CN101203532A - 抗念珠菌抗原的抗体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及域抗体，特别涉及识别念珠菌毒力特性的域抗体(dAb)，并提供针对念珠菌病的被动保护。

Description

抗念珠菌抗原的抗体

本发明涉及域抗体，特别涉及能识别念珠菌(Candida spp)毒力特性，并提供针对念珠菌病被动保护的域抗体。

在感染原新发和复发，杀菌剂耐药性威胁增加及缺乏新药和预防性疫苗的时代中，被动免疫，即抗体或抗原反应性抗体片段在治疗和预防中的应用，是一非常具有吸引力的控制感染性疾病的方法。在体弱宿主中，以被动免疫控制依靠免疫紊乱引发疾病的机会性感染原特别具有吸引力。免疫能力的缺失或降低使宿主不能与抗菌剂进行必要的联合行动，特别使得难于产生保护性疫苗。白色念珠菌(Candida albicans)就是这样一种机会感染原，用被动免疫的方法进行治疗似乎特别具有前途。在免疫受损宿主中，特别是AIDS患者和进行骨髓移植的嗜中性白血球减少症、血液病患者中，白色念珠菌为一主要的粘膜性和系统性致病原，它在阴道念珠菌病和其他皮肤粘膜病理学中也是主要的致病原。实际上，据估计，所有的正常育龄期妇女中，四分之三经历过至少一次急性阴道念珠菌病发作，而且，更重要的是，她们中的约5％在此后遭受慢性复发。慢性阴道念珠菌病采用抗真菌剂几乎是不可治愈的，越来越多的关注和临床证据表明，在反复治疗的情况下，念珠菌可能成为抗真菌剂难控制的细菌。

白色念珠菌(C.albicans)本质上为细胞外致病原，具有某些特定的毒力特性。实验性动物感染模型的研究证明，具有恰当的(right)特异性抗体及其同型都确能保护急性粘膜性和全身性的实验性感染。实验特别重点研究了真菌分泌型天冬氨酸蛋白酶(Sap)和公认的甘露糖蛋白粘附素(MP65)中一员的毒力特性，为利用特异性多克隆、单克隆抗体和肽片段治疗真菌建立了基础。

通过对免疫治疗人粘膜念珠菌的分析，产生人源化抗体或人抗体是其关键性问题。最近采用重组DNA技术使这一问题变得经济而可行。特别是，噬菌体表达库使得能够相对大量的和较容易标准化的选择和生产具有预先确定特异性的人单链可变区片段(scFv)或单域抗体(dAbs)。

先前已有制备治疗性抗念珠菌的scFv抗体的报道(Magliani，W.，et al.，1995 Nat.Biotechnol.15：155-158)。

但在该领域中，仍有选择可替代的有效治疗抗念珠菌(Candidaspp.)感染的念珠菌抗体的需求。

发明简述

本发明已生产了若干单域抗体(dAbs)，已表明它们可以有效治疗念珠菌感染，特别是治疗阴道念珠菌。已表明，这些单域抗体可结合和/或抑制某念珠菌(Candida spp.)毒力因子的功能活性。

因此，本发明一方面提供了单域抗体(dAb)，所述抗体能结合和/或抑制来自念珠菌(Candida spp.)的分泌型天冬氨酸蛋白酶(Sap)的功能活性。

根据本文描述的发明，本文提供的序列表中被命名为ADR4-X的氨基酸序列为Sap2结合的dAb的氨基酸序列。

根据本发明，可被1种或多种dAbs(dAbs)结合的分泌型天冬氨酸蛋白酶包括Sap1、Sap2、Sap3、Sap4、Sap5和Sap6、Sap7、Sap8、Sap9和Sap10分泌型天冬氨酸酶。在本发明以上方面优选的实施方案中，所述的dAb为Sap2结合的dAb(Sap2结合dAb)。

优选的是，dAb为Sap2结合的dAb，包括，优选组成为一个或多个本文提供的序列表中的序列，所述序列被命名为ADR4-2到ADR4-23，序列号分别为SEQ ID No 14到SEQ ID No 35。

在本发明以上方面最优选的实施方案中，所述的dAb为Sap2结合的dAb，包括，优选组成为一个或多个本文提供的序列表中的序列，所述序列被命名为ADR4-6，序列号为SEQ ID No 18，和ADR4-13，序列号为SEQ ID No 25。

有利的是，本发明的dAb结合本文的一个或多个SAPs，其K_off速率常数限定在5×10^-1～1×10^-7s^-1之间。

更为有利的是，本发明的dAb结合Sap2，解离常数(Kd)为至少100μM到1pM。

可用本发明的一种或多种dAb治疗任何种类的念珠菌感染。适合利用本发明的dAb治疗的念珠菌感染包括由下面酵母菌组成的组群中的任何一种：西弗念珠菌(Candida ciferrii)、无名念珠菌(Candidafamata)、郎比可念珠菌(Candida lambica)、解脂念珠菌(Candidalipolytica)、挪威念珠菌(Candida norvegensis)、皱落念珠菌(Candidarugosa)、维斯念珠菌(Candida viswanathii)、涎沫念珠菌(Candidazeylanoides)、白色念珠菌(Candida albicans)、热带念珠菌(Candidatropicalis)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、近平滑念珠菌(Candidaparapsilosis)、克鲁斯念珠菌(Candida krusei)、葡萄牙念珠菌(Candidalusitaniae)、克鲁斯念珠菌(Candida kefyr)，高里念珠菌(Candidaguilliermondii)和杜氏念珠菌(Candida dubliniensis)。

本发明可治疗的念珠菌感染优选组成为由下面酵母菌组成的组群中的任何一种：白色念珠菌(Candida albicans)，热带念珠菌(Candida tropicalis)，光滑念珠菌(Candida glabrata)，近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)，克鲁斯念珠菌(Candida krusei)，葡萄牙念珠菌(Candida lusitaniae)。

在本发明以上方面最优选的实施方案中，念珠菌种属为白色念珠菌(Candida albicans)。

本发明另一方面提供了一种能结合和/或抑制来自念珠菌的分泌型天冬氨酸蛋白酶(Sap)功能活性的单域抗体，该单域抗体与本文提供的一种或多种Sap dAb保持80％的同一性。

在本发明以上方面优选的实施方案中，dAb与本文提供的一种或多种Sap2 dAb具有82、84、86、88、90、92、94、96、98或99％的同一性。

在本发明以上方面优选的实施方案中，本发明的dAb能结合本文中的一种或多种Sap蛋白，K_off速率常数限定在5×10^-1和1×10^-7s^-1之间。

更为有利的是，本发明以上方面的优选实施方案的dAb能结合Sap2，解离常数(Kd)为至少100μM～1 pM，和/或K_off速率常数在5×10^-1～1×10^-7s^-1之间。

本发明另一方面，提供了单域抗体(dAb)，所述抗体能结合和/或抑制念珠菌(Candida spp.)甘露糖蛋白粘附素(MP)的功能活性。

根据本发明，被命名为ADR3-X的序列为甘露糖蛋白粘附素(MP)结合的dAbs(MP dAbs)的序列。

根据本发明以上方面，dAb最好为MP65结合的dAb，包括，优选组成为1个或多个本文提供序列表中的序列，所述序列被命名为ADR3-1、ADR3-2、ADR3-3、ADR3-4、ADR3-5、ADR3-6、ADR3-7、ADR3-8和ADR3-9，分别被表示为SEQ ID No 5到SEQ IDNo 13。

根据本发明以上方面，dAb最好为MP65结合的dAb，包括，优选组成为1个或多个本文提供序列表中的序列，所述序列被命名为ADR3-1、ADR3-2和ADR3-6，分别被表示为SEQ ID NO 5、6和10。

有利的是，本发明的dAb能与本文的一个或多个SAP结合，K_off速率常数限定在5×10^-1～1×10^-7s^-1之间，

更为有利的是，本发明的dAb能与MP65结合，解离常数(Kd)至少为100μM～1pM。

可用本发明的一种或多种dAb治疗任何种属的念珠菌感染，根据本发明治疗的念珠菌优选包括由下面酵母菌组成的组群中的任何一种：白色念珠菌(Candida albicans)、热带念珠菌(Candida tropicalis)，光滑念珠菌(Candida glabrata)、近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)、克鲁斯念珠菌(Candida krusei)和葡萄牙念珠菌(Candida lusitaniae)。在本发明上述方面最优选的实施方案中，念珠菌属为白色念珠菌。

本发明另一方面提供了能结合和/或抑制念珠菌甘露糖蛋白粘附素(MP)的单域抗体(dAb)，所述抗体与被鉴定为ADR3-1、ADR3-2和ADR3-6，并被分别命名为SEQ ID NOs5、6和10的抗体有80％的同一性。

在本发明以上方面优选的实施方案中，dAb与一种或多种被鉴定为ADR3-1、ADR3-2和ADR3-6，并被分别命名为SEQ ID NO 5、6和10的抗体有82、84、86、88、90、92、94、96、98或99％的同一性。

本发明还另一面提供了药用组合物，所述组合物包含一种或多种本发明的dAb和药学可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。

在本发明以上方面优选的实施方案中，所述的药用组合物包括，优选组成为MP65和Sap2结合的dAb。

在本发明以上方面可选择的实施方案中，所述的药用组合物包括，优选组成为一种或多种可抑制MP65和Sap2功能活性的dAb。

本发明另一方面提供了预防和/或治疗念珠菌感染的方法，所述方法通过给予需要这种治疗的患者一种或多种本发明的dAb或组合物。

本发明另一方面，提供了本发明的dAb用于预防和/或治疗念珠菌感染。

本发明另一方面提供了预防和/或治疗患者中唑类耐药的念珠菌感染的方法，所述方法通过给予需要这种治疗的患者SAP2和/或MP65 dAb，其中的念珠菌对由下面药物组成的组群中的一种或多种药物耐药：伊曲康唑、氟康唑和伏立康唑。

另一方面，本发明提供了治疗患者咪唑类耐药的念珠菌感染的方法，所述方法包括给予需要这种治疗的患者Sap2和/或MP65dAb，其中的念珠菌感染对下面药物组成的组群中的一种或多种药物耐药：克霉唑、益康唑、芬替康唑、硫康唑和噻康唑。

根据本发明以上方面，Sap2或MP65‘dAb’指本文描述的单域抗体，所述抗体能结合和/或抑制本文描述的Sap2和/或MP65功能活性。

根据本文描述的本发明的方法或药物，用本文描述的一种或多种dAbs/dAbs，优选治疗的念珠菌感染包括而不限于由下面酵母菌组成的组群中的任何一种引起的感染：白色念珠菌(Candida albicans)，热带念珠菌(Candida tropicalis)，光滑念珠菌(Candida glabrata)，近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)，克鲁斯念珠菌(Candida krusei)和葡萄牙念珠菌(Candida lusitaniae)。

本领域技术人员应了解念珠菌感染可以发生于全身、阴道、皮肤、口腔、粘膜、支气管和肺部。进一步讲，真菌感染可表现为甲癣(指甲感染)、口咽部念珠菌病、食道念珠菌病或外阴阴道炎。

在本发明优选的实施方案中，本发明的一种或多种dAbs/dAbs用于预防和/或治疗阴道或全身性念珠菌感染。

用本文描述的本发明的方法和药物，通过给予本发明的dAb/dAb有效治疗患者的念珠菌感染，结果使真菌感染加速清除；优选开始用dAb治疗后21-28天内治愈/解决。

本发明人认为用本发明的方法、dAb和组合物治疗念珠菌，可使注射位点或感染区全部(100％)的念珠菌清除。另外，本发明人认为感染区一些剩余的念珠菌可能对患者有益。在本发明以上方面优选的实施方案中，用本发明一种或多种dAb及其组合物治疗，会将念珠菌降低到共生水平(即正常健康个体中的水平)。

本发明人认为根据本发明的dAb和组合物特别适用于预防和/或治疗免疫受损的患者。

因此，本发明另一方面提供了本发明的dAb或组合物在制备药物中的应用，用于预防和/或治疗一种或多种免疫受损个体表现出的病症。

具有特别风险患念珠菌病的患者包括AIDS或HIV感染者。其它风险因子包括粒细胞减少、骨髓移植、化疗的类型/持续时间、移植物抗宿主病、化疗相关的粘膜炎症的程度、念珠菌定植、广谱抗生素的应用、血液透析和/或氮血(症)、中心血管插管、海洛因成瘾、严重疾病、营养过度、复发性或持续性胃肠道穿孔、手术前、实体器官移植和新生儿。

用本发明的一种或多种dAb治疗以上列出的患者组群中的一种或多种患者的念珠菌感染是本文考虑范围内的。

在本发明以上方面的实施方案中，免疫受损的患者正遭受由AIDs、HIV感染和酵母菌感染所组成的组群中的一种或多种疾病。

本发明dAb的给药方法在本发明详述中有详细描述。dAb优选局部和/或全身给药。在本发明以上方面优选实施方案中，包含dAb的药用组合物治疗念珠菌患者的给药方法包括在一段时间内连续输入，或单剂量或推注给药。另外，应注意的是，单剂量或推注给药后，可以再次进行推注或连续给药。

在本发明优选的实施方案中，dAb为人抗体可变域或包含人框架区(FWs)和一个或多个异种的CDR，所述CDR能特异性结合一个或多个本文描述的Sap和/或MP。CDR和框架区是具有免疫学重要性的蛋白序列的Kabat数据库所定义的免疫球蛋白可变域的那些区域。

优选的人框架区是由种系基因片段DP47和DPK9编码的。V_H或V_L域的FW1、FW2和FW3优选具有来自DP47和DPK9的FW1、FW2和FW3序列。人框架可任选包含突变，例如在本发明dAb中应用的人框架中总计达到约5个氨基酸或约10个氨基酸改变。

本发明进一步的方面提供了预防和/或治疗患者念珠菌全身性感染的方法，所述方法包括给予需要这种治疗的患者一种或多种：

(i)    结合Sap和/或MP蛋白的抗体；

(ii)   结合Sap和/或MP蛋白的抗体片段；

(iii)  结合Sap和/或MP蛋白的dAb。

本发明最后一方面提供了预防和/或治疗患者念珠菌全身性感染的方法，所述方法包括给予需要这种治疗的患者一种或多种：

(i)    抑制Sap和/或MP蛋白功能活性的抗体；

(ii)   抑制Sap和/或MP蛋白功能活性的抗体片段；

(iii)  抑制Sap和/或MP蛋白功能活性的dAb。

在本发明以上方面优选的实施方案中，抗体及其片段优选单特异性的，Sap优选Sap2，MP蛋白优选MP65。

本发明另一方面，dAb可以多种形式应用，其中dAb或直接或通过合适的接头(直接法例如在dAb之间形成化学键如酰胺键)或与接头结合或融合到一起。合适的接头是本技术领域所公知的，可以为简单的氨基酸链如Ala-Ala-Ala、Gly₄Ser，或其多倍形式，如(Gly₄Ser)₅，或基于化学的接头，如N-羟基琥珀酰亚胺或马来酰亚胺。

另外，多聚dAb抗体可以是同种的，即一种dAb，或异种的，即多于一种dAb，即所谓的异多聚体。

在优选的实施方案中，本发明的dAb可被制成二聚体形式，可以是同种的，即只有SAP dAb；或异种的，即SAP dAb和MPdAb。

本发明的另一方面涉及预防或治疗医疗器械的真菌感染或建群。例如，在疾病的治疗中，使用导管或插管如血管插管、中心静脉导管、导尿管、腹膜透析导管和透析插管，有真菌感染特别是酵母菌如念珠菌感染的风险。念珠菌可在医疗器械上产生生物膜，其通常对抗真菌药物高度耐药，经常被迫放弃该医疗器械。本发明的域抗体已证明能够除去或治疗塑料的真菌感染。

在本发明的另一方面，本发明的dAb结合Sap或MP，其中所述dAb具有的氨基酸序列与序列号分别为SEQ ID No 14到SEQ IDNo 35的ADR4-2、ADR4-3、ADR4-4、ADR4-5、ADR4-6、ADR4-7、ADR4-8、ADR4-9、ADR4-10、ADR4-11、ADR4-12、ADR4-13、ADR4-14、ADR4-15、ADR4-16、ADR4-17、ADR4-18、ADR4-19、ADR4-21、ADR4-22、ADR4-23，或序列号分别为SEQ ID NO5到SEQ ID No 13的ADR3-1、ADR3-2、ADR3-3、ADR3-4、ADR3-5、ADR3-6、ADR3-7、ADR3-8和ADR3-9的氨基酸序列相同，或与序列号分别为SEQ ID No 14到SEQ ID No 35的ADR4-2、ADR4-3、ADR4-4、ADR4-5、ADR4-6、ADR4-7、ADR4-8、ADR4-9、ADR4-10、ADR4-11、ADR4-12、ADR4-13、ADR4-14、ADR4-15、ADR4-16、ADR4-17、ADR4-18、ADR4-19、ADR4-21、ADR4-22、ADR4-23，或序列号分别为SEQ ID NO 5到SEQ ID No 13的ADR3-1、ADR3-2、ADR3-3、ADR3-4、ADR3-5、ADR3-6、ADR3-7、ADR3-8和ADR3-9的氨基酸序列的不同之处不超过25个氨基酸位置，并且其CDR1序列与序列号分别为SEQ ID No 14到SEQ IDNo 35的ADR4-2、ADR4-3、ADR4-4、ADR4-5、ADR4-6、ADR4-7、ADR4-8、ADR4-9、ADR4-10、ADR4-11、ADR4-12、ADR4-13、ADR4-14、ADR4-15、ADR4-16、ADR4-17、ADR4-18、ADR4-19、ADR4-21、ADR4-22、ADR4-23，或序列号分别为SEQ ID NO5到SEQ ID No 13的ADR3-1、ADR3-2、ADR3-3、ADR3-4、ADR3-5、ADR3-6、ADR3-7、ADR3-8和ADR3-9的CDR1序列有至少50％的同一性。

在本发明的另一方面，本发明的dAb结合Sap或MP，其中所述dAb具有的氨基酸序列与序列号分别为SEQ ID No 14到SEQ IDNo 35的ADR4-2、ADR4-3、ADR4-4、ADR4-5、ADR4-6、ADR4-7、ADR4-8、ADR4-9、ADR4-10、ADR4-11、ADR4-12、ADR4-13、ADR4-14、ADR4-15、ADR4-16、ADR4-17、ADR4-18、ADR4-19、ADR4-21、ADR4-22、ADR4-23，或序列号分别为SEQ ID NO5到SEQ ID No 13的ADR3-1、ADR3-2、ADR3-3、ADR3-4、ADR3-5、ADR3-6、ADR3-7、ADR3-8和ADR3-9的氨基酸序列相同，或与序列号分别为SEQ ID No 14到SEQ ID No 35的ADR4-2、ADR4-3、ADR4-4、ADR4-5、ADR4-6、ADR4-7、ADR4-8、ADR4-9、ADR4-10、ADR4-11、ADR4-12、ADR4-13、ADR4-14、ADR4-15、ADR4-16、ADR4-17、ADR4-18、ADR4-19、ADR4-21、ADR4-22、ADR4-23，或序列号分别为SEQ ID NO 5到SEQ ID No 13的ADR3-1、ADR3-2、ADR3-3、ADR3-4、ADR3-5、ADR3-6、ADR3-7、ADR3-8和ADR3-9的氨基酸序列的不同之处不超过25个氨基酸位置，并且其CDR2序列与序列号分别为SEQ ID No 14到SEQ IDNo 35的ADR4-2、ADR4-3、ADR4-4、ADR4-5、ADR4-6、ADR4-7、ADR4-8、ADR4-9、ADR4-10、ADR4-11、ADR4-12、ADR4-13、ADR4-14、ADR4-15、ADR4-16、ADR4-17、ADR4-18、ADR4-19、ADR4-21、ADR4-22、ADR4-23，或序列号分别为SEQ ID NO5到SEQ ID No 13的ADR3-1、ADR3-2、ADR3-3、ADR3-4、ADR3-5、ADR3-6、ADR3-7、ADR3-8和ADR3-9的CDR2序列有至少50％的同一性。

在本发明的另一方面，本发明的dAb结合Sap或MP，其中所述dAb具有的氨基酸序列与序列号分别为SEQ ID No 14到SEQ IDNo 35的ADR4-2、ADR4-3、ADR4-4、ADR4-5、ADR4-6、ADR4-7、ADR4-8、ADR4-9、ADR4-10、ADR4-11、ADR4-12、ADR4-13、ADR4-14、ADR4-15、ADR4-16、ADR4-17、ADR4-18、ADR4-19、ADR4-21、ADR4-22、ADR4-23，或序列号分别为SEQ ID NO5到SEQ ID No 13的ADR3-1、ADR3-2、ADR3-3、ADR3-4、ADR3-5、ADR3-6、ADR3-7、ADR3-8和ADR3-9的氨基酸序列相同，或与序列号分别为SEQ ID No 14到SEQ ID No 35的ADR4-2、ADR4-3、ADR4-4、ADR4-5、ADR4-6、ADR4-7、ADR4-8、ADR4-9、ADR4-10、ADR4-11、ADR4-12、ADR4-13、ADR4-14、ADR4-15、ADR4-16、ADR4-17、ADR4-18、ADR4-19、ADR4-21、ADR4-22、ADR4-23，或序列号分别为SEQ ID NO 5到SEQ ID No 13的ADR3-1、ADR3-2、ADR3-3、ADR3-4、ADR3-5、ADR3-6、ADR3-7、ADR3-8和ADR3-9的氨基酸序列的不同之处不超过25个氨基酸位置，并且其CDR3序列与序列号分别为SEQ ID No 14到SEQ IDNo 35的ADR4-2、ADR4-3、ADR4-4、ADR4-5、ADR4-6、ADR4-7、ADR4-8、ADR4-9、ADR4-10、ADR4-11、ADR4-12、ADR4-13、ADR4-14、ADR4-15、ADR4-16、ADR4-17、ADR4-18、ADR4-19、ADR4-21、ADR4-22、ADR4-23，或序列号分别为SEQ ID NO5到SEQ ID No 13的ADR3-1、ADR3-2、ADR3-3、ADR3-4、ADR3-5、ADR3-6、ADR3-7、ADR3-8和ADR3-9的CDR3序列有至少50％的同一性。

在本发明的另一方面，本发明的dAb结合Sap或MP，其中所述dAb具有的氨基酸序列与序列号分别为SEQ ID No 14到SEQ IDNo 35的ADR4-2、ADR4-3、ADR4-4、ADR4-5、ADR4-6、ADR4-7、ADR4-8、ADR4-9、ADR4-10、ADR4-11、ADR4-12、ADR4-13、ADR4-14、ADR4-15、ADR4-16、ADR4-17、ADR4-18、ADR4-19、ADR4-21、ADR4-22、ADR4-23，或序列号分别为SEQ ID NO5到SEQ ID No 13的ADR3-1、ADR3-2、ADR3-3、ADR3-4、ADR3-5、ADR3-6、ADR3-7、ADR3-8和ADR3-9的氨基酸序列相同，或与序列号分别为SEQ ID No 14到SEQ ID No 35的ADR4-2、ADR4-3、ADR4-4、ADR4-5、ADR4-6、ADR4-7、ADR4-8、ADR4-9、ADR4-10、ADR4-11、ADR4-12、ADR4-13、ADR4-14、ADR4-15、ADR4-16、ADR4-17、ADR4-18、ADR4-19、ADR4-21、ADR4-22、ADR4-23，或序列号分别为SEQ ID NO 5到SEQ ID No 13的ADR3-1、ADR3-2、ADR3-3、ADR3-4、ADR3-5、ADR3-6、ADR3-7、ADR3-8和ADR3-9的氨基酸序列的不同之处不超过25个氨基酸位置，并且其CDR1序列与序列号分别为SEQ ID No 14到SEQ IDNo 35的ADR4-2、ADR4-3、ADR4-4、ADR4-5、ADR4-6、ADR4-7、ADR4-8、ADR4-9、ADR4-10、ADR4-11、ADR4-12、ADR4-13、ADR4-14、ADR4-15、ADR4-16、ADR4-17、ADR4-18、ADR4-19、ADR4-21、ADR4-22、ADR4-23，或序列号分别为SEQ ID NO5到SEQ ID No 13的ADR3-1、ADR3-2、ADR3-3、ADR3-4、ADR3-5、ADR3-6、ADR3-7、ADR3-8和ADR3-9的CDR1序列有至少50％的同一性，且其CDR2序列与序列号分别为SEQ ID No 14到SEQ ID No 35的ADR4-2、ADR4-3、ADR4-4、ADR4-5、ADR4-6、ADR4-7、ADR4-8、ADR4-9、ADR4-10、ADR4-11、ADR4-12、ADR4-13、ADR4-14、ADR4-15、ADR4-16、ADR4-17、ADR4-18、ADR4-19、ADR4-21、ADR4-22、ADR4-23，或序列号分别为SEQID NO 5到SEQ ID No13的ADR3-1、ADR3-2、ADR3-3、ADR3-4、ADR3-5、ADR3-6、ADR3-7、ADR3-8和ADR3-9的CDR2序列有至少50％的同一性。

在本发明的另一方面，本发明的dAb结合Sap或MP，其中所述dAb具有的氨基酸序列与序列号分别为SEQ ID No 14到SEQ IDNo 35的ADR4-2、ADR4-3、ADR4-4、ADR4-5、ADR4-6、ADR4-7、ADR4-8、ADR4-9、ADR4-10、ADR4-11、ADR4-12、ADR4-13、ADR4-14、ADR4-15、ADR4-16、ADR4-17、ADR4-18、ADR4-19、ADR4-21、ADR4-22、ADR4-23，或序列号分别为SEQ ID NO5到SEQ ID No 13的ADR3-1、ADR3-2、ADR3-3、ADR3-4、ADR3-5、ADR3-6、ADR3-7、ADR3-8和ADR3-9的氨基酸序列相同，或与序列号分别为SEQ ID No 14到SEQ ID No 35的ADR4-2、ADR4-3、ADR4-4、ADR4-5、ADR4-6、ADR4-7、ADR4-8、ADR4-9、ADR4-10、ADR4-11、ADR4-12、ADR4-13、ADR4-14、ADR4-15、ADR4-16、ADR4-17、ADR4-18、ADR4-19、ADR4-21、ADR4-22、ADR4-23，或序列号分别为SEQ ID NO 5到SEQ ID No 13的ADR3-1、ADR3-2、ADR3-3、ADR3-4、ADR3-5、ADR3-6、ADR3-7、ADR3-8和ADR3-9的氨基酸序列的不同之处不超过25个氨基酸位置，并且其CDR2序列与序列号分别为SEQ ID No 14到SEQ IDNo 35的ADR4-2、ADR4-3、ADR4-4、ADR4-5、ADR4-6、ADR4-7、ADR4-8、ADR4-9、ADR4-10、ADR4-11、ADR4-12、ADR4-13、ADR4-14、ADR4-15、ADR4-16、ADR4-17、ADR4-18、ADR4-19、ADR4-21、ADR4-22、ADR4-23，或序列号分别为SEQ ID NO5到SEQ ID No 13的ADR3-1、ADR3-2、ADR3-3、ADR3-4、ADR3-5、ADR3-6、ADR3-7、ADR3-8和ADR3-9的CDR2序列有至少50％的同一性，且其CDR3序列与序列号分别为SEQ ID No 14到SEQ ID No 35的ADR4-2、ADR4-3、ADR4-4、ADR4-5、ADR4-6、ADR4-7、ADR4-8、ADR4-9、ADR4-10、ADR4-11、ADR4-12、ADR4-13、ADR4-14、ADR4-15、ADR4-16、ADR4-17、ADR4-18、ADR4-19、ADR4-21、ADR4-22、ADR4-23，或序列号分别为SEQID NO 5到SEQ ID No 13的ADR3-1、ADR3-2、ADR3-3、ADR3-4、ADR3-5、ADR3-6、ADR3-7、ADR3-8和ADR3-9的CDR3序列有至少50％的同一性。

在本发明的另一方面，本发明的dAb结合Sap或MP，其中所述dAb具有的氨基酸序列与序列号分别为SEQ ID No 14到SEQ IDNo 35的ADR4-2、ADR4-3、ADR4-4、ADR4-5、ADR4-6、ADR4-7、ADR4-8、ADR4-9、ADR4-10、ADR4-11、ADR4-12、ADR4-13、ADR4-14、ADR4-15、ADR4-16、ADR4-17、ADR4-18、ADR4-19、ADR4-21、ADR4-22、ADR4-23，或序列号分别为SEQ ID NO5到SEQ ID No 13的ADR3-1、ADR3-2、ADR3-3、ADR3-4、ADR3-5、ADR3-6、ADR3-7、ADR3-8和ADR3-9的氨基酸序列相同，或与序列号分别为SEQ ID No 14到SEQ ID No 35的ADR4-2、ADR4-3、ADR4-4、ADR4-5、ADR4-6、ADR4-7、ADR4-8、ADR4-9、ADR4-10、ADR4-11、ADR4-12、ADR4-13、ADR4-14、ADR4-15、ADR4-16、ADR4-17、ADR4-18、ADR4-19、ADR4-21、ADR4- 22、ADR4-23，或序列号分别为SEQ ID NO 5到SEQ ID No 13的ADR3-1、ADR3-2、ADR3-3、ADR3-4、ADR3-5、ADR3-6、ADR3-7、ADR3-8和ADR3-9的氨基酸序列的不同之处不超过25个氨基酸位置，并且其CDR1序列与序列号分别为SEQ ID No 14到SEQ IDNo 35的ADR4-2、ADR4-3、ADR4-4、ADR4-5、ADR4-6、ADR4-7、ADR4-8、ADR4-9、ADR4-10、ADR4-11、ADR4-12、ADR4-13、ADR4-14、ADR4-15、ADR4-16、ADR4-17、ADR4-18、ADR4-19、ADR4-21、ADR4-22、ADR4-23，或序列号分别为SEQ ID NO5到SEQ ID No 13的ADR3-1、ADR3-2、ADR3-3、ADR3-4、ADR3-5、ADR3-6、ADR3-7、ADR3-8和ADR3-9的CDR1序列有至少50％的同一性，且其CDR3序列与序列号分别为SEQ ID No 14到SEQ ID No 35的ADR4-2、ADR4-3、ADR4-4、ADR4-5、ADR4-6、ADR4-7、ADR4-8、ADR4-9、ADR4-10、ADR4-11、ADR4-12、ADR4-13、ADR4-14、ADR4-15、ADR4-16、ADR4-17、ADR4-18、ADR4-19、ADR4-21、ADR4-22、ADR4-23，或序列号分别为SEQID NO 5到SEQ ID No13的ADR3-1、ADR3-2、ADR3-3、ADR3-4、ADR3-5、ADR3-6、ADR3-7、ADR3-8和ADR3-9的CDR3序列有至少50％的同一性。

在本发明的另一方面，本发明的dAb结合Sap或MP，其中所述dAb具有的氨基酸序列与序列号分别为SEQ ID No 14到SEQ IDNo 35的ADR4-2、ADR4-3、ADR4-4、ADR4-5、ADR4-6、ADR4-7、ADR4-8、ADR4-9、ADR4-10、ADR4-11、ADR4-12、ADR4-13、ADR4-14、ADR4-15、ADR4-16、ADR4-17、ADR4-18、ADR4-19、ADR4-21、ADR4-22、ADR4-23，或序列号分别为SEQ ID NO5到SEQ ID No 13的ADR3-1、ADR3-2、ADR3-3、ADR3-4、ADR3-5、ADR3-6、ADR3-7、ADR3-8和ADR3-9的氨基酸序列相同，或与序列号分别为SEQ ID No 14到SEQ ID No 35的ADR4-2、ADR4-3、ADR4-4、ADR4-5、ADR4-6、ADR4-7、ADR4-8、ADR4-9、ADR4-10、ADR4-11、ADR4-12、ADR4-13、ADR4-14、ADR4-15、ADR4-16、ADR4-17、ADR4-18、ADR4-19、ADR4-21、ADR4-22、ADR4-23，或序列号分别为SEQ ID NO 5到SEQ ID No 13的ADR3-1、ADR3-2、ADR3-3、ADR3-4、ADR3-5、ADR3-6、ADR3-7、ADR3-8和ADR3-9的氨基酸序列的不同之处不超过25个氨基酸位置，并且其CDR1序列与序列号分别为SEQ ID No 14到SEQ IDNo 35的ADR4-2、ADR4-3、ADR4-4、ADR4-5、ADR4-6、ADR4-7、ADR4-8、ADR4-9、ADR4-10、ADR4-11、ADR4-12、ADR4-13、ADR4-14、ADR4-15、ADR4-16、ADR4-17、ADR4-18、ADR4-19、ADR4-21、ADR4-22、ADR4-23，或序列号分别为SEQ ID NO5到SEQ ID No 13的ADR3-1、ADR3-2、ADR3-3、ADR3-4、ADR3-5、ADR3-6、ADR3-7、ADR3-8和ADR3-9的CDR1序列有至少50％的同一性，并且其CDR2序列与序列号分别为SEQ ID No 14到SEQ ID No 35的ADR4-2、ADR4-3、ADR4-4、ADR4-5、ADR4-6、ADR4-7、ADR4-8、ADR4-9、ADR4-10、ADR4-11、ADR4-12、ADR4-13、ADR4-14、ADR4-15、ADR4-16、ADR4-17、ADR4-18、ADR4-19、ADR4-21、ADR4-22、ADR4-23，或序列号分别为SEQID NO 5到SEQ ID No 13的ADR3-1、ADR3-2、ADR3-3、ADR3-4、ADR3-5、ADR3-6、ADR3-7、ADR3-8和ADR3-9的CDR2序列有至少50％的同一性，且其CDR3序列与序列号分别为SEQ ID No14到SEQ ID No 35的ADR4-2、ADR4-3、ADR4-4、ADR4-5、ADR4-6、ADR4-7、ADR4-8、ADR4-9、ADR4-10、ADR4-11、ADR4-12、ADR4-13、ADR4-14、ADR4-15、ADR4-16、ADR4-17、ADR4-18、ADR4-19、ADR4-21、ADR4-22、ADR4-23，或序列号分别为SEQ ID NO 5到SEQ ID No 13的ADR3-1、ADR3-2、ADR3-3、ADR3-4、ADR3-5、ADR3-6、ADR3-7、ADR3-8和ADR3-9的CDR3序列有至少50％的同一性。

在本发明的另一方面，本发明的dAb结合Sap或MP，其中所述dAb具有的CDR1序列与序列号分别为SEQ ID No 14到SEQ IDNo 35的ADR4-2、ADR4-3、ADR4-4、ADR4-5、ADR4-6、ADR4-7、ADR4-8、ADR4-9、ADR4-10、ADR4-11、ADR4-12、ADR4-13、ADR4-14、ADR4-15、ADR4-16、ADR4-17、ADR4-18、ADR4-19、ADR4-21、ADR4-22、ADR4-23，或序列号分别为SEQ ID NO5到SEQ ID No 13的ADR3-1、ADR3-2、ADR3-3、ADR3-4、ADR3-5、ADR3-6、ADR3-7、ADR3-8和ADR3-9的CDR1序列有至少50％的同一性。

在本发明的另一方面，本发明的dAb结合Sap或MP，其中所述dAb具有的CDR2序列与序列号分别为SEQ ID No 14到SEQ IDNo 35的ADR4-2、ADR4-3、ADR4-4、ADR4-5、ADR4-6、ADR4-7、ADR4-8、ADR4-9、ADR4-10、ADR4-11、ADR4-12、ADR4-13、ADR4-14、ADR4-15、ADR4-16、ADR4-17、ADR4-18、ADR4-19、ADR4-21、ADR4-22、ADR4-23，或序列号分别为SEQ ID NO5到SEQ ID No 13的ADR3-1、ADR3-2、ADR3-3、ADR3-4、ADR3-5、ADR3-6、ADR3-7、ADR3-8和ADR3-9的CDR2序列有至少50％的同一性。

在本发明的另一方面，本发明的dAb结合Sap或MP，其中所述dAb具有的CDR3序列与序列号分别为SEQ ID No 14到SEQ IDNo 35的ADR4-2、ADR4-3、ADR4-4、ADR4-5、ADR4-6、ADR4-7、ADR4-8、ADR4-9、ADR4-10、ADR4-11、ADR4-12、ADR4-13、ADR4-14、ADR4-15、ADR4-16、ADR4-17、ADR4-18、ADR4-19、ADR4-21、ADR4-22、ADR4-23，或序列号分别为SEQ ID NO5到SEQ ID No 13的ADR3-1、ADR3-2、ADR3-3、ADR3-4、ADR3-5、ADR3-6、ADR3-7、ADR3-8和ADR3-9的CDR3序列有至少50％的同一性。

在本发明的另一方面，本发明的dAb结合Sap或MP，其中所述dAb具有CDR1序列和CDR2序列，CDR1序列与DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、DOM16-39-100(SEQID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、DOM16-39-109(SEQID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)的CDR1序列具有至少50％同一性；CDR2序列与DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、DOM16-39-100(SEQ  ID  NO：423)、DOM16-39-107(SEQ  IDNO：430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ IDNO：438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)的CDR2序列具有至少50％同一性。

在本发明的另一方面，本发明的dAb结合Sap或MP，其中所述dAb具有CDR2序列和CDR3序列，CDR2序列与DOM16-39(SEQID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、DOM16-39-100(SEQID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、DOM16-39-109(SEQID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)的CDR2序列具有至少50％同一性；CDR3序列与DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ IDNO：430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ IDNO：438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)的CDR3序列具有至少50％同一性。

在本发明的另一方面，本发明的dAb结合Sap或MP，其中所述dAb具有CDR1序列和CDR3序列，CDR1序列与DOM16-39(SEQID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、DOM16-39-100(SEQID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、DOM16-39-109(SEQID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)的CDR1序列具有至少50％同一性；CDR3序列与DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、DOM16-39-100(SEQ ID  NO：423)、DOM16-39-107(SEQ IDNO：430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ IDNO：438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)的CDR3序列具有至少50％同一性。

在本发明的另一方面，本发明的dAb结合Sap或MP，其中所述dAb具有CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列，CDR1序列与DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ IDNO：430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ IDNO：438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)的CDR1序列具有至少50％同一性；CDR2序列与DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)的CDR2序列具有至少50％同一性；CDR3序列与DOM16-39(SEQID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、DOM16-39-100(SEQID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、DOM16-39-109(SEQID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)的CDR3序列具有至少50％同一性。

在本发明的另一方面，本发明的dAb的血清半衰期可用半衰期延长部分来增加。在一个优选的实施方案中，半衰期延长部分为PEG。

附图简述

图1：用dAb阴道给药治疗大鼠白色念珠菌引起的阴道感染(空心三角形：ADR4-6+SA40；X：ADR3-2+SA40；实心正方形：SA40(对照)；实心圆形SA40+氟康唑；实心三角形：SA40+胃蛋白酶抑制剂)

图2：用抗SAP2dAbs ADR4-6(三角形)或ADR4-13(菱形)阴道给药治疗大鼠白色念珠菌引起的阴道感染。对照组为无关的dAbHel4(圆形)或仅用白色念珠菌攻击的未处理组(正方形)。

图3：用抗MP65域阴道给药治疗大鼠白色念珠菌引起的阴道感染。(实心三角形ADR3-1；圆形ADR3-2；空心三角形ADR3-6；菱形Hel4；实心正方形SA40(对照))

图4：用抗SAP2dAb治疗白色念珠菌氟康唑耐药株(AIDS 68)引起的阴道感染；菱形AIDS68+ADR4-6；三角形AIDS68+ADR4-13；正方形AIDS68；圆形AIDS68+氟康唑

图5：白色念珠菌攻击后(1，24，48Hrs)，dAb阴道给药治疗大鼠白色念珠菌引起的阴道感染(实心正方形：仅SA40真菌攻击；菱形：ADR4-6；空心正方形：ADR3-6 dAb；三角形：ADR4-6和ADR3-6 dAb；圆形：氟康唑)。

图6：用异二聚dAb治疗白色念珠菌感染(圆形ADR3-6/4-6；菱形ADR4-6/3-6；正方形SA40(对照)；正方形异二聚体dAb VH-VL(对照))。

定义

免疫球蛋白：是指保有抗体分子免疫球蛋白折叠特性的一族多肽，包括2个β片层，并且经常含有一保守的二硫键。免疫球蛋白超家族的成员参与体内细胞和非细胞相互作用的许多方面，包括在免疫系统中的普遍角色(例如，抗体、T-细胞受体分子等等)，参与细胞粘附(例如ICAM分子)和细胞间信号传导(例如受体分子，如PDGF受体)。本发明适应于所有拥有结合结构域的免疫球蛋白分子超家族。本发明优选涉及抗体。

结构域：结构域为独立于蛋白其余部分的、保持四级结构的折叠蛋白结构。一般而言，结构域担负着蛋白独立的功能特性。在很多情况下，结构域的增加，移除或转移到其他蛋白并不丢失剩余蛋白和/或结构域的功能。

本文中应用的术语“单抗体可变域”(dAb)是指包含抗体可变域序列特征的折叠多肽域。因此，它包括完整的抗体可变域和修饰的可变域，例如包括抗体可变域中的一个或几个“环”被另外的序列取代，或抗体可变域被截短或N-或C-末端延长，也包括至少部分保持全长域结合活性和特异性的可变域折叠片段。此外，术语dAb在其范围内还包括，一个或多个高可变区环和/或CDR被同源或异源的第二可变域序列取代的单抗体可变域。

库：术语“库”是指不同种类的多肽或核酸混合物。库由成员组成，每成员为单一的多肽或核酸序列。在该程度上，“库”与“repertoire”同义。库成员之间的序列不同是库存在多样性的原因。库可以是多肽或核酸简单混合物的形式，也可以是有机体或细胞的形式，例如，被核酸库转化的大肠杆菌、病毒、动物或植物细胞等等。优选的是，每一单独有机体或细胞只包含一个或有限数目的库成员。有利的是，核酸整合到表达载体中，以表达该核酸编码的多肽。因此，在优选的方面，库以有机体宿主群的形式存在，每一有机体含有一个或多个表达载体考批，所述表达载体含有以核酸形式存在的单一库成员，可以表达产生相应的多肽成员。因此，有机宿主群具有编码大容量库的遗传相异的多肽变体的潜能。

抗体包括抗体(如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE)或其片段(如Fab、F(ab’)₂、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、闭合结构的多特异性抗体、二硫键连接的scFv、微型双功能抗体、dAb)，不管它们来自任何天然产生抗体的种属，或利用重组DNA技术创造；还是分离自血清、B-细胞、杂交瘤、转染瘤，酵母菌或大肠杆菌。

抗原是指可被本发明配体结合的分子。通常而言，在体内抗原可以被抗体配体结合，并能够引发抗体反应。抗原可以为多肽、蛋白、核酸和其它分子。总之，本发明的dAbs被筛选出来以特异性的靶向特定抗原。根据传统抗体及其片段而言，由可变环(L1、L2、L3和H1、H2、H3)限定的抗体结合位点能与抗原结合。

抗原决定簇可被免疫球蛋白V_H/V_L对结合的结构单位。抗原决定簇定义了抗体的最小结合位点，因而代表了抗体特异性的靶点。就单域抗体而言，抗原决定簇代表了可被可变域独立结合的结构单位。

通用框架单抗体的框架序列对应于含有Kabat(“Sequences ofProteins of Immunological Interest”免疫学重要性的蛋白序列，USDepartment of Health and Human Services)所定义的保守序列的抗体域，或对应于Chothia and Lesk，(1987)J.Mol.Biol.196：910-917所定义的人种系免疫球蛋白库或结构。本发明提供了单个框架或一系列该框架的应用，表明这些框架可以衍生出事实上任何的结合特异性，尽管变异仅存于高变区。

基本一致：第一氨基酸或核苷酸序列包含数目足够多的与第二氨基酸或核苷酸序列相同的氨基酸残基或核苷酸，以使第一和第二氨基酸或核苷酸序列具有相似的活性。就抗体而言，与二抗具有同样的结合特异性，并且具有至少50％一致的亲和力。

全身性念珠菌病：本申请中，应用了术语“全身性念珠菌病”，但与术语“侵袭性念珠菌病”、“播散性念珠菌病”和“念珠菌败血症(hematogenous Candidiasis)”同义。

发明详述

除非另外定义，本文应用的所有技术和科学术语与所属领域技术人员所通常理解的意义一致(如，在细胞培养、分子遗传学、核酸化学、杂交技术和生物化学中)。在分子、遗传和生物学方法(通常见，Sambrook等的《分子克隆：实验室手册》，第二版，(1989)冷泉港实验室出版社，Cold Spring Harbor，N.Y.和Ausubel等的《精编分子生物学实验指南》(1999)，第四版，John Wiley & Sons，Inc，上述在此以参考文献形式插入)和化学方法中采用了标准技术。

(A)念珠菌(Candida spp.)感染

酵母菌感染通常由一种叫做白色念珠菌(Candida albicans)的真菌过度生长引起。发生于皮肤、指甲下或嘴、阴道和肺的粘膜。

阴道酵母菌感染是一种阴道炎，其症状特点是生殖器外部和内部瘙痒，这常与白带粘稠和/或凝乳状(像白软干酪)有关，严重感染可导致组织炎症发生，并导致发红、肿胀，甚至“针尖样出血(pinpoint bleeding)”。

任何种属的念珠菌感染可以用一种或多种本发明的dAbs治疗。根据本发明，可治疗的的念珠菌优选组成为由下面酵母菌组成的组群中的任何一种：白色念珠菌(Candida albicans)，热带念珠菌(Candidatropicalis)，光滑念珠菌(Candida glabrata)，近平滑念珠菌(Candidaparapsilosis)，克鲁斯念珠菌(Candida krusei)和葡萄牙念珠菌(Candidalusitaniae)。在本发明以上方面优选的实施方案中，念珠菌菌种属为白色念珠菌(Candida albicans)。

目前的治疗

可利用的治疗念珠菌引起的酵母菌感染的OTC药物包括克霉唑(Gyne-Lotrimin

，Mycelex)、咪康唑(Monistat

)和布康唑(butoconazole)(Femstat

)。处方药包括口服的氟康唑(Diflucan

)、制霉菌素(Mycostatin

)阴道片、特康唑(Terazol

)阴道霜剂和布康唑((Gynazole

)阴道霜剂。抗真菌霜剂也可以局部用于外阴部(外生殖器)以减轻瘙瘁。

阴道炎

阴道炎就是阴道发生炎症

阴道炎的通常的三个原因为激素失调，刺激和感染。感染性阴道炎在育龄妇女中最为常见，一般由三种类型的感染之一引起：细菌性阴道病(BV)，念珠菌感染引起的念珠菌病(例如白念珠菌感染)或滴虫病。

(B)与本发明dAbs结合的念珠菌毒力因子

本发明一方面提供了能结合和/或抑制源自念珠菌的分泌型天冬氨酸蛋白酶(Sap)功能活性的单域抗体(dAb)。

另一方面，本发明提供了能结合和/或抑制源自念珠菌的甘露糖蛋白粘附素(MP)功能活性的单域抗体(dAb)。

(Bi)念珠菌毒力因子

(i)SAPs.

由10个SAP基因家族编码的分泌型天冬氨酸蛋白酶(Sap)是念珠菌家族的致病性成员的主要毒力决定因素。研究最多的是白色念珠菌的Sap。白色念珠菌的所有的10个SAP基因编码较成熟蛋白长约60个氨基酸的酶原前体，该酶原前体在通过分泌通路时被加工。成熟的酶在35到50kDa，含有天冬氨酸蛋白酶特征的序列基序，包括两个保守的活性位点的天冬氨酸残基和用于保持三级结构的保守的丝氨酸残基。多数Sap蛋白含有公认的糖基化位点，目前，有人认为，白色念珠菌丝氨酸蛋白酶的主要作用是为细胞体提供营养，协助渗透和入侵，并规避免疫应答。(Naglik，J.，R.2003 Microbiologyand Molecular Biology Reviews，67.3.400-428).

(ii)甘露糖蛋白粘附素

致病性念珠菌属成功定殖和感染宿主组织取决于这些有机体粘附到黏膜表面的能力。不同种属粘附能力不同，其粘附能力与毒性之间有明确的关系。多数白色念珠菌致病性菌属粘附到上皮细胞的机制已有详细研究，认为涉及酵母菌表面特异性结合分子(粘附素)和上皮细胞表面互补受体分子之间的凝集素样相互作用。目前的信息表明，定位于酵母菌表面原纤维的甘露糖蛋白的蛋白部分，担当粘附素的角色，与上皮细胞上的糖苷受体相互作用。

(Bii)本发明Sap结合的dAb

可被本发明的一个或多个dAbs结合的分泌型天冬氨酸蛋白酶包括Sap1、Sap2、Sap3、Sap4、Sap5和Sap6、Sap8、Sap9和Sap10分泌型天冬氨酸蛋白酶。在本发明以上方面优选的实施方案中，所述的dAb为Sap2结合的dAb(Sap2结合的dAb)。所述的dAb优选为Sap2结合的dAb，包括，优选组成为一个或多个见于本文提供的序列表中的，名为ADR4-2而序列号为SEQ ID No 14直至ADR4-23和SEQ ID No 35的序列。根据本发明的描述，那些被命名为ADR4-X的氨基酸序列代表了Sap2的氨基酸序列。

优选的是，本发明的dAb能与本文的一个或多个SAPs结合，K_off速率常数限定在5×10^-1和1×10^-7s^-1之间，更为有利的是，本发明的dAb能与SAP2结合，解离常数(Kd)为至少100μM到1pM。

(Biii)本发明MP结合的dAb

根据本发明，本文提供的序列表中的被命名为ADR3-X的序列代表了结合dAbs(dAbs)的甘露糖蛋白粘附素的序列。

根据本发明，比较适合的是，所述的dAb为MP65结合dAb，包括，优选组成为一个或多个见于本文提供的序列表中的，被命名为ADR3-1、ADR3-2、ADR3-3、ADR3-4、ADR3-5、ADR3-6、ADR3-7、ADR3-8、ADR3-9，并分别被表示为SEQ ID No到SEQ IDNo 13的序列。

根据本发明以上方面，更为有利的是，所述的dAb为MP65结合的dAb，包括，优选组成为一个或多个见于本文提供的序列表中的，被命名为ADR3-1、ADR3-2和ADR3-6，并分别被表示为SEQID No 5、6和10的序列。

优选的是，本发明的dAb能与本文的一个或多个MPs结合，K_off速率常数限定在5×10^-1和1×10^-7s^-1之间，更为有利的是，本发明的dAb能与MP65结合，解离常数(Kd)为至少100μM到1pM。

本发明另一方面提供了单域抗体(dAb)，所述抗体可结合来自念珠菌的甘露糖蛋白粘附素和/或抑制其功能活性，所述抗体与被鉴定为ADR3-1、ADR3-2和ADR3-6，并分别被命名为SEQ ID NOs5、6和10的dAb具有80％的同一性。

在本发明以上方面优选的实施方案中，所述的dAb与被鉴定为ADR3-1、ADR3-2和ADR3-6，并分别被命名为SEQ ID NOs5、6和10的dAb具有82、84、86、88、90、92、94、96、98或99％的同一性。

氨基酸序列的同一性的计算

与本文公开序列相似或同源(例如，至少80％序列一致)的序列也被视同本发明的一部分。在一些实施方案中，氨基酸水平的序列同一性可以约为85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。在核酸水平，序列同一性可以约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。另外，在选择的杂交条件下(如，非常高严格度杂交条件)当核酸片段与其互补链杂交，说明基本的同一性是存在的。核酸可以全细胞，细胞裂解物，或部分纯化的或充分纯化的形式存在。

按照如下操作计算两个序列之间的“同源性”或“序列同一性”或“相似性”(本文中这些术语可以替代使用)。以最优化比较目的排列两条序列(如，可以在1条或第一条和第二条氨基酸或核酸序列中都引入gap以优化排列，考虑比较目的，非同源序列可以忽略不计)。在优化的实施方案中，用于比较目的的参考序列的长度至少为参考序列长度的30％，优选40％，甚至进一步优选60％，更进一步优选至少70％、80％、90％、100％。然后比较相应的氨基酸位或核苷酸位上的氨基酸或核苷酸。当第一条序列上的某一位置与第二序列上相应位置为同样的氨基酸残基或核苷酸(如本文应用的氨基酸或核酸“同源”等同于氨基酸或核酸“同一性”)。两条序列之间的同一性百分数为同一性位置的数目被序列除的函数，要考虑因最优化两序列排列而引入的gap的数目，每一gap的长度。

有利的是，采用BLAST算法(版本2.0)进行序列排列，参数设定为默认值。在美国国家生物技术信息中心(“.ncbi”)万维网(“www”)中“/Blast/”目录下，“blast_help.html”文件中有关于BLAST算法的详细描述。搜索参数定义如下，设置为默认参数比较有利。

BLAST(局部相似性基本查询工具，或者基本局部比对搜索工具)为运用blastp，blastn，blastx，tblastn和tblastx程序的启发式搜索算法；这五种程序是利用稍许改进的Karlin和Altschul，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(6)：2264-8(见如上描述的“blast_help.html”文件)统计学方法来描述检索结果的显著性。BLAST程序适合于序列相似性搜索，如对确定一检测序列的同族体。该程序一般不支持主题形式检索。如需讨论序列数据库相似性搜索的基本问题，参见seeAltschul et al.(1994)。

美国国家生物技术信息中心网址上提供的5个BLAST程序可完成如下任务。

blastp：将待查询的氨基酸序列与蛋白质序列数据库进行比较；

blastn：将待查询的核苷酸序列与核苷酸序列数据库进行比较；

blastx：将待查询的核苷酸序列(双链)六读码框概念翻译产物与蛋白质序列数据库进行比较；

tblastn：将寡核苷酸数据库中的序列自动翻译成按六读码框蛋白质序列(双链)，然后将待查询的蛋白质序列与其翻译结果进行比较；

tblastx：先将待查询的核苷酸序列和核苷酸序列数据库中的序列按六种可读框架翻译成蛋白质序列，然后对两种序列进行比较。

BLAST应用如下搜索参数

直方图(Histogram)：显示每次检索评分的直方图，默认值为yes(见BLAST手册中参数H)。

描述(Descriptions)：限定配对序列的简短描述的数目，默认值为100。(见BLAST手册中参数V)，还见期望值(EXPECT)和截断值(CUTOFF)。

对准(Alignments)：限定检出高积分片断配对(HSPs)的数据库序列的条数。默认值为50，如果较50更多的数据库序列满足报告的统计学显著性基线(见下面的期望值(EXPECT)和截断值(CUTOFF))，BLAST仅报告最具统计学显著性的配对序列(见BLAST手册中的参数B)。

期望值(Expect)：是指报告与数据库序列配对的统计学显著性基线；默认值为10，根据Karlin和Altschul(1990)的随机模型，就意味着期望仅随机发现10个配对。如果某一配对的统计显著性大于期望基线，该配对将不会被报告。期望值越低，限制越严格，甚至会导致无随机配对序列报告。小数值也是接受的(见BLAST中的E)

截断值(CUTOFF)：设定报告高积分片断配对(HSPs)的评分截断值。默认值根据期望值(EXPECT)(见上)计算。只有当数据库序列的HSP配对的统计显著性至少和具有与截断值相等的分数的单独HSP的统计显著性一样高时，该HSP将被报告。截断值越高，其限制就越严格，甚至会导致无随机配对序列报告(见BLAST手册中参数S)。通常而言，用期望值(Expect)可更直观的管理显著性基线。

矩阵(Matrix)：为BLAST、BLASTX、TBLASTN和TBLASTX程序指定一个可替代的评分矩阵。其默认矩阵为BLOSUM62(Henikoff & Henikoff，1992，Proc.Natl.Aacad.Sci.USA89(22)：10915-9)，有效的可替代的选择包括：PAM40、PAM120、PAM250和IDENTITY。没有针对BLASTN的可替代评分矩阵。如在BLASTN要求中指定矩阵将得到错误的回应。

链(Strand)：将BLASTN检索只限定在数据库序列链的首端或末端；或把BLASTN、BLASTX或TBLASTX检索只限定在查询序列链的首端或末端的阅读框。

过滤(Filter)：该程序可过滤查询序列中如SEG程序(Wootton &Federhen(1993)Computers and Chemistry 17：149-163)确定的组成低复杂片断，或如XNU程序(Claverie & States，1993，Computers andChemistry 17：191-201)确定的包含短周期内重复片断，或对BLASTN而言，利用Tatusov和Lipman(见NCBI网页)的DUST程序。过滤程序可以从blast输出结果中去除统计显著性但生物学无意义的报告(例如，碰到普通的酸性、碱性或脯氨酸等氨基酸丰富区的情况)，以留下查询序列中有更多生物学意义的区域与数据库序列进行特异性配对。

过滤程序发现的组成低复杂片断在核苷酸序列中用字母“N”代替(例如，“N”重复了13次)，在蛋白质序列中用字母“X”替代(例如，“X”重复了9次)

过滤程序仅适应于查询序列(或其翻译产物)，而不能过滤数据库序列。默认的过滤对BLASTN而言是DUST，对其它程序而言为SEG。

当应用到SWISS-PROT中的序列时，SEG、XNU或二个程序都什么也没有过滤，这并非不寻常。所以，过滤并不总期望得到效果。另外，在某些情况下，序列以整体被过滤，这提示，对比被过滤的查询序列，任何报告的配对的统计显著性值得怀疑。

NCBI-GI：使在输出结果中显示NCBI gi标识符，另外还有收录号和/或基因座名。

最优选的是，用上面描述的NCBI网页“/BLAST”目录提供的最简单的BLAST搜索运算法进行序列比对。

(C)制备本发明的dAbs

可采用先前已经建立的应用于抗体工程领域的，制备scFv，“噬菌体”抗体和其它工程抗体分子的技术制备本发明的dAbs。制备抗体的技术在随后的本文引用的综述和参考文献中以举例的方式进行了描述：Winter & Milstein，(1991)Nature 349：293-299；Plueckthun(1992)Immunological Reviews 130：151-188；Wright et al.，(1992)Crti.Rev.Immunol.12：125-168；Holliger，P.& Winter，G.(1993)Curr.Op.Biotechn.4，446-449；Carter，et al.(1995)J.Hematother.4，463-470；Chester，K.A.& Hawkins，R.E.(1995)Trends Biotechn.13，294-300；Hoogenboom，H.R.(1997)Nature Biotechnol.15，125-126；Fearon，D.(1997)Nature Biotechnol.15，618-619；Plückthun，A.&Pack，P.(1997)Immunotechnology 3，83-105；Carter，P.& Merchant，A.M.(1997)Curr.Opin.Biotechnol.8，449-454；Holliger，P.& Winter，G.(1997)Cancer Immunol.Immunother.45，128-130。

筛选可变域的技术采用了本领域公知的建库和筛选方法。天然库(Marks et al.(1991)J.Mol.Biol.，222：581；Vaughan et al.(1996)Nature Biotech.，14：309)采用了重排的收集自人B细胞的V基因，该技术为该领域技术人员所公知。通过应用PCR技术克隆免疫球蛋白V基因可制备合成库(Hoogenboom & Winter(1992)J.Mol.Biol.，227：381；Barbas et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4457；Nissim etal.(1994)EMBO J.，13：692；Griffiths et al.(1994)EMBO J.，13：3245；De Kruif et al.(1995)J.Mol.Biol.，248：97)，PCR程序的错误可导致高度的随机性，可分别选择针对靶抗原或表位的V_H和/或V_L。

库载体系统

有多种本领域公知的筛选系统适合用于本发明。将在下面中描述这种筛选系统的例子。

噬菌体λ表达系统可根据噬菌斑或溶原性细菌的克隆进行筛选，这两种方法先前都曾被描述过(Huse et al.(1989)Science，246：1275；Caton and Koprowski(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，87；Mullinax etal.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，87：8095；Persson etal.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，88：2432)，并应用于本发明中。然而，该表达系统可用于筛选10⁶个不同库成员，但并不适合筛选更多的库成员(大于10⁶个成员)。

噬菌体表面展示筛选系统在库构建中特别有用，可使得核酸与其表达的多肽联系起来。如本文中所应用的，筛选系统通过合适的展示手段，通过结合某类的和/或靶配体，使得能够筛选独特的库成员。

大容量库中目的成员的筛选方法为该领域所公知，以噬菌体展示技术为典型代表。该系统中，不同的肽序列被展示在丝状噬菌体表面(Scott and Smith(1990)Science，249；386)，已证明该系统可用于建立抗体片段库(和编码这些片段的核苷酸序列库)，以体外筛选和扩增特定的结合靶抗原的抗体片段(McCafferty et al.，WO92/01047)。

将编码V_H和V_L区的核苷酸序列连接到编码前导信号肽的基因片段上，后者可以将前者引导到大肠杆菌的细胞周质间隙，结果得到的抗体片段展示在噬菌体的表面，通常为与噬菌体外壳蛋白(例如，pIII或pVIII)融合的形式。另外，抗体片段也可以展示在噬菌体λ衣壳外表上(phagebodies)。基于噬菌体的展示系统的优点是，因为它们都是生物系统，筛选的库成员可以简单地在大肠杆菌中通过培养含有所选库成员的噬菌体得以扩增。进一步讲，因为编码多肽库成员的核苷酸序列包含在噬菌体或噬菌粒载体中，测序，表达和随后的遗传操作都相对简单。

构建噬菌体抗体展示库和λ噬菌体表达库的方法在该技术领域是公知的(McCafferty et al.(1990)Nature，348：552；Kang et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，88：4363；Clackson et al.(1991)Nature，352：624；Lowman et al.(1991)Biochemistry，30：10832；Burton et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.，88：10134；Hoogenboom et al.(1991)Nucleic Acids Res.，19：4133；Chang et al.(1991)J.Immunol.，147：3610；Breitling et al.(1991)Gene，104：147；Marks et al.(1991)supra；Barbaset al.(1992)supra；Hawkins and Winter(1992)J.Immunol.，22：867；Marks et al.，1992，J.Biol.Chem.，267：16007；Lerner et al.(1992)Science，258：1313，在此以参考文献形式插入)。

一种特别有利的方法是应用噬菌体库技术(Huston et al.，1988，Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.，85：5879-5883；Chaudhary et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.，87：1066-1070；McCafferty et al.(1990)supra；Clackson et al.(1991)Nature，352：624；Marks et al.(1991)J.Mol.Biol.，222：581；Chiswell et al.(1992)Trends Biotech.，10：80；Marks etal.(1992)J.Biol.Chem.，267)。各种表达在噬菌体外壳蛋白上的scFv库的实施方案已有描述。更为详尽的噬菌体展示方法也已知晓，如见于WO96/06213和WO92/01047(Medical Research Council et al.)和WO97/08320(Morphosys)中的有关描述，在此处以参考文献形式插入。

其它用于建立多肽库的系统，包括应用非细胞酶机制体外合成库成员。在一种方法中，通过交替轮换针对靶配体筛选和PCR扩增，筛选得到RNA分子(Tuerk and Gold(1990)Science，249：505；Ellington and Szostak(1990)Nature，346：818)。相似的技术也被用于鉴定与规定的人转录因子结合的DNA序列(Thiesen and Bach(1990)Nucleic Acids Res.，18：3203；Beaudry and Joyce(1992)Science，257：635；WO92/05258 and WO92/14843)。在一相近的技术中，体外翻译的方法被用于合成多肽，做为建立大容量库的方法。这些方法一般包括稳定的多核糖体复合物，在WO88/08453、WO90/05785、WO90/07003、WO91/02076、WO91/05058和WO92/02536中有进一步描述。可选择的非基于噬菌体的展示系统，如在专利WO95/22625和WO95/11922(Affymax)中所公开的，采用多核糖体展示多肽以进行筛选。

另外，更深层次的筛选技术涉及在人工小室中库的筛选，该方法将基因及其产物联系起来。例如，在水包油乳浊液形成的微囊中筛选编码目的基因产物的核酸，这种方法在WO99/02671、WO00/40712和Tawfik & Griffiths(1998)Nature Biotechnol 16(7)，652-6中有详细描述。将编码具有预期活性基因产物的遗传元素间隔分入微囊中，并在微囊内转录和/或翻译产生其各自的基因产物(RNA或蛋白质)。由此使产生具有预期活性基因产物的遗传元素得以分类。该方法通过各种手段检测预期活性可以筛选感兴趣的基因产物。

库的构建

可采用本领域所公知的技术，例如上述提出的方法，建立用于筛选的库，或从商业来源购买。可用于本发明的库已有描述，如在WO99/20749中。一旦选择了某种载体系统，可如上所描述，将一个或多个编码感兴趣多肽的核酸序列克隆入载体库中，可以在表达前进行突变，以使克隆分子产生多样性；另外，也可在突变前和进行其它轮次筛选前，如上所描述对编码蛋白进行表达和筛选。可采用标准的分子学方法对编码结构优化多肽的核酸序列进行突变，特别是运用多聚酶链反应，或PCR(Mullis and Faloona(1987)MethodsEnzymol.，155：335，在此以参考文献的形式插入)。PCR采用热稳定的，DNA依赖的DNA聚合酶催化多循环DNA复制，以扩增感兴趣的目的序列，这是该领域所公知的的技术。在Winter等(1994)Ann.Rev.Immunology 12，433-55中讨论了各种抗体库的构建，并附有参考文献。

PCR的进行需要模板DNA(至少1fg；更通常为1-1000ng)和至少25pmol寡核苷酸引物；当引物池严重相异时，最好应用更大量的引物，因为每一条序列仅仅由一小部分引物池分子扩增，在后面的扩增循环中，引物量便受到限制。典型的反应混合物包括：2μlDNA，25pmol寡核苷酸引物，2.5μl 10X PCR缓冲液1(Perkin-Elmer，Foster City，CA)，0.4μl 1.25μM dNTP，0.15μl(或2.5单位)Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer，Foster City，CA)，加去离子水至总体积25μl。覆盖以矿物油，用可编程的热循环仪进行PCR。PCR循环每步骤的时程和温度，还有循环数需要根据实践中的严格要求进行调整。退火温度和时间根据引物与模板的退火效率和可以容忍的错配率决定。很明显，当核酸分子被同时扩增和突变时，错配是需要的，至少在第一个合成周期中。优化引物退火条件的是本领域技术人员能力范围之内的。退火温度通常采用30℃和72℃之间。模板分子的起始变性温度一般是92℃到99℃，4min，然后是20-40个循环，包括变性(94-99℃15s到1min)，退火(根据上述讨论确定温度，1-2min)和延伸(72℃，1-5min，取决于扩增产物的长度)。最后延伸一般采用72℃4min，然后是无限制的步骤4℃0-24h。

I.主链构象的筛选

免疫球蛋白超家族成员都具有相似的多肽链折叠模式。例如，尽管抗体就其一级序列而言高度保守，比较其序列和晶体结构表明，与预期相反，抗体中6个抗原结合环中的5个(H1、H2、L1、L2、L3)采用了有限数目的主链构象或正则结构(Chothia and Lesk(1987)J.Mol.Biol.，196：901；Chothia et al.(1989)Nature，342：877)。因此，对环长度和主要残基的分析能够预测见于大多数人抗体中的H1、H2、L1、L2和L3的主链构象(Chothia et al.(1992)J.Mol.Biol.，227：799；Tomlinson et al.(1995)EMBO J.，14：4628；Williams et al.(1996)J.Mol.Biol.，264：220)。尽管，H3区就其序列、长度和结构而言，更具多样性(因为D片段的应用)，但因H3区环长度较短，也形成了有限数目的主链构象，这取决于其长度和环及抗体框架上关键位置存在的特定残基或残基的种类(Martin et al.(1996)J.Mol.Biol.，263：800；Shirai et al.(1996)FEBS Letters，399：1)。

本发明的dAb本身可以库的形式提供。本发明一方面，设计了dAb和/或域库，其中选择了某个环长度和关键残基以确保成员的主链构象是已知的。如上述讨论，比较适合的是，这些构象是见于自然界的免疫球蛋白超家族分子的真正的构象，以减小这些构象是无功能构象的几率。种系V基因片段担当着构建抗体或T细胞受体库合适的基本框架的角色；其它序列也可以应用。控制变异在较低频率发生，以使小部分功能成员拥有改变的主链构象，但并不影响其功能。

正则结构理论也被用于评定由配体编码的不同主链构象的数目，以根据配体的序列预测主链构象，并选择残基以多样化而不影响正则结构。众所周知，在人V_κ域，L1环可形成4个正则结构中的一个，L2环具有1个单独的正则结构，90％的人V_κ域可形成L3环的4个或5个正则结构中的一个(Tomlinson et al.(1995)supra)；

因此，仅在V_κ域，不同的正则结构可以联合形成一系列不同的主链构象。假设V_λ域可以为L1、L2和L3环编码一系列不同的正则构象，并且V_κ和V_λ域可与为H1和H2环编码几种正则结构的任何V_H域配对，可观察到的正则构象的组合的数目是巨大的。这提示，主链构象多样性的产生是生产广泛结合特异性所必需的。但，通过基于单个已知的主链构象构建抗体库，发现，与预期相反，主链构象的多样性并非是产生足够多样性以靶向基本上所有抗原所必需的。更出人意料的是，该单个主链构象并不需要是共有结构——单个的自然产生的构象可以作为整个库的基础。所以，在优选的方面，本发明的dAb具有单个已知的主链构象。

选择的单个主链构象优选所讨论的免疫球蛋白超家族分子中的普通构象。绝大数天然产生分子中具有的构象即为普通构象。因此，本发明优选的方面，分别考虑免疫球蛋白域每个结合环的不同主链构象的天然发生率，然后选择具有期望的不同环主链构象组合的天然产生的可变域。如果没有可以选择的，可以选择最相近的。优选的是，期望的不同环主链构象的组合是通过选择编码期望主链构象的种系基因片段创造的。更为优选的是，选择的种系基因片段在自然中被经常表达，最为优选的是，选择的种系基因片段是所有天然种系基因片段中表达最经常的。

在设计dAb或其库中，可以分别考虑6个抗原结合环中每个环的不同主链构象的发生率。对H1、H2、L1、L2和L3，选择20-100％天然产生分子的抗原结合环具有的特定构象。典型的，其观察的发生率高于35％(即在35％和100％之间)，理想的大于50％，甚至大于65％。因为大多数H3环不具有正则结构，优选的是选择能显示正则构象的环中的普通的主链构象。对每个环而言，因此选择在天然库中发现最多的构象。在人抗体中，每个环最通用的正则构象(CS)如下：H1-CS1(表达库中的79％)，H2-CS 3(46％)，V_κ的L1-CS2(39％)，L2-CS 1(100％)，V_κ的L3-CS1(36％)(计算假设的κ∶λ比率为70∶30，Hood et al.(1967)Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.，48：133)。对具有正则结构的H3环而言，具有7个残基的CDR3长度(Kabat et al.(1991)Sequences of proteins of immunological interest，U.S.Department of Health and Human Services)，从残基94到101有盐桥，似乎是最共同的结构。在EMBL数据库中，至少有16个人抗体序列具有必需的H3长度和关键残基以形成这种构象，并在蛋白质数据库中至少有2个晶体结构，可用做抗体模型化的基础(2cgr和1tet)。正则结构组合中最经常表达的种系基因片段为：V_H片段3-23(DP-47)，J_H片段JH4b，V_κ片段O2/O12(DPK9)和J_κ片段J_κ1。V_H片段DP45和DP38也适合。因此这些片段在组合中应用，以建立具有期望的单个主链构象的库。

作为选择，不是单独的基于每个结合环的不同主链构象的自然发生率，而是基于主链构象组合的自然发生率选择单个主链构象。

就抗体而言，例如，可以确定任何2、3、4、5或所有6个抗原结合环正则结构的自然发生率。在此，比较优选的是，选择的构象是天然产生抗体中的普通成员。最为优选的是，选择的正则结构在自然库中是最为常见。因此，在人抗体中，例如，考虑5个抗原结合环H1、H2、L1、L2和L3天然组合，确定正则结构最常见的组合，然后与H3环最常见的构象进行组合，作为选择单个主链构象的基础。

ii标准序列的多样化

已选择几种已知的主链构型，或优选单个的已知的主链构型后，可以通过改变分子的结合位点构建本发明的dAb或用于本发明的库，以产生具有结构和/或功能多样性的库。这意味着变异体的产生使得它们有足够的结构和/或功能多样性，以至于它们能够提供一系列活性。

通过在一个或多个位点上改变选择的分子是获得预期多样性的代表性方法。改变的位点可以随机选择或优化选择。可以通过随机方法获得突变体，原存的氨基酸可以被任何氨基酸或其天然或合成类似物取代，产生大量的突变体，或者用一个或多个限定的氨基酸亚组取代原存氨基酸，产生有限数目的突变体。

已有报道各种产生多样性的方法。易错PCR法(Hawkins et al.(1992)J.Mol.Biol.，226：889)、化学突发诱变法(Deng et al.(1994)J.Biol.Chem.，269：9533)或大常杆菌突变株(Low et al.(1996)J.Mol.Biol.，260：359)可被用于在编码某分子的基因中引入变异。定点突变的方法也是本研究领域所公知的，包括利用错配寡核苷酸或退变寡核苷酸，使用或不使用PCR。例如，通过靶向突变抗原结合环，已经建立了几个合成的抗体库。人破伤风类毒素结合Fab的H3区经随机突变产生了一系列新的结合特性(Barbas et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4457)。将随机或半随机H3和L3区添加到种系V基因片段产生了大容量的库，而框架区无突变(Hoogenboom & Winter(1992)J.Mol.Biol.，227：381；Barbas et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4457；Nissim et al.(1994)EMBO J.，13：692；Griffiths et al.(1994)EMBO J.，13：3245；De Kruif et al.(1995)J.Mol.Biol.，248：97)。这种多样化还延伸到包括某些或全部其它抗原结合环(Crameri etal.(1996)Nature Med.，2：100；Riechmann et al.(1995)Bio/Technology，13：475；Morphosys，WO97/08320，supra)。

因为环的随机性，仅对H3而言，潜在能够生成约多于10¹⁵个突变体，对其它5个环也会产生相似的较大数目的突变体。利用目前的转化技术或甚至无细胞系统，建立一个代表所有可能的组合的库，是不可行的。例如，在目前构建的一个最大库中，产生了6×10¹⁰个不同的抗体，该数目仅仅是该设计的库的潜在多样性的一部分(Griffiths et al.(1994)supra)。

在优选的实施方案中，只对那些直接参与了产生或改进了分子所需功能的残基进行了多样化突变。对很多分子而言，发挥功能要与靶点进行结合，因此，多样性应集中在靶结合位点，而避免改变那些对分子整体包装或保持选择的主链构型至关重要的残基。

当标准序列应用于抗体域时，对其进行多样化

就抗体dAb而言，靶点的结合位点大多数是抗原结合位点。在人抗体库中这些残基非常多样化，并且已知在高精度的抗体/抗原复合物中相互接触。例如，在L2中，已知的天然产生的抗体的位置50和53展示多样化，并发现它们与抗原相互接触。相比较，传统的方法是在如Kabat等(1991，supra)定义的对应的互补决定区(CDR1)中是所有的残基进行多样化，某7个残基被多样化，而本发明应用的库中仅两个残基被多样化。要产生功能多样，必须创造一系列抗原结合特异性而言，就这一点而言，该方法代表了明显的进步。

实际上，抗体多样性是两个过程的结果：种系V，D和J基因片段的体细胞重组，建立了幼稚型初级库(所谓的种系和连接多样性)和含有得到的重排V基因的体细胞高度突变。对人抗体序列的分析表明，初级库的多样性主要集中在抗原结合位点，而体细胞高度突变多样性扩散到初级库高度保守的抗原结合位点的周围区域(见Tomlinson et al.(1996)J.Mol.Biol.，256：813)。这种互补方式可能进化为搜索合适的序列间隔的策略，尽管表面上看是对抗体特异的，也可以轻松的运用到其它多肽库中。变化的残基为那些形成靶结合位点的亚组。如果需要，在筛选过程中不同阶段使得靶结合位点残基的不同(包括重叠)亚组发生多样化。

就抗体库而言，某些抗原结合位点的残基，但非全部被多样化后，即为初始“幼稚型”库。正如在本文中所应用的，术语“幼稚型”是指无预确定靶点的抗体分子。这些分子类似那些未遭受免疫多样化的个体中免疫球蛋白基因编码的分子，胎儿和新生儿的情况就是就是这样，它们的免疫系统还没有被各种种类的抗原刺激物攻击过。然后以一系列的抗原或表位筛选该库，如果需要，可以在初始库中已多样化区域之外引入进一步多样化。该成熟的库可以筛选改良的功能，特异性和亲和力。

在构建本发明应用的库过程中，所选位置的多样化通常在核酸水平达到，通过改变限定多肽序列的编码序列，使得一些可能的氨基酸(20种或其亚组)可以插入在该位置。应用IUPAC命名法，最通用的密码子是NKK，它可以编码所有氨基酸和TAG终止密码子。NNK密码子优选用于引入需要的多样性，其它能达到这一效果的密码子也可以应用，包括NNN密码子，NNN将导致产生额外的密码子TGA和TAA。

人抗体抗原结合位点的侧链多样性的特征具有显著的偏好，表现为喜好某些氨基酸残基。如果统计每个V_H、V_κ和V_λ区10个最多样性位置的氨基酸组成，高于76％的侧链多样性仅来自7个不同的残基，它们是，丝氨酸(24％)、酪氨酸(14％)、天冬酰胺(11％)、甘氨酸(9％)、丙氨酸(7％)、天冬氨酸(6％)和苏氨酸(6％)。这些残基倾向于疏水性残基和小的残基，这种倾向为主链提供了弹性，也可能反映了分子表面的进化，预示能结合一系列抗原或表位，并可以帮助解释初级库中抗体所需要的混乱(promiscuity)。

因为优选模仿氨基酸的这种分布，需要变化的位置的氨基酸分布优选模拟抗体分子中抗原结合位点的分布。氨基酸置换的这种倾向使得筛选针对一系列靶抗原的某种多肽(不仅仅为抗体多肽)可容易的应用到任何多肽库。有各种方法在要改变的位置偏置氨基酸分布(包括应用三核苷酸突变法，见WO97/08320)，其中因为合成容易，最优选的方法是应用传统的简并密码子。通过比较简并密码子(每个位置具有等比例的单、双、三和四重简并性)与天然氨基酸用途的所有组合编码的氨基酸序型，有可能计算出最有代表性的密码子。这些密码子(AGT)(AGC)T、(AGT)(AGC)C和(AGT)(AGC)(CT)-即，DVT、DVC和DVY，分别使用IUPAC命名法-最接近于所需氨基酸序型：它们编码22％丝氨酸和11％酪氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、苏氨酸和半胱氨酸。因此，优选用DVT、DVC或DVY密码子在每个多样化的位置构建文库。D.本发明dAb的表征

可用本领域熟悉的方法，包括ELISA，测试本发明的dAb与其特异性抗原(念珠菌毒力因子)或表位的结合。在一优选的实施方案中，用单克隆噬菌体ELISA测定了其结合。

噬菌体ELISA可根据任何合适的步骤进行操作：下面提出了示范的实验方法。

每轮筛选的噬菌体群可用ELISA结合到选定的抗原或表位的方法进行筛选，以鉴别“多克隆”噬菌体抗体。可用ELISA方法筛选这些群中单感染细菌克隆的噬菌体，以鉴别“单克隆”噬菌体抗体。也很容易筛选结合抗原或表位的可溶性抗体片段，这也可以通过ELISA的方法用试剂，例如，抗C-或N-端标签进行(参见，例如Winter et al.(1994)Ann.Rev.Immunology 12，433-55，并通过引用并入本文)。

筛选的多克隆抗体的多样性可以通过PCR产物凝胶电泳(Markset al.1991，supra；Nissim et al.1994supra)，探针法(Tomlinson et al.，1992)J.Mol.Biol.227，776)或对DNA载体测序的方法加以评定。

E.用本发明的dAb治疗念珠菌(Candida spp)感染

根据本发明方法筛选的dAb可被用于体内治疗和预防，体外和体内诊断，体外分析和试剂等等。例如，根据对本领域技术人员所熟知的方法，dAb可被用于基于抗体的分析技术，例如ELISA技术。

正如上述提到的，本发明的dAb可用于诊断，治疗和预防。本发明筛选的单域抗体(dAbs)在诊断方面通过标准免疫化学方法用于Western分析和原位蛋白检测。为开展这方面的应用，依照本领域已知技术标记选择库的抗体，这种抗体多肽与色谱支持物如树脂，形成复合物，可初步用于亲和层析。所有这些技术对本领域技术人员是公知的。

优选本发明基本纯的至少90～95％同质的dAb对哺乳动物给药，更优选98～99％或更同质的dAb用于药物，特别当哺乳动物是人时。纯化后，如预期的部分或完全同质，筛选的该dAb可用于诊断和/或治疗(包括离体)或建立和进行分析方法、免疫荧光染色等等(Lefkovite and Pernis，(1979 and 1981)Immunological Methods，Volumes I and II，Academic Press，NY)。

本发明的dAb将代表性的用于预防、抑制或治疗个体中念珠菌感染，特别是白色念珠菌感染。

在本申请中，术语“预防”包括在诱导疾病前给予保护性组合物，“抑制”是指诱导事件之后，但在疾病临床表现之前给予组合物。“治疗”包括在疾病症状变得明显时，给予保护性组合物。

用于筛选dAb保护或治疗念珠菌感染的动物模型系统是现有的，对本领域技术人员而言相当熟悉。采用的某些模型系统的细节将在实施例中提供。念珠菌感染可发生于全身、粘膜、支气管、肺、指甲下、口或阴道。在本发明描述的优选的实施方案中，本发明的一种或多种dAb用于治疗阴道或全身性念珠菌感染，特别是阴道或全身性白色念珠菌感染。

本文公开的dAb，可构建成体内血清半衰期延长的形式。体内半衰期延长有利于免疫球蛋白的体内应用，特别有利于抗体，尤其有利于小分子抗体片段如dAb。这类片段(Fvs、二硫键键合的Fvs、Fabs、scFvs、dAbs)快速从体内清除，严重限制了临床应用。

可将dAb构建成抗体的大抗原结合片段，或构建成具有大水动力学尺寸的抗体(例如，构建成Fab、Fab′、F(ab)₂、F(ab′)₂、IgG、scFv形式)。例如，通过连接聚亚烷基二醇基(例如聚乙二醇(PEG)基、聚丙二醇、聚丁二醇)、血清白蛋白、运铁蛋白、运铁蛋白受体或至少运铁蛋白结合部分、抗体Fc区，或者通过与抗体域缀合，可将dAb构建成具有大水动力学尺寸。在一些实施方案中，dAb是PEG化的。优选PEG化的dAb结合SAP和MP，其亲和力或亲和能力基本上与未PEG化的dAb相同。例如，dAb可以是包含结合SAP和MP的dAb的PEG化dAb，其亲和力与未PEG化形式的dAb的差异不超过约1000倍，优选不超过约100倍，更优选不超过约10倍，或其亲和力与未PEG化形式的亲和力基本上没有发生变化。参见，PCT/GB03/002804，2003年6月30日提交，(WO 2004/081026)关于PEG化的单可变域和dAbs，其合适的制备方法，PEG化单可变域和dAb单体和多聚体体内半衰期延长，合适的PEG，优选PEG水动力学尺寸，及优选的PEG化单可变域和dAb单体和多聚体的优选水动力学尺寸。PCT/GB03/002804(WO 2004/081026)的完整的教导，包括上述部分，通过引用并入本文。

本发明dAbs(例如，dAb单体和多聚体)的水动力学尺寸可用本领域已知的方法测定。例如，凝胶过滤色谱可用于测定其水动力学尺寸。测定dAb水动力学尺寸的合适的凝胶过滤基质，如交联琼脂糖基质，是本领域已知的。

dAb形式的尺寸(例如，连于dAb的PEG部分的尺寸)，可根据实际应用作出调整。例如，想要使dAb离开循环并进入外周组织，就要保持低水平的水动力学尺寸，以促使其从血液排除。此外，想要使其在系统循环中保持较长一段时间，则要增加dAb的尺寸，例如将其构建成Ig样蛋白，或添加上30-60kDa PEG部分(例如，直链或支链PEG 30-40kDa PEG，例如添加上两段200kDa PEG部分)。可调整dAb形式的尺寸，使其达到理想的血清半衰期，从而，例如，控制与毒素的接触和/或减少毒性药物的副作用。

dAb的水动力学尺寸及其血清半衰期还可通过缀合或连接上能结合所述提高体内半衰期的抗原或表位的结合域(例如，抗体或抗体片段)来增加。例如，dAb可缀合或连接于抗血清白蛋白或抗新生儿Fc受体抗体或抗体片段，例如抗SA或抗新生儿Fc受体dAb、Fab、Fab′或scFv，或连接于抗-SA亲和体(affibody)或抗新生儿Fc受体亲和体。

用于本发明配体的合适的白蛋白、白蛋白片段或白蛋白变异体的实例见WO 2005/077042A2，其通过引用并入本文。特别是以下白蛋白、白蛋白片段或白蛋白变异体可用于本发明：

●SEQ ID NO：1(见WO 2005/077042A2，本序列通过引用清楚地并入本公开文献中)；

●包含或组成为WO 2005/077042A2中SEQ ID NO：1的氨基酸1-387的白蛋白片段或变异体；

●白蛋白，或其片段或变异体，包含选自以下的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO：1的氨基酸54-61，见WO 2005/077042A2；(b)SEQ IDNO：1的氨基酸76-89，见WO 2005/077042A2；(c)SEQ ID NO：1的氨基酸92-100，见WO 2005/077042A2；(d)SEQ ID NO：1的氨基酸170-176，见WO 2005/077042A2；(e)SEQ ID NO：1的氨基酸247-252，见WO 2005/077042A2；(f)SEQ ID NO：1的氨基酸266-277，见WO 2005/077042A2；(g)SEQ ID NO：1的氨基酸280-288，见WO2005/077042A2；(h)SEQ ID NO：1的氨基酸362-368，见WO2005/077042A2；(i)SEQ ID NO：1的氨基酸439-447，见WO2005/077042A2G)SEQ ID NO：1的氨基酸462-475，见WO2005/077042A2；(k)SEQ ID NO：1的氨基酸478-486，见WO2005/077042A2；以及(1)SEQ ID NO：1的氨基酸560-566，见WO2005/077042A2。

dAb组合物中使用的合适的白蛋白，或其片段或类似物的其它实例见WO 03/076567A2，其通过引用整体并入本文。特别是以下白蛋白，或其片段或变异体可用于本发明：

●人血清白蛋白，见WO 03/076567A2，例如，在图3中(该序列信息用过引用清楚地加入到本公开文献中)；

●人血清白蛋白(HA)，其组成为单非糖基化肽链，有585个氨基酸，分子量为66,500(见，Meloun等，FEBS Letters 58：136(1975)；Behrens等，Fed.Proc.34：591(1975)；Lawn等，Nucleic AcidsResearch 9：6102-6114(1981)；Minghetti，et al，J.Biol.Chem.261：61A1(1986))；

●白蛋白的多形变异体或类似物或片段，见Weitkamp等，Ann.Hum.Genet.37：219(1973)；

●白蛋白片段或变异体，见EP 322094，例如，HA(1-373.，HA(1-388)，HA(1-389)，HA(1-369)和HA(1-419)，以及1-369和1-419间的片段；

●白蛋白片段或变异体，见EP 399666，例如，HA(1-177)和HA(1-200)以及HA(1-X)间的片段，其中X为178-199间的任何数值。

当(一种或多种)半衰期延长部分(例如，白蛋白、转铁蛋白及其片段和类似物)用于本发明dAb时，可用任何合适的方法将其与dAb缀合起来，例如，通过使用编码融合蛋白的单核苷酸构建体直接融合于dAb，其中融合蛋白编码为单肽链，其半衰期延长部分位于细胞表面靶结合部分的N-或C-端。除此之外，可通过使用dAb间肽接头进行连接，例如，WO 03/076567A2或WO 2004/003019(这些接头的公开通过引用结合入本文，用以提供本发明中所用的实例)所述的肽接头。

通常，增加体内血清半衰期的多肽是体内天然存在的多肽，能对抗内源机制的降解或清除，这种机制能够从生物体(如，人)清除不想要的材料。例如，增加体内血清半衰期的多肽可选自：来自细胞外基质的蛋白，血中发现的蛋白，血脑屏障或神经组织中发现的蛋白，位于肾、肝、肺、心、皮肤或骨的蛋白，应激蛋白，疾病特异性蛋白，或涉及Fc转运的蛋白。

增加体内血清半衰期的合适多肽包括，例如，转铁蛋白受体特异性配体神经药理学药物融合蛋白(见美国专利5,977,307，其教导通过引用并入本文)，脑毛细管内皮细胞受体，转铁蛋白，转铁蛋白受体(例如，可溶性转铁蛋白受体)，胰岛素，胰岛素-样生长因子1(IGF 1)受体，胰岛素-样生长因子2(IGF 2)受体，胰岛素受体，凝血因子X，α1-抗胰蛋白酶和HNF 1α。增加体内血清半衰期的合适多肽还包括α-1糖蛋白(血清类粘蛋白；AAG)，α-1抗凝乳蛋白酶(ACT)，α-1微球蛋白(蛋白质HC；AIM)，抗凝血酶III(AT III)，载脂蛋白A-I(Apo A-I)，载脂蛋白B(Apo B)，血浆铜蓝蛋白(Cp)，补体组分C3(C3)，补体组分C4(C4)，C 1酯酶抑制剂(C 1 DSfH)，C-反应蛋白(CRP)，铁蛋白(FER)，血红素结合蛋白(HPX)，脂蛋白(a)(Lp(a))，甘露糖-结合蛋白质(MBP)，肌红蛋白(Myo)，前清蛋白(运甲状腺素蛋白；PAL)，视黄醇结合蛋白(RBP)，及类风湿样因子(RF)。

来自细胞外基质的合适蛋白包括，例如，胶原，层粘联蛋白，整合素和纤连蛋白。胶原是主要的细胞外基质蛋白。目前已知约15种分子类型，存在于身体的不同部分，例如I型胶原(占身体胶原的90％)存在于骨，皮肤，腱，韧带，角膜，内脏，或I型胶原存在于软骨，椎骨盘，脊索和眼玻璃体液。

合适的血液蛋白包括，例如，血浆蛋白(例如，纤维蛋白，α-2微球蛋白，血清白蛋白，纤维蛋白原(例如，纤维蛋白原A，纤维蛋白原B)，血清淀粉状蛋白A，触珠蛋白，[肌动蛋白]抑制蛋白，遍在蛋白，子宫珠蛋白和β-2-微球蛋白)，酶和酶抑制剂(例如，纤溶酶原，溶菌酶，胱抑蛋白C，α-1-抗胰蛋白酶和胰腺的胰蛋白酶抑制剂)，免疫系统的蛋白，例如免疫球蛋白(例如，IgA，IgD，IgE，IgG，IgM，免疫球蛋白轻链(κ/λ))，转运蛋白(例如，视黄醇结合蛋白，α-1微球蛋白)，防卫素(例如，β-防卫素1，嗜中性的防卫素1，嗜中性的防卫素2和嗜中性的防卫素3)等。

在血脑屏障或在神经组织中发现的合适的蛋白包括，例如，黑皮质素受体，髓磷脂，抗坏血酸盐转运蛋白等。

延长体内血清半衰期的合适的多肽包括定位于肾的蛋白(例如，多囊蛋白，IV型胶原，有机阴离子转运蛋白K1，Heymann′s抗原)，定位于肝的蛋白(例如，乙醇脱氢酶，G250)，定位于肺的蛋白(例如，分泌成分，其结合IgA)，定位于心的蛋白(例如，HSP 27，与膨胀的心肌病有关)，定位于皮肤的蛋白(例如，角蛋白)，骨特异性蛋白例如形态发生蛋白(BMPs)，其为具有成骨活性的蛋白的转化生长因子β超家族的亚组(例如，BMP-2，BMP-4，BMP-5，BMP-6，BMP-7，BMP-8)，肿瘤特异性蛋白(例如，滋养层抗原，赫赛汀受体，雌激素受体，组织蛋白酶(例如，组织蛋白酶B，其可存在于肝和脾中))。

合适的疾病特异性蛋白，例如，仅在活化T-细胞上表达的抗原，包括LAG-3(淋巴细胞活化基因)，护骨蛋白配体(OPGL；见Nature 402，304-309(1999))，OX40(TNF受体家族成员，表达于活化的T细胞并在人T细胞白血病病毒I型(HTLV-I)-产生细胞中特别上调；见Immunol.165(1)：263-70(2000))。合适的疾病特异性蛋白还包括，例如，金属蛋白(与关节炎/癌症相关)，包括CG6512果蝇，人截瘫蛋白，人FtsH，人AFG3L2，鼠的ftsH；以及血管生成生长因子，包括酸性成纤维细胞生长因子(FGF-I)，碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2)，血管内皮细胞生长因子/血管渗透性因子(VEGF/VPF)，转化生长因子-α(TGF α)，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，血管生成素，白介素-3(IL-3)，白介素-8(IL-8)，血小板衍生的内皮生长因子(PD-ECGF)，胎盘生长因子(PlGF)，中期因子血小板衍生的生长因子-BB(PDGF)，和CX₃C趋化因子。

延长体内血清半衰期的合适的多肽还包括应激蛋白入热休克蛋白(HSP)。HSP通常发现于细胞内。当出现在细胞外时，表示该细胞已死亡并溢出其内容物。这种非程序性细胞死亡(坏死)发生于外伤、疾病或损伤后，细胞外HSP引发免疫系统应答时。与细胞外HSP结合可导致本发明组合物定位于疾病位点。

与Fc转运蛋白有关的合适蛋白包括，例如，Brambell受体(也称为FcRB)。该Fc受体有两种功能，这两种功能都有可能用于递送。所述功能为(1)将IgG从母体经胎盘转运到胎儿(2)保护IgG不被降解，从而延长其血清半衰期。目前认为该受体从内体回收利用IgG。(见，Holliger et al，Nat Biotechnol 15(7)：632-6(1997))。

药代动力学分析和dAb半衰期测定方法是本领域技术人员已知的。详见Kenneth，A等：Chemical Stability of Pharmaceuticals：AHandbook for Pharmacists，以及Peters等，Pharmacokinetc analysis：APractical Approach(1996)。还可参见″Pharmacokinetics″，M Gibaldi &D Perron，Marcel Dekker出版，2^nd Rev.ex版(1982)，其中描述了药代动力学参数如tα和tβ半衰期以及曲线下面积(AUC)。

通常而言，dAb将以纯化形式与药理学适合的载体一起应用。典型地，这些载体包括水溶液的或醇/水溶液、乳剂或悬浮剂，任何包括生理盐水和/或缓冲剂的介质。胃肠外介质包括氯化钠溶液、Ringer′s右旋糖、右旋糖和氯化钠和乳酸化Ringer′s。如果需要保持多肽复合物混悬液，可从增稠剂中选用合适的生理可接受的佐剂，如羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、明胶和海藻酸。

静脉载体包括液体和营养补充剂和电解质补充剂，如那些基于Ringer′s右旋糖的介质。防腐剂和其它添加剂，如抗生素、抗氧剂、鳌合剂和惰性气体也可以加入(Mack(1982)Remington′sPharmaceutical Sciences，16th Edition，Remington′s药物科学，第16版)。

本发明的dAb可作为单独给药的组合物应用，或与其它药物合用。其它药物包括各种免疫治疗药物，包括环孢菌素、甲氨蝶呤、阿霉素或顺铂和免疫毒素。药用组合物包括各种细胞毒或其它药物与本发明dAb合用的“鸡尾酒”，甚至与具有不同特异性的本发明dAb合用。

本发明的药物组合物的给药途径可以为本领域技术人员所熟知的途径。对治疗而言，包括而不限于免疫治疗，可通过标准技术，将dAb和本发明组合物给予任何患者。可以任何合适的模式给药，包括非胃肠道、静脉、肌肉、腹膜内、透皮、通过肺部途径，或还，如果适当，通过导管直接输注。给药的剂量和频率可根据年龄、性别和患者状况、同时服用其它药物情况、禁忌情况和其它临床医师考虑到的参数。

在本发明优选的实施方案中，本文描述的治疗组合物通过或局部给药或全身给药。

在本发明优选的实施方案中，包含用于治疗患有念珠菌病的患者的dAb药用组合物的给药方法包括在一段时间内连续输注，或单次或推注给药。另外，值得注意的是，单次或推注给药后，可以给予第二次推注给药或进行连续输注。

本发明的dAb可在合适的载体中冻干保存，使用前将其复溶在适合的载体中。该技术在传统的免疫球蛋白中已被证明有效。可应用本领域已知的冻干和复溶技术。本领域技术人员应意识到冻干和复溶会导致不同程度的活性损失(如就传统的免疫球蛋白而言，IgM抗体较IgG抗体易于产生更大的活性损失)，其应用水平应当上调予以补偿。

可给予含有dAb或其鸡尾酒混合物的组合物以发挥预防和/或治疗作用。在某些治疗应用中，某一适当剂量至少达到部分抑制、压制、调节或杀死选择的细胞群，或达到其它可衡量的参数，该剂量被定义为“治疗有效剂量”。要达到这种效果所需要的药量取决于疾病的严重程度，患者自身免疫系统的一般状态，但一般范围为0.005到5.0mg选择的dAb每公斤体重，剂量0.05至2.0mg/kg/剂量更为常用。就预防应用而言，包含dAb或其鸡尾酒混合物的组合物可以相同的或稍低的剂量服用。

本发明包含dAb或其鸡尾酒混合物的组合物可用于预防和治疗，以帮助改变、灭活、杀死或清除选定的哺乳动物靶细胞群。另外，本文描述的dAb可用于离体或体外选择性杀死、耗尽或有效去除来自细胞异种集合体的靶细胞群。采用标准技术将哺乳动物来源的血液与选择的抗体、细胞表面受体或其结合蛋白进行离体合并，从而将不希望有的细胞杀死或从用以回输到哺乳动物体内的血液中清除。

在下面的实施例中，仅为说明目的，进一步描述了本发明。

实施例

实施例1：材料和方法

微生物和生长条件

在整个研究中，使用了普通的实验室酵母菌白色念珠菌。但，值得注意的是本发明可预防或治疗其它真菌，如热带念珠菌(tropicalis)，光滑念珠菌(glabtrata)，克鲁斯念珠菌(krusei)，挪威念珠菌(norvegensis)或平常念珠菌(inconspicua)。

整个研究中使用了白色念珠菌SA40和AIDS 68。SA40株对氟康唑和其它唑类药物完全敏感，而分离自AIDS患者的AIDS 68株对氟康唑具有耐药性(即，如NCLLS法所定义的，MIC＞64μg/ml)。两种菌株都按常规生长在28℃的酵母膏胨葡萄糖(YPD；1％酵母菌提取物，2％细菌蛋白胨，2％葡萄糖，所有按w/v计算)或酵母氮源(YNB；2％葡萄糖，0.17％无氨基酸和硫酸铵的酵母氮源，0.5％硫酸铵，w/v)或Winge(0.3％酵母提取物，0.2％葡萄糖)或SDB(1％细菌蛋白胨，2％右旋糖)的培养基中。所有培养基用2％琼脂固化。

将固相细胞稀释至2×10⁸细胞/ml水，将1×10⁶个细胞接种到199培养基，Lee’s培养基，spider培养基和血清平板上，并在37℃孵育7天，在琼脂固化培养基上得到菌丝(形成菌丝)。如前述方法(Sharkey，L.L.，et al.，1999.J Bacteriol 181：5273-9)，固相199培养基用150mM Tris(pH 7)进行缓冲(M199，cat.NO 31100-019，Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)，固相spider培养基、血清和改进的Lee′s培养基平板根据前述方法制备(Liu，H，J.，et al.，1994.Science 266：1723-6)。

将固相细胞以10⁸细胞/ml密度接种至预热的肉汤中，于37℃在M199培养基，改良Lee’s培养基，spider培养基和血清平板上培养，评价芽管的形成。阴性对照于28℃在同一培养基中孵育。

所有的化学制品和抗生素来自Roche Diagnostic(Perkin ElmerRoche，Branchburg，NJ，)和Sigma-Aldrich(Milano，Italy)。生物学粉末(M199除外)来自Becton Dickinson(Becton Dickinson & Co.，Sparks，MD)。

重组蛋白的生产

如别处的详细描述，本研究采用质粒pRLV126和pRLV130克隆烯醇化酶和MP65(La Valle，R.，S.et al.，2000.Infect Immun 68：6777-84；Sandini，S.，et al.，2002.Med Mycol 40：471-8)。

为在大肠杆菌(E.coli)中克隆成熟形态的CaMP65，用Ca69和Ca65寡核苷酸(表1)扩增CaMP65从分泌的N末端序列到终止密码子的1200bp DNA片段，PCR产物经BamHI和HindIII酶切，克隆入pDS56-RBSII中相应的位点，得到pRLV148。

为分子克隆蛋白酶SAP2的编码序列，用Ca70和Ca71寡核苷酸扩增全长度的SAP2编码区。用BamHI和PstI部分酶切后，成熟形态的SAP2被克隆入pDS56-RBSII的相应位点，得到pRLV 143。

表1：

ID	序列	限制酶	CaMP65位置起始＝1终止＝1138	CaSAP2位置起始＝1，终止＝1198
					Ca70	GGGGGATCCATGTTTTTAAAGAATATTTTCATTG-SEQ ID No.1	BamHI		1-25
Ca71	CCTAAGCTTAGGTCAAGGCAGAAATACTGGAAGCAG-SEQ ID No.2	HindIII		1216-1198
					Ca69	CCCGGATCCCTGTTCATGTTGTTACC-SEQ ID No.3	BamHI	98-114
Ca65	GGGCTGCAGGTGCTTAGTTAGAGTAA-SEQ ID No.4	PstI	1142-1125

使用前，对pRLV143和pRLV148中所有的DNA插入序列进行测序以确定与已知基因同源。仅发现少量不同，但都不会引起其编码产物氨基酸的改变。

重组白色念珠菌(C.Albicans)蛋白的表达和纯化

在含有产生Lac抑制子的pUHA1质粒(Hochuli，et al.，1988.JChromatogr.，444：293-302)的E.coli M15中表达重组蛋白。在含有卡那霉素和青霉素的LB培养基中进行诱导，在OD.600为0.7的培养物中加入终浓度为1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG；Boehringer)，然后在37℃进一步培养5h。利用镍鳌合亲和层析根据产品说明书(Qiagen；变性条件下)纯化重组的6x组氨酸标签蛋白。收集含有纯化多肽的组分，用3倍体积的无水乙醇沉淀，用水重悬，保存于-20℃。

重组白色念珠菌蛋白的再折叠

将纯化的蛋白溶于8M尿素中，在4℃的逐步降低尿素浓度(4M、2M、1M、0.5M)的PBS中透析，使蛋白再折叠，样品每一尿素浓度孵育6h，最后在PBS(Sigma-Aldrich)(10m MPBS；2.7mM KCl；137mM NaCl；pH7.4)中透析。

噬菌体展示dAb库的建立

dAb噬菌体库基于VH(V3-23[基因座]DP47[V基条目(Baseentry)]和J_H4b)和VL(012/02[基因座]DPκ9[V基条目(Base entry)]和J_κ1)的单人抗体框架，用DNA核苷酸多样化技术引入多样性，以在已知的使蛋白与已知分子结构的抗原发生接触并在成熟人文库中发生天然多样化的位置产生氨基酸侧链多样性。将dAb可变区克隆入噬菌体载体pDOM4，所述的pDOM4基于fd-噬菌体基因组，因此包含筛选过程所用的感染性噬菌体颗粒的生产所必须的所有噬菌体基因。

用噬菌体展示筛选dAb

依据被动包被到Maxisorp Immuno^TM Tube免疫试管(Nunc)上的MP65和SAP2进行筛选dAb。用4ml溶于BupH碳酸盐-碳酸氢盐缓冲溶液(0.2M碳酸盐-碳酸氢盐缓冲溶液，pH 9.4)(Perbio，UK)的两种抗原10μg/ml包被免疫试管，4℃过夜。随后，免疫试管用含有2％脱脂奶粉的PBS(PBSM)室温下封闭1h，用PBS洗涤3次。将每种dAb库的大约1×10¹¹个噬菌体，于总体积1ml 2％PBSM中，在抗原包被的试管中，在50rpm旋转条件下，室温孵育1h。用补充了0.1％Tween-20(Sigma-Aldrich)(PBST)的PBS洗涤10次。第一轮筛选洗涤10次(第二轮和第三轮筛选分别洗涤20次)，结合的噬菌体用500μl含有1mg/ml胰蛋白酶，并补充了0.1mM CaCl₂(Sigma-Aldrich)的PBS，在50rpm旋转条件下，室温洗脱10min，回收含有洗脱噬菌体的胰蛋白酶溶液，用250μl感染对数生长期的E.coli TG1，37℃30min。文库平板接种和系列对数稀释(按噬菌体滴度)在补充有15μg/ml四环素(Sigma-Aldrich)的2xTYE-琼脂板(15g细菌琼脂，8gNaCl，10g蛋白胨，5g酵母提取物，溶于1L水)上进行。随后几轮筛选中，通过刮入2ml的补充有20％甘油(Sigma-Aldrich)的(16g胰蛋白胨，10g酵母提取物和5g NaCl，溶于1L水)2xTY培养基从生长平板回收细胞，取其中的50μl用于37℃接种50ml的2xTYE-Tet进行噬菌体扩增。

在经过所需数目的筛选后(典型的为2到3)，取20μg经所需筛选得到的纯化的(QIAgen-Midiprep)dAb噬菌体DNA，在NEB3缓冲液(1μg/ml BSA，100mM NaCl，50mM Tris-HCl，10mM MgCl₂，1mM二硫苏糖醇，pH 7.9@25℃)中，用限制性内切酶SalI和NotI(NEB)消化，从而回收富集的dAb基因。切开的dAb基因在1％琼脂糖(Sigma-Aldrich)凝胶上电泳，在TBE(Sigma-Aldrich)(44.5mM Tris-硼酸盐和1mM EDTA，pH8.3)中于150V电泳1h。电泳后，切割dAb基因并用QIAgen凝胶纯化试剂盒纯化。然后，用T4DNA连接酶(NewEngland Biolabs)，在连接缓冲液(50mM Tris-HCl，10mM MgCl2，1mMATP，10mM dithiothreitol，25μg/ml BSA，pH7.5@25℃)中，于室温连接100ng纯化的消化过的dAb基因与400ng经SalI/NotI消化的可溶性表达载体，持续一小时。用3微升的连接产物转化50μ1的电感受态大肠杆菌HB2151(200Ω，25μFd，2.5kV，0.2cm gap cuvettes)，将所需量的转化细胞铺在补充有5％葡萄糖和50μg/ml羧苄青霉素(Sigma-Aldrich)的琼脂平板上；然后37℃孵育过夜。

用ELISA筛选特异性dAb结合剂

用ELISA对新鲜E.coli HB2151克隆进行MP65和SAP2结合dAbs分析。各克隆培养于装有200μl的2xTY(含50μg/ml羧苄青霉素，0.1％葡萄糖)的96-孔微量滴定板(Corning)中，于37℃以250rpm振摇6小时，用1mM终浓度的IPTG诱导，30℃/250rpm继续孵育过夜以表达可溶性dAb。将板870xg室温离心10min，如下所述用ELISA分析上清液(除非指明，所有体积是指50μl/孔)。用BupH碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液中的1μg/ml MP65或SAP2于4℃包被96孔ELISA板(Nunc Maxisorp)，然后浸入PBST中洗涤三次。然后用200μl/孔PBS(补充有2％(v/v)Tween-20)室温封闭板1小时，然后用PBST洗涤3次。将25微升过夜培养的上清液1∶1稀释于PBST中，加入到每孔中并室温孵育1小时。用PBST洗涤3次后，结合的SAP2特异性dAb与在PBST中1∶2000稀释的蛋白-A辣根过氧化物酶缀合物室温孵育1小时。而筛选的抗MP65的dAb用1∶2000稀释的小鼠9E10抗体(anti-myc，Sigma-Aldrich，Cat No M5546)的PBST溶液室温检测1小时，用PBST洗涤3次，然后加入1∶2000稀释的蛋白-A辣根过氧化物酶缀合物(Sigma-Aldrich，Cat No A0168)的PBST溶液，并于室温孵育1小时。用合适的检测配体孵育后，SAP2和MP65都用PBST洗涤3次，然后用PBS洗涤3次。然后，所有板的每孔中加入50μl的TMB底物(SureBlue，KPL，MD.USA)进行显色。使反应物显色几分钟，直到相对于对照孔显现出足够的信号，然后加入100μl/孔的1M HCl停止反应。在微读板器上于450nm读取吸收度(Perkin Elmer)。

dAb蛋白的表达和纯化

挑选对应于每种可溶性dAb ELSIA阳性克隆的单独新鲜克隆接种入5ml 2xTY培养基中，补充以50μg/ml羧苄青霉素和5％葡萄糖，于37℃，250rpm振荡的条件下培养过夜。用5ml该培养物接种500ml新鲜预热培养基(2xTY培养基补充以50μg/ml羧苄青霉素和0.1％葡萄糖)，于37℃，250rpm振荡的条件下培养至OD600达到0.8，此时，在培养物中加入IPTG至终浓度1mM进行诱导，于30℃，250rpm振荡的条件下培养过夜。3450xg离心10min，使细胞沉淀，得到的澄清上清液用0.45μm灭菌滤器过滤。将50ml该上清液与200μl适合分离VL dAb的蛋白-L-琼脂糖凝胶(Sigma-Aldrich)或适合分离VH dAb的蛋白A streamline(Amersham Pharmacia)混合，在室温下，50rpm条件下旋转混合1h。在96孔纸滤器板(Whatman)中，于220xg离心1min，回收树脂，用1ml 0.5M NaCl PBS溶液和1mlPBS溶液分别洗涤2次，然后用210μl 0.1M甘氨酸(pH2.0)稀释，加入40μl 1M Tris-HCl(pH8.0)进行中和。在还原条件下，采用12％NuPAGE Bis-Tris，在MEM缓冲溶液中(Novex gel system，Invitrogen)进行SDS-PAGE，确定dAb的纯度。用考马斯亮蓝(Simply BlueSafestain，Invitrogen)对胶进行染色。根据在280nm的吸光度确定dAb样品的浓度。

dAb与内皮细胞或塑料的粘附分析

于28℃在YPD琼脂斜面上(2.0％wt/vol葡萄糖，1.0％wt/vol酵母菌提取物，2.0wt/vol细菌蛋白胨(Difco，Detroit，Mich.)培养真菌细胞。根据Rotronsen改良法(Rotronsen，D.，et al.1986.Rev Infect Dis.；8：73-85)制备每一有机体的单细胞悬液。简言之，在盛有YBD肉汤pH5.0(0.2％wt/vol酵母提取物，2.0％wt/vol BSA和2.0％wt/vol右旋糖(Difco，Detroit，Mich.)的旋转鼓中，于28℃培养真菌细胞24h。离心收集白色念珠菌细胞(C.albicans)，用生理盐水溶液(0.85％NaCl)洗涤细胞3次。用Thoma相机计数芽生孢子，并用含钙和镁的Hank’s平衡盐溶液(Hyclone，Logan，Utah)调整至预期浓度(10⁸细胞/ml)。

根据Jaffe等人的改良法(Jaffe，et al.，1989.J.Immunol.15；143：3961-6)制备人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。简述如下，用0.5mg/ml胶原酶H(Boehringer-Mannheim，Mannheim，Germany)消化人脐静脉得到HUVEC。细胞按常规培养在50％培养基-199，50％D-最低必须培养基(EuroClone，Yorkshire，United Kingdom)中，补充以20％肽牛血清(Hyclone，Logan，Utah)，50ng/ml肝素(Sigma)和50μg/ml ECGF(Becton Dickinson)。

对念珠菌粘附研究而言，细胞在包被有0.5％细菌明胶(Difco，Detroit，Mich.)的12孔组织培养板上(Corning Incorporated，Corning，NY，USA)生长至融合。所有培养操作在37℃，湿度95％，5％CO2环境中进行。

对塑料粘附实验而言，如上述培养真菌细胞，用水洗涤两次，按1.5×10³细胞/ml浓度悬浮在改良的Lee’s或M199液体培养基中。在6孔聚苯乙烯板(Corning Incorporated，Corning，NY)中每孔培养1.5×10³个真菌细胞，于37℃培养3h。经过充分洗涤后，将1mlSabouraud右旋糖琼脂倒入每孔中，使其凝固。于37℃培养24h，计数克隆数，结果以接种量的百分数表示。通过直接在Sabouraud右旋糖琼脂平板上接种部分培养物确认每孔悬浮液的接种量。

ELISA

用酶联免疫吸附法(ELISA)测定dAb与其抗原的结合。简而言之，将200ng抗原溶于100μl 0.05M碳酸钠(pH9.6)中，于4℃过夜包被抗原聚苯乙烯板(Dynatech，PBI，Milan，Italy)。用牛血清白蛋白-磷酸缓冲盐(PBS)封闭液洗涤。以PBS-0.05％Tween 202倍稀释的免疫动物的腹水，取100μl于37℃与包被抗原孵育2h。

以自非免疫鼠收集的血清(1∶2稀释)作为阴性对照。用400μl PBS-Tween20洗涤3次，在孔中加入1∶1.000PBS稀释的抗鼠多价抗体-碱性磷酸酶结合物(Sigma)作为二抗，37℃孵育1h，以硝基苯磷酸二钠(Sigma)作为底物，进行显色反应。滴度定义为光学读数最小为阴性对照2倍的小鼠血清的最大稀释倍数。就免疫印记而言，从IPTG诱导的M15(pUHA1，pDS56/RBSH6xhis-ca)细胞中纯化得到重组蛋白，按每μl约1μg蛋白将纯化蛋白重悬在样品缓冲液中，煮沸10min，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE(5％到15梯度))。将电泳后的胶体在含有25mM Tris，192mM甘氨酸，0.1％SDS和20％甲醇的缓冲液中电印迹到硝酸纤维滤纸上。如单一实验所详述，将滤纸与腹水进行孵育。在所有实验中，用含有1％牛血清白蛋白的磷酸缓冲盐溶液(PBS)室温下封闭滤纸2h，防止腹水与硝酸纤维的非特异性结合。用PBS-Tween20充分洗涤后，用1∶1000PBS稀释的抗鼠多价抗体-碱性磷酸酶结合物(Sigma)作为二抗，检测结合的抗体。

蛋白酶分析

该研究基于天然的高纯SAP2制备物对牛血清白蛋白的降解，基本根据Ross等人的描述操作。简述如下，每次分析包含：在50mM柠檬酸钠(pH 3.2)中加入0.6ml 1％(w/v)BSA(Sigma Chem.Co.，Detroit，MI)和0.15酶溶液(100ug/ml)。37℃孵育30min后，加入0.4ml 10％(w/v)三氯乙酸。将试管冰浴30min，离心(1600xg)10min。上清液在280nm测定吸光度，对照为不含酶的1％BSA柠檬酸溶液。1单位酶每分钟可催化1delta OD，就我们纯化的SAP2制备物而言，在delta OD 0.1-0.4之间，酶的浓度与OD值是成正比的，检测限为1μg。

大鼠阴道感染

贯穿整个研究，选择了卵巢切除的雌性Wistar大鼠(80-100g，Charles River Breeding Laboratories，Calco，Italy)。所有大鼠注射苯甲酸雌二醇(Amsa Farmaceutici srl，Rome，Italy)保持假发情状态。首剂量注射雌二醇后第6天，大鼠阴道内灌输0.1ml含10⁷酵母菌细胞的生理盐水。如前所描述(De Bernardis，et al.1999.J Infect Dis.179：201-8)，在含有氯霉素(50μg/ml)的Sabouraud琼脂板上培养取自各大鼠的10μl阴道液体(利用校准的塑料接菌环，Disponoic，PBI，Milan，Italy)，计算酵母菌数。如在大鼠阴道灌洗液中检测到至少1个CFU，即计数为≥10³CFU/ml，该大鼠被认定为感染。其它阴道样品还用过碘酸(periodic acid)-Schiff-van Gieson法染色以进行显微镜检查。

实施例2：结果

1.dAbs产生、筛选和表征

在用噬菌体展示技术进行dAb筛选前，对再折叠的重组白色念珠菌(C.albicans)蛋白进行功能活性测试。用蛋白酶酶法测试SAP2，结果表明具有良好的功能，这提示结构准确折叠。用与SP2一样的方法对MP65进行再折叠，但由于缺乏稳定的分析方法，未对其进行功能测定。应用了4个噬菌体库进行筛选，合并容量超过1×10¹⁰个不同的dAb，而每轮筛选至少选用1×10¹¹个单独的噬菌体(意味着至少10倍过量的代表了库的多样性)。三轮筛选后，噬菌体的输出滴度增加超过5log。用ELISA法监控含有表达dAb的大肠杆菌培养基上清液，根据其结合到被动吸附抗原上的情况，筛选出MP65特异和SAP2特异的dAb。鉴定了10个不同的MP65特异的结合剂(3VH和7VK)和27个不同的SAP2特异的结合剂(22VH和5VK)。为测定各dAb对其各自抗原的抑制活性，对每种不同的阳性克隆纯化了几克样品用以筛选。

2.dAb结合性质和功能性质

对从两个不同噬菌体表达库，包括VH和VK亚库，筛选的抗SAP2或MP65的克隆，在经过酶免法(见上)进行适当的筛选后，还需要进行另外的功能学筛选。就SAP2而言，还评价了dAb对天然蛋白制备物酶学活性的抑制能力；而对MP65，还测试了每种dAb结合剂对念珠菌与塑料粘附的抑制能力。在初步分析之后，根据它们与重组蛋白较强的结合能力和它们对粘附和酶活性的功能性抑制能力，从每一dAb家族中筛选出有限数目的成员。但是，值得注意的是，所有的dAb在结合实验和功能分析时都发挥作用。

通过举例，表2为各筛选的单个SAP2结合剂在酸性条件下对BSA降解的抑制能力与原型天冬氨酸蛋白酶抑制剂胃酶抑素A的比较。

表2

样品	ΔOD/ml/min	％抑制
			柠檬酸盐缓冲剂+1％BSA+SAP	1.0	-
柠檬酸盐缓冲剂+1％BSA+SAP+胃酶抑素	036	100*
			ADR4-11	0.80	29
ADR4-12	0.60	60
			ADR4-13	0.46	82
ADR4-3	0.66	40
			ADR4-4	0.76	32
ADR4-5	1	0
			ADR4-6	0.50	78
ADR4-7	0.70	61
			ADR4-8	1	0
ADR4-9	093	5
			ADR4-10	083	13
DUMMY	093	5
			He14/pr2	116	-

与胃酶抑素比较的最强的dAb ADR4-13和ADR4-6被选择并纯化用于进一步研究。就MP65结合剂而言，根据dAb对MP65与塑料粘附的抑制作用，dAb ADR3-1、ADR3-2和ADR3-6被筛选。

3.dAb在大鼠阴道念珠菌病模型中的活性

评价了上述筛选的dAb从强致病性阴道病念珠菌株攻击的阴道腔中加速清除真菌的能力。对照组选用无关dAb和抗烯醇化酶抗体作为阴性对照，抗真菌素氟康唑和胃酶抑素A(原型Sap抑制剂)作为阳性对照。

对结果的解释建立在两个主要标准上：1.治疗早期的加速清除情况，即阴道内攻击后3-6天；2.攻击后21天感染的治愈情况(＜1CFU/ul阴道液体)。用双参数(Student’s t检验)和非参数(Mann-Withney U检验)统计法评价差异性。进行了两种类型的实验(重复3次)，一种为预防型，一种为治疗型。在前一实验中，在阴道内念珠菌攻击前30min阴道内给予单一dAb(20ug蛋白)，而后者在攻击后1，24和48h给予同样剂量的dAb。

4.dAb的预防活性

在一项初步试验中，用抗MP65 dAb(ADR3-2)或抗SAP2 dAb(ADR4-6)预处理大鼠(图1)，或用氟康唑或胃酶抑素处理大鼠，两种dAb都表现出加速念珠菌从阴道清除的活性，其动力学行为与氟康唑或胃酶抑素基本相当(图1)。所有处理组确于21天时治愈了所有感染，而所有对照组鼠(未处理)在28天时仍处于感染水平。随后的实验将旨在分析检测每种单独的dAb的活性，还检测例如当真菌攻击后，dAb是否能发挥治疗活性。

如图2所示，与对照组、未处理组或无关dAb处理组大鼠比较，两种抗SAP2 dAb(ADR4-6或ADR4-13)都对真菌攻击能提供高预防性保护，这可通过更快速初步清除真菌和预期的感染治愈(21天)加以例证。比较两种dAb，无统计学上显著性差异。例如在图2所阐明的实验中，仅在第14天的动物阴道念珠菌CFU上，两种dAb有界限性统计学上显著性差异(P＝0.048；Student’s t检验)，但在另外实验中没有得到重复。

3种筛选的抗MP65dAb在鼠阴道念珠菌病模型中相当有效，总体表现出相近的加速清除阴道念珠菌的行为和能力。尽管用dAbADR3-2预处理大鼠在21天时仍感染了念珠菌，它们与其它2种抗MP65dAb预处理的大鼠一样，在随后的观察日(28天)(图3)同样获得痊愈。

另外，正如根据dAb公认的作用机理(抑制SAP2活性)所预期的，ADR4-6和ADR4-13都甚至对氟康唑耐药念珠菌菌株AIDS 68引发的感染非常有效，可强效加速念珠菌的清除和促进感染痊愈(图4)。

dAb治疗活性

念珠菌攻击后，服用dAb，开展了进一步试验评价dAb发挥治疗效应的潜能，所以感染后1、24和48h给予每种dAb。如图5所示，与未处理组或无关dAb处理组鼠比较，该治疗方法能加速真菌从阴道清除。不管应用哪种dAb，尽管本文中的大鼠的清除率似乎低于相应的dAb预处理结果，但处理组感染仍在对照组前得到完全治愈，尽管是在28天上。就这种治疗方法而言，抗SAP2和抗MP65dAb无统计学上显著性差异，而氟康唑在各检测点，就降低阴道CFU数目而言，明显更有效。利用抗SAP2和抗MP65 dAb混合物处理也没有明显优点。虽然如此，所有的处理组大鼠在28天时全部治愈。

念珠菌感染的全身控制

用标准方法评价了抗SAP2和抗MP65dAb控制全身性白色念珠菌C.albicans感染的能力。

简而言之，每只小鼠通过侧尾静脉注射1×10⁶细胞(0.2ml生理盐水中)使其慢性感染白色念珠菌。如前述给予小鼠抗SAP2或抗MP65dAb。测定较对照组动物的生存率。

另外，值得注意的是，在任何可能的感染前，给予有效剂量的dAb，可对易感受试者提供针对真菌感染的被动保护。所谓的有效剂量可以通过本技术领域公知的方法加以确定。

小鼠按1mg/kg或10mg/kg给予抗SAP2或抗MP65 dAb，然后通过尾静脉注射1×10⁶细胞(0.2ml生理盐水中)/每鼠给予白色念珠菌。测定较对照组动物的真菌感染率和生存率。结果发现，与对照组比较抗SAP2和抗MP65 dAb可保护小鼠防止真菌感染。

实施例3异二聚体的构建

将编码dAbs ADR3-6和ADR4-6的DNA按顺序以两种方向克隆到表达载体pDOM5D-5U中，得到两个独立的构建载体(ADR3-6/ADR4-6和ADR4-6/ADR3-6)。该载体以pDOM5为基础(如在单体构建实施例中所描述的pDOM4但没有噬菌体表达编码)，并在dAb克隆位点之间含有适合的接头。

蛋白质表达

表达和纯化如单体dAb生产所描述，采用了蛋白-A。用SDS-PAGE后考马斯亮蓝染色确定蛋白的纯度。

体内分析

每组选用5只卵巢切除的雌性Wistar大鼠(80-100g，CharlesRiver Breeding Laboratories，Calco，Italy)。动物饲养和总体照顾如它文所描述(De Bernardis，F.，et al.J.Infect.Dis.161，1276-1283(1990)。所有大鼠每隔一天注射50mg苯甲酸雌二醇(Amsa Farmaceutici srl，Rome，Italy)以保持假发情状态。首剂量注射雌二醇后6天，大鼠阴道内灌注各种二聚体分子20μg(0.1ml生理盐水中)，30min后，阴道内灌注含有10⁷白色念珠菌细胞(菌株SA-40)的0.1ml生理盐水溶液进行攻击实验。在含有氯霉素(50μg/ml)的Sabouraud琼脂板上培养取自各大鼠的10μl阴道液体(利用校准的塑料接菌环，Disponoic，PBI，Milan，Italy)计算酵母菌数。如在大鼠阴道灌洗液中检测到至少1个CFU，即计数为＞10³CFU/ml，该大鼠被认定为感染。

在本说明书中提及的所有出版物和在所述出版物中引用的参考文献都以参考文献的方式并入本文。各种对本发明所描述方法和体系的修饰和改变对本领域技术人员是显而易见的，但并未偏离本发明范围和精神之外。尽管本发明的描述都关联在特定的优选的实施方案中，但应理解为所要求保护的本发明不应被过度限制于这种特定的实施方案。事实上，对描述的用于开展本发明的模式所进行的各种修饰，对本领域或相关技术人员是显而易见的，这些修饰应包含在下面的要求范围之内。

实施例4

PEG化单特异性和异二聚dAb形式的产生：

将编码个体dAb的DNA序列克隆入表达载体pDOM5，采用PCR使其突变以改变编码最后dAb框架4氨基酸(通常为VH dAb的丝氨酸和VK dAb的精氨酸)到半胱氨酸(...TGC...密码子)的密码子。两个终止密码子(...TAATAA...)连在紧邻TGC密码子的3′位置。用类似的方法将半胱氨酸加入到异二聚构建体的3′dAb中。

蛋白表达：

突变单体构建体的表达和纯化如单体dAb中所述，对VH克隆用蛋白-A，或者对VK克隆用蛋白-L。突变二聚构建体的表达和纯化如使用蛋白-A的单体dAb中所述。突变单体和二聚构建体来说，两者都适用SDS-PAGE加考马斯亮蓝染色测定蛋白纯度。

PEG化：

单体和二聚形式中的dAb用标准马来酰亚胺接头化学法进行PEG化。PEG分子连接在天然的或加在dAb上的半胱氨酸或赖氨酸上。如果半胱氨酸或赖氨酸是加上的，则将其加在dAb的N或C端，或加在dAb框架内。

一旦PEG化完成，使用前就使用标准SEC纯化技术对其进行纯化分离。

结果：

对单体和二聚构建体的PEG化形式控制全身性白色念珠菌感染Balb/c小鼠进行有效性研究，方案类似于上述的鼠全身性模式。每组8只小鼠感染后2、6和24小时后，给予1mg/kg PEG化dAb蛋白或氟康唑。双特异性异二聚构建体ADR4-6/ADR3-6-PEG显示出最强的活性。该分子比其组分单体或氟康唑都更有效。

样品	存活率	平均存活时间(天)
			dAb稀释剂(PBS)	50％	2
ADR3-1-PEG	75％	＞30
			HEL4-PEG	62％	＞30
ADR3-6-PEG	62％	＞30
			ADR4-6-PEG	88％	＞30
ADR4-6\ADR3-6-PEG	88％	＞30
			ADR4-13-PEG	50％	4
ADR3-6\ADR4-6-PEG	100％	＞30
			氟康唑	88％	＞30
仅SA40	25％	2
			未感染小鼠	100％

序列表

SEQ ID No.1

GGGGGATCCATGTTTTTAAAGAATATTTTCATTG

SEQ ID No.2

CCTAAGCTTAGGTCAAGGCAGAAATACTGGAAGCAG

SEQ ID No.3

CCCGGATCCCTGTTCATGTTGTTACC

SEQ ID No.4

GGGCTGCAGGTGCTTAGTTAGAGTAA

ADR3-1SEQ ID No.5

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFPDYSMTWVRQAPGKGLEWVSLISNSGKT

TMYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKWVNRILQEFDYWGQ

GTLVTVSS

ADR3-2SEQ ID No.6

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISAALAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGV

PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQIGRRPDTFGQGTKVEIKRAAAEQKLISE

ED

ADR3-3SEQ ID No.7

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIKKKLAWYQQKPGKAPKLLIYNASHLQSGV

PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWRRFPITFGQGTKVEIKRAAAEQKLISE

ED

ADR3-4SEQ ID No.8

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIKKQLNWYQQKPGKAPKLLIYKASHLQSGV

PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMRVLPITFGQGTKVEIKRAAAEQKLIS

EED

ADR3-5SEQ ID No.9

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIKKHLAWYQQKPGKAPKLLIYGASHLQSGV

PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWRRKPITFGQGTKVEIKRAAAEQKLIS

EED

ADR3-6SEQ ID No.10

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIKKQLNWYQQKPGKAPKLLIYKASHLQSGV

PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWRRFPITFGQGTKVEIKRAAAEQKLISE

ED

ADR3-7SEQ ID No.11

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFPSYSMVWVRQAPGKGLEWVSLISKAGST

TLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKWVNRILQEFDYWGQG

TLVTVSS

ADR3-8SEQ ID No.12

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIKHSLQWYQQKPGKAPKLLIYKASRLQSGV

PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVKRRPGTFGQGTKVEIKRAAAEQKLIS

EED

ADR3-9SEQ ID No.13

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIKKQLNWYQQKPGKAPKLLIYKASHLQSGV

PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMRVLPITFGQGTKVEIKRAAAEQKLIS

EED

ADR4-2SEQ ID No.14

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIFIALKWYQQKPGKAPKLLIYNASVLQSGVP

SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQQSRKPQTFGQGTKVEIKRAAAEQKLISE

ED

ADR4-3SEQ ID No.15

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAQYRMAWVRQAPGKGLEWVSQINAQGT

QTGYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKWVGGARYTFDYWG

QGTLVTVSS

ADR4-4SEQ ID No.16

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFLDYQMSWRQAPGKGLEWVSGISRSGN

KTKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKWAGLNRHDFDYWG

QGTLVTVSS

ADR4-5SEQ ID No.17

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGDRISSEFMGWVRQAPGKGLEWVSAIYKPNGS

TYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGRARRTESTYQLRYW

GQGTLVTVSS

ADR4-6SEQ ID No.18

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFRVSNYDLTWVRQAPGKGLEWVSTISATNGS

TYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAVTWWLLRHNDNLGF

WGQGTLVTVSS

ADR4-7SEQ ID No.19

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSVTYQNMAWVRQAPGKGLEWVSTITVPNG

STYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGLGEVLRDGNANVQF

WGQGTLVTVSS

ADR4-8SEQ ID No.20

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSYKVMGWVRQAPGKGLEWVSAINRENG

STYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGFARRGAPHSASVEF

WGQGTLVTVSS

ADR4-9SEQ ID No.21

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGVRLSHQVMGWVRQAPGKGLEWVSAIRSSDG

STYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGWRSAKSQMHYWGQ

GTLVTVSS

ADR4-10SEQ ID No.22

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGVSVSAYTMSWVRQAPGKGLEWVSAILKKNG

STYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGRPSVTFGGPGKRYD

YHFQYWGQGTLVTVSS

ADR4-11SEQ ID No.23

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGVIFTDQTMGWVRQAPGKGLEWVSAIKTRDG

STYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARFLRPNASRGSAREAQ

IHSWGQGTLVTVSS

ADR4-12SEQ ID No.24

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGDTVSSKAMAWVRQAPGKGLEWVSGIFIPNGS

TYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAKQRAVLSRWGSSTEF

GSWGQGTLVTVSS

ADR4-13SEQ ID No.25

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSISYKNMAWVRQAPGKGLEWVSAIKAANG

STYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATGSQKKRTYTFDFWG

QGTLVTVSS

ADR4-14SEQ ID No.26

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDLYSMKWVRQAPGKGLEWVSGISANGM

ITWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWAAFDYRGQGTL

VTVSS

ADR4-15SEQ ID No.27

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAVYTMDWVRQAPGKGLEWVSSIRPMGH

QTRYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNGEIFDYWGQGTLV

TVSS

ADR4-16SEQ ID No.28

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFREYVMDWVRQAPGKGLEWVSGITGNGV

STRYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSESPGMAIFDYWGQ

GTLVTVSS

ADR4-17SEQ ID No.29

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRVYMMAWVRQAPGKGLEWVSKISSQGI

STHYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQARLGHQSFDYWG

QGTLVTVSS

ADR4-18SEQ ID No.30

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGLYSMSWVRQAPGKGLEWVSGILAGGG

ATSYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGLLLFDYWGQGTLV

TVSS

ADR4-19SEQ ID No.31

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFADYLMLWVRQAPGKGLEWVSAIGASGS

STIYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKKGMRLKQFDYWGQG

TLVTVSS

ADR4-20SEQ ID No.32

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFADYLMLWVRQAPGKGLEWVSAIGASGS

STIYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQARLGHQSFDYWGQ

GTLVTVSS

ADR4-21SEQ ID No.33

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGLYSMSWVRQAPGKGLEWVSGILAGGG

ATSYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAGDTAVYYCAKGLLLFDYWGQGTLV

TVSS

ADR4-22SEQ ID No.34

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFQSYSMMWVRQAPGKGLEWVSRISSRGLE

TYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRSRFQPRSFDYWGQG

TLVTVSS

ADR4-23SEQ ID No.35

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRMYSMRWVRQAPGKGLEWVSAISGSGG

STYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWGAFDYWGQGTL

VTVSS

Claims (74)

1.一种单域抗体(dAb)，其特征在于能结合来自念珠菌(Candidaspp.)的分泌型天冬氨酸蛋白酶(Sap)。

2.权利要求1的单域抗体(dAb)，其特征在于能结合Sap2。

3.权利要求2的单域抗体(dAb)，所述的单域抗体包括，优选组成为由下列序列组成的组中的任何序列：分别被命名为SEQ ID No14到SEQ ID No 35的ADR4-2、ADR4-3、ADR4-4、ADR4-5、ADR4-6、ADR4-7、ADR4-8、ADR4-9、ADR4-10、ADR4-11、ADR4-12、ADR4-13、ADR4-14、ADR4-15、ADR4-16、ADR4-17、ADR4-18、ADR4-19、ADR4-21、ADR4-22、ADR4-23。

4.权利要求2或3的单域抗体(dAb)，所述的单域抗体包括，优选组成为被命名为SEQ ID No 18的ADR4-6或被命名为SEQ IDNo 25的ADR4-13的序列。

5.前述权利要求中任一项的单域抗体(dAb)，其中所述的单域抗体结合如本文所定义的Sap，其K_off速率常数限定在5×10^-1～1×10^-7s^-1之间。

6.权利要求1的单域抗体(dAb)，所述的单域抗体结合Sap，其解离常数(Kd)为至少100μM到1pM。

7.权利要求4、5、6中任一项的单域抗体(dAb)，其特征在于能结合Sap2。

8.一种单域抗体(dAb)，其特征在于能结合来自念珠菌的分泌型天冬氨酸蛋白酶(Sap)，并且所述的单域抗体与被命名为SEQ IDNo 18的ADR4-6或被命名为SEQ ID No 25的ADR4-13的序列具有至少80％的氨基酸序列同一性。

9.一种单域抗体(dAb)，其特征在于能抑制来自念珠菌的分泌型天冬氨酸蛋白酶(Sap)的功能活性。

10.权利要求9的单域抗体(dAb)，其特征在于能抑制Sap2的功能活性。

11.权利要求10的单域抗体(dAb)，所述的单域抗体包括，优选组成为由下列序列组成的组中的任何序列：分别被命名为SEQ IDNo 14到SEQ ID No 35的ADR4-2、ADR4-3、ADR4-4、ADR4-5、ADR4-6、ADR4-7、ADR4-8、ADR4-9、ADR4-10、ADR4-11、ADR4-12、ADR4-13、ADR4-14、ADR4-15、ADR4-16、ADR4-17、ADR4-18、ADR4-19、ADR4-21、ADR4-22、ADR4-23。

12.前述权利要求中任一项的单域抗体(dAb)，所述的单域抗体包括，优选组成为被命名为SEQ ID No 18的ADR4-6或被命名为SEQ ID No 25的ADR4-13的序列。

13.一种单域抗体，其特征在于能抑制来自念珠菌的分泌型天冬氨酸蛋白酶(Sap)的功能活性，并且所述的单域抗体与被命名为SEQ ID No 18的ADR4-6或被命名为SEQ ID No 25的ADR4-13的序列具有至少80％的氨基酸序列同一性。

14.一种单域抗体，其特征在于能抑制来自念珠菌的甘露糖蛋白粘附素(MP)。

15.权利要求14的单域抗体，其特征在于能结合MP65。

16.权利要求15的单域抗体(dAb)，所述的单域抗体包括，优选组成为由下列序列组成的组中的任何序列：分别被命名为SEQ IDNo 5到SEQ ID No 13的ADR3-1、ADR3-2、ADR3-3、ADR3-4、ADR3-5、ADR3-6、ADR3-7、ADR3-8和ADR3-9。

17.权利要求15和16中任一项的单域抗体(dAb)，其中所述的单域抗体结合MP，其K_off速率常数限定在5×10^-1～1×10^-7s^-1之间。

18.权利要求15至17中任一项的单域抗体(dAb)，所述的单域抗体结合MP，其解离常数(Kd)为至少100μM到1pM。

19.权利要求18的单域抗体，其特征在于能结合MP65。

20.一种单域抗体(dAb)，其特征在于能抑制来自念珠菌的甘露糖蛋白粘附素(MP)，并且所述的单域抗体与由以下序列组成的组中的那些dAb具有80％的同一性：分别被命名为SEQ ID NO 5到SEQID No 13的ADR3-1、ADR3-2、ADR3-3、ADR3-4、ADR3-5、ADR3-6、ADR3-7、ADR3-8和ADR3-9。

21.一种单域抗体(dAb)，其特征在于能抑制来自念珠菌的甘露糖蛋白粘附素(MP)的功能活性。

22.权利要求21的单域抗体(dAb)，其特征在于能抑制MP65的功能活性。

23.一种单域抗体(dAb)，所述的单域抗体包括，优选组成为由下列序列组成的组中的任何序列：分别被命名为SEQ ID No 5到SEQ ID No 13的ADR3-1、ADR3-2、ADR3-3、ADR3-4、ADR3-5、ADR3-6、ADR3-7、ADR3-8和ADR3-9。

24.一种单域抗体(dAb)，其特征在于能抑制来自念珠菌的甘露糖蛋白粘附素(MP)的功能活性，并且所述的单域抗体与由以下序列组成的组中的那些dAb具有80％的同一性：分别被命名为SEQ IDNo 5到SEQ ID No 13的ADR3-1、ADR3-2、ADR3-3、ADR3-4、ADR3-5、ADR3-6、ADR3-7、ADR3-8和ADR3-9。

25.一种药用组合物，所述的药用组合物包含一种或多种前述权利要求中任一项的dAb和药学可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。

26.权利要求25的药用组合物，所述的药用组合物包含一种或多种MP65和Sap2结合dAb。

27.权利要求25的药用组合物，所述的药用组合物包含一种或多种能抑制MP65的功能活性的dAb，和一种或多种能抑制Sap2的功能活性的dAb。

28.一种预防和/或治疗患者念珠菌感染的方法，所述方法包括通过给予需要这种治疗的患者一种或多种前述权利要求中任一项的dAb，或其组合物。

29.权利要求1-24任何一项的dAb或权利要求25至28中任一项的组合物，所述的dAb或组合物用于预防和/或治疗念珠菌感染。

30.一种预防和/或治疗患者中唑类耐药的念珠菌感染的方法，所述方法包括给予需要这种治疗的患者权利要求1-24任何一项的dAb或权利要求25至28中任一项的组合物。

31.权利要求30的方法，其中所述的唑类为三唑。

32.权利要求31的预防和/或治疗唑类耐药的念珠菌感染的方法，所述方法包括给予需要这种治疗的患者权利要求1-24任何一项的dAb或权利要求25至28中任一项的组合物，其中所述的念珠菌感染对由如下唑类组成的组中的一种或多种药物耐药：伊曲康唑、氟康唑和伏立康唑。

33.权利要求30的治疗咪唑类耐药念珠菌感染的方法，所述方法包括给予需要这种治疗的患者权利要求1-24任何一项的dAb或权利要求25至28中任一项的组合物，其中所述的念珠菌感染对由如下药物组成的组中的一种或多种药物耐药：克霉唑、益康唑、芬替康唑、硫康唑和噻康唑。

34.前述权利要求中任一项的dAb、方法或组合物，其中所述的念珠菌感染为由下面念珠菌组成的组中的一种或多种：白色念珠菌(Candida albicans)、热带念珠菌(Candida tropicalis)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)、克鲁斯念珠菌(Candida krusei)、葡萄牙念珠菌(Candida lusitaniae)。

35.权利要求34的dAb、方法或组合物，其中所述的念珠菌感染为白色念珠菌。

36.前述权利要求中任一项的dAb、方法或组合物，其中所述的感染发生于由下面组成的组中的一个或多个位置：全身、粘膜、口腔、指甲下、支气管、肺部、阴道(包括外阴阴道)、食管和口咽部。

37.权利要求36的方法或dAb，其中所述的念珠菌感染为全身性或粘膜性的。

38.权利要求37的方法或dAb，其中所述的念珠菌感染为全身性的。

39.权利要求29至38中任一项的方法或dAb，其中所述的dAb通过由下面组成的列表中任何途经给予受试者：全身给药、局部给药、口服给药、鼻内给药和粘膜给药。

40.权利要求39的方法或应用，其中所述的dAb通过口服给药的方式给予受试者。

41.权利要求40的方法或应用，其中所述的dAb通过全身给药的方式给予受试者。

42.权利要求1至24中任一项的dAb或权利要求25至28中任一项的组合物在制备预防和/或治疗一种或多种免疫受损患者相关疾病的药物中的应用。

43.权利要求42的应用，其中所述的免疫受损患者正患有由如下疾病组成的组中的一种或多种疾病：HIV感染、AID和酵母菌感染。

44.权利要求42或43的应用，其中所述的dAb或其组合物以单剂量的形式给予患者。

45.权利要求44的应用，其中所述的dAb或其组合物以先单剂量后继以多剂量的形式给予患者。

46.一种预防和/或治疗患者全身性念珠菌感染的方法，其中所述的方法包括给予需要这种治疗的患者一种或多种如下药物的步骤：

(i)结合Sap和/或MP蛋白的抗体；

(ii)结合Sap和/或MP蛋白的抗体的片段；

(iii)结合Sap和/或MP蛋白的抗体的dAb。

47.一种预防和/或治疗患者全身性念珠菌感染的方法，其中所述的方法包括给予需要这种治疗的患者一种或多种如下药物的步骤：

(i)抑制Sap和/或MP蛋白功能活性的抗体；

(ii)抑制Sap和/或MP蛋白功能活性的抗体的片段；

(iii)抑制Sap和/或MP蛋白功能活性的dAb。

48.权利要求46或47的方法，其中所述的dAb通过全身方式给药。

49.权利要求46、47或48的方法，其中所述的抗体为单特异性的。

50.权利要求46-49任何一项的方法，其中的Sap为Sap2。

51.权利要求46-49任何一项的方法，其中的MP蛋白为MP65。

52.一种组合物，所述组合物包含含有与权利要求14-24的dAb连接的权利要求1-13的dAb的dAb多聚体。

53.权利要求52的组合物，其中所述的dAb多聚体为二聚体。

54.权利要求52或53的组合物，其中所述的dAb为直接连接。

55.权利要求52或53的组合物，其中所述的dAb通过接头连接。

56.一种药用组合物，所述的组合物包含权利要求52-55的dAb多聚体和药学可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。

57.一种预防和/或治疗医疗器械念珠菌感染的方法，所述方法包括用权利要求1-28、52-55的一种或多种dAb或其组合物处理有需要的医疗器械的步骤。

58.一种能结合Sap或MP的dAb，其中所述dAb的氨基酸序列与序列号分别为SEQ ID No 14到SEQ ID No 35的ADR4-2、ADR4-3、ADR4-4、ADR4-5、ADR4-6、ADR4-7、ADR4-8、ADR4-9、ADR4-10、ADR4-11、ADR4-12、ADR4-13、ADR4-14、ADR4-15、ADR4-16、ADR4-17、ADR4-18、ADR4-19、ADR4-21、ADR4-22、ADR4-23，或序列号分别为SEQ ID NO 5到SEQ ID No 13的ADR3-1、ADR3-2、ADR3-3、ADR3-4、ADR3-5、ADR3-6、ADR3-7、ADR3-8和ADR3-9的氨基酸序列相同，或与序列号分别为SEQ IDINo 14到SEQ ID No 35的ADR4-2、ADR4-3、ADR4-4、ADR4-5、ADR4-6、ADR4-7、ADR4-8、ADR4-9、ADR4-10、ADR4-11、ADR4-12、ADR4-13、ADR4-14、ADR4-15、ADR4-16、ADR4-17、ADR4-18、ADR4-19、ADR4-21、ADR4-22、ADR4-23，或序列号分别为SEQ ID NO 5到SEQ ID No 13的ADR3-1、ADR3-2、ADR3-3、ADR3-4、ADR3-5、ADR3-6、ADR3-7、ADR3-8和ADR3-9的氨基酸序列的不同之处不超过25个氨基酸位置，并且其CDR1序列与序列号分别为SEQ ID No 14到SEQ ID No 35的ADR4-2、ADR4-3、ADR4-4、ADR4-5、ADR4-6、ADR4-7、ADR4-8、ADR4-9、ADR4-10、ADR4-11、ADR4-12、ADR4-13、ADR4-14、ADR4-15、ADR4-16、ADR4-17、ADR4-18、ADR4-19、ADR4-21、ADR4-22、ADR4-23，或序列号分别为SEQ ID NO 5到SEQ ID No 13的ADR3-1、ADR3-2、ADR3-3、ADR3-4、ADR3-5、ADR3-6、ADR3-7、ADR3-8和ADR3-9的CDR1序列有至少50％的同一性。

59.一种能结合Sap或MP的dAb，其中所述dAb的氨基酸序列与序列号分别为SEQ ID No 14到SEQ ID No 35的ADR4-2、ADR4-3、ADR4-4、ADR4-5、ADR4-6、ADR4-7、ADR4-8、ADR4-9、ADR4-10、ADR4-11、ADR4-12、ADR4-13、ADR4-14、ADR4-15、ADR4-16、ADR4-17、ADR4-18、ADR4-19、ADR4-21、ADR4-22、ADR4-23，或序列号分别为SEQ ID NO 5到SEQ ID No 13的ADR3-1、ADR3-2、ADR3-3、ADR3-4、ADR3-5、ADR3-6、ADR3-7、ADR3-8和ADR3-9的氨基酸序列相同，或与序列号分别为SEQ IDNo 14到SEQ ID No 35的ADR4-2、ADR4-3、ADR4-4、ADR4-5、ADR4-6、ADR4-7、ADR4-8、ADR4-9、ADR4-10、ADR4-11、ADR4-12、ADR4-13、ADR4-14、ADR4-15、ADR4-16、ADR4-17、ADR4-18、ADR4-19、ADR4-21、ADR4-22、ADR4-23，或序列号分别为SEQ ID NO 5到SEQ ID No 13的ADR3-1、ADR3-2、ADR3-3、ADR3-4、ADR3-5、ADR3-6、ADR3-7、ADR3-8和ADR3-9的氨基酸序列的不同之处不超过25个氨基酸位置，并且其CDR2序列与序列号分别为SEQ ID No 14到SEQ ID No 35的ADR4-2、ADR4-3、ADR4-4、ADR4-5、ADR4-6、ADR4-7、ADR4-8、ADR4-9、ADR4-10、ADR4-11、ADR4-12、ADR4-13、ADR4-14、ADR4-15、ADR4-16、ADR4-17、ADR4-18、ADR4-19、ADR4-21、ADR4-22、ADR4-23，或序列号分别为SEQ ID NO 5到SEQ ID No 13的ADR3-1、ADR3-2、ADR3-3、ADR3-4、ADR3-5、ADR3-6、ADR3-7、ADR3-8和ADR3-9的CDR2序列有至少50％的同一性。

60.一种能结合Sap或MP的dAb，其中所述dAb的氨基酸序列与序列号分别为SEQ ID No 14到SEQ ID No 35的ADR4-2、ADR4-3、ADR4-4、ADR4-5、ADR4-6、ADR4-7、ADR4-8、ADR4-9、ADR4-10、ADR4-11、ADR4-12、ADR4-13、ADR4-14、ADR4-15、ADR4-16、ADR4-17、ADR4-18、ADR4-19、ADR4-21、ADR4-22、ADR4-23，或序列号分别为SEQ ID NO 5到SEQ ID No 13的ADR3-1、ADR3-2、ADR3-3、ADR3-4、ADR3-5、ADR3-6、ADR3-7、ADR3-8和ADR3-9的氨基酸序列相同，或与序列号分别为SEQ IDNo 14到SEQ ID No 35的ADR4-2、ADR4-3、ADR4-4、ADR4-5、ADR4-6、ADR4-7、ADR4-8、ADR4-9、ADR4-10、ADR4-11、ADR4-12、ADR4-13、ADR4-14、ADR4-15、ADR4-16、ADR4-17、ADR4-18、ADR4-19、ADR4-21、ADR4-22、ADR4-23，或序列号分别为SEQ ID NO 5到SEQ ID No 13的ADR3-1、ADR3-2、ADR3-3、ADR3-4、ADR3-5、ADR3-6、ADR3-7、ADR3-8和ADR3-9的氨基酸序列的不同之处不超过25个氨基酸位置，并且其CDR3序列与序列号分别为SEQ ID No 14到SEQ ID No 35的ADR4-2、ADR4-3、ADR4-4、ADR4-5、ADR4-6、ADR4-7、ADR4-8、ADR4-9、ADR4-10、ADR4-11、ADR4-12、ADR4-13、ADR4-14、ADR4-15、ADR4-16、ADR4-17、ADR4-18、ADR4-19、ADR4-21、ADR4-22、ADR4-23，或序列号分别为SEQ ID NO 5到SEQ ID No 13的ADR3-1、ADR3-2、ADR3-3、ADR3-4、ADR3-5、ADR3-6、ADR3-7、ADR3-8和ADR3-9的CDR3序列有至少50％的同一性。

61.一种能结合Sap或MP的dAb，其中所述dAb的氨基酸序列与序列号分别为SEQ ID No 14到SEQ ID No 35的ADR4-2、ADR4-3、ADR4-4、ADR4-5、ADR4-6、ADR4-7、ADR4-8、ADR4-9、ADR4-10、ADR4-11、ADR4-12、ADR4-13、ADR4-14、ADR4-15、ADR4-16、ADR4-17、ADR4-18、ADR4-19、ADR4-21、ADR4-22、ADR4-23，或序列号分别为SEQ ID NO 5到SEQ ID No 13的ADR3-1、ADR3-2、ADR3-3、ADR3-4、ADR3-5、ADR3-6、ADR3-7、ADR3-8和ADR3-9的氨基酸序列相同，或与序列号分别为SEQ IDNo 14到SEQ ID No 35的ADR4-2、ADR4-3、ADR4-4、ADR4-5、ADR4-6、ADR4-7、ADR4-8、ADR4-9、ADR4-10、ADR4-11、ADR4-12、ADR4-13、ADR4-14、ADR4-15、ADR4-16、ADR4-17、ADR4-18、ADR4-19、ADR4-21、ADR4-22、ADR4-23，或序列号分别为SEQ ID NO 5到SEQ ID No 13的ADR3-1、ADR3-2、ADR3-3、ADR3-4、ADR3-5、ADR3-6、ADR3-7、ADR3-8和ADR3-9的氨基酸序列的不同之处不超过25个氨基酸位置，并且其CDR1序列与序列号分别为SEQ ID No 14到SEQ ID No 35的ADR4-2、ADR4-3、ADR4-4、ADR4-5、ADR4-6、ADR4-7、ADR4-8、ADR4-9、ADR4-10、ADR4-11、ADR4-12、ADR4-13、ADR4-14、ADR4-15、ADR4-16、ADR4-17、ADR4-18、ADR4-19、ADR4-21、ADR4-22、ADR4-23，或序列号分别为SEQ ID NO 5到SEQ ID No 13的ADR3-1、ADR3-2、ADR3-3、ADR3-4、ADR3-5、ADR3-6、ADR3-7、ADR3-8和ADR3-9的CDR1序列有至少50％的同一性，且其CDR2序列与序列号分别为SEQ ID No 14到SEQ ID No 35的ADR4-2、ADR4-3、ADR4-4、ADR4-5、ADR4-6、ADR4-7、ADR4-8、ADR4-9、ADR4-10、ADR4-11、ADR4-12、ADR4-13、ADR4-14、ADR4-15、ADR4-16、ADR4-17、ADR4-18、ADR4-19、ADR4-21、ADR4-22、ADR4-23，或序列号分别为SEQ ID NO 5到SEQ ID No 13的ADR3-1、ADR3-2、ADR3-3、ADR3-4、ADR3-5、ADR3-6、ADR3-7、ADR3-8和ADR3-9的CDR2序列有至少50％的同一性。

62.一种能结合Sap或MP的dAb，其中所述dAb的氨基酸序列与序列号分别为SEQ ID No 14到SEQ ID No 35的ADR4-2、ADR4-3、ADR4-4、ADR4-5、ADR4-6、ADR4-7、ADR4-8、ADR4-9、ADR4-10、ADR4-11、ADR4-12、ADR4-13、ADR4-14、ADR4-15、ADR4-16、ADR4-17、ADR4-18、ADR4-19、ADR4-21、ADR4-22、ADR4-23，或序列号分别为SEQ ID NO 5到SEQ ID No 13的ADR3-1、ADR3-2、ADR3-3、ADR3-4、ADR3-5、ADR3-6、ADR3-7、ADR3-8和ADR3-9的氨基酸序列相同，或与序列号分别为SEQ IDNo 14到SEQ ID No 35的ADR4-2、ADR4-3、ADR4-4、ADR4-5、ADR4-6、ADR4-7、ADR4-8、ADR4-9、ADR4-10、ADR4-11、ADR4-12、ADR4-13、ADR4-14、ADR4-15、ADR4-16、ADR4-17、ADR4-18、ADR4-19、ADR4-21、ADR4-22、ADR4-23，或序列号分别为SEQ ID NO 5到SEQ ID No 13的ADR3-1、ADR3-2、ADR3-3、ADR3-4、ADR3-5、ADR3-6、ADR3-7、ADR3-8和ADR3-9的氨基酸序列的不同之处不超过25个氨基酸位置，并且其CDR2序列与序列号分别为SEQ ID No 14到SEQ ID No 35的ADR4-2、ADR4-3、ADR4-4、ADR4-5、ADR4-6、ADR4-7、ADR4-8、ADR4-9、ADR4-10、ADR4-11、ADR4-12、ADR4-13、ADR4-14、ADR4-15、ADR4-16、ADR4-17、ADR4-18、ADR4-19、ADR4-21、ADR4-22、ADR4-23，或序列号分别为SEQ ID NO 5到SEQ ID No 13的ADR3-1、ADR3-2、ADR3-3、ADR3-4、ADR3-5、ADR3-6、ADR3-7、ADR3-8和ADR3-9的CDR2序列有至少50％的同一性，且其CDR3序列与序列号分别为SEQ ID No 14到SEQ ID No 35的ADR4-2、ADR4-3、ADR4-4、ADR4-5、ADR4-6、ADR4-7、ADR4-8、ADR4-9、ADR4-10、ADR4-11、ADR4-12、ADR4-13、ADR4-14、ADR4-15、ADR4-16、ADR4-17、ADR4-18、ADR4-19、ADR4-21、ADR4-22、ADR4-23，或序列号分别为SEQ ID NO 5到SEQ ID No 13的ADR3-1、ADR3-2、ADR3-3、ADR3-4、ADR3-5、ADR3-6、ADR3-7、ADR3-8和ADR3-9的CDR3序列有至少50％的同一性。

63.一种能结合Sap或MP的dAb，其中所述dAb的氨基酸序列与序列号分别为SEQ ID No 14到SEQ ID No 35的ADR4-2、ADR4-3、ADR4-4、ADR4-5、ADR4-6、ADR4-7、ADR4-8、ADR4-9、ADR4-10、ADR4-11、ADR4-12、ADR4-13、ADR4-14、ADR4-15、ADR4-16、ADR4-17、ADR4-18、ADR4-19、ADR4-21、ADR4-22、ADR4-23，或序列号分别为SEQ ID NO 5到SEQ ID No 13的ADR3-1、ADR3-2、ADR3-3、ADR3-4、ADR3-5、ADR3-6、ADR3-7、ADR3-8和ADR3-9的氨基酸序列相同，或与序列号分别为SEQ IDNo 14到SEQ ID No 35的ADR4-2、ADR4-3、ADR4-4、ADR4-5、ADR4-6、ADR4-7、ADR4-8、ADR4-9、ADR4-10、ADR4-11、ADR4-12、ADR4-13、ADR4-14、ADR4-15、ADR4-16、ADR4-17、ADR4-18、ADR4-19、ADR4-21、ADR4-22、ADR4-23，或序列号分别为SEQ ID NO 5到SEQ ID No 13的ADR3-1、ADR3-2、ADR3-3、ADR3-4、ADR3-5、ADR3-6、ADR3-7、ADR3-8和ADR3-9的氨基酸序列的不同之处不超过25个氨基酸位置，并且其CDR1序列与序列号分别为SEQ ID No 14到SEQ ID No 35的ADR4-2、ADR4-3、ADR4-4、ADR4-5、ADR4-6、ADR4-7、ADR4-8、ADR4-9、ADR4-10、ADR4-11、ADR4-12、ADR4-13、ADR4-14、ADR4-15、ADR4-16、ADR4-17、ADR4-18、ADR4-19、ADR4-21、ADR4-22、ADR4-23，或序列号分别为SEQ ID NO 5到SEQ ID No 13的ADR3-1、ADR3-2、ADR3-3、ADR3-4、ADR3-5、ADR3-6、ADR3-7、ADR3-8和ADR3-9的CDR1序列有至少50％的同一性，且其CDR3序列与序列号分别为SEQ ID No 14到SEQ ID No 35的ADR4-2、ADR4-3、ADR4-4、ADR4-5、ADR4-6、ADR4-7、ADR4-8、ADR4-9、ADR4-10、ADR4-11、ADR4-12、ADR4-13、ADR4-14、ADR4-15、ADR4-16、ADR4-17、ADR4-18、ADR4-19、ADR4-21、ADR4-22、ADR4-23，或序列号分别为SEQ ID NO 5到SEQ ID No 13的ADR3-1、ADR3-2、ADR3-3、ADR3-4、ADR3-5、ADR3-6、ADR3-7、ADR3-8和ADR3-9的CDR3序列有至少50％的同一性。

64.一种能结合Sap或MP的dAb，其中所述dAb的氨基酸序列与序列号分别为SEQ ID No 14到SEQ ID No 35的ADR4-2、ADR4-3、ADR4-4、ADR4-5、ADR4-6、ADR4-7、ADR4-8、ADR4-9、ADR4-10、ADR4-11、ADR4-12、ADR4-13、ADR4-14、ADR4-15、ADR4-16、ADR4-17、ADR4-18、ADR4-19、ADR4-21、ADR4-22、ADR4-23，或序列号分别为SEQ ID NO 5到SEQ ID No 13的ADR3-1、ADR3-2、ADR3-3、ADR3-4、ADR3-5、ADR3-6、ADR3-7、ADR3-8和ADR3-9的氨基酸序列相同，或与序列号分别为SEQ IDNo 14到SEQ ID No 35的ADR4-2、ADR4-3、ADR4-4、ADR4-5、ADR4-6、ADR4-7、ADR4-8、ADR4-9、ADR4-10、ADR4-11、ADR4-12、ADR4-13、ADR4-14、ADR4-15、ADR4-16、ADR4-17、ADR4-18、ADR4-19、ADR4-21、ADR4-22、ADR4-23，或序列号分别为SEQ ID NO 5到SEQ ID No 13的ADR3-1、ADR3-2、ADR3-3、ADR3-4、ADR3-5、ADR3-6、ADR3-7、ADR3-8和ADR3-9的氨基酸序列的不同之处不超过25个氨基酸位置，并且其CDR1序列与序列号分别为SEQ ID No 14到SEQ ID No 35的ADR4-2、ADR4-3、ADR4-4、ADR4-5、ADR4-6、ADR4-7、ADR4-8、ADR4-9、ADR4-10、ADR4-11、ADR4-12、ADR4-13、ADR4-14、ADR4-15、ADR4-16、ADR4-17、ADR4-18、ADR4-19、ADR4-21、ADR4-22、ADR4-23，或序列号分别为SEQ ID NO 5到SEQ ID No 13的ADR3-1、ADR3-2、ADR3-3、ADR3-4、ADR3-5、ADR3-6、ADR3-7、ADR3-8和ADR3-9的CDR1序列有至少50％的同一性，且其CDR2序列与序列号分别为SEQ ID No 14到SEQ ID No 35的ADR4-2、ADR4-3、ADR4-4、ADR4-5、ADR4-6、ADR4-7、ADR4-8、ADR4-9、ADR4-10、ADR4-11、ADR4-12、ADR4-13、ADR4-14、ADR4-15、ADR4-16、ADR4-17、ADR4-18、ADR4-19、ADR4-21、ADR4-22、ADR4-23，或序列号分别为SEQ ID NO 5到SEQ ID No 13的ADR3-1、ADR3-2、ADR3-3、ADR3-4、ADR3-5、ADR3-6、ADR3-7、ADR3-8和ADR3-9的CDR2序列有至少50％的同一性，且其CDR3序列与序列号分别为SEQ ID No 14到SEQ ID No 35的ADR4-2、ADR4-3、ADR4-4、ADR4-5、ADR4-6、ADR4-7、ADR4-8、ADR4-9、ADR4-10、ADR4-11、ADR4-12、ADR4-13、ADR4-14、ADR4-15、ADR4-16、ADR4-17、ADR4-18、ADR4-19、ADR4-21、ADR4-22、ADR4-23，或序列号分别为SEQ ID NO 5到SEQ ID No 13的ADR3-1、ADR3-2、ADR3-3、ADR3-4、ADR3-5、ADR3-6、ADR3-7、ADR3-8和ADR3-9的CDR3序列有至少50％的同一性。

65.一种能结合Sap或MP的dAb，其中所述dAb的CDR1序列与序列号分别为SEQ ID No 14到SEQ ID No 35的ADR4-2、ADR4-3、ADR4-4、ADR4-5、ADR4-6、ADR4-7、ADR4-8、ADR4-9、ADR4-10、ADR4-11、ADR4-12、ADR4-13、ADR4-14、ADR4-15、ADR4-16、ADR4-17、ADR4-18、ADR4-19、ADR4-21、ADR4-22、ADR4-23，或序列号分别为SEQ ID NO 5到SEQ ID No 13的ADR3-1、ADR3-2、ADR3-3、ADR3-4、ADR3-5、ADR3-6、ADR3-7、ADR3-8和ADR3-9的CDR1序列有至少50％的同一性。

66.一种能结合Sap或MP的dAb，其中所述dAb的CDR2序列与序列号分别为SEQ ID No 14到SEQ ID No 35的ADR4-2、ADR4-3、ADR4-4、ADR4-5、ADR4-6、ADR4-7、ADR4-8、ADR4-9、ADR4-10、ADR4-11、ADR4-12、ADR4-13、ADR4-14、ADR4-15、ADR4-16、ADR4-17、ADR4-18、ADR4-19、ADR4-21、ADR4-22、ADR4-23，或序列号分别为SEQ ID NO 5到SEQ ID No 13的ADR3-1、ADR3-2、ADR3-3、ADR3-4、ADR3-5、ADR3-6、ADR3-7、ADR3-8和ADR3-9的CDR2序列有至少50％的同一性。

67.一种能结合Sap或MP的dAb，其中所述dAb的CDR3序列与序列号分别为SEQ ID No 14到SEQ ID No 35的ADR4-2、ADR4-3、ADR4-4、ADR4-5、ADR4-6、ADR4-7、ADR4-8、ADR4-9、ADR4-10、ADR4-11、ADR4-12、ADR4-13、ADR4-14、ADR4-15、ADR4-16、ADR4-17、ADR4-18、ADR4-19、ADR4-21、ADR4-22、ADR4-23，或序列号分别为SEQ ID NO 5到SEQ ID No 13的ADR3-1、ADR3-2、ADR3-3、ADR3-4、ADR3-5、ADR3-6、ADR3-7、ADR3-8和ADR3-9的CDR3序列有至少50％的同一性。

68.一种结合Sap或MP的dAb，其中所述dAb具有CDR1序列和CDR2序列，CDR1序列与DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、DOM16-39-109(SEQ IDNO：432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438)和DOM16-39-200(SEQID NO：441)的CDR1序列具有至少50％同一性；CDR2序列与DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ IDNO：430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ IDNO：438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)的CDR2序列具有至少50％同一性。

69.一种结合Sap或MP的dAb，其中所述dAb具有CDR2序列和CDR3序列，CDR2序列与DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、DOM16-39-109(SEQ IDNO：432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438)和DOM16-39-200(SEQID NO：441)的CDR2序列具有至少50％同一性；CDR3序列与DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQID NO：420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ IDNO：430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ IDNO：438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)的CDR3序列具有至少50％同一性。

70.一种结合Sap或MP的dAb，其中所述dAb具有CDR1序列和CDR3序列，CDR1序列与DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、DOM16-39-109(SEQ IDNO：432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438)和DOM16-39-200(SEQID NO：441)的CDR1序列具有至少50％同一性；CDR3序列与DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ IDNO：430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ IDNO：438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)的CDR3序列具有至少50％同一性。

71.一种结合Sap或MP的dAb，其中所述dAb具有CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列，CDR1序列与DOM16-39(SEQ IDNO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、DOM16-39-100(SEQ IDNO：423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、DOM16-39-109(SEQ IDNO：432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438)和DOM16-39-200(SEQID NO：441)的CDR1序列具有至少50％同一性；CDR2序列与DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ IDNO：430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ IDNO：438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)的CDR2序列具有至少50％同一性；CDR3序列与DOM16-39(SEQ ID NO：345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO：420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO：423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO：430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO：432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO：438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO：441)的CDR3序列具有至少50％同一性。

72.权利要求1-24、29和58-71中任一项的dAb，权利要求25-27和56中任一项的药用组合物，或权利要求52-55中任一项的组合物，其中所述的dAb、药用组合物或组合物任选包含半衰期延长部分。

73.权利要求71的dAb、药用组合物或组合物，其中所述的半衰期延长部分为PEG。

74.权利要求71的dAb、药用组合物或组合物，其中所述的半衰期延长部分结合在血清白蛋白上。

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