CN101413947A - 一种检测三聚氰胺的酶联免疫测试盒及其制备及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测三聚氰胺的酶联免疫测试盒，其检测快速准确、操作简便，且无需贵重仪器设备，检测成本低，为此，本发明还提供了测试盒的制备及使用该测试盒的检测三聚氰胺的专用检测方法。其包括洗涤液，显色液A，显色液B和终止液，其特征是其还包括由96或48或24孔包被板、三聚氰胺标准品、三聚氰胺的抗体冻干品、酶标记的羊抗鼠抗体冻干品。检测时取包被有三聚氰胺－卵清蛋白的微孔包被板，加入三聚氰胺标准品或处理好的样品到各自的微孔中，加抗三聚氰胺抗体，35℃～45℃左右孵育约0.5小时～1小时，洗涤液洗2次～3次，加辣根过氧化物酶－羊抗鼠抗体，35℃～45℃左右孵育约0.5小时～1小时，用洗涤液洗4次～5次，加50μl显色液A和50μl显色液B，暗处静置15分钟～20分钟后加终止液，在450nm处测其吸光度值，从标准曲线计算样品中的三聚氰胺含量。
Description
(一)技术领域
本发明涉及生物检测领域，用于对饲料及食品中的三聚氰胺含量的检测，具体为一种检测三聚氰胺的酶联免疫测试盒及其制备及检测方法。
(二)背景技术
三聚氰胺是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，重要的氮杂环有机化工原料，简称三胺，又叫蜜胺、三聚氰酰胺、氰脲三酰胺。三聚氰胺是一种用途广泛的基本有机化工中间产品，最主要的用途是作为生产三聚氰胺甲醛树脂(MF)的原料。由于三聚氰胺分子中含有大量氮元素，常被人为添加进动物饲料及植物蛋白中以提高产品中蛋白质含量，而长期或反复大量食用含有三聚氰胺的饲料或食物，会造成动物或人类生殖、泌尿系统的损害，膀胱、肾部结石，并可进一步诱发膀胱癌。因此，有必要对饲料及食品中的三聚氰胺的含量进行检测。
目前检测三聚氰胺方法主要有重量法、升华法。近几年发展起来的方法主要有高效液相色谱法和气质联用法，这些色谱方法具有很好的灵敏度和特异性，但操作繁琐，需要昂贵的仪器设备，且耗时长，检测成本高，而酶联免疫吸附法(ELISA)快速、灵敏、准确、可定量、操作简便、无需贵重仪器设备，且对样品纯度要求不高，特异性强，简化了样品预处理和纯化过程，特别适用于大批量样品的检测。关于三聚氰胺的ELISA检测鲜见报道。
(三)发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种检测三聚氰胺的酶联免疫测试盒，其检测快速准确、操作简便，且无需贵重仪器设备，检测成本低，为此，本发明还提供了测试盒的制备及使用该测试盒的的检测三聚氰胺的专用检测方法。
一种检测三聚氰胺的酶联免疫测试盒，其包括洗涤液，显色液A，显色液B和终止液，其特征是其还包括由96或48或24孔包被板、三聚氰胺标准品、三聚氰胺的抗体冻干品、酶标记的羊抗鼠抗体冻干品。
一种检测三聚氰胺的酶联免疫测试盒的制备：其特征在于：其包括以下步骤：三聚氰胺标准品的制备、96孔或48孔或24孔包被板的制备、三聚氰胺-卵清蛋白(OVA)偶联物的制备、三聚氰胺与牛血清白蛋白(BSA)的偶联物制备、抗三聚氰胺单克隆抗体及其溶液的制备、酶标记的羊抗鼠抗体冻干品的制备、洗涤液的制备、显色液A的制备、显色液B的制备、终止液的制备。
其进一步特征在于：
所述的酶标记的羊抗鼠抗体冻干品为辣根过氧化物酶-羊抗鼠抗体冻干品，洗涤液为含有吐温和NaN3的磷酸盐缓冲溶液，显色液A为含有过氧化氢的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液，显色液B为四甲基联苯二胺的乙醇溶液，终止液为硫酸溶液；
所述三聚氰胺标准品从三聚氰胺纯品中稀释得到，稀释液为去离子水，三聚氰胺浓度为：0.001ng/mL～1000ng/mL；
所述96孔或48孔或24孔包被板包被固相抗原的制作方法：用10mmol/L～100mmol/L pH9～10 Na2CO3-NaHCO3缓冲液将三聚氰胺-卵清蛋白适当稀释做为包被液，分别加入到96或48或24孔微孔板各孔中，2℃～8℃放置过夜，弃去包被液，洗涤3次，按250μl/孔加入含1％～3％牛血清白蛋白，pH7～8左右的磷酸盐缓冲液，2℃～8℃封闭过夜，弃去封闭液，吹干，板条密封后置-40℃～-20℃左右冷冻保存；
所述三聚氰胺-卵清蛋白偶联物的制备：
称取一定量三聚氰胺，溶于吡啶溶液中，分别加入琥珀醛酸溶液和氰基硼氢化钠，室温下搅拌反应该混合物至反应完毕，然后低温浓缩至干，得半抗原；将所得半抗原，溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，分别加入N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)，室温下搅拌过夜，反应液离心，取上清，缓慢滴加到一定浓度的OVA溶液中，室温下搅拌反应4小时～6小时，PBS透析2天～3天，冷冻干燥后于-40℃～-20℃左右保存；上述反应成分比例为：三聚氰胺∶琥珀醛酸∶氰基硼氢化钠(摩尔比)＝(0.5～1)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)；半抗原：DCC：NHS：OVA(摩尔比)＝(50～500)：(100～500)：(100～5000)：(0.5～2)；
所述三聚氰胺与牛血清白蛋白(BSA)的偶联物制备：
称取一定量三聚氰胺，溶于吡啶溶液中，分别加入琥珀醛酸溶液和氰基硼氢化钠，室温下搅拌反应该混合物至反应完毕，然后低温浓缩至干，得半抗原；将所得半抗原，溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，分别加入N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)，室温下搅拌过夜，反应液离心，取上清，缓慢滴加到一定浓度的BSA溶液中，室温下搅拌反应4小时～6小时，PBS透析2天～3天，冷冻干燥后于-40℃～-20℃左右保存；上述反应成分摩尔比比例为：三聚氰胺：琥珀醛酸：氰基硼氢化钠＝(0.5～1)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)；半抗原：DCC：NHS：BSA(摩尔比)＝(50～500)：(100：500)：(100～5000)：(0.5～1.5)；
抗三聚氰胺(Melamine)单克隆抗体及其溶液的制备：三聚氰胺-牛血清白蛋白偶联抗原用生理盐水配成0.1μg/μl～10μg/μl抗原溶液，与等体积完全福氏佐剂混匀，充分乳化，供首次免疫用，加强免疫时用同量的不完全福氏佐剂代替完全福氏佐剂，首次免疫采用小鼠腹腔内直接注射，免疫剂量为10μg/只～100μg/只小鼠，以后每隔2周～4周加强免疫一次，加强免疫采用尾静脉注射，免疫剂量10μg/只～100μg/只，最后一次免疫采用脾内注射，4天后取脾融合，将分离的免疫小鼠脾细胞与处于对数生长期的骨髓瘤细胞SP-2/o以10:1比例混合，离心，去除上清，在50S～90S内将0.1ml～10ml 50％聚乙二醇(分子量为1500)加至细胞中，充分混匀，使其融合，1分钟～3分钟后加入10ml～50ml DMEM培养液，终止融合，水浴静止10分钟～30分钟后离心，去除上清；将融合细胞用含5％～30％小牛血清的HAT选择性培养基悬浮后，以最后浓度为1×104～1×106饲养细胞/0.1ml接种于以小鼠腹腔巨噬细胞作饲养层的96孔培养板中，于5％～10％CO2，35℃～45℃条件下培养，5天～10天后，每培养孔更换2/3HT培养液，10天～20天后，开始对镜检有杂交瘤克隆生长的培养孔，取上清液进行筛选，对检测结果呈阳性的细胞立即用有限稀释法进行克隆，杂交瘤筛选采用固相抗原间接非竞争ELISA法进行，以三聚氰胺-卵清蛋白为包被抗原，以免疫小鼠的血清为阳性对照，以SP-2/o骨髓瘤细胞培养的上清液为阴性对照；阳性细胞孔的判定标准为(A试验-A空白)/(A对照-A空白)>2.1；对分泌阳性抗体的细胞进行克隆；采用有限稀释法，将阳性克隆细胞吹匀，取一微滴至培养瓶内，倒置显微镜下准确计数细胞个数，稀释为70个/ml，再取1ml稀释20倍，接种入96孔培养板中进行亚克隆，直至所有细胞孔的培养上清均呈阳性为止；对10周龄～13周龄Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.3ml/只～0.5ml/只，8天～10天后，腹腔注射培养至对数期的杂交瘤细胞，5×105细胞/只，5天后注意观察，收集腹水，离心去除沉淀，加甘油于-40℃～-20℃保存；
其中样品的前处理：称取试样于具塞三角瓶中，加入乙腈:水(体积比1:1)溶液，密塞，超声波提取4分钟～5分钟，过滤，量取一定体积滤液用样品稀释液稀释为5倍～50倍，即为待测样液；取50μL～100μL的待测样液直接加样于微孔中，进行ELISA检测；
所述样品为各类食品与饲料；
所述酶标记的羊抗鼠抗体冻干品为辣根过氧化物酶-羊抗鼠抗体冻干品；
所述完全福氏佐剂是由下列材料配比而成，液体石蜡:羊毛脂:卡介苗＝(6～24)g:(10～40)ml:(0.05～0.5)g；所述不完全福氏佐剂是由下列材料配比而成，液体石蜡:羊毛脂＝(6～24)g:(10～40)ml；
一种检测三聚氰胺的酶联免疫测试盒的检测方法，
其特征在于：取包被有三聚氰胺-卵清蛋白的微孔包被板，加入三聚氰胺标准品或处理好的样品到各自的微孔中，加抗三聚氰胺抗体，35℃～45℃左右孵育约0.5小时～1小时，洗涤液洗2次～3次，加辣根过氧化物酶-羊抗鼠抗体，35℃～45℃左右孵育约0.5小时～1小时，用洗涤液洗4次～5次，加50μl显色液A和50μl显色液B，暗处静置15分钟～20分钟后加终止液，在450nm处测其吸光度值，从标准曲线计算样品中的三聚氰胺含量。
本发明的三聚氰胺酶联免疫吸附检测方法操作简便，检测过程快速，检测结果准确，不需要使用贵重仪器，检测成本低，专用测试盒使用方便、价格低、灵敏度高，适用于大批量样品的检测。
(四)附图说明
图1为三聚氰胺的标准曲线图。
(五)具体实施方式
见图1，一种检测三聚氰胺的酶联免疫测试盒，其包括洗涤液，显色液A，显色液B和终止液，其还包括由96或48或24孔包被板、三聚氰胺标准品、三聚氰胺的抗体冻干品、酶标记的羊抗鼠抗体冻干品。
酶标记的羊抗鼠抗体冻干品为辣根过氧化物酶-羊抗鼠抗体冻干品，洗涤液为含有吐温和NaN3的磷酸盐缓冲溶液，显色液A为含有过氧化氢的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液，显色液B为四甲基联苯二胺的乙醇溶液，终止液为硫酸溶液。
一种检测三聚氰胺的酶联免疫测试盒的制备：其特征在于：其包括以下步骤：所述三聚氰胺标准品的制备、所述96孔或48孔或24孔包被板的制备、所述三聚氰胺-卵清蛋白偶联物的制备、所述三聚氰胺与牛血清白蛋白(BSA)的偶联物制备、抗三聚氰胺单克隆抗体及其溶液的制备、所述酶标记的羊抗鼠抗体冻干品的制备、洗涤液的制备、显色液A的制备、显色液B的制备、终止液的制备。
下面结合实施例描述测试盒的制备方法：
实施例1
所述96孔或48孔或24孔包被板包被固相抗原的制作方法：用10mmol/LpH9 Na2CO3-NaHCO3缓冲液将三聚氰胺-卵清蛋白适当稀释做为包被液，分别加入到96或48或24孔微孔板各孔中，8℃放置过夜，弃去包被液，洗涤3次，按250μl/孔加入含1％牛血清白蛋白，pH8左右的磷酸盐缓冲液，8℃封闭过夜，弃去封闭液，吹干，板条密封后置-30℃左右冷冻保存；
所述三聚氰胺-卵清蛋白(OVA)偶联物的制备：
称取一定量三聚氰胺，溶于吡啶溶液中，分别加入琥珀醛酸溶液和氰基硼氢化钠，室温下搅拌反应该混合物至反应完毕，然后低温浓缩至干，得半抗原；将所得半抗原，溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，分别加入N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)，室温下搅拌过夜，反应液离心，取上清，缓慢滴加到一定浓度的OVA溶液中，室温下搅拌反应4小时，PBS透析3天，冷冻干燥后于-20℃左右保存；上述反应成分摩尔比比例为：三聚氰胺：琥珀醛酸：氰基硼氢化钠＝0.5：1.5：1；
半抗原：DCC：NHS：OVA(摩尔比)＝50：500：100：1.25；
所述三聚氰胺与牛血清白蛋白(BSA)的偶联物制备：
称取一定量三聚氰胺，溶于吡啶溶液中，分别加入琥珀醛酸溶液和氰基硼氢化钠，室温下搅拌反应该混合物至反应完毕，然后低温浓缩至干，得半抗原；将所得半抗原，溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，分别加入N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)，室温下搅拌过夜，反应液离心，取上清，缓慢滴加到一定浓度的BSA溶液中，室温下搅拌反应4h，PBS透析3天，冷冻干燥后于-20℃左右保存；上述反应成分摩尔比比例为：三聚氰胺：琥珀醛酸：氰基硼氢化钠＝0.5：1.5：1；半抗原：DCC：NHS：BSA(摩尔比)＝50：500：5000：1；
抗三聚氰胺(Melamine)单克隆抗体及其溶液的制备：三聚氰胺-牛血清白蛋白偶联抗原用生理盐水配成0.1μg/μl抗原溶液，与等体积完全福氏佐剂混匀，充分乳化，供首次免疫用，加强免疫时用同量的不完全福氏佐剂代替完全福氏佐剂，首次免疫采用小鼠腹腔内直接注射，免疫剂量为100μg/只小鼠，以后每隔3周加强免疫一次，加强免疫采用尾静脉注射，免疫剂量100μg/只，最后一次免疫采用脾内注射，4天后取脾融合，将分离的免疫小鼠脾细胞与处于对数生长期的骨髓瘤细胞SP-2/o以10:1比例混合，离心，去除上清，在50S内将10ml50％聚乙二醇(分子量为1500)加至细胞中，充分混匀，使其融合，3分钟后加入50ml DMEM培养液，终止融合，水浴静止10分钟后离心，去除上清；将融合细胞用含5％小牛血清的HAT选择性培养基悬浮后，以最后浓度为1×104饲养细胞/0.1ml接种于以小鼠腹腔巨噬细胞作饲养层的96孔培养板中，于10％CO2，35℃条件下培养，10天后，每培养孔更换2/3HT培养液，10天后，开始对镜检有杂交瘤克隆生长的培养孔，取上清液进行筛选，对检测结果呈阳性的细胞立即用有限稀释法进行克隆，杂交瘤筛选采用固相抗原间接非竞争ELISA法进行，以三聚氰胺-卵清蛋白为包被抗原，以免疫小鼠的血清为阳性对照，以SP-2/o骨髓瘤细胞培养的上清液为阴性对照；阳性细胞孔的判定标准为(A试验-A空白)/(A对照-A空白)>2.1；对分泌阳性抗体的细胞进行克隆；采用有限稀释法，将阳性克隆细胞吹匀，取一微滴至培养瓶内，倒置显微镜下准确计数细胞个数，稀释为70个/ml，再取1ml稀释20倍，接种入96孔培养板中进行亚克隆，直至所有细胞孔的培养上清均呈阳性为止；对10周龄Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.5ml/只，8天后，腹腔注射培养至对数期的杂交瘤细胞，5×105细胞/只，5天后注意观察，收集腹水，离心去除沉淀，加甘油于-20℃保存；
其中样品的前处理：称取试样于具塞三角瓶中，加入乙腈:水(体积比1:1)溶液，密塞，超声波提取4分钟，过滤，量取一定体积滤液用样品稀释液稀释为27倍，即为待测样液，取100μL的待测样液直接加样于微孔中，进行ELISA检测；
所述样品为各类食品与饲料；
所述酶标记的羊抗鼠抗体冻干品为辣根过氧化物酶-羊抗鼠抗体冻干品；
所述完全福氏佐剂是由下列材料配比而成，液体石蜡:羊毛脂:卡介苗＝6g:40ml:0.5g；所述不完全福氏佐剂是由下列材料配比而成，液体石蜡:羊毛脂＝24g:10ml；
三聚氰胺标准品从三聚氰胺纯品中稀释得到，稀释液为去离子水，三聚氰胺浓度为：0.001ng/mL。
实施例2
所述96孔或48孔或24孔包被板包被固相抗原的制作方法：用100mmol/L pH10 Na2CO3-NaHCO3缓冲液将三聚氰胺-卵清蛋白适当稀释做为包被液，分别加入到96或48或24孔微孔板各孔中，2℃放置过夜，弃去包被液，洗涤3次，按250μl/孔加入含3％牛血清白蛋白，pH7.5左右的磷酸盐缓冲液，2℃封闭过夜，弃去封闭液，吹干，板条密封后置-20℃左右冷冻保存；
所述三聚氰胺-卵清蛋白(OVA)偶联物的制备：
称取一定量三聚氰胺，溶于吡啶溶液中，分别加入琥珀醛酸溶液和氰基硼氢化钠，室温下搅拌反应该混合物至反应完毕，然后低温浓缩至干，得半抗原；将所得半抗原，溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，分别加入N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)，室温下搅拌过夜，反应液离心，取上清，缓慢滴加到一定浓度的OVA溶液中，室温下搅拌反应6小时，PBS透析2天，冷冻干燥后于-40℃左右保存；上述反应成分摩尔比比例为：三聚氰胺：琥珀醛酸：氰基硼氢化钠＝0.75：0.5：1.5；
半抗原：DCC：NHS：OVA＝500：100：2500：0.5；
所述三聚氰胺与牛血清白蛋白(BSA)的偶联物制备：
称取一定量三聚氰胺，溶于吡啶溶液中，分别加入琥珀醛酸溶液和氰基硼氢化钠，室温下搅拌反应该混合物至反应完毕，然后低温浓缩至干，得半抗原；将所得半抗原，溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，分别加入N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)，室温下搅拌过夜，反应液离心，取上清，缓慢滴加到一定浓度的BSA溶液中，室温下搅拌反应6小时，PBS透析2天，冷冻干燥后于-30℃左右保存；上述反应成分比例为：三聚氰胺：琥珀醛酸：氰基硼氢化钠(摩尔比)＝0.75：0.5：0.5；半抗原：DCC：NHS：BSA(摩尔比)＝500：100：2500：0.5；
抗三聚氰胺(Melamine)单克隆抗体及其溶液的制备：三聚氰胺-牛血清白蛋白偶联抗原用生理盐水配成10μg/μl抗原溶液，与等体积完全福氏佐剂混匀，充分乳化，供首次免疫用，加强免疫时用同量的不完全福氏佐剂代替完全福氏佐剂，首次免疫采用小鼠腹腔内直接注射，免疫剂量为10μg/只小鼠，以后每隔2周加强免疫一次，加强免疫采用尾静脉注射，免疫剂量10μg/只，最后一次免疫采用脾内注射，4天后取脾融合，将分离的免疫小鼠脾细胞与处于对数生长期的骨髓瘤细胞SP-2/o以10:1比例混合，离心，去除上清，在90S内将0.1ml 50％聚乙二醇(分子量为1500)加至细胞中，充分混匀，使其融合，1分钟后加入10ml DMEM培养液，终止融合，水浴静止20分钟后离心，去除上清；将融合细胞用含17.5％小牛血清的HAT选择性培养基悬浮后，以最后浓度为1×106饲养细胞/0.1ml接种于以小鼠腹腔巨噬细胞作饲养层的96孔培养板中，于5％CO2，45℃条件下培养，8天后，每培养孔更换2/3HT培养液，20天后，开始对镜检有杂交瘤克隆生长的培养孔，取上清液进行筛选，对检测结果呈阳性的细胞立即用有限稀释法进行克隆，杂交瘤筛选采用固相抗原间接非竞争ELISA法进行，以三聚氰胺-卵清蛋白为包被抗原，以免疫小鼠的血清为阳性对照，以SP-2/o骨髓瘤细胞培养的上清液为阴性对照；阳性细胞孔的判定标准为(A试验-A空白)/(A对照-A空白)>2.1；对分泌阳性抗体的细胞进行克隆；采用有限稀释法，将阳性克隆细胞吹匀，取一微滴至培养瓶内，倒置显微镜下准确计数细胞个数，稀释为70个/ml，再取1ml稀释20倍，接种入96孔培养板中进行亚克隆，直至所有细胞孔的培养上清均呈阳性为止；对11周龄Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.3ml/只，10天后，腹腔注射培养至对数期的杂交瘤细胞，5×105细胞/只，5天后注意观察，收集腹水，离心去除沉淀，加甘油于-30℃保存；
其中样品的前处理：称取试样于具塞三角瓶中，加入乙腈:水(体积比1:1)溶液，密塞，超声波提取5分钟，过滤，量取一定体积滤液用样品稀释液稀释为50倍，即为待测样液。取50μL的待测样液直接加样于微孔中，进行ELISA检测；
所述样品为各类食品与饲料；
所述酶标记的羊抗鼠抗体冻干品为辣根过氧化物酶-羊抗鼠抗体冻干品；
所述完全福氏佐剂是由下列材料配比而成，液体石蜡:羊毛脂:卡介苗＝24g:10ml:0.05g；所述不完全福氏佐剂是由下列材料配比而成，液体石蜡:羊毛脂＝6g:25ml；
三聚氰胺标准品从三聚氰胺纯品中稀释得到，稀释液为去离子水，三聚氰胺浓度为：500ng/mL。
实施例3
所述96孔或48孔或24孔包被板包被固相抗原的制作方法：用55mmol/LpH9.5 Na2CO3-NaHCO3缓冲液将三聚氰胺-卵清蛋白适当稀释做为包被液，分别加入到96或48或24孔微孔板各孔中，5℃放置过夜，弃去包被液，洗涤3次，按250μl/孔加入含2％牛血清白蛋白，pH7左右的磷酸盐缓冲液，5℃封闭过夜，弃去封闭液，吹干，板条密封后置-40℃左右冷冻保存；
所述三聚氰胺-卵清蛋白(OVA)偶联物的制备：
称取一定量三聚氰胺，溶于吡啶溶液中，分别加入琥珀醛酸溶液和氰基硼氢化钠，室温下搅拌反应该混合物至反应完毕，然后低温浓缩至干，得半抗原；将所得半抗原，溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，分别加入N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)，室温下搅拌过夜，反应液离心，取上清，缓慢滴加到一定浓度的OVA溶液中，室温下搅拌反应5小时，PBS透析3天，冷冻干燥后于-30℃左右保存；上述反应成分摩尔比比例为：三聚氰胺：琥珀醛酸：氰基硼氢化钠＝1：1：0.5；
半抗原：DCC：NHS：OVA＝275：300：5000：2；
所述三聚氰胺与牛血清白蛋白(BSA)的偶联物制备：
称取一定量三聚氰胺，溶于吡啶溶液中，分别加入琥珀醛酸溶液和氰基硼氢化钠，室温下搅拌反应该混合物至反应完毕，然后低温浓缩至干，得半抗原；将所得半抗原，溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，分别加入N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)，室温下搅拌过夜，反应液离心，取上清，缓慢滴加到一定浓度的BSA溶液中，室温下搅拌反应5小时，PBS透析2天，冷冻干燥后于-40℃左右保存；上述反应成分摩尔比比例为：三聚氰胺：琥珀醛酸：氰基硼氢化钠＝1：1：1：5；半抗原：DCC：NHS：BSA(摩尔比)＝300：350：100：1.5；
抗三聚氰胺(Melamine)单克隆抗体及其溶液的制备：三聚氰胺-牛血清白蛋白偶联抗原用生理盐水配成5.05μg/μl抗原溶液，与等体积完全福氏佐剂混匀，充分乳化，供首次免疫用，加强免疫时用同量的不完全福氏佐剂代替完全福氏佐剂，首次免疫采用小鼠腹腔内直接注射，免疫剂量为55μg/只小鼠，以后每隔3周加强免疫一次，加强免疫采用尾静脉注射，免疫剂量55μg/只，最后一次免疫采用脾内注射，4天后取脾融合，将分离的免疫小鼠脾细胞与处于对数生长期的骨髓瘤细胞SP-2/o以10:1比例混合，离心，去除上清，在70S内将0.55ml 50％聚乙二醇(分子量为1500)加至细胞中，充分混匀，使其融合，2分钟后加入30ml DMEM培养液，终止融合，水浴静止30分钟后离心，去除上清；将融合细胞用含30％小牛血清的HAT选择性培养基悬浮后，以最后浓度为1×105饲养细胞/0.1ml接种于以小鼠腹腔巨噬细胞作饲养层的96孔培养板中，于7.5％CO2，40℃条件下培养，5天后，每培养孔更换2/3HT培养液，15天后，开始对镜检有杂交瘤克隆生长的培养孔，取上清液进行筛选，对检测结果呈阳性的细胞立即用有限稀释法进行克隆，杂交瘤筛选采用固相抗原间接非竞争ELISA法进行，以三聚氰胺-卵清蛋白为包被抗原，以免疫小鼠的血清为阳性对照，以SP-2/o骨髓瘤细胞培养的上清液为阴性对照；阳性细胞孔的判定标准为(A试验-A空白)/(A对照-A空白)>2.1；对分泌阳性抗体的细胞进行克隆；采用有限稀释法，将阳性克隆细胞吹匀，取一微滴至培养瓶内，倒置显微镜下准确计数细胞个数，稀释为70个/ml，再取1ml稀释20倍，接种入96孔培养板中进行亚克隆，直至所有细胞孔的培养上清均呈阳性为止；对13周龄Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.4ml/只，9天后，腹腔注射培养至对数期的杂交瘤细胞，5×105细胞/只，5天后注意观察，收集腹水，离心去除沉淀，加甘油于-40℃保存；
其中样品的前处理：称取试样于具塞三角瓶中，加入乙腈:水(体积比1:1)溶液，密塞，超声波提取4.5分钟，过滤，量取一定体积滤液用样品稀释液稀释为5倍，即为待测样液。取75μL的待测样液直接加样于微孔中，进行ELISA检测；
所述样品为各类食品与饲料；
所述酶标记的羊抗鼠抗体冻干品为辣根过氧化物酶-羊抗鼠抗体冻干品；
所述完全福氏佐剂是由下列材料配比而成，液体石蜡:羊毛脂:卡介苗＝15g:25ml:0.25g；所述不完全福氏佐剂是由下列材料配比而成，液体石蜡:羊毛脂＝15g:25ml；
三聚氰胺标准品从三聚氰胺纯品中稀释得到，稀释液为去离子水，三聚氰胺浓度为：1000ng/mL。
下面结合实施例描述测试盒的检测方法
实施例1
取包被有三聚氰胺-卵清蛋白的微孔包被板，加入三聚氰胺标准品或处理好的样品到各自的微孔中，加抗三聚氰胺抗体，35℃左右孵育约1小时，洗涤液洗3次，加辣根过氧化物酶-羊抗鼠抗体，35℃左右孵育约0.5小时，用洗涤液洗4次，加50μl显色液A和50μl显色液B，暗处静置15分钟后加终止液，在450nm处测其吸光度值，从标准曲线计算样品中的三聚氰胺含量。
实施例2
取包被有三聚氰胺-卵清蛋白的微孔包被板，加入三聚氰胺标准品或处理好的样品到各自的微孔中，加抗三聚氰胺抗体，45℃左右孵育约0.5小时，洗涤液洗2次，加辣根过氧化物酶-羊抗鼠抗体，45℃左右孵育约1小时，用洗涤液洗5次，加50μl显色液A和50μl显色液B，暗处静置20分钟后加终止液，在450nm处测其吸光度值，从标准曲线计算样品中的三聚氰胺含量。
实施例3
取包被有三聚氰胺-卵清蛋白的微孔包被板，加入三聚氰胺标准品或处理好的样品到各自的微孔中，加抗三聚氰胺抗体，40℃左右孵育约0.75小时，洗涤液洗2次，加辣根过氧化物酶-羊抗鼠抗体，40℃左右孵育约0.75小时，用洗涤液洗5次，加50μl显色液A和50μl显色液B，暗处静置17.5分钟后加终止液，在450nm处测其吸光度值，从标准曲线计算样品中的三聚氰胺含量。
Claims (10)
1、一种检测三聚氰胺的酶联免疫测试盒，其包括洗涤液，显色液A，显色液B和终止液，其特征是其还包括由96或48或24孔包被板、三聚氰胺标准品、三聚氰胺的抗体冻干品、酶标记的羊抗鼠抗体冻干品。
2、一种检测三聚氰胺的酶联免疫测试盒的制备：其特征在于：其包括以下步骤：三聚氰胺标准品的制备、96孔或48孔或24孔包被板的制备、三聚氰胺-卵清蛋白偶联物的制备、三聚氰胺与牛血清白蛋白(BSA)的偶联物制备、抗三聚氰胺单克隆抗体及其溶液的制备、酶标记的羊抗鼠抗体冻干品的制备、洗涤液的制备、显色液A的制备、显色液B的制备、终止液的制备。
3、根据上权利要求2所述一种检测三聚氰胺的酶联免疫测试盒的制备：其特征在于：所述的酶标记的羊抗鼠抗体冻干品为辣根过氧化物酶-羊抗鼠抗体冻干品，洗涤液为含有吐温和NaN3的磷酸盐缓冲溶液，显色液A为含有过氧化氢的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液，显色液B为四甲基联苯二胺的乙醇溶液，终止液为硫酸溶液；所述三聚氰胺标准品从三聚氰胺纯品中稀释得到，稀释液为去离子水，三聚氰胺浓度为：0.001ng/mL～1000ng/mL。
4、根据上权利要求2所述一种检测三聚氰胺的酶联免疫测试盒的制备：其特征在于：所述96孔或48孔或24孔包被板包被固相抗原的制作方法：用10mmol/L～100mmol/L pH9～10 Na2CO3-NaHCO3缓冲液将三聚氰胺-卵清蛋白适当稀释做为包被液，分别加入到96或48或24孔微孔板各孔中，2℃～8℃放置过夜，弃去包被液，洗涤3次，按250μl/孔加入含1％～3％牛血清白蛋白，pH7～8左右的磷酸盐缓冲液，2℃～8℃封闭过夜，弃去封闭液，吹干，板条密封后置-40℃～-20℃左右冷冻保存。
5、根据上权利要求2所述一种检测三聚氰胺的酶联免疫测试盒的制备：其特征在于：所述三聚氰胺-卵清蛋白(OVA)偶联物的制备：
称取一定量三聚氰胺，溶于吡啶溶液中，分别加入琥珀醛酸溶液和氰基硼氢化钠，室温下搅拌反应该混合物至反应完毕，然后低温浓缩至干，得半抗原；将所得半抗原，溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，分别加入N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)，室温下搅拌过夜，反应液离心，取上清，缓慢滴加到一定浓度的OVA溶液中，室温下搅拌反应4小时～6小时，PBS透析2天～3天，冷冻干燥后于-40℃～-20℃左右保存；上述反应成分摩尔比比例为：三聚氰胺：琥珀醛酸：氰基硼氢化钠＝(0.5～1)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)；半抗原：DCC：NHS：OVA＝(50～500)：(100～500)：(100～5000)：(0.5～2)。
6、根据上权利要求2所述一种检测三聚氰胺的酶联免疫测试盒的制备：其特征在于：所述三聚氰胺与牛血清白蛋白(BSA)的偶联物制备：
称取一定量三聚氰胺，溶于吡啶溶液中，分别加入琥珀醛酸溶液和氰基硼氢化钠，室温下搅拌反应该混合物至反应完毕，然后低温浓缩至干，得半抗原；将所得半抗原，溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，分别加入N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)，室温下搅拌过夜，反应液离心，取上清，缓慢滴加到一定浓度的BSA溶液中，室温下搅拌反应4小时～6小时，PBS透析2天～3天，冷冻干燥后于-40℃～-20℃左右保存；上述反应成分摩尔比比例为：三聚氰胺：琥珀醛酸：氰基硼氢化钠＝(0.5～1)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)；半抗原：DCC：NHS：BSA(摩尔比)＝(50～500)：(100：500)：(100～5000)：(0.5～1.5)。
7、根据上权利要求2所述一种检测三聚氰胺的酶联免疫测试盒的制备：其特征在于：抗三聚氰胺(Melamine)单克隆抗体及其溶液的制备：三聚氰胺-牛血清白蛋白偶联抗原用生理盐水配成0.1μg/μl～10μg/μl抗原溶液，与等体积完全福氏佐剂混匀，充分乳化，供首次免疫用，加强免疫时用同量的不完全福氏佐剂代替完全福氏佐剂，首次免疫采用小鼠腹腔内直接注射，免疫剂量为10μg/只～100μg/只小鼠，以后每隔2周～4周加强免疫一次，加强免疫采用尾静脉注射，免疫剂量10μg/只～100μg/只，最后一次免疫采用脾内注射，4天后取脾融合，将分离的免疫小鼠脾细胞与处于对数生长期的骨髓瘤细胞SP-2/o以10:1比例混合，离心，去除上清，在50S～90S内将0.1ml～10ml50％聚乙二醇(分子量为1500)加至细胞中，充分混匀，使其融合，1分钟～3分钟后加入10ml～50mlDMEM培养液，终止融合，水浴静止10分钟～30分钟后离心，去除上清；将融合细胞用含5％～30％小牛血清的HAT选择性培养基悬浮后，以最后浓度为1×104～1×106饲养细胞/0.1ml接种于以小鼠腹腔巨噬细胞作饲养层的96孔培养板中，于5％～10％CO2，35℃～45℃条件下培养，5天～10天后，每培养孔更换2/3HT培养液，10天～20天后，开始对镜检有杂交瘤克隆生长的培养孔，取上清液进行筛选，对检测结果呈阳性的细胞立即用有限稀释法进行克隆，杂交瘤筛选采用固相抗原间接非竞争ELISA法进行，以三聚氰胺-卵清蛋白为包被抗原，以免疫小鼠的血清为阳性对照，以SP-2/o骨髓瘤细胞培养的上清液为阴性对照；阳性细胞孔的判定标准为(A试验-A空白)/(A对照-A空白)>2.1；对分泌阳性抗体的细胞进行克隆；采用有限稀释法，将阳性克隆细胞吹匀，取一微滴至培养瓶内，倒置显微镜下准确计数细胞个数，稀释为70个/ml，再取1ml稀释20倍，接种入96孔培养板中进行亚克隆，直至所有细胞孔的培养上清均呈阳性为止；对10周龄～13周龄Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.3ml/只～0.5ml/只，8天～10天后，腹腔注射培养至对数期的杂交瘤细胞，5×105细胞/只，5天后注意观察，收集腹水，离心去除沉淀，加甘油于-40℃～-20℃保存。
8、根据上权利要求7所述一种检测三聚氰胺的酶联免疫测试盒的制备：其特征在于：其中样品的前处理：称取试样于具塞三角瓶中，加入乙腈：水(体积比1:1)溶液，密塞，超声波提取4分钟～5分钟，过滤，量取一定体积滤液用样品稀释液稀释为5～50倍，即为待测样液；取50～100μL的待测样液直接加样于微孔中，进行ELISA检测。
9、根据上权利要求8所述一种检测三聚氰胺的酶联免疫测试盒的制备：其特征在于：所述样品为各类食品与饲料；所述完全福氏佐剂是由下列材料配比而成，液体石蜡：羊毛脂：卡介苗＝(6～24)g：(10～40)ml：(0.05～0.5)g；所述不完全福氏佐剂是由下列材料配比而成，液体石蜡:羊毛脂＝(6～24)g:(10～40)ml。
10、一种检测三聚氰胺的酶联免疫测试盒的检测方法，其特征在于：取包被有三聚氰胺-卵清蛋白的微孔包被板，加入三聚氰胺标准品或处理好的样品到各自的微孔中，加抗三聚氰胺抗体，35℃～45℃左右孵育约0.5小时～1小时，洗涤液洗2次～3次，加辣根过氧化物酶-羊抗鼠抗体，35℃～45℃左右孵育约0.5小时～1小时，用洗涤液洗4次～5次，加50μl显色液A和50μl显色液B，暗处静置15分钟～20分钟后加终止液，在450nm处测其吸光度值，从标准曲线计算样品中的三聚氰胺含量。
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| CN115650927A (zh) * | 2022-09-29 | 2023-01-31 | 深圳市绿诗源生物技术有限公司 | 新型三聚氰胺半抗原、完全抗原、抗体及制备方法 |
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