CN105143267A - 人pac1抗体 - Google Patents

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Abstract

提供了结合人PAC1的抗体及其抗原结合片段。还提供了编码所述抗体及其抗原结合片段的核酸、编码所述核酸的载体和细胞。所述抗体及其抗原结合片段可抑制PAC1对PACAP的结合，并且用于许多PAC1相关疾病，包括头痛疾病，包括偏头痛和丛集性头痛的治疗和/或预防。

Description

人PAC1抗体
优先权
本申请要求2013年3月15日提交的美国临时申请系列号61/792,678(其整体通过引用并入本文)的优先权利益。
参考序列表
本申请含有已以ASCII格式电子地提交的，从而在此通过引用整体并入的序列表。创建于2014年3月12日的所述ASCII被命名为A-1804-PCT_SL.txt并且大小为461,614字节。
背景
存在对偏头痛的有效疗法，特别地预防性疗法的明显未满足的需要。多个研究的结果表明在美国约1400万偏头痛患者可符合有效安全的预防疗法并从其获益。目前批准的偏头痛预防疗法仅部分有效且具有显著限制这些药物的可接受性的相当大的副作用特征谱。尽管存在这些限制，但在美国450万具有频繁偏头痛的个体采用预防药物来治疗它们的偏头痛。
垂体腺苷酸环化酶激活多肽(PACAP)是基于它们在垂体前叶细胞中刺激cAMP形成的能力最先从牛下丘脑提取物分离的38个氨基酸(PACAP38)、或27个氨基酸(PACAP27)的肽(Miyata，A.，等人，“Isolationofanovel38residue-hypothalamicpolypeptidewhichstimulatesadenylatecyclaseinpituitarycells.”，BiochemBiophysResCommun.1989；164：567-574；Miyata，A.，等人，“IsolationofaneuropeptidecorrespondingtotheN-terminal27residuesofthepituitaryadenylatecyclaseactivatingpolypeptidewith38residues(PACAP38)。”，BiochemBiophysResCommun.1990；170：643-648)。PACAP肽属于血管活性肠肽VIP-促胰液素-激素-释放激素(GHRH)-胰高血糖素超家族，人PACAP27的序列与血管活性肠多肽(VIP)共有68％同一性(Campbell，R.M.和Scanes，C.G.，“Evolutionofthegrowthhormone-releasingfactor(GRF)familyofpeptides.GrowthRegul.”1992；2：175-191)。PACAP在人体中的主要形式是PACAP38并且已显示PACAP38与PACAP27的药理学彼此不同。除非本文中另外指出，否则PACAP或PACAP38将用于代表PACAP38，而PACAP27将用于指定PACAP27。
已报导了3种PACAP受体：以高亲和力结合PACAP并且具有低得多对于VIP的亲和力的受体(PAC1受体或简称“PAC1”)，和基本上同样好地识别PACAP和VIP的两种受体(分别是为VPAC1和VPAC2报告分子或简称“VPAC1”或“VPAC2”)(Vaudry，D.等人“Pituitaryadenylatecyclase-activatingpolypeptideanditsreceptors：20yearsafterthediscovery.”，PharmacolRev.2009；九月61(3)：283-357)。
PACAP能够以相似的效力结合所有3个受体(PAC1、VPAC1、VPAC2)，从而无特别的选择性。VIP，在另一方面，以相较于PAC1显著更高的亲和力结合VPAC1和VPAC2。Maxadilan，最初从沙蝇分离的65个氨基酸的肽(Lerner，E.A.等人，“Isolationofmaxadilan，apotentvasodilatorypeptidefromthesalivaryglandsofthesandflyLutzomyialongipalpis”，JBiolChem.1991年6月15日；266(17)：11234-6；Lerner，E.A.等人，“Maxadilan，aPAC1receptoragonistfromsandflies”，Peptides.2007年9月；28(9)：1651-1654.)，相较于VPAC1或VPAC2对PAC1具有精巧选择性，并从而可用作PAC1选择性激动剂。
概述
在一个方面，本发明包括特异性结合人PAC1的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：(A)轻链CDR1，其包含(i)选自由表4A中所示的LCCDR1序列组成的组的氨基酸序列、(ii)与选自由表4A中所示的LCCDR1序列组成的组的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列或(iii)与选自由表4A中所示的LCCDR1序列组成的组的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列；(B)轻链CDR2，其包含(i)选自由表4A中所示的LCCDR2序列组成的组的氨基酸序列、(ii)与选自由表4A中所示的LCCDR2序列组成的组的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列或(iii)与选自由表4A中所示的LCCDR2序列组成的组的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列；和(C)轻链CDR3，其包含(i)选自由表4A中所示的LCCDR3序列组成的组的氨基酸序列、(ii)与选自由表4A中所示的LCCDR3序列组成的组的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列或(iii)与选自由表4A中所示的LCCDR3序列组成的组的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列；
在另一个方面，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其中(A)所述抗体或其抗原结合片段以10nM或更低(例如，5nM或1nM)的Ki与参照抗体竞争对人PAC1的结合，所述参照抗体选自由以下组成的组：01B、14A、14B、26A、26B、28A、29A、29B、39A和39B；和(B)所述抗体或其抗原结合片段特异性结合人PAC1。
在另一个方面，本发明包括特异性结合人PAC1的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：(A)重链CDR1，其包含(i)选自以由表4B中所示的HCCDR1序列组成的组的氨基酸序列、(ii)与选自由表4B中所示的HCCDR1序列组成的组的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列或(iii)与选自由表4B中所示的HCCDR1序列组成的组的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列；(B)重链CDR2，其包含(i)选自由表4B中所示的HCCDR2序列组成的组的氨基酸序列、(ii)与选自由表4B中所示的HCCDR2序列组成的组的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列或(iii)与选自由表4B中所示的HCCDR2序列组成的组的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列；和(C)重链CDR3，其包含(i)选自由表4B中所示的HCCDR3序列组成的组的氨基酸序列、(ii)与选自由表4B中所示的HCCDR3序列组成的组的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列或(iii)与选自由表4B中所示的HCCDR3序列组成的组的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列；
在另一个方面，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其中(A)CDRL包含(i)选自由CDRL1-C1和CDRL1-C2组成的组的CDRL1，(ii)选自由CDRL2-C1、CDRL2-C2和CDRL2-C3组成的组的CDRL2，和(iii)由CDRL3-C1组成的CDRL3；(B)CDRH包含(i)选自由CDRH1-C1和CDRH1-C2组成的组的CDRH1；(ii)选自由CDRH2-C1、CDRH2-C2和CDRH2-C3组成的组的CDRH2；和(iii)由CDRH3-C1组成的CDRH3，和(C)特异性结合人PAC1的抗体或其抗原结合片段。
在上述的一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含CDRL1-C1、CDRL2-C1、CDRL3-C1、CDRH1-C1、CDRH2-C1和CDRH3-C1。
在上述另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含CDRL1-C1、CDRL2-C1、CDRL3-C1、CDRH1-C1、CDRH2-C2和CDRH3-C1。
在上述另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含CDRL1-C1、CDRL2-C1、CDRL3-C1、CDRH1-C1、CDRH2-C3和CDRH3-C1.
在上述另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含CDRL1-C1、CDRL2-C1、CDRL3-C1、CDRH1-C2、CDRH2-C1和CDRH3-C1。
在上述另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含CDRL1-C1、CDRL2-C1、CDRL3-C1、CDRH1-C2、CDRH2-C2和CDRH3-C1。
在上述另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含CDRL1-C1、CDRL2-C1、CDRL3-C1、CDRH1-C2、CDRH2-C3和CDRH3-C1。
在上述另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含CDRL1-C1、CDRL2-C2、CDRL3-C1、CDRH1-C1、CDRH2-C1和CDRH3-C1。
在上述另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含CDRL1-C1、CDRL2-C2、CDRL3-C1、CDRH1-C1、CDRH2-C2和CDRH3-C1。
在上述另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含CDRL1-C1、CDRL2-C2、CDRL3-C1、CDRH1-C1、CDRH2-C3和CDRH3-C1。
在上述另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含CDRL1-C1、CDRL2-C2、CDRL3-C1、CDRH1-C2、CDRH2-C1和CDRH3-C1。
在上述另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含CDRL1-C1、CDRL2-C2、CDRL3-C1、CDRH1-C2、CDRH2-C2和CDRH3-C1。
在上述另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含CDRL1-C1、CDRL2-C2、CDRL3-C1、CDRH1-C2、CDRH2-C3和CDRH3-C1。
在上述另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含CDRL1-C1、CDRL2-C3、CDRL3-C1、CDRH1-C1、CDRH2-C1和CDRH3-C1。
在上述另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含CDRL1-C1、CDRL2-C3、CDRL3-C1、CDRH1-C1、CDRH2-C2和CDRH3-C1。
在上述另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含CDRL1-C1、CDRL2-C3、CDRL3-C1、CDRH1-C1、CDRH2-C3和CDRH3-C1。
在上述另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含CDRL1-C1、CDRL2-C3、CDRL3-C1、CDRH1-C2、CDRH2-C1和CDRH3-C1。
在上述另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含CDRL1-C1、CDRL2-C3、CDRL3-C1、CDRH1-C2、CDRH2-C2和CDRH3-C1。
在上述另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含CDRL1-C1、CDRL2-C3、CDRL3-C1、CDRH1-C2、CDRH2-C3和CDRH3-C1。
在上述另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含CDRL1-C2、CDRL2-C1、CDRL3-C1、CDRH1-C1、CDRH2-C1和CDRH3-C1。
在上述另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含CDRL1-C2、CDRL2-C1、CDRL3-C1、CDRH1-C1、CDRH2-C2和CDRH3-C1。
在上述另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含CDRL1-C2、CDRL2-C1、CDRL3-C1、CDRH1-C1、CDRH2-C3和CDRH3-C1。
在上述另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含CDRL1-C2、CDRL2-C1、CDRL3-C1、CDRH1-C2、CDRH2-C1和CDRH3-C1。
在上述另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含CDRL1-C2、CDRL2-C1、CDRL3-C1、CDRH1-C2、CDRH2-C2和CDRH3-C1。
在上述另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含CDRL1-C2、CDRL2-C1、CDRL3-C1、CDRH1-C2、CDRH2-C3和CDRH3-C1。
在上述另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含CDRL1-C2、CDRL2-C2、CDRL3-C1、CDRH1-C1、CDRH2-C1和CDRH3-C1。
在上述另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含CDRL1-C2、CDRL2-C2、CDRL3-C1、CDRH1-C1、CDRH2-C2和CDRH3-C1。
在上述另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含CDRL1-C2、CDRL2-C2、CDRL3-C1、CDRH1-C1、CDRH2-C3和CDRH3-C1。
在上述另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含CDRL1-C2、CDRL2-C2、CDRL3-C1、CDRH1-C2、CDRH2-C1和CDRH3-C1。
在上述另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含CDRL1-C2、CDRL2-C2、CDRL3-C1、CDRH1-C2、CDRH2-C2和CDRH3-C1。
在上述另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含CDRL1-C2、CDRL2-C2、CDRL3-C1、CDRH1-C2、CDRH2-C3和CDRH3-C1。
在上述另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含CDRL1-C2、CDRL2-C3、CDRL3-C1、CDRH1-C1、CDRH2-C1和CDRH3-C1。
在上述另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含CDRL1-C2、CDRL2-C3、CDRL3-C1、CDRH1-C1、CDRH2-C2和CDRH3-C1。
在上述另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含CDRL1-C2、CDRL2-C3、CDRL3-C1、CDRH1-C1、CDRH2-C3和CDRH3-C1。
在上述另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含CDRL1-C2、CDRL2-C3、CDRL3-C1、CDRH1-C2、CDRH2-C1和CDRH3-C1。
在上述另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含CDRL1-C2、CDRL2-C3、CDRL3-C1、CDRH1-C2、CDRH2-C2和CDRH3-C1。
在上述另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含CDRL1-C2、CDRL2-C3、CDRL3-C1、CDRH1-C2、CDRH2-C3和CDRH3-C1。
在另一个方面，本发明包括特异性结合人PAC1的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含(i)各自具有如上所述对应的重链CDR的序列的重链CDRCDR1、CDR2和CDR3，和(ii)各自具有如上所述对应的轻链CDR的序列的轻链CDRCDR1、CDR2和CDR3。
在一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含重链CDR：CDRH1-8、CDRH2-2和CDRH3-3；和轻链CDR：CDRL1-3、CDRL2-2、CDRL3-2.
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含重链CDR：CDRH1-11、CDRH2-5和CDRH3-9和轻链CDR：CDRL1-13、CDRL2-1、CDRL3-1。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含重链CDR：CDRH1-1、CDRH2-4和CDRH3-6和轻链CDR：CDRL1-2、CDRL2-1、CDRL3-1。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含重链CDR：CDRH1-1、CDRH2-4和CDRH3-6和轻链CDR：CDRL1-1、CDRL2-1、CDRL3-1。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含重链CDR：CDRH1-3、CDRH2-5和CDRH3-5和轻链CDR：CDRL1-1、CDRL2-1、CDRL3-1。
在另一个实施方案中，本发明抗体或抗原结合片段。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含重链CDR：CDRH1-9、CDRH2-6和CDRH3-1和轻链CDR：CDRL1-4、CDRL2-3、CDRL3-3。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含重链CDR：CDRH1-4、CDRH2-7和CDRH3-8和轻链CDR：CDRL1-6、CDRL2-4、CDRL3-5。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含重链CDR：CDRH1-10、CDRH2-1和CDRH3-7和轻链CDR：CDRL1-5、CDRL2-3、CDRL3-4。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含重链CDR：CDRH1-6、CDRH2-8和CDRH3-2和轻链CDR：CDRL1-7、CDRL2-5、CDRL3-6。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含重链CDR：CDRH1-7、CDRH2-3和CDRH3-4和轻链CDR：CDRL1-8、CDRL2-6、CDRL3-7。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含重链CDR：CDRH1-2、CDRH2-8和CDRH3-2和轻链CDR：CDRL1-9、CDRL2-5、CDRL3-8。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含重链CDR：CDRH1-6、CDRH2-8和CDRH3-2和轻链CDR：CDRL1-10、CDRL2-5、CDRL3-6。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含重链CDR：CDRH1-6、CDRH2-8和CDRH3-2和轻链CDR：CDRL1-10、CDRL2-5、CDRL3-6。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含重链CDR：CDRH1-6、CDRH2-8和CDRH3-2和轻链CDR：CDRL1-12、CDRL2-5、CDRL3-6。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含重链CDR：CDRH1-5、CDRH2-8和CDRH3-2和轻链CDR：CDRL1-11、CDRL2-5、CDRL3-8。
在另一个方面，本发明包括特异性结合人PAC1的分离的抗体或其抗原结合片段，其包括选自由以下组成的组的重链CDR1：CDRH1-1、CDRH1-2、CDRH1-3、CDRH1-4、CDRH1-5、CDRH1-6、CDRH1-7、CDRH1-8、CDRH1-9、CDRH1-10和CDRH1-11。
在另一个方面，本发明包括特异性结合人PAC1的分离的抗体或其抗原结合片段，其包括选自由以下组成的组的重链CDR2：CDRH2-1、CDRH2-2、CDRH2-3、CDRH2-4、CDRH2-5、CDRH2-6、CDRH2-7和CDRH2-8。
在另一个方面，本发明包括特异性结合人PAC1的分离的抗体或其抗原结合片段，其包括选自由以下组成的组的重链CDR3：CDRH3-1、CDRH3-2、CDRH3-3、CDRH3-4、CDRH3-5、CDRH3-6、CDRH3-7、CDRH3-8和CDRH3-9。
在另一个方面，本发明包括特异性结合人PAC1的分离的抗体或其抗原结合片段，其包括选自由以下组成的组的轻链CDR1：CDRL1-1、CDRL1-2、CDRL1-3、CDRL1-4、CDRL1-5、CDRL1-6、CDRL1-7、CDRL1-8、CDRL1-9、CDRL1-10、CDRL1-11、CDRL1-12和CDRL1-13。
在另一个方面，本发明包括特异性结合人PAC1的分离的抗体或其抗原结合片段，其包括选自由以下组成的组的轻链CDR2：CDRL2-1、CDRL2-2、CDRL2-3、CDRL2-4、CDRL2-5和CDRL2-6。
在另一个方面，本发明包括特异性结合人PAC1的分离的抗体或其抗原结合片段，其包括选自由以下组成的组的轻链CDR3：CDRL3-1、CDRL3-2、CDRL3-3、CDRL3-4、CDRL3-5、CDRL3-6、CDRL3-7和CDRL3-8。
在另一个方面，本发明包括任选地特异性结合人PAC1的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含如上所述的重链CDR1、如上所述的重链CDR2、如上所述的重链CDR3、如上所述的轻链CDR1、如上所述的轻链CDR2和如上所述的轻链CDR3。
在另一个方面，本发明包括任选地特异性结合人PAC1的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变区，所述轻链可变区包含(i)选自由表3A中所示的VLAA序列组成的组的氨基酸序列、(ii)与选自由表3A中所示的VLAA序列组成的组的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列或(iii)与选自由表3A中所示的VLAA序列组成的组的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明包括特异性结合人PAC1的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区，所述重链可变区包含(i)选自由表3B中所示的VHAA序列组成的组的氨基酸序列、(ii)与选自由表3B中所示的VHAA序列组成的组的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列或(iii)与选自由表3B中所示的VHAA序列组成的组的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明包括特异性结合人PAC1的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含选自由以下组成的组的轻链可变区氨基酸序列：LV-01、LV-02、LV-03、LV-04、LV-05、LV-06、LV-07、LV-08、LV-09、LV-10、LV-11、LV-12、LV-13、LV-14、LV-15、LV-16、LV-17、LV-18、LV-19、LV-20和LV-21。
在另一个方面，本发明包括特异性结合人PAC1的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含选自由以下组成的组的重链可变区氨基酸序列：HV-01、HV-02、HV-03、HV-04、HV-05、HV-06、HV-07、HV-08、HV-09、HV-10、HV-11、HV-12、HV-13、HV-14、HV-15、HV-16、HV-17、HV-18、HV-19、HV-20、HV-21、HV-22、HV-23、HV-24、HV-25和HV-26。
在一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LV-01和HV-01。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LV-02和HV-02。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LV-03和HV-02。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LV-04和HV-03。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LV-05和HV-03。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LV-06和HV-03。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LV-04和HV-04。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LV-04和HV-05.
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LV-07和HV-04。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LV-07和HV-05。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LV-07和HV-03。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LV-04和HV-06。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LV-04和HV-06。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LV-05和HV-05。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LV-08和HV-05。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LV-09和HV-05。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LV-05和HV-07。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LV-05和HV-08。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LV-09和HV-07。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LV-09和HV-08。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LV-09和HV-09。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LV-05和HV-09。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LV-05和HV-10。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LV-08和HV-10。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LV-05和HV-11。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LV-05和HV-12。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LV-05和HV-13。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LV-08和HV-13。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LV-10和HV-14。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LV-11和HV-14。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LV-12和HV-15。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LV-12和HV-16。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LV-13和HV-17。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LV-14和HV-18。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LV-14和HV-19。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LV-15和HV-20。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LV-16和HV-21。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LV-17和HV-22。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LV-18和HV-23。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LV-19和HV-24。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LV-19和HV-25。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LV-20和HV-21。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LV-21和HV-26。
在另一个方面，本发明包括特异性结合人PAC1的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含(i)选自由表2A中所示的序列组成的组的序列，或(ii)与表2A中所示的序列之一具有至少90％同一性的序列，或(iii)与表2A中所示的序列之一具有至少95％同一性的序列。
在另一个方面，本发明包括特异性结合人PAC1的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含(i)选自由表2B中所示的序列组成的组的序列，或(ii)与表2B中所示的序列之一具有至少90％同一性的序列，或(iii)与表2B中所示的序列之一具有至少95％同一性的序列。
在另一个方面，本发明包括特异性结合人PAC1的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含选自由以下组成的组的轻链氨基酸序列：LC-01、LC-02、LC-03、LC-04、LC-05、LC-06、LC-07、LC-08、LC-09、LC-10、LC-11、LC-12、LC-13、LC-14、LC-15、LC-16、LC-17、LC-18、LC-19、LC-20和LC-21。
在另一个方面，本发明包括特异性结合人PAC1的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含选自由以下组成的组的重链氨基酸序列：HC-01、HC-02、HC-03、HC-04、HC-05、HC-06、HC-07、HC-08、HC-09、HC-10、HC-11、HC-12、HC-13、HC-14、HC-15、HC-16、HC-17、HC-18、HC-19、HC-20、HC-21、HC-22、HC-23、HC-24、HC-25、HC-26、HC-27、HC-28、HC-29、HC-30、HC-31、HC-32、HC-33、HC-34、HC-35、HC-36、HC-37、HC-38、HC-39、HC-40、HC-41、HC-42、HC-43、HC-44、HC-45、HC-46、HC-47、HC-48、HC-49、HC-50、HC-51、HC-52和HC-53。
在一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-01和HC-01(01A)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-01和HC-02(01B)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-02和HC-03(02A)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-02和HC-04(02B)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-02和HC-05(02C)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-03和HC-03(03A)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-04和HC-06(04A)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-04和HC-07(04B)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-04和HC-08(04C)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-05和HC-06(05A)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-05和HC-07(05B)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-05和HC-08(05C)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-06和HC-06(06A)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-06和HC-07(06B)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-06和HC-08(06C)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-04和HC-09(07A)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-04和HC-10(07B)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-04和HC-11(07C)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-04和HC-12(08A)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-04和HC-13(08B)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-04和HC-14(08C)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-07和HC-09(09A)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-07和HC-10(09B)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-07和HC-11(09C)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-07和HC-12(10A)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-07和HC-13(10B)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-07和HC-14(10C)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-07和HC-06(11A)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-07和HC-07(11B)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-07和HC-08(11C)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-04和HC-15(12A)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-04和HC-16(12B)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-04和HC-17(12C)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-05和HC-12(13A)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-05和HC-13(13B)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-05和HC-14(13C)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-08和HC-12(14A)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-08和HC-13(14B)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-08和HC-14(14C)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-09和HC-12(15A)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-09和HC-13(15B)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-09和HC-14(15C)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-05和HC-18(16A)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-05和HC-19(16B)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-05和HC-20(16C)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-05和HC-21(17A)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-05和HC-22(17B)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-05和HC-23(17C)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-09和HC-18(18A)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-09和HC-19(18B)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-09和HC-20(18C)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-09和HC-21(19A)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-09和HC-22(19B)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-09和HC-23(19C)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-09和HC-24(20A)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-09和HC-25(20B)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-09和HC-26(20C)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-05和HC-24(21A)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-05和HC-25(21B)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-05和HC-26(21C)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-05和HC-27(22A)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-05和HC-28(22B)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-05和HC-29(22C)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-08和HC-27(23A)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-08和HC-28(23B)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-08和HC-29(23C)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-05和HC-30(24A)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-05和HC-31(24B)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-05和HC-32(24C)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-05和HC-33(25A)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-05和HC-34(25B)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-05和HC-35(25C)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-05和HC-36(26A)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-05和HC-37(26B)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-05和HC-38(26C)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-08和HC-36(27A)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-08和HC-37(27B)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-08和HC-38(27C)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-10和HC-39(28A)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-10和HC-40(28B)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-10和HC-41(28C)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-11和HC-39(29A)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-11和HC-40(29B)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-11和HC-41(29C)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-12和HC-42(30A)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-12和HC-43(31A)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-13和HC-44(32A)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-14和HC-45(33A)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-14和HC-46(34A)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-15和HC-47(35A)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-16和HC-48(36A)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-17和HC-49(37A)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-18和HC-50(38A)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-19和HC-51(39A)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-19和HC-52(39B)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-20和HC-48(40A)。
在另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含LC-21和HC-53(41A)。
在另一个方面，本发明包括前述内容的任一项的分离的抗体或其抗原结合片段，其中抗体是多克隆抗体。
在另一个方面，本发明包括上述内容的任一项的分离的抗体，其中分离的抗体选自以下组成的组：单克隆抗体、Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、Fv片段、双抗体和单链抗体。
在另一个方面，本发明包括如上所述的分离的抗体，其中分离的抗体选自以下组成的组：完全人抗体、人源化抗体和嵌合抗体。
在上述的一个实施方案中，根据上述内容的任一项的分离的抗体是完全人单克隆抗体。
在另一个方面，本发明包括如上所述的分离的抗体，其中抗体是IgG1型、IgG2型、IgG3型或IgG4型抗体。
在另一个方面，本发明包括如上所述的分离的抗体，其中抗体是无糖基化IgG1抗体。
在另一个方面，本发明包括如上所述的分离的抗体，其中无糖基化IgG1抗体在其重链的位置N297上包含突变。
在另一个方面，本发明包括如上所述的分离的抗体，其中无糖基化IgG1抗体在其重链中包含取代N297G。
在另一个方面，本发明包括如上所述的分离的抗体，其中无糖基化IgG1抗体在其重链中包含取代N297G、R292C和V302C。
在另一个方面，本发明包括如上所述的分离的抗体，其中抗体相对于hVPA1和hVPAC2选择性抑制hPAC1。
在另一个方面，本发明包括如上所述的分离的抗体，其中所述选择性比率大于100∶1。
在另一个方面，本发明包括如上所述的分离的抗体，其中所述选择性比率大于1000∶1。
在另一个方面，本发明包括编码如上所述的任何抗体的分离的多核苷酸。
在另一个方面，本发明包括编码特异性结合人PAC1的抗体或其抗原结合片段的分离的核酸，其包含(i)选自由表1A中所示的序列组成的组的序列，或(ii)与表1A中所示的序列之一具有至少90％同一性的序列，或(iii)与表1A中所示的序列之一具有至少95％同一性的序列。
在另一个方面，本发明包括编码特异性结合人PAC1的抗体或其抗原结合片段的分离的核酸，其包含(i)选自由表1B中所示的序列组成的组的序列，或(ii)与表1B中所示的序列之一具有至少90％同一性的序列，或(iii)与表1B中所示的序列之一具有至少95％同一性的序列。
在另一个方面，本发明包括分离的多核苷酸，所述多核苷酸具有选自由表1A中所示的序列组成的组的核酸序列，(ii)与选自由表1A中所示的序列组成的组的核酸序列具有至少80％同一性的核酸序列，(iii)与选自由表1A中所示的序列组成的组的核酸序列具有至少90％同一性的核酸序列，或(iv)与选自由表1A中所示的序列组成的组的核酸序列具有至少95％同一性的核酸序列。
在另一个方面，本发明包括分离的多核苷酸，所述多核苷酸具有选自由表1B中所示的序列组成的组的核酸序列，(ii)与选自由表1B中所示的序列组成的组的核酸序列具有至少80％同一性的核酸序列，(iii)与选自由表1B中所示的序列组成的组的核酸序列具有至少90％同一性的核酸序列，或(iv)与选自由表1B中所示的序列组成的组的核酸序列具有至少95％同一性的核酸序列。
在另一个方面，本发明包括分离的多核苷酸，所述多核苷酸具有选自由编码表3A中所示的可变区的核酸序列组成的组的核酸序列，(ii)与选自由编码表3A中所示的可变区的核酸序列组成的组的核酸序列具有至少80％同一性的核酸序列，(iii)与选自由编码表3A中所示的可变区的核酸序列组成的组的核酸序列具有至少90％同一性的核酸序列，或(iv)与选自由编码表3A中所示的可变区的核酸序列组成的组的核酸序列具有至少95％同一性的核酸序列。在另一个方面，本发明包括分离的多核苷酸，所述多核苷酸具有选自由编码表3B中所示的可变区的核酸序列组成的组的核酸序列，(ii)与选自由编码表3B中所示的可变区的核酸序列组成的组的核酸序列具有至少80％同一性的核酸序列，(iii)与选自由编码表3B中所示的可变区的核酸序列组成的组的核酸序列具有至少90％同一性的核酸序列，或(iv)与选自由编码表3A中所示的可变区的核酸序列组成的组的核酸序列具有至少95％同一性的核酸序列。
在另一个方面，本发明包括包含如上所述的任何分离的核酸或多核苷酸的表达载体。
在另一个方面，本发明包括用如上所述表达载体转化的细胞系。
在另一个方面，本发明包括产生如上所述的任何抗体或其抗原结合片段的方法，包括从如上所述分泌抗体或其抗原结合片段的宿主细胞制备抗体或其抗原结合片段。
在另一个方面，本发明包括包含如上所述的任何抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
在另一个方面，本发明包括用于治疗患者的与PAC1相关的病症的方法，其包括向患者施用有效量的如上所述的任何抗体或其抗原结合片段。
在另一个方面，本发明包括如上所述的方法，其中所述病症是头痛。
在另一个方面，本发明包括如上所述的方法，其中所述病症是偏头痛。
在另一个方面，本发明包括如上所述的方法，其中所述偏头痛是阵发性偏头痛。
在另一个方面，本发明包括如上所述的方法，其中偏头痛是慢性偏头痛。
在另一个方面，本发明包括如上所述的方法，其中所述病症是丛集性头痛。
在另一个方面，本发明如上所述的任何方法，其中所述方法包括预防性治疗。
附图简述
图1显示选择的抗-hPAC1轻链CDR序列和定义的抗-hPAC1轻链CDR共有序列CDRL1-C1、CDRL1-C2、CDRL2-C1、CDRL2-C2、CDRL2-C3和CDRL3-C1。
图2显示选择的抗-hPAC1重链CDR序列和定义的抗-hPAC1重链CDR共有序列CDRH1-C1、CDRH1-C2、CDRH2-C1、CDRH2-C2、CDRH2-C3和CDRH3-C1。
详述
本文中使用的章节标题仅用于组织目的，并且不被解释为限制所描述的主题。
除非本文中另外定义，否则与本申请结合使用的科学和技术术语将具有由本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文中另外要求，否则单数术语将包括复数并且复数术语将包括单数。
一般地，与本文中描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质及核酸化学以及杂交结合使用的术语以及其中的技术是本领域中公知的和通常使用的那些术语。除非另外指出，否则通常按照本领域中公知的和如在整个本说明书中引用和论述的各种一般和更具体的参考文献中描述的常规方法进行本发明的方法和技术。参见，例如，Sambrook等人，MolecularCloning：ALaboratoryManual，第3版，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，N.Y.(2001)，Ausubel等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology，GreenePublishingAssociates(1992)以及Harlow和LaneAntibodies：ALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，N.Y.(1990)(所述文献通过引用并入本文)。按照制造商的说明书进行酶促反应和纯化技术，如在本领域中通常实现的或如本文中描述的。与本文中描述的分析化学、合成有机化学以及医学及药物化学结合使用的术语以及其中的实验室方法和技术是本领域中公知和通常使用的那些术语以及方法和技术。标准技术可用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及患者的治疗。
应当理解，本发明不限于本文中描述的特定术语、方案和试剂等，这样其可变化。本文中使用的术语仅仅是为了描述特定实施方案，并且无意限制仅由权利要求确定的本发明的范围。
除在操作实例中外或当另外指出时，所有表达本文中使用的成分或反应条件的数值应当理解为在所有情况下由术语“约”修饰的。当结合百分比使用时，术语“约”意指±10％。
定义
术语“多核苷酸”或“核酸”包括单链和双链核苷酸聚合物。包含多核苷酸的核苷酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或任一类型的核苷酸的经修饰的形式。
“分离的核酸分子”意指不与其中在天然状态下发现所述分离的多核苷酸的多核苷酸的全部或部分结合，或连接于在天然状态下不与其连接的多核苷酸的基因组的DNA或RNA、mRNA、cDNA或合成来源的或其一些组合。为了本公开内容的目的，应当理解“包含特定核苷酸序列的核酸分子”不包括完整染色体。“包含”指定的核酸序列的分离的核酸分子还包括，除指定的序列以外，多达10种或甚至多达20种其它蛋白质或其部分的编码序列，或可包括控制引用的核酸序列的编码区的表达的有效连接的调控序列，和/或可包括载体序列。
除非另外指出，否则本文中论述的任何单链多核苷酸序列的左手末端是5’末端；双链多核苷酸的左手方向被称为5’方向。新生RNA转录物的5′至3′添加的方向被称为转录方向；具有与RNA转录物相同的序列的DNA链上的位于RNA转录物的5′末端的5′的序列区域被称为“上游序列”；具有与RNA转录物相同的序列的DNA链上的位于RNA转录物的3′末端的3′的序列区域被称为“下游序列”。
术语“控制序列”是指可实现连接于其的编码序列的表达和加工的多核苷酸序列。此类控制序列的性质可取决于宿主生物体。在具体的实施方案中，原核生物的控制序列可包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列。例如，真核生物的控制序列可包括包含一个或多个转录因子的识别位点的启动子、转录增强子序列和转录终止序列。“控制序列”可包括前导序列和/或融合伴侣序列。
术语“载体”意指用于将蛋白质编码信息转移进宿主细胞的任何分子或实体(例如，核酸、质粒、噬菌体或病毒)。
术语“表达载体”或“表达构建体”是指适合用于宿主细胞的转化并且含有指导和/或控制(与宿主细胞结合)有效地连连接于其的一个或多个异源编码区的表达的核酸序列的载体。表达构建体可包括，但不限于影响或控制有效地连接于其的编码区的转录、翻译以及如果内含子存在的话，影响所述编码区的RNA剪接的序列。
如本文中所用，“有效连接的”意指术语所应用于的组分处于允许它们在合适的条件下进行它们的固有功能的关系中。例如，“有效地连接”于蛋白质编码序列的载体中的控制序列被连接于其，以使得在与控制序列的转录活性相容的条件下实现蛋白质编码序列的表达。
术语“宿主细胞”意指已用核酸序列转化的或能够用核酸序列转化，从而表达目标基因的细胞。术语包括亲代细胞的后代，无论后代在形成学上或在遗传构成是否与原始亲代细胞相同，只要目标基因存在即可。
术语“转导”意指通常通过噬菌体将基因从一个细菌转移至另一个细菌。“转导”还指通过复制缺陷型逆转录病毒获得和转移真核细胞序列。
术语“转染”意指细胞对外来或外源DNA的吸收，当外源DNA已被引入在细胞膜内侧时，细胞已被“转染”。许多转染技术在本领域中是公知的并且在本文中进行了描述。参见，例如，Graham等人，1973，Virology52：456；Sambrook等人，2001，MolecularCloning：ALaboratoryManual，同上；Davis等人，1986，BasicMethodsinMolecularBiology，Elsevier；Chu等人，1981，Gene13：197。此类技术可用于将一个或多个外源DNA部分引入合适的宿主细胞。
术语“转化”是指细胞遗传特征的变化，当细胞已被修饰来含有新的DNA或RNA时所述细胞已被转化。例如，当通过经由转染、转导或其它技术引入新的遗传物质从其天然状态遗传修饰细胞时，所述细胞被转化。在转染或转导后，转化DNA可通过物理整合进细胞的染色体与细胞的DNA重组，或可作为附加型元件被瞬时维持而不被复制，或可作为质粒独立地复制。当转化DNA通过细胞的分裂被复制时，细胞被认为已被“稳定地转化”。
术语“多肽”或“蛋白质”在本文中可互换地用于指氨基酸残基的聚合物。术语还用于其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然存在的氨基酸的类似物或模拟物的氨基酸聚合物，以及用于天然存在的氨基酸聚合物。术语还可包括已例如通过添加糖类残基以形成糖蛋白而被修饰的或磷酸化的氨基酸聚合物。多肽和蛋白质可由天然存在的细胞和非重组细胞产生；或其由基因工程或重组细胞产生，并且包含具有天然蛋白质的氨基酸序列的分子，或具有天然序列的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代的分子。术语“多肽”和“蛋白质”具体地包括抗体，例如抗-PAC1抗体(也称为PAC1抗体)、PAC1结合蛋白、具有抗原结合蛋白的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代的抗体或序列。术语“多肽片段”是指相较于全长蛋白质具有氨基末端缺失、羧基末端缺失和/或内部缺失的多肽。此类片段还可相较于全长蛋白质含有经修饰的氨基酸。在某些实施方案中，片段的长度为约5至500个氨基酸。例如，片段的长度可为至少5、6、8、10、14、20、50、70、100、110、150、200、250、300、350、400或450个氨基酸。有用的多肽片段包括抗体的免疫功能片段，包括结合结构域。在PAC1结合抗体的情况下，有用的片段包括但不限于CDR区、重链或轻链的可变结构域、抗体链的部分或正好其包括2个CDR的可变结构域等。
术语“分离的蛋白”(例如，分离的抗体)、“分离的多肽”或“分离的抗体”意指主题蛋白、多肽或抗体不含大部分通常与其一起被发现的的其它蛋白，并且已与至少约50％的在自然界中与其结合的多核苷酸、脂质、糖类或其它材料分离。通常地，“分离的蛋白”、“分离的多肽”或“分离的抗体”组成至少约5％、至少约10％、至少约25％或至少约50％的给定的样品。基因组DNA、cDNA、mRNA或合成来源的其它RNA或其任意组合可编码此类分离的蛋白。优选地，分离的蛋白、多肽或抗体基本上不含在其天然环境中被发现的可干扰其治疗、诊断、预防、研究或其它用途的其它蛋白或其它多肽或其它污染物。
术语“人PAC1”、“人PAC1”、“hPAC1”和“hPAC1”、“人PAC1受体”、“人PAC1受体”、“hPAC1受体”和“hPAC1受体”可互换使用并指人垂体腺苷酸环化酶激活肽I型受体。hPAC1为在UniProtKB/Swiss-Prot数据库中命名为P41586(PACR_HUMAN)的468个氨基酸的蛋白，并且由ADCYAP1R1基因编码。PACAP-27和PACAP-38是PAC1的主要内源激动剂。除非另外指定或根据其中使用术语的上下文清楚地了解，否则“PAC1”是指人hPAC1。
多肽的“变体”(例如，抗原结合蛋白或抗体)包含其中相对于另一个多肽序列，一个或多个氨基酸残基被插入氨基酸序列，从其缺失和/或在所述氨基酸序列中被取代的氨基酸序列。变体包括融合蛋白。
多肽的“衍生物”是已以与插入、缺失或取代变体不同的方式，例如通过至另一种化学部分的缀合化学修饰的多肽(例如，抗原结合蛋白或抗体)。
如在整篇本说明中结合生物材料例如多肽、核酸、宿主细胞等使用的，术语“天然存在的”是指被在自然界中发现的材料。
当解离常数(KD)为≤10-6M时，抗体或其抗原结合片段被认为是“特异性结合”其靶。当KD≤1x10-8M时，抗体以“高亲和力”特异性结合靶抗原。在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段将以≤5x10-7的KD结合PAC1或人PAC1；在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段将以≤1x10-7的KD结合；在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段将以≤5x10-8的KD结合；在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段将以≤1x10-8的KD结合；在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段将以≤5x10-9的KD结合；在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段将以≤1x10-9的KD结合；在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段将以≤5x10-10的KD结合；在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段将以≤1x10-10的KD结合。
当抗体、其抗原结合片段或抗原结合蛋白在特定受体的抑制测定中的IC50比另一种“参照”受体例如hVPAC1或hVPAC2在抑制测定中的IC50低至少50倍时，抗体、其抗原结合片段或抗原结合蛋白相较于其它受体“选择性抑制”特定受体。“选择性比率”为参照受体的IC50除以特定受体的IC50。例如，如果hPAC1是特定受体，并且hVPAC1是参照受体，本文中描述的特定抗-PAC1抗体针对hPAC1的IC50为10nm并且针对hVPAC1的IC50为10μm，则该特定的抗体可被表征为具有1000∶1的hPAC1相对于hVPAC1的选择性比率。IC50是实现50％(生物或生物化学功能的)抑制所需的剂量/浓度。对于放射性配体，IC50是替代50％的放射性配体的特异性结合的竞争性配体的浓度。EC50是诱导50％最大反应所需的浓度或剂量。
Ki数据通常在竞争性结合实验的上下文中被产生，所述实验通常通过将放射性同位素(例如，125I)附接于“激动剂”来进行。实验测量在递增浓度的“拮抗剂”存在的情况下激动剂的结合。Ki是指“激动剂”或测试化合物例如测试抗-PAC1抗体的浓度，如果不存在放射性配体的话，所述激动剂或测试化合物可占据50％的受体。Ki可使用公式Ki＝IC50/(1+([L]/Kd))来计算，其中[L]是使用的放射性配体(例如，125I-标记的PAC-1抗体)的浓度，并且Kd是放射性配体的解离常数。参见，例如，KeenM，MacDermotJ(1993)Analysisofreceptorsbyradioligandbinding.In：WhartonJ，PolakJM(编辑)Receptorautoradiography，principlesandpractice.OxfordUniversityPress，Oxford。
“抗原结合区”意指特异性结合指定抗原的蛋白或蛋白的部分。例如，含有与抗原相互作用并对抗体赋予其对于抗原的特异性和亲和力的氨基酸残基的抗体的该部分被称为“抗原结合区”。抗原结合区通常包括一或多个“互补结合区”(“CDR”)。某些抗原结合区还包括一个或多个“框架”区。“CDR”是促成抗原结合特异性和亲和力的氨基酸序列。“框架”区可帮助维持CDR的正确构象以促进抗原结合区与抗原之间的结合。
在某些方面，提供了结合PAC1蛋白或人PAC1的重组抗体或其抗原结合片段。在本说明书中，“重组蛋白”是使用重组技术，即通过如本文中所述的重组核酸的表达产生的蛋白。用于产生重组蛋白的方法和技术在本领域中是公知的。
术语“抗体”是指任何同种型的完整免疫球蛋白或可与完整抗体竞争对靶抗原的特异性结合的其抗原结合片段，并且包括，例如嵌合抗体、人源化抗体、完全人抗体和双特异性抗体或其抗原结合片段。这样的“抗体”是抗原结合蛋白的种类。完整抗体通常包含至少两个全长重链和两个全长轻链，但在一些情况下，可包括更少的链，诸如可只包含重链的天然存在于骆驼科动物中的抗体。抗体或其抗原结合片段可只来源于单个来源，或可以是“嵌合的”，即，抗体的不同部分可来源于如下文中进一步描述的两个不同来源。抗体或其结合片段可通过重组DNA技术在杂交瘤中产生，或通过完整抗体的酶促或化学切割来产生。除非另外指出，否则术语“抗体”，除了包含两个全长重链和两个全长轻链的抗体外，还包括其衍生物、变体、片段和突变，其实例描述于下文中。
术语“轻链”包括全长轻链和其具有充足的可变区序列来赋予结合特异性的片段。全长轻链包括可变区结构域VI和恒定区结构域CL。轻链的可变区结构域在多肽的氨基末端。轻链包括κ链和λ链。
术语“重链”包括全长重链和其具有充足的可变区序列来赋予结合特异性的片段。全长重链包括可变区结构域VH和3个恒定区结构域CII1、CII2和CII3。VII结构域在多肽的氨基末端，并且CII结构域在羧基末端，CH3最靠近与多肽的羧基末端。重链可具有任何同种型，包括IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚型)、IgA(包括IgA1和IgA2亚型)、IgM和IgE。在一个实施方案中，重链是无糖基化IgG1、例如具有N297G突变的IgG1HC。
术语“信号序列”、“前导序列”或“信号肽”是指指导蛋白质的运输的短(长度为3-60个氨基酸)肽链。信号肽带可被称为靶向信号、信号序列、转运肽或定位信号。一些信号肽在蛋白质被运输后通过信号肽酶被从蛋白质切割，以便所述蛋白(例如，如本文中描述的抗体)的生物活性形式是切割的较短的形式。因此，术语诸如“包含重链......的抗体”、“包含轻链......的抗体”等，当抗体被表征为具有拥有特定的经鉴定的序列的重链和/或轻链时，被理解为包括具有所述特定的经鉴定的序列的抗体、除信号序列被不同的信号序列替代外具有特定的经鉴定的序列的抗体，以及具有除去任何信号序列的经鉴定的序列的抗体。
如本文中所用，术语抗体或免疫球蛋白链(重链或轻链)的“抗原结合片段”(或简称“片段”)，包含缺乏至少一些存在于全长链中的氨基酸但能够特异性结合抗原的抗体的部分(无论如何获得或合成该部分)。此类片段具有生物活性，因为它们特异性结合靶抗原并且可与其它抗体或其抗原结合片段竞争对给定的表位的特异性结合。在一个方面，此类片段将保留至少一个存在于全长轻链或重链中的CDR，并且在一些实施方案中将包含单个重链和/或轻链或其部分。这些生物活性片段可通过重组DNA技术产生，或可以例如通过完整抗体的酶促或化学切割产生。免疫功能性免疫球蛋白片段包括，但不限于Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、结构域抗体和单链抗体，并且可来源于任何哺乳动物来源，包括但不限于人、小鼠、大鼠、骆驼科动物或兔。还设想本文中公开的抗体的功能性部分例如一个或多个CDR可被共价地结合于第二蛋白或小分子以生成导向身体中的特定靶的治疗剂，从而具有双功能治疗性质或具有延长的血清半衰期。
“Fab片段”由一条轻链和CH1以及一条重链的可变区组成。Fab分子的重链不能与另一条重链分子形成二硫键。
“Fc”区含有两个包含抗体的CH1和CH2结构域的重链片段。两个重链片段通过两个或更多个二硫键以及通过CH3结构域的疏水相互作用保持在一起。
“Fab′片段”含有一条轻链和一条重链的部分(其含有VH结构域和CH1结构域以及还有CH1与CH2结构域之间的区域的部分)，以便可在两个Fab′片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab′)2分子。
“F(ab′)2片段”含有两条轻链和两条含有CH1与CH2结构域之间的恒定区的部分的重链，以便在两条重链之间形成链间二硫键。F(ab′)2片段从而由通过两条重链之间的二硫键保持在一起的两个Fab′片段组成。
“Fv区”包含来自重链和轻链的可变区，但缺乏恒定区。
“单链抗体”是其中重链与轻链可变区已通过柔性接头连接来形成单条多肽链(其形成抗原结合区)的Fv分子。单链抗体在国际专利申请公开号WO88/01649和美国专利号4,946,778和No.5,260,203(所述国际专利申请公开号和美国专利号的公开内容通过引用并入)中进行了详细描述。
“结构域抗体”是只含有重链的可变区或轻链的可变区的免疫功能性免疫球蛋白片段。在一些情况下，两个或更多个VH区通过肽接头共价地连接，以生成双价结构域抗体。双价结构域抗体的两个VH区可靶向相同或不同的抗原。
“双价抗原结合蛋白”或“双价抗体”包含两个抗原结合位点。在一些情况下，两个结合位点具有相同抗原特异性。双价抗体可以是双特异性的，参见下文。
“多特异性抗原结合蛋白”或“多特异性抗体”是靶向不止一种抗原或表位的抗原结合蛋白或抗体。
“双特异性”、“双重-特异性”或“双功能性”抗原结合蛋白或抗体是分别具有两个不同的抗原结合位点的杂交抗原结合蛋白或抗体。双特异性抗体是一种多特异性抗原结合蛋白或多特异性抗体，并且可通过多种方法产生，包括，但不限于杂交瘤的融合或Fab′片段的连接。参见，例如，Songsivilai和Lachmann，1990，Clin.Exp.Immunol.79：315-321；Kostelny等人，1992，J.Immunol.148：1547-1553。双特异性抗原结合蛋白或抗体的两个结合位点将结合两个不同的表位，所述表位存在于相同或不同的蛋白质靶上。
术语“中和抗原结合蛋白”或“中和抗体”分别指结合配体，阻止配体对其结合伴侣的结合和中断否则可因配体对其结合伴侣的结合而产生的生物应答的抗原结合蛋白或抗体。在评估抗原结合部分例如抗体或其免疫功能性抗原结合片段的结合及特异性中，当过量的抗体使结合于配体的结合伴侣的量减少至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或更多(如在体外竞争性结合测定中测量的)时，抗体或片段将其基本上抑制配体对其结合伴侣的结合。在PAC1结合蛋白的情况下，此类中和分子将消除PAC1结合PACAP例如PACAP-27或PACAP-38的能力。
术语“抗原”或“免疫原”是指能够被选择性结合剂，诸如抗原结合蛋白(包括，例如抗体或其免疫功能性抗原结合片段)结合的且另外地能够在动物中用于产生能够结合该抗原的抗体的分子或分子的部分。抗原可具有能够与不同抗体或其片段相互作用的一个或多个表位。
术语“表位”是被抗原结合蛋白(例如，抗体)结合的分子的部分。术语包括能够特异性结合于抗原结合蛋白诸如抗体或T细胞受体的任何决定簇。表位可以是连续的或非连续的(例如，在多肽序列中彼此不连续的但在分子的上下文中被抗原结合蛋白结合的氨基酸残基)。在某些实施方案中，表位可以是模拟的，因为它们包含与用于产生抗体的表位相似，但仍然不包含或仅包含一些在用于产生抗体的该表位中发现的氨基酸残基的三维结构。最常见地，蛋白质上的表位残基，但在一些情况下，可存在于其它类型的分子诸如核酸上。表位决定簇可包括分子诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基的化学活性表面分组，并且可具有特定的三维结构特征，和/或特殊的电荷特征。通常地，对于特定靶抗原是特异的抗体将优先识别蛋白质和/或大分子的复杂混合物中的靶抗原上的表位。
术语“同一性”是指两个或更多个多核苷酸分子或两个或更多个核酸分子的序列之间的关系，如通过比对和比较序列测定的。“百分比同一性”意指被比较的分子中的氨基酸或核苷酸之间的相同残基的百分比，并且可基于待比较的最小的分子的大小来计算。为了进行这些计算，必须通过特定的数学模型或计算机程序(即，“算法”)来解决比对中的缺口(如果有的话)。可用于计算比对的核酸或多肽的同一性的方法包括如下文献中中描述的那些方法：ComputationalMolecularBiology，(Lesk，A.M.，编辑)，1988，NewYork：OxfordUniversityPress；BiocomputingInformaticsandGenomeProjects，(Smith，D.W.编辑)，1993，NewYork：AcademicPress；ComputerAnalysisofSequenceData，第I部分，(Griffin，A.M.和Griffin，H.G.，编辑)，1994，NewJersey：HumanaPress；vonHeinje，G.，1987，SequenceAhalysisinMolecularBiology，NewYork：AcademicPress；SequenceAnalysisPrimer，(Gribskov，M.和Devereux，J.，编辑)，1991，NewYork：M.StocktonPress；和Carillo等人，1988，SIAMJ.AppliedMath.48：1073。
在计算百分比同一性中，以产生序列之间最大匹配的方式比对待比较的序列。用于测定百分比同一性的计算机程序是GCG程序包，其包括GAP(Devereux等人，1984，Nucl.AcidRes.12：387；GeneticsComputerGroup，UniversityofWisconsin，Madison，WI)。计算机算法GAP用于使将要测定其百分比序列同一性的两个多肽或多核苷酸比对。比对序列以最佳地匹配它们各自的氨基酸或核苷酸(“匹配距离”，如通过比对测定的)。将缺口开放罚分(其被计算为3x平均对角线，其中“平均对角线”是待使用的比较矩阵的对角线的平均值；“对角线”是通过特定比较矩阵赋予每一个完美氨基酸匹配的评分或数值)和缺口延伸罚分(其通常为缺口开放罚分的1/10)以及比较矩阵诸如PAM250或BLOSUM62与算法结合使用。在某些实施方案中，也通过算法使用标准比较矩阵(关于PAM250比较矩阵，参见，Dayhoff等人，1978，AtlasofProteinSequenceandStructure5：345-352；关于BLOSUM62比较矩阵，参见，Henikoff等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：10915-10919)。
用于使用GAP程序测定多肽或核苷酸序列的百分比同一性的推荐参数如下：
算法：Needleman等人，1970，J.Mol.Biol.48：443-453；
比较矩阵：BLOSUM62fromHenikoff等人，1992，同上；
缺口罚分：12(但无对末端缺口的罚分)
缺口长度罚分：4
相似性阈值：0
用于比对两个氨基酸序列的某些比对方案可导致两个序列中的仅短的区域的匹配，并该小的比对区域即使在两个全长序列之间不存在显著关系时亦可具有极高序列同一性。因此，如果需要导致横跨靶多肽的至少50个连续氨基酸的比对，则可调整选择的比对法(GAP程序)。
如本文中所用，“基本上纯的”意指所需分子种类是存在的主要种类，即基于摩尔数，其比相同混合物中的任何其它单个种类更丰富。在某些实施方案中，基本上纯的分子是其中目标种类包含至少50％(基于摩尔数)的所有存在的大分子种类的组合物。在其它实施方案中，基本上纯的组合物将包含至少80％、85％、90％、95％或99％的存在于所述组合物中的所有大分子种类。在其它实施方案中，目标种类被纯化至基本上同质，其中污染性种类不能通过常规检测法在组合物中检测到，从而所述组合物由单一可检测的大分子种类组成。
术语“治疗”是指损伤、病状或病症的治疗或改善中的成功的任何标记，包括任何客观或主观参数诸如减轻；缓解；症状的逐渐消失或使损伤、病状或病症更可被患者耐受；退化或衰退速率的减缓；使退化的终点不太虚弱；改善患者的身体或精神健康。症状的治疗或改善可以基于客观或主观的参数；包括身体检查、神经精神检查和/或精神评估的结果。例如，本文中提供的某些方法成功地治疗(预防性地或作为紧急治疗)偏头痛，从而降低偏头痛的频率，降低偏头痛的严重程度，和/或改善与偏头痛相关的症状。
“有效量”通常是足以减轻症状的严重程度和/或降低其频率，消除症状和/或潜在原因，预防症状和/或其潜在原因的发生，和/或改善或矫治因偏头痛引起的或与之相关的损害的量。在一些实施方案中，有效量是治疗有效量或预防有效量。“治疗有效量”是足以纠正疾病状态(例如偏头痛)或症状，特别是状态或与疾病状态相关的症状，或另外地以任何方式预防、阻碍、延迟或逆转疾病状态或与疾病相关的任何其它不期望的症状的进展的量。“预防有效量”是当向受试者施用时，将具有所需的预防效果，例如，预防或延缓偏头痛发作(或复发)，或减小偏头痛或偏头痛症状发作(或复发)的可能性的药物组合物的量。完全治疗或预防效果不一定通过一个剂量的施用发生，并且只有在一系列剂量的施用后才可能发生。因此，可在一次或多次施用中施用治疗或预防有效量。
“氨基酸”包括其在本领域中的正常含义。20种天然存在的氨基酸及其缩写遵循常规用法。参见，Immunology-ASynthesis，第2版，(E.S.Golub和D.R.Green，编辑，SinauerAssociates：Sunderland，Mass.(1991)(为了所有目的通过引用并入本文)。20种常规氨基酸的立体异构体(例如，D-氨基酸)、非天然氨基酸诸如α-，α-二取代的氨基酸、N-烷基氨基酸和其它非常规氨基酸也可以是多肽的适当组件并且包括在短语“氨基酸”内。非常规氨基酸的实例包括：4-羟脯氨酸、γ羧基谷氨酸、ε-N，N，N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰赖氨酸、O-磷酸丝氨酸，N-乙酰丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟赖氨酸、σ-N-甲基精氨酸和其它类似的氨基酸和亚氨基酸(例如，4-羟脯氨酸)。在本文中所用的多肽符号中，根据标准用法和惯例，左手方向是氨基末端方向，右手方向是羧基末端方向。
疾病中的PAC1
存在于颅内血管的血管周间隙中的神经肽一直被认为是在偏头痛发作过程中伤害感受性输入的重要介质。垂体腺苷酸环化酶激活多肽(PACAP)存在于感觉三叉神经神经元中，并且可以在神经系统的不同水平上调节伤害感受。人的实验研究已经表明，PACAP38诱导头痛和偏头痛样发作(Schytz，等人，2009，“PACAP38inducesmigraine-likeattacksinpatientswithmigrainewithoutaura”，Brain：132第16-25页)，从而支持PAC1受体拮抗剂可用于偏头痛的预防性治疗和/或紧急治疗的想法。
抗体
本文提供了结合的PAC1蛋白，包括人PAC1(hPAC1)蛋白的抗体。提供的抗体是将如本文中所描述的一个或多个互补决定区(CDR)嵌入或联接于其中的多肽。在一些抗体中，CDR被嵌入于“框架”区，其确定CDR的方向，使得实现CDR的适当的抗原结合性质。一般地，提供的抗体可干扰、阻断、减少或调节PAC1与其配体例如PACAP(诸如PACAP-38)之间的相互作用。
在某些实施方案中，所述抗体包括，但不限于单克隆抗体、双特异性抗体、微型抗体、结构域抗体、合成抗体(有时在本文中称为“抗体模拟物”)、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、抗体融合物(有时在本文中称为“抗体缀合物”)及其片段。在本文的下文中将进一步描述各种结构。
本文提供的抗体已被证实结合PAC1，特别是人PAC1和食蟹猴PAC1。如在下面的实施例中进一步描述的，测试某些抗体，并且发现其结合于与被许多其它针对PAC1的组分之一或另一组分的抗体结合的那些表位不同的表位。提供的抗体阻止PACAP(例如，PACAP-38)与其受体结合。因此，本文中提供的抗体能够抑制PAC1活性。具体地，结合这些表位的抗体可具有一种或多种下列活性：抑制(除其它以外)PAC1信号转导途径的诱导，抑制血管舒张、引起血管收缩、减轻炎症，例如，神经性炎症，和在PACAP结合后由PAC1诱导的其它生理作用。
本文所公开的抗体具有多种用途。一些抗体，例如，在特异性结合测定、PAC1特别地hPAC1或其配体的亲和纯化中以及在鉴定PAC1活性的其它拮抗剂的筛选测定中是有用的。一些抗体可用于抑制PAC1配体(例如，PACAP-38)对PAC1的结合。
所述抗体可用于多种治疗应用，如本文中解释的。例如，某些PAC1抗体用于治疗与PAC1介导的信号相关的病症，诸如减少偏头痛的频率、缓解偏头痛的严重度和/或治疗偏头痛，减少、缓解或治疗丛集性头痛，减少、缓解或治疗慢性疼痛，缓解或治疗糖尿病(II型)，减少、缓解或治疗心血管疾病，以及减少、减轻或治疗与患者的内毒素血症和脓毒症相关的血液动力学紊乱。抗体的其它用途包括，例如，PAC1相关疾病或病症的诊断和测定PAC1的存在或不存在的筛选测定。某些本文中描述的抗体可用于治疗与PAC1活性相关的后果、症状和/或病态。这些包括，但不限于各种类型的头痛，包括偏头痛(例如，慢性和/或偶发性偏头痛)。
一些提供的抗体具有通常与天然存在的抗体相关联的结构。这些抗体的结构单位通常包含一个或多个四聚体，每一个四聚体由两个相同的多肽链的偶联体组成，尽管一些哺乳动物的种也产生仅具有单一重链抗体。在典型抗体中，每一对或偶联体包括一个全长“轻”链(在某些实施方案中，大约25kDa)和一个全长“重”链(在某些实施方案中，约50-70kDa的)。每一个个体免疫球蛋白链由几个“免疫球蛋白结构域”组成，每一个免疫球蛋白结构域由大致90至110个氨基酸组成并且表达特征性折叠模式。这些结构域是组成抗体多肽的基本单位。每一条链的氨基末端部分通常包括负责抗原识别的可变结构域。该羧基末端部分在进化上比比该链的另一端更保守，并且被称为“恒定区”或“C区”。人轻链通常分类为κ和λ轻链，并且这些轻链的每一个含有一个可变结构域和一个恒定结构域。重链通常分类为μ、δ、γ、α或ε链，并且这些轻链将将抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE抗体。IgG具有几个亚型，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM的亚型包括IgM1和IgM2。IgA的亚型包括IgA1和IgA2。在人中，IgA和IgD同种型含有4条重链和4条轻链；IgG和IgE同种型含有两条重链和两条轻链；并且IgM同种型含有5条重链和5条轻链。重链C区通常包含一个或多个可负责效应子功能的结构域。重链恒定区结构域的数目将取决于同种型。IgG重链，例如，每一条含有称为CH1、CH2和CH3的3个C区结构域。提供的抗体可具有这些同种型和亚型的任一个。在某些实施方案中，PAC1抗体具有IgG1、IgG2或IgG4亚型。
在全长轻链和重链中，可变区与恒定区通过约12或更多个氨基酸的“J”区联接，重链也包括约10个以上的氨基酸的“D”区。参见，例如，FundamentalImmunology，第2版，第7章(Paul，W.，编辑)1989，NewYork：RavenPress(为了所有目的在此通过引用整体并入)。每一条轻链/重链对的可变区通常形成抗原结合位点。
免疫球蛋白链的可变区通常展现相同的总体结构，包含通过3个高变区(更常见地称为“互补决定区”或CDR)联接的相对保守的框架区(FR)。来自上文中提及的每一个重链/轻链对的两条链的CDR通常通过框架区比对以形成与靶蛋白(例如，PAC1)上的特定表位特异性结合的结构。从N末端至C末端，天然存在的轻链和重链可变区通常都遵照这些元件的下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。编号系统已被设计用来将数字赋予占据这些结构域的每一个中的位置的氨基酸。该编号系统在KabatSequencesofProteinsofImmunologicalInterest(1987和1991，NIH，Bethesda，MD)或Chothia&Lesk，1987，J.Mol.Biol.196：901-917；Chothia等人，1989，Nature342：878-883中进行了定义。
本文中提供的各种重链和轻链可变区描述于表3A和3B中。可将这些可变区中的每一个附接于上述重链和轻链恒定区以分别形成完整的抗体重链和轻链。此外，可组合所产生的重链和轻链序列的每一个以形成完整抗体结构。应当理解，还可将本文中提供的重链和轻链可变区附接于具有除上文中所列的示例性序列外的不同序列的其它恒定结构域。
还提供了编码本文中所述的抗体或其部分的核酸序列，包括编码抗体的一条或两条链或其片段、衍生物、突变蛋白或其变体的核酸、编码重链可变区或仅CDR的多核苷酸、足以用于杂交探针的多核苷酸、用于鉴定、分析、突变或扩增编码多肽的多核苷酸的PCR引物或测序引物、用于抑制多核苷酸的表达的反义核酸和产述核酸的互补序列。所述核酸可具有任何长度。它们在长度上可以为例如5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、750、1,000、1,500或更多个核苷酸，和/或可包含一个或多个另外的序列，例如，调控序列和/或为更大核酸例如载体的部分。核酸可以是单链的或双链的，并且可包含RNA和/或DNA核苷酸以及其人工变体(例如，肽核酸)。
表1A和1B显示示例性核酸序列。可将本文中提供的任何可变区附接于这些恒定区以形成完全重链和轻链序列。然而，应当理解，这些恒定区序列仅被提供为特定实例——本领域普通技术人员可应用其它恒定区，包括IgG1重链恒定区、IgG3或IgG4重链恒定区、7个λ轻链恒定区的任何恒定区(包括hCL-1、hCL-2、hCL-3和hCL-7)；已被修饰以改善稳定性、表达、可制造性或其它所需特征的恒定区等。在一些实施方案中，将可变区序列联接于本领域已知的其它恒定区序列。
提供的抗体的全长轻链和重链以及它们的对应的核酸和氨基酸序列的具体实例概述于表1A、1B、2A和2B中。表1A和2A显示示例性轻链序列，表1B和2B显示示例性重链序列，所述序列经显示不带各自的信号序列。
表1A-示例性抗-hPAC1抗体轻链核酸序列
表1B-示例性抗-hPAC1抗体的重链核酸序列
表2A-示例性抗-hPAC1抗体的轻链氨基酸序列
表2B-示例性抗-hPAC1抗体的重链氨基酸序列
抗体的可变结构域
还提供了含有如下文表3A和3B中显示的抗体轻链可变区或抗体重链可变区以及这些轻链和重链可变区的免疫功能性片段、衍生物、突变蛋白和变体的抗体(和对应的核酸序列)。
还包括的是编码表3A和3B中显示的可变区的核酸序列。因为这些序列包含在表1A和1B中显示的对应抗体的全长核酸序列中，因此它们不被作为单独的序列从表中或序列表中剔除，但可由本领域普通技术人员基于表3A和3B中提供的可变区以及表1A和1B中的全长DNA序列来容易地确定。
该类型的抗体通常可由式″VHx/VLy″来命名，其中″x″对应于重链可变区的数目，并且″y″对应于轻链可变区的数目。
表3A-示例性抗-hPAC1抗体的轻链可变区氨基酸序列
表3B-示例性抗-hPAC1抗体的重链可变区氨基酸序列
可将表3B中所列的重链可变区的每一个与表3A中显示的轻链可变区的任一个组合来形成抗体。
CDR
本文中公开的抗体是将一个或多个CDR移植、插入和/或联接进其中的多肽。抗体可具有1、2、3、4、5或6个CDR。抗体从而可具有例如一个重链CDR1(“CDRH1”)、和/或一个重链CDR2(“CDRH2”)、和/或一个重链CDR3(“CDRH3”)、和/或一个轻链CDR1(“CDRL1”)、和/或一个轻链CDR2(“CDRL2”)、和/或一个轻链CDR3(“CDRL3”)。一些抗体包括CDRH3和CDRL3。特定的重链和轻链CDR分别鉴定于在表3A和3B中。
给定的抗体的互补决定区(CDR)和框架区(FR)可使用由Kabat等人在SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第5版，USDept.ofHealthandHumanServices，PHS，NIH，NIH公开号91-3242，1991中描述的系统来鉴定。本文中公开的某些抗体包含一个或多个氨基酸序列，所述氨基酸序列与表4A(CDRL)和表4B(CDRH)中所示的CDR的一个或多个的氨基酸序列相同或与其具有充分的序列同一性。
表4A-示例性抗-hPAC1抗体轻链CDR氨基酸序列
表4B-示例性抗-hPAC1抗体重链CDR氨基酸序列
表5A-示例性抗-hPAC1抗体的LC序列组织
表5B-示例性抗-hPAC1抗体的HC序列组织
已描述了天然存在的抗体内的CDR的结构和性质，同上。简言之，在常规抗体中，CDR埋入在重链和轻链可变区中的框架中，其中它们构成负责抗原结合和识别的区域。可变区包含在框架区(由Kabat等人(1991，同上)称为框架区1-4、FR1、FR2、FR3和FR4；也参见Chothia和Lesk，1987，同上)内的至少三个重链或轻链CDR，参见，同上(Kabat等人，1991，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，PublicHealthServiceN.I.H.，Bethesda，MD；也参见Chothia和Lesk，1987，J.Mol.Biol.196：901-917；Chothia等人，1989，Nature342：877-883)。然而，本文中提供的CDR可以不仅用于确定常规抗体结构的抗原结合结构域，而且可被埋入在多种其它多肽结构中，如本文中描述的。
本文中公开的抗体中的一些抗体与本文中公开的其它抗体共有某些区域或序列。这些关系概述于上表中。
在一个方面，本文中提供的分离的抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、多特异性抗体或其抗原结合片段。
在另一个实施方案中，本文中提供的分离的抗体的抗体片段可以是Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、Fv片段、双抗体或单链抗体分子。
在其它实施方案中，本文中提供的分离的抗体是人抗体并且可具有IgG1型、IgG2型、IgG3型或IgG4型。在其它实施方案中，分离的抗体是IgG1型或IgG2型。在其它实施方案中，分离的抗体是IgG2型。在其它实施方案中，分离的抗体是IgG1型抗体。在其它实施方案中，IgG1型抗体是无糖基化IgG1抗体。在其它实施方案中，无糖基化IgG1抗体具有N297G突变。
在另一个实施方案中，抗体仅由如表2A-2B中所示的轻链或重链多肽组成。在一些实施方案中，抗体仅由轻链可变结构域或重链可变结构域诸如表3A和3B中所列的那些结构域组成。此类抗体可被一个或多个PEG分子PEG化。
在另一个方面，可将本文中提供的分离的抗体偶联于标记基团，并且可与本文中提供的分离的抗体之一的抗体竞争对人PAC1的细胞外部分的结合。在一个实施方案中，本文中提供的分离的抗体可减小单核细胞的趋化作用，抑制单核细胞迁移进肿瘤或当向患者施用时抑制肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤中的积累和功能。
如将由本领域普通技术人员所理解的，对于具有不止一个来自所述序列的CDR的任何抗体，独立地选自所述序列的CDR的任意组合是有用的。因此，可产生具有1、2、3、4、5或6个独立选择的CDR的抗体。然而，如将由本领域普通技术人员所理解的，特定的实施方案通常使用为非重复的CDR的组合，例如抗体通常不用2个CDRH2区来产生，等等。
单克隆抗体
提供的抗体包括结合PAC1的单克隆抗体。单克隆抗体可使用本领域中已知的任何技术，例如通过在完成免疫方案后永生化从转基因动物收获的脾细胞来产生。脾细胞可使用本领域中已知的任何技术，例如通过将它们与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤来进行永生化。用于杂交瘤生成融合法的骨髓瘤细胞优选为非抗体生成性的，具有高融合效率，和使得它们不能在某些选择性培养基中生长的酶缺陷，所述选择性培养基只支持所需融合细胞(杂交瘤)的生长。用于小鼠融合的合适的细胞系的实例包括Sp-20、P3-X63/Ag8、P3-X63-Ag8.653、NS1/1.Ag41、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG1.7和S194/5XXOBul；用于大鼠融合的细胞系的实例包括R210.RCY3、Y3-Ag1.2.3、IR983F和4B210。用于细胞融合的其它细胞系是U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2和UC729-6。
在一些情况下，通过如下步骤产生杂交瘤细胞：用PAC1免疫原免疫动物(例如，具有人免疫球蛋白序列的转基因动物)；从被免疫的动物收获脾细胞；将收获的脾细胞融合于骨髓瘤细胞系，从而产生杂交瘤细胞；从杂交瘤细胞建立杂交瘤细胞系，和鉴定产生结合PAC1(例如，如在下文中的实施例1-3中描述的)的抗体的杂交瘤细胞系。此类杂交瘤细胞系，和由其产生的抗-PAC1单克隆抗体是本申请的方面。
由杂交瘤细胞系分泌的单克隆抗体可使用本领域已知的任何技术来纯化。
嵌合和人源化抗体
还提供了基于前述序列的嵌合和人源化抗体。可在使用前以各种方式修饰用作治疗剂的单克隆抗体。一个实例是嵌合抗体，其为由来自不同抗体的蛋白质区段组成的抗体，所述区段被共价联接来产生功能性免疫球蛋白轻链或重链或其免疫功能性部分。一般地，重链和/或轻链的部分与来源于特定物种的抗体中的对应序列相同或同源或属于特定抗体种类或亚类，然而链的其余部分与来源于另一物种的抗体中的对应序列相同或同源，或属于另一抗体种类或亚类。对于与嵌合抗体相关的方法，参见，例如，美国专利号4,816,567；和Morrison等人，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81：6851-6855，所述专利号和文献在此通过引用并入。在例如美国专利号6,180,370、5,693,762、5,693,761、5,585,089和5,530,101中描述了CDR移植。
一般地，产生嵌合抗体的目的是生成其中使来自期望的患者种类的氨基酸的数目最大化的嵌合物。一个实例是“CDR移植”抗体，其中抗体包含一个或多个来自特定物种的互补决定区(CDR)或属于特定抗体种类或亚类，然而抗体的其余部分与来源于另一物种的抗体中的对应序列相同或同源，或属于另一抗体种类或亚类。为了在人中使用，通常将来自啮齿类动物抗体的可变区或选择的CDR移植至人抗体中，从而替代人抗体的天然存在的可变区或CDR。
一个有用类型的嵌合抗体是“人源化”抗体。通常地，从最初在非人动物中产生的单克隆抗体产生人源化抗体。修饰该单克隆抗体中的某些氨基酸残基(通常来自抗体的非抗原识别部分)以与对应的同种型的人抗体中的对应残基同源。人源化可以例如使用各种方法，通过用啮齿类动物可变区的至少部分取代人抗体的对应区域来进行(参见，例如，美国专利号5,585,089和5,693,762；Jones等人，1986，Nature321：522-525；Riechmann等人，1988，Nature332：323-27；Verhoeyen等人，1988，Science239：1534-1536)。
在一个方面，将本文中提供的抗体的轻链和重链可变区的CDR移植至来自相同或不同系统发育种的抗体的框架区(FR)。例如，可将本文中描述的重链和轻链可变区的CDR移植至共有人FR。为了生成共有人FR，可比对来自几种人重链或轻链氨基酸序列的FR以鉴定共有氨基酸序列。在其它实施方案中，用来自不同重链或轻链的FR替代本文中公开的重链或轻链的FR。在一个方面，抗-PAC1抗体的重链和轻链的FR中的稀有氨基酸不被替代，然而FR氨基酸的其余部分被替代。″稀有氨基酸″是特殊氨基酸，其存在于其中在FR中通常未发现该特定氨基酸的位置上。或者，可将来自一个重链或轻链的移植可变区与恒定区一起使用，所述恒定区与如本文中公开的该特定重链或轻链的恒定区不同。在其它实施方案中，移植的可变区是单链Fv抗体的部分。
在某些实施方案中，可将来自除人外的物种的恒定区与人可变区一起使用来产生杂交抗体。
全长人抗体
还提供了完全人抗体。存在用于产生对于给定的抗原是特异性的完全人抗体(“完全人抗体”)而无需将人类暴露于抗原的方法。被提供用于实现完全人抗体的产生的一个具体方法是小鼠体液免疫系统的“人源化”。将人免疫球蛋白(Ig)基因座引入其中内源Ig基因已被灭活的小鼠是在小鼠(可用任何所需的抗原免疫的小鼠)中产生完全人单克隆抗体(mAb)的一个方法。使用完全人抗体可使免疫原性和过敏性反应降至最低，所述反应有时可由向人施用小鼠或小鼠来源的mAb(作为治疗剂)引起。
完全人抗体可通过免疫转基因动物(通常地小鼠)来产生，所述转基因动物能够在缺少内源免疫球蛋白的产生的情况下产生一整套人抗体。用于该目的的抗原通常具有6个或更多个连续氨基酸，并且任选地缀合于载体，诸如半抗原。参见，例如，Jakobovits等人，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：2551-2555；Jakobovits等人，1993，Nature362：255-258；和Bruggermann等人，1993，YearinImmunol.7：33。在此类方法的一个实例中，通过使编码小鼠重和轻免疫球蛋白链的内源性小鼠免疫球蛋白基因座在其中失能，并将大片段的含有编码人重链和轻链蛋白的基因座的人基因组DNA插入小鼠基因组来产生转基因动物。随后将经部分修饰的动物(其具有不太完全的人免疫球蛋白基因座的补充)杂交繁育以获得具有所有所需的免疫系统修饰的动物。当施用免疫原时，这些转基因动物产生具有针对免疫原的免疫特异性但具有人而非鼠的氨基酸序列(包括可变区)的抗体。关于此类方法的进一步内容，参见，例如，WO96/33735和WO94/02602。与用于产生人抗体的转基因小鼠相关的另外的方法描述于美国专利号5,545,807、6,713,610、6,673,986、6,162,963、5,545,807、6,300,129、6,255,458、5,877,397、5,874,299和5,545,806中；PCT公开WO91/10741、WO90/04036中以及EP546073B1和EP546073A1中。
上述转基因小鼠，在本文中称为″HuMab″小鼠，含有编码与使内源[μ]和[κ]链基因座失活的靶向突变一起的未重排的人重链([μ]和[γ])和[κ]轻链免疫球蛋白的人免疫球蛋白基因微型基因座(minilocus)(Lonberg等人，1994，Nature368：856-859)。因此，小鼠展示减少的小鼠IgM或[κ]的表达和对免疫的响应，并且引入的人重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变以产生高亲和力的人IgG[κ]单克隆抗体(Lonberg等人，同上；Lonberg和Huszar，1995，Intern.Rev.Immunol.13：65-93；Harding和Lonberg，1995，Ann.N.YAcad.Sci.764：536-546)。HuMab小鼠的制备在如下文献中进行了详细描述：Taylor等人，1992，NucleicAcidsResearch20：6287-6295；Chen等人，1993，InternationalImmunology5：647-656；Tuaillon等人，1994，J.Immunol.152：2912-2920；Lonberg等人，1994，Nature368：856-859；Lonberg，1994，HandbookofExp.Pharmacology113：49-101；Taylor等人，1994，InternationalImmunology6：579-591；Lonberg和Huszar，1995，Intern.Rev.Immunol.13：65-93；HardingandLonberg，1995，Ann.N.YAcad.Sci.764：536-546；Fishwild等人，1996，NatureBiotechnology14：845-851，上述参考资料出于所有目的在此通过引入整体并入。参见，其它美国专利号5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,789,650、5,877,397、5,661,016、5,814,318、5,874,299和5,770,429；以及美国专利号5,545,807；国际公开号WO93/1227；WO92/22646和WO92/03918，所有所述美国专利号和国际公开号的公开内容出于所有目的在此通过引用整体并入。用于在这些转基因小鼠中产生人抗体的技术也公开于WO98/24893和Mendez等人，1997，NatureGenetics15：146-156中，所述国际公开号和文献在此通过引用并入。例如，HCo7和HCo12转基因小鼠品系可用于产生抗-PAC1抗体。关于使用转基因小鼠产生人抗体的其它细节提供于下文中的实施例中。
通过使用杂交瘤技术，可从转基因小鼠诸如上述那些转基因小鼠产生和选择具有所需特异性的抗原特异性人mAb。此类抗体可使用适当的载体和宿主细胞来克隆和表达，或可从培养的杂交瘤细胞收获所述抗体。
完全人抗体还可来源于噬菌体展示文库(如在Hoogenboom等人，1991，J.Mol.Biol.227：381；和Marks等人，1991，J.Mol.Biol.222：581国公开的)。噬菌体展示技术模拟通过在丝状噬菌体上展示抗体库，和随后通过它们对选择的抗原的结合选择噬菌体来模拟免疫选择。一个这样的技术在PCT公开号WO99/10494(在此通过引用并入)中进行了描述，所述PCT公开号描述了使用这样的方法进行的MPL-受体和msk-受体的高亲和力和功能性拮抗性抗体的分离。
双特异性或双功能性抗体
提供的抗体还包括包含如上所述的一个或多个CDR或一个或多个可变区的双特异性和双功能性抗体。双特异性或双功能性抗体在一些情况下是具有两个不同的重/轻链对和两个不同的结合位点的人工杂交抗体。双特异性抗体可通过多种方法产生，包括，但不限于杂交瘤的融合或Fab′片段的连接。参见，例如，Songsivilai和Lachmann，1990，Clin.Exp.Immunol.79：315-321；Kostelny等人，1992，J.Immunol.148：1547-1553。
各种其它形式
提供的抗体中的一些抗体是上文中公开的抗体的变体形式。例如，一些抗体在上文中所列的一个或多个重链或轻链、可变区或CDR中具有一个或多个保守氨基酸取代。
可基于共同的侧链性质将天然存在的氨基酸分类成：
1)疏水性的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
2)中性亲水性的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
3)酸性的：Asp、Glu；
4)碱性的：His、Lys、Arg；
5)影响链取向的残基：Gly、Pro；和
6)芳族的：Trp、Tyr、Phe。
保守氨基酸取代可包括这些种类之一的成员与相同种类的另一成员的交换。保守氨基酸取代可包括非天然存在的氨基酸残基，其通常通过化学肽合成而非通过生物系统中的合成来掺入。这些非天然存在的氨基酸残基包括拟肽和氨基酸部分的其它反向或倒置形式。
非保守取代可包括上述种类之一的成员与来自另一个种类的成员的交换。此类取代的残基可被引入与人抗体同源的抗体的区域，或引入分子的非同源区域。
在产生此类变化中，根据某些实施方案，可考虑氨基酸的亲水指数。蛋白质的亲水性分布图通过赋予每一个氨基酸数值(“亲水指数”)和随后沿着肽链反复地平均这些值来计算。已基于其疏水性和电荷特征赋予每一个氨基酸亲水指数。它们是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。
亲水性分布图在赋予蛋白质交互生物学功能中的重要性在本领域中是为人理解的(参见，例如，Kyte等人，1982，J.Mol.Biol.157：105-131)。已知某些氨基酸可取代具有相似亲水指数或评分的其它氨基酸并且仍然保持相似的生物活性。在基于亲水指数产生变化中，在某些实施方案中，包括其亲水指数在±2内的氨基酸的取代。在一些方面，包括在±1内的那些氨基酸，并且在其它方面，包括在±0.5内的那些氨基酸。
在本领域中还应理解，可基于亲水性有效地产生相似氨基酸的取代，特别地当由此产生的具有生物功能的蛋白或肽意欲用于免疫实施方案(如在本情况下)时。在某些实施方案中，蛋白质的最大局部平均亲水性(如受其相邻氨基酸的亲水性限制的)，与其免疫原性和抗原结合或免疫原性相关，即与蛋白质的生物学特性相关。
下列亲水性值已被赋予这些氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5+1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)。在基于相似的亲水值产生变化中，在某些实施方案中，包括其亲水性值在±2内的氨基酸取代，在其它实施方案中，包括其亲水性值在±1内的那些氨基酸取代，以及在其它实施方案中，包括其亲水性值在±0.5内的那些氨基酸取代。在一些情况下，还可基于亲水性鉴定来自一级氨基酸序列的表位。这些区域也称为“表位核心区”。
示例性保守氨基酸取代示于表6中。
表6：保守氨基酸取代
原始残基 示例性取代
Ala Ser
原始残基 示例性取代
Arg Lys
Asn Gln，His
Asp Glu
Cys Ser
Gln Asn
Glu Asp
Gly Pro
His Asn，Gln
Ile Leu，Val
Leu Ile，Val
Lys Arg，Gln，Glu
Met Leu，Ile
Phe Met，Leu，Tyr
Ser Thr
Thr Ser
Trp Tyr
Tyr Trp，Phe
Val Ile，Leu
本领域普通技术人员将能够使用公知的技术测定本文中所示的多肽的合适的变体。本领域普通技术人员可通过靶向据信对于活性不重要的区域来鉴定可被改变而不破坏活性的分子的适当区域。本领域普通技术人员还将能够鉴定在相似多肽之间为保守的分子的残基和部分。在其它实施方案中，甚至对于生物活性或对于结构可以是重要的区域可经历保守氨基酸取代而不破坏生物活性或不会不利地影响多肽结构。
此外，本领域普通技术人员可回顾结构-功能研究，从而鉴定相似多肽中的对于活性或结构是重要的残基。根据这样的比较，可预测蛋白质中对应于相似蛋白质中对于活性或结构来说是重要的氨基酸残基的氨基酸残基的重要性。本领域普通技术人员可选择化学上相似的氨基酸来取代此类预测的重要氨基酸残基。
本领域普通技术人员还可分析三维结构和与相似多肽中的该结构相关的氨基酸序列。鉴于这样的信息，本领域普通技术人员可在其三维结构方面预测抗体的氨基酸残基的比对。本领域普通技术人员可选择不对经预测存在于蛋白质表面上的氨基酸残基产生根本性变化，因为此类残基可参与与其它分子的重要相互作用。此外，本领域普通技术人员可产生在每一个期望的氨基酸残基上含有单个氨基酸取代的测试变体。随后可使用测定筛选这些变体的PAC1中和活性，(参见下文中的实例)从而产生关于哪个氨基酸可被改变以及哪个氨基酸决不能被改变的信息。换句话说，基于从此类常规实验收集的信息，本领域普通技术人员可容易地确定其中应当避免单独的或与其它突变组合的其它取代的氨基酸位置。
许多科学出版物一直致力于二级结构的预测。参见，Moult，1996，Curr.Op.inBiotech.7：422-427；Chou等人，1974，Biochem.13：222-245；Chou等人，1974，Biochemistry113：211-222；Chou等人，1978，Adv.Enzymol.Relat.AreasMoi.Biol.47：45-148；Chou等人，1979，Ann.Rev.Biochem.47：251-276；和Chou等人，1979，Biophys.J.26：367-384。此外，计算机程序目前可用于帮助预测二级结构。预测二级结构的一个方法基于同源性建模。例如，具有大于30％的序列同一性或大于40％的相似性的两个多肽或蛋白质可具有相似的结构拓扑学。蛋白质结构数据库(PDB)的近年来的增长已提供提高的二级结构的预测性，包括多肽或蛋白质的结构内的折叠的潜在数目。参见，Holm等人，1999，Nucl.Acid.Res.27：244-247。已表明(Brenner等人，1997，Curr.Op.Struct.Biol.7：369-376)在给定的多肽或蛋白质中存在有限数目的折叠，以及一旦临界数目的结构已得到解析，则结构预测将变得明显更加精确。
预测二级结构的另外方法包括“穿线法”(Jones，1997，Curr.Opin.Struct.Biol.7：377-387；Sippl等人，1996，Structure4：15-19)，“profileanalysis”(Bowie等人，1991，Science253：164-170；Gribskov等人，1990，Meth.Enzym.183：146-159；Gribskov等人，1987，Proc.Nat.Acad.Sci.84：4355-4358)和“进化连锁”(参见，Holm，1999，同上；和Brenner，1997，同上)。
在一些实施方案中，产生氨基酸取代，所述取代：(1)减少对蛋白质水解的易感性，(2)减少对氧化的易感性，(3)改变结合亲和力以形成蛋白质复合物，(4)改变配体或抗原结合亲和力，和/或(4)赋予或修改此类多肽的其它物理化学或功能性质。例如，可在天然存在的序列中产生单个或多个氨基酸取代(在某些实施方案中，保守氨基酸取代)。可在存在于形成分子间接触的结构域外部的抗体的该部分中产生取代。在此类实施方案中，可使用不显著改变亲代序列的结构特征的保守氨基酸取代(例如，不破坏表征亲代或天然抗体的二级结构的一个或多个替代氨基酸)。本领域公认的多肽二级和三级结构的实例在Proteins，StructuresandMolecularPrinciples(Creighton，编辑)，1984，W.H.NewYork：FreemanandCompany；IntroductiontoProteinStructure(Branden和Tooze，编辑)，1991，NewYork：GarlandPublishing；和Thornton等人，1991，Nature354：105(所述文献各自通过引用并入本文)中进行了描述。
另外的优选抗体变体包括半胱氨酸变体，其中亲代或天然氨基酸序列中的一个或多个半胱氨酸残基被缺失或被另一种氨基酸(例如，丝氨酸)取代。半胱氨酸变体是有用的，尤其当抗体必须再折叠成具有生物活性的构象时。半胱氨酸变体可具有比天然抗体更少的半胱氨酸残基，并且通常具有偶数以使因未配对的半胱氨酸而导致的相互作用减小至最小。
公开的重链和轻链、可变区结构域和CDR可用于制备含有可特异性结合PAC1的抗原结合区的多肽。例如，表4A和4B中所列的CDR的一个或多个可被共价或非共价地整合进分子(例如，多肽)以产生免疫粘附素。免疫粘附素可将CDR整合为更大多肽链的部分，可将CDR共价地连接于另一个多肽链，或可非共价地整合CDR。所述CDR使得免疫粘附素能够特异性结合特定目标抗原(例如，PAC1或其表位)。
基于本文中描述的可变区结构域和CDR的模拟物(例如，“肽模拟物”或“拟肽”)。这些类似物可以是肽、非肽或肽与非肽区域的组合。Fauchere，1986，Adv.DrugRes.15：29；Veber和Freidinger，1985，TINSp.392；和Evans等人，1987，J.Med.Chem.30：1229，所述文献出于任何目的通过引用并入本文。结构上与治疗上有用的肽相似的肽模拟物可用于产生相似的治疗或预防效果。此类化合物通常借助于计算机化分子建模来开发。一般地，拟肽是在结构上与展示所需的生物活性，诸如此处特异性结合PAC1的能力的抗体相似，但一个或多个肽键联任选地通过本领域中公知的方法被选自-CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH-CH-(顺式和反式)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-和-CH2SO-的键联替代的蛋白质。利用相同类型的D-氨基酸对共有序列的一个或多个氨基酸的系统性取代(例如，D-赖氨酸替代L-赖氨酸)可用于在某些实施方案中产生更稳定的蛋白质。此外，包含共有序列或基本上相同的共有序列变异的约束肽可通过本领域已知的方法(Rizo和Gierasch，1992，Ann.Rev.Biochem.61：387)，通过引用并入本文)，例如，通过添加能够形成环化肽的分子内二硫桥的内部半胱氨酸残基来产生。
还提供了本文中描述的抗体的衍生物。衍生的抗体可包含赋予抗体或片段所需性质(诸如特定用途中的延长的半衰期)的任何分子或物质。衍生抗体可包含，例如检测的(或标记)部分(例如，放射性分子、比色分子、抗原分子或酶促分子、可检测的珠粒(诸如磁珠或电子致密(例如，金)珠粒)，或结合另一种分子的分子(例如，生物素或链霉抗生物素蛋白))、治疗性或诊断性部分(例如，放射性部分、细胞毒性部分或药物活性部分)、或增加抗体对于特定用途(例如，向受试者诸如人受试者的施用，或其它体内或体外用途)的适合性的分子。可用于衍生抗体的分子的实例包括白蛋白(例如，人血清白蛋白)和聚乙二醇(PEG)。抗体的白蛋白连接的衍生物和PEG化衍生物可使用本领域公知的技术来制备。某些抗体包括如本文中描述的PEG化单链多肽。在一个实施方案中，将抗体缀合于或另外地连接于转甲状腺素蛋白(TTR)或TTR变体。可用例如化学物质化学地修饰TTR或TTR变体，所述化学物质选自葡聚糖、聚(正-乙烯吡咯烷酮)、聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯多元醇(polyoxyethylatedpolyol)和聚乙烯醇。
其它衍生物包括PAC1结合蛋白与其它蛋白或多肽的共价或聚集缀合物，诸如通过包含融合于PAC1结合蛋白的N末端或C末端的异源多肽的重组融合蛋白的表达。例如，缀合的肽可以是异源信号(或前导)多肽，例如，酵母α因子前导序列或肽诸如表位标签。含PAC1抗体的融合蛋白可包含被添加来促进PAC1结合蛋白的纯化或鉴定的肽(例如，多聚组氨酸)。还可将PAC1结合蛋白连接于如Hopp等人，1988，Bio/Technology6：1204；和美国专利号5,011,912中描述的FLAG肽。FLAG肽具有高度抗原性并且提供被特异性单克隆抗体(mAb)可逆地结合的表位，从而使得能够快速测定和容易地纯化表达的重组蛋白。用于制备其中将FLAG肽融合于给定的多肽的融合蛋白的试剂是商购可得的(Sigma，St.Louis，MO)。
含有一个或多个PAC1结合蛋白的寡聚物可用作PAC1拮抗剂。寡聚物可以以共价连接的或非共价连接的二聚体、三聚体或高级寡聚物的形式存在。考虑使用包含两个或更多个PAC1结合蛋白的寡聚物，一个实例是同二聚体。其它寡聚物包括异二聚体、同三聚体、异三聚体、同四聚体、异四聚体等。
一个实施方案涉及包含通过融合于PAC1结合蛋白的肽部分之间的共价或非共价相互作用联接的多个PAC1-结合多肽的寡聚体。此类肽可以是肽接头(间隔子)，或具有促进寡聚化的性质的肽。亮氨酸拉链和某些来源于抗体的多肽属于可促进附接于其的PAC1结合蛋白的寡聚化的肽，如在下文中更详细描述的。
在具体实施方案中，寡聚物包含2至4个PAC1结合蛋白。寡聚物的PAC1结合蛋白部分可以上述任何形式例如变体或片段存在。优选地，寡聚物包含具有PAC1结合活性的PAC1结合蛋白。
在一个实施方案中，使用源自免疫球蛋白的多肽制备寡聚物。包含融合于抗原衍生的多肽的各种部分(包括Fc结构域)的某些异源多肽的融合蛋白的制备已例如由Ashkenazi等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：10535；Byrn等人，1990，Nature344：677；和Hollenbaugh等人，1992″ConstructionofImmunoglobulinFusionProteins″，于CurrentProtocolsinImmunology，增刊4，第10.19.1-10.19.11页中描述。
一个实施方案涉及包含2个通过将PAC1结合蛋白融合于抗体的Fc区生成的融合蛋白的二聚体。可通过例如将编码融合蛋白的基因融合物插入适当的表达载体，在用所述重组表达载体转化的宿主细胞中表达所述基因融合物，并使表达的融合蛋白装配得非常象抗体分子(由此链间二硫键在Fc部分之间形成，以产生二聚体)来制备二聚体。
如本文中所用，术语“Fc多肽”包括来源于抗体的Fc区的多肽的天然和突变蛋白形式。还包括含有促进二聚化的铰链区的此类多肽的截短形式。包含Fc部分的融合蛋白(和从其形成的寡聚物)提供了通过在蛋白A或蛋白G柱上进行亲和色谱来进行容易的纯化的有利方面。
PCT申请WO93/10151和美国专利号5,426,048和5,262,522中描述的一种合适的Fc多肽是从人IgG1抗体的N末端铰链区延伸至Fc区的天然C末端的单链多肽。另一个有用的Fc多肽是美国专利号5,457,035中和Baum等人，1994，EMBOJ.13：3992-4001中描述的Fc突变蛋白。除氨基酸19已从Leu改变成Ala，氨基酸20已从Leu改变成Glu和氨基酸22已从Gly改变成Ala外，该突变蛋白的氨基酸序列与WO93/10151中呈现的天然Fc序列的突变蛋白相同。突变蛋白展示减小的对于Fc受体的亲和力。
在其它实施方案中，PAC1结合蛋白(诸如本文中公开的)的重链和/或轻链的可变部分可取代抗体重链和/或轻链的可变部分。
或者，寡聚物是包含多个PAC1结合蛋白的融合蛋白，其具有或不具有肽接头(间隔子肽)。在合适的肽接头中有美国专利号4,751,180和4,935,233中描述的那些肽接头。
用于制备寡聚PAC1结合蛋白衍生物的另一个方法包括亮氨酸拉链的使用。亮氨酸拉链结构域是促进在其中发现它们的蛋白质的寡聚化的肽。亮氨酸拉链最初在几种DNA结合蛋白中被鉴定(Landschulz等人，1988，Science240：1759)，并且自此以后已在多种不同的蛋白质中被发现。在已知的亮氨酸拉链中有天然存在的肽和其二聚化或三聚化的衍生物。适合用于产生可溶性寡聚蛋白的亮氨酸拉链结构域的实例在PCT申请WO94/10308中进行了描述，来源于肺表面活性蛋白D(SPD)在Hoppe等人，1994，FEBSLetters344：191(在此通过引用并入)中进行了描述。允许融合于其的异源蛋白的稳定三聚化的经修饰的亮氨酸拉链的使用在FanslOW等人，1994，Semin.Immunol.6：267-278中进行了描述。在一个方法中，将包含融合于亮氨酸拉链肽的PAC1结合蛋白片段或衍生物的重组融合蛋白在适当的宿主细胞中表达，和从培养上清液回收形成的可溶性寡聚PAC1结合蛋白片段或衍生物。
在某些实施方案中，抗体具有低于1pM、10pM、100pM、1nM、2nM、5nM、10nM、25nM或50nM的KD(平衡结合亲和力)。
另一个方面提供具有至少一天的体外或体内半衰期(例如，当向人受试者施用时)的抗体。在一个实施方案中，抗体具有至少3天的半衰期。在另一个实施方案中，抗体或其部分具有4天或更长的半衰期。在另一个实施方案中，抗体或其部分具有8天或更长的半衰期。在另一个实施方案中，衍生或修饰抗体或其抗原结合部分，以便其具有相较于未衍生或未经修饰的抗体更长的半衰期。在另一个实施方案中，抗体含有点突变以增加血清半衰期，诸如在2000年2月24日公开的WO00/09560(通过引用并入)中描述的。
糖基化
抗体具有与在天然种类中发现的糖基化不同或改变的糖基化模式。如在本领域中已知的，糖基化模式可取决于蛋白质的序列(例如，下文中论述的特定糖基化氨基酸残基的存在或不存在)，或其中产生所述蛋白质的宿主细胞或生物体。
多肽的糖基化通常是N-连接的或O-连接的。N-连接的是指糖类部分至天冬酰胺残基的侧链的附接。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X为除脯氨酸外的任意氨基酸)是用于将糖类部分酶促附接于天冬酰胺侧链的识别序列。因此，这些三肽序列的任一个在多肽中的存在生成潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化是指糖类N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一至羟氨酸，最常见地丝氨酸或苏氨酸的附接，尽管也可使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。
糖基化位点至抗体的添加通过改变氨基酸序列，以使其含有一个或多个上述三肽序列(对于N-连接的糖基化位点)来方便地实现。所述改变还可通过将一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基添加至起始序列或通过对起始序列进行一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基取代(对于O-连接的糖基化位点)来产生。为方便起见，抗体的氨基酸序列可通过在DNA水平上的变化，特别地通过在预先选择的碱基上突变编码靶多肽的DNA(以便产生将翻译成所需氨基酸的密码子)来改变。
增加抗体上的糖部分的数目的另一个方法是通过将糖苷化学地或酶促偶联于蛋白质。这些方法是有利的，因为它们不需要在具有N-和O-连接的糖基化的糖基化能力的宿主细胞中产生蛋白质。取决于使用的偶联模式，糖可被附接于(a)精氨酸和组氨酸，(b)游离羧基，(c)游离巯基诸如半胱氨酸的那些巯基，(d)游离羟基诸如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的那些巯基，(e)芳族残基诸如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的那些芳族残基，或(f)谷氨酰胺的酰胺基。这些方法在1987年9月11日公开的WO87/05330中，和Aplin和Wriston，1981，CRCCrit.Rev，Biochem.，第259-306页中进行了描述。
存在于起始抗体上的糖部分的去除可通过化学方法或酶促方法来实现。化学去糖基化需要将蛋白质暴露于化合物三氟甲磺酸或等同化合物。该处理导致除连接糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)外的大多数或所有糖的切割，同时保持多肽完整。化学去糖基化由Hakimuddin等人，1987，Arch.Biochem.Biophys.259：52和由Edge等人，1981，Anal.Biochem.118：131描述。多肽上的糖部分的酶促切割可通过使用多种如由Thotakura等人，1987，Meth.Enzymol.138：350描述的内切和外切糖苷酶来实现。潜在糖基化位点上的糖基化可通过使用如由Duskin等人，1982，J.Biol.Chem.257：3105描述的化合物衣霉素来阻止。衣霉素阻断蛋白质-N-糖苷键联的形成。
因此，方面包括其中糖基化位点的数目和/类型相较于亲代多肽的氨基酸序列已被改变的抗体的糖基化变体。在某些实施方案中，抗体蛋白变体包含比天然抗体更大或更少的N-连接糖基化位点。N-连接的糖基化位点的特征在于序列：Asn-X-Ser或Asn-X-Thr，其中指定为X的氨基酸残基可以是除脯氨酸外的任意氨基酸残基。生成该序列的氨基酸残基的取代提供用于添加N-连接的糖链的潜在新位点。或者，消除或改变该序列的取代将阻止存在于天然多肽中的N-连接的糖链的添加。例如，糖基化可通过Asn的缺失或通过用不同氨基酸取代Asn来减少。在其它实施方案中，生成一个或多个新的N-连接的位点。抗体通常在Fc区域中具有N-连接的糖基化位点。
已知人IgG1在N297(EU编号系统)上具有糖基化，并且糖基化促成IgG1抗体的效应子功能。基团具有突变的N297以试图产生无糖基化抗体。突变集中在用在物理化学性质上与天冬酰胺相似的氨基酸诸如谷氨酰胺(N297Q)或用模拟不具有极性基团的天冬酰胺的丙氨酸(N297A)取代N297。
如本文中所用，“无糖基化抗体”或“无糖基化fc”是指Fc的位置297上的残基的糖基化状态。抗体或其它分子可在一个或多个其它位置上含有糖基化但仍可被视为无糖基化抗体或无糖基化Fc-融合蛋白。
为了产生无效应子功能IgG1Fc分子，发现人IgG1的氨基酸N297至甘氨酸的突变即N297G提供优于在该残基上的其它氨基酸取代的纯化效率和生物物理性质。还发现，无糖基化IgG1框架中的抗PAC1抗体阻止Fcγ受体诱导的血小板耗竭，如使用吞噬作用测定(参见实施例5)评估的。因此，在优选实施方案中，抗-PAC1抗体包含具有“B”或“C”后缀(标示IgG1无糖基化变体)的抗体。在某些实施方案中，抗体包含具有N297G取代的Fc。
包含具有N297G突变的人IgG1Fc的Fc还可包含其它插入、缺失和取代。在某些实施方案中，人IgG1Fc包含N297G取代，并且与表2B中所示的一个或多个氨基酸序列(示例性抗-hPAC1Ab重链氨基酸序列)具有至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性。
含无糖基化IgG1Fc的分子不如含IgG1Fc的分子稳定。Fc区域从而可被进一步工程化来增强无糖基化分子的稳定性。在一些实施方案中，将一个或多个氨基酸取代成半胱氨酸以在二聚体状态中形成二硫键。对应于IgG1氨基酸重链序列的V259、A287、R292、V302、L306、V323或I332的残基从而可用半胱氨酸取代。在优选实施方案中，特定的残基对是使它们优先彼此形成二硫键，从而限制或防止二硫键混杂的取代。优选的对包括，但不限于A287C和L306C、V259C和L306C、R292C和V302C以及V323C和I332C。
本文中明确例举的是含无糖基化(N297G)IgG1Fc的重链，其中一个或两个残基R292和V302被半胱氨酸取代。具有“C”后缀的无糖基化(N297G)IgG1抗体在它们的重链中含有R292C和V302C取代。
标记和效应基团
在一些实施方案中，抗原结合包含一个或多个标记。术语“标记基团”或“标记”意指任何可检测的标记。合适的标记基团的实例包括，但不限于下列放射性同位素或放射性核素(例如，3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、荧光基团(例如，FITC、罗丹明、镧系元素磷光体)、酶促基团(例如，辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光基团、生物素基团或被第二报告分子识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、第二抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)。在一些实施方案中，将标记基团通过不同长度的间隔子臂偶联于抗体，以减少潜在的空间位阻。用于标记蛋白质的各种方法在本领域中是已知的并且当看到合适时可被使用。
术语“效应基团”意指偶联于用作细胞毒性剂的抗体的任何基团。合适的效应基团的实例是放射性同位素或放射性核素(例如，3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)。其它合适的基团包括毒素、治疗性基团或化学治疗基团。合适的基团的实例包括卡里奇霉素、奥利斯达汀、格尔德霉素和美坦辛。在一些实施方案中，通过不同长度的间隔子臂将效应基团偶联于抗体以减少潜在的空间位阻。
一般地，标记落入多个种类中，这取决于其中将检测它们的测定：a)同位素标记，其可以是放射性同位素或或重同位素；b)磁性标记(例如，磁性颗粒)；c)氧化还原活性部分；d)光学染料；酶促基团(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)；e)生物素化基团；和f)被第二报告分子识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、第二抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签等)。在一些实施方案中，通过不同长度的间隔子臂将标记基团偶联于抗体以减少潜在的空间位阻。用于标记蛋白质的各种方法在本领域中是已知的。
特定的标记包括光学染料，包括，但不限于生色团、磷光体和荧光团，后者在许多情况下是特异的。荧光团可以是“小分子”磷光体或蛋白质性质的磷光体。
“荧光标记”意指可通过其固有的荧光性质检测的任何分子。合适的荧光标记包括，但不限于萤光素、罗丹明、四甲基罗丹明、伊红、赤藓红、香豆素、甲基-香豆素、芘、孔雀绿、均二苯乙烯、荧光黄、CascadeBlueJ、TexasRed、IAEDANS、EDANS、BODIPYFL、LCRed640、Cy5、Cy5.5、LCRed705、Oregongreen、Alexa-Fluor染料(AlexaFluor350、AlexaFluor430、AlexaFluor488、AlexaFluor546、AlexaFluor568、AlexaFluor594、AlexaFluor633、AlexaFluor647、AlexaFluor660、AlexaFluor680)、CascadeBlue、CascadeYellow和R-藻红蛋白(PE)(MolecularProbes，Eugene，OR)、FITC、罗丹明(Rhodamine)和TexasRed(Pierce，Rockford，IL)、Cy5、Cy5.5、Cy7(AmershamLifeScience，Pittsburgh，PA)。合适的光学染料，包括荧光团，由RichardP.Haugland在MOLECULARPROBESHANDBOOK(在此明确地通过引用并入)中进行了描述。
合适的蛋白质性质的荧光标记还包括，但不限于，绿色荧光蛋白，包括GFP的海肾属、海笔属(Ptilosarcus)或多管水母属种类(Chalfie等人，1994，Science263：802-805)、EGFP(ClontechLabs.，Inc.，GenbankAccessionNumberU55762)、蓝色荧光蛋白(BFP，QuantumBiotechnologies，Inc.，Quebec，Canada；Stauber，1998，Biotechniques24：462-471；Heim等人，1996，Curr.Biol.6：178-182)、增强的黄色荧光蛋白(EYFP，ClontechLabs.，Inc.)、萤光素酶(Ichiki等人，1993，J.Immunol.150：5408-5417)、β半乳糖苷酶(Nolan等人，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：2603-2607)和海肾(WO92/15673、WO95/07463、WO98/14605、WO98/26277、WO99/49019、美国专利号5292658、5418155、5683888、5741668、5777079、5804387、5874304、5876995、5925558)。
核酸
一个方面还提供在特定杂交条件下与其它核酸(例如，包含表1A和1B中所列的核苷酸序列的核酸)杂交的核酸。用于杂交核酸的方法在本领域中是公知的。参见，例如，CurrentProtocolsinMolecularBiology，JohnWiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。如本文中定义的，中等严格杂交条件使用含有5x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)、0.5％SDS、1.0mMEDTA(pH8.0)、约50％甲酰胺的杂交缓冲液、6xSSC的预洗涤溶液，和55℃的杂交温度(或其它相似杂交条件，诸如含有约50％甲酰胺的杂交溶液，42℃的杂交温度)，以及60℃，于0.5xSSC、0.1％SDS中的洗涤条件。严格杂交条件在45℃下于6xSSC中杂交，随后在68℃下于0.1xSSC、0.2％SDS中洗涤一或多次。此外，本领域普通技术人员可操纵杂交和/或洗涤条件来增强或减弱杂交的严格度，以便包含相互具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的核苷酸序列的核酸通常保持相互杂交。
影响杂交条件的选择的基本参数和用于设计合适条件的指导方针由例如Sambrook，Fritsch和Maniatis(2001，MolecularCloning：ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，N.Y.，同上；和CurrentProtocolsinMolecularBiology，1995，Ausubel等人，编辑，JohnWiley&Sons，Inc.，2.10和6.3-6.4节)提供，并且可由本领域普通技术人员基于例如核酸的长度和/或碱基组成来容易地确定。
可通过突变将变化引入核酸，从而导致其编码的多肽(例如，抗体或抗体衍生物)的氨基酸序列的变化。可使用本领域已知的任何技术引入突变。在一个实施方案中，使用例如定点诱变方案改变一个或多个特定的氨基酸残基。在另一个实施方案中，使用例如随机诱变方案改变一个或多个随机选择的残基。无论其是如何产生的，突变的多肽可被表达并且可筛选其所需的性质。
可将突变引入核酸而不会显著地改变其编码的多肽的生物活性。例如，可产生在非必需氨基酸残基上导致氨基酸取代的核苷酸取代。或者，可将一个或多个突变引入选择性改变其编码的多肽的生物活性的核酸。例如，突变可以定量或定性地改变生物活性。定量改变的实例包括增强、减弱或消除活性。定性改变的实例包括改变抗体的抗原特异性。在一个实施方案中，可使用本领域中良好建立的分子生物学技术来突变编码本文中描述的任何抗体的核酸以改变氨基酸序列。
另一个方面提供适合用作用于检测核酸序列的引物或杂交探针的核酸分子。核酸分子可只包含一部分编码全长多肽的核酸序列，例如可用作探针或引物的片段或编码多肽的活性部分(例如，PAC1结合部分)的片段。
基于核酸的序列的探针可用于检测核酸或相似的核酸，例如编码多肽的转录物。探针可包含标记基团，例如放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。此类探针可用于鉴定表达多肽的细胞。
另一个方面提供包含编码多肽或其部分(例如含有一个或多个CDR或一个或多个可变区结构域的片段)的核酸的载体。载体的实例包括，但不限于，质粒、病毒载体、非附加型哺乳动物载体和表达载体，例如，重组表达载体。重组表达载体可包含呈适合于核酸在宿主细胞中表达的形式的核酸。重组表达载体包括一个或多个调控序列(其于待用于表达的宿主细胞选择的)，其有效地连接于待表达的核酸序列。调控序列包括指导核苷酸序列在许多类型的宿主细胞中组成型表达的那些调控序列(例如，SV40早期基因增强子、劳斯肉瘤病毒启动子和巨细胞病毒启动子)、指导核苷酸序列仅在某些宿主细胞中表达的那些调控序列(例如，组织特异性调控序列，参见，Voss等人，1986，TrendsBiochem.Sci.11：287，Maniatis等人，1987，Science236：1237，通过引用整体并入本文)，以及指导核苷酸序列响应特定处理或条件的可诱导的表达的那些调控序列(例如，哺乳动物细胞中的金属硫蛋白启动子，以及原核生物和真核生物系统中的tet-应答和/或链霉素应答启动子(参见，同上)。本领域普通技术人员将理解，表达载体的设计可取决于诸如待转化的宿主细胞的选择、所需的蛋白质的表达水平等因素。可将表达载体引入宿主细胞，从而产生由如本文中描述的核酸编码的蛋白质或肽，包括融合蛋白或肽。
另一个方面提供已向其中引入重组表达载体的宿主细胞。宿主细胞可以是任何原核细胞(例如，大肠杆菌(E.coli))或真核细胞(例如，酵母、昆虫或哺乳动物细胞(例如，CHO细胞))。可通过常规转化或转染技术将载体DNA引入原核或真核细胞。对于哺乳动物细胞的稳定转染，已知，取决于使用的表达载体和转染技术，只有少部分细胞可将外来DNA整合进它们的基因组。为了鉴定和选择这些整合体，通常将编码可选择标志(例如，用于针对抗生素的抗性)的基因与目标基因一起引入宿主细胞。优选地可选择标志包括赋予对药物诸如G418、潮霉素和氨甲蝶呤的抗性的那些可选择标志。除其它方法以外，可通过药物选择(例如，已整合可选择标志基因的细胞可存活，然而其它细胞死亡)鉴定利用引入的核酸稳定转染的细胞。
制备抗体
提供的非人抗体可以是例如来源于任何抗体生成动物，诸如小鼠、大鼠、兔、山羊、驴或非人灵长类动物(诸如猴(例如，食蟹猴或恒河猴)或猿(例如，黑猩猩))。可将非人抗体用于例如体外细胞培养和基于细胞培养的应用，或其中对抗体的免疫应答不发生或不显著，可被阻止，未被关注，或是所需的任何其它应用。在某些实施方案中，抗体可通过使用如上描述的本领域中已知的方法免疫动物来产生。抗体可以是多克隆的、单克隆的，或可通过表达重组DNA在宿主细胞中合成。可如上所述，通过免疫含有人免疫球蛋白基因座的转基因动物，或通过选择正在表达人抗体库的噬菌体展示文库来制备完全人抗体。
单克隆抗体(mAb)可通过多种技术(包括常规单克隆抗体法，例如Kohler和Milstein，1975，Nature256：495的标准体细胞杂交技术)来产生。或者，用于产生单克隆抗体的其它技术可用于例如B淋巴细胞的病毒或致癌转化。用于制备杂交瘤的一个适当的动物系统是鼠系统，所述系统是非常良好建立的方法。用于分离用于融合的经免疫的脾细胞的免疫方案和技术在本领域中是已知的并且举例说明性方法在下文的实施例中进行了描述。对于此类方法，通常将来自免疫小鼠的B细胞与合适的永生化融合伴侣诸如鼠骨髓瘤细胞系融合。必要时，可免疫大鼠或除此以外的其它哺乳动物而不免疫小鼠，并且可将来自此类动物的B细胞与鼠骨髓瘤细胞系融合以形成杂交瘤。或者，可使用来自除小鼠外的来源的骨髓瘤细胞系。用于产生杂交瘤的融合方法也是公知的。
提供的单链抗体可通过经由氨基酸桥(短肽接头)连接重链与轻链可变结构域(Fv区)片段(从而导致单一多肽链)来形成。此类单链Fv(scFv)可通过融合编码编码2个可变结构域多肽(VL和VH)的DNA之间的肽接头的DNA来制备。所得的多肽本身可折叠回以形成抗原结合单体，或它们可形成多聚体(例如，二聚体、三聚体或四聚体)，这取决于两个可变结构域之间的柔性接头的长度(Kortt等人，1997，Prot.Eng.10：423；Kortt等人，200l，Biomol.Eng.18：95-108)。通过组合包含不同VI和VH的多肽，可形成结合不同表位的多聚scFv(Kriangkum等人，2001，Biomol.Eng.18：31-40)。被开发用于产生单链抗体的技术包括美国专利号4,946,778；Bird，1988，Science242：423；Huston等人，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：5879；Ward等人，1989，Nature334：544，deGraaf等人，2002，MethodsMolBiol.178：379-387中描述的那些技术。来源于本文中提供的抗体的单链抗体包括，但不限于包含表3A和3B中描述的重链和轻链可变区的可变结构域组合或包括表4A和表4B中描述的CDR的轻链和重链可变结构域的组合的scFv。
可使用亚类转换法将本文中提供的属于一个亚类的抗体改变成来自不同亚类的抗体。因此，IgG抗体可以来源于例如IgM抗体，反之亦然。此类技术允许制备新抗体，所述新抗体具有给定的抗体(亲代抗体)的抗原结合性质，而且还展示与来自亲代抗体的同种型或亚类不同的抗体同种型或亚类相关的生物学特性。可使用重组DNA技术。可将编码特定抗体多肽的克隆的DNA用于此类方法，例如，编码所需同种型的抗体的恒定结构域的DNA。参见，例如，Lantto等人，2002，MethodsMol.Biol.178：303-316。
因此，提供的抗体包括包含例如描述的可变结构域组合(同上)，具有所需同种型(例如，IgA、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE和IgD)及其Fab或F(ab’)2片段的那些抗体。此外，如果IgG4是所需要的，则还可期望将点突变(CPSCp-＞CPPCP)引入铰链区(如Bloom等人，1997，ProteinScience6：407(通过引用并入本文)中描述的)以减缓形成可导致IgG4抗体的异质性的H链内二硫键。
此外，用于衍生具有不同性质(即，改变对于它们所结合的抗原的亲和力)的抗体的技术也是已知的。一种这样的技术(称为链改组)包括在丝状噬菌体的表面上展示免疫球蛋白可变结构域基因库，通常称为噬菌体展示。链改组已被用于制备针对半抗原2-苯基噁唑-5-酮的高亲和力抗体，如由Marks等人，1992，BioTechnology10：779描述的。
可对表3A和3B中描述的重链和轻链可变区或表4A和4B中描述的CDR产生保守修饰(和针对编码核酸的对应修饰)，以产生具有某些所需的功能和生物化学特征的PAC1结合蛋白。用于实现此类修饰的方法在上文中进行了描述。
可以以各种方式进一步修饰PAC1抗体。例如，如果将它们用于治疗目的，可用聚乙二醇缀合(PEG化)它们以延长血清半衰期或增强蛋白质递送。或者，可将主题抗体或其片段的V区与不同抗体分子的Fc区融合。用于该目的的Fc区可被修饰，以使其不结合补体，从而当将融合蛋白用作治疗剂时减少在患者中诱导细胞裂解的可能性。此外，可用人血清白蛋白缀合主题抗体或其功能性片段以增强抗体或其抗原结合片段的血清半衰期。抗体或其片段的另一个有用的融合伴侣是转甲状腺素蛋白(TTR)。TTR具有形成四聚体的能力，从而抗体-TTR融合蛋白可形成可增强其结合亲合力的多价抗体。
或者，本文中描述的抗体的功能和/或生物化学特征的实质性改变可通过于在它们对维持如下性质的作用上显著不同的重链和轻链的氨基酸序列中生成取代来实现：(a)分子主链在取代的区域中的结构，例如折叠片或螺旋构象，(b)分子在靶位点上的电荷或疏水性，或(c)侧链的庞大。“保守氨基酸取代”可包括用对该位置上的氨基酸钱基的极性或电荷几乎没有或没有作用的非天然残基取代天然氨基酸残基。参见，表6，同上。此外，多肽中的任何天然残基还可用丙氨酸取代，如先前已针对丙氨酸扫描诱变所描述的。
主题抗体的氨基酸取代(无论是保守的还是非保守的)可由本领域普通技术人员通过应用常规技术来实现。氨基酸取代可用于鉴定本文中提供的抗体的重要残基，或增强或减弱这些抗体对于人PAC1的亲和力或用于改变本文中描述的其它抗体的结合亲和力。
表达抗体的方法
本文中还提供了呈包含至少一个如上所述的多核苷酸的质粒、表达载体、转录或表达盒的形式的表达系统和构建体，以及包含此类表达系统或构建体的宿主细胞。
本文中提供的抗体可通过许多常规技术中的任何技术来制备。例如，PAC1抗体可使用本领域中已知的任何技术，通过重组表达系统来产生。参见，例如，MonoclonalAntibodies，Hybridomas：ANewDimensioninBiologicalAnalyses，Kennet等人(编辑)PlenumPress，NewYork(1980)；和Antibodies：ALaboratoryManual，Harlow和Lane(编辑)，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，N.Y.(1988)。
抗体可在杂交瘤细胞系(例如，特别地抗体可在杂交瘤中表达)或在除杂交瘤外的细胞系中表达。编码抗体的表达构建体可用于转化哺乳动物、昆虫或微生物宿主细胞。可使用任何已知的用于将多核苷酸引入宿主细胞的方法来进行转化，所述方法包括例如将多核苷酸包装在病毒或噬菌体中和通过本领域中已知的转染方法(如由美国专利号4,399,216、4,912,040、4,740,461、4,959,455举例说明的)利用构建体转导宿主细胞。使用的最佳转化法将取决于哪种类型的宿主细胞将被转化。用于将异源多核苷酸导入哺乳动物细胞的方法在本领域中是公知的，包括，但不限于葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、多核苷酸在脂质体中的封装、将核酸与带正电荷的脂质混合和DNA至细胞核内的直接显微注射。
重组表达构建体通常包含编码含有以下部分的一种或多种的多肽的核酸分子：本文中提供的一个或多个CDR；轻链恒定区；轻链可变区；重链恒定区(例如，CH1、CH2和/或CH3)；和/或PCA1抗体的另一个支架部分。使用标准连接技术将这些核酸序列插入适当的表达载体。在一个实施方案中，将重链或轻链恒定区附接于抗-PAC1-特异性重链或轻链可变区的C末端，并且将其连接至表达载体。通常选择在使用的特定宿主细胞中具有功能的载体(即，载体与宿主细胞机器相容，从而允许基因的扩增和/或表达可发生)。在一些实施方案中，使用应用使用蛋白质报告分子诸如二氢叶酸还原酶的蛋白质-片段互补测定(，参见，例如美国专利号6,270,964，其在此通过引用并入)的载体。适当的表达载体可购自例如InvitrogenLifeTechnologies或BDBiosciences(先前称为″Clontech″)。用于克隆和表达抗体及片段的其它有用载体包括Bianchi和McGrew，2003，Biotech.Biotechnol.Bioeng.84：439-44(其在此通过引用并入)中描述的那些载体。在例如MethodsEnzymol.，第185卷(D.V.Goeddel，编辑)，1990，NewYork：AcademicPress中论述了另外的合适的表达载体。
通常地，用于任何宿主细胞的表达载体将含有用于质粒维持以及用于外源核苷酸序列的克隆和表达的序列。此类序列(在某些实施方案中统称为“侧翼序列”)通常可包括下列核苷酸序列的一个或多个：启动子、一个或多个增强子序列、复制起始点、转录终止序列、含有供体和受体剪接位点的完全内含子序列、编码用于多肽分泌的前导序列的序列、核糖体结合位点、多腺苷酸化序列、用于插入编码待表达的多肽的核酸的多接头区和可选择标志元件。在下文中论述这些序列的每一个序列。
任选地，载体可含有“标签”-编码序列，即位于PAC1结合蛋白编码序列的5′或3′末端的寡核苷酸分子；所述寡核苷酸序列编码多聚His(诸如六His)，或存在针对其的商购可得的抗体的另一种“标签”诸如HA(血凝素流感病毒)或myc。在多肽表达后，该标签通常被融合于所述多肽，并且可用作用于从宿主细胞亲和纯化PAC1结合蛋白或检测其的方法。亲和纯化可以例如通过使用针对标签的抗体作为亲和基质的柱层析来实现。任选地，随后可通过各种方法诸如使用某些肽酶进行切割来从纯化的PAC1结合蛋白除去标签。
侧翼序列可以是同源的(即，来自与宿主细胞相同的物种和/或品系)、异源的(即，来自除宿主细胞物种或品系外的物种)、杂交的(即，来自不止一个来源的侧翼序列的组合)、合成的或天然的。这样，侧翼序列的来源可以是任何原核生物或真核生物，任何有脊椎生物或无脊椎生物，或任何植物，只要侧翼序列在宿主细胞机器中具有功能，并且可被所述机器激活。
用于载体的侧翼序列可通过本领域中公知的几种方法的任何方法来获得。通常地，本文中使用的侧翼序列先前已通过作图和/或通过限制性内切核酸酶消化进行了鉴定，从而可使用适当的限制性内切核酸酶从适当的组织来源分离。在一些情况下，侧翼序列的全长核苷酸序列可以是已知的。此处，侧翼序列可使用本文中针对核酸合成或克隆所描述的方法来合成。
全部还是仅部分侧翼序列是已知的，可使用聚合酶链式反应(PCR)和/或通过利用合适的探针诸如来自相同或另一物种的寡核苷酸和/或侧翼序列片段筛选基因组文库来获得。当侧翼序列未知时，可从更大片段的可含有例如编码序列或甚至另一基因或另外的基因的DNA分离含有侧翼序列的DNA片段。分离可通过限制性内切核酸酶消化(以产生适当的DNA片段)，随后使用琼脂糖凝胶纯化、柱层析(Chatsworth，CA)或对于本领域普通技术人员来说是已知的其它方法来实现。实现该目的的合适的酶的选择对于本领域普通技术人员来说是显而易见的。
复制起始点通常是商购的那些原核表达载体的部分，并且所述起始点帮助载体在宿主细胞中的扩增。如果选择的载体不含复制起始点位点，则可基于已知的序列合成其，并将其连接进入载体。例如，来自质粒pBR322(NewEnglandBiolabs，Beverly，MA)的复制起始点适合于大多数革兰阴性细菌，并且各自病毒来源(例如，SV40病毒、多瘤病毒、腺病毒、水疱性口炎病毒(VSV)或乳头状瘤病毒诸如HPV或BPV)用于在哺乳动物细胞中克隆载体。通常地，复制起始点组件对于哺乳动物表达载体不是必需的(例如，SV40起始点之所以被经常使用只是因为其还含有病毒早期启动子)。
转录终止序列通常位于多肽编码区的末端的3′，并且用于终止转录。通常地，原核细胞中的转录终止序列是富含G-C的片段，后接多聚T序列。虽然所述序列可容易地从文库克隆或甚至作为载体的部分商业购买，但其还可使用用于核酸合成的方法(诸如本文中描述的那些方法)来容易地合成。
可选择标志基因编码在选择培养基上生长的宿主细胞存活和生长所必需的蛋白质。常见选择标志基因编码蛋白质，所述蛋白质(a)赋予原核宿主细胞对抗生素或其它毒素诸如氨苄西林、四环素或卡那霉素的抗性；(b)补充细胞的营养缺陷；或(c)供应不可从复杂培养基或确定的培养基获得的重要营养物。具体的可选择标志是卡那霉素抗性基因、氨苄西林抗性基因和四环素抗性基因。有利地，新霉素抗性基因也可用于原核和真核宿主细胞中的选择。
其它可选择基因可用于扩增将被表达的基因。扩增是其中产生对于生长或细胞存活是至关重要的蛋白质所需的基因，以串联的方式在重组细胞的连续代的染色体内重复的过程。用于哺乳动物细胞的合适的可选择标志的实例包括二氢叶酸还原酶(DHFR)和无启动子胸苷激酶基因。将哺乳动物细胞转化体置于选择压下，其中仅转化体凭借存在于载体中的可选择基因唯一地适合存活。选择压通过在其中连续升高培养基中的选择剂的浓度的条件下培养转化的细胞，从而导致可选择基因和编码另一个基因(诸如结合PAC1的抗体)的DNA扩增来进行施加。作为结果，增加的量的多肽诸如抗体从扩增的DNA合成。
核糖体结合位点通常是mRNA的释放起始所必需的，并且特征在于Shine-Dalgarno序列(原核生物)或Kozak序列(真核生物)。所述元件通常位于启动子的3′和待表达的多肽的编码序列的5′。
在一些情况下，诸如当在真核宿主细胞表达系统中需要糖基化时，可操纵各种前序列或原序列以增加糖基化或产率。例如，可改变特定信号肽的肽酶切割位点，或添加源序列，所述序列也可影响糖基化。终蛋白质产物可在-1位置(相对于成熟蛋白质的第一个氨基酸)中具有一个或多个伴随表达的额外氨基酸，其可能未被完全除去。例如，终蛋白质产物可具有附接于氨基末端的在肽酶切割位点中发现的一个或两个氨基酸残基。或者，如果酶在成熟多肽的此类区域切割，则一些酶切割位点的使用可导致所需多肽的略微截短的形式。
表达和克隆通常含有被宿主生物识别的并且有效地连接于编码PAC1结合蛋白的分子的启动子。启动子是位于结构基因的起始密码子上游(即，5′)的非转录序列(通常在约100至1000bp内)，其控制结构基因的转录。启动子被常规分类成两类之一：诱导型启动子和组成型启动子。诱导型启动子响应培养条件的某些变化(诸如营养物的存在或不存在或温度的变化)而启始升高水平的从处于它们的控制之下的DNA的转录。组成型启动子，在另一方面，一致地转录有效连接于它们的基因，即，对基因的表达几乎无或无控制。大量被多种潜在宿主细胞识别的启动子是公知的。通过利用限制性酶消化从源DNA除去启动子并将所需的启动子序列插入载体，来将合适的启动子有效地连接于编码包含PAC1结合蛋白的重链或轻链的DNA。
与酵母宿主一起使用的合适的启动子在本领域中也是公知的。有利地将酵母增强子与酵母启动子一起使用。与哺乳动物宿主细胞一起使用的合适的启动子是公知的，包括，但不限于获自病毒诸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(诸如腺病毒2)、牛乳头状瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和猿猴病毒40(SV40)的基因组的那些启动子。其它合适的哺乳动物启动子包括异源哺乳动物启动子，例如，热激蛋白启动子和肌动蛋白启动子。
可能感兴趣的另外的启动子包括，但不限于：SV40早期启动子(Benoist和Chambon，1981，Nature290：304-310)；CMV启动子(Thornsen等人，1984，Proc.Natl.Acad.U.S.A.81：659-663)；劳斯肉瘤病毒的3′长末端重复中含有的启动子(Yamamoto等人，1980，Cell22：787-797)；疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等人，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：1444-1445)；来自金属硫蛋白基因的启动子和调控序列(Prinster等人，1982，Nature296：39-42)；和原核生物启动子诸如β-内酰胺酶启动子启动子(Villa-Kamaroff等人，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.US.A.75：3727-3731)；或tac启动子(DeBoer等人，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：21-25)。还感兴趣的是下列动物转录控制区，其展示组织特异性并且已被用于转基因动物中：在胰腺腺泡病毒中具有活性的弹性蛋白酶I基因控制区(Swift等人，1984，Cell38：639-646；Ornitz等人，1986，ColdSpringHarborSymp.Quant.Biol.50：399-409；MacDonald，1987，Hepatology7：425-515)；在胰腺β细胞中具有活性的胰岛素基因控制区(Hanahan，1985，Nature315：115-122)；在淋巴样细胞中具有活性的免疫球蛋白基因控制区(Grosschedl等人，1984，Cell38：647-658；Adames等人，1985，Nature318：533-538；Alexander等人，1987，Mol.Cell.Biol.7：1436-1444)；在睾丸、乳腺、淋巴样和肥大细胞中具有活性的小鼠乳房瘤病毒控制区(Leder等人，1986，Cell45：485-495)；在肝中具有活性的白蛋白基因控制区(Pinkert等人，1987，GenesandDevel.1：268-276)；在肝中具有活性的甲胎蛋白基因控制区(Krumlauf等人，1985，Mol.Cell.Biol.5：1639-1648；Hammer等人，1987，Science253：53-58)；在肝中具有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制区(Kelsey等人，1987，GenesandDevel.1：161-171)；在髓系细胞中具有活性的β珠蛋白基因控制区(Mogram等人，1985，Nature315：338-340；Kollias等人，1986，Cell46：89-94)；在脑的少突胶质细胞中具有活性的髓磷脂碱蛋白基因控制区(Readhead等人，1987，Cell48：703-712)；在骨骼肌中具有活性的肌球蛋白轻链-2基因控制区(Sani，1985，Nature314：283-286)；和在下丘脑中具有活性的促性腺激素释放激素基因控制区(Mason等人，1986，Science234：1372-1378)。
可将增强子序列插入载体以增加高等真核生物的编码包含人PAC1结合蛋白的轻链或重链的DNA的转录。增强子是在长度上约10-300bp的DNA顺式作用元件，其作用于启动子以增加转录。增强子具有相对方向和位置依赖性，已被发现位于转录单位的5′和3′的位置上。可从哺乳动物基因获得的几种增强子序列是已知的(例如，珠蛋白、弹性蛋白、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)。然而，通常地，使用来自病毒的增强子。本领域中已知的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒增强子和腺病毒增强子是用于真核细胞启动子的活化的示例性增强元件。虽然增强子可在载体中位于编码序列的5′或3′，但其通常位于启动子的5′位置。可将编码适当的天然或异源信号序列(前导序列或信号肽)的序列整合进表达载体，以促进抗体的细胞外分泌。信号肽或前导序列的选择取决于将在其中表达抗体的宿主细胞的类型，并且异源信号序列可替代天然信号序列。在哺乳动物宿主细胞中具有功能的信号肽的实例包括下列：美国专利号4,965,195中描述的白细胞介素-7(IL-7)的信号序列；Cosman等人，1984，Nature312：768中白细胞介素-2受体的信号序列；EP专利号0367566中描述的白细胞介素-4受体信号肽；美国专利号4,968,607中描述的I型白细胞介素-1受体信号肽；EP专利号0460846中描述的II型白细胞介素-1受体信号肽。
提供的表达载体可从起始载体诸如商购可得的载体构建。此类载体可含有或可以不含有所有所需的侧翼序列。当本文中描述的侧翼序列的一个或多个已未存在于载体中时，它们可被单独地获得并被连接进载体。用于获得每一个侧翼序列的方法对于本领域普通技术人员来说是公知的。
在载体已被构建并且编码轻链、重链或包含PAC1抗原结合序列的轻链和重链的核酸分子已被插入载体的适当位点后，可将完成的载体插入合适的宿主细胞以进行扩增和/或多肽表达。将抗体的表达载体转化进选择的宿主细胞可通过公知的方法来实现，包括转染、感染、磷酸钙共沉淀、电穿孔、显微注射、脂转染、DEAE-葡聚糖介导的转染或其它已知技术。选择的方法将部分是待使用的宿主细胞的类型的函数。这些方法和其它合适的方法对于本领域普通技术人员来说是公知的，并且示于例如Sambrook等人，2001(同上)中。
宿主细胞，当在适当的条件下培养时，合成抗体，随后可从培养基(如果宿主细胞将其分泌进培养基中时)或直接从产生其的宿主细胞(如果其不被分泌)收集所述抗体。适当的宿主细胞的选择将取决于各种因素，诸如所需的表达水平、是活性(诸如糖基化或磷酸化)所需或必需的多肽修饰和折叠成生物活性分子的容易性。
可用作用于表达的宿主的哺乳动物细胞系在本领域中是公知的并且包括，但不限于可获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)的永生化细胞系，包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如，HepG2)和许多其它细胞系。在某些实施方案中，可通过确定哪个细胞具有高表达水平和组成型地产生具有PAC1结合性质的抗体来选择细胞系。在另一个实施方案中，可选择来自不产生其自己的抗体但具有产生和分泌异源抗体的能力的B细胞谱系的细胞系。
人PAC1抗体用于诊断和治疗目的的用途
抗体用于检测生物样品中的PAC1和鉴定产生PAC1的细胞或组织。例如，PAC1抗体可用于诊断测定，例如结合测定以检测和/或定量组织或细胞中表达的PAC1。特异性结合PAC1的抗体还可用于治疗有此需要的患者的与PAC1相关的疾病。此外，PAC1抗体可用于抑制PAC1与其配体PACAP(例如，PACAP-38)形成复合物，从而调节PAC1在细胞或组织中的生物活性。可被调节的活性的实例包括，但不限于抑制血管舒张和/或减少神经源性炎平。结合PAC1的抗体从而可调节和/或阻断与其它结合化合物的相互作用，这样可在改善与PAC1相关的疾病中具有治疗性用途。
适应症
与人PAC1相关的疾病或病症包括其在患者中的发作至少部分由PAC1与其配体PACAP(例如，PACAP-38)的相互作用引起的任何疾病或病症。疾病或病症的严重度还可通过PAC1与PACAP(例如，PACAP-38)的相互作用来增强或减轻。可用本文中描述的抗体来治疗的疾病和病症的实例包括头痛，诸如丛集性头痛、偏头痛，包括偏头痛性头痛、慢性疼痛、II型糖尿病、炎症，例如神经源性炎症、心血管疾病和与内毒素血症和脓毒症相关的血液动力学紊乱。
具体地，本文中描述的抗体可用于治疗偏头痛(作为偏头痛发作已开始后开始的紧急治疗，和/或例如每日一次、每周一次、每两周一次、每月一次、每两月一次、每年二次等施用的预防性治疗)，以预防或减少与偏头痛发作相关的症状例如疼痛症状的频率和/或严重度。
PAC1受体激动剂PACAP的输注引起偏头痛患者的偏头痛样头痛，这表明阻断PAC1可用于治疗偏头痛。支持本发明的在食蟹猴中进行的免疫组织化学研究将PACAP和PAC1的位置定位于通过蝶颚神经节(SPG；也称为翼腭神经节)的副交感神经通路，所述副交感神经通路还刺激硬脑膜血管。副交感神经通路是独立的并且与也控制硬脑膜血管张力的感觉传导路平行，因此可能在偏头痛病理生理学中起作用。支持本发明的进行的另外实验显示，选择性PAC1Ab阻断电刺激的三叉神经颈复合体(TCC)激活(一种经报导与临床偏头痛疗效相关的电生理模型)。总之，证据支持利用选择拮抗剂诸如本文中描述的抗-PAC1抗体靶向PAC1治疗偏头痛。抗-PAC1治疗剂用于治疗人患者的偏头痛的预期功效进一步得到公开的论文支持，包括例如Schytz，H.W.，等人，“ThePACAPreceptor：anoveltargetformigrainetreatment.”，Neurotherapeutics.2010年4月；7(2)：191-6；OlesenJ.，等人，“Emergingmigrainetreatmentsanddrugtargets”，TrendsPharmacolSci.2011年6月；32(6)：352-9和Schytz，H.W.，等人，“PACAP38inducesmigraine-likeattacksinpatientswithmigrainewithoutaura”，Brain(2009)132(1)：16-25。
丛集性头痛是牵涉(作为其最显著的特征)单侧巨痛的病症。一些医生和科学家已将因丛集性头痛引起的疼痛描述为人可忍受的最强疼痛，超过分娩、烧伤或骨折。丛集性头痛通常周期性发生：疼痛的自发性缓解中断活跃期。丛集性头痛发作的平均年龄为～30-50岁。其在男性中更普遍，男女比变化为2.5∶1或3.5∶1。SPG刺激已用于治疗丛集性头痛。最近，AutonomicTechnologies已开发了ATITMNeurostimulation系统来递送低水平(但高频率，生理-阻断)电刺激以提供期望减轻丛集性头痛的急性衰弱性疼痛的紧急SPG刺激疗法。在它们的最近临床试验中已显示强劲的功效(NCT01616511；SchoenenJ等人，“Stimulationofthesphenopalatineganglion(SPG)forclusterheadachetreatment.PathwayCH-1：Arandomized，sham-controlledstudy.”，Cephalalgia.2013；33(10)：816-30。鉴于上述内容和因为PACAP是SPG中的主要神经递质之一，因此PAC1受体拮抗剂诸如本文中描述的抗-PAC1抗体预期具有治疗人的丛集性头痛的功效。
诊断方法
本文中描述的抗体可用于诊断目的，以检测、诊断或监测与PAC1相关的疾病和/或病症。还提供了用于使用本领域普通技术人员已知的经典免疫组织学方法(例如，Tijssen，1993，PracticeandTheoryofEnzymeImmunoassays，第15卷(编辑，R.H.Burdon和P.H.vanKnippenberg，Elsevier，Amsterdam)；Zola，1987，MonoclonalAntibodies：AManualofTechniques，第147-158页(CRCPress，Inc.)；Jalkanen等人，1985，J.Cell.Biol.101：976-985；Jalkanen等人，1987，J.CellBiol.105：3087-3096)检测PAC1在样品中的存在的方法。可在体内或体外进行PAC1的检测。
本文中提供的诊断应用包括使用抗体来检测PAC1的表达和配体对PAC1的结合。用于检测PAC1的存在的方法的实例包括免疫测定，诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射性免疫测定(RIA)。
对于诊断应用，通常用可检测标记基团标记抗体。合适的标记基团包括，但不限于下列标记物：放射性同位素或放射性核素(例如，3H、14C、15N、35S、90y、99Tc、111In、125I、131I)、荧光基团(例如，FITC、罗丹明、镧系元素磷光体)、酶促基团(例如，辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光基团、生物素基团或被第二报告分子识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、第二抗体的结合位噗、金属结合结构域、表位标签)。在一些实施方案中，通过不同长度的间隔子臂将标记基团偶联于抗体以减少潜在空间位阻。用于标记蛋白质的各种方法在本领域中是已知的并且可被使用。
在另一个方面，抗体可用于鉴定表达PAC1的细胞。在具体的实施方案中，用标记基团标记抗体，并检测标记的抗体对PAC1的结合。在其它具体的实施方案中，体内检测抗体对PAC1的结合。在其它具体的实施方案中，分离PAC1抗体并且其使用本领域已知的技术测量。参见，例如，Harlow和Lane，1988，Antibodies：ALaboratoryManual，NewYork：ColdSpringHarbor(1991年编辑和定期增刊)；JohnE.Coligan，编辑，1993，CurrentProtocolsInImmunologyNewYork：JohnWiley&Sons。
另一个方面提供用于检测与提供的抗体竞争对PAC1的结合的测试分子的存在。一个这样的测定的实例包括检测在测试分子存在或不存在的情况下含有一定量的PAC1的溶液中的游离抗体的量。游离抗体(即，未结合于PAC1的抗体)的量的增加可表明所述测试分子能够与所述抗体竞争PAC1结合。在一个实施方案中，用标记基团标记抗体。或者，标记测试分子并在抗体存在或不存在的情况下监测游离测试分子的量。
治疗方法：药物制剂，施用途径
还提供了使用抗体的方法。在一些方法中，向患者提供抗体。抗体抑制PACAP对人PAC1的结合。
还提供了包含治疗有效量的一种或多种抗体和药学上可接受的稀释剂、载体、稳定剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂的药物组合物。此外，还包括通过施用此类药物组合物治疗患者(例如对于偏头痛)的方法。术语“患者”包括人患者。
可接受的配制材料在使用的剂量和浓度上对于受者是无毒的。在具体实施方案中，提供了包含治疗有效量的人PAC1抗体的药物组合物。
在某些实施方案中，可接受的配制材料优选地在使用的剂量和浓度上对于受者是无毒的。在某些实施方案中，药物组合物可含有用于改变、维持或保持例如组合物的pH、渗透性、粘性、澄清度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸附或渗透的配制材料。在此类实施方案中，合适的配制材料包括，但不限于氨基酸(诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)；抗微生物剂；抗氧化剂(诸如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)；缓冲剂(诸如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其它有机酸)；膨胀剂(诸如甘露醇或甘氨酸)；螯合剂(诸如乙二胺四乙酸(EDTA))；络合剂(诸如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)；填充剂；单糖；二糖和其它碳水化合物(诸如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白质(诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；着色剂、调味剂和稀释剂；乳化剂；亲水聚合物(诸如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；成盐抗衡离子(诸如钠)；防腐剂(诸如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸，硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢)；溶剂(诸如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(诸如甘露醇或山梨醇)；悬浮剂；表面活性剂或润湿剂(诸如普朗尼克、PEG、脱水山梨醇酯、聚山梨醇酯诸如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯，曲拉通、氨基丁三醇、卵磷脂、胆固醇、泰洛沙泊)；稳定性增强剂(诸如蔗糖或山梨醇)；张力增强剂(诸如碱金属卤化物，优选氯化钠或氯化钾、甘露醇山梨醇)；递送载体；稀释剂；赋形剂和/或药物佐剂。参见，REMINGTON’SPHARMACEUTICALSCIENCES，第18版，(A.R.Genrmo，编辑)，1990，MackPublishingCompany。
在某些实施方案中，可由本领域普通技术人员取决于例如所需的施用途径、递送形式和所需剂量测定最佳药物组合物。参见，例如，REMINGTON’SPHARMACEUTICALSCIENCES(同上)。在某些实施方案中，此类组合物可影响公开的抗体的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。在某些实施方案中，药物组合物中的主要媒介物或载体可以本质上是水性的或非水性的。例如，合适的媒介物或载体可以是注射用水、生理盐水溶液或人工脑脊髓液(可能地补充有在用于胃肠外施用的组合物中常用的其它材料)。中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水是其它示例性媒介物。在具体的实施方案中，药物组合物包含约pH7.0-8.5的Tris缓冲液，或约pH4.0-5.5的醋酸盐缓冲液，并且还可包括山梨醇或合适的取代物。在某些实施方案中，可通过将具有所需纯度的选择的组合物与任选的配制剂(REMINGTON’SPHARMACEUTICALSCIENCES，同上)以冻干饼或水溶液的形式组合来配制人PAC1抗体组合物。此外，在某些实施方案中，可使用适当的赋形剂诸如蔗糖将人PAC1抗体可被配制为冻干产物。
药物组合物可被选择用于胃肠外递送。或者，组合物可被选择用于吸入或用于通过消化道递送，诸如口服。此类药学上可接受的组合物的制剂在本领域普通技术人员的能力之内。
制剂组分优选地以对于施用部位是可接受的浓度存在。在某些实施方案中，缓冲剂用于使组合物维持在生理pH或略低的pH，通常在约5至约8的pH范围内。
当考虑胃肠外施用时，可以以在药学上可接受的媒介物中包含所需的人PAC1结合蛋白的无热源、胃肠外可接受的水溶液的形式提供治疗性组合物。用于胃肠外注射的特别合适的媒介物是其中将人PAC1抗体配制为适当地保存的无菌等渗溶液的无菌蒸馏水。在某些实施方案中，制剂可包括用试剂诸如可注射微球体、生物可侵蚀颗粒、聚合物化合物(诸如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠粒或脂质体配制所需的分子，所述试剂可提供可通过储库型注射递送的产品的受控或持续释放。在某些实施方案中，还可使用透明质酸，其具有在循环中延长持续时间的作用。在某些实施方案中，可植入药物递送装置可用于引入所需的抗体。
某些药物组合物被配制用于吸入。在一些实施方案中，将人PAC1抗体配制为干燥可吸入粉剂。在具体的实施方案中，还可用推进剂配制人PAC1抗体吸入溶液以用于气溶胶递送。在某些实施方案中，可将溶液喷雾。经肺施用和配制方法从而进一步描述于国际专利申请号PCT/US94/001875中，所述国际专利申请号通过引用并入并且描述经化学修饰的蛋白质的经肺递送。一些制剂可口服施用。以该方式施用的人PAC1抗体可以用或可以不用常用于配混固体剂型诸如片剂和胶囊剂的载体来配制。在某些实施方案中，胶囊可被设计来在胃肠道中的点上(此时生物利用度被最大化并且系统前降解被降至最低)释放制剂的活性部分。可包含另外的试剂来促进PAC1抗体的吸收。还可使用稀释剂、调味剂、低熔点石蜡、植物油、润滑剂、悬浮剂、片剂崩解剂和粘合剂。
一些药物组合物在与适合制造片剂的无毒赋形剂的混合物中包含有效量的一种或多种人PAC1抗体。通过将片剂溶解于无菌水或另一种适当的媒介物中，可以以单位剂量形式配制溶液。合适的赋形剂包括，但不限于惰性稀释剂，诸如碳酸钙、碳酸钠或碳酸氢钠、乳糖或磷酸钙；或粘合剂，诸如淀粉、明胶或阿拉伯胶；或润滑剂诸如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。
另外的药物组合物对于本领域普通技术人员来说将是显而易见的，包括在持续或受控递送制剂中包含人PAC1抗体的制剂。用于配制多种其它持续或受控递送装置诸如脂质体载体、生物可侵蚀微粒或多孔珠粒和储库型注射的技术对于本领域普通技术人员而言也是已知的。参见，例如，国际专利申请号PCT/US93/00829，其通过引用并入并且描述了多孔聚合微粒用于递送药物组合物的受控释放。持续释放制剂可包括以特型制品诸如薄膜或微胶囊的形式存在的半透性聚合物基质。持续释放基质可包括聚酯、水凝胶、聚乳酸(如美国专利号3,773,919和欧洲专利申请公开号EP058481(其每一个通过引用并入)中公开的)、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman等人，1983，Biopolymers2：547-556)、聚(2-羟乙基-异丁烯酸酯)(Langer等人，1981，J.Biomed.Mater.Res.15：167-277和Langer，1982，Chem.Tech.12：98-105)、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等人，1981，同上)或聚-D(-)-3-羟丁酸(欧洲专利申请公开号EP133,988)。持续释放组合物还可包括可通过本领域中已知的几种方法的任何方法来制备。参见，例如，Eppstein等人，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：3688-3692；欧洲专利申请公开号EP036,676；EP088,046和EP143,949，通过引用并入。
用于体内施用的药物组合物通常以无菌制剂的形式提供。灭菌可通过经过无菌滤膜过滤来实现。当将组合物冷冻干燥时，可在冷冻干燥和重建之前或之后进行使用该方法的灭菌。可将用于胃肠外施用的组合物以冻干形式贮存或贮存于溶液中。通常将胃肠外组合物置于具有无菌入口的容器中，例如具有可利用皮下注射针穿透的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。
在某些实施方案中，封装表达如本文中公开的重组抗体的细胞以用于递送(参见，Invest.OphthalmolVisSci43：3292-3298，2002和Proc.Natl.Acad.Sciences103：3896-3901，2006)。
在某些实施方案中，抗体具有至少10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml、100mg/ml或150mg/ml的浓度。一些制剂含有缓冲剂、蔗糖和聚山梨醇酯。制剂的实例是含有50-100mg/ml的抗体、5-20mM醋酸钠、5-10％w/v蔗糖和0.002-0.008％w/v聚山梨醇酯的制剂。某些制剂例如在9-11mM醋酸钠缓冲液、8-10％w/v蔗糖和0.005-0.006％w/v聚山梨醇酯中含有65-75mg/ml的抗体。某些此类制剂的pH在4.5-6的范围内。其它制剂具有5.0-5.5的pH(例如，5.0、5.2或5.4的pH)。
在药物组合物已被配制后，可将其作为溶液、悬浮液、凝胶、乳剂、固体、晶体或作为脱水或冻干粉剂贮存在无菌小瓶中。此类制剂可以以即用型形式或以在施用前重建的形式(例如，冻干的)进行贮存。还提供了用于产生单剂施用单元的试剂盒。某些试剂盒含有具有干燥的蛋白质的第一容器和具有含水制剂的第二容器。在某些实施方案中，提供了含有单室和多室预充填注射器(例如，液体注射器和冷冻注射器(lyosyringe))的试剂盒。待使用的含有治疗有效量的人PAC1抗体的药物组合物将取决于例如治疗背景和目的。本领域普通技术人员将理解，用于治疗的适当剂量水平将部分地根据递送的分子、将对其使用人PAC1抗体的适应症、施用途径以及患者的大小(体重、身体表面或器官大小)和/或状况(年龄和一般健康)而变化。在某些实施方案中，临床医生可调整剂量和更改施用途径以获得最佳治疗效果。
典型剂量可在约1μg/kg至约30mg/kg或更多的范围内，这取决于上述因素。在具体的实施方案中，剂量可在10μg/kg至约30mg/kg，任选地0.1mg/kg至约30mg/kg，或者0.3mg/kg至约20mg/kg的范围内。在一些应用中，剂量为0.5mg/kg至20mg/kg。在一些情况下，0.3mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、3mg/kg、10mg/kg或20mg/kg的剂量施用抗体。在一些治疗方案中剂量方案是以0.3mg/kgqW、0.5mg/kgqW、1mg/kgqW、3mg/kgqW、10mg/kgqW或20mg/kgqW的剂量。
给药频率将取决于制剂中使用的特定人PAC1抗体的药代动力学参数。通常地，临床医生施用组合物直至达到实现所需疗效的剂量。组合物从而可在一段时间内以单次剂量或以两次或更多次剂量(其可含有或可以不含有相同量的所需分子)，或以通过植入装置或导管进行的连续输注来进行施用。在某些实施方案中，可长期向患者施用抗体。抗体的慢性施用使通常与非完全人的抗体(例如在非人动物中针对人抗原产生的抗体，例如，在非人物种中产生的非完全人抗体或非人抗体)相关的不利免疫或过敏反应最小化。
药物组合物的施用途径与已知的方法一致，例如，口服，通过经由静脉内、腹膜内、脑内(实质内)、脑室内、肌内、眼内、动脉内、门静脉内或病变内途径的注射。在某些实施方案中，可通过快速浓注施用或通过输注或通过植入装置连续地施用组合物。
还可通过植入已将所需分子吸收或封装在其上的膜、海绵或另一种适当的材料来局部施用组合物。在某些实施方案中，当使用植入装置时，可将所述装置植入任何适当的组织或器官，并且所需分子的递送可以是通过扩散、定时推注或连续施用。
还可期望离体使用人PAC1抗体药物组合物。在这样的情况下，将已从患者取出的细胞、组织或器官暴露于人PAC1抗体药物组合物，此后随后将细胞、组织和/或器官植回患者中。
具体地，可通过植入已使用方法如本文中描述的那些方法进行遗传工程(以表达和分泌所述多肽)的某些细胞来递送人PAC1抗体。在某些实施方案中，此类细胞可以是动物或人细胞，并且可以是自体的、异体的或异种的。在某些实施方案中，可使细胞永生化。在其它实施方案中，为减少免疫应答的机会，可封装细胞以避免周围组织的渗入。在其它实施方案中，封装材料通常是相物相容的半透性聚合外壳或膜，其允许蛋白质产物释放但阻止患者的免疫系统或来自周围组织的其它有害因素对细胞的破坏。
下列实施例，包括进行的实验和获得的结果，被提供来仅用于举例说明性目的，并且不被解释为限制所附权利要求的范围。
实施例1
PAC1抗体
A.抗-PAC1抗体的产生
使用标准方法，例如基本上如美国专利公布US2010-0172895A1中详述的方法，通过用PAC1细胞外结构域蛋白、利用T细胞表位标签标记的DNA、表达全长人PAC1的L1.2细胞以及其它hPAC1抗原免疫XENOMOUSE动物来产生全长人抗体。
B.抗-PAC1抗体的筛选
在测定中筛选杂交瘤上清液的对PAC1的结合以及功能拮抗剂活性，从而检测它们阻断因PACAP(例如，PACAP-27或PACAP-38)或选择性外源肽配体(Maxadilan)对PAC1的激活而进行的cAMP的产生的能力，随后针对相关受体VPAC1和VPAC2进行反向筛选。对具有所需功能和选择性的那些上清液进行测序，并将其克隆，重组表达，纯化和使用标准方法(例如，基本上如美国专利公开US2010-0172895A1(通过参考并入本文)中所描述的)再次测试其功能和选择性。
C.PAC1激动剂的选择性
进行实验以评估3种PAC1激动剂(PACAP、VIP和Maxadilan)针对相关受体PAC1、VPAC1和VPAC2的活性和选择性。这些实验的数据示于下表7中，并且证明PACAP对于所有3种受体具有相似的激动剂活性，VIP对PAC1具有一定活性但对VPAC1和VPAC2具有更高活性(～10-100x)，Maxadilan对于PAC1相对于VPAC1和VPAC2具有高度选择性。
表7PACAP受体和激动剂
实施例2
PAC1特异性阻断性单克隆抗体在cAMP功能测定中的活性
A.抗-PAC1抗体的活性
在体外PAC1介导的cAMP测定中筛选如本文中描述的选择的hPAC1抗体以测定固有效力。测定使用SH-SY-5Y(一种内源地表达hPAC1的人成神经细胞瘤细胞系(Biedler，J.L.，等人，1978，″Multipleneurotransmittersynthesisbyhumanneuroblastomacelllinesandclones″.CancerRes.38(11Pt1)：3751-7；Lutz，E.M.，等人，“CharacterizationofnovelsplicevariantsofthePAC1receptorinhumanneuroblastomacells：consequencesforsignalingbyVIPandPACAP.”MolCellNeurosci2006；31：193-209)和几个表达具有下列登录号的重组PAC1、VPAC1和VPAC2构建体的细胞系：人PAC1(hPAC1)：NM_001118.4；hPAC1短的(缺失氨基酸残基89-109(使用的范围：1-88，110-468)的hPAC1)：NM_001199637.1；食蟹猴PAC1：XM_005549858.1；大鼠PAC1：NM_133511.2；小鼠PAC1：NM_001025372.2；人VPAC1(hVPAC1)：NM_004624.3；人VPAC2(hVPAC2)：NM_003382.4；大鼠VPAC2：NM_017238.1；小鼠VPAC2：NM_009511.2。
将SHSY-5Y细胞在最低必需培养基(MEM)(Invitrogen11095-072)与Ham’sF12营养混合物(Invitrogen11765-047)、10％胎牛血清(Invitrogen10099-141)、1X青霉素-链霉素-谷氨酰胺(Invitrogen10378016)和1XMEM非必需氨基酸(Invitrogen11140-050)的1∶1混合物中生长。将PAC1-CHO、大鼠PAC1和食蟹猴PAC1细胞在达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)(Gibco目录号11965)、10％透析的FBS(Invitrogen26400044)、1％MEM非必需氨基酸(Invitrogen11140-050)、1％丙酮酸钠(Invitrogen11360070)、1％谷氨酰胺/青霉素/链霉素(Invitrogen10378016)中生长。将CHO-Trex-大鼠和小鼠VPAC2R稳定细胞系生长在基础培养基：F12(Invitrogen11765-047)、P/S/G：1X(Invitrogen10378016)、热灭活的FBS：10％(Invitrogen10100147)、杀稻瘟素：5ug/ml(InvitrogenR21001)和潮霉素：400ug/ml(Invitrogen10687010)中生长。用四环素(Sigma87128)：3.5ug/ml诱导细胞，在测定前24小时添加。将hPAC1-CHO-K1细胞(PerkinElmer；ES-272-A)在Ham’sF12(Invitrogen11765-047)、10％FBS(Invitrogen10099-141)、青霉素-链霉素：1X(Invitrogen15140122)、400ug/mlG418(原液：50mg/ml＝＞8ml/L培养基)(Invitrogen10131027)、250ug/ml博莱霉素(原液：100mg/ml＝＞2.5ml/L培养基)(InvitrogenR25005)中生长。将VPAC1/CHO-CRE-BLA(Invitrogen；激动剂：VIP)细胞在达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)(Gibco目录号11965)、透析的FBS：10％(Invitrogen26400044)、NEAA：1X(Invitrogen11140-050)、青霉素/链霉素：1X(Invitrogen15140122)、HEPES(pH7.3)：25mM(Invitrogen15630130)中生长。将VPAC2/CHO-CRE-BLA(Invitrogen；激动剂：VIP)细胞如上文中针对VPAC1细胞所描述的一样生长，添加杀稻瘟素：5ug/ml(InvitrogenR21001)和遗传霉素：500ug/ml(G418)(Invitrogen10131027)。将SK-N-MC细胞在MEM(Invitrogen11095-072)、10％FBS(Invitrogen10099-141)、1XNEAA(Invitrogen11140-050)、1X丙酮酸钠(Invitrogen11360070)、1X谷氨酰胺/青霉素/链霉素(Invitrogen10378016)中生长。将L6细胞在达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)(Gibco目录号11965)、10％胎牛血清(Gibco目录号10099-141)、1X谷氨酰胺/青霉素/链霉素(Gibco目录号10378-016)中生长。
将细胞在上述条件下生长并在80-90％汇合时收获。用VERSENE(1∶5000，Invitrogen，15040-060)(针对SHSY5Y细胞)、0.05％胰蛋白酶-EDTA(1X)、酚红(Invitrogen，25300054)分离细胞，随后在4℃于BeckmanGS-6R单元中以1000rpm离心细胞，进行5分钟。用细胞冷冻培养基(Invitrogen，12648010)重悬浮沉淀。随后使用Z1CoulterParticle计数器计数细胞，并将其调整至所需浓度(5E6/ml或2E6/ml)，将等分于-80℃或液氮中贮存，直至使用。PAC1细胞hVPAC1/2CHO的浓度为4K/10μl；其它细胞浓度为2K/10μl；对于SKNMC和L6，浓度为1K/10μl。
在筛选中使用LANCEUltracAMP测定试剂盒(PerkinElmer，Boston，MA)。在白色Optiplates半面96孔板(Costar3642)中以40μL的总体积以一式三份进行测定。简言之，通过在水浴中在37℃下孵育解冻冷冻细胞的小瓶。用测定缓冲液(F12，0.1％BSA，1mMIBMX)洗涤解冻的细胞一次，随后将细胞浓度调整至2K/10μl。将细胞悬浮于10μl等分试样中分配至96半面白板中。随后添加5微升的拮抗剂(例如，如本文中描述的抗-PAC1抗体)，在轻轻振荡的条件下将样品在室温下孵育30分钟。随后添加5微升的激动剂(例如，PACAP38)，在轻轻振荡的条件下再次将样品在室温下孵育另外15分钟。随后添加10微升的4XEu-cAMP示踪工作溶液和10微升的4XULight-抗-cAMP工作溶液，随后在室温下将样品孵育另外45分钟。
在Em665/615nM下于EnVision仪上分析样品。利用GraphPadPrism软件5/6版(GraphPadInc.，LaJolla，CA)处理数据以将POC(对照的百分比)显示为测试的拮抗剂抗-PAC1抗体浓度的函数，并将其用标准非线性回归曲线拟合以产生IC50值。如下计算POC：
本文中描述的和测定中测试的所有抗体具有约0.1nM至约200nM的IC50活性；大多数抗体具有0.1nM至100nM的活性。使用上述表达食蟹猴PAC1的重组细胞和表达大鼠PAC1的大鼠细胞进行类似实验。使用人和食蟹猴PAC1获得的IC50是相似的，然而测试的抗体对于大鼠PAC1未显示均一的交叉反应孔。此外，表达相关受体hVPAC1(CRE-Bla-CHO-K1/Invitrogen)和hVPAC2(-Bla-CHO-K1/Invitrogen)的细胞用于进一步评估测试的抗体的选择性。测试的抗体在测试的范围内都不具有显著的针对hVPAC1或hVPAC2的抑制活性(在所有情况下IC50＞10,000nM)。示例性数据示于下表8中。
表8示例性抗-PAC1抗体在表达PAC1、VPAC1或VPAC2受体的细胞中的IC50活性
人PAC1与人VPAC1和VPAC2受体之间的IC50的差异阐述了这些抗体对于PAC1的高度选择性高于相关受体。
实施例3
用于受体阻断性抗体的Ki测定的放射配体结合测定
将125I-标记的PAC-1抗体(用于PAC1结合测定)或125I-标记的PEG-PACAP38(用于PACAP38结合测定)(两者都获自PerkinElmer(Billerica，MA))和从hPAC-1AequoScreenCHO制备的细胞膜(PerkinElmerLifeandAnalyticalSciences，Boston，Massachusetts)在不同浓度的测试抗体存在的情况下用于放射配体结合实验，以测定对应的Ki值。
细胞膜制备
将细胞在40xT225培养瓶中于Ham’sF12、10％FBS、100μg/ml链霉素、400μ/mlG418(受体表达选择)和Zeocin(水母发光蛋白表达选择)中生长至汇合。用1x不含Ca/Mg的PBS洗涤培养瓶。完全除去PBS。将5mlVERSENE添加至每一个培养瓶中，并等待约5分钟。在侧面轻敲培养瓶，并取出所有细胞。将来自所有烧瓶中的VERSENE/细胞悬浮液转移至50ml锥形管中，并置于冰上。为了收集任何剩余的细胞，用不含Ca/Mg但含蛋白酶抑制剂的冰冷PBS漂洗烧瓶，随后将溶液添加至管中的细胞。将管以1000rpm离心沉淀10分钟。将沉淀于-80℃贮存。
膜制备的当天，将细胞沉淀称重并在冰上进行溶解。将沉淀重悬浮于(10ml/克的沉淀)10mMTrisHCl，pH7.4、1mMEDTA、Roche蛋白酶抑制剂(1片/50ml)中，并通过用机动杜恩斯匀浆机进行30次击打来匀浆。将细胞匀浆物在4℃以2500rpm(～1000g)离心10分钟。将上清液转移至Beckman离心管并保持在冰上。用15ml缓冲液再匀浆沉淀，重复离心步骤。将上清液组合，并以48,400g离心30分钟。将沉淀重悬浮于15ml缓冲液中，并通过18G注射器剪切以打碎沉淀。通过20次击打匀浆沉淀，随后以48,400g离心30分钟。将沉淀重悬浮于～6ml的不含BSA的PACAP结合缓冲液(20mMTrisHCl，5mMMgSO4+蛋白酶抑制剂)。使用18G注射器重悬浮沉淀，将其进行杜恩斯匀浆，等分并于-70℃下贮存。利用微量滴定板BCA蛋白测定(Pierce)来测定总的膜蛋白浓度。
结合测定
在室温下于96孔板中设置PAC1结合测定，所述96孔板含有：120μl结合缓冲液(20mMTris-HCl，pH7.5、5.0mMMgSO4、150mMNaCl、0.1％BSA(Sigma)、1片完全TM/50ml缓冲剂(蛋白酶抑制剂))；10μl测试化合物(20X)；50μl人PAC1CHO膜悬浮液(0.2μg/孔)；和20μl的125I-PAC-1抗体(10X；用于PAC1结合测定)或125I-PEG-PACAP38(10X；用于PACAP38结合测定)。
通过向指定的板中添加10μl的(20X)20μMPACAP6-38来测定非特异性结合。在以60rpm振荡的条件下将板在室温下孵育2小时，随后将每一个孔的内容物在0.5％聚乙烯亚胺(PEI)处理的(进行至少2小时)GF/C96孔过滤板上进行过滤。用冰冷的50mMTris，pH7.5洗涤GF/C过滤板5次，随后在烘箱中于55℃干燥1小时。随后密封GF/C板的底部。向每一个孔中添加40μlMicroscintTM20，用TopSealTM-A(压贴粘接密封膜)密封GF/C板顶部，并且用TopCountNXT(Packard)计数GF/C板。使用Prizm(GraphPadSoftwareInc.)分析数据。
如上所述获得的显示Ki值的示例性数据示于下表9中。PAC1结合测定的数据与指定的125I-标记的PAC-1抗体示于不同栏中，测试抗体示于不同行中。对一些测试抗体运行来自不同生产批次的样品，如所显示的(01A、26A、39A)。结果表明在实施例2描述的cAMP测定中具有生物活性的测试的抗-PAC1抗体竞争PAC1的激动剂(125I-标记的PEG-PACAP38)的结合，并且还彼此交叉竞争hPAC1上的相同或相似表位。
表9
实施例4
通过KINEXA测量的结合KD
A.使用表达hPAC1的全细胞进行的实验
在KinExA上测试抗-Pacl抗体与CHOKl/huPacl细胞的结合。简言之，用山羊-抗-huFc(JacksonImmunoResearch目录号109-005-098)预涂覆UltraLinkBiosupport(Pierce目录号53110)，并用BSA进行封闭。将10pM、30pM、100pM和300pM的抗-Pac1抗体与不同密度(1.7x101-9x106个细胞/mL)的表达huPac1的CHOK1细胞在含有1％FBS和0.05％叠氮化钠的培养基F12中进行孵育。将含有抗-Pac1抗体和全细胞的样品在室温下旋转孵育4小时，随后在4℃以220-g离心5分钟，以将全细胞和抗-Pac1抗体-细胞复合物与未结合的抗-Pac1抗体分离。将含有游离抗-Pac1抗体的上清液通过0.22μm的过滤器过滤，随后在KinExA上加载至山羊-抗-huFc-涂覆的珠粒。利用荧光(AlexaFluor647)标记的抗-huIgG(H+L)抗体(JacksonImmunoResearch目录号109-605-088)定量珠粒结合的抗-Pac1抗体的量。在每一个细胞密度上结合信号与溶液中的游离抗-Pac1抗体的浓度成正比。通过KinExATMPro软件(SapidyneInstruments，Inc.，Boise，ID)中的n-曲线分析估计平衡解离常数(KD)。
B.使用hPAC1胞外结构域(ECD；hPAC11-135)的实验
在KinExA上测试抗-Pac1抗体与huPac1(1-135)：：6xHis的结合。简言之，用huPac1(1-135)：：6xHis预涂覆UltraLinkBiosupport(ThermoFisherScientific目录号53110)，并如上所述用BSA进行封闭。在室温下将30、100和300pM的Ab与不同浓度的huPac1(1-135)：：6xHis一起孵育至少8小时，随后通过huPac1(1-135)：：6xHis涂覆的珠粒运行。通过荧光(DyLight649)标记的山羊抗-huIgG(H+L)抗体(JacksonImmunoResearch目录号109-495-088)定量珠粒结合的Ab的量。在结合平衡时结合信号与游离Ab的浓度成正比。使用一位点均匀结合模型(KinExATMPro软件)从竞争曲线的非线性回归获得平衡解离常数(KD)。
与测试样品与CHOK1/huPac1细胞和huPac1(1-135)：：6xHis结合的平衡解离常数的概述示于下表10(平均数后跟(范围))中。
表10
实施例5
血小板吞噬测定
为了阐明任何潜在的Fcγ受体诱导的血小板耗竭，在吞噬测定中测试一个亚组的本文中描述的抗体。
A.外周血白细胞(PBL)和血小板的制备
如先前所述(Semple，J.W.等人，Blood(2007)109：4803-4805)制备人和食蟹猴的血小板。简言之，在不中断的条件下将来自健康食蟹猴供体的全血样品以170xg离心15分钟。从顶层收集富含血小板的血浆(PRP)。将样品的底层以2000xg离心10分钟，以获得贫血小板血浆(PPP)层和血沉棕黄层。在室温下用20μMCellTrackerGreenCMFDA标记PRP级分中的血小板，进行30分钟。用PBS洗涤标记的血小板，将其重悬浮于含有10％FBS的RPMI-1640中，并调整至1x108个细胞/mL的浓度。从获自相同供体的血沉棕黄层制备PBL。按照由提供商提供的方案用BDPharm-lyse裂解红细胞。裂解后，用含有10％FBS的RPMI-1640洗涤PBL2次，将终浓度调整至5x106个细胞/ml。
B.吞噬测定
通过用测试品在黑暗中孵育100μL的每一种CMFDA-标记的血小板和PBMC来起始吞噬反应。在6小时的孵育后，通过将板置于冰上来终止反应。通过用0.1％台盼蓝孵育2分钟来淬灭细胞外荧光。在用冰冷的PBS洗涤2次后，用碘化丙啶和抗-CD14在4℃孵育细胞30分钟。洗涤后，通过BDLSRII流式细胞仪(图2)分析细胞。基于先前的经验，吞噬血小板的单核细胞具有为阴性对照(a-SA或a-DNP)至少2倍或更高的CMFDA中位荧光强度值(2)。
示例性数据示于下表11中。结果显示，当在达到14mg/mL的抗体浓度上测试时，被测定的无糖基化IgG1变体(以“B”或“C”结尾的抗体，尽管在本研究只测试了“B”)都未激活人或食蟹猴全血中的血小板。类似地，对于高达并且包括最高测试浓度(3mg/ml)的体外血小板吞噬未观察到作用。在任何测试的浓度上未记录到体外嗜中性粒细胞激活。
表11
Ab ID 犬血小板 人血小板
01A 在3mg/ml呈阳性 在0.3mg/ml呈阳性
01B 阴性 阴性
13A 在0.1mg/ml呈阳性 在0.3mg/ml呈阳性
14A 在0.3mg/ml呈阳性 在0.3mg/ml呈阳性
14B 阴性 阴性
26A 在0.3mg/ml呈阳性 在0.1mg/ml呈阳性
26B 阴性 阴性
29B 阴性 阴性
39A 在0.1mg/ml呈阳性 在0.1mg/ml呈阳性
39B 阴性 阴性
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Claims (30)

1.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合人PAC1，其包含
(A)轻链CDR1，其包含(i)选自由表4A中所示的LCCDR1序列组成的组的氨基酸序列、(ii)与选自由表4A中所示的LCCDR1序列组成的组的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列或(iii)与选自由表4A中所示的LCCDR1序列组成的组的氨基酸序列具有至少95%同一性的氨基酸序列；
(B)轻链CDR2，其包含(i)选自由表4A中所示的LCCDR2序列组成的组的氨基酸序列、(ii)与选自由表4A中所示的LCCDR2序列组成的组的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列或(iii)与选自由表4A中所示的LCCDR2序列组成的组的氨基酸序列具有至少95%同一性的氨基酸序列；
(C)轻链CDR3，其包含(i)选自由表4A中所示的LCCDR3序列组成的组的氨基酸序列、(ii)与选自由表4A中所示的LCCDR3序列组成的组的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列或(iii)与选自由表4A中所示的LCCDR3序列组成的组的氨基酸序列具有至少95%同一性的氨基酸序列；
(D)重链CDR1，其包含(i)选自以由表4B中所示的HCCDR1序列组成的组的氨基酸序列、(ii)与选自由表4B中所示的HCCDR1序列组成的组的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列或(iii)与选自由表4B中所示的HCCDR1序列组成的组的氨基酸序列具有至少95%同一性的氨基酸序列；
(E)重链CDR2，其包含(i)选自由表4B中所示的HCCDR2序列组成的组的氨基酸序列、(ii)与选自由表4B中所示的HCCDR2序列组成的组的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列或(iii)与选自由表4B中所示的HCCDR2序列组成的组的氨基酸序列具有至少95%同一性的氨基酸序列；和
(F)重链CDR3，其包含(i)选自由表4B中所示的HCCDR3序列组成的组的氨基酸序列、(ii)与选自由表4B中所示的HCCDR3序列组成的组的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列或(iii)与选自由表4B中所示的HCCDR3序列组成的组的氨基酸序列具有至少95%同一性的氨基酸序列。
2.分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合人PAC1，其包含轻链可变区，所述轻链可变区包含(i)选自由表3A中所示的VLAA序列组成的组的氨基酸序列、(ii)与选自由表3A中所示的VLAA序列组成的组的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列或(iii)与选自由表3A中所示的VLAA序列组成的组的氨基酸序列具有至少95%同一性的氨基酸序列。
3.分离的抗体或其抗原结合片段，其包含氨基酸序列LV-01和HV-01；LV-02和HV-02；LV-03和HV-02；LV-04和HV-03；LV-05和HV-03；LV-06和HV-03；LV-04和HV-04；LV-04和HV-05；LV-07和HV-04；LV-07和HV-05；LV-07和HV-03；LV-04和HV-06；LV-04和HV-06；LV-05和HV-05；LV-08和HV-05；LV-09和HV-05；LV-05和HV-07；LV-05和HV-08；LV-09和HV-07；LV-09和HV-08；LV-09和HV-09；LV-05和HV-09；LV-05和HV-10；LV-08和HV-10；LV-05和HV-11；LV-05和HV-12；LV-05和HV-13；LV-08和HV-13；LV-10和HV-14；LV-11和HV-14；LV-12和HV-15；LV-12和HV-16；LV-13和HV-17；LV-14和HV-18；LV-14和HV-19；LV-15和HV-20；LV-16和HV-21；LV-17和HV-22；LV-18和HV-23；LV-19和HV-24；LV-19和HV-25；LV-20和HV-21或LV-21和HV-26；其中所述抗体或其抗原结合片段选择性结合hPAC1。
4.分离的抗体或其抗原结合片段，其包含氨基酸序列LC-01和HC-01(01A)；LC-01和HC-02(01B)；LC-02和HC-03(02A)；LC-02和HC-04(02B)；LC-02和HC-05(02C)；LC-03和HC-03(03A)；LC-04和HC-06(04A)；LC-04和HC-07(04B)；LC-04和HC-08(04C)；LC-05和HC-06(05A)；LC-05和HC-07(05B)；LC-05和HC-08(05C)；LC-06和HC-06(06A)；LC-06和HC-07(06B)；LC-06和HC-08(06C)；LC-04和HC-09(07A)；LC-04和HC-10(07B)；LC-04和HC-11(07C)；LC-04和HC-12(08A)；LC-04和HC-13(08B)；LC-04和HC-14(08C)；LC-07和HC-09(09A)；LC-07和HC-10(09B)；LC-07和HC-11(09C)；LC-07和HC-12(10A)；LC-07和HC-13(10B)；LC-07和HC-14(10C)；LC-07和HC-06(11A)；LC-07和HC-07(11B)；LC-07和HC-08(11C)；LC-04和HC-15(12A)；LC-04和HC-16(12B)；LC-04和HC-17(12C)；LC-05和HC-12(13A)；LC-05和HC-13(13B)；LC-05和HC-14(13C)；LC-08和HC-12(14A)；LC-08和HC-13(14B)；LC-08和HC-14(14C)；LC-09和HC-12(15A)；LC-09和HC-13(15B)；LC-09和HC-14(15C)；LC-05和HC-18(16A)；LC-05和HC-19(16B)；LC-05和HC-20(16C)；LC-05和HC-21(17A)；LC-05和HC-22(17B)；LC-05和HC-23(17C)；LC-09和HC-18(18A)；LC-09和HC-19(18B)；LC-09和HC-20(18C)；LC-09和HC-21(19A)；LC-09和HC-22(19B)；LC-09和HC-23(19C)；LC-09和HC-24(20A)；LC-09和HC-25(20B)；LC-09和HC-26(20C)；LC-05和HC-24(21A)；LC-05和HC-25(21B)；LC-05和HC-26(21C)；LC-05和HC-27(22A)；LC-05和HC-28(22B)；LC-05和HC-29(22C)；LC-08和HC-27(23A)；LC-08和HC-28(23B)；LC-08和HC-29(23C)；LC-05和HC-30(24A)；LC-05和HC-31(24B)；LC-05和HC-32(24C)；LC-05和HC-33(25A)；LC-05和HC-34(25B)；LC-05和HC-35(25C)；LC-05和HC-36(26A)；LC-05和HC-37(26B)；LC-05和HC-38(26C)；LC-08和HC-36(27A)；LC-08和HC-37(27B)；LC-08和HC-38(27C)；LC-10和HC-39(28A)；LC-10和HC-40(28B)；LC-10和HC-41(28C)；LC-11和HC-39(29A)；LC-11和HC-40(29B)；LC-11和HC-41(29C)；LC-12和HC-42(30A)；LC-12和HC-43(31A)；LC-13和HC-44(32A)；LC-14和HC-45(33A)；LC-14和HC-46(34A)；LC-15和HC-47(35A)；LC-16和HC-48(36A)；LC-17和HC-49(37A)；LC-18和HC-50(38A)；LC-19和HC-51(39A)；LC-19和HC-52(39B)；LC-20和HC-48(40A)或LC-21和HC-53(41A)；其中所述抗体或其抗原结合片段选择性结合hPAC1。
5.分离的抗体或其抗原结合片段，其包含
重链CDR：CDRH1-8、CDRH2-2和CDRH3-3以及轻链CDR：CDRL1-3、CDRL2-2、CDRL3-2，
重链CDR：CDRH1-11、CDRH2-5和CDRH3-9以及轻链CDR：CDRL1-13、CDRL2-1、CDRL3-1，
重链CDR：CDRH1-1、CDRH2-4和CDRH3-6以及轻链CDR：CDRL1-2、CDRL2-1、CDRL3-1，
重链CDR：CDRH1-1、CDRH2-4和CDRH3-6以及轻链CDR：CDRL1-1、CDRL2-1、CDRL3-1，
重链CDR：CDRH1-3、CDRH2-5和CDRH3-5以及轻链CDR：CDRL1-1、CDRL2-1、CDRL3-1，
重链CDR：CDRH1-9、CDRH2-6和CDRH3-1以及轻链CDR：CDRL1-4、CDRL2-3、CDRL3-3，
重链CDR：CDRH1-4、CDRH2-7和CDRH3-8以及轻链CDR：CDRL1-6、CDRL2-4、CDRL3-5，
重链CDR：CDRH1-10、CDRH2-1和CDRH3-7以及轻链CDR：CDRL1-5、CDRL2-3、CDRL3-4，
重链CDR：CDRH1-6、CDRH2-8和CDRH3-2以及轻链CDR：CDRL1-7、CDRL2-5、CDRL3-6，
重链CDR：CDRH1-7、CDRH2-3和CDRH3-4以及轻链CDR：CDRL1-8、CDRL2-6、CDRL3-7，
重链CDR：CDRH1-2、CDRH2-8和CDRH3-2以及轻链CDR：CDRL1-9、CDRL2-5、CDRL3-8，
重链CDR：CDRH1-6、CDRH2-8和CDRH3-2以及轻链CDR：CDRL1-10、CDRL2-5、CDRL3-6，
重链CDR：CDRH1-6、CDRH2-8和CDRH3-2以及轻链CDR：CDRL1-12、CDRL2-5、CDRL3-6，或
重链CDR：CDRH1-5、CDRH2-8和CDRH3-2以及轻链CDR：CDRL1-11、CDRL2-5、CDRL3-8，
其中所述抗体或其抗原结合片段选择性结合hPAC1。
6.一种抗体或其抗原结合片段，其中
(A)所述抗体或其抗原结合片段以100nM或更低(例如，50nM)的Ki与参照抗体竞争对人PAC1的结合，所述参照抗体选自由01B、14A、14B、26A、26B、28A、29A、29B、39A和39B组成的组；和
(B)所述抗体或其抗原结合片段选择性结合人PAC1。
7.抗体或其抗原结合片段，其中
(A)所述CDRL选自由如下部分组成的组：(i)选自由CDRL1-C1和CDRL1-C2组成的组的CDRL1，(ii)选自由CDRL2-C1、CDRL2-C2和CDRL2-C3组成的组的CDRL2，和(iii)由CDRL3-C1组成的CDRL3；
(B)所述CDRH选自由如下部分组成的组：(i)选自由CDRH1-C1和CDRH1-C2组成的组的CDRH1；(ii)选自由CDRH2-C1、CDRH2-C2和CDRH2-C3组成的组的CDRH2；和(iii)由CDRH3-C1组成的CDRH3，和
(C)所述抗体或其抗原结合片段选择性结合PAC1。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是单克隆抗体。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的分离的抗体，其中所述分离的抗体选自由单克隆抗体、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、双抗体和单链抗体组成的组。
10.根据权利要求9所述的分离的抗体，其中所述单克隆抗体选自由完全人抗体、人源化抗体和嵌合抗体组成的组。
11.根据权利要求10所述的分离的抗体，其中所述分离的抗体是完全人单克隆抗体。
12.根据权利要求8所述的分离的抗体，其中所述抗体是IgG1型抗体、IgG2型抗体、IgG3型抗体或IgG4型抗体。
13.根据权利要求12所述的分离的抗体，其中所述抗体是无糖基化IgG1抗体。
14.根据权利要求13所述的分离的抗体，其中所述抗体在其重链中包含N297突变。
15.根据权利要求14所述的分离的抗体，其中所述抗体在其重链中包含N297G取代。
16.根据权利要求14所述的分离的抗体，其中所述抗体在其重链中还包含取代R292C和V302C。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体相对于VPA1和VPAC2选择性抑制hPAC1。
18.根据权利要求17所述的分离的抗体，其中所述选择性比率大于100:1。
19.根据权利要求18所述的分离的抗体，其中所述选择性比率大于1000:1。
20.分离的多核苷酸，其编码权利要求1-19中任一项的抗体。
21.表达载体，其包含权利要求20的分离的核酸或多核苷酸。
22.细胞系，其已用权利要求21的表达载体转化。
23.方法，其产生权利要求1-19中任一项的抗体或其抗原结合片段，所述方法包括从权利要求22的宿主细胞制备所述抗体或其抗原结合片段，所述宿主细胞分泌所述抗体或其抗原结合片段。
24.药物组合物，其包含权利要求1-19中任一项的抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的赋形剂。
25.一种用于治疗患者的与PAC1相关的病症的方法，所述方法包括向患者施用有效量的权利要求1-19中任一项的抗体或其抗原结合片段。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述病症是头痛。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述病症是偏头痛。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述偏头痛是阵发性偏头痛或慢性偏头痛。
29.根据权利要求26所述的方法，其中所述病症是丛集性头痛。
30.根据权利要求25至29中任一项所述的方法，其中所述方法包括预防性治疗。
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