CN101321784A - 针对egfr和igf－ir的纳米抗体tm和多肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及针对表皮生长因子受体(EGFR)和/或胰岛素生长因子－I受体(IGF－IR)的多肽和纳米抗体。本发明还涉及编码所述纳米抗体和多肽的核酸；制备所述纳米抗体和多肽的方法；表达或能够表达所述纳米抗体或多肽的宿主细胞；组合物，且具体地药物组合物，其包括所述纳米抗体、多肽、核酸和/或宿主细胞；和所述纳米抗体、多肽、核酸、宿主细胞和/或组合物的用途，具体地其对于预防、治疗或诊断目的的用途。

Description

针对EGFR和IGF-IR的纳米抗体TM和多肽
本发明涉及针对表皮生长因子受体和/或胰岛素生长因子-I受体(分别地，“EGFR”和“IGF-IR”)的多肽和纳米抗体TM。[注意：纳米抗体TM(NanobodyTM，NanobodiesTM)和纳米克隆TM(NanocloneTM)是Ablynx N.V.的商标]
本发明还涉及编码所述纳米抗体和多肽的核酸；制备所述纳米抗体和多肽的方法；表达或能够表达所述纳米抗体或多肽的宿主细胞；包含所述纳米抗体、多肽、核酸和/或宿主细胞的组合物，且特别是药物组合物；和所述纳米抗体，多肽，核酸，宿主细胞和/或组合物，特别地对预防，治疗或诊断目的，如本文所提及的预防，治疗或诊断目的的应用。
通过本文进一步的描述，本发明的其他方面，实施方案，优势和应用将会变清楚。
申请人的国际申请WO 05/044858和WO 04/041867描述了针对EGFR的纳米抗体，包含所述纳米抗体的多肽，包含所述纳米抗体和多肽的组合物，以及用于制备和使用所述纳米抗体，多肽和组合物的方法。
通常，本发明的目的是提供针对EGFR的纳米抗体和包含所述纳米抗体的多肽，所述纳米抗体和所述多肽是WO 05/044858和WO 04/041867中所述的纳米抗体和多肽的另一种选择，且优选地具有与WO 05/044858和WO04/041867中所述的纳米抗体和多肽相比的改良特性。
特别地，本发明的目的是提供一定范围的针对EGFR的改良纳米抗体和多肽。例如，在一个优选的，但非限制性的实施方案中，本发明提供这样的针对EGFR的纳米抗体，所述纳米抗体与胞外域EGFR结合，与与EGFR上的EGF，TGFα而不与爱必妥(Eribtux)结合位点相竞争。在另一个优选的，但非限制性的实施方案中，本发明提供这样的纳米抗体，其与胞外域EGFR结合，并与EGFR上的EGF，爱必妥和TGFα结合位点相竞争。在再一个优选的，但非限制性的实施方案中，本发明提供这样的纳米抗体，其与胞外域EGFR结合，并与EGFR上的TGFα，而不与EGF或爱必妥结合位点相竞争。如本文进一步描述地，全部这些不同类型的纳米抗体和多肽依赖于对用途所需的特性，可以发现不同的(治疗的或诊断的)效用。
通常，本文中所述的纳米抗体和多肽，以及特别地，本文中所述的改良的针对EGFR的纳米抗体，可以用于WO 05/044858和WO 04/041867中公开的纳米抗体和多肽的所有应用和用途。因此，例如，在制备WO 05/044858和WO 04/041867中所述的多肽和纳米抗体构建体中，可以用本文所述的纳米抗体代替WO 05/044858和WO 04/041867中所述的针对EGFR的纳米抗体。而且，可以如WO 05/044858和WO 04/041867中所述地配制和应用本文所述的纳米抗体和多肽。
特别地，本文所述的纳米抗体，多肽和组合物可以用在预防，诊断和/或治疗与EGFR和/或IGF-IR相关的疾病和病症中，且具体地，与过表达EGFR和/或IGF-IR(即，在某些组织或细胞中)相关的或通过其表征的疾病和病症中。所述疾病和病症的实例对于技术人员而言是很清楚的，且其包括不同形式的癌症和肿瘤，诸如本文所提及的那些，以及某些皮肤炎症疾病。
本文所述的抗IGF-IR纳米抗体本身可以用于治疗癌症和其他与IGF-IR(的过表达)相关的其它疾病和病症，但还可以用于增强任何抗EGFR治疗(例如，用抗EGFR化合物，抗EGFR抗体(包括抗体片段)，或用抗EGFR纳米抗体或多肽的治疗)，用于减少所述治疗中所使用的抗EGFR化合物或抗体的量(及由此例如减少与其相关的副作用)，和/或防止或降低针对抗EGFR治疗的抗性。所述抗EGFR治疗的实例对于技术人员而言是很清楚的，例如来自本文所引用的相关现有技术。例如，还参考Friess等，临床癌症研究(Clin.Cancer Res)，11(14)，2005，5300和Thaker等，临床癌症研究(Clin.Cancer Res.)，11(13)，2005，4923。已经成功地将多种小鼠单克隆抗体引入到临床前和临床应用中，例如，来自Imclone系统(Imclonesystems)的IMC-C225(爱必妥或西妥昔单抗(Cetuximab))，来自默克(Merck)的EMD7200(马妥珠单抗(Matuzumab))，来自Abgenix的ABX-EGF(帕尼单抗(Panitumumab))和来自Genmab的2F8。
而且，通常，利用WO 05/044858和WO 04/041867中所述的一种或多种体外测定，体内测定，基于细胞的测定或动物模型，可以确定本文所述的纳米抗体和多肽的体外和/或体内活性和/或功效。参考Roovers等，“由拮抗的抗EGFR纳米抗体引起对EGFR信号转导和肿瘤生长的有效抑制”(“Efficient inhibition of EGFR signalling and of tumor growth by antagonisiticanti-EGFR Nanobodies”)(原稿已被提交用于公开)。用于评估本文所述的纳米抗体，多肽和组合物，特别地在治疗肿瘤和/或抑制肿瘤细胞生长或增殖中功效的其他测定，模型和技术对于技术人员而言是很清楚的，例如来自与本文所提及的EGFR和IGF-IR相关的现有技术。
本发明的另一个目的是提供针对IGF-IR的纳米抗体，和包含所述纳米抗体的多肽。
关于IGF-I受体在癌症中的作用以及癌症治疗中靶向IGF-IR的方案，还特别参考Hofman和Garcia-Echeverria，当今药物发现(Drug DiscoveryToday)，卷10，15，2005年8月，1041；Papa等，癌症研究(Cancer Res.)，1993年8月15日，53(16)：3736-40；Arteaga等，临床调查杂志(J.Clin.Invest.)，卷84.，1989年11月，1418-1423；Maloney等，癌症研究(Cancer Research)63，5073-5083，2003；Baehr和Groner，生长因子(Growth Factors)，2005年3月，23(1)1-14；Ulfarsson等，临床癌症研究(Clin.Cancer Res.)，2005，11(13)，2005；Burtrum等，癌症研究(Cancer Research)，63，8912-8921(2003)；Miyamoto等，临床癌症研究(Clin.Cancer Res.)，2005，11(9)，2005；Hailey等，分子癌症治疗学(Molecular Cancer Therapeutics)，卷1，1349-1353，2002年12月。
还报告了IGF-I受体在开发对Herceptin的抗性中起作用(Altundag等，分子癌症治疗学(Mol.Cancer Ther.)，2005，(4)7，1136；Monnier等，癌症报告(Bull.Cancer.)，2004年9月；91(9)：685-94；Chakravarti等，癌症研究(Cancer Research)62，200-207，2002)。在例如下列文献中描述了EGF和IGF-I的协同作用：Faisal等，外科研究杂志(Journal of Surgical Research)，69，354-358(1997)，Adams等，生长因子(Growth Factors)，2004年6月，卷22(2)，89-95，和Knowlden，内分泌学(Endocrinology)，2005年7月21日(印刷前的电子公开)。由Chong等，生物化学和生物物理的研究交流(Biochem.Biophys.Res.Commun.)，2004，322(2)：535-41描述了EGFR信号的IGF的增强。由例如van den Berg等，英国癌症杂志(Br.J.Cancer)，1996，73(4)：477-81描述了乳腺癌中EGFR和IGF-IR表达的联合。由Cohen等，临床癌症研究(Clinical Cancer Research)卷11，2063-2073(2005)描述了利用针对IGF-IR的单克隆抗体的癌症组合治疗法。Lu等，JBC，卷279.，第4号，2856-2865(2004)描述了利用双特异性单克隆抗体同时阻断EGFR和IGF-IR对癌细胞生长的影响。Manes等，内分泌学(Endocrinology)，卷138，第3号，905描述了IGF-IR的表位定位。
在本发明中，通常，这些目的是通过使用本文提供的纳米抗体和多肽实现的。
因此，本发明的一个目的是提供改良的针对EGFR的纳米抗体，和/或针对IGF-IR的纳米抗体和多肽，具体地，分别地针对EGFR或IGF-IR，来自温血动物，更具体地，分别地针对EGFR或IGF-IR，来自哺乳动物，和尤其针对人EGFR或IGF-R，提供包含或基本由至少一种所述纳米抗体组成的蛋白质和多肽。
具体地，本发明的一个目的是提供这样的纳米抗体和这样的蛋白质和/或多肽，其适用于在温血动物中，且具体地哺乳动物中，以及更具体地人类中的预防，治疗和/或诊断应用。
更具体地，本发明的一个目的是提供这样的纳米抗体和这样的蛋白质和/或多肽，其可以用于在温血动物中，和具体地哺乳动物中，以及更具体地人类中，预防，治疗，减轻和/或诊断一种或多种分别与EGFR或IGF-IR相关的，和/或分别由EGFR或IGF-IR介导的疾病，病症或状况(condition)(诸如本文中所提及的疾病，病症和状况)。
本发明还有一个目的是提供这样的纳米抗体和这样的蛋白质和/或多肽，其可以用于制备药物或兽用组合物，所述药物或兽用组合物用于预防和/或治疗温血动物中，和具体地哺乳动物中，以及更具体地人类中的一种或多种分别与EGFR或IGF-IR相关的，和/或分别由EGFR或IGF-IR介导的疾病，病症或状况(诸如本文中所提及的疾病，病症和状况)。
本发明的一个特定的但非限制性目的是提供分别针对EGFR或IGF-IR的纳米抗体，蛋白质和/或多肽，其与分别针对EGFR或IGF-IR的常规抗体或其片段以及WO 05/044858和WO 04/041867中描述的抗EGFR纳米抗体和多肽相比，具有改良的治疗和/或药理特性和/或其他有利特性(诸如，例如，改良的制备便易性和/或降低的材料成本)，所述常规抗体片段诸如Fab’片段，F(ab’)2片段，ScFv构建体，“双抗体”和/或其他种类的(单)结构域抗体，诸如由Ward等(下文)描述的“dAb’s。这些改良的和有利的特性将在本文进一步的描述中变得清楚。
这些目的通过本文所述的纳米抗体，蛋白质和多肽实现。这些纳米抗体在本文中还称为“本发明的纳米抗体”且这些蛋白质和多肽在本文中还统称为“本发明的多肽”。
因此，在第一个方面，本发明涉及针对EGFR的改良纳米抗体，和具体地，涉及针对来自温血动物的EGFR的纳米抗体，和更具体地，涉及针对来自哺乳动物的EGFR的改良纳米抗体，以及尤其涉及针对人EGFR的改良纳米抗体，其中所述改良的纳米抗体定义如下。
在另一个方面，本发明涉及直接针对IGF-IR的小于15kDa的结合多肽。在一个实施方案中，所述结合多肽能够抑制IGF-I与IGF-IR的相互作用。在优选的实施方案中，所述多肽是单结构域抗体，结构域抗体，“dAb”，VH，VHH或纳米抗体。
因此，本发明优选地涉及针对IGF-IR的纳米抗体，和具体地涉及针对来自温血动物的IGF-IR的纳米抗体，和更具体地，涉及针对来自哺乳动物的IGF-IR的纳米抗体，以及尤其涉及针对人IGF-IR的纳米抗体。
在另一个方面，本发明涉及这样的蛋白质或多肽，所述蛋白质或多肽包括或基本由至少一种所述分别针对EGFR或IGF-IR的纳米抗体组成。
按照另一个实施方案，本发明提供针对EGFR的纳米抗体和多肽，以及用于组合治疗，特别地用于癌症治疗中的针对EGFR的纳米抗体。在所述组合治疗中，本文中所述的针对IGF-IR的纳米抗体和多肽可以与WO05/044858和WO 04/041867中所述的抗EGFR纳米抗体和多肽，和/或与本文中所述的抗EGFR纳米抗体和多肽共同使用。
按照一个特定的但非限制性的实施方案中，如本文所述的多肽包括至少一种针对EGFR的纳米抗体和至少一种针对IGF-IR的纳米抗体。在所述双特异性纳米抗体构建体中，本文所述的针对IGF-IR的纳米抗体和多肽可以与一种或多种WO 05/044858和WO 04/041867中所述的抗EGFR纳米抗体和多肽，和/或一种或多种本文中所述的抗EGFR纳米抗体和多肽共同使用。
对于技术人员十分清楚的是为了制药应用，本发明的纳米抗体和多肽优选地分别针对人EGFR或IGF-IR，而为了兽医的目的，本发明的纳米抗体和多肽优选地分别针对来自待治疗物种的EGFR或IGF-IR。
而且，按照本发明，分别针对来自第一温血动物物种EGFR或IGF-IR的纳米抗体和多肽可以表现或可以不表现出与分别来自一种或多种其他温血动物物种EGFR或IGF-IR的交叉反应性。例如，分别针对人EGFR或IGF-IR的纳米抗体和多肽可以表现或可以不表现出与分别来自一种或多种灵长类动物其它物种的EGFR或IGF-IR，和/或与分别来自一种或多种动物物种的EGFR或IGF-IR的交叉反应性，所述动物物种通常用于疾病的动物模型中(例如，小鼠，大鼠，兔，猪或狗)，和特别地在分别与EGFR或IGF-IR相关的疾病和病症的动物模型中，(诸如本文所提及的物种和动物模型)。在这个方面，对于技术人员而言清楚的是，就药物开发的观点而言，所述交叉反应性在出现时具有优势，其原因在于它容许在所述疾病模型中测试分别针对人EGFR或IGF-IR的纳米抗体和多肽。
更一般地，本发明的范围还包括分别针对来自一种动物物种的EGFR或IGF-IR的纳米抗体和多肽用于治疗另一种动物物种(诸如分别针对人EGFR或IGF-IR的纳米抗体和多肽)，只要所述纳米抗体和/或多肽的应用在待治疗物种中提供所需的作用。
本发明处于其最广泛的意义中，且不具体地受到本发明纳米抗体和多肽所分别针对的EGFR或IGF-IR的特异性抗原决定簇，表位，部分，结构域，亚单位或构象(confirmation)(当合适时)的限制或由其定义。然而，特别地，本发明的纳米抗体和多肽可以针对暴露在细胞表面上的表位。
还属于本发明范围的是，当合适时，本发明的纳米抗体可以分别与EGFR或IGF-IR的两个或多个抗原决定簇，表位，部分，结构域，亚单位或构象结合。在所述情形中，分别与本发明的纳米抗体和多肽结合的EGFR或IGF-IR的抗原决定簇，表位，部分，结构域或亚单位可以基本相同(例如，如果EGFR或IGF-IR分别含有重复的结构基序，或以多聚体存在)或可以不同(且在另一种情形中，本发明的纳米抗体和多肽可以分别与EGFR或IGF-IR的这类不同抗原决定簇，表位，部分，结构域或亚单位结合，其具有可能相同或不同的亲和力和/或特异性)。而且，例如，当EGFR或IGF-IR分别以有活性构象和无活性构象存在时，本发明的纳米抗体和多肽可以与这些构象中的任一种结合，或可以与全部两种这些构象结合(即，其具有可能相同或不同的亲和力和/或特异性)。而且，例如，本发明的纳米抗体和多肽可以分别与EGFR或IGF-IR的构象结合，其中它与相关的配体结合，本发明的纳米抗体和多肽可以分别与EGFR或IGF-IR的构象结合，其中它不与相关的配体结合，或者本发明的纳米抗体和多肽可以与全部两种所述构象结合(也具有可能相同或不同的亲和力和特异性)。
还预期本发明的纳米抗体和多肽应该通常分别与EGFR或IGF-IR的所有天然存在的或合成的类似物，变体，突变体，等位基因，部分和片段结合，或至少与EGFR或IGF-IR的那些类似物，变体，突变体，等位基因，部分和片段分别结合，所述类似物，变体，突变体，等位基因，部分和片段含有一个或多个抗原决定簇或表位，所述抗原决定簇或表位与EGFR或IGF-IR中本发明的纳米抗体和多肽所结合的抗原决定簇或表位分别基本相同(例如，分别在野生型EGFR或IGF-IR中)。此外，在这样的情形中，本发明的纳米抗体和多肽可以以这样的亲和力和/或特异性与所述类似物，变体，突变体，等位基因，部分和片段结合，所述亲和力和/或特异性与本发明的纳米抗体分别结合于(野生型)EGFR或IGF-IR的亲和力和/或特异性相同或不同(即，更高或更低)。本发明的范围还包括，本发明的纳米抗体和多肽分别与EGFR或IGF-IR的一些类似物，变体，突变体，等位基因，部分和片段结合，但不与其他结合。
当EGFR或IGF-IR分别以单体形式和一种或多种多聚体形式存在时，本发明的范围包括，本发明的纳米抗体和多肽仅与处于单体形式的EGFR或IGF-IR分别结合，或本发明的纳米抗体和多肽另外还与一种或多种所述多聚体形式结合。而且，当EGFR或IGF-IR可以分别与其他蛋白质或多肽联合形成蛋白质复合物时，本发明的范围包括，本发明的纳米抗体和多肽与处于非联合状态的EGFR或IGF-IR分别结合，与处于其联合状态的EGFR或IGF-IR分别结合，或与全部二者结合。在所有这些情形中，本发明的纳米抗体和多肽可以以这样的亲和力和/或特异性与所述多聚体或联合的蛋白质复合物结合，所述亲和力和/或特异性与本发明的纳米抗体分别结合于处于单体和非联合状态的EGFR或IGF-IR的亲和力和/或特异性可能相同或不同(即，更高或更低)。
通常，如技术人员应该清楚的是，本发明的纳米抗体和多肽应该至少与就生物和/或治疗的观点而言最相关的那些形式(包括单体，多聚体和联合形式)结合。
本发明的范围还包括应用本发明的纳米抗体和多肽的部分，片段，类似物，突变体，变体，等位基因和/或衍生物，和/或应用包括或基本由该相同成分组成的蛋白质或多肽，只要这些适合于本文所证实的应用。将在本文叙述中进一步描述所述部分，片段，类似物，突变体，变体，等位基因，衍生物，蛋白质和/或多肽。
如本文更详细讨论地，本发明的纳米抗体通常包括单氨基酸链，认为所述单氨基酸链包括“构架序列”或“FR”(通常如本文所述)和“互补决定区”或“CDR”。本发明的纳米抗体中存在的一些优选的CDR如本文所述。
更一般地，对于针对IGF-IR并具有本文给出的进一步定义参考的纳米抗体，本发明的纳米抗体中存在的CDR序列是可获得的/可以通过包括下列步骤的方法获得：
a)通过通常包括下列步骤的方法，提供至少一个针对IGF-IR的VHH结构域，所述步骤是：(i)免疫接种属于骆驼科的具有IGF-IR或其部分或片段的哺乳动物，从而增加针对IGF-IR的免疫响应和/或抗体(和特别是重链抗体)；(ii)从由此免疫接种的哺乳动物中获得生物样品，其中所述样品包括针对IGF-IR的重链抗体序列和/或VHH序列；和(iii)从所述生物样品中获得(例如，分离)针对IGF-IR的重链抗体序列和/或VHH序列；和/或通过通常包括下列步骤的方法，提供至少一个针对IGF-IR的VHH结构域，所述步骤是：(i)筛选文库，所述文库包括重链抗体序列和/或重链抗体序列的VHH序列和/或针对IGF-IR或针对其至少一部分或片段的VHH序列；和(ii)从所述文库获得(例如，分离)针对IGF-IR的重链抗体序列和/或VHH序列；
b)任选地对由此获得的针对IGF-IR的重链抗体序列和/或VHH序列进行亲和力成熟，诱变(例如，随机诱变或指定位点的诱变)，和/或任何其他增加IGF-IR的重链抗体序列和/或VHH序列亲和力和/或特异性的技术；
c)确定由此获得的针对IGF-IR的重链抗体序列和/或VHH序列的CDR序列；和任选地
d)提供纳米抗体，其中至少一个，优选地至少两个，和更优选地全部三个CDR(即，CDR1，CDR2和CDR3，以及特别地至少CDR3)具有由步骤c确定的序列。
通常，在步骤d)中，本发明纳米抗体中存在的所有CDR序列来源于相同的重链抗体或VHH序列。然而，处于其最广泛意义中的本发明不受此限制。例如，还有可能(尽管常常是不优选的)，在本发明的纳米抗体中，适当地组合来自两种或三种不同的针对IGF-IR的重链抗体或VHH序列，和/或在本发明的纳米抗体中，适当地组合来自一个或多个源自重链抗体或VHH序列的CDR或VHH序列(特别地，至少CDR3)，所述重链抗体或VHH序列具有一个或多个源自不同来源的CDR(例如，合成的CDR或源自人抗体或VH结构域的CDR)。
按照本发明非限制性但优选的实施方案，本发明纳米抗体中的CDR序列是本发明的纳米抗体以这样的解离常数(KD)和/或这样的结合亲和力和/或这样的亲和力分别结合于EGFR或IGF-IR，所述解离常数是10-5-10-12摩尔/升或更低，和优选地10-7-10-12摩尔/升或更低，和更优选地10-8-10-12摩尔/升或更低，所述结合亲和力是至少107M-1，优选地至少108M-1，更优选地至少109M-1，诸如至少1012M-1，所述亲和力低于500nM，优选地低于200nM，更优选地低于10nM，诸如低于500pM。本发明纳米抗体分别针对EGFR或IGF-IR的亲和力可以通过本身已知的方式确定，例如利用本文所述的测定。
在优选的但非限制性的方面，本发明涉及针对EGFR的纳米抗体(如本文所定义的)，其由4个构架区(分别地，FR1-FR4)和3个互补决定区(分别地，CDR1-CDR3)组成，其中：
(a)CDR1是这样的氨基酸序列，其选自由下列各项组成的组：
TYTMA    [SEQ ID NO：42]
SYGMG    [SEQ ID NO：43]
GFAMG    [SEQ ID NO：44]
SNNMG    [SEQ ID NO：45]
GDVMG    [SEQ ID NO：46]
SYVVG    [SEQ ID NO：47]
DYNMA    [SEQ ID NO：48]
TYTMA    [SEQ ID NO：49]
NNAMA    [SEQ ID NO：50]
SYVMG    [SEQ ID NO：51]
SYAMG    [SEQ ID NO：52]
A        [SEQ ID NO：53]
或选自由这样的氨基酸序列组成的组，所述氨基酸序列具有与以上氨基酸序列之一至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％，甚至更优选地至少99％的序列同一性(如本文所定义的)；其中
i)任意氨基酸替换优选地是保守的氨基酸替换(如本文所定义的)；和/或
ii)所述氨基酸序列与以上氨基酸序列相比，优选地仅含有氨基酸替换，且没有氨基酸缺失或插入；
和/或选自由这样的氨基酸序列组成的组，所述氨基酸序列与以上氨基酸序列之一相比具有2个或仅1个的“氨基酸的区别”(如本文所定义的)，其中：
i)任意氨基酸替换优选地是保守的氨基酸替换(如本文所定义的)；和/或
ii)所述氨基酸序列与以上氨基酸序列相比，优选地仅含有氨基酸替换，且没有氨基酸缺失或插入；
和/或其中：
(b)CDR2是这样的氨基酸序列，其选自由下列各项组成的组：
GISRSDGGTYDADSVKG    [SEQ ID NO：54]
GISWRGDSTGYADSVKG    [SEQ ID NO：55]
AISWSGGSLLYVDSVKG    [SEQ ID NO：56]
AIGWGGLETHYSDSVKG    [SEQ ID NO：57]
GFSRSTSTTHYADSVKG    [SEQ ID NO：58]
GIAWGDGITYYADSVKG    [SEQ ID NO：59]
HISWLGGRTYYRDSVKG    [SEQ ID NO：60]
GFSGSGGATYYAHSVEG    [SEQ ID NO：61]
AISWRGGSTYYADSVKG    [SEQ ID NO：62]
AINWSSGSTYYADSVKG    [SEQ ID NO：63]
TLAWDSGSTYYADSVKG    [SEQ ID NO：64]
GLSWSADSTYYADSVKG    [SEQ ID NO：65]
或选自由这样的氨基酸序列组成的组，所述氨基酸序列与以上氨基酸序列之一相比具有至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％，甚至更优选地至少99％的序列同一性(如本文所定义的)；其中
i)任意氨基酸替换优选地是保守的氨基酸替换(如本文所定义的)；和/或
ii)所述氨基酸序列与以上氨基酸序列相比，优选地仅含有氨基酸替换，且没有氨基酸缺失或插入；
和/或选自由这样的氨基酸序列组成的组，所述氨基酸序列与以上氨基酸序列之一相比具有3个，2个或仅1个的“氨基酸的区别”(如本文所定义的)，其中：
i)任意氨基酸替换优选地是保守的氨基酸替换(如本文所定义的)；和/或
ii)所述氨基酸序列与以上氨基酸序列相比，优选地仅含有氨基酸替换，且没有氨基酸缺失或插入；
和/或其中：
(c)CDR3是这样的氨基酸序列，其选自由下列各项组成的组：
ASVKLVYVNPNRYSY    [SEQ ID NO：66]
AAGSAWYGTLYEYDY    [SEQ ID NO：67]
AAGSTWYGTLYEYDY    [SEQ ID NO：68]
MVGPPPRSLDYGLGNHYEYDY    [SEQ ID NO：69]
SSTRTVIYTLPRMYNY         [SEQ ID NO：70]
NSRSSWVIFTIKGQYDR        [SEQ ID NO：71]
RPGMIITTIQATYGF          [SEQ ID NO：72]
GSPYGTELPYTRIEQYAY       [SEQ ID NO：73]
ANEYWVYVNPNRYTY          [SEQ ID NO：74]
RRKSGEVVFTIPARYDY        [SEQ ID NO：75]
VYRVGAISEYSGTDYYTDEYDY   [SEQ ID NO：76]
GYQINSGNYNFKDYEYDY       [SEQ ID NO：77]
SYNVYYNNYYYPISRDEYDY     [SEQ ID NO：78]
HRRPFASVFTTTRMYDY        [SEQ ID NO：79]
或选自由这样的氨基酸序列组成的组，所述氨基酸序列与以上氨基酸序列之一相比具有至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％，甚至更优选地至少99％的序列同一性(如本文所定义的)；其中
i)任意氨基酸替换优选地是保守的氨基酸替换(如本文所定义的)；和/或
ii)所述氨基酸序列与以上氨基酸序列相比，优选地仅含有氨基酸替换，且没有氨基酸缺失或插入；
和/或选自由这样的氨基酸序列组成的组，所述氨基酸序列与以上氨基酸序列之一相比具有3个，2个或仅1个的“氨基酸的区别”(如本文所定义的)，其中：
i)任意氨基酸替换优选地是保守的氨基酸替换(如本文所定义的)；和/或
ii)所述氨基酸序列与以上氨基酸序列相比，优选地仅含有氨基酸替换，且没有氨基酸缺失或插入；
在另一个优选的但非限制性的方面，本发明涉及针对IGF-IR的纳米抗体(如本文所定义的)，其由4个构架区(分别地，FR1-FR4)和3个互补决定区(分别地，CDR1-CDR3)组成，其中：
(a)CDR1是这样的氨基酸序列，其选自由下列各项组成的组：
FNAMG    [SEQ ID NO：94]
INVMA    [SEQ ID NO：95]
NYAMG    [SEQ ID NO：96]
RTAMA    [SEQ ID NO：97]
或选自由这样的氨基酸序列组成的组，所述氨基酸序列与以上氨基酸序列之一相比具有至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％，甚至更优选地至少99％的序列同一性(如本文所定义的)；其中
i)任意氨基酸替换优选地是保守的氨基酸替换(如本文所定义的)；和/或
ii)所述氨基酸序列与以上氨基酸序列相比，优选地仅含有氨基酸替换，且没有氨基酸缺失或插入；
和/或选自由这样的氨基酸序列组成的组，所述氨基酸序列与以上氨基酸序列之一相比具有2个或仅1个的“氨基酸的区别”(如本文所定义的)，其中：
i)任意氨基酸替换优选地是保守的氨基酸替换(如本文所定义的)；和/或
ii)所述氨基酸序列与以上氨基酸序列相比，优选地仅含有氨基酸替换，且没有氨基酸缺失或插入；
和/或其中：
(b)CDR2是这样的氨基酸序列，其选自由下列各项组成的组：
VIISGGSTHYVDSVKG     [SEQ ID NO：98]
EITRSGRTNYVDSVKG     [SEQ ID NO：99]
AINWNSRSTYYADSVKG    [SEQ ID NO：100]
TITWNSGTTRYADSVKG    [SEQ ID NO：101]
或选自由这样的氨基酸序列组成的组，所述氨基酸序列与以上氨基酸序列之一相比具有至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％，甚至更优选地至少99％的序列同一性(如本文所定义的)；其中
i)任意氨基酸替换优选地是保守的氨基酸替换(如本文所定义的)；和/或
ii)所述氨基酸序列与以上氨基酸序列相比，优选地仅含有氨基酸替换，且没有氨基酸缺失或插入；
和/或选自由这样的氨基酸序列组成的组，所述氨基酸序列与以上氨基酸序列之一相比具有3个，2个或仅1个的“氨基酸的区别”(如本文所定义的)，其中：
i)任意氨基酸替换优选地是保守的氨基酸替换(如本文所定义的)；和/或
ii)所述氨基酸序列与以上氨基酸序列相比，优选地仅含有氨基酸替换，且没有氨基酸缺失或插入；
和/或其中：
(c)CDR3是这样的氨基酸序列，其选自由下列各项组成的组：
KKFGDY              [SEQ ID NO：102]
IDGSWREY            [SEQ ID NO：103]
SHDSDYGGTNANLYDY    [SEQ ID NO：104]
TAAAVITPTRGYYNY     [SEQ ID NO：105]
或选自由这样的氨基酸序列组成的组，所述氨基酸序列与以上氨基酸序列之一相比具有至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％，甚至更优选地至少99％的序列同一性(如本文所定义的)；其中
i)任意氨基酸替换优选地是保守的氨基酸替换(如本文所定义的)；和/或
ii)所述氨基酸序列与以上氨基酸序列相比，优选地仅含有氨基酸替换，且没有氨基酸缺失或插入；
和/或选自由这样的氨基酸序列组成的组，所述氨基酸序列与以上氨基酸序列之一相比具有3个，2个或仅1个的“氨基酸的区别”(如本文所定义的)，其中：
i)任意氨基酸替换优选地是保守的氨基酸替换(如本文所定义的)；和/或
ii)所述氨基酸序列与以上氨基酸序列相比，优选地仅含有氨基酸替换，且没有氨基酸缺失或插入；
由此，在表A-1中分别对EGFR或IGF-IR，列出了本发明纳米抗体中存在的一些特别优选的但非限制性的CDR序列和CDR序列的组合，见下。
Figure A20068004496800251
Figure A20068004496800261
由此，在本发明的纳米抗体中，存在的CDR1，CDR2和CDR3中的至少一种分别选自由表A-1中对EGFR或IGF-IR的分别列出的CDR1，CDR2和CDR3序列组成的组，或分别选自由这样的CDR1，CDR2和CDR3组成的组，所述CDR1，CDR2和CDR3与表A-1中分别对EGFR或IGF-IR所列出的CDR1，CDR2和CDR3序列中的至少一种分别相比，具有至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％，甚至更优选地至少99％“序列同一性”(如本文所定义的)，和/或分别选自由这样的CDR1，CDR2和CDR3序列组成的组，所述CDR1，CDR2和CDR3与表A-1中分别对EGFR或IGF-IR所列出的CDR1，CDR2和CDR3序列中的至少一种分别相比，具有3个，2个或仅1个“氨基酸区别”(如本文所定义的)。
特别地，在本发明的纳米抗体中，至少存在的CDR3序列选自由表A-1中对EGFR或IGF-IR分别列出的CDR3序列组成的组，或选自由这样的CDR3序列组成的组，所述CDR3与表A-1中分别对EGFR或IGF-IR所列出的CDR3序列中的至少一种相比，具有至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％，甚至更优选地至少99％序列同一性，和/或分别选自由这样的CDR3组成的组，所述CDR3表与A-1中分别对EGFR或IGF-IR所列出的CDR3序列中的至少一种相比，具有3个，2个或仅1个氨基酸区别。
优选地，在本发明的纳米抗体中，存在的CDR1，CDR2和CDR3中的至少两种分别选自由表A-1中对EGFR或IGF-IR的分别列出的CDR1，CDR2和CDR3序列组成的组，或分别选自由这样的CDR1，CDR2和CDR3序列组成的组，所述CDR1，CDR2和CDR3序列分别与表A-1中分别对EGFR或IGF-IR所列出的CDR1，CDR2和CDR3序列中的至少一种相比，具有至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％，甚至更优选地至少99％序列同一性，和/或分别选自由这样的CDR1，CDR2和CDR3序列组成的组，所述CDR1，CDR2和CDR3序列与表A-1中分别对EGFR或IGF-IR所列出的CDR1，CDR2和CDR3序列中的至少一种分别相比，具有3个，2个或仅1个“氨基酸区别”。
特别地，在本发明的纳米抗体中，至少存在的CDR3序列选自由表A-1中对EGFR或IGF-IR分别列出的CDR3序列组成的组，或选自由这样的CDR3序列组成的组，所述CDR3与表A-1中分别对EGFR或IGF-IR所列出的CDR3序列中的至少一种相比，具有至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％，甚至更优选地至少99％序列同一性，且存在的CDR1和CDR2序列中的至少一种选自分别由表A-1中对EGFR或IGF-IR分别列出的CDR1和CDR2序列组成的组，或选自由这样的CDR1和CDR2序列组成的组，所述CDR1和CDR2与表A-1中分别对EGFR或IGF-IR所列出的CDR1和CDR2的至少一种具有至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％，甚至更优选地至少99％序列同一性，和/或分别选自由这样的CDR1和CDR2序列组成的组，所述CDR1和CDR2与表A-1中分别对EGFR或IGF-IR所列出的CDR1和CDR2序列中的至少一种分别相比，具有3个，2个或仅1个氨基酸区别。
最优选地，在本发明的纳米抗体中，全部三种存在的CDR1，CDR2和CDR3序列选自由表A-1中对EGFR或IGF-IR的分别列出的CDR1，CDR2和CDR3序列组成的组，或分别选自由这样的CDR1，CDR2和CDR3序列组成的组，所述CDR1，CDR2和CDR3序列分别与表A-1中分别对EGFR或IGF-IR所列出的CDR1，CDR2和CDR3序列中的至少一种相比，具有至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％，甚至更优选地至少99％序列同一性，和/或分别选自由这样的CDR1，CDR2和CDR3序列组成的组，所述CDR1，CDR2和CDR3序列与表A-1中分别对EGFR或IGF-IR所列出的CDR1，CDR2和CDR3序列中的至少一种分别相比，具有3个，2个或仅1个氨基酸区别。
甚至更优选地，在本发明的纳米抗体中，存在的CDR1，CDR2和CDR3序列中的至少一种分别选自由表A-1中分别对EGFR或IGF-IR所列出的CDR1，CDR2和CDR3序列组成的组。优选地，在该实施方案中，至少一种或优选地全部另外两种存在的CDR序列选自由这样的CDR序列，所述CDR序列分别与表A-1中分别对EGFR或IGF-IR所列出的相应CDR序列中的至少一种相比，具有至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％，甚至更优选地至少99％序列同一性，和/或选自由这样的CDR序列组成的组，所述CDR序列分别与表A-1中分别对EGFR或IGF-IR所列出的相应序列中的至少一种相比，具有3个，2个或仅1个氨基酸区别。
特别地，在本发明的纳米抗体中，至少存在的CDR3序列选自由表A-1中对EGFR或IGF-IR分别列出的CDR3组成的组。优选地，在该实施方案中，存在的至少一种和优选地全部CDR1和CDR2序列分别选自这样的CDR1和CDR2序列组，所述CDR1和CDR2序列分别与表A-1中分别对EGFR或IGF-IR所列出的CDR1和CDR2序列相比，具有至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％，甚至更优选地至少99％序列同一性，和/或选自由这样的CDR1和CDR2序列组成的组，所述CDR1和CDR2序列分别与表A-1中分别对EGFR或IGF-IR所列出的CDR1和CDR2序列中的至少一种相比，具有3个，2个或仅1个氨基酸区别。
甚至更优选地，在本发明的纳米抗体中，存在的CDR1，CDR2和CDR3中的至少两种分别选自由表A-1中分别对EGFR或IGF-IR所列出的CDR1，CDR2和CDR3序列组成的组。优选地，在该实施方案中，剩余存在的CDR序列选自由这样的CDR序列组成的组，所述CDR序列分别与表A-1中分别对EGFR或IGF-IR所列出的相应CDR序列中的至少一种相比，具有至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％，甚至更优选地至少99％序列同一性，和/或选自由这样的CDR序列组成的组，所述CDR序列与表A-1中分别对EGFR或IGF-IR所列出的相应序列中的至少一种相比，具有3个，2个或仅1个氨基酸区别。
特别地，在本发明的纳米抗体中，至少CDR3序列选自由表A-1中对EGFR或IGF-IR分别列出的CDR3序列组成的组，且CDR1序列或CDR2序列分别选自由表A-1中对EGFR或IGF-IR分别列出的CDR1和CDR2序列组成的组。优选地，在该实施方案中，剩余存在的CDR序列选自这样的CDR序列组，所述CDR序列分别与表A-1中分别对EGFR或IGF-IR所列出的相应CDR序列中的至少一种相比，具有至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％，甚至更优选地至少99％序列同一性，和/或选自由这样的CDR序列组成的组，所述CDR序列与表A-1中分别对EGFR或IGF-IR所列出的相应的CDR序列相比，具有3个，2个或仅1个氨基酸区别。
甚至更优选地，在本发明的纳米抗体中，全部三种存在的CDR1，CDR2和CDR3分别选自由表A-1中分别对EGFR或IGF-IR所列出的CDR1，CDR2和CDR3序列组成的组。
而且，通常，表A-1中分别对EGFR或IGF-IR所列出的CDR的组合(即，表A-1中在同一行中提及的那些)是优选的。因此，通常优选地，当本发明纳米抗体中的CDR是表A-1中所提及的CDR序列或选自这样的CDR序列组，其中所述CDR序列与表A-1中分别对EGFR或IGF-IR所列出的CDR序列相比，具有至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％，甚至更优选地至少99％序列同一性，和/或选自由这样的CDR序列组成的组，所述CDR序列与表A-1中分别对EGFR或IGF-IR所列出的CDR序列相比，具有3个，2个或仅1个氨基酸区别时，其他CDR中的至少一种和优选地全部两种选自属于表A-1中相同组合中(即，在表A-1中同一行中提及)的CDR序列，或选自这样的CDR序列组，所述CDR序列与属于相同组合中的CDR序列相比，具有至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％，甚至更优选地至少99％序列同一性，和/或选自由这样的CDR序列组成的组，所述CDR序列与属于相同组合中的CDR序列相比，具有3个，2个或仅1个氨基酸区别。以上段落中指出的其他优选方案也适用于表A-1提及的CDR的组合。
由此，通过非限制性实例，本发明的纳米抗体可以例如包括CDR1序列，其与表A-1中所提及的CDR1序列之一相比，具有超过80％的序列同一性，CDR2序列，其与表A-1中所提及的CDR2序列之一相比，具有3个，2个或1个氨基酸区别(但属于不同的组合)和CDR3序列。
本发明一些优选的纳米抗体可以例如包括：(1)CDR1序列，其与表A-1中所提及的CDR1序列之一相比，具有超过80％的序列同一性；CDR2序列，其与表A-1中所提及的CDR2序列之一相比，具有3个，2个或1个氨基酸区别(但属于不同的组合)；和CDR3序列，其与表A-1中所提及的CDR3序列之一相比，具有超过80％的序列同一性(但属于不同的组合)；或(2)CDR1序列，其与表A-1中所提及的CDR1序列之一相比，具有超过80％的序列同一性；CDR2序列，和表A-1中分别对EGFR或IGF-IR所列出CDR3序列之一，或(3)CDR1序列；CDR2序列，其与表A-1中分别对EGFR或IGF-IR所列出CDR2序列之一相比，具有超过80％的序列同一性；CDR3序列，其与表A-1中所提及的与CDR2序列属于相同组合的CDR3序列相比，具有3个，2个或1个氨基酸区别。
本发明一些特别优选的纳米抗体可以例如包括：(1)CDR1序列，其与表A-1中所提及的CDR1序列之一相比，具有超过80％的序列同一性；CDR2序列，其与表A-1中所提及的属于相同组合的CDR2序列相比，具有3个，2个或1个氨基酸区别；和CDR3序列，其与表A-1中所提及的属于相同组合的CDR3序列相比，具有超过80％的序列同一性；(2)CDR1序列；表A-1中分别对EGFR或IGF-IR所列出CDR2，和表A-1中分别对EGFR或IGF-IR所列出CDR3序列，(其中CDR2序列和CDR3序列可以属于不同的组合)。
本发明一些甚至更优选的纳米抗体可以例如包括：(1)CDR1序列，其与表A-1中所提及的CDR1序列之一相比，具有超过80％的序列同一性；表A-1中分别对EGFR或IGF-IR所列出的属于相同组合的CDR2序列；和表A-1中所提及的属于不同组合的CDR3序列；或(2)表A-1中所提及的CDR1序列；CDR2序列，其与表A-1中所提及的属于相同组合的CDR2序列相比，具有3个，2个或1个氨基酸区别；和CDR3序列，其与表A-1中分别对EGFR或IGF-IR所列出属于相同或不同组合的CDR3序列相比，具有超过80％的序列同一性。
本发明特别优选的纳米抗体可以例如包括表A-1中所提及的CDR1序列，CDR2序列，其与表A-1中所提及的属于相同组合的CDR2序列相比，具有超过80％的序列同一性；和表A-1中所提及的属于相同组合的CDR3序列。
在本发明最优选的纳米抗体中，存在的CDR1，CDR2和CDR3序列选自表A-1中分别对EGFR或IGF-IR所列出CDR1，CDR2和CDR3序列的组合之一。
优选地，当CDR序列选自这样的CDR序列的组时，其中所述CDR序列与表A-1中分别对EGFR或IGF-IR所列出CDR序列之一相比，具有至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％，甚至更优选地至少99％序列同一性(如本文所定义)，和/或当CDR序列选自这样的CDR序列的组时，其中所述CDR序列与表A-1中分别对EGFR或IGF-IR所列出CDR序列之一相比，具有3个，2个或仅1个氨基酸区别，
i)任意氨基酸替换优选地是保守的氨基酸替换(如本文所定义的)；和/或
ii)所述氨基酸序列与表A-1中分别对EGFR或IGF-IR所列出CDR序列相比，优选地仅含有氨基酸替换，且没有氨基酸缺失或插入；
按照本发明的非限制性但优选的实施方案，本发明纳米抗体中的CDR序列如上定义，且还使本发明的纳米抗体以这样的解离常数(KD)和/或这样的结合亲和力和/或这样的亲和力分别结合于EGFR或IGF-IR，所述解离常数是10-5-10-12摩尔/升或更低，和优选地10-7-10-12摩尔/升或更低，和更优选地10-8-10-12摩尔/升或更低，所述结合亲和力是至少107M-1，优选地至少108M-1，更优选地至少109M-1，诸如至少1012M-1，所述亲和力低于500nM，优选地低于200nM，更优选地低于10nM，诸如低于500pM。本发明分别针对EGFR或IGF-IR的纳米抗体的亲和力可以通过本身已知的方式确定，例如利用本文所述的测定。
按照本发明的另一个优选的但非限制性的实施方案，(a)CDR1具有1-12个氨基酸残基的长度，且通常2-9个氨基酸残基，诸如5，6或7个氨基酸残基；和/或(b)CDR2具有13-24个氨基酸残基的长度，且通常15-21个氨基酸残基，诸如16或17个氨基酸残基；和/或(c)CDR3具有2-35个氨基酸残基的长度，通常3-30个氨基酸残基，诸如6-23个氨基酸残基。
具有以上CDR序列的纳米抗体优选地具有如本文进一步定义的构架序列。
在另一个方面，本发明涉及具有这样的氨基酸序列的纳米抗体，所述氨基酸序列选自由SEQ ID NO’s：80-93组成的组，或选自由与SEQ ID NO’s：80-93的氨基酸序列中的一个或多个相比，具有超过80％，优选地超过90％，更优选地超过95％，诸如99％或更高序列同一性(如本文所定义的)的氨基酸序列组成的组。
在另一个方面，本发明涉及具有这样的氨基酸序列的纳米抗体，所述氨基酸序列选自由SEQ ID NO’s：106-109组成的组，或选自由与SEQ ID NO’s：106-109的氨基酸序列中的一个或多个相比，具有超过80％，优选地超过90％，更优选地超过95％，诸如99％或更高序列同一性(如本文所定义的)的氨基酸序列组成的组。
按照特定但非限制性的实施方案，较后面的氨基酸序列已经被人源化了，如本文进一步所述。
本发明的多肽包括或基本由至少一个本发明的纳米抗体组成。在SEQ IDNO’s：110-143中给出一些本发明优选的但非限制性的多肽实例。
通常，包括或基本由单一纳米抗体(诸如单一本发明的纳米抗体)组成的蛋白质或多肽在本文中称为“单价”蛋白质或多肽或称为“单价构建体”。包括或基本由两个或更多纳米抗体(诸如至少两个本发明的纳米抗体或至少一个本发明的纳米抗体和至少一个其他纳米抗体)组成的蛋白质或多肽在本文中称为“多价”蛋白质或多肽或称为“多价构建体”，且它们与本发明相应的单价纳米抗体相比，可以提供某些优势。从本文进一步的叙述中，所述多价构建体的一些非限制性实例将变得清楚。
按照一个特定但非限制性的实施方案，本发明的多肽包括或基本由至少两个本发明的纳米抗体，诸如两个或三个本发明的纳米抗体组成。如本文进一步所述，该多价构建体与包括或基本由单个本发明纳米抗体组成的蛋白质或多肽相比，可以提供某些优势，诸如分别对EGFR或IGF-IR改良了很多的亲和力和/或特异性。
按照另一个特定但非限制性的实施方案，本发明的多肽包括或基本由至少一个本发明的纳米抗体和至少一个其他纳米抗体(即，针对另一个表位，抗原，靶标，蛋白质或多肽)组成。所述蛋白质或多肽在本文中还称为“多特异性”蛋白质或多肽或称为“多特异性构建体”，且它们与本发明相应的单价纳米抗体相比，可以提供某些优势。此外，从本文进一步的叙述中，所述多特异性构建体的一些非限制性实例将变得清楚。
按照再一个特定但非限制性的实施方案，本发明的多肽包括或基本由至少一个本发明的纳米抗体，任选地一个或多个其他纳米抗体，和至少一个其他氨基酸序列(诸如蛋白质或多肽)组成，所述氨基酸序列对本发明的纳米抗体和/或由此产生的融合蛋白赋予至少一种所需特性。此外，所述融合蛋白与本发明相应的单价纳米抗体相比，可以提供某些优势。从本文进一步的叙述中，所述氨基酸序列和所述融合构建体的一些非限制性实例将变得清楚。
还有可能组合两个或更多个以上实施方案，例如从而提供三价双特异性构建体，所述三价双特异性构建体包括两个本发明的纳米抗体和一个其他纳米抗体，和任选地一个或多个其他氨基酸序列。所述构建体以及本发明上下文中所特别优选的一些构建体的其他非限制性实例将通过本文进一步的叙述变得清楚。
在以上构建体中，一个或多个纳米抗体和/或其他氨基酸序列可以直接连接或通过一个或多个连接体序列连接。所述连接体的一些合适的但非限制性实例将通过本文进一步的叙述变得清楚。
在本发明的一个优选的实施方案中，本发明的多肽包括一个或多个(诸如两个或优选地一个)本发明的纳米抗体，其与一个或多个(诸如两个和优选地一个)氨基酸序列连接(任选地通过一个或多个合适的连接体序列)，所述氨基酸序列容许由此产生的本发明的多肽穿过血脑屏障。具体地，所述一个或多个容许由此产生的本发明多肽穿过血脑屏障的氨基酸序列可以是一个或多个(诸如两个和优选地一个)纳米抗体，如WO 02/057445中所述的纳米抗体，其中FC44(SEQ ID NO：35)和FC5(SEQ ID NO：36)是一些优选的非限制性实例。
在本发明的另一个优选的实施方案中，本发明的多肽包括一个或多个(诸如两个或优选地一个)本发明的纳米抗体，其与一个或多个(诸如两个和优选地一个)氨基酸序列连接(任选地通过一个或多个合适的连接体序列)，所述氨基酸序列赋予由此产生的本发明多肽增长的体内半衰期。具体地，所述赋予由此产生的本发明多肽增长的体内半衰期的氨基酸序列可以是一个或多个(诸如两个和优选地一个)纳米抗体，且具体地，针对人血清蛋白如人血清清蛋白的纳米抗体，其中PMP6A6(“ALB-1”，SEQ ID NO：32)，ALB-8(ALB-1的人源化形式，SEQ ID NO：33)和PMP6A8(“ALB-2”，SEQ IDNO：34)是一些优选的非限制性实例。本申请中，由以下提及的申请人描述了针对小鼠或人血清清蛋白的合适纳米抗体的其他实例。
在本发明的再一个优选的实施方案中，本发明的多肽包括一个或多个(诸如两个或优选地一个)本发明的纳米抗体，一个或多个(诸如两个和优选地一个)容许由此产生的本发明的多肽跨越血脑屏障的氨基酸序列，和一个或多个(诸如两个和优选地一个)赋予由此产生的本发明的多肽增长的体内半衰期的氨基酸序列(任选地通过一个或多个合适的连接体序列)。而且，所述一个或多个容许由此产生的本发明的多肽跨越血脑屏障的氨基酸序列可以是一个或多个(诸如两个和优选地一个)纳米抗体(如本文所提及的)，且所述赋予由此产生的本发明的多肽增长的体内半衰期的氨基酸序列可以是一个或多个(诸如两个和优选地一个)纳米抗体(也如本文所提及的)。
按照本发明非限制性但优选的实施方案，本发明的多肽优选地以这样的解离常数(KD)和/或这样的结合亲和力和/或这样的亲和力分别结合于EGFR或IGF-IR，所述解离常数是10-5-10-12摩尔/升或更低，和优选地10-7-10-12摩尔/升或更低，和更优选地10-8-10-12摩尔/升，所述结合亲和力是至少107M-1，优选地至少108M-1，更优选地至少109M-1，诸如至少1012M-1，所述亲和力低于500nM，优选地低于200nM，更优选地低于10nM，诸如低于500pM。本发明多肽针对EGFR或IGF-IR的亲和力可以通过本身已知的方式确定，例如利用本文所述的测定。
本发明的多肽的一些优选的但非限制性实例是SEQ ID NO’s：110-143的多肽，其中：
-SEQ ID NO’s：134-135是本发明针对IGF-IR的多价(且具体地二价)多肽的一些实例；
-SEQ ID NO’s：110-133和141-143是本发明针对EGFR的多价(且具体地二价)多肽的一些实例；
-其中，SEQ ID NO’s：141-143是本发明针对EGFR的多价(且具体地二价)biparatopic多肽的一些实例；
-SEQ ID NO’s：136-140是本发明双特异性多肽的一些实例，其包括一个针对EGFR的纳米抗体和一个针对IGF-IR的纳米抗体。
本发明的其他多肽可以例如选自由这样的氨基酸序列组成的组，所述氨基酸序列与SEQ ID NO’s：110-143氨基酸序列中的一个或多个相比，具有超过80％，优选地超过90％，更优选地超过95％，诸如99％或更高的“序列同一性”(如本文所定义的)，其中所述氨基酸序列中所包括的纳米抗体优选地如本文所定义。
在另一个方面，本发明涉及编码本发明纳米抗体和/或本发明多肽的核酸。所述核酸在本文中还称为“本发明的核酸”，且可以例如处于遗传构建体的形式，如本文所定义。
在另一个方面，本发明涉及这样的宿主或宿主细胞，其表达或能够表达本发明的纳米抗体和/或本发明的多肽；和/或含有本发明的核酸。所述宿主或宿主细胞的一些优选的但非限制性实例将通过本文进一步的叙述而变得清楚。
本发明进一步涉及这样的产物或组合物，其含有或包括至少一种本发明的纳米抗体，至少一种本发明的多肽和/或至少一种本发明的核酸，且依赖于所述组合物预期的用途，任选地本身已知的所述组合物的一种或多种另外的成分。所述产物或组合物可以例如是药物组合物(如本文所述)，兽药组合物或用于诊断应用的的产物或组合物(也如本文所述)。所述产物或组合物的一些优选的但非限制性实例将通过本文进一步的叙述而变得清楚。
本发明进一步涉及用于制备或产生本文所述的纳米抗体，多肽，核酸，宿主细胞，产物和组合物的方法。所述方法的一些优选的但非限制性实例将通过本文进一步的叙述而变得清楚。
本发明进一步涉及本文所述的纳米抗体，多肽，核酸，宿主细胞，产物和组合物的应用和用途，以及涉及用于预防和/或治疗分别与EGFR或IGF-IR相关的疾病和病症的方法。一些优选的但非限制性应用和用途将通过本文进一步的叙述而变得清楚。
本发明的其他方面，实施方案，优势和应用也将通过本文进一步的叙述而变得清楚。
发明详述
本发明的以上和其他方法，实施方案和优势将通过本文进一步的叙述而变得清楚，其中：
a)除非另外指出或定义，所有使用的术语具有它们在本领域中的普遍含义，该含义对技术人员是清楚的。将参考文献例如指定为标准手册，诸如Sambrook等，“分子克隆：实验室手册”(″Molecular Cloning：A LaboratoryManual″)(第2版)，卷1-3，冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press)(1989)；F.Ausubel等，eds.，“分子生物学通用方案”(″Current protocols in molecular biology″)，Green Publishing and WileyInterscience，纽约(New York)(1987)；Lewin，“基因II”(“Genes II”)，JohnWiley & Sons，纽约(New York)，N.Y.，(1985)；Old等，“基因操作的原则：遗传工程介绍”(“Principles of Gene Manipulation：An Introduction to GeneticEngineering”)，第2版，加州大学出版社(University of California Press)，伯克利(Berkeley)，CA(1981)；Roitt等，“免疫学”(“Immunology”)(第6版)，Mosby/Elsevier，爱丁堡(Edinburgh)(2001)；Roitt等，Roitt基础免疫学(Roitt’s Essential Immunology)，第10版，Blackwell Publishing，UK(2001)；和Janeway等，“免疫学”(“Immunobiology”)(第6版)，Garland SciencePublishing/Churchill Livingstone，纽约(New York)(2005)，以及本文所引用的一般背景技术；
b)除非另外指出，术语“免疫球蛋白序列”-无论其用于本文中指重链抗体或指常规4-链抗体-用作一般术语，从而包括全长抗体，其各个链，及其所有的部分，结构域或片段(包括但不限于抗原结合结构域或片段，如分别地，VHH结构域或VH/VL结构域)。另外，如本文所使用的术语“序列”(例如，在术语如“免疫球蛋白序列”，“抗体序列”，“可变结构域序列”，“VHH序列”或“蛋白质序列”)，除非上下文要求更加受限制的解释，否则应该通常被理解为包括相关的氨基酸序列以及编码所述氨基酸序列的核酸序列或核苷酸序列；
c)除非另外指出，所有没有特别详述的方法，步骤，技术和操作可以或已经以本身已知的方式进行，其原因在于它们对技术人员是清楚的。参考文献例如也指定为标准手册和本文所提及的一般背景技术，以及其中所引用的其他参考文献；
d)氨基酸残基按照标准三字母或单字母氨基酸密码显示，如表A-2中所提及；
表A-2：单字母和三字母氨基酸密码
Figure A20068004496800371
Figure A20068004496800381
e)为了比较两个或更多核苷酸序列的目的，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列间“序列同一性”的百分比可以通过[第一核苷酸序列中与第二核苷酸序列中相应位置处的核苷酸相同的核苷酸的数量]除以[第一核苷酸序列中核苷酸总数]并乘以[100％]来计算，其中第二核苷酸序列中的每个核苷酸缺失，插入，替换或添加-与第一核苷酸序列相比-被认为是在单核苷酸(位置)的差别。
备选地，两个或更多核苷酸序列间序列同一性程度可以利用已知的用于序列匹配的计算机运算法则诸如NCBI Blast v2.0，以及利用标准设置而计算。
一些其他的用于确定序列同一性程度的技术，计算机运算法则和设置例如记述在WO 04/037999，EP 0967284，EP 1085089，WO 00/55318，WO00/78972，WO 98/49185和GB 2357768-A中。
通常，为了依照上文中所略述的计算方法确定两个核苷酸序列间的“序列同一性”百分比的目的，将具有最大核苷酸数量的核苷酸序列取作“第一”核苷酸序列，且将另一条核苷酸序列取作“第二”核苷酸序列；
f)为了比较两个或更多氨基酸序列的目的，第一氨基酸序列和第二氨基酸序列间“序列同一性”的百分比可以通过[第一氨基酸序列中与第二氨基酸序列中相应位置处的氨基酸残基相同的氨基酸残基的数量]除以[第一氨基酸序列中氨基酸总数]并乘以[100％]来计算，其中第二氨基酸序列中的每个氨基酸缺失，插入，替换或添加-与第一氨基酸序列相比-被认为是在单氨基酸(位置)的差别，即作为本文所定义的“氨基酸区别”。
备选地，两个氨基酸序列间序列同一性的程度可以利用已知的计算机运算法则，诸如以上提及的用于为核苷酸序列确定序列同一性程度的那些，以及也利用标准设置而计算。
通常，为了确定两个依照上文中所略述的计算方法的氨基酸序列间的“序列同一性”百分比的目的，将具有最大氨基酸残基数量的氨基酸序列取作“第一”氨基酸序列，且将另一条氨基酸序列取作“第二”氨基酸序列。
而且，在确定两个氨基酸序列间序列同一性程度中，技术人员可以考虑所谓的“保守”氨基酸替换，所述“保守”氨基酸替换可以通常被描述为这样的氨基酸替换，其中氨基酸残基被另一个具有相似化学结构且其具有对多肽的功能，活性，或其他生物特性具有很小或基本无影响的氨基酸替换。所述保守氨基酸替换在本领域中众所周知，例如来自WO 04/037999，GB-A-2357768，WO 98/49185，WO 00/46383和WO 01/09300；并且可以基于来自WO 04/037999和WO 98/49185以及来自其中所引用的其他参考文献选择所述替换(优选)的类型和/或组合。
所述保守的替换优选地是这样的替换，其中下列组(a)-(e)中的一个氨基酸被相同组中的另一个氨基酸残基替换：(a)小脂肪族，非极性或稍微极性的残基：Ala，Ser，Thr，Pro和Gly；(b)极性，带负电的残基和其他(不带电的)酰胺：Asp，Asn，Glu和Gln；(c)极性，带正电的残基：His，Arg和Lys；(d)大脂肪族，非极性残基：Met，Leu，Ile，Val和Cys；和(e)芳香族残基：Phe，Tyr和Trp。
特别优选的保守替换如下：Ala变为Gly或变为Ser；Arg变为Lys；Asn变为Gln或变为His；Asp变为Glu；Cys变为Ser；Gln变为Asn；Glu变为Asp；Gly变为Ala或变为Pro；His变为Asn或变为Gln；Ile变为Leu或变为Val；Leu变为Ile或变为Val；Lys变为Arg，变为Gln或变为Glu；Met变为Leu，变为Tyr或变为Ile；Phe变为Met，变为Leu或变为Tyr；Ser变为Thr；Thr变为Ser；Trp变为Tyr；Tyr变为Trp；和/或Phe变为Val，变为Ile或变为Leu。
应用于本文所述多肽的任何氨基酸替换还可以基于由Schulz等，蛋白质结构的原则(Principles of Protein Structure)，Springer-Verlag，1978揭不的不同物种同源蛋白质间氨基酸变异频率的分析，基于由Chou和Fasman，生物化学(Biochemistry)13：211，1974和酶学进展(Adv.Enzymol.)，47：45-149，1978揭示的结构形成潜力分析，和基于由Eisenberg等，美国国家科学院学刊(Proc.Nad.Acad Sci.USA)81：140-144，1984；Kyte & Doolittle；分子生物学杂志(J Molec.Biol.)157：105-132，1981，和Goldman等，生物物理学和化学年度综述(Ann.Rev.Biophys.Chem.)15：321-353，1986揭示的蛋白质中疏水性模式的分析，将其全部内容引入本文作为参考。在本文的叙述和以上引用的一般背景技术中给出了纳米抗体第一，第二和第三结构的信息。而且，为了这个目的，例如由Desmyter等，自然结构生物学(Nature StructuralBiology)，卷3，9，803(1996)；Spinelli等，自然结构生物学(Natural StructuralBiology)(1996)；3，752-757；和Decanniere等，结构(Structure)，卷7，4，361(1999)给出了来自骆驼的VHH结构域的晶体结构。进一步关于一些在常规VH结构域中形成VH/VL分界面的氨基酸残基和关于骆驼化这些位置替换的潜力的信息记述在WO 94/04678，WO 96/34103，WO 03/035694，Muyldermans等，蛋白质工程(Protein Eng.)1994年9月；7(9)：1129-3，Davies和Riechmann(1994和1996)中。
g)如果氨基酸序列和核酸序列在其全长范围内具有100％序列同一性(如本文定义)，则将它们称为“完全地相同”；
h)当比较两个氨基酸序列时，术语“氨基酸区别”指与第二序列相比，第一序列位置上单个氨基酸残基的插入，缺失或替换；可以理解两个氨基酸序列可以含有一个，两个或多个所述的氨基酸区别；
i)认为核酸序列或氨基酸序列是“(处于)基本分离的(形式)”-例如，与它的天生生物来源和/或获得它的反应培养基或培养基相比较-当将它从至少一种通常在该来源或培养基中与它联合的其他成分，如另一种核酸，另一种蛋白质/多肽，另一种生物成分或高分子或至少一种污染物，杂质或微量成分分离时。特别地，当将核酸序列或氨基酸序列纯化至少2倍，特别地至少10倍，更特别地至少100倍，和高达1000倍或更高时，认为它们是“基本分离的”。如利用合适的技术，如合适的层析技术，如聚丙烯酰胺凝胶电泳确定地，“处于基本分离形式的”核酸序列或氨基酸序列优选地是基本同源的；
j)术语“结构域”用于本文时，通常指抗体链的球状区域，且具体地指重链抗体的球状区域，或指基本由所述球状区域组成的多肽。通常，所述结构域包括稳定的肽环(例如，3或4个肽环)，例如，作为片层或通过二硫键。
k)术语“抗原决定簇”指由抗原结合分子(诸如本发明的纳米抗体或多肽)，且更具体地由所述分子的抗原结合位点识别的抗原上的表位。术语“抗原决定簇”和“表位”还可以在本文中交替使用。
l)可以与特异性抗原决定簇，表位，抗原或蛋白质(或至少其一个部分、片段或表位)结合的，对其具有亲和力和/或对其具有特异性的氨基酸序列(如本发明的纳米抗体，抗体，多肽，或通常地抗原结合蛋白或多肽或其片段)称为“针对(against)”或“针对(directed against)”所述抗原决定簇，表位，抗原或蛋白质。
m)术语“特异性”指特殊的抗原结合分子或抗原结合蛋白(如本发明的纳米抗体或多肽)分子抗原结合的不同类型抗原或抗原决定簇的数量。可以基于亲和力(affinity)和/或抗体亲抗原性(avidity)确定抗原结合蛋白的特异性。由抗原与抗原结合蛋白解离的平衡常数(KD)表示的亲和力是抗原决定簇和抗原结合蛋白上的抗原结合位点间结合强度的测量：KD值越小，抗原决定簇和抗原结合分子(备选地，亲和力还可以表达为亲和力常数(KA)，即1/KD)间的结合强度越强。如对技术人员清楚地(例如基于本文进一步的公开内容)，依赖于兴趣的特异性抗原，可以以本身已知的方式确定亲和力。抗体亲抗原性是抗原结合分子(如本发明的纳米抗体或多肽)和相关抗原间结合强度的测量。抗体亲抗原性涉及抗原决定簇和其在抗原结合分子上的抗原结合位点间的亲和力，以及抗原结合分子上存在的相关结合位点的数量。典型地，抗原结合蛋白(如本发明的纳米抗体和/或多肽)以这样的解离常数(KD)和/或这样的结合亲和力结合，所述解离常数是10-5-10-12摩尔/升或更低，和优选地10-7-10-12摩尔/升或更低，和更优选地10-8-10-12摩尔/升或更低，所述结合亲和力是至少107M-1，优选地至少108M-1，更优选地至少109M-1，诸如至少1012M-1。通常认为任何高于10-4摩尔/升的KD值表示非特异性结合。优选地，本发明的纳米抗体或多肽以低于500nM，优选地低于200nM，更优选地低于10nM，诸如低于500pM的亲和力结合于所需抗原。抗原结合蛋白对抗原或抗原决定簇的特异性结合可以以任何合适的本身已知方式和其在本领域中本身已知的不同变体确定，所述方式包括例如，斯卡查德分析(Scatchard analysis)和/或竞争结合分析诸如放射性免疫测定(RIA)，酶免疫测定(EIA)和夹心式竞争测定(sandwich competition assays)。
n)如本文进一步所述，可以认为纳米抗体的氨基酸序列和结构-然而不受其限制-包括四个构架区或“FR”，其在本领域和本文中分别指“构架区1”或“FR1”；“构架区2”或“FR2”；“构架区3”或“FR3”；和“构架区4”或“FR4”；所述构架区由三个互补决定区或“CDR”间隔开，所述三个互补决定区或“CDR”分别指本领域中的互补决定区1或“CDR1”；互补决定区或2“CDR2”；和互补决定区3或“CDR3”；
o)也如本文进一步所述，纳米抗体中氨基酸残基的总数可以在110-120的范围内，优选地112-115，和最优选地113。然而应该注意，纳米抗体的部分、片段、类似物或衍生物(如本文进一步所述)不特别地受它们长度和/或尺寸的限制，只要所述部分、片段、类似物或衍生物满足本文所述的其他要求，并且还优选地适合于本文所述的目的；
p)当应用于来自本文所参考的Riechmann和Muyldermans文章中的骆驼VHH结构域时(参见，例如所述参考文献的图2)，按照由Kabat等(“目的免疫球蛋白序列”(“Sequence of proteins of immunological interest”)，美国公共卫生局(US Public Health Services)，NIH Bethesda，MD，公开号91)给出的VH结构域一般编号方式，对纳米抗体的氨基酸残基进行编号。按照该编号方式，纳米抗体的FR1包括位置1-30处的氨基酸残基，纳米抗体的CDR1包括位置31-35处的氨基酸残基，纳米抗体的FR2包括位置36-49处的氨基酸残基，纳米抗体的CDR2包括位置50-65处的氨基酸残基，纳米抗体的FR3包括位置66-94处的氨基酸残基，纳米抗体的CDR3包括位置95-102处的氨基酸残基，和纳米抗体的FR4包括位置103-113处的氨基酸残基。[在这个方面，应该注意-如在VH结构域和VHH结构域的领域中众所周知地-每个CDR中氨基酸残基的总数可以变化，并且可以不符合由Kabat编号(即，一个或多按照Kabat编号的位置可以不占据在实际序列中，或实际序列可以含有比由Kabat编号所容许的数量多的氨基酸残基)所表示的氨基酸残基的总数。这意味着，通常，按照Kabat进行的编号可以或可以不符合实际序列中氨基酸残基的实际编号。通常，然而，可以说，按照Kabat的编号且不考虑CDR中氨基酸残基的数量，按照Kabat编号的位置1相当于FR1的起始，且反之亦然，按照Kabat编号的位置36相当于FR2的起始，且反之亦然，按照Kabat编号的位置66相当于FR3的开始，且反之亦然，及按照Kabat编号的位置103相当于FR4的开始，且反之亦然]。
编号VH结构域氨基酸残基的其他方法是由Chothia等(自然(Nature)342，877-883(1989))，即所谓的“AbM定义”和所谓的“接触定义”所述的方法，还可以以类似的方式将该方法应用于来自骆驼的VHH结构域和应用于纳米抗体中。然而，在本说明书，权利要求和附图中，当由Riechmann和Muyldermans应用于VHH结构域时，应该遵循按照Kabat的编号，除非另外指出；和
q)给出附图、序列列表和试验部分/实施例，仅仅是为了进一步举例说明本发明，并且不应该将其解释或诠释为以任何方式限制本发明和/或附加权利要求的范围，除非在本文中另外明确指出。
为了重链抗体和其可变结构域的一般说明，特别参考下述文献，将所述参考文献作为一般背景技术提及：Vrije Universiteit Brussel的WO 94/04678，WO 95/04079和WO 96/34103；Unilever的WO 94/25591，WO 99/37681，WO00/40968，WO 00/43507，WO 00/65057，WO 01/40310，WO 01/44301，EP1134231和WO 02/48193；Vlaams Instituut voor Biotechnologie(VIB)的WO97/49805，WO 01/21817，WO 03/035694，WO 03/054016和WO 03/055527；Algonomics N.V.和申请人的WO 03/050531；加拿大国家研究委员会(National Research Council of Canada)的WO 01/90190；抗体学会(Instituteof Antibodies)的WO 03/025020(＝EP 1433793)；以及申请人的WO04/041867，WO 04/041862，WO 04/041865，WO 04/041863，WO 04/062551和申请人的其他公开专利申请；Hamers-Casterman等，自然(Nature)1993年6月3；363(6428)：446-8；Davies和Riechmann，FEBS知识(FEBS Lett.)1994年2月21日；339(3)：285-90；Muyldermans等，蛋白质工程(Protein Eng.)1994年9月；7(9)：1129-3；Davies和Riechmann，生物工程学(Biotechnology)(NY)1995年5月；13(5)：475-9；Gharoudi等，第9届应用生物工程学论坛(9thForum of Applied Biotechnology)，Med.Fac.Landbouw Univ.Gent.1995；60/4a部分I：2097-2100；Davies和Riechmann，蛋白质工程(Protein Eng).1996年6月；9(6)：531-7；Desmyter等，自然结构生物学(Nat Struct Biol.)1996年9月；3(9)：803-11；Sheriff等，自然结构生物学(Nat Struct Biol.)1996年9月；3(9)：733-6；Spinelli等，自然结构生物学(Nat Struct Biol.)1996年9月；3(9)；752-7；Arbabi Ghahroudi等，FEBS知识(FEBS Lett.)1997年9月15日；414(3)：521-6；Vu等，分子免疫学(Mol Immunol.)1997年11-12月；34(16-17)：1121-31；Atarhouch等，骆驼实践和研究杂志(Journal of Camel Practice andResearch)1997；4：177-182；Nguyen等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)1998年1月23日；275(3)：413-8；Lauwereys等，EMBO杂志(EMBO J.)1998年7月1日；17(13)：3512-20；Frenken等，研究免疫学(Res Immunol.)1998年7-8月；149(6)：589-99；Transue等，蛋白质(Proteins)1998年9月1日；32(4)：515-22；Muyldermans和Lauwereys，分子识别杂志(J.Mol.Recognit.)1999年3-4月；12(2)：131-40；van der Linden等，生物化学和生物物理杂志(Biochim.Biophys.Acta)1999年4月12日；1431(1)：37-46.；Decanniere等，结构折叠和设计(Structure Fold.Des.)1999年4月15日；7(4)：361-70；Ngyuen等，分子免疫学(Mol.Immunol.)1999年6月；36(8)：515-24；Woolven等，免疫遗传学(Immunogenetics)1999年10月；50(1-2)：98-101；Riechmann和Muyldermans，免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)1999年12月10日；231(1-2)：25-38；Spinelli等，生物化学(Biochemistry)2000年2月15日；39(6)：1217-22；Frenken等，生物工程学杂志(J.Biotechnol.)2000年2月28日；78(1)：11-21；Nguyen等，EMBO杂志(EMBO J.)2000年3月1日；19(5)：921-30；van der Linden等，免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)2000年6月23日；240(1-2)：185-95；Decanniere等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)2000年6月30日；300(1)：83-91；van der Linden等，生物工程学杂志(J.Biotechnol.)2000年7月14日；80(3)：261-70；Harmsen等，分子免疫学(Mol.Immunol.)2000年8月；37(10)：579-90；Perez等，生物化学(Biochemistry)2001年1月9日；40(1)：74-83；Conrath等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)2001年3月9日；276(10)：7346-50；Muyldermans等，生物化学科学动向(TrendsBiochem Sci.)2001年4月；26(4)：230-5；Muyldermans S.，生物工程学杂志(J.Biotechnol.)2001年6月；74(4)：277-302；Desmyter等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)2001年7月13日；276(28)：26285-90；Spinelli等，生物化学杂志(J.Mol.Biol.)2001年8月3日；311(1)：123-9；Conrath等，抗菌试剂的化学疗法(Antimicrob Agents Chemother.)2001年10月；45(10)：2807-12；Decanniere等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)2001年10月26日；313(3)：473-8；Nguyen等，免疫学进展(Adv Immunol.)2001；79：261-96；Muruganandam等，FASEB杂志(FASEB J.)2002年2月；16(2)：240-2；Ewert等，生物化学(Biochemistry)2002年3月19日；41(11)：3628-36；Dumoulin等，蛋白质科学(Protein Sci.)2002年3月；11(3)：500-15；Cortez-Retamozo等，国际癌症杂志(Int.J.Cancer.)2002年3月20日；98(3)：456-62；Su等，分子生物学进展(Mol.Biol.Evol.)2002年3月；19(3)：205-15；van der Vaart JM.，分子生物学方法(Methods Mol Biol.)2002；178：359-66；Vranken等，生物化学(Biochemistry)2002年7月9日；41(27)：8570-9；Nguyen等，免疫遗传学(Immunogenetics)2002年4月；54(1)：39-47；Renisio等，蛋白质(Proteins)2002年6月1日；47(4)：546-55；Desmyter等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)2002年6月28日；277(26)：23645-50；Ledeboer等，乳品科学杂志(J.DairySci.)2002年6月；85(6)：1376-82；De Genst等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)2002年8月16日；277(33)：29897-907；Ferrat等，生物化学杂志(Biochem.J.)2002年9月1日；366(部分2)：415-22；Thomassen等，酶和微生物技术(Enzyme and Microbial Technol.)2002；30：273-8；Harmsen等，应用微生物学和生物工程(Appl.Microbiol.Biotechnol.)2002年12月；60(4)：449-54；Jobling等，自然生物工程(Nat Biotechnol.)2003年1月；21(1)：77-80；Conrath等，比较免疫学发展(Dev.Comp.Immunol.)2003年2月；27(2)：87-103；Pleschberger等，生物配对化学(Bioconjug.Chem.)2003年3-4月；14(2)：440-8；Lah等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)2003年4月18日；278(16)：14101-11；Nguyen等，免疫学(Immunology.)2003年5月；109(1)：93-101；Joosten等，微生物细胞事实(Microb.Cell Fact.)2003年1月30日；2(1)：1；Li等，蛋白质(Proteins)2003年7月1日；52(1)：47-50；Loris等，生物化学(BiolChem.)2003年7月25日；278(30)：28252-7；van Koningsbruggen等，免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods.)2003年8月；279(1-2)：149-61；Dumoulin等，自然(Nature.)2003年8月14日；424(6950)：783-8；Bond等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)2003年9月19日；332(3)：643-55；Yau等，免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods.)2003年10月1日；281(1-2)：161-75；Dekker等，病毒学杂志(J.Virol.)2003年11月；77(22)：12132-9；Meddeb-Mouelhi等，Toxicon.2003年12月；42(7)：785-91；Verheesen等，Biochim.Biophys.Acta2003年12月5；1624(1-3)：21-8；Zhang等，分子生物学杂志(J Mol Biol.)2004年1月2日；335(1)：49-56；Stijlemans等，生物化学杂志(J Biol Chem.)2004年1月9日；279(2)：1256-61；Cortez-Retamozo等，癌症研究(CancerRes.)2004年4月15日；64(8)：2853-7；Spinelli等，FEBS知识(FEBS Lett.)2004年4月23日；564(1-2)：35-40；Pleschberger等，生物配对化学(Bioconjug.Chem.)2004年5-6月；15(3)：664-71；Nicaise等，蛋白质科学(Protein Sci.)2004年7月；13(7)：1882-91；Omidfar等，肿瘤生物学(Tumour Biol.)2004年7-8月；25(4)：179-87；Omidfar等，肿瘤生物学(Tumour Biol.)2004年9-12月；25(5-6)：296-305；Szynol等，抗菌试剂的化学疗法(Antimicrob AgentsChemother.)2004年9月；48(9)：3390-5；Saerens等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)2004年12月10日；279(50)：51965-72；De Genst等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)2004年12月17日；279(51)：53593-601；Dol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按照以上参考文献中使用的术语学，天然存在的重链抗体中存在的可变结构域还称为“VHH结构域”，从而将它们与常规4-链抗体中存在的重链可变结构域(下文中将其称为“VH结构域”)和与常规4-链抗体中存在的轻链可变结构域(下文中将其称为“VL结构域”)区别开。
如以上参考的现有技术中所提及地，VHH结构域具有大量独特的结构特征和功能特性，所述特征和特性使分离的VHH结构域(以及在其基础上的纳米抗体，所述纳米抗体与天然存在的VHH结构域共享这些结构特征和功能特性)和含有该VHH结构域的蛋白质非常有利于用作功能抗原结合结构域或蛋白质。特别地，并且不对其进行限制，VHH结构域(其已被天然“设计”为在轻链可变结构域不存在以及无相互作用的条件下，功能性地结合于抗原)和纳米抗体可以作为单一的，相对较小的功能抗原结合结构单位、结构域或蛋白质起作用。这将VHH结构域从常规4-链抗体的VH和VL结构域中区分出来，其自身通常不适合于作为单一抗原结合蛋白或结构域的实际应用，而需要以一些或其他形式组合，从而提供功能抗原结合单位(如在例如常规抗体片段，如Fab片段中；在ScFv’s片段中，其由与VL结构域共价结合的VH结构域组成)。
由于这些独特的特性，VHH结构域和纳米抗体作为单一抗原结合蛋白或作为抗原结合结构域(即，作为较大蛋白质或多肽的一部分)的应用相对于常规VH和VL结构域，ScFv’s或常规抗体片段(如Fab-或F(ab’)2-片段)的应用提供大量显著的优势：
-以高亲和力和高选择性与抗原的结合仅需要单一的结构域，所以不需要有两个分离的结构域存在，也不需要确保这两个结构域以正确的空间构象和构型存在(即，通过使用特别设计的连接体，如ScFv’s)；
-VHH结构域和纳米抗体可以由单一基因表达并且不需要翻译后的折叠或修饰；
-VHH结构域和纳米抗体可以容易地被改造为多价的和多特异性的形式(如本文进一步讨论地)；
-VHH结构域和纳米抗体非常易溶，且不具有集聚的倾向(如与由Ward等，自然(Nature)，卷341，1989，第544页所述的小鼠来源的抗原结合结构域)；
-VHH结构域和纳米抗体对热，pH，蛋白酶和其他变性试剂或条件非常稳定(参见例如Ewer等，见上)；
-制备VHH结构域和纳米抗体很容易并且相对便宜，即使在生产所需的规模上。例如，利用微生物发酵(例如，如下文进一步所述)，并且不需要使用哺乳动物表达系统，如用例如常规抗体片段，可以生产VHH结构域，纳米抗体和含有它们的蛋白质/多肽；
-VHH结构域和纳米抗体与常规4-链抗体及其抗原结合片段相比较小(大约15kDa，或比常规IgG小10倍)，并由此表现出以比所述常规4-链抗体及其抗原结合片段(更)高的渗透性进入到组织中(包括，但不仅限于实体瘤或其他致密组织)；
-VHH结构域和纳米抗体可以表现出所谓的空腔结合特性(尤其由于他们与常规VH结构域相比延长的CDR3环)，并还可以由此接近常规4-链抗体及其抗原结合片段不可接近的靶标和表位。例如，已显示出VHH结构域和纳米抗体可以抑制酶(参见例如WO97/49805；Transue等，(1998)，见上；Lauwereys等，(1998)，见上)。
如以上所提及地，本发明通常涉及分别针对EGFR或IGF-IR的纳米抗体，以及包括或基本由一个或多个所述纳米抗体组成的多肽，所述纳米抗体和多肽可以用于本文所述的预防，治疗和/或诊断的目的。
还如本文进一步所述，本发明进一步涉及编码所述纳米抗体和多肽的核酸，涉及制备所述纳米抗体和多肽的方法，涉及表达或能够表达所述纳米抗体或多肽的宿主细胞，涉及包括所述纳米抗体，多肽，核酸或宿主细胞的组合物，以及涉及所述纳米抗体，多肽，核酸，宿主细胞或组合物的用途。
一般地，应该注意到以其最广泛含义用于本文的术语纳米抗体不受特殊生物来源或特殊制备方法的限制。例如，如将在下文中更加详细讨论地，本发明的纳米抗体通常可以通过下列方式获得：(1)通过分离天然存在的重链抗体的VHH结构域；(2)通过表达编码天然存在的VHH结构域的核苷酸序列；(3)通过“人源化”(如本文所述)天然存在的VHH结构域或通过表达编码所述人源化的VHH结构域的核酸；(4)通过“骆驼化”(如本文所述)天然存在的来自任何动物物种的，特别地来自哺乳动物物种，如来自人类的VH结构域，或通过表达编码所述骆驼化的VH结构域的核酸；(5)通过“骆驼化”由Ward等(见上)所述的“结构域抗体”或“Dab”，或通过表达编码所述骆驼化的VH结构域的核酸；(6)通过使用本身已知的制备蛋白质，多肽或其他氨基酸序列的合成或半合成技术；(7)通过利用本身已知的核酸合成技术制备编码纳米抗体的核酸，随后通过表达由此获得的核酸；和/或(8)通过上述一项或多项的组合。基于本文的公开内容，实现上述各项的合适方法和技术对技术人员是清楚的，并且例如包括本文更详细描述的方法和技术。
一个优选的纳米抗体种类对应天然存在的分别针对EGFR或IGF-IR的重链抗体的VHH结构域。如本文进一步所述，所述VHH序列通常可以通过一些方式产生或获得：通过分别用EGFR或IGF-IR合适地免疫接种Camelid物种(即，以致产生分别针对EGFR或IGF-IR的免疫响应和/或重链抗体)，通过由所述Camelid获得合适的生物样品(如血液样品，血清样品或B细胞样品)，和通过利用本身已知的任何合适技术，从所述样品开始，产生分别针对EGFR或IGF-IR的VHH序列。这些技术对技术人员是清楚的，且/或在本文中进一步有所描述。
备选地，天然存在的分别针对EGFR或IGF-IR的VHH结构域可以利用一种或多种本身已知的筛选技术，例如通过分别利用EGFR或IGF-IR或其至少一个部分、片段、抗原决定簇或表位筛选文库，从首次用于实验的Camelid VHH序列文库中获得。所述文库和技术记述在例如WO 99/37681，WO 01/90190，WO 03/025020和WO 03/035694中。备选地，如例如WO00/43507中所述，可以通过诸如随机诱变和/或CDR改组的技术，使用从首次用于实验的VHH文库衍生而来的改良的合成或半合成文库，诸如从首次用于实验的VHH文库的VHH文库衍生而来。
获得分别针对EGFR或IGF-IR的VHH序列的再一种技术涉及对能够表达重链抗体的转基因哺乳动物进行适当的免疫接种(即，以致产生分别针对EGFR或IGF-IR的免疫响应和/或重链抗体)，从所述转基因哺乳动物中获得合适的生物样品(如血液样品，血清样品或B细胞样品)，并然后利用本身已知的任意合适技术，从所述样品开始，产生分别针对EGFR或IGF-IR的VHH序列。例如，为了该目的，可以使用表达重链抗体的小鼠，以及WO02/085945中和WO 04/049794中所述其他方法和技术。
本发明特别优选的纳米抗体种类包括具有这样的氨基酸序列的纳米抗体，所述氨基酸序列与天然存在的VHH结构域的氨基酸序列相符但已被“人源化”了，即通过将所述天然存在的VHH序列的氨基酸序列中(且特别地在构架区序列中)的一个或多个氨基酸残基取代为一个或多个存在于来自人类的常规4-链抗体的VH结构域中相应位置的氨基酸残基(例如，上文所示)。例如基于本文进一步的描述以及本文所参考的人源化现有技术，这可以以本身已知的方式进行，所述方式对技术人员是清楚的。而且，应该注意本发明的人源化纳米抗体可以以任何本身已知的合适方式获得(即，如以上(1)-(8)点所示)，并且因此不严格受限于这样的多肽，所述多肽是利用包含天然存在的VHH结构域的多肽作为起始材料获得的。
本发明另一个特别优选的纳米抗体种类包括具有这样的氨基酸序列的纳米抗体，所述氨基酸序列与天然存在的VH结构域的氨基酸序列相符但已被“骆驼化”，即，通过将来自常规4-链抗体的天然存在VH结构域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基取代为重链抗体的VHH结构域中相应位置处存在的一个或多个氨基酸残基。例如基于本文进一步的描述，这可以以本身已知的方式进行，所述方式对技术人员是清楚的。所述“骆驼化”替换优选地在形成和/或存在于VH-VL分界面处的氨基酸位置处，和/或在所谓的骆驼科标志残基(hallmark residue)处插入，如本文所定义(参见例如WO94/04678和Davie和Riechmann(1994和1996)，见上)。优选地，用作产生或设计骆驼化的纳米抗体的起始材料或起始点VH序列优选地是来自哺乳动物的VH序列，更优选地，人类的VH序列，如VH3序列。然而，应该注意所述本发明骆驼化的纳米抗体可以以任何本身已知的合适方式获得(即，如以上(1)-(8)点所示)，并且因此不严格受限于这样的多肽，所述多肽是利用包含天然存在的VH结构域的多肽作为起始材料获得的。
例如，再如本文进一步的描述，“人源化”和“骆驼化”均可以通过下列步骤实现，所述步骤是：提供分别编码天然存在的VHH结构域或VH结构域的核苷酸序列，并且然后以本身已知的方式，以这样的方式改变所述核苷酸序列中一个或多个密码子，以使新的核苷酸序列分别编码本发明的“人源化”或“骆驼化”的纳米抗体。然后，可以以本身已知的方式表达该核酸，从而提供本发明所需的纳米抗体。备选地，分别基于天然存在的VHH结构域或VH结构域的氨基酸序列，利用本身已知的肽合成技术可以重新设计并且再合成本发明所需的分别人源化或骆驼化纳米抗体的氨基酸序列。而且，分别基于天然存在的VHH结构域或VH结构域的氨基酸序列或核苷酸序列，利用本身已知的核酸合成技术可以重新设计并且再合成分别编本发明所需的人源化或骆驼化纳米抗体的核苷酸序列，随后可以以本身已知的方式表达由此获得的核酸，从而提供本发明所需的纳米抗体。
由天然存在的VH序列或优选地从VHH序列开始获得本发明纳米抗体和/或编码所述纳米抗体的核酸的其他合适方法和技术对技术人员很清楚，并且可以例如包括以合适的方式，组合一个或多个天然存在的VH序列的一个或多个部分(如一个或多个FR序列和/或CDR序列)，一个或多个天然存在的VHH序列的一个或多个部分(如一个或多个FR序列或CDR序列)，和/或一个或多个合成的或半合成的序列，从而提供本发明的纳米抗体或编码它们的核苷酸序列或核酸。
按照本发明所述方面的一个优选的但非限制性方面，纳米抗体在其最广泛的含义中可以被一般地定义为这样的多肽，其包括：
(a)包括四个构架区/序列的氨基酸序列，所述四个构架区/序列由三个互补决定区/序列间隔开，所述氨基酸序列中按照Kabat编号位置108处的氨基酸残基是Q；
和/或：
(b)包括四个构架区/序列的氨基酸序列，所述四个构架区/序列由三个互补决定区/序列间隔开，所述氨基酸序列中按照Kabat编号位置45处的氨基酸残基是带电的氨基酸(如本文所定义)或半胱氨酸残基，且位置44优选地是E；
和/或：
(c)包括四个构架区/序列的氨基酸序列，所述四个构架区/序列由三个互补决定区/序列间隔开，所述氨基酸序列中按照Kabat编号位置103处的氨基酸残基选自由P，R和S组成的组，且特别地，选自由R和S组成的组。
因此，在第一优选的但非限制性方面，本发明的纳米抗体可以具有这样的结构
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中，FR1-FR4分别指构架区1-4，且其中CDR1-CDR3分别指互补决定区1-3，且其中
(a)按照Kabat编号位置108处的氨基酸残基是Q；
和/或其中：
(b)按照Kabat编号位置45处的氨基酸残基是带电的氨基酸(如本文所定义)或半胱氨酸，且按照Kabat编号位置44处的氨基酸残基优选地是E；
和/或其中：
(c)按照Kabat编号位置103处的氨基酸残基选自由P，R和S组成的组，且特别地，选自由R和S组成的组；
和其中：
(d)CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义，且优选地，如按照本文的一个优选的实施方案所定义，且更优选地，按照本发明的一个更优选的实施方案所定义。
特别地，纳米抗体在其最广泛含义中可以被一般地定义为这样的多肽，所述多肽包括：
(a)包括四个构架区/序列的氨基酸序列，所述四个构架区/序列由三个互补决定区/序列间隔开，所述氨基酸序列中按照Kabat编号位置108处的氨基酸残基是Q；
和/或：
(b)包括四个构架区/序列的氨基酸序列，所述四个构架区/序列由三个互补决定区/序列间隔开，所述氨基酸序列中按照Kabat编号位置44处的氨基酸残基是E，且按照Kabat编号位置45处的氨基酸是R；
和/或：
(c)包括四个构架区/序列的氨基酸序列，所述四个构架区/序列由三个互补决定区/序列间隔开，所述氨基酸序列中按照Kabat编号位置103处的氨基酸残基选自由P，R和S组成的组，且特别地，选自由R和S组成的组。
因此，按照优选的但非限制性方面，本发明的纳米抗体可以具有这样的结构
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中，FR1-FR4分别指构架区1-4，且其中CDR1-CDR3分别指互补决定区1-3，且其中
(a)按照Kabat编号位置108处的氨基酸残基是Q；
和/或其中：
(b)按照Kabat编号位置44处的氨基酸残基是E，且其中按照Kabat编号位置45处的氨基酸残基是R；
和/或其中：
(c)按照Kabat编号位置103处的氨基酸残基选自由P，R和S组成的组，且特别地，选自由R和S组成的组；
和其中：
(d)CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义，且优选地，如按照本文的一个优选的实施方案所定义，且更优选地，按照本发明的一个更优选的实施方案所定义。
特别地，按照本发明分别针对EGFR或IGF-IR的纳米抗体可以具有这样的结构：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中，FR1-FR4分别指构架区1-4，且其中CDR1-CDR3分别指互补决定区1-3，且其中
(a)按照Kabat编号位置108处的氨基酸残基是Q；
和/或其中：
(b)按照Kabat编号位置44处的氨基酸残基是E，且其中按照Kabat编号位置45处的氨基酸残基是R；
和/或其中：
(c)按照Kabat编号位置103处的氨基酸残基选自由P，R和S组成的组，且特别地，选自由R和S组成的组；
和其中：
(d)CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义，且优选地，如按照本文的一个优选的实施方案所定义，且更优选地，按照本发明的一个更优选的实施方案所定义。
特别地，按照本发明所述方面的一个优选的但非限制性方面，通常可以将纳米抗体定义为包含这样的氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列包括四个构架区/序列，所述四个构架区/序列由三个互补决定区/序列间隔开，其中；
(a-1)按照Kabat编号位置44处的氨基酸残基选自由A，G，E，D，G，Q，R，S，L组成的组；且优选地选自由G，E或Q组成的组；和
(a-2)按照Kabat编号位置45处的氨基酸残基选自由L，R或C组成的组；且优选地选自由L或R组成的组；和
(a-3)按照Kabat编号位置103处的氨基酸残基选自由W，R或S组成的组；且优选地选自由W或R组成的组，且最优选地是W；
(a-4)按照Kabat编号位置108处的氨基酸残基是Q；
或其中：
(b-1)按照Kabat编号位置44处的氨基酸残基选自由E和Q组成的组；和
(b-2)按照Kabat编号位置45处的氨基酸残基是R；和
(b-3)按照Kabat编号位置103处的氨基酸残基选自由W，R和S组成的组；且优选地是W；
(b-4)按照Kabat编号位置108处的氨基酸残基选自由Q和L组成的组；且优选地是Q；
或其中：
(c-1)按照Kabat编号位置44处的氨基酸残基选自由A，G，E，D，Q，R，S和L组成的组；且优选地选自由G，E和Q组成的组；和
(c-2)按照Kabat编号位置45处的氨基酸残基选自由L，R和C组成的组；且优选地选自由L和R组成的组；和
(c-3)按照Kabat编号位置103处的氨基酸残基选自由P，R和S组成的组；且特别地选自由R和S组成的组；和
(c-4)按照Kabat编号位置108处的氨基酸残基选自由Q和L组成的组；且优选地是Q；
和其中
(d)CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义，且优选地，如按照本文的一个优选的实施方案所定义，且更优选地，按照本发明的一个更优选的实施方案所定义。
因此，在另一个优选的但非限制性方面，本发明的纳米抗体可以具有这样的结构
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中，FR1-FR4分别指构架区1-4，且其中CDR1-CDR3分别指互补决定区1-3，且其中：
(a)按照Kabat编号位置44处的氨基酸残基选自由A，G，E，D，G，Q，R，S，L组成的组；且优选地选自由G，E或Q组成的组；
和其中：
(b)按照Kabat编号位置45处的氨基酸残基选自由L，R或C组成的组；且优选地选自由L或R组成的组；
和其中：
(c)按照Kabat编号位置103处的氨基酸残基选自由W，R或S组成的组；且优选地选自由W或R组成的组，且最优选地是W；
和其中
(d)按照Kabat编号位置108处的氨基酸残基是Q；
和其中：
(e)CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义，且优选地，如按照本文的一个优选的实施方案所定义，且更优选地，按照本发明的一个更优选的实施方案所定义。
因此，在另一个优选的但非限制性方面，本发明的纳米抗体可以具有这样的结构
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中，FR1-FR4分别指构架区1-4，且其中CDR1-CDR3分别指互补决定区1-3，且其中：
(a)按照Kabat编号位置44处的氨基酸残基选自由E和Q组成的组；
和其中：
(b)按照Kabat编号位置45处的氨基酸残基是R；
和其中：
(c)按照Kabat编号位置103处的氨基酸残基选自由W，R和S组成的组；且优选地是W；
和其中：
(d)按照Kabat编号位置108处的氨基酸残基选自由Q和L组成的组；且优选地是Q；
和其中：
(e)CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义，且优选地，如按照本文的一个优选的实施方案所定义，且更优选地，按照本发明的一个更优选的实施方案所定义。
因此，在另一个优选的但非限制性方面，本发明的纳米抗体可以具有这样的结构
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中，FR1-FR4分别指构架区1-4，且其中CDR1-CDR3分别指互补决定区1-3，且其中：
(a)按照Kabat编号位置44处的氨基酸残基选自由A，G，E，D，Q，R，S和L组成的组；且优选地选自由G，E和Q组成的组；
和其中：
(b)按照Kabat编号位置45处的氨基酸残基选自由L，R和C组成的组；且优选地选自由L和R组成的组；
和其中：
(c)按照Kabat编号位置103处的氨基酸残基选自由P，R和S组成的组；且特别地选自由R和S组成的组；
和其中：
(d)按照Kabat编号位置108处的氨基酸残基选自由Q和L组成的组；且优选地是Q；
和其中：
(e)CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义，且优选地，如按照本文的一个优选的实施方案所定义，且更优选地，按照本发明的一个更优选的实施方案所定义。
本发明的两个特别优选的，但非限制性的纳米抗体组按照上文a)；按照上文(a-1)-(a-4)；按照上文b)；按照上文(b-1)-(b-4)；按照上文c)；和/或按照上文(c-1)-(c-4)的那些，其中：
a)按照Kabat编号位置44-47处的氨基酸残基形成序列GLEW(或如本文所定义的GLEW样的序列)，且位置108处的氨基酸残基是Q或L；
或其中：
b)按照Kabat编号位置43-46处的氨基酸残基形成序列KERE或KQRE(或KERE样的序列)，且位置108处的氨基酸残基是Q或L，且优选地是Q。
因此，在另一个优选的但非限制性方面，本发明的纳米抗体可以具有这样的结构
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中，FR1-FR4分别指构架区1-4，且其中CDR1-CDR3分别指互补决定区1-3，且其中：
(a)按照Kabat编号位置44-47处的氨基酸残基形成序列GLEW(或如本文所定义的GLEW样的序列)，且位置108处的氨基酸残基是Q或L；
和其中：
(b)CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义，且优选地，如按照本文的一个优选的实施方案所定义，且更优选地，按照本发明的一个更优选的实施方案所定义。
在另一个优选的但非限制性方面，本发明的纳米抗体可以具有这样的结构
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中，FR1-FR4分别指构架区1-4，且其中CDR1-CDR3分别指互补决定区1-3，且其中：
(a)按照Kabat编号位置43-46处的氨基酸残基形成序列KERE或KQRE(或KERE样的序列)，且位置108处的氨基酸残基是Q或L，且优选地是Q；
和其中：
(b)CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义，且优选地，如按照本文的一个优选的实施方案所定义，且更优选地，按照本发明的一个更优选的实施方案所定义。
在本发明这样的纳米抗体中，位置37处的氨基酸残基最优选地是F，其中所述纳米抗体中按照Kabat编号位置43-46处的氨基酸残基形成序列KERE或KQRE。在本发明这样的纳米抗体中，位置37处的氨基酸残基选自由Y，H，I，L，V或F组成的组，且最优选地是V，其中所述纳米抗体中按照Kabat编号位置44-47处的氨基酸残基形成序列GLEW。
因此，在不以任何方式受其限制的条件下，以存在于上述位置处的氨基酸残基为基础，通常在下列三组的基础上，可以对本发明的纳米抗体进行分类：
a)“GLEW组”：在按照Kabat编号位置44-47处具有氨基酸序列GLEW且在按照Kabat编号位置108处具有Q或L的纳米抗体。如本文进一步所述，该组中的纳米抗体通常在位置37处具有V，且在位置103处具有W，P，R或S，且优选地在位置103处具有W。GLEW组还包括一些GLEW样的序列，如下表A-3中所述的那些；
b)“KERE组”：在按照Kabat编号位置43-46处具有氨基酸序列KERE或KQRE且在按照Kabat编号位置108处具有Q或L的纳米抗体。如本文进一步所述，该组中的纳米抗体通常在位置37处具有F，在位置47处具有L或F；且在位置103处可以具有W，P，R或S，且优选地在位置103处具有W；
c)“103P，R，S组”：在位置103处具有P，R或S的纳米抗体。这些纳米抗体可以在Kabat编号位置44-47处具有氨基酸序列GLEW或在按照Kabat编号位置43-46处具有氨基酸序列KERE或KQRE，后者最优选地处于与位置37处的F和位置47处的L或F的组合中(如对KERE组的定义)；且可以在按照Kabat编号位置108处的氨基酸残基是Q或L，且优选地具有Q。
因此，在另一个优选的，但非限制性方面，本发明的纳米抗体可以是属于GLEW组的纳米抗体(如本文所定义)，且其中CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义，且优选地，如按照本文的一个优选的实施方案所定义，且更优选地，按照本发明的一个更优选的实施方案所定义。
在另一个优选的，但非限制性方面，本发明的纳米抗体可以是属于KERE组的纳米抗体(如本文所定义)，且CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义，且优选地，如按照本文的一个优选的实施方案所定义，且更优选地，按照本发明的一个更优选的实施方案所定义。
因此，在另一个优选的，但非限制性方面，本发明的纳米抗体可以是属于103P，R，S组的纳米抗体(如本文所定义)，且其中CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义，且优选地，如按照本文的一个优选的实施方案所定义，且更优选地，按照本发明的一个更优选的实施方案所定义。
而且，更一般地且除上述108Q，43E/44R和103P，R，S残基外，本发明的纳米抗体可以在一个或多个这样的位置含有一个或多个这样的氨基酸残基，所述位置在常规VH结构域中形成(部分)VH/VL分界面，所述一个或多个氨基酸残基比天然存在于相应的天然存在的VH序列的相同位置处的氨基酸残基带更高的电荷，且特别地是一个或多个带电的氨基酸残基(如表A-2中所提及的)。所述替换包括，但不仅限于，下表A-3中所提及的GLEW样序列；以及关于所谓的“微体”的国际申请WO 00/29004中所述的替换，例如，从而获得在位置108处具有Q的纳米抗体，所述位置108处的Q处于与位置44-47处的KLEW组合中。在这些位置处的其他可能的替换基于本文的公开，对技术人员是清楚的。
在本发明纳米抗体的一个实施方案中，位置83处的氨基酸残基选自由L，M，S，V和W组成的组，且优选地是L。
而且，在本发明纳米抗体的一个实施方案中，位置83处的氨基酸残基选自由R，K，N，E，G，I，T和Q组成的组，且最优选地是K或E(对于与天然存在的VHH结构域相符的纳米抗体)或R(对于“人源化”抗体，如本文所述)。在一个实施方案中，位置84处的氨基酸残基选自P，A，R，S，D T，和V组成的组，且最优选地是P(对于与天然存在的VHH结构域相符的纳米抗体)或R(对于“人源化”的纳米抗体，如本文所述)。
此外，在本发明纳米抗体的一个实施方案中，位置104处的氨基酸残基选自由G和D组成的组，且最优选地是G。
总之，上述纳米抗体中位置11，37，44，45，47，83，84，103，104和108处的氨基酸残基在本文中也称为“标志残基(Hallmark Residue)”。在表A-3中总结了所述标志残基以及位于最紧密相关的人VH结构域中相应位置处的氨基酸残基。
表A-4中提及这些标志残基存在于天然存在的VHH结构域中时的一些特别优选但非限制性的组合。为了比较，将称为DP-47的人VH3的相应氨基酸残基表示为斜体。
表A-3：纳米抗体中的标志残基
Figure A20068004496800611
Figure A20068004496800631
在所述纳米抗体中，位于除标志残基外的任意其他位置处的每个氨基酸残基可以是天然存在于天然存在的VHH结构域的相应位置处(按照Kabat编号)的任何氨基酸残基。
所述氨基酸残基对于技术人员是清楚的。表A-5-A-8提及了一些可以存在于天然存在的VHH结构域的每个FR1，FR2，FR3和FR4位置处(按照Kabat编号)的非限制性残基。对于每个位置，将天然存在的VHH结构域中每个位置处最频繁出现的氨基酸残基(且其为对纳米抗体中所述位置最优选的氨基酸残基)表示为粗体；并在每个位置的其他优选氨基酸残基下划线(注意：在天然存在的VHH结构域的位置26-30处发现的氨基酸残基的数量支持构成编号Chothia(见上)基础的假说，其中位于这些位置处的残基已经形成部分的CDR1)。
在表A-5-A-8中，还提及了一些可以存在于人VH3结构域的每个位置处的非限制性残基。同样地，对于每个位置，将天然存在的人VH3结构域中每个位置处最频繁出现的氨基酸残基表示为粗体；并在其他优选氨基酸残基下划线。
仅为了参考，表A-5还含有对1118个VHH序列的代表性样品的每个氨基酸位置处的VHH熵(“VHH Ent.”)和VHH可变性(“VHH Var.”)的数据(数据由乌得勒支大学(Utrecht University)的David Lutje Hulsing和TheoVerrips教授友好地提供)。VHH熵和VHH可变性的值为所分析的1118个VHH序列间氨基酸残基的可变性和保守程度提供测量标准：低值(即，＜1，诸如＜0.5)表示氨基酸残基在VHH序列间是高度保守的(即，很小的可变性)。例如，位置8处的G和位置9处的G具有分别为0.1和0的VHH熵，这表示这些残基高度保守并具有很小的可变性(且在所分析的全部1118个序列中位置9是G的情形中)，而对于形成CDR的一部分的残基，通常发现1.5或更高的值(数据未显示)。注意(1)表A-5的第二栏中所列出的氨基酸残基基于比为了确定最后两栏中所提及的VHH熵和VHH可变性而分析的1118个VHH序列更大的样本；和(2)以下所示的数据支持的这样的假说，该假说是位于位置27-30处以及可能甚至位置93和94处的氨基酸残基形成了CDR的一部分(尽管本发明不受任何具体假说或解释的限制，且如上所述，本文中使用了按照Kabat的编号系统)。序列熵，序列可变性的一般解释以及确定它们的方法学，参见Oliveira等，蛋白质：结构，功能和遗传学(PROTEINS：Structure，Function and Genetics)，52：544-552(2003)。
表A-5：FR1中氨基酸残基的非限制性实例(脚注，参见表A-3的脚注)
Figure A20068004496800651
表A-5：FR1中氨基酸残基的非限制性实例(继续)
表A-6：FR2中氨基酸残基的非限制性实例(脚注，参见表A-3的脚注)
Figure A20068004496800662
表A-7：FR3中氨基酸残基的非限制性实例(脚注，参见表A-3的脚注)
表A-7：FR3中氨基酸残基的非限制性实例(继续)
Figure A20068004496800681
表A-8：FR4中氨基酸残基的非限制性实例(脚注，参见表A-3的脚注)
Figure A20068004496800682
因此，在另一个优选的但非限制性方面，本发明的纳米抗体可以具有这样的结构
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中，FR1-FR4分别指构架区1-4，且其中CDR1-CDR3分别指互补决定区1-3，且其中：
(a)所述标志残基如本文所定义；
和其中：
(b)CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义，且优选地，如按照本文的一个优选的实施方案所定义，且更优选地，按照本发明的一个更优选的实施方案所定义。
在另一个优选的但非限制性方面，本发明的纳米抗体可以具有这样的结构
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中，FR1-FR4分别指构架区1-4，且其中CDR1-CDR3分别指互补决定区1-3，且其中：
(a)FR1选自由下列氨基酸序列组成的组：
[1]QVQLQESGGGXVQAGGSLRLSCAASG[26]    [SEQ ID NO：1]
或选自由与上述氨基酸序列具有至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％，甚至更优选地至少99％序列同一性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组；其中
i)除标志位置外，任意位置处的任何氨基酸替换优选地是保守的氨基酸替换(如本文所定义)和/或如表A-5中所定义的氨基酸替换；和/或
ii)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地仅含有氨基酸替换，且无氨基酸缺失或插入；
和/或选自由与上述氨基酸序列之一相比具有3，2或仅1个的“氨基酸区别”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
i)除标志位置外，任意位置处的任何氨基酸替换优选地是保守的氨基酸替换(如本文所定义)和/或如表A-5中所定义的氨基酸替换；和/或
ii)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地仅含有氨基酸替换，且无氨基酸缺失或插入；
且其中：
(b)FR2选自由下列氨基酸序列组成的组：
[36]WXRQAPGKXXEXVA[49]    [SEQ ID NO：2]
或选自由与上述氨基酸序列具有至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％，甚至更优选地至少99％序列同一性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组；其中
i)除标志位置外，任意位置处的任何氨基酸替换优选地是保守的氨基酸替换(如本文所定义)和/或如表A-6中所定义的氨基酸替换；和/或
ii)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地仅含有氨基酸替换，且无氨基酸缺失或插入；
和/或选自由与上述氨基酸序列之一相比具有3，2或仅1个的“氨基酸区别”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
i)除标志位置外，任意位置处的任何氨基酸替换优选地是保守的氨基酸替换(如本文所定义)和/或如表A-6中所定义的氨基酸替换；和/或
ii)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地仅含有氨基酸替换，且无氨基酸缺失或插入；
且其中：
(c)FR3选自由下列氨基酸序列组成的组：
[66]RFTISRDNAKNTVYLQMNSLXXEDTAVYYCAA[94]    [SEQ ID NO：3]
或选自由与上述氨基酸序列具有至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％，甚至更优选地至少99％序列同一性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组；其中
i)除标志位置外，任意位置处的任何氨基酸替换优选地是保守的氨基酸替换(如本文所定义)和/或如表A-7中所定义的氨基酸替换；和/或
ii)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地仅含有氨基酸替换，且无氨基酸缺失或插入；
和/或选自由与上述氨基酸序列之一相比具有3，2或仅1个的“氨基酸区别”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
i)除标志位置外，任意位置处的任何氨基酸替换优选地是保守的氨基酸替换(如本文所定义)和/或如表A-7中所定义的氨基酸替换；和/或
ii)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地仅含有氨基酸替换，且无氨基酸缺失或插入；
且其中：
(d)FR4选自由下列氨基酸序列组成的组：
[103]XXQGTXVTVSS  [113]    [SEQ ID NO：4]
或选自由与上述氨基酸序列具有至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％，甚至更优选地至少99％序列同一性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组；其中
i)除标志位置外，任意位置处的任何氨基酸替换优选地是保守的氨基酸替换(如本文所定义)和/或如表A-8中所定义的氨基酸替换；和/或
ii)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地仅含有氨基酸替换，且无氨基酸缺失或插入；
和/或选自由与上述氨基酸序列之一相比具有3，2或仅1个的“氨基酸区别”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
i)除标志位置外，任意位置处的任何氨基酸替换优选地是保守的氨基酸替换(如本文所定义)和/或如表A-8中所定义的氨基酸替换；和/或
ii)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地仅含有氨基酸替换，且无氨基酸缺失或插入；
且其中：
(e)CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义，且优选地，如按照本文的一个优选的实施方案所定义，且更优选地，按照本发明的一个更优选的实施方案所定义；
其中，标志残基由“X”表示，并如上文所定义，且其中括号中的数字指按照Kabat编号的氨基酸位置。
在另一个优选的但非限制性方面，本发明的纳米抗体可以具有这样的结构
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中，FR1-FR4分别指构架区1-4，且其中CDR1-CDR3分别指互补决定区1-3，且其中：
(a)FR1选自由下列氨基酸序列组成的组：
[1]QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASG[26]    [SEQ ID NO：5]
或选自由与上述氨基酸序列具有至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％，甚至更优选地至少99％序列同一性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组；其中
i)除标志位置外，任意位置处的任何氨基酸替换优选地是保守的氨基酸替换(如本文所定义)和/或如表A-5中所定义的氨基酸替换；和/或
ii)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地仅含有氨基酸替换，且无氨基酸缺失或插入；和
iii)位置11处的标志残基如以上序列所示；
和/或选自由与上述氨基酸序列之一相比具有3，2或仅1个的“氨基酸区别”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
i)除标志位置外，任意位置处的任何氨基酸替换优选地是保守的氨基酸替换(如本文所定义)和/或如表A-5中所定义的氨基酸替换；和/或
ii)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地仅含有氨基酸替换，且无氨基酸缺失或插入；和
iii)位置11处的标志残基如以上序列所示；
且其中：
(b)FR2选自由下列氨基酸序列组成的组：
[36]WFRQAPGKERELVA[49]    [SEQ ID NO：6]
[36]WFRQAPGKEREFVA[49]    [SEQ ID NO：7]
[36]WFRQAPGKEREGA[49]     [SEQ ID NO：8]
[36]WFRQAPGKQRELVA[49]    [SEQ ID NO：9]
[36]WFRQAPGKQREFVA[49]    [SEQ ID NO：10]
[36]WYRQAPGKGLEWA[49]     [SEQ ID NO：11]
或选自由与上述氨基酸序列之一具有至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％，甚至更优选地至少99％序列同一性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组；其中
i)除标志位置外，任意位置处的任何氨基酸替换优选地是保守的氨基酸替换(如本文所定义)和/或如表A-6中所定义的氨基酸替换；和/或
ii)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地仅含有氨基酸替换，且无氨基酸缺失或插入；和
iii)位置37，44，45和47处的标志残基如以上每个序列所示；
和/或选自由与上述氨基酸序列之一相比具有3，2或仅1个的“氨基酸区别”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
i)除标志位置外，任意位置处的任何氨基酸替换优选地是保守的氨基酸替换(如本文所定义)和/或如表A-6中所定义的氨基酸替换；和/或
ii)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地仅含有氨基酸替换，且无氨基酸缺失或插入；和
iii)位置37，44，45和47处的标志残基如以上每个序列所示；
且其中：
(c)FR3选自由下列氨基酸序列组成的组：
[66]RFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAA[94]    [SEQ ID NO：12]
或选自由与上述氨基酸序列具有至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％，甚至更优选地至少99％序列同一性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组；其中
i)除标志位置外，任意位置处的任何氨基酸替换优选地是保守的氨基酸替换(如本文所定义)和/或如表A-7中所定义的氨基酸替换；和/或
ii)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地仅含有氨基酸替换，且无氨基酸缺失或插入；和
iii)位置83和84处的标志残基如以上每个序列所示；
和/或选自由与上述氨基酸序列之一相比具有3，2或仅1个的“氨基酸区别”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
i)除标志位置外，任意位置处的任何氨基酸替换优选地是保守的氨基酸替换(如本文所定义)和/或如表A-7中所定义的氨基酸替换；和/或
ii)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地仅含有氨基酸替换，且无氨基酸缺失或插入；和
iii)位置83和84处的标志残基如以上每个序列所示；
且其中：
(d)FR4选自由下列氨基酸序列组成的组：
[103]WGQGTQVTVSS[113]    [SEQ ID NO：13]
[103]WGQGTLVTVSS[113]    [SEQ ID NO：14]
或选自由与上述氨基酸序列之一具有至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％，甚至更优选地至少99％序列同一性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组；其中
i)除标志位置外，任意位置处的任何氨基酸替换优选地是保守的氨基酸替换(如本文所定义)和/或如表A-8中所定义的氨基酸替换；和/或
ii)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地仅含有氨基酸替换，且无氨基酸缺失或插入；和
iii)位置103，104和108处的标志残基如以上每个序列所示；
和/或选自由与上述氨基酸序列之一相比具有3，2或仅1个的“氨基酸区别”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
i)除标志位置外，任意位置处的任何氨基酸替换优选地是保守的氨基酸替换(如本文所定义)和/或如表A-8中所定义的氨基酸替换；和/或
ii)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地仅含有氨基酸替换，且无氨基酸缺失或插入；和
iii)位置103，104和108处的标志残基如以上每个序列所示；
且其中：
(e)CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义，且优选地，如按照本文的一个优选的实施方案所定义，且更优选地，按照本发明的一个更优选的实施方案所定义。
在另一个优选的但非限制性方面，本发明的纳米抗体可以具有这样的结构
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中，FR1-FR4分别指构架区1-4，且其中CDR1-CDR3分别指互补决定区1-3，且其中：
a)FR1选自由下列氨基酸序列组成的组：
[1]QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASG[26]    [SEQ ID NO：5]
和/或选自由与上述氨基酸序列之一相比具有3，2或仅1个的“氨基酸区别”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
i)除标志位置外，任意位置处的任何氨基酸替换优选地是保守的氨基酸替换(如本文所定义)和/或如表A-5中所定义的氨基酸替换；和/或
ii)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地仅含有氨基酸替换，且无氨基酸缺失或插入；和
iii)位置11处的标志残基如以上序列所示；
且其中：
(b)FR2选自由下列氨基酸序列组成的组：
[36]WFRQAPGKERELVA[49]    [SEQ ID NO：6]
[36]WFRQAPGKEREFVA[49]    [SEQ ID NO：7]
[36]WFRQAPGKEREGA[49]     [SEQ ID NO：8]
[36]WFRQAPGKQRELVA[49]    [SEQ ID NO：9]
[36]WFRQAPGKQREFVA[49]    [SEQ ID NO：10]
和/或选自由与上述氨基酸序列之一相比具有2或仅1个的“氨基酸区别”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
i)除标志位置外，任意位置处的任何氨基酸替换优选地是保守的氨基酸替换(如本文所定义)和/或如表A-6中所定义的氨基酸替换；和/或
ii)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地仅含有氨基酸替换，且无氨基酸缺失或插入；和
iii)位置37，44，45和47处的标志残基如以上每个序列所示；
且其中：
(c)FR3选自由下列氨基酸序列组成的组：
[66]RFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAA[94]    [SEQ ID NO：12]
和/或选自由与上述氨基酸序列之一相比具有3，2或仅1个的“氨基酸区别”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
i)除标志位置外，任意位置处的任何氨基酸替换优选地是保守的氨基酸替换(如本文所定义)和/或如表A-7中所定义的氨基酸替换；和/或
ii)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地仅含有氨基酸替换，且无氨基酸缺失或插入；和
iii)位置83和84处的标志残基如以上每个序列所示；
且其中：
(d)FR4选自由下列氨基酸序列组成的组：
[103]WGQGTQVTVSS[113]    [SEQ ID NO：13]
[103]WGQGTLVTVSS[113]    [SEQ ID NO：14]
和/或选自由与上述氨基酸序列之一相比具有3，2或仅1个的“氨基酸区别”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
i)除标志位置外，任意位置处的任何氨基酸替换优选地是保守的氨基酸替换(如本文所定义)和/或如表A-8中所定义的氨基酸替换；和/或
ii)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地仅含有氨基酸替换，且无氨基酸缺失或插入；和
iii)位置103，104和108处的标志残基如以上每个序列所示；
且其中：
(e)CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义，且优选地，如按照本文的一个优选的实施方案所定义，且更优选地，按照本发明的一个更优选的实施方案所定义。
在另一个优选的但非限制性方面，本发明的纳米抗体可以具有这样的结构
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中，FR1-FR4分别指构架区1-4，且其中CDR1-CDR3分别指互补决定区1-3，且其中：
a)FR1选自由下列氨基酸序列组成的组：
[1]QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASG[26]    [SEQ ID NO：5]
和/或选自由与上述氨基酸序列之一相比具有3，2或仅1个的“氨基酸区别”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
i)除标志位置外，任意位置处的任何氨基酸替换优选地是保守的氨基酸替换(如本文所定义)和/或如表A-5中所定义的氨基酸替换；和/或
ii)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地仅含有氨基酸替换，且无氨基酸缺失或插入；和
iii)位置11处的标志残基如以上序列所示；
且其中：
(b)FR2选自由下列氨基酸序列组成的组：
[36]WYRQAPGKGLEWA[49]    [SEQ ID NO：11]
和/或选自由与上述氨基酸序列之一相比具有2或仅1个的“氨基酸区别”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
i)除标志位置外，任意位置处的任何氨基酸替换优选地是保守的氨基酸替换(如本文所定义)和/或如表A-6中所定义的氨基酸替换；和/或
ii)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地仅含有氨基酸替换，且无氨基酸缺失或插入；和
iii)位置37，44，45和47处的标志残基如以上每个序列所示；
且其中：
(c)FR3选自由下列氨基酸序列组成的组：
[66]RFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAA[94]    [SEQ ID NO：12]
和/或选自由与上述氨基酸序列之一相比具有3，2或仅1个的“氨基酸区别”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
i)除标志位置外，任意位置处的任何氨基酸替换优选地是保守的氨基酸替换(如本文所定义)和/或如表A-7中所定义的氨基酸替换；和/或
ii)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地仅含有氨基酸替换，且无氨基酸缺失或插入；和
iii)位置83和84处的标志残基如以上每个序列所示；
且其中：
(d)FR4选自由下列氨基酸序列组成的组：
[103]WGQGTQVTVSS[113]    [SEQ ID NO：13]
和/或选自由与上述氨基酸序列之一相比具有3，2或仅1个的“氨基酸区别”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
i)除标志位置外，任意位置处的任何氨基酸替换优选地是保守的氨基酸替换(如本文所定义)和/或如表A-8中所定义的氨基酸替换；和/或
ii)与上述氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地仅含有氨基酸替换，且无氨基酸缺失或插入；和
iii)位置103，104和108处的标志残基如以上每个序列所示；
且其中：
(e)CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义，且优选地，如按照本文的一个优选的实施方案所定义，且更优选地，按照本发明的一个更优选的实施方案所定义。
可以在上文所提及的欧洲专利EP 656946中发现一些其他的可以存在于本发明的纳米抗体中的构架序列(参见还例如授权的美国同族专利5,759,808)，
在另一个优选的但非限制性方面，本发明的纳米抗体可以具有这样的结构
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中，FR1-FR4分别指构架区1-4，且其中CDR1-CDR3分别指互补决定区1-3，且其中：
(a)FR1选自由分别存在于SEQ ID NO’s：80-93或106-109的纳米抗体中的FR1序列组成的组，
或选自由与所述FR1序列之一具有至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％，甚至更优选地至少99％序列同一性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组；其中
i)除标志位置外，任意位置处的任何氨基酸替换优选地是保守的氨基酸替换(如本文所定义)和/或如表A-5中所定义的氨基酸替换；和/或
ii)与所述FR1序列相比，所述氨基酸序列优选地仅含有氨基酸替换，且无氨基酸缺失或插入；和
iii)位置11处的标志残基如所述FR1序列中所示；
和/或选自由与所述FR1序列之一相比具有3，2或仅1个的“氨基酸区别”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
i)除标志位置外，任意位置处的任何氨基酸替换优选地是保守的氨基酸替换(如本文所定义)和/或如表A-5中所定义的氨基酸替换；和/或
ii)与所述FR1序列相比，所述氨基酸序列优选地仅含有氨基酸替换，且无氨基酸缺失或插入；和
iii)位置11处的标志残基如所述FR1序列中所示；
且其中：
(b)FR2选自由分别存在于SEQ ID NO’s：80-93或106-109的纳米抗体中的FR2序列组成的组，
或选自由与所述FR2序列之一具有至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％，甚至更优选地至少99％序列同一性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组；其中
i)除标志位置外，任意位置处的任何氨基酸替换优选地是保守的氨基酸替换(如本文所定义)和/或如表A-6中所定义的氨基酸替换；和/或
ii)与所述FR2序列相比，所述氨基酸序列优选地仅含有氨基酸替换，且无氨基酸缺失或插入；和
iii)位置37，44，45和47处的标志残基如所述FR2序列中所示；
和/或选自由与所述FR2序列之一相比具有3，2或仅1个的“氨基酸区别”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
i)除标志位置外，任意位置处的任何氨基酸替换优选地是保守的氨基酸替换(如本文所定义)和/或如表A-6中所定义的氨基酸替换；和/或
ii)与所述FR2序列相比，所述氨基酸序列优选地仅含有氨基酸替换，且无氨基酸缺失或插入；和
iii)位置37，44，45和47处的标志残基如所述FR2序列中所示；
且其中：
(c)FR3选自由分别存在于SEQ ID NO’s：80-93或106-109的纳米抗体中的FR3序列组成的组，
或选自由与所述FR3序列之一具有至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％，甚至更优选地至少99％序列同一性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组；其中
i)除标志位置外，任意位置处的任何氨基酸替换优选地是保守的氨基酸替换(如本文所定义)和/或如表A-7中所定义的氨基酸替换；和/或
ii)与所述FR3序列相比，所述氨基酸序列优选地仅含有氨基酸替换，且无氨基酸缺失或插入；和
iii)位置83和84处的标志残基如所述FR3序列中所示；
和/或选自由与所述FR3序列之一相比具有3，2或仅1个的“氨基酸区别”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
i)除标志位置外，任意位置处的任何氨基酸替换优选地是保守的氨基酸替换(如本文所定义)和/或如表A-7中所定义的氨基酸替换；和/或
ii)与所述FR3序列相比，所述氨基酸序列优选地仅含有氨基酸替换，且无氨基酸缺失或插入；和
iii)位置83和84处的标志残基如所述FR3序列中所示；
且其中：
(d)FR4选自由分别存在于SEQ ID NO’s：80-93或106-109的纳米抗体中的FR4序列组成的组，
或选自由与所述FR4序列之一具有至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％，甚至更优选地至少99％序列同一性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组；其中
i)除标志位置外，任意位置处的任何氨基酸替换优选地是保守的氨基酸替换(如本文所定义)和/或如表A-8中所定义的氨基酸替换；和/或
ii)与所述FR4序列相比，所述氨基酸序列优选地仅含有氨基酸替换，且无氨基酸缺失或插入；和
iii)位置103，104和108处的标志残基如所述FR3序列中所示；
和/或选自由与所述FR4序列之一相比具有3，2或仅1个的“氨基酸区别”(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组，其中：
i)除标志位置外，任意位置处的任何氨基酸替换优选地是保守的氨基酸替换(如本文所定义)和/或如表A-8中所定义的氨基酸替换；和/或
ii)与所述FR4序列相比，所述氨基酸序列优选地仅含有氨基酸替换，且无氨基酸缺失或插入；和
iii)位置103，104和108处的标志残基如所述FR4序列中所示；
且其中：
(e)CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义，且优选地，如按照本文的一个优选的实施方案所定义，且更优选地，按照本发明的一个更优选的实施方案所定义。
本发明一些特别优选的纳米抗体可以选自由分别为SEQ ID NO’s：80-93和106-109的氨基酸序列组成的组，或选自由与所述氨基酸序列之一具有至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％，甚至更优选地至少99％序列同一性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组；其中
i)标志残基可以如上表A-3中所示；
ii)除标志位置外，任意位置处的任何氨基酸替换优选地是保守的氨基酸替换(如本文所定义)和/或如表A-5-A-8中所定义的氨基酸替换；和/或
iii)与以上氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选地仅含有氨基酸替换，且无氨基酸缺失或插入。
本发明一些甚至更优选的纳米抗体可以选自由分别为SEQ ID NO’s：80-93或106-109的氨基酸序列组成的组，或选自由与所述氨基酸序列之一具有至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％，甚至更优选地至少99％序列同一性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组；其中
(1)标志残基可以如来自SEQ ID NO’s：80-93或106-109的相关序列中所示；
(2)除标志位置外，任意位置处的任何氨基酸替换优选地是保守的氨基酸替换(如本文所定义)和/或如表A-5-A-8中所定义的氨基酸替换；和/或
(3)与选自SEQ ID NO’s：80-93或106-109的相关序列相比，所述氨基酸序列优选地仅含有氨基酸替换，且无氨基酸缺失或插入。
本发明一些最优选的分别针对EGFR和IGF-IR的纳米抗体可以选自由分别为SEQ ID NO’s：80-93或106-109的氨基酸序列组成的组。
优选地，本发明纳米抗体中的CDR序列和FR序列使本发明的纳米抗体以这样的解离常数(KD)和/或这样的结合亲和力和/或这样的亲和力分别结合于EGFR或IGF-IR，所述解离常数是10-5-10-12摩尔/升或更低，和优选地10-7-10-12摩尔/升或更低，和更优选地10-8-10-12摩尔/升或更低，所述结合亲和力是至少107M-1，优选地至少108M-1，更优选地至少109M-1，诸如至少1012M-1，所述亲和力低于500nM，优选地低于200nM，更优选地低于10nM，诸如低于500pM。本发明纳米抗体分别针对EGFR或IGF-IR的亲和力可以通过本身已知的方式确定，例如利用本文所述的测定。
按照本发明的一个非限制性方面，纳米抗体可以如本文所定义，但具有这样的限制性条件，该限制性条件是其与天然存在的人VH结构域的相应构架区相比，且特别地与DP-47的相应构架区相比，在至少一个构架区中具有至少“一个氨基酸区别”(如本文所定义)。更具体地，按照本发明的一个非限制性方面，纳米抗体可以如本文所定义，但具有这样的限制性条件，该限制性条件是其与天然存在的人VH结构域的相应构架区相比，且特别地与DP-47的相应构架区相比，在至少一个标志残基处(包括位于位置108，103和/或45的那些)中具有至少“一个氨基酸区别”(如本文所定义)。通常，纳米抗体在至少FR2和/或FR4之一中，和特别地，在FR2和/或FR4中的至少一个标志残基处(同样地，包括位于位置108，103和/或45的那些)，应该具有至少一个所述的与天然存在的VH结构域相比的氨基酸区别。
而且，本发明的人源化的纳米抗体可以如本文所定义，但具有这样的限制性条件，该限制性条件是其与天然存在的VHH结构域的相应构架区相比，在至少一个构架区中具有至少“一个氨基酸区别”(如本文所定义)。更具体地，按照本发明的一个非限制性方面，纳米抗体可以如本文所定义，但具有这样的限制性条件，该限制性条件是其与天然存在的VHH结构域的相应构架区相比，在至少一个标志残基处(包括位于位置108，103和/或45的那些)中具有至少“一个氨基酸区别”(如本文所定义)。通常，纳米抗体在至少FR2和/或FR4之一中，和特别地，在FR2和/或FR4中的至少一个标志残基处(同样地，包括位于位置108，103和/或45的那些)，应该具有至少一个所述的与天然存在的VHH结构域相比的氨基酸区别。
如从本文的公开内容清楚地可知，使用天然或合成的如本文所定义的本发明纳米抗体的类似物、突变体、变体、等位基因、同系物和直向同源物(本文总称为：“类似物”)，和具体地SEQ ID NO’s 80-93或SEQ ID NO’s106-109的纳米抗体的类似物，也属于本发明的范围。因此，按照本发明的一个实施方案，术语“本发明的纳米抗体”在其最广泛的含义下也包括所述类似物。
一般地，在所述类似物中，与如本文所定义的本发明的纳米抗体相比，可以取代，缺失和/或添加了一个或多个氨基酸残基。可以将所述替换，插入或缺失指定在一个或多个构架区和/或一个或多个CDR中。当将所述替换，插入或缺失指定在一个或多个构架区中时，可将它们指定在一个或多个标志残基处和/或构架残基中的一个或多个其他位置处，尽管在标志残基处的替换，插入或缺失通常是较不优选的(除非这些是如本文所述的合适的人源化替换)。
依靠非限制性实例，替换可以例如是保守的替换(如本文所定义)和/或氨基酸残基可以被天然存在于另一个VHH结构域中相同位置处的另一个氨基酸残基所取代(所述替换的一些非限制性实例参见表A-5-A-8)，尽管本发明一般不受此限制。因此，本发明的范围包括任何一个或多个替换，缺失或插入或其任意的组合，其改进本发明纳米抗体的特性或至少不太多地破坏本发明纳米抗体的所需特性或所需特性的平衡或组合(即，达到使纳米抗体不再适合于其预期的用途的程度)。基于本文的公开内容以及任选地在有限的常规试验后，技术人员一般能够确定和选择合适的替换，缺失或插入，或其合适的组合，其可以例如涉及引入有限数量可能的替换和确定它们对由此获得的纳米抗体特性的影响。
例如，且依赖于用于表达本发明纳米抗体或多肽的宿主生物体，可以以这样的方式设计所述缺失和/或替换，所述方式是去除一个或多个翻译后的修饰位点(如一个或多个糖基化位点)，如在本领域技术人员能力范围内。备选地，可以设计替换或插入，从而应用一个或多个附加功能团的位点(如本文所定义)，例如容许位点特异性PEG化(也如本文所定义)。
如可以从上表A-5-A-8中给出的VHH熵和VHH可变性的数据看出，构架区中的一些氨基酸残基比其他的更保守。通常，尽管本发明在其最广泛含义下不受此限制，但是，优选地，将任何的替换，缺失或插入指定在较不保守的位置处。而且，通常，氨基酸的替换优于氨基酸的缺失或插入。
所述类似物优选地以这样的解离常数(KD)和/或这样的结合亲和力和/或这样的亲和力分别结合于EGFR或IGF-IR，所述解离常数是10-5-10-12摩尔/升或更低，和优选地10-7-10-12摩尔/升或更低，和更优选地10-8-10-12摩尔/升或更低，所述结合亲和力是至少107M-1，优选地至少108M-1，更优选地至少109M-1，诸如至少1012M-1的结合亲和力，所述亲和力低于500nM，优选地低于200nM，更优选地低于10nM，诸如低于500pM。所述类似物分别针对EGFR或IGF-IR的亲和力可以通过本身已知的方式确定，例如利用本文所述的测定。
如本文所述，所述类似物还优选地使它们保持纳米抗体的有利特性。
而且，按照一个优选的实施方案，所述类似物与SEQ ID NOs 80-93或SEQ ID NO’s 106-109的纳米抗体之一相比，具有至少70％，优选地至少80％，更优选地至少90％，诸如至少95％或99％或更高的序列同一性程度；和/或优选地具有最多20，优选地最多10，甚至更优选地最多5，诸如4，3，2或仅1个的氨基酸区别(如本文所定义)。
而且，所述类似物的构架序列和CDR优选地使它们与本文所定义的优选实施方案一致。更一般地，如本文所述，所述类似物应该具有(a)位置108处的Q；和/或(b)位置45处的带电氨基酸或半胱氨酸残基，和优选地位置44处的E，和更优选地位置44处的E和位置45处的R；和/或(c)位置103处的P，R或S。
本发明纳米抗体类似物的一个优选的种类包括被人源化了的纳米抗体(即，与本发明天然存在的纳米抗体的序列相比)。如在本文所引用的背景技术中所提及地，所述人源化通常涉及将天然存在的VHH的序列中的一个或多个氨基酸残基取代为人VH结构域，如人VH3结构域中相同位置处的氨基酸残基。可能的人源化替换或人源化替换组合的实例对技术人员是清楚的，例如来自本文的附表，来自本文所引用的背景技术中所提及的可能的人源化替换，和/或来自纳米抗体序列和天然存在的人VH结构域序列的比较。
应该将人源化替换选择为使由此产生的人源化纳米抗体仍然保持如本文所定义的纳米抗体的有利特性，且更优选地使它们如以上段落中对类似物所描述地。技术人员基于本文的公开内容以及任选地有限度的常规试验后，通常能够确定和选择合适的人源化替换或人源化替换合适组合，其可以例如涉及引入有限数量可能的人源化替换和确定它们对由此获得的纳米抗体特性的影响。
一般地，作为人源化的结果，本发明的纳米抗体可以成为更加“人样的”，而仍然保持如本文所述的本发明纳米抗体的有利特性。作为结果，所述人源化纳米抗体可以具有若干优势，如与相应的天然存在的VHH结构域相比降低的免疫原性。而且，基于本文的公开内容以及任选地在有限的常规试验后，技术人员能够选择人源化替换或人源化替换的合适组合，其最优化或达到一方面由人源化替换所提供的有利特性和另一方面天然存在的VHH结构域的有利特性之间所需或合适的平衡。
可以以任何本身已知的方式提供人源化的和其他类似物，以及编码它们的核酸序列。例如，所述类似物可以通过以下步骤获得，所述步骤是提供编码天然存在的VHH结构域的核酸，改变一个或多个氨基酸残基的密码子，所述密码子将被替换成相应的所需氨基酸残基的密码子(例如，通过位点定向的诱变或通过利用合适错配引物的PCR)，在合适的宿主或表达系统中表达由此获得的核酸/核苷酸序列；和任选地分离和/或纯化由此获得的类似物，从而提供所述处于基本分离形式的类似物(例如，如本文进一步所述)。这通常可以利用本身已知的方法和技术实现，这些方法和技术对于技术人员是清楚的，例如来自本文所引用的手册和参考文献，本文所引用的背景技术和/或来自本文进一步的描述。备选地，可以以本身已知的方式(例如，利用用于合成具有预定的氨基酸序列的核酸序列的自动化设备)合成，并然后可以如本文所述表达编码所需类似物的核酸。再一种技术可以涉及组合一个或多个天然存在和/或合成的核酸序列，其中每个所述的核酸序列编码所需类似物的一部分，并且然后如本文所述表达组合的核酸序列。而且，可以利用本身已知的肽合成技术，如本文所提及的那些，化学合成相关氨基酸序列来提供所述类似物。
在这个方面中，也对技术人员清楚的是可以从人VH序列(即，氨基酸序列或相应的核苷酸序列)开始，诸如例如从人VH3序列，诸如DP-47，DP-51或DP-29设计和/或制备本发明的纳米抗体(包括它们的类似物)，即通过引入一个或多个骆驼化的替换(即将所述人VH结构域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基改变为VHH结构域中相应处存在的氨基酸残基)，从而提供本发明纳米抗体的序列和/或从而对因此获得的序列赋予纳米抗体的有利特性。而且，这可以利用以上段落中参考的多种方法和技术，利用人VH结构域的氨基酸序列和/或核苷酸序列作为起始点来实现。
一些优选的但非限制性骆驼化的替换可以由表A-5-A-8衍生而来。还清楚的是位于一个或多个标志残基处的骆驼化替换通常比位于一个或多个其他氨基酸位置处的替换对所需特性具有更大的影响，尽管两者及其任意合适的组合包括在本发明的范围中。例如，可能引入一个或多个已经赋予了至少一些所需特性的骆驼化替换，并且然后引用进一步改进所述特性和/或赋予另外有利特性的进一步骆驼化的替换。而且，技术人员基于本文的公开内容以及任选地在有限的常规试验后，通常能够确定和选择合适的骆驼化替换或骆驼化替换的合适组合，其可以例如涉及引入有限数量的可能的骆驼化替换和确定是否获得或改进了纳米抗体的有利特性(即，与原始VH结构域相比较)。
一般地，然而，所述骆驼化替换优选的使由此产生的氨基酸序列至少含有(a)位置108处的Q；和/或(b)位置45处的带电氨基酸或半胱氨酸残基，和优选地还有位置44处的E，以及更优选地位置44处的E和位置45处的R；和/或(c)位置103处的P，R或S；和任选地一个或多个进一步的骆驼化的替换。更优选地，所述骆驼化的替换是使它们导致本发明的纳米抗体和/或导致其类似物(如本文所定义)，诸如导致人源化的类似物和/或优选地导致如以上段落中所定义的类似物。
还如应该由本文的公开内容清楚地可知，使用如本文所定义的本发明纳米抗体的部分或片段，或两个或更多部分或片段的组合，以及具体地SEQID NO’s 80-93或SEQ ID NO’s 106-109的纳米抗体的部分或片段也属于本发明的范围。因此，按照本发明的一个实施方案，术语“本发明的纳米抗体”在其最广泛的含义下还包括所述部分或片段。
通常，所述的本发明纳米抗体的部分或片段(包括其类似物)具有这样的氨基酸序列，其中，与相应的本发明全长纳米抗体氨基酸序列(或其类似物)相比，缺失和/或去除了一个或多个N末端的氨基酸残基，一个或多个C末端的氨基酸残基，一个或多个连续的(contiguous)内部氨基酸残基，或其任意的组合。
所述部分或片段优选地使它们以这样的解离常数(KD)和/或这样的结合亲和力和/或这样的亲和力分别结合于EGFR或IGF-IR，所述解离常数是10-5-10-12摩尔/升或更低，和优选地10-7-10-12摩尔/升或更低，和更优选地10-8-10-12摩尔/升或更低，所述结合亲和力是至少107M-1，优选地至少108M-1，更优选地至少109M-1，诸如至少1012M-1，所述亲和力低于500nM，优选地低于200nM，更优选地低于10nM，诸如低于500pM。所述部分或片段分别针对EGFR或IGF-IR的亲和力可以通过本身已知的方式确定，例如利用本文所述的测定。
任何部分或片段优选地使其包括相应的本发明全长纳米抗体的氨基酸序列的至少10个连续氨基酸残基，优选的至少20个连续氨基酸残基，更优选地至少30个连续的氨基酸残基，诸如至少40个连续氨基酸残基。
而且，任何部分或片段优选地使其包括至少一个CDR1，CDR2和/或CDR3或其至少一部分(且特别地至少CDR3或其至少一部分)。更优选地，任何部分或片段使其包括至少一个CDR(且优选地至少CDR3或其一部分)和至少一个其他的CDR(即，CDR1或CDR2)或其至少一部分，优选地通过合适的构架序列或其至少一部分连接。更优选地，任何部分或片段使其包括至少一个CDR(且优选地至少CDR3或其一部分)和至少剩余两种CDR的一部分，也优选地通过合适的构架序列或其至少一部分连接。
按照另一个特别优选的但非限制性实施方案，所述部分或片段包括至少CDR3，诸如相应的本发明全长纳米抗体的FR3，CDR3和FR4，即如例如国际申请WO 03/050531(Lasters等)中所述。
如上文已经提及地，还可能组合两个或多个所述的部分或片段(即，来自相同或不同的本发明的纳米抗体)，即从而提供类似物(如本文所定义)和/或提供本发明纳米抗体的进一步的部分或片段(如本文所定义)。例如，还可能组合一个或多个本发明纳米抗体的部分或片段和一个或多个人VH结构域的部分或片段。
按照一个优选的实施方案，所部分或片段具有与SEQ ID NOs 80-93或SEQ ID NO’s 106-109的纳米抗体之一相比至少50％，优选地至少60％，更优选地至少70％，甚至更优选地至少80％，诸如至少90％，95％或99％或更高的序列同一性程度。
可以以本身已知的方式提供和任选地组合所述部分和片段，以及编码它们的核酸序列。例如，可以通过将终止密码子插入到编码本发明的全长纳米抗体核酸中，并然后以本身已知的方式(例如，如本文所述)表达由此获得的核酸，来获得所部分或片段。备选地，编码所述部分或片段的核酸可以通过适当地限制编码本发明全长纳米抗体的核酸或通过以本身已知的方式合成所述核酸而获得。还可以利用本身已知的肽合成技术提供所述部分或片段。
本发明在其最广泛的含义下还包括本发明纳米抗体的衍生物。所述衍生物通常可以通过修饰，和具体地通过化学和/或生物(例如酶法)修饰本发明的纳米抗体和/或一个或多个形成本发明纳米抗体的氨基酸残基而获得。
所述修饰的实例，以及可以以所述方式被修饰的纳米抗体序列中的氨基酸残基的实例(即在蛋白质主链上，但优选地在侧链上)，可以用于引入所述修饰的方法或技术，以及所述修饰的潜在用途和优势对技术人员应该是清楚的。
例如，所述修饰可以涉及将一个或多个功能团，残基或部分，和具体地一个或多个对本发明纳米抗体赋予一种或多种所需特性或功能性的功能团，残基或部分，引入(通过共价连接或以其他合适方式)到本发明的纳米抗体之中或之上。所述功能团的实例对于技术人员是清楚的。
例如，所述修饰可以包括一个或多个这样的的功能团的引入(通过共价结合或以任何其他合适方式)，所述功能团增加本发明纳米抗体半衰期，溶解性和/或吸水性，降低本发明纳米抗体的免疫原性和/或毒性，消除或削弱本发明纳米抗体的任何不受欢迎的副作用，和/或对本发明的纳米抗体和/或多肽赋予其他有利特性和/或减少不受欢迎的特性；或上述两项或多项的任意组合。所述功能团和引入它们的技术的实例对于技术人员是清楚的，且通常可以包括上文所引用的一般背景技术中所提及的所有的功能团和技术，以及用于修饰药物蛋白质，和特别地用于修饰抗体或抗体片段(包括ScFv’s和单一结构域的抗体)的本身已知的功能团和技术，为此将参考文献例如雷明顿制药科学(Remington′s Pharmaceutical Sciences)，第16版，Mack Publishing Co.，Easton，PA(1980)。如也对技术人员清楚地，所述功能团可以例如直接连接于(例如共价地)本发明的纳米抗体，或任选地通过合适的连接体或间隔区。
最广泛用于增长药物蛋白质半衰期和/或降低免疫原性的技术之一包括附加合适的药用聚合体，如聚(乙二醇)(PEG)或其衍生物(如甲氧基聚(乙二醇)或mPEG)。通常，可以使用任何合适形式的PEG化(pegylation)形式，如在用于抗体和抗体片段(包括但不仅限于(单一)结构域抗体和ScFv’s)的技术领域中使用的PEG化；将参考文献例如Chapman，自然生物工程(Nat.Biotechnol.)，54，531-545(2002)；由Veronese和Harris，药物递送综述进展(Adv.Drug Deliv.Rev.)54，453-456(2003)，由Harris和Chess，药物发现的自然综述(Nat.Rev.Drug.Discov.)，2，(2003)和WO04/060965中。多种用于蛋白质PEG化作用的试剂也可以商业购买，例如购自美国的Nektar Therapeutics。
优选地，使用定点PEG化作用，特别地通过半胱氨酸残基(参见例如Yang等，蛋白质工程(Protein Engineering)，16，10，761-770(2003))。例如，为了该目的，可以将PEG附加于天然存在于本发明纳米抗体中的半胱氨酸残基，可以修饰本发明的纳米抗体从而适当地为PEG的附加引入一个或多个半胱氨酸残基，或可以将为了PEG的附加包括一个或多个半胱氨酸残基的氨基酸序列融合于本发明纳米抗体的N和/或C末端，全部使用本身对技术人员已知的蛋白质工程技术。
优选地，对于本发明的纳米抗体和蛋白质，使用这样的PEG，所述PEG具有高于5000的分子量，诸如高于10,000和低于200,000，如低于100,000；例如在20,000-80,000的范围内。
另外，通常较不优选的修饰依赖于用于表达本发明纳米抗体或多肽的宿主细胞，包括N-连接的或O-连接的糖基化，通常作为共翻译和/或翻译后修饰的一部分。
依赖于对标记的纳米抗体所预期的用途，另一种修饰可以包括引入一个或多个可检测到的标记或其他产生信号的组或部分。适合的标记以及用于附加、应用和检测它们的技术对于技术人员是清楚的，且例如包括，但不限于荧光标记(如荧光素，异硫氰酸盐，若丹明，藻红蛋白，藻青蛋白，别藻蓝蛋白，邻-苯二醛(o-phthaldehyde)，和荧光胺和荧光金属，如152Eu或其他来自镧系的金属)，发磷光的标记，化学发光标记或生物发光标记(如鲁米那，isoluminol，theromatic吖啶鎓酯(acridinium esters)，咪唑，吖啶鎓盐(acridinium salts)，草酸酯，dioxetane或GFP和其类似物)，放射性同位素(如3H，125I，32P，35S，14C，51Cr，36Cl，57Co，58Co，59Fe，和75Se)，金属，金属螯合物或金属阳离子(例如诸如99mTc，123I，111In，131I，97Ru，67Cu，67Ga，和68Ga的金属阳离子或其他特别适合用于体内，体外或原位诊断和成像的金属或金属阳离子，诸如(157Gd，55Mn，162Dy，52Cr，and 56Fe)，以及发色团和酶(诸如苹果酸脱氢酶，葡萄球菌核酸酶，δ-V-类固醇异构酶，酵母醇脱氢酶，α-甘油磷酸脱氢酶，磷酸丙糖异构酶，生物素抗生物素蛋白过氧化物酶，辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，天冬酰胺酶，葡糖氧化酶，β-半乳糖苷酶，核糖核酸酶，脲酶，过氧化氢酶，葡萄糖-VI-磷酸脱氢酶，葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶)。其他合适的标记对技术人员是清楚的，且例如包括可以利用NMR或ESR分光术检测到的部分。
所述本发明标记的纳米抗体和多肽依赖于特异性标记的选择，可以例如用于体内，体外或原位测定(包括本身已知的免疫测定，如ELISA，RIA，EIA和其他“夹心式测定”等)，以及体内诊断和成像的目的。
如对技术人员清楚地，另一种修饰可以涉及引入螯合基团，例如从而与以上所述的金属或金属阳离子之一螯合。合适的螯合基团例如不受限地包括，二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)。
另一种修饰可以包括这样的功能团的引入，所述功能团是特异性结合对，如生物素-(链酶)抗生物素结合对的一部分。所述功能团可以用于连接本发明的纳米抗体和另一种与所述结合对的另一半结合的蛋白质，多肽或化学化合物，即通过形成所述结合对。例如，本发明的纳米抗体可以与生物素缀合，并与另一种与抗生物素蛋白或链酶抗生物素缀合的蛋白质，多肽，化合物或载体连接。例如，所述缀合的纳米抗体可以，例如在诊断系统中，用作报道物，其中产生可检测到的信号的试剂与抗生物素蛋白或链酶抗生物素缀合。所述结合对还可以例如用于使本发明的纳米抗体结合于载体，包括适合于药物目的的载体。一个非限制性实例是由Cao和Suresh，药物靶标杂志(Journal of Drug Targetting)，8，4，257(2000)所述的脂质体制剂。所述结合对还可以用于连接治疗活性试剂和本发明的纳米抗体。
为了一些应用，特别是为了在其中意欲杀死表达本发明纳米抗体所针对的靶标的细胞(例如，在癌症的治疗中)，或减少或减缓生长和/或增殖所述细胞的那些应用，本发明的纳米抗体还可以与毒素或毒性残基或部分相连接。可以与本发明的纳米抗体相连接，从而提供例如细胞毒性化合物的毒性部分、化合物或残基的实例应该对技术人员是清楚的，且可以例如见于以上所引用的现有技术中和/或本文的进一步描述中。一个实例是所谓的ADEPTTM技术WO 03/055527。
其他潜在的化学和酶的修饰对技术人员是清楚的。还可以将这些修饰引入到研究的目的中(例如，为了研究功能-活性关系)。参考文献例如Lundblad和Bradshaw，生物工程和应用生物化学(Biotechnol.Appl.Biochem.)，26，143-151(1997)。
优选地，所述衍生物使它们以这样的解离常数(KD)和/或这样的结合亲和力和/或这样的亲和力分别结合于EGFR或IGF-IR，所述解离常数是10-5-10-12摩尔/升或更低，和优选地10-7-10-12摩尔/升或更低，和更优选地10-8-10-12摩尔/升或更低，所述结合亲和力是至少107M-1，优选地至少108M-1，更优选地至少109M-1，诸如至少1012M-1，所述亲和力低于500nM，优选地低于200nM，更优选地低于10nM，诸如低于500pM。本发明纳米抗体的衍生物分别针对EGFR或IGF-IR的亲和力可以通过本身已知的方式确定，例如利用本文所述的测定。
如上所述，本发明还涉及基本由至少一个本发明的纳米抗体或包括至少一个本发明的纳米抗体的蛋白质或多肽。由“基本由-------组成”意指本发明多肽的氨基酸序列与本发明纳米抗体的氨基酸序列完全相同或与本发明纳米抗体的氨基酸序列相当，其具有在所述纳米抗体氨基酸序列的氨基末端，在羧基末端，或氨基末端和羧基末端添加的有限量的氨基酸残基，诸如1-20个氨基酸残基，例如1-10个氨基酸残基和优选地1-6个氨基酸残基，诸如1，2，3，4，5或6个氨基酸残基。
所述氨基酸残基可以或可以不转变，改变或否则影响纳米抗体的(生物)特性，并且可以或可以不对纳米抗体添加另外的功能性。例如，所述氨基酸残基：
a)可以包括N末端的Met残基，例如作为异源宿主细胞或宿主生物体中表达的结果。
b)可以形成信号序列或前导序列，所述信号序列或前导序列随着合成指导纳米抗体从宿主细胞中的分泌。合适的分泌前导肽对技术人员是清楚的，且可以如本文进一步所述。通常，所述前导序列应该与纳米抗体的N末端连接，尽管本发明在其最广泛含义下不受其限制；
c)可以形成序列或信号，所述序列或信号容许将纳米抗体指向和/或使其穿透或进入特异性器官，组织，细胞或细胞的部分或区室，和/或容许纳米抗体穿透或穿过生物屏障，如细胞膜，细胞层，如上皮细胞层，包括实体瘤的肿瘤，或血脑屏障。所述氨基酸序列的实例对技术人员是清楚的。一些非限制性实例是WO 03/026700和Temsamani等，生物治疗法的专业观点(Expert Opin.Biol.Ther.)，1，773(2001)；Temsamani和Vidal，今日药物发现(Drug Discov.Today)，9，1012(004)和Rousselle，药理学和试验治疗学杂志(J.Pharmacol.Exp.Ther.)，296，124-131(2001)中所述的小肽载体(“Pep-trans载体”)，和由Zhao等，程序性细胞死亡(Apoptosis)，8，631-637(2003)所述的膜易位体序列。例如由Cardinale等，方法(Methods)，34，171(2004)描述了用于细胞内抗体片段靶向的C末端和N末端氨基酸序列。其他用于细胞内靶向的合适技术涉及包括本发明纳米抗体的所谓“胞内抗体”的表达和/或应用，如下所述；
d)可以形成“标记物”，例如容许或促进纳米抗体纯化的氨基酸序列或残基，例如利用针对所述序列或残基的亲和力技术。其后，可以除去所述序列或残基(例如，通过化学或酶分裂)，从而提供纳米抗体序列(为了该目的，所述标记物可以任选地通过可分裂的连接体序列连接于纳米抗体序列或含有可分裂的基序)。所述残基的一些优选的但非限制性的实例是多组氨酸残基，谷胱甘肽残基，和myc-标记物，如AAAEQKLISEEDLNGAA[SEQ ID NO：31]；
e)可以是一个或多个氨基酸残基，所述氨基酸残基已被功能化和/或可以起到附加功能团的位点的作用。合适的氨基酸残基和功能团对技术人员是清楚的，且包括，但不限于本文为本发明纳米抗体的衍生物所提及的氨基酸残基和功能团。
按照另一个实施方案，本发明的多肽包括本发明的纳米抗体，其在它的氨基末端，在它的羧基末端，或它的氨基末端和它的羧基末端与至少一个另外的氨基酸序列融合，即从而提供包括所述本发明纳米抗体和一个或多个另外的氨基酸序列的融合蛋白。所述融合在本文中也指“纳米抗体融合”。
所述一个或多个另外的氨基酸序列可以是任何合适的和/或所需的氨基酸序列。所述另外的氨基酸序列可以或可以不转变，改变或否则影响纳米抗体的(生物)特性，并且可以或可以不对本发明的纳米抗体或多肽添加另外的功能性。优选地，所述另外的氨基酸序列使其向本发明的纳米抗体或多肽赋予一种或多种所需的特性或功能性。
所述氨基酸序列的实例对技术人员是清楚的，且通常可以包括基于常规抗体和其片段(包括但不仅限于ScFv’s和单一结构域抗体)在肽融合使用的所有氨基酸序列。参考文献例如Holliger和Hudson，自然生物工程(Nature Biotechnology)，23，9，1126-1136(2005)的综述。
例如，所述氨基酸序列可以是这样的氨基酸序列，其与自身的本发明的纳米抗体相比，增加本发明多肽的半衰期，溶解性，或吸收性，降低其免疫原性或毒性，消除或削弱其不受欢迎的副作用，和/或对其赋予其他有利特性和/或减少不受欢迎的特性。所述氨基酸序列的一些非限制性实例是血清蛋白，如人血清清蛋白(参见例如WO 00/27435)或半抗原分子(例如通过循环抗体识别的半抗原，参见例如WO 98/22141)。
所述另外的氨基酸序列还可以提供第二结合位点，该结合位点可以针对任何所需的蛋白质，多肽，抗原，抗原决定簇或表位(包括但不仅限于本发明纳米抗体所针对的相同蛋白质，多肽，抗原，抗原决定簇或表位，或不同的蛋白质，多肽，抗原，抗原决定簇或表位)。例如，所述另外的氨基酸序列可以提供针对血清蛋白(诸如，例如，人血清清蛋白或另一种血清蛋白诸如IgG)的第二结合位点，从而在血清中提供增长的半衰期。参考文献例如EP 0 368 684，WO 91/01743，WO 01/45746和WO 04/003019(其中提及了多种血清蛋白)，WO 06/040153，以及Harmsen等，疫苗(Vaccine)，23(41)；4926-42。
按照另一个实施方案，所述一种或多种另外的氨基酸序列可以包括常规4-链抗体(和特别是人抗体)和/或重链抗体的部分，片段或结构域中的一个或多个。例如，尽管通常较不优选，本发明的纳米抗体可以同样任选地通过连接体序列(包括但不仅限于其他(单一)结构域抗体，诸如由Ward等所述的dAb’s)，连接于常规(优选地，人)VH或VL结构域结构域，或天然的或合成的VH或VL结构域的类似物。
至少一种纳米抗体也可以连接于一个或多个(优选地，人)CH1，CH2和/或CH3结构域，任选地通过连接体序列。例如，与适合的CH1结构域相连的纳米抗体可以例如与适合的轻链一起，用于产生类似于常规Fab片段或F(ab’)2片段的抗体片段/结构，但是其中一个或(在F(ab’)2片段的情形中)一个或全部两个常规VH结构域已经被本发明的纳米抗体取代了。而且，两个纳米抗体可以连接于CH3结构域(任选地通过连接体)，从而提供具有增长的体内半衰期的构建体。
按照本发明多肽的一个具体实施方案，一个或多个本发明的纳米抗体可以连接于一个或多个抗体部分，片段或结构域，所述抗体部分，片段或结构域赋予本发明的多肽一种或多个效应子功能和/或可以赋予结合于一个或多个Fc受体的能力。例如，为了该目的，且不受其限制，所述一个或多个另外的氨基酸序列可以包括抗体的一个或多个CH2和/或CH3结构域，诸如来自重链抗体(如本文所述)和更优选地来自常规人4-链抗体；和/或可以形成(部分)和Fc区域，例如来自IgG，来自IgE或来自另一种人类Ig。例如，WO 94/04678描述了包括骆驼化的VHH结构域或其人源化衍生物(即，纳米抗体)的重链抗体，其中骆驼科CH2和/或CH3结构域已经被人CH2和CH3结构域取代了，从而提供由2条重链组成的免疫球蛋白，所述每条重链包括纳米抗体和人CH2和CH3结构域(但是无CH1结构域)，所述免疫球蛋白具有由CH2和CH3结构域提供的效应子功能，且所述免疫球蛋白可以在无任何轻链的存在下发挥作用。可以适当地连接于本发明纳米抗体从而提供效应子功能的其他氨基酸序列对于技术人员是清楚的，且可以基于所需的效应子功能对其进行选择。参考文献例如WO 04/058820，WO 99/42077和WO 05/017148，以及Holliger and Hudson的综述，见上。与本发明相应的纳米抗体相比，本发明纳米抗体与Fc部分的偶联还可以导致增长的半衰期。为了一些应用，赋予增长的半衰期而无任何生物学显著效应子功能的Fc部分和/或恒定结构域(即CH2和/或CH3结构域)的应用也可以是合适的或甚至优选的。其他包括一个或多个纳米抗体和一个或多个恒定结构域，具有增长的体内半衰期的合适构建体对于技术人员是清楚的，且可以例如包括两个与CH3结构域相连的纳米抗体，任选地通过连接体序列。通常，任何具有增长的半衰期的融合蛋白或衍生物优选地具有超过50kD的分子量，即肾脏吸收的截止值。
所述另外的氨基酸序列还可以形成这样的信号序列或前导序列，所述信号序列或前导序列随着合成，指导本发明纳米抗体或多肽从宿主细胞中的分泌(例如，从而依赖于用于表达本发明多肽的宿主细胞，提供本发明多肽的前(pre-)，原(pro-)或前…原(prepro-)形式)。
所述另外的氨基酸序列还可以形成这样的序列或信号，所述序列或信号容许将本发明的纳米抗体或多肽指向和/或使其穿透或进入特异性器官，组织，细胞，或细胞的部分或区室，和/或容许本发明纳米抗体或多肽穿透或穿过生物屏障，如细胞膜，细胞层，如上皮细胞层，肿瘤包括实体瘤，或血脑屏障。所述氨基酸序列的合适实例对技术人员是清楚的，其例如包括，但不仅限于，上文所提及的“Peptrans”载体，由Cardinale等所述的序列和可以作为所谓“胞内抗体”用于表达或产生本发明纳米抗体和多肽的本身已知的氨基酸序列和抗体片段，例如，如下列文献所述：WO94/02610，WO 95/22618，US-A-6004940，WO 03/014960，WO 99/07414；WO05/01690；EP 1512696；和Cattaneo，A.& Biocca，S.(1997)细胞内抗体：发展和应用。(Intracellular Antibodies：Development and Applications.)Landes和Springer-Verlag；和Kontermann，方法(Methods)34，(2004)，163-170，以及其中所述的其他参考文献。
为了一些应用，特别是为了在其中意欲杀死表达本发明纳米抗体所针对的靶标的细胞(例如，在癌症的治疗中)，或减少或减缓生长和/或增殖所述细胞的那些应用，本发明的纳米抗体还可以与(细胞)毒性蛋白或多肽相连接。所述可以与本发明的纳米抗体相连接，从而提供例如本发明的细胞毒性多肽的毒性蛋白和多肽的实例对技术人员是清楚的，且可以例如见于以上所引用的现有技术中和/或本文的进一步描述中。一个实例是所谓的ADEPTTM技术WO 03/055527。
按照一个优选的但非限制性实施方案，所述一个或多个另外的氨基酸序列包括至少一种另外的纳米抗体，从而提供包括至少两个，诸如三，四，五或多个纳米抗体的本发明多肽，其中所述纳米抗体可以任选地通过一个或多个连接体序列(如本文所定义)连接。包括两个或多个纳米抗体的本发明多肽在本文中还称为本发明的“多价”多肽，其中至少一个纳米抗体是本发明的纳米抗体，且存在于所述多肽中纳米抗体在本文中也称为处于“多价形式”。例如，本发明的“二价”多肽包括两个纳米抗体，任选地通过连接体序列相连接，而本发明的“三价“多肽包括三个纳米抗体，任选地通过两个连接体序列相连接；等；其中至少一个存在于所述多肽中的纳米抗体，和多达所有存在于所述多肽中的纳米抗体，是本发明的纳米抗体。
在本发明的多价多肽中，所述两个或多个纳米抗体可以是相同或不同的，且可以针对相同的抗原或抗原决定簇(例如针对相同的部分或表位或针对不同的部分或表位)或可以备选地针对不同的抗原或抗原决定簇；或其任意的合适组合。例如，本发明的二价多肽可以包括(a)两个相同的纳米抗体；(b)针对蛋白质或抗原的第一抗原决定簇的第一纳米抗体和针对所述蛋白质或抗原的相同抗原决定簇的第二纳米抗体，所述第二纳米抗体与第一纳米抗体不同；(c)针对蛋白质或抗原的第一抗原决定簇的第一纳米抗体和针对所述蛋白质或抗原的另一个抗原决定簇的第二纳米抗体；或(d)针对第一蛋白质或抗原的第一纳米抗体和针对第二蛋白质或抗原(即，与所述第一抗原不同)的第二纳米抗体。类似地，本发明的三价多肽可以，例如并不受其限制地，包括(a)三个相同的纳米抗体；(b)针对抗原的第一抗原决定簇的两个相同的纳米抗体和针对相同抗原的不同抗原决定簇的第三纳米抗体；(c)针对抗原的第一抗原决定簇的两个相同的纳米抗体和针对与所述第一抗原不同的第二抗原的第三纳米抗体；(d)针对第一抗原的第一抗原决定簇的第一纳米抗体，针对所述第一抗原的第二抗原决定簇的第二纳米抗体和针对与所述第一抗原不同的第二抗原的第三纳米抗体；或(e)针对第一抗原的第一纳米抗体，针对与所述第一抗原不同的第二抗原的第二纳米抗体，和针对与所述第一和第二抗原不同的第三抗原的第三纳米抗体。
在优选的实施方案中，本发明提供这样的二价多肽，其包括或基本由两个相同的针对EFGR的纳米抗体组成。在SEQ ID NO’s：122-123中提供了所述二价多肽的非限制性实例。在另一个优选的实施方案中，本发明提供这样的二价多肽，其包括或基本由两个相同的针对IGF-IR的纳米抗体组成。在SEQ ID NO’s：134-135中提供了所述二价多肽的非限制性实例。
本发明含有至少两个纳米抗体的多肽也称为本发明的“多特异性“多肽，其中至少一个纳米抗体针对第一抗原(即，分别针对EGFR或IGF-IR)，且至少一个纳米抗体针对第二抗原(即分别区别于EGFR或IGF-IR)，并且存在于所述多肽中的纳米抗体在本文在还称为处于”多价形式“。因此，例如，本发明的”双特异性“多肽是这样的多肽，其包括至少一个针对第一抗原(即，分别为EGFR或IGF-IR)的纳米抗体和至少一个针对第二抗原(即分别区别于EGFR或IGF-IR)的另外的纳米抗体，而本发明的“三特异性”多肽是这样的多肽，其包括至少一个针对第一抗原(即，分别为EGFR或IGF-IR)的纳米抗体，至少一个针对第二抗原(即分别区别于EGFR或IGF-IR)的另外的纳米抗体和至少一个针对第三抗原(即，分别区别于EGFR或IGF-IR，以及第二抗原)的另外的纳米抗体；等。
因此，在其最简单的形式中，本发明的双特异性多肽是本发明的二价多肽(如本文所定义)，其包括分别针对EGFR或IGF-IR的第一纳米抗体，和针对第二抗原的第二纳米抗体，其中所述第一和第二纳米抗体抗体可以任选地通过连接体序列(如本文所定义)相连接；而处于其最简单形式的本发明的三特异性多肽是本发明的三价多肽(如本文所定义)，其包括分别针对EGFR或IGF-IR的第一纳米抗体，针对第二抗原的第二纳米抗体和针对第三抗原的第三纳米抗体，其中所述第一，第二和第三纳米抗体任选地通过一个或多个，且特别地一个或多个，特别地两个连接体序列相连接。
然而，如从上文描述所清楚地，本发明在这样的方面中不受其限制，该方面是本发明的多特异性多肽包括至少一个分别针对EGFR或IGF-IR的纳米抗体，和任意数量的针对一个或多个分别区别于EGFR或IGF-IR的纳米抗体。
按照一个具体但非限制性实施方案，如本文所述的多肽包括至少一个针对EGFR的纳米抗体和至少一个针对IGF-IR的纳米抗体，任选地利用一个或多个合适的连接体相连接。在所述双特异性纳米抗体构建体中，本文所述的针对IGF-IR的纳米抗体和多肽可以与一个或多个WO 05/044858和WO 04/041867中所述的抗EGFR纳米抗体和多肽，和/或与一个或多个本文所述的抗EGFR的纳米抗体和多肽组合。所述双特异性纳米抗体构建体的非限制性实例包括SEQ ID NOs：136-140。
包括两个结合部分的双特异性多肽在肿瘤靶向中非常有利，其中每个结合部分特异于与肿瘤相关的抗原(即，在肿瘤细胞上表达的抗原，也称为“肿瘤标记”)。所述双特异性多肽能够同时靶向两种与肿瘤相关的抗原，从而导致增强的肿瘤特异性。已知大多数肿瘤标记不真正是肿瘤特异的，而还发生(主要以较低水平)在正常组织或细胞上。因此，单特异性结合部分，即仅针对一种肿瘤标记的纳米抗体或多肽，也识别那些正常的组织或细胞，从而导致非特异性细胞捕获或杀死。特异于一种或多种肿瘤细胞上两种或多种标记的多肽应该更加肿瘤特异得多，并提供更好的特异性结合。它们由此可以同时阻断多种受体活性和下游信号转导途径，并提供对肿瘤增殖和肿瘤细胞捕获或杀死更好的抑制。
因此，本发明还涉及双特异性或多特异性多肽，其包括或基本由至少两个结合部分组成，其中所述至少两个结合部分中的每个针对与肿瘤相关的抗原或表位。在一个实施方案中，每个结合部分针对相同的肿瘤相关抗原上不同的表位(也称为双互补位(biparatopic)结合部分)。在另一个实施方案中，每个结合部分针对不同的肿瘤相关抗原。每个结合部分可以针对单一或毗连肿瘤细胞上不同的肿瘤相关抗原。在优选的实施方案中，所述至少两个结合部分具有对它们单独的肿瘤相关抗原或表位中等或低亲和力，且因此，仅具有正常组织或表达肿瘤相关抗原之一的细胞的减少保留。然而，那些至少两个结合部分优选地靶向(对其具有高亲和力)表达由双特异性或多特异性多肽识别的全部两种抗原的肿瘤细胞。
按照本发明的结合部分可以是含有这样的部分的任何肽或核苷酸，所述部分对至少一种抗原具有已知的结合亲和力。所述部分可以是蛋白质，多肽，蛋白质片段(如抗体片段)或任意蛋白质的一个或多个亚单位。结合部分的典型实例是酶，受体或转运蛋白。它还可以是载体蛋白，诸如清蛋白或抗体。所述结合部分还可以是，或包括DAN或RNA序列。
在优选的实施方案中，本发明的双特异性或多特异性多肽上的一个或多个结合部分是低于15kDa的多肽。在甚至更优选的实施方案中，本发明的双特异性或多特异性多肽上的一个或多个结合部分是VH，VHH，结构域抗体，单结构域抗原，“dAb”或纳米抗体。在最优选的实施方案中，本发明的双特异性或多特异性多肽上的结合部分是纳米抗体。
不同的EGFR家族成员(EGFR，HER2，HER3，HER4)，例如，在乳腺癌，结肠癌，卵巢癌，肺癌和头和颈部癌症中的肿瘤上过表达。通过同时靶向这些肿瘤相关抗原中的两种，或这些肿瘤相关抗原中一种上的不同表位，将获得高得多的选择性和/或增高的肿瘤靶向。
因此，在优选的实施方案中，本发明还提供这样的双特异性多肽，其包括或基本由针对EGFR的纳米抗体和针对EGFR家族另一成员的纳米抗体组成。本发明的多肽可以包括或基本由针对EGFR的纳米抗体和针对HER2的纳米抗体组成。在另一个实施方案中，本发明的多肽可以包括或基本由针对EGFR的纳米抗体和针对HER3的纳米抗体组成。在另一个实施方案中，本发明的多肽可以包括或基本由针对EGFR的纳米抗体和针对HER4的纳米抗体组成。在进一步的实施方案中，本发明的多肽还可以包括或基本由针对HER2的纳米抗体和针对EGFR家族另一成员的纳米抗体组成。本发明的多肽可以包括或基本由针对HER2的纳米抗体和针对HER3的纳米抗体组成。在另一个实施方案中，本发明的多肽可以包括或基本由针对HER2的纳米抗体和针对HER4的纳米抗体组成。在另一个进一步的实施方案中，本发明的多肽还可以包括或基本由针对HER3的纳米抗体和针对EGFR家族另一成员的纳米抗体组成。本发明的多肽可以包括或基本由针对HER3的纳米抗体和针对HER4的纳米抗体组成。
在另一个优选的实施方案中，本发明提供这样的双特异性多肽，其包括或基本由针对EGFR的特异性表位的纳米抗体和针对EGFR的另一个特异性表位的纳米抗体组成。所述双特异性/双互补位多肽的非限制性实例是SEQ ID NOs：141-143。
另一个非限制性实例是表达在多骨髓瘤细胞上的CD138和CD38肿瘤标记。通过同时靶向CD138和CD38，获得那些多骨髓瘤细胞选择性高得多的靶向。
可以由本发明的双特异性或多特异性多肽同时靶向的肿瘤标记包括-但不仅限于-EGFR，IGF-IR，HER2，HER3，HER4，CEA，VEGF，CD38，CD138。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及三特异性或多特异性多肽，其包括或基本由至少三个结合部分组成，其中所述至少三个结合部分中的两个针对肿瘤相关抗原或表位，且其他结合部分针对另一种靶标或抗原。优选地，该靶标或抗原是可以在体内增长所述多肽半衰期(如本文所定义)的分子或具有效应子功能的分子，诸如CD3，Fc受体或补体蛋白。在一个实施方案中，针对肿瘤相关抗原或表位的两个结合部分针对相同肿瘤相关抗原上不同的表位(也称为双互补位结合部分)。在另一个实施方案中，针对肿瘤相关抗原或表位的两个结合部分针对不同的肿瘤相关抗原。这些结合部分中的每一个可以针对单一或毗连肿瘤细胞上不同的肿瘤相关抗原。
在一个优选的实施方案中，本发明的三特异性或多特异性多肽上一个或多个结合部分是低于15kDa的多肽。在甚至更优选的实施方案中，本发明的三特异性或多特异性多肽上的一个或多个结合部分是VH，VHH，结构域抗体，单结构域抗原，“dAb”或纳米抗体。在最优选的实施方案中，本发明的三特异性或多特异性多肽上的结合部分是纳米抗体。
在一个实施方案中，本发明提供这样的三特异性多肽，其包括或基本由针对EGFR的纳米抗体，针对IGF-IR的纳米抗体和针对人血清清蛋白的纳米抗体组成，如非限制性实例SEQ ID NO’s：138-140。在另一个实施方案中，本发明提供这样的三特异性多肽，其包括或基本由针对EGFR上的特异性表位的纳米抗体，针对EGFR上另一个特异性表位的纳米抗体和针对人血清清蛋白的纳米抗体组成，如非限制性实例SEQ ID NO’s：142-143。
此外，尽管本发明多肽中各种纳米抗体的特异性顺序或排列可以对本发明最终多肽的特性(包括但不仅限于分别EGFR或IGF-IR，或针对一种或多种其他抗原的亲和力(affinity)，特异性或抗体亲抗原性(avidity))具有一些影响属于本发明的范围，但是所述顺序或排列通常不是关键的且可以由技术人员进行适当的选择，任选地在一些基于本发明公开内容的有限常规试验后。因此，当参考本发明的特异性多价或多特异性多肽时，应该注意除非明确指出，这包括相关纳米抗体的任何顺序或排列。
还包括在本发明范围内的是包括或基本由至少两个纳米抗体组成的双特异性或多特异性多肽，其中所述的至少两个纳米抗体之一随着通过其他纳米抗体与其抗原的结合，具有对其抗原降低或增高的亲和力。所述结合称为“有条件的双特异性或多特异性结合”。所述双特异性或多特异性多肽也称为“本发明有条件结合的双特异性或多特异性多肽”。
所述抗原与所述的至少两个纳米抗体中的第一个的结合可以调节，如增高，降低或抑制所述抗原与所述的至少两个纳米抗体中的第二个的结合。在实施方案中，与所述的至少两个纳米抗体中第一个的结合刺激与所述的至少两个纳米抗体中第二个的结合。在另一个实施方案中，与所述的至少两个纳米抗体中第一个的结合至少部分地抑制与所述的至少两个纳米抗体中第二个的结合。在另一个实施方案中，与所述的至少两个纳米抗体中第一个的结合抑制与所述的至少两个纳米抗体中第二个的结合。在所述实施方案中，可以将本发明的多肽，例如，通过与蛋白质的结合体内保持在受试者生物体体内，所述蛋白质将多肽的半衰期增长到直到这样的时刻，在所述时刻时，其变得与其第二靶抗原结合且从半衰期增长的蛋白质中解离出来。
上文中所述的结合的调节是作为纳米抗体相对于彼此的抗原结合位点的结构接近度的结果获得的。所述结构接近度可以通过连接两个或多个抗原结合位点的构件性质而获得，例如通过提供具有将抗原结合位点保持在靠近接近度的相对刚性结构的连接体。有利地，所述两个或多个抗原结合位点处于物理上彼此靠近的接近度，由此一个位点通过涉及所述多肽中位阻作用和/或构象改变的过程，调节另一个位点上抗原的结合。
因此，在一个方面，本发明还涉及用于产生本发明的有条件结合的双特异性或多特异性多肽的方法，其包括下列步骤：
a)通过其与第一表位结合的能力选择第一纳米抗体，
b)通过其与第二表位结合的能力选择第二纳米抗体，
c)任选通过连接体序列组合所述纳米抗体；和
d)通过其与所述第一表位和所述第二表位结合的能力选择本发明的有条件结合的双特异性或多特异性多肽。
在一个实施方案中，可以针对其与所述第一表位和所述第二表位结合的能力，选择本发明的有条件结合的双特异性或多特异性多肽，其中与所述表位之一的结合增强与其他表位的结合。有利地，结合被增强了25％或更多，有利地，40％，50％，60％，70％，80％，90％或更多，且优选地100％或更多。
在另一个实施方案中，可以针对其与所述第一表位和所述第二表位结合的能力，选择本发明的有条件结合的双特异性或多特异性多肽，其中与所述表位之一的结合减弱与其他表位的结合。在该实施方案的优选方面，可以针对其与所述第一表位和所述第二表位，而非与所述第一和第二表位二者同时结合的能力，选择本发明的有条件结合的双特异性或多特异性多肽。在该情形中，所述第一和第二纳米抗体竞争表位的结合。有利地，结合被减弱了25％或更多，有利地，40％，50％，60％，70％，80％，90％或更多，且优选地高达或接近100％，由此完全抑制了结合。可以通过常规抗原结合测定，如ELISA，通过基于荧光的技术，包括FRET，或通过诸如测量分子质量的表面等离振子共振的技术，测量表位的结合。
在以上方法的进一步实施方案中，提供了进一步的步骤，所述步骤包括通过其与第三或另外的表位结合的能力选择第三或另外的纳米抗体。在该方法中，产生的多特异性多肽包括多于两个纳米抗体。在本发明的这个方面，所述纳米抗体中的至少两种提供有条件的双特异性结合(即，所述抗原与所述至少两种纳米抗体中第一种的结合调节，如增强，减弱或抑制所述抗原与所述至少两种纳米抗体中第二种的结合)。其他一种或多种纳米抗体也可以提供有条件的结合(也称为有条件的多特异性结合)或可以自由地独立联合于它的表位。
在优选的实施方案中，所述双特异性有条件结合的多肽可以包括结合于靶分子的第一纳米抗体和结合于延长所述多肽半衰期的分子或基团的第二纳米抗体(下文中进一步描述了所述分子或基团的实例)。在一个实施方案中，所述第一纳米抗体仅在增长半衰期的分子或基团与第二纳米抗体结合时，能够与靶分子结合。在另一个实施方案中，所述第一纳米抗体仅在从第二纳米抗体中置换增长半衰期的分子或基团时，能够与靶分子结合。因此，例如，通过体积大的分子，如HSA，将双特异性有条件结合的多肽维持在受试者的血流循环中。当遇到靶分子时，双特异性有条件结合的多肽的结合结构域间的竞争导致HSA的置换和靶标的结合。
最后，还包括在本发明范围内是本发明的多肽含有两种或更多纳米抗体和一个或多个另外的氨基酸序列(如本文所提及的)。
对于含有一个或多个VHH结构域及其制剂的多价和多特异性多肽，参考文献Conrath等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，卷276，10.7346-7350，2001，以及例如WO 96/34103和WO 99/23221。本发明的一些具体的多特异性和/或多价多肽的一些其他实例可以见于本文参考的申请人的申请。
本发明的多特异性多肽的一个优选的但非限制性实例包括至少一种本发明的纳米抗体和至少一种提供增长的半衰期的纳米抗体。所述纳米抗体的一些优选的但非限制性实例包括针对血清蛋白，如人血清清蛋白，甲状腺素结合蛋白，(人)转铁蛋白，纤维蛋白原，免疫球蛋白诸如IgG，IgE或IgM，或WO 04/003019中所列出的一种其他的血清蛋白的纳米抗体。
例如，为了小鼠中的试验，可以使用针对小鼠血清清蛋白(MSA)的纳米抗体，而为了药物应用，可以使用针对人血清清蛋白的纳米抗体。
本发明的另一个实施方案是如上所述的多肽构建体，其中所述至少一种(人)血清蛋白是(人)血清清蛋白，(人)血清免疫球蛋白，(人)甲状腺素结合蛋白，(人)转铁蛋白，(人)纤维蛋白原等中的任意一种。
按照本发明具体的但非限制性方面，本发明的多肽除一种或多种本发明的纳米抗体外，含有至少一种针对人血清清蛋白的纳米抗体。尽管这些针对人血清清蛋白的纳米抗体可以是如以上引用的申请人在本申请中进行一般描述(参见例如W04/062551)，但是按照特别优选的但非限制性实施方案，所述针对人血清清蛋白的纳米抗体由4个构架区(分别地，FR1-FR4)和3个互补决定区(分别地，CDR1-CDR3)组成，其中：
i)CDR1是这样的的氨基酸序列，其选自下列各项组成的组：
SFGMS    [SEQ ID NO：15]
LNLMG    [SEQ ID NO：16]
INLLG    [SEQ ID NO：17]
NYWMY；  [SEQ ID NO：18]
和/或选自由这样的氨基酸序列组成的组，所述氨基酸序列与以上氨基酸序列之一相比具有2个或仅1个的“氨基酸的区别”(如本文所定义的)，其中：
(1)任意氨基酸替换优选地是保守的氨基酸替换(如本文所定义的)；和/或
(2)所述氨基酸序列与以上氨基酸序列相比，优选地仅含有氨基酸替换，且没有氨基酸缺失或插入；
且其中：
ii)CDR2是这样的的氨基酸序列，其选自下列各项组成的组：
SISGSGSDTLYADSVKG    [SEQ ID NO：19]
TITVGDSTNYADSVKG     [SEQ ID NO：20]
TITVGDSTSYADSVKG     [SEQ ID NO：21]
SINGRGDDTRYADSVKG    [SEQ ID NO：22]
AISADSSTKNYADSVKG    [SEQ ID NO：23]
AISADSSDKRYADSVKG    [SEQ ID NO：24]
RISTGGGYSYYADSVKG    [SEQ ID NO：25]
或选自由这样的氨基酸序列组成的组，所述氨基酸序列具有与以上氨基酸序列之一相比至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％，甚至更优选地至少99％的序列同一性(如本文所定义的)；其中
(1)任意氨基酸替换优选地是保守的氨基酸替换(如本文所定义的)；和/或
(2)所述氨基酸序列与以上氨基酸序列相比，优选地仅含有氨基酸替换，且没有氨基酸缺失或插入；
和/或选自由这样的氨基酸序列组成的组，所述氨基酸序列与以上氨基酸序列之一相比具有3个，2个或仅1个的“氨基酸的区别”(如本文所定义的)，其中：
(1)任意氨基酸替换优选地是保守的氨基酸替换(如本文所定义的)；和/或
(2)所述氨基酸序列与以上氨基酸序列相比，优选地仅含有氨基酸替换，且没有氨基酸缺失或插入；
且其中：
iii)CDR3是这样的的氨基酸序列，其选自下列各项组成的组：
DREAQVDTLDFDY    [SEQ ID NO：26]
或选自由这样的氨基酸序列组成的组，所述氨基酸序列具有与以上氨基酸序列之一相比至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％，甚至更优选地至少99％的序列同一性(如本文所定义的)；其中
(1)任意氨基酸替换优选地是保守的氨基酸替换(如本文所定义的)；和/或
(2)所述氨基酸序列与以上氨基酸序列相比，优选地仅含有氨基酸替换，且没有氨基酸缺失或插入；
和/或选自由这样的氨基酸序列组成的组，所述氨基酸序列与以上氨基酸序列之一相比具有3个，2个或仅1个的“氨基酸的区别”(如本文所定义的)，其中：
(1)任意氨基酸替换优选地是保守的氨基酸替换(如本文所定义的)；和/或
(2)所述氨基酸序列与以上氨基酸序列相比，优选地仅含有氨基酸替换，且没有氨基酸缺失或插入；
或选自由序列各项组成的组：
GGSLSR      [SEQ ID NO：27]
RRTWHSEL    [SEQ ID NO：28]
GRSVSRS     [SEQ ID NO：29]
GRGSP       [SEQ ID NO：30]
和/或选自由这样的氨基酸序列组成的组，所述氨基酸序列与以上氨基酸序列之一相比具有3个，2个或仅1个的“氨基酸的区别”(如本文所定义的)，其中：
(1)任意氨基酸替换优选地是保守的氨基酸替换(如本文所定义的)；和/或
(2)所述氨基酸序列与以上氨基酸序列相比，优选地仅含有氨基酸替换，且没有氨基酸缺失或插入。
在另一个方面，本发明涉及针对人血清清蛋白的纳米抗体，其由4个构架区(分别地，FR1-FR4)和3个互补决定区(分别地，CDR1-CDR3)组成，其选自由这样的纳米抗体组成的组，所述纳米抗体分别具有下列CDR1，CDR2和CDR3组合之一：
-CDR1：SFGMS；CDR2：SISGSGSDTLYADSVKG；CDR3：GGSLSR；
-CDR1：LNLMG；CDR2：TITVGDSTNYADSVKG；CDR3：RRTWHSEL；
-CDR1：INLLG；CDR2：TITVGDSTSYADSVKG；CDR3：RRTWHSEL；
-CDR1：SFGMS；CDR2：SINGRGDDTRYADSVKG；CDR3：GRSVSRS；
-CDR1：SFGMS；CDR2：AISADSSDKRYADSVKG；CDR3：GRGSP；
-CDR1：SFGMS；CDR2：AISADSSDKRYADSVKG；CDR3：GRGSP；
-CDR1：NYWMY；CDR2：RISTGGGYSYYADSVKG；CDR3：DREAQVDTLDFDY.
在包括上述CDR组合的本发明纳米抗体中，每个CDR可以被选自由这样的氨基酸序列组成的组的CDR取代，所述氨基酸序列具有与所提及的CDR相比至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％，甚至更优选地至少99％的序列同一性(如本文所定义的)；其中
(1)任意氨基酸替换优选地是保守的氨基酸替换(如本文所定义的)；和/或
(2)所述氨基酸序列与以上氨基酸序列相比，优选地仅含有氨基酸替换，且没有氨基酸缺失或插入；
和/或选自由这样的氨基酸序列组成的组，所述氨基酸序列与以上氨基酸序列之一相比具有3个，2个或仅1个(如前述段落所示)的“氨基酸的区别”(如本文所定义的)，其中：
(1)任意氨基酸替换优选地是保守的氨基酸替换(如本文所定义的)；和/或
(2)所述氨基酸序列与以上氨基酸序列相比，优选地仅含有氨基酸替换，且没有氨基酸缺失或插入。
然而，本发明包括上述CDR组合的纳米抗体中，包括一个或更多个以上列出的CDR的纳米抗体是特别优选的；包括两个或更多个以上列出的CDR的纳米抗体是更特别优选的；且包括三个以上列出的CDR的纳米抗体是最特别优选的。
在这些针对人血清清蛋白的纳米抗体中，构架区FR1-FR4优选地如上文对本发明的纳米抗体所定义的。
下表A-9中列出了可以用于本发明多肽中的针对人血清清蛋白的纳米抗体的一些优选的但非限制性实例。ALB-8是ALB-1的人源化形式。
表A-9：清蛋白结合纳米抗体的优选但非限制性实例
  <名称，SEQ ID #；PRT(蛋白质)；->序列
  <PMP 6A6(ALB-1)，SEQ ID NO：32；PRT；->AVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKEPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLKPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTQVTVSS
  <ALB-8(humanized ALB-1)，SEQ ID NO：33；PRT；->EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS
  <PMP 6A8(ALB-2)，SEQ ID NO：34；PRT；->AVQLVESGGGLVQGGGSLRLACAASERIFDLNLMGWYRQGPGNERELVATCITVGDSTNYADSVKGRFTISMDYTKQTVYLHMNSLRPEDTGLYYCKIRRTWHSELWGQGTQVTVSS
通常，具有增长半衰期的本发明任何的衍生物和/或多肽(例如本发明PEG化的纳米抗体或多肽，分别针对EGFR或IGF-IR，和(人)血清清蛋白的多特异性纳米抗体，或融合于Fc部分的纳米抗体，全部如本文所述)具有这样的半衰期，所述半衰期是相应的本发明纳米抗体半衰期的至少1.5倍，优选地至少2倍，诸如至少5倍，例如至少10倍或超过20倍。
而且，具有增长半衰期的本发明任何的衍生物和/或多肽优选地具有这样的半衰期，所述半衰期超过1小时，优选地超过2小时，更优选地超过6小时，诸如超过12小时，和例如大约1天，2天，1周，2周或3周，且优选地不超过2个月，尽管后者可能是较不关键的。
通常可以将半衰期定义为在体内将所述多肽的血清浓度降低50％所需的时间，例如由于由天然机制引起的配体降解和/或配体清除或螯合。用于药物动力学分析和确定半衰期的方法为本领域那些技术人员所熟悉。详细资料可见于Kenneth，A等：药物的化学稳定性：药剂师手册(ChemicalStability of Pharmaceuticals：A Handbook for Pharmacists)和Peters等，药物动力学分析：实践方案(Pharmacokinete analysis：A Practical Approach)(1996)中。还参考文献“药物动力学”，M Gibaldi & D Perron，由Marcel Dekker出版，第二Rev.ex版本(1982)。
按照本发明的一个方面，所述多肽能够结合于一个或多个可以体内增长该多肽半衰期的分子。
在体内稳定本发明的多肽，且通过与抵抗降解和/或清除或螯合的分子的结合增长其半衰期。典型地，所述分子是天然存在的，本身在体内具有长半衰期的蛋白质。
本发明多特异性多肽的另一个优选的但非限制性的实例包括至少一种本发明的纳米抗体和至少一种指导本发明多肽朝向，和/或容许本发明多肽穿透或进入特定器官，组织，细胞或细胞的部分或区室，和/或容许纳米抗体穿透或穿过生物屏障，如细胞膜，细胞层诸如上皮细胞层，肿瘤包括实体瘤，或血脑屏障的纳米抗体。所述纳米抗体的实例包括指向特异性细胞表面蛋白，所需器官、组织或细胞的标记或表位(例如，与肿瘤细胞联合的细胞表面标记)，和WO 02/057445中所述的单结构域靶向脑的抗体片段的纳米抗体，其中FC44(SEQ ID NO 35)和FC5(SEQ ID NO：36)是优选的实例。
表A-10：FC44和FC5的序列列表
  <名称，SEQ ID #；PRT(蛋白质)；->序列
  <FC44，SEQ ID NO：35；PRT；->EVQLQASGGGLVQAGGSLRLSCSASVRTFSIYAMGWFRQAPGKEREFVAGINRSGDVTKYADFVKGRFSISRDNAKNMVYLQMNSLKPEDTALYYCAATWAYDTVGALTSGYNFWGQGTQVTVSS
  <FC5，SEQ ID NO：36；PRT；->EVQLQASGGGLVQAGGSLRLSCAASGFKITHYTMGWFRQAPGKEREFVSRITWGGDNTFYSNSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTADYYCAAGSTSTATPLRVDYWGKGTQVTVSS
在本发明的多肽中，所述一种或多种纳米抗体和所述一种或多种多肽可以彼此直接相连接(如例如WO 99/23221中所述)，和/或可以通过一个或多个合适的间隔区或连接体，或其任意组合彼此相连接。
对于在多价和多特异性多肽中的应用合适的间隔区或连接体对技术人员是清楚的，且通常可以是在本领域用于连续氨基酸序列的任何连接体或间隔区。优选地，所述连接体或间隔区适合用于构建为药物应用所预期的蛋白质或多肽。
一些特别优选的间隔区包括本领域中用于连接抗体片段或抗体结构域的间隔区和连接体。这些包括以上引用的一般背景技术中所提及的连接体，以及例如本领域中用于构建双抗体或ScFv片段的连接体(在该方面，然而，应该注意，尽管在双抗体和ScFv片段中，所使用的连接体序列应该具有容许相关VH和VL一起形成完整抗原结合位点的长度，柔性程度和其他特性，不存在对用于本发明多肽中的连接体长度或柔性的特别限制，其原因在于每个纳米抗体本身形成完整的抗原结合位点)。
例如，连接体可以是合适的氨基酸序列，且特别地1-50个氨基酸残基，优选地1-30个氨基酸残基，诸如1-10个氨基酸残基的氨基酸序列。所述氨基酸序列的一些优选的实例包括gly-ser连接体，例如类型(glyxsery)z，诸如(例如，(gly4ser)3或(gly3ser2)3，如WO 99/42077中所述，铰链样区域诸如天然存在的重链抗体的铰链区或相似序列(诸如WO 94/04678中所述)。
一些其他特别优选的连接体是聚丙氨酸(诸如AAA)，以及表A-11中所提及的连接体，其中AAA，GS-7和GS-9是特别优选的。
表A-11：连接体序列列表
  <名称，SEQ ID #；PRT(蛋白质)；->序列
  <GS30，SEQ ID NO：37；PRT；->GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
  <GS15，SEQ ID NO：38；PRT；->GGGGSGGGGSGGGGS
  <GS9，SEQ ID NO：39；PRT；->GGGGSGGGS
  <GS7，SEQ ID NO：40；PRT；->SGGSGGS
  <Llama upper long hinge region，SEQ ID NO：41；PRT；->EPKTPKPQPAAA
其他合适的连接体通常包括有机化合物或聚合体，特别是适合用于为了药物用途的蛋白质中的那些。例如，已将聚(乙二醇)部分用于连接抗体结构域，参见例如WO 04/081026。
包括在本发明的范围内的是所使用的连接体的长度，柔性程度和/或其他特性(尽管不是关键的，而其通常对于ScFv片段中所述的连接体是关键的)可以对本发明最终多肽的特性具有一些影响，包括但不仅限于分别对EGFR或IGF-IR，或针对一种或多种其他抗原的亲和力(affinity)，特异性或抗体亲抗原性(avidity)。基于本文的公开内容，技术人员能够确定在本发明特异性多肽中使用的最佳连接体，任选地在一些有限常规试验后。
例如，在包括针对多聚体抗原(如多聚体受体或其他蛋白质)的纳米抗体的本发明多价多肽中，连接体的长度和柔性优选地使其容许所述多肽中存在的每个本发明纳米抗体与多聚体的每个亚单位上的抗原决定簇结合。类似地，在包括针对相同抗原上的两个或更多个不同抗原决定簇(例如针对抗原的不同表位和/或针对多聚体受体、通道或蛋白质的不同亚单位)纳米抗体的本发明多特异性多肽中，连接体的长度和柔性优选地使其容许每个纳米抗体与其预期的抗原决定簇相结合。同样地，基于本文的公开内容，技术人员能够确定在本发明特异性多肽中使用的最佳连接体，任选地在一些有限的常规试验后。
还属于本发明范围的是，所使用的连接体赋予本发明多肽一种或多种其他的有利特性或功能性，和/或提供一个或多个用于衍生物形成和/或用于功能团附加的位点(例如，如本文对本发明纳米抗体衍生物所描述地)。例如，含有一个或多个带电的氨基酸残基(参见上表A-2)的连接体可以提供改良的亲水特性，而形成或含有小表位或标记物的连接体可以用于检测，识别和/或纯化的目的。同样地，基于本文的公开内容，技术人员能够确定在本发明特异性多肽中使用的最佳连接体，任选地在一些有限的常规试验后。
最后，当在本发明多肽中使用两个或更多连接体时，这些连接体可以是相同的或不同的。同样地，基于本文的公开内容，技术人员能够确定在本发明特异性多肽中使用的最佳连接体，任选地在一些有限的常规试验后。
通常，为了简化表达和生产，本发明的多肽是线性多肽。然而，本发明在其最广泛的含义下不受此限制。例如，当本发明的多肽包括三个或更多纳米抗体时，有可能通过使用具有三个或更多个“臂”的连接体来连接它们，其中每个“臂”连接于纳米抗体，从而提供“星形”构建体。尽管通常是较不优选的，但是还有可能使用圆形构建体。
本发明还包括本发明多肽的衍生物，其可以与本发明纳米抗体的衍生物基本类似，即如本文所述。
本发明还包括“基本由”本发明的多肽“组成”的蛋白质或多肽(其中，词语“基本由------组成”具有与上文所指出的相同的含义)。
按照本发明的一个实施方案，本发明的多肽处于基本分离的形式，如本文所定义。
如从本发明进一步的叙述对技术人员清楚地，本发明的纳米抗体、多肽和核酸可以通过本身已知的方式制备。例如，本发明的纳米抗体和多肽可以通过用于制备抗体和特别地用于制备抗体片段(包括但不仅限于(单)结构域抗体和ScFv片段)的任意本身已知的方式制备。一些用于制备纳米抗体、多肽和核酸的优选的但非限制性方法包括本文所述的方法和技术。
如对技术人员清楚地，一种用于制备本发明纳米抗体和/或多肽的特别有用的方法通常包括下列步骤：
-表达，在合适的宿主细胞或宿主生物体(本文中也称为“本发明的宿主”)中，或在另一种合适的核酸表达系统中，所述核酸编码本发明纳米抗体或多肽(本文中也称为“本发明的核酸”)，任选地，随后：
-分离和/或纯化由此获得的本发明的纳米抗体或多肽。
特别地，所述方法可以包括下列步骤：
-将本发明的宿主培养和/或保持在这样的条件下，该条件使所述本发明的宿主表达和/或产生至少一种本发明的纳米抗体和/或多肽；任选地，随后：
-分离和/或纯化由此获得的本发明的纳米抗体或多肽。
本发明的核酸可以处于单或双链DNA或RNA形式，且优选地处于双链DNA形式。例如，本发明的核苷酸序列可以是基因组DNA，cDNA或合成的DNA(如具有这样的密码子用法的DNA，所述密码子用法已经明确地适合于预期的宿主细胞或宿主生物体中的表达)。
按照本发明的一个实施方案，本发明的核酸处于基本分离的形式，如本文所定义。
本发明的核酸还可以处于载体的形式，存在于载体中和/或是载体的一部分，载体诸如例如质粒，黏粒或YAC，其也处于基本分离的形式。
基于本文所给出的本发明多肽的氨基酸序列的信息，可以以本身已知的方式制备或获得本发明的核酸，和/或可以从合适的天然来源分离本发明的核酸。为了提供类似物，可以对编码天然存在的VHH结构域的核苷酸序列例如进行定点诱变，从而提供编码所述类似物的本发明核酸。而且，如对技术人员清楚地，为了制备本发明的核酸，还有若干核苷酸序列，诸如至少一种编码纳米抗体的核苷酸序列和例如编码一种或多种连接体的核酸可以以合适的方式连接在一起。
用于产生本发明核酸的技术对技术人员是清楚的，且可以例如包括，但不仅限于，DNA自动合成；定点诱变；组合两个或更多天然存在的和/或合成的序列(或其两个或更多部分)，引入导致剪截表达产物表达的突变；引入一个或多个限制性位点(例如，为了创建可以利用合适的限制性酶被容易地消化和/或连接的盒和/或区域)，和/或引入通过利用一种或多种“错配的”引物，利用例如天然存在的GPCR序列作为模板的PCR反应方式产生的突变。这些和其他技术对技术人员是清楚的，可同样地参考文献标准手册，诸如以上所提及的Sambrook等和Ausubel等，以及一些实施例。
本发明的核酸还可以处于遗传构建体的形式，存在于遗传构建体中和/或是遗传构建体的一部分，如对本领域技术人员清楚地。所述遗传构建体通常包括至少一种本发明的核酸，其任选地连接于一个或多个本身已知的遗传构建体元件，诸如例如一个或多个合适的调节元件(诸如合适的启动子，增强子，终止子，等)和本文所提到的遗传构建体另外的元件。所述包括至少一个本发明核酸的遗传构建体在本文中还称为“本发明的遗传构建体”。
本发明的遗传构建体可以是DNA或RNA，且优选地是双链DNA。本发明的遗传构建体还可以处于适合于预期宿主细胞或宿主生物体的转化的形式，处于适合于整合进入所预期的宿主细胞的基因组DNA的形式，或处于适合于所预期的宿主生物体中的独立复制，维持和/或遗传的形式。例如，本发明的遗传构建体可以处于载体的形式，诸如例如质粒，黏粒，YAC，病毒载体或转座子。特别地，所述载体可以是表达载体，即可以在体外和/或体内(例如，在合适的宿主细胞，宿主生物体和/或表达系统中)提供表达的载体。
在优选的但非限制性实施方案中，本发明的遗传构建体包括
a)至少一种本发明的核酸；可操作地连接于
b)一个或多个调节元件，诸如启动子和任选地合适的终止子；
和任选地还有
c)本身已知的遗传构建体的一个或多个另外的元件；
其中术语“调节元件”，“启动子”，“终止子”和“可操作地连接”具有它们在本领域中的普遍含义(如本文进一步所述)；且其中所述存在于遗传构建体中的“另外的元件”可以例如是3’-或5’-UTR序列，前导序列，选择标记，表达标记/报告基因，和/或可以促进或增加转化或整合(的效率)的元件。这些和其他对所述遗传构建体合适的元件对技术人员是清楚的，且可以例如依赖于所使用的构建体的类型，所预期的宿主细胞或宿主生物体；感兴趣的本发明核苷酸序列表达的方式(例如，通过组成型，瞬时或可诱导的表达)；和/或待用的转化技术。例如，可以以基本类似的方式使用本身已知的用于表达和产生抗体和抗体片段(包括但不仅限于(单)结构域抗体和ScFv片段)的调节序列，启动子和终止子。
优选地，在本发明的遗传构建体中，所述至少一种本发明的核酸和所述调节元件，和任选地所述一个或多个另外的元件，彼此“可操作地连接”，由此通常意指它们与彼此处于功能关系中。例如，如果启动子能够起始或否则控制/调节编码序列的转录和/或表达，则所述启动子被认为是“可操作地连接于”编码序列(其中应该将所述编码序列理解为在所述启动子的“控制下”)。通常，当两个核苷酸序列可操作地连接时，它们处于相同的方向，且通常也处于相同的阅读框中。它们通常还是基本邻近的(contiguous)，尽管这也可以是不需要的。
优选地，本发明遗传构建体的调节和另外的元件使其能够在预期的宿主细胞或宿主生物体中提供它们预期的生物功能。
例如，启动子，增强子或终止子在预期的宿主细胞或宿主生物体中应该是“可操作的”，由此意指(例如)所述启动子应该能够起始或否则控制/调节其可操作地相连的(如本文所定义)核苷酸序列-例如编码序列-的转录和/或表达。
一些特别优选的启动子包括，但不仅限于，本身已知用于本文所提及的宿主细胞中的表达的启动子；和特别地用于细菌细胞中表达的启动子，如本文所提及的那些和/或实施例中所使用的那些。
选择标记应该使其容许-即，在适当的选择条件下-将已被本发明核苷酸序列(成功)转化了的宿主细胞和/或宿主生物体区别于未被(成功)转化的宿主细胞/生物体。所述标记的一些优选的但非限制性实例是提供针对抗生素(如卡那霉素和安匹西林)抗性的基因，提供温度抗性的基因，或容许在培养基中缺乏某些因子，化合物和/或(食物)成分的条件下维持宿主细胞或宿主生物体的基因，所述培养基对于非转化的细胞或生物体的生存是基本的。
前导序列应该-在预期的宿主细胞或宿主生物体中-使其容许所需的翻译后修饰和/或使其向细胞的所需部分或细胞器官指引转录的mRNA。前导序列还可以容许表达产物从所述细胞中的分泌。同样地，所述前导序列可以是在宿主细胞或宿主生物体中可操作的任何前、原或前…原序列。在细菌细胞中的表达可以不需要前导序列。例如，可以以基本类似的方式使用本身已知用于表达和产生抗体和抗体片段(包括但不仅限于单结构域抗体和ScFv片段)的前导序列。
表达标记或报告基因应该-在宿主细胞或宿主生物体中-使其容许检测遗传构建体(上存在的基因或核苷酸序列)的表达。表达标记还可以任选地容许表达产物的定位，例如在细胞的特定部分或细胞器官中和/或在特定细胞，组织，器官或多细胞生物体的一部分中。所述报道基因还可以作为与本发明氨基酸序列的蛋白质融合进行表达。一些优选的但非限制性实例包括荧光蛋白，如GFP。
合适启动子，终止子和另外的元件的一些优选的但非限制性实例包括可以用在本文所提及的宿主细胞中表达的那些；和特别地适合于表达细菌细胞的那些，诸如本文所提及的那些和/或在以下实施例中所使用的那些。对于启动子，选择标记，前导序列，表达标记和可以存在于/用于本发明遗传构建体另外的元件-诸如终止子，转录和/或翻译增强子和/或整合因子-的一些(另外的)非限制性实例，参考一般的手册，诸如以上提及的Sambrook等和Ausubel等，以及WO 95/07463，WO 96/23810，WO 95/07463，WO 95/21191，WO 97/11094，WO 97/42320，WO 98/06737，WO 98/21355，US-A-6,207,410，US-A-5,693,492和EP 1085089中所给出的实例。其他实例对技术人员是清楚的。也参考以上所引用一般的背景技术和本文所引用的其他参考文献。
本发明的遗传构建体通常可以通过适当地连接本发明的核苷酸序列和一个或多个上文所述的另外的元件而提供，例如利用以上所提及的一般手册，诸如Sambrook等和Ausubel等中所述的技术。
通常，本发明的遗传构建体通过将本发明的核苷酸序列插入到本身已知的合适(表达)载体中而获得。合适的表达载体的一些优选的但非限制性实例是以下实施例中所使用的那些，以及本文所提及的那些。
本发明的核酸和/或本发明的遗传构建体可以用于转化宿主细胞或宿主生物体，即从而表达和/或产生本发明的纳米抗体或多肽。合适的宿主或宿主细胞的技术人员是清楚的，且可以例如是任何合适的真菌，原核或真核细胞或细胞系或任何合适的真菌，原核或真核生物体，例如：
-细菌菌株，包括但不仅限于革兰氏阴性菌株，诸如大肠杆菌(Escherichia coli)菌株；变形菌属(Proteus)菌株，例如奇异变形菌(Proteus mirabilis)菌株；假单胞菌属(Pseudomonas)菌株，例如荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)菌株；和革兰氏阳性菌株，诸如杆菌属(Bacillus)菌株，例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株或短芽孢杆菌(Bacillus brevis)菌株；链酶菌属(Streptomyces)菌株，例如浅青紫链酶菌(Streptomyces lividans)菌株；葡萄球菌属(Staphylococcus)菌株，例如肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)菌株；和乳球菌属(Lactococcus)菌株，例如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)菌株；
-真菌细胞，包括但不仅限于来自下列物种的细胞：木霉属(Trichoderma)，例如来自里氏木霉(Trichoderma reesei)；脉孢菌属(Neurospora)，例如来自粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；粪壳属(Sordaria)，例如来自大孢粪壳(Sordaria macrospora)；曲霉属(Aspergillus)，；例如来自黑曲霉(Aspergillus niger)或来自酱油曲霉(Aspergillus sojae)；或来自其他丝状真菌；
-酵母细胞，包括但不仅限于来自下列物种的细胞：酵母属(Saccharomyces)，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)，例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；毕赤酵母属(Pichia)，例如毕赤巴斯德酵母(Pichia pastoris)菌株或甲醇毕赤酵母(Pichiamethanolica)菌株；汉逊酵母属(Hansenula)，例如多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)菌株；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)，例如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)；Arxula菌株，例如Arxula adeninivorans；Yarrowia，例如Yarrowia lipolytica；
-两栖动物细胞或细胞系，如爪蟾卵母细胞(Xenopus oocytes)；
-昆虫来源的细胞或细胞系，如衍生自鳞翅目的细胞/细胞系，包括但不仅限于贪夜蛾(Spodoptera)SF9和Sf21的细胞/细胞系，衍生自果蝇(Drosophila)的细胞/细胞系，诸如Schneider和Kc细胞；
-植物或植物细胞，例如在烟草植物中；和/或
-哺乳动物细胞或细胞系，例如衍生自人，衍生自哺乳动物的起源细胞或细胞系，其包括但不仅限于CHO-细胞，BHK-细胞(例如BHK-21细胞)和人细胞或细胞系诸如HeLa，COS(例如COS-7)和PER.C6细胞；
以及其他本身已知用于表达和产生抗体和抗体片段(包括但不仅限于(单)结构域抗体和ScFv片段)的宿主或宿主细胞，其对技术人员是清楚的。还参考上文所引用的一般背景技术，以及例如WO 94/29457；WO96/34103；WO 99/42077；Frenken等，(1998)，见上；Riechmann和Muyldermans，(1999)，见上；van der Linden，(2000)，见上；Thomassen等，(2002)，见上；Joosten等，(2003)，见上；Joosten等，(2005)，见上；和本文所引用的其他参考文献。
还可以将本发明的纳米抗体和多肽引入和表达于多细胞生物体的一种或多种细胞，组织或器官中，例如为了预防和/或治疗的目的(例如，作为基因疗法)。为了该目的，可以以任意合适的方法将本发明的核苷酸序列引入到细胞或组织中，例如同样地(例如，利用脂质体)或在将它们插入到合适的基因治疗载体(例如衍生自反转录病毒诸如腺病毒，或细小病毒诸如腺相关病毒)中后。如也对技术人员清楚地，可以通过向患者或向患者的特定细胞或特定组织或器官施用本发明的核酸或编码本发明核酸的合适基因治疗载体，在患者的身体中，体内和/或原位地进行所述基因治疗；或可以用本发明的核苷酸序列体外处理合适的细胞(通常取自待治疗患者体内，如移植的淋巴细胞，骨髓吸出物或活组织切片)，并然后将其恰当地(再)引入到患者体内。所有这些可以利用技术人员熟知的基因治疗载体，技术和递送系统实现，参见Culver，K.W.，“基因疗法”(″Gene Therapy″)，1994，p.xii，Mary Ann Liebert，Inc.，Publishers，纽约，NY).Giordano，自然F医学(Nature F Medicine)2(1996)，534-539；Schaper，Circ.Res.79(1996)，911-919；Anderson，科学(Science)256(1992)，808-813；Verma，自然(Nature)389(1994)，239；Isner，Lancet 348(1996)，370-374；Muhlhauser，Circ.Res.77(1995)，1077-1086；Onodera，血液(Blood)91；(1998)，30-36；Verma，基因疗法(Gene Ther.)5(1998)，692-699；Nabel，纽约科学院年报(Ann.N.Y.Acad.Sci.)：811(1997)，289-292；Verzeletti，人类基因疗法(Hum.GeneTher.)9(1998)，2243-51；Wang，自然医学(Nature Medicine)2(1996)，714-716；WO 94/29469；WO 97/00957，US 5,580,859；1 US 5,5895466；或Schaper，当前生物工程观点(Current Opinion in Biotechnology)7(1996)，635-640。例如，本领域已经描述了ScFv片段(Afanasieva等，基因疗法(GeneTher.)，10，1850-1859(2003))和双抗体(Blanco等，免疫学杂志(J.Immunol)，171，1070-1077(2003))的原位表达。
为了细胞中纳米抗体的表达，还可以将它们表达为所谓的“胞内抗体”，如例如WO 94/02610，WO 95/22618和US-A-6004940；WO 03/014960中；Cattaneo，A.& Biocca，S.(1997)细胞间的抗体：发展和应用。(IntracellularAntibodies：Development and Applications.)Landes and Springer-Verlag中；和Kontermann，方法(Methods)34，(2004)，163-170中所述。
为了生产，本发明的纳米抗体和多肽还可以例如在转基因哺乳动物的乳汁中产生，例如在兔、母牛、山羊或绵羊的乳汁中(关于用于向哺乳动物中引入转基因的一般技术，参见例如US-A-5,741,957，US-A-5,304,489和US-A-5,849,992)，在植物或植物的部分，其包括但不仅限于它们的叶子，花，果实，种子，根或块茎(例如，在烟草，玉米，大豆或紫花苜蓿中)中产生或例如蚕Bombix mori的蛹中产生。
此外，还可以在无细胞表达系统中表达和/或产生本发明的纳米抗体和多肽，且所述系统的合适实例对技术人员是清楚的，一些优选的但非限制性实例包括麦芽系统中；兔网织红细胞裂解物中；或大肠杆菌Zubay系统中的表达。
如上所述，使用纳米抗体的一个优势是可以通过在合适细菌系统中的表达制备基于其上的多肽，且合适的细菌表达系统，载体，宿主细胞，调节元件等对技术人员是清楚的，例如来自以上所引用的参考文献。然而应该注意本发明在其最广泛的含义下不受细菌系统中表达的限制。
优选地，在本发明中，使用(体内或体外)表达系统，诸如细菌表达系统，其提供处于适合于药物用途的形式中的本发明多肽，并且所述表达系统也对技术人员是清楚的。也作为对技术人员清楚地，可以利用用于肽合成的技术来制备适合于药物用途的本发明多肽。
为了进行工业规模的生产，对(工业)生产纳米抗体或含纳米抗体的蛋白质治疗物的优选异源宿主包括适合于大规模表达/生产/发酵，且特别是大规模药物表达/生产/发酵的大肠杆菌，毕赤巴斯德酵母，酿酒酵母菌株。所述菌株合适的实例对技术人员是清楚的。所述菌株和生产/表达系统也是可以从公司，如Biovitrum(乌普萨拉(Uppsala)，瑞典)获得的。
备选地，哺乳动物细胞系，特别是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，可以用于大规模表达/生产/发酵，且特别是用于大规模药物表达/生产/发酵。同样地，所述表达/生产系统也可以从上述一些公司获得。
特定表达系统的选择部分依赖于对于一定的翻译后修饰，更具体地对于糖基化的要求。需要或要求糖基化的含纳米抗体的重组蛋白的生产使得哺乳动物表达宿主的使用成为必需，该宿主具有糖基化表达的蛋白质的能力。在这个方面，对于技术人员而言清楚的是，所获得的糖基化模式(即所附加残基的类型，数量和位置)依赖于用于表达的细胞或细胞系。优选地，使用了人细胞或细胞系(即引起基本具有人糖基化模式的蛋白质)，或使用了另一种哺乳动物细胞系，所述哺乳动物细胞系可以提供基本和/或功能上与人糖基化相同或至少模拟人糖基化的糖基化模式。通常，原核宿主，如大肠杆菌不具有糖基化蛋白质的能力，且较低级真核细胞，如酵母的应用通常引起与人糖基化不同的糖基化模式。然而，应该理解依赖于所需的待获得纳米抗体或蛋白，所有上述宿主细胞和表达系统都可以用在本发明中。
因此，按照本发明的一个非限制性实施方案，本发明的纳米抗体或多肽是糖基化的。按照本发明另一个非限制性的实施方案，本发明的纳米抗体或多肽是非糖基化的。
按照本发明的一个优选的但非限制性实施方案，本发明的纳米抗体或多肽产生于细菌细胞中，特别是适用于大规模药物生产的细菌细胞中，诸如上述菌株的细胞。
按照本发明的另一个优选的但非限制性实施方案，本发明的纳米抗体或多肽产生于酵母细胞中，特别是适用于大规模药物生产的酵母细胞中，诸如上述物种的细胞。
按照本发明的再一个优选的但非限制性实施方案，本发明的纳米抗体或多肽产生于哺乳动物细胞中，特别地在人细胞或在人细胞系的细胞中，且更特别地，在适用于大规模药物生产的人细胞或人细胞系的细胞中，诸如上文所提及的细胞系。
当宿主细胞中的表达用于产生本发明的纳米抗体和蛋白质时，本发明的纳米抗体和蛋白质可在细胞内(例如，细胞溶胶中，在周质中或内含体中)产生，并然后从宿主细胞中分离，以及任选地进行进一步的纯化；或者可以在细胞外(例如，培养宿主细胞的培养基中)产生，并然后从培养基中分离，以及任选地进行进一步的纯化。当使用真核宿主细胞时，细胞外的生产通常是优选的，其原因在于其相当促进所获得的纳米抗体和蛋白质的进一步分离和下游处理。细菌细胞，诸如上述的大肠杆菌菌株，通常不在细胞外分泌蛋白质，除很少种类的蛋白质，诸如毒素和溶血素外，且大肠杆菌中的分泌产物指引蛋白质穿过内膜向周质空间的迁移。周质生产提供若干超越细胞溶胶生产的优势。例如，分泌产物的N末端氨基酸序列可以相同于由特异性信号肽酶所引起的分泌信号序列分裂后的天然基因产物。而且，周质中似乎存在比胞质中低得多的蛋白酶活性。另外，由于周质中较少的污染蛋白，蛋白质纯化更加简单。另一个优势是由于周质比胞质提供更加氧化的环境，所以可以形成正确的二硫键。大肠杆菌中蛋白质的过表达通常存在于不可溶的聚集，即所谓的内含体中。这些内含体可以位于细胞溶胶中或位于周质中；生物活性蛋白从这些内含体中的回收需要变性/重新折叠过程。从内含体回收了许多重组蛋白，包括治疗蛋白。备选地，如对技术人员清楚地，可以使用已被遗传修饰从而分泌所需蛋白质的细菌的重组菌株，和特别地本发明的纳米抗体或多肽。
因此，按照本发明的一个非限制性实施方案，本发明的纳米抗体或多肽是这样的纳米抗体或多肽，其在细胞内产生，并从宿主细胞，和特别地从细菌细胞或从细菌细胞中的内含体中分离而来。按照本发明的另一个非限制性实施方案，本发明的纳米抗体或多肽是这样的纳米抗体或多肽，其在细胞外产生，并从培养宿主细胞的培养基中分离而来。
与这些宿主细胞一起使用的一些优选的非限制性启动子包括，
-用于大肠杆菌中的表达：lac启动子(及其衍生物，如lacUV5启动子)；阿拉伯糖启动子；噬菌体λ的左-(PL)和右侧(PR)启动子；trp操纵子的启动子；杂交lac/trp启动子(tac和trc)；T-7启动子(更具体地T7-噬菌体基因10的启动子)以及其他T-噬菌体启动子；Tn10四环素抗性基因的启动子；以上启动子改造的变体，所述变体包括外来调节操纵基因序列的一个或多个拷贝；
-用于酿酒酵母中的表达：组成型：ADH1(醇脱氢酶1)，ENO(烯醇酶)，CYC1(细胞色素ciso-1)，GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)；PGK1(磷酸甘油酸激酶)，PYK1(丙酮酸激酶)；调节的：GAL1，10，7(半乳糖代谢酶)，ADH2(醇脱氢酶2)，PHO5(酸性磷酸酶)，CUP1(铜金属硫蛋白)；异源的：CaMV(花椰菜花叶病毒35S启动子)；
-用于毕赤巴斯德酵母的表达：AOX1启动子(醇氧化酶I)
-用于哺乳动物细胞中的表达：人巨细胞病毒(hCMV)即早期增强子/启动子；人巨细胞病毒(hCMV)即早期启动子变体，其含有两个四环素操纵基因序列从而使所述启动子可以受到Tet阻抑物的调节；单纯疱疹病毒胸苷激酶(TK)启动子；劳斯肉瘤病毒长末端重复序列(RSV LTR)增强子/启动子；来自人、黑猩猩、小鼠或大鼠的延伸因子1α(hEF-1α)启动子；SV40早期启动子；HIV-1长末端重复序列启动子；β-肌动蛋白启动子；
与这些宿主细胞一起使用的一些优选的但非限制性载体包括：
-用于哺乳动物细胞中表达的载体：pMAMneo(Clontech)，pcDNA3(Invitrogen)，pMC1neo(Stratagene)，pSG5(Stratagene)，EBO-pSV2-neo(ATCC 37593)，pBPV-1(8-2)(ATCC 37110)，pdBPV-MMTneo(342-12)(ATCC 37224)，pRSVgpt(ATCC 37199)，pRSVneo(ATCC37198)，pSV2-dhfr(ATCC 37146)，pUCTag(ATCC 37460)和1ZD35(ATCC 37565)，以及基于病毒的表达系统，如基于腺病毒的那些；
-用于在细菌细胞中表达的载体：pET载体(Novagen)和pQE载体(Qiagen)；
-用于在酵母或其他真菌细胞中表达的载体：pYES2(Invitrogen)和毕赤酵母表达载体(Invitrogen)；
-用于在昆虫细胞中表达的载体：pBlueBacII(Invitrogen)和其他杆状病毒载体
-用于在植物或植物细胞中表达的载体：例如基于花椰菜花叶病毒或烟草花叶病毒的载体，合适的土壤杆菌(Agrobacterium)菌株，或基于Ti质粒的载体。
与这些宿主细胞一起使用的一些优选的但非限制性分泌序列包括：
-用于细菌细胞，如大肠杆菌中：PelB，Bla，OmpA，OmpC，OmpF，OmpT，StII，PhoA，PhoE，MalE，Lpp，LamB，等；TAT信号肽，溶血素C-末端分泌信号
-用于酵母中：前α-杂交因子序列原(α-mating factorprepro-sequence)，磷酸酶(phol)，转化酶(Suc)，等；
-用于哺乳动物中：固有信号，如果靶蛋白是真核来源的；鼠科Igκ-链V-J2-C信号肽；等。
适合用于转化本发明宿主或宿主细胞的方法对技术人员是清楚的，且依赖于预期的宿主细胞/宿主生物体以及所使用的遗传构建体。同样地，参考上文提及的手册和专利申请。
转化后，实施用于探测和选择被本发明核苷酸序列/遗传构建体所成功地转化的那些宿主细胞或宿主生物体的步骤。这可以是例如基于本发明遗传构建体中存在的可选择的标记的选择步骤或涉及本发明氨基酸序列探测的步骤，例如，利用特异性抗体。
转化的宿主细胞(其可以处于稳定细胞系的形式)或宿主生物体(其可以处于稳定突变品系或菌株形式)形成本发明的进一步的方面。
优选地，这些宿主细胞或宿主生物体是表达或(至少)能够表达(例如，在适当的条件下)本发明的氨基酸序列(且在宿主生物体的情形中：在其至少一个细胞，部分，组织或器官中)的那些。本发明还包括本发明宿主细胞或宿主生物体的更远后代(further generations)，后裔和/或子孙，它们可以是例如通过细胞分裂或通过有性或无性生殖而获得的。
为了产生/获得本发明氨基酸序列的表达，通常可以将转化的宿主细胞或转化的宿主生物体保持，维持和/或培养在表达/产生(所需的)本发明氨基酸序列的条件下。适合的条件对技术人员是清楚的，且通常依赖于所使用的宿主细胞/宿主生物体，以及依赖于控制本发明(相关)核苷酸序列表达的调节元件。同样地，参考以上关于本发明遗传构建体的段落中提及的手册和专利申请。
通常，适合的条件可以包括合适的培养基的使用，合适的食物源和/或合适的营养的存在，合适的温度的使用，以及任选地合适的诱导因子或化合物的存在(例如，当本发明的核苷酸序列在可诱导启动子的控制下)；其中全部可由技术人员选择。同样地，在该条件下，可以以组成的方式，瞬时的方式或仅当被适当地诱导时表达本发明的氨基酸序列。
还对技术人员清楚的是本发明的氨基酸序列可以(首先)以不成熟的形式生成(如上所述)，随后依赖于所使用的宿主细胞/宿主生物体，可以对其进行翻译后的修饰。而且，同样地，依赖于所使用的宿主细胞/宿主生物体，可以糖基化本发明的氨基酸序列。
然后，利用本身已知的蛋白质分离和/或纯化技术，诸如(制备性)层析法和/或电泳技术，差沉淀技术，亲和力技术(例如，利用与本发明氨基酸序列融合的特异性可裂解氨基酸序列)和/或制备性免疫学技术(即，利用针对待分离氨基酸序列的抗体)可以从宿主细胞/宿主生物体和/或从培养所述宿主细胞或宿主生物体的培养基中分离本发明的氨基酸序列。
通常，为了药用，可以将本发明的多肽配制为药物制剂，其包括至少一种本发明的多肽和至少一种药用载体，稀释剂或赋形剂和/或佐剂，以及任选地一种或多种另外的药物活性多肽和/或化合物。通过非限制性实例，该制剂可以处于适合于口服施药，肠胃外施药(诸如通过静脉内，肌肉内或皮下注射或静脉内灌输)，局部施药，通过吸入、皮肤贴、移植、栓剂等施药的形式。所述合适的施药形式——其依赖于施药的方式，可以是固体的，半固体的或液体的——及其制备中使用的方法和载体对技术人员是清楚的，且在本文中有进一步的描述。
由此，在进一步的方面，本发明涉及这样的药物组合物，其包括至少一种本发明的纳米抗体或至少一种本发明的多肽和至少一种合适的载体，稀释剂或赋形剂(即，适合于药用)，以及任选地一种或多种另外的活性物种。
通常，可以以任意本身已知的合适方式来配制和施用本发明的纳米抗体和多肽，为此参考例如以上所引用的一般背景技术(且具体地，WO04/041862，WO 04/041863，WO 04/041865和WO 04/041867)，以及标准手册，诸如雷明顿制药科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences)，第18版，默克出版公司(Mack Publishing Company)，美国(1990)或雷明顿，制药业的科学与实践(Remington，the Science and Practice of Pharmacy)，第21版，Lippincott Williams and Wilkins(2005)。
例如，可以以任何本身已知的用于常规抗体和抗体片段(包括ScFv’s和双抗体)以及其他药物活性蛋白质的方式配制和施用本发明的纳米抗体和多肽。所述制剂及其制备方法对技术人员是清楚的，且例如包括适合于肠胃外施药(例如静脉内，腹膜内，皮下，肌肉内，腔内，动脉内或鞘内施药)或局部(即，经皮或皮内)制药的制剂。
用于肠胃外施药的制剂可以例如是适合于灌输或注射的无菌溶液、混悬液、分散剂或乳剂。适合于所述制剂的载体或稀释剂例如不受限制地包括，无菌水和水性缓冲剂和溶液诸如生理磷酸盐缓冲液，林格溶液(Ringer′ssolutions)，葡萄糖溶液，和Hank′s溶液；水油；甘油；乙醇；二醇诸如丙二醇以及矿物油，动物油和植物油，例如花生油，大豆油，及其合适的混合物。通常，水性溶液或混悬液是优选的。
本发明进一步涉及本文所述的纳米抗体，多肽和组合物在癌症诊断，治疗或预防中的用途。本发明提供针对肿瘤特异性或肿瘤相关抗原，如EGFR(EGFR)和胰岛素生长因子受体(IGF-IR)的单结构域抗体，更准确地纳米抗体。本发明进一步涉及它们在诊断和治疗中的用途。所述抗体可以具有高度同源于人构架序列的构架序列。组合物包括单独针对IGF-IR和EGFR或处于与其他所述药物组合中的抗体。
EGFR是ERBB受体家族的一部分，该家族具有四个紧密相关的成员：EGFR(ErbB-1)，HER2(ErbB-2或Neu)，HER3(ErbB-3)和HER4(ErbB-4)。这些成员中的每一个由细胞外配体结合结构域，跨膜结构域和细胞内酪氨酸激酶结构域组成(Yarden等，2001，分子细胞生物学自然综述(Nature Rev.Mol.Cell Biol.)2，127-137)。
表皮细胞中促有丝分裂刺激的第一步是配体诸如表皮生长因子(EGF)或转化生长因子α(TGFα)与已知为EGFR(EGF受体)的膜糖蛋白的特异性结合。(Carpenter等，1979，表皮生长因子(Epidermal Growth Factor)，生物化学年刊(Annual Review Biochem.)，卷48，193-216)。成熟的EGF受体包括1186个氨基酸组成，所述EGF可以分为621个残基的细胞外部分和542个残基的细胞质部分，其通过23个残基的单一疏水跨膜片段相连。(Ullrich等，1986，自然(Nature)，卷309，418-425)。
可以将EGF受体的外部部分再分为4个结构域。已经证明了与两个富含半胱氨酸的结构域相邻接的结构域I和III可能含有受体的EGF结合位点。(Ogiso等，2002.人表皮生长因子和受体细胞结构域复合物的晶体结构(Crystal structure of the complex of human epidermal growth factor andreceptor extracellular domains).细胞(Cell)110，775-787；Garrett等，2002.结合于转化生长因子α剪截EGFR细胞外结构域的晶体结构(Crystalstructure of a truncated EGFR extracellular domain bound to transforminggrowth factor α).细胞(Cell)110，763-773.)。在无配体与受体结合的条件下，分子内结构域II-结构域IV的相互作用将受体维持于无活性的束缚状态(Ferguson KM，Berger MB，Mendrola JM，Cho HS，Leahy DJ，Lemmon MA2003.EGF通过除去自身抑制胞外域二聚作用的相互作用来激活其受体(EGF activates its receptor by removing interactions that autoinhibitectodomain dimerization).分子细胞(Mol.Cell.)11：507-17)。
作为与EGFR的结构域I和III结合的单价配体的结果，结构域II变为暴露的，且使邻近受体的结构域II的分子间接触导致受体的二聚作用。该受体的二聚状态对于激活细胞质结构域中的酪氨酸激酶是必需的。这导致细胞内结构域中酪氨酸残基的转磷酸作用和引起DNA合成及最终引起细胞增殖和分化的信号转导级联。EGFR的活化起始一连串事件的级联，所述事件导致将大量衔接蛋白质装配为已知作为包被网格蛋白的小窝(pit)的结构，其在质膜内陷和出芽后，引起小泡，该小泡被称为包被了网格蛋白的小泡(CCV)。
随后，将活化的受体分类为用于蛋白水解降解的内体和最终的溶酶体，其导致受体的下调或螯合(Vieira AV，Lamaze C，Schmid SL，1996.网格蛋白介导的细胞内吞作用所引起的对EGF受体信号的控制(Control of EGFreceptor signaling by clathrin-mediated endocytosis).科学(Science)274：2086-2089)。在正常细胞中，该反馈机制控制异常受体信号。
肿瘤生长和发育中涉及的过程，包括肿瘤细胞增殖，血管发生，转移，细胞程序化死亡的抑制和对放射性或化学疗法的抗性中，暗示了EGFR的异常活化(Grünwald V，Hidalgo M 2003.用于癌症治疗的EGFR发育抑制剂(Developing inhibitors of the EGFR for cancer treatment).国家癌症学院杂志(J.Natl.Cancer Inst.)95：851-867.；和本文中的参考文献)。EGF受体信号转导的调节异常是下列现象的结果：i)配体或受体过表达(例如基因复制后)或ii)通过形成异源二聚体或EGFR突变形式如EGFRvIII而引起的组成型受体信号转导。作为异源二聚体的实例，EGFR-HER2的特点在于与EGFR同源二聚体相比更持续的信号转导活性(Arteaga CL 2001.EGFR：从非人癌症的致癌基因到人瘤形成中的治疗靶标(The EGFR：from mutantoncogene in nonhuman cancers to therapeutic target in human neoplasia).临床肿瘤学杂志(J.Clin.Oncol.)19：32S-40S)。
EGFR表达于广泛多样的上皮来源肿瘤中，包括＞40％的NSCLC(非-小-细胞-肺癌)，＞95％的头颈部癌症，＞30％的胰腺癌，＞90％的肾癌，＞35％的卵巢癌，＞40％的神经胶质瘤和＞31％的膀胱癌(Salomon等，1995.肿瘤学和血液学关键综述(Crit.Review Oncol.Hematol)，19，183-232)。乳腺癌细胞表现出EGR受体密度与肿瘤尺寸间的正相关及其与分化程度间的负相关。(Sainsbury等，1985，人乳腺癌中的EGFR和雌激素受体(EGFRs andOestrogen Receptors in Human Breast Cancer)，Lancet，卷1，364-366；Sainsbury等，1985，乳腺癌患者中EGFR作为不良预后指示剂存在(Presence of EGFR as an Indicator of Poor Prognosis in Patients with BreastCancer)，临床病理学杂志(J.Clin.Path.)，卷38，1225-1228；Sainsbury等，1987.表皮-生长因子受体作为乳腺癌早期复发和死亡预报因子的状态(Epidermal-Growth-Factor Receptor Status as Predictor of Early Recurrenceand Death From Breast Cancer)，Lancet，卷1，1398-1400)。由于EGFR表达的高水平与疾病进程，增加的转移和不良预后相互关联，所以其为开发用于治疗多种实体瘤的有效EGFR靶抗体提供强有力的基本原理。
由于滑膜纤维原细胞和角化细胞是也表达EGF受体的细胞类型，这些细胞是分别用做治疗炎症关节炎和银屑癣的候选靶细胞。EGFR也在数种其他疾病中有所涉及，诸如炎症关节炎(US 5906820，US 5614488)，喉乳头瘤(Johnston D，Hall H，DiLorenzo TP，Steinberg BM 1999.人的乳头瘤病毒感染的喉乳头瘤中EGFR的升高和依赖的信号(Elevation of the EGFR anddependent signaling in human papillomavirus-infected laryngeal papillomas).癌症研究(Cancer Res.)59：968-74.)和肺中粘液分泌过多(Barnes PJ，HanselTT 2003.对用于慢性阻塞性肺病的新型药物的展望(Prospects for newdrugs for chronic obstructive pulmonary disease).Lancet 364：985-996；US6566324和US 6551989)。
抑制EGFR的Mab的识别在临床开发中是用于靶向恶性瘤中EGFR的异常信号转导的方法。所述EGFR靶抗体的实例是IMC-C225(爱必妥，Imclone)，EMD72000(Merck Darmstadt)，ABX-EGF(Abgenix)，h-R3(theraCIM，YM生物科学(YM Biosciences))和Humax-EGFR(Genmab)。这些抗体作用机制依赖于对配体与受体结合的抑制以及随后的受体转磷酸作用和下游信号级联的抑制。Mab 225(其中爱必妥是嵌合衍生物)，225来源的F(ab’)2片段能够诱导EGFR的内在化和适度的受体螯合，但仅发生在持续培养表达EGFR的细胞后。然而，单价的225来源的Fab’片段仅在与兔抗小鼠抗体预培养后诱导受体的下调(Fan Z，Mendelsohn J，Masui H，Kumar R 1993.通过抗受体单克隆抗体对NIH3T3/Her-14细胞中的EGFR的调节(Regulation of EGFR in NIH3T3/Her-14 cells by antireceptormonoclonal antibodies).生物化学杂志(J.Biol.Chem.)268：21073-21079；Fan Z，Lu Y，Wu X，Mendelsohn J 1994.抗体诱导的EGFR二聚作用介导对A431扁平癌细胞自分泌增殖的抑制(Antibody-induced EGFR dimerizationmediates inhibition of autocrine proliferation of A431 squamous carcinomacells).生物化学杂志(J.Biol.Chem.)269：27595-27602)。这些抗体显示出针对广泛的人肿瘤异种移植物的抗肿瘤活性(综述于Grünwald V，HidalgoM 2003.用于癌症治疗的EGFR发育抑制剂(Developing inhibitors of theEGFR for cancer treatment).国家癌症学院杂志(J.Natl.Cancer Inst.)95：851-867)。
治疗肿瘤的主要目标是杀死所有的肿瘤细胞。将杀死所述细胞的治疗试剂定义为细胞毒性的。将防止细胞复制而非杀死它们的治疗试剂定义为抑制细胞的。已知的基于抗体的，与EGF受体结合的治疗物仅防止细胞复制，且由此所述常规抗体起到细胞抑制剂的作用(EP 667165，EP 359282，US5844093)。然而，这些抗体或现存的可用的小分子药物对于治疗癌症均不完全有效，且大部分受到严重的毒性限制。另外，开发对所述靶序列具有充分效能和选择性的新型化学个体(NCE)是极其困难和冗长过程。抗体提供作为药物的显著潜力，其原因在于它们对其靶标具有敏锐的特异性以及低内在毒性。而且，若与开发新型化学个体(NCE)相比，开发时间可以明显缩短。
由于多种原因，从诸如小鼠、绵羊、山羊、兔等来源衍生而来的抗体及其人源化衍生物作为需要抑制细胞或细胞毒素作用的癌症治疗的应用是存在问题的。由于常规抗体在室温下不稳定，它们离不开所需的连续低温运输系统(从生产到患者治疗)，从而对其开发和治疗中的应用增加了额外的成本。冷藏有时在一些发展中国家中是不可行的。此外，所述抗体的制造或小规模生产很昂贵，其原因在于表达完整的和功能性抗体所必需的哺乳动物细胞系统需要时间和设备方面的高水平支持，且产率非常低。常规抗体通常表现出在有限的pH窗口中的功能抗原结合活性。因此，它们不适合于在具有极端pH条件的环境，诸如消化道中应用。另外，常规抗体在低或高pH时不稳定，且由此不适合用于口服施药。此外，常规抗体不适合在生物活性温度范围(例如，37±20℃)外的温度下进行测定或试剂盒中使用，其原因在于其结合活性依赖于温度。
多肽治疗剂，尤其是基于抗体的治疗剂具有作为药物的重要潜力，因为它们具有对其靶标敏锐的特异性和低内在毒性。然而，技术人员公知已得到的针对治疗上有用的靶标的抗体需要额外的修饰以准备将其用于人的治疗，从而避免当施用于人时在人个体中发生的不想要的免疫学反应。该修饰过程通常被称为“人源化”。技术人员公知在不同于人的物种产生的抗体需要人源化以便使得该抗体可用于人的治疗((1)CDR嫁接：蛋白质设计实验室(Protein Design Labs)：US 6180370，US 5693761；Genentech US6054297；Celltech：460167，EP 626390，US 5859205；(2)贴面(veneering)：Xoma：US 5869619，US 5766886，US 5821123)。需要一种产生抗体的方法，该方法避免了对实质人源化的需要，或者完全不需要人源化。需要一类新的抗体，这些抗体具有明确的框架区或者氨基酸残基并且可被施用于人受试者而不需要实质人源化，或者根本不需要人源化。
常规抗体的另一个重要的缺陷是它们是复杂的大分子并且因此相对不稳定，并且它们对蛋白酶降解敏感。这意味着常规抗体药物不能经口、舌下、局部、鼻、阴道、直肠或者吸入施用，因为它们不能抵抗这些部位的低pH，这些部位和血液中蛋白酶的作用和/或因为它们的大尺寸。它们必须通过注射(静脉内、皮下，等)施用以克服这些问题中的一些。通过注射施用需要专家训练以便正确和安全地使用皮下注射器或针。还需要无菌设备、治疗性多肽的液体制剂、所述多肽无菌和稳定形式的小瓶包装，且对于受试者，需要适合的针进入部位。此外，在接受注射前和注射时受试者通常经历生理和心理上的压力。因此，需要一种递送治疗多肽的方法，该方法避免了对注射的需要，该方法不仅节省费用/时间，而且对受试者更方便和更舒适。
实体瘤由密集压缩的高度增殖细胞组成。为了治疗实体瘤，需要使治疗抗体渗透肿瘤的最深层，以导致快速且均匀的分布，从而避免肿瘤复发。当比较完整的常规抗体(150kDa)和衍生的免疫球蛋白形式诸如F(ab’)2，Fab’和scFv片段(通过编码重链和轻链可变结构域基因片段的遗传融合而形成的最小抗原结合单位，所述重链和轻链由短连接体序列隔开)时，显示scFvs在肿瘤团块中表现出最快且最均匀的分布(Yokota T，Milenic DE，Whitlow M，Schlom J 1992.单链Fv的快速肿瘤渗透以及与其它免疫球蛋白形式的比较(Rapid tumor penetration of a single-chain Fv and comparisonwith other immunoglobulin forms))。
这些以及其他目标通过使用本发明的抗体得到了实现。
已知本发明中描述的来自骆驼科重链抗体的纳米抗体具有腔结合倾向(WO97/49805；Lauwereys等，EMBO杂志(EMBO J.)17，5312，1998)。因此，所述纳米抗体内在地适合于识别受体上的配体结合结构域或适合于与这样的表位结合，所述表位不易于常规抗体的接近，且可以因此通过不同的作用机制来操作，从而在肿瘤细胞上产生细胞毒素作用。
重链抗体缺乏轻链。因此，与常规抗体的抗原结合结构域相反，其抗原结合结构域由单一结构域，VHH(大约15kDa)形成，所述常规抗体需要重链和轻链可变结构域的功能折叠。功能VHH的表达仅需要单一基因片段，从而使这些VHH作为结构单元是适合的(Conrath KE，Lauwereys M，Wyns L，Muyldermans S 2001.双特异性二价抗体构建体中作为分子构建单位的骆驼单结构域抗体(Camel single-domain antibodies as modular buildingunits in bispecific and bivalent antibody constructs).生物化学杂志(J.Biol.Chem.)276：7346-7350)。所述重链抗体片段(或多聚体衍生物)可以利用与哺乳动物细胞培养发酵相比较便宜的表达系统，如酵母，大肠杆菌或其他微生物在发酵罐中“一起”产生(EP 0698097)。
此外，已显示出骆驼科纳米抗体具有出乎意料的高热稳定性，其在60℃-80℃的范围内具有Tms，并且骆驼科纳米抗体抵抗苛刻的条件，如极端的pH和变性试剂(Ewert S等，生物化学(Biochemistry)2002年3月19日；41(11)：3628-36；Pérez等，生物化学(Biochemistry)，2001，40：74-83)，由此使其适合于通过口服施药而递送。这容许，尤其，与常规抗体及其衍生物(例如，scFv)的标记相比更好的标记效率。同样地，可以获得更高的特异性活性，从而导致优越的成像结果或治疗功效。另外，骆驼科纳米抗体具有增长的保存期限(Perez等，生物化学(Biochemistry)，40，74，2001)。由于VHH是最小的抗原结合结构域(15kDa)，它们极其适合于实体瘤团块中的最佳分布。因为VHH来源于天然存在的重链抗体，该重链抗体经历了体内成熟，所以不再需要消耗时间和劳动密集的体外亲和力成熟作用。本发明的目的是提供包括一个或多个单结构域抗体的多肽(且尤其是纳米抗体)，所述多肽结合于肿瘤特异性或肿瘤相关抗原诸如EGFR(EGFR)和胰岛素生长因子受体(IGF-IR)，即所述多肽的同源物和功能部分。所述多肽可以i)抑制天然配体与受体的结合和/或，ii)诱导受体的下调，和/或iii)防止受体的同源和异源二聚作用和/或iv)诱导人细胞中程序性细胞死亡，由此随着结合，修饰EGFR的生物活性，v)利用标记的多肽检测表达IGF-IR和/或EGFR的肿瘤，vi)由于其与肿瘤抗原的结合而对细胞具有细胞毒性的作用。所述多肽可能结合于EGFR的配体结合槽中，或可能不结合配体结合槽中。所述多肽是单结构域抗体。
本发明的进一步目的是提供参与于治疗化合物，诸如抗肿瘤试剂中的，或参与适合于MRI或CAT扫描中可视化的成像试剂中的纳米抗体或多肽。
本发明的一个实施方案是这样的抗EGFR或抗IGF-IR多肽，其包括至少一个分别针对EGFR或IGF-IR的单结构域抗体。
本发明的另一个实施方案是如上所述的抗EGFR或抗IGF-IR多肽，其中至少一个单结构域抗体是重链可变结构域。
本发明的另一个实施方案是如上所述的抗EGFR或抗IGF-IR多肽，其中至少一个单结构域抗体是VHH或纳米抗体。
本发明的另一个实施方案是如上所述的抗EGFR或抗IGF-IR多肽，其中至少一个单结构域抗体是VHH，其中在基本不改变其抗原结合能力的条件下替换了一个或多个氨基酸残基。
本发明的另一个实施方案是如上所述的抗EGFR或抗IGF-IR多肽，其中至少一个单结构域抗体是VH，其中在基本不改变其抗原结合能力的条件下替换了一个或多个氨基酸残基，和特别地进行了骆驼化。
本发明的另一个实施方案是如上所述的抗EGFR或抗IGF-IR多肽，其中至少一个单结构域抗体是人源化的VHH。
本发明的另一个实施方案是如上所述的抗EGFR或抗IGF-IR多肽，其中所述单结构域抗体是全长单结构域抗体的同源序列、功能部分、或同源序列的功能部分。
本发明的另一个实施方案是如上所述的抗EGFR或抗IGF-IR多肽，其进一步包括至少一种共价附着或重组融合的物质，其涉及改进半衰期。
本发明的另一个实施方案是如上所述的抗EGFR或抗IGF-IR多肽，其中所述涉及改进半衰期的物质是聚乙二醇，血清蛋白的任一种。
本发明的另一个实施方案是如上所述的抗EGFR或抗IGF-IR多肽，其中所述物质是针对血清蛋白的单结构域抗体。
本发明的另一个实施方案是如上所述的抗EGFR或抗IGF-IR多肽，其中所述血清蛋白是血清清蛋白、血清免疫球蛋白、甲状腺素结合蛋白、运铁蛋白、或血纤蛋白原的任一种。
本发明的另一个实施方案是如上所述的抗EGFR或抗IGF-IR多肽，其中所述血清蛋白是人的。
本发明的另一个实施方案是如上所述的抗EGFR或抗IGF-IR多肽，其中所述单结构域抗体是全长单结构域抗体的同源序列、功能部分、或同源序列的功能部分。
本发明的另一个实施方案是如上所述的抗EGFR或抗IGF-IR多肽，其中所述多肽是全长单结构域抗体的同源序列、功能部分、或同源序列的功能部分。
本发明的另一个实施方案是如上所述的抗EGFR或抗IGF-IR多肽，其中所述针对EGFR或IGF-IR的单结构域抗体的数目是至少2个。
本发明的另一个实施方案是如上所述的抗EGFR或抗IGF-IR多肽，其中所述的至少两个单结构域抗体在不存在连接体序列的条件下头尾连接。
本发明的另一个实施方案是如上所述的抗EGFR或抗IGF-IR多肽，其中至少一个单结构域抗体能够与EGFR结合，从而使受体内在化，但不与转铁蛋白共定位。
本发明的另一个实施方案是如上所述的抗EGFR或抗IGF-IR多肽，其进一步包括一种或多种放射性同位素。
本发明的另一个实施方案是如上所述的抗EGFR或抗IGF-IR多肽，其中至少一种同位素是188Re，131I或211At之一。
本发明的另一个实施方案是如上所述的抗EGFR或抗IGF-IR多肽，其进一步包括一种或多种抗肿瘤试剂。
本发明的另一个实施方案是如上所述的抗EGFR或抗IGF-IR多肽，其中至少一种抗肿瘤试剂是antracyclines，甲氨蝶呤，长春地辛，顺铂，蓖麻毒蛋白，加里刹霉素和细胞因子的任一种。
本发明的另一个实施方案是如上所述的抗EGFR或抗IGF-IR多肽，其进一步包括一种或多种能够活化前药的酶。
本发明的另一个实施方案是编码如上所述抗EGFR或抗IGF-IR多肽的核酸。
本发明的另一个实施方案是如上所述的抗EGFR或抗IGF-IR多肽，或编码所述多肽的核酸，用于治疗和/或预防和/或减轻与炎症反应相关的疾病。
本发明的另一个实施方案是如上所述的抗EGFR或抗IGF-IR多肽，或编码所述多肽的核酸，用于治疗和/或预防和/或减轻与癌症相关的疾病。
本发明的另一个实施方案是如上所述的抗EGFR或抗IGF-IR多肽，或编码所述多肽的核酸用于制备治疗和/或预防和/或减轻与癌症相关疾病的药物的应用。
本发明的另一个实施方案是如上所述的抗EGFR多肽，抗IGF-IR多肽，或核酸，其中所述癌症选自由下列癌症组成的组：乳腺癌，卵巢癌，睾丸癌，肺癌，结肠癌，直肠癌，胰腺癌，肝癌，中枢神经系统癌，头和颈部癌，肾癌，骨癌，血液和淋巴系统癌。
本发明的另一个实施方案是这样的组合物，其包括如上所述的抗EGFR或抗IGF-IR多肽或编码所述多肽的核酸以及合适的药物载体。
本发明的另一个实施方案是诊断特征为异常EGFR信号或存在IGF-IR的疾病的方法，其包括：
(a)将样品与如上描述的抗-EGFR或抗-IGF-IR多肽接触，
(b)检测所述多肽与所述样品的结合，和
(c)将步骤(b)中所检测到的结合与标准进行比较，其中相对于所述样品结合中的差异诊断特征分别为异常EGFR信号或存在IGF-IR的疾病。
本发明的另一个实施方案是用于利用如上所述的方法筛选以上引用的疾病的试剂盒。
本发明的另一个实施方案是用于筛选以上引用疾病的试剂盒，该试剂盒包括如上所述的分离的抗EGFR或抗IGF-IR多肽。
本发明的另一个实施方案是如上所述的抗EGFR或抗IGF-IR多肽分别抑制EGF和一种或多种EGF受体或IGF-IR和一种或多种IGF-IR受体间相互作用的应用。
本发明的另一个实施方案是产生如上所述的抗EGFR或抗IGF-IR多肽的方法，该方法包括：
(a)在允许该多肽表达的条件下培养含有能够编码上述抗EGFR或抗IGF-IR多肽的核酸的宿主细胞，和
(b)从培养物回收所产生的多肽。
本发明的另一实施方案是如上描述的方法，其中所述宿主细胞是细菌或酵母。
本发明的另一个实施方案是用于筛选癌症的试剂盒，其包括如上所述的抗EGFR或抗IGF-IR多肽。
本发明的另一个实施方案是如上所述的抗EGFR或抗IGF-IR多肽，其进一步包括一种或多种成像剂。
本发明的另一个实施方案是如上所述的抗EGFR或抗IGF-IR多肽，其中所述成像剂是放射性标记，酶标记，磁共振顺磁螯合物，和/或光学染色之一。
本发明的另一个实施方案是如上所述用于成像的抗EGFR或抗IGF-IR多肽。
本发明的另一个实施方案是用于使EGFR或IGF-IR靶标成像的方法，该方法包括施用如上所述的抗EGFR或抗IGF-IR多肽。
如上所述的抗EGFR或抗IGF-IR多肽制备用于成像的组合物，更优选地，诊断组合物的应用。
本发明的另一个实施方案是如上所述的方法，其中抗EGFR或抗IGF-IR单结构域抗体的数目是至少2个。
本发明的另一个实施方案是如上所述的方法，其中将所述多肽通过微粒，超声泡，微球体，乳剂或脂质体的形式施用于受试者。
本发明的另一个实施方案是用于增长抗EGFR或抗IGF-IR多肽在它们各自受体上停留时间的方法，该方法包括使所述多肽与一种或多种针对血清蛋白的单结构域抗体融合。
本发明的另一个实施方案是如上所述的方法，其中所述抗EGFR或抗IGF-IR多肽是如上所述的多肽。
本发明的另一实施方案是一种鉴定试剂的方法，该试剂调节上述抗EGFR或抗IGF-IR多肽与EGFR或IGF-IR的结合，该方法包括步骤：
(a)将如上所述的多肽与靶标EGFR或IGF-IR或其片段在存在和不存在候选调节剂时，在允许所述多肽和相应靶标结合的条件下接触，和
(b)测量步骤(a)的多肽和靶标之间的结合，其中相对于不存在所述候选调节剂时的结合，在所述候选调节剂的存在下结合降低表示所述候选调节剂为一种试剂，该试剂调节如上所述的抗EGFR或抗IGF-IR多肽分别与EGFR或IGF-IR的结合。
本发明的另一实施方案是一种鉴定试剂的方法，该试剂通过上述抗EGFR或抗IGF-IR多肽或抗IGF-IR多肽分别与EGFR或IGF-IR的结合调节EGFR或IGF-IR介导的疾病，该方法包括：
(a)将如上所述的抗EGFR或抗IGF-IR多肽与靶标EGFR或IGF-IR或其片段在存在和不存在候选调节剂时，在允许所述多肽和相应靶标结合的条件下接触，和
(b)测量步骤(a)的多肽和靶标之间的结合，其中相对于不存在所述候选调节剂时的结合，在所述候选调节剂的存在下结合降低表示所述候选调节剂为一种试剂，该试剂调节EGFR或IGF-IR介导的疾病。
本发明的另一实施方案是鉴定一种试剂的方法，该试剂通过如上所述的抗EGFR或抗IGF-IR多肽与EGFR的结合调节表皮生长因子与其受体的结合，该方法包括：
(a)将如上所述的抗EGFR或抗IGF-IR多肽与靶标EGFR，或其片段，或其同源序列，在存在和不存在候选调节剂时，在允许所述多肽和靶标结合的条件下接触，和
(b)测量步骤(a)的多肽和靶标之间的结合，其中相对于不存在所述候选调节剂时，在所述候选调节剂的存在下结合降低表示所述候选调节剂为一种试剂，该试剂调节EGFR天然配体的结合。
本发明的另一实施方案是筛选调节EGFR介导或抗IGF-IR介导疾病的试剂的试剂盒，该试剂盒分别含有如上所述的抗EGFR或抗IGF-IR多肽和EGFR或IGF-IR，或其片段。
本发明的另一实施方案是通过根据上述方法鉴定的一种未知试剂，该试剂调节如上描述的多肽与EGFR或IGF-IR的结合。
本发明的另一实施方案是通过根据上述方法鉴定的一种未知试剂，该试剂调节EGFR介导或IGF-IR介导的疾病。
本发明的另一实施方案是如上描述的一种未知试剂，其中所述疾病是癌症，类风湿性关节炎，银屑病或肺中粘液分泌过多的一种或多种。
本发明的另一实施方案是如上所述的抗EGFR或抗IGF-IR多肽，用于治疗和/或预防和/或减轻易受EGFR或IGF-IR拮抗剂递送调节的疾病，该拮抗剂能够穿过胃环境而不被失活。
本发明的另一实施方案是如上所述的抗EGFR或抗IGF-IR多肽的用途，用于制备治疗，预防和/或减轻易受EGFR或IGF-IR拮抗剂递送调节的疾病症状的药物，该拮抗剂能够穿过胃环境而不被失活。
本发明的另一实施方案是如上所述的多肽，用于治疗，预防和/或减轻疾病症状，所述疾病易受EGFR或IGF-IR拮抗剂在不被失活条件下向阴道和/或直肠递送的调节。
本发明的另一实施方案是如上所述多肽用于制备治疗，预防和/或减轻疾病症状药物的用途，所述疾病易受EGFR或IGF-IR拮抗剂在不被失活条件下向阴道和/或直肠递送的调节。
本发明的另一实施方案是如上所述的多肽，用于治疗，预防和/或减轻易受EGFR或IGF-IR拮抗剂在不被失活条件下向上呼吸道和肺递送调节的疾病症状。
本发明的另一实施方案是如上所述的多肽的用途，用于制备需要将治疗化合物递送到上呼吸道和肺而治疗、预防和/或减轻疾病症状的药物。
本发明的另一实施方案是如上所述的多肽，用于治疗和/或预防和/或减轻易受EGFR或IGF-IR拮抗剂在不被失活条件下向肠粘膜递送调节的疾病，其中所述疾病增加了肠粘膜的渗透性。
本发明的另一实施方案是如上所述的多肽的用途，用于制备治疗，预防和/或减轻易受EGFR或IGF-IR拮抗剂在不被失活条件下递送调节的疾病症状的药物，其中所述疾病增加了肠粘膜的渗透性。
本发明的另一实施方案是如上所述的多肽，用于治疗和/或预防和/或减轻易受EGFR或IGF-IR拮抗剂在不被失活条件下向舌下组织递送调节的疾病。
本发明的另一实施方案是如上所述多肽的用途，用于制备治疗，预防和/或减轻易受EGFR或IGF-IR拮抗剂在不被失活条件下向舌下组织递送调节的疾病症状的药物。
本发明的另一实施方案是如上所述的多肽，用于治疗和/或预防和/或减轻易受EGFR或IGF-IR拮抗剂在不被失活条件下经皮递送调节的疾病。
本发明的另一实施方案是如上所述多肽的用途，用于制备治疗，预防和/或减轻易受EGFR或IGF-IR拮抗剂在不被失活条件下经皮递送调节的疾病症状的药物。
本发明的另一实施方案是如上所述多肽，核酸或试剂，如上所述多肽，核酸或试剂的用途，如上所述的多肽，如上所述的多肽的用途，其中所述疾病是癌症，类风湿性关节炎，银屑病或肺中粘液分泌过多。
本发明的另一实施方案是如上所述多肽的用途，用于抑制EGF和一种或多种EGFR间的相互作用。
本发明的另一实施方案是治疗组合物，其包括：
(a)VHH，其通过所述VHH与所述肿瘤细胞的EGFR或IGF-IR的结合抑制人肿瘤细胞的生长，和
(b)抗瘤剂。
本发明的另一实施方案是适于分开施用组分的如上所述的治疗组合物。
本发明涉及抗EGFR(EGFR)多肽，其包括至少一个针对EGFR的单结构域抗体。本发明还涉及抗IGF-IR(IGF-IR)多肽，其包括至少一个针对IGF-IR的单结构域抗体。本发明还涉及能够编码所述多肽的核酸。
EGFR在许多癌症细胞的表面上过表达，且该过表达与预后不良，发展，生存缩短和对化学疗法或激素疗法的抗性有关。而且，已经证明了EGFR的过表达改变细胞周期的调节(增加肿瘤细胞上的增殖)，阻断程序性细胞死亡并促进血管发生。由此，与肿瘤细胞中信号转导途径有关的EGFR的阻断应该导致：(i)肿瘤细胞增殖的抑制，(ii)细胞周期停滞，(iii)细胞程序性死亡的诱导和(iv)血管发生的抑制。
本发明的药物化合物阻断EGF与受体的结合，抑制由EGF结合引起的受体酪氨酸激酶活性(抑制酪氨酸的磷酸化作用)，刺激受体的内在化，抑制由体外细胞培养物上的EGF诱导的细胞增殖，具有显著的前细胞程序性死亡作用，并具有有效的抗血管发生活性，从而导致VEGF产量的下调并减少微管计数的数目。当所述药物化合物与其他抗癌症治疗组合时，这些作用会得到进一步的增强。
本发明的一个实施方案涉及这样的药物组合物，其包括至少一种本发明的多肽和至少一种药用载体，稀释剂或赋形剂。
按照一个优选的但非限制性实施方案，所述药物组合物适合于口服施用。
按照本发明的一个方面，纳米抗体是这样的多肽，其由重链抗体衍生而来，且其构架区和互补决定区是单结构域多肽的一部分。所述重链抗体的实例包括，但不仅限于，天然存在的缺乏轻链的免疫球蛋白。所述免疫球蛋白公开在例如WO 94/04678中。
该与众不同的重链抗体种类的抗原结合位点具有独特的结构，该结构包括单可变结构域。为了阐明，本文已知由天然缺乏轻链的重链抗体衍生而来的可变结构域是VHH或VHH结构域或纳米抗体。所述VHH结构域肽可以由骆驼科物种，例如在骆驼、单峰骆驼、美洲驼、羊驼和驮马中产生的抗体衍生而来。除了骆驼科之外的其他物种(例如，鲨鱼，河豚)可以产生天生缺乏轻链的功能抗原结合重链抗体。由所述重链抗体衍生而来的VHH结构域在本发明的范围内。
骆驼科抗体表达缺乏轻链的功能重链抗体的独特且大范围的所有组成部分(extensive repertoire)。由骆驼科抗体衍生而来的VHH分子是已知的最小的完整抗原结合结构域(大约15kDa，或比常规IgG小10倍)，且由此良好地适合于向密集组织的递送和接近大分子间的有限空间。
纳米抗体的其他实例包括由常规四链抗体的VH结构域衍生而来的纳米抗体，所述四链抗体是经过用骆驼科特异性残基替换一个或多个氨基酸残基(所谓的重链抗体的骆驼化，WO 94/04678)而被修饰的。该位置可以优选地发生在VH-VL交界面和所谓的骆驼科标志残基处(WO94/04678)，包括位置37，44，45，47，103和108。
纳米抗体对应于由单一免疫球蛋白(Ig)结构域形成的小的、活跃有效的识别单位。
如本文所述的抗EGFR或抗IGF-IR多肽及其衍生物不仅拥有常规抗体的有利特征，诸如低毒性和高选择性，而且它们还表现出另外的特性。它们更易溶；由此可以以高于常规抗体的浓度对它们进行保存和/或施用。
常规抗体在室温下不稳定，且必须被冷藏制备和储存，需要必要的冷藏实验室设备，储存和运输，这消耗了时间和费用。本发明的抗EGFR或抗IGF-IR多肽在室温下稳定；由此可以在不使用冷藏设备的条件下对其进行制备，储存和/或运输，这表达了费用，时间和环境节约。此外，常规抗体不适合在生物活性温度范围(例如，37±20℃)外的温度下进行的测定或试剂盒中使用。
与常规抗体相比，如本文所述的抗EGFR或抗IGF-IR多肽的其他有利特征包括循环中的半衰期调节，所述循环可以受到按照本发明，通过例如清蛋白偶联，或通过与一个或多个针对血清蛋白诸如例如血清清蛋白纳米抗体偶联的调节。本发明的一个方面是双特异性抗EGFR多肽，如WO 04/041865中所述，其具有一种针对血清蛋白诸如血清清蛋白的特异性和另一种针对靶标的特异性，并将其引入本文作为参考。其他增长半衰期的方法包括本发明多肽与Fc或与其他针对EGFR的纳米抗体的偶联(即，创建多价纳米抗体-二价，三价，等)或与聚乙二醇的偶联。可控制的半衰期对于用直接作用调节剂量而言是理想的。
常规抗体不适合于在通常生理pH范围外的环境中使用。它们在低或高pH时不稳定，且由此不适合于口服施药。骆驼科抗体抵抗严酷的条件，如极端pH、变性试剂和高温，因此使得本文所公开的抗EGFR或抗IGF-IR多肽适于通过经口施用递送。骆驼科抗体抵抗蛋白酶的作用，该抗性在常规抗体的情形中较低。
常规抗体表达的产率非常低，且产生方法需要大量的劳动。此外，所述抗体的制造或小规模生产非常昂贵，其原因在于表达完整有活性抗体所必需的哺乳动物细胞系统需要时间和设备上的高水平支持，且产率非常低。可以通过在常规重组宿主生物体诸如大肠杆菌和酵母中的发酵而成本高效地生产本发明的抗EGFR或抗IGF-IR多肽；与同样需要昂贵哺乳动物细胞培养设备的常规抗体不同，本发明的抗EGFR或抗IGF-IR多肽可实现的表达水平高。本发明多肽产率的实例是1-10mg/ml(大肠杆菌)和高达1g/l(酵母)。
本发明的抗EGFR或抗IGF-IR多肽表现出对广泛范围不同抗原类型的高结合亲和力，和与不被常规抗体识别的表位结合的能力；例如它们显示具有渗透到腔中潜力的长CDR3环。
本发明的抗EGFR或抗IGF-IR多肽表现出由如WO 96/34103(将其引入本文作为参考)中公开的通过(头-到-尾)融合而简单产生双或多功能分子。
通过它们的小尺寸，本发明的抗EGFR或抗IGF-IR多肽容许优于常规抗体的组织渗透性和到达身体所有部分的能力。
美洲驼单结构域抗体可以迁移穿过人的血脑屏障。在本发明的一个实施方案中，抗EGFR或抗IGF-IR多肽可以渗透血脑屏障。在本发明的另一个实施方案中，抗EGFR或抗IGF-IR多肽不可以渗透血脑屏障。
如本文所公开的抗EGFR或抗IGF-IR多肽比常规抗体具有更低的免疫原性。已经发现了这样的骆驼科抗体的子集，其表现出95％同源于人VH构架区的氨基酸序列。这提示随着在人类受试者中的施用，可以预测免疫原性很小或甚至不存在。备选地，如果需要如此，则纳米抗体的人源化令人吃惊地仅要求很少的残基需要被替换。
按照一个优选的但非限制性实施方案，本发明的多肽具有4-11之间的等电点。优选地，本发明的多肽具有5-10之间的等电点。
按照一个优选的但非限制性实施方案，本发明的多肽包括两条共价连接的氨基酸链(本文称为“重链”)。
本发明的重链优选地通过二硫键而连接。更优选地，本发明的重链通过半胱氨酸残基形成二硫键而连接。
按照一个优选的但非限制性实施方案，本发明的重链具有大约35kDa-50kDa的分子量。如Hamers-Casterman等(自然(Nature)1993)中所述，确定该分子量。
优选地，本发明的重链具有40kDa-50kDa的分子量。
更优选地，本发明的重链具有41kDa-49kDa，42kDa-48kDa，43kDa-47kDa，或44kDa-46kDa的分子量。
最优选地，本发明的重链具有43kDa-46kDa的分子量.
按照一个优选的但非限制性实施方案，本发明的重链具有分子量43kDa。
按照一个优选的但非限制性实施方案，本发明的重链具有分子量46kDa。
单结构域抗体是这样的抗体，其互补决定区是单结构域多肽的一部分。实例包括，但不仅限于，重链或轻链抗体，天然缺乏轻链的抗体，由常规4-链抗体衍生而来的单结构域抗体，来自常规抗体的VH结构域，编码这些部分的各自人种系序列，改造的抗体和除了由抗体衍生的那些外的单结构域支架。单结构域抗体可以是任何领域中已知的抗体，或任何将来的单结构域抗体。单结构域抗体可以从任何物种衍生而来，所述物种包括但不仅限于，小鼠，人，骆驼，美洲驼，鲨鱼，河豚，山羊，兔，牛。按照本发明的一个方面，本文所使用的单结构域抗体是天然存在的缺乏轻链的免疫球蛋白。所述单结构域抗体公开于例如WO 94/04678中。为了阐明原因，将这个从天然缺少轻链的重链抗体衍生而来的可变结构域在本文称为VHH或者纳米抗体，以便将其与四链免疫球蛋白的常规VH区别。所述VHH分子可以由骆驼科物种，例如骆驼，单峰骆驼，美洲驼，南美骆马，羊驼和驮马中产生的抗体衍生而来。除骆驼科外的其他物种(例如，鲨鱼，河豚)可以产生天然缺乏轻链的功能抗原结合重链抗体；且由该重链抗体衍生而来的VHHs属于本发明的范围。
按照本发明，纳米抗体是重链可变结构域，其由天生缺乏轻链的免疫球蛋白衍生而来，诸如由WO 94/04678中所述的骆驼科衍生而来的那些(且下文中称为VHH结构域或纳米抗体)。VHH分子比IgG分子小大约10倍。它们是单多肽，并且非常稳定，抵抗极端的pH和温度条件。此外，微生物宿主中VHHs的表达产生高产率的适当折叠的功能VHHs。由此可以避免在哺乳动物宿主中的表达。
而且，它们对蛋白酶作用具有抗性，在常规抗体的情形中该抗性较低。本发明的VHHs对由消化道蛋白酶所引起的消化具有抗性，且该抗性通常高于常规抗体。这容许通过口服摄入，治疗地使用所述VHHs。此外，当将本发明的VHHs在37℃培养在人血清中时，其表现出超过几个月的稳定性。
另外，Camelid中产生的抗体会通过使用抗体文库或通过使除Camelid外的哺乳动物免疫而识别表位，所述表位是除了被体外产生的抗体识别的以外的表位(WO 97/49805)。同样地，抗EGFR和抗IGF-IR VHH在分别结合于EGFR或IGF-IR时，可以比常规抗体更有效地相互作用，或诱导独特的生物作用，从而阻断其与EGFR配体的相互作用，或更有效地阻断IGF-IR抗原对其各自受体的活性。由于已知VHH结合到“不寻常”表位，诸如腔或槽中(WO 97/49805)，所述VHH的亲和力可以更适合于治疗剂的治疗。
已经描述了若干EGFR靶向的抗体，诸如IMC-C225，ABX-EGF，Humax-EGFR，hR3和EMD72000，它们表现出对于人类癌细胞的抑制细胞作用。其生物机制通过这些EGFR靶向抗体从而抑制配体与EGF受体的胞外结构域结合的能力，及由此阻止受体介导的细胞增殖所需的下游信号得到解释。可商业购买的表现出抑制细胞作用的EGFR抗体之一是爱必妥(小鼠单克隆抗体225的嵌合形式)，所述爱必妥近期被批准用于与伊立替康(irinotecan)的组合治疗法中治疗结肠直肠癌。细胞用于降低EGF受体介导的信号的方法之一是受体螯合或下调机制。当配体和受体结合后，细胞可以通过配体-受体复合物的内在化来下调受体信号，从而导致溶酶体中配体-受体复合物的降解。
本发明人惊讶地发现某些抗EGFR纳米抗体能够与EGF，TGFα和/或爱必妥竞争。将该新型抗EGFR纳米抗体按功能分为3种类型的配体竞争纳米抗体。不同种类纳米抗体的非限制性实例如下：
-A型纳米抗体(与胞外结构域EGFR结合，与EGFR上EGF，TGFα而非爱必妥的结合位点相竞争。该纳米抗体的实例是27-10-E8(SEQ ID NO：80；家族I)和PMP7A5(SEQ ID NO：84；家族III))。
-B型纳米抗体(与胞外结构域EGFR结合，与EGFR上EGF，爱必妥和TGFα结合位点相竞争。该纳米抗体的实例是PMP7D12和PMP7C12(SEQ ID NO’s：81-82；家族II))。
-C型纳米抗体(与胞外结构域EGFR结合，与EGFR下调上的TGFα而非EGF或爱必妥结合位点相竞争。该纳米抗体的实例是PMP8C7(SEQ ID NO：90；家族XIII))。
因此，本发明的实施方案是这样的抗EGFR多肽，其包括单结构域抗体或特异性结合于EGFR胞外结构域并与EGFR上的EGF和TGFα结合位点，而非EGFR上的爱必妥结合位点相竞争的纳米抗体。本发明另一个实施方案是这样的抗EGFR多肽，其包括单结构域抗体或特异性结合于EGFR胞外结构域并与EGFR上的EGF，TGFα和爱必妥结合位点相竞争的纳米抗体。在本发明的再一个实施方案中，所述抗EGFR多肽包括单结构域抗体或特异性结合于EGFR胞外结构域并与EGFR上的TGFα结合位点，而非EGFR上的EGF或爱必妥结合位点相竞争的纳米抗体。
本发明的一个方面是包括至少一个抗EGFR纳米抗体的抗EGFR或抗IGF-IR多肽。本发明的一个方面是该多肽可以包括另外的成分。所述成分可以是多肽序列，例如，一个或多个抗EGFR纳米抗体，一个或多个抗IGF-IR纳米抗体，一个或多个抗血清清蛋白纳米抗体。其他融合蛋白也属于本发明的范围，并且可以包括，例如，与载体多肽，信号分子，标记物和酶的融合。其他成分可以包括，例如，放射性标记，有机染色，荧光化合物。
本发明的一个实施方案是由这样的序列组成的抗EGFR或抗IGF-IR多肽，所述序列对应于分别针对EGFR或IGF-IR，或紧密相关的家族成员的骆驼科VHH的序列。
本发明的单结构域抗体针对EGFR，IGF-IR或紧密相关的家族成员。
本发明的另一个实施方案是如本文所公开的多价抗EGFR或抗IGF-IR多肽，其包括至少两个针对EGFR的单结构域抗体。本发明的另一个实施方案是如本文所公开的多价抗IGF-IR多肽，其包括至少两个针对IGF-IR的单结构域抗体。所述多价抗EGFR或抗IGF-IR多肽具有这样的优势：对于靶标具有超乎寻常的高功能亲和力，表现出与它们的单价负体相比高得多预期抑制特性。
该多价抗EGFR或抗IGF-IR多肽具有这样的功能亲和力，所述功能亲和力比单价亲代抗EGFR或抗IGF-IR多肽分别高若干数量级。本发明人发现这些多价多肽的功能亲和力远高于在关于二价和多价抗体的现有技术中报告的那些亲和力。令人惊讶地，本发明包括直接或通过短连接体序列相互连接的单结构域抗体的抗EGFR或抗IGF-IR多肽表现出理论上用多价常规4-链抗体所预期的高功能亲和力。
本发明人发现可以优选地用包括多结构域和多聚蛋白质的抗原，在直接结合测定中或在功能测定，例如细胞毒性测定中，检测该极大增高的功能活性。
本发明人还发现多价多肽增加了针对它们各自IGF-IR和/或EGFR靶标的滞留时间和亲和力/抗体亲抗原性。可以通过放射性标记，酶标记，或用MR顺磁螯合物标记，或引入到微粒，超声泡，微球体，乳剂，或脂质体中，改变这些多聚多肽，以便提供IGF-IR或EGFR特异性成像剂；或者其中结合部分与光学染料缀合。
本文所使用的多价抗EGFR或抗IGF-IR多肽指包括两个或更多通过共价连接的抗EGFR单结构域抗体的多肽。本文所使用的多价抗IGF-IR多肽指包括两个或更多通过共价连接的抗IGF-IR单结构域抗体的多肽。抗EGFR或抗IGF-IR单结构域抗体可以在序列上相同或不同，但是针对相同靶标或其相同的抗原或表位。备选地，该多价构建体可以针对相同靶标的不同表位。
依赖于所连接的抗EGFR或抗IGF-IR单结构域抗体的数目，多价抗EGFR或抗IGF-IR多肽可以是二价的(两个抗EGFR单结构域抗体或两个抗IGF-IR单结构域抗体)，三价的(3个抗EGFR或抗IGF-IR多结构域抗体)，四价的(4个抗EGFR或抗IGF-IR多结构域抗体)或更高价分子。
按照本发明的另一个方面，抗EGFR或抗IGF-IR多肽可以包括至少两个抗EGFR纳米抗体。本发明的一个方面是该多肽可以包括如上所述的另外的成分。
本发明包括两个抗EGFR纳米抗体或两个抗IGF-IR纳米抗体的抗EGFR或抗IGF-IR多肽的实例分别为下表4(SEQ ID NO’s：122-133和141-143)和表6(SEQ ID NO’s：134-135)中所述的多肽。
按照本发明进一步的方面，本发明的抗EGFR或抗IGF-IR多肽可以包括1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15或超过15个分别针对EGFR或IGF-IR纳米抗体。
按照本发明的一个方面，本发明的抗EGFR或抗IGF-IR多肽可包括至少两个相同或非相同的抗EGFR纳米抗体序列。本发明的一个方面可以是上述序列中至少两个对EGFR不具有相等的亲和力，因此形成与抗EGFR或抗IGF-IR多肽弱组合和高亲和力结合的序列。
本发明二价抗EGFR或抗IGF-IR多肽的实例包括下表4(SEQ IS NO’s：122-133)和表6(SEQ ID NO’s：134-135)中所分别给出的序列，其中二价抗EGFR或抗IGF-IR多肽包括两个相同的分别针对EGFR或IGF-IR的纳米抗体。
如下所述，纳米抗体可以与或不与连接体序列组合。
构建二价多肽的方法在本领域已知(例如US 2003/0088074)，并且在下文也有所记述。
关于效应子功能而修饰本发明的抗EGFR或抗IGF-IR多肽从而提高其治疗功效可能是理想的。例如，与某些Fc结构域，特别是与人来源的Fc结构域的纳米抗体融合可能是有优势的。
本发明还涉及这样的发现，所述发现是本文所公开的进一步包括一个或多个各自针对受试者血清蛋白的纳米抗体的抗EGFR或抗IGF-IR多肽，与不作为所述多肽一部分的抗EGFR或抗IGF-IR纳米抗体的半衰期相比令人吃惊地具有在所述受试者的循环中显著延长的半衰期。此外，发现了该抗EGFR或抗IGF-IR多肽表现出如上所述纳米抗体的相同有利特性，诸如在小鼠体内保持完整的高稳定性，极端pH抗性，高温度稳定性和高靶标特异性和亲和力。
因此，本文所公开的抗EGFR或抗IGF-IR多肽，其包括一个或多个分别针对EGFR或IGF-IR的纳米抗体，和一个或多个具有对血清蛋白特异性的纳米抗体，比仅分别靶向EGFR或IGF-IR的多肽更有效得多。
例如包括一个针对EGFR的纳米抗体和一个针对血清清蛋白的纳米抗体的双特异性抗EGFR多肽的实例基本如WO 05/044858和WO 04/041867中所述。
血清蛋白可以是受试者血清中发现的任意合适的蛋白质，或其片段。在本发明的一个方面，血清蛋白是血清清蛋白，血清免疫球蛋白，甲状腺素结合蛋白，转铁蛋白或纤维蛋白原之一。受试者可以是，例如，兔，山羊，小鼠，大鼠，母牛，小牛，骆驼，美洲驼，猴，驴，豚鼠，鸡，绵羊，狗，猫，马和优选地人。依赖于预期的用途，诸如有效治疗所需的半衰期和/或靶抗原的区分，纳米抗体配偶体可以针对以上血清蛋白之一。
按照本发明的一个方面，本发明抗EGFR或抗IGF-IR多肽中针对血清蛋白的纳米抗体的数目是1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15或超过15个。
本发明的另一个方面是这样的抗EGFR或抗IGF-IR多肽，其进一步包括至少一种共价地(连接地)或非共价地结合的物质，该物质在体内改进所述多肽的半衰期。改进半衰期的物质的实例在本领域已知，且包括，例如，聚乙二醇和血清清蛋白。
连接纳米抗体和其他物质从而形成双和多特异性多肽的方法对技术人员是已知的，并如下所述。
不是按照本发明修饰来增长半衰期的本发明多肽具有从身体中快速清除的特征。相反地，包括一个或多个针对EGFR纳米抗体和一个或多个抗血清蛋白纳米抗体的双特异性多肽能够在受试者血清中循环数天，这降低了治疗的频率，增长了体内功能活性持续的时间，减少了对受试者的麻烦，并导致降低的治疗费用。对包括其他目标为改进半衰期物质的本发明多肽可以观察到相同的优势特征。
此外，本发明的一个方面是本文所公开抗EGFR或抗IGF-IR多肽的半衰期可以受到所述多肽中存在的抗血清蛋白纳米抗体数目的控制。可控制的半衰期在若干情形中，例如在时控剂量的治疗性抗EGFR多肽的应用中是理想的。
药物动力学分析和确定半衰期的方法对本领域技术人员是熟悉的。详细信息可见于Kenneth，A等：药物的化学稳定性：药剂师手册(ChemicalStability of Pharmaceuticals：A Handbook for Pharmacists)中和Peters等，药物动力学分析：实践方法(Pharmacokinete analysis：A Practical Approach)(1996)中.还将参考文献“药物动力学”(″Pharmacokinetics″)，M Gibaldi &D Perron，由Marcel Dekker出版，第二Rev.ex版本(1982)中。
按照本发明的一个方面，所述多肽能够与一个或多个可以在体内增长该多肽半衰期的分子结合。
半衰期是多肽的血清浓度在体内被降低50％，例如由于通过天然机制配体降解和/或配体清除或螯合，所花费的时间。本发明的多肽在体内稳定，且它们的半衰期通过与抵抗降解和/或清除或螯合的分子结合得到增长。典型地，所述分子是天然存在的本身在体内具有长半衰期的蛋白质。
如果本发明多肽在体内的功能活性保持了比对增长半衰期分子不具特异性的类似多肽更长的时期，则本发明多肽的半衰期增长了。因此，比较本发明特异于HSA和靶分子的多肽和这样的相同多肽，其中所述相同多肽不存在对HSA特异性，其不与HSA结合，而与其他分子结合。例如，它可结合靶分子上的第二种表位。典型地，半衰期被增长了10％，20％，30％，40％，50％或更多。在2x，3x，4x，5x，10x，20x，30x，40x，50x或更长半衰期范围内的增加是可能的。备选地，或另外地，在高达30x，40x，50x，60x，70x，80x，90x，100x，150x半衰期范围内的增加是可能的。
典型地，可以在体内增长所述多肽半衰期的分子是在体内天然存在的且通过内源性机制抵抗降解或清除的多肽，所述内源性机制从生物体内清除不需要的物质。例如，增长生物体半衰期的分子可以选自以下各项：
来自细胞外基质的蛋白质：例如，胶原蛋白，层粘连蛋白，整联蛋白和纤连蛋白。胶原蛋白是细胞外基质的主要蛋白质。目前已知大约15种胶原蛋白分子类型，存在于身体的不同部分中，例如，I型胶原蛋白(占身体胶原蛋白的90％)存在于骨骼，皮肤，腱，韧带，角膜，内脏中，或型II胶原蛋白存在于软骨，无脊椎动物盘窝，脊索，眼睛的玻璃体液中；
存在于血液中的蛋白质，其包括血浆蛋白质，诸如纤维蛋白，α-2巨球蛋白，血清清蛋白，纤维蛋白原A，纤维蛋白原B，血清淀粉蛋白A，七球蛋白，抑制蛋白，泛蛋白，子宫珠蛋白和β-2微球蛋白；
酶和抑制剂，诸如纤维蛋白溶酶原，溶菌酶，半胱氨酸蛋白酶抑制剂C，α-1抗胰岛素和胰腺胰岛素抑制剂。纤维蛋白溶酶原是胰岛素样丝氨酸蛋白酶纤维蛋白溶酶的非活性前体。其常见于经血流而循环。当纤维蛋白溶酶原变成有活性的且转变为纤维蛋白溶酶原时，其展开有效的酶结构域，该结构域溶解使血液细胞凝结成块的纤维蛋白原。将其称为纤维蛋白溶解。
免疫系统蛋白质，诸如IgE，IgG，IgM。
转运蛋白，诸如视黄酮结合蛋白，α-1微球蛋白。
防卫素，诸如β-防卫素1，嗜中性防卫素1，2和3。
存在于血脑屏障处或神经组织中的蛋白质，诸如黑皮质素受体，髓磷脂，维生素C转运蛋白。
转铁蛋白受体特异性配体-神经药剂融合蛋白(见US 5977307)；
脑毛细血管内皮细胞受体，转铁蛋白，转铁蛋白受体，胰岛素，胰岛素样生长因子1(IGF 1)受体，胰岛素样生长因子2(IGF 2)受体，胰岛素受体。
位于肾的蛋白质，诸如多囊蛋白，类型IV胶原蛋白，有机阴离子转运蛋白KI，Heymann抗原，
位于肝的蛋白质，例如醇脱氢酶，G250。
血液凝结因子X，α1抗胰岛素，HNF1α。
位于肺的蛋白质，诸如分泌性成分(结合IgA)。
位于心脏的蛋白质，例如HSP27。其与膨胀心肌症有关。
位于皮肤的蛋白质，例如角蛋白。
骨骼特异性蛋白质，诸如骨形态发生蛋白(BMP)，其为表现成骨活性的转化生长因子β超家族的子集。实例包括BMP-2，-4，-5，-6，-7(也称为成骨蛋白(OP-1)和-8(OP-2))。
肿瘤特异性蛋白质，包括人滋养层抗原，herceptin受体，雌激素受体，组织蛋白酶，例如组织蛋白酶B(存在于肝和脾中)。
疾病特异性蛋白质，诸如仅在活性T细胞上表达的抗原：包括LAG-3(淋巴细胞活性基因)，护骨蛋白配体(OPGL)，OX40(TNF受体家族成员，表达于活性T细胞和仅共刺激T细胞分子上，已知所述活性T细胞和仅共刺激T细胞分子在人类T细胞白血病病毒类型I(HTLV-I)生成细胞中受到特异性上调)；金属蛋白酶(与关节炎/癌症有关)，包括CG6512果蝇，人截瘫蛋白，人FtsH，人AFG3L2，鼠科ftsH；血管生长因子，包括酸性成纤维细胞生长因子(FGF-1)，基本成纤维细胞生长因子(FGF-2)，脉管内皮生长因子/脉管渗透因子(VEGF/VPF)，转化生长因子-a(TGF a)，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，血管生成素，白细胞介素-3(IL-3)，白细胞介素-8(IL-8)，血小板衍生的内皮生长因子(PD-ECGF)，胎盘生长因子(P1GF)，中期因子血小板衍生的生长因子-BB(PDGF)，CXXXC趋化分子(fractalkine)。
应激蛋白(热休克蛋白)：HSP通常存在于细胞内。当它们存在于细胞外时，是细胞死亡并溢出其内容物的指示。该非程序性的细胞死亡(坏死)仅出现在作为外伤，疾病或伤害的结果时，并且因此在体内，细胞外HSP触发来自免疫系统的与感染和疾病作斗争的响应。可以将与细胞外HSP结合的双重特异性定位于疾病位点。
在Fc转运中涉及的蛋白质：Brambell受体(也称为FcRB)。该Fc受体具有两种功能，这两种功能均潜在地有效用于递送。所述功能是：IgG经过胎盘从母亲向子女的传输，和防止IgG降解从而延长IgG的血清半衰期。认为受体从内体中再循环使用IgG。
可以将按照本发明的多肽设计为在不需要体内半衰期的任何增加或增长体内半衰期的条件下特异于以上靶标。例如，按照本发明的多肽可以特异于前述组织特异性靶标，从而在不考虑半衰期的任何增加的条件下，组织特异性靶向所述多肽，尽管这可能引起半衰期的增加。而且，当所述多肽靶向肾或肝时，其可以将多肽重新定向到备选的体内清除途径中(例如，可将所述多肽从肝清除定向到肾清除中)。
本发明的另一个实施方案是如本文所述的抗EGFR或抗IGF-IR多肽，其中一个或多个纳米抗体是人源化的。所述人源化纳米抗体可以是抗EGFR纳米抗体，抗IGF-IR纳米抗体，抗血清球蛋白，按照本发明有效的其他纳米抗体，或它们的组合。
本发明的一个实施方案是这样的抗EGFR或抗IGF-IR多肽，其包括一个或多个人源化的抗EGFR或抗IGF-IR纳米抗体和一个或多个人源化的抗人血清球蛋白纳米抗体。
通过人源化意指突变的，由此随着向人类受试者的施药，潜在免疫原性很小或不存在。按照本发明，对多肽进行人源化可以包括这样的步骤，所述步骤是：将一个或多个非人免疫球蛋白氨基酸取代为它们的人类负体，该负体是在人类共有序列或人类种系基因序列中存在，无缺乏其典型特征的多肽，即人源化不显著地影响由此产生的多肽的抗原结合能力。
按照本发明的一个方面，将人源化纳米抗体定义为与人构架区具有至少50％同源性(例如，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，98％，100％)的纳米抗体。
本发明人决定了纳米抗体的氨基酸残基，其在不削减天然亲和力的条件下可得到修饰，从而降低其关于异源物种的免疫原性。
本发明人还发现纳米抗体多肽的人源化作用需要在不显著损失结合和/或抑制活性的条件下，在单多肽链中仅引入和诱变有限数目氨基酸。这与scFv，Fab，(Fab)2和IgG的人源化作用相反，scFv，Fab，(Fab)2和IgG的人源化作用需要在两条链，即轻链和重链中引入氨基酸改变，并保持这两条链的装配。
本发明人惊奇地发现包括高度同源于人种系序列的构架序列如DP29，DP47和DP51的本发明纳米抗体是高效的。它们天然存在于一些物种，如骆驼科的那些物种。所述纳米抗体的特征在于它们在位置45处携带来自由下列各项组成的组的氨基酸：甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，甲硫氨酸，丝氨酸，苏氨酸，天冬酰胺，或谷酰胺，诸如例如，L45。另外，按照Kabat编号，它们可以在位置103处携带人物种“J”色氨酸。这类的骆驼科VHH或其他携带该类一个或多个构架序列的突变纳米抗体属于本发明的范围。
同样地，属于上述种类的纳米抗体或携带该类突变的纳米抗体表现出与人VH构架区的高度氨基酸序列同源性，并且可以将包括这些的本发明多肽在不预期获得不希望的免疫响应和无人源化的负担的条件下，直接施用于人类。本发明还涉及能够编码所述多肽的核酸。
通过这样的方法可以实现人源化技术，所述方法包括将任意的纳米抗体残基单独地或组合地取代为种系VH基因(如DP 47，DP 29和DP 51)的相应构架区1，2和3(FR1，FR2和FR3)残基。
按照本发明的一个方面，纳米抗体的人源化是通过将所述纳米抗体中一个或多个位于下述位置处的氨基酸替换为来自种系VH基因构架区的相应氨基酸而实现的，其中的编号按照Kabat编号：
按照本发明的一个方面，纳米抗体未替换的构架区保持与原始的纳米抗体构架区一样。
按照本发明的一个方面，按照以上方案替换FR1，FR2和FR3的一个或多个中的残基。
按照本发明的一个方面，按照以上方案替换FR1中的至少1，2，3或全部残基。
按照本发明的一个方面，按照以上方案替换FR2中的至少1，2，3或全部残基。
按照本发明的一个方面，按照以上方案替换FR3中的至少1，2，3，4，5，6或全部残基。
按照本发明的一个方面，按照以上方案替换FR4中的至少1，2，3或全部残基。
在本发明的另一个实施方案中，通过将纳米抗体CDR区域的全部或部分移植到种系人VH构架支架上而获得人源化的纳米抗体。
按照本发明的一个方面，通过将所述纳米抗体的CDR1，CDR2和CDR3中的一个或多个替换到种系人VH构架支架上而实现纳米抗体的人源化作用。合适构架支架的实例包括DP 47，DP 29和DP 51的那些。
按照上述人源化方法获得本发明纳米抗体是本发明的一部分。
可以对针对EGFR或IGF-IR的常规四链抗体进行骆驼化，即突变以便除去轻链，并且用骆驼科特异性的残基替换一个或多个氨基酸残基(参见例如，WO 94/04678，将其引入本文作为参考)。所述位置优先地存在于VH-VL的分界面处和所谓的骆驼科标志残基处，包括位置37，44，45，47，103和108。所述骆驼化的抗体是按照本发明的纳米抗体。其中至少一个纳米抗体是VH的多肽是按照本发明的纳米抗体，所述VH中的一个或多个氨基酸残基被部分地替换为纳米抗体的特异性序列或氨基酸残基。
如上所述的纳米抗体可以利用本领域已知的方法结合起来形成本文所公开的任何包括超过一个纳米抗体的抗EGFR或抗IGF-IR多肽。例如，它们可以通过由氨基酸残基与有机衍生化试剂诸如Blattler等(Biochemistry24，1517-1524；EP294703)所述的试剂反应所引起的化学交联而融合。备选地，纳米抗体可以在DNA水平遗传融合，即形成编码完整抗EGFR或抗IGF-IR多肽的多核苷酸，其中所述抗EGFR或抗IGF-IR多肽包括一个或多个抗EGFR或抗IGF-IR纳米抗体和任选地一个或多个抗血清蛋白纳米抗体。产生二价或多价纳米抗体的方法公开在PCT专利申请WO 96/34103中。
按照本发明的另一个方面，纳米抗体可以直接或通过连接体序列彼此连接。用常规抗体很难产生该构建体，其原因在于该巨大亚单位的空间位阻，会丧失或极大地减少其功能性。如对本发明的纳米抗体所观察到地，与单价抗EGFR或抗IGF-IR多肽相比，当它们连接在一起时，功能性明显增高。
按照本发明的一个方面，纳米抗体在不使用连接体的条件下彼此直接相连。与其中需要连接体序列来保持两个亚单位中结合活性的连接的巨大常规抗体相反，本发明的多肽可以直接相连，从而避免连接体序列的潜在问题，诸如施用于人类受试者时的抗原性，或连接体序列引起亚单位解离的不稳定性。
按照本发明的另一个方面，纳米抗体通过肽连接体序列彼此相连。所述连接体序列可以是天然存在的序列或非天然存在的序列。认为该连接体序列在施用了抗EGFR或抗IGF-IR多肽的受试者体内无免疫原性。连接体序列在可以在抵抗蛋白水解降解的同时，对多价抗EGFR或抗IGF-IR多肽提供充分的灵活度。连接体序列的非限制性实例是如WO 96/34103中所述的从纳米抗体的铰链区衍生的序列。另一个实例是连接体序列3a(Ala-Ala-Ala)。
在待审批的国际申请WO 06/040153中列出了由本发明人构建的用于融合双特异性和二价抗EGFR或抗IGF-IR多肽的备选连接体序列。一个连接体序列是美洲驼上方长铰链区。其他连接体是不同长度的Gly/Ser连接体。对于本领域技术人员显而易见地是，所述序列连接体可以用于融合本发明的任意两个单价序列。
按照本发明的一个方面，抗EGFR或抗IGF-IR多肽可以是全长抗EGFR或抗IGF-IR多肽的同源序列。按照本发明的另一个方面，抗EGFR或抗IGF-IR多肽可以是全长抗EGFR或抗IGF-IR多肽的功能部分。按照本发明的另一个方面，抗EGFR或抗IGF-IR多肽可以是全长抗EGFR或抗IGF-IR多肽同源序列的功能部分。按照本发明的一个方面，抗EGFR或抗IGF-IR多肽可以包括抗EGFR或抗IGF-IR多肽序列。
按照本发明的一个方面，用于形成抗EGFR或抗IGF-IR多肽的纳米抗体可以是完整的纳米抗体或其同源序列。按照本发明的另一个方面，用于形成抗EGFR或抗IGF-IR多肽的纳米抗体可以是完整纳米抗体的功能部分。按照本发明的另一个方面，用于形成抗EGFR或抗IGF-IR多肽的纳米抗体可以是完整纳米抗体的同源序列。按照本发明的另一个方面，用于形成抗EGFR或抗IGF-IR多肽的纳米抗体可以是完整纳米抗体同源序列的功能部分。
用于本文时，本发明的同源序列可以包括添加，缺失或替换一个或多个氨基酸，其基本不改变本发明多肽的功能特征。缺失或替换的氨基酸数目优选地多达1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69或70个氨基酸。
按照本发明的同源序列可以是通过添加，缺失或替换氨基酸而修饰的抗EGFR或抗IGF-IR多肽，与未修饰的多肽相比，该修饰基本不改变其功能特征。
按照本发明的同源序列可以是存在于其他骆驼科物种，诸如例如骆驼，单峰骆驼，美洲驼，羊驼，驮马等中的序列。
当同源序列表示序列同一性时，它意味着表现出与母体序列高序列同一性(超过70％，75％，80％，85％，90％，95％或98％序列同一性)的序列，且优选地，其特征为与母体序列相似的特性，例如结合于相同的靶标。
按照本发明的同源核苷酸序列可以指超过50，100，200，300，400，500，600，800或1000个核苷酸的核苷酸序列，其能够在严格的杂交条件下，与能够编码母体序列的核苷酸序列的反向补体杂交(诸如由Sambrook等，分子克隆(Molecular Cloning)，实验室手册(Laboratory Manuel)，冷泉港实验室出版社(Cold Spring，Harbor Laboratory press)，纽约(New York)中所述的那些)。
用于本文时，功能部分指纳米抗体这样的序列，所述序列具有足够的尺寸，以便以1×10-6M或更高的亲和力维持目的的相互作用。
备选地，功能部分包括完整氨基酸序列的部分缺失，并仍然维持与靶标结合和相互作用所必需的结合位点及蛋白质结构域。
备选地，本发明纳米抗体的功能部分包括完整氨基酸序列的部分缺失，并仍然维持与靶标结合和相互作用所必需的结合位点及蛋白质结构域。
备选地，功能部分是这样的多肽，其包括完整氨基酸序列的部分缺失，并仍然维持用于抑制EGFR与另一个EGFR结合所必需的结合位点及蛋白质结构域。
备选地，功能部分是这样的多肽，其包括完整氨基酸序列的部分缺失，并仍然维持与EGFR结合和相互作用所必需的结合位点及蛋白质结构域。
备选地，功能部分包括多肽完整氨基酸序列的部分缺失，且仍然维持与针对其而产生的抗原结合和相互作用所必需的结合位点及蛋白质结构域。其包括，但不仅限于纳米抗体。
用于本文时，功能部分比100％的完整序列短(例如，99％，90％，80％，70％，60％，50％，40％，30％，20％，10％，5％，1％，等)，但包括5个或更多氨基酸或15个或更多核苷酸。
本发明的同源序列可以包括人源化的抗EGFR或抗IGF-IR多肽。新型纳米抗体的抗体人源化将进一步减少人类个体随着施药而引起不希望的免疫原性反应的可能性。
纳米抗体的其他实例包括“功能片段”，其意指在抗原结合中具有功能的片段(如WO 03/035694中所述)。所述片段包括活性抗原结合区域。所述片段可以是如上所述的功能纳米抗体的片段，行为如同功能纳米抗体的分子的片段，功能化的抗体的片段，或从常规四链抗体衍生而来的纳米抗体的片段，所述衍生而来的纳米抗体是通过用骆驼科特异性残基替换一个或多个氨基酸残基而被修饰的。
对于重链抗体，纳米抗体，VH结构域或其片段，“功能的”意指与其体内结合相比，相同物种保留对其表位的显著的结合(解离常数处于微摩尔范围或更佳)，并且其表现出无或有限的聚集(在1mg/ml以上可溶且无聚集)，从而容许将抗体用作粘合剂。
对于重链抗体，纳米抗体或其片段，“功能化的”意指将功能赋予所述重链抗体，纳米抗体或其片段。
用于功能片段的含义中时，“---的片段”意指对应于超过该序列95％，超过该序列90％，超过该序列85％，超过该序列80％，超过该序列75％，超过该序列70％，超过该序列65％，超过该序列60％，超过该序列55％，超过该序列50％的部分。
按照本发明，靶标是EGFR，IGF-IR或血清蛋白质中任一项。所述靶标是哺乳动物，且从诸如兔，山羊，小鼠，大鼠，母牛，小牛，骆驼，美洲驼，猴子，驴，豚鼠，鸡，绵羊，狗，猫，马，和优选地人的物种衍生而来。
本文中所提及的靶标，诸如EGFR，IGF-IR和血清蛋白(例如，血清清蛋白，血清免疫球蛋白，甲状腺素结合蛋白，转铁蛋白，纤维蛋白原)可以是所述靶标的片段。因此靶标还是所述靶标的片段，能够激发免疫应答。靶标还是所述靶标的片段，其能够与针对全长靶标而产生的纳米抗体结合。
针对靶标的纳米抗体优选地意指能够以高于10-6M的亲和力与其靶标结合的纳米抗体。
将EGFR理解为全长EGFR或EGFR的任意片段。还预期本发明的纳米抗体和多肽通常会与EGFR全部天然存在或合成的类似物，变体，突变体，等位基因，部分或片段，或至少与含有一个或多个抗原决定簇或表位的那些EGFR类似物，变体，突变体，等位基因，部分和片段结合，所述抗原决定簇或表位与本发明纳米抗体和多肽在EGFR中(例如，在野生型EGFR中)结合的抗原决定簇或表位基本相同。
将IGF-IR(也称为IGF-1R)理解为全长IGF-IR或IGF-IR的任意片段。还预期本发明的纳米抗体和多肽通常会与IGF-IR全部天然存在或合成的类似物，变体，突变体，等位基因，部分或片段，或至少与含有一个或多个抗原决定簇或表位的那些IGF-IR类似物，变体，突变体，等位基因，部分和片段结合，所述抗原决定簇或表位与本发明纳米抗体和多肽在IGF-IR中(例如，在野生型IGF-IR中)结合的抗原决定簇或表位基本相同。
用于本文的片段比100％的序列短(例如，99％，90％，80％，70％，60％，50％，40％，30％，20％，10％等)，但包括5，6，7，8，9，10，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25或更多个氨基酸。片段优选地具有足够的长度，以便以1×10-6M或更高的亲和力维持目的的相互作用。
用于本文的片段指一个或多个氨基酸的任选的插入，缺失和替换，其基本不改变该靶标与针对野生型靶标而产生的纳米抗体结合的能力。氨基酸插入，缺失或替换的数目优选地多达1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69或70个氨基酸。
本发明的一个实施方案涉及包含至少一个纳米抗体的多肽，其中在基本不改变抗原结合能力的条件下替换了一个或多个氨基酸残基。
本文所提及的靶标，诸如EGFR，IGF-IR和血清蛋白可以是存在于任意物种中的序列，所述物种包括，但不仅限于的小鼠，人，骆驼，美洲驼，鲨鱼，河豚，山羊，兔，牛。
靶标可以是完整靶标的同源序列。靶标可以是完整靶标同源序列的片段。
技术人员承认可以修饰本发明的抗EGFR或抗IGF-IR多肽，且该修饰属于本发明的范围。例如，可以将该多肽用作药物载体，在该情形中，它们可以与治疗活性试剂融合，或者它们的溶解性特性可以通过与离子/双极性基团的融合而改变，或者可以通过与适当成像标记的融合而将它们用在成像中，或者它们可以包括修饰的氨基酸等。还可以将它们制备成盐。所述基本维持与EGFR和/或IGF-IR结合的修饰属于本发明的范围。
按照本发明的一个方面，抗EGFR或抗IGF-IR多肽可以用于口服施药。基于常规抗体的治疗法具有作为药物的显著潜力，原因在于它们具有对其靶标的极好的特异性和低内在毒性，然而，它们具有一个重要的缺陷：它们相当无稳定，且对由蛋白酶引起的分解很敏感。这意味着常规抗体药物不能通过口服、舌下，局部，鼻，阴道，直肠或通过吸入施用，原因在于它们不能抵抗这些位点处的低pH，这些位点处和血液中蛋白酶的作用，和/或由于它们的大尺寸。必须通过注射(静脉内，皮下，等)来施用它们，从而克服这些问题中的一些。通过注射的施药需要专家的训练，以便正确和安全地使用皮下注射器或针头。还需要无菌的设备，液态剂型的治疗多肽，瓶装的无菌稳定形式的所述多肽，和受试者中适于针头进入的位点。此外，受试者在注射前或过程中普遍经历生理和心理上的压力。不过，本发明的多肽可以用于通过注射的施用。
本发明的一个方面通过提供本发明的抗EGFR或抗IGF-IR多肽，克服了现有技术的这些问题。所述多肽充分小，有抵抗力并且在基本不损失活性的条件下稳定地通过口服、舌下、局部、鼻、阴道、直肠或通过吸入递送。避免了注射需要的本发明多肽不仅节省了费用/时间，并且还更加方便，和使受试者更加舒适。
本发明的一个实施方案是本文所公开的抗EGFR或抗IGF-IR多肽，其用于治疗，预防和/或减轻疾病症状，所述疾病易受由分别控制EGFR或IGF-IR的物质的调节，所述物质能够穿过胃环境而不被失活。
如本领域技术人员所知，一旦拥有所述多肽，可以应用制剂技术在正确的位置(在胃中，在结肠中，等)释放最大量的多肽。这种递送方法对于治疗，预防和/或减轻靶标位于内脏系统中的疾病症状很重要。
本发明的一个方面是用于通过向受试者口服施用本文所公开的抗EGFR或抗IGF-IR多肽，治疗、预防和/或减轻疾病症状的方法，所述疾病易受由分别控制EGFR或IGF-IR的物质的调节，所述物质能够穿过胃环境而不被失活。
本发明的另一个实施方案是如本发明所公开的抗EGFR或抗IGF-IR多肽用于制备治疗、预防和/或减轻疾病症状药物的用途，所述疾病易受由分别控制EGFR或IGF-IR的物质的调节，所述物质能够穿过胃环境而不被失活。
本发明的一个方面是通过向受试者口服施用本文所公开的抗EGFR或抗IGF-IR多肽，将分别控制EGFR或IGF-IR的物质，在不被失活的条件下，递送到内脏系统中的方法。
本发明的一个方面是通过向受试者口服施用本文所公开的抗EGFR或抗IGF-IR多肽，将分别控制EGFR或IGF-IR的物质递送到受试者血流并且所述物种不被失活的方法。
本发明的另一个实施方案是如本文所公开的纳米抗体或多肽，其用于治疗、预防和/或减轻疾病的症状，所述疾病易受本发明纳米抗体或多肽的调节，该纳米抗体或多肽被递送到阴道和/或直肠道。
疾病的实例是任何导致炎症，包括但不仅限于类风湿性关节炎，局限性回肠炎，溃疡性结肠炎，炎症肠综合征和多发性硬化。在非限制性实例中，按照本发明的制剂包括如本文所公开的纳米抗体或多肽，该制剂为凝胶、霜剂、栓剂、膜剂的形式或者为海绵或者阴道环的形式，该制剂随时间缓慢释放活性成分(这些制剂在EP 707473、EP 684814、US 5629001中描述)。
本发明的一方面是通过将本文中公开的纳米抗体或多肽经阴道和/或直肠施用于受试者以治疗、预防和/或减轻易受本文中公开的纳米抗体或多肽调节的疾病的症状的方法，该纳米抗体或多肽被递送到阴道和/或直肠道。
本发明的另一实施方案是本文中公开的纳米抗体或多肽的用途，用于制备治疗、预防和/或减轻易受本文中公开的纳米抗体或多肽调节的疾病的症状的药物，该纳米抗体或多肽被递送到阴道和/或直肠道。
本发明的一方面是通过将本文中公开的纳米抗体或多肽经阴道和/或直肠道施用于受试者以将本文中公开的纳米抗体或多肽递送到阴道和/或直肠道并且所述物质不被失活的方法。
本发明的一方面是通过将本文中公开的纳米抗体或多肽经阴道和/或直肠道施用于受试者以将本文中公开的纳米抗体或多肽递送所述受试者的血流并且所述物质不被失活的方法。
本发明的另一实施方案是本文中公开的抗EGFR或抗IGF-IR多肽，其用于治疗、预防和/或减轻易受分别控制EGFR或IGF-IR的物质调节的疾病的症状，该物质被递送到鼻、上呼吸道和/或肺。
在非限制性实例中，根据本发明的制剂含有本文中公开的抗EGFR或抗IGF-IR多肽，该制剂为鼻喷雾剂(例如，气溶胶)或者吸入器的形式。因为该多肽小，所以其可以比治疗性IgG分子更有效地到达其靶标。
本发明的一方面是通过嘴或鼻吸入将本文中公开的抗EGFR或抗IGF-IR多肽施用于受试者以治疗、预防和/或减轻易受分别控制EGFR或IGF-IR的物质调节的疾病的症状，该物质被递送到上呼吸道和肺。
本发明的另一实施方案是本文中公开的抗EGFR或抗IGF-IR多肽的用途，用于制备治疗、预防和/或减轻易受分别控制EGFR或IGF-IR的物质调节的疾病的症状的药物，该物质被递送到鼻、上呼吸道和/或肺，并且所述多肽未被失活。
本发明的一方面是通过将本文中公开的抗EGFR或抗IGF-IR多肽施用于受试者的鼻、上呼吸道和/或肺，将分别控制EGFR或IGF-IR的物质递送到鼻、上呼吸道和肺而不失活的方法。
本发明的一方面是通过将本文中公开的抗EGFR或抗IGF-IR多肽施用于受试者的鼻、上呼吸道和/或肺，将分别控制EGFR或IGF-IR的物质递送到受试者的血流而不失活的方法。
本发明的一个实施方案是本文中公开的抗EGFR或抗IGF-IR多肽，其用于治疗、预防和/或减轻易受分别控制EGFR或IGF-IR的物质调节的疾病的症状，该物质能够有效穿过舌下的组织。本文中公开的所述多肽的制剂，例如，片剂、喷雾剂、滴剂被置于舌下并通过粘膜吸收到舌下的毛细管网络中。
本发明的一方面是通过将本文中公开的抗EGFR或抗IGF-IR多肽舌下施用于受试者，治疗、预防和/或减轻易受分别控制EGFR或IGF-IR的物质调节的疾病的症状的方法，该物质能够有效穿过舌下的组织。
本发明的另一个实施方案是本文中公开的抗EGFR或抗IGF-IR多肽的用途，用于制备治疗、预防和/或减轻易受分别控制EGFR或IGF-IR的物质调节的疾病的症状的药物，该物质能够穿过舌下的组织。
本发明的一方面是通过将本文中公开的抗EGFR或抗IGF-IR多肽舌下施用于受试者将分别控制EGFR或IGF-IR的物质递送到舌下的组织而不失活的方法。
本发明的一方面是通过将本文中公开的抗EGFR或抗IGF-IR多肽经口施用于受试者而将分别控制EGFR或IGF-IR的物质递送到受试者的血流而不失活的方法。
本发明的另一个实施方案是本文中公开的纳米抗体或多肽在治疗、预防和/或减轻易受本文中公开的纳米抗体或多肽调节的疾病的症状中的应用，该纳米抗体或多肽能够有效穿过皮肤。
疾病的实例是导致炎症的任一疾病，包括，但不限于，类风湿性关节炎、银屑病、局限性回肠炎、溃疡性结肠炎、炎症肠综合征和多发性硬化。所述多肽构建体的制剂，例如，霜剂、膜剂、喷雾剂、滴剂、贴剂被置于皮肤上并穿过皮肤。
本发明的一方面是通过将本文中公开的纳米抗体或多肽局部施用于受试者，治疗、预防和/或减轻易受本文中公开的纳米抗体或多肽调节的疾病的症状的方法，该纳米抗体或多肽能够有效穿过皮肤。
本发明的另一个实施方案是本文中公开的纳米抗体或多肽的用途，用于制备治疗、预防和/或减轻易受本文中公开的纳米抗体或多肽调节的疾病的症状的药物，该纳米抗体或多肽能够有效穿过皮肤。
本发明的一方面是通过将本文中公开的纳米抗体或多肽局部施用于受试者将本文中公开的纳米抗体或多肽递送到皮肤而不失活的方法。
本发明的一方面是通过将本文中公开的纳米抗体或多肽局部施用于受试者而将本文中公开的纳米抗体或多肽递送到受试者的血流的方法。
本发明的一个实施方案是本文中公开的抗EGFR或抗IGF-IR多肽，其用于治疗、预防和/或减轻易受分别控制EGFR或IGF-IR的物质调节的疾病的症状，该调节物质被递送到肠粘膜，其中所述疾病增加肠粘膜的透性。文中公开的抗EGFR或抗IGF-IR多肽因为它们的小尺寸，所以可以穿过肠粘膜并更有效地到达患有疾病的受试者的血流，所述疾病导致肠粘膜的透性增加。
本发明的一方面是通过对受试者经口施用本文中公开的抗EGFR或抗IGF-IR多肽治疗、预防和/或减轻疾病的症状的方法，所述疾病易受被递送到肠粘膜的分别控制EGFR或IGF-IR的物质调节，其中所述疾病增加了肠粘膜的透性。
该方法甚至可以被本发明的额外方面——使用主动运输载体——进一步增强。在本发明的该方面，纳米抗体与载体融合，该载体增强了穿过肠壁进入血流的传递。在非限制性实例中，该“载体”是另一纳米抗体，其融合到治疗纳米抗体。利用本领域中公知的方法制备这种融合多肽。该“载体”纳米抗体特异结合到肠壁上的受体，该结合诱导穿过肠壁的主动传递。
本发明的另一实施方案是使用本文中公开的抗EGFR或抗IGF-IR多肽制备用于治疗、预防和/或减轻疾病的症状的药物，该疾病易受递送到肠粘膜的分别控制EGFR或IGF-IR的物质调节，其中所述疾病增加了肠粘膜的通透性。
本发明的一方面是通过对受试者经口施用本发明的抗EGFR或抗IGF-IR多肽将分别控制EGFR或IGF-IR的物质递送到肠粘膜而不失活的方法。
本发明的一方面是通过对受试者经口施用本发明的抗EGFR或抗IGF-IR多肽将分别控制EGFR或IGF-IR的物质递送到受试者的血流而不失活的方法。该方法甚至可以被本发明的额外方面——使用主动运输载体——进一步增强。在本发明的该方面，本文中公开的抗EGFR或抗IGF-IR多肽与载体融合，该载体增强了穿过肠壁进入血流的传递。在非限制性实例中，该“载体”是与所述多肽融合的纳米抗体。利用本领域中公知的方法制备这种融合多肽。该“载体”纳米抗体特异结合到肠壁上的受体，该结合诱导穿过肠壁的主动传递。
在本发明的另一实施方案，本文公开的抗EGFR或抗IGF-IR多肽还含有载体纳米抗体(例如，纳米抗体)，其作为主动运输载体将所述多肽通过肺腔运输到血液中。
抗EGFR或抗IGF-IR多肽可以进一步包括与粘膜表面(支气管上皮细胞)上的受体特异结合的载体，导致该多肽从肺腔向血液的主动运输。该载体纳米抗体可以融合到多肽。这种融合多肽可以利用本领域中公知的方法制备并且在本文中描述。“载体”纳米抗体特异结合粘膜表面上的受体，该结合诱导穿过该表面的主动传递。
本发明的另一方面是确定当经鼻施用时哪些纳米抗体(例如纳米抗体)被主动运输到血流中的方法。类似地，可以将首次用于实验的或者免疫纳米抗体噬菌体文库经鼻施用，并且施用后不同的时间点后，可以分离血液或器官以拯救已经被主动运输到血流中的噬菌体。从肺腔向血流的主动运输的受体的一个非限制性实例是Fc受体N(FcRn)。本发明的一方面包括通过该方法鉴定的纳米抗体。然后这种纳米抗体可以作为载体纳米抗体在经鼻施用时将治疗纳米抗体递送到血流中的相应靶标中。
本发明的多肽可以作为下列用法使用：作为与常规化学疗法和放射疗法组合反复剂量施药；作为通过立体定位手术的腔内施药，诸如治疗脑癌；或作为诊断识别肿瘤过表达EGFR患者。
本发明的一个实施方案是本文公开的抗EGFR或抗IGF-IR多肽，或者能够编码所述多肽的核酸，它们用于治疗、预防和/或减轻与炎症过程或癌症有关的疾病的症状。
本发明的另一个实施方案是本文公开的抗IGF-IR多肽，或者能够编码所述多肽的核酸，它们用于治疗、预防和/或减轻与癌症有关的疾病的症状。
本发明的另一实施方案是本文公开的抗EGFR或抗IGF-IR多肽、或者编码所述多肽的核酸的用途，用于制备治疗与炎症过程或癌症有关的疾病的药物。
炎症过程中涉及EGFR，且阻断EGFR作用可以具有抗炎症作用，这在某些疾病状态，诸如例如炎症关节炎或银屑病中是非常理想的。此外，阻断EGFR和IGF-IR可以抑制人肿瘤的生长，因此本发明的抗EGFR或抗IGF-IR多肽可以对肿瘤具有抑制细胞或细胞毒性作用。我们的实施例证明按照本发明的与EGFR结合并且阻断配体与EGFR结合的VHHs防止受体的(异源)二聚作用和/或诱导程序性细胞死亡。
本发明的多肽和方法适用于治疗和诊断上皮癌，诸如肺癌、肝癌、中枢神经系统癌，骨骼癌、血液癌和淋巴系统癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、直肠癌、膀胱癌、头和颈部癌、卵巢癌、睾丸癌、胰腺癌、睾丸癌、肾癌和鳞状细胞癌。该人类癌症列表是代表性而非包括的。
本发明的抗EGFR或抗IGF-IR多肽和方法还适用于其他与EGFR和/或IGF-IR(过表达)有关的疾病。所述疾病和病症的实例对技术人员是清楚的。
本发明提供包括抗EGFR或抗IGF-IR多肽治疗组合物，所述抗EGFR或抗IGF-IR多肽单独通过所述VHH分别与所述肿瘤细胞的EGFR或IGF-IR结合，或同时通过与抗肿瘤或化学治疗试剂的组合，抑制或杀死人类肿瘤细胞。抗肿瘤或化学治疗试剂，诸如阿霉素和顺铂，是本领域已知的。含有抗EGFR和抗IGF-IR单结构域抗体的治疗组合物也属于本发明的范围。
本发明还提供利用本文公开的抗EGFR或抗IGF-IR多肽检测相应条件的诊断方法。诊断方法在本领域中众所周知，且包括筛选测定和成像技术(以下进一步讨论)。
本发明的另一个实施方案是诊断特征为EGFR异常信号转导的疾病的方法，其包括：
(a)将样品与如上描述的抗EGFR或抗IGF-IR多肽接触，
(b)检测所述多肽与所述样品的结合，和
(c)将步骤(b)中所检测到的结合与标准比较，其中相对于所述样品的结合中的差异可以诊断特征为EGFR异常信号转导的疾病。
本发明的另一个实施方案是诊断特征为存在IGF-IR的疾病的方法，其包括：
(a)将样品与如上描述的抗IGF-IR多肽接触，
(b)检测所述多肽与所述样品的结合，和
(c)将步骤(b)中所检测到的结合与标准比较，其中相对于所述样品的结合中的差异可以诊断特征为存在IGF-IR的疾病。
在本发明的一方面中，可以使用本文中公开的抗EGFR或抗IGF-IR多肽，以便筛选调节该多肽与EGFR或IGF-IR分别结合的试剂。当在测量结合或者仅所述多肽置换的测定中鉴定时，可以将试剂进行功能试验以确定它们是否在体内调节EGFR或IGF-IR的作用。
通常，“治疗有效量”、“治疗有效剂量”和“有效量”指实现所希望的一个或多个结果(调节EGFR或IGF-IR结合；治疗或防止癌症或炎症)所需的量。本领域技术人员将认识到潜能和因此“有效量”将随着用于本发明中调节EGFR或IGF-IR结合的多种化合物而变。本领域技术人员将容易评估该化合物的潜能。
如文中所用的，术语“化合物”指本发明的抗EGFR或抗IGF-IR纳米抗体或多肽，或者能够编码所述多肽的核酸，或者根据文中描述的筛选方法鉴定的试剂或者含有一种或多种衍生氨基酸的所述多肽。
“药用”指不是生物学上的材料或者不是不希望的材料，即，该材料可以与该化合物一起施用于个体而不导致任何不希望的生物学效应或不与药物组合物中所含有的其他组分中的任一种以有害的方式相互作用。
如本文中公开的人样VHH种类多肽用于治疗或者预防受试者中的病症并且包括施用治疗有效量的化合物或组合物。
本发明的多肽用于治疗或预防受试者中与癌症、类风湿性关节炎和银屑病有关的病症并且包括施用治疗有效量的结合EGFR或IGF-IR或全部二者的化合物或组合物。
本文中公开的抗EGFR或抗IGF-IR多肽用于治疗或者预防受试者中与癌症、类风湿性关节炎和银屑病有关的病症并且包括联合另一种化合物如，例如，阿霉素施用治疗有效量的化合物。
本发明不限于施用含有本发明的单一化合物的制剂。在本发明范围内提供联合治疗，其中对需要该治疗的患者施用制剂，该制剂含有一种以上的本发明化合物。
EGFR或/和IGF-IR介导的病症包括，但不限于癌症、类风湿性关节炎和银屑病。
用于本发明的化合物可配制成药物组合物并且以适于所选施用途径的各种形式施用于哺乳动物宿主，诸如人类患者或者家畜动物，该施用途径即经口或肠胃外、通过吸入而鼻内、静脉内、肌内、局部或皮下途径。本发明的药物组合物可以包括以下列出的化合物和合适的药物载体。
利用递送的基因治疗方法也可以施用本发明的化合物。见，例如，美国专利号5,399,346，该专利被完整并入作为参考。使用递送的基因治疗方法，用本发明化合物的基因转染的原代细胞还可以另外被组织特异的启动子转染以靶定特定器官、组织、移植物、肿瘤，或者细胞，并且还可以另外被亚细胞定位表达的信号和稳定序列转染。
因此，本发明化合物可以与药学上可接受的载体，诸如惰性稀释剂或者可同化的可食用载体组合全身施用，如经口施用。它们可以被封闭在硬或软壳明胶胶囊中，可被压缩成片剂，或者可以直接掺入患者膳食的食物中。对于经口治疗施用，活性化合物可以与一种或多种赋形剂组合并且以可摄取的片剂、口含片剂、锭剂、胶囊剂、酏剂、悬浮剂、糖浆剂、糯米纸囊剂等的形式使用。这种组合物和制剂将含有至少0.1％活性化合物。当然，组合物和制剂的百分数可以改变并且可便利地为给定单位剂型重量的约2到约60％。这种治疗上有用的组合物中活性化合物的量为将得到有效剂量水平的量。
片剂、锭剂、丸剂、胶囊剂等等还可以含有下面的：结合剂，如黄蓍树胶、阿拉伯树胶、玉米淀粉或者明胶；赋形剂如磷酸二钙；崩解剂如玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸等等；润滑剂如硬脂酸镁；和甜味剂如蔗糖、果糖、乳糖或阿司帕坦或者增香剂如欧薄荷、冬青油，或者樱桃香料。当单位剂型是胶囊剂时，其除了上面类型的物质，还可以含有液态载体，如植物油或者聚乙二醇。可以存在多种其他材料作为包衣或者另外改变固态单位剂型的物理形式。例如，用明胶、蜡、虫胶或者糖等等可以将片剂、丸剂或者胶囊剂包衣。糖浆剂或者酏剂可以含有活性化合物、作为甜味剂的蔗糖或者果糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、染料和香料如樱桃或者桔子香料。当然，用制备任一单位剂型中的任一材料都应该是药学上可接受的并且在用量内实质上无毒。此外，活性化合物可被掺入缓释制剂和装置。
还可以通过灌注或注射，静脉内或者腹膜内地施用活性化合物。可以在水中制备活性化合物或者其盐的溶液，其任选与无毒表面活性剂混合。还可以在甘油、液态聚乙二醇、三醋精，和它们的混合物和油中制备分散剂。在保存和使用的通常条件下，这些制剂含有用于防止微生物生长的防腐剂。
适于注射或灌注的药学剂型可包括含有活性成分的无菌水性溶液或者分散剂或者无菌粉剂，其适于临时制备无菌注射液或者灌注液或分散剂，任选封装在脂质体中。在所有情况中，最终剂型在生产和保存条件下必须是无菌的、流体的和稳定的。液态载体或赋形剂可以是溶剂或者液态分散介质，其含有，例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液态聚乙二醇，等等)、植物油、无毒甘油酯，和它们的适宜的混合物。通过例如，形成脂质体，对于分散剂的情况通过保持所需要的颗粒大小或者通过使用表面活性剂可以保持适当流动性。通过多种抗细菌和抗真菌剂，例如，对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞，等等可以防止微生物的作用。在许多情况中，优选包括等渗剂，例如，糖、缓冲剂或者氯化钠。通过在组合物中使用延迟吸收的试剂，例如，单硬脂酸铝和明胶可以延长可注射组合物的吸收。
将适当溶剂中的所需要的量的活性化合物与上面列举的多种其他成分(如果需要)合并，然后过滤除菌可以制备无菌注射液。对于用于制备无菌注射液的无菌粉剂的情况，优选制备方法是真空干燥和冰冻干燥技术，这些技术产生前面无菌过滤溶液中存在的活性成分加上任何额外的所希望的成分的粉末。
对于局部施用，本化合物可以以纯的形式应用(即，当它们是液体时)。然而，通常希望将它们作为组合物或者制剂，联合皮肤病学上可接受的载体施用于皮肤，这些载体可以是固体或者液体。
可用的固态载体包括细分的固体，如滑石、粘土、微晶纤维素、硅土、矾土，等等。可用的液态载体包括水、羟烷基或二元醇或者水-乙醇/二元醇掺合物，其中本化合物可以任选通过无毒表面活性剂的帮助以有效水平溶解或者分散。可以加入佐剂诸如芳香剂或者额外的抗微生物剂以优化给定用途的性质。所得液态组合物可以从吸收垫应用，用于浸渍绷带和其他包扎用品，或者使用泵型或者气溶胶喷雾器喷到受侵袭的区域。
增稠剂如合成聚合物、脂肪酸、脂肪酸盐和酯、脂肪醇、改性纤维素或者改性矿物材料可以与液态载体一起使用以形成可涂抹的膏剂、凝胶剂、软膏剂、皂剂，等等，以直接应用于使用者的皮肤。
可用于将该化合物递送到皮肤的有用的皮肤病学组合物的实例是本领域中公知的；例如，见Jacquet等人(美国专利号4,608,392)、Geria(美国专利号4,992,478)、Smith等人(美国专利号4,559,157)和Wortzman(美国专利号4,820,508)。
通过比较化合物的体外活性和动物模型中的体内活性可以确定该化合物的有用剂量。将小鼠，和其他动物中的有效剂量外推到人的方法是本领域中公知的；例如，见美国专利号4,938,949。
通常，液态组合物如洗剂中化合物的浓度将为约0.1-25wt-％，优选约0.5-10wt-％。半固态或者固态组合物如凝胶剂或者粉剂中的浓度将为约0.1-5wt-％，优选约0.5-2.5wt-％。
用于治疗所需的化合物，或者其活性盐或者衍生物的量将不仅随着所选的具体盐而且随着施用途径、被治疗的病症的性质和患者的年龄和状况而变，并且将最终由主治医生或者临床医生的判断决定。而且该化合物的剂量将根据靶细胞、肿瘤、组织、移植物，或者器官而变。
所希望的剂量可便利地作为单剂给出或者作为分开的剂量给出，以适宜的间隔施用，例如，作为每天2、3、4或多个亚剂量。该亚剂量本身还可以被分成例如，许多离散的松散隔开的施用；诸如吹入器的多次吸入或者通过应用于眼睛的多次滴剂。
施用方案可以包括长期的、每日治疗。“长期”指至少两周，优选数周、数月或者数年持续时间。本领域普通技术人员仅使用此处教导中的常规实验法就可以确定该剂量范围中必要的修饰。见雷明顿药物科学(Remington′s Pharmaceutical Sciences)(Martin，E.W.，第四版)，马克出版公司(Mack Publishing Co.)，Easton，PA。如果发生任何并发症，个别医生还可以调节剂量。
本发明的药物化合物可与常规化学疗法和放射性疗法组合施用。
根据本发明的高通量筛选试剂盒含有实施试剂的检测所有必要的方式和介质，该试剂在优选1μM到1mM浓度的多肽存在下通过分别与EGFR或IGF-IR或其片段相互作用调节EGFR/配体或IGF-IR/配体相互作用。
该试剂盒含有下面的：本发明的重组细胞，其含有并表达编码EGFR或其片段的核苷酸序列，根据本领域技术人员中公知的方法，特别是WO00/02045中描述的方法，该重组细胞根据试剂盒生长在固体支持体，诸如微量滴定板，更优选地96孔微量滴定板上，备选地，本领域技术人员以纯化的形式提供EGFR或其片段，其被固定在例如96孔微量滴定板上。备选地，在试剂盒中提供EGFR或其片段，其被预先固定在例如，96孔微量滴定板上。EGFR可以是完整EGFR或者其片段。可以为IGF-IR开发类似的试剂盒。
浓度为约1μM到1mM或以上的根据本发明的调节剂被加到限定的孔中，孔中存在适当浓度的抗EGFR或抗IGF-IR多肽、其同源序列、其功能部分或者其同源序列的功能部分，所述多肽的所述浓度优选为1μM到1mM。试剂盒可以含有一种或多种本文中公开的抗EGFR或抗IGF-IR多肽。
本发明人发现本发明的抗EGFR或抗IGF-IR多肽，在被适当的显像剂标记时，为体内成像提供良好的标记。体内优秀的肿瘤定位在不消除IGF-IR纳米抗体的高抗IGF-IR亲和力的条件下，可以获得良好特异性。利用放射性核苷酸99mTc作为具有6小时短半衰期的标记试剂，其与快速清除的本发明纳米抗体组合，导致与目前和常规抗体的可用备选物的组合相比更低背景放射性，并且因此导致优秀成像。
本发明的一个方面是本文中公开的抗EGFR或抗IGF-IR多肽，其进一步包括一种或多种显像剂。显像剂适合于体内使用，其包括但不仅限于99mTc，111Indium，123Iodine。其他适合于磁共振成像的显像剂包括顺磁化合物，MR顺磁螯合物。其他显像剂包括光学染料。
本发明的另一个方面是进一步包括一种或多种显像剂的抗EGFR或抗IGF-IR多肽的体内成像用途
可以利用本领域中的已知方法，用显像剂标记抗EGFR或抗IGF-IR多肽。
本发明的一个方面是将标记的多肽引入微粒、超声泡、微球体、乳剂或脂质体中。该制剂容许更有效的递送。
本发明的抗EGFR或抗IGF-IR多肽可以用于将放射性疗法治疗剂量直接指引到肿瘤。用一种或多种放射性同位素标记所述多肽，其中所述同位素导致肿瘤的损伤或破坏。合适放射性同位素的实例包括，但不仅限于188Re，131I和211At。利用常规技术可以使这些同位素附着于所述多肽，或者附着于与本发明多肽融合的标记物(例如，His-标记物)。
本发明的多肽还可以与一种或多种抗肿瘤试剂连接，其随着抗EGFR或抗IGF-IR多肽分别结合于EGFR或IGF-IR，导致肿瘤的破坏或损伤。合适的化学治疗试剂是技术人员已知的，且包括安慈那环素，甲氨蝶呤，长春地辛，顺铂，蓖麻毒素和加里刹霉素。
与本发明多肽附着的抗肿瘤试剂还可以是活化前药的酶。这容许将失活前药的活化为其活性细胞毒性形式。与本发明多肽缀合的抗肿瘤试剂还可以是细胞因子，诸如白细胞介素-2，白细胞介素-4或肿瘤坏死因子α。
本发明的一个方面是将治疗标记的多肽引入微粒、超声泡、微球体、乳剂或脂质体中。该制剂容许更有效地递送被标记的多肽。
在进一步的方面，本发明提供一种或多种编码本文定义的纳米抗体的核酸分子。
在单核酸分子上可以编码多价或多特异性纳米抗体；备选地，每个纳米抗体可以由单独的核酸分子编码。当多价或多特异性纳米抗体由单核酸分子编码时，其纳米抗体形成部分可以以scFv分子的形式表达为融合多肽，或可以分别表达并随之例如利用化学连接剂连接在一起。将通过适当的方法将从单独的核酸表达的多价或多特异性纳米抗体连接起来。
所述核酸可以进一步编码随着表达将多肽从宿主细胞中输出的信号序列，并且可以随着表达与丝状噬菌体微粒的表面成分(或选择显示系统的其他成分)融合。
在本发明进一步的方面中，提供这样的载体，其包括编码按照本发明多肽的核酸。
在再一个方面，本发明提供被编码按照本发明多肽的载体转染的宿主细胞。
可以对来自该载体的表达进行设定，从而例如在噬菌体微粒表面上产生用于选择的纳米抗体。这容许利用本发明方法选择显示的纳米抗体，以及由此选择多肽。
本发明进一步提供至少包括按照本发明多肽的试剂盒。
按照本发明使用的细胞是任何细菌细胞诸如例如大肠杆菌，酵母细胞诸如例如，酿酒酵母(S.cerevisiae)、毕赤巴斯德酵母(P.pastoris)，昆虫细胞，哺乳动物细胞或霉菌，所述霉菌包括曲霉属或木霉属的那些。
按照本发明使用的细胞可以是任一细胞，编码依照本发明纳米抗体或多肽的核酸序列可被导入该细胞，从而该多肽可以以如文中定义的天然水平或者高于天然水平表达。优选地，在细胞中表达的本发明的多肽显示出如文中定义的正常的或者接近正常的药理学。
根据本发明的优选实施方案，细胞选自COS7-细胞、CHO细胞、LM(TK-)细胞、NIH-3T3细胞、HEK-293细胞、K-562细胞或者1321N1星形细胞瘤细胞(astrocytoma cell)以及其他可被转染的细胞系。
最后，尽管使用本发明的纳米抗体(如本文定义)和本发明的多肽是非常优选的，但是在本文描述的基础上应该清楚的是，技术人员还应该能够以类似的方式，设计和/或生成其他分别针对EGFR或IGF-IR的(单)结构域抗体，以及包括该(单)结构域抗体(其中，术语“结构域抗体”和“单结构域抗体”具有它们在本领域中的一般含义，参见例如本文引用的现有技术)的多肽。
因此，本发明的一个进一步的方面涉及分别针对EGFR或IGF-IR的结构域抗体或单结构域抗体，以及包括至少一个所述(单)结构域抗体和/或基本由该(单)结构域抗体组成的多肽。
特别地，所述分别针对EGFR或IGF-IR的(单)结构域抗体可以包括3个CDR，其中所述CDR如同以上对本发明纳米抗体所定义的。例如，所述(单)结构域抗体可以是已知为“dAb’s”的单结构域抗体，如例如由Ward等所描述的，见上，但其具有如上文关于本发明的纳米抗体所定义的CDR’s。而如上所述，与相应的本发明纳米抗体的用途相比，这类“dAb’s”的用途通常具有若干缺陷。因此，按照本发明的这个方面分别针对EGFR或IGF-IR的任何(单)结构域抗体应该优选地具有构架区，这些构架区为这些分别针对EGFR或IGF-IR的(单)结构域抗体提供这样的特性，所述特性使它们实质上(substantively)等同于本发明的纳米抗体。
本发明的这个方面还包括编码所述(单)结构域抗体和/或多肽的核酸，包括所述(单)结构域抗体、多肽或核酸的组合物，(可以)表达所述(单)结构域抗体或多肽的宿主细胞，和制备和利用所述(单)结构域抗体、多肽或核酸的方法，这些可以与以上对本发明纳米抗体所述的多肽、核酸、组合物、宿主细胞、方法和用途基本类似。
此外，还应该对技术人员清楚的是，有可能将一个或多个以上对本发明纳米抗体所提及的CDR移植到其他“支架”中，所述支架包括但不仅限于人支架或非免疫球蛋白支架。对于所述CDR移植适合的支架和技术的技术人员是清楚的，且在本领域中众所周知，参见例如US-A-6,180,370，WO01/27160，EP 0 605 522，EP 0 460 167，US-A-6,054,297，Nicaise等，蛋白质科学(Protein Science)(2004)，13：1882-1891；Ewert等，方法(Methods)，2004Oct；34(2)：184-199；Kettleborough等，蛋白质工程(Protein Eng.)1991Oct；4(7)：773-783；O’Brien和Jones，分子生物学方法(Methods Mol.Biol.)2003：207：81-100；和Skerra，分子识别杂志(J.Mol.Recognit.)2000：13：167-187，和Saerens等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)2005年9月23日；352(3)：597-607，以及其中引用的其他参考文献。例如，用将小鼠或大鼠CDR移植到人构架区和支架上的本身已知的技术可以以类似的方式提供嵌合蛋白质，该嵌合蛋白质包括本发明纳米抗体的一个或多个CDR，以及一个或人类构架区或序列。
因此，在另一个实施方案中，本发明包括嵌合多肽，所述嵌合多肽包括至少一个这样CDR序列，该CDR序列选自由本文对本发明纳米抗体所提及的CDR1序列，CDR2序列和CDR3序列组成的组。优选地，该嵌合多肽包括至少一个这样CDR序列，该CDR序列选自由本文对本发明纳米抗体所提及的CDR3序列组成的组，且任选地，还有至少一个这样的CDR序列，该CDR序列选自由本文对本发明纳米抗体所提及的CDR1序列和CDR2序列组成的组。例如，该嵌合多肽可以包括一个选自由本文对本发明纳米抗体所提及的CDR3序列组成的组的CDR序列，一个选自由本文对本发明纳米抗体所提及的CDR1序列组成的组的CDR序列和一个选自由本文对本发明纳米抗体所提及的CDR2序列组成的组的CDR序列。如作为本发明纳米抗体优选的而在本文中提及的CDR组合对这些嵌合多肽通常也是优选的。
在所述嵌合多肽中，CDR可以与另外的氨基酸序列连接和/或可以与通过氨基酸序列彼此连接，其中所述氨基酸序列优选地是构架序列或起构架序列作用的氨基酸序列，或一起形成呈现CDR的支架。同样还参考最近段落中提及的现有技术。按照一个优选的实施方案，氨基酸序列是人构架序列，例如VH3构架序列。然而，也可以使用非人、合成、半合成或非免疫球蛋白构架序列。优选地，所使用的构架序列这样的序列：(1)嵌合多肽能够分别与EGFR或IGF-IR结合，即其具有这样的亲和力，该亲和力是相应的本发明纳米抗体亲和力的至少1％，优选地至少5％，更优选地至少10％，诸如至少25％和高达50％或90％或更高；(2)嵌合多肽适合于药物用途；和(3)嵌合多肽优选地在其预期的药用条件(即，指示，施药模式，剂量和治疗方案)下是基本无免疫原性的(这可能与本文中对使用本发明纳米抗体所述的条件基本类似)。
按照一个非限制性实施方案，嵌合多肽包括至少两个CDR序列(如上所述)，其通过至少一个构架序列连接，其中优选地，这两个CDR序列中至少一个是CDR3序列，其他CDR序列是CDR1或CDR2序列。按照优选的非限制性实施方案，嵌合多肽包括至少3个CDR序列(如上所述)，其通过至少两个构架序列连接，其中优选地，这三个CDR序列中的至少一个是CDR3序列，其它两个CDR序列是CDR1或CDR2序列，且优选地是一个CDR1序列和一个CDR2序列。按照一个特别优选的非限制性实施方案，嵌合多肽具有结构FR1’-CDR1-FR2’-CDR2-FR3’-CDR3-FR4’，其中CDR1，CDR2和CDR3如本文对本发明纳米抗体的CDR所定义的，且FR1’，FR2’，FR3’和FR4’是构架序列。具体地，FR1’，FR2’，FR3’和FR4’可以分别是人抗体(如VH3序列)的构架1，构架2，构架3和构架4序列和/或所述构架序列的部分或片段。还可能使用具有结构FR1’-CDR1-FR2’-CDR2-FR3’-CDR3-FR4’的嵌合多肽的部分或片段。优选地，所述部分和片段使它们符合前段中陈述的标准。
本发明还涉及包括和/或基本由所嵌合多肽组成的蛋白质和多肽，编码所述蛋白质或多肽的核酸；制备所述蛋白质和多肽的方法；表达或能够表达所述蛋白质或多肽的宿主细胞；包括所述蛋白质或多肽、核酸或宿主细胞的组合物，和具体地，药物组合物；和所述蛋白质或多肽、所述核酸、所述宿主细胞和/或所述组合物具体地用于预防、治疗或诊断目的，如上文提及的预防、治疗或诊断目的的用途。例如，所述蛋白质、多肽、核酸、方法、宿主细胞、组合物和用途可以与本文对本发明纳米抗体所述的蛋白质、多肽、核酸、方法、宿主细胞、组合物和用途相类似。
还应该注意的是，当本发明的纳米抗体含有一个或多个除上文提及的优选CDR序列外的其他CDR序列时，这些CDR序列可以通过本身已知的任意方式获得，例如，来自纳米抗体(优选的)，来自常规抗体(和具体地来自人抗体)的VH结构域，重链抗体，常规4链抗体(如常规人4链抗体)或其他分别针对EGFR或IGF-IR的免疫球蛋白序列。所述分别针对EGFR或IGF-IR的免疫球蛋白序列可以通过本身已知的任意方式产生，如对技术人员清楚的，即通过分别用EGFR或IGF-IR免疫，或通过分别用EGFR或IGF-IR或其任意的合适组合筛选合适的免疫球蛋白序列文库。任选地，随后可以进行诸如随机或定点诱变的技术和/或其他本身已知的亲和力成熟技术。产生所述免疫球蛋白序列的合适技术对技术人员是清楚的，且例如包括由Hoogenboom，自然生物工程(Nature Biotechnology——，23，9，1105-1116(2005)综述的筛选技术。产生针对特定靶标的免疫球蛋白的其他技术包括例如纳米抗体技术(如例如未预先公开的国际申请PCT/EP2005/011819中所述)，所谓的SLAM技术(如例如欧洲专利申请0542810中所述)，使用转基因小鼠表达人免疫球蛋白或熟知杂交瘤的技术(参见例如Larrick等，生物工程(Biotechnology)，卷7，1989，p.934)。全部这些技术可以用于产生分别用EGFR或IGF-IR的免疫球蛋白，且所述免疫球蛋白的CDR可以用在本发明的纳米抗体中，即如上所概述的。例如，所述CDR的序列可以被确定，合成和/或分离，和插入到本发明的纳米抗体序列中(例如，从而取代相应的天然CDR)，所有这些都利用了本身已知的技术，如本文中描述的那些，或者可以重新合成含有所述CDR(或编码该CDR的核酸)的本发明纳米抗体，同样利用以上提及的技术。
附图简述
图1：由本发明纳米抗体引起的抑制EGF和具有EGFR的A431小泡间的相互作用。
图2：由本发明纳米抗体引起的抑制TGFα和具有EGFR的A431小泡间的相互作用。
图3：EGF与EGFR-Fcγ1结合的抑制。
图4：Fab爱必妥与EGFR-Fcγ1结合的抑制。
图5：EGFR纳米抗体与表达EGFR的A431肿瘤细胞的结合。
图6：用EGF(道1)，PMP7C12(道3)，PMP7D12(道4)和PMP9C1(道5)培养后，对HER14上EGFR磷酸化状态的调节。道2中显示了在缺乏外源配体条件下的背景EGFR磷酸化。用文字记述了检测用于蛋白质印迹显现的抗体的参考。
图7：HER14细胞上由EGF介导的EGFR信号转导的抑制。
图8：由纳米抗体介导的肿瘤细胞增殖抑制。细胞增殖的浓度依赖性抑制体现在与缺乏纳米抗体或抗体条件下细胞数目相比的相对细胞数目。
图9：纳米抗体介导的表达于Hela细胞上的EGFR的降解。
图10：夹心式ELISA显示纳米抗体同时结合于具有EGFR的A431小泡和血清清蛋白。
图11：由本发明纳米抗体或多肽引起的对EGF与具有EGFR的A431小泡间结合的抑制。
图12：由三价双特异性纳米抗体引起的对A431肿瘤细胞增殖的抑制。细胞增殖的浓度依赖性抑制体现在与缺乏纳米抗体或抗体条件下细胞数目相比的相对细胞数目。
图13：清蛋白相互作用对A431结合的影响。
图14：由本发明纳米抗体引起的对IGF-I与rhIGF-IR结合的抑制。
实施例
实施例1：美洲驼中αEGFR重链依赖性免疫响应的诱导。
专利WO 05/044858中描述了在四只美洲驼中，通过注射完整人表皮癌细胞(A431；ATCC CRL 1555；Giard DJ，Aaronson SA，Todaro GJ，Arnstein P，Kersey JH，Dosik H，Parks WP 1973.人肿瘤的体外培养：由一系列实体瘤衍生而来的细胞系的建立(In vitro cultivation of human tumors：establishment of cell lines derived from a series of solid tumors).国家癌症研究所杂志(J.Natl.Cancer Inst.)51：1417-1423)，A431衍生的膜小泡(按照Cohen S，Ushiro H，Stoscheck C，Chinkers M，1982.来自脱落的质膜小泡的天然170,000个表皮生长因子受体-激酶复合物(A native 170,000epidermal growth factor receptor-kinase complex from shed plasma membranevesicles).生物和化学杂志(J.Biol.Chem.)257：1523-31制备而来)或纯化的EGFR(希格玛Sigma)进行的重链依赖性免疫响应诱导。按照Panayotou等，利用固定的抗体亲和力树脂，从EGFR过表达肿瘤细胞(A431)制备EGFR(希格玛)(受体纯化(Receptor Purification)1990；1：289)。
实施例2：EGFR-Fcγ1的表达和纯化。
使用了EGFR的细胞外结构域N末端的618个氨基酸残基序列和编码人IgG1-铰链-CH2-CH3(EGFR-Fcγ1)的序列的遗传融合序列。该质粒容许140kDa的EGFR-Fc融合蛋白的表达及随后向培养上清液中的运输。用EGFR-Fcγ1构建体瞬间转染中国仓鼠卵巢细胞系(CHO)，并收集培养上清液以便进行进一步的处理。蛋白质G亲和力层析后，从该上清液中纯化EGFR-Fcγ1融合体。在ELISA中评估EGFR-Fcγ1的功能性。在ELISA中，EGFR特异性mAb528和生物素化的EGF能够与兔抗人IgG捕获的EGFR-Fcγ1融合体显著地结合，这表示EGF配体的构象和细胞外EGFR结构域上的mAb528结合位点没有受到明显地影响。
实施例3：爱必妥单价Fab片段的产生。
爱必妥是从小鼠单克隆mAb225衍生而来的抗EGFR治疗嵌合抗体(Sato JD，Kawamoto T，Le AD，Mendelsohn J，Polikoff J，Sato GH 1983.单克隆抗体对人表皮生长因子受体的体外生物影响(Biological effects in vitroof monoclonal antibodies to human epidermal growth factor receptors.)分子生物医学(Mol.Biol.Med.)1：511-529)。按照根据Fan和合著者的木瓜蛋白酶消化作用制备来自爱必妥的Fab片段(Fan Z，Mendelsohn J，Masui H，Kumar R，1993.抗受体单克隆抗体对NIH3T3/HR14细胞中表皮生长因子受体的调节(Regulation of Epidermal Growth Factor Receptor inNIH3T3/HER14 Cells by Antireceptor Monoclonal Antibodies).生物和化学杂志(J.Biol.Chem.)268：21073-21079)。通过蛋白质A柱上的亲和力层析和随后的大小排阻层析，从未消化的IgG和Fc片段中纯化经木瓜蛋白酶消化的Fab片段。
实施例4：EGFR胞外域和受体结合蛋白的生物素化。
IMAC-纯化的重组人EGFR胞外域是K.M.Ferguson博士的友好礼物，其编码杆状病毒中产生的EGFR的氨基酸残基1-614(EGFR-ECD)(Ferguson KM，Darling PJ，Mohan MJ，Macatee TL，Lemmon MA，2000.细胞外结构域推动erbB受体的同源而非异源二聚作用(Extracellular domainsdrive homo-but not hetero-dimerization of erbB receptors).EMBO杂志(EMBO J.)19：4632-4643)。按照制造商关于分别使用5或3倍摩尔过量生物素试剂的建议，利用有反应力的生物素衍生物生物素氨基己酸3-磺基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(钠盐；希格玛)，生物素化Fab爱必妥和EGFR-ECD。通过透析除去未反应的生物素。在ELISA中，二价抗体爱必妥和其单价衍生物Fab爱必妥均能够与中性抗生物素蛋白捕获的生物素化的EGFR-ECD结合，这表示生物素的引入不明显影响EGFR-ECD上爱必妥或Fab爱必妥相互作用的位点。生物素化的EGF和TGFα可以获自Peprotech或Invitrogen。
实施例5：纳米抗体能够抑制配体与EGFR的结合。
基本如专利WO 05/044858中所述，进行重链抗体片段(VHH)所有组成部分的克隆以及随后的EGFR特异性纳米抗体的分离。利用ELISA，针对EGFR特异性，在包被EGFR的固相(希格玛)上筛选单独纳米抗体的周质提取物。序列分析后，引起一组14个EGFR纳米抗体(SEQ ID NO’s：80-93；表1)的识别，这些EGFR纳米抗体属于13个不同的纳米抗体家族(表2)。将纳米抗体家族定义为一组这样的纳米抗体，其含有相同CDR3或CDR3中仅具有有限数目残基突变。
为了识别能够与EGFR相互作用蛋白质(配体EGF，TGFα或中和的抗EGFR抗体)竞争的纳米抗体，进行了若干测定。对于首次基于ELISA的测定，如实施例1中所述制备A431衍生的小泡，并利用来自Pierce的BCA蛋白质测定试剂盒，按照制造商的方案，通过分光光度法确定总蛋白质含量。在4℃，Maxisorp微滴定板中，将A431小泡以5μg/ml的浓度在PBS中固定过夜。用PBS-吐温0.05％洗涤板，并随后用PBS-酪蛋白1％在室温下封闭2小时。洗涤后，在存在IMAC纯化的可溶性纳米抗体稀释范围(最终浓度的范围在160-0.009nM之间)的条件下，同时将等体积的1.6nM生物素化的EGF(EGFbiot)应用到PBS-酪蛋白0.1％中，并在室温(rt)培养1小时。用extravidine-碱性磷酸酶缀合物(希格玛)检测了与EGFbiot结合的受体，随后利用仲-硝基苯磷酸盐(希格玛)进行比色反应。作为结果，识别了8个与EGF竞争结合于表达EGFR的A431小泡的纳米抗体家族(表2中总结的家族I-VI和XI-XII)。作为实例，图1中显示了纳米抗体PMP7A5，PMP7C12，PMP7D12和27-10-E8的EGF封闭能力。然而，两种纳米抗体(分别属于纳米抗体家族X和XIII的PMP9C1和PMP8C7)在该测定中不能竞争EGFR上EGF表位(图1)。
为了评估EGF的封闭能力，进行了另一个竞争ELISA。将多克隆抗人IgG(Dako，cat.nr.A0424)以1∶1000的稀释度涂布在PBS中，4℃过夜。第二天，用200ul PBS洗涤该板三次，并用其中含有2％BSA的200ul PBS进行封闭。室温下，在含有1％BSA的PBS中捕获3μg/ml的EGFR-Fcγ1融合体(实施例2)1小时。再次洗涤板，并在单独的板中用50μl含有1％BSA的PBS制备不同纳米抗体的连续稀释液。然后将50μl的20ng/mlEGFbiot加入到每个孔中(最终浓度10ng/ml)，并将纳米抗体和EGFbiot的混合物加入到固定的EGFR-Fcγ1中。室温培养1.5小时后，洗涤该板四次，并用过氧化物酶偶联的链霉抗生素(杰克逊免疫研究实验室(JacksonImmuno-research Laboratories)；在含有1％BSA的PBS中稀释1∶5000)检测结合的EGF，并用o-苯二胺(OPD)/H2O2进行染色。在490nm处读取吸光率。按照该筛选方法和随后的测序，用EGFR封闭能力识别纳米抗体家族IX(类型实例27-1-H7)(表2)。
进行了相似的竞争ELISA，以便筛选能够抑制TGFα与EGFR相互作用的纳米抗体。在该竞争ELISA中，在纳米抗体(周质提取物或IMAC纯化的)稀释范围的存在下评估了4nM生物素化的TGFα与A431小泡的结合。令人吃惊地，先前识别的纳米抗体家族X和XIII，不能阻断EGF与受体的结合，但能抑制TGFα与EGFR的结合(表2；图2)。
执行了另一种筛选EGFR竞争物的测定，即所谓的α-筛选。放大的发光接近同质性分析(Amplified Luminiscent Proximity Homogeneous Assay)-筛选是接近基于珠子的同质性分析，其容许定量检测两种在生物学上相互作用的分子。当这两种相互作用的配偶体分别偶联于接受体和供体珠时，将这些珠子接近放置，在680nm处激发后产生的单态氧分子可导致荧光团介导的接受体珠在520-620nm处发光，这是通过Envision(Perkin Elmer)检测的。这个自动化的高吞吐量筛选方法容许在384孔形式中筛选相互作用对的竞争物。与EGFR-Fcγ1缀合的接受体珠组合使用了捕获EGFbiot的链霉抗生素缀合的供体珠，或在备选的筛选中，组合使用了生物素化的Fab爱必妥，其中所述EGFR-Fcγ1缀合的接受体珠是按照制造商(Perkin Elmer)的说明在两种识别EGF或爱必妥竞争物的α筛选测定中的说明而制备的。分别以1和0.4nM使用EGF或Fab爱必妥。在第一种筛选中，对总共3000种纳米抗体测量由周质纳米抗体提取物引起的EGF-EGFR-Fcγ1相互作用抑制。所测试的纳米抗体的大约10％表现出EGF与EGFR-Fcγ1融合体的抑制。该筛选方法以及随后的测序后，识别了两种另外的EGF竞争纳米抗体家族(VII和VIII)(表2)。作为所获得的抑制曲线的实例，在图3中显示了纳米抗体PMP9G8(相对于爱必妥和Fab爱必妥)的浓度依赖性EGF竞争能力。在随后的α筛选中，筛选了全部EGF竞争纳米抗体抑制Fab爱必妥与EGFR-Fc相互作用的能力，其导致仅有一个纳米抗体家族(家族II；类型实例PMP7D12)的识别，该家族抑制EGF和Fab爱必妥跟EGFR的相互作用(图4)。
总结、广泛筛选和序列分析导致13个以前未识别的EGFR特异性纳米抗体家族(I-XIII)的识别，与专利WO 05/044858中公开的EGFR纳米抗体相比，这些家族能够阻断配体和EGFR的结合。在这13个纳米抗体家族中，11个可以抑制EGF与EGFR的结合。令人吃惊地，剩余的两个纳米抗体家族(X和XIII)仅能够阻断TGFα而非EGF与EGFR的相互作用。表2中显示了全部13个αEGFR纳米抗体家族的总结。
将新型抗EGFR纳米抗体按功能分为3种类型的配体竞争纳米抗体。不同种类纳米抗体的非限制性实例如下：
-A型纳米抗体(与胞外结构域EGFR结合，与EGFR上的EGF，TGFα而非爱必妥结合位点竞争，该纳米抗体的实例是27-10-E8(家族I)和PMP7A5(家族III)。
-B型纳米抗体(与胞外结构域EGFR结合，与EGFR上的EGF，爱必妥和TGFα结合位点竞争，该纳米抗体的实例是PMP7D12和PMP7C12(家族II)。
-C型纳米抗体(与胞外结构域EGFR结合，与EGFR下调上的TGFα而非EGF或爱必妥结合位点竞争，该纳米抗体的实例是PMP8C7(家族XIII)。
实施例6：通过表面胞质基因共振(BIAcore)筛选动力学失效率常数
按照制造商的说明，以密度～5500RU纯化的EGFR(希格玛)包被表面胞质基因共振传感芯片(CM5)。使50nM NaOH流过三秒，从而进行芯片表面的再生。最初，筛选周质纳米抗体提取物，以便确定失效率。对于最相关的纳米抗体家族，即在EGF竞争小泡ELISA中阻断EGF的结合并显示最高IC50的纳米抗体家族(I-III和VI-IX)，筛选了属于相同家族的若干纳米抗体代表，并且将表现出最低失效率的纳米抗体指定为纳米抗体家族类型实例。用IMAC纯化的纳米抗体证实了相关家族类型实例的失效率，并将其记录在表3中。
在所测试的7个纳米抗体家族中，5个纳米抗体家族类型实例，即27-10-E8，PMP7A5，PMP7E12，PMP9G8和PMP3867(表3)表现出与Fab爱必 妥(kd＝1.7E-3s-1)相比，相等或更低的失效率。
实施例7：纳米抗体识别不同来源细胞上细胞表面表达的EGFR表位。
流式细胞计数分析容许检测细胞表面表达的EGFR。用于纳米抗体结合评估的EGFR细胞系是EGFR转染的小鼠纤维原细胞系HER14(具有估计大约为1×105的受体密度)，其母体非转染小鼠纤维原细胞系NIH3T3和人表皮癌细胞系A431肿瘤细胞(受体密度1.2×106)。将1E5细胞(100μl)与1μg纳米抗体混合，并通过多克隆兔抗纳米抗体藻红蛋白(PE)标记的抗血清(R23-PE)对其进行检测。全部试验均在FACSarray(BD生物科学(BDBiosciences))上完成。在流式细胞计数中测试的已知阻断配体与EGFR结合的A、B和C型纳米抗体(如实施例5中所述)是27-10-E8(A型)，PMP7D12(B型)，PMP7A5(A型)和PMP9C1(C型)(分别代表纳米抗体家族I，II，III和X)。毫无例外地，所测试的全部拮抗纳米抗体与背景荧光(用R23-PE缀合的检测)相比，均表现出与A431和HER14，但不对无EGFR表达的NIH3T3的偏移，如图5中所示，这说明这些纳米抗体特异地识别表面表达的EGFR。
实施例8：纳米抗体抑制EGF介导的受体信号转导。
将HER14细胞以100,000细胞/孔接种到12孔组织培养板的含有10％(v/v)血清的DMEM(Gibco生命工程(Gibco Life Technologies))中，并使其在37℃，5％CO2的条件下生长。8小时后，用含有0.5％(v/v)FCS的DMEM洗涤细胞一次，并在相同的培养基中血清饥饿过夜。进行测定的当天，用增补了2％脱脂牛奶的培养基更新培养基。在37℃加入配体(8nM)或过量纳米抗体(1μM)。15分钟后，在冰上迅速冷却细胞，并用冰冷的PBS洗涤两次。通过将细胞从板上刮到50μl Laemmli蛋白质样品缓冲液中而制备全部细胞的溶胞产物。在6％(w/v)聚丙烯酰胺凝胶上按尺寸分离蛋白质(在两块平行的凝胶上加载了20μl溶胞产物/凝胶)，并随后印迹PVDF膜(罗氏(Roche))。用对受体的兔多克隆抗血清染色总量EGFR的印迹(Santa Cruz生物技术(Santa Cruz Biotechnology))，并且对于磷酸化的受体，使用小鼠单克隆抗-磷酸-酪氨酸抗体tyr1068(细胞信号转导(Cellsignalling))，随后使用各自的过氧化物酶-缀合第二抗体(驴抗兔和驴抗小鼠)。作为加载对照，用单克隆抗肌动蛋白抗体(ICN生物医学公司(ICNBiomedicals Inc))对平行印迹进行染色，从而显现肌动蛋白。通过利用Western LightningTM物质(Perkin Elmer生命科学(Perkin Elmer Life Sciences))提高化学发光而显现结合的抗体。外源EGF配体的出现诱导清楚的EGFR酪氨酸磷酸作用，以及由此的受体的活化(图6，道1)，而在缺乏外源配体的条件下检测受体磷酸化作用的剩余水平(图6，道2)。纳米抗体PMP7C12或PMP7D12(家族II)不活化在丧失了EGF的HER14细胞上表达的EGFR，其体现为受体酪氨酸磷酸化作用的缺乏(图6，道3和4)。然而，与背景受体磷酸化水平相比，纳米抗体PMP9C1(家族X)(图6，道5)在应用条件下表现出增高的EGFR磷酸化状态。
在EGF诱导的受体磷酸化后，发生下游受体介导的活化。在EGF受体介导的信号转导中有所涉及的下游效应子蛋白质之一是促分裂原活化的蛋白质激酶(MAPK)。磷酸化后，MAPK触发推动静止细胞进入细胞分裂的事件(Well A，1999.处于焦点的分子：EGF受体(Molecules in focus：EGF receptor).国际生物化学和细胞生物学杂志(Int.J.Biochem.CellBiol.)31：637-643)。通过用小鼠单克隆抗-磷酸-MAPK抗体染色上述印迹来评估下游MAPK磷酸化作用(细胞信号转导(Cell signalling))。在由外源EGF(图6，道1)和对较小的范围由PMP9C1(图6，道5)引起的诱导后，而不在缺乏外源EGF或存在PMP7C12，PMP7D12(图6，分别为道2，3和4)的条件下，检测到HER14中清楚的MAPK磷酸化诱导。
其次，以与上述相似的方式评估了纳米抗体在存在外源配体的条件下抑制受体活化的能力。在该试验中，在存在8nM EGF配体的条件下，将纳米抗体稀释物(1，10，100或1000nM)加入到HER14细胞中。通过用小鼠单克隆的蛋白质印迹法评估受体的磷酸化作用，所述小鼠单克隆与EGFR的磷酸化Tyr1068结合(细胞信号转导(Cell signalling))。外源EGF配体的添加仅导致Tyr1068清楚的磷酸化作用(图7A，道EGF)，而受体磷酸化作用的剩余水平仍在甚至不添加外源配体的条件下检测(图7A，道n.c.)。在该细胞EGF竞争测定中测试了抗体家族I(27-10-E8)，II(PMP7D12)，III(PMP7A5)，VII(PMP9G8)，VIII(PMP38G7)和X(PMP9C1)。纳米抗体家族I，II，III，VII，VIII而非纳米抗体家族X(PMP9C1；未显示)诱导对由EGF介导的受体磷酸化作用的浓度依赖性抑制，这证实了实施例5中所述的纳米抗体家族I，II，III，VII，VIII的EGF竞争能力(表2)。图7显示纳米抗体PMP9G8，27-10-E8(组B)和PMP7D12(组A)对由EGF介导的受体磷酸化作用的浓度依赖性抑制。
实施例9：纳米抗体抑制表达EGFR的肿瘤细胞的体外细胞增殖。
在培养基处理过的96孔板中，将1000A431细胞/孔接种到100μl重碳酸盐缓冲的DMEM(Gibco)+10％FCS中，其中还增补了青霉素和链霉素，并在37℃，5％CO2的条件下培养48小时。培养后，保留一个接种了A431的完整96孔板作为对照板，以便通过磺基若丹明B染色(SRB)确定在t＝0时的无抑制(100％)生长，改写自Sken等(Skehan P，Storeng R，Scudiero D，Monks A，McMahon J，Vistica D，Warren JT，Bokesch H，KenneyS，Boyd MR，1990.用于抗癌药物筛选的新型比色细胞毒性测定(Newcolorimetric cytotoxicity assay for anticancer-drug screening).国家癌症研究所杂志(J.Natl Cancer Inst)82：1107-1112)。随后，在不添加外源配体的条件下，将一连串纳米抗体或增殖调节对照成分的稀释物(0-1000nM)应用到含有1％FCS培养基。然后在37℃，5％CO2的条件下培养该板。培养72小时后，通过比色测定估算细胞数目。用三氯乙酸固定细胞蛋白质，并随后用SRB对其进行染色。通过洗涤除去未结合的染料，并用10mM未缓冲的Tris碱提取与蛋白质结合的染料。在564nm处测量光学密度。通过比较多种纳米抗体与爱必妥(完整的或Fab片段)的剂量-响应曲线来检验所测试纳米抗体的相对潜力。
对家族I，II，III，VII，VIII和XIII中的纳米抗体的抑制能力进行了评估(与单或二价爱必妥相比)，并将结果描述在图8中。纳米抗体之间存在在强大的正相关关系，这显示了对配体与受体结合显著阻断(参见实施例5和8)和抑制A431体外细胞生长增殖的潜力。
实施例10：纳米抗体诱导来自细胞表面的受体螯合。
为了检测来自细胞表面的EGFR螯合(下调)，在进行测定的前一天，以100000细胞/孔，将Hela细胞接种到增补了10％(v/v)FCS和2mM L-谷酰胺的DMEM中。24小时后，将细胞与重组的人EGF(8nM)或过量抗体或纳米抗体(均为1μM)一起在37℃，以长达120分钟的不同时间间隔进行培养。在指定的时间间隔后，在冰上迅速冷却细胞，并且如同实施例8，对其进行总细胞溶胞产物的制备，尺寸分离和印迹。然后用多克隆兔EGFR抗血清对EGFR总量的印迹进行染色(Santa Cruz生物技术(SantaCruz Biotechnologies))。作为加载对照，对相同的印迹的肌动蛋白进行了染色。通过提高化学发光显现结合的抗体(实施例8)。
如所预期地，用8nM外源EGF刺激Hela细胞，2小时后几乎导致EGFR的完全降解(图9，组A)，而对于爱必妥和所测试的纳米抗体家族I，II和III(分别通过类型实例27-10-E8，PMP7D12和PMP7A5代表)，没有在Hela细胞中检测到受体降解。仅对于纳米抗体家族XIII(PMP8C7)，在120分钟时，在Hela细胞上检测到了微小的受体螯合(图9)。先前，Fan和其同事(Fan Z，Mendelsohn J，Masui H，Kumar R 1993.NIH3T3/HER14细胞内由抗受体单克隆抗体引起的表皮生长因子受体的调节(Regulation ofepidermal growth factor receptor in NIH3T3/HER14 cells by antireceptormonoclonal antibodies).生物学和化学杂志(J.Biol.Chem.)268：21073-21079；Fan Z，Lu Y，Wu X，Mendelsohn J 1994.抗体诱导的表皮生长因子受体二聚作用介导对A431鳞状癌细胞自分泌增殖的抑制(Antibody-induced epidermal growth factor receptor dimerization mediatesinhibition of autocrine proliferation of A431squamous carcinoma cells).生物学和化学杂志(J.Biol.Chem.)269：27595-27602)在它们的试验设置下，能够显示出有限的mAb225依赖性EGFR螯合。尽管重复地进行了我们的试验，但是用阻断小鼠mAb225的EGF(数据未显示)或其嵌合衍生物爱必妥(图9)培养2小时在我们测试的条件下不引起可检测到的EGF受体下调作用。
实施例11：修整纳米抗体的形式从而改进血清半衰期和拮抗潜力。
将已经构建的多价/多特异性纳米抗体列在表4中(SEQ ID NO’s：110-133和141-143)。为了在动物模型中测试选择的纳米抗体是否具有作为抗癌试剂的潜力，增长血清半衰期的方案是优选的(如例如专利申请WO04/041865中所述)，因为单或二价纳米抗体(大约分别15或30Kda)的血清半衰期对该治疗指示不是最佳的。在此我们描述了三价双特异性纳米抗体的结构和特征，该纳米抗体由两个位于N末端的抗EGFR分子和与之融合的具有血清清蛋白特异性的第三个纳米抗体组成，且全部通过9(GS)氨基酸连接体肽隔开。选择了人血清清蛋白特异性纳米抗体ALB8，其具有与小鼠血清清蛋白的杂交反应性(表A-9；SEQ ID NO：33)。编码纳米抗体PMP7D12或PMP7A5和ALB8的DAN片段从头到尾地融合，从而导致构建体7D12-GS-7D12-GS-ALB8和7A5-GS-7A5-GS-ALB8(表4；分别是SEQ ID NO’s：126和124)，其中这两种αEGFR纳米抗体通过9(GS)氨基酸连接体隔开。在大肠杆菌中表达这两种纳米抗体，并通过在NiNTA基质上的亲和力层析(IMAC)对其进行纯化，从而达到纯度水平约95％。
为了检验双特异性构建体是否能够同时结合于EGFR和MSA，进行了夹心式ELISA。如实施例5所述进行了A431小泡(5μg/ml)的固定和板封闭。加入一连串纳米抗体稀释物后，通过生物素化的MSA检测与纳米抗体结合的小泡，随后如实施例5，进行extravidine-碱性磷酸酶缀合(希格玛)及之后的比色反应。我们显示，如预期地，仅双特异性三价构建体(图10)而非二价无清蛋白特异性纳米抗体(数据未显示)同时结合A431小泡和血清清蛋白。
随后，通过EGF-A431小泡竞争ELISA对纳米抗体7D12-GS-7D12-GS-ALB8和7A5-GS-7A5-GS-ALB8的配体阻断能力进行了评估(实施例9)。如图11中的描述，与各自的单价抗EGFR纳米抗体相比，7D12-GS-7D12-GS-ALB8和7A5-GS-7A5-GS-ALB8的IC50值分别降低了5和10倍。
为了清楚地显示我们的纳米抗体能够在体外抑制表达EGFR的肿瘤细胞的增殖，如实施例9中的描述，将纳米抗体7D12-GS-7D12-GS-ALB8和7A5-GS-7A5-GS-ALB8应用于增殖A431肿瘤细胞。如图12中的描述，7D12-GS-7D12-GS-ALB8和7A5-GS-7A5-GS-ALB8的IC50值显著低于单价EGFR纳米抗体PMP7A5和PMP7D12的IC50值(图8)。
可以制造这样的纳米抗体，该纳米抗体在缺乏或存在实体的条件下，靶向EGFR上不同的互补位(双互补位纳米抗体)，从而改进血清半衰期。作为实例，可以制造这样的纳米抗体，该纳米抗体与EGFR纳米抗体PMP7D12和PMP7A5(分别属于B型和A型)组合，并包括血清半衰期改进纳米抗体ALB8(EGFRPMP7D12-GS-EGFRPMP7A5-GS-ALB8；SEQID NO：142和EGFRPMP7D12-GS-ALB8-GS-EGFRPMP7A5；SEQ ID NO：143，Table 4)或不具有改进血清半衰期的部分(EGFRPMP7D12-GS-EGFRPMP7A5；SEQ ID NO：141，表4)。靶向抗EGFR双互补位的纳米抗体阻断竞争ELISA中的配体结合(如实施例5中所述)，并且抑制表达EGFR的肿瘤细胞的增殖。改进半衰期范围的部分可以是清蛋白特异性纳米抗体或Fc受体特异性纳米抗体。在相同的构建体中，血清半衰期功能可以被具有另一种生物功能的结合蛋白取代，例如为了恢复免疫效应子功能(例如，抗CD3纳米抗体或与补体蛋白结合的纳米抗体)。
实施例12：纳米抗体格式化是形成有条件的EGFR结合的原因。
构建了一组12种双特异性纳米抗体构建体，它们与单一αEGFR(PMP7D12或PMP7A5)和α清蛋白纳米抗体(ALB8)组合，且通过3(3A)，5(GGGGS)，9(GS)，或25(GS5)氨基酸连接体隔开，并将它们总结在表4(SEQ ID NO’s：110-121)中。
对14种双特异性纳米抗体进行三个平行的流式细胞计数试验，这些试验使用了等分子纳米抗体量，以便利用不同的检测方法评估所述双特异性纳米抗体与A431肿瘤细胞的结合。在第一个试验中，用多克隆兔α-纳米抗体PE缀合物(R23-PE)检测纳米抗体。在第二组试验中，在用Alexa-647缀合的小鼠清蛋白(mSA-647)进行检测前，将纳米抗体与A431细胞共同培养。该检测方法容许评估清蛋白是否能够与A431结合的纳米抗体相互作用。在第三个试验中，将纳米抗体和mSA-647预培养30分钟(EGFR相互作用前容许清蛋白结合)，并随后将其加入到A431细胞中，从而检验清蛋白结合的双特异性纳米抗体是否还能够结合表面表达的EGFR。将获得的FACS结果显示在图13中。
当ALB8处于双特异性构建体的C末端时，在不考虑αEGFR纳米抗体的条件下，用R23-PE检测到对A431细胞表面的最大结合(平均荧光性＞5×104)。进行相同的R23-PE检测，位于N末端ALB8对A431结合具有负作用(表现为与ALB8-EGFR构建体相比降低的平均荧光性)，尽管较少说出增加连接体长度。尽管对于在ALB8-EGFR形式中所测试的两种EGFR纳米抗体，检测到了清楚的A431结合，但是N末端ALB8融合体似乎对EGFR与PMP7D12结合的影响大于其对EGFR与PMP7A5结合的影响。这受到表面胞质基因共振试验的支持，该试验显示与PMP7D12-ALB8形式相比，ALB8-PMP7D12双特异性纳米抗体的EGFR结合的显著减少(数据未显示)。当在无预培养的条件下，用mSA-647进行A431结合的检测时，双特异性构建体的平均荧光性很低(不考虑EGFR实体和ALB8的位置)，这暗示A431结合受到了负向影响。对ALB8-PMP7D12构建体实施该检测方法，连接体长度似乎正向影响双特异性构建体的A431结合(图13)。
令人吃惊地，然而，不考虑EGFR纳米抗体，ALB8的位置或测试的连接体长度，用mSA-647的预培养明显地改进A431的结合，这暗示在清蛋白结合后的有条件的EGFR相互作用。当然，与从无mSA-647预培养中获得的那些相比，清蛋白相互作用显著地改进了双特异性纳米抗体构建体的平均荧光性(图13)。
实施例13：纳米抗体能够抑制IGF-I配体与IGF-IR的结合。
为识别IGF-IR特异性纳米抗体，使用了克隆的VHH所有组成部分，其如同实施例5中所述且源自A431细胞免疫的美洲驼。重组人IGF-IR(rhIGFIR)和IGF-I获自Peprotech。基本如专利WO 05/044858中所述进行了IGF-IR特异性纳米抗体的分离，其利用IGF-I配体选择在表位上与IGF-IR结合的纳米抗体，所述表位至少与配体结合位点重叠。将这两种作为rhIGFIR且具有IGF-IR的A431小泡用作进行选择的抗原形式。选择后，通过包被受体的固相上的ELISA，针对IGF-IR特异性，筛选单独纳米抗体的周质提取物。序列分析后，这导致一组4种不同IGF-IR纳米抗体PMP4B11，PMP3G7，PMP2C7和PMP1C7(分别是SEQ ID NO’s：106-109；表5)的识别，它们属于4个不同的纳米抗体家族。
实现了类似于实施例5中所述的竞争ELISA，从而筛选能够抑制IGF-I与IGF-IR相互作用的纳米抗体。如实施例4中的描述，利用5倍摩尔过量生物素试剂对IGF-I进行生物素化。通过透析除去未反应的生物素残余。对rhIGFIR进行固相固定(1μg/ml)，并在缺乏或存在竞争物的条件下，用extravidin碱性磷酸酶缀合物检测生物素化的IGF-I(50ng/ml)的结合。只有PMP1C7能够显著地抑制IGF-I与rhIGFIR的相互作用，如图14所示。随后的表面胞质基因共振分析(BIAcore)显示固定的IGF-IR上PMP1C7的解离常数等于1.9E-3s-1。
构建了通过9(GS)或25(GS5)氨基酸连接体隔开的双特异性抗IGF-IR纳米抗体(SEQ ID NO’s：134-135，表6)，且这些纳米抗体与单价IGF-IR纳米抗体相比，明显地改进了IGF-I的阻断(竞争ELISA)和表达IGF-IR的肿瘤细胞增殖的抑制。
实施例14：双特异性αEGFR-αIGF-IR纳米抗体能够抑制IGF-IR和EGFR的信号转导级联。
可以制造这样的纳米抗体，该纳米抗体在缺乏或存在实体的条件下，同时靶向EGFR和IGF-IR上的表位，从而改进血清半衰期。作为实例，可以制造这样的纳米抗体，该纳米抗体在具有或没有血清清蛋白纳米抗体ALB8的条件下，与EGFR纳米抗体PMP7D12和IGF-IR纳米抗体PMP1C7组合(SEQ ID NO’s：136-140，表7)。靶向EGFR-IGF-IR的纳米抗体阻断竞争ELISA中配体与它们各自受体的结合(实施例5中所述)，并且抑制表达EGFR/IGF-IR的肿瘤细胞的增殖。改进半衰期范围的部分可以是清蛋白特异性纳米抗体或Fc受体特异性纳米抗体。在相同的构建体中，血清半衰期功能可以被具有另一种生物功能的结合蛋白取代，例如为了恢复免疫效应子功能(例如，抗CD3纳米抗体或与补体蛋白结合的纳米抗体)。
表1：优选的针对EGFR的纳米抗体
  <名称，SEQ ID #；PRT(蛋白质)；->序列
  <27-10-E8，SEQ ID NO：80；PRT；->EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSTYTMAWFRQAPGKEREFVQGISRSDGGTYDADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYFCAAASVKLVYVNPNRYSYWGQGTQVTVSS
  <PMP7D12，SEQ ID NO：81；PRT；->QVKLEESGGGSVQTGGSLRLTCAASGRTSRSYGMGWFRQAPGKEREFVSGISWRGDSTGYADSVKGRFTISRDNAKNTVDLQMNSLKPEDTAIYYCAAAAGSAWYGTLYEYDYWGQGTQVTVSS
  <PMP7C12，SEQ ID NO：82；PRT；->AVQLVESGGGSVQAGGSLRLTCAASGRTSRSYGMGWFRQAPGKEREFVSGISWRGDSTGYADSVKGRFTISRDNAKNTVDLQMNSLKPEDTAIYYCAAAAGSTWYGTLYEYDYWGQGTQVTVSS
  <PMP9C1，SEQ ID NO：83；PRT ；->EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSGFAMGWFRQAPGKEREFVAAISWSGGSLLYVDSVKGRFTISRDNAKNTVHLQMNSLKPGDTAVYYCAAMVGPPPRSLDYGLGNHYEYDYWGQGTQVTVSS
  <PMP7A5，SEQ ID NO：84；PRT；->EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASDRTFSSNNMGWFRQAPGKEREFVAAIGWGGLETHYSDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTARYYCAVSSTRTVIYTLPRMYNYWGQGTQVTVSS
  <PMP9A7，SEQ ID NO：85；PRT；->EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAVSGRTFSGDVMGWFRQAPGKEREFVAGFSRSTSTTHYADSVKGRFTISGDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAANSRSSWVIFTIKGQYDRWGQGTQVTVSS
  <PMP8B5，SEQ ID NO：86；PRT；->EVQLVESGCGLVQAGGSLRVSCVASIRSFSSYVVGWFRQAPGKDREFVAGIAWGDGITYYADSVKGRFTISRDHAKNTAYLQMNSLRPEDTAVYYCAVRPGMIITTIQATYGFWGQGTQVTVSS
  <PMP11C9，SEQ ID NO：87；PRT；->EVQLVESGGGLVQAGASLRLSCAASGRYFSDYNMAWFRQAPGKEREFVAHISWLGGRTYYRDSVKGRFTISRDNAKDTVYLQMNSLKPEDTAVYSCAAGSPYGTELPYTRIEQYAYWGQGTQVTVSS
  <PMP11H6，SEQ ID NO：88；PRT；->AVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSTYTMAWFRQAPGKEREFVQGISRSDGGTYDADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYFCAAANEYWVYVNPNRYTYWGRGTQVTVSS
  <PMP7E12，SEQ ID NO：89；PRT；->EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCTASGRTFENNAMAWFRQAAGKEREFVAGFSGSGGATYYAHSVEGRFTISRDNAKNTVDLQMNSLSLEDTAVYLCAARRKSGEVVFTIPARYDYWGQGTQVTVSS
  <PMP8C7，SEQ ID NO：90；PRT；->QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRAFSSYVMGWFRQAPGKEREIVGAISWRGGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAVYRVGAISEYSGTDYYTDEYDYWGQGTQVTVSS
  <PMP9G8，SEQ ID NO：91；PRT；->EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSSYAMGWFRQAPGKEREFVVAINWSSGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTMYLQMNSLKPEDTAVYYCAAGYQINSGNYNFKDYEYDYWGQGTQVTVSS
  <PMP38G7，SEQ ID NO：92；PRT；->EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSSYVMGWFRQATGKEREFVATIAWDSGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVHLQMNSLKPEDTAVYYCAASYNVYYNNYYYPISRDEYDYWGQGTQVTVSS
  <27-1-H7，SEQ ID NO：93；PRT；->EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRGAWAWFRQAPGKEREFVGGLSWSADSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVFLQMTNLKADDTAVYYCAAHRRPFASVFTTTRMYDYWGPGTQVTVSS
表2：抗EGFR纳米抗体家族
  纳米抗体家族 纳米抗体类型实例   EGF竞争物   FabErblrux竞争物   TGFα竞争物   CDR3AA序列
  IIIIIIIVVVIVIIVIIIIXXXIXIIXIII   27-10-E8PMP7D12PMP7A5PMP9A7PMP8B5PMP7E12PMP9G8PMP38G727-1-H7PMP9C1PMP11C9PMP11H6PMP8C7   +++++++++-++-   -+-未检测------未检测未检测未检测   +++未检测未检测未检测未检测未检测未检测+未检测未检测+   ASVKLVFVNPHRYIYAAGSAWYGTLYEYDYSSTRTVIYTLPRMYNYNSRSSWVIFTIKGQYDRRPGMIITTIQATYGFRRKSGEVVFTIPARYDYGYQINSGNYNFKDYEYDYSYNVYYNNYYYPISRDEYDYHRRPFASVFTTTRMYDYMVGPPPRSLDYGLGNHYEYDYGSPYGTELPYTRIEQYAYANEYWVYVNPNRYTYVYRVGAISEYSGTDYYTDEYDY
表3：阻断EGF结合的EGFR特异性纳米抗体的失效率
  纳米抗体家族   纳米抗体类似实例   失效率(s-1)
  I   27-10-E8   1.7E-3
  II   PMP7D12   2.5E-3
  III   PMP7A5   1.5E-3
  VI   PMP7E12   1.5E-3
  VII   PMP9G8   4.5E-4
  VIII   PMP38G7   1.7E-4 10
  IX   27-1-H7   3.1E-3
表4：多价/多特异性EGFR纳米抗体序列
  <名称，SEQ ID #；PRT(蛋白质)；->序列
  <ALB8-3A-7A5，SEQ ID NO：110；PRT；->EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSAAAEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASDRTFSSNNMGWFRQAPGKEREFVAAIGWGGLETHYSDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTARYYCAVSSTRTVIYTLPRMYNYWGQGTQVTVSS
  <ALB8-GGGGS-7A5，SEQ ID NO：111；PRT；->EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASDRTFSSNNMGWFRQAPGKEREFVAAIGWGGLETHYSDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTARYYCAVSSTRTVIYTLPRMYNYWGQGTQVTVSS
  <ALB8-GS-7A5，SEQ ID NO：112；PRT；->EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASDRTFSSNNMGWFRQAPGKEREFVAAIGWGGLETHYSDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTARYYCAVSSTRTVIYTLPRMYNYWGQGTQVTVSS
  <ALB8-GS5-7A5，SEQ ID NO：113；PRT；->EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASDRTFSSNNMGWFRQAPGKEREFVAAIGWGGLETHYSDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTARYYCAVSSTRTVIYTLPRMYNYWGQGTQVTVSS
  <ALB8-3A-7D12，SEQ ID NO：114；PRT；->EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSAAAEVQLVESGGGSVQTGGSLRLTCAASGRTSRSYGMGWFRQAPGKEREFVSGISWRGDSTGYADSVKGRFTISRDNAKNTVDLQMNSLKPEDTAIYYCAAAAGSAWYGTLYEYDYWGQGTQVTVSS
  <ALB8-GGGGS-7D12，SEQ ID NO：115；PRT；->EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSEVQLVESGGGSVQTGGSLRLTCAASGRTSRSYGMGWFRQAPGKEREFVSGISWRGDSTGYADSVKGRFTISRDNAKNTVDLQMNSLKPEDTAIYYCAAAAGSAWYGTLYEYDYWGQGTQVTVSS
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  <7D12-GS-ALB8-GS-7D12，SEQ ID NO：130；PRT；->QVKLEESGGGSVQTGGSLRLTCAASGRTSRSYGMGWFRQAPGKEREFVSGISWRGDSTGYADSVKGRFTISRDNAKNTVDLQMNSLKPEDTAIYYCAAAAGSAWYGTLYEYDYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGSVQTGGSLRLTCAASGRTSRSYGMGWFRQAPGKEREFVSGISWRGDSTGYADSVKGRFTISRDNAKNTVDLQMNSLKPEDTAIYYCAAAAGSAWYGTLYEYDYWGQGTQVTVSS
  <7C12-GS-ALB8-GS-7C12，SEQ ID NO：131；PRT；->AVQLVESGGGSVQAGGSLRLTCAASGRTSRSYGMGWFRQAPGKEREFVSGISWRGDSTGYADSVKGRFTISRDNAKNTVDLQMNSLKPEDTAIYYCAAAAGSTWYGTLYEYDYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGSVQAGGSLRLTCAASGRTSRSYGMGWFRQAPGKEREFVSGISWRGDSTGYADSVKGRFTISRDNAKNTVDLQMNSLKPEDTAIYYCAAAAGSTWYGTLYEYDYWGQGTQVTVSS
  <ALB8-GS-7A5-GS-7A5，SEQ ID NO：132；PRT；->EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASDRTFSSNNMGWFRQAPGKEREFVAAIGWGGLETHYSDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTARYYCAVSSTRTVIYTLPRMYNYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASDRTFSSNNMGWFRQAPGKEREFVAAIGWGGLETHYSDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTARYYCAVSSTRTVIYTLPRMYNYWGQGTQVTVSS
  <ALB8-GS-7D12-GS-7D12，SEQ ID NO：133；PRT；->EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGSVQTGGSLRLTCAASGRTSRSYGMGWFRQAPGKEREFVSGISWRGDSTGYADSVKGRFTISRDNAKNTVDLQMNSLKPEDTAIYYCAAAAGSAWYGTLYEYDYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGSVQTGGSLRLTCAASGRTSRSYGMGWFRQAPGKEREFVSGISWRGDSTGYADSVKGRFTISRDNAKNTVDLQMNSLKPEDTAIYYCAAAAGSAWYGTLYEYDYWGQGTQVTVSS
  <EGFRPMP7D12-GS-EGFRPMP7A5，SEQ ID NO：141；PRT；->QVKLEESGGGSVQTGGSLRLTCAASGRTSRSYGMGWFRQAPGKEREFVSGISWRGDSTGYADSVKGRFTISRDNAKNTVDLQMNSLKPEDTAIYYCAAAAGSAWYGTLYEYDYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSQVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCVASGRTFSRTAMAWFRQAPGKEREFVATITWNSGTTRYADSVKGRFFISKDSAKNTIYLEMNSLEPEDTAVYYCAATAAAVITPTRGYYNYWGQGTQVTVSS
  <EGFRPMP7D12-GS-EGFRPMP7A5-GS-ALB8，SEQ ID NO：142；PRT；->QVKLEESGGGSVQTGGSLRLTCAASGRTSRSYGMGWFRQAPGKEREFVSGISWRGDSTGYADSVKGRFTISRDNAKNTVDLQMNSLKPEDTAIYYCAAAAGSAWYGTLYEYDYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSQVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCVASGRTFSRTAMAWFRQAPGKEREFVATITWNSGTTRYADSVKGRFFISKDSAKNTIYLEMNSLEPEDTAVYYCAATAAAVITPTRGYYNYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS
  <EGFRPMP7D12-GS-ALB8-GS-EGFRPMP7A5，SEQ ID NO：143；PRT；->QVKLEESGGGSVQTGGSLRLTCAASGRTSRSYGMGWFRQAPGKEREFVSGISWRGDSTGYADSVKGRFTISRDNAKNTVDLQMNSLKPEDTAIYYCAAAAGSAWYGTLYEYDYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSQVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCVASGRTFSRTAMAWFRQAPGKEREFVATITWNSGTTRYADSVKGRFFISKDSAKNTIYLEMNSLEPEDTAVYYCAATAAAVITPTRGYYNYWGQGTQVTVSS
表5：优选的针对IGF-IR的纳米抗体
  <名称，SEQ ID #；PRT(蛋白质)；->序列
  <PMP4B11，SEQ ID NO：106；PRT；->EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFTFNAMGWYRQAPGKQRELVAVIISGGSTHYVDSVKGRFTISRDNAKKMVYLQMNSLKPEDTAVYYCNVKKFGDYWGQGTQVTVSS
  <PMP3G7，SEQ ID NO：107；PRT；->DVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASESISTINVMAWYRQAPGKQRELVAEITRSGRTNYVDSVKGRFTISRDNAKNTMYLQMNSLNLEDTAVYYCRTIDGSWREYWGQGTQVTVSS
  <PMP2C7，SEQ ID NO：108；PRT；->QVKLEESGGGLVQPGGSLRLSCVASGRTFSNYAMGWFRQAPGQEREFVAAINWNSRSTYYADSVKGRFTISRLNARNTVYLQMNRLKPEDTAVYDCAASHDSDYGGTNANLYDYWGQGTQVTVSS
  <PMP1C7，SEQ ID NO：109；PRT；->QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCVASGRTFSRTAMAWFRQAPGKEREFVATITWNSGTTRYADSVKGRFFISKDSAKNTIYLEMNSLEPEDTAVYYCAATAAAVITPTRGYYNYWGQGTQVTVSS
表6：多价/多特异性IGF-IR纳米抗体序列
  <名称，SEQ ID #；PRT(蛋白质)；->序列
  <PMP1C7-GS-PMP1C7，SEQ ID NO：134；PRT；->QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCVASGRTFSRTAMAWFRQAPGKEREFVATITWNSGTTRYADSVKGRFFISKDSAKNTIYLEMNSLEPEDTAVYYCAATAAAVITPTRGYYNYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSQVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCVASGRTFSRTAMAWFRQAPGKEREFVATITWNSGTTRYADSVKGRFFISKDSAKNTIYLEMNSLEPEDTAVYYCAATAAAVITPTRGYYNYWGQGTQVTVSS
  <PMP1C7-GS5-PMP1C7，SEQ ID NO：135；PRT；->QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCVASGRTFSRTAMAWFRQAPGKEREFVATITWNSGTTRYADSVKGRFFISKDSAKNTIYLEMNSLEPEDTAVYYCAATAAAVITPTRGYYNYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCVASGRTFSRTAMAWFRQAPGKEREFVATITWNSGTTRYADSVKGRFFISKDSAKNTIYLEMNSLEPEDTAVYYCAATAAAVITPTRGYYNYWGQGTQVTVSS
表7：优选的针对EGFR和IGF-IR的纳米抗体
  <名称，SEQ ID #；PRT(蛋白质)；->序列
  <EGFRPMP7D12-GS-IGFRPMP1C7，SEQ ID NO：136；PRT；->QVKLEESGGGSVQTGGSLRLTCAASGRTSRSYGMGWFRQAPGKEREFVSGISWRGDSTGYADSVKGRFTISRDNAKNTVDLQMNSLKPEDTAIYYCAAAAGSAWYGTLYEYDYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSQVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCVASGRTFSRTAMAWFRQAPGKEREFVATITWNSGTTRYADSVKGRFFISKDSAKNTIYLEMNSLEPEDTAVYYCAATAAAVITPTRGYYNYWGQGTQVTVSS
  <EGFRPMP7D12-GS5-IGFRPMP1C7，SEQ ID NO：137；PRT；->QVKLEESGGGSVQTGGSLRLTCAASGRTSRSYGMGWFRQAPGKEREFVSGISWRGDSTGYADSVKGRFTISRDNAKNTVDLQMNSLKPEDTAIYYCAAAAGSAWYGTLYEYDYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCVASGRTFSRTAMAWFRQAPGKEREFVATITWNSGTTRYADSVKGRFFISKDSAKNTIYLEMNSLEPEDTAVYYCAATAAAVITPTRGYYNYWGQGTQVTVSS
  <EGFRPMP7D12-GS-IGFRPMP1C7-GS-ALB8，SEQ ID NO：138；PRT；->QVKLEESGGGSVQTGGSLRLTCAASGRTSRSYGMGWFRQAPGKEREFVSGISWRGDSTGYADSVKGRFTISRDNAKNTVDLQMNSLKPEDTAIYYCAAAAGSAWYGTLYEYDYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSQVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCVASGRTFSRTAMAWFRQAPGKEREFVATITWNSGTTRYADSVKGRFFISKDSAKNTIYLEMNSLEPEDTAVYYCAATAAAVITPTRGYYNYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS
  <EGFRPMP7D12-GS-ALB8-GS-IGFRPMP1C7，SEQ ID NO：139；PRT；->QVKLEESGGGSVQTGGSLRLTCAASGRTSRSYGMGWFRQAPGKEREFVSGISWRGDSTGYADSVKGRFTISRDNAKNTVDLQMNSLKPEDTAIYYCAAAAGSAWYGTLYEYDYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSQVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCVASGRTFSRTAMAWFRQAPGKEREFVATITWNSGTTRYADSVKGRFFISKDSAKNTIYLEMNSLEPEDTAVYYCAATAAAVITPTRGYYNYWGQGTQVTVSS
  <EGFRPMP7D12-GS5-IGFRPMP1C7-GS-ALB8，SEQ ID NO：140；PRT；->QVKLEESGGGSVQTGGSLRLTCAASGRTSRSYGMGWFRQAPGKEREFVSGISWRGDSTGYADSVKGRFTISRDNAKNTVDLQMNSLKPEDTAIYYCAAAAGSAWYGTLYEYDYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCVASGRTFSRTAMAWFRQAPGKEREFVATITWNSGTTRYADSVKGRFFISKDSAKNTIYLEMNSLEPEDTAVYYCAATAAAVITPTRGYYNYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS
表8：SEQ ID NO’s：1-41
  <名称，SEQ ID #；PRT(蛋白质)；->序列
  <FR1，SEQ ID NO：1；PRT；->QVQLQESGGGXVQAGGSLRLSCAASG
  <FR2，SEQ ID NO：2；PRT；->WXRQAPGKXXEXVA
  <FR3，SEQ ID NO：3；PRT；->RFTISRDNAKNTVYLQMNSLXXEDTAVYYCAA
  <FR4，SEQ ID NO：4；PRT；->XXQGTXVTVSS
  <FR1，SEQ ID NO：5；PRT；->QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASG
  <FR2，SEQ ID NO：6；PRT；->WFRQAPGKERELVA
  <FR2，SEQ ID NO：7；PRT；->WFRQAPGKEREFVA
  <FR2，SEQ ID NO：8；PRT；->WFRQAPGKEREGA
  <FR2，SEQ ID NO：9；PRT；->WFRQAPGKQRELVA
  <FR2，SEQ ID NO：10；PRT；->WFRQAPGKQREFVA
  <FR2，SEQ ID NO：11；PRT；->WYRQAPGKGLEWA
  <FR3，SEQ ID NO：12；PRT；->RFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAA
  <FR4，SEQ ID NO：13；PRT；->WGQGTQVTVSS
  <FR4，SEQ ID NO：14；PRT；->WGQGTLVTVSS
  <CDR1，SEQ ID NO：15；PRT；->SFGMS
  <CDR1，SEQ ID NO：16；PRT；->LNLMG
  <CDR1，SEQ ID NO：17；PRT；->INLLG
  <CDR1，SEQ ID NO：18；PRT；->NYWMY
  <CDR2，SEQ ID NO：19；PRT；->SISGSGSDTLYADSVKG
  <CDR2，SEQ ID NO：20；PRT；->TITVGDSTNYADSVKG
  <CDR2，SEQ ID NO：21；PRT；->TITVGDSTSYADSVKG
  <CDR2，SEQ ID NO：22；PRT；->SINGRGDDTRYADSVKG
  <CDR2，SEQ ID NO：23；PRT；->AISADSSTKNYADSVKG
  <CDR2，SEQ ID NO：24；PRT；->AISADSSDKRYADSVKG
  <CDR2，SEQ ID NO：25；PRT；->RISTGGGYSYYADSVKG
  <CDR3，SEQ ID NO：26；PRT；->DREAQVDTLDFDY
  <CDR3，SEQ ID NO：27；PRT；->GGSLSR
  <CDR3，SEQ ID NO：28；PRT；->RRTWHSEL
  <CDR3，SEQ ID NO：29；PRT；->GRSVSRS
  <CDR3，SEQ ID NO：30；PRT；->GRGSP
  <Myc-tag，SEQ ID NO：31；PRT；->AAAEQKLISEEDLNGAA
  <PMP 6A6(ALB-1)，SEQ ID NO：32；PRT；->AVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKEPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLKPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTQVTVSS
  <ALB-8，SEQ ID NO：33；PRT；->EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS
  <PMP 6A8(ALB-2)，SEQ ID NO：34；PRT；->AVQLVESGGGLVQGGGSLRLACAASERIFDLNLMGWYRQGPGNERELVATCITVGDSTNYADSVKGRFTISMDYTKQTVYLHMNSLRPEDTGLYYCKIRRTWHSELWGQGTQVTVSS
  <FC44，SEQ ID NO：35；PRT；->EVQLQASGGGLVQAGGSLRLSCSASVRTFSIYAMGWFRQAPGKEREFVAGINRSGDVTKYADFVKGRFSISRDNAKNMVYLQMNSLKPEDTALYYCAATWAYDTVGALTSGYNFWGQGTQVTVSS
  <FC5，SEQ ID NO：36；PRT；->EVQLQASGGGLVQAGGSLRLSCAASGFKITHYTMGWFRQAPGKEREFVSRITWGGDNTFYSNSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTADYYCAAGSTSTATPLRVDYWGKGTQVTVSS
  <GS30，SEQ ID NO：37；PRT；->GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
  <GS15，SEQ ID NO：38；PRT；->GGGGSGGGGSGGGGS
  <GS9，SEQ ID NO：39；PRT；->GGGGSGGGS
  <GS7，SEQ ID NO：40；PRT；->SGGSGGS<
  <美洲驼上方长铰链区，SEQ ID NO：41；PRT；->EPKTPKPQPAAA
表9：针对EGFR的纳米抗体的优选CDR
  <名称，SEQ ID #；PRT(蛋白质)；->序列
  <CDR1，SEQ ID NO：42；PRT；->TYTMA
  <CDR1，SEQ ID NO：43；PRT；->SYGMG
  <CDR1，SEQ ID NO：44；PRT；->GFAMG
  <CDR1，SEQ ID NO：45；PRT；->SNNMG
  <CDR1，SEQ ID NO：46；PRT；->GDVMG
  <CDR1，SEQ ID NO：47；PRT；->SYVVG
  <CDR1，SEQ ID NO：48；PRT；->DYNMA
  <CDR1，SEQ ID NO：49；PRT；->TYTMA
  <CDR1，SEQ ID NO：50；PRT；->NNAMA
  <CDR1，SEQ ID NO：51；PRT；->SYVMG
  <CDR1，SEQ ID NO：52；PRT；->SYAMG
  <CDR1，SEQ ID NO：53；PRT；->A
  <CDR2，SEQ ID NO：54；PRT；->GISRSDGGTYDADSVKG
  <CDR2，SEQ ID NO：55；PRT；->GISWRGDSTGYADSVKG
  <CDR2，SEQ ID NO：56；PRT；->AISWSGGSLLYVDSVKG
  <CDR2，SEQ ID NO：57；PRT；->AIGWGGLETHYSDSVKG
  <CDR2，SEQ ID NO：58；PRT；->GFSRSTSTTHYADSVKG
  <CDR2，SEQ ID NO：59；PRT；->GIAWGDGITYYADSVKG
  <CDR2，SEQ ID NO：60；PRT；->HISWLGGRTYYRDSVKG
  <CDR2，SEQ ID NO：61；PRT；->GFSGSGGATYYAHSVEG
  <CDR2，SEQ ID NO：62；PRT；->AISWRGGSTYYADSVKG
  <CDR2，SEQ ID NO：63；PRT；->AINWSSGSTYYADSVKG
  <CDR2，SEQ ID NO：64；PRT；->TIAWDSGSTYYADSVKG
  <CDR2，SEQ ID NO：65；PRT；->GLSWSADSTYYADSVKG
  <CDR3，SEQ ID NO：66；PRT；->ASVKLVYVNPNRYSY
  <CDR3，SEQ ID NO：67；PRT；->AAGSAWYGTLYEYDY
  <CDR3，SEQ ID NO：68；PRT；->AAGSTWYGTLYEYDY
  <CDR3，SEQ ID NO：69；PRT；->MVGPPPRSLDYGLGNHYEYDY
  <CDR3，SEQ ID NO：70；PRT；->SSTRTVIYTLPRMYNY
  <CDR3，SEQ ID NO：71；PRT；->NSRSSWVIFTIKGQYDR
  <CDR3，SEQ ID NO：72；PRT；->RPGMIITTIQATYGF
  <CDR3，SEQ ID NO：73；PRT；->GSPYGTELPYTRIEQYAY
  <CDR3，SEQ ID NO：74；PRT；->ANEYWVYVNPNRYTY
  <CDR3，SEQ ID NO：75；PRT；->RRKSGEVVFTIPARYDY
  <CDR3，SEQ ID NO：76；PRT；->VYRVGAISEYSGTDYYTDEYDY
  <CDR3，SEQ ID NO：77；PRT；->GYQINSGNYNFKDYEYDY
  <CDR3，SEQ ID NO：78；PRT ；->SYNVYYNNYYYPISRDEYDY
  <CDR3，SEQ ID NO：79；PRT；->HRRPFASVFTTTRMYDY
表10：针对IGF-IR的纳米抗体的优选CDR
  <名称，SEQ ID #；PRT(蛋白质)；->序列
  <CDR1，SEQ ID NO：94；PRT；->FNAMG
  <CDR1，SEQ ID NO：95；PRT；->INVMA
  <CDR1，SEQ ID NO：96；PRT；->NYAMG
  <CDR1，SEQ ID NO：97；PRT；->RTAMA
  <CDR2，SEQ ID NO：98；PRT；->VIISGGSTHYVDSVKG
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  <CDR2，SEQ ID NO：100；PRT；->AINWNSRSTYYADSVKG
  <CDR2，SEQ ID NO：101；PRT；->TITWNSGTTRYADSVKG
  <CDR3，SEQ ID NO：102；PRT；->KKFGDY
  <CDR3，SEQ ID NO：103；PRT；->IDGSWREY
  <CDR3，SEQ ID NO：104；PRT；->SHDSDYGGTNANLYDY
  <CDR3，SEQ ID NO：105；PRT；->TAAAVITPTRGYYNY
序列表
<110>埃博灵克斯股份有限公司
<120>EGFR/IGF-IR
<130>P05-005-PCT1
<160>143
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>26
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>按照表A-5的标志残基
<400>1
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Xaa Val Gln Ala Gly Gly
1         5          10           15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
       20           25
<210>2
<211>14
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>按照表A-6的标志残基
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>按照表A-6的标志残基
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>按照表A-6的标志残基
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>按照表A-6的标志残基
<400>2
Trp Xaa Arg Gln Ala Pro Gly Lys Xaa Xaa Glu Xaa Val Ala
1        5            10
<210>3
<211>32
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(21)..(21)
<223>按照表A-7的标志残基
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(22)..(22)
<223>按照表A-7的标志残基
<400>3
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln
1        5             10          15
Met Asn Ser Leu Xaa Xaa Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
      20          25          30
<210>4
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>按照表A-8的标志残基
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>按照表A-8的标志残基
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>按照表A-8的标志残基
<400>4
Xaa Xaa Gln Gly Thr Xaa Val Thr Val Ser Ser
1        5           10
<210>5
<211>26
<212>PRT
<213>人工的
<400>5
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1         5          10           15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
       20          25
<210>6
<211>14
<212>PRT
<213>人工的
<400>6
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val Ala
1         5           10
<210>7
<211>14
<212>PRT
<213>人工的
<400>7
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala
1         5           10
<210>8
<211>13
<212>PRT
<213>人工的
<400>8
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Ala
1         5           10
<210>9
<211>14
<212>PRT
<213>人工的
<400>9
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala
1         5           10
<210>10
<211>14
<212>PRT
<213>人工的
<400>10
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Phe Val Ala
1         5           10
<210>11
<211>13
<212>PRT
<213>人工的
<400>11
Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ala
1         5           10
<210>12
<211>32
<212>PRT
<213>人工的
<400>12
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln
1         5           10           15
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
      20           25           30
<210>13
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<400>13
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1         5           10
<210>14
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<400>14
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1         5           10
<210>15
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<400>15
Ser Phe Gly Met Ser
1         5
<210>16
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<400>16
Leu Asn Leu Met Gly
1        5
<210>17
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<400>17
Ile Asn Leu Leu Gly
1         5
<210>18
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<400>18
Asn Tyr Trp Met Tyr
1         5
<210>19
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<400>19
Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1           5           10          15
Gly
<210>20
<211>16
<212>PRT
<213>人工的
<400>20
Thr Ile Thr Val Gly Asp Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1         5           10            15
<210>21
<211>16
<212>PRT
<213>人工的
<400>21
Thr Ile Thr Val Gly Asp Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1         5           10            15
<210>22
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<400>22
Ser Ile Asn Gly Arg Gly Asp Asp Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1         5           10           15
Gly
<210>23
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<400>23
Ala Ile Ser Ala Asp Ser Ser Thr Lys Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1          5           10           15
Gly
<210>24
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<400>24
Ala Ile Ser Ala Asp Ser Ser Asp Lys Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1          5           10           15
Gly
<210>25
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<400>25
Arg Ile Ser Thr Gly Gly Gly Tyr Ser Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1          5           10           15
Gly
<210>26
<211>13
<212>PRT
<213>人工的
<400>26
Asp Arg Glu Ala Gln Val Asp Thr Leu Asp Phe Asp Tyr
1        5           10
<210>27
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<400>27
Gly Gly Ser Leu Ser Arg
1         5
<210>28
<211>8
<212>PRT
<213>人工的
<400>28
Arg Arg Thr Trp His Ser Glu Leu
1        5
<210>29
<211>7
<212>PRT
<213>人工的
<400>29
Gly Arg Ser Val Ser Arg Ser
1         5
<210>30
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<400>30
Gly Arg Gly Ser Pro
1         5
<210>31
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<400>31
Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala
1         5           10           15
Ala
<210>32
<211>115
<212>PRT
<213>人工的
<400>32
Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1         5           10           15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe
       20           25          30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Pro Glu Trp Val
    35           40           45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
  50             55           60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65          70            75          80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
         85          90           95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Gln Val Thr
        100          105           110
Val Ser Ser
     115
<210>33
<211>115
<212>PRT
<213>人工的
<400>33
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1         5           10           15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
       20           25          30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
    35           40           45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
  50             55           60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65          70            75          80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
        85           90           95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
        100          105           110
Val Ser Ser
     115
<210>34
<211>117
<212>PRT
<213>人工的
<400>34
Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Gly Gly Gly
1         5          10           15
Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Ala Ser Glu Arg Ile Phe Asp Leu Asn
       20          25           30
Leu Met Gly Trp Tyr Arg Gln Gly Pro Gly Asn Glu Arg Glu Leu Val
    35          40           45
Ala Thr Cys Ile Thr Val Gly Asp Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
  50            55          60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Met Asp Tyr Thr Lys Gln Thr Val Tyr
65          70            75          80
Leu His Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Leu Tyr Tyr Cys
         85          90           95
Lys Ile Arg Arg Thr Trp His Ser Glu Leu Trp Gly Gln Gly Thr Gln
        100          105              110
Val Thr Val Ser Ser
     115
<210>35
<211>125
<212>PRT
<213>人工的
<400>35
Glu Val Gln Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1         5           10           15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Val Arg Thr Phe Ser Ile Tyr
       20           25           30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
    35           40          45
Ala Gly Ile Asn Arg Ser Gly Asp Val Thr Lys Tyr Ala Asp Phe Val
  50            55          60
Lys Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Met Val Tyr
65          70            75          80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
        85           90           95
Ala Ala Thr Trp Ala Tyr Asp Thr Val Gly Ala Leu Thr Ser Gly Tyr
       100           105         110
Asn Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
    115          120          125
<210>36
<211>122
<212>PRT
<213>人工的
<400>36
Glu Val Gln Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1         5          10            15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Lys Ile Thr His Tyr
       20           25          30
Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
    35          40           45
Ser Arg Ile Thr Trp Gly Gly Asp Asn Thr Phe Tyr Ser Asn Ser Val
  50            55          60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65          70            75          80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Asp Tyr Tyr Cys
         85          90          95
Ala Ala Gly Ser Thr Ser Thr Ala Thr Pro Leu Arg Val Asp Tyr Trp
       100           105          110
Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
    115          120
<210>37
<211>30
<212>PRT
<213>人工的
<400>37
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1         5           10           15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
       20           25          30
<210>38
<211>15
<212>PRT
<213>人工的
<400>38
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1         5           10           15
<210>39
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<400>39
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1         5
<210>40
<211>7
<212>PRT
<213>人工的
<400>40
Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1         5
<210>41
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
<400>41
Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Pro Ala Ala Ala
1         5           10
<210>42
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<400>42
Thr Tyr Thr Met Ala
1         5
<210>43
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<400>43
Ser Tyr Gly Met Gly
1         5
<210>44
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<400>44
Gly Phe Ala Met Gly
1         5
<210>45
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<400>45
Ser Asn Asn Met Gly
1        5
<210>46
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<400>46
Gly Asp Val Met Gly
1        5
<210>47
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<400>47
Ser Tyr Val Val Gly
1         5
<210>48
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<400>48
Asp Tyr Asn Met Ala
1        5
<210>49
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<400>49
Thr Tyr Thr Met Ala
1         5
<210>50
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<400>50
Asn Asn Ala Met Ala
1        5
<210>51
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<400>51
Ser Tyr Val Met Gly
1         5
<210>52
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<400>52
Ser Tyr Ala Met Gly
1         5
<210>53
<211>1
<212>PRT
<213>人工的
<400>53
Ala
l
<210>54
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<400>54
Gly Ile Ser Arg Ser Asp Gly Gly Thr Tyr Asp Ala Asp Ser Val Lys
1          5           10           15
Gly
<210>55
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<400>55
Gly Ile Ser Trp Arg Gly Asp Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1          5           10           15
Gly
<210>56
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<400>56
Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Leu Leu Tyr Val Asp Ser Val Lys
1          5           10           15
Gly
<210>57
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<400>57
Ala Ile Gly Trp Gly Gly Leu Glu Thr His Tyr Ser Asp Ser Val Lys
1          5           10           15
Gly
<210>58
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<400>58
Gly Phe Ser Arg Ser Thr Ser Thr Thr His Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1         5            10           15
Gly
<210>59
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<400>59
Gly Ile Ala Trp Gly Asp Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1         5           10            15
Gly
<210>60
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<400>60
His Ile Ser Trp Leu Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys
1          5           10           15
Gly
<210>61
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<400>61
Gly Phe Ser Gly Ser Gly Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala His Ser Val Glu
1         5           10           15
Gly
<210>62
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<400>62
Ala Ile Ser Trp Arg Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1          5           10           15
Gly
<210>63
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<400>63
Ala Ile Asn Trp Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1         5            10           15
Gly
<210>64
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<400>64
Thr Ile Ala Trp Asp Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1          5           10           15
Gly
<210>65
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<400>65
Gly Leu Ser Trp Ser Ala Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1         5           10               15
Gly
<210>66
<211>15
<212>PRT
<213>人工的
<400>66
Ala Ser Val Lys Leu Val Tyr Val Asn Pro Asn Arg Tyr Ser Tyr
1         5           10          15
<210>67
<211>15
<212>PRT
<213>人工的
<400>67
Ala Ala Gly Ser Ala Trp Tyr Gly Thr Leu Tyr Glu Tyr Asp Tyr
1         5           10            15
<210>68
<211>15
<212>PRT
<213>人工的
<400>68
Ala Ala Gly Ser Thr Trp Tyr Gly Thr Leu Tyr Glu Tyr Asp Tyr
1         5           10           15
<210>69
<211>21
<212>PRT
<213>人工的
<400>69
Met Val Gly Pro Pro Pro Arg Ser Leu Asp Tyr Gly Leu Gly Asn His
1         5           10           15
Tyr Glu Tyr Asp Tyr
      20
<210>70
<211>16
<212>PRT
<213>人工的
<400>70
Ser Ser Thr Arg Thr Val Ile Tyr Thr Leu Pro Arg Met Tyr Asn Tyr
1         5           10            15
<210>71
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<400>71
Asn Ser Arg Ser Ser Trp Val Ile Phe Thr Ile Lys Gly Gln Tyr Asp
1         5           10            15
Arg
<210>72
<211>15
<212>PRT
<213>人工的
<400>72
Arg Pro Gly Met Ile Ile Thr Thr Ile Gln Ala Thr Tyr Gly Phe
1         5            10            15
<210>73
<211>18
<212>PRT
<213>人工的
<400>73
Gly Ser Pro Tyr Gly Thr Glu Leu Pro Tyr Thr Arg Ile Glu Gln Tyr
1         5           10           15
Ala Tyr
<210>74
<211>15
<212>PRT
<213>人工的
<400>74
Ala Asn Glu Tyr Trp Val Tyr Val Asn Pro Asn Arg Tyr Thr Tyr
1         5          10           15
<210>75
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<400>75
Arg Arg Lys Ser Gly Glu Val Val Phe Thr Ile Pro Ala Arg Tyr Asp
1        5           10           15
Tyr
<210>76
<211>22
<212>PRT
<213>人工的
<400>76
Val Tyr Arg Val Gly Ala Ile Ser Glu Tyr Ser Gly Thr Asp Tyr Tyr
1         5           10            15
Thr Asp Glu Tyr Asp Tyr
      20
<210>77
<211>18
<212>PRT
<213>人工的
<400>77
Gly Tyr Gln Ile Asn Ser Gly Asn Tyr Asn Phe Lys Asp Tyr Glu Tyr
1         5            10          15
Asp Tyr
<210>78
<211>20
<212>PRT
<213>人工的
<400>78
Ser Tyr Asn Val Tyr Tyr Asn Asn Tyr Tyr Tyr Pro Ile Ser Arg Asp
1         5           10          15
Glu Tyr Asp Tyr
      20
<210>79
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<400>79
His Arg Arg Pro Phe Ala Ser Val Phe Thr Thr Thr Arg Met Tyr Asp
1         5           10           15
Tyr
<210>80
<211>124
<212>PRT
<213>人工的
<400>80
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1         5           10           15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Thr Tyr
       20           25          30
Thr Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
    35           40          45
Gln Gly Ile Ser Arg Ser Asp Gly Gly Thr Tyr Asp Ala Asp Ser Val
  50            55          60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65          70            75          80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
        85           90           95
Ala Ala Ala Ser Val Lys Leu Val Tyr Val Asn Pro Asn Arg Tyr Ser
       100           105          110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
     115          120
<210>81
<211>124
<212>PRT
<213>人工的
<400>81
Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly
1         5           10           15
Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser Arg Ser Tyr
       20           25          30
Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
    35           40          45
Ser Gly Ile Ser Trp Arg Gly Asp Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
  50             55          60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Asp
65          70            75          80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
        85           90           95
Ala Ala Ala Ala Gly Ser Ala Trp Tyr Gly Thr Leu Tyr Glu Tyr Asp
       100           105          110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
     115          120
<210>82
<211>124
<212>PRT
<213>人工的
<400>82
Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1         5           10           15
Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser Arg Ser Tyr
       20          25           30
Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
    35           40          45
Ser Gly Ile Ser Trp Arg Gly Asp Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
  50            55           60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Asp
65          70            75          80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
        85           90           95
Ala Ala Ala Ala Gly Ser Thr Trp Tyr Gly Thr Leu Tyr Glu Tyr Asp
       100          105           110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
    115           120
<210>83
<211>130
<212>PRT
<213>人工的
<400>83
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1         5           10           15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Gly Phe
       20           25          30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
    35           40          45
Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Leu Leu Tyr Val Asp Ser Val
  50            55           60
Lys Gly Arp Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val His
65          70            75          80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
        85           90           95
Ala Ala Met Val Gly Pro Pro Pro Arg Ser Leu Asp Tyr Gly Leu Gly
       100          105           110
Asn His Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
    115           120          125
Ser Ser
  130
<210>84
<211>125
<212>PRT
<213>人工的
<400>84
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1         5           10           15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Asp Arg Thr Phe Ser Ser Asn
       20           25          30
Asn Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
    35          40           45
Ala Ala Ile Gly Trp Gly Gly Leu Glu Thr His Tyr Ser Asp Ser Val
  50            55          60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65          70            75          80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys
        85           90           95
Ala Val Ser Ser Thr Arg Thr Val Ile Tyr Thr Leu Pro Arg Met Tyr
       100           105           110
Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
    115          120           125
<210>85
<211>126
<212>PRT
<213>人工的
<400>85
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1         5          10            15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Arg Thr Phe Ser Gly Asp
       20           25          30
Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
    35           40          45
Ala Gly Phe Ser Arg Ser Thr Ser Thr Thr His Tyr Ala Asp Ser Val
  50           55           60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gly Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65          70            75          80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
        85           90           95
Ala Ala Asn Ser Arg Ser Ser Trp Val Ile Phe Thr Ile Lys Gly Gln
       100          105           110
Tyr Asp Arg Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
    115          120          125
<210>86
<211>124
<212>PRT
<213>人工的
<400>86
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1         5           10           15
Ser Leu Arg Val Ser Cys Val Ala Ser Ile Arg Ser Phe Ser Ser Tyr
       20           25          30
Val Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Asp Arg Glu Phe Val
    35           40          45
Ala Gly Ile Ala Trp Gly Asp Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
  50            55          60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp His Ala Lys Asn Thr Ala Tyr
65          70            75          80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
        85           90           95
Ala Val Arg Pro Gly Met Ile Ile Thr Thr Ile Gln Ala Thr Tyr Gly
       100          105        110
Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
    115           120
<210>87
<211>127
<212>PRT
<213>人工的
<400>87
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Ala
1         5           10           15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Tyr Phe Ser Asp Tyr
       20           25          30
Asn Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
    35           40          45
Ala His Ile Ser Trp Leu Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
  50             55          60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asp Thr Val Tyr
65          70            75          80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Ser Cys
        85           90           95
Ala Ala Gly Ser Pro Tyr Gly Thr Glu Leu Pro Tyr Thr Arg Ile Glu
       100           105          110
Gln Tyr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
    115           120          125
<210>88
<211>124
<212>PRT
<213>人工的
<400>88
Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1         5           10       15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Thr Tyr
       20           25          30
Thr Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
    35           40          45
Gln Gly Ile Ser Arg Ser Asp Gly Gly Thr Tyr Asp Ala Asp Ser Val
  50            55           60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65          70            75          80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
        85           90           95
Ala Ala Ala Asn Glu Tyr Trp Val Tyr Val Asn Pro Asn Arg Tyr Thr
       100          105          110
Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
    115           120
<210>89
<211>126
<212>PRT
<213>人工的
<400>89
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1         5           10           15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Arg Thr Phe Glu Asn Asn
       20           25          30
Ala Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Ala Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
    35           40          45
Ala Gly Phe Ser Gly Ser Gly Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala His Ser Val
  50           55           60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Asp
65          70            75          80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Ser Leu Glu Asp Thr Ala Val Tyr Leu Cys
        85           90           95
Ala Ala Arg Arg Lys Ser Gly Glu Val Val Phe Thr Ile Pro Ala Arg
       100          105          110
Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
    115           120          125
<210>90
<211>131
<212>PRT
<213>人工的
<400>90
Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1         5           10           15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ala Phe Ser Ser Tyr
       20           25          30
Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ile Val
    35           40          45
Gly Ala Ile Ser Trp Arg Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
  50            55           60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65          70            75          80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
        85           90           95
Ala Ala Val Tyr Arg Val Gly Ala Ile Ser Glu Tyr Ser Gly Thr Asp
       100          105           110
Tyr Tyr Thr Asp Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
    115          120          125
Val Ser Ser
  130
<210>91
<211>127
<212>PRT
<213>人工的
<400>91
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1         5           10           15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
       20           25          30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
    35           40          45
Val Ala Ile Asn Trp Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
  50            55           60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr
65          70            75          80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
        85           90           95
Ala Ala Gly Tyr Gln Ile Asn Ser Gly Asn Tyr Asn Phe Lys Asp Tyr
       100           105           110
Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
    115           120          125
<210>92
<211>129
<212>PRT
<213>人工的
<400>92
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1         5           10           15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
       20           25          30
Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Thr Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
    35           40          45
Ala Thr Ile Ala Trp Asp Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
  50            55           60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val His
65          70            75          80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
        85           90           95
Ala Ala Ser Tyr Asn Val Tyr Tyr Asn Asn Tyr Tyr Tyr Pro Ile Ser
       100          105           110
Arg Asp Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
    115          120           125
Ser
<210>93
<211>122
<212>PRT
<213>人工的
<400>93
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1         5           10           15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Gly Ala Trp Ala Trp
       20           25          30
Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Gly Gly Leu Ser
    35           40          45
Trp Ser Ala Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
  50           55           60
Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Phe Leu Gln Met Thr
65            70          75          80
Asn Leu Lys Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala His Arg
         85          90          95
Arg Pro Phe Ala Ser Val Phe Thr Thr Thr Arg Met Tyr Asp Tyr Trp
       100          105       110
Gly Pro Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
    115           120
<210>94
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<400>94
Phe Asn Ala Met Gly
1         5
<210>95
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<400>95
Ile Asn Val Met Ala
1         5
<210>96
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<400>96
Asn Tyr Ala Met Gly
1         5
<210>97
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<400>97
Arg Thr Ala Met Ala
1         5
<210>98
<211>16
<212>PRT
<213>人工的
<400>98
Val Ile Ile Ser Gly Gly Ser Thr His Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly
1           5           10           15
<210>99
<211>16
<212>PRT
<213>人工的
<400>99
Glu Ile Thr Arg Ser Gly Arg Thr Asn Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly
1          5           10          15
<210>100
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<400>100
Ala Ile Asn Trp Asn Ser Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1         5            10           15
Gly
<210>101
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<400>101
Thr Ile Thr Trp Asn Ser Gly Thr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1         5            10           15
Gly
<210>102
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<400>102
Lys Lys Phe Gly Asp Tyr
1         5
<210>103
<211>8
<212>PRT
<213>人工的
<400>103
Ile Asp Gly Ser Trp Arg Glu Tyr
1         5
<210>104
<211>16
<212>PRT
<213>人工的
<400>104
Ser His Asp Ser Asp Tyr Gly Gly Thr Asn Ala Asn Leu Tyr Asp Tyr
1         5           10           15
<210>105
<211>15
<212>PRT
<213>人工的
<400>105
Thr Ala Ala Ala Val Ile Thr Pro Thr Arg Gly Tyr Tyr Asn Tyr
1         5            10           15
<210>106
<211>114
<212>PRT
<213>人工的
<400>106
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1         5          10            15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Thr Phe Asn
       20           25          30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
    35          40           45
Ala Val Ile Ile Ser Gly Gly Ser Thr His Tyr Val Asp Ser Val Lys
  50             55           60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Met Val Tyr Leu
65          70            75          80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
        85           90           95
Val Lys Lys Phe Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
       100          105          110
Ser Ser
<210>107
<211>116
<212>PRT
<213>人工的
<400>107
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1         5          10           15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Ser Ile Ser Thr Ile Asn
       20           25          30
Val Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
    35           40          45
Ala Glu Ile Thr Arg Ser Gly Arg Thr Asn Tyr Val Asp Ser Val Lys
  50            55           60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr Leu
65          70            75          80
Gln Met Asn Ser Leu Asn Leu Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Arg
        85           90          95
Thr Ile Asp Gly Ser Trp Arg Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val
        100          105          110
Thr Val Ser Ser
    115
<210>108
<211>125
<212>PRT
<213>人工的
<400>108
Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1        5            10           15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asn Tyr
       20           25          30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Gln Glu Arg Glu Phe Val
    35          40           45
Ala Ala Ile Asn Trp Asn Ser Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
  50            55          60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Leu Asn Ala Arg Asn Thr Val Tyr
65          70            75          80
Leu Gln Met Asn Arg Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Asp Cys
        85          90           95
Ala Ala Ser His Asp Ser Asp Tyr Gly Gly Thr Asn Ala Asn Leu Tyr
       100          105           110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
    115          120          125
<210>109
<211>124
<212>PRT
<213>人工的
<400>109
Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1         5          10           15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Arg Thr
       20           25          30
Ala Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
    35           40          45
Ala Thr Ile Thr Trp Asn Ser Gly Thr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
  50            55           60
Lys Gly Arg Phe Phe Ile Ser Lys Asp Ser Ala Lys Asn Thr Ile Tyr
65          70            75           80
Leu Glu Met Asn Ser Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
        85           90           95
Ala Ala Thr Ala Ala Ala Val Ile Thr Pro Thr Arg Gly Tyr Tyr Asn
       100          105            110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
    115           120
<210>110
<211>243
<212>PRT
<213>人工的
<400>110
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1         5           10           15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
       20           25          30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
    35           40          45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
  50             55           60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65          70            75          80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
        85           90           95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
        100          105           110
Val Ser Ser Ala Ala Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
    115            120          125
Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Asp
  130          135           140
Arg Thr Phe Ser Ser Asn Asn Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly
145          150          155           160
Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Gly Trp Gly Gly Leu Glu Thr
         165          170           175
His Tyr Ser Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
       180          185           190
Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
     195         200          205
Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala Val Ser Ser Thr Arg Thr Val Ile Tyr
  210           215         220
Thr Leu Pro Arg Met Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
225          230          235          240
Val Ser Ser
<210>111
<211>245
<212>PRT
<213>人工的
<400>111
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1         5           10           15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
       20           25          30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
    35           40           45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
  50             55           60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65          70            75          80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
        85           90           95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
        100          105           110
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
    115           120           125
Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
  130          135          140
Ser Asp Arg Thr Phe Ser Ser Asn Asn Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala
145          150           155         160
Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Gly Trp Gly Gly Leu
         165          170          175
Glu Thr His Tyr Ser Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
       180           185          190
Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro
    195          200          205
Glu Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala Val Ser Ser Thr Arg Thr Val
  210          215          220
Ile Tyr Thr Leu Pro Arg Met Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln
225           230          235          240
Val Thr Val Ser Ser
         245
<210>112
<211>249
<212>PRT
<213>人工的
<400>112
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1         5           10              15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
       20           25          30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
    35           40           45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
  50             55           60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65          70            75          80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
        85           90           95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Gln Val Thr
        100          105           110
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu
    115            120          125
Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu
  130           135          140
Ser Cys Ala Ala Ser Asp Arg Thr Phe Ser Ser Asn Asn Met Gly Trp
145          150           155          160
Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Gly
        165           170          175
Trp Gly Gly Leu Glu Thr His Tyr Ser Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
       180          185           190
Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn
     195          200           205
Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala Val Ser Ser
  210           215          220
Thr Arg Thr Val Ile Tyr Thr Leu Pro Arg Met Tyr Asn Tyr Trp Gly
225          230            235         240
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        245
<210>113
<211>265
<212>PRT
<213>人工的
<400>113
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1         5           10           15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
       20           25          30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
    35          40           45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
  50            55            60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65          70            75          80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
        85           90           95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Gln Val Thr
        100          105           110
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
    115           120           125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu
  130           135          140
Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu
145          150          155           160
Ser Cys Ala Ala Ser Asp Arg Thr Phe Ser Ser Asn Asn Met Gly Trp
         165           170          175
Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Gly
       180          185          190
Trp Gly Gly Leu Glu Thr His Tyr Ser Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
    195          200           205
Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn
  210           215          220
Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala Val Ser Ser
225          230          235           240
Thr Arg Thr Val Ile Tyr Thr Leu Pro Arg Met Tyr Asn Tyr Trp Gly
         245            250          255
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
       260           265
<210>114
<211>242
<212>PRT
<213>人工的
<400>114
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1         5           10           15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
       20           25          30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
    35           40          45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
  50             55           60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65          70            75          80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
        85           90          95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
        100          105           110
Val Ser Ser Ala Ala Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
    115           120           125
Ser Val Gln Thr Gly Gly Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly
  130           135          140
Arg Thr Ser Arg Ser Tyr Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly
145          150           155          160
Lys Glu Arg Glu Phe Val Ser Gly Ile Ser Trp Arg Gly Asp Ser Thr
         165          170            175
Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
       180          185          190
Ala Lys Asn Thr Val Asp Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
    195          200          205
Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Ala Gly Ser Ala Trp Tyr Gly
  210            215          220
Thr Leu Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
225          230          235           240
Ser Ser
<210>115
<211>244
<212>PRT
<213>人工的
<400>115
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1         5           10           15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
       20           25          30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
    35           40           45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
  50             55           60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65          70            75          80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
        85           90          95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
        100          105           110
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
    115           120           125
Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala
  130           135          140
Ser Gly Arg Thr Ser Arg Ser Tyr Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala
145          150           155          160
Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ser Gly Ile Ser Trp Arg Gly Asp
         165          170           175
Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
       180          185           190
Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Asp Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro
    195          200          205
Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Ala Gly Ser Ala Trp
  210          215           220
Tyr Gly Thr Leu Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val
225          230          235           240
Thr Val Ser Ser
<210>116
<211>248
<212>PRT
<213>人工的
<400>116
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1         5           10           15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
       20           25          30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
    35           40           45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
  50             55           60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65          70            75          80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
        85           90           95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Gln Val Thr
        100          105           110
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu
    115           120           125
Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly Ser Leu Arg Leu
  130           135          140
Thr Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser Arg Ser Tyr Gly Met Gly Trp
145          150          155           160
Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ser Gly Ile Ser
         165          170          175
Trp Arg Gly Asp Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
      180           185          190
Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Asp Leu Gln Met Asn
     195          200           205
Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Ala
  210           215          220
Gly Ser Ala Trp Tyr Gly Thr Leu Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln
225           230          235          240
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
         245
<210>117
<211>264
<212>PRT
<213>人工的
<400>117
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1         5           10          15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
       20           25          30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
    35           40           45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
  50            55            60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65          70            75          80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
        85           90           95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Gln Val Thr
        100          105           110
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
     115          120           125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu
  130       135              140
Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly Ser Leu Arg Leu
145           150          155          160
Thr Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser Arg Ser Tyr Gly Met Gly Trp
         165          170           175
Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ser Gly Ile Ser
       180          185          190
Trp Arg Gly Asp Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
    195          200           205
Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Asp Leu Gln Met Asn
  210           215          220
Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Ala
225          230          235            240
Gly Ser Ala Trp Tyr Gly Thr Leu Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln
         245           250          255
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
       260
<210>118
<211>249
<212>PRT
<213>人工的
<400>118
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1         5           10           15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Asp Arg Thr Phe Ser Ser Asn
       20           25          30
Asn Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
    35           40          45
Ala Ala Ile Gly Trp Gly Gly Leu Glu Thr His Tyr Ser Asp Ser Val
  50            55           60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Aeg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65          70            75          80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys
        85           90           95
Ala Val Ser Ser Thr Arg Thr Val Ile Tyr Thr Leu Pro Arg Met Tyr
       100           105           110
Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
    115          120          125
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
  130           135          140
Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
145          150          155          160
Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
         165           170          175
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr
       180          185            190
Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
    195          200           205
Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp
  210           215         220
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser
225          230           235           240
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
         245
<210>119
<211>265
<212>PRT
<213>人工的
<400>119
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1         5           10           15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Asp Arg Thr Phe Ser Ser Asn
       20           25          30
Asn Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
    35          40           45
Ala Ala Ile Gly Trp Gly Gly Leu Glu Thr His Tyr Ser Asp Ser Val
  50            55          60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65          70            75          80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys
        85           90           95
Ala Val Ser Ser Thr Arg Thr Val Ile Tyr Thr Leu Pro Arg Met Tyr
       100           105       110
Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
    115          120           125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
  130       135              140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
145          150           155          160
Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
         165          170          175
Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
       180           185          190
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr
    195          200            205
Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
  210          215           220
Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp
225          230          235          240
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser
         245          250            255
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
      260           265
<210>120
<211>248
<212>PRT
<213>人工的
<400>120
Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly
1         5          10           15
Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser Arg Ser Tyr
       20           25          30
Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
    35           40          45
Ser Gly Ile Ser Trp Arg Gly Asp Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
  50             55          60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Asp
65          70            75          80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
        85           90           95
Ala Ala Ala Ala Gly Ser Ala Trp Tyr Gly Thr Leu Tyr Glu Tyr Asp
       100          105           110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
     115          120          125
Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
  130           135          140
Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
145          150          155           160
Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
         165           170          175
Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu
       180          185            190
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
     195          200          205
Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr
  210          215          220
Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln
225          230           235           240
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
         245
<210>121
<211>264
<212>PRT
<213>人工的
<400>121
Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly
1         5           10           15
Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser Arg Ser Tyr
       20          25           30
Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
    35           40          45
Ser Gly Ile Ser Trp Arg Gly Asp Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
  50            55           60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Asp
65          70            75          80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
        85           90           95
Ala Ala Ala Ala Gly Ser Ala Trp Tyr Gly Thr Leu Tyr Glu Tyr Asp
       100          105           110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
     115          120          125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
  130           135          140
Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
145          150          155           160
Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
         165          170           175
Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
       180           185          190
Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu
    195          200            205
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
  210          215           220
Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr
225          230          235          240
Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln
         245          250            255
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
       260
<210>122
<211>257
<212>PRT
<213>人工的
<400>122
Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly
1         5          10           15
Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser Arg Ser Tyr
       20           25          30
Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
    35           40          45
Ser Gly Ile Ser Trp Arg Gly Asp Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
  50             55          60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Asp
65          70            75          80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
        85           90          95
Ala Ala Ala Ala Gly Ser Ala Trp Tyr Gly Thr Leu Tyr Glu Tyr Asp
       100          105           110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
    115           120          125
Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser
   130          135          140
Val Gln Thr Gly Gly Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Arg
145          150          155           160
Thr Ser Arg Ser Tyr Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
         165           170          175
Glu Arg Glu Phe Val Ser Gly Ile Ser Trp Arg Gly Asp Ser Thr Gly
       180          185            190
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
    195           200          205
Lys Asn Thr Val Asp Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr
  210          215          220
Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Ala Gly Ser Ala Trp Tyr Gly Thr
225           230           235          240
Leu Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
        245           250          255
Ser
<210>123
<211>273
<212>PRT
<213>人工的
<400>123
Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly
1         5          10           15
Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser Arg Ser Tyr
       20          25           30
Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
    35           40          45
Ser Gly Ile Ser Trp Arg Gly Asp Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
  50             55          60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Asp
65          70            75                      80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
        85           90           95
Ala Ala Ala Ala Gly Ser Ala Trp Tyr Gly Thr Leu Tyr Glu Tyr Asp
       100          105           110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
    115           120          125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
  130           135          140
Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser
145          150           155          160
Val Gln Thr Gly Gly Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Arg
         165           170          175
Thr Ser Arg Ser Tyr Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
        180         185           190
Glu Arg Glu Phe Val Ser Gly Ile Ser Trp Arg Gly Asp Ser Thr Gly
    195          200            205
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
  210           215          220
Lys Asn Thr Val Asp Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr
225          230          235          240
Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Ala Gly Ser Ala Trp Tyr Gly Thr
          245           250          255
Leu Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
      260           265          270
Ser
<210>124
<211>383
<212>PRT
<213>人工的
<400>124
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1         5           10           15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Asp Arg Thr Phe Ser Ser Asn
      20            25          30
Asn Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
    35          40           45
Ala Ala Ile Gly Trp Gly Gly Leu Glu Thr His Tyr Ser Asp Ser Val
  50            55          60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65          70            75                      80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys
         85          90           95
Ala Val Ser Ser Thr Arg Thr Val Ile Tyr Thr Leu Pro Arg Met Tyr
       100           105           110
Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
    115          120          125
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
  130           135          140
Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Asp
145          150           155          160
Arg Thr Phe Ser Ser Asn Asn Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly
         165           170         175
Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Gly Trp Gly Gly Leu Glu Thr
       180          185           190
His Tyr Ser Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
     195          200           205
Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
  210          215          220
Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala Val Ser Ser Thr Arg Thr Val Ile Tyr
225          230          235            240
Thr Leu Pro Arg Met Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
         245          250          255
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu
       260           265          270
Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu
    275           280          285
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp
  290           295          300
Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser
305          310          315           320
Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
          325          330          335
Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn
        340          345          350
Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly
     355          360          365
Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
  370           375           380
<210>125
<211>377
<212>PRT
<213>人工的
<400>125
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1         5           10           15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Asp Arg Thr Phe Ser Ser Asn
       20           25          30
Asn Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
    35          40           45
Ala Ala Ile Gly Trp Gly Gly Leu Glu Thr His Tyr Ser Asp Ser Val
  50            55          60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65          70            75          80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys
         85          90           95
Ala Val Ser Ser Thr Arg Thr Val Ile Tyr Thr Leu Pro Arg Met Tyr
       100           105           110
Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
    115           120          125
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
  130           135          140
Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Asp
145          150          155           160
Arg Thr Phe Ser Ser Asn Asn Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly
         165          170          175
Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Gly Trp Gly Gly Leu Glu Thr
       180          185           190
His Tyr Ser Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
     195          200           205
Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
  210          215          220
Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala Val Ser Ser Thr Arg Thr Val Ile Tyr
225          230          235           240
Thr Leu Pro Arg Met Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
         245          250          255
Val Ser Ser Ala Ala Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
       260           265          270
Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
    275           280          285
Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
  290           295          300
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr
305          310          315             320
Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
         325          330           335
Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp
      340           345          350
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser
     355          360           365
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
  370          375
<210>126
<211>381
<212>PRT
<213>人工的
<400>126
Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly
1         5          10                15
Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser Arg Ser Tyr
       20          25           30
Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
    35           40          45
Ser Gly Ile Ser Trp Arg Gly Asp Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
  50            55           60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Asp
65          70            75           80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
        85           90           95
Ala Ala Ala Ala Gly Ser Ala Trp Tyr Gly Thr Leu Tyr Glu Tyr Asp
       100           105          110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
    115           120          125
Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser
  130           135          140
Val Gln Thr Gly Gly Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Arg
145          150           155          160
Thr Ser Arg Ser Tyr Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
         165           170          175
Glu Arg Glu Phe Val Ser Gly Ile Ser Trp Arg Gly Asp Ser Thr Gly
       180          185            190
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
     195          200          205
Lys Asn Thr Val Asp Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr
  210          215          220
Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Ala Gly Ser Ala Trp Tyr Gly Thr
225           230       235              240
Leu Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
         245          250          255
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu
       260          265           270
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys
     275          280          285
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg
  290           295          300
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser
305          310          315           320
Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
         325          330           335
Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
       340          345          350
Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu
    355          360           365
Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
  370           375          380
<210>127
<211>381
<212>PRT
<213>人工的
<400>127
Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1         5           10           15
Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser Arg Ser Tyr
       20          25           30
Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
    35          40           45
Ser Gly Ile Ser Trp Arg Gly Asp Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
  50            55           60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Asp
65          70            75          80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
        85           90           95
Ala Ala Ala Ala Gly Ser Thr Trp Tyr Gly Thr Leu Tyr Glu Tyr Asp
       100          105           110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
     115          120          125
Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser
  130           135          140
Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Arg
145          150           155          160
Thr Ser Arg Ser Tyr Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
         165           170          175
Glu Arg Glu Phe Val Ser Gly Ile Ser Trp Arg Gly Asp Ser Thr Gly
      180           185            190
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
    195           200          205
Lys Asn Thr Val Asp Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr
  210          215          220
Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Ala Gly Ser Thr Trp Tyr Gly Thr
225           230           235          240
Leu Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
         245          250           255
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu
       260          265           270
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys
     275          280          285
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg
  290           295          300
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser
305          310          315           320
Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
         325          330           335
Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
       340          345          350
Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu
     355          360          365
Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
  370           375          380
<210>128
<211>371
<212>PRT
<213>人工的
<400>128
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1         5           10           15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Asp Arg Thr Phe Ser Ser Asn
       20           25          30
Asn Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
    35          40           45
Ala Ala Ile Gly Trp Gly Gly Leu Glu Thr His Tyr Ser Asp Ser Val
  50            55          60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65          70            75          80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys
        85           90           95
Ala Val Ser Ser Thr Arg Thr Val Ile Tyr Thr Leu Pro Arg Met Tyr
       100           105           110
Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser
    115           120          125
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
  130          135           140
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
145          150          155           160
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
         165          170           175
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
        180           185           190
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
    195          200            205
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
  210          215          220
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
225           230           235           240
Val Ser Ser Ala Ala Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
          245           250         255
Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Asp
       260          265          270
Arg Thr Phe Ser Ser Asn Asn Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly
    275           280         285
Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Gly Trp Gly Gly Leu Glu Thr
  290          295           300
His Tyr Ser Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
305          310           315          320
Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
         325          330          335
Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala Val Ser Ser Thr Arg Thr Val Ile Tyr
       340          345           350
Thr Leu Pro Arg Met Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
    355          360           365
Val Ser Ser
  370
<210>129
<211>383
<212>PRT
<213>人工的
<400>129
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1         5           10           15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Asp Arg Thr Phe Ser Ser Asn
       20           25          30
Asn Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
    35          40           45
Ala Ala Ile Gly Trp Gly Gly Leu Glu Thr His Tyr Ser Asp Ser Val
  50            55          60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65          70            75          80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys
        85           90           95
Ala Val Ser Ser Thr Arg Thr Val Ile Tyr Thr Leu Pro Arg Met Tyr
       100           105           110
Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
    115           120          125
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
  130           135          140
Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
145          150           155          160
Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
         165           170          175
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr
       180          185            190
Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
    195           200          205
Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp
  210           215          220
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser
225          230           235           240
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
         245           250          255
Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala
       260          265          270
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Asp Arg Thr Phe Ser
    275           280          285
Ser Asn Asn Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu
  290          295          300
Phe Val Ala Ala Ile Gly Trp Gly Gly Leu Glu Thr His Tyr Ser Asp
305          310            315         320
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr
         325          330            335
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Arg Tyr
       340          345          350
Tyr Cys Ala Val Ser Ser Thr Arg Thr Val Ile Tyr Thr Leu Pro Arg
    355           360           365
Met Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
 370          375           380
<210>130
<211>381
<212>PRT
<213>人工的
<400>130
Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly
1         5           10           15
Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser Arg Ser Tyr
       20          25           30
Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
    35           40          45
Ser Gly Ile Ser Trp Arg Gly Asp Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
  50            55           60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Asp
65          70            75          80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
         85          90           95
Ala Ala Ala Ala Gly Ser Ala Trp Tyr Gly Thr Leu Tyr Glu Tyr Asp
       100          105           110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
     115          120          125
Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
  130           135          140
Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
145          150          155           160
Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
         165           170          175
Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu
      180           185            190
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
    195           200          205
Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr
  210          215          220
Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln
225          230            235          240
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
        245           250           255
Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly
       260          265           270
Gly Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser Arg Ser
    275          280           285
Tyr Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe
  290          295          300
Val Ser Gly Ile Ser Trp Arg Gly Asp Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser
305           310           315          320
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val
         325          330            335
Asp Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr
      340          345          350
Cys Ala Ala Ala Ala Gly Ser Ala Trp Tyr Gly Thr Leu Tyr Glu Tyr
    355           360           365
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
  370          375          380
<210>131
<211>382
<212>PRT
<213>人工的
<400>131
Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1         5           10           15
Ser Leu Arg Leu Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser Arg Ser
       20          25           30
Tyr Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe
    35          40           45
Val Ser Gly Ile Ser Trp Arg Gly Asp Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser
  50            55           60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val
65          70            75           80
Asp Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr
        85          90            95
Cys Ala Ala Ala Ala Gly Ser Thr Trp Tyr Gly Thr Leu Tyr Glu Tyr
      100           105           110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
    115           120          125
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
  130           135          140
Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
145          150          155           160
Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
         165           170          175
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr
       180          185            190
Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
    195          200           205
Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp
  210           215         220
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser
225          230           235           240
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
         245          250           255
Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala
       260          265           270
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser Arg
    275           280          285
Ser Tyr Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu
  290          295           300
Phe Val Ser Gly Ile Ser Trp Arg Gly Asp Ser Thr Gly Tyr Ala Asp
305           310           315          320
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr
         325          330            335
Val Asp Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr
      340          345          350
Tyr Cys Ala Ala Ala Ala Gly Ser Thr Trp Tyr Gly Thr Leu Tyr Glu
    355           360          365
Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
  370          375          380
<210>132
<211>383
<212>PRT
<213>人工的
<400>132
Glu Val Gln Leu Val Arg Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1         5          10            15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
       20           25          30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
    35          40           45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
  50             55           60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65          70            75          80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
        85           90           95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
        100          105       110
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu
    115            120          125
Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu
  130           135          140
Ser Cys Ala Ala Ser Asp Arg Thr Phe Ser Ser Asn Asn Met Gly Trp
145          150           155          160
Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Gly
         165           170         175
Trp Gly Gly Leu Glu Thr His Tyr Ser Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
       180          185           190
Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn
     195           200          205
Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala Val Ser Ser
  210           215         220
Thr Arg Thr Val Ile Tyr Thr Leu Pro Arg Met Tyr Asn Tyr Trp Gly
225          230            235         240
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
         245          250           255
Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala
       260          265           270
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Asp Arg Thr Phe Ser
    275           280          285
Ser Asn Asn Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu
   290         295          300
Phe Val Ala Ala Ile Gly Trp Gly Gly Leu Glu Thr His Tyr Ser Asp
305          310           315          320
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr
         325           330           335
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Arg Tyr
       340          345          350
Tyr Cys Ala Val Ser Ser Thr Arg Thr Val Ile Tyr Thr Leu Pro Arg
    355           360           365
Met Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
 370           375          380
<210>133
<211>381
<212>PRT
<213>人工的
<400>133
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1         5           10           15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
       20           25          30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
    35           40          45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
  50             55           60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65          70            75          80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
        85           90           95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
        100          105       110
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu
    115            120          125
Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly Ser Leu Arg Leu
  130           135          140
Thr Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser Arg Ser Tyr Gly Met Gly Trp
145          150           155          160
Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ser Gly Ile Ser
         165          170          175
Trp Arg Gly Asp Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
       180          185          190
Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Asp Leu Gln Met Asn
     195           200          205
Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Ala
   210          215          220
Gly Ser Ala Trp Tyr Gly Thr Leu Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln
225           230          235          240
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
         245           250          255
Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly
       260          265           270
Gly Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser Arg Ser
    275           280          285
Tyr Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe
  290          295          300
Val Ser Gly Ile Ser Trp Arg Gly Asp Thr Ser Gly Tyr Ala Asp Ser
305           310           315          320
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val
         325           330           335
Asp Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr
      340          345          350
Cys Ala Ala Ala Ala Gly Ser Ala Trp Tyr Gly Thr Leu Tyr Glu Tyr
    355           360           365
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
  370          375          380
<210>134
<211>257
<212>PRT
<213>人工的
<400>134
Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1         5           10           15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Arg Thr
       20           25          30
Ala Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
    35           40           45
Ala Thr Ile Thr Trp Asn Ser Gly Thr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
  50            55           60
Lys Gly Arg Phe Phe Ile Ser Lys Asp Ser Ala Lys Asn Thr Ile Tyr
65          70            75           80
Leu Glu Met Asn Ser Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
        85           90           95
Ala Ala Thr Ala Ala Ala Val Ile Thr Pro Thr Arg Gly Tyr Tyr Asn
       100       105               110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
     115          120          125
Ser Gly Gly Gly Ser Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu
  130           135          140
Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg
145          150           155          160
Thr Phe Ser Arg Thr Ala Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
         165           170          175
Glu Arg Glu Phe Val Ala Thr Ile Thr Trp Asn Ser Gly Thr Thr Arg
       180          185           190
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Phe Ile Ser Lys Asp Ser Ala
    195           200          205
Lys Asn Thr Ile Tyr Leu Glu Met Asn Ser Leu Glu Pro Glu Asp Thr
  210           215          220
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Thr Ala Ala Ala Val Ile Thr Pro Thr
225          230          235           240
Arg Gly Tyr Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
         245          250          255
Ser
<210>135
<211>273
<212>PRT
<213>人工的
<400>135
Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1         5           10           15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Arg Thr
       20           25          30
Ala Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
    35           40          45
Ala Thr Ile Thr Trp Asn Ser Gly Thr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
  50            55           60
Lys Gly Arg Phe Phe Ile Ser Lys Asp Ser Ala Lys Asn Thr Ile Tyr
65          70            75           80
Leu Glu Met Asn Ser Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
        85           90           95
Ala Ala Thr Ala Ala Ala Val Ile Thr Pro Thr Arg Gly Tyr Tyr Asn
       100          105            110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
    115           120          125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
  130           135          140
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu
145          150           155          160
Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg
         165           170          175
Thr Phe Ser Arg Thr Ala Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
       180          185           190
Glu Arg Glu Phe Val Ala Thr Ile Thr Trp Asn Ser Gly Thr Thr Arg
    195          200            205
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Phe Ile Ser Lys Asp Ser Ala
  210          215           220
Lys Asn Thr Ile Tyr Leu Glu Met Asn Ser Leu Glu Pro Glu Asp Thr
225           230          235          240
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Thr Ala Ala Ala Val Ile Thr Pro Thr
         245          250           255
Arg Gly Tyr Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
      260           265          270
Ser
<210>136
<211>257
<212>PRT
<213>人工的
<400>136
Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly
1         5           10           15
Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser Arg Ser Tyr
       20          25           30
Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
    35          40           45
Ser Gly Ile Ser Trp Arg Gly Asp Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
  50            55          60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Asp
65          70            75          80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
        85           90           95
Ala Ala Ala Ala Gly Ser Ala Trp Tyr Gly Thr Leu Tyr Glu Tyr Asp
       100          105           110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
     115          120          125
Ser Gly Gly Gly Ser Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu
  130           135          140
Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg
145          150          155           160
Thr Phe Ser Arg Thr Ala Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
         165           170          175
Glu Arg Glu Phe Val Ala Thr Ile Thr Trp Asn Ser Gly Thr Thr Arg
      180           185           190
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Phe Ile Ser Lys Asp Ser Ala
    195           200          205
Lys Asn Thr Ile Tyr Leu Glu Met Asn Ser Leu Glu Pro Glu Asp Thr
  210           215          220
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Thr Ala Ala Ala Val Ile Thr Pro Thr
225          230           235          240
Arg Gly Tyr Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
         245          250          255
Ser
<210>137
<211>273
<212>PRT
<213>人工的
<400>137
Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly
1         5           10           15
Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser Arg Ser Tyr
       20          25           30
Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
    35           40          45
Ser Gly Ile Ser Trp Arg Gly Asp Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
  50             55          60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Asp
65          70            75          80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
        85           90           95
Ala Ala Ala Ala Gly Ser Ala Trp Tyr Gly Thr Leu Tyr Glu Tyr Asp
       100          105           110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
     115          120          125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
  130           135          140
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu
145          150          155           160
Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg
         165           170          175
Thr Phe Ser Arg Thr Ala Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
       180          185           190
Glu Arg Glu Phe Val Ala Thr Ile Thr Trp Asn Ser Gly Thr Thr Arg
    195          200            205
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Phe Ile Ser Lys Asp Ser Ala
  210           215         220
Lys Asn Thr Ile Tyr Leu Glu Met Asn Ser Leu Glu Pro Glu Asp Thr
225           230          235          240
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Thr Ala Ala Ala Val Ile Thr Pro Thr
         245               250          255
Arg Gly Tyr Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
       260          265          270
Ser
<210>138
<211>381
<212>PRT
<213>人工的
<400>138
Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly
1         5           10           15
Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser Arg Ser Tyr
       20          25           30
Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
    35           40          45
Ser Gly Ile Ser Trp Arg Gly Asp Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
   50            55          60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Asp
65          70             75         80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
        85           90           95
Ala Ala Ala Ala Gly Ser Sla Trp Tyr Gly Thr Leu Tyr Glu Tyr Asp
       100          105           110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
    115           120          125
Ser Gly Gly Gly Ser Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu
   130          135          140
Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg
145          150           155          160
Thr Phe Ser Arg Thr Ala Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
         165           170          175
Glu Arg Glu Phe Val Ala Thr Ile Thr Trp Asn Ser Gly Thr Thr Arg
       180          185           190
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Phe Ile Ser Lys Asp Ser Ala
    195           200          205
Lys Asn Thr Ile Tyr Leu Glu Met Asn Ser Leu Glu Pro Glu Asp Thr
  210           215          220
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Thr Ala Ala Ala Val Ile Thr Pro Thr
225          230          235           240
Arg Gly Tyr Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
         245          250           255
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu
       260          265           270
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys
    275           280           285
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg
  290           295          300
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser
305          310          315           320
Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
         325          330           335
Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
       340          345          350
Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu
    355          360           365
Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
   370          375          380
<210>139
<211>381
<212>PRT
<213>人工的
<400>139
Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly
1         5           10           15
Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser Arg Ser Tyr
       20           25          30
Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
    35           40          45
Ser Gly Ile Ser Trp Arg Gly Asp Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
  50             55          60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Asp
65           70           75          80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
        85           90           95
Ala Ala Ala Ala Gly Ser Ala Trp Tyr Gly Thr Leu Tyr Glu Tyr Asp
       100           105          110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
     115          120          125
Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
  130           135          140
Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
145          150          155           160
Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
         165           170          175
Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu
       180          185            190
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
    195           200          205
Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr
  210           215         220
Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln
225          230            235          240
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
         245          250           255
Ser Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly
       260          265           270
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Arg
    275           280           285
Thr Ala Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe
   290         295          300
Val Ala Thr Ile Thr Trp Asn Ser Gly Thr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser
305           310          315           320
Val Lys Gly Arg Phe Phe Ile Ser Lys Asp Ser Ala Lys Asn Thr Ile
         325          330            335
Tyr Leu Glu Met Asn Ser Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
      340          345           350
Cys Ala Ala Thr Ala Ala Ala Val Ile Thr Pro Thr Arg Gly Tyr Tyr
    355           360           365
Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val thr Val Ser Ser
  370          375          380
<210>140
<211>397
<212>PRT
<213>人工的
<400>140
Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly
1         5           10           15
Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser Arg Ser Tyr
       20           25          30
Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
    35           40          45
Ser Gly Ile Ser Trp Arg Gly Asp Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
  50            55           60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Asp
65          70            75          80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
        85           90           95
Ala Ala Ala Ala Gly Ser Ala Trp Tyr Gly Thr Leu Tyr Glu Tyr Asp
       100          105           110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
    115           120          125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
  130           135      140
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu
145          150          155           160
Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg
         165           170          175
Thr Phe Ser Arg Thr Ala Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
       180          185           190
Glu Arg Glu Phe Val Ala Thr Ile Thr Trp Asn Ser Gly Thr Thr Arg
    195          200            205
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Phe Ile Ser Lys Asp Ser Ala
  210           215          220
Lys Asn Thr Ile Tyr Leu Glu Met Asn Ser Leu Glu Pro Glu Asp Thr
225           230          235          240
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Thr Ala Ala Ala Val Ile Thr Pro Thr
         245          250           255
Arg Gly Tyr Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
      260           265          270
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu
    275           280           285
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys
  290           295          300
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg
305           310          315          320
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser
         325          330           335
Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
       340          345          350
Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
    355          360           365
Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu
  370          375           380
Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
385           390           395
<210>141
<211>257
<212>PRT
<213>人工的
<400>141
Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly
1         5           10           15
Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser Arg Ser Tyr
       20          25           30
Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
    35           40          45
Ser Gly Ile Ser Trp Arg Gly Asp Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
  50            55           60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Asp
65          70            75          80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
        85           90           95
Ala Ala Ala Ala Gly Ser Ala Trp Tyr Gly Thr Leu Tyr Glu Tyr Asp
       100          105           110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
     115          120          125
Ser Gly Gly Gly Ser Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu
   130          135          140
Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg
145          150           155          160
Thr Phe Ser Arg Thr Ala Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
         165           170          175
Glu Arg Glu Phe Val Ala Thr Ile Thr Trp Asn Ser Gly Thr Thr Arg
      180           185            190
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Phe Ile Ser Lys Asp Ser Ala
    195           200          205
Lys Asn Thr Ile Tyr Leu Glu Met Asn Ser Leu Glu Pro Glu Asp Thr
  210           215          220
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Thr Ala Ala Ala Val Ile Thr Pro Thr
225          230          235           240
Arg Gly Tyr Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
         245          250          255
Ser
<210>142
<211>381
<212>PRT
<213>人工的
<400>142
Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly
1         5           10           15
Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser Arg Ser Tyr
       20          25           30
Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
    35           40          45
Ser Gly Ile Ser Trp Arg Gly Asp Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
  50             55          60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Asp
65          70            75          80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
        85           90           95
Ala Ala Ala Ala Gly Ser Ala Trp Tyr Gly Thr Leu Tyr Glu Tyr Asp
       100           105          110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
     115          120          125
Ser Gly Gly Gly Ser Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu
  130           135          140
Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg
145          150           155          160
Thr Phe Ser Arg Thr Ala Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
         165          170           175
Glu Arg Glu Phe Val Ala Thr Ile Thr Trp Asn Ser Gly Thr Thr Arg
      180           185           190
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Phe Ile Ser Lys Asp Ser Ala
    195          200           205
Lys Asn Thr Ile Tyr Leu Glu Met Asn Ser Leu Glu Pro Glu Asp Thr
  210           215          220
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Thr Ala Ala Ala Val Ile Thr Pro Thr
225          230          235           240
Arg Gly Tyr Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
         245          250          255
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu
       260          265           270
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys
    275           280          285
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg
  290           295          300
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser
305          310          315           320
Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
         325          330          335
Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
       340          345          350
Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu
    355          360           365
Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
  370           375          380
<210>143
<211>381
<212>PRT
<213>人工的
<400>143
Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly
1         5           10          15
Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser Arg Ser Tyr
       20           25          30
Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
    35           40          45
Ser Gly Ile Ser Trp Arg Gly Asp Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
  50            55           60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Asp
65          70            75          80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
        85           90           95
Ala Ala Ala Ala Gly Ser Ala Trp Tyr Gly Thr Leu Tyr Glu Tyr Asp
       100          105           110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
    115           120          125
Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
  130           135          140
Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
145          150          155           160
Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
         165           170          175
Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu
       180          185            190
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
    195          200           205
Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr
  210          215          220
Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln
225          230            235          240
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
         245          250           255
Ser Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly
       260          265           270
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Arg
    275          280           285
Thr Ala Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe
  290          295          300
Val Ala Thr Ile Thr Trp Asn Ser Gly Thr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser
305           310           315          320
Val Lys Gly Arg Phe Phe Ile Ser Lys Asp Ser Ala Lys Asn Thr Ile
         325          330           335
Tyr Leu Glu Met Asn Ser Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
       340         345           350
Cys Ala Ala Thr Ala Ala Ala Val Ile Thr Pro Thr Arg Gly Tyr Tyr
    355           360           365
Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
 370           375          380

Claims (37)

1.针对EGFR的纳米抗体，其包括或由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1-CDR3)组成，其中：
CDR1是这样的氨基酸序列，其选自由下列各项组成的组：
TYTMA    [SEQ ID NO：42]
SYGMG    [SEQ ID NO：43]
GFAMG    [SEQ ID NO：44]
SNNMG    [SEQ ID NO：45]
GDVMG    [SEQ ID NO：46]
SYVVG    [SEQ ID NO：47]
DYNMA    [SEQ ID NO：48]
TYTMA    [SEQ ID NO：49]
NNAMA    [SEQ ID NO：50]
SYVMG    [SEQ ID NO：51]
SYAMG    [SEQ ID NO：52]
A        [SEQ ID NO：53]
或选自由这样的氨基酸序列组成的组，所述氨基酸序列与以上氨基酸序列之一具有至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％，甚至更优选地至少99％的序列同一性(如本文定义)；其中：
(i)任何氨基酸替换优选地是保守氨基酸替换(如本文定义)；和/或
(ii)所述氨基酸序列与以上氨基酸序列相比，优选地仅含有氨基酸替换，且没有氨基酸缺失或插入；
和/或选自由这样的氨基酸序列组成的组，所述氨基酸序列与以上氨基酸序列之一相比具有2个或仅1个的“氨基酸的区别”(如本文所定义的)，其中：
(i)任意氨基酸替换优选地是保守的氨基酸替换(如本文所定义的)；和/或
(ii)所述氨基酸序列与以上氨基酸序列相比，优选地仅含有氨基酸替换，且没有氨基酸缺失或插入；
和/或其中：
CDR2是这样的氨基酸序列，其选自由下列各项组成的组：
GISRSDGGTYDADSVKG    [SEQ ID NO：54]
GISWRGDSTGYADSVKG    [SEQ ID NO：55]
AISWSGGSLLYVDSVKG    [SEQ ID NO：56]
AIGWGGLETHYSDSVKG    [SEQ ID NO：57]
GFSRSTSTTHYADSVKG    [SEQ ID NO：58]
GIAWGDGITYYADSVKG    [SEQ ID NO：59]
HISWLGGRTYYRDSVKG    [SEQ ID NO：60]
GFSGSGGATYYAHSVEG    [SEQ ID NO：61]
AISWRGGSTYYADSVKG    [SEQ ID NO：62]
AINWSSGSTYYADSVKG    [SEQ ID NO：63]
TIAWDSGSTYYADSVKG    [SEQ ID NO：64]
GLSWSADSTYYADSVKG    [SEQ ID NO：65]
或选自由这样的氨基酸序列组成的组，所述氨基酸序列具有与以上氨基酸序列之一至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％，甚至更优选地至少99％的序列同一性(如本文所定义的)；其中
(i)任意氨基酸替换优选地是保守的氨基酸替换(如本文所定义的)；和/或
(ii)所述氨基酸序列与以上氨基酸序列相比，优选地仅含有氨基酸替换，且没有氨基酸缺失或插入；
和/或选自由这样的氨基酸序列组成的组，所述氨基酸序列与以上氨基酸序列之一相比具有3个，2个或仅1个的“氨基酸的区别”(如本文所定义的)，其中：
(i)任意氨基酸替换优选地是保守的氨基酸替换(如本文所定义的)；和/或
(ii)所述氨基酸序列与以上氨基酸序列相比，优选地仅含有氨基酸替换，且没有氨基酸缺失或插入；
和/或其中：
CDR3是这样的氨基酸序列，其选自由下列各项组成的组：
ASVKLVYVNPNRYSY            [SEQ ID NO：66]
AAGSAWYGTLYEYDY            [SEQ ID NO：67]
AAGSTWYGTLYEYDY            [SEQ ID NO：68]
MVGPPPRSLDYGLGNHYEYDY      [SEQ ID NO：69]
SSTRTVIYTLPRMYNY           [SEQ ID NO：70]
NSRSSWVIFTIKGQYDR          [SEQ ID NO：71]
RPGMIITTIQATYGF            [SEQ ID NO：72]
GSPYGTELPYTRIEQYAY         [SEQ ID NO：73]
ANEYWVYVNPNRYTY            [SEQ ID NO：74]
RRKSGEVVFTIPARYDY          [SEQ ID NO：75]
VYRVGAISEYSGTDYYTDEYDY     [SEQ ID NO：76]
GYQINSGNYNFKDYEYDY         [SEQ ID NO：77]
SYNVYYNNYYYPISRDEYDY       [SEQ ID NO：78]
HRRPFASVFTTTRMYDY          [SEQ ID NO：79]
或选自由这样的氨基酸序列组成的组，所述氨基酸序列具有与以上氨基酸序列之一至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％，甚至更优选地至少99％的序列同一性(如本文所定义的)；其中
(i)任意氨基酸替换优选地是保守的氨基酸替换(如本文所定义的)；和/或
(ii)所述氨基酸序列与以上氨基酸序列相比，优选地仅含有氨基酸替换，且没有氨基酸缺失或插入；
和/或选自由这样的氨基酸序列组成的组，所述氨基酸序列与以上氨基酸序列之一相比具有3个，2个或仅1个的“氨基酸的区别”(如本文所定义的)，其中：
(i)任意氨基酸替换优选地是保守的氨基酸替换(如本文所定义的)；和/或
(ii)所述氨基酸序列与以上氨基酸序列相比，优选地仅含有氨基酸替换，且没有氨基酸缺失或插入。
2.针对IGF-IR的小于15kDa的多肽。
3.按照权利要求2的多肽，所述多肽能够抑制IGF-I与IGF-IR的相互作用。
4.按照权利要求2或3的多肽，所述多肽以至少107M-1的结合亲和力与IGF-IR结合。
5.按照权利要求2-4中任一项的多肽，所述多肽选自单结构域抗体，结构域抗体，“dAb”，VH，VHH或纳米抗体。
6.针对IGF-IR的纳米抗体。
7.按照权利要求6的纳米抗体，所述纳米抗体包括或由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1-CDR3)组成，其中：
CDR1是这样的氨基酸序列，其选自由下列各项组成的组：
FNAMG    [SEQ ID NO：94]
INVMA    [SEQ ID NO：95]
NYAMG    [SEQ ID NO：96]
RTAMA    [SEQ ID NO：97]
或选自由这样的氨基酸序列组成的组，所述氨基酸序列与以上氨基酸序列之一具有至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％，甚至更优选地至少99％的序列同一性(如本文定义)；其中：
(i)任何氨基酸替换优选地是保守氨基酸替换(如本文定义)；和/或
(ii)所述氨基酸序列与以上氨基酸序列相比，优选地仅含有氨基酸替换，且没有氨基酸缺失或插入；
和/或选自由这样的氨基酸序列组成的组，所述氨基酸序列与以上氨基酸序列之一相比具有2个或仅1个的“氨基酸的区别”(如本文所定义的)，其中：
(i)任意氨基酸替换优选地是保守的氨基酸替换(如本文所定义的)；和/或
(ii)所述氨基酸序列与以上氨基酸序列相比，优选地仅含有氨基酸替换，且没有氨基酸缺失或插入；
和/或其中：
CDR2是这样的氨基酸序列，其选自由下列各项组成的组：
VIISGGSTHYVDSVKG    [SEQ ID NO：98]
EITRSGRTNYVDSVKG    [SEQ ID NO：99]
AINWNSRSTYYADSVKG   [SEQ ID NO：100]
TITWNSGTTRYADSVKG   [SEQ ID NO：101]
或选自由这样的氨基酸序列组成的组，所述氨基酸序列与以上氨基酸序列之一具有至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％，甚至更优选地至少99％的序列同一性(如本文所定义的)；其中
(i)任意氨基酸替换优选地是保守的氨基酸替换(如本文所定义的)；和/或
(ii)所述氨基酸序列与以上氨基酸序列相比，优选地仅含有氨基酸替换，且没有氨基酸缺失或插入；
和/或选自由这样的氨基酸序列组成的组，所述氨基酸序列与以上氨基酸序列之一相比具有3个，2个或仅1个的“氨基酸的区别”(如本文所定义的)，其中：
(i)任意氨基酸替换优选地是保守的氨基酸替换(如本文所定义的)；和/或
(ii)所述氨基酸序列与以上氨基酸序列相比，优选地仅含有氨基酸替换，且没有氨基酸缺失或插入；
和/或其中：
CDR3是这样的氨基酸序列，其选自由下列各项组成的组：
KKFGDY              [SEQ ID NO：102]
IDGSWREY            [SEQ ID NO：103]
SHDSDYGGTNANLYDY    [SEQ ID NO：104]
TAAAVITPTRGYYNY     [SEQ ID NO：105]
或选自由这样的氨基酸序列组成的组，所述氨基酸序列与以上氨基酸序列之一具有至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％，甚至更优选地至少99％的序列同一性(如本文所定义的)；其中
(i)任意氨基酸替换优选地是保守的氨基酸替换(如本文所定义的)；和/或
(ii)所述氨基酸序列与以上氨基酸序列相比，优选地仅含有氨基酸替换，且没有氨基酸缺失或插入；
和/或选自由这样的氨基酸序列组成的组，所述氨基酸序列与以上氨基酸序列之一相比具有3个，2个或仅1个的“氨基酸的区别”(如本文所定义的)，其中：
(i)任意氨基酸替换优选地是保守的氨基酸替换(如本文所定义的)；和/或
(ii)所述氨基酸序列与以上氨基酸序列相比，优选地仅含有氨基酸替换，且没有氨基酸缺失或插入。
8.获得按照权利要求6的纳米抗体的方法，所述方法包括下列步骤：
a)通过通常包括下列步骤的方法提供至少一个针对IGF-IR的VHH结构域，所述步骤是：(i)用IGF-IR或其部分或片段对属于骆驼科的哺乳动物进行免疫，从而产生针对IGF-IR的免疫应答和/或抗体(和特别地重链抗体)；(ii)从如此免疫的哺乳动物中获得生物样品，其中所述样品包括针对IGF-IR的重链抗体序列和/或VHH序列；和(iii)从所述生物样品中获得(例如，分离)针对IGF-IR的重链抗体序列和/或VHH序列；和/或通过通常包括下列步骤的方法提供至少一个针对IGF-IR的VHH结构域，所述步骤是：(i)筛选包括针对IGF-IR或针对其至少一部分或片段的重链抗体序列和/或重链抗体序列的VHH序列和/或VHH序列的文库；和(ii)从所述文库中获得(例如，分离)针对IGF-IR的重链抗体序列和/或VHH序列；
b)任选地对由此获得的针对IGF-IR的重链抗体序列和/或VHH序列进行亲和力成熟、诱变(例如，随机诱变或定点诱变)和/或任何其他增加重链抗体序列和/或VHH序列对IGF-IR亲和力和/或特异性的技术；
c)确定由此获得的针对IGF-IR的重链抗体序列和/或VHH序列的CDR序列；和
d)提供纳米抗体，其中至少一个，优选地至少两个，和更优选地全部三个CDR(即，CDR1，CDR2和CDR3，和具体地至少CDR3)具有步骤c)中确定的序列。
9.多肽，其包括至少一种按照权利要求1或6-7中任一项的纳米抗体或包括至少按照权利要求2-5中任一项的多肽，或EGFR或IGF-IR结合部分或其片段。
10.多肽，其包括至少两个结合部分，其中所述的至少两个结合部分中的每一个均针对肿瘤相关的抗原或表位。
11.按照权利要求10的多肽，其中所述的至少两个结合部分中的每一个针对不同的肿瘤相关抗原。
12.按照权利要求10的多肽，其中所述的至少两个结合部分中的每一个针对相同肿瘤相关抗原上的不同表位
13.按照权利要求10-12中任一项的多肽，其中至少所述结合部分之一选自VH，VHH，结构域抗体，单结构域抗体，“dAb”或纳米抗体。
14.按照权利要求10-13中任一项的多肽，其中所述结合部分中的每一个均是纳米抗体。
15.按照权利要求10的多肽，其包括至少一个针对EGFR的纳米抗体和至少一个针对EGFR家族成员的纳米抗体，所述成员选自由HER2，HER3，和HER4组成的组。
16.按照权利要求10的多肽，其包括至少一个针对EGFR的纳米抗体和至少一个针对IGF-IR的纳米抗体。
17.多肽，其包括至少两个纳米抗体，其中所述的至少两个纳米抗体之一的结合调节通过所述的至少两种纳米抗体中第二个纳米抗体的结合。
18.按照权利要求17的多肽，其中增强了通过所述的至少两种纳米抗体中第二个纳米抗体的结合。
19.按照权利要求17的多肽，其中减弱了通过所述的至少两种纳米抗体中第二个纳米抗体的结合。
20.按照权利要求17的多肽，其中抑制了通过所述的至少两种纳米抗体中第二个纳米抗体的结合。
21.核酸，其编码按照权利要求1或6-7中任一项的纳米抗体，或编码按照权利要求2-5或9-20中任一项的多肽。
22.宿主细胞，其表达按照权利要求1或6-7中任一项的纳米抗体，或表达按照权利要求2-5或9-20中任一项的多肽，或包括按照权利要求21的核酸。
23.用于制备按照权利要求1或6-7中任一项的纳米抗体或按照权利要求2-5或9-20中任一项的多肽的方法，所述方法包括下列步骤：
-表达，在合适的宿主细胞或宿主生物体中，或在另一种合适的按照权利要求21的核酸的表达系统中进行，任选地随后
-分离和/或纯化由此获得的纳米抗体或多肽。
24.一种组合物，其包括至少一种按照权利要求1或6-7中任一项的纳米抗体，至少一种按照权利要求2-5或9-20中任一项的多肽，和/或至少一种按照权利要求21的核酸。
25.药物组合物，其包括至少一种按照权利要求1或6-7中任一项的纳米抗体，至少一种按照权利要求2-5或9-20中任一项的多肽，和/或至少一种按照权利要求21的核酸，和任选地至少一种药用载体。
26.诊断组合物，其包括至少一种按照权利要求1或6-7中任一项的纳米抗体，至少一种按照权利要求2-5或9-20中任一项的多肽，和/或至少一种按照权利要求21的核酸，和任选地至少一种成像剂。
27.按照权利要求1或6-7中任一项的纳米抗体，按照权利要求2-5或9-20中任一项的多肽，按照权利要求21的核酸，和/或按照权利要求25的药物组合物，其用于预防和/或治疗。
28.预防和/或治疗与EGFR和/或IGF-IR相关疾病或病症的方法，所述方法包括施用治疗有效量的按照权利要求1或6-7中任一项的纳米抗体，按照权利要求2-5或9-20中任一项的多肽或按照权利要求25的药物组合物。
29.按照权利要求28的方法，其中所述疾病或病症相关于或特征为EGFR和/或IGF-IR的过表达。
30.按照权利要求29的方法，其中所述疾病或病症是癌症或肿瘤。
31.按照权利要求28的方法，其中所述疾病或病症涉及炎症过程。
32.按照权利要求31的方法，其中所述疾病或病症是类风湿性关节炎，银屑病，或肺部粘液分泌过多。
33.抑制EGF和EGFR间相互作用的方法，所述方法包括施用按照权利要求1的纳米抗体，或按照权利要求9-20中任一项的多肽，或按照权利要求25的药物组合物的步骤。
34.增强抗EGFR治疗的方法，所述方法包括施用按照权利要求6-7中任一项的纳米抗体，按照权利要求2-5或9-20中任一项的多肽，或按照权利要求25的药物组合物的步骤。
35.诊断与EGFR和/或IGF-IR相关疾病或病症的方法，所述方法包括下列步骤：
(a)使样品与按照权利要求1或6-7中任一项的纳米抗体，或按照权利要求2-5或9-20中任一项的多肽相接触，
(b)检测所述纳米抗体或多肽与所述样品的结合，和
(c)将步骤(b)中检测到的结合和标准进行比较，其中在结合中相对于所述样品的区别分别是对与EGFR和/或IGF-IR相关疾病或病症的诊断。
36.成像EGFR或IGF-IR靶标的方法，所述方法包括施用按照权利要求1或6-7中任一项的纳米抗体，按照权利要求2-5或9-20中任一项的多肽，或按照权利要求26的诊断组合物的步骤。
37.按照权利要求1或6-7中任一项的纳米抗体，按照权利要求2-5或9-20中任一项的多肽在制备治疗癌症、肿瘤、涉及炎症过程的病症、类风湿性关节炎、银屑病或肺部粘液分泌过多的药物中的用途。
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