CN102060924B - 针对脱氧雪腐镰刀菌烯醇的单域抗体 - Google Patents

Abstract

一种针对脱氧雪腐镰刀菌烯醇的单域抗体和多肽，其具有SEQ ID NO.：1所示的氨基酸序列的蛋白质或多肽，本发明所提供的氨基酸序列可以作为前体，通过随机或定点突变技术进行改造，能够获得性质(水溶性、稳定性、亲和力以及特异性等)更好的突变体，用来发展进一步用于医药、工业、农业的蛋白质或多肽。

Description

针对脱氧雪腐镰刀菌烯醇的单域抗体

技术领域

本发明涉及单域抗体技术(又称为纳米抗体技术)，以及基因工程抗体技术，特别是涉及针对脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)的单域抗体或多肽。

技术背景

单域抗体是指仅由普通抗体可变区(VH或VL)组成的基因工程抗体。单域重链抗体(又称为纳米抗体，VHH抗体，variable domain of heavy chain of heavy-chainantibody)是指仅由重链抗体(Heavy-chain antibodies)可变区(Variable region)组成的基因工程抗体，其中，重链抗体(Heavy-chain antibodies)是一种存在于骆驼、鲨鱼等动物中天然缺失轻链的抗体。单域抗体和单域重链抗体都具有分子量小、渗透性好等特点，目前已广泛用于基础研究、医学诊断和检测、抗体药物开发等领域。

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)，又名呕吐毒素(vomitoxin，VT)，属于单端孢霉烯族真菌毒素，主要是由某些镰刀菌产生。该毒素常出现于谷物及其加工产品中，许多国家和地区都检测到了DON的污染。DON会引起动物增重下降、食欲减退、营养吸收率降低，并影响免疫功能。大部分国家对食品、谷物、饲料中的DON含量都做了严格规定。

目前，已有针对DON的多克隆抗体、单克隆抗体的公开报道。与单域重链抗体相比，这些抗体存在生产成本相对较高，制备过程繁琐等缺点。单域抗体具备分子量小、渗透性好等性质，显示出广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供针对脱氧雪腐镰刀菌烯醇的单域抗体(包括含有所述单域抗体全部或部分功能区域的蛋白质或多肽)及其氨基酸序列，可以被用于制备检测或抑制DON污染的试剂和工具。

本发明提供一种针对脱氧雪腐镰刀菌烯醇的单域抗体，具有SEQ ID NO.：1所示的氨基酸序列，其氨基酸序列的IMGT编号和结构域的划分如图1所示。

本发明所提供的单域抗体包括4个框架区(Framework region，FR)和三个互补决定区(Complementarity-determining region，CDR)，其中，框架区(FR1-FR4)分别选自SEQ ID NO.：2，SEQ ID NO.：3，SEQ ID NO.：4和SEQ ID NO.：5，互补决定区(CDR1-CDR3)分别选自SEQ ID NO.：6，SEQ ID NO.：7和SEQ ID NO.：8。互补决定区主要负责抗原的识别，框架区结构相对稳定，主要起着支撑维持蛋白质结构的作用。

本发明提供一种蛋白质或多肽，其特征是包含SEQ ID NO.：2，SEQ ID NO.：3，SEQID NO.：4和SEQ ID NO.：5中的一个或者两个以上的氨基酸序列，且至少与一个氨基酸序列具有90％同源性。

本发明提供一种蛋白质或多肽，其特征是包含SEQ ID NO.：6，SEQ ID NO.：7和SEQ ID NO.：8中的一个或者两个以上的氨基酸序列，且至少与一个氨基酸序列具有80％同源性。

本发明还提供了一种核酸分子，其特征是编码SEQ ID NO.：1，SEQ ID NO.：2，SEQID NO.：3，SEQ ID NO.：4，SEQ ID NO.：5，SEQ ID NO.：6，SEQ ID NO.：7和SEQ IDNO.：8，通过遗传密码子可以随时获得该核酸分子的具体序列。

本发明所提供的核苷酸序列或至少部分序列可以通过合适的表达系统进行表达以得到相应的蛋白质或多肽。这些表达系统包括细菌，酵母菌，丝状真菌，动物细胞，昆虫细胞，植物细胞，或无细胞表达系统。

本发明还提供一种载体，包含所述核酸序列。由于遗传密码子具有简并性，该核酸序列可以根据不同的应用目的而不同。

本发明还提供一种宿主细胞，包含所述蛋白质或多肽的表达载体。

本发明还提供了一种净化或检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇的方法，其特征是含有上述蛋白质或多肽。基于本发明提供的蛋白质或多肽与脱氧雪腐镰刀菌烯醇特异性结合的能力，建立脱氧雪腐镰刀菌烯醇的净化或检测方法。其中，优选的方法包括酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，荧光免疫法(Fluoroimmunoassay，FIA)，免疫芯片法和亲和层析法。

本发明所提供的氨基酸序列可以作为前体，通过随机或定点突变技术进行改造，能够获得性质(水溶性、稳定性、亲和力以及特异性等)更好的突变体，用来发展进一步用于医药、工业、农业的蛋白质或多肽。例如将FR2中的V42、G49、P50和W52分别替换为F42、E49、R50和G52，可得到具有更好的溶解性和稳定性的重链抗体化突变体。

本发明中所叙述的一些术语具有如下含义：

同源性：描述两个或更多氨基酸序列的相似程度，第一个氨基酸序列和第二个氨基酸序列之间同源性的百分比可以通过【第一氨基酸序列中与第二氨基酸序列中相应位置处的氨基酸残基相同的氨基酸残基的数量】除以【第一个氨基酸序列中氨基酸总数】再乘以【100％】来计算，其中第二氨基酸序列中的某个氨基酸的缺失、插入、替换或添加(与第一氨基酸相比)被认为是有差别。备选地，同源性百分比也可以利用已知的用于序列匹配的计算机运算程序如NCBI Blast获得。

结构域：蛋白质三级结构的基本结构单位，通常具有一定的功能。

IMGT编号：IMGT数据库(The International ImMunoGeneTics Database)中的一种已经标准化的抗体氨基酸序列编号方法。具体编号方法可以参考文献(Ehrenmann，F.，Q.Kaas，et al.(2010).″IMGT/3Dstructure-DB and IMGT/DomainGapAlign：a databaseand a tool for immunoglobulins or antibodies，T cell receptors，MHC，IgSF and MhcSF.″Nucleic Acids Res 38(Database issue)：D301-307.Lefranc，M.P.，C.Pommie，et al.(2003).″IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Igsuperfamily V-like domains.″Dev Comp Immunol 27(1)：55-77.)中的描述。

密码子(codon)：又称为三联体密码(triplet code)，指对应于某种氨基酸的核苷酸三联体。在转译过程中决定该种氨基酸插入生长中多肽链的位置。

附图说明

图1氨基酸编号及结构域示意图。

图2间接phage-ELISA法测定噬菌体结合活性。纵坐标表示ELISA读数计测定450nm处吸光度值，横坐标表示按照表1加样，其中1表示实验组，2表示背景对照，3表示空白对照a，4表示空白对照b。

图3噬菌粒pHEN-DONIV2结构图。

图4表达质粒pRX3-DONIV2结构图。

图5亲和层析纯化单域抗体SDS-PAGE电泳图。泳道M为低分子量蛋白标准，泳道1为亲和层析纯化前细胞破碎上清，泳道2为亲和层析纯化后单域抗体DONIV2。

图6融合表达质粒pAP-DONIV2。

具体实施方式

下面通过单域抗体(多肽)的制备、分析以及应用，对本发明作进一步说明，这些具体实施例不应以任何方式被解释为限制本发明的应用范围。

应用实例1：

抗DON单域抗体的淘选与鉴定。

采用固相淘选的方法从驼源天然抗体噬菌体展示文库NA-PDL中淘选针对DON的单域抗体。参照文献(邓舜洲，游淑珠，许杨.脱氧雪腐镰刀菌烯醇人工抗原的研制[J].食品科学，2007，28(2)：149-152.)制备DON的人工抗原DON-MBSA，用PBS稀释DON-MBSA至50～100μg/mL，每孔加入100μL，4℃包被过夜，吸出包被液，PBS洗板3次，3％BSA-PBS在37℃封闭2h，PBS洗板3次，加入噬菌体抗体库100μL(约含2×10¹¹CFU)，37℃孵育1.5h，用PBST(含0.5％Tween-20)洗板3次(逐轮增加1次)，再用TBS洗板10次(逐轮增加5次)。以100μL洗脱液(甘氨酸-盐酸，pH 2.2)洗脱吸附在酶标孔中的噬菌体，用50μL Tris-HCl(1mol/L，pH 8.0)中和洗脱物，取10μL用于滴度测定，其余洗脱物扩增后用于下一轮淘选。

经四轮淘选后，采用辅助噬菌体KM13对随机挑取的单克隆进行救援，分别得到展示抗体可变区的噬菌体颗粒，再用间接ELISA法测定噬菌体颗粒的结合活性(图2)，实验设定阳性对照、阴性对照及背景对照，具体加样步骤见表1。

表1间接phage-ELISA加样表

将ELISA阳性克隆DONIV2送生物技术服务公司进行序列测定，得到插入片段的DNA序列如下：

＞DONIV2

CCATGGCCCAGTTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTGCAACCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCGGAAGCTCTGGCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGAAAGGGGCCCGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTAGTGGTGGTCGTAGGAGATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGCTGTATCTCCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCCTATATTACTGTGCGAGAGGTTCCCGGTCCAGAGTTACCTCGATTATTCCCGTCGACAAAGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGCGCACCACAGCGAAGACCCCGCGGCCGC

(下划线表示限制性内切酶识别位点)

应用实例2：

抗DON单域抗体在大肠杆菌中表达与纯化。

编码抗DON单域抗体的DNA片段的获取：1.采用限制性内切酶NcoI/NotI，双酶切噬菌粒pHEN-DONIV2(图3)，琼脂糖凝胶电泳回收抗DON单域抗体基因；2.直接将抗DON单域抗体编码序列送生物技术服务公司进行化学合成；3.设计特异性引物，通过PCR技术从羊驼(Lama pacos)来源的cDNA库中扩增。

将得到的抗DON单域抗体基因片段克隆至表达载体pRX3，经PCR和酶切鉴定，构建完成抗DON单域抗体的大肠杆菌表达质粒，命名为pRX3-DONIV2(图4)。

表达质粒pRX3-DONIV2转化至大肠杆菌BL21后，挑取单菌落进行诱导表达。将单菌落接入4mL LBA(Luria-Bertanibroth with 100μg/mL ampicillin)液体培养基中，37℃、250r/min振荡培养12h；以1％的接种量将其转接到50mL LBA液体培养基中，37℃、250r/min振荡培养至OD600达到0.5(约需2.5～3h)后，加入终浓度0.1mM的IPTG，30℃、200r/min诱导培养。

诱导培养物8000r/min离心，细胞沉淀加入20mL磷酸缓冲液(pH 7.4)混匀，8000r/min离心，去上清，保留细胞沉淀；细胞沉淀加入10mL相同缓冲液，混匀，冰上超声波细胞破碎处理，超声破碎条件为200W，破碎2s，间歇3s，共240个循环，在4℃下对细胞破碎物12000r/min离心20min，取上清进行亲和层析纯化和SDS-PAGE电泳分析(图5)，或加入终浓度30％的甘油，混匀，保存于-20℃冰柜待用。

通过优化诱导表达条件(如宿主菌、表达载体、诱导培养时间、温度以及IPTG浓度等)，可以进一步提高目的蛋白(单域抗体)表达量，为大量制备抗DON单域抗体提供了途径。

应用实例3：

抗DON单域抗体的融合表达。

将抗DON单域抗体基因克隆至融合表达载体pAP，经PCR和酶切鉴定，构建完成抗DON单域抗体的碱性磷酸酶融合表达质粒，命名为pAP-DONIV2(图6)。

碱性磷酸酶可以非特异性催化磷酸单酯水解生成无机磷酸和相应的醇、酚或糖类化合物。该酶常作为信号标签用于ELISA、免疫印迹、组织化学等检测方法。融合表达质粒pAP-DONIV2将抗DON单域抗体融合于碱性磷酸酶的N端，参考应用实例2中的表达方法，可以在大肠杆菌中表达、纯化出融合蛋白AP-DONIV2。

应用实例4：

基于抗DON单域抗体的DON检测方法。

基于间接竞争酶联免疫吸附试验的原理，建立检测DON的方法。人工抗原的制备，溶液的配置以及样品预处理参考文献(何庆华，许杨，刘仁荣，邓舜洲.脱氧雪腐镰刀菌烯醇ELISA定量检测试剂盒的研制[J].食品与发酵工业，2008，34(12)：160-162.)进行，融合蛋白AP-DONIV2的制备参照应用实例3，显色试剂为分析纯对硝基苯磷酸二钠(pNPP·2Na)。

检测步骤包括，(1)抗原包被：用10mM磷酸缓冲液(pH 7.4)将DON-MBSA人工抗原溶解后，100μL/孔，包被于酶标板，4℃过夜，含0.5％Tween-20(W/V)的磷酸缓冲液洗板4次，拍干板条，加入3％脱脂牛奶(W/V)，300μL/孔，37℃封闭2h。(2)竞争结合：磷酸缓冲液洗板4次后，按顺序依次加入0、50、100、200、400ng/mL浓度DON标准品及样品提取液50μL/孔，再加入50μL/孔融合蛋白AP-DONIV2，水平方向轻轻混匀，37℃温育30min。(3)取出温育后板条，磷酸缓冲液洗板4次，拍干，加入100μL/孔pNPP显色液，37℃避光显色5min。(4)加入50μL/孔终止液(2M H₂SO₄)，酶标仪读数。

Claims (6)

1.一种针对脱氧雪腐镰刀菌烯醇的单域抗体，其特征是为SEQ ID NO.：1所示的氨基酸序列，由4个框架区和3个互补决定区组成，其中，4个框架区分别由SEQ IDNO.：2，SEQ ID NO.：3，SEQ ID NO.：4和SEQ ID NO.：5组成，3个互补决定区分别由SEQ ID NO.：6，SEQ ID NO.：7和SEQ ID NO.：8组成。

2.权利要求1所述的单域抗体在食品、谷物、饲料中DON净化和检测中的应用。

3.权利要求1所述的单域抗体在制备检测或抑制食品、谷物、饲料中DON污染试剂中的应用。

4.一种编码权利要求1中所述单域抗体的核酸。

5.一种含有权利要求4所述核酸的载体。

6.一种含有权利要求4所述核酸的原核或真核宿主细胞。