加入洗涤液300μL，甩干孔中液体。

S5.加二抗：以磷酸吐温缓冲液(PBST，0.01M)作为HRP-羊抗鼠二抗的稀释液，每孔加入100μL稀释5000倍的HRP-羊抗鼠，37℃水浴箱中反应30min后，洗板同S4。

S6.显色：H₂O₂显色A液与TMB底物显色B液等体积混合，每孔加入混合液100μL，置于37℃水浴箱中显色10min后，每孔加入50μL 10％H₂SO₄终止液。

S7.测定：用酶联免疫检测仪测定各孔A_450nm的吸光值。

S8.计算：用Origin2018的四参数拟合模块计算抑制曲线的IC₂₀、IC₅₀、IC₈₀值。

抑制率＝(效价的OD值-抑制的OD值)/效价的OD值*100％)。

二、实验结果

标准曲线见图6。所得甲基异柳磷标准曲线IC50为0.47ng/mL，检测限(IC10)为0.052ng/mL，线性范围为0.12～1.90ng/mL；所得水胺硫磷标准曲线IC50为0.96ng/mL，检测限(IC10)为0.112ng/mL，线性范围为0.25～3.75ng/mL。

实施例5一种基于间接竞争ELISA同时检测甲基异柳磷和水胺硫磷的检测试剂盒

一、组成

由于2019年5月28日保藏于位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2019107的杂交瘤细胞株CZJ-S分泌的单克隆抗体；

式(V-1)所示人工抗原作为包被抗原，

pH9.6碳酸缓冲液、0.01MPBS缓冲液、0.01MPBST缓冲液、封闭液、洗涤液、甲基异柳磷标准液、水胺硫磷标准液、HRP-羊抗鼠、H₂O₂显色A液和TMB底物显色B液。

二、使用方法

1、96孔酶标板包被抗原，得到包被有式(V-1)所示人工抗原的96孔聚苯乙烯酶标板：

(1)包被：用pH9.6碳酸缓冲液将包被原(式(V-1)所示人工抗原)稀释至1μg/mL，加入96孔聚苯乙烯酶标板孔中，100μL/孔，37℃水浴箱中过夜。

(2)洗涤：倾去孔内液体，洗板机洗板2次，每孔加洗涤液300μL，甩干孔中液体。

(3)封闭：每孔加入120μL封闭液(2％的酪蛋白溶液)，37℃封闭3h，甩干孔内液体，倒置于37℃烘箱中1h备用。

2、提取样品中的甲基异柳磷或水胺硫磷，得到样品待测液

样品提取药物方法参照GB23200.113规定方法中的样品前处理方法进行。

3、酶联免疫检测

(1)将样品待测液、甲基异柳磷标准品、水胺硫磷标准品分别加入已包被好包被原的96孔透明聚苯乙烯酶标板中。

(2)加入实施例3制备得到杂交瘤细胞株CZJ-S分泌的单克隆抗体，37℃水浴箱孵育40min，洗涤液洗板5次。

(3)加入5000倍稀释好的HRP-羊抗鼠溶液100μL，37℃水浴箱孵育30min，洗涤液洗板5次。

(4)加入100μL显色混合液(H₂O₂显色A液与3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物显色B液等体积混合)，再次37℃水浴箱孵育10min。

(5)加入10％浓硫酸终止反应。

(6)通过比色的方法，定性分析样品中甲基异柳磷和水胺硫磷的含量；或者利用酶标仪测试吸光值，通过实施例4基于间接竞争ELISA方法建立标准曲线，定量分析样品中两种药物的含量。

三、结果判读

通过对比标准品孔和样品孔的颜色深浅，进行定性分析药物含量，样品孔颜色相比标准品孔颜色更浅，则样品中药物浓度比标准品药物浓度高，颜色越浅则药物含量越高，反之，样品孔颜色相比标准品孔颜色更深，则样品中药物浓度比标准品药物浓度低。

通过实施例4基于间接竞争ELISA方法建立标准曲线，定量分析样品中药物含量。

实施例6一种基于间接竞争ELISA评价同时检测甲基异柳磷和水胺硫磷的抗体的特异性

一、实验方法

使用实施例4制备得到的杂交瘤细胞株CZJ-S分泌的单克隆抗体，基于间接竞争ELISA方法检测其他有机磷农药，交叉反应率CR(％)如下所示：

间接竞争ELISA检测步骤如下：

S1.包被：用pH9.6碳酸缓冲液将包被原(实施例2制备的式(V-1)所示人工抗原)稀释至1μg/mL，加入酶标板孔中，100μL/孔，37℃水浴箱中过夜。

S2.洗涤：倾去孔内液体，洗板机洗板2次，每孔加洗涤液300μL，甩干孔中液体。

S3.封闭：每孔加入120μL封闭液(2％(w/v)的酪蛋白溶液)，37℃封闭3h，甩干孔内液体，倒置于37℃烘箱中1h备用。

S4.加样及孵育：以磷酸缓冲液(PBS，0.01M，pH＝7.4)作为抗体和药物标准品的稀释液，将其他结构类似的有机磷农药分别稀释成系列梯度标准液，从药物浓度为1000ng/mL开始十倍梯度稀释，共稀释7个点(1000、100、10、1、0.1、0.01、0.01ng/mL)，第8个点为对照点(药物浓度为0ng/mL)，将梯度稀释药物标准液分别每孔加50μL，然后加入30ng/mL单克隆抗体(实施例3中杂交瘤细胞株CZJ-S分泌的)的稀释液50μL，37℃水浴箱中反应40min后，洗板机洗板5次，每孔加入洗涤液300μL，甩干孔中液体。

S5.加二抗：以磷酸吐温缓冲液(PBST，0.01M)作为HRP-羊抗鼠二抗的稀释液，每孔加入100μL稀释5000倍的HRP-羊抗鼠，37℃水浴箱中反应30min后，洗板同S4。

S6.显色：H₂O₂显色A液与TMB底物显色B液等体积混合，每孔加入混合液100μL，置于37℃水浴箱中显色10min后，每孔加入50μL 10％H₂SO₄终止液。

S7.测定：用酶联免疫检测仪测定各孔A_450nm的吸光值。

S8.计算：用Origin2018的四参数拟合模块计算抑制曲线的IC₂₀、IC₅₀、IC₈₀值。

CR(％)＝IC₅₀(甲基异柳磷)/IC₅₀(水胺硫磷或者其他结构类似物)×100％。

二、检测结果

实施例3制备得到的单克隆抗体的特异性检测如表2所示。说明该抗体对甲基异柳磷和水胺硫磷具有高灵敏度和高特异性识别的能力，对其他结构类似物的交叉反应率不高于0.3％。

表2：

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株于2019年5月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC No：C 2019107。

2.一种单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌。

3.权利要求1所述的杂交瘤细胞株在建立甲基异柳磷和/或水胺硫磷的检测方法和/或制备甲基异柳磷和/或水胺硫磷的检测试剂盒中的应用。

4.权利要求2所述的单克隆抗体在建立甲基异柳磷和/或水胺硫磷的检测方法和/或制备甲基异柳磷和/或水胺硫磷的检测试剂盒中的应用。

5.一种甲基异柳磷和/或水胺硫磷的检测方法，其特征在于，使用权利要求2所述的单克隆抗体作为检测抗体。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法为间接竞争检测法检测抗原，以结构式如(V)所示化合物作为包被原，

7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法为间接竞争检测法检测抗原，以结构式如(V-1)所示化合物作为包被原，

8.一种检测甲基异柳磷和/或水胺硫磷的免疫学试剂盒，其特征在于，含有权利要求2所述的单克隆抗体。

9.根据权利要求8所述的免疫学试剂盒，其特征在于，还含有结构式如(V)所示化合物作为包被原，

10.根据权利要求8所述的免疫学试剂盒，其特征在于，还含有结构式如(V-1)所示化合物作为包被原，

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