CN101158685A - 一种呕吐毒素半定量速测试剂条的制备与使用方法 - Google Patents

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孙秀兰
邵景东
张银志
王俊双
刘杰
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一种呕吐毒素半定量速测试剂条的制备与使用方法，属于生物技术领域。本发明涉及应用可特异性识别呕吐毒素的抗体来制备一种呕吐毒素半定量速测试剂条及其使用。其目的是为实现我国粮谷食品中呕吐毒素的快速检测开辟了广泛的应用前景。这种新型免疫速测产品的研制，不仅帮助解决因毒素标准品来源困难而影响检测这一难题，从而降低了检测成本；更为检测人员提供了安全检测的条件，具有简便、快速、灵敏度高、特异性好，安全、环保等优点。

Description

一种呕吐毒素半定量速测试剂条的制备与使用方法
技术领域
一种呕吐毒素半定量速测试剂条的制备与使用方法，属于生物技术领域。
背景技术
呕吐毒素(vomitoxin)又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol；缩写DON))，化学名称为3α，7α，15一三羟基草镰孢菌-9-烯-8-酮，属单端孢霉烯族化合物。在检测波长为220nm时有紫外吸收。DON主要由镰刀菌属Fusarium的几个种产生，尤其是禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)和黄色镰刀菌(Fusariumculmorum.)。其结构为四环的倍半萜，分子式为C15H20O6，分子量296.3。呕吐毒素的产毒菌株适宜在阴凉、潮湿的条件下生长。当谷物的水分含量为22％时，在很短时间内，谷物即产生大量的呕吐毒素。
人类和动物所消费的小麦、玉米、大麦等经常被呕吐毒素所污染。研究表明，在美国、德国、新西兰、保加利亚、匈牙利、俄国、中国、朝鲜以及阿根廷60％～100％的检测样品被DON污染，其含量竟高达44μg/g(是美国食品药品监督局制定人类可食量10μg/g的4倍)。在1991年，美国的一项研究显示50％的样品DON含量水平是19μg/g或是远远高于10μg/g。此外，呕吐毒素曾在加拿大和中国引发了两场较大的肠胃疾病风暴。
显而易见，DON也会存在于农业加工产品中，例如：面包、啤酒以及饲料等，而且这种真菌毒素也可能会引起工作环境污染的问题，在谷物的一些加工过程中(例如：研磨、焙烤、酿造)，呕吐毒素可能会漂浮于空气中，进入呼吸道危害工作人员的健康。
国际上对呕吐毒素的检测方法研究进展较快。采用薄层色谱法(TLC)和高效液相色谱法(HPLC)等检测方法；采用柱净化法结合电子捕获检测器的气相色谱法(GC/ECD)；高效液相结合质谱的方法(HPLC/MS)；放射性免疫测定法(RIA)；Casale等则提出了酶联免疫(ELISA)的检测方法。在国内，魏润蕴等先后报道了采用甲醇/水提取，以XAD-4柱净化，双向展开的薄层色谱检测方法及气相色谱法；郭玉凤等提出了使用PIB-CI衍生化的液相色谱检测方法；阳传和等报道了酶联免疫吸附的测定方法；张鹏等提出了采用免疫亲和柱(IAC)或多功能净化柱(MFC)净化结合高效液相色谱法。
金免疫层析技术(Gold immunochromatography assay，GICA)是一种将纳米金标记技术、免疫检测技术和层析分析技术等多种方法有机结合在一起的固相标记免疫检测技术。纳米金标记抗体的技术在临床检验上已得到广泛和成功的运用，如早早孕(HCG)检测试纸，乙肝表面抗原(HbsAg)检测试纸。而纳米金技术检测小分子化合物也有成功的产品，如吗啡纳米金检测试剂盒和瘦肉精纳米金检测试剂盒等。另外，国外已有关于呕吐毒素抗体(单抗或多抗)的制备的文献报道。国外已商品化的呕吐毒素ELISA kit所用的抗体为呕吐毒素单克隆抗体。
发明内容
本发明的目的是提供一种呕吐毒素半定量速测试剂条的制备与使用方法，其目的是为实现我国粮谷食品中呕吐毒素的快速检测开辟了广泛的应用前景。
本发明的技术方案：一种呕吐毒素半定量速测试剂条的制备方法，速测试剂条由样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和样品吸收垫四部分组成；样品垫和样品吸收垫为：吸水纸；金标垫为：用胶体金和呕吐毒素抗体结合制成金标抗体，结合过程为：将50mL浓度为1×10-4g/mL的氯金酸溶液加热到沸腾，然后迅速加入1.5mL柠檬酸三钠，继续加热搅拌反应15分钟得到胶体金溶液，然后将抗体溶液以1∶1体积比的比例逐滴加入到胶体金溶液中，边加边搅拌，反应5分钟后，即得到金标抗体溶液，将制备好的金标抗体调成A540＝1.0的浓度，分散在玻璃纤维滤膜上，自然干燥后即为金标垫备用；所用硝酸纤维素膜为：用自动点样仪对硝酸纤维素膜进行检测试剂线性包被，下端横线包被呕吐毒素抗原DON-O-BSA，浓度为1mg/mL为检测线，上端横线包被羊抗鼠IgG，浓度为2mg/mL为控制线，包被检测线和控制线后的硝酸纤维素膜自然干燥后用0.1mol/L的BSA的pH7.4的PBS溶液浸泡30min进行封闭处理，干燥后备用；将样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和样品吸收垫四部分依次相互叠加粘贴于试剂板上，以宽3.5mm/条切条后即为呕吐毒素半定量速测试剂条。
所制备的呕吐毒素半定量速测试剂条的应用方法：
(1)检测小麦，玉米或稻谷：
准确称取5g粉碎均匀的样品于三角瓶中，加入25mL体积浓度10％的甲醇水溶液作为提取液，振荡10min，以定性滤纸快速过滤，收集滤液，取滤液用试剂条进行检测分析；
或(2)检测啤酒、或麦芽汁：
取一定量的啤酒样品，搅拌，除去过量的CO2，直至不产生明显的气泡，静置后用试剂条进行检测分析；麦芽汁样品直接用试剂条进行检测分析；
或(3)检测面包、或蛋糕：
用粉碎机将样品粉碎，室温保存，称取20g粉碎试样，置于200mL具塞锥形瓶中，加入8mL水和100mL三氯甲烷-无水乙醇，三氯甲烷-无水乙醇的体积比为8∶2，密塞，在瓶塞上涂层水，盖严防漏，震荡1小时，通过折叠快速定性滤纸过滤，取25mL滤液于75mL玻璃蒸发皿中，置于90℃水浴上通风挥干，用50mL石油醚分次溶解蒸发皿中的残渣，洗入100mL分液漏斗中，再用20mL甲醇水，甲醇∶水体积比为8∶2，分次洗涤蒸发皿，转入同一分液漏斗中，振摇分液漏斗1.5分钟，静置15分钟后使分层，将下层甲醇水提取液进行样品检测。不要将两相交界面处的白色絮状物放入柱内。
本发明的有益效果：本发明涉及应用可特异性识别呕吐毒素的抗体来制备一种呕吐毒素半定量速测试剂条产品。通过将抗呕吐毒素抗原复合物、羊抗兔IgG以条带状分别包被于硝酸纤维素膜的检测区(T)和质控区(C)，用纳米金标记另一株抗体，并将其吸附于金标垫上，成功建立了快速、特异、灵敏的检测呕吐毒素抗原的纳米金免疫层析试纸条(GICA)。本发明为实现我国粮谷食品中呕吐毒素的快速检测开辟了广泛的应用前景。这种新型免疫速测产品的研制，不仅帮助解决因毒素标准品来源困难而影响检测这一难题，从而降低了检测成本；更为检测人员提供了安全检测的条件，具有简便、快速、灵敏度高、特异性好，安全、环保等优点。
附图说明
图1呕吐毒素半定量速测试剂条检测示意图，A阴性显示，B阳性显示。
图2呕吐毒素半定量速测试剂条检测结果(DONmg/L)。
具体实施方式
呕吐毒素半定量速测试剂条的制备如上述技术方案所述。
实施例1  小麦中呕吐毒素检测：
1)前处理：
准确称取5g粉碎均匀的样品于三角瓶中，加入25mL甲醇水(1+9)提取液，振荡10min。以定性滤纸快速过滤，收集滤液。取适量滤液进行检测分析。
2)呕吐毒素半定量速测试剂条产品的使用方法：
取样品滤液100μL缓慢滴加于试纸条的玻璃纤维膜上，15min后观察试纸条上检测线(T线)、质控线(C线)的显色情况。根据试纸条的检测原理来限量判定样品提取液中呕吐毒素的含量：若只有一条红色色带出现则判定样液为阳性(大于1μg/g)，呕吐毒素超标；若出现两条红色色带则判定样液为阴性(小于1μg/g)，呕吐毒素没有超标；若无色带出现则该试纸条失效。
3)检测结果：
T线红色色带消失，小麦样品中呕吐毒素含量大于1μg/g。
实施例2啤酒中呕吐毒素检测
1)前处理：
取10mL的啤酒样品，搅拌，除去过量的CO2(直接不产生明显的气泡)，静置后进行检测；
2)呕吐毒素半定量速测试剂条产品的使用方法：
取样品滤液100μL缓慢滴加于试纸条的玻璃纤维素膜上，15min后观察试纸条上检测线(T线)、质控线(C线)的显色情况。根据试纸条的检测原理来限量判定样品提取液中呕吐毒素的含量：若只有一条红色色带出现则判定样液为阳性(大于1μg/g)，呕吐毒素超标；若出现两条红色色带则判定样液为阴性(小于1μg/g)，呕吐毒素没有超标；若无色带出现则该试纸条失效。
3)检测结果：
T线红色色带消失，样品中呕吐毒素含量大于1μg/g。
实施例3饲料中呕吐毒素检测
1)前处理：
用粉碎机将样品粉碎，室温保存。称取20g粉碎试样，置于200mL具塞锥形瓶中，加入8mL水和100mL三氯甲烷-无水乙醇(8+2)，密塞。在瓶塞上涂层水，盖严防漏，震荡1小时，通过折叠快速定性滤纸过滤，取25mL滤液于75mL玻璃蒸发皿中，置于90℃水浴上通风挥干。
用50mL石油醚分次溶解蒸发皿中的残渣，洗入100mL分液漏斗中，再用20mL(玉米试样用30mL)甲醇水(8+2)分次洗涤蒸发皿，转入同一分液漏斗中。振摇分液漏斗1.5分钟，静置15分钟使分层后，将下层甲醇水作为样品待测。
2)呕吐毒素半定量速测试剂条产品的使用方法：
取样品滤液100μL缓慢滴加于试纸条的玻璃纤维素膜上，15min后观察试纸条上检测线(T线)、质控线(C线)的显色情况。根据试纸条的检测原理来限量判定样品提取液中呕吐毒素的含量：若只有一条红色色带出现则判定样液为阳性(大于1μg/g)，呕吐毒素超标；若出现两条红色色带则判定样液为阴性(小于1μg/g)，呕吐毒素没有超标；若无色带出现则该试纸条失效。
3)检测结果：
T线红色色带消失，样品中呕吐毒素含量大于1μg/g。

Claims (2)

1.一种呕吐毒素半定量速测试剂条的制备方法，其特征如下：
速测试剂条由样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和样品吸收垫四部分组成；样品垫和样品吸收垫为：吸水纸；金标垫为：用胶体金和呕吐毒素抗体结合制成金标抗体，结合过程为：将50mL浓度为1×10-4g/mL的氯金酸溶液加热到沸腾，然后迅速加入1.5mL柠檬酸三钠，继续加热搅拌反应15分钟得到胶体金溶液，然后将抗体溶液以1∶1体积比的比例逐滴加入到胶体金溶液中，边加边搅拌，反应5分钟后，即得到金标抗体溶液，将制备好的金标抗体调成A540＝1.0的浓度，分散在玻璃纤维滤膜上，自然干燥后即为金标垫备用；所用硝酸纤维素膜为：用自动点样仪对硝酸纤维素膜进行检测试剂线性包被，下端横线包被呕吐毒素抗原DON-O-BSA，浓度为1mg/mL为检测线，上端横线包被羊抗鼠IgG，浓度为2mg/mL为控制线，包被检测线和控制线后的硝酸纤维素膜自然干燥后用0.1mol/L的BSA的pH7.4的PBS溶液浸泡30min进行封闭处理，干燥后备用；将样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和样品吸收垫四部分依次相互叠加粘贴于试剂板上，以宽3.5mm/条切条后即为呕吐毒素半定量速测试剂条。
2.如权利要求1所述方法制备的呕吐毒素半定量速测试剂条的应用方法，其特征是：
(1)检测小麦，玉米或稻谷：
准确称取5g粉碎均匀的样品于三角瓶中，加入25mL体积浓度10％的甲醇水溶液作为提取液，振荡10min，以定性滤纸快速过滤，收集滤液，取滤液用试剂条进行检测分析；
或(2)检测啤酒、或麦芽汁：
取一定量的啤酒样品，搅拌，除去过量的CO2，直至不产生明显的气泡，静置后用试剂条进行检测分析；麦芽汁样品直接用试剂条进行检测分析；
或(3)检测面包、或蛋糕：
用粉碎机将样品粉碎，室温保存，称取20g粉碎试样，置于200mL具塞锥形瓶中，加入8mL水和100mL三氯甲烷-无水乙醇，三氯甲烷-无水乙醇的体积比为8∶2，密塞，在瓶塞上涂层水，盖严防漏，震荡1小时，通过折叠快速定性滤纸过滤，取25mL滤液于75mL玻璃蒸发皿中，置于90℃水浴上通风挥干，用50mL石油醚分次溶解蒸发皿中的残渣，洗入100mL分液漏斗中，再用20mL甲醇水，甲醇∶水体积比为8∶2，分次洗涤蒸发皿，转入同一分液漏斗中，振摇分液漏斗1.5分钟，静置15分钟后使分层，将下层甲醇水提取液进行样品检测。
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