CN113185530B - 一种杂交瘤细胞株及其分泌的2型短裸甲藻毒素单克隆抗体和应用 - Google Patents

一种杂交瘤细胞株及其分泌的2型短裸甲藻毒素单克隆抗体和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及免疫学领域，尤其涉及一种杂交瘤细胞株及其分泌的2型短裸甲藻毒素单克隆抗体和应用。所述杂交瘤细胞株命名为BTX‑2‑18G6，由式I所示半抗原制备得到。本发明使用2型短裸甲藻毒素制备半抗原，进一步合成免疫原并免疫小鼠，经过细胞融合、筛选等技术制备得到一种能分泌识别短裸甲藻毒素的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株分泌单克隆抗体效率较高。分泌得到的单克隆抗体可以准确检测短裸甲藻毒素，并且特异性较高，和黄曲霉B1、喹诺酮和氯霉素之间无交叉反应。

Description

一种杂交瘤细胞株及其分泌的2型短裸甲藻毒素单克隆抗体 和应用
技术领域
本发明涉及免疫学领域，尤其涉及一种杂交瘤细胞株及其分泌的2型短裸甲藻毒素单克隆抗体和应用。
背景技术
赤潮是海水中某些微小的微型藻、原生动物或细菌在一定的环境条件下暴发性增殖或聚集在一起而引起水体变色的一种生态异常现象。近年来，世界各地频繁发生的赤潮，其中有一些是有毒赤潮，这些赤潮生物分泌的黏液，含有毒素，粘在鱼、虾、海洋贝类生物上。少量的毒素就会使鱼中毒死亡，而贝类生物对这些毒素的忍受力度较高，并使这些毒素在贝类生物体内聚集，它们也无生态危害，可是当人们食用这些含有毒素的贝类后，毒素迅速被释放，造成人类中毒，甚至死亡。
贝类毒素属于天然毒素，不同于人工合成的毒素。目前，一些国家己经制定了贝类毒素的检测标准，以最高允许限量(MPL)表示。美国、加拿大、日本及欧盟对冷藏鲜贝肉的MPL为0.8ng/g，对罐头原料用贝肉中毒素限量，美国MPL为2ng/g，加拿大MPL为1.6ng/g。常见的贝类毒素分为麻痹性贝毒、腹泻性贝毒、神经性贝毒、失忆性贝毒。其中，神经性贝毒可引起晕眩，瞳孔放大，发冷发热，恶心，呕吐及腹泻，严重时会心律失常、窒息。除了摄食贝类之外，这种毒素也可通过海洋中的气溶胶造成呼吸道中毒，致气喘，干咳，流鼻涕及眼角膜炎，这种毒素的中毒症状在美国及美洲沿海出现过。神经性贝毒活性成分包括短裸甲藻毒素A(Brevetoxin A)，短裸甲藻毒素B(Brevetoxin，BTX)和半短裸甲藻毒素B(Hemibrevetoxins B)等，主要由短裸甲藻产生。其中，BTX-2是毒性最强的神经毒素，人类误食含有BTX-2的贝类食物，会引起中毒甚至死亡。
目前已建立的BTX-2主要分析方法有生物活体毒性测定，该方法用小鼠(mouse，腹腔注射方式)和大鼠(rat，口服方式)作为实验动物，虽然应用比较广泛，但由于该方法自身缺陷及动物福利的原因，逐渐被替代；仪器分析方法，如色谱分析法，包括薄层色谱、液相色谱和液相色谱质谱联用法，该方法对人员和仪器设备的要求较高，并且需要昂贵的标准品，不利于快速检测，而以酶联免疫为主的免疫法，具有快速、操作简单、成本低高通量等特点，逐渐呈现出强大的生命力。
在免疫分析方法中，识别原件十分重要，目前文献报道的BTX-2的分子识别原件主要有核酸适配体和抗体。Shimaa Eissa et al等2015年采用SELEX法筛选出7条核酸适配体序列，其中，BT10对BTX-2的亲和力最强，并且利用该核酸适配体建立了电化学阻抗法，该方法具有较高的灵敏度，它的检测限是0.106ng/mL。Rui Yun Tian等2016年也采用SELEX技术报道了BTX-2的核酸适配体，并且建立了ELISA分析方法，该方法的IC50是73.81ng/mL。虽然，核酸适配体的使用也可以建立灵敏度高的免疫学分析方法，可是由于核酸适配体的灵敏度不够，结构不稳定，基于核酸适配体的免疫分析仍然不成熟。抗体仍是免疫学分析方法的制约性因素，因此制备BTX-2抗体十分重要。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种杂交瘤细胞株及其分泌的2型短裸甲藻毒素单克隆抗体和应用。所述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体可以准确地对短裸甲藻毒素进行检测。
第一方面，本发明提供一种半抗原，所述半抗原包括如式I所示结构：
Figure BDA0003090712320000031
本发明进一步提供由所述半抗原和载体蛋白BSA反应得到的抗原。
第二方面，本发明提供一种杂交瘤细胞株BTX-2-18G6，通过所述半抗原或所述抗原制备得到。
本发明进一步提供由所述杂交瘤细胞株BTX-2-18G6分泌的单克隆抗体。
本发明进一步提供包含所述单克隆抗体的试剂盒。
本发明进一步提供包含所述单克隆抗体的免疫层析试纸条。
第二方面，本发明提供一种生产2型短裸甲藻毒素单克隆抗体的方法，包括：将所述杂交瘤细胞株BTX-2-18G6接种于小鼠腹腔中。
进一步地，在接种所述杂交瘤细胞株之前，还包括：
向小鼠腹腔注射0.5～1mL弗氏不完全佐剂进行预处理。
本发明进一步提供所述单克隆抗体、或所述试剂盒、或所述免疫层析试纸条在检测短裸甲藻毒素中的应用。
进一步地，所述短裸甲藻毒素包括BTX-1、BTX-2或BTX-3中的一种或多种。
进一步地，所述检测为通过间接竞争ELISA或免疫层析方法中的一种或多种方法进行检测。
本发明具备如下有益效果：
本发明使用2型短裸甲藻毒素制备半抗原，进一步合成免疫原并免疫小鼠，经过细胞融合、筛选等技术制备得到一种能分泌识别短裸甲藻毒素的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，得到单克隆抗体BTX-2-18G6能够识别BTX-1,BTX-2,BTX-3,IC50值分别为：52.6ng/mL,60.7ng/mL和51.8ng/mL，交叉反应率为115.4％、100％、117.2％。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的BTX-CMO-KLH/BSA合成路线图。
图2为本发明实施例1提供的BTX-2-HS-KLH/BSA合成路线图。
图3为本发明实施例2提供的BTX-2、血蓝蛋白、BTX-CMO-KLH/BSA和BTX-HS-KLH/BSA的免疫原紫外扫描图谱。
图4为本发明实施例2提供的BTX-2、血蓝蛋白、BTX-CMO-KLH/BSA和BTX-HS-KLH/BSA的包被原紫外扫描图谱。
图5为本发明实施例4提供的BTX间接竞争ELISA标准曲线。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1半抗原的制备
取2mg BTX-2标准品，加入5mL吡啶，使之溶解，升温至90℃；
称取1mg CMO，用3mL吡啶使之溶解，随后滴入前述的BTX-2标准品溶液中，磁力搅拌反应6小时；
将反应液抽真空旋转蒸发抽干，除去吡啶溶液，加入10mL 0.1MNaHCO3，使残渣溶解；用5mL乙酸乙酯萃取，弃掉有机相乙酸乙酯层，水相使用1M的盐酸调pH至3左右，5mL乙酸乙酯萃取3次，合并有机相乙酸乙酯，乙酸乙酯采用氮气吹干，即获得半抗原BTX-2-CMO，化学反应方程式见图1。
取2mg BTX-2标准品，加入5mL吡啶，使之溶解，升温至90℃；
称取1mg丁二酸酐，用3mL吡啶使之溶解，随后滴入上面的溶液，磁力搅拌反应6小时；
处理步骤如上述所述，即获得半抗原BTX-HS，化学反应方程式见图2。
实施例2抗原的制备
将半抗原BTX-2-CMO溶于0.5mL DMF中，之后加入EDC 2mg，NHS 1.2mg，室温搅拌反应4h。称取KLH 5mg(BSA 10mg)溶于5mL 0.1M PBS(pH 7.4)的溶液中，之后将上述活化的BTX-2-CMO滴入到载体蛋白溶液中，室温搅拌反应6小时。之后PBS透析3天，获得抗原BTX-2-CMO-KLH/BSA，分装保存在-20℃.
将半抗原BTX-2-HS与载体蛋白BSA采用活泼酯法进行合成，如上述所述，PBS透析3天，获得包被原BTX-2-HS-KLH/BSA，分装保存在-20℃.
免疫原BTX-2-CMO-KLH和BTX-2-HS-KLH经过紫外扫描鉴定，见图3，BTX-2-CMO-KLH和BTX-2-HS-KLH的最大吸收波长较载体蛋白KLH均匀一定的偏移，说明抗原制备成功。
包被原BTX-2-CMO-BSA和BTX-2-HS-BSA经过紫外扫描鉴定，见图4，BTX-2-CMO-BSA和BTX-2-HS-BSA的最大吸收波长较载体蛋白BSA均匀一定的偏移，说明包被原制备成功。
实施例3单克隆抗体的制备
3.1小鼠免疫
以实施例2中制备的免疫原BTX-2-CMO-KLH和BTX-2-HS-KLH免疫6周龄的Balb/C雌性小鼠6只。免疫程序采用一次基础免疫及两次次加强免疫，免疫间隔时间为21天。第三次免疫8天后，采尾血，分离血清，间接ELISA法检测血清抗体效价，间接竞争ELISA检测血清的特异性。包被原为BTX-2-HS-BSA，稀释倍数为500倍，进行包被，小鼠血清稀释500倍进行测定。结果见表1和表2.说明BTX-2-CMO-KLH免疫小鼠获得了较好的免疫，根据标准品抑制情况，选取6号小鼠进行融合。而BTX-2-HS-KLH免疫小鼠具有一定的效价，可是标准品抑制情况较差。
表1.BTX-2-CMO-KLH小鼠免疫结果
Figure BDA0003090712320000051
Figure BDA0003090712320000061
表2.BTX-2-HS-KLH小鼠免疫结果
Figure BDA0003090712320000062
3.2细胞融合与筛选
在融合前3天，给小鼠腹腔注射含300μg免疫原BTX-2-CMO-KLH，冲击免疫。取未免疫的Balb/C鼠，制备饲养细胞，取冲击免疫的小鼠脾脏制备脾细胞悬液，采用PEG1450与骨髓瘤细胞进行融合。将融合细胞悬液以每孔0.25mL，接种于20块96孔细胞培养板中，置于37℃5％CO2培养箱中培养7天。利用间接竞争ELISA方法筛选出分泌抗BTX-2的阳性细胞孔，用有限稀释法连续3次克隆化，最终建立一株能稳定分泌抗BTX-2的杂交瘤细胞株18G6。
3.3腹水单抗制备与鉴定
在接种7天前，每只小鼠腹腔注射0.5mL弗氏不完全佐剂进行预处理。并将BTX-2-18G6细胞数调至每只小鼠腹腔接种106个杂交瘤细胞，进行接种。待小鼠腹部明显膨大，采集腹水，即为抗BTX-2的单克隆抗体。
实施例4单克隆抗体的性能测试
4.1试剂配制
碳酸盐缓冲液(pH 9.6)：准确称取Na2CO3 1.59g、NaHCO3 2.93g，少量超纯水溶解，定容至1000mL。
洗涤液(pH 7.4)：准确称取NaCl 8.00g，KH2PO4 0.20g，Na2HPO4·12H2O 2.90g，KCl0.20g，少量超纯水溶解，加0.50mL Tween 20，定容至1000mL。
磷酸盐缓冲液(pH 7.4)：准确称取NaCl 8.00g，KH2PO4 0.20g，Na2HPO4·12H2O2.90g，KCl 0.20g，少量超纯水溶解，定容至1000mL。
封闭液：准确称取蔗糖50g，酪蛋白2.5g，Na2HPO4·12H2O 5.8g，NaH2PO4·2H2O0.6g，去离子水950mL，小牛血清50mL，搅拌混匀直至蛋白完全溶解。
底物：购自北京维德维康生物技术有限公司，底物A和B等体积混匀，现配现用。
终止液：准确量取浓硫酸100mL，缓慢滴加到800mL超纯水中。
4.2间接ELISA和间接竞争ELISA步骤
包被：用碳酸盐缓冲液将BTX-2-HS-BSA稀释500倍，100μL/孔，4℃过夜；
洗涤与封闭：倾去孔内液体，用洗涤液洗涤3次，每孔加入150μL封闭液，37℃恒温封闭1h，然后洗涤3次；
加样：将50μL 0.01M PBS与50μL抗体(10000倍稀释)依次加到酶标板上，37℃反应0.5小时，洗涤3次；加入100μL HRP-羊抗兔IgG(5000倍稀释)，37℃反应0.5小时，洗涤3次；
显色测定：每孔加入底物溶液100μL，37℃显色15min，然后每孔加入50μL 2M H2SO4以终止反应，最后用酶标仪测定各孔的OD450nm值。
间接竞争ELISA步骤与间接ELISA步骤基本类同，将加样中的PBS更换成系列的标准品浓度即可。
4.3标准曲线的建立
将BTX-2标准品配制成0、6.2、12.5、25、50、100、200μg/L等7个浓度梯度，每个浓度5个平行孔，做间接竞争ELISA，绘制标准曲线，见图5。进行回归拟合，其中IC50是60.7μg/L，线性范围为6.2～200μg/L。
3.6交叉反应实验
分别将BTX-1、BTX-2、BTX-3、黄曲霉B1、喹诺酮和氯霉素倍比稀释成梯度浓度，按所建立的间接竞争ELISA方法，测定其IC50值，与BTX-2标准品IC50值对比得到交叉反应率，结果见表3，本研究建立的间接竞争ELISA方法对黄曲霉B1，喹诺酮，氯霉素药物均无交叉反应，与BTX-1和BTX-3的交叉反应率为115.4％和117.2％。
表3.单克隆抗体对喹噁啉类药物或代谢物的交叉反应率
Figure BDA0003090712320000081
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (3)

1.一种半抗原，其特征在于，所述半抗原包括如式I所示结构：
Figure FDA0003570532280000011
2.一种抗原，其特征在于，由权利要求1所述半抗原和载体蛋白BSA反应得到。
3.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述半抗原或权利要求2所述抗原。
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