CN101413954A - 呕吐毒素的酶联免疫吸附检测专用测试盒及制备及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明为呕吐毒素的酶联免疫吸附检测专用测试盒。其检测快速、灵敏、准确、可定量、操作简便、且对样品纯度要求不高，特异性强，特别适用于大批量样品的检测，为此本发明还提供了专用测试盒的制备及检测方法。其包括洗涤液、显色液A、显色液B和终止液，其特征在于：其还包括包被有呕吐毒素固相抗原的包被板、呕吐毒素(DON)标准品、呕吐毒素(DON)单克隆抗体冻干品以及酶标记的羊抗鼠抗体冻干品。检测时，取包被板，加入50μl～100μl的DON标准品或处理好的样品到各自的微孔中，加50μl～100μl抗DON抗体，35℃～45℃孵育0.5h～1h，洗涤液洗3次～5次，加50μl～100μl辣根过氧化物酶(HRP)－羊抗鼠抗体，35℃～45℃孵育0.5h～1h，用洗涤液洗3次～5次，加50μl～100μl显色液A和50μl～100μl显色液B，暗处静置10分钟～20分钟后加终止液，在450nm处测其吸光度值，从标准曲线计算样品中的DON含量。
Description
(一)技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体为呕吐毒素的酶联免疫吸附检测专用测试盒及制备及检测方法。
(二)背景技术
呕吐毒素(Vomitoxin)，化学上称作脱氧腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)，属于霉菌的单端孢菌素族，多分布于小麦、大麦、玉米等谷物籽实中，其对谷物的污染率和污染水平居镰刀菌毒素之首，具有很高的细胞毒性及免疫抑制性质，是由几种粉色镰刀霉真菌属产生的。呕吐毒素在小麦、玉米以及稻米中的含量通常是mg/kg级。
目前，呕吐毒素的检测方法有高效液相色谱法(HPLC)，气相色谱法(GC)，薄层层析法(TLC)等，由于以上诸分析方法的样品前处理比较复杂、操作时需专门的技术人员、检测费用昂贵，不利于推广应用。
(三)发明内容
针对上述问题，本发明提供了呕吐毒素的酶联免疫吸附检测专用测试盒，其检测快速、灵敏、准确、可定量、操作简便、无需贵重仪器设备，且对样品纯度要求不高，特异性强，简化了样品预处理和纯化过程，特别适用于大批量样品的检测，为此本发明还提供了专用测试盒的制备及检测方法。
呕吐毒素的酶联免疫吸附检测专用测试盒，其包括洗涤液、显色液A、显色液B和终止液，其特征在于：其还包括包被有呕吐毒素固相抗原的包被板、呕吐毒素(DON)标准品、呕吐毒素(DON)单克隆抗体冻干品以及酶标记的羊抗鼠抗体冻干品。
呕吐毒素的酶联免疫吸附检测专用测试盒的制备，其特征在于：其包括以下步骤，包被板的制作、呕吐毒素DON标准品的制作、呕吐毒素-牛血清白蛋白DON-BSA偶联物的制备、呕吐毒素-卵清蛋白DON-OVA偶联物的制备、抗呕吐毒素DON单克隆抗体及其溶液的制备、完全福氏佐剂的制备、不完全福氏佐剂的制备、酶标记的羊抗鼠抗体冻干品的制备；洗涤液的制备；显色液A的制备；显色液B的制备；终止液的制备。
其进一步特征在于：所述包被板包被呕吐毒素固相抗原，其采用96或48或24孔微孔板，用10mmol/L～100mmol/L pH9～10 Na2CO3-NaHCO3的缓冲液作为包被液，将呕吐毒素-卵清蛋白(DON-OVA)稀释至0.1μg/mL～1.0μg/mL，96或48或24孔微孔板各孔加100μl，2℃～8℃放置过夜，弃去包被液，洗涤2次～5次，按加入含1％～5％牛血清白蛋白(溶于pH 7～8的磷酸盐缓冲液)，2℃～8℃封闭过夜，弃去封闭液，吹干，板条密封后置-20℃～-40℃冷冻保存。
所述呕吐毒素(DON)标准品从呕吐毒素(DON)纯品中稀释得到，稀释液为去离子水，DON浓度为：0.001ng/mL～1000ng/mL。
呕吐毒素-牛血清白蛋白(DON-BSA)偶联物的制备：将DON溶解在吡啶中，在反应瓶中加入1一丁基硼酸；混合物在室温下搅拌过夜，产生7，15一氧一(丁基硼)-脱氧雪腐镰刀菌烯醇；再在其中加入琥珀酸酐，并通入氮气；密封反应瓶，混合物在沸水浴中搅拌90分钟～120分钟，产生3一氧一半琥珀酰一7，15一氧一(丁基硼)一脱氧雪腐镰刀菌烯醇；将吡啶在室温吹干后，加入少量的水，然后将残余物溶解于5mL乙酸乙酯中，超声波处理10分钟～30分钟后，6000rpm～15000rpm下离心5分钟～30分钟，取上清液；将沉淀物用乙酸乙醋溶解，重复上述操作，合并上清液，将上清液减压浓缩后备用；取浓缩物与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、二环己基碳化二亚胺(DCC)溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温振荡10min～60min，离心；将上清液缓慢滴加到牛血清白蛋白(溶于0.01M～0.2M NaHCO3溶液中)，在2℃～8℃振荡2hr～3hr，然后，在0.01M～0.2M PBS(pH 7～8)溶液中透析，换透析液3次～8次；冷冻干燥，偶联物-20℃～-40℃保存；上述反应成分的比例为：DON：1一丁基硼酸：琥珀酸酐＝(10～1000)mg：(30～4000)mg：(10-2000)mg，3一氧一半琥珀酰一7，15一氧一(丁基硼)一脱氧雪腐镰刀菌烯醇浓缩物：NHS：DCC：BSA＝(10～2000)mg：(3～1000)mg：(5-2000)mg：(10-6000)mg。
呕吐毒素-卵清蛋白(DON-OVA)偶联物的制备：将DON溶解在吡啶中，在反应瓶中加入1一丁基硼酸，混合物在室温下搅拌过夜，产生7，15一氧一(丁基硼)-脱氧雪腐镰刀菌烯醇，再在其中加入琥珀酸酐，并通入氮气，密封反应瓶，混合物在沸水浴中搅拌90分钟～120分钟，产生3一氧一半琥珀酰一7，15一氧一(丁基硼)一脱氧雪腐镰刀菌烯醇；将吡啶在室温吹干后，加入少量的水，然后将残余物溶解于乙酸乙酯中，超声波处理10分钟～30分钟后，6000rpm～15000rpm下离心5分钟～30分钟，取上清液；将沉淀物用乙酸乙醋溶解，重复上述操作，合并上清液，将上清液减压浓缩后备用；取浓缩物与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、二环己基碳化二亚胺(DCC)溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温振荡10分钟～60分钟，离心，将上清液缓慢滴加到卵清蛋白(溶于0.01M～0.2M NaHCO3溶液中)，在2℃～8℃振荡2hr～3hr，然后，在0.01M～0.2M PBS pH 7～8溶液中透析，换透析液3次～8次；冷冻干燥，偶联物-20℃～-40℃保存；上述反应成分的比例为：DON：1一丁基硼酸：琥珀酸酐＝(10～1000)mg：(30～4000)mg：(10-2000)mg，3一氧一半琥珀酰一7，15一氧一(丁基硼)一脱氧雪腐镰刀菌烯醇浓缩物：NHS：DCC：OVA＝(10～2000)mg：(3～1000)mg：(5-2000)mg：(10-8000)mg。
所述抗呕吐毒素(DON)单克隆抗体及其溶液的制备：取呕吐毒素-牛血清白蛋白(DON-BSA)偶联物用生理盐水配成0.1μg/μl～10μg/μl抗原溶液，与等体积完全福氏佐剂混匀，充分乳化，供首次免疫用，加强免疫时用同量的不完全福氏佐剂代替完全福氏佐剂，首次免疫采用小鼠腹腔内直接注射，免疫剂量为10μg/只～100μg/只小鼠，以后每隔2周～4周加强免疫一次，加强免疫采用尾静脉注射，免疫剂量10μg/只～100μg/只，最后一次免疫采用脾内注射，4天后取脾融合，将分离的免疫小鼠脾细胞与处于对数生长期的骨髓瘤细胞SP-2/o以10:1比例混合，离心，去除上清，在50S～90S内将0.1ml～10ml50％聚乙二醇(分子量为1500)加至细胞中，充分混匀，使其融合，1min～3min后加入10ml～50ml DMEM培养液，终止融合，水浴静止10min～30min后离心，去除上清；将融合细胞用含5％～30％小牛血清的HAT选择性培养基悬浮后，以最后浓度为1×104～1×106饲养细胞/0.1ml接种于以小鼠腹腔巨噬细胞作饲养层的96孔培养板中，于5％～10％CO2，35℃～45℃条件下培养，5天～10天后，每培养孔更换2/3HT培养液，10天～20天后，开始对镜检有杂交瘤克隆生长的培养孔，取上清液进行筛选，对检测结果呈阳性的细胞立即用有限稀释法进行克隆，杂交瘤筛选采用固相抗原间接非竞争ELISA法进行，以呕吐毒素-卵清蛋白(DON-OVA)为包被抗原，以免疫小鼠的血清为阳性对照，以SP-2/o骨髓瘤细胞培养的上清液为阴性对照；阳性细胞孔的判定标准为(A试验-A空白)/(A对照-A空白)>2.1；对分泌阳性抗体的细胞进行克隆；采用有限稀释法，将阳性克隆细胞吹匀，取一微滴至培养瓶内，倒置显微镜下准确计数细胞个数，稀释为70个/ml，再取1ml稀释20倍，接种入96孔培养板中进行亚克隆，直至所有细胞孔的培养上清均呈阳性为止；对10周龄～13周龄Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.3ml/只～0.5ml/只，8天～10天后，腹腔注射培养至对数期的杂交瘤细胞，5×105细胞/只，5天后注意观察，收集腹水，离心去除沉淀，加甘油于-20℃～-40℃保存；上述反应成分的比例为：DON-BSA：生理盐水＝(10～1000)μg：(0.1～10)ml。
所述完全福氏佐剂是由下列材料配比而成，液体石蜡:羊毛脂:卡介苗＝(6～24)g:(10～40)ml:(0.05～0.5)g；所述不完全福氏佐剂是由下列材料配比而成，液体石蜡:羊毛脂＝(6～24)g:(10～40)ml。
所述的酶标记的羊抗鼠抗体冻干品为辣根过氧化物酶-羊抗鼠抗体冻干品；所述洗涤液为含有吐温和NaN3的磷酸盐缓冲溶液；所述显色液A为含有过氧化氢的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液；所述显色液B为四甲基联苯二胺的乙醇溶液；所述终止液为硫酸溶液。
呕吐毒素的酶联免疫吸附检测专用测试盒的检测方法，其特征在于：取包被有DON-OVA的微孔包被板，加入50μL～100μL的DON标准品或处理好的样品到各自的微孔中，加50μL～100μL抗DON抗体，35℃～45℃孵育0.5h～1h，洗涤液洗3次～5次，加50μL～100μL辣根过氧化物酶(HRP)-羊抗鼠抗体，35℃～45℃孵育0.5h～1h，用洗涤液洗3次～5次，加50μL～100μL显色液A和50μL～100μL显色液B，暗处静置10分钟～20分钟后加终止液，在450nm处测其吸光度值，从标准曲线计算样品中的DON含量。
本发明的呕吐毒素酶联免疫吸附检测方法操作简便，检测快速、灵敏、准确，专用测试盒使用方便、价格低，适用于大批量样品的检测。
(四)附图说明
图1为呕吐毒素DON标准曲线图，横坐标为DON标准溶液浓度的对数，纵坐标为百分比，即各标准品孔和样品孔光密度值除以0ng/mL标准品孔光密度值(A0)再乘以100％所得；光密度值(标准孔或样品孔)/光密度值(A0)×100％＝％(纵坐标)。
(五)具体实施方式
呕吐毒素的酶联免疫吸附检测专用测试盒，其包括洗涤液、显色液A、显色液B和终止液，其还包括包被有呕吐毒素固相抗原的包被板、呕吐毒素(DON)标准品、呕吐毒素(DON)单克隆抗体冻干品以及酶标记的羊抗鼠抗体冻干品。
下面结合实施例描述本发明中呕吐毒素的酶联免疫吸附检测专用测试盒的制备，
实施例1
包被板包被呕吐毒素固相抗原，其采用96或48或24孔微孔板，用10mmol/L pH9 Na2CO3-NaHCO3的缓冲液作为包被液，将呕吐毒素-卵清蛋白(DON-OVA)稀释至1.0μg/mL，96或48或24孔微孔板各孔加100μl，8℃放置过夜，弃去包被液，洗涤4，按加入含5％牛血清白蛋白，pH7.5酸盐缓冲液，2℃封闭过夜，弃去封闭液，吹干，板条密封后置-20℃冷冻保存；
所述呕吐毒素(DON)标准品从呕吐毒素(DON)纯品中稀释得到，稀释液为去离子水，DON浓度为：0.001ng/mL；
呕吐毒素-牛血清白蛋白(DON-BSA)偶联物的制备：将DON溶解在吡啶中，在反应瓶中加入1一丁基硼酸；混合物在室温下搅拌过夜，产生7，15一氧一(丁基硼)-脱氧雪腐镰刀菌烯醇；再在其中加入琥珀酸酐，并通入氮气；密封反应瓶，混合物在沸水浴中搅拌120min，产生3一氧一半琥珀酰一7，15一氧一(丁基硼)一脱氧雪腐镰刀菌烯醇；将吡啶在室温吹干后，加入少量的水，然后将残余物溶解于5mL乙酸乙酯中，超声波处理20钟后，10500rpm下离心5分钟，取上清液；将沉淀物用乙酸乙醋溶解，重复上述操作，合并上清液，将上清液减压浓缩后备用；取浓缩物与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、二环己基碳化二亚胺(DCC)溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温振荡35min，离心；将上清液缓慢滴加到牛血清白蛋白(溶于0.2M NaHCO3溶液中)，在5℃振荡3hr，然后，在0.01M PBS(pH 7.5)溶液中透析，换透析液3次；冷冻干燥，偶联物-30℃保存。上述反应成分的比例为：DON：1一丁基硼酸：琥珀酸酐＝1000mg：2015mg：10mg，3一氧一半琥珀酰一7，15一氧一(丁基硼)一脱氧雪腐镰刀菌烯醇浓缩物：NHS：DCC：BSA＝2000mg：495mg：1000mg：3000mg；
呕吐毒素-卵清蛋白(DON-OVA)偶联物的制备：将DON溶解在吡啶中，在反应瓶中加入1一丁基硼酸，混合物在室温下搅拌过夜，产生7，15一氧一(丁基硼)-脱氧雪腐镰刀菌烯醇，再在其中加入琥珀酸酐，并通入氮气，密封反应瓶，混合物在沸水浴中搅拌105min，产生3一氧一半琥珀酰一7，15一氧一(丁基硼)一脱氧雪腐镰刀菌烯醇；将吡啶在室温吹干后，加入少量的水，然后将残余物溶解于乙酸乙酯中，超声波处理30分钟后，15000rpm下离心5分钟，取上清液；将沉淀物用乙酸乙醋溶解，重复上述操作，合并上清液，将上清液减压浓缩后备用；取浓缩物与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、二环己基碳化二亚胺(DCC)溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温振荡35min，离心，将上清液缓慢滴加到卵清蛋白(溶于0.2M NaHCO3溶液中)，在8℃振荡2hr，然后，在0.2M PBS(pH 7.5)溶液中透析，换透析液6次；冷冻干燥，偶联物-20℃保存；上述反应成分的比例为：DON：1一丁基硼酸：琥珀酸酐＝495mg：4000mg：995mg，3一氧一半琥珀酰一7，15一氧一(丁基硼)一脱氧雪腐镰刀菌烯醇浓缩物：NHS：DCC：OVA＝2000mg：3mg：995mg：3995mg；
所述抗呕吐毒素(DON)单克隆抗体及其溶液的制备：取呕吐毒素-牛血清白蛋白(DON-BSA)偶联物用生理盐水配成10μg/μl抗原溶液，与等体积完全福氏佐剂混匀，充分乳化，供首次免疫用，加强免疫时用同量的不完全福氏佐剂代替完全福氏佐剂，首次免疫采用小鼠腹腔内直接注射，免疫剂量为10μg/只小鼠，以后每隔4周加强免疫一次，加强免疫采用尾静脉注射，免疫剂量55μg/只，最后一次免疫采用脾内注射，4天后取脾融合，将分离的免疫小鼠脾细胞与处于对数生长期的骨髓瘤细胞SP-2/o以10:1比例混合，离心，去除上清，在50S内将0.1ml50％聚乙二醇(分子量为1500)加至细胞中，充分混匀，使其融合，3min后加入50ml DMEM培养液，终止融合，水浴静止20min后离心，去除上清；将融合细胞用含30％小牛血清的HAT选择性培养基悬浮后，以最后浓度为1×106饲养细胞/0.1ml接种于以小鼠腹腔巨噬细胞作饲养层的96孔培养板中，于7.5％CO2，40℃条件下培养，10天后，每培养孔更换2/3HT培养液，20天后，开始对镜检有杂交瘤克隆生长的培养孔，取上清液进行筛选，对检测结果呈阳性的细胞立即用有限稀释法进行克隆，杂交瘤筛选采用固相抗原间接非竞争ELISA法进行，以呕吐毒素-卵清蛋白(DON-OVA)为包被抗原，以免疫小鼠的血清为阳性对照，以SP-2/o骨髓瘤细胞培养的上清液为阴性对照；阳性细胞孔的判定标准为(A试验-A空白)/(A对照-A空白)>2.1；对分泌阳性抗体的细胞进行克隆；采用有限稀释法，将阳性克隆细胞吹匀，取一微滴至培养瓶内，倒置显微镜下准确计数细胞个数，稀释为70个/ml，再取1ml稀释20倍，接种入96孔培养板中进行亚克隆，直至所有细胞孔的培养上清均呈阳性为止；对10周龄Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.5ml/只，8天后，腹腔注射培养至对数期的杂交瘤细胞，5×105细胞/只，5天后注意观察，收集腹水，离心去除沉淀，加甘油于-40℃保存；上述反应成分的比例为：DON-BSA：生理盐水＝10μg：4.95ml；
所述完全福氏佐剂是由下列材料配比而成，液体石蜡:羊毛脂:卡介苗＝6g:25ml:0.5g；所述不完全福氏佐剂是由下列材料配比而成，液体石蜡:羊毛脂＝24g:40ml。
实施例2
所述包被板包被呕吐毒素固相抗原，其采用96或48或24孔微孔板，用100mmol/L pH10 Na2CO3-NaHCO3的缓冲液作为包被液，将呕吐毒素-卵清蛋白(DON-OVA)稀释至0.1μg/mL，96或48或24孔微孔板各孔加100μl，5℃放置过夜，弃去包被液，洗涤2次，按加入含1％牛血清白蛋白，pH 7的磷酸盐缓冲液，8℃封闭过夜，弃去封闭液，吹干，板条密封后置-40℃冷冻保存；
所述呕吐毒素(DON)标准品从呕吐毒素(DON)纯品中稀释得到，稀释液为去离子水，DON浓度为：1000ng/mL；
呕吐毒素-牛血清白蛋白(DON-BSA)偶联物的制备：将DON溶解在吡啶中，在反应瓶中加入1一丁基硼酸；混合物在室温下搅拌过夜，产生7，15一氧一(丁基硼)-脱氧雪腐镰刀菌烯醇；再在其中加入琥珀酸酐，并通入氮气；密封反应瓶，混合物在沸水浴中搅拌90min，产生3一氧一半琥珀酰一7，15一氧一(丁基硼)一脱氧雪腐镰刀菌烯醇；将吡啶在室温吹干后，加入少量的水，然后将残余物溶解于5mL乙酸乙酯中，超声波处理10分钟后，6000rpm下离心30分钟，取上清液；将沉淀物用乙酸乙醋溶解，重复上述操作，合并上清液，将上清液减压浓缩后备用；取浓缩物与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、二环己基碳化二亚胺(DCC)溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温振荡10min，离心；将上清液缓慢滴加到牛血清白蛋白(溶于0.01M NaHCO3溶液中)，在2℃振荡2hr，然后，在0.2M PBS(pH 7)溶液中透析，换透析液8次；冷冻干燥，偶联物-20℃保存。上述反应成分的比例为：DON：1一丁基硼酸：琥珀酸酐＝10mg:30mg:2000mg，3一氧一半琥珀酰一7，15一氧一(丁基硼)一脱氧雪腐镰刀菌烯醇浓缩物：NHS：DCC：BSA＝10mg:1000mg:2000mg:6000mg；
呕吐毒素-卵清蛋白(DON-OVA)偶联物的制备：将DON溶解在吡啶中，在反应瓶中加入1一丁基硼酸，混合物在室温下搅拌过夜，产生7，15一氧一(丁基硼)-脱氧雪腐镰刀菌烯醇，再在其中加入琥珀酸酐，并通入氮气，密封反应瓶，混合物在沸水浴中搅拌120min，产生3一氧一半琥珀酰一7，15一氧一(丁基硼)一脱氧雪腐镰刀菌烯醇；将吡啶在室温吹干后，加入少量的水，然后将残余物溶解于乙酸乙酯中，超声波处理20分钟后，6000rpm下离心30分钟，取上清液；将沉淀物用乙酸乙醋溶解，重复上述操作，合并上清液，将上清液减压浓缩后备用；取浓缩物与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、二环己基碳化二亚胺(DCC)溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温振荡60min，离心，将上清液缓慢滴加到卵清蛋白(溶于0.01M NaHCO3溶液中)，在2℃振荡2hr，然后，在0.01MPBS(pH7)溶液中透析，换透析液3次；冷冻干燥，偶联物-40℃保存；上述反应成分的比例为：DON：1一丁基硼酸：琥珀酸酐＝1000mg:30mg:2000mg，3一氧一半琥珀酰一7，15一氧一(丁基硼)一脱氧雪腐镰刀菌烯醇浓缩物：NHS：DCC：OVA＝995mg:1000mg:2000mg:8000mg；
所述抗呕吐毒素(DON)单克隆抗体及其溶液的制备：取呕吐毒素-牛血清白蛋白(DON-BSA)偶联物用生理盐水配成0.1μg/μl抗原溶液，与等体积完全福氏佐剂混匀，充分乳化，供首次免疫用，加强免疫时用同量的不完全福氏佐剂代替完全福氏佐剂，首次免疫采用小鼠腹腔内直接注射，免疫剂量为100μg/只小鼠，以后每隔2周加强免疫一次，加强免疫采用尾静脉注射，免疫剂量10μg/只，最后一次免疫采用脾内注射，4天后取脾融合，将分离的免疫小鼠脾细胞与处于对数生长期的骨髓瘤细胞SP-2/o以10:1比例混合，离心，去除上清，在90S内将4.95ml50％聚乙二醇(分子量为1500)加至细胞中，充分混匀，使其融合，1min后加入10ml DMEM培养液，终止融合，水浴静止10min后离心，去除上清；将融合细胞用含17.5％小牛血清的HAT选择性培养基悬浮后，以最后浓度为1×104饲养细胞/0.1ml接种于以小鼠腹腔巨噬细胞作饲养层的96孔培养板中，于5％CO2，45℃条件下培养，5天后，每培养孔更换2/3HT培养液，10天后，开始对镜检有杂交瘤克隆生长的培养孔，取上清液进行筛选，对检测结果呈阳性的细胞立即用有限稀释法进行克隆，杂交瘤筛选采用固相抗原间接非竞争ELISA法进行，以呕吐毒素-卵清蛋白(DON-OVA)为包被抗原，以免疫小鼠的血清为阳性对照，以SP-2/o骨髓瘤细胞培养的上清液为阴性对照；阳性细胞孔的判定标准为(A试验-A空白)/(A对照-A空白)>2.1；对分泌阳性抗体的细胞进行克隆；采用有限稀释法，将阳性克隆细胞吹匀，取一微滴至培养瓶内，倒置显微镜下准确计数细胞个数，稀释为70个/ml，再取1ml稀释20倍，接种入96孔培养板中进行亚克隆，直至所有细胞孔的培养上清均呈阳性为止；对13周龄Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.3ml/只，10天后，腹腔注射培养至对数期的杂交瘤细胞，5×105细胞/只，5天后注意观察，收集腹水，离心去除沉淀，加甘油于-20℃保存；上述反应成分的比例为：DON-BSA：生理盐水＝1000μg：10ml；
所述完全福氏佐剂是由下列材料配比而成，液体石蜡:羊毛脂:卡介苗＝24g:40ml:0.05g；所述不完全福氏佐剂是由下列材料配比而成，液体石蜡:羊毛脂＝6g:25ml。
实施例3
所述包被板包被呕吐毒素固相抗原，其采用96或48或24孔微孔板，用55mmol/L pH9.5 Na2CO3-NaHCO3的缓冲液作为包被液，将呕吐毒素-卵清蛋白(DON-OVA)稀释至4.95μg/mL，96或48或24孔微孔板各孔加100μl，2℃放置过夜，弃去包被液，洗涤5次，按加入含3％牛血清白蛋白，pH8的磷酸盐缓冲液，5℃封闭过夜，弃去封闭液，吹干，板条密封后置-30℃冷冻保存；
所述呕吐毒素(DON)标准品从呕吐毒素(DON)纯品中稀释得到，稀释液为去离子水，DON浓度为：500ng/mL；
呕吐毒素-牛血清白蛋白(DON-BSA)偶联物的制备：将DON溶解在吡啶中，在反应瓶中加入1一丁基硼酸；混合物在室温下搅拌过夜，产生7，15一氧一(丁基硼)-脱氧雪腐镰刀菌烯醇；再在其中加入琥珀酸酐，并通入氮气；密封反应瓶，混合物在沸水浴中搅拌105min，产生3一氧一半琥珀酰一7，15一氧一(丁基硼)一脱氧雪腐镰刀菌烯醇；将吡啶在室温吹干后，加入少量的水，然后将残余物溶解于5ml乙酸乙酯中，超声波处理30分钟后，15000rpm下离心17.5分钟，取上清液；将沉淀物用乙酸乙醋溶解，重复上述操作，合并上清液，将上清液减压浓缩后备用；取浓缩物与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、二环己基碳化二亚胺(DCC)溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温振荡60min，离心；将上清液缓慢滴加到牛血清白蛋白(溶于0.095M NaHCO3溶液中)，在8℃振荡2.5hr，然后，在0.095M PBS(pH8)溶液中透析，换透析液6次；冷冻干燥，偶联物-40℃保存。上述反应成分的比例为：DON：1一丁基硼酸：琥珀酸酐＝495mg：4000mg：995mg，3一氧一半琥珀酰一7，15一氧一(丁基硼)一脱氧雪腐镰刀菌烯醇浓缩物：NHS：DCC：BSA＝995mg：3mg：5mg：10mg；
呕吐毒素-卵清蛋白(DON-OVA)偶联物的制备：将DON溶解在吡啶中，在反应瓶中加入1一丁基硼酸，混合物在室温下搅拌过夜，产生7，15一氧一(丁基硼)-脱氧雪腐镰刀菌烯醇，再在其中加入琥珀酸酐，并通入氮气，密封反应瓶，混合物在沸水浴中搅拌90min，产生3一氧一半琥珀酰一7，15一氧一(丁基硼)一脱氧雪腐镰刀菌烯醇；将吡啶在室温吹干后，加入少量的水，然后将残余物溶解于乙酸乙酯中，超声波处理10分钟后，10005rpm下离心17.5分钟，取上清液；将沉淀物用乙酸乙醋溶解，重复上述操作，合并上清液，将上清液减压浓缩后备用；取浓缩物与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、二环己基碳化二亚胺(DCC)溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温振荡10min，离心，将卵清蛋白OVA溶于0.095M NaHCO3溶液中，然后将上清液缓慢滴加到溶于NaHCO3溶液的卵清蛋白中，反应混合物在5℃振荡3hr，然后，在0.095M PBS(pH 8)溶液中透析，换透析液8次；冷冻干燥，偶联物-30℃保存。上述反应成分的比例为：DON：1一丁基硼酸：琥珀酸酐＝10mg：1985mg：10mg，3一氧一半琥珀酰一7，15一氧一(丁基硼)一脱氧雪腐镰刀菌烯醇浓缩物：NHS：DCC：OVA＝10mg：498.5mg：5mg：10mg；
所述抗呕吐毒素(DON)单克隆抗体及其溶液的制备：取呕吐毒素-牛血清白蛋白(DON-BSA)偶联物用生理盐水配成4.95μg/μl抗原溶液，与等体积完全福氏佐剂混匀，充分乳化，供首次免疫用，加强免疫时用同量的不完全福氏佐剂代替完全福氏佐剂，首次免疫采用小鼠腹腔内直接注射，免疫剂量为55μg/只小鼠，以后每隔3周加强免疫一次，加强免疫采用尾静脉注射，免疫剂量100μg/只，最后一次免疫采用脾内注射，4天后取脾融合，将分离的免疫小鼠脾细胞与处于对数生长期的骨髓瘤细胞SP-2/o以10:1比例混合，离心，去除上清，在70S内将10ml 50％聚乙二醇(分子量为1500)加至细胞中，充分混匀，使其融合，2min后加入30ml DMEM培养液，终止融合，水浴静止30min后离心，去除上清；将融合细胞用含5％小牛血清的HAT选择性培养基悬浮后，以最后浓度为1×105饲养细胞/0.1ml接种于以小鼠腹腔巨噬细胞作饲养层的96孔培养板中，于10％CO2，35℃条件下培养，8天后，每培养孔更换2/3HT培养液，15天后，开始对镜检有杂交瘤克隆生长的培养孔，取上清液进行筛选，对检测结果呈阳性的细胞立即用有限稀释法进行克隆，杂交瘤筛选采用固相抗原间接非竞争ELISA法进行，以呕吐毒素-卵清蛋白(DON-OVA)为包被抗原，以免疫小鼠的血清为阳性对照，以SP-2/o骨髓瘤细胞培养的上清液为阴性对照；阳性细胞孔的判定标准为(A试验-A空白)/(A对照-A空白)>2.1；对分泌阳性抗体的细胞进行克隆；采用有限稀释法，将阳性克隆细胞吹匀，取一微滴至培养瓶内，倒置显微镜下准确计数细胞个数，稀释为70个/ml，再取1ml稀释20倍，接种入96孔培养板中进行亚克隆，直至所有细胞孔的培养上清均呈阳性为止；对11.5周龄Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.4ml/只，9天后，腹腔注射培养至对数期的杂交瘤细胞，5×105细胞/只，5天后注意观察，收集腹水，离心去除沉淀，加甘油于-30℃保存；上述反应成分的比例为：DON-BSA：生理盐水＝495μg：0.1ml；
所述完全福氏佐剂是由下列材料配比而成，液体石蜡:羊毛脂:卡介苗＝15g:10ml:0.25g；所述不完全福氏佐剂是由下列材料配比而成，液体石蜡:羊毛脂＝15g:10ml；
酶标记的羊抗鼠抗体冻干品为辣根过氧化物酶-羊抗鼠抗体冻干品；所述洗涤液为含有吐温和NaN3的磷酸盐缓冲溶液；所述显色液A为含有过氧化氢的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液；所述显色液B为四甲基联苯二胺的乙醇溶液；所述终止液为硫酸溶液；
上述实施例中，所述PBS溶液为磷酸盐缓冲液。
下面结合实施例描述呕吐毒素的酶联免疫吸附检测专用测试盒的检测方法：
实施例1，取包被有DON-OVA的微孔包被板，加入50μL的DON标准品或处理好的样品到各自的微孔中，加100μL抗DON抗体，35℃孵育0.5h，洗涤液洗3次，加100μL辣根过氧化物酶(HRP)-羊抗鼠抗体，45℃孵育0.75h，用洗涤液洗3次，加100μL显色液A和100μL显色液B，暗处静置20min后加终止液，在450nm处测其吸光度值，从标准曲线计算样品中的DON含量。
实施例2，取包被有DON-OVA的微孔包被板，加入100μL的DON标准品或处理好的样品到各自的微孔中，加50μL抗DON抗体，45℃孵育1h，洗涤液洗5次，加50μL辣根过氧化物酶(HRP)-羊抗鼠抗体，35℃孵育0.5h，用洗涤液洗5次，加50μL显色液A和75μL显色液B，暗处静置10min后加终止液，在450nm处测其吸光度值，从标准曲线计算样品中的DON含量。
实施例3，取包被有DON-OVA的微孔包被板，加入75μL的DON标准品或处理好的样品到各自的微孔中，加75μL抗DON抗体，40℃孵育0.75h，洗涤液洗4次，加75μL辣根过氧化物酶(HRP)-羊抗鼠抗体，40℃孵育1h，用洗涤液洗4次，加75μL显色液A和50μL显色液B，暗处静置15min后加终止液，在450nm处测其吸光度值，从标准曲线计算样品中的DON含量。
Claims (10)
1、呕吐毒素的酶联免疫吸附检测专用测试盒，其包括洗涤液、显色液A、显色液B和终止液，其特征在于：其还包括包被有呕吐毒素固相抗原的包被板、呕吐毒素(DON)标准品、呕吐毒素(DON)单克隆抗体冻干品以及酶标记的羊抗鼠抗体冻干品。
2、呕吐毒素的酶联免疫吸附检测专用测试盒的制备，其特征在于：其包括以下步骤，包被板的制作、呕吐毒素DON标准品的制作、呕吐毒素-牛血清白蛋白DON-BSA偶联物的制备、呕吐毒素-卵清蛋白DON-OVA偶联物的制备、抗呕吐毒素DON单克隆抗体及其溶液的制备、完全福氏佐剂的制备、不完全福氏佐剂的制备、的酶标记的羊抗鼠抗体冻干品的制备；洗涤液的制备；显色液A的制备；显色液B的制备；终止液的制备。
3、根据权利要求2所述呕吐毒素的酶联免疫吸附检测专用测试盒的制备，其特征在于：所述包被板包被呕吐毒素固相抗原，其采用96或48或24孔微孔板，用10mmol/L～100mmol/L pH9～10Na2CO3-NaHCO3的缓冲液作为包被液，将呕吐毒素-卵清蛋白(DON-OVA)稀释至0.1μg/m L～1.0μg/m L，96或48或24孔微孔板各孔加100μl，2℃～8℃放置过夜，弃去包被液，洗涤2次～5次，按加入含1％～5％牛血清白蛋白(溶于pH7～8的磷酸盐缓冲液)，2℃～8℃封闭过夜，弃去封闭液，吹干，板条密封后置-20℃～-40℃冷冻保存。
4、根据权利要求2所述呕吐毒素的酶联免疫吸附检测专用测试盒的制备，其特征在于：所述呕吐毒素(DON)标准品从呕吐毒素(DON)纯品中稀释得到，稀释液为去离子水，DON浓度为：0.001ng/mL～1000ng/mL。
5、根据权利要求2所述呕吐毒素的酶联免疫吸附检测专用测试盒的制备，其特征在于：呕吐毒素-牛血清白蛋白(DON-BSA)偶联物的制备：将DON溶解在吡啶中，在反应瓶中加入1一丁基硼酸；混合物在室温下搅拌过夜，产生7，15一氧一(丁基硼)-脱氧雪腐镰刀菌烯醇；再在其中加入琥珀酸酐，并通入氮气；密封反应瓶，混合物在沸水浴中搅拌90分钟～120分钟，产生3一氧一半琥珀酰一7，15一氧一(丁基硼)一脱氧雪腐镰刀菌烯醇；将吡啶在室温吹干后，加入少量的水，然后将残余物溶解于5mL乙酸乙酯中，超声波处理10分钟～30分钟后，6000rpm～15000rpm下离心5分钟～30分钟，取上清液；将沉淀物用乙酸乙酯溶解，重复上述操作，合并上清液，将上清液减压浓缩后备用；取浓缩物与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、二环己基碳化二亚胺(DCC)溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温振荡10min～60min，离心；将上清液缓慢滴加到牛血清白蛋白(溶于0.01M～0.2M NaHCO3溶液中)，在2℃～8℃振荡2hr～3hr，然后，在0.01M～0.2M磷酸盐缓冲液(PBS溶液)(pH7～8)中透析，换透析液3次～8次；冷冻干燥，偶联物-20℃～-40℃保存；上述反应成分的比例为：DON：1一丁基硼酸：琥珀酸酐＝(10～1000)mg：(30～4000)mg：(10-2000)mg，3一氧一半琥珀酰一7，15一氧一(丁基硼)一脱氧雪腐镰刀菌烯醇浓缩物：NHS：DCC：BSA＝(10～2000)mg：(3～1000)mg：(5-2000)mg：(10-6000)mg。
6、根据权利要求2所述呕吐毒素的酶联免疫吸附检测专用测试盒的制备，其特征在于，呕吐毒素-卵清蛋白(DON-OVA)偶联物的制备：将DON溶解在吡啶中，在反应瓶中加入1一丁基硼酸，混合物在室温下搅拌过夜，产生7，15一氧一(丁基硼)-脱氧雪腐镰刀菌烯醇，再在其中加入琥珀酸酐，并通入氮气，密封反应瓶，混合物在沸水浴中搅拌90分钟～120分钟，产生3一氧一半琥珀酰一7，15一氧一(丁基硼)一脱氧雪腐镰刀菌烯醇；将吡啶在室温吹干后，加入少量的水，然后将残余物溶解于乙酸乙酯中，超声波处理10分钟～30分钟后，6000rpm～15000rpm下离心5分钟～30分钟，取上清液；将沉淀物用乙酸乙醋溶解，重复上述操作，合并上清液，将上清液减压浓缩后备用；取浓缩物与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、二环己基碳化二亚胺(DCC)溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温振荡10分钟～60分钟，离心，将上清液缓慢滴加到卵清蛋白(溶于0.01M～0.2M NaHCO3溶液中)，在2℃～8℃振荡2hr～3hr，然后，在0.01M～0.2M磷酸盐缓冲液(PBS溶液)(pH 7～8)中透析，换透析液3次～8次；冷冻干燥，偶联物-20℃～-40℃保存；上述反应成分的比例为：DON：1一丁基硼酸：琥珀酸酐＝(10～1000)mg：(30～4000)mg：(10-2000)mg，3一氧一半琥珀酰一7，15一氧一(丁基硼)一脱氧雪腐镰刀菌烯醇浓缩物：NHS：DCC：OVA＝(10～2000)mg：(3～1000)mg：(5-2000)mg：(10-8000)mg。
7、根据权利要求2所述呕吐毒素的酶联免疫吸附检测专用测试盒的制备，其特征在于：所述抗呕吐毒素(DON)单克隆抗体及其溶液的制备：取呕吐毒素-牛血清白蛋白(DON-BSA)偶联物用生理盐水配成0.1μg/μl～10μg/μl抗原溶液，与等体积完全福氏佐剂混匀，充分乳化，供首次免疫用，加强免疫时用同量的不完全福氏佐剂代替完全福氏佐剂，首次免疫采用小鼠腹腔内直接注射，免疫剂量为10μg/只～100μg/只小鼠，以后每隔2周～4周加强免疫一次，加强免疫采用尾静脉注射，免疫剂量10μg/只～100μg/只，最后一次免疫采用脾内注射，4天后取脾融合，将分离的免疫小鼠脾细胞与处于对数生长期的骨髓瘤细胞SP-2/o以10:1比例混合，离心，去除上清，在50S～90S内将0.1ml～10ml50％聚乙二醇(分子量为1500)加至细胞中，充分混匀，使其融合，1min～3min后加入10ml～50ml DMEM培养液，终止融合，水浴静止10min～30min后离心，去除上清；将融合细胞用含5％～30％小牛血清的HAT选择性培养基悬浮后，以最后浓度为1×104～1×106饲养细胞/0.1ml接种于以小鼠腹腔巨噬细胞作饲养层的96孔培养板中，于5％～10％CO2，35℃～45℃条件下培养，5天～10天后，每培养孔更换2/3HT培养液，10天～20天后，开始对镜检有杂交瘤克隆生长的培养孔，取上清液进行筛选，对检测结果呈阳性的细胞立即用有限稀释法进行克隆，杂交瘤筛选采用固相抗原间接非竞争ELISA法进行，以呕吐毒素-卵清蛋白(DON-OVA)为包被抗原，以免疫小鼠的血清为阳性对照，以SP-2/o骨髓瘤细胞培养的上清液为阴性对照；阳性细胞孔的判定标准为(A试验-A空白)/(A对照-A空白)>2.1；对分泌阳性抗体的细胞进行克隆；采用有限稀释法，将阳性克隆细胞吹匀，取一微滴至培养瓶内，倒置显微镜下准确计数细胞个数，稀释为70个/ml，再取1ml稀释20倍，接种入96孔培养板中进行亚克隆，直至所有细胞孔的培养上清均呈阳性为止；对10周龄～13周龄Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.3ml/只～0.5ml/只，8天～10天后，腹腔注射培养至对数期的杂交瘤细胞，5×105细胞/只，5天后注意观察，收集腹水，离心去除沉淀，加甘油于-20℃～-40℃保存；上述反应成分的比例为：DON-BSA：生理盐水＝(10～1000)μg：(0.1～10)ml。
8、根据权利要求2所述呕吐毒素的酶联免疫吸附检测专用测试盒的制备，其特征在于：所述完全福氏佐剂是由下列材料配比而成，液体石蜡：羊毛脂：卡介苗＝(6～24)g：(10～40)ml：(0.05～0.5)g；所述不完全福氏佐剂是由下列材料配比而成，液体石蜡：羊毛脂＝(6～24)g：(10～40)ml。
9、根据权利要求2所述呕吐毒素的酶联免疫吸附检测专用测试盒的制备，其特征在于：所述的酶标记的羊抗鼠抗体冻干品为辣根过氧化物酶-羊抗鼠抗体冻干品；所述洗涤液为含有吐温和NaN3的磷酸盐缓冲溶液；所述显色液A为含有过氧化氢的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液；所述显色液B为四甲基联苯二胺的乙醇溶液；所述终止液为硫酸溶液。
10、呕吐毒素的酶联免疫吸附检测专用测试盒的检测方法，其特征在于：取包被有DON-OVA的微孔包被板，加入50μL～100μL的DON标准品或处理好的样品到各自的微孔中，加50μL～100μL抗DON抗体，35℃～45℃孵育0.5h～1h，洗涤液洗3次～5次，加50μL～100μL辣根过氧化物酶(HRP)-羊抗鼠抗体，35℃～45℃孵育0.5h～1h，用洗涤液洗3次～5次，加50μL～100μL显色液A和50μL～100μL显色液B，暗处静置10分钟～20分钟后加终止液，在450nm处测其吸光度值，从标准曲线计算样品中的DON含量。
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| CN101413954B (zh) | 2013-07-17 |
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Owner name: XU JING Free format text: FORMER OWNER: ZHAO CHUNCHENG Effective date: 20131111 |
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