ES2770976T3 - Anticuerpos PAC1 humanos - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente al receptor tipo I del polipéptido de activación de la adenilato ciclasa de la pituitaria humana (PAC1), que comprende una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada, en el que: (a) la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de SEQ ID NO:153 y la región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de SEQ ID NO:174; (b) la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de SEQ ID NO:156 y la región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de SEQ ID NO:174; o (c) la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de SEQ ID NO:153 y la región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de SEQ ID NO:182.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos PACI humanos.

Antecedentes

Hay una necesidad no satisfecha significativa de terapias efectivas, particularmente terapias de profilaxis, para la migraña. Los resultados de múltiples estudios indican que ~14 millones de migrañosos en EE.UU. podrían estar cualificados y beneficiarse de una terapia preventiva efectiva y segura. Las terapias profilácticas para la migraña actualmente aprobadas son solo parcialmente efectivas y tienen considerables perfiles de efectos secundarios que limitan significativamente la capacidad de aceptación de estas medicaciones. A pesar de estas limitaciones, 4,5 millones de individuos con frecuentes cefaleas por migraña en EE.UU. toman medicación profiláctica para sus migrañas.

Los polipéptidos que activan la adenilato ciclasa de la pituitaria (PACAP) son péptidos de 38 aminoácidos (PACAP38) o 27 aminoácidos (PACAP27) que se aislaron primero de un extracto hipotalámico ovino en base a su capacidad para estimular la formación de cAMP en las células de la pituitaria anterior (Miyata, A., et al., “Isolation of a novel 38 residue-hypothalamic polypeptide which stimulates adenylate cyclase in pituitary cells”, Biochem Biophys Res Commun. 1989; 164:567-574; Miyata, A., et al., “Isolation of a neuropeptide corresponding to the N-terminal 27 residues of the pituitary adenylate cyclase activating polypeptide with 38 residues (PACAP38).”, Biochem Biophys Res Commun. 1990; 170:643-648). Los péptidos PACAP pertenecen a la superfamilia de glucagón-hormona de liberación de la hormona (GHRH)-secretina-polipéptido intestinal vasoactivo VIP con la secuencia de PACAP27 humano que comparte el 68% de identidad con el polipéptido intestinal vasoactivo (VIP) (Campbell, R.M. y Scanes, C.G., “Evolution of the growth hormone-releasing factor (GRF) family of peptides. Growth Regul.” 1992; 2:175-191). La forma principal de péptido PACAP en el cuerpo humano es PACAP38 y la farmacología de PACAP38 y PACAP27 no se ha mostrado que sea diferente del uno respecto al otro. A menos que se indique de otra forma en la presente memoria, PACAP o PACAP38 se usará para representar PACAP38, PACAP27 se usará para especificar PACAP27.

Tres receptores de PACAP se han presentado: uno que se une a PACAP con alta afinidad y tiene una afinidad mucho menor por VIP (receptor de PAC1, o simplemente “PAC1”), y dos que reconocen PACAP y VIP esencialmente igualmente bien (receptores VPAC1 y VPAC2, o simplemente “VPAC1” o “VPAC2”, respectivamente) (Vaudry, D., et al. “Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide and its receptors: 20 years after the discovery.”, Pharmacol Rev. 2009, Sept. 61(3):283-357).

PACAP es capaz de unirse a los tres receptores (PAC1, VPAC1, VPAC2) con potencia similar y por consiguiente no es particularmente selectivo. VIP, por otro lado, se une con afinidad significativamente mayor a VPAC1 y VPAC2, en se comparación con PAC1. Maxadilán, un péptido de 65 aminoácidos originalmente aislado de la mosca de la arena (Lerner, E.A., et al., “Isolation of maxadilan, a potent vasodilatory peptide from the salivary glands of the sand fly Lutzomyia longipalpis”, J Biol Chem. 15 de junio de 1991; 266(17):11234-6; Lerner, E.A., et al., “Maxadilan, a PAC1 receptor agonist from sand flies”, Peptides. Sept. 2007; 28(9):1651 -1654.), es exquisitamente selectivo para PAC1 en comparación con VPAC1 o VPAC2, y por consiguiente puede usarse como un agonista selectivo de PAC1. El documento EP 2048 162 A1 se refiere a un anticuerpo anti-PAC1 capaz de reconocer un PAC1 que tiene una estructura nativa y usos del mismo asociados con actividad de PAC1. La producción y caracterización de anticuerpos al receptor tipo I PACAP se trata además por Zvirbliene et al. (Hybridoma 1999, Vol. 18(4):335-342). La expresión y localización de PACAP y sus variantes del receptor tipo I específicas en tejido de cáncer de próstata humano se ha presentado por Moretti et al. (Ann N Y Acad Sci. 2006, Vol. 1070(1):440-9). La inducción de ataques tipo migraña en pacientes con migraña mediante infusión de PACAP38 y el receptor de PACAP como una diana nueva para el tratamiento de migraña se ha tratado por Schytz et al. (Neurotherapeutics 2010, Vol. 7(2):191 -6). Compendio

La presente invención se refiere a un anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a PAC1 humano. En particular, la presente invención proporciona:

1. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente al receptor de tipo I de polipéptido que activa la adenilato ciclasa de la pituitaria humana (PAC1), que comprende una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada, en el que:

(a) la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de SEQ ID NO:153 y la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de SEQ ID NO:174;

(b) la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de SEQ ID NO:156 y la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de SEQ ID NO:174; o

(c) la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de SEQ ID NO:153 y la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de SEQ ID NO:182.

2. El anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo de 1, en el que la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de SEQ ID NO:153 y la región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de SEQ ID NO:182.

3. El anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo de 1, en el que la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de SEQ ID NO:153 y la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de SEQ ID NO:174.

4. El anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo de 1, en el que la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de SEQ ID NO:156 y la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de SEQ ID NO:174.

5. El anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo de 1, en el que el anticuerpo comprende:

(a) una cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO:79 y una cadena pesada que comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID NOs:107-109 y 131-133; o

(b) una cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO:82 y una cadena pesada que comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID NOs:107-109.

6. El anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo de 5, en el que el anticuerpo comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO:79 y una cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO:131.

7. El anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo de 5, en el que el anticuerpo comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO:79 y una cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO:132.

8. El anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo de 5, en el que el anticuerpo comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO:79 y una cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO:133.

9. El anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo de cualquiera de 1 a 5, en el que el anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo monoclonal, un fragmento Fab, un fragmento Fab’, un fragmento F(ab’)2, un fragmento de Fv, un diacuerpo y un anticuerpo monocatenario.

10. El anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo de 9, en el que el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal totalmente humano.

11. El anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo de 9, en el que el anticuerpo es un anticuerpo tipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, preferiblemente en el que el anticuerpo es un anticuerpo IgG1 aglucosilado.

12. El anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo de 11, en el que el anticuerpo comprende una mutación en la posición N297 en su cadena pesada, preferiblemente una mutación N297G en su cadena pesada. 13. El anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo de 12, en el que el anticuerpo comprende además mutaciones R292C y V302C en su cadena pesada.

14. Un polinucleótido aislado que codifica un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de cualquiera de 1 a 13.

15. Un vector de expresión que comprende el polinucleótido de 14.

16. Una línea celular transformada con el vector de expresión de 15.

17. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de cualquiera de 1 a 13 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

18. Un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de cualquiera de 1 a 13 para usar en el tratamiento de cefalea en un paciente.

19. El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo para usar según 18, en el que la cefalea es migraña o cefalea en racimos.

20. El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo para usar según 19, en el que la migraña es migraña episódica o migraña crónica.

21. El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo para usar según cualquiera de 18 a 20, en el que el uso comprende tratamiento profiláctico.

En otro aspecto, se describe en la presente memoria un método de fabricación de un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de cualquiera como los anteriores, que comprende preparar el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de una célula huésped como anteriormente que secreta el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo.

En otro aspecto, se describe en la presente memoria el tratamiento de una condición asociada con PAC1 en un paciente, que comprende administrar a un paciente una cantidad efectiva de un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de cualquiera de los anteriores.

Breve descripción de las figuras

La FIG. 1 muestra secuencias de CDR de cadena ligera anti-hPAC1 seleccionadas y secuencias de consenso de CDR de cadena ligera anti-hPAC1 definidas CDRL1-C1, CDRL1-C2, CDRL2-C1, CDRL2-C2, CDRL2-C3 y CDRL3-C1.

La FIG. 2 muestra secuencias de CDR de cadena pesada anti-hPAC1 seleccionadas y secuencias de consenso de CDR de cadena pesada anti-hPAC1 definidas CDRH1-C1, CDRH1-C2, CDRH2-C1, CDRH2-C2, CDRH2-C3 y CDRH3-C1.

Descripción detallada

Los encabezados de la sección usados en la presente memoria son por propósitos organizativos solo y no van a construirse como limitantes del tema descrito.

A menos que se defina de otra forma en la presente memoria, los términos científicos y técnicos usados en conexión con la presente memoria tendrán los significados que se entienden normalmente por los expertos en la técnica. Además, a menos que se necesite de otra forma por contexto, los términos singulares incluirán pluralidades y los términos plurales incluirán el singular.

Generalmente, las nomenclaturas usadas en conexión con, y técnicas de, cultivo celular y tisular, biología molecular, inmunología, microbiología, genética y química de proteína y ácido nucleico e hibridación descritas en la presente memoria son aquellas bien conocidas y usadas normalmente en la técnica. Los métodos y técnicas de la presente solicitud se realizan generalmente según métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en diversas referencias generales y más específicas que se citan y se tratan a lo largo de la presente memoria a menos que se indique de otra forma. Véase, p.ej., Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001), Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), y Harlow y Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990). Las reacciones enzimáticas y técnicas de purificación se realizan según las especificaciones del fabricante, como se consiguen normalmente en la técnica o como se describen en la presente memoria. La terminología usada en conexión con, y los procedimientos de laboratorio y técnicas de, química analítica, química orgánica sintética, y química medicinal y farmacéutica descrita en la presente memoria son aquellos bien conocidos y normalmente usados en la técnica. Las técnicas estándar pueden usarse para síntesis químicas, análisis químicos, preparación, formulación y distribución farmacéutica y tratamiento de pacientes. Debería entenderse que esta invención no está limitada a la metodología particular, protocolos, y reactivos, etc., descritos en la presente memoria y como tal pueden variar. La terminología usada en la presente memoria es con el propósito de describir solo realizaciones particulares, y no pretende limitar el alcance de la presente invención, que se define únicamente por las reivindicaciones añadidas.

Distintos que en los ejemplos de operación, o donde se indique de otra forma, todos los números que expresan cantidades de ingredientes o condiciones de reacción usadas en la presente memoria deberían entenderse como modificados en todos los ejemplos mediante el término “aproximadamente”. El término “aproximadamente” cuando se usa en conexión con porcentajes significa ±10%.

Definiciones

El término “polinucleótido” o “ácido nucleico” incluye polímeros de nucleótidos tanto monocatenarios como bicatenarios. Los nucleótidos que comprenden el polinucleótido pueden ser ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido.

Una “molécula de ácido nucleico aislada” significa un ADN o ARN de origen genómico, ARNm, ADNc o sintético o alguna combinación de los mismos que no está asociado con todo o una parte de un polinucleótido en que el polinucleótido aislado se encuentra en la naturaleza, o está unido a un polinucleótido al que no está unido en la naturaleza. Por propósitos de esta descripción, debería entenderse que “una molécula de ácido nucleico que comprende” una secuencia de nucleótidos particular no incluye cromosomas intactos. Las moléculas de ácido nucleico aisladas “que comprenden” secuencias de ácido nucleico especificadas pueden incluir, además de las secuencias especificadas, secuencias de codificación para hasta diez o incluso hasta veinte proteínas distintas o partes de las mismas, o pueden incluir secuencias reguladoras unidas de forma operable que controlan la expresión de la región de codificación de las secuencias de ácido nucleico enumeradas, y/o pueden incluir secuencias de vector.

A menos que se especifique otra cosa, el extremo de la izquierda de cualquier secuencia de polinucleótidos monocatenaria tratada en la presente memoria es el extremo 5’; la dirección de la izquierda de secuencias de polinucleótido bicatenarias se denomina como la dirección 5’. La dirección de 5’ a 3’ además de transcritos de ARN naciente se denomina como la dirección de transcripción; las regiones de secuencia en la hebra de ADN que tienen la misma secuencia que el tránscrito de ARN que son 5’ al extremo 5’ del tránscrito de ARN se denominan como “secuencias corriente arriba”; las regiones de secuencia en la hebra de ADN que tienen la misma secuencia que el tránscrito de ARN que son 3’ al extremo 3’ del tránscrito de ARN se denominan como “secuencias corriente abajo”.

El término “secuencia de control” se refiere a una secuencia de polinucleótido que pueden afectar a la expresión y procesado de las secuencias de codificación a la que está ligada. La naturaleza de dichas secuencias de control puede depender del organismo huésped. En realizaciones particulares, las secuencias de control para procariotas pueden incluir un promotor, un sitio de unión ribosómica, y una secuencia de terminación de la transcripción. Por ejemplo, las secuencias de control para eucariotas pueden incluir promotores que comprenden uno o una pluralidad de sitios de reconocimiento para factores de transcripción, secuencias potenciadoras de la transcripción, y secuencias de terminación de la transcripción. “Secuencias de control” pueden incluir secuencia líder y/o secuencias compañeras de fusión.

El término “vector” significa cualquier molécula o entidad (p.ej., ácido nucleico, plásmido, bacteriófago o virus) usada para transferir la información que codifica la proteína en una célula huésped.

El término “vector de expresión” o “constructo de expresión” se refiere a un vector que es adecuado para la transformación de una célula huésped y contiene secuencias de ácido nucleico que dirigen y/o controlan (en conjunto con la célula huésped) la expresión de una o más regiones de codificación heteróloga unida de forma operativa a ella. Un constructo de expresión puede incluir, aunque no estar limitado a, secuencias que afectan o controlan la transcripción, traducción y, si están presentes los intrones, afectar al corte de ARN de una región de codificación unida de forma operable a ella.

Como se usa en la presente memoria, “unido de forma operable” significa que los componentes al que el término se aplica están en una relación que los permite realizar sus funciones inherentes bajo condiciones adecuadas. Por ejemplo, una secuencia de control en un vector que está “unido de forma operable” a una secuencia que codifica una proteína está ligada a ella de manera que la expresión de la secuencia de codificación de la proteína se consigue bajo condiciones compatibles con la actividad transcripcional de las secuencias de control.

El término “célula huésped” significa una célula que se ha transformado, o es capaz de transformarse, con una secuencia de ácido nucleico y de este modo expresa un gen de interés. El término incluye la progenie de la célula parental, sea o no la progenie idéntica en morfología o en constitución genética a la célula parental original, mientras el gen de interés esté presente.

El término “transducción” significa la transferencia de genes de una bacteria a otra, normalmente mediante un bacteriófago. “Transducción” también se refiere a la adquisición y transferencia de secuencias celulares eucariotas mediante retrovirus defectuosos para la replicación.

El término “transfección” significa la absorción de ADN extraño o exógeno por una célula, y una célula se ha “transfectado” cuando el ADN exógeno se ha introducido dentro de la membrana celular. Un número de técnicas de transfección se conocen bien en la técnica y se describen en la presente memoria. Véase, p.ej., Graham et al., 1973, Virology 52:456; Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, supra; Davis et al., 1986, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier; Chu et al., 1981, Gene 13:197. Dichas técnicas pueden usarse para introducir uno o más restos de ADN exógeno en células huésped adecuadas.

El término “transformación” se refiere a un cambio en las características genéticas de una célula, y una célula se ha transformado cuando se ha modificado para contener nuevo ADN o ARN. Por ejemplo, una célula se transforma cuando se modifica genéticamente desde su estado nativo introduciendo nuevo material genético por medio de transfección, transducción u otras técnicas. Después de la transfección o transducción, el ADN de transformación puede recombinarse con el de la célula integrándose físicamente en un cromosoma de la célula, o puede mantenerse de forma transitoria como un elemento episomal sin replicarse, o puede replicarse independientemente como un plásmido. Una célula se considera que se ha “transformado de forma estable” cuando el ADN de transformación se replica con la división de la célula.

Los términos “polipéptido” o “proteína” se usan de forma intercambiable en la presente memoria para referirse a un polímero de residuos de aminoácido. Los términos también se aplican a polímeros de aminoácidos en que uno o más residuos de aminoácido es un análogo o mimético de un aminoácido que se da de forma natural correspondiente, además de polímeros de aminoácidos que se dan de forma natural. Los términos pueden además incluir polímeros de aminoácido que se han modificado, p.ej., mediante la adición de residuos de carbohidrato para formar glucoproteínas, o fosforilado. Los polipéptidos y proteínas pueden producirse mediante una célula que se da de forma natural y no recombinante; o se produce mediante una célula diseñada genéticamente o recombinante, y comprenden moléculas que tienen la secuencia de aminoácidos de la proteína nativa, o moléculas que tienen supresiones de, adiciones a, y/o sustituciones de uno o más aminoácidos de la secuencia nativa. Los términos “polipéptido” y “proteína” específicamente incluyen anticuerpos, p.ej., anticuerpos anti-PAC1 (conocidos como anticuerpos PAC1), proteínas de unión a PAC1, anticuerpos o secuencias que tienen supresiones de, adiciones a, y/o sustituciones de uno o más aminoácidos de una proteína de unión al antígeno. El término “fragmento de polipéptido” se refiere a un polipéptido que tiene una supresión amino-terminal, una supresión carboxilo-terminal, y/o una supresión interna en comparación con la proteína de longitud completa. Dichos fragmentos pueden contener también aminoácidos modificados en comparación con la proteína de longitud completa. En ciertas realizaciones, los fragmentos son aproximadamente de cinco a 500 aminoácidos de largo. Por ejemplo, los fragmentos pueden ser de al menos 5, 6, 8, 10, 14, 20, 50, 70, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400 o 450 aminoácidos de largo. Los fragmentos de polipéptido útiles incluyen fragmentos inmunológicamente funcionales de anticuerpos, que incluyen dominios de unión. En el caso de un anticuerpo de unión a PAC1, los fragmentos útiles incluyen aunque no están limitados a una región CDR, un dominio variable de una cadena pesada o ligera, una parte de una cadena de anticuerpo o solo su dominio variable que incluye dos CDR, y similares.

El término “proteína aislada” (p.ej., anticuerpo aislado), “polipéptido aislado” o “anticuerpo aislado” significa que una proteína, polipéptido o anticuerpo de estudio está libre de la mayoría de las demás proteínas con que normalmente se encontrarían y se ha separado de al menos aproximadamente el 50 por ciento de los polinucleótidos, lípidos, carbohidratos u otros materiales con los que se asocia en la naturaleza. Típicamente, una “proteína aislada”, “polipéptido aislado” o “anticuerpo aislado” constituye al menos aproximadamente 5%, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 25%, o al menos aproximadamente 50% de una muestra dada. ADN genómico, ADNc, ARNm u otro ARN, de origen sintético, o cualquier combinación de los mismos pueden codificar dicha proteína aislada. Preferiblemente, el polipéptido o anticuerpo de proteína aislado está sustancialmente libre de otras proteínas u oros polipéptidos u otros contaminantes que se encuentran en su medio natural que interferirían con su uso terapéutico, diagnóstico, profiláctico, de investigación u otro uso.

Los términos “PAC1 humano”, “PAC¹ humano”, “hPAC1” y “hPACr, “receptor de PAC1 humano”, “receptor de PAC¹ humano”, “receptor de hPAC1 ” y “receptor de hPACr se usan de forma intercambiable y se refieren al receptor tipo I de polipéptido que activa la adenilato ciclasa de la pituitaria humana. hPAC1 es una proteína de 468 aminoácidos designada como P41586 (PACR_HUMAN) en la base de datos UniProtKB/Swiss-Prot y está codificada por el gen ADCYAP1R1. PACAP-27 y PACAP-38 son los principales agonistas endógenos de PAC1. A menos que se especifique otra cosa o esté claro a partir del contexto en que se usa el término, “PAC1 ” se refiere a hPAC1 humano.

Una “variante” de un polipéptido (p.ej., una proteína de unión al antígeno, o un anticuerpo) comprende una secuencia de aminoácidos en la que uno o más residuos de aminoácido se insertan en, se suprimen de y/o se sustituyen en la secuencia de aminoácidos respecto a otra secuencia de polipéptidos. Las variantes incluyen proteínas de fusión.

Un “derivado” de un polipéptido es un polipéptido (p.ej., una proteína de unión al antígeno, o un anticuerpo) que se ha modificado químicamente de alguna manera distinta de variantes de inserción, supresión o sustitución, p.ej., por medio de conjugación a otro resto químico.

El término “que se da de forma natural” como se usa a lo largo de la memoria en conexión con los materiales biológicos tales como polipéptidos, ácidos nucleicos, células huésped y similares, se refiere a materiales que se encuentran en la naturaleza.

Un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo se dice que “se une específicamente a” su diana cuando la constante de disociación (K^d) es <10-6 M. El anticuerpo se une específicamente al antígeno diana con “alta afinidad” cuando la K^d es <1x10-8 M. En un aspecto, los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos se unirán a PAC1, o PAC1 humano con una K^d <5x10-7; en otro aspecto los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos se unirán con una K^d <1x10-7; en otro aspecto los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos se unirán con una K^d <5x10-8; en otro aspecto los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos se unirán con una K^d <1x10-8; en otro aspecto los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos se unirán con una K^d <5x10-9; en otro aspecto los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos se unirán con una K^d <1x10-9; en otro aspecto los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos se unirán con una K^d <5x10-10; en otro aspecto los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos se unirán con una K^d <1x10-10.

Un anticuerpo, fragmento de unión al antígeno del mismo o proteína de unión al antígeno “inhibe de forma selectiva” un receptor específico respecto a otros receptores cuando la CI50 del anticuerpo, fragmento de unión al antígeno del mismo o proteína de unión al antígeno en un ensayo de inhibición del receptor específico es al menos 50 veces menor que la CI50 en un ensayo de inhibición de otro receptor de “referencia”, p.ej., un receptor de hVPAC1 o hVPAC2. La “relación de selectividad” es la CI50 del receptor de referencia dividido por CI50 del receptor específico. Por ejemplo, si hPAC1 es el receptor específico y hVPAC1 es el receptor de referencia, y la CI50 de un anticuerpo anti-PAC1 particular descrito en la presente memoria frente a hPAC1 es 10 nm y frente a hVPAC1 es 10 pm, ese anticuerpo particular puede caracterizarse como que tiene una relación de selectividad de 1000:1 para hPAC1 respecto a hVPAC1. CI50 es la dosis/concentración necesaria para alcanzar el 50% de la inhibición (de una función biológica o bioquímica). Con ligandos radioactivos, CI50 es la concentración de un ligando competitivo que desplaza el 50% de la unión específica del radioligando. CE50 es la concentración o dosis necesaria para inducir una respuesta del 50% de la respuesta máxima.

Los datos Ki se generan típicamente en el contexto de experimentos de unión por competición, que se hacen típicamente uniendo un isótopo radioactivo (p.ej., un ¹²⁵I) a un “agonista”. Los experimentos miden la unión del agonista en concentraciones crecientes de un “antagonista”. Ki se refiere a la concentración del “antagonista” o compuesto de prueba, p.ej., un anticuerpo anti-PAC1 de prueba, que ocuparía el 50% de los receptores si no hubiera radioligando presente. Ki puede calcularse usando la ecuación Ki=CI50/(1+[L]/Kd)), donde [L] es la concentración del radioligando usado (p.ej., un anticuerpo PAC-1 marcado con ¹²⁵I) y Kd es la constante de disociación del radioligando. Véase, p.ej., Keen M, MacDermot J (1993) Analysis of receptors by radioligand binding. En: Wharton J, Polak JM (eds) Receptor autoradiography, principles and practice. Oxford University Press. Oxford.

“Región de unión al antígeno” significa una proteína, o una parte de una proteína, que se une específicamente a un antígeno específico. Por ejemplo, esa parte de un anticuerpo que contiene los residuos de aminoácidos que interactúan con un antígeno y otorga al anticuerpo su especificidad y afinidad por el antígeno se denomina como “región de unión al antígeno”. Una región de unión al antígeno típicamente incluye una o más “regiones de unión complementarias” (“CDR”). Ciertas regiones de unión al antígeno también incluyen una o más regiones “estructurales”. Una “CDR” es una secuencia de aminoácidos que contribuye a la especificidad de unión al antígeno y a la afinidad. Las regiones “estructurales” pueden ayudar en el mantenimiento de la conformación apropiada de las CDR para promover la unión entre la región de unión al antígeno y un antígeno.

En ciertos aspectos, los anticuerpos recombinantes o fragmentos de unión al antígeno de los mismos que se unen a la proteína PAC1, o PAC1 humana, se describen en la presente memoria. En este contexto, una “proteína recombinante” es una proteína hecha usando técnicas recombinantes, es decir, a través de la expresión de un ácido nucleico recombinante como se describe en la presente memoria. Los métodos y técnicas para la producción de proteínas recombinantes se conocen bien en la técnica.

El término “anticuerpo” se refiere a una inmunoglobulina intacta de cualquier isotipo, o un fragmento de unión al antígeno de la misma que puede competir con el anticuerpo intacto para la unión específica al antígeno diana, e incluye, por ejemplo, anticuerpos quiméricos, humanizados, completamente humanos y biespecíficos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos. Un “anticuerpo” como tal es una especie de una proteína de unión al antígeno. Un anticuerpo intacto generalmente comprenderá al menos dos cadenas pesadas de longitud completa y dos cadenas ligeras de longitud completa, pero en algunos ejemplos pueden incluir menos cadenas tal como los anticuerpos que se dan de forma natural en los camélidos que pueden comprender solo cadenas pesadas. Los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos pueden derivarse únicamente de una única fuente, o pueden ser “quiméricos”, es decir, diferentes partes del anticuerpo pueden derivarse de dos anticuerpos diferentes como se describe adicionalmente a continuación. Los anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos pueden producirse en hibridomas, mediante técnicas de ADN recombinante, o mediante escisión enzimática o química de los anticuerpos intactos. A menos que se indique otra cosa, el término “anticuerpo” incluye, además de anticuerpos que comprenden dos cadenas pesadas de longitud completa y dos cadenas ligeras de longitud completa, derivados, variantes, fragmentos y mutaciones de los mismos, cuyos ejemplos se describen a continuación.

El término “cadena ligera” incluye una cadena ligera de longitud completa y fragmentos de la misma que tengan suficiente secuencia de región variable para conferir especificidad de unión. Una cadena ligera de longitud completa incluye un dominio de región variable, V^l, y un dominio de región constante, C^l. El dominio de región variable de la cadena ligera está en el extremo amino del polipéptido. Las cadenas ligeras incluyen cadenas kappa y cadenas lambda.

El término “cadena pesada” incluye una cadena pesada de longitud completa y fragmentos de la misma que tienen suficiente secuencia de región variable para conferir especificidad de unión. Una cadena pesada de longitud completa incluye un dominio de región variable, V^h, y tres dominios de región constante, C^h1, C^h2 y C^h3. El domino VH está en el extremo amino del polipéptido, y los dominios CH están en el extremo carboxilo, siendo el CH3 el más cercano al extremo carboxi del polipéptido. Las cadenas pesadas pueden ser de cualquier isotipo, incluyendo IgG (que incluye los subtipos IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4), IgA (que incluye los subtipos IgA1 e IgA2), IgM e IgE. En una realización, la cadena pesada es una IgG1 aglucosilada, p.ej., una Hc de IgG1 con una mutación N297G.

El término “secuencia señal”, “secuencia líder” o “péptido señal” se refiere a una cadena peptídica corta (3-60 aminoácidos de larga) que dirige el transporte de una proteína. Los péptidos señal también pueden denominarse señales de direccionamiento, secuencias señal, péptidos de tránsito, o señales de localización. Algunos péptidos señal se escinden de la proteína mediante peptidasa de señal después de transportarse las proteínas, de manera que la forma biológicamente activa de la proteína (p.ej., un anticuerpo como se describe en la presente memoria) es la forma más corta, escindida. Por consiguiente, los términos tales como “anticuerpo que comprende una cadena pesada...”, “anticuerpo que comprende una cadena ligera...”, etc., donde el anticuerpo se caracteriza por tener una cadena pesada y/o ligera con una secuencia identificada particular, se entiende que incluyen anticuerpos que tienen las secuencias identificadas específicas, anticuerpos que tienen las secuencias identificadas específicas excepto que las secuencias señal están sustituidas por diferentes secuencias señal, además de anticuerpos que tienen las secuencias identificadas, menos cualquier secuencia señal.

El término “fragmento de unión al antígeno” (o simplemente “fragmento”) de un anticuerpo o cadena de inmunoglobulina (cadena pesada o ligera), como se usa en la presente memoria, comprende una parte (independientemente de cómo se obtiene o sintetiza esa parte) de un anticuerpo que carece de al menos algunos de los aminoácidos presentes en una cadena de longitud completa pero que es capaz de unirse específicamente a un antígeno. Dichos fragmentos son biológicamente activos en que se unen específicamente al antígeno diana y pueden competir con otros anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, por unión específica a un epítopo dado. En un aspecto, dicho fragmento retendrá al menos una CDR presente en la cadena ligera o pesada de longitud completa, y en algunos aspectos comprenderá una única cadena pesada y/o cadena ligera o parte de las mismas. Estos fragmentos biológicamente activos pueden producirse mediante técnicas de ADN recombinante, o pueden producirse, p.ej., mediante escisión enzimática o química de anticuerpos intactos. Los fragmentos de inmunoglobulina inmunológicamente funcionales incluyen, aunque no están limitados a Fab, Fab’, F(ab’)², Fv, anticuerpos de dominio y anticuerpos monocatenarios, y pueden estar derivados de cualquier fuente de mamífero, incluyendo aunque no limitándose a humano, ratón, rata, camélido o conejo. Se contempla además que una parte funcional de los anticuerpos descritos en la presente memoria, por ejemplo, una o más CDR, podrían unirse de forma covalente a una segunda proteína o a una pequeña molécula para crear un agente terapéutico dirigido a una diana particular en el cuerpo, poseyendo propiedades terapéuticas bifuncionales, o teniendo una prolongada vida media en suero.

Un “fragmento Fab” está comprendido por una cadena ligera y las regiones C^h1 y variable de una cadena pesada. La cadena pesada de una molécula Fab no puede formar un enlace disulfuro con otra molécula de cadena pesada. Una región “Fc” contiene dos fragmentos de cadena pesada que comprenden los dominios C^h1 y C^h2 de un anticuerpo. Los dos fragmentos de cadena pesada se mantienen juntos mediante dos o más enlaces disulfuro y mediante interacciones hidrófobas de los dominios C^h3.

Un “fragmento Fab’” contiene una cadena ligera y una parte de una cadena pesada que contiene el dominio V^h y el dominio C^h1 y también la región entre los dominios C^h1 y C^h2, de manera que el enlace disulfuro entre cadenas puede formarse entre las dos cadenas pesadas de los dos fragmentos Fab’ para formar una molécula F(ab’)².

Un “fragmento F(ab’)²” contiene dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas que contienen una parte de la región constante entre los dominios C^h1 y C^h2, de manera que se forma un enlace disulfuro entre cadenas entre las dos cadenas pesadas. Un fragmento F(ab^’)2 está compuesto por consiguiente de dos fragmentos Fab’ que se mantienen juntos mediante un enlace disulfuro entre las dos cadenas pesadas.

La “región Fv” comprende las regiones variables de las cadenas tanto pesada como ligera, pero carece de las regiones constantes.

“Anticuerpos monocatenarios” son moléculas Fv en que las regiones variables de la cadena pesada y ligera se han conectado mediante un conector flexible para formar una única cadena polipeptídica, que forma una región de unión al antígeno. Los anticuerpos monocatenarios se tratan en detalle en la Publicación de Solicitud de Patente Internacional núm. WO 88/01649 y las Patentes de Estados Unidos núm. 4.946.778 y núm. 5.260.203.

Un “anticuerpo de dominio” es un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional que contiene solo la región variable de una cadena pesada o la región variable de una cadena ligera. En algunos ejemplos, dos o más regiones V^h se unen de forma covalente con un conector peptídico para crear un anticuerpo de dominio bivalente. Las dos regiones V^h de un anticuerpo de dominio bivalente pueden dirigirse al mismo o diferentes antígenos.

Una “proteína de unión al antígeno bivalente” o “anticuerpo bivalente” comprende dos sitios de unión al antígeno. En algunos ejemplos, los dos sitios de unión tienen las mismas especificidades de antígeno. Los anticuerpos bivalentes pueden ser biespecíficos, véase, infra.

Una “proteína de unión al antígeno multiespecífica” o “anticuerpo multiespecífico” es uno que se dirige a más de un antígeno o epítopo.

Una proteína de unión al antígeno o anticuerpo “biespecífico”, “específico dual” o “bifuncional” es una proteína de unión al antígeno o anticuerpo híbrido, respectivamente, que tiene dos diferentes sitios de unión al antígeno diferentes. Los anticuerpos biespecíficos son una especie de proteína de unión al antígeno multiespecífica o anticuerpo multiespecífico y pueden producirse mediante una variedad de métodos que incluyen, aunque no están limitados a, fusión de hibridomas o unión de fragmentos Fab’. Véase, p.ej., Songsivilai y Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321; Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553. Los dos sitios de unión de una proteína de unión al antígeno o anticuerpo biespecíficos se unirán a diferentes epítopos, que pueden estar en las mismas o diferentes dianas de proteína.

El término “proteína de unión al antígeno de neutralización” o “anticuerpo de neutralización” se refiere a una proteína de unión al antígeno o anticuerpo, respectivamente, que se une a un ligando, evita la unión del ligando a su compañero de unión e interrumpe la respuesta biológica que resultaría de otra forma de la unión del ligando a su compañero de unión. En la evaluación de la unión y especificidad de una proteína de unión al antígeno, p.ej., un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno inmunológicamente funcional del mismo, un anticuerpo o fragmento inhibirán sustancialmente la unión de un ligando a su compañero de unión cuando un exceso de anticuerpo reduce la cantidad de compañero de unión unido al ligando en al menos aproximadamente 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99% o más (como se mide en un ensayo de unión competitiva in vitro). En el caso de una proteína de unión a PAC1, dicha molécula de neutralización disminuirá la capacidad de PAC1 para unirse a PACAP, p.ej., PACAP-27 o PACAP-38.

El término “antígeno” o “inmunógeno” se refiere a una molécula o una parte de una molécula capaz de unirse mediante un agente de unión selectivo, tal como una proteína de unión al antígeno (que incluye, p.ej., un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno inmunológicamente funcional del mismo), y adicionalmente capaz de usarse en un animal para producir anticuerpos capaces de unirse a ese antígeno. Un antígeno puede poseer uno o más epítopos que son capaces de interactuar con diferentes anticuerpos o fragmentos de los mismos.

El término “epítopo” es la parte de una molécula que está unida por una proteína de unión al antígeno (por ejemplo, un anticuerpo). El término incluye cualquier determinante capaz de unirse específicamente a una proteína de unión al antígeno, tal como un anticuerpo o a un receptor de célula T. Un epítopo puede estar contiguo o no contiguo (p.ej., residuos de aminoácido que no son contiguos los unos a los otros en la secuencia polipeptídica pero que en el contexto de la molécula están unidos por la proteína de unión al antígeno). En ciertos aspectos, los epítopos pueden ser miméticos en que comprenden una estructura tridimensional que es similar a un epítopo usado para generar el anticuerpo, incluso comprenden ninguno o solo algunos de los residuos de aminoácido encontrados en ese epítopo usado para generar el anticuerpo. Lo más habitual, los epítopos se encuentran en proteínas, pero en algunos ejemplos pueden encontrarse en otras clases de moléculas, tal como ácidos nucleicos. Los determinantes de epítopo pueden incluir agrupaciones de superficie químicamente activa de moléculas tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcares, grupos fosforilo o sulfonilo, y pueden tener características estructurales tridimensionales específicas, y/o características de carga específicas. Generalmente, los anticuerpos específicos para un antígeno diana particular reconocerán preferentemente un epítopo en el antígeno diana en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas.

El término “identidad” se refiere a una relación entre las secuencias de dos o más moléculas polipeptídicas o dos o más moléculas de ácido nucleico, como se determina alineando y comparando las secuencias. “Porcentaje de identidad” significa el porcentaje de residuos idénticos entre los aminoácidos o nucleótidos en las moléculas comparadas y se calcula en base al tamaño de la menor de las moléculas que se comparan. Para estos cálculos, los huecos en los alineamientos (si los hay) deben estar dirigidos por un modelo matemático o programa informático particular (es decir, un “algoritmo”). Los métodos que pueden usarse para calcular la identidad de los ácidos nucleicos o polipéptidos alineados incluyen los descritos en Computational Molecular Biology, (Lesk, A. M., ed.), 1988, Nueva York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D. W., ed.), 1993, Nueva York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., y Griffin, H. G., eds.) 1994, Nueva Jersey: Humana Press; von Heinje, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, Nueva York: Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. y Devereux, J., eds.), 1991, Nueva York: M. Stockton Press; y Carillo et al., 1988, SIAM J. Applied Math. 48:1073.

En el cálculo del porcentaje de identidad, las secuencias que se comparan se alinean de una forma que da la mayor coincidencia entre las secuencias. El programa informático usado para determinar el porcentaje de identidad es el paquete de programas GCG, que incluye GAP (Devereux et al., 1984, Nucl. Acid Res. 12:387; Genetics Computer Group, Universidad de Wisconsin, Madison, WI). El algoritmo informático GAP se usa para alinear los dos polipéptidos o polinucleótidos para los que se va a determinar el porcentaje de identidad de secuencia. Las secuencias se alinean para la coincidencia óptima de sus respectivos aminoácidos o nucleótidos (el “rango de coincidencia”, como se determina por el algoritmo). Una penalización por apertura de hueco (que se calcula como 3x la diagonal promedio, en la que la “diagonal promedio” es el promedio de la diagonal de la matriz de comparación que se usa; la “diagonal” es el valor o número asignado a cada coincidencia perfecta de aminoácido mediante la matriz de comparación particular) y una penalización por extensión del hueco (que es normalmente 1/10 veces la penalización de apertura de hueco), además de una matriz de comparación tal como PAM 250 o BLOSUM 62 se usan en conjunto con el algoritmo. En ciertos aspectos, una matriz de comparación estándar (véase, Dayhoff et al., 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352 para la matriz de comparación PAM 250; Henikoff et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10915-10919 para la matriz de comparación BLOSUM 62) se usa también mediante el algoritmo.

Los parámetros recomendados para determinar el porcentaje de identidad para polipéptidos o secuencias de nucleótidos que usan el programa GAP son los siguientes:

Algoritmo: Needleman et al., 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453;

Matriz de comparación: BLOSUM 62 de Henikoff et al., 1992, supra;

Penalización de hueco: 12 (aunque sin penalización para los huecos finales)

Penalización de longitud de hueco: 4

Umbral de similitud: 0

Ciertos esquemas de alineamiento para alinear dos secuencias de aminoácidos pueden dar por resultado la coincidencia de solo una corta región de las dos secuencias, y esta pequeña región alineada puede tener identidad de secuencia muy alta incluso aunque no haya una relación significativa entre las dos secuencias de longitud completa. Por consiguiente, el método de alineamiento seleccionado (programa GAP) puede ajustarse si así se desea para dar por resultado un alineamiento que se extiende al menos 50 aminoácidos contiguos del polipéptido diana.

Como se usa en la presente memoria, “sustancialmente puro” significa que la especie descrita de la molécula es la especie predominante presente, es decir, en una base molar es más abundante que cualquier otra especie individual en la misma mezcla. En ciertos aspectos, una molécula sustancialmente pura es una composición en la que la especie objeto comprende al menos el 50% (en una base molar) de toda la especie macromolecular presente. En otros aspectos, una composición sustancialmente pura comprenderá al menos 80%, 85%, 90%, 95% o 99% de toda la especie macromolecular presente en la composición. En otros aspectos, la especie objeto se purifica a la homogeneidad esencial en la que la especie contaminante no puede detectarse en la composición por métodos de detección convencionales y por consiguiente la composición consiste en una única especie macromolecular detectable.

El término “que trata” se refiere a cualquier indicio de éxito en el tratamiento o mejora de una lesión, patología o condición, que incluye cualquier parámetro objetivo o subjetivo tal como alivio; remisión; disminución de síntomas o formación de la lesión, patología o condición más tolerable al paciente; ralentización en la velocidad de degeneración o empeoramiento; hacer el punto final de degeneración menos debilitante; mejora del bienestar físico o mental del paciente. El tratamiento o mejora de síntomas puede basarse en parámetros objetivos o subjetivos; incluyendo los resultados de un examen físico, exámenes neuropsiquiátricos, y/o una evaluación psiquiátrica. Por ejemplo, ciertos métodos presentados en la presente memoria tratan con éxito las cefaleas por migraña o bien de forma profiláctica o como un tratamiento agudo, disminuyendo la frecuencia de cefaleas por migraña, disminuyendo la gravedad de cefaleas por migraña, y/o mejorando un síntoma asociado con las cefaleas por migraña.

Una “cantidad efectiva” es generalmente una cantidad suficiente para reducir la gravedad y/o frecuencia de los síntomas, eliminar los síntomas y/o causa subyacente, evitar la ocurrencia de síntomas y/o su causa subyacente, y/o mejorar o remediar el daño que resulta de o está asociado con la cefalea por migraña. En algunas realizaciones, la cantidad efectiva es una cantidad terapéuticamente efectiva o una cantidad profilácticamente efectiva. Una “cantidad terapéuticamente efectiva” es una cantidad suficiente para remediar un estado de enfermedad (p.ej. cefalea por migraña) o síntomas, particularmente un estado o síntomas asociados con el estado de enfermedad, o de otra forma evitar, dificultar, retardar o revertir la progresión del estado de enfermedad o cualquier otro síntoma indeseable asociado con la enfermedad en cualquier forma que sea. Una “cantidad profilácticamente efectiva” es una cantidad de una composición farmacéutica que, cuando se administra a un sujeto, tendrá el efecto profiláctico previsto, p.ej., evitar o retrasar el comienzo (o nueva ocurrencia) de la cefalea por migraña o síntomas de cefalea por migraña. El efecto terapéutico o profiláctico completo no se da necesariamente mediante la administración de una dosis, y puede darse solo después de la administración de una serie de dosis. Por consiguiente, una cantidad terapéuticamente o profilácticamente efectiva puede administrarse en una o más administraciones.

“Aminoácido” incluye su significado normal en la técnica. Los veinte aminoácidos que se dan de forma natural y sus abreviaturas siguen el uso convencional. Véase, Immunology-A Synthesis, 2a edición, (E. S. Golub y D. R. Green, eds.), Sinauer Associates: Sunderland, Mass. (1991). Los estereoisómeros (p.ej., D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos convencionales, aminoácidos no naturales tales como aminoácidos a-,a-disustituidos, N-alquilaminoácidos, y otros aminoácidos no convencionales pueden ser también componentes adecuados para polipéptidos y se incluyen en la frase “aminoácido”. Ejemplos de aminoácidos no convencionales incluyen: 4-hidroxiprolina, Y-carboxiglutamato, £-N,N,N-trimetil-lisina, e-N-acetil-lisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, o-N-metilarginina, y otros aminoácidos similares e iminoácidos (p.ej., 4-hidroxiprolina). En la notación de polipéptido usada en la presente memoria, la dirección a la izquierda es la dirección amino-terminal y la dirección a la derecha es la dirección carboxilo-terminal, de acuerdo con el uso estándar y la convención.

PAC1 en la enfermedad

Los neuropéptidos presentes en el espacio perivascular de los vasos craneales se han implicado como importantes mediadores de entrada nociceptiva durante los ataques de migraña. El polipéptido que activa la adenilato ciclasa de la pituitaria (PACAP) está presente en neuronas trigeminales sensoriales y puede modular la nocicepción a diferentes niveles del sistema nervioso. Estudios experimentales humanos han mostrado que PACAP38 induce los ataques tanto de cefalea como de tipo migraña (Schytz, et al., 2009, “PACAP38 induces migraine-like attacks in patients with migraine without aura”, Brain:132 págs. 16-25), soportando la idea de que los antagonistas del receptor de PAC1 pueden usarse en el tratamiento profiláctico y/o agudo de la migraña.

Anticuerpos

Los anticuerpos que se unen a la proteína PACI, incluyendo la proteína PACI humana (hPACI) se describen en la presente memoria. Los anticuerpos son polipéptidos en que una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDR), como se describen en la presente memoria, están integradas y/o unidas. En algunos anticuerpos, las CDR están integradas en una región “estructural”, que orienta la(s) CDR(s) de manera que se alcanza(n) las propiedades de unión al antígeno apropiadas de la(s) CDR(s). En general, los anticuerpos que se describen en la presente memoria pueden interferir con, bloquear, reducir o modular la interacción entre PAC1 y su(s) ligando(s), p.ej., PACAP, tal como PACAP-38.

Los anticuerpos incluyen, aunque no están limitados a, anticuerpos monoclonales, anticuerpos biespecíficos, minicuerpos, anticuerpos de dominio, anticuerpos sintéticos (a veces denominados en la presente memoria como “miméticos de anticuerpo”), anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, fusiones de anticuerpo (a menudo denominados en la presente memoria como “conjugados de anticuerpo”), y fragmentos de los mismos. Las diversas estructuras se describen adicionalmente en la presente memoria a continuación.

Los anticuerpos descritos en la presente memoria se ha demostrado que se unen a PAC1, en particular PAC1 humano y PAC1 cino. Como se describe adicionalmente en los ejemplos posteriores, se probó y se encontró que ciertos anticuerpos se unen a epítopos diferentes de los unidos por un número de otros anticuerpos dirigidos contra uno o el otro de los componentes de PAC1. Los anticuerpos que se describen en la presente memoria evitan que PACAP (p.ej., PACAP-38) se una a su receptor. Como consecuencia, los anticuerpos descritos en la presente memoria son capaces de inhibir la actividad de PAC1. En particular, los anticuerpos que se unen a estos epítopos pueden tener una o más de las siguientes actividades: inhibir, entre otros, la inducción de las rutas de transducción de la señal PAC1, inhibir la vasodilatación, provocar la vasoconstricción, disminuir la inflamación, p.ej., inflamación neurogénica, y otros efectos fisiológicos inducidos por PAC1 tras la unión a PACAP.

Los anticuerpos que se describen en la presente memoria tienen una variedad de utilidades. Algunos de los anticuerpos, por ejemplo, son útiles en ensayos de unión específicos, purificación por afinidad de PAC1, en particular hPAC1 o sus ligandos y en ensayos de cribado para identificar otros antagonistas de la actividad PAC1. Algunos de los anticuerpos son útiles para inhibir la unión de un ligando PAC1 (p.ej., PACAP-38) a PAC1.

Los anticuerpos pueden usarse en una variedad de aplicaciones de tratamiento, como se explica en la presente memoria. Por ejemplo, ciertos anticuerpos PAC1 son útiles para tratar condiciones asociadas con la señalización mediada por PAC1, tal como reducir, aliviar, o tratar la frecuencia y/o gravedad de la cefalea por migraña, reducir, aliviar o tratar la cefalea en racimos, reducir, aliviar o tratar el dolor crónico, aliviar o tratar la diabetes mellitus (tipo II), reducir, aliviar o tratar trastornos cardiovasculares, y reducir, aliviar o tratar desequilibrios hemodinámicos asociados con endotoxemia y sepsis en un paciente. Otros usos para los anticuerpos incluyen, por ejemplo, el diagnóstico de enfermedades o condiciones asociadas con PAC1 y ensayos de cribado para determinar la presencia o ausencia de PAC1. Algunos de los anticuerpos descritos en la presente memoria son útiles en el tratamiento de las consecuencias, síntomas, y/o la patología asociada con la actividad de PAC1. Estas incluyen, aunque no están limitadas a, varios tipos de cefaleas, que incluyen la migraña (p.ej., migraña crónica y/o episódica).

Algunos de los anticuerpos que se describen en la presente memoria tienen la estructura típicamente asociada con los anticuerpos que se dan de forma natural. Las unidades estructurales de estos anticuerpos típicamente comprenden uno o más tetrámeros, cada uno compuesto de dos dupletes idénticos de cadenas polipeptídicas, aunque algunas especies de mamíferos también producen anticuerpos que tienen solo una única cadena pesada. En un anticuerpo típico, cada par o duplete incluye una cadena “ligera” de longitud completa (en ciertas realizaciones, aproximadamente 25 kDa) y una cadena “pesada” de longitud completa (en ciertas realizaciones, aproximadamente 50-70 kDa). Cada cadena de inmunoglobulina individual está compuesta de varios “dominios de inmunoglobulina”, consistiendo cada uno en aproximadamente 90 a 110 aminoácidos y expresando un patrón de plegado característico. Estos dominios son las unidades básicas de las que están compuestos los polipéptidos de anticuerpo. La parte amino-terminal de cada cadena incluye típicamente un dominio variable que es responsable del reconocimiento del antígeno. La parte carboxi-terminal está más conservada de forma evolutiva que el otro extremo de la cadena y se denomina como la “región constante” o “región C”. Las cadenas ligeras humanas generalmente se clasifican como cadenas ligeras kappa y lambda, y cada una de estas contiene un dominio de variable y un dominio constante. Las cadenas pesadas se clasifican típicamente como cadenas mu, delta, gamma, alfa o épsilon, y estas definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. La IgG tiene varios subtipos, que incluyen, aunque no están limitados a, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Los subtipos de IgM incluyen IgM e IgM2. Los subtipos IgA incluyen IgA1 e IgA2. En humanos, los isotipos IgA e IgD contienen cuatro cadenas pesadas y cuatro cadenas ligeras; los isotipos IgG e IgE contienen dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras; y el isotipo IgM contiene cinco cadenas pesadas y cinco cadenas ligeras. La región C de la cadena pesada típicamente comprende uno o más dominios que pueden ser responsables de la función efectora. El número de dominios de la región constante de la cadena pesada dependerá del isotipo. Las cadenas pesadas de IgG, por ejemplo, contienen cada una tres dominios de región C conocidos como C^h1, C^h2 y C^h3. Los anticuerpos que se describen en la presente memoria pueden tener cualquiera de estos isotipos y subtipos. En ciertas realizaciones, el anticuerpo PAC1 es del subtipo IgG1, IgG2 o IgG4.

En las cadenas ligera y pesada de longitud completa, las regiones variables y constantes se unen por una región “J” de aproximadamente doce o más aminoácidos, incluyendo además la cadena pesada una región “D” de aproximadamente diez aminoácidos más. Véase, p.ej., Fundamental Immunology, 2a ed., Cap. 7 (Paul, W., ed.) 1989, Nueva York: Raven Press. Las regiones variables de cada par de cadenas ligera/pesada típicamente forman el sitio de unión al antígeno.

Las regiones variables de cadenas de inmunoglobulina generalmente muestran la misma estructura total, que comprenden regiones estructurales (FR) relativamente conservadas unidas por tres regiones hipervariables, más habitualmente denominadas “regiones de determinación de la complementariedad” o CDR. Las CDR de las dos cadenas de cada par de cadena pesada/cadena ligera mencionadas anteriormente típicamente se alinean por las regiones estructurales para formar una estructura que se une específicamente con un epítopo específico en la proteína diana (p.ej., PACI). Desde el extremo N al extremo C, las regiones variables de la cadena ligera y pesada que se dan de forma natural ambas típicamente se forman con el siguiente orden de estos elementos: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. Un sistema de numeración se ha ideado para asignar números a aminoácidos que ocupan posiciones en cada uno de estos dominios. Este sistema de numeración se define en Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (1987 y 1991, NIH, Bethesda, MD), o Chothia y Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342:878-883.

Las diversas regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera descritas en la presente memoria se representan en las Tablas 3A y 3B. Cada una de estas regiones variables puede unirse a las regiones constantes de cadena pesada y ligera anteriores para formar una cadena pesada y ligera del anticuerpo completa, respectivamente. Además, cada una de las secuencias de cadena pesada y ligera así generadas puede combinarse para formar una estructura de anticuerpo completa. Debería entenderse que las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera descritas en la presente invención pueden también unirse a otros dominios constantes que tienen diferentes secuencias de las secuencias ejemplares enumeradas anteriormente.

Los ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos descritos en la presente memoria, o parte de los mismos, también se describen, incluyendo los ácidos nucleicos que codifican una o ambas cadenas de un anticuerpo, o un fragmento, derivado, muteína o variante de los mismos, polinucleótidos que codifican regiones variables de la cadena pesada o solo CDR, polinucleótidos suficientes para usar como sondas de hibridación, cebadores de PCR o cebadores de secuenciación para identificar, analizar, mutar o amplificar un polinucleótido que codifica un polipéptido, ácidos nucleicos anti-sentido para inhibir la expresión de un polinucleótido, y secuencias complementarias de lo precedente. Los ácidos nucleicos pueden ser de cualquier longitud. Pueden ser de, por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 750, 1.000, 1.500 o más nucleótidos de longitud, y/o pueden comprender una o más secuencias adicionales, por ejemplo, secuencias reguladoras y/o ser parte de un ácido nucleico mayor, por ejemplo, un vector. Los ácidos nucleicos pueden ser monocatenarios o bicatenarios y pueden comprender nucleótidos de ARN y/o ADN, y variantes artificiales de los mismos (p.ej., ácidos péptidonucleicos).

Las Tablas 1A y 1B muestran secuencias de ácido nucleico ejemplares. Cualquier región variable descrita en la presente memoria puede unirse a estas regiones constantes para formar secuencias de cadena pesada y ligera completas. Sin embargo, debería entenderse que estas secuencias de regiones constantes se proporcionan solo como ejemplos específicos - un experto en la técnica puede emplear otras regiones constantes, incluyendo la región constante de la cadena pesada de IgG1, regiones constantes de la cadena pesada de IgG3 o IgG4, cualquiera de las siete regiones constantes de la cadena ligera lambda, incluyendo hCL-1, hCL-2, hCL-3 y hCL-7; regiones constantes que se han modificado para estabilidad, expresión, capacidad de fabricación mejoradas u otras características deseadas, y similares. En algunas realizaciones, las secuencias de región variable se unen a otras secuencias de la región constante que se conocen en la técnica.

Ejemplos específicos de cadenas ligeras y pesadas de longitud completa de los anticuerpos que se describen y sus correspondientes secuencias nucleicas y de aminoácidos se resumen en las Tablas 1A, 1B, 2A, y 2B. Las Tablas 1A y 2A muestran secuencias de cadena ligera ejemplares, y las Tablas 1B y 2B muestran secuencias de cadena pesada ejemplares, que se muestran sin las respectivas secuencias señal.

Tabla 1A - Secuencias de ácido nucleico de la cadena ligera del anticuerpo anti-hPACI ejemplares

Tabla 1B - Secuencias de ácido nucleico de cadena pesada del anticuerpo anti-hPACI ejemplares

Tabla 2A - Secuencias de aminoácidos de la cadena ligera del anticuerpo anti-hPACI ejemplares

Tabla 2B - Secuencias de aminoácidos de la cadena pesada del anticuerpo anti-hPACI ejemplares

Dominios variables de los anticuerpos

También se describen anticuerpos (y las secuencias de ácido nucleico correspondientes) que contienen una región variable de la cadena ligera del anticuerpo o una región variable de la cadena pesada del anticuerpo, como se muestra en las Tablas 3A y 3B posteriores, y fragmentos inmunológicamente funcionales, derivados, muteínas y variantes de estas regiones variables de la cadena ligera y la cadena pesada.

También se incluyen secuencias de ácido nucleico que codifican las regiones variables mostradas en las Tablas 3A y 3B. Debido a que esas secuencias están contenidas en las secuencias de ácido nucleico de longitud completa de los correspondientes anticuerpos mostrados en las Tablas 1A y 1B, no se seleccionan como secuencias separadas en una tabla o en el listado de secuencias, pero pueden determinarse fácilmente por un experto en la técnica en base a las regiones variables proporcionadas en las Tablas 3A y 3B, junto con las secuencias de ADN de longitud completa en las Tablas 1A y 1B.

Los anticuerpos de este tipo pueden designarse generalmente por la fórmula “VHX/Vi_y”, donde “x” corresponde al número de regiones variables de la cadena pesada e “y” corresponde al número de regiones variables de la cadena ligera.

Tabla 3A - Secuencias de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo anti-hPACI ejemplares

Tabla 3B - Secuencias de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo anti-hPACI ejemplares

Cada una de las regiones variables de la cadena pesada enumeradas en la Tabla 3B puede combinarse con cualquiera de las regiones variables de la cadena ligera mostradas en la Tabla 3A para formar un anticuerpo.

CDR

Los anticuerpos descritos en la presente memoria son polipéptidos en que una o más CDR se injertan, insertan y/o unen. Un anticuerpo puede tener 1, 2, 3, 4, 5 o 6 CDR. Un anticuerpo por consiguiente puede tener, por ejemplo, una CDR1 de cadena pesada (“CDRH1”), y/o una CDR2 de cadena pesada (“CDRH2”), y/o una CDR3 de cadena pesada (“CDRH3”), y/o una CDR1 de cadena ligera (“CDRL1”), y/o una CDR2 de cadena ligera (“CDRL2”), y/o una CDR3 de cadena ligera (“CDRL3”). Algunos anticuerpos incluyen tanto una CDRH3 como una CDRL3. Las CDR de cadena pesada y ligera específicas se identifican en las Tablas 3A y 3B, respectivamente.

Las regiones de determinación de la complementariedad (CDR) y regiones estructurales (FR) de un anticuerpo dado pueden identificarse usando el sistema descrito por Kabat et al. en Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed., Depto. de EE.UU. de salud y servicios sociales, PHS, NIH, publicación de NIH núm. 91-3242, 1991. Ciertos anticuerpos que se describen en la presente memoria comprenden una o más secuencias de aminoácidos que son idénticas o tienen identidad de secuencia sustancial a las secuencias de aminoácidos de una o más de las CDR presentadas en la Tabla 4A (CDRL) y la Tabla 4B (CDRH).

Tabla 4A - Secuencias de aminoácidos de CDR de la cadena ligera del anticuerpo anti-hPAC1 ejemplares

Tabla 4B - Secuencias de aminoácidos de CDR de la cadena pesada del anticuerpo anti-hPACI ejemplares

Tabla 5A - Organización de la secuencia de LC del anticuerpo anti-hPACI ejemplar

Tabla 5B - Organización de la secuencia de la HC del anticuerpo anti-hPAC1 ejemplar

Se han descrito la estructura y las propiedades de las CDR en un anticuerpo que se da de forma natural, supra. Brevemente, en un anticuerpo tradicional, las CDR están integradas en una estructura en la región variable de la cadena pesada y ligera donde constituyen las regiones responsables de la unión al antígeno y el reconocimiento. Una región variable comprende al menos tres CDR de cadena pesada o ligera, véase, supra (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Servicio de salud pública N.I.H., Bethesda, MD; véase también Chothia y Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342:877-883), en una región estructural (regiones estructurales designadas 1-4, FR1, FR2, FR3 y FR4, por Kabat et al., 1991, supra; véase también Chothia y Lesk, 1987, supra). Las CDR descritas en la presente memoria, sin embargo, pueden no solo usarse para definir el dominio de unión al antígeno de una estructura de anticuerpo tradicional, sino que pueden integrarse en una variedad de otras estructuras polipeptídicas, como se describe en la presente memoria.

Algunos de los anticuerpos descritos en la presente memoria comparten ciertas regiones o secuencias con otros anticuerpos descritos en la presente memoria. Estas relaciones se resumen en las tablas anteriores.

En un aspecto, los anticuerpos aislados descritos en la presente memoria pueden ser un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo recombinante, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo multiespecífico, o un fragmento de unión al antígeno de anticuerpo de los mismos.

El fragmento de anticuerpo de los anticuerpos aislados descritos en la presente memoria puede ser un fragmento Fab, un fragmento Fab’, un fragmento F(ab’)², un fragmento Fv, un diacuerpo, o una molécula de anticuerpo monocatenaria.

El anticuerpo aislado descrito en la presente memoria puede ser un anticuerpo humano y puede ser del tipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. El anticuerpo aislado puede ser un tipo IgG 1 o IgG2. El anticuerpo aislado puede ser un tipo IgG2. El anticuerpo aislado puede ser un tipo IgG1. El anticuerpo tipo IgG1 puede ser un anticuerpo IgG1 aglucosilado. El anticuerpo IgG1 aglucosilado puede tener una mutación N297G.

En otro aspecto, el anticuerpo consiste en solo un polipéptido de cadena ligera o pesada como se presenta en las Tablas 2A-2B. En algunos aspectos, el anticuerpo puede consistir solo en un dominio variable de cadena ligera o variable de cadena pesada tal como los enumerados en las Tablas 3A y 3B. Dichos anticuerpos pueden pegilarse con una o más moléculas PEG.

En aún otro aspecto, el anticuerpo aislado descrito en la presente memoria puede acoplarse a un grupo de marcaje y puede competir para unirse a la parte extracelular de PAC1 humano con un anticuerpo de uno de los anticuerpos aislados descritos en la presente memoria. En un aspecto, el anticuerpo aislado descrito en la presente memoria puede reducir la quimiotaxis del monocito, inhibir la migración del monocito en tumores o inhibir la acumulación y función de macrófago asociado al tumor en un tumor cuando se administra a un paciente.

Como se apreciará por aquellos en la técnica, para cualquier anticuerpo con más de una CDR de las secuencias representadas, cualquier combinación de CDR seleccionadas independientemente de las secuencias representadas es útil. Por consiguiente, pueden generarse anticuerpos con una, dos, tres, cuatro, cinco o seis de CDR independientemente seleccionadas. Sin embargo, como se apreciará por aquellos en la técnica, las realizaciones específicas generalmente utilizan combinaciones de CDR que son no repetitivas, p.ej., los anticuerpos no están hechos generalmente con dos regiones CDRH2, etc.

Anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos que se describen en la presente memoria incluyen anticuerpos monoclonales que se unen a PAC1. Los anticuerpos monoclonales pueden producirse usando cualquier técnica conocida en la técnica, p.ej., inmortalizando células del bazo cosechadas del animal transgénico después de completar el programa de inmunización. Las células del bazo pueden inmortalizarse usando cualquier técnica conocida en la técnica, p.ej., fusionándolas con células de mieloma para producir hibridomas. Las células de mieloma para usar en procedimientos de fusión productores de hibridoma son preferiblemente no productoras de anticuerpo, tienen alta eficiencia de fusión y deficiencias enzimáticas que las hacen incapaces de crecer en ciertos medios selectivos que soportan el crecimiento de solo las células fusionadas deseadas (hibridomas). Ejemplos de líneas celulares adecuadas para usar en fusiones de ratón incluyen Sp-20, P3-X63/Ag8, P3-X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 4 1, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 y S194/5XXO Bul; ejemplos de líneas celulares usadas en fusiones de rata incluyen R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F y 4B210. Otras líneas celulares útiles para fusiones celulares son U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 y UC729-6.

En algunos ejemplos, una línea celular hibridoma se produce inmunizando un animal (p.ej., un animal transgénico que tiene secuencias de inmunoglobulina humana) con un inmunógeno PAC1; cosechando células del bazo del animal inmunizado; fusionando las células del bazo cosechadas a una línea celular de mieloma, generando así células de hibridoma; estableciendo las líneas celulares de hibridoma a partir de las células de hibridoma, e identificando una línea celular de hibridoma que produce un anticuerpo que se une a PAC1 (p.ej., como se describe en los Ejemplos 1-3, a continuación). Dichas líneas celulares de hibridoma, y los anticuerpos monoclonales anti-PAC1 producidos por ellas, son aspectos de la presente solicitud.

Los anticuerpos monoclonales secretados por una línea celular de hibridoma pueden purificarse usando cualquier técnica conocida en la técnica.

Anticuerpos quiméricos y humanizados

Los anticuerpos quiméricos y humanizados basados en las secuencias precedentes también se describen. Los anticuerpos monoclonales para usar como agentes terapéuticos pueden modificarse de varias formas antes del uso. Un ejemplo es un anticuerpo quimérico, que es un anticuerpo compuesto por segmentos de proteína de diferentes anticuerpos que están unidos de forma covalente para producir cadenas ligeras o pesadas de inmunoglobulina funcionales o partes inmunológicamente funcionales de las mismas. Generalmente, una parte de la cadena pesada y/o cadena ligera es idéntica a u homóloga a una secuencia correspondiente en los anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenece a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es/son idéntica(s) a u homóloga(s) a una secuencia correspondiente en los anticuerpos derivados de otra especie o que pertenece a otra clase o subclase de anticuerpos. Para métodos relacionados con anticuerpos quiméricos, véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos núm. 4.816.567; y Morrison et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81.6851-6855. El injerto de CDR se describe, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos núm.

6.180.370, núm. 5.693.762, núm. 5.693.761, núm. 5.585.089 y núm. 5.530.101.

Generalmente, el resultado de fabricar un anticuerpo quimérico es crear una quimera en que el número de aminoácidos de la especie paciente prevista se maximiza. Un ejemplo es el anticuerpo “injertado con CDR”, en que el anticuerpo comprende una o más regiones de determinación de la complementariedad (CDR) de una especie particular o que pertenece a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) de anticuerpo es/son idéntica(s) a u homóloga(s) a una secuencia correspondiente en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenece a otra clase o subclase de anticuerpo. Para el uso en humanos, la región variable o CDR seleccionadas de un anticuerpo de roedor a menudo se injertan en un anticuerpo humano, sustituyendo las regiones variables que se dan de forma natural o CDR del anticuerpo humano.

Un tipo útil de anticuerpo quimérico es un anticuerpo “humanizado”. Generalmente, un anticuerpo humanizado se produce a partir de un anticuerpo monoclonal surgido inicialmente en un animal no humano. Ciertos residuos de aminoácido en este anticuerpo monoclonal, típicamente de partes que no reconocen el antígeno del anticuerpo, se modifican para ser homólogos de residuos correspondientes en un anticuerpo humano del isotipo correspondiente. La humanización puede realizarse, por ejemplo, usando diversos métodos sustituyendo al menos una parte de una región variable de roedor por las correspondientes regiones de un anticuerpo humano (véase, p.ej., Patentes de Estados Unidos núm. 5.585.089 y núm. 5.693.762; Jones et al., 1986, Nature 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-27; Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-1536).

En un aspecto, las CDR de las regiones variables de las cadenas ligera y pesada de los anticuerpos descritos en la presente memoria se injertan en regiones estructurales (FR) desde anticuerpos de la misma, o una diferente, especie filogenética. Por ejemplo, las CDR de las regiones variables de cadenas pesada y ligera descritas en la presente memoria pueden injertarse en FR humanas de consenso. Para crear FR humanas de consenso, las FR de varias secuencias de aminoácidos de cadena pesada o cadena ligera humanas pueden alinearse para identificar una secuencia de aminoácidos de consenso. En otros aspectos, las FR de una cadena pesada o cadena ligera descritas en la presente memoria se sustituyen con las FR de una cadena pesada o cadena ligera diferente. En un aspecto, los aminoácidos raros en las FR de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo anti-PAC1 no se sustituyen, mientras que el resto de los aminoácidos de FR se sustituyen. Un “aminoácido raro” es un aminoácido específico que está en una posición en que este aminoácido particular no se encuentra normalmente en una FR. De forma alternativa, las regiones variables injertadas desde la cadena pesada o ligera pueden usarse con una región constante que es diferente de la región constante de esa cadena pesada o ligera particular como se describe en la presente memoria. En otros aspectos, las regiones variables injertadas son parte de un anticuerpo Fv monocatenario.

En ciertos aspectos, las regiones constantes de especies distintas de la humana pueden usarse junto con la(s) región(ones) variable(s) humana(s) para producir anticuerpos híbridos.

Anticuerpos completamente humanos

Los anticuerpos completamente humanos también se describen en la presente memoria. Los métodos están disponibles para fabricar anticuerpos completamente humanos específicos para un antígeno dado sin exponer a los seres humanos al antígeno (“anticuerpos completamente humanos”). Un medio específico proporcionado para implementar la producción de anticuerpos completamente humanos es la “humanización” del sistema inmune humoral del ratón. La introducción de sitios de inmunoglobulina (Ig) humana en ratones en que los genes de Ig endógena se han inactivado es un medio para producir anticuerpos monoclonales completamente humanos (mAbs) en el ratón, un animal que puede inmunizarse con cualquier antígeno deseable. Usar anticuerpos completamente humanos puede minimizar las respuestas inmunogénicas y alérgicas que a veces pueden provocarse administrando mAbs de ratón o derivadas de ratón a humanos como agentes terapéuticos.

Los anticuerpos completamente humanos pueden producirse inmunizando animales transgénicos (normalmente ratones) que son capaces de producir un repertorio de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Los antígenos para este propósito tienen típicamente seis o más aminoácidos contiguos, y opcionalmente se conjugan a un transporte, tal como un hapteno. Véase, p.ej., Jakobovits et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551-2555; Jakobovits et al., 1993, Nature 362:255-258; y Bruggermann et al., 1993, Year in Immunol. 7:33. En un ejemplo de dicho método, los animales transgénicos se producen incapacitando los sitios de inmunoglobulina de ratón endógena que codifican las cadenas de inmunoglobulina pesada y ligera de ratón en ellos, e insertando en el genoma de ratón grandes fragmentos de ADN de genoma humano que contienen sitios que codifican las proteínas de la cadena pesada y ligera humanas. Los animales parcialmente modificados, que tienen menos del complemento completo de sitios de inmunoglobulina humana, se cruzan entonces para obtener un animal que tenga todas las modificaciones del sistema inmune deseadas. Cuando se administra un inmunógeno, estos animales transgénicos producen anticuerpos que son inmunoespecíficos para el inmunógeno pero tienen secuencias de aminoácidos humanas más que murinas, incluyendo las regiones variables. Para más detalles de dichos métodos, véanse, por ejemplo, los documentos WO96/33735 y WO94/02602. Métodos adicionales relacionados con ratones transgénicos para fabricar anticuerpos humanos se describen en las Patentes de Estados Unidos núm.

5.545.807; núm. 6.713.610; núm. 6.673.986; núm. 6.162.963; núm. 5.545.807; núm. 6.300.129; núm. 6.255.458; núm. 5.877.397; núm. 5.874.299 y núm. 5.545.806; en Publicaciones PCT WO91/10741; WO90/04036, y en patentes europeas EP 546073B1 y EP546073A1.

Los ratones transgénicos descritos anteriormente, denominados en la presente memoria como ratones “HuMab”, contienen un minisitio génico de inmunoglobulina humana que codifica secuencias no reordenadas de inmunoglobulina de cadena pesada ([mu] y [gamma]) y [kappa] ligera humanas, junto con mutaciones dirigidas que inactivan los sitios de la cadena [mu] y [kappa] endógenas (Lonberg et al., 1994, Nature 368:856-859). Por consiguiente, los ratones muestran expresión reducida de IgM o [kappa] de ratón y en respuesta a la inmunización, y los transgenes de cadena pesada y ligera humanos experimentan cambio de clase y mutación somática para generar anticuerpos monoclonales IgG [kappa] humanos de alta afinidad (Lonberg et al., supra; Lonberg y Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93; Harding y Lonberg, 1995, Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546). La preparación de ratones HuMab se describe en detalle en Taylor et al., 1992, Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen et al., 1993, International Immunology 5:647-656; Tuaillon et al., 1994, J. Immunol. 152:2912-2920; Lonberg et al., 1994, Nature 368:856-859; Lonberg, 1994, Handbook of Exp. Pharmacology 113:49-101; Taylor et al., 1994, International Immunology 6:579-591; Lonberg y Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93; Harding y Lonberg, 1995, Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546; Fishwild et al., 1996, Nature Biotechnology 14:845-851. Véase, además las Patentes de Estados Unidos núm. 5.545.806; núm. 5.569.825; núm. 5.625.126; núm. 5.633.425; núm. 5.789.650; núm.

5.877.397; núm. 5.661.016; núm. 5.814.318; núm. 5.874.299 y núm. 5.770.429; además de la Patente de Estados Unidos núm. 5.545.807; Publicaciones Internacionales núms. WO 93/1227; WO 92/22646; y WO 92/03918. Las tecnologías utilizadas para producir anticuerpos humanos en estos ratones transgénicos se describen también en el documento WO 98/24893, y Méndez et al., 1997, Nature Genetics 15:146-156. Por ejemplo, las cepas de ratones transgénicos HCo7 y HCo12 pueden usarse para generar anticuerpos anti-PAC1. Detalles adicionales respecto a la producción de anticuerpos humanos usando ratones transgénicos se proporcionan en los ejemplos posteriores.

Usando la tecnología de hibridomas, los mAbs humanos específicos del antígeno con la especificidad deseada pueden producirse y seleccionarse a partir de ratones transgénicos como los descritos anteriormente. Dichos anticuerpos pueden clonarse y expresarse usando un vector y célula huésped adecuados, o los anticuerpos pueden cosecharse a partir de células de hibridoma cultivadas.

Los anticuerpos completamente humanos pueden derivarse también de bibliotecas de visualización de fagos (como se describe en Hoogenboom et al., 1991, J. Mol. Biol. 227:381; y Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222:581). Las técnicas de visualización de fagos imitan la selección inmune a través de la visualización de repertorios de anticuerpos en la superficie de bacteriófagos filamentosos, y la posterior selección de fagos por su unión a un antígeno de elección. Una técnica tal se describe en la Publicación PCT núm. WO 99/10494, que describe el aislamiento de anticuerpos agonísticos funcionales y de alta afinidad para receptores MPL y msk usando dicha estrategia.

Anticuerpos biespecíficos o bifuncionales

Los anticuerpos que se describen también incluyen anticuerpos biespecíficos y bifuncionales que incluyen una o más CDR o una o más regiones variables como se describe anteriormente. Un anticuerpo biespecífico o bifuncional en algunos ejemplos es un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos diferentes pares de cadena pesada/ligera y dos sitios de unión diferentes. Los anticuerpos biespecíficos pueden producirse mediante una variedad de métodos que incluyen, aunque no están limitados a, fusión de hibridomas o unión de fragmentos Fab’. Véase, p.ej., Songsivilai y Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321; Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553.

Diversas formas distintas

Algunos de los anticuerpos que se describen son formas variantes de los anticuerpos descritos anteriormente. Por ejemplo, algunos de los anticuerpos tienen una o más sustituciones de aminoácidos conservativas en una o más de las cadenas pesadas o ligeras, regiones variables o CDR enumeradas anteriormente.

Los aminoácidos que se dan de forma natural pueden dividirse en clases en base a las propiedades de la cadena lateral común:

1) hidrófobos: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

2) hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

3) ácidos: Asp, Glu;

4) básicos: His, Lys, Arg;

5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro; y

6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

Las sustituciones de aminoácidos conservativas pueden implicar el intercambio de un miembro de una de estas clases con otro miembro de la misma clase. Las sustituciones de aminoácidos conservativas pueden incluir residuos de aminoácidos que no se dan de forma natural, que se incorporan típicamente mediante síntesis peptídica química más que por síntesis en sistemas biológicos. Estos incluyen peptidomiméticos y otras formas al revés o invertidas de restos de aminoácido.

Las sustituciones no conservativas pueden implicar el intercambio de un miembro de una de las clases anteriores por un miembro de otra clase. Dichos residuos sustituidos pueden introducirse en regiones del anticuerpo que son homólogos con anticuerpos humanos, o en las regiones no homólogas de la molécula.

En la realización de dichos cambios, según ciertos aspectos, el índice hidropático de los aminoácidos puede considerarse. El perfil hidropático de una proteína se calcula asignando a cada aminoácido un valor numérico (“índice de hidropatía”) y después promediando de forma repetitiva estos valores a lo largo de la cadena peptídica. A cada aminoácido se ha asignado un índice hidropático en base a su hidrofobicidad y características de carga. Son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4,5).

La importancia del perfil hidropático en la atribución de función biológica interactiva en una proteína se entiende en la técnica (véase, p.ej., Kyte et al., 1982, J. Mol. Biol. 157:105-131). Se sabe que ciertos aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos que tienen un índice o valor hidropático similar y aún retienen una actividad biológica similar. En la realización de cambios en base al índice hidropático, en ciertos aspectos, la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están dentro de ±2 se incluye. En algunos aspectos, aquellos que están dentro de ±1 se incluyen, y en otros aspectos, aquellos dentro de ±0,5 se incluyen.

También se entiende en la técnica que la sustitución de aminoácidos parecidos puede hacerse de forma efectiva en base a la hidrofilicidad, particularmente donde la proteína o péptido biológicamente funcional así creado pretende usarse en aspectos inmunológicos, como en el presente caso. En ciertos aspectos, la mayor hidrofilicidad promedio local de una proteína, como se dirige por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, correlaciona con su inmunogenicidad y unión al antígeno o inmunogenicidad, es decir, con una propiedad biológica de la proteína.

Los siguientes valores de hidrofilicidad se han asignado a estos residuos de aminoácido: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0±1); glutamato (+3±1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (­ 0,4); prolina (-0,5±1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5) y triptófano (-3,4). En la realización de cambios en base a valores similares de hidrofilicidad, en ciertos aspectos, la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad están dentro de ±2 se incluye, en otros aspectos, aquellos que están dentro de ±1 se incluyen, y en aún otros aspectos, aquellos dentro de ±0,5 se incluyen. En algunos ejemplos, se pueden también identificar epítopos a partir de secuencias primarias de aminoácidos en base a la hidrofilicidad. Estas regiones se denominan también como “regiones de núcleo epitópico”.

Las sustituciones de aminoácidos conservativas ejemplares se presentan en la Tabla 6.

Tabla 6: Sustituciones de aminoácidos conservativas

Un experto será capaz de determinar variantes adecuadas de polipéptidos como se presenta en la presente memoria usando técnicas bien conocidas. Un experto en la técnica puede identificar áreas adecuadas de la molécula que pueden cambiarse sin destruir la actividad mediante direccionamiento a regiones que no se cree que sean importantes para la actividad. Los expertos además serán capaces de identificar residuos y partes de las moléculas que se conservan entre polipéptidos similares. En aspectos adicionales, incluso áreas que pueden ser importantes para la actividad biológica o para la estructura pueden someterse a sustituciones de aminoácidos conservativas sin destruir la actividad biológica o sin afectar de forma adversa a la estructura polipeptídica.

Adicionalmente, un experto en la técnica puede revisar los estudios de estructura-función que identifican los residuos en polipéptidos similares que son importantes para la actividad o estructura. En vista de dicha comparación, se puede predecir la importancia de los residuos de aminoácidos en una proteína que corresponde a residuos de aminoácido importantes para la actividad o estructura en proteínas similares. Un experto en la técnica puede optar por sustituciones de aminoácidos químicamente similares para dichos residuos de aminoácido importantes predichos.

Un experto en la técnica puede también analizar la estructura 3-dimensional y la secuencia de aminoácidos en relación con esa estructura en polipéptidos similares. En vista de dicha información, un experto en la técnica puede predecir el alineamiento de residuos de aminoácido de un anticuerpo con respecto a su estructura tridimensional. Un experto en la técnica puede elegir no realizar cambios radicales a residuos de aminoácido predichos para estar en la superficie de la proteína, ya que dichos residuos pueden estar implicados en importantes interacciones con otras moléculas. Además, un experto en la técnica puede generar variantes de prueba que contienen una única sustitución de aminoácido en cada residuo de aminoácido deseado. Estas variantes pueden cribarse entonces usando ensayos para PAC1 que neutraliza la actividad, (véanse los ejemplos posteriores) proporcionando por consiguiente información respecto a que aminoácidos pueden cambiarse y cuales no deben cambiarse. En otras palabras, en base a la información reunida a partir de dichos experimentos rutinarios, un experto en la técnica puede determinar fácilmente las posiciones de aminoácidos donde más sustituciones deberían evitarse o bien solas o en combinación con otras mutaciones.

Un número de publicaciones científicas se han dedicado a la predicción de la estructura secundaria. Véase, Moult, 1996, Curr. Op. in Biotech. 7:422-427; Chou et al., 1974, Biochem. 13:222-245; Chou et al., 1974, Biochemistry 113:211-222; Chou et al., 1978, Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 47:45-148; Chou et al., 1979, Ann. Rev. Biochem. 47:251-276; y Chou et al., 1979, Biophys. J. 26:367-384. Además, están disponibles actualmente programas informáticos para ayudar con la predicción de la estructura secundaria. Un método para predecir la estructura secundaria se basa en el modelado por homología. Por ejemplo, dos polipéptidos o proteínas que tienen una identidad de secuencia de más de 30%, o similitud mayor que 40% pueden tener topologías estructurales similares. El reciente crecimiento de la base de datos estructural de proteínas (PDB) ha proporcionado una capacidad de predicción mejorada de la estructura secundaria, que incluye el número potencial de pliegues en una estructura de polipéptido o proteína. Véase, Holm et al., 1999, Nucl. Acid. Res. 27:244-247. Se ha sugerido (Brenner et al., 1997, Curr. Op. Struct. Biol. 7:369-376) que hay un número limitado de pliegues en un polipéptido o proteína dada y que una vez que se han resuelto un número crítico de estructuras, la predicción estructural se volverá dramáticamente más exacta.

Los métodos adicionales de predicción de la estructura secundaria incluyen “enhebrado” (Jones, 1997, Curr. Opin. Struct. Biol. 7:377-387; Sippl et al., 1996, Structure 4:15-19), “análisis de perfil” (Bowie et al., 1991, Science 253:164-170; Gribskov et al., 1990, Meth. Enzym. 183:146-159; Gribskov et al., 1987, Proc. Nat. Acad. Sci. 84:4355-4358), y “unión evolutiva” (Véase, Holm, 1999, supra; y Brenner, 1997, supra).

Pueden hacerse sustituciones de aminoácidos que: (1) reducen la susceptibilidad a la proteólisis, (2) reducen la susceptibilidad a la oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos de proteína, (4) alteran las afinidades de unión al ligando o antígeno, y/o (4) confieren o modifican otras propiedades fisicoquímicas o funcionales en dichos polipéptidos. Por ejemplo, pueden hacerse sustituciones de aminoácido sencillas o múltiples (en ciertos aspectos, sustituciones de aminoácidos conservativas) en la secuencia que se da de forma natural. Pueden hacerse sustituciones en esa parte del anticuerpo que queda fuera del (de los) dominio(s) que forma(n) contactos intermoleculares). En dichos aspectos, pueden usarse sustituciones de aminoácidos conservativas que no cambian sustancialmente las características estructurales de la secuencia parental (p.ej., uno o más aminoácidos de sustitución que no interrumpen la estructura secundaria que caracteriza al anticuerpo parental o nativo). Ejemplos de estructuras secundarias y terciarias de polipéptido reconocidas por la técnica se describen en Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed.), 1984, W.H. Nueva York: Freeman and Company; Introduction to Protein Structure (Branden y Tooze, eds.), 1991, Nueva York: Garland Publishing; y Thornton et al., 1991, Nature 354:105.

Las variantes de anticuerpo preferidas adicionales incluyen variantes de cisteína en las que uno o más residuos de cisteína en la secuencia de aminoácidos parental o nativa se eliminan de o se sustituyen con otro aminoácido (p.ej., serina). Las variantes de cisteína son útiles, entre otras cuando los anticuerpos deben replegarse en una conformación biológicamente activa. Las variantes de cisteína pueden tener menos residuos de cisteína que el anticuerpo nativo, y típicamente tiene un número parejo para minimizar las interacciones que resultan de cisteína desapareadas.

Las cadenas pesada y ligera, dominios de regiones variables y CDR que se describen pueden usarse para preparar polipéptidos que contienen una región de unión al antígeno que puede unirse específicamente a PAC1. Por ejemplo, una o más de las CDR enumeradas en las Tablas 4A y 4B pueden incorporarse en una molécula (p.ej., un polipéptido) de forma covalente o no covalente para generar una inmunoadhesión. Una inmunoadhesión puede incorporar la(s) CDR(s) como parte de una cadena polipeptídica mayor, puede unir de forma covalente la(s) CDR(s) a otra cadena polipeptídica, o puede incorporar la(s) CDR(s) de forma no covalente. La(s) CDR(s) permite(n) que la inmunoadhesión se una específicamente a un antígeno particular de interés (p.ej., PAC1 o epítopo del mismo).

Los miméticos (p.ej., “miméticos peptídicos” o “peptidomiméticos”) basados en los dominios de la región variable y las CDR que se describen en la presente memoria también se describen. Estos análogos pueden ser péptidos, no péptidos o combinaciones de regiones peptídicas y no peptídicas. Fauchere, 1986, Adv. Drug Res. 15:29; Veber y Freidinger, 1985, TINS p. 392; y Evans et al., 1987, J. Med. Chem. 30:1229. Los miméticos peptídicos que son estructuralmente similares a los péptidos terapéuticamente útiles pueden usarse para producir un efecto terapéutico o profiláctico similar. Dichos compuestos se desarrollan a menudo con la ayuda de modelado molecular computerizado. Generalmente, los peptidomiméticos son proteínas que son estructuralmente similares a un anticuerpo que presenta una actividad biológica deseada, tal como aquí la capacidad de unirse específicamente a PAC1, pero tienen una o más uniones peptídicas sustituidas opcionalmente mediante una unión seleccionada de: -CH²NH-, -CH²S-, -CH²-CH²-, -CH-CH-(cis y trans), -COCH²-, -CH(OH)CH²-, y -CH²SO-, por métodos bien conocidos en la técnica. La sustitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia de consenso con un D-aminoácido del mismo tipo (p.ej., D-lisina en lugar de L-lisina) puede usarse en ciertos aspectos para generar más proteínas estables. Además, pueden generarse péptidos impedidos que comprenden una secuencia de consenso o una variación de secuencia de consenso sustancialmente idéntica por métodos conocidos en la técnica (Rizo y Gierasch, 1992, Ann. Rev. Biochem. 61:387), por ejemplo, añadiendo residuos de cisteína internos capaces de formar puentes disulfuro intramoleculares que ciclan el péptido.

Derivados de los anticuerpos que se describen en la presente memoria se describen también. Los anticuerpos derivados pueden comprender cualquier molécula o sustancia que de una propiedad deseada al anticuerpo o fragmento, tal como vida media aumentada en un uso particular. El anticuerpo derivado puede comprender, por ejemplo, un resto detectable (o de marcaje) (p.ej., una molécula radioactiva, colorimétrica, antigénica o enzimática, una perla detectable (tal como una perla magnética o electrodensa (p.ej., oro)), o una molécula que se une a otra molécula (p.ej. biotina o estreptavidina)), un resto terapéutico o diagnóstico (p.ej., un resto radioactivo, citotóxico o farmacéuticamente activo), o una molécula que aumenta la idoneidad del anticuerpo para un uso particular (p.ej., administración a un sujeto, tal como un sujeto humano, u otros usos in vivo o in vitro). Ejemplos de moléculas que pueden usarse para derivar un anticuerpo incluyen albúmina (p.ej., albúmina de suero humano) y polietilenglicol (PEG). Pueden prepararse derivados de anticuerpos unidos a albúmina y PEGilados usando técnicas bien conocidas en la técnica. Ciertos anticuerpos incluyen un polipéptido monocatenario pegilado como se describe en la presente memoria. En una realización, el anticuerpo se conjuga o se une de otra forma a transtiretina (TTR) o una variante de TTR. La TTR o variante de TTR puede modificarse químicamente con, por ejemplo, un compuesto químico seleccionado del grupo que consiste en dextrano, poli(n-vinilpirrolidona), polietilenglicoles, homopolímeros de propilenglicol, copolímeros de poli(óxido de propileno)/óxido de etileno, polioles polioxietilados y poli(alcoholes de vinilo).

Otros derivados incluyen conjugados covalentes o agregativos de proteínas de unión a PAC1 con otras proteínas o polipéptidos, tal como mediante la expresión de proteínas de fusión recombinantes que comprenden polipéptidos heterólogos fusionados al extremo N o extremo C de una proteína de unión a PAC1. Por ejemplo, el péptido conjugado puede ser un polipéptido de señal heterólogo (o líder), p.ej., el líder de factor alfa de la levadura, o un péptido tal como una etiqueta de epítopo. Las proteínas de fusión que contienen anticuerpo PAC1 pueden comprender péptidos añadidos para facilitar la purificación o identificación de la proteína de unión a PAC1 (p.ej., poli-His). Una proteína de unión a PAC1 puede también unirse al péptido FLAG como se describe en Hopp et al., 1988, Bio/Technology 6:1204; y la Patente de Estados Unidos núm. 5.011.912. El péptido FLAG es altamente antigénico y proporciona un epítopo unido de forma reversible por un anticuerpo monoclonal específico (mAb), que permite el ensayo rápido y la purificación fácil de la proteína recombinante expresada. Los reactivos útiles para preparar las proteínas de fusión en que el péptido FLAG se fusiona a un polipéptido dado están comercialmente disponibles (Sigma, St. Louis, MO).

Los oligómeros que contienen una o más proteínas de unión a PAC1 pueden emplearse como antagonistas de PAC1. Los oligómeros pueden estar en forma de dímeros, trímeros u oligómeros superiores, unidos de forma covalente o unidos de forma no covalente. Los oligómeros que comprenden dos o más proteínas de unión a PAC1 se contemplan para el uso, siendo un ejemplo un homodímero. Otros oligómeros incluyen heterodímeros, homotrímeros, heterotrímeros, homotetrámeros, heterotetrámeros, etc.

Un aspecto está dirigido a oligómeros que comprenden múltiples polipéptidos de unión a PAC1 unidos por medio de interacciones covalentes o no covalentes entre restos peptídicos fusionados con las proteínas de unión a PAC1. Dichos péptidos pueden ser conectores peptídicos (espaciadores), o péptidos que tienen la propiedad de promover la oligomerización. Las cremalleras de leucina y ciertos polipéptidos derivados de anticuerpos están entre los péptidos que pueden promover la oligomerización de proteínas de unión a PAC1 unidos a ellos, como se describe en más detalle a continuación.

En aspectos particulares, los oligómeros comprenden de dos a cuatro proteínas de unión a PAC1. Los restos de proteína de unión a PAC1 del oligómero pueden estar en cualquiera de las formas descritas anteriormente, p.ej., variantes o fragmentos. Preferiblemente, los oligómeros comprenden proteínas de unión a PAC1 que tienen actividad de unión a PAC1.

En un aspecto, un oligómero se prepara usando polipéptidos derivados de inmunoglobulinas. La preparación de proteínas de fusión que comprenden ciertos polipéptidos heterólogos fusionados a diversas partes de polipéptidos derivados de anticuerpo (incluyendo el dominio Fc) se han descrito, p.ej., por Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535; Byrn et al., 1990, Nature 344:677; y Hollenbaugh et al., 1992 “Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins”, en Current Protocols in Immunology, Supl. 4, páginas 10.19.1-10.19.11.

Un aspecto está dirigido a un dímero que comprende dos proteínas de fusión creadas fusionando una proteína de unión a PAC1 a la región Fc de un anticuerpo. El dímero puede hacerse, por ejemplo, insertando un gen de fusión que codifica la proteína de fusión en un vector de expresión apropiado, expresando la fusión del gen en células huésped transformadas con el vector de expresión recombinante, y permitiendo a la proteína de fusión expresada montar moléculas de anticuerpo parecidas, mientras los enlaces disulfuro entre cadenas se forman entre los restos de Fc para proporcionar el dímero.

El término “polipéptido Fc” como se usa en la presente memoria incluye formas nativa y de muteína de polipéptidos derivados de la región Fc de un anticuerpo. Las formas truncadas de dichos polipéptidos que contienen la región bisagra que promueve la dimerización también se incluyen. Las proteínas de fusión que comprenden restos Fc (y oligómeros formados de los mismos) ofrecen la ventaja de purificación fácil por cromatografía de afinidad sobre columnas de proteína A o proteína G.

Un polipéptido Fc adecuado, descrito en la solicitud PCT WO 93/10151 y las Patentes de Estados Unidos núm.

5.426.048 y núm. 5.262.522, es un polipéptido monocatenario que se extiende desde la región bisagra N-terminal al extremo C nativo de la región Fc de un anticuerpo IgG1 humano. Otro polipéptido Fc útil es la muteína Fc descrita en la Patente de Estados Unidos núm. 5.457.035, y en Baum et al., 1994, eMbO J. 13:3992-4001. La secuencia de aminoácidos de esta muteína es idéntica a la de la secuencia Fc nativa presentada en el documento WO 93/10151, excepto que el aminoácido 19 se ha cambiado de Leu a Ala, el aminoácido 20 se ha cambiado de Leu a Glu, y aminoácido 22 se ha cambiado de Gly a Ala. La muteína muestra la afinidad reducida por los receptores Fc.

En otros aspectos, la parte variable de las cadenas pesada y/o ligera de una proteína de unión a PAC1 tal como se describe en la presente memoria puede sustituirse por la parte variable de una cadena pesada y/o ligera de anticuerpo.

De forma alternativa, el oligómero es una proteína de fusión que comprende múltiples proteínas de unión a PAC1, con o sin conectores peptídicos (péptidos espaciadores). Entre los conectores peptídicos adecuados están los descritos en las Patentes de Estados Unidos núm. 4.751.180 y núm. 4.935.233.

Otro método para preparar derivados de proteína de unión a PAC1 oligoméricos implica el uso de una cremallera de leucina. Los dominios de cremallera de leucina son péptidos que promueven la oligomerización de las proteínas en que se encuentran. Las cremalleras de leucina se identificaron originalmente en varias proteínas de unión a ADN (Landschulz et al., 1988, Science 240:1759), y se han encontrado desde entonces en una variedad de diferentes proteínas. Entre las cremalleras de leucina conocidas están los péptidos que se dan de forma natural y derivados de los mismos que dimerizan o trimerizan. Los ejemplos de dominios de cremallera de leucina adecuados para producir proteínas oligoméricas solubles se describen en la solicitud PCT WO 94/10308, y la cremallera de leucina derivada de la proteína D tensioactiva pulmonar (SPD) descrita en Hoppe et al., 1994, FEBS Letters 344:191. El uso de una cremallera de leucina modificada que permite la trimerización estable de una proteína heteróloga fusionada a ella se describe en Fanslow et al., 1994, Semin. Immunol. 6:267-278. En una estrategia, las proteínas de fusión recombinantes que comprenden un fragmento de proteína de unión a PAC1 o derivado fusionado a un péptido de cremallera de leucina se expresan en células huésped adecuadas, y los fragmentos de proteína de unión a PACI oligoméricos solubles o derivados que forman se recuperan del sobrenadante del cultivo.

En ciertos aspectos, el anticuerpo tiene una K^d (afinidad de unión de equilibrio) de menos de 1 pM, 10 pM, 100 pM, 1 nM, 2 nM, 5 nM, 10 nM, 25 nM o 50 nM.

Otro aspecto proporciona un anticuerpo que tiene una vida media de al menos un día in vitro o in vivo (p.ej., cuando se administra a un sujeto humano). En un aspecto, el anticuerpo tiene una vida media de al menos tres días. En otro aspecto, el anticuerpo o parte del mismo tiene una vida media de cuatro días o más. En otro aspecto, el anticuerpo o parte del mismo tiene una vida media de ocho días o más. En otro aspecto, el anticuerpo o parte de unión al antígeno del mismo se deriva o modifica de manera que tiene una vida media mayor cuando se compara con el anticuerpo no derivado o no modificado. En otro aspecto, el anticuerpo contiene mutaciones puntuales para aumentar la vida media en suero, tal como se describe en el documento WO 00/09560, publicado el 24 de febrero de 2000.

Glucosilación

El anticuerpo puede tener un patrón de glucosilación que es diferente o está alterado del encontrado en la especie nativa. Como se conoce en la técnica, los patrones de glucosilación pueden depender tanto de la secuencia de la proteína (p.ej., la presencia o ausencia de residuos de aminoácido de glucosilación particulares, tratados a continuación), como de la célula huésped u organismo en que se produce la proteína. Los sistemas de expresión particulares se tratan a continuación.

La glucosilación de polipéptidos es típicamente o unida a N o unida a O. Unida a N se refiere a la unión del resto carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias tri-péptido asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del resto carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. Por consiguiente, la presencia de cualquiera de estas secuencias tri-péptido en un polipéptido crea un sitio potencial de glucosilación. La glucosilación unida a O se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa, a un hidroxiaminoácido, lo más normalmente serina o treonina, aunque 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina pueden usarse también.

La adición de los sitios de glucosilación al anticuerpo se consigue convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de manera que contenga una o más de las secuencias tri-péptido descritas anteriormente (para los sitios de glucosilación unidos a N). La alteración puede hacerse también mediante la adición de, o sustitución por, uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia de partida (para los sitios de glucosilación unidos a O). Por comodidad, la secuencia de aminoácidos del anticuerpo puede alterarse a través de cambios al nivel de ADN, particularmente mutando el ADN que codifica el polipéptido diana en bases preseleccionadas de manera que se generen esos codones que se traducirán en los aminoácidos deseados.

Otro medio para aumentar el número de restos carbohidrato en el anticuerpo es mediante acoplamiento químico o enzimático de glucósidos a la proteína. Estos procedimientos son ventajosos en que no necesitan la producción de la proteína en una célula huésped que tiene capacidades de glucosilación para la glucosilación unida a N y O. Dependiendo del modo de acoplamiento usado, el (los) azúcar(es) puede(n) unirse a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos sulfhidrilo libres tales como los de cisteína, (d) grupos hidroxilo libres tales como los de serina, treonina o hidroxiprolina, (e) residuos aromáticos tales como los de fenilalanina, tirosina o triptófano, o (f) el grupo amida de glutamina. Estos métodos se describen en el documento WO 87/05330 publicado el 11 de septiembre de 1987, y en Aplin y Wriston, 1981, CRC Crit. Rev. Biochem., págs. 259-306.

La eliminación de restos carbohidrato presentes en el anticuerpo de partida puede conseguirse químicamente o enzimáticamente. La desglucosilación química necesita la exposición de la proteína al compuesto ácido trifluorometanosulfónico, o un compuesto equivalente. Este tratamiento da por resultado la escisión de la mayoría o todos los azúcares excepto el azúcar de unión (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina), mientras que deja el polipéptido intacto. La desglucosilación química se describe por Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys.

259:52 y por Edge et al., 1981, Anal. Biochem. 118:131. La escisión enzimática de restos carbohidrato en polipéptidos pueden conseguirse mediante el uso de una variedad de endo- y exo-glucosidasas como se describe por Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol. 138:350. La glucosilación en sitios potenciales de glucosilación puede evitarse mediante el uso del compuesto tunicamicina como se describe por Duskin et al., 1982, J. Biol. Chem.

257:3105. La tunicamicina bloquea la formación de uniones proteína-N-glucósido.

Por tanto, los aspectos incluyen variantes de glucosilación de los anticuerpos en los que el número y/o tipo de sitio(s) de glucosilación se ha alterado en comparación con las secuencias de aminoácidos del polipéptido parental. En ciertos aspectos, los variantes de proteína de anticuerpo comprenden un mayor o menor número de sitios de glucosilación unidos a N que el anticuerpo nativo. Un sitio de glucosilación unido a N se caracteriza por la secuencia: Asn-X-Ser o Asn-X-Thr, en la que el residuo de aminoácido designado como X puede ser cualquier residuo de aminoácido excepto prolina. La sustitución de residuos de aminoácido para crear esta secuencia proporciona un nuevo sitio potencial para la adición de una cadena de carbohidrato unida a N. De forma alternativa, las sustituciones que eliminan o alteran esta secuencia evitarán la adición de una cadena de carbohidrato unida a N presente en el polipéptido nativo. Por ejemplo, la glucosilación puede reducirse mediante la supresión de una Asn o sustituyendo la Asn con un aminoácido diferente. En otros aspectos, se crean uno o más nuevos sitios unidos a N. Los anticuerpos tienen típicamente un sitio de glucosilación unido a N en la región Fc.

Se sabe que la IgG1 humana tiene un sitio de glucosilación en N297 (sistema de numeración UE) y la glucosilación contribuye a la función efectora de los anticuerpos IgG1. Los grupos han mutado N297 en un esfuerzo por fabricar anticuerpos aglucosilados. Las mutaciones tienen los focos en la sustitución de N297 con aminoácidos que se parecen a la asparagina en la naturaleza fisioquímica tal como la glutamina (N297Q) o con alanina (N297A) que imita las asparaginas sin grupos polares.

Como se usa en la presente memoria, “anticuerpo aglucosilado” o “fc aglucosilado” se refiere al estado de glucosilación del residuo en posición 297 del Fc. Un anticuerpo u otra molécula puede contener glucosilación en una o más posiciones distintas pero puede considerarse aún un anticuerpo aglucosilado o proteína de fusión de Fc aglucosilado.

En un esfuerzo de fabricar moléculas Fc de IgG1 no funcional efectoras, se descubrió que la mutación del aminoácido N297 de IgG1 humana a glicina, es decir, N297G, proporciona propiedades de eficiencia de purificación y biofísicas superiores sobre otras sustituciones de aminoácidos en ese residuo. Se descubrió además que los anticuerpos antiPAC1 en una estructura IgG1 aglucosilada evitaban que el gamma receptor de Fc indujera la supresión de plaquetas como se evaluó usando un ensayo de fagocitosis (véase el ejemplo 5). Por consiguiente, en realizaciones preferidas, los anticuerpos anti-PAC1 comprenden anticuerpos con un sufijo “B” o “C”, designando variantes aglucosiladas de IgG1. En ciertas realizaciones, un anticuerpo comprende el Fc que tiene una sustitución N297G.

Un Fc que comprende un Fc de IgG1 humana que tiene la mutación N297G puede comprender más inserciones, supresiones y sustituciones. En ciertas realizaciones el Fc de IgG1 humana comprende la sustitución N297G y es al menos 90% idéntica, al menos 91% idéntica, al menos 92% idéntica, al menos 93% idéntica, al menos 94% idéntica, al menos 95% idéntica, al menos 96% idéntica, al menos 97% idéntica, al menos 98% idéntica, o al menos 99% idéntica a una o más secuencias de aminoácidos presentadas en la Tabla 2B (secuencias de aminoácidos de la cadena pesada de Ab anti-hPAC1 ejemplares).

Unas moléculas que contienen Fc de IgG1 glucosiladas pueden ser menos estables que las moléculas que contienen Fc de IgG1 glucosiladas. La región Fc puede por consiguiente diseñarse adicionalmente para aumentar la estabilidad de la molécula aglucosilada. En algunos aspectos, uno o más aminoácidos se sustituyen a cisteína para así formar enlaces disulfuro en el estado dimérico. Los residuos que corresponden a V259, A287, R292, V302, L306, V323 o I332 de una secuencia de la cadena pesada de aminoácidos de IgG1 pueden por consiguiente sustituirse con cisteína. En aspectos preferidos, pares específicos de residuos son una sustitución de manera que forman preferentemente un enlace disulfuro el uno con el otro, limitando por consiguiente o evitando el intercambio del enlace disulfuro. Los pares preferidos incluyen, aunque no están limitados a, A287C y L306C, V259C y L306C, R292C y V302C, y V323C e I332C.

Se ejemplifican específicamente en la presente memoria cadenas pesadas que contienen Fc de IgG1 aglucosiladas (N297G) en las que uno o ambos residuos R292 y V302 están sustituidos con cisteína. Los anticuerpos de IgG1 aglucosilados (N297G) con un sufijo “C” contienen sustituciones tanto R292C como V302C en sus cadenas pesadas.

Marcas y grupos efectores

En algunas realizaciones la unión al antígeno comprende una o más marcas. El término “grupo de marcaje” o “marca” significa cualquier marca detectable. Ejemplos de grupos de marcaje adecuados incluyen, aunque no están limitados a, los siguientes: radioisótopos o radionúclidos (p.ej., 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), grupos fluorescentes (p.ej., FITC, rodamina, fósforos con base de lantánidos), grupos enzimáticos (p.ej., peroxidasa de rábano picante, p-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), grupos quimioluminiscentes, grupos biotinilo, o epítopos de polipéptido predeterminados reconocidos por un indicador secundario (p.ej., secuencias de pares de cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metal, marcas de epítopo). En algunas realizaciones, el grupo de marcaje está acoplado con el anticuerpo por medio de brazos espaciadores de diversas longitudes para reducir el impedimento estérico potencial. Varios métodos para proteínas de marcaje se conocen en la técnica y pueden usarse mientras se vea que ajustan.

El término “grupo efector” significa cualquier grupo acoplado a un anticuerpo que actúa como un agente citotóxico. Ejemplos de grupos efectores adecuados son radioisótopos o radionúclidos (p.ej., 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I). Otros grupos adecuados incluyen toxinas, grupos terapéuticos o grupos quimioterapéuticos. Ejemplos de grupos adecuados incluyen calicheamicina, auristatinas, geldanamicina y maitansina. En algunas realizaciones, el grupo efector se acopla al anticuerpo por medio de brazos espaciadores de diversas longitudes para reducir el impedimento estérico potencial.

En general, las marcas están en una variedad de clases, dependiendo del ensayo en que se van a detectar: a) marcas isotópicas, que pueden ser isótopos radioactivos o pesados; b) marcas magnéticas (p.ej., partículas magnéticas); c) restos activos redox; d) tintes ópticos; grupos enzimáticos (p.ej., peroxidasa de rábano picante, pgalactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina); e) grupos biotinilados; y f) epítopos de polipéptido predeterminados reconocidos por un indicador secundario (p.ej., secuencias de pares de cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metal, marcas de epítopo, etc.). En algunas realizaciones, el grupo de marcaje se acopla al anticuerpo por medio de brazos espaciadores de diversas longitudes para reducir el impedimento estérico potencial. Varios métodos para marcar proteínas se conocen en la técnica.

Marcas específicas incluyen tintes ópticos, que incluyen, aunque no están limitados a, cromóforos, fósforos y fluoróforos, siendo los últimos específicos en muchos ejemplos. Los fluoróforos pueden ser o flúores de “molécula pequeña” o flúores proteináceos.

Por “marca fluorescente” se entiende cualquier molécula que pueda detectarse por medio de sus propiedades fluorescentes inherentes. Marcas fluorescentes adecuadas incluyen, aunque no están limitadas a, fluoresceína, rodamina, tetrametilrodamina, eosina, eritrosina, cumarina, metil-cumarinas, pireno, verde malacina, estilbeno, amarillo lucifer, azulJ cascada, rojo Texas, IAEDANS, EDANS, BODIPY FL, ^lC Rojo 640, Cy5, Cy5.5, ^lC Rojo 705, verde Oregón, los tintes de flúor Alexa (Alexa Flúor 350, Alexa Flúor 430, Alexa Flúor 488, Alexa Flúor 546, Alexa Flúor 568, Alexa Flúor 594, Alexa Flúor 633, Alexa Flúor 647, Alexa Flúor 660, Alexa Flúor 680), Azul Cascada, Amarillo Cascada y R-ficoeritrina (PE) (Molecular Probes, Eugene, OR), FITC, rodamina, y rojo Texas (Pierce, Rockford, IL), Cy5, Cy5.5, Cy7 (Amersham Life Science, Pittsburgh, PA). Tintes ópticos adecuados, que incluyen fluoróforos, se describen en Molecular Probes Handbook de Richard P. Haugland.

Las marcas fluorescentes proteináceas adecuadas también incluyen, aunque no están limitadas a, proteína fluorescente verde, que incluye una especie de Renilla, Ptilosarcus o Aequorea de GFP (Chalfie et al., 1994, Science 263:802-805); E^g F^p (Clontech Labs., Inc., Número de Acceso a Genbank U55762), proteína fluorescente azul (BFP, Quantum Biotechnologies, Inc., Quebec, Canadá; Stauber, 1998, Biotechniques 24:462-471; Heim et al., 1996, Curr. Biol. 6:178-182), proteína fluorescente amarilla mejorada (EYFP, Clontech Labs., Inc.), luciferasa (Ichiki et al., 1993, J. Immunol. 150:5408-5417), p-galactosidasa (Nolan et al., 1988, Proc. Natl., Acad. Sci. U.S.A. 85:2603-2607) y Renilla (documentos WO92/15673, WO95/07463, WO98/14605, WO98/26277, WO99/49019, Patentes de Estados Unidos núm. 5292658, núm. 5418155, núm. 5683888, núm. 5741668, núm. 5777079, núm. 5804387, núm. 5874304, núm. 5876995, núm. 5925558).

Ácidos nucleicos

Un aspecto adicional proporciona ácidos nucleicos que hibridan con otros ácidos nucleicos (p.ej., ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de nucleótidos enumerada en las Tablas 1A y 1B bajo condiciones de hibridación particulares. Los métodos para hibridar ácidos nucleicos se conocen bien en la técnica. Véase, p.ej., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Como se define en la presente memoria, una condición de hibridación moderadamente estricta usa una disolución de prelavado que contiene 5x de cloruro sódico/citrato sódico (SSC), SDS al 0,5%, EDTA 1,0 mM (pH 8,0), tampón de hibridación de aproximadamente 50% de formamida, 6x de SSC, y una temperatura de hibridación de 55°C (u otras disoluciones de hibridación similares, tal como la que contiene aproximadamente 50% de formamida, con una temperatura de hibridación de 42°C), y condiciones de lavado de 60°C, en 0,5x de SSC, SDS al 0,1%. Una condición de hibridación estricta hibrida en 6x de SSC a 45°C, seguido por uno o más lavados en 0,1x de SSC, SDS al 0,2% a 68°C. Además, un experto en la técnica puede manipular las condiciones de hibridación y/o lavado para aumentar o disminuir la severidad de hibridación de manera que los ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos que son al menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% idénticos los unos a los otros permanecen típicamente hibridados los unos a los otros.

Los parámetros básicos que afectan a la elección de las condiciones de hibridación y guía para elaborar condiciones adecuadas se presentan, por ejemplo, por Sambrook, Fritsch, y Maniatis (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., supra; y Current Protocols in Molecular Biology, 1995, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., secciones 2.10 y 6.3-6.4), y pueden determinarse fácilmente por los que tienen experiencia en la técnica en base a, p.ej., la longitud y/o composición de bases del ácido nucleico.

Pueden introducirse cambios por mutación en un ácido nucleico, llevando así a cambios en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido (p.ej., un anticuerpo o derivado de anticuerpo) que se codifica. Las mutaciones pueden introducirse usando cualquier técnica conocida en la técnica. En un aspecto, uno o más residuos de aminoácido particulares se cambian usando, por ejemplo, un protocolo de mutagénesis dirigida al sitio. En otro aspecto, uno o más residuos seleccionados aleatoriamente se cambia usando, por ejemplo, un protocolo de mutagénesis aleatoria. Independientemente de cómo se haga, un polipéptido mutante puede expresarse y cribarse por una propiedad deseada.

Las mutaciones pueden introducirse en un ácido nucleico sin alterar significativamente la actividad biológica de un polipéptido que codifica. Por ejemplo, se pueden hacer sustituciones de nucleótidos que llevan a sustituciones de aminoácidos en residuos de aminoácido no esenciales. De forma alternativa, una o más mutaciones pueden introducirse en un ácido nucleico que cambia de forma selectiva la actividad biológica de un polipéptido que codifica. Por ejemplo, la mutación puede cambiar de forma cuantitativa o cualitativa la actividad biológica. Ejemplos de cambios cuantitativos incluyen aumentar, reducir o eliminar la actividad. Ejemplos de cambios cualitativos incluyen cambiar la especificidad al antígeno de un anticuerpo. En un aspecto, un ácido nucleico que codifica cualquier anticuerpo descrito en la presente memoria puede mutarse para alterar la secuencia de aminoácidos usando técnicas de biología molecular que están bien establecidas en la técnica.

Otro aspecto proporciona moléculas de ácido nucleico que son adecuadas para usar como cebadores o sondas de hibridación para la detección de secuencias de ácido nucleico. Una molécula de ácido nucleico puede comprender solo una parte de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de longitud completa, por ejemplo, un fragmento que puede usarse como una sonda o cebador o un fragmento que codifica una parte activa (p.ej., una parte de unión a PAC1) de un polipéptido.

Las sondas basadas en la secuencia de un ácido nucleico pueden usarse para detectar el ácido nucleico o ácidos nucleicos similares, por ejemplo, tránscritos que codifican un polipéptido. La sonda puede comprender un grupo de marcaje, p.ej., un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima, o un co-factor enzimático. Dichas sondas pueden usarse para identificar una célula que expresa el polipéptido.

Otro aspecto proporciona vectores que comprenden un ácido nucleico que codifica un polipéptido o una parte del mismo (p.ej., un fragmento que contiene una o más CDR o uno o más dominios de región variable). Ejemplos de vectores incluyen, aunque no están limitados a, plásmidos, vectores víricos, vectores y vectores de expresión de mamífero no episomales, por ejemplo, vectores de expresión recombinantes. Los vectores de expresión recombinantes pueden comprender un ácido nucleico en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula huésped. Los vectores de expresión recombinantes incluyen una o más secuencias reguladoras, seleccionadas en base a las células huésped a usar para la expresión, que está unida de forma operable a la secuencia de ácido nucleico a expresar. Las secuencias reguladoras incluyen aquellas que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células huésped (p.ej., potenciador del gen temprano de SV40, promotor del virus de sarcoma de Rous y promotor de citomegalovirus), aquellas que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos solo en ciertas células huésped (p.ej., secuencias reguladoras específicas del tejido, véase, Voss et al., 1986, Trends Biochem. Sci. 11:287, Maniatis et al., 1987, Science 236:1237), y aquellas que dirigen la expresión inducible de una secuencia de nucleótidos en respuesta al tratamiento o condición particular (p.ej., el promotor de metalotionina en células de mamífero y el promotor sensible a tet y/o sensible a estreptomicina en sistemas tanto procariotas como eucariotas (véase, id.). Se apreciará por los expertos en la técnica que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped a transformar, el nivel de expresión de proteína deseada, etc. Los vectores de expresión pueden introducirse en células huésped para producir así proteínas o péptidos, incluyendo proteínas o péptidos de fusión, codificadas por ácidos nucleicos como se describe en la presente memoria.

Otro aspecto proporciona células huésped en que se ha introducido un vector de expresión recombinante. Una célula huésped puede ser cualquier célula procariota (por ejemplo, E. coli) o célula eucariota (por ejemplo, células de levadura, insecto o mamífero (p.ej., células CHO)). Puede introducirse el vector de ADN en células procariotas o eucariotas por medio de técnicas de transformación o transfección convencionales. Para la transfección estable de células de mamífero, se sabe que, dependiendo del vector de expresión y la técnica de transfección usada, solo una pequeña fracción de células puede integrar el ADN extraño en su genoma. Para identificar y seleccionar estos integrantes, un gen que codifica un marcador seleccionable (p.ej., para resistencia a antibióticos) se introduce generalmente en las células huésped junto con el gen de interés. Los marcadores seleccionables preferidos incluyen aquellos que confieren resistencia a fármacos, tal como G418, higromicina y metotrexato. Las células transfectadas de forma estable con el ácido nucleico introducido pueden identificarse por selección de fármaco (p.ej., las células que han incorporado el gen marcador seleccionable sobrevivirán, mientras que las demás células mueren), entre otros métodos.

Preparación de anticuerpos

Los anticuerpos no humanos que se describen pueden, por ejemplo, derivarse de cualquier animal que produce anticuerpos, tal como ratón, rata, conejo, cabra, burro, o primate no humano (tal como mono (p.ej., mono cinomolgo o Rhesus) o simio (p.ej., chimpancé)). Pueden usarse anticuerpos no humanos, por ejemplo, en cultivo celular in vitro y aplicaciones basadas en cultivo celular, o cualquier otra aplicación donde una respuesta inmune al anticuerpo no se da o es insignificante, puede evitarse, no es un problema, o se desea. En ciertos aspectos, los anticuerpos pueden producirse inmunizando animales usando métodos conocidos en la técnica, como se describe anteriormente. Los anticuerpos pueden ser policlonales, monoclonales, o pueden sintetizarse en células huésped expresando ADN recombinante. Los anticuerpos completamente humanos pueden prepararse como se describe anteriormente inmunizando animales transgénicos que contienen sitios de inmunoglobulina humana o seleccionando una biblioteca de visualización de fagos que está expresando un repertorio de anticuerpos humanos.

Los anticuerpos monoclonales (mAbs) pueden producirse por una variedad de técnicas, que incluyen metodología de anticuerpo monoclonal convencional, p.ej., la técnica de hibridación de células somáticas estándar de Kohler y Milstein, 1975, Nature 256:495. De forma alternativa, otras técnicas para producir anticuerpos monoclonales pueden emplearse, por ejemplo, la transformación vírica u oncogénica de linfocitos B. Un sistema animal adecuado para preparar hibridomas es el sistema murino, que es un procedimiento muy bien establecido. Los protocolos y técnicas de inmunización para el aislamiento de esplenocitos inmunizados para la fusión se conocen en la técnica y se describen estrategias ilustrativas en los ejemplos, a continuación. Para dichos procedimientos, las células B de ratones inmunizados se fusionan típicamente con un compañero de fusión inmortalizado adecuado, tal como una línea celular de mieloma murino. Si se desea, pueden inmunizarse ratas u otros mamíferos además en vez de ratones y las células B de dichos animales pueden fusionarse con la línea celular de mieloma murino para formar hibridomas. De forma alternativa, puede usarse una línea celular de mieloma de una fuente distinta de ratón. Los procedimientos de fusión para fabricar hibridomas también se conocen bien.

Los anticuerpos monocatenarios que se describen pueden formarse uniendo fragmentos de dominio variable de cadena pesada y ligera (región Fv) por medio de un puente de aminoácidos (conector peptídico corto), dando por resultado una única cadena polipeptídica. Dichos Fvs monocatenarios (scFvs) pueden prepararse fusionando ADN que codifica un conector peptídico entre ADN que codifican los dos polipéptidos de dominio variable (V^l y V^h). Los polipéptidos resultantes pueden plegarse sobre sí mismos para formar monómeros de unión al antígeno, o pueden formar multímeros (p.ej., dímeros, trímeros o tetrámeros), dependiendo de la longitud de un conector flexible entre los dos dominios variables (Kortt et al., 1997, Prot. Eng. 10:423; Kortt et al., 2001, Biomol. Eng. 18:95-108). Combinando diferentes polipéptidos que comprenden V^l y V^h, se pueden formar scFvs multiméricos que se unen a diferentes epítopos (Kriangkum et al., 2001, Biomol. Eng. 18:31-40). Las técnicas desarrolladas para la producción de anticuerpos monocatenarios incluyen las descritas en la Patente de EE.UU. núm. 4.946.778; Bird, 1988, Science 242:423; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879; Ward et al., 1989, Nature 334:544, de Graaf et al., 2002, Methods Mol Biol. 178:379-387. Los anticuerpos monocatenarios derivados de anticuerpos descritos en la presente memoria incluyen, aunque no están limitados a scFvs que comprenden las combinaciones de dominio variable de las regiones variables de cadena pesada y ligera representadas en las Tablas 3A y 3B, o combinaciones de dominios variables de cadena ligera y pesada que incluyen CDR representadas en las Tablas 4A y 4B.

Los anticuerpos descritos en la presente memoria que son de una subclase pueden cambiarse a anticuerpos de una subclase diferente usando métodos de intercambio de subclase. Por consiguiente, los anticuerpos de IgG pueden derivarse de un anticuerpo de IgM, por ejemplo, y viceversa. Dichas técnicas permiten la preparación de nuevos anticuerpos que poseen las propiedades de unión al antígeno de un anticuerpo dado (el anticuerpo parental), pero también muestran propiedades biológicas asociadas con el isotipo de anticuerpo o subclase diferentes de las del anticuerpo parental. Pueden emplearse técnicas de ADN recombinante. El ADN clonado que codifica polipéptidos de anticuerpo particulares puede emplearse en dichos procedimientos, p.ej., ADN que codifica el dominio constante de un anticuerpo del isotipo deseado. Véase, p.ej., Lantto et al., 2002, Methods Mol. Biol. 178:303-316.

Por consiguiente, los anticuerpos que se describen incluyen aquellos que comprenden, por ejemplo, las combinaciones de dominio variable descritas, supra, que tienen un isotipo deseado (por ejemplo, IgA, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE e IgD) además de fragmentos Fab o F(ab^{’ )2} de los mismos. Además, si una IgG4 se desea, pueden también desearse introducir una mutación puntual (CPSCP->CPPCP) en la región bisagra como se describe en Bloom et al., 1997, Protein Science 6:407 para aliviar una tendencia a formar enlaces disulfuro dentro de la cadena H que pueden llevar a la heterogenicidad en los anticuerpos IgG4.

Además, las técnicas para derivar anticuerpos que tienen diferentes propiedades (es decir, variar las afinidades por el antígeno al que se unen) se conocen también. Una técnica tal, denominada como intercambio de cadenas, implica la visualización de repertorios génicos de dominio variable de inmunoglobulina en la superficie de bacteriófago filamentoso, a menudo denominado como visualización de fagos. El intercambio de cadenas se ha usado para preparar anticuerpos de alta afinidad al hapteno 2-feniloxazol-5-ona, como se describe por Marks et al., 1992, BioTechnology 10:779.

Pueden hacerse modificaciones conservativas a las regiones variables de cadena pesada y ligera descritas en las Tablas 3A y 3B, o las CDR descritas en las Tablas 4A y 4B (y modificaciones correspondientes a los ácidos nucleicos de codificación) para producir una proteína de unión a PAC1 que tiene ciertas características funcionales y bioquímicas deseables. Los métodos para conseguir dichas modificaciones se describen anteriormente.

Los anticuerpos PAC1 pueden modificarse adicionalmente de varias formas. Por ejemplo, si se van a usar por propósitos terapéuticos, pueden conjugarse con polietilenglicol (pegilarse) para prolongar la vida media en suero o para mejorar la distribución de proteína. De forma alternativa, la región V de los anticuerpos de estudio o fragmentos de los mismos puede fusionarse con la región Fc de una molécula de anticuerpo diferente. La región Fc usada para este propósito puede modificarse de manera que no se une al complemento, reduciendo así la probabilidad de inducir lisis celular en el paciente cuando la proteína de fusión se usa como un agente terapéutico. Además, los anticuerpos de estudio o fragmentos funcionales de los mismos pueden conjugarse con albúmina de suero humano para mejorar la vida media en suero del anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo. Otro compañero de fusión útil para los anticuerpos o fragmentos de los mismos es la transtiretina (TTR). La TTR tiene la capacidad de formar un tetrámero, por consiguiente una proteína de fusión de TTR-anticuerpo puede formar un anticuerpo multivalente que puede aumentar su avidez de unión.

De forma alternativa, pueden conseguirse modificaciones sustanciales en las características funcionales y/o bioquímicas de los anticuerpos descritos en la presente memoria creando sustituciones en la secuencia de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera que difieren significativamente en su efecto en el mantenimiento de (a) la estructura del esqueleto molecular en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación laminar o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena lateral. Una “sustitución de aminoácido conservativa” puede implicar una sustitución de un residuo de aminoácido nativo con un residuo no nativo que tiene poco o ningún efecto en la polaridad o carga del residuo de aminoácido en esa posición. Véase, Tabla 6, supra. Además, cualquier residuo nativo en el polipéptido puede también sustituirse con alanina, como se ha descrito anteriormente para la mutagénesis de barrido de alanina.

Las sustituciones de aminoácidos (conservativas o no conservativas) de los anticuerpos de estudio pueden implementarse por los expertos en la técnica aplicando técnicas rutinarias. Las sustituciones de aminoácidos pueden usarse para identificar residuos importantes de los anticuerpos descritos en la presente memoria, o para aumentar o disminuir la afinidad de estos anticuerpos por el PAC1 humano o para modificar la afinidad de unión de otros anticuerpos descritos en la presente memoria.

Métodos de expresión de anticuerpos

Los sistemas de expresión y constructos en forma de plásmidos, vectores de expresión, casetes de transcripción o expresión que comprenden al menos un polinucleótido como se describen anteriormente se describen también en la presente memoria, además de células huésped que comprenden dichos sistemas de expresión o constructos.

Los anticuerpos descritos en la presente memoria pueden prepararse por cualquiera de un número de técnicas convencionales. Por ejemplo, los anticuerpos PAC1 pueden producirse mediante sistemas de expresión recombinante, usando cualquier técnica conocida en la técnica. Véase, p.ej., Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Kennet et al. (eds.) Plenum Press, Nueva York (1980); y Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988).

Los anticuerpos pueden expresarse en líneas celulares de hibridoma (p.ej., en anticuerpos particulares pueden expresarse en hibridomas) o en líneas celulares distintas de hibridomas. Los constructos de expresión que codifican los anticuerpos pueden usarse para transformar una célula huésped de mamífero, insecto o microbiana. La transformación puede realizarse usando cualquier método conocido para introducir polinucleótidos en una célula huésped, que incluyen, por ejemplo empaquetar el polinucleótido en un virus o bacteriófago y transducir una célula huésped con el constructo mediante procedimientos de transfección conocidos en la técnica, como se ejemplifica por las Patentes de Estados Unidos núm. 4.399.216; núm. 4.912.040; núm. 4.740.461; núm. 4.959.455. El procedimiento de transformación óptimo usado dependerá de que tipo de célula huésped se está transformando. Los métodos para la introducción de polinucleótidos heterólogos en células de mamífero se conocen bien en la técnica e incluyen, aunque no están limitados a, transfección mediada por dextrano, precipitación de fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplasto, electroporación, encapsulación del (de los) polinucleótido(s) en liposomas, mezcla de ácido nucleico con lípidos cargados positivamente, y microinyección directa del ADN en los núcleos.

Los constructos de expresión recombinante comprenden típicamente una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende uno o más de lo siguiente: una o más CDR descritas en la presente memoria; una región constante de cadena ligera; una región variable de cadena ligera; una región constante de cadena pesada (p.ej., C^h1, C^h2 y/o C^h3); y/u otra parte de la estructura de un anticuerpo PAC1. Estas secuencias de ácido nucleico se insertan en un vector de expresión apropiado usando técnicas de ligado estándar. En una realización, la región constante de la cadena pesada o ligera se añade al extremo C de la región variable de cadena pesada o ligera específica de anti-PAC1 y se liga en un vector de expresión. El vector se selecciona típicamente para ser funcional en la célula huésped particular empleada (es decir, el vector es compatible con la maquinaria de la célula huésped, permitiendo que la amplificación y/o expresión del gen pueda ocurrir). En algunas realizaciones, se usan vectores que emplean ensayos de complementación del fragmento de proteína usando indicadores de proteína, tal como dihidrofolato reductasa (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. núm. 6.270.964). Los vectores de expresión adecuados pueden comprarse, por ejemplo, de Invitrogen Life Technologies o BD Biosciences (anteriormente “Clontech”). Otros vectores útiles para clonar y expresar los anticuerpos y fragmentos incluyen los descritos en Bianchi y McGrew, 2003, Biotech. Biotechnol. Bioeng. 84:439-44. Los vectores de expresión adecuados adicionales se tratan, por ejemplo, en Methods Enzymol., vol. 185 (D.V. Goeddel, ed.), 1990, Nueva York: Academic Press.

Típicamente, los vectores de expresión usados en cualquiera de las células huésped contendrán secuencias para el mantenimiento de plásmidos y para el clonado y la expresión de secuencias de nucleótido exógenas. Dichas secuencias, denominadas de forma colectiva como “secuencias flanqueantes” en ciertos aspectos incluirán típicamente una o más de las siguientes secuencias de nucleótidos: un promotor, una o más secuencias potenciadoras, un origen de replicación, una secuencia de terminación transcripcional, una secuencia de intrón completa que contiene un sitio de corte y empalme dador y aceptor, una secuencia que codifica una secuencia líder para la secreción del polipéptido, un sitio de unión al ribosoma, una secuencia de poliadenilación, una región policonectora para insertar el ácido nucleico que codifica el polipéptido a expresar, y un elemento marcador seleccionable. Cada una de estas secuencias se trata a continuación.

Opcionalmente, el vector puede contener una secuencia que codifica una “etiqueta”, es decir, una molécula de oligonucleótido en el extremo 5’ o 3’ de la secuencia de codificación de proteína de unión a PAC1; la secuencia de oligonucleótido codifica poliHis (tal como hexaHis), u otra “etiqueta” tal como FLAG®, HA (virus de la gripe de hemaglutinina), o myc, para la que existen anticuerpos disponibles comercialmente. Esta etiqueta se fusiona típicamente al polipéptido tras la expresión del polipéptido, y puede servir como un medio para la purificación por afinidad o detección de la proteína de unión a PAC1 procedente de la célula huésped. La purificación por afinidad puede conseguirse, por ejemplo, mediante cromatografía de columna usando anticuerpos contra la etiqueta como una matriz de afinidad. Opcionalmente, la etiqueta puede quitarse posteriormente de la proteína de unión a PACI purificada mediante diversos medios tal como el uso de ciertas peptidasas para la escisión.

Las secuencias flanqueantes pueden ser homólogas (es decir, de la misma especie y/o cepa que la célula huésped), heterólogas (es decir, de una especie distinta de la especie o cepa de la célula huésped), híbridas (es decir, una combinación de secuencias flanqueantes de más de una fuente), sintéticas o nativas. Como tal, la fuente de una secuencia flanqueante puede ser cualquier organismo procariota o eucariota, cualquier organismo vertebrado o invertebrado, o cualquier planta, con tal que la secuencia flanqueante sea funcional en, y pueda activarse por, la maquinaria de la célula huésped.

Las secuencias flanqueantes útiles en los vectores pueden obtenerse por cualquiera de varios métodos bien conocidos en la técnica. Típicamente, las secuencias flanqueantes útiles en la presente memoria se habrán identificado previamente por mapeo y/o por digestión con endonucleasas de restricción y pueden por consiguiente aislarse de la fuente tisular apropiada usando las endonucleasas de restricción apropiadas. En algunos casos, la secuencia de nucleótidos completa de una secuencia flanqueante puede conocerse. Aquí, la secuencia flanqueante puede sintetizarse usando los métodos descritos en la presente memoria para la síntesis o clonado de ácidos nucleicos.

Se conozca toda o solo una parte de la secuencia flanqueante, puede obtenerse usando la reacción de la cadena polimerasa (PCR) y/o por visualización de una biblioteca genómica con una sonda adecuada tal como un oligonucleótido y/o fragmento de secuencia flanqueante de la misma u otra especie. Cuando no se conoce la secuencia flanqueante, un fragmento de ADN que contiene una secuencia flanqueante puede aislarse de un trozo mayor de ADN que puede contener, por ejemplo, una secuencia de codificación o incluso otro gen o genes. El aislamiento puede conseguirse mediante digestión por endonucleasa de restricción para producir el fragmento de ADN apropiado seguido por aislamiento usando purificación con gel de agarosa, cromatografía en columna Qiagen® (Chatsworth, CA), u otros métodos conocidos por el experto. La selección de enzimas adecuadas para conseguir este propósito será fácilmente evidente para un experto en la técnica.

Un origen de replicación es típicamente una parte de esos vectores de expresión procariotas comprados comercialmente, y el origen ayuda en la amplificación del vector en una célula huésped. Si el vector de elección no contiene un origen de sitio de replicación, puede sintetizarse uno químicamente en base a una secuencia conocida, y ligarse al vector. Por ejemplo, el origen de replicación procedente del plásmido pBR322 (New England Biolabs, Beverly, MA) es adecuado para la mayoría de bacterias gram-negativas, y varios orígenes víricos (p.ej., SV40, polioma, adenovirus, virus de estomatitis vesicular (VSV) o virus del papiloma tal como HPV o BPV) son útiles para clonar vectores en células de mamífero. Generalmente, el componente del origen de replicación no se necesita para los vectores de expresión de mamíferos (por ejemplo, el origen de SV40 se usa a menudo solo porque también contiene el promotor temprano del virus).

Una secuencia de terminación de transcripción está situada típicamente en 3’ al final de una región de codificación de polipéptido y sirve para terminar la transcripción. Normalmente, una secuencia de terminación de transcripción en células procariotas es un fragmento rico en G-C seguido por una secuencia poli-T. Aunque la secuencia se clone fácilmente de una biblioteca o incluso se compre comercialmente como parte de un vector, puede también sintetizarse fácilmente usando métodos para la síntesis de ácido nucleico tal como los descritos en la presente memoria.

Un gen marcador seleccionable codifica una proteína necesaria para la supervivencia y crecimiento de una célula huésped cultivada en un medio de cultivo selectivo. Los genes marcadores de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, p.ej., ampicilina, tetraciclina o kanamicina para células huésped procariotas; (b) complementan las deficiencias auxotróficas de la célula; o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles desde el complejo o medio definido. Los marcadores seleccionables específicos son el gen de resistencia a la kanamicina, el gen de resistencia a la ampicilina, y el gen de resistencia a la tetraciclina. De forma ventajosa, un gen de resistencia a la neomicina puede usarse también para la selección tanto en células huésped procariotas como eucariotas.

Otros genes seleccionables pueden usarse para amplificar el gen que se expresará. La amplificación es el proceso en el que los genes que se necesitan para la producción de una proteína crítica para el crecimiento o supervivencia celular se repiten en tándem en los cromosomas de sucesivas generaciones de células recombinantes. Ejemplos de marcadores seleccionables adecuados para células de mamífero incluyen dihidrofolato reductasa (DHFR) y genes de timidina quinasa sin promotor. Los transformantes de células de mamífero se ponen bajo presión de selección en la que solo los transformantes se adaptan únicamente para sobrevivir en virtud del gen seleccionable presente en el vector. La presión de selección se impone cultivando las células transformadas bajo condiciones en que la concentración del agente de selección en el medio se aumenta de forma sucesiva, llevando por consiguiente a la amplificación tanto del gen seleccionable como del ADN que codifica otro gen, tal como un anticuerpo que se une a PAC1. Como resultado, se sintetizan cantidades aumentadas de un polipéptido tal como un anticuerpo a partir del ADN amplificado.

Un sitio de unión al ribosoma es normalmente necesario para el inicio de la traducción de ARNm y se caracteriza por una secuencia de Shine-Dalgarno (procariotas) o una secuencia de Kozak (eucariotas). El elemento se sitúa típicamente en 3’ al promotor y en 5’ a la secuencia de codificación del polipéptido a expresar.

En algunos casos, tal como donde se desea la glucosilación en un sistema de expresión de célula huésped eucariota, se puede manipular las diversas pre- o pro-secuencias para mejorar la glucosilación o rendimiento. Por ejemplo, se puede alterar el sitio de escisión de peptidasa de un péptido señal particular, o añadir pro-secuencias, que pueden también afectar a la glucosilación. El producto de proteína final puede tener, en la posición -1 (respecto al primer aminoácido de la proteína madura), uno o más aminoácidos adicionales incidentes a la expresión, que puede no haberse eliminado totalmente. Por ejemplo, el producto de proteína final puede tener uno o dos residuos de aminoácido encontrados en el sitio de escisión de peptidasa, unidos al extremo amino. De forma alternativa, el uso de algunos sitios de escisión enzimática puede dar por resultado una forma truncada ligeramente del polipéptido deseado, si la enzima corta en dicha área en el polipéptido maduro.

La expresión y el clonado contendrán típicamente un promotor que se reconoce por el organismo huésped y se une de forma operable a la molécula que codifica una proteína de unión a PACI. Los promotores son secuencias no transcritas situadas corriente arriba (es decir, 5’) al codón de partida de un gen estructural (generalmente en aproximadamente 100 a 1000 pb) que controlan la transcripción del gen estructural. Los promotores se agrupan convencionalmente en una de dos clases: promotores inducibles y promotores constitutivos. Los promotores inducibles inician los niveles aumentados de transcripción desde el ADN bajo su control en respuesta a algún cambio en las condiciones de cultivo, tal como la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio en la temperatura. Los promotores constitutivos, por otro lado, transcriben uniformemente un gen al que están unidos de forma operable, es decir, con poco o ningún control sobre la expresión génica. Un gran número de promotores, reconocidos por una variedad de células huésped potenciales, se conocen bien. Un promotor adecuado está unido de forma operable al ADN que codifica cadena pesada o cadena ligera que comprende una proteína de unión a PAC1 eliminando el promotor de la fuente de ADN mediante digestión con enzima de restricción e insertando la secuencia promotora deseada en el vector.

Promotores adecuados para usar con huéspedes de levadura se conocen también en la técnica. Los potenciadores de la levadura se usan de forma ventajosa con promotores de levadura. Los promotores adecuados para usar con células huésped de mamífero se conocen bien e incluyen, aunque no están limitados a, los obtenidos de los genomas de virus tales como virus de polioma, virus de la viruela aviar, adenovirus (tal como Adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, retrovirus, virus de la hepatitis B, y virus de simio 40 (SV40). Otros promotores de mamífero adecuados incluyen promotores de mamífero heterólogos, por ejemplo, promotores de choque térmico y el promotor de actina.

Promotores adicionales que pueden ser de interés incluyen, aunque no están limitados a: promotor temprano de SV40 (Benoist y Chambon, 1981, Nature 290:304-310); promotor de CMV (Thornsen et al., 1984, Proc. Natl. Acad. U.S.A. 81:659-663); el promotor contenido en la repetición terminal larga 3’ del virus de sarcoma de Rous (Yamamoto et al., 1980, Cell 22:787-797); promotor de timidina quinasa de herpes (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1444-1445); secuencias promotoras y reguladoras del gen de metalotionina (Prinster et al., 1982, Nature 296:39-42); y promotores procariotas tal como el promotor de beta-lactamasa (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731); o el promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25). También son de interés las siguientes regiones de control de transcripción animal, que muestran especificidad tisular y se han utilizado en animales transgénicos: la región de control del gen de elastasa I que es activo en células acinares pancreáticas (Swift et al., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); la región de control del gen de insulina que es activo en células beta pancreáticas (Hanahan, 1985, Nature 315:115-122); la región de control del gen de inmunoglobulina que es activo en las células linfoides (Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-658; Adames et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444); la región de control de virus tumoral mamario de ratón que es activo en células testiculares, de mama, linfoides y mastocitos (Leder et al., 1986, Cell 45:485-495); la región de control del gen de albúmina que es activo en el hígado (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1:268-276); la región de control del gen de alfa-feto-proteína que es activo en el hígado (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 253:53-58); la región de control del gen de alfa-1-antitripsina que es activo en el hígado (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1:161-171); la región de control del gen de beta-globina que es activo en células mieloides (Mogram et al., 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94); la región de control del gen de proteína básica de mielina que es activo en las células de oligodendrocitos en el cerebro (Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712); la región de control del gen de cadena ligera-2 de miosina que es activo en el músculo esquelético (Sani, 1985, Nature 314:283-286); y la región de control del gen de la hormona de liberación gonadotrópica que es activo en el hipotálamo (Mason et al., 1986, Science 234:1372-1378).

Una secuencia potenciadora puede insertarse en el vector para aumentar la transcripción del ADN que codifica la cadena ligera o cadena pesada que comprende una proteína de unión a PAC1 humano mediante eucariotas superiores. Los potenciadores son elementos que actúan en cis de ADN, normalmente aproximadamente 10-300 pb de longitud, que actúan en el promotor para aumentar la transcripción. Los potenciadores son relativamente independientes de la orientación y la posición, habiéndose encontrado en las posiciones tanto 5’ como 3’ a la unidad de transcripción. Se conocen varias secuencias potenciadoras disponibles de genes de mamífero (p.ej., globina, elastasa, albúmina, alfa-feto-proteína e insulina). Típicamente, sin embargo, se usa un potenciador de un virus. El potenciador de SV40, el potenciador del promotor temprano del citomegalovirus, el potenciador del polioma, y los potenciadores de adenovirus conocidos en la técnica son elementos de potenciación ejemplares para la activación de promotores eucariotas. Aunque un potenciador puede situarse en el vector o en 5’ o en 3’ a una secuencia de codificación, está típicamente situado en el sitio 5’ desde el promotor. Una secuencia que codifica una secuencia señal nativa o heteróloga apropiada (secuencia líder o péptido señal) puede incorporarse en un vector de expresión, para promover la secreción extracelular del anticuerpo. La elección de péptido señal o líder depende del tipo de células huésped en que el anticuerpo se va a producir, y una secuencia señal heteróloga puede sustituir a la secuencia señal nativa. Ejemplos de péptidos señal que son funcionales en las células huésped de mamífero incluyen los siguientes: la secuencia señal para interleucina-7 (IL-7) descrita en la Patente de EE.UU. núm.

4.965.195; la secuencia señal para el receptor de interleucina-2 descrito en Cosman et al., 1984, Nature 312:768; el péptido señal del receptor de interleucina-4 descrito en la Patente EP núm. 0367566; el péptido señal del receptor de interleucina-1- tipo I descrito en la Patente de EE.UU. núm. 4.968.607; el péptido señal del receptor de interleucina-1 tipo II descrito en la Patente EP núm. 0460846.

Los vectores de expresión que se describen pueden construirse a partir de un vector de partida tal como un vector disponible comercialmente. Dichos vectores pueden contener o no todas las secuencias flanqueantes deseadas. Cuando una o más de las secuencias flanqueantes descritas en la presente memoria no están ya presentes en el vector, pueden obtenerse de forma individual y ligarse al vector. Los métodos usados para obtener cada una de las secuencias flanqueantes se conocen bien por un experto en la técnica.

Después de que se ha construido el vector y una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena ligera, una cadena pesada, o una cadena ligera y una cadena pesada que comprende una secuencia de unión al antígeno PAC1 se ha insertado en el sitio apropiado del vector, el vector completo puede insertarse en una célula huésped adecuada para la amplificación y/o expresión del polipéptido. La transformación de un vector de expresión para un anticuerpo en una célula huésped seleccionada puede conseguirse por métodos bien conocidos que incluyen la transfección, infección, co-precipitación con fosfato de calcio, electroporación, microinyección, lipofección, transfección mediada por DEAE-dextrano, u otras técnicas conocidas. El método seleccionado será en parte una función del tipo de célula huésped a usar. Estos métodos y otros métodos adecuados se conocen bien por el experto, y se presentan, por ejemplo, en Sambrook et al., 2001, supra.

Una célula huésped, cuando se cultiva bajo condiciones apropiadas, sintetiza un anticuerpo que puede recogerse posteriormente del medio de cultivo (si la célula huésped lo secreta en el medio) o directamente de la célula huésped que lo produce (si no se secreta). La selección de una célula huésped apropiada dependerá de varios factores, tal como niveles de expresión deseados, modificaciones polipeptídicas que son deseables o necesarias para la actividad (tal como glucosilación o fosforilación) y facilidad de plegado en una molécula biológicamente activa.

Las líneas celulares de mamífero disponibles como huéspedes para la expresión se conocen bien en la técnica e incluyen, aunque no están limitadas a, líneas celulares inmortalizadas de la Colección Americana de Cultivo Tipo (ATCC), que incluyen aunque no están limitadas a células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células renales de cría de hámster (BHK), células renales de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (p.ej., Hep G2) y un número de otras líneas celulares. Las líneas celulares pueden seleccionarse determinando que líneas celulares tienen altos niveles de expresión y producen de forma constitutiva anticuerpos con propiedades de unión a PAC1. Puede seleccionarse una línea celular de la línea de células B que no fabrica su propio anticuerpo pero tiene la capacidad de fabricar un secretar un anticuerpo heterólogo.

Uso de anticuerpos PAC1 humanos para propósitos diagnósticos y terapéuticos

Los anticuerpos son útiles para detectar PAC1 en muestras biológicas y la identificación de células o tejidos que producen PAC1. Por ejemplo, los anticuerpos PAC1 pueden usarse en ensayos diagnósticos, p.ej., ensayos de unión para detectar y/o cuantificar el PAC1 expresado en un tejido o célula. Los anticuerpos que se unen específicamente a PAC1 pueden usarse también en el tratamiento de enfermedades relacionadas con PAC1 en un paciente que lo necesita. Además, los anticuerpos PAC1 pueden usarse para inhibir que PAC1 forme un complejo con su ligando PACAP (p.ej., PACAP-38), modulando así la actividad biológica de PAC1 en una célula o tejido. Ejemplos de actividades que pueden modularse incluyen, aunque no están limitadas a, inhibir la vasodilatación y/o disminución de inflamación neurogénica. Los anticuerpos que se unen a PAC1 pueden por consiguiente modular y/o bloquear la interacción con otros compuestos de unión y como tal pueden tener uso terapéutico en la mejora de enfermedades relacionadas con PAC1.

Indicaciones

Una enfermedad o condición asociada con PACI humano incluye cualquier enfermedad o condición cuyo comienzo en un paciente esté provocado por, al menos en parte, la interacción de PAC1 con su ligando, PACAP (p.ej., PACAP-38). La gravedad de la enfermedad o condición pueden también aumentarse o disminuirse mediante la interacción de PAC1 con PACAP (p.ej., PACAP-38). Ejemplos de enfermedades y condiciones que pueden tratarse con los anticuerpos descritos en la presente memoria incluyen cefaleas, tales como cefaleas en racimo, migraña, que incluyen cefaleas por migraña, dolor crónico, diabetes mellitus tipo II, inflamación, p.ej., inflamación neurogénica, trastornos cardiovasculares y desequilibrios hemodinámicos asociados con la endotoxemia y la sepsis.

En particular, los anticuerpos descritos en la presente memoria pueden usarse para tratar la migraña, o como un tratamiento agudo que comienza después de que un ataque de migraña ha comenzado, y/o como un tratamiento profiláctico administrado, p.ej., diariamente, semanalmente, bisemanalmente, mensualmente, bimensualmente, bianualmente, etc.) para prevenir o reducir la frecuencia y/o gravedad de los síntomas, p.ej., síntomas de dolor, asociados con ataques de migraña.

La infusión del PACAP agonista del receptor de PAC1 provoca cefalea tipo migraña en pacientes de migraña, sugiriendo que bloquear el PAC1 puede ser útil para tratar la migraña. Estudios de inmunohistoquímica en mono cinomolgo realizados como soporte de la presente invención mapearon la localización de PACAP y PAC1 a la ruta parasimpática a través del ganglio esfenopalatino (SPG; también conocido como ganglio pterigopalatino), que también inerva el sistema vascular de la duramadre. La ruta parasimpática es independiente y paralela a la ruta sensorial que también controla el tono del sistema vascular de la duramadre, por tanto probablemente juega un papel en la patofisiología de la migraña. Experimentos adicionales realizados como soporte de la presente invención mostraron que un Ab PAC1 selectivo bloqueó la activación del complejo cervical trigeminal (TCC) estimulado eléctricamente, un modelo de electrofisiología que se ha presentado por correlacionar con la eficacia de la migraña clínica. Tomado junto, la evidencia soporta el tomar como objetivo el PAC1 con un antagonista selectivo tal como un anticuerpo anti-PAC1 como se describe en la presente memoria para tratar la migraña. La eficacia esperada de un agente terapéutico anti-PAC1 para el tratamiento de la migraña en pacientes humanos está soportado además por documentos publicados, que incluyen, por ejemplo Schytz, H.W., et al., “The PACAP receptor: a novel target for migraine treatment.”, Neurotherapeutics. Abril de 2010; 7(2):191-6; Olesen J., et al., “Emerging migraine treatments and drug targets”, Trend Pharmacol Sci., junio de 2011; 32(6):352-9; y Schytz, H.W. et al., “PACAP38 induces migraine-like attacks in patients with migraine without aura”, Brain (2009) 132(1 ):16-25.

La cefalea en racimo es una condición que implica, como su característica más destacada, un grado de dolor inmenso, de un lado. Algunos médicos y científicos han descrito el dolor que resulta de las cefaleas en racimo como el dolor más intenso que un humano puede soportar - peor que dar a luz, quemaduras o huesos rotos. Las cefaleas en racimo a menudo se dan periódicamente: remisiones espontáneas interrumpen los periodos activos de dolor. La edad promedio del comienzo de la cefalea en racimo es ~30-50 años. Es más prevalente en hombres con una relación de hombres a mujeres que varía de 2,5:1 o 3,5:1. La estimulación de SPG se ha usado para el tratamiento de la cefalea en racimo. Lo más recientemente, Autonomic Technologies ha desarrollado el sistema de neuroestimulación ATI™ para distribuir estimulación eléctrica de bajo nivel (aunque alta frecuencia, de bloqueo fisiológico) para proporcionar terapia de estimulación de SPG aguda con la intención de aliviar el dolor debilitante agudo de la cefalea en racimo. Se ha demostrado una fuerte eficacia en su reciente ensayo clínico (NCT01616511; Schoenen J, et al., “Stimulation of the sphenopalatine ganglion (SPG) for cluster headache treatment. Pathway CH-1: A randomized, sham-controlled study.”, Cephalalgia. 2013; 33(10):816-30. En vista de lo anterior y debido a que PACAP es uno de los principales neurotransmisores en SPG, un antagonista del receptor de PAC1 tal como un anticuerpo anti-PAC1 descrito en la presente memoria se espera que tenga eficacia para tratar la cefalea en racimo en humanos.

Métodos diagnósticos

Los anticuerpos descritos en la presente memoria pueden usarse por propósitos diagnósticos para detectar, diagnosticar, o monitorizar enfermedades y/o condiciones asociadas con PAC1. También se describen métodos para la detección de la presencia de PAC1 en una muestra usando métodos inmunohistológicos clásicos conocidos por los expertos en la técnica (p.ej., Tijssen, 1993, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, Vol. 15 (Eds R.H. Burdon y P.H. van Knippenberg, Elsevier, Ámsterdam); Zola, 1987, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, págs. 147-158 (CRC Press, Inc.); Jalkanen et al., 1985, J. Cell. Biol. 101:976-985; Jalkanen et al., 1987, J. Cell Biol.

105:3087-3096). La detección de PAC1 puede realizarse in vivo o in vitro.

Las aplicaciones diagnósticas descritas en la presente memoria incluyen el uso de los anticuerpos para detectar la expresión de PAC1 y la unión de los ligandos a PAC1. Ejemplos de métodos útiles en la detección de la presencia de PAC1 incluyen inmunoensayos, tal como el ensayo inmunosorbente unido a enzima (ELISA) y el radioinmunoensayo (RIA).

Para aplicaciones diagnósticas, el anticuerpo típicamente se marcará con un grupo de marcaje detectable. Los grupos de marcaje adecuados incluyen, aunque no están limitados a, los siguientes: radioisótopos o radionúclidos (p.ej., 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), grupos fluorescentes (p.ej., FITC, rodamina, fósforos con base de lantánidos), grupos enzimáticos (p.ej., peroxidasa de rábano picante, p-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), grupos quimioluminiscentes, grupos biotinilo, o epítopos de polipéptido predeterminados reconocidos por un indicador secundario (p.ej., secuencias de pares de cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metal, etiquetas de epítopo). El grupo de marcaje puede acoplarse al anticuerpo por medio de brazos espaciadores de diversas longitudes para reducir el impedimento estérico potencial. Se conocen y puede usarse diversos métodos para marcar proteínas en la técnica.

En otro aspecto, un anticuerpo puede usarse para identificar una célula o células que expresan PAC1. El anticuerpo puede marcarse con un grupo de marcaje y se detecta la unión del anticuerpo marcado a PAC1. En un aspecto más específico, la unión del anticuerpo a PAC1 se detecta in vivo. En un aspecto más específico, el anticuerpo PAC1 se aísla y se mide usando técnicas conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Nueva York: Cold Spring Harbor (ed. 1991 y suplementos periódicos); John E. Coligan, ed., 1993, Current Protocols In Immunology Nueva York: John Wiley & Sons.

Otro aspecto se proporciona para detectar la presencia de una molécula de prueba que compite por la unión a PAC1 con los anticuerpos descritos. Un ejemplo de uno de dichos ensayos implicaría detectar la cantidad de anticuerpo libre en una disolución que contiene una cantidad de PAC1 en presencia o ausencia de la molécula de prueba. Un aumento en la cantidad de anticuerpo libre (es decir, el anticuerpo no unido a PAC1) indicaría que la molécula de prueba es capaz de competir por la unión a PAC1 con el anticuerpo. En una realización, el anticuerpo se marca con un grupo de marcaje. De forma alternativa, la molécula de prueba se marca y la cantidad de molécula de prueba libre se monitoriza en presencia y ausencia de un anticuerpo.

Métodos de tratamiento: formulaciones farmacéuticas, rutas de administración

También se describen métodos de uso de los anticuerpos. En algunos métodos, un anticuerpo se proporciona a un paciente. El anticuerpo inhibe la unión de PACAP a PAC1 humano.

Se describen también composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o una pluralidad de anticuerpos y un diluyente, transporte, solubilizante, emulgente, conservante y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable. Además, se incluyen métodos de tratamiento de un paciente, p.ej., para migraña, administrando dicha composición farmacéutica. El término “paciente” incluye pacientes humanos.

Los materiales de formulación aceptables son no tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas. En aspectos específicos, se describen composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de anticuerpos PAC1 humanos.

En ciertos aspectos, los materiales de formulación aceptables son preferiblemente no tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas. En ciertos aspectos, la composición farmacéutica puede contener materiales de formulación para modificar, mantener o conservar, por ejemplo, el pH, osmolaridad, viscosidad, claridad, color, isotonicidad, olor, esterilidad, estabilidad, velocidad de disolución o liberación, adsorción o penetración de la composición. Los materiales de formulación adecuados incluyen, aunque no están limitados a, aminoácidos (tal como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina); antimicrobianos; antioxidantes (tal como ácido ascórbico, sulfito sódico o sulfito de hidrógeno y sodio); tampones (tal como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos u otros ácidos orgánicos); agentes espesantes (tal como manitol o glicina); agentes quelantes (tal como ácido etilendiaminatetraacético (EDTA)); agentes complejantes (tal como cafeína, polivinilpirrolidona, betaciclodextrina o hidroxipropil-beta-ciclodextrina); cargas; monosacáridos; disacáridos; y otros carbohidratos (tal como glucosa, manosa o dextrinas); proteínas (tal como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas); agentes colorantes, saborizantes y diluyentes; agentes emulgentes; polímeros hidrófilos (tal como polivinilpirrolidona); polipéptidos de bajo peso molecular; contraiones formadores de sales (tal como sodio); conservantes (tal como cloruro de benzalconio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, alcohol de fenetilo, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico o peróxido de hidrógeno); disolventes (tal como glicerina, propilenglicol o polietilenglicol); alcoholes de azúcar (tal como manitol o sorbitol); agentes de suspensión; tensioactivos o agentes humectantes (tal como plurónicos, PEG, ésteres de sorbitano, polisorbatos tal como polisorbato 20, polisorbato, tritón, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal); agentes potenciadores de la estabilidad (tal como sacarosa o sorbitol); agentes potenciadores de la tonicidad (tal como haluros de metal alcalino, preferiblemente cloruro de sodio o potasio, manitol sorbitol); vehículos de distribución; diluyentes; excipientes y/o adyuvantes farmacéuticos. Véase, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18’’ Edición, (A.R. Genrmo, ed.), 1990, Mack Publishing Company.

En ciertas realizaciones, la composición farmacéutica óptima se determinará por un experto en la técnica dependiendo de, por ejemplo, la ruta prevista de administración, formato de distribución y dosificación deseada. Véase, por ejemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences, supra. En ciertas realizaciones, dichas composiciones pueden influir en el estado físico, estabilidad, velocidad de liberación in vivo y velocidad de aclaramiento in vivo de los anticuerpos descritos. En ciertas realizaciones, el vehículo o transporte primario en una composición farmacéutica puede ser de naturaleza o acuosa o no acuosa. Por ejemplo, un vehículo o transporte puede ser agua para inyección, solución salina fisiológica o fluido cerebroespinal artificial, posiblemente suplementado con otros materiales normales en las composiciones para la administración parenteral. La solución salina tamponada neutra o solución salina mezclada con albúmina sérica son vehículos ejemplares adicionales. En realizaciones específicas, las composiciones farmacéuticas comprenden tampón Tris de aproximadamente pH 7,0-8,5, o tampón acetato de aproximadamente pH 4,0-5,5 y pueden incluir además sorbitol o un sustituto adecuado. Las composiciones de anticuerpo PACI humano pueden prepararse para el almacenaje mezclando la composición seleccionada que tiene el grado de pureza deseado con agentes de formulación opcionales (Remington’s Pharmaceutical Sciences, supra) en forma de una torta liofilizada o una disolución acuosa. Además, el anticuerpo PAC1 humano puede formularse como un liofilizado usando excipientes apropiados tales como sacarosa.

Las composiciones farmacéuticas pueden seleccionarse para distribución parenteral. De forma alternativa, las composiciones pueden seleccionarse para inhalación o para distribución a través del tracto digestivo, tal como de forma oral. La preparación de dichas composiciones farmacéuticamente aceptables está dentro de las competencias de la técnica.

Los componentes de formulación están presentes preferiblemente en concentraciones que son aceptables para el sitio de administración. Los tampones pueden usarse para mantener la composición a pH fisiológico o a un pH ligeramente inferior, típicamente en un intervalo de pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 8.

Cuando se contempla la administración parenteral, las composiciones terapéuticas pueden proporcionarse en forma de una disolución acuosa parenteralmente aceptable, libre de pirógenos, que comprende la proteína de unión a PAC1 humano deseada en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un vehículo particularmente adecuado para la inyección parenteral es agua destilada estéril en que el anticuerpo PAC1 humano se formula como una disolución isotónica, estéril, conservada de forma apropiada. La preparación puede implicar la formulación de la molécula deseada con un agente, tal como microesferas inyectables, partículas bio-erosionables, compuestos poliméricos (tal como poli(ácido láctico) o poli(ácido glucólico)), perlas o liposomas, que pueden proporcionar la liberación controlada o sostenida del producto que puede distribuirse por medio de inyección de depósito. También puede usarse ácido hialurónico, que tiene el efecto de promover la duración sostenida en la circulación. Pueden usarse dispositivos de distribución de fármaco implantables para introducir el anticuerpo deseado.

Ciertas composiciones farmacéuticas se formulan para inhalación. Los anticuerpos PAC1 humanos pueden formularse como un polvo seco inhalable. En aspectos específicos, las disoluciones de inhalación de anticuerpo PAC1 humano pueden formularse también con un propelente para la distribución en aerosol. En ciertos aspectos, las disoluciones pueden nebulizarse. La administración pulmonar y los métodos de formulación por lo tanto se describen adicionalmente en la Solicitud de Patente Internacional núm. PCT/US94/001875, que describe la distribución pulmonar de proteínas químicamente modificadas. Algunas formulaciones pueden administrarse de forma oral. Los anticuerpos PAC1 humanos que se administran de este modo pueden formularse con o sin transportes usados normalmente en la composición de formas de dosificación sólida tal como comprimidos y cápsulas. En ciertos aspectos, una cápsula puede diseñarse para liberar la parte activa de la formulación en el punto en el tracto gastrointestinal cuando la biodisponibilidad se maximiza y la degradación pre-sistémica se minimiza. Pueden incluirse agentes adicionales para facilitar la absorción del anticuerpo PAC1 humano. También pueden emplearse diluyentes, saborizantes, ceras de bajo punto de fusión, aceites vegetales, lubricantes, agentes de suspensión, agentes disgregantes del comprimido y aglutinantes.

Algunas composiciones farmacéuticas comprenden una cantidad efectiva de uno o una pluralidad de anticuerpos PAC1 humanos en una mezcla con excipientes no tóxicos que son adecuados para la fabricación de comprimidos. Disolviendo los comprimidos en agua estéril, u otro vehículo apropiado, las disoluciones pueden prepararse en forma de dosis unitaria. Los excipientes adecuados incluyen, aunque no están limitados a, diluyentes inertes, tal como carbonato de calcio, carbonato o bicarbonato sódico, lactosa o fosfato de calcio; o agentes aglutinantes, tal como almidón, gelatina o goma arábiga; o agentes lubricantes tal como estearato de magnesio, ácido esteárico o talco.

Composiciones farmacéuticas adicionales serán evidentes para los expertos en la técnica, que incluyen formulaciones que implican anticuerpos PAC1 humanos en formulaciones de distribución sostenida o controlada. Las técnicas para formular una variedad de otros medios de distribución sostenida o controlada, tal como transportes en liposoma, micropartículas bio-erosionables o perlas porosas e inyecciones de depósito, también se conocen por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, la Solicitud de Patente Internacional núm. PCT/US93/00829, que describe la liberación controlada de micropartículas poliméricas porosas para la distribución de composiciones farmacéuticas. Las preparaciones de liberación sostenida pueden incluir matrices poliméricas semipermeables en forma de artículos conformados, p.ej., películas o microcápsulas. Las matrices de liberación sostenida pueden incluir poliésteres, hidrogeles, polilactidas (como se describe en la Patente de EE.UU. núm. 3.773.919 y la Publicación de Solicitud de Patente Europea núm. EP 058481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma-etil-L-glutamato (Sidman et al., 1983, Biopolymers 2:547-556), poli(2-hidroxietil-inetacrilato) (Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 y Langer, 1982, Chem. Tech. 12:98-105), etilenovinilacetato (Langer et al., 1981, supra) o ácido poli-D(-)-3-hidroxibutírico (Publicación de Solicitud de Patente Europea núm. EP 133.988). Las composiciones de liberación sostenida pueden incluir además liposomas que pueden prepararse por cualquiera de varios métodos conocidos en la técnica. Véase, p.ej., Eppstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:3688-3692; Publicaciones de Solicitud de Patente Europea núms. EP 036.676; EP 088.046 y EP 143.949.

Las composiciones farmacéuticas usadas para la administración in vivo se proporcionan típicamente como preparaciones estériles. La esterilización puede conseguirse por filtración a través de membranas de filtración estériles. Cuando la composición se liofilia, la esterilización que usa este método puede realizarse o bien antes de o después de la liofilización y reconstitución. Las composiciones para la administración parenteral pueden almacenarse en forma liofilizada o en una disolución. Las composiciones parenterales generalmente se ponen en un contenedor que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa o vial de disolución intravenosa que tiene un tapón perforable mediante una aguja de inyección hipodérmica.

Las células que expresan un anticuerpo recombinante como se describen en la presente memoria pueden encapsularse para la distribución (véase, Invest. Ophthalmol Vis Sci 43:3292-3298, 2002 y Proc. Natl. Acad. Sciences 103:3896-3901,2006).

En ciertas formulaciones, un anticuerpo tiene una concentración de al menos 10 mg/ml, 20 mg/ml, 30 mg/ml, 40 mg/ml, 50 mg/ml, 60 mg/ml, 70 mg/ml, 80 mg/ml, 90 mg/ml, 100 mg/ml o 150 mg/ml. Algunas formulaciones contienen un tampón, sacarosa y polisorbato. Un ejemplo de una formulación es una que contiene 50-100 mg/ml de anticuerpo, acetato sódico 5-20 mM, 5-10% en p/v de sacarosa, y 0,002-0,008% en p/v de polisorbato. Ciertas formulaciones, por ejemplo, contienen 65-75 mg/ml de un anticuerpo en tampón de acetato sódico 9-11 mM, 8-10% en p/v de sacarosa y 0,005-0,006% en p/v de polisorbato. El pH de ciertas de dichas formulaciones está en el intervalo de 4,5-6. Otras formulaciones tienen un pH de 5,0-5,5 (p.ej., pH de 5,0, 5,2 o 5,4).

Una vez que la composición farmacéutica se ha formulado, puede almacenarse en viales estériles como una disolución, suspensión, gel, emulsión, sólido, cristal, o como un polvo deshidratado o liofilizado. Dichas formulaciones pueden almacenarse o en una forma lista para usar o en una forma (p.ej., liofilizada) que se reconstituye antes de la administración. También se describen kits para producir una unidad de administración de dosis única. Ciertos kits contienen un primer contenedor que tiene una proteína seca y un segundo contenedor que tiene una formulación acuosa. En ciertos aspectos, se describen kits que contienen jeringas pre-llenas de cámara sencilla o múltiple (p.ej., jeringas líquidas y liojeringas). La cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que contiene anticuerpo PAC1 humano a emplear dependerá, por ejemplo, del contexto terapéutico y los objetivos. Un experto en la técnica apreciará que los niveles de dosificación apropiados para el tratamiento variarán dependiendo, en parte, de la molécula distribuida, la indicación para la que se está usando el anticuerpo PAC1 humano, la ruta de administración, y el tamaño (peso corporal, superficie corporal o tamaño del órgano) y/o condición (la edad y salud general) del paciente. En ciertos aspectos, el médico puede valorar la dosificación y modificar la ruta de administración para obtener el efecto terapéutico óptimo.

Una dosificación típica puede oscilar de aproximadamente 1 pg/kg hasta aproximadamente 30 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. La dosificación puede oscilar de 10 pg/kg hasta aproximadamente 30 mg/kg, opcionalmente de 0,1 mg/kg hasta aproximadamente 30 mg/kg, alternativamente de 0,3 mg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg. En algunas aplicaciones, la dosificación es de 0,5 mg/kg a 20 mg/kg. En algunos ejemplos, un anticuerpo se dosifica a 0,3 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg, 10 mg/kg o 20 mg/kg. El horario de dosificaciones en algunos regímenes de tratamiento es a una dosis de 0,3 mg/kg qW, 0,5 mg/kg qW, 1 mg/kg qW, 3 mg/kg qW, 10 mg/kg qW o 20 mg/kg qW.

La frecuencia de dosificación dependerá de los parámetros farmacocinéticos del anticuerpo PAC1 humano particular en la formulación usada. Típicamente, un médico administra la composición hasta que se alcanza una dosificación que consigue el efecto deseado. La composición puede por lo tanto administrarse como una dosis única, o como dos o más dosis (que pueden o no contener la misma cantidad de la molécula deseada) en el tiempo, o como una infusión continua por medio de un dispositivo de implantación o catéter. Las dosificaciones apropiadas pueden determinarse a través del uso de los datos de respuesta a la dosis apropiados. Los anticuerpos pueden administrarse a pacientes a lo largo de un extenso periodo de tiempo. La administración crónica de un anticuerpo minimiza la respuesta inmune o alérgica adversa asociada normalmente con anticuerpos que no son completamente humanos, por ejemplo un anticuerpo presentado contra un antígeno humano en un animal no humano, por ejemplo, un anticuerpo no completamente humano o anticuerpo no humano producido en una especie no humana.

La ruta de administración de la composición farmacéutica está de acuerdo con los métodos conocidos, p.ej., de forma oral, a través de inyección mediante rutas intravenosa, intraperitoneal, intracerebral (intra-parenquimal), intracerebroventricular, intramuscular, intra-ocular, intraarterial, intraportal, o intralesional; mediante sistemas de liberación sostenida o mediante dispositivos de implantación. Las composiciones pueden administrarse mediante inyección de bolo o de forma continua por infusión, o mediante un dispositivo de implantación.

La composición puede también administrarse de forma local por medio de la implantación de una membrana, esponja otro material apropiado en que la molécula deseada se ha absorbido o encapsulado. Donde se usa un dispositivo de implantación, el dispositivo puede implantarse en cualquier tejido u órgano adecuado, y la distribución de la molécula deseada puede ser por medio de difusión, bolo de liberación temporizada, o administración continua. También puede ser deseable usar composiciones farmacéuticas de anticuerpo PAC1 humano ex vivo. En dichos ejemplos, las células, tejidos u órganos que se han quitado del paciente se exponen a composiciones farmacéuticas de anticuerpo PAC1 humano después de lo cual las células, tejidos y/u órganos se implantan posteriormente de nuevo en el paciente.

En particular, los anticuerpos PAC1 humanos pueden distribuirse implantando ciertas células que se han diseñado genéticamente, usando métodos tales como los descritos en la presente memoria, para expresar y secretar el polipéptido. Dichas células pueden ser células animales o humanas, y pueden ser autólogas, heterólogas o xenogénicas. Las células pueden inmortalizarse. Para disminuir la posibilidad de una respuesta inmunológica, las células pueden encapsularse para evitar la infiltración de los tejidos circundantes. Los materiales de encapsulación pueden ser típicamente recintos o membranas poliméricas semipermeables, biocompatibles, que permiten la liberación del (de los) producto(s) de proteína pero evitan la destrucción de las células por el sistema inmune del paciente o por otros factores perjudiciales de los tejidos circundantes.

Los siguientes ejemplos, que incluyen los experimentos realizados y los resultados conseguidos, se proporcionan por propósitos ilustrativos solo y no se van a construir como limitantes del alcance de las reivindicaciones añadidas. Ejemplo 1

Anticuerpos PAC1

A. Generación de anticuerpos anti-PAC1

Se generaron anticuerpos completamente humanos a través de la inmunización de animales Xenomouse con la proteína de dominio extracelular de PAC1, ADN etiquetado con una etiqueta de epítopo de célula T, células L1.2 que expresan PAC1 humano de longitud completa, y otros antígenos hPAC1 usando métodos estándar, p.ej., sustancialmente como se detalla en la publicación de patente de EE.UU. US 2010-0172895 A1.

B. Cribado de anticuerpos anti-PAC1

Los sobrenadantes de hibridoma se cribaron para la unión a PAC1 y también para la actividad antagonista funcional en un ensayo que detecta su capacidad para bloquear la generación de cAMP mediante la activación de PAC1 con o PACAP (p.ej., PACAP-27 o PACAP-38) o un ligando peptídico exógeno, selectivo (Maxadilán), y después se contra­ cribaron frente a los receptores relacionados VPAC1 y VPAC2. Esos sobrenadantes con función y selectividad deseables se secuenciaron y clonaron, se expresaron de forma recombinante, se purificaron, y se probaron de nuevo para la función y selectividad usando métodos estándar, p.ej., sustancialmente como se detalla en la publicación de patente de EE.UU. US 2010-0172895 A1.

C. Selectividad de agonistas de PAC1

Se realizaron experimentos para evaluar la actividad y selectividad de tres agonistas de PAC1 (PACAP, VIP y Maxadilán) frente a los receptores relacionados PAC1, VPAC1 y VPAC2. Los datos de estos experimentos se muestran en la Tabla 7 posterior, y demuestran que PACAP tiene actividad agonista similar en los tres receptores, VIP tiene alguna actividad en PAC1 pero (~10-100x) mayor actividad en VPAC1 y VPAC2, y Maxadilán es altamente selectivo para PAC1 frente a VPAC1 y VPAC2.

Tabla 7. Receptores y agonistas de PACAP

Ejemplo 2

Actividad de anticuerpos monoclonales de bloqueo específico de PAC1 en ensayo funcional de cAMP

A. Actividad de anticuerpos anti-PAC1

Se cribaron anticuerpos hPAC1 seleccionados como se describe en la presente memoria en un ensayo de cAMP mediado por PAC1 in vitro para determinar la potencia intrínseca. El ensayo empleó SH-SY-5Y, una línea celular de neuroblastoma humano que expresa de forma endógena hPAC1 (Biedler, J.L., et al., 1978, “Multiple neurotransmitter synthesis by human neuroblastoma cell lines and clones”. Cancer Res. 38 (11 Pt 1):3751-7; Lutz, E.M., et al., “Characterization of novel splice variants of the PAC1 receptor in human neuroblastoma cells: consequences for signaling by VIP and PACAP.” Mol Cell Neurosci 2006; 31:193-209), y varias líneas celulares que expresan constructos PAC1, VPAC1 y VPAC2 recombinantes que tienen los siguientes números de acceso: PAC1 humano (hPAC1): NM_001118.4; hPAC1 corto (hPAC1 con los residuos de aminoácido 89-109 suprimidos (intervalo usado: 1-88, 110-468)): NM_001199637.1; PAC1 de cino: XM_005549858.1; PAC1 de rata: NM_133511.2; PAC1 de ratón: NM_001025372.2; VPAC1 humano (hVPAC1): NM_004624.3; VPAC2 humano (hVPAC2): NM_003382.4; VPAC2 de rata: NM_017238.1; VPAC2 de ratón: NM_009511.2.

Se cultivaron células SHSY-5Y en una mezcla 1:1 de medio esencial mínimo (MEM) (Invitrogen 11095-072) y mezcla de nutrientes F12 de Ham (Invitrogen 11765-047); suero bovino fetal al 10% (Invitrogen 10099-141), 1X de penicilina-estreptomicina-glutamina (Invitrogen 10378016), y 1X de aminoácidos no esenciales de MEM (Invitrogen 11140-050). Las células PAC1-CHO, PAC1 de rata y PAC1 de cino se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Gibco cat. núm. 11965), FBS dializado al 10% (Invitrogen 26400044), 1% de aminoácidos no esenciales de MEM (Invitrogen 11140-050); 1% de piruvato sódico (Invitrogen 11360070), 1% de glutamina/pen/estrep (Invitrogen 10378016). Las líneas celulares estables de CHO-Trex-rata y VPAC2R de ratón se cultivaron en medio basal: F12 (Invitrogen 11765-047), P/S/G: 1X (Invitrogen 10378016), FBS inactivado por calor: 10% (Invitrogen 10100147), Blasticidina: 5 ug/ml (Invitrogen R21001) e higromicina: 400 ug/ml (Invitrogen 10687010). Las células se indujeron con tetraciclina (Sigma 87128): 3,5 ug/ml, añadir 24 horas antes del ensayo. Las células hPAC1-CHO-K1 (Perkin-Elmer; ES-272-A) se cultivaron en F12 de Ham (Invitrogen 11765-047), FBS al 10% (Invitrogen 10099-141), Pen-Estrep: 1X (Invitrogen 15140122), 400 ug/ml de G418 (Existencias: 50 mg/ml => 8 ml/L de medio) (Invitrogen 10131027), 250 ug/ml de Zeocina (existencias: 100 mg/ml => 2,5 ml/L de medio) (Invitrogen R25005). Se cultivaron células VPAC1/CHO-CRE-BLA (Invitrogen; Agonista: VIP) en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Gibco cat. núm. 11965), FBS dializado: 10% (Invitrogen 26400044), NEAA: 1X (Invitrogen 11140-050), Pen/Estrep: 1X (Invitrogen 15140122), HEPES (pH 7,3): 25 mM (Invitrogen 15630130). Se cultivaron células VPAC2/CHO-CRE-BLA (Invitrogen; Agonista: VIP) como se describe anteriormente para las células VPAC1, con la adición de blasticidina: 5 ug/ml (Invitrogen R21001) y geneticina: 500 ug/ml (G418) (Invitrogen 10131027). Se cultivaron células SK-N-MC en MEM (Invitrogen 11095-072), FBS al 10% (Invitrogen 10099-141), 1X de NEAA (Invitrogen 11140-050), 1X de piruvato sódico (Invitrogen 11360070), 1X de glutamina/pen/estrep (Invitrogen 10378016). Se cultivaron células L6 en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Gibco cat. núm. 11965), suero bovino fetal al 10% (Gibco cat. núm. 10099-141), 1X de glutamina/pen/estrep (Gibco cat. núm.

10378-016).

Las células se cultivaron bajo las condiciones descritas anteriormente y se cosecharon al 80-90% de confluencia. Las células se disociaron con VERSENE (1:5000, Invitrogen, 15040-060) para las células SHSY5Y; con 0,05% de tripsina-EDTA (1X), rojo de fenol (Invitrogen, 25300054), y se centrifugaron después en una unidad GS-6R de Beckman a 1000 rpm durante 5 minutos a 4°C. Los granulados se suspendieron de nuevo con medio de congelación celular (Invitrogen, 12648010). Las células se contaron entonces usando un Contador de partículas Coulter Z1 y se ajustaron a la concentración deseada (5E6/ml o 2E6/ml), y se almacenaron alícuotas a -80°C o en nitrógeno líquido hasta el uso. Las concentraciones para las células PAC1, hVPAC1/2 CHO fueron 4K/10 gl; las demás a 2K/10 gl; para SKNMC y L6, la concentración fue 1K/10 gl.

El kit de ensayo de cAMP LANCE Ultra (PerkinElmer, Boston, MA) se usó en el cribado. Los ensayos se realizaron por triplicado en placas de 96 pocillos de la mitad de área Optiplates blancos (Costar 3642) en un volumen total de 40 gL. En pocas palabras, los viales de células congeladas se descongelaron incubando a 37°C en un baño de agua. Las células descongeladas se lavaron una vez con tampón de ensayo (F12, 0,1% de BSA, IBMX 1 mM) y la concentración celular se ajustó a 2K/10 gl. La suspensión celular se distribuyó en alícuotas de 10 gl en las 96 placas blancas de mitad de área. Cinco microlitros de antagonista (p.ej., un anticuerpo anti-PAC1 como se describe en la presente memoria) se añadieron después, y las muestras se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitación suave. Cinco microlitros de agonista (p.ej., PACAP38) se añadieron entonces, y las muestras se incubaron durante unos 15 minutos adicionales, de nuevo a temperatura ambiente, con agitación suave. Se añadieron entonces diez microlitros de 4X de disolución de trabajo indicadora de Eu-cAMP y diez microlitros de 4X de disolución de trabajo ULight-anti-cAMP y las muestras se incubaron unos 45 minutos adicionales a temperatura ambiente.

Las muestras se analizaron en un instrumento EnVision a Em665/615 nM. Los datos se procesaron mediante software GraphPad Prism versión 5/6 (GraphPad Inc., La Jolla, CA) para mostrar el POC (porcentaje de control) como una función de la concentración de anticuerpo anti-PAC1 antagonista probado, y se ajustaron con curvas de regresión no lineal estándar para dar los valores de CI50. El POC se calculó como sigue:

R espuesta de agonista con an tagon ista— respuesta reíubzrsm agonista yGutnaojiisti; POC = 100j;E?n665ríe--^ ^ ^ ^ ¿ ¿ -----R espuesta de agonista sm an tagon ista - respuesta ceííiínrsm agonista y an tagotnsta

Todos los anticuerpos descritos en la presente memoria y probados en el ensayo tuvieron actividad CI50 entre aproximadamente 0,1 nM y aproximadamente 200 nM; la mayoría tuvo actividad entre 0,1 nM y 100 nM. Se realizaron experimentos similares usando células recombinantes que expresaban PAC1 de cinomolgo y células de rata que expresaban PAC1 de rata como se describe anteriormente. La CI50 obtenida usando PAC1 humano y cinomolgo fueron similares, mientras que no pareció que los anticuerpos probados reaccionaran uniformemente bien con el PAC1 de rata. Además, las células que expresaban los receptores relacionados hVPAC1 (CRE-Bla-CHO-K1/ Invitrogen) y hVPAC2 (-Bla-CHO-K1/ Invitrogen) se usaron para evaluar adicionalmente la selectividad de los anticuerpos probados. Ninguno de los anticuerpos probados tuvo actividad inhibidora significativa frente a hVPAC1 o hVPAC2 sobre el intervalo probado (CI50 fue >10.000 nM en todos los casos). Los datos ejemplares se muestran en la Tabla 8, a continuación.

Tabla 8. Actividad CI50 de anticuerpos anti-PAC1 ejemplares en células que expresan receptores de PAC1, VPAC1 o VPAC2.

Las diferencias en CI50 entre los receptores de PACI humano y VPAC1 y VPAC2 humanos ilustra la alta selectividad de estos anticuerpos por el PAC1 sobre los receptores relacionados.

Ejemplo 3

Ensayos de unión a radioligando para la determinación de Ki de los anticuerpos bloqueantes del receptor

Los anticuerpos PAC-1 marcados con 125I (para el ensayo de unión a PAC1) o PEG-PACAP38 marcado con 125I (para el ensayo de unión a PACAP38), ambos obtenidos de Perkin Elmer (Billerica, MA), y las membranas celulares preparadas a partir de CHO AequoScreen hPAC-1 (PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Boston, Massachusetts) se usaron para los experimentos de unión a radioligando en presencia de diversas concentraciones de los anticuerpos de prueba para determinar los correspondientes valores Ki.

Preparación de la membrana celular

Se cultivaron células hasta confluencia en matraces 40xT225 en F12 de Ham, FBS al 10%, 100 pg/ml de estreptomicina, 400 p/ml de G418 (selección de expresión del receptor) y Zeocina (selección de expresión de Aequorina). Los matraces se lavaron 1x con PBS libre de Ca/Mg. El PBS se quitó completamente. Se añadieron 5 ml de VERSENE a cada matraz y se esperó aproximadamente 5 min. Los matraces se golpearon suavemente en el lateral y todas las células se sacaron. La suspensión de VERSENE/célula de todos los matraces se transfirieron a tubos cónicos de 50 ml y se pusieron en hielo. Para recoger cualquier célula que quedara, los matraces se enjuagaron con PBS frío con hielo, sin Ca/Mg, con inhibidores de proteasa y la disolución se añadió a las células en los tubos. Los tubos se rotaron a 1000 rpm durante 10 min. Los granulados se almacenaron a -80°C.

El día de la preparación de la membrana, los granulados celulares se pesaron y se disolvieron en hielo. Los granulados se suspendieron de nuevo en (10 ml/gramo de granulado) TrisHCl 10 mM, pH 7,4, EDTA 1 mM, inhibidores de proteasa Roche (1 comprimido/50 ml) y se homogeneizaron mediante 30 golpes con el homogeneizador dounce motorizado. Los homogeneizados celulares se centrifugaron a 2500 rpm (~1000g) durante 10 min a 4°C. Los sobrenadantes se transfirieron a un tubo centrífugo de Beckman y se mantuvieron en hielo. Los granulados se homogeneizaron de nuevo con 15 ml del tampón y la etapa de rotación se repitió. Ambos sobrenadantes se combinaron y se centrifugaron a 48.400g durante 30 min. Los granulados se suspendieron de nuevo en 15 ml de tampón y se atravesaron por una jeringa de 18G para romper el granulado. Los granulados se homogeneizaron mediante 20 golpes y se centrifugaron a 48.400g durante 30 min. Los granulados se suspendieron de nuevo en ~6 ml de tampón de unión a PACAP sin BSA (Tris HCl 20 mM, MgSO4 5 mM Inhibidores de proteasa). Los granulados se suspendieron de nuevo usando una jeringa de 18G, se homogeneizaron con homogeneizador dounce, se hicieron alícuotas y se almacenaron a -70°C. La concentración de proteína de membrana total se determinó con un ensayo de proteína BCA de microplaca (Pierce).

Ensayo de unión

El ensayo de unión a PAC1 se puso a temperatura ambiente en placas de 96 pocillos que contenían: 120 pl de tampón de unión (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, MgSO45,0 mM, NaCl 150 mM, BSA al 0,1% (Sigma), 1 comprimido de CompleteTM/50 ml de tampón (un inhibidor de proteasa)); 10 pl de compuesto de ensayo (20X); 50 pl de suspensión de membrana de CHO de PAC1 humano (0,2 pg por pocillo); y 20 pl de cualquier anticuerpo 125I-PAC-1 (10X; para el ensayo de unión a PAC1) o 125I-PEG-PACAP 38 (10X; para el ensayo de unión a PACAP38).

La unión no específica se determinó añadiendo 10 pl de (20X) PACAP 6-38 20 pM en las placas designadas. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas con agitación a 60 rpm, y después los contenidos de cada pocillo se filtraron sobre placas de filtro de 96 pocillos GF/C tratadas con polietilenimina (PEI) al 0,5% (durante al menos dos horas). Las placas de filtro GF/C se lavaron cinco veces con Tris 50 mM frío con hielo, pH 7,5 y se secaron en un horno a 55°C durante 1 hora. Los fondos de las placas GF/C se sellaron entonces. Se añadieron 40 pl de Microscint™ 20 a cada pocillo, las partes superiores de las placas GF/C se sellaron con TopSealTM-A (una película de sellado adhesivo de presión), y las placas GF/C se contaron con TopCount NXT (Packard). Los datos se analizaron usando Prizm (GraphPad Software Inc.).

Los datos ejemplares que muestran los valores Ki obtenidos como se describe anteriormente se muestran en la Tabla 9, a continuación. Los datos del ensayo de unión a PAC1 se muestran con los anticuerpos PAC-1 marcados con 125I indicados en diferentes columnas, y los anticuerpos de prueba como se muestran en diferentes filas. Las muestras de diferentes lotes de producción se trataron con algunos de los anticuerpos de prueba, como se muestra (01A, 26A, 39A). Los resultados indican que los anticuerpos anti-PAC1 probados que tienen actividad biológica en el ensayo de cAMP descrito en el Ejemplo 2 compiten con la unión de un agonista de PAC1 (PEG-PACAP38 marcado con 125I), y también compite con otro para el mismo epítopo o similar en hPAC1.

Tabla 9

Ejemplo 4

KD de unión medida por Kinexa

A. Experimentos que usan células enteras que expresan hPAC1.

La unión de anticuerpo anti-Pac1 con células CHOK1/huPac1 se probaron en KinExA. En pocas palabras, el Biosoporte UltraLink (Pierce cat. núm. 53110) se pre-recubrió con anti-huFc de cabra (Jackson Immuno Research cat. núm. 109-005-098) y se bloqueó con BSA. Se incubaron 10 pM, 30 pM, 100 pM y 300 pM de anticuerpo anti-Pac1 con diversa densidad (1,7x101-9x106 células/mL) de células CHOK1 que expresan huPac1 en medio F12 que contenía FBS al 1% y azida sódica al 0,05%. Las muestras que contenían anticuerpo anti-Pac1 y células completas se incubaron con rotación a temperatura ambiente durante 4 horas antes de la centrifugación a 220g de 5 minutos a 4°C para separar las células completas de los complejos de célula-anticuerpo anti-Pac1 del anticuerpo anti-Pac1 no unido. Los sobrenadantes que contenían anticuerpo anti-Pac1 libre se filtraron a través de un filtro de 0,22 gm antes de cargarlos en las perlas recubiertas con anti-huFc de cabra en KinExA. La cantidad de anticuerpo anti-Pac1 unido a la perla se cuantificó mediante anticuerpo anti-hulgG (H+L) marcado fluorescente (Alexa Flúor 647) (Jackson Immuno Research cat. núm. 109-605-088). La señal de unión es proporcional a la concentración de anticuerpo anti-Pac1 libre en disolución a cada densidad celular. La constante de disociación en equilibrio (KD) se estimó mediante el análisis de n-curva en software KinExATM Pro (Sapidyne Instruments, Inc., Boise, ID).

B. Experimentos usando el dominio extra-celular hPAC1 (ECD; hPAC1 1-135).

La unión de Abs anti-Pac1 con huPac1(1-135)::6xHis se probó en KinExA. En pocas palabras, el Biosoporte UltraLink (Thermo Fisher Scientific cat. núm. 53110) se pre-recubrió con huPac1 (1-135)::6xHis y se bloqueó con BSA como se describe anteriormente. Se incubaron 30, 100 y 300 pM de Ab con diversas concentraciones de huPac1 (1-135)::6xHis a temperatura ambiente durante al menos 8 horas antes de ensayar las perlas recubiertas con huPac1 (1-135)::6xHis. La cantidad del Ab unido a la perla se cuantificó mediante anticuerpo anti-huIgG de cabra (H+L) marcado fluorescente (DyLight 649) (Jackson Immuno Research cat. núm. 109-495-088). La señal de unión es proporcional a la concentración de Ab libre en el equilibrio de unión. La constante de disociación en equilibrio (KD) se obtuvo a partir de regresión no lineal de las curvas de competición usando un modelo de unión homogéneo de un sitio (software KinExATM Pro).

Un compendio de las constantes de disociación en equilibrio para las muestras probadas que se unen con célula CHOK1/huPac1 y huPac1 (1-135)::6xHis se muestran en la Tabla 10, a continuación (promedio seguido por (intervalo)).

Tabla 10

Ejemplo 5

Ensayo de fagocitosis de plaquetas

Para abordar cualquier disminución de plaquetas inducida por el receptor Fc gamma potencial, un subconjunto de los anticuerpos descritos en la presente memoria se probó en un Ensayo de fagocitosis.

A. Preparación de leucocitos de sangre periférica (PBL) y plaquetas

Se prepararon plaquetas tanto humanas como cinomolgas como se describe anteriormente (Semple, J.W. et al., Blood (2007) 109:4803-4805). En resumen, se centrifugaron muestras de sangre completa de donantes cinomolgos sanos a 170 x g durante 15 minutos sin frenar. El plasma rico en plaquetas (PRP) se recogió de la capa superior. Las capas del fondo de la muestra se centrifugaron a 2000 x g durante 10 minutos para obtener la capa de plasma pobre en plaquetas (PPP) y la capa leucoplaquetaria. Las plaquetas en la fracción PRP se marcaron con Cell Tracker Green CMFDA 20 pM durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las plaquetas marcadas se lavaron con PBS, se suspendieron de nuevo en RPMI-1640 con FBS al 10%, y se ajustaron a una concentración de 1 x 108 células/mL. Se prepararon PBL a partir de la capa leucoplaquetaria obtenida del mismo donante. Los eritrocitos se lisaron con BD Pharm-lyse siguiendo el protocolo proporcionado por el vendedor. Después de lisar, los PBL se lavaron dos veces con RPMI-1640 con FBS al 10% y la concentración final se ajustó a 5x106 células/ml.

B. Ensayo de fagocitosis

La reacción de fagocitosis se inició incubando 100 pL de cada una de las plaquetas marcadas con CMFDA y PBMC con artículos de prueba en la oscuridad. Después de seis horas de incubación, la reacción se paró poniendo las placas en hielo. La fluorescencia extracelular se desactivó incubando 2 minutos con azul de tripano al 0,1%. Después de lavar dos veces con PBS frío con hielo, las células se incubaron con yoduro de propidio y anti-CD14 durante 30 minutos a 4°C. Después de lavar, las células se analizaron mediante un Citómetro de flujo BD LSRII (Figura 2). En base a las experiencias anteriores, los monocitos que fagocitan plaquetas tienen valores de intensidad de fluorescencia media de CMFDA de al menos 2 veces o más que los controles negativos (o a-SA o a-DNP) (2). Los datos ejemplares se muestran en la Tabla 11, a continuación. Los resultados muestran que ninguna de las variantes de IgG1 aglucosiladas probadas (anticuerpos que terminan con “B” o “C”, aunque solo los “B” se probaron en este estudio) activaron las plaquetas en la sangre completa humana o cinomolga cuando se probaron a concentraciones de anticuerpo hasta 14 mg/mL. De forma similar no se vio efecto en la fagocitosis de plaquetas in vitro hasta e incluyendo la mayor concentración probada (3 mg/ml). No se notó activación neutrófila in vitro en ninguna concentración probada.

Tabla 11

Claims (21)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente al receptor tipo I del polipéptido de activación de la adenilato ciclasa de la pituitaria humana (PAC1), que comprende una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada, en el que:

(a) la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de SEQ ID NO:153 y la región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de SEQ ID NO:174;

(b) la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de SEQ ID NO:156 y la región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de SEQ ID NO:174; o

(c) la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de SEQ ID NO:153 y la región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de SEQ ID NO:182.

2. El anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo según la reivindicación 1, en el que la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de SEQ ID NO:153 y la región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de SEQ ID NO:182.

3. El anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo según la reivindicación 1, en el que la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de SEQ ID NO:153 y la región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de SEQ ID NO:174.

4. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno del mismo según la reivindicación 1, en el que la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de SEQ ID NO:156 y la región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de SEQ ID NO:174.

5. El anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo comprende:

(a) una cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO:79 y una cadena pesada que comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID NOs:107-109 y 131-133; o

(b) una cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO:82 y una cadena pesada que comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID NOs:107-109.

6. El anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo según la reivindicación 5, en el que el anticuerpo comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO:79 y una cadena pesada que comprende la secuencia se SEQ ID NO:131.

7. El anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo según la reivindicación 5, en el que el anticuerpo comprende una cadena ligera que comprende la secuencia se SEQ ID NO:79 y una cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO:132.

8. El anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo según la reivindicación 5, en el que el anticuerpo comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO:79 y una cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO:133.

9. El anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo monoclonal, un fragmento Fab, un fragmento Fab’, un fragmento F(ab’)2, un fragmento Fv, un diacuerpo y un anticuerpo monocatenario.

10. El anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo según la reivindicación 9, en el que el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal completamente humano.

11. El anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo según la reivindicación 9, en el que el anticuerpo es un anticuerpo tipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, preferiblemente en el que el anticuerpo es un anticuerpo IgG1 aglucosilado.

12. El anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo según la reivindicación 11, en el que el anticuerpo comprende una mutación en la posición N297 en su cadena pesada, preferiblemente una mutación N297G en su cadena pesada.

13. El anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo según la reivindicación 12, en el que el anticuerpo comprende además las mutaciones R292C y V302C en su cadena pesada.

14. Un polinucleótido aislado que codifica un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.

15. Un vector de expresión que comprende el polinucleótido según la reivindicación 14.

16. Una línea celular transformada con el vector de expresión según la reivindicación 15.

17. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

18. Un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para usar en el tratamiento de cefalea en un paciente.

19. El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo para usar según la reivindicación 18, en el que la cefalea es migraña o cefalea en racimo.

20. El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo para usar según la reivindicación 19, en el que la migraña es migraña episódica o migraña crónica.

21. El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo para usar según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, en el que el uso comprende el tratamiento profiláctico.