TWI636064B - 人類ｐａｃ１抗體 - Google Patents

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Abstract

本發明提供與人類PAC1結合之抗體及其抗原結合片段。亦提供編碼該等抗體及其抗原結合片段之核酸、載體及編碼其之細胞。該等抗體及其抗原結合片段可抑制PAC1與PACAP結合，且適用於多種PAC1相關病症，包括治療及/或預防包括偏頭痛及叢集性頭痛在內之頭痛病症。

Description

人類PAC1抗體 優先權
本申請案主張2013年3月15日申請之美國臨時申請案第61/792,678號之優先權益，其全文以引用的方式併入本文中。
序列表參考
本申請案含有序列表，該序列表已以ASCII格式以電子方式提交且其全文以引用的方式併入本文中。該ASCII複本於2014年3月12日創建，名為A-1804-PCT_SL.txt且為461,614位元組大小。
存在大量未滿足的有效治療，尤其預防治療偏頭痛之需要。來自多項研究之結果表明在美國約一千四百萬偏頭痛患者可證明有效及安全的預防性治療為合格的及受益於該治療。目前審批通過之偏頭痛預防治療僅為部分有效且具有明顯限制此等藥物之可接受性之相當大的副作用特徵。儘管此等限制，但在美國四百五十萬患有頻繁偏頭痛的個人針對其偏頭痛服用預防藥物。
垂體腺苷酸環化酶活化多肽(PACAP)為基於其刺激cAMP在前垂體細胞中形成之能力，首次自綿羊下丘腦提取物分離的38-胺基酸(PACAP38)或27-胺基酸(PACAP27)肽(Miyata A,Arimura A,Dahl RR等人Isolation of a novel 38 residue-hypothalamic polypeptide which stimulates adenylate cyclase in pituitary cells.Biochem Biophys Res Commun.1989；164：567-574；Miyata A,Jiang L,Dahl RD等人 Isolation of a neuropeptide corresponding to the N-terminal 27 residues of the pituitary adenylate cyclase activating polypeptide with 38 residues(PACAP38).Biochem Biophys Res Commun.1990；170：643-648)。PACAP肽屬於血管活性腸多肽VIP-胰泌素激素-釋放激素(GHRH)-升糖素總科，其具有與血管活性腸多肽(VIP)共有68%一致性之人類PACAP27序列(Campbell RM及Scanes CG.Evolution of the growth hormone-releasing factor(GRF)family of peptides.Growth Regul.1992；2：175-191)。PACAP肽在人體中之主要形式為PACAP38且PACAP38及PACAP27之藥理學尚未展示彼此不同。本文除非另外指明，否則PACAP或PACAP38將用於表示PACAP38，及PACAP27將用於指定PACAP27。
已報導三種PACAP受體：一種以高親和性結合PACAP且對VIP具有低得多的親和性(PAC1受體。或簡言之「PAC1」)。及兩種基本上同樣很好識別PACAP及VIP(VPAC1及VPAC2受體，或分別簡言之「VPAC1」或「VPAC2」)(Vaudry D,Falluel-Morel A,Bourgault S等人Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide and its receptors：20 years after the discovery.Pharmacol Rev.2009；9月61(3)：283-357)。
PACAP能夠以類似效能結合所有三種受體(PAC1、VPAC1、VPAC2)且由此為非特別選擇的。另一方面，VIP以明顯較高親和性結合VPAC1及VPAC2，如與PAC1相比。Maxadilan，一種最初自白蛉分離的65胺基酸肽(Lerner E.A等人，「Isolation of maxadilan,a potent vasodilatory peptide from the salivary glands of the sand fly Lutzomyia longipalpis」,J Biol Chem.1991年6月15日；266(17))11234-6；Lerner E.A等人，「Maxadilan,a PAC1 receptor agonist from sand flies」,Peptides.2007年9月；28(9)：1651-1654)相比於VPAC1或VPAC2，對PAC1具有精巧地選擇性，且可由此用作PAC1選擇性促效劑。
在一個態樣中，本發明包括特異地結合人類PAC1之分離抗體或其抗原結合片段，其包含：(A)輕鏈CDR1，其包含(i)選自由表4A中所陳述之LC CDR1序列組成之群的胺基酸序列、(ii)與選自由表4A中所陳述之LC CDR1序列組成之群的胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列或(iii)與選自由表4A中所陳述之LC CDR1序列組成之群的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；(B)輕鏈CDR2，其包含(i)選自由表4A中所陳述之LC CDR2序列組成之群的胺基酸序列、(ii)與選自由表4A中所陳述之LC CDR2序列組成之群的胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列或(iii)與選自由表4A中所陳述之LC CDR2序列組成之群的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；及(C)輕鏈CDR3，其包含(i)選自由表4A中所陳述之LC CDR3序列組成之群的胺基酸序列、(ii)與選自由表4A中所陳述之LC CDR3序列組成之群的胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列或(iii)與選自由表4A中所陳述之LC CDR3序列組成之群的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其中(A)抗體或其抗原結合片段與參考抗體競爭結合人類PAC1時之Ki值為10nM或小於10nM，該參考抗體選自由01B、14A、14B、26A、26B、28A、29A、29B、39A及39B組成之群；及(B)抗體或其抗原結合片段特異地結合人類PAC1。
在另一態樣中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其中(A)CDRL包含(i)選自由CDRL1-C1及CDRL1-C2組成之群的CDRL1、(ii)選自由CDRL2-C1、CDRL2-C2及CDRL2-C3組成之群的CDRL2及(iii)由CDRL3-C1組成的CDRL3；(B)CDRH包含(i)選自由CDRH1-C1及CDRH1-C2組成之群的CDRH1；(ii)選自由CDRH2-C1、CDRH2-C2及CDRH2-C3組成之群的CDRH2；及(iii)由CDRH3-C1組成的CDRH3及 (C)抗體或其抗原結合片段特異地結合人類PAC1。
在另一態樣中，本發明包括特異地結合人類PAC1之分離抗體或其抗原結合片段，其包含(A)重鏈CDR1，其包含(i)選自由表4B中所陳述之HC CDR1序列組成之群的胺基酸序列、(ii)與選自由表4B中所陳述之HC CDR1序列組成之群的胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列或(iii)與選自由表4B中所陳述之HC CDR1序列組成之群的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；(B)重鏈CDR2，其包含(i)選自由表4B中所陳述之HC CDR2序列組成之群的胺基酸序列、(ii)與選自由表4B中所陳述之HC CDR2序列組成之群的胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列或(iii)與選自由表4B中所陳述之HC CDR2序列組成之群的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；及(C)重鏈CDR3，其包含(i)選自由表4B中所陳述之HC CDR3序列組成之群的胺基酸序列、(ii)與選自由表4B中所陳述之HC CDR3序列組成之群的胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列或(iii)與選自由表4B中所陳述之HC CDR3序列組成之群的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明包括特異地結合人類PAC1之分離抗體或其抗原結合片段，其包含(i)重鏈CDR，CDR1、CDR2及CDR3，各具有如上所述相應重鏈CDR之序列及(ii)輕鏈CDR，CDR1、CDR2及CDR3，各具有如上所述相應重鏈CDR之序列。
在另一態樣中，本發明包括特異地結合人類PAC1之分離抗體或其抗原結合片段，其包含輕鏈可變區，其包含(i)選自由表3A中所陳述之VL AA序列組成之群的胺基酸序列、(ii)與選自由表3A中所陳述之VL AA序列組成之群的胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列或(iii)與選自由表3A中所陳述之VL AA序列組成之群的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
在一個實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含 重鏈CDR：CDRH1-8、CDRH2-2及CDRH3-3及輕鏈CDR：CDRL1-3、CDRL2-2、CDRL3-2。(01A)
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈CDR：CDRH1-8、CDRH2-2及CDRH3-3及輕鏈CDR：CDRL1-3、CDRL2-2、CDRL3-2。(01B)
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈CDR：CDRH1-11、CDRH2-5及CDRH3-9及輕鏈CDR：CDRL1-13、CDRL2-1、CDRL3-1。(02A)
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈CDR：CDRH1-1、CDRH2-4及CDRH3-6及輕鏈CDR：CDRL1-2、CDRL2-1、CDRL3-1。(04A)
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈CDR：CDRH1-1、CDRH2-4及CDRH3-6及輕鏈CDR：CDRL1-1、CDRL2-1、CDRL3-1。(05A)
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈CDR：CDRH1-1、CDRH2-4及CDRH3-6及輕鏈CDR：CDRL1-2、CDRL2-1、CDRL3-1。(07A)
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈CDR：CDRH1-3、CDRH2-5及CDRH3-5及輕鏈CDR：CDRL1-1、CDRL2-1、CDRL3-1。(28A)
在另一實施例中，本發明包括抗體或抗原結合片段。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈CDR：CDRH1-9、CDRH2-6及CDRH3-1及輕鏈CDR：CDRL1-4、CDRL2-3、CDRL3-3。(30A)
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈CDR：CDRH1-4、CDRH2-7及CDRH3-8及輕鏈CDR：CDRL1-6、 CDRL2-4、CDRL3-5。(32A)
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈CDR：CDRH1-10、CDRH2-1及CDRH3-7及輕鏈CDR：CDRL1-5、CDRL2-3、CDRL3-4。(35A)
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈CDR：CDRH1-6、CDRH2-8及CDRH3-2及輕鏈CDR：CDRL1-7、CDRL2-5、CDRL3-6。(36A)
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈CDR：CDRH1-7、CDRH2-3及CDRH3-4及輕鏈CDR：CDRL1-8、CDRL2-6、CDRL3-7。(37A)
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈CDR：CDRH1-2、CDRH2-8及CDRH3-2及輕鏈CDR：CDRL1-9、CDRL2-5、CDRL3-8。(38A)
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈CDR：CDRH1-6、CDRH2-8及CDRH3-2及輕鏈CDR：CDRL1-10、CDRL2-5、CDRL3-6。(39A)
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈CDR：CDRH1-6、CDRH2-8及CDRH3-2及輕鏈CDR：CDRL1-10、CDRL2-5、CDRL3-6。(39B)
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈CDR：CDRH1-6、CDRH2-8及CDRH3-2及輕鏈CDR：CDRL1-12、CDRL2-5、CDRL3-6。(40A)
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈CDR：CDRH1-5、CDRH2-8及CDRH3-2及輕鏈CDR：CDRL1-11、CDRL2-5、CDRL3-8。(41A)
在另一態樣中，本發明包括特異地結合人類PAC1之分離抗體或 其抗原結合片段，其包含選自由CDRH1-1、CDRH1-2、CDRH1-3、CDRH1-4、CDRH1-5、CDRH1-6、CDRH1-7、CDRH1-8、CDRH1-9、CDRH1-10及CDRH1-11組成之群的重鏈CDR1。
在另一態樣中，本發明包括特異地結合人類PAC1之分離抗體或其抗原結合片段，其包含選自由CDRH2-1、CDRH2-2、CDRH2-3、CDRH2-4、CDRH2-5、CDRH2-6、CDRH2-7及CDRH2-8組成之群的重鏈CDR2。
在另一態樣中，本發明包括特異地結合人類PAC1之分離抗體或其抗原結合片段，其包含選自由CDRH3-1、CDRH3-2、CDRH3-3、CDRH3-4、CDRH3-5、CDRH3-6、CDRH3-7、CDRH3-8及CDRH3-9組成之群的重鏈CDR3。
在另一態樣中，本發明包括特異地結合人類PAC1之分離抗體或其抗原結合片段，其包含選自由CDRL1-1、CDRL1-2、CDRL1-3、CDRL1-4、CDRL1-5、CDRL1-6、CDRL1-7、CDRL1-8、CDRL1-9、CDRL1-10、CDRL1-11、CDRL1-12及CDRL1-13組成之群的輕鏈CDR1。
在另一態樣中，本發明包括特異地結合人類PAC1之分離抗體或其抗原結合片段，其包含選自由CDRL2-1、CDRL2-2、CDRL2-3、CDRL2-4、CDRL2-5及CDRL2-6組成之群的輕鏈CDR2。
在另一態樣中，本發明包括特異地結合人類PAC1之分離抗體或其抗原結合片段，其包含選自由CDRL3-1、CDRL3-2、CDRL3-3、CDRL3-4、CDRL3-5、CDRL3-6、CDRL3-7及CDRL3-8組成之群的輕鏈CDR3。
在另一態樣中，本發明包括特異地結合人類PAC1之分離抗體或其抗原結合片段，其包含如上所述重鏈CDR1、如上所述重鏈CDR2、如上所述重鏈CDR3、如上所述輕鏈CDR1、如上所述輕鏈CDR2及如 上所述輕鏈CDR3。
在另一態樣中，本發明包括特異地結合人類PAC1之分離抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區，其包含(i)選自由表3B中所陳述之VH AA序列組成之群的胺基酸序列、(ii)與選自由表3B中所陳述之VH AA序列組成之群的胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列或(iii)與選自由表3B中所陳述之VH AA序列組成之群的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明包括特異地結合人類PAC1之分離抗體或其抗原結合片段，其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列的輕鏈可變區：輕鏈可變區胺基酸序列LV-01、LV-02、LV-03、LV-04、LV-05、LV-06、LV-07、LV-08、LV-09、LV-10、LV-11、LV-12、LV-13、LV-14、LV-15、LV-16、LV-17、LV-18、LV-19、LV-20及LV-21。
在另一態樣中，本發明包括特異地結合人類PAC1之分離抗體或其抗原結合片段，其包含(i)選自由表3A中所陳述之序列組成之群的序列，或(ii)與表3A中所陳述之序列中之一者至少90%相同的序列，或(iii)與表3A中所陳述之序列中之一者至少95%相同的序列。
在另一態樣中，本發明包括特異地結合人類PAC1之分離抗體或其抗原結合片段，其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列的重鏈可變區：重鏈可變區胺基酸序列HV-01、HV-02、HV-03、HV-04、HV-05、HV-06、HV-07、HV-08、HV-09、HV-10、HV-11、HV-12、HV-13、HV-14、HV-15、HV-16、HV-17、HV-18、HV-19、HV-20、HV-21、HV-22、HV-23、HV-24、HV-25及HV-26。
在另一態樣中，本發明包括特異地結合人類PAC1之分離抗體或其抗原結合片段，其包含(i)選自由表3B中所陳述之序列組成之群的序列，或(ii)與表3B中所陳述之序列中之一者至少90%相同的序列，或(iii)與表3B中所陳述之序列中之一者至少95%相同的序列。
在一個實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LV-01及HV-01(01A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LV-02及HV-02(02A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LV-03及HV-02(03A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LV-04及HV-03(04A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LV-05及HV-03(05A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LV-06及HV-03(06B)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LV-04及HV-04(07A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LV-04及HV-05(08A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LV-07及HV-04(09A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LV-07及HV-05(10A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LV-07及HV-03(11A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LV-04及HV-06(12A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LV-04及HV-06(12B)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LV-05及HV-05(13A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LV-08及HV-05(14A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LV-09及HV-05(15A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LV-05及HV-07(16A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LV-05及HV-08(17A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LV-09及HV-07(18A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LV-09及HV-08(19A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LV-09及HV-09(20A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LV-05及HV-09(21A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LV-05及HV-10(22A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LV-08及HV-10(23A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LV-05及HV-11(24A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LV-05及HV-12(25A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LV-05及HV-13(26A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LV-08及HV-13(27A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LV-10及HV-14(28A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LV-11及HV-14(29A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LV-12及HV-15(30A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LV-12及HV-16(31A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LV-13及HV-17(32A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LV-14及HV-18(33A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LV-14及HV-19(34A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LV-15及HV-20(35A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LV-16及HV-21(36A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LV-17及HV-22(37A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LV-18及HV-23(38A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LV-19及HV-24(39A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LV-19及HV-25(39B)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LV-20及HV-21(40A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LV-21及HV-26(41A)。
在另一態樣中，本發明包括視情況特異地結合人類PAC1之分離抗體或其抗原結合片段，其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列的輕鏈：輕鏈胺基酸序列LC-01、LC-02、LC-03、LC-04、LC-05、LC-06、LC-07、LC-08、LC-09、LC-10、LC-11、LC-12、LC-13、LC-14、LC-15、LC-16、LC-17、LC-18、LC-19、LC-20及LC-21。
在另一態樣中，本發明包括特異地結合人類PAC1之分離抗體或其抗原結合片段，其包含(i)選自由表2A中所陳述之序列組成之群的序列，或(ii)與表2A中所陳述之序列中之一者至少90%相同的序列，或(iii)與表2A中所陳述之序列中之一者至少95%相同的序列。
在另一態樣中，本發明包括視情況特異地結合人類PAC1之分離抗體或其抗原結合片段，其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列的重鏈：重鏈胺基酸序列HC-01、HC-02、HC-03、HC-04、HC-05、HC-06、HC-07、HC-08、HC-09、HC-10、HC-11、HC-12、HC-13、HC-14、HC-15、HC-16、HC-17、HC-18、HC-19、HC-20、HC-21、HC-22、HC-23、HC-24、HC-25、HC-26、HC-27、HC-28、HC-29、HC-30、HC-31、HC-32、HC-33、HC-34、HC-35、HC-36、HC-37、HC-38、HC-39、HC-40、HC-41、HC-42、HC-43、HC-44、HC-45、HC-46、HC-47、HC-48、HC-49、HC-50、HC-51、HC-52及HC-53。
在一個實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-01及HC-01(01A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-01及HC-02(01B)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-02及HC-03(02A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-02及HC-04(02B)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-02及HC-05(02C)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-03及HC-03(03A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-04及HC-06(04A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-04及HC-07(04B)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-04及HC-08(04C)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-05及HC-06(05A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-05及HC-07(05B)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-05及HC-08(05C)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-06及HC-06(06A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-06及HC-07(06B)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-06及HC-08(06C)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-04及HC-09(07A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-04及HC-10(07B)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-04及HC-11(07C)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-04及HC-12(08A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-04及HC-13(08B)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-04及HC-14(08C)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-07及HC-09(09A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-07及HC-10(09B)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-07及HC-11(09C)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-07及HC-12(10A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-07及HC-13(10B)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-07及HC-14(10C)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-07及HC-06(11A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-07及HC-07(11B)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-07及HC-08(11C)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-04及HC-15(12A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-04及HC-16(12B)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-04及HC-17(12C)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-05及HC-12(13A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-05及HC-13(13B)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-05及HC-14(13C)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-08及HC-12(14A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-08及HC-13(14B)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-08及HC-14(14C)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-09及HC-12(15A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-09及HC-13(15B)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-09及HC-14(15C)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-05及HC-18(16A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-05及HC-19(16B)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-05及HC-20(16C)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-05及HC-21(17A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-05及HC-22(17B)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-05及HC-23(17C)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-09及HC-18(18A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-09及HC-19(18B)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-09及HC-20(18C)。
在一個實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-09及HC-21(19A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-09及HC-22(19B)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-09及HC-23(19C)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-09及HC-24(20A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-09及HC-25(20B)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-09及HC-26(20C)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-05及HC-24(21A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-05及HC-25(21B)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-05及HC-26(21C)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-05及HC-27(22A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-05及HC-28(22B)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-05及HC-29(22C)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-08及HC-27(23A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-08及HC-28(23B)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-08及HC-29(23C)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-05及HC-30(24A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-05及HC-31(24B)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-05及HC-32(24C)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-05及HC-33(25A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-05及HC-34(25B)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-05及HC-35(25C)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-05及HC-36(26A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-05及HC-37(26B)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-05及HC-38(26C)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-08及HC-36(27A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-08及HC-37(27B)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-08及HC-38(27C)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-10及HC-39(28A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-10及HC-40(28B)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-10及HC-41(28C)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-11及HC-39(29A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-11及HC-40(29B)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-11及HC-41(29C)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-12及HC-42(30A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-12及HC-43(31A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-13及HC-44(32A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-14及HC-45(33A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-14及HC-46(34A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-15及HC-47(35A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-16及HC-48(36A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-17及HC-49(37A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-18及HC-50(38A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-19及HC-51(39A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-19及HC-52(39B)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-20及HC-48(40A)。
在另一實施例中，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包含LC-21及HC-53(41A)。
在另一態樣中，本發明包括特異地結合人類PAC1之分離抗體或其抗原結合片段，其包含(i)選自由表2A中所陳述之序列組成之群的序列，或(ii)與表2A中所陳述之序列中之一者至少90%相同的序列，或(iii)與表2A中所陳述之序列中之一者至少95%相同的序列。
在另一態樣中，本發明包括特異地結合人類PAC1之分離抗體或其抗原結合片段，其包含(i)選自由表2B中所陳述之序列組成之群的序列，或(ii)與表2B中所陳述之序列中之一者至少90%相同的序列，或(iii)與表2B中所陳述之序列中之一者至少95%相同的序列。
在另一態樣中，本發明包括特異地結合人類PAC1之分離抗體或其抗原結合片段，其包含(i)選自由表3A中所陳述之序列組成之群的序列，或(ii)與表3A中所陳述之序列中之一者至少90%相同的序列，或(iii)與表3A中所陳述之序列中之一者至少95%相同的序列。
在另一態樣中，本發明包括特異地結合人類PAC1之分離抗體或其抗原結合片段，其包含(i)選自由表3B中所陳述之序列組成之群的 序列，或(ii)與表3B中所陳述之序列中之一者至少90%相同的序列，或(iii)與表3B中所陳述之序列中之一者至少95%相同的序列。
在另一態樣中，本發明包括前述中之任一者之分離抗體或其抗原結合片段，其中抗體為多株抗體。
在另一態樣中，本發明包括上文中之任一者之分離抗體，其中分離抗體係選自由單株抗體、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、雙功能抗體及單鏈抗體組成之群。
在另一態樣中，本發明包括如上所述之分離抗體，其中分離抗體為選自由純人類抗體、人類化抗體及嵌合抗體組成之群。
在另一態樣中，本發明包括如上所述之分離抗體，其中抗體為IgG1型、IgG2型、IgG3型或IgG4型抗體。
在另一態樣中，本發明包括如上所述之分離抗體，其中抗體為去糖基化IgG1抗體。
在另一態樣中，本發明包括如上所述之分離抗體，其中去糖基化IgG1抗體包含在其重鏈中之N297位置處取代。
在另一態樣中，本發明包括如上所述之分離抗體，其中去糖基化IgG1抗體包含其重鏈中之N297G處取代。
在另一態樣中，本發明包括如上所述之分離抗體，其中去糖基化IgG1抗體包含其重鏈中之N297G、R292C及V302C處取代。
在另一態樣中，本發明包括如上所述之任何分離抗體，其中抗體相對於VPA1及VPAC2選擇性抑制hPAC1。
在另一態樣中，本發明包括如上所述之分離抗體，其中選擇性比大於100：1。
在另一態樣中，本發明包括如上所述之分離抗體，其中選擇性比大於1000：1。
在另一態樣中，本發明包括編碼如上所述之任何抗體的經分離 聚核苷酸。
在另一態樣中，本發明包括特異地結合人類PAC1之編碼抗體或其抗原結合片段的經分離核酸，其包含(i)選自由表1A中所陳述之序列組成之群的序列，或(ii)與表1A中所陳述之序列中之一者至少90%相同的序列，或(iii)與表1A中所陳述之序列中之一者至少95%相同的序列。
在另一態樣中，本發明包括特異地結合人類PAC1之編碼抗體或其抗原結合片段的經分離核酸，其包含(i)選自由表1B中所陳述之序列組成之群的序列，或(ii)與表1B中所陳述之序列中之一者至少90%相同的序列，或(iii)與表1B中所陳述之序列中之一者至少95%相同的序列。
在另一態樣中，本發明包括經分離聚核苷酸，其具有選自由表1A中所陳述之序列組成之群的核酸序列、(ii)與選自由表1A中所陳述之序列組成之群的核酸序列至少80%相同的核酸序列、(iii)與選自由表1A中所陳述之序列組成之群的核酸序列至少90%相同的核酸序列或(iv)與選自由表1A中所陳述之序列組成之群的核酸序列至少95%相同的核酸序列。
在另一態樣中，本發明包括經分離聚核苷酸，其具有選自由表1B中所陳述之序列組成之群的核酸序列、(ii)與選自由表1B中所陳述之序列組成之群的核酸序列至少80%相同的核酸序列、(iii)與選自由表1B中所陳述之序列組成之群的核酸序列至少90%相同的核酸序列或(iv)與選自由表1B中所陳述之序列組成之群的核酸序列至少95%相同的核酸序列。
在另一態樣中，本發明包括經分離聚核苷酸，其具有選自由表3A中所陳述之編碼可變區之核酸序列組成之群的核酸序列、(ii)與選自由表3A中所陳述之編碼可變區之核酸序列組成之群的核酸序列至 少80%相同的核酸序列、(iii)與選自由表3A中所陳述之編碼可變區之核酸序列組成之群的核酸序列至少90%相同的核酸序列或(iv)與選自由表3A中所陳述之編碼可變區之核酸序列組成之群的核酸序列至少95%相同的核酸序列。
在另一態樣中，本發明包括經分離聚核苷酸，其具有選自由表3B中所陳述之編碼可變區之核酸序列組成之群的核酸序列、(ii)與選自由表3B中所陳述之編碼可變區之核酸序列組成之群的核酸序列至少80%相同的核酸序列、(iii)與選自由表3B中所陳述之編碼可變區之核酸序列組成之群的核酸序列至少90%相同的核酸序列或(iv)與選自由表3B中所陳述之編碼可變區之核酸序列組成之群的核酸序列至少95%相同的核酸序列。
在另一態樣中，本發明包括如上所述之任何經分離核酸或聚核苷酸之表現載體。
在另一態樣中，本發明包括用如上所述之表現載體轉化之細胞株。
在另一態樣中，本發明包括製造如上所述之任何抗體或其抗原結合片段的方法，其包含自如上所述分泌抗體或其抗原結合片段之宿主細胞製備抗體其抗原結合片段。
在另一態樣中，本發明包括包含如上所述之任何抗體或其抗原結合片段之醫藥組合物及醫藥學上可接受之賦形劑。
在另一態樣中，本發明包括治療患者中與PAC1相關之病症的方法，其包含向患者投與有效量之如上所述之任何抗體或其抗原結合片段。
在另一態樣中，本發明包括如上所述之方法，其中病症為頭痛。
在另一態樣中，本發明包括如上所述之方法，其中病症為偏頭 痛。
在另一態樣中，本發明包括如上所述之方法，其中偏頭痛為間歇性偏頭痛。
在另一態樣中，本發明包括如上所述之方法，其中偏頭痛為慢性偏頭痛。
在另一態樣中，本發明包括如上所述之方法，其中病症為叢集性頭痛。
在另一態樣中，本發明包括如上所述之任何方法，其中方法包含預防治療。
圖1展示所選擇的抗hPAC1輕鏈CDR序列及所選擇的抗hPAC1輕鏈CDR共同序列：CDRL1-C1、CDRL1-C2、CDRL2-C1、CDRL2-C2、CDRL2-C3及CDRL3-C1。
圖2展示所選擇的抗hPAC1重鏈CDR序列及所選擇的抗hPAC1重鏈CDR共同序列：CDRH1-C1、CDRH1-C2、CDRH2-C1、CDRH2-C2、CDRH2-C3及CDRH3-C1。
本文使用之章節標題僅出於組織目的而不應被視為限制所述標的物。
除非本文另有定義，否則與本申請案結合使用之科學及技術術語將具有一般技術者通常理解之含義。此外，除非上下文另有需要，否則單數術語將包括複數且複數術語將包括單數。
通常，本文所述關於細胞及組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學及蛋白質與核酸化學及雜交使用之命名法及該等學科之技術為此項技術中所熟知及常用之命名法及技術。除非另有指示，否則通常根據此項技術中所熟知且如貫穿本說明書所引用及討論 之多種一般及較特定參考文獻中所述之習知方法來執行本申請案之方法及技術。參見例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Laboraty Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001)；Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates(1992)；及Harlow及Lane Antibodies：A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press，冷泉港，N.Y.(1990)，其以引用的方式併入本文中。酶促反應及純化技術根據製造商說明書如此項技術中通常實現或如本文中所述執行。本文所述之關於分析化學、合成有機化學及醫藥與藥物化學使用之術語及該等學科之實驗室程序及技術為此項技術中熟知及常用的。標準技術可用於化學合成、化學分析、醫藥製備、調配及傳遞以及治療患者。
應瞭解本發明不限於本文所描述之特定方法、方案及試劑等，且因而可變化。本文所用之術語僅出於描述特定實施例之目的，而並不意欲限制本發明之範疇，該範疇僅由申請專利範圍界定。
除在操作實例中或另外指示之地方外，本文中所用之表示成分之量或反應條件之所有數字應瞭解為在所有情況下均由術語「約」修飾。術語「約」當與百分比結合使用時意謂±1%。
定義
術語「聚核苷酸」或「核酸」包括單股核苷酸聚合物及雙股核苷酸聚合物二者。包含聚核苷酸之核苷酸可為核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸或任一類型之核苷酸之經修飾形式。
「經分離核酸分子」意謂基因組、mRNA、cDNA或合成來源之DNA或RNA或其某種組合，其不與在自然界中發現經分離聚核苷酸之聚核苷酸之全部或一部分結合，或其連接於其在自然界中不連接之聚核苷酸。出於本發明之目的，應瞭解「包含特定核苷酸序列之核酸分 子」不涵蓋完整染色體。除指定序列外，「包含」指定核酸序列之經分離核酸分子可包括多達10種或甚至多達20種其他蛋白質之編碼序列或其部分，或可包括控制所述核酸序列之編碼區表現的可操作地連接之調節序列及/或可包括載體序列。
除非另外規定，否則本文所論述之任何單股聚核苷酸序列之左手端為5'端；雙股聚核苷酸序列之左手方向稱為5'方向。初生RNA轉錄物之5'至3'添加方向稱為轉錄方向；DNA股上具有與RNA轉錄物相同之序列且相對於RNA轉錄物5'端為5'之序列區域稱為「上游序列」；DNA股上具有與RNA轉錄物相同之序列且相對於RNA轉錄物3'端為3'之序列區域稱為「下游序列」。
術語「控制序列」係指可影響其所連接之編碼序列之表現及加工的聚核苷酸序列。該等控制序列之性質可視宿主生物體而定。在特定實施例中，原核生物之控制序列可包括啟動子、核糖體結合位點及轉錄終止序列。舉例而言，真核生物之控制序列可包括啟動子，該等啟動子包含轉錄因子、轉錄強化子序列及轉錄終止序列之一個或複數個識別位點。「控制序列」可包括前導序列及/或融合搭配物序列。
術語「載體」意謂用於將編碼信息之蛋白質轉移至宿主細胞中之任何分子或實體(例如核酸、質體、噬菌體或病毒)。
術語「表現載體」或「表現構築體」係指適於轉化宿主細胞且含有引導及/或控制(連同宿主細胞一起)與其可操作地連接之一或多個異源編碼區之表現的核酸序列之載體。表現構築體可包括(但不限於)影響或控制轉錄、轉譯及(若存在內含子)影響可操作地連接於其之編碼區之RNA剪接的序列。
如本文所用，「可操作地連接」意謂該術語所應用之組分呈允許其在適合條件下執行其固有功能之關係。舉例而言，載體中「可操作地連接」至蛋白質編碼序列之控制序列與蛋白質編碼序列接合以便在 與控制序列之轉錄活性相容之條件下達成蛋白編碼序列之表現。
術語「宿主細胞」意謂已用或能夠用核酸序列轉化且藉此表現相關基因之細胞。該術語包括親本細胞之子代，而不管子代在形態或遺傳組成方面是否與原始親本細胞一致，只要存在相關基因即可。
術語「轉導」意謂基因通常藉由噬菌體自一個細菌轉移至另一個細菌。「轉導」亦係指藉由複製缺陷反轉錄病毒獲取及轉移真核細胞序列。
術語「轉染」意謂細胞攝取外來或外源DNA，且當外源DNA已引入細胞膜內時，細胞已經「轉染」。許多轉染技術在此項技術中熟知且揭示於本文中。參見例如Graham等人，1973,Virology 52：456；Sambrook等人，2001,Molecular Cloning：A Laboratory Manual，同前文獻；Davis等人，1986,Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier；Chu等人，1981,Gene 13：197。該等技術可用於將一或多個外源性DNA部分引入合適之宿主細胞中。
術語「轉化」係指細胞遺傳特徵之變化，且當細胞已經修飾而含有新DNA或RNA時，細胞已經轉化。舉例而言，當細胞經由轉染、轉導或其他技術引入新的遺傳物質而自其原生狀態經遺傳修飾時，細胞經轉化。在轉染或轉導後，可藉由將轉化DNA物理整合至細胞染色體中使其與細胞DNA重組，或轉化DNA可短暫維持游離元件形式而不複製，或可以質體形式獨立複製。當轉化DNA隨細胞分裂一起複製時，將細胞視為已經「穩定轉化」。
術語「多肽」或「蛋白質」在本文中可互換使用，且係指胺基酸殘基之聚合物。該等術語亦適用於一或多個胺基酸殘基為對應的天然存在胺基酸之類似物或模擬物之胺基酸聚合物，以及適用於天然存在之胺基酸聚合物。術語亦可涵蓋已經修飾(例如藉由添加醣類殘基以形成醣蛋白)或經磷酸化之胺基酸聚合物。多肽及蛋白可由天然存 在及非重組之細胞產生；或其係由基因工程改造或重組細胞產生，且包含具有天然蛋白質之胺基酸序列之分子或具有一或多個天然序列之胺基酸的缺失、添加及/或取代之分子。術語「多肽」及「蛋白質」特定地涵蓋抗體，例如抗PAC1抗體(亦稱PAC1抗體)、PAC1結合蛋白、抗體或具有抗原結合蛋白之一或多個胺基酸之缺失、添加及/或取代的序列。術語「多肽片段」係指相較於全長天然蛋白質，具有胺基端缺失、羧基端缺失及/或內部缺失之多肽。該等片段與全長蛋白質相比亦可含有經修飾之胺基酸。在某些實施例中，片段為約5至500個胺基酸長。舉例而言，片段可為至少5、6、8、10、14、20、50、70、100、110、150、200、250、300、350、400或450個胺基酸長。適用的多肽片段包括抗體之免疫功能性片段，包括結合域。在PAC1結合抗體之情況下，適用的片段包含(但不限於)CDR域、重鏈或輕鏈之可變域、抗體鏈之一部分或剛好其包括兩個CDR之可變域，及其類似區域。
術語「經分離蛋白質」(例如經分離抗體)、「經分離多肽」或「經分離抗體」意謂其將通常在不含大部分其他蛋白質之標的蛋白質、多肽或抗體中發現，且已與與其本質上相關之至少約50%之聚核苷酸、脂質、碳水化合物或其他材料分離。通常「經分離蛋白質」、「經分離多肽」或「經分離抗體」構成給定樣品之至少約5%、至少約10%、至少約25%或至少約50%。基因組DNA、cDNA、mRNA或合成來源之其他RNA或其任何組合均可編碼此類經分離蛋白質。較佳地，經分離蛋白質多肽或抗體實質上不含發現在其天然環境中將干擾其治療、診斷、預防、研究或其他用途之其他蛋白質或其他多肽或其他污染物。
術語「人類PAC1」、「人類PAC1」、「hPAC1」及「hPAC1」、「人類PAC1受體」、「人類PAC1受體」、「hPAC1受體」及「hPAC1受體」可互 換使用且係指人類垂體腺苷酸環化酶活化多肽I型受體。hPAC1為在UniProtKB/Swiss-Prot資料庫中指定為P41586(PACR_HUMAN)的含468個胺基酸之蛋白質且由ADCYAP1R1基因編碼。PACAP-27及PACAP-38為PAC1之主要內源性促效劑。除非另外規定或自使用該術語之上下文清楚，否則「PAC1」係指人類hPAC1。
多肽(例如抗原結合蛋白或抗體)之「變異體」包含以下胺基酸序列：其中相對於另一多肽序列，在該胺基酸序列中插入、缺失及/或取代有一或多個胺基酸殘基。變異體包括融合蛋白。
多肽之「衍生物」為已以與插入、缺失或取代變異體不同之某種方式(例如經由結合至另一化學部分)經化學修飾之多肽(例如抗原結合蛋白或抗體)。
如通篇說明書中與諸如多肽、核酸、宿主細胞及其類似物之生物物質結合使用之術語「天然存在」係指發現於自然界中之物質。
當解離常數(KD)為10-6M時，抗體或其抗原結合片段稱為「特異性結合」其標靶。當KD為1×10-8M時，抗體以「高親和性」特異性結合靶抗原。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段將以KD 5×10-7結合至PAC1或人類PAC1；在另一實施例中，抗體或其抗原結合片段將以KD 1×10-7結合；在另一實施例中，抗體或其抗原結合片段將以KD 5×10-8結合；在另一實施例中，抗體或其抗原結合片段將以KD 1×10-8結合；在另一實施例中，抗體或其抗原結合片段將以KD 5×10-9結合；在另一實施例中，抗體或其抗原結合片段將以KD 1×10-9結合；在另一實施例中，抗體或其抗原結合片段將以KD 5×10-10結合；在另一實施例中，抗體或其抗原結合片段將以KD 1×10-10結合。
當在特異性受體之抑制分析中抗體、其抗原結合片段或抗原結合蛋白之IC50比另一「參考」受體(例如hVPAC1或hVPAC2受體)之抑 制分析中之IC50小至少50倍時，該抗體、其抗原結合片段或抗原結合蛋白相對於其他受體「選擇性抑制」特異性受體。「選擇性比」為參考受體之IC50除以特異性受體之IC50的比值。IC50為達成50%抑制作用(對生物或生物化學功能)所需之劑量/濃度。對於放射性配位體，IC50為取代放射性配位體之50%特異性結合之競爭性配位體的濃度。EC50為誘發最大反應之50%反應所需的濃度或劑量。
Ki資料通常在競爭結合實驗之情形下產生，該等實驗通常藉由將放射性同位素(例如125I)連接至「促效劑」進行。實驗量測促效劑在遞增濃度之「拮抗劑」中之結合。Ki係指「拮抗劑」或測試化合物(例如測試抗PAC1抗體，若不存在放射性配位體則其將佔據50%之受體)之濃度。Ki可使用公式Ki=IC50/(1+([L]/Kd))計算，其中[L]為所使用之放射性配位體(例如標記125I之PAC-1抗體)的濃度且Kd為放射性配位體之解離常數。參見例如Keen M,MacDermot J(1993)Analysis of receptors by radioligand binding.In：Wharton J,Polak JM(編)Receptor autoradiography,principles and practice.Oxford University Press,Oxford。
「抗原結合區」意謂與特定抗原特異性結合之蛋白質或蛋白質的一部分。舉例而言，含有與抗原相互作用且賦予抗體其針對抗原之特異性及親和性之胺基酸殘基的抗體部分稱為「抗原結合區」。抗原結合區通常包括一或多個「互補結合區」(「CDR」)。某些抗原結合區亦包括一或多個「構架」區。「CDR」為促成抗原結合特異性及親和性之胺基酸序列。「構架」區可有助於維持CDR之適當構形以促進抗原結合區與抗原之間的結合。
在某些態樣中，提供結合PAC1蛋白或人類PAC1之重組抗體或其抗原結合片段。在此情形下，「重組蛋白」為使用重組技術(亦即經由表現如本文所述之重組核酸)製備之蛋白質。產生重組蛋白之方法及 技術在此項技術中為熟知的。
術語「抗體」係指任何同型之完整免疫球蛋白或其可與完整抗體競爭特異性結合至靶抗原之抗原結合片段，且包括例如嵌合抗體、人類化抗體、純人類抗體及雙特異性抗體或其抗原結合片段。因而，「抗體」為抗原結合蛋白物質。完整抗體通常將包含至少兩條全長重鏈及兩條全長輕鏈，但在一些情況下可包括較少的鏈，諸如駱駝中天然存在之抗體可僅包含重鏈。如下文進一步描述，抗體或其抗原結合片段可僅來源於單一來源或可為「嵌合」，即抗體之不同部分可來源於兩種不同抗體。抗原或其結合片段可在融合瘤中藉由重組DNA技術或藉由完整抗體之酶促或化學裂解來產生。除非另外指示，否則術語「抗體」除包含兩條全長重鏈及兩條全長輕鏈之抗體之外亦包括其衍生物、變異體、片段及其突變體，其實例在下文中描述。
術語「輕鏈」包括全長輕鏈及其具有足以賦予結合特異性之可變區序列之片段。全長輕鏈包括可變區域VL及恆定區域CL。輕鏈可變區域位於多肽之胺基端處。輕鏈包括κ鏈及λ鏈。
術語「重鏈」包括全長重鏈及其具有足以賦予結合特異性之可變區序列之片段。全長重鏈包括可變區結構域VH及三個恆定區結構域CH1、CH2及CH3。VH結構域位於多肽之胺基端，且CH結構域位於羧基端，其中CH3最靠近多肽之羧基端。重鏈可為任何同型，包括IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3及IgG4亞型)、IgA(包括IgA1及IgA2亞型)、IgM及IgE。在一個實施例中，重鏈為去糖基化IgG1，例如具有N297G突變之IgG1 HC。
術語「信號序列」、「前導序列」或「信號肽」係指引導蛋白質轉運之短的(長度為3-60個胺基酸)肽鏈。信號肽亦可稱為靶向信號、信號序列、轉運肽或定位信號。一些信號肽在蛋白質轉運之後由信號肽酶自蛋白質裂解，以使得蛋白質(例如如本文所述之抗體)之生物活 性形式為經裂解的較短形式。因此，諸如「包含重鏈......之抗體」、「包含輕鏈......之抗體」等(其中抗體之特徵為具有含有特定鑑別序列之重鏈及/或輕鏈)之術語理解為包括具有特異性鑑別序列之抗體、除了信號序列經不同信號序列替代外具有特異性鑑別序列之抗體以及具有減去任何信號序列之鑑別序列之抗體。
如本文所用，術語抗體或免疫球蛋白鏈(重鏈或輕鏈)之「抗原結合片段」(或簡言之「片段」)包含缺乏以全長鏈存在之至少一些胺基酸但能夠特異結合至抗原之抗體的一部分(不管如何獲得或合成該部分)。該等片段具有生物活性，由於其特異結合至靶抗原且可針對特異性結合至給定抗原決定基與其他抗體或其抗原結合片段競爭。在一個態樣中，此類片段將保留至少一個存在於全長輕鏈或重鏈中之CDR，且在一些實施例中將包含單一重鏈及/或輕鏈或其部分。此等生物活性片段可藉由重組DNA技術或可例如藉由完整抗體之酶促或化學斷裂產生。免疫功能性免疫球蛋白片段包括(但不限於)Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、結構域抗體及單鏈抗體，且可來源於任何哺乳動物來源，包含但(不限於)人類、小鼠、大鼠、駱駝或兔。進一步預期本文所揭示之抗體之功能性部分(例如一或多個CDR)可與第二蛋白或小分子共價結合以形成針對體內特定靶標、具有雙功能治療特性或具有延長之血清半衰期的治療劑。
「Fab片段」包含一條輕鏈及一條重鏈之CH1及可變區。Fab分子之重鏈不能與另一重鏈分子形成二硫鍵。
「Fc」區含有兩個包含抗體之CH1及CH2結構域的重鏈片段。兩個重鏈片段由兩個或兩個以上二硫鍵及CH3域之疏水性相互作用固持在一起。
「Fab'片段」含有一條輕鏈、及一條含有VH結構域及CH1結構域以及CH1結構域與CH2結構域之間的區域之重鏈的一部分，以便在兩 個Fab'片段之兩條重鏈之間可形成鏈間二硫鍵以形成F(ab')2分子。
「F(ab')2片段」含有兩條輕鏈、及兩條含有CH1結構域與CH2結構域之間的一部分恆定區的重鏈，以便在兩條重鏈之間形成鏈間二硫鍵。由此，F(ab')2片段由兩條重鏈之間的二硫鍵固持在一起的兩個Fab'片段構成。
「Fv區」包含來自重鏈與輕鏈兩者之可變區，但缺少恆定區。
「單鏈抗體」為重鏈可變區及輕鏈可變區已由可撓性連接子連接以形成單一多肽鏈之Fv分子，該單一多肽鏈形成抗原結合區。單鏈抗體詳細討論於國際專利申請公開案第WO 88/01649號及美國專利第4,946,778號及第5,260,203號中，其揭示內容以引用的方式併入本文中。
「結構域抗體」為僅含有重鏈可變區或輕鏈可變區之免疫功能性免疫球蛋白片段。在一些情況下，兩個或兩個以上VH區與肽連接子共價接合以產生二價結構域抗體。二價結構域抗體之兩個VH區可靶向相同或不同抗原。
「二價抗原結合蛋白」或「二價抗體」包含兩個抗原結合位點。在一些情況下，兩個結合位點具有相同抗原特異性。二價抗體可為雙特異性，參見下文。
「多特異性抗原結合蛋白」或「多特異性抗體」為靶向一種以上抗原或抗原決定基之抗原結合蛋白或抗體。
「雙特異性」、「雙重特異性」或「雙功能性」抗原結合蛋白或抗體分別為具有兩個不同抗原結合位點之雜交抗原結合蛋白或抗體。雙特異性抗體為多特異性抗原結合蛋白或多特異性抗體之物質且可藉由包括(但不限於)融合融合瘤或連接Fab'片段之多種方法產生。參見例如Songsivilai及Lachmann,1990,Clin.Exp.Immunol.79：315-321；Kostelny等人，1992,J.Immunol.148：1547-1553。雙特異性抗原結合蛋 白或抗體之兩個結合位點將與兩個不同的抗原決定基結合，該兩個不同的抗原決定基可存在於相同或不同蛋白標靶上。
術語「中和抗原結合蛋白」或「中和抗體」係指抗原結合蛋白或抗體分別與配位體結合，防止配位體與其結合搭配物結合及中斷另外將由配位體與其結合搭配物結合所產生之生物反應。在評定抗原結合蛋白(例如抗體或其免疫功能性抗原結合片段)之結合及特異性中，當過量之抗體使結合至配位體之結合搭配物的量降低至少約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或更多(如活體外競爭性結合分析所量測)時，抗體或片段將實質上抑制配位體與其結合搭配物結合。在PAC1結合蛋白之情況下，此類中和分子將使PAC1結合PACAP(例如PACAP-27或PACAP-38)之能力減少。
術語「抗原」或「免疫原」係指能夠藉由選擇性結合劑(諸如抗原結合蛋白(包括例如抗體或其免疫功能性抗原結合片段))結合及另外能夠用於動物以產生能夠與抗原結合之抗體之分子或一部分分子。抗原可具有一或多個能夠與不同抗體或其片段相互作用之抗原決定基。
術語「抗原決定基」為由抗原結合蛋白(例如抗體)結合之分子的部分。該術語包括能夠特異性結合抗原結合蛋白(諸如抗體或T細胞受體)之任何決定子。抗原決定基可為鄰接或非鄰接(例如胺基酸殘基在多肽序列中彼此不鄰接但在分子情形中藉由抗原結合蛋白結合)。在某些實施例中，抗原決定基由於其包含類似於用於產生抗體之抗原決定基之三維結構因此可模擬的，但其不包含或僅包含用於產生抗體之抗原決定基中所發現之胺基酸殘基中之一些。最通常，抗原決定基位於蛋白質上，但在一些情況下，可位於其他種類之分子(諸如核酸)上。抗原決定基決定子可包括分子之化學活性表面基團(chemically active surface grouping)，諸如胺基酸、糖側鏈、磷醯基或磺醯基，且 可具有特定三維結構特徵及/或荷質比特徵。通常，對特定靶抗原具有特異性之抗體將優先識別蛋白質及/或巨分子之複雜混合物中靶抗原上的抗原決定基。
術語「一致性」係指兩個或兩個以上多肽分子或兩個或兩個以上核酸分子之序列之間的關係，如藉由比對及比較序列所測定。「一致性百分比」意謂所比較分子中胺基酸或核苷酸之間相同殘基之百分比，且基於所比較之最小分子之尺寸來計算。對於此等計算，必須利用特定數學模型或電腦程式(亦即「演算法」)來處理對準中之空隙(若存在)。可用於計算所比對核酸或多肽之一致性的方法包括以下文獻中所述之方法：Computational Molecular Biology,(Lesk,A.M.編)，1988,New York：Oxford University Press；Biocomputing Informatics and Genome Projects,(Smith,D.W.編)，1993,New York：Academic Press；Computer Analysis of Sequence Data，第I，部分(Griffin,A.M.及Griffin,H.G.編)，1994,New Jersey：Humana Press；von Heinje,G.,1987,Sequence Analysis in Molecular Biology,New York：Academic Press；Sequence Analysis Primer,(Gribskov,M.及Devereux,J.編)，1991,New York：M.Stockton Press；及Carillo等人，1988,SIAM J.Applied Math.48：1073。
在計算一致性百分比時，以在序列之間得到最大匹配之方式比對所比較之序列。用於測定一致性百分比之電腦程式為包括GAP之GCG程式包(Devereux等人，1984,Nucl.Acid Res. 12：387；Genetics Computer Group,University of Wisconsin,Madison,WI)。使用電腦演算法GAP比對待測定序列一致性百分比之兩個多肽或聚核苷酸。將序列對準以獲得其各別胺基酸或核苷酸之最佳匹配(「匹配跨度」，如演算法所確定)。結合演算法使用空隙開放罰分(gap opening penalty)(其計算為3×平均對角線，其中「平均對角線」為所用比較矩陣之對角線 的平均值；「對角線」為由特定比較矩陣分配至各完美胺基酸匹配之評分或數值)；及空隙擴展罰分(gap extension penalty)(通常為1/10×空隙開放罰分)以及比較矩陣(諸如PAM 250或BLOSUM 62)。在某些實施例中，演算法亦使用標準比較矩陣(對於PAM 250比較矩陣，請參見Dayhoff等人，1978,Atlas of Protein Sequence and Structure 5：345-352；對於BLOSUM 62比較矩陣，請參見Henikoff等人，1992,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 89：10915-10919)。
使用GAP程式測定多肽或核苷酸序列之一致性百分比之推薦參數如下：演算法：Needleman等人，1970,J.Mol.Biol. 48：443-453；比較矩陣：BLOSUM 62，來自Henikoff等人，1992，同前文獻；空隙罰分：12(但無末端空隙罰分)
空隙長度罰分：4
相似性臨限值：0
用於比對兩個胺基酸序列之某些比對方案可能產生兩個序列僅較短區域的匹配，且此小比對區域可能具有極高序列一致性，即使在兩個全長序列之間不存在顯著關係。因此，若需要產生涵蓋靶多肽之至少50個鄰接胺基酸的比對，則可調整所選擇的比對方法(GAP程式)。
如本文所用，「實質上純」意謂所述分子物質為存在之主要物質，亦即以莫耳計，其含量大於同一混合物中之任何其他個別物質。在某些實施例中，實質上純的分子為目標物質佔所存在之所有巨分子物質的至少50%(以莫耳濃度計)之組合物。在其他實施例中，實質上純的組合物將佔存在於組合物中之所有巨分子物質的至少80%、85%、90%、95%或99%。在其他實施例中，目標物質種類經純化以達成基本均質性，其中藉由習知偵測方法不可偵測出組合物中有污染 性物質且由此組合物由單一可偵測之巨分子物質組成。
術語「治療」係指治療或改善損傷、病變或病症中之任何成功標誌，包括任何客觀或主觀參數，諸如症狀之減輕；緩解；消除或使得損傷、病變或病症對患者為較可耐受的；減緩退化或衰退速率；使得退化之終點為較少虛弱的；改良患者之身體或精神健康。治療或改善症狀可基於客觀或主觀參數；包括身體檢查、神經精神檢查及/或精神評估之結果。舉例而言，本文所呈現之某些方法成功地預防性或急性治療偏頭痛，進而降低偏頭痛之頻率、降低偏頭痛之嚴重度及/或改善與偏頭痛相關之症狀。
「有效量」通常為足以降低症狀之嚴重度及/或頻率、消除症狀及/或潛伏病因、防止症狀及/或其潛伏病因發生、及/或改良或改善由偏頭痛所致或與偏頭痛相關之損傷的量。在一些實施例中，有效量為治療有效量或預防有效量。「治療有效量」為足以補救疾病病況(例如偏頭痛)或症狀，特定言之與疾病病況相關之病況或症狀，或以其他方式預防、妨礙、扼止或逆轉疾病病況或以任何無論什麼方式與疾病相關之任何其他不合需要的症狀之發展的量。「預防有效量」為在投與個體時將具有預定預防作用，例如防止或延遲偏頭痛發作(或復發)或降低偏頭痛或偏頭痛症狀發作(或復發)之可能性之醫藥組合物的量。完全治療或預防作用在投與一個劑量時未必會發生，且可能僅在投與一系列劑量之後方發生。因此，治療或預防有效量可以一或多次投藥來投與。
「胺基酸」包括其在此項技術中之正常含義。二十種天然存在胺基酸及其縮寫遵循習知用法。參見Immunology-A Synthesis，第2版，(E.S.Golub及D.R.Green，編)，Sinauer Associates：Sunderland,Mass.(1991)，其出於任何目的以引用的方式併入本文中。二十種習知胺基酸之立體異構體(例如D-胺基酸)、非天然胺基酸(諸如α-,α-雙取代胺 基酸、N-烷基胺基酸)及其他非習知胺基酸亦可為多肽之適合組分且包括於片語「胺基酸」中。非習知胺基酸之實例包括：4-羥基脯胺酸、γ-羧基麩胺酸、ε-N,N,N-三甲基離胺酸、ε-N-乙醯基離胺酸、O-磷酸絲胺酸、N-乙醯基絲胺酸、N-甲醯基甲硫胺酸、3-甲基組胺酸、5-羥基離胺酸、σ-N-甲基精胺酸及其他類似胺基酸及亞胺基酸(例如4-羥基脯胺酸)。在本文中所使用之多肽符號中，根據標準用法及慣例，左手方向為胺基端方向及右手方向為羧基端方向。
疾病中之PAC1
存在於顱腦血管之血管周隙中之神經肽已表明為在偏頭痛發作期間疼痛輸入之重要介體。垂體腺苷酸環化酶活化多肽(PACAP)存在感覺三叉神經元於中且可調變神經系統之不同水準的傷痛刺激。人體實驗研究已展示PACAP38誘發頭痛及偏頭痛狀發作(Schytz等人，2009,「PACAP38 induces migraine-like attacks in patients with migraine without aura」,Brain：132第16至25頁)，此等研究支持PAC1受體拮抗劑可用於預防性及/或急性治療偏頭痛之觀點。
抗體
本文提供結合PAC1蛋白質(包括人類PAC1(hPAC1)蛋白質)之抗體。所提供之抗體為嵌入及/或接合一或多個如本文中所述之互補決定區(CDR)的多肽。在一些抗體中，CDR嵌入「構架」區域中，該構架區域取向於CDR以便達成CDR之適當抗原結合特性。一般而言，所提供之抗體可干擾、阻斷、降低或調變PAC1與其配位體(例如PACAP(諸如PACAP-38))之間的相互作用。
在某些實施例中，抗體包括(但不限於)單株抗體、雙特異性抗體、微型抗體、結構域抗體、合成抗體(在本文中有時稱作「抗體模擬物」)、嵌合抗體、人類化抗體、人源性抗體、抗體融合(在本文中有時稱作「抗體結合物」)及其片段。下文進一步描述各種結構。
本文提供之抗體已顯示與PAC1結合，特定言之為人類PAC1及獼猴PAC1。如以下實例中進一步所述，測試某些抗體且發現其與不同於藉由多個其他針對PAC1組分之一個或其他之抗體結合的彼等抗原決定基的抗原決定基結合。所提供之抗體阻止PACAP(例如PACAP-38)與其受體結合。因此，本文提供之抗體能夠抑制PAC1活性。特定言之，與此等抗原決定基結合之抗體可具有以下活性中之一或多者：抑制尤其誘導PAC1信號轉導路徑、抑制血管擴張、引起血管收縮、降低炎症(例如神經性炎症)及在PACAP結合時藉由PAC1誘導之其他生理效應。
本文所揭示之抗體具有多種效用。例如一些抗體適用於PAC1(特定言之hPAC1或其配位體)之特異性結合分析、親和性純化，且在篩檢分析中確定PAC1之其他拮抗劑的活性。一些抗體適用於抑制PAC1配位體(例如PACAP-38)與PAC1結合。
如本文說明抗體可用於多種治療應用。舉例而言，某些PAC1抗體適用於與PAC1介導之信號傳導相關之治療條件，諸如在患者中降低、緩解或治療偏頭痛之頻率及/或嚴重度、降低、緩解或治療叢集性頭痛、降低、緩解或治療慢性疼痛、緩解或治療糖尿病(II型)、降低、緩解或治療心臟血管病症及降低、緩解或治療與內毒血症及敗血症相關之血液動力學紊亂。抗體之其他用途包括，例如診斷PAC1相關之疾病或病症及篩檢分析以確定PAC1存在或不存在。本文所述之抗體中之一些適用於治療與PAC1活性相關之及結果、症狀及/或病變。此等包括(但不限於)各種類型之頭痛，包括偏頭痛(例如慢性及/或間歇性偏頭痛)。
所提供之一些抗體具有通常與天然存在之抗體相關之結構。此等抗體之結構單元通常包含一或多個四聚物，各自由相同的兩對多肽鏈構成，但一些哺乳動物物種亦產生僅具有單一重鏈之抗體。在一典 型抗體中，各對(pair/couplet)包括一條全長「輕」鏈(在某些實施例中為約25kDa)及一條全長「重」鏈(在某些實施例中為約50-70kDa)。各個別免疫球蛋白鏈由若干個「免疫球蛋白域」構成，各域由約90至110個胺基酸組成且表現特徵性摺疊模式。此等結構域為構成抗體多肽之基本單元。各鏈之胺基端部分通常包括負責抗原識別之可變域。羧基端部分在演化上比鏈之另一端更保守且稱為「恆定區」或「C區」。人類輕鏈通常分類為κ鏈及λ鏈，其各自含有一個可變域及一個恆定域。重鏈通常分類為μ、δ、γ、α或ε鏈，且此等鏈分別將抗體之同型定義為IgM、IgD、IgG、IgA及IgE。IgG具有若干亞型，包括(但不限於)IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。IgM亞型包括IgM及IgM2。IgA亞型包括IgA1及IgA2。在人類中，IgA及IgD同型含有四條重鏈及四條輕鏈；IgG及IgE同型含有兩條重鏈及兩條輕鏈；且IgM同型含有五條重鏈及五條輕鏈。重鏈C區通常包含可負責效應子功能之一或多個結構域。重鏈恆定區之數目將視同型而定。舉例而言，IgG重鏈各自含有三個C區結構域，稱為CH1、CH2及CH3。所提供之抗體可具有任何此等同型及亞型。在某些實施例中，PAC1抗體為IgG1、IgG2或IgG4亞型。
在全長輕鏈及重鏈中，可變區及恆定區由具有約12個或更多個胺基酸之「J」區結合，其中重鏈亦包括具有約10個或更多個胺基酸之「D」區。參見例如Fundamental Immunology，第2版，第7章(Paul,W.編)1989,New York：Raven Press(出於所有目的以全文引用的方式併入本文中)。各輕鏈/重鏈對之可變區通常形成抗原結合位點。免疫球蛋白鏈之可變區一般展示相同整體結構，其包含由3個更常稱為「互補決定區」或CDR之高變區接合之相對保守構架區(FR)。來自以上提及之各重鏈/輕鏈對之兩條鏈的CDR通常由構架區對準以形成與靶標蛋白質(例如PAC1)上之特異抗原決定基特異性結合之結構。自N端至 C端，天然存在之輕鏈與重鏈可變區二者通常皆與此等元件之以下順序相符：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。已設計出對佔據此等結構域中之每一個中之位置的胺基酸分配編號的編號系統。此編號系統在Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(1987及1991,NIH,Bethesda,MD)或Chothia及Lesk,1987,J.Mol.Biol.196：901-917；Chothia等人，1989,Nature 342：878-883中定義。
已知人類IgG1在N297(EU編號系統)處具有糖基化位點且糖基化促進IgG1抗體之效應子功能。具有突變型N297之群組致力於產生去糖基化抗體。突變集中在用生物化學性質類似天冬醯胺之胺基酸(諸如麩醯胺酸(N297Q))或用模擬天冬醯胺而無極性基團之丙胺酸(N297A)取代N297上。
如本文所用，「去糖基化抗體」或「去糖基化fc」係指Fc之297位置處之殘基的糖基化狀態。抗體或其他分子可在一個或多個其他位置處含有糖基化，但仍可視為去糖基化抗體或去糖基化Fc融合蛋白質。
致力於製造效應子無功能的IgG1 Fc分子時，發現人類IgG1之胺基酸N297突變成甘胺酸，亦即N297G，其所提供之優良純化效率及生物物理學特性遠超過該殘基處被其他胺基酸取代時之結果。如使用吞噬作用分析所評定，可進一步發現去糖基化IgG1構架中之抗PAC1抗體阻止Fc γ受體誘導血小板消耗(參見實例5)。由此，在較佳實施例中，抗PAC1抗體包含具有「B」或「C」後綴字尾之抗體，表示IgG1去糖基化變型。在某些實施例中，抗體包含具有N297G取代之Fc。
包含具有N297G突變之人類IgG1 Fc的Fc亦可進一步包含插入、缺失及取代。在某些實施例中，人類IgG1 Fc包含N297G取代且與表2B中所陳述之胺基酸序列(例示性抗hPAC1 Ab重鏈胺基酸序列)中之一或多者至少90%相同、至少91%相同、至少92%相同、至少93%相 同、至少94%相同、至少95%相同、至少96%相同、至少97%相同、至少98%相同或至少99%相同。
含有去糖基化IgG1 Fc之分子可能比含有糖基化IgG1 Fc之分子更不穩定。因此Fc區可能進一步經工程改造以提高去糖基化分子之穩定性。在一些實施例中，一或多個胺基酸經半胱胺酸取代，因此形成呈二聚物狀態之二硫鍵。因此可由對應於IgG1胺基酸重鏈序列之V259、A287、R292、V302、L306、V323或I332的殘基經半胱胺酸取代。在較佳實施例中，取代一對特定殘基，以使得其彼此優先形成二硫鍵，由此限制或阻止二硫鍵混雜。較佳之成對殘基包括(但不限於)A287C與L306C、V259C與L306C、R292C與V302C及V323C與I332C。
本文明確舉例說明含有去糖基化(N297G)IgG1 Fc之重鏈，其中殘基R292及V302中之一個或兩個經半胱胺酸取代。具有「C」後綴字尾之去糖基化(N297G)IgG1抗體在其重鏈中含有R292C及V302C兩個取代。
本文提供之各種重鏈及輕鏈可變區示於表3A及3B中。此等可變區各自可連接至以上重鏈及輕鏈恆定區，以分別形成完整的抗體重鏈及輕鏈。此外，如此產生之重鏈及輕鏈序列各自可經組合，以形成完整的抗體結構。應瞭解，本文提供之重鏈及輕鏈可變區亦可連接於其序列不同於以上所列例示性序列的其他恆定域。
亦提供編碼本文所述之抗體或其部分的核酸，包括編碼抗體之一條或兩條鏈或其片段、衍生物、突變蛋白質或其變異體之核酸、編碼重鏈可變區或僅CDR之聚核苷酸、足以在對編碼多肽之聚核苷酸進行鑑別、分析、突變或擴增時用作雜交探針、PCR引子或測序引子之聚核苷酸、用於抑制聚核苷酸之表現的反義核酸及前述核酸之互補序列。核酸可為任何長度。其長度可為例如5、10、15、20、25、30、 35、40、45、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、750、1,000、1,500或更多個核苷酸，及/或其可包含一或多個其他序列(例如調節序列)及/或為較大核酸(例如載體)之部分。核酸可為單股或雙股且可包含RNA及/或DNA核苷酸及其人造變異體(例如肽核酸)。
表1A及1B展示例示性核酸序列。本文提供之任何可變區可與此等恆定區連接以形成完整的重鏈及輕鏈序列。但是，應瞭解提供此等恆定區序列僅作為特定實例--此項技術之技術人員可採用其他恆定區，包括IgG1重鏈穩定區、IgG3或IgG4重鏈恆定區、七個λ輕鏈恆定區中之任一者(包括hCL-1、hCL-2、hCL-3及hCL-7)；為了改良穩定性、表現可製造性或其他所需特徵已經修飾之恆定區及其類似恆定區。在一些實施例中，可變區序列與此項技術中已知之其他恆定區序列接合。
所提供之抗體之全長輕鏈及重鏈的特定實例及其相應核酸及胺基酸序列概述於表1A、1B、2A及2B中。表1A及2A展示例示性輕鏈序列及表1B及2B展示例示性重鏈序列，其展示而無對應的信號序列。
抗體可變域
亦提供含有如以下表3A及3B中所示之抗體輕鏈可變區或抗體重鏈可變區之抗體(及相應核酸序列)及免疫功能性片段、衍生物、突變蛋白質及此等輕鏈及重鏈可變區之變異體。
亦包括編碼表3A及3B中所示之可變區之核酸序列。由於彼等序列包含在表1A及1B中所示之相應抗體之全長核酸序列中，因此其無法作為表或序列表中之獨立序列挑出，但可易於由熟習此項技術者基於表3A及3B中提供之可變區連同表1A及1B中之全長DNA序列確定。
此類型之抗體可通常特指式「VHx/VLy」其中「x」對應於重鏈可變區之數目及「y」對應於輕鏈可變區之數目。
表3B中所列之重鏈可變區各自可與表3A中所示之輕鏈可變區中之任一者組合以形成抗體。
CDR
本文所揭示之抗體為經一或多個CDR移植、插入及/或接合之多肽。抗體可具有1、2、3、4、5或6個CDR。因此，抗體可具有例如一 個重鏈CDR1(「CDRH1」)、及/或一個重鏈CDR2(「CDRH2」)、及/或一個重鏈CDR3(「CDRH3」)、及/或一個輕鏈CDR1(「CDRL1」)、及/或一個輕鏈CDR2(「CDRL2」)、及/或一個輕鏈CDR3(「CDRL3」)。一些抗體包括CDRH3及CDRL3二者。在表3A及3B中分別鑑別出特異性重鏈及輕鏈CDR。
給定抗體之互補決定區(CDR)及構架區(FR)可使用Kabat等人在Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，US Dept.of Health and Human Services,PHS,NIH,NIH公開案第91-3242號，1991中所描述之系統來鑑別。本文所揭示之某些抗體包含一或多個與表4A(CDRL)及表4B(CDRH)中所呈現之一或多個CDR之胺基酸序列相同或具有實質性序列一致性的胺基酸序列。
天然存在之抗體中之CDR之結構及性質已經描述，同上。簡言 之，在傳統抗體中，CDR嵌埋在重鏈及輕鏈可變區中之構架中，其中其構成負責抗原結合及識別之區域。可變區在構架區(由Kabat等人，1991，同前文獻特指構架區1-4、FR1、FR2、FR3及FR4；亦參見Chothia及Lesk,1987，同前文獻)內包含至少三個重鏈或輕鏈CDR，參見同前文獻(Kabat等人，1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,Public Health Service N.I.H.,Bethesda,MD；亦參見Chothia及Lesk,1987,J.Mol.Biol. 196：901-917；Chothia等人，1989,Nature 342：877-883)。但是，如本文所述，本文提供之CDR可不僅用於定義習知抗體結構之抗原結合域且亦可嵌埋於多種其他多肽結構中。
本文所揭示之一些抗體與本文所揭示之其他抗體共用某些區域或序列。此等關係概述於以上表中。
在一個態樣中，本文提供之經分離抗體可為單株抗體、多株抗體、重組抗體、人源性抗體、人類化抗體、嵌合抗體、多特異性抗體或其抗原結合片段抗體。
在另一實施例中，本文提供之經分離抗體之抗體片段可為Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、雙功能抗體或單鏈抗體分子。
在另一實施例中，本文提供之經分離抗體為人源性抗體且可為IgG1型、IgG2型、IgG3型或IgG4型。在另一實施例中，經分離抗體為IgG1或IgG2型。在另一實施例中，經分離抗體為IgG2型。在另一實施例中，經分離抗體為IgG1型。在另一實施例中，IgG1型抗體為去糖基化IgG1抗體。在另一實施例中，去糖基化IgG1抗體具有N297G突變。
在另一實施例中，抗體剛好由如表2A-2B中所陳陳述之輕鏈或重鏈多肽組成。在一些實施例中，抗體剛好由諸如表3A及3B中所列之彼等者的輕鏈可變域或重鏈可變域組成。該等抗體可經一或多個PEG分子聚乙二醇化。
在又一態樣中，本文提供之經分離抗體可連接至標記基團且可與本文所提供經分離抗體中之一者的抗體競爭結合人類PAC1之胞外部分。在一個實施例中，本文提供之經分離抗體當投與患者時，可降低單核細胞趨化性、抑制單核細胞遷移至腫瘤中或抑制腫瘤中與腫瘤相關之巨噬細胞的積聚及功能。
彼等熟悉此相關技術者應瞭解，對於具有超過一個來自所示序列之CDR的任何抗體，適合使用獨立選自所示序列之CDR的任何組合。由此，可產生具有一個、兩個、三個、四個、五個或六個經獨立選擇的CDR之抗體。但是，彼等熟悉此相關者應瞭解，特定實施例通常使用非重複性CDR之組合，例如抗體通常不會用兩個CDRH2區製得，等等。
單株抗體
所提供之抗體包括與PAC1結合之單株抗體。可使用此項技術中已知的任何技術產生單株抗體，例如藉由在完成免疫接種時程後，使自轉殖基因動物收集之脾細胞永生化。可使用此項技術中已知的任何技術使脾細胞永生化，例如使其與骨髓瘤細胞融合，以產生融合瘤。適用於產生融合瘤之融合程序之骨髓瘤細胞較佳係不產生抗體，具有高融合效率且酶缺陷，使其不能在僅支持所需融合細胞(融合瘤)生長之某些選擇性培養基中生長。小鼠融合中所用之合適細胞株的實例包括Sp-20、P3-X63/Ag8、P3-X63-Ag8.653、NS1/1.Ag 4 1、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG 1.7及S194/5XXO Bul；大鼠融合中所用之細胞株實例包括R210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3、IR983F及4B210。其他適用於細胞融合之細胞株為U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2及UC729-6。
在一些情況下，融合瘤細胞株製法為：用PAC1免疫原免疫接種動物(例如具有人類免疫球蛋白序列之轉殖基因動物)；自已免疫之動 物收集脾細胞；使所收集之脾細胞與骨髓瘤細胞株融合，藉此產生融合瘤細胞；自融合瘤細胞建立融合瘤細胞株，及鑑別可產生與PAC1結合之抗體的融合瘤細胞株(例如如以下實例1-3中所描述)。該等融合瘤細胞株及由其產生之抗PAC1單株抗體為本申請案之態樣。
由融合瘤細胞株分泌之單株抗體可使用此項技術中已知之任何技術來純化。
嵌合及人類化抗體
亦提供基於上述序列之嵌合抗體及人類化抗體。適用作治療劑之單株抗體可在使用之前以各種方式經修飾。一個實例為嵌合抗體，其為由來自不同抗體之蛋白質區段構成之抗體，該等區段共價接合產生功能性免疫球蛋白輕鏈或重鏈或其免疫功能性部分。通常，重鏈及/或輕鏈之一部分與來源於特定物種或屬於特定抗體類別或子類別之抗體中的相應序列一致或同源，而該(等)鏈之其餘部分與來源於另一物種或屬於另一抗體類別或子類別之抗體中的相應序列一致或同源。對於涉及嵌合抗體之方法，參見例如美國專利第4,816,567號；及Morrison等人，1985,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855，其以引用的方式併入本文中。CDR移植例如描述於美國專利第6,180,370號、第5,693 762號、第5,693,761號、第5,585,089號及第5,530,101號中。
通常，製造嵌合抗體之目標為產生其中來自預定患者物種之胺基酸數目得到最大化之嵌合體。一個實例為「CDR移植」抗體，其中抗體包含一或多個來自特定物種或屬於特定抗體類別或子類別之互補決定區(CDR)，而抗體鏈之其餘部分與來源於另一物種或屬於另一抗體類別或子類別之抗體中之相應序列一致或同源。用於人類時，通常將來自嚙齒動物抗體之可變區或所選CDR移植至人類抗體中，替換人類抗體之天然存在之可變區或CDR。
一種適用類型之嵌合抗體為「人類化」抗體。人類化抗體一般 自最初在非人類動物中產生之單株抗體製造。該單株抗體中之某些胺基酸殘基(通常來自抗體之非抗原識別部分)通常經修飾成與對應同型之人類抗體中的相應殘基同源。人類化可例如使用各種方法藉由用至少一部分嚙齒動物可變區替代人類抗體之相應區域來進行(參見例如美國專利第5,585,089號及第5,693,762號；Jones等人，1986,Nature 321：522-525；Riechmann等人，1988,Nature 332：323-27；Verhoeyen等人，1988,Science 239：1534-1536)。
在一個態樣中，本文提供之抗體之輕鏈及重鏈可變區的CDR移植至來自相同或不同系統發育物種之抗體的構架區(FR)。舉例而言，本文所述之重鏈及輕鏈可變區之CDR可移植至共同人類FR。為產生共同人類FR，可比對來自若干人類重鏈或輕鏈胺基酸序列之FR以鑑別共同胺基酸序列。在其他實施例中，本文揭示之重鏈或輕鏈之FR經來自不同重鏈或輕鏈之FR置換。在一個態樣中，不置換抗PAC1抗體之重鏈及輕鏈之FR中的稀有胺基酸，而置換其餘FR胺基酸。「稀有胺基酸」為位於某一位置之特定胺基酸，在FR之該位置中通常未發現此特定胺基酸。或者，來自一個重鏈或輕鏈之移植可變區可與不同於如本文揭示之該特定重鏈或輕鏈之恆定區的恆定區一起使用。在其他實施例中，移植可變區為單鏈Fv抗體之部分。
在某些實施例中，來自除人類外之物種的恆定區可與人類可變區一起用於產生雜合抗體。
純人類抗體
亦提供純人類抗體。可獲得用於在不使人類接觸抗原之情況下製備針對給定抗原具有特異性之純人類抗體(「純人類抗體」)的方法。提供用於實施純人類抗體製造之一種特定手段為小鼠體液免疫系統之「人類化」。將人類免疫球蛋白(Ig)基因座引入內源性Ig基因已失活之小鼠體內為在小鼠(一種可用任何所需抗原進行免疫接種之動物) 體內產生純人類單株抗體(mAb)之一種手段。使用純人類抗體可使有時會因向人類投與小鼠或小鼠衍生之mAb作為治療劑所引起之免疫原性及過敏性反應減至最少。
純人類抗體可藉由對能夠在不產生內源性免疫球蛋白下產生人類抗體譜之轉殖基因動物(通常為小鼠)進行免疫接種來製造。為此目的，抗原通常具有六個或六個以上相連的胺基酸，且視情況與載體結合(諸如半抗原)。參見例如Jakobovits等人，1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2551-2555；Jakobovits等人，1993,Nature 362：255-258；及Bruggermann等人，1993,Year in Immunol. 7：33。在該種方法之一個實例中，如下產生轉殖基因動物：使其中編碼小鼠免疫球蛋白重鏈及輕鏈之內源性小鼠免疫球蛋白基因座失能，及向小鼠基因組中插入含有編碼人類重鏈及輕鏈蛋白質之基因座之人類基因組DNA的大片段。接著對具有少於人類免疫球蛋白基因座之完整補體之經部分修飾之動物進行雜交育種以獲得具有所有所需免疫系統修飾之動物。當投與免疫原時，此等轉殖基因動物產生對免疫原具有免疫特異性、但具有人類而非鼠類胺基酸序列(包括可變區)之抗體。關於該等方法之其他細節，參見例如WO96/33735及WO94/02602。涉及用於製造人類抗體之轉殖基因小鼠之其他方法描述於美國專利第5,545,807號；第6,713,610號；第6,673,986號；第6,162,963號；第5,545,807號；第6,300,129號；第6,255,458號；第5,877,397號；第5,874,299號及第5,545,806號中；PCT公開案WO 91/10741、WO 90/04036及EP 546073B1及EP 546073A1中。
上述轉殖基因小鼠(本文中稱為「HuMab」小鼠)含有編碼未經重排之人類重鏈([μ]及[γ])及[κ]輕鏈免疫球蛋白序列之人類免疫球蛋白基因微型基因座，以及所靶向之使內源性[μ]及[κ]鏈基因座失活之突變體(Lonberg等人，1994,Nature 368：856-859)。因此，小鼠展示降低 之小鼠IgM或[κ]表現及對免疫作用之反應，且所引入之人類重鏈及輕鏈轉基因經歷類別轉換及體細胞突變以產生高親和性人類IgG[κ]單株抗體(Lonberg等人，同前文獻；Lonberg及Huszar,1995,Intern.Rev.Immunol.13：65-93；Harding及Lonberg,1995,Ann.N.Y Acad.Sci. 764：536-546)。HuMab小鼠之製備詳細描述於Taylor等人，1992,Nucleic Acids Research 20：6287-6295；Chen等人，中1993,International Immunology 5：647-656；Tuaillon等人，1994,J.Immunol.152：2912-2920；Lonberg等人，1994,Nature 368：856-859；Lonberg,1994,Handbook of Exp.Pharmacology 113：49-101；Taylor等人，1994,International Immunology 6：579-591；Lonberg及Huszar,1995,Intern.Rev.Immunol.13：65-93；Harding及Lonberg,1995,Ann.N.Y Acad.Sci. 764：536-546；Fishwild等人，1996,Nature Biotechnology 14：845-851；出於所有目的前述參考文獻其全文以引用的方式併入本文中。進一步參見美國專利第5,545,806號；第5,569,825號；第5,625,126號；第5,633,425號；第5,789,650號；第5,877,397號；第5,661,016號；第5,814,318號；第5,874,299號；及第5,770,429號；以及美國專利第5,545,807號；國際公開案第WO 93/1227；WO 92/22646及WO 92/03918號，出於所有目的所有揭示內容其全文以引用的方式併入本文中。用於在此等轉殖基因小鼠中製造人類抗體之技術亦揭示於WO 98/24893及Mendez等人，1997,Nature Genetics 15：146-156中，其以引用的方式併入本文中。舉例而言，可使用HCo7及HCo12轉殖基因小鼠品系來產生抗抗PAC1抗體。關於使用轉殖基因小鼠製造人類抗體之其他細節在以下實例中提供。
使用融合瘤技術，具有所需特異性之抗原特異性人類mAb可由諸如上文所述之彼等轉殖基因小鼠產生或選自彼等小鼠。可使用適合載體及宿主細胞來選殖及表現該等抗體，或可自所培養之融合瘤細胞收 集抗體。
純人類抗體亦可來源於噬菌體展示庫(如Hoogenboom等人，1991,J.Mol.Biol. 227：381；及Marks等人，1991,J.Mol.Biol. 222：581中所揭示)。噬菌體呈現技術模擬經由使抗體譜系呈現於絲狀噬菌體之表面上且隨後使其結合於所選抗原對噬菌體進行選擇來進行免疫選擇。描述於公開案第WO 99/10494號(以引用的方式併入本文中)中之一個該技術，其描述使用該方法對於MPL-及msk-受體分離高親和性及功能性促效抗體。
雙特異性或雙功能性抗體
所提供之抗體亦包括雙特異性及雙功能性抗體，其包括如上文所述之一或多個CDR或一或多個可變區。在一些情況下，雙特異性或雙功能性抗體為具有兩個不同重鏈/輕鏈對及兩個不同結合位點之人造雜合抗體。雙特異性抗體可藉由各種方法產生，包括(但不限於)融合瘤之融合或Fab'片段之連接。參見例如Songsivilai及Lachmann,1990,Clin.Exp.Immunol.79：315-321；Kostelny等人，1992,J.Immunol.148：1547-1553。
各種其他形式
所提供之一些抗體為上文所揭示之抗體的變異體形式。舉例而言，一些抗體在以上列出之一或多個重鏈或輕鏈、可變區或CDR中具有一或多個保守胺基酸取代。
天然存在之胺基酸可基於共同的側鏈特性分成數類。
(1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)鹼性：His、Lys、Arg；(5)影響鏈取向的殘基：gly、pro；及 (6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
保守性胺基酸取代可涉及將此等類別之一的成員更換為同一類別中之另一成員。保守性胺基酸取代可涵蓋通常藉由化學肽合成而非藉由生物系統中合成所併入的非天然存在之胺基酸殘基。其包括肽模擬物及胺基酸部分之其他逆轉或反轉形式。
非保守性取代可涉及將以上類別之一的成員更換為另一類別之成員。該等經取代之殘基可引入抗體中與人源性抗體同源之區域或引入分子之非同源區域中。
在進行該等改變時，根據某些實施例，可考慮胺基酸之親水指數。蛋白質之親水概況藉由賦予各胺基酸以數值(「親水指數」)且接著沿肽鏈重複計算此等值之平均值來計算。已基於疏水性及電荷特徵賦予各胺基酸以親水指數。其為：異白胺酸(+4.5)；纈胺酸(+4.2)；白胺酸(+3.8)；苯丙胺酸(+2.8)；半胱胺酸/胱胺酸(+2.5)；甲硫胺酸(+1.9)；丙胺酸(+1.8)；甘胺酸(-0.4)；蘇胺酸(-0.7)；絲胺酸(-0.8)；色胺酸(-0.9)；酪胺酸(-1.3)；脯胺酸(-1.6)；組胺酸(-3.2)；麩胺酸(-3.5)；麩醯胺酸(-3.5)；天冬胺酸(-3.5)；天冬醯胺(-3.5)；離胺酸(-3.9)；及精胺酸(-4.5)。
此項技術中瞭解親水概況對賦予蛋白質相互作用之生物功能的重要性(參見例如Kyte等人，1982,J.Mol.Biol. 157：105-131)。已知某些胺基酸可取代具有類似親水指數或分數之其他胺基酸且仍然保留類似生物活性。在基於親水指數進行改變時，在某些實施例中，包括親水指數在±2以內之胺基酸的取代。在一些態樣中，納入在±1內之彼等胺基酸，且在其他態樣中，納入在±0.5內之彼等胺基酸。
此項技術中亦應瞭解，類似胺基酸之取代可基於親水性有效地進行，尤其當由此產生之生物學功能性蛋白質或肽意欲用於免疫學實施例中時，如在本發明之情況下。在某些實施例中，蛋白質之最大局 部平均親水性(取決於其相鄰胺基酸之親水性)與其免疫原性及抗原結合或免疫原性(亦即該蛋白質之生物性質)有關。
已賦予此等胺基酸殘基以下親水性值：精胺酸(+3.0)；離胺酸(+3.0；天冬胺酸(+3.0±1)；麩胺酸(+3.0±1)；絲胺酸(+0.3)；天冬醯胺(+0.2)；麩醯胺酸(+0.2)；甘胺酸(0)；蘇胺酸(-0.4)；脯胺酸(-0.5±1)；丙胺酸(-0.5)；組胺酸(-0.5)；半胱胺酸(-1.0)；甲硫胺酸(-1.3)；纈胺酸(-1.5)；白胺酸(-1.8)；異白胺酸(-1.8)；酪胺酸(-2.3)；苯丙胺酸(2.5)及色胺酸(-3.4)。在基於類似親水性值作出變化時，在某些實施例中，納入親水性值在±2內之胺基酸的取代，在其他實施例中，納入在±1內之彼等胺基酸，且在其他實施例中，納入在±0.5內之彼等胺基酸。在一些情況下，亦可基於親水性自一級胺基酸序列鑑別抗原決定基。此等區域亦稱為「抗原決定基核心區」。
例示性保守胺基酸取代陳述於表6中。
熟習此項技術者將能夠使用熟知技術確定如本文所陳述之多肽之合適的變異體。熟習此項技術者可藉由靶向咸信對於活性不重要之區域來鑑別分子中可經改變而不破壞活性之合適區域。熟習此項技術者亦將能夠鑑別分子中在類似多肽中具有保守性之殘基及部分。在另外實施例中，甚至對生物活性或對結構可為重要之區域可經受保守胺基酸取代而不破壞生物活性或不會不利地影響多肽結構。
此外，熟習此項技術者可回顧鑑別類似多肽中對於活性或結構重要之殘基的結構-功能研究。鑒於該比較，可預測蛋白質中對應於類似蛋白質中對於活性或結構重要之胺基酸殘基之胺基酸殘基的重要性。熟習此項技術者可選擇化學上類似之胺基酸取代來用於該等預測之重要胺基酸殘基。
熟習此項技術者亦可聯繫類似多肽之結構對三維結構及胺基酸序列進行分析。鑒於該資訊，熟習此項技術者可關於抗體之三維結構預測其胺基酸殘基之排列。熟習此項技術者可選擇不對預測位於蛋白質表面上之胺基酸殘基作出根本變化，此因為該等殘基可能涉及與其他分子之重要的相互作用。此外，熟習此項技術者可產生在每一理想的胺基酸殘基處含有單一胺基酸取代之測試變異體。接著可使用PAC1中和活性分析篩選此等變異體(參見以下實例)，從而產生關於哪些胺基酸可變化且哪些不可變化之資訊。換言之，基於自該等常規實驗收集之資訊，熟習此項技術者可輕易確定應避免單獨或與其他突變組合之其他取代的胺基酸位置。
許多科學出版物已致力於預測二級結構。參見Moult,1996,Curr.Op.in Biotech. 7：422-427；Chou等人，1974,Biochem.13：222-245；Chou等人，1974,Biochemistry 113：211-222；Chou等人，1978,Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol.Biol. 47：45-148；Chou等人，1979,Ann.Rev.Biochem. 47：251-276；及Chou等人，1979,Biophys.J. 26：367-384。此外，當前可獲得電腦程式以輔助預測二級結構。預測二級結構之一種方法係基於同源模建法。舉例而言，序列一致性大於30%或相似性大於40%之兩個多肽或蛋白質可具有類似結構佈局。蛋白質結構資料庫(PDB)之最新發展已使得二級結構之可預測性提高，包括多肽或蛋白質結構中之潛在摺疊數。參見Holm等人，1999,Nucl.Acid.Res. 27：244-247。已提出(Brenner等人，1997,Curr.Op.Struct.Biol. 7：369-376)在給定多肽或蛋白質中存在有限數目之摺疊且一旦已解析臨界數目之結構，結構預測即變得顯著更加精確。
其他預測二級結構之方法包括「穿線」(Jones,1997,Curr.Opin.Struct.Biol. 7：377-387；Sippl等人，1996,Structure 4：15-19)、「輪廓分析」(Bowie等人，1991,Science 253：164-170；Gribskov等人，1990,Meth.Enzym. 183：146-159；Gribskov等人，1987,Proc.Nat.Acad.Sci. 84：4355-4358)及「進化連接」(參見Holm,1999，同前文獻；及Brenner,1997，同前文獻)。
在一些實施例中，進行胺基酸取代以便(1)降低蛋白易分解性，(2)降低易氧化性，(3)改變結合親和力以形成蛋白質複合物，(4)改變配體或抗原結合親和力，及/或(4)賦予或修改該等多肽上之其他物理化學或功能特性。舉例而言，可在天然存在之序列中進行單一或多個胺基酸取代(在某些實施例中為保守性胺基酸取代)。可在抗體中位於形成分子間接觸之結構域以外的部分中進行取代。在該等實施例中，可使用不會實質上改變親本序列之結構特徵的保守性胺基酸取代(例 如一或多個不破壞表徵親本或原生抗體之二級結構之置換胺基酸)。技術公認之多肽二級及三級結構之實例描述於Proteins,Structures and Molecular Principles(Creighton編)，1984,W.H.New York：Freeman and Company；Introduction to Protein Structure(Branden及Tooze編)，1991,New York：Garland Publishing；及Thornton等人，1991,Nature 354：105中，其各自以引用的方式併入本文中。
其他較佳抗體變異體包括半胱胺酸變異體，其中親本或原生胺基酸序列中之一或多個半胱胺酸殘基缺失或經另一胺基酸(例如絲胺酸)取代。尤其當抗體必須再摺疊為生物學活性構形時，半胱胺酸變異體為適用的。與原生抗體相比，半胱胺酸變異體可具有較少的半胱胺酸殘基，且通常為偶數個以最小化由不成對半胱胺酸引起之相互作用。
所揭示之重鏈及輕鏈、可變區結構域及CDR可用於製備含有可與PAC1特異性結合之抗原結合區之多肽。舉例而言，表4A及4B中所列之CDR中之一或多者可共價或非共價併入分子(例如多肽)中以形成免疫黏附。免疫黏附可併入CDR作為較大多肽鏈之一部分，可使CDR共價連接至另一多肽鏈，或可非共價併入CDR。CDR使免疫黏附能夠與相關特定抗原(例如PAC1或其抗原決定基)特異性結合。
亦提供本文所述之基於可變區結構域及CDR之模擬物(例如「肽模擬物(peptide mimetics/peptidomimetics)」)。此等類似物可為肽、非肽或肽與非肽區之組合。Fauchere,1986,Adv.Drug Res. 15：29；Veber及Freidinger,1985,TINS p,392；及Evans等人，1987,J.Med.Chem. 30：1229，出於任何目的其以引用的方式併入本文中。結構上類似於治療學上適用之肽之肽模擬物可用於產生類似的治療或預防效果。該等化合物通常藉助於電腦化分子模型來研發。通常，肽模擬物為在結構上與展示所需生物活性(諸如在本文中特異性結合PAC1之能 力)之抗體類似之蛋白質，但視情況藉由在此項技術中熟知之方法用選自以下之鍵置換一或多個肽鍵：-CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH-CH-(順式及反式)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-及-CH2SO-。在某些實施例中，可使用以同一類型之D-胺基酸系統取代共同序列之一或多個胺基酸(例如D-離胺酸替代L-離胺酸)來產生較穩定的蛋白質。此外，包含共同序列或實質上相同之一致序列變化的限定肽可由此項技術中已知之方法產生(Rizo及Gierasch,Ann.Rev.Biochem. 61：387(1992)，其以引用的方式併入本文中)，例如藉由添加能夠形成使肽環化之分子內二硫橋鍵的內部半胱胺酸殘基。
亦提供本文所述之抗體的衍生物。衍生化抗體可包含賦予抗體或片段所需特性(諸如特定用途中之增加的半衰期)之任何分子或物質。衍生化抗體可包含例如可偵測(或標記)部分(例如放射性、比色抗原或酶分子、可偵測珠粒(諸如磁性或電子緻密(例如金)珠粒)或與另一分子(例如生物素或抗生蛋白鏈菌素)結合之分子)、治療或診斷部分(例如放射性、細胞毒性或醫藥學活性部分)，或增加抗體用於特定用途(例如向諸如人類個體之個體投與，或其他活體內或活體外用途)之適合性的分子。可用於衍生化抗體之分子之實例包括白蛋白(例如人類血清白蛋白)及聚乙二醇(PEG)。可使用此項技術中熟知之技術製備抗體之連接白蛋白及聚乙二醇化衍生物。某些抗體包括如本文中所述自豪聚乙二醇化單鏈多肽。在一個實施例中，抗體結合或以其他方式連接至甲狀腺素運載蛋白(TTR)或TTR變異體。TTR或TTR變異體可用例如選自由以下組成之群的化學物質進行化學修飾：聚葡萄糖、聚(n-乙烯基吡咯啶酮)、聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇及聚乙烯醇。
其他衍生物包括PAC1結合蛋白與其他蛋白質或多肽之共價或聚集結合物，諸如藉由包含與PAC1結合蛋白之N端或C端融合之異源多 肽的重組融合蛋白之表現。舉例而言，結合之肽可為異源信號(或前導)多肽(例如酵母α-因子前導序列)，或肽(諸如抗原決定基標籤)。含PAC1抗體之融合蛋白可包含為促進PAC1結合蛋白(例如聚組胺酸)之純化或鑑別而添加之肽。PAC1結合蛋白亦可與如Hopp等人，1988,Bio/Technology 6：1204；及美國專利第5,011,912號中所述之FLAG肽連接。FLAG肽具高抗原性且提供由特異性單株抗體(mAb)可逆地結合之抗原決定基，從而實現所表現重組蛋白質之快速分析及便捷純化。適用於製備FLAG肽融合於指定多肽之融合蛋白的試劑可購得(Sigma,St.Louis,MO)。
可使用含有一或多個PAC1結合蛋白之寡聚物作為PAC1拮抗劑。寡聚物可呈共價連接或非共價連接之二聚物、三聚物或更高級寡聚物形式。考慮使用包含兩種或兩種以上PAC1結合蛋白之寡聚物，其中一個實例為均二聚體。其他寡聚物包括雜二聚物、均三聚物、雜三聚物、均四聚物、雜四聚物等。
一個實施例係有關包含與PAC1結合蛋白融合之肽部分之間經由共價或非共價相互作用接合的多個PAC1結合多肽寡聚物。該等肽可為肽連接子(間隔子)，或具有促進寡聚合之性質的肽。如下文中更詳細描述，白胺酸拉鏈及來源於抗體之某些多肽屬於可促進連接於其上之PAC1結合蛋白寡聚化之肽。
在特定實施例中，寡聚物包含兩個至四個PAC1結合蛋白。寡聚物之PAC1結合蛋白部分可呈任何上述形式，例如變異體或片段。較佳地，寡聚物包含具有PAC1結合活性之PAC1結合蛋白。
在一個實施例中，使用來源於免疫球蛋白之多肽製備寡聚物。包含某些異源多肽融合於抗體來源多肽之各種部分(包括Fc域)的融合蛋白之製備已例如由以下文獻描述：Ashkenazi等人，1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10535；Byrn等人，1990,Nature 344：677；及 Hollenbaugh等人，1992「Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins」,Current Protocols in Immunology，增刊4，第10.19.1-10.19.11頁。
一個實施例係有關包含藉由使PAC1結合蛋白與抗體之Fc區域融合而形成之兩個融合蛋白的二聚體。該二聚物可如下製得：例如將編碼融合蛋白質之基因融合物插入適當表現載體中、在經重組表現載體轉化之宿主細胞中表現基因融合物、及使所表現之融合蛋白質極像抗體分子般組裝、隨後在Fc部分之間形成鏈間二硫鍵形式以產生二聚物。
如本文所用，術語「Fc多肽」包括衍生自抗體Fc區之多肽的原生及突變形成之蛋白質形式。亦包括含有促進二聚合之鉸鏈區的該等多肽之截短形式。包含Fc部分之融合蛋白質(及由其形成之寡聚物)提供藉由蛋白質A或蛋白質G管柱親和層析進行輕易純化之優勢。
描述於PCT申請案WO 93/10151及美國專利第5,426,048號及第5,262,522號中之一種合適之Fc多肽為單鏈多肽，其自人類IgG1抗體之Fc區的N端鉸鏈區延伸至原生C端。另一適用的Fc多肽為描述於美國專利第5,457,035號及Baum等人，1994,EMBO J. 13：3992-4001中之Fc突變蛋白質。此突變蛋白質之胺基酸序列與呈現於WO 93/10151中之原生Fc序列的胺基酸序列相同，除了胺基酸19已由Leu變成Ala，胺基酸20已由Leu變成Glu，且胺基酸22已由Gly變成Ala。突變蛋白質展現降低之Fc受體親和力。
在其他實施例中，PAC1結合蛋白(諸如本文所揭示)之重鏈及/或輕鏈之可變部分可替代抗體重鏈及/或輕鏈之可變部分。
或者，寡聚物為包含具有或不具有肽連接子(間隔肽)之多個PAC1結合蛋白質的融合蛋白。適合肽連接子為彼等描述於美國專利第4,751,180號及第4,935,233號中者。
用於製備寡聚PAC1結合蛋白質衍生物之另一方法涉及使用白胺酸拉鏈。白胺酸拉鏈域為促進可見該等白胺酸拉鏈域之蛋白質之寡聚化的肽。最初，在若干DNA結合蛋白中鑑別白胺酸拉鏈(Landschulz等人，1988,Science 240：1759)，且隨後在各種不同蛋白質中發現。已知白胺酸拉鏈包括可二聚或三聚之天然存在之肽及其衍生物。適合於製造可溶性寡聚蛋白質之白胺酸拉鏈結構域之實例描述於PCT申請案WO 94/10308中，且衍生自肺表面活性蛋白質D(SPD)之白胺酸拉鏈描述於Hoppe等人，1994,FEBS Letters 344：191中，其以以引用的方式併入本文中。經修飾之白胺酸拉鏈允許融合於其上之異源蛋白質穩定三聚的用途描述於Fanslow等人，1994,Semin.Immunol.6：267-278中。在一種方法中，包含與白胺酸拉鏈肽融合之PAC1結合蛋白片段或衍生物之重組融合蛋白在合適之宿主細胞中表現，且所形成之可溶性寡聚PAC1結合蛋白片段或衍生物自培養上清液中回收。
在某些實施例中，抗體之KD(平衡結合親和力)小於1pM、10pM、100pM、1nM、2nM、5nM、10nM、25nM或50nM。
在另一態樣中，提供活體外或活體內半衰期為至少一天(例如當向人類個體投與時)之抗體。在一個實施例中，抗體半衰期為至少3天。在另一實施例中，抗體或其部分之半衰期為4天或4天以上。在另一實施例中，抗體或其部分之半衰期為8天或8天以上。在另一實施例中，抗體或其抗原結合部分經衍生或修飾以使其半衰期比未經衍生或未經修飾之抗體長。在另一實施例中，抗體含有點突變以增加血清半衰期，諸如描述於以引用的方式併入之2000年2月24日公佈的WO 00/09560中。
糖基化
抗體可具有與原生物種中所見不同或有所改變之糖基化模式。如此項技術中所已知，糖基化模式可視蛋白質之序列(例如存在或不 存在以下所論述之特定糖基化胺基酸殘基)或產生蛋白質之宿主細胞或生物體而定。以下論述特定表現系統。
多肽之糖基化通常為N連接或O連接。N連接型係指碳水化合物部分與天冬醯胺殘基之側鏈連接。三肽序列天冬醯胺酸-X-絲胺酸及天冬醯胺酸-X-蘇胺酸(其中X為除脯胺酸之外的任何胺基酸)為碳水化合物部分酶連至天冬醯胺酸側鏈之識別序列。由此，此等三肽序列中之任一者在多肽中的存在產生潛在性糖基化位點。經O連接之糖基化係指糖N-乙醯基半乳胺糖、半乳糖或木糖中之一者與羥基胺基酸連接，儘管亦可使用5-羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸，但該羥基胺基酸最通常為絲胺酸或蘇胺酸。
在抗體中添加糖基化位點便利地藉由改變胺基酸序列，以使其含有上述三肽序列中之一或多者來實現(針對N-連接型糖基化位點)。亦可藉由向原始序列加入一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基或經一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基取代原始序列來進行改變(對於O-連接糖基化部位)。出於簡易性，可經由改變DNA水準來改變抗體胺基酸序列，尤其藉由使編碼靶標多肽之DNA在預選鹼基處突變以便產生將轉譯為所需胺基酸之密碼子。
增加抗體碳水化合物部分之數目的另一方法為藉由使醣苷與蛋白質化學或酶促偶合。此等程序為有利的，因為其不需要在具有糖基化能力之宿主細胞中產生蛋白質來進行N-連接型及O-連接型糖基化。視所用偶合模式而定，可將該(等)糖連接至(a)精胺酸及組胺酸、(b)游離羧基、(c)游離巰基諸如半胱胺酸之彼等巰基、(d)游離羥基諸如絲胺酸、蘇胺酸、或羥基脯胺酸之彼等羥基、(e)芳族殘基諸如苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸之彼等芳族殘基、或(f)谷醯胺酸之醯胺基。此等方法描述於1987年九月11日公開之WO 87/05330及Aplin及Wriston,1981,CRC Crit.Rev,Biochem.第259-306頁中。
移除存在於起始抗體上之碳水化合物部分可以化學或酶促方式實現。化學去糖基化作用需要將該抗體曝露至化合物三氟甲磺酸、或等效化合物。此處理導致除連接糖(N-乙醯葡糖胺或N-乙醯半乳糖胺)之外的絕大多數或所有糖裂解，而使抗體完整。化學去糖基化藉由Hakimuddin等人，1987,Arch.Biochem.Biophys. 259：52及Edge等人，1981,Anal.Biochem. 118：131描述。多肽上之碳水化合物部分之酶促裂解可藉由使用各種內及外糖苷酶實現，如藉由Thotakura等人，1987,Meth.Enzymol.138：350描述。在潛在糖基化位點處之糖基化可藉由使用化合物衣黴素阻止，如藉由Duskin等人，1982,J.Biol.Chem. 257：3105描述。衣黴素阻斷蛋白質-N-糖苷鍵之形成。
因此，態樣包括抗體之糖基化變異體，其中與親本多肽之胺基酸序列相比，糖基化位點之數目及/或類型已改變。在某些實施例中，與原生抗體相比，抗體蛋白質變異體包含更多數目或更少數目之N-連接糖基化位點。N-連接糖基化位點具有以下序列：Asn-X-Ser或Asn-X-Thr，其中表示為X之胺基酸殘基可為除脯胺酸之外的任何胺基酸殘基。為創造此序列之胺基酸殘基之取代提供潛在的新位點以用於N-連接醣鏈之添加。或者，消除或改變此序列之取代將阻止添加存在於原生多肽中之N-連接碳水化合物鏈。舉例而言，可藉由缺失Asn或藉由用不同胺基酸取代Asn來減少糖基化。在其他實施例中，產生一或多個新的N-連接位點。抗體通常在Fc區中具有N-連接糖基化位點。
標記及效應子基團
在一些實施例中，抗原結合蛋白質包含一或多個標記。術語「標記基團」或「標記」意謂任何可偵測標記。合適之標記基團之實例包括(但不限於)以下：放射性同位素或放射性核種(例如3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、螢光基團(例如FITC、若丹 明、鑭系元素磷光體)、酶促基團(例如辣根過氧化酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶)、化學發光基團、生物素基團或由二次報導體識別之預定多肽抗原決定基(例如白胺酸拉鏈對序列、二次抗體之結合位點、金屬結合域、抗原決定基標籤)。在一些實施例中，標記基團經由各種長度之間隔臂與抗體偶合以降低潛在位阻。標記蛋白質之各種方法為此項技術中已知且可適當使用。
術語「效應子基團」意謂與抗體偶合且充當細胞毒性劑之任何基團。合適之效應子基團的實例為放射性同位素或放射性核種(例如3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)。其他合適之基團包括毒素、治療基團或化學治療基團。合適之基團的實例包括刺孢黴素(calicheamicin)、奧瑞他汀(auristatin)、格爾德黴素(geldanamycin)及美登素(maytansine)。在一些實施例中，效應子基團經由各種長度之間隔臂與抗體偶合以降低潛在位阻。
通常，視待偵測標記之分析而定，標記屬於各種類別：a)同位素標記，其可為放射性或重同位素；b)磁性標記(例如磁性粒子)；c)氧化還原活性部分；d)光學染料；酶促基團(例如辣根過氧化酶、β半乳糖、螢光素酶、鹼性磷酸酶)；e)生物素化基團；及f)由二級報導子識別之預定多肽抗原決定基(例如白胺酸拉鏈對序列、二級抗體之結合位點、金屬結合域、抗原決定基標籤等)。在一些實施例中，標記基團經由各種長度之間隔臂與抗體偶合以降低潛在位阻。用於標記蛋白質之各種方法為此項技術中已知的。
特異性標記包括光學染料，包括(但不限於)發色團、磷光體及螢光團，其中後者在許多情況下具特異性。螢光團可為「小分子」螢光或蛋白質螢光。
「螢光標記」意謂可經由分子之固有螢光特性偵測之任何分子。合適之螢光標籤包含但(不限於)螢光素、若丹明、四甲基若丹 明、伊紅、赤藻紅、香豆素、甲基香豆素、芘、Malacite綠、芪、螢光黃(Lucifer Yellow)、Cascade Blue J、德克薩斯紅(Texas Red)、IAEDANS、EDANS、BODIPY FL、LC Red 640、Cy 5、Cy 5.5、LC Red 705、Oregon綠、Alexa-Fluor染料(Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680)、Cascade Blue、Cascade Yellow及R-藻紅素(PE)(Molecular Probes,Eugene,OR)、FITC、若丹明及德克薩斯紅(Pierce,Rockford,IL)、Cy5、Cy5.5、Cy7(Amersham Life Science,Pittsburgh,PA)。合適之光學染料(包括螢光團)藉由Richard P.Haugland描述於MOLECULAR PROBES HANDBOOK中，其以引用的方式在此明確併入。
合適之蛋白質螢光標籤亦包含但(不限於)綠色螢光蛋白質，包括Renilla、Ptilosarcus或Aequorea類型之GFP(Chalfie等人，1994,Science 263：802-805)、EGFP(Clontech Labs.,Inc.,Genbank登錄號U55762)；藍色螢光蛋白質(BFP,Quantum Biotechnologies,Inc.,Quebec,Canada；Stauber,1998,Biotechniques 24：462-471；Heim等人，1996,Curr.Biol. 6：178-182)；增強型黃色螢光蛋白質(EYFP,Clontech Labs.,Inc.)；螢光素酶(Ichiki等人，1993,J.Immunol. 150：5408-5417)；β半乳糖(Nolan等人，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 85：2603-2607)及Renilla(WO92/15673、WO95/07463、WO98/14605、WO98/26277、WO99/49019、美國專利第5292658號、第5418155號、第5683888號、第5741668號、第5777079號、第5804387號、第5874304號、第5876995號、第5925558號)。
核酸
一態樣進一步提供在特定雜交條件下雜交成其他核酸(例如包含 表1A及1B中所列之核苷酸序列的核酸)之核酸。用於雜交核酸之方法在此項技術中為熟知的。參見例如Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley及Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6。如本文所定義，中等嚴格之雜交條件使用含有5×氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)、0.5%SDS、1.0mM EDTA(pH 8.0)之預洗滌溶液，約50%甲醯胺、6×SSC之雜交緩衝液及55℃之雜交溫度(或其他類似雜交溶液，諸如含有約50%甲醯胺之雜交溶液，且雜交溫度為42℃)，且洗滌條件為60℃，於0.5×SSC，0.1%SDS中。嚴格的雜交條件在6×SSC中在45℃下雜交，隨後在68℃下在0.1×SSC、0.2%SDS中洗滌一或多次。此外，熟習此項技術者可控制雜交及/或洗滌條件以增加或降低雜交之嚴格度，使得包含彼此具至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%一致性之核苷酸序列的核酸通常保持彼此雜交。
影響雜交條件之選擇的基本參數及適合條件設計指導藉由例如Sambrook、Fritsch及Maniatis(2001,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.，同前文獻；及Current Protocols in Molecular Biology,1995,Ausubel等人編，John Wiley及Sons,Inc.，章節2.10及6.3-6.4)陳述，且可由一般技術者基於例如核酸之長度及/或基礎組合物而容易地確定。
可藉由突變向核酸中引入改變，藉此在其編碼之多肽(例如抗體或抗體衍生物)的胺基酸序列中產生改變。可使用此項技術中已知的任何技術引入突變。在一個實施例中，使用例如定點突變誘發方案改變一或多個特定胺基酸殘基。在另一實施例中，使用例如隨機突變誘發方案改變一或多個隨機選擇之殘基。無論以何種方式進行，可針對所需性質表現及篩選突變型多肽。
可在未顯著改變核酸所編碼之多肽之生物活性的情況下將突變 引入核酸中。舉例而言，可進行引起非必需胺基酸殘基處之胺基酸取代的核苷酸取代。或者，可將選擇性改變核酸所編碼之多肽之生物活性的一或多個突變引入核酸中。舉例而言，突變可定量或定性地改變生物活性。定量改變之實例包括提高、降低或去除活性。定性改變之實例包括改變抗體之抗原特異性。在一個實施例中，可使用在此項技術中公認之分子生物學技術使編碼本文所述之任何抗體之核酸突變以改變胺基酸序列。
另一態樣提供適合於用作偵測核酸序列之引子或雜交探針的核酸分子。核酸分子可僅包含編碼全長多肽之核酸序列的一部分，例如可用作探針或引子之片段或編碼多肽之活性部分(例如PAC1結合部分)的片段。
基於核酸序列之探針可用於偵測核酸或類似核酸，例如編碼多肽之轉錄物。探針可包含標記基團，例如放射性同位素、螢光化合物、酶或酶輔因子。該等探針可用於鑑別表現多肽之細胞。
另一態樣提供包含編碼多肽或其部分(例如含有一或多個CDR或一或多個可變區結構域之片段)之核酸的載體。載體之實例包括(但不限於)質體、病毒載體、非游離型哺乳動物載體及表現載體，例如重組型表現載體。重組表現載體可包含呈適合於核酸在宿主細胞中表現之形式的核酸。重組型表現載體包括基於用於表現之宿主細胞選擇之一或多個調節序列，其可操作地連接至待表現之核酸序列。調節序列包括彼等導引核苷酸序列在許多類型之宿主細胞中之組成性表現的調節序列(例如SV40早期基因強化子、勞斯肉瘤(Rous sarcoma)病毒啟動子及巨細胞病毒啟動子)、彼等僅導引核苷酸序列在某些宿主細胞中之表現的調節序列(例如組織特異性調節序列，參見Voss等人，1986,Trends Biochem.Sci. 11：287；Maniatis等人，1987,Science 236：1237，其全文以引用的方式併入本文中)及彼等導引核苷酸序列回應於特定 處理或條件之誘導性表現的調節序列(例如哺乳動物細胞中之金屬硫蛋白啟動子及原核與真核系統中之tet響應性及/或鏈黴素響應性啟動子)(參見同上文獻)。熟習此項技術者應瞭解表現載體之設計可視諸如所選擇之待轉化的宿主細胞、所需蛋白質之表現量等因素而定。表現載體可引入宿主細胞中以藉此產生蛋白質或肽，包括藉由如本文所述之核酸編碼之融合蛋白或肽。
另一態樣提供已引入重組表現載體之宿主細胞。宿主細胞可為任何原核細胞(例如大腸桿菌(E.coli))或真核細胞(例如酵母、昆蟲或哺乳動物細胞(例如CHO細胞))。可經習知轉化或轉染技術將載體DNA引入原核或真核細胞中。對於哺乳動物細胞之穩定轉染，已知視所用表現載體及轉染技術而定，僅小部分細胞可將外來DNA整合入其基因組中。為鑑別及選擇此等整合體，一般將編碼可選擇標記(例如針對對抗生素之抗性)之基因與所關注之基因一起引入宿主細胞中。較佳可選擇標記包括賦予藥物(諸如G418、潮黴素(hygromycin)及甲胺喋呤)抗性之標記。可藉由藥物選擇以及其他方法來鑑別經引入之核酸穩定轉染之細胞(例如已併入可選擇標記基因之細胞將存活而其他細胞死亡)。
抗體製備
所提供之非人源性抗體可例如衍生自任何產生抗體之動物，諸如小鼠、大鼠、兔、山羊、驢或非人類靈長類動物(諸如猴子(例如獼猴或恆河猴)或猿(例如黑猩猩))。非人源性抗體可用於例如活體外細胞培養物及基於細胞培養物之應用中，或其中對抗體之免疫反應不出現或無意義、可得到阻止、不受關注，或所需之任何其他應用中。在某些實施例中，抗體可藉由使用如上所述之此項技術中已知的方法免疫動物產生。抗體可為多株抗體、單株抗體或可於宿主細胞中藉由表現重組型DNA來合成。可如上文所描述藉由免疫含有人免疫球蛋白基 因座之轉殖基因動物或藉由選擇表現人源性抗體譜之噬菌體呈現文庫來製備純人類抗體。
單株抗體(mAb)可藉由各種技術產生，包括習知單株抗體方法，例如標準體細胞雜交技術(Kohler及Milstein,1975,Nature 256：495)。或者可採用用於製造單株抗體之其他技術，例如B-淋巴細胞之病毒性或致癌性轉化。一種適用於製備融合瘤之動物系統為鼠類系統，其為一種極公認程序。用於分離融合用免疫脾細胞之免疫接種方案及技術為此項技術中已知且說明性方法描述於以下實例中。關於該等程序，來自已免疫小鼠之B細胞通常與經合適之永生化的融合搭配物(諸如鼠類骨髓瘤細胞株)融合。必要時，可對大鼠或此外其他哺乳動物進行免疫替代小鼠且可使來自該等動物之B細胞與鼠類骨髓瘤細胞株融合以形成融合瘤。或者，可使用來自除小鼠以外之來源的骨髓瘤細胞株。亦熟知製造融合瘤之融合程序。
所提供之單鏈抗體可藉由使重鏈可變域與輕鏈可變域(Fv區)片段經由胺基酸橋鍵(較短肽連接子)連接來形成，從而產生單多肽鏈。該等單鏈Fv(scFv)可藉由使編碼DNA(該等DNA編碼兩個可變域多肽(VL及VH))之間的肽連接子之DNA融合來製備。視兩個可變域之間的可撓性連接子之長度而定，所得多肽可自身摺疊回來以形成抗原結合單體，或其可形成多聚體(例如二聚體、三聚體或四聚體)(Kortt等人，1997,Prot.Eng. 10：423；Kortt等人，2001,Biomol.Eng. 18：95-108)。藉由將包含不同VL及VH之多肽合併，吾人可形成與不同抗原決定基結合之多聚scFv(Kriangkum等人，2001,Biomol.Eng. 18：31-40)。為製造單鏈抗體而研發之技術包括描述於以下文獻中之技術：美國專利第4,946,778號；Bird,1988,Science 242：423；Huston等人，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 85：5879；Ward等人，1989,Nature 334：544,de Graaf等人，2002,Methods Mol Biol. 178：379-387。衍生自本文提供之 抗體的單鏈抗體包含(但不限於)scFv，其包含表3A及3B中所示之重鏈及輕鏈可變區之可變域組合，或包括表4A及4B中所示之CDR的輕鏈及重鏈可變域組合。
可使用子類別轉換方法將本文中提供之一種子類別抗體變成不同子類別之抗體。因此，例如IgG抗體可衍生自IgM抗體，且反之亦然。該等技術允許製備具有既定抗體(親本抗體)之抗原結合性質且亦顯示與親本抗體不同之抗體同型或子類相關之生物性質的新穎抗體。可採用重組DNA技術。在該等程序中可採用編碼特定抗體多肽之經選殖之DNA，例如編碼所需同型之抗體之恆定域的DNA。參見例如Lantto等人，2002,Methods Mol.Biol. 178：303-316。
因此，所提供之抗體包括彼等包含例如上文所述之可變域組合、具有所需同型(例如IgA、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE及IgD)以及其Fab或F(ab')2片段之抗體。此外，若需要IgG4，則亦可能如Bloom等人，1997,Protein Science 6：407(其以引入的方式併入本文中)中所述需要在鉸鏈區中引入點突變(CPSCP->CPPCP)，以緩解形成H鏈內二硫鍵之趨勢，該H鏈內二硫鍵可在IgG4抗體中引起非均質性。
此外，亦已知用於產生具有不同性質(亦即對其所結合之抗原呈現不同親和力)之抗體之技術。一種該類技術(稱為鏈改組)涉及在絲狀噬菌體表面上展示免疫球蛋白可變域基因譜，通常稱為噬菌體展示。鏈改組已用於製備針對半抗原2-苯基噁唑-5-酮之高親和力抗體，如由Marks等人，1992,BioTechnology,10：779描述。
可對表3A及3B中所描述之重鏈及輕鏈可變區或表4A及4B中所描述之CDR進行保守修飾(且對編碼核酸進行相應修飾)以產生具有某些所需功能性及生物化學特徵之PAC1抗原結合蛋白質。實現該等修飾之方法描述於上文中。
PAC1抗體可進一步以各種方式修飾。舉例而言，若其將用於治 療目的，則其可與聚乙二醇結合(聚乙二醇化)以延長血清半衰期或增強蛋白質傳遞。或者，標的抗體或其片段之V區可與不同抗體分子之Fc區融合。可修飾用於此目的之Fc區以使其不結合補體，從而降低在融合蛋白質用作治療劑時誘導患者中細胞溶解之可能性。另外，標的抗體或其功能性片段可與人類血清白蛋白結合以增強抗體或其抗原結合片段之血清半衰期。抗體或其片段之另一適用的融合搭配物為轉甲狀腺素蛋白(TTR)。TTR具有形成四聚物之能力，因此抗體-TTR融合蛋白質可形成可增大其結合親合力之多價抗體。
或者，可藉由在維持(a)取代區域中分子主鏈之結構，例如片狀或螺旋狀構形，(b)目標位點處分子之電荷或疏水性或(c)側鏈之蓬鬆度中作用顯著不同之重鏈及輕鏈之胺基酸序列中產生取代來實現本文所述之抗體之功能及/或生物化學特徵的實質修飾。「保守性胺基酸取代」可涉及以非原生殘基取代原生胺基酸殘基，其對該位置處之胺基酸殘基的極性或電荷影響極小或無影響。參見表6，同前。此外，亦可用丙胺酸取代多肽中之任何原生殘基，如先前關於丙胺酸掃描突變誘發所描述。
可由熟習此項技術者藉由應用常規技術來實施標的抗體之胺基酸取代(無論保守性或非保守性)。胺基酸取代可用於確定本文提供之抗體的重要殘基或用於增加或降低此等抗體對人類PAC1之親和力或用於改良本文所述之其他抗體之結合親和力。
表現抗體之方法
本文亦提供包含至少一種如上文所述之聚核苷酸的呈質體、表現載體、轉錄或表現卡匣形式之表現系統及構築體，以及包含該等表現系統或構築體之宿主細胞。
本文提供之抗體可藉由習多個知技術中之任一者製備。例如PAC1抗體可藉由重組表現系統使用此項技術中已知之任何技術產 生。參見例如Monoclonal Antibodies,Hybridomas：A New Dimension in Biological Analyses,Kennet等人(編)Plenum Press,New York(1980)；及Antibodies：A Laboratory Manual,Harlow及Lane(編)，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1988)。
抗體可在融合瘤細胞株中表現(例如特定言之抗體可在融合瘤中表現)或在除融合瘤以外的細胞株中表現。編碼抗體之表現構築體可用於轉化哺乳動物、昆蟲或微生物宿主細胞。可使用將聚核苷酸引入宿主細胞中之任何已知方法進行轉化，該方法包括例如將聚核苷酸封裝於病毒或噬菌體中及藉由此項技術中已知之轉染程序用構築體轉導宿主細胞，如由美國專利第4,399,216號；第4,912,040號；第4,740,461號；第4,959,455號所例示。所用最佳轉化程序將視所轉化之宿主細胞為哪一類型而定。將異源聚核苷酸引入哺乳動物細胞中之方法為此項技術所熟知，且包括(但不限於)葡聚糖介導之轉染、磷酸鈣沈澱、凝聚胺(polybrene)介導之轉染、原生質體融合、電穿孔、聚核苷酸囊封於脂質體中、將核酸與帶正電之脂質混合、及將DNA直接顯微注射至細胞核中。
重組表現構築體通常包含編碼多肽之核酸分子，該多肽包含一或多個以下組成：本文提供之一或多個CDR；輕鏈恆定區；輕鏈可變區；重鏈恆定區(例如CH1、CH2及/或CH3)；及/或PAC1抗體之另一骨架部分。使用標準連接技術將該等核酸序列插入適當表現載體中。在一個實施例中，重鏈或輕鏈恆定區附加至抗PAC1特異性重鏈或輕鏈可變區之C末端且與表現載體連接。通常選擇在所用特定宿主細胞中有功能之載體(亦即載體與宿主細胞機構相容，從而允許進行基因之擴增及/或表現)。在一些實施例中，使用載體，該等載體使用蛋白質報導子(諸如二氫葉酸還原酶)採用蛋白質片段互補分析(參見例如美國專利第6,270,964號，其以引用的方式併入本文中)。可例如自 Invitrogen Life Technologies或BD Biosciences(先前為「Clontech」)購買合適之表現載體。用於選殖及表現抗體及片段之其他適用的載體包括描述於Bianchi及McGrew,2003,Biotech.Biotechnol.Bioeng. 84：439-44(其以引用的方式併入本文中)中之載體。其他合適之表現載體討論於例如Methods Enzymol.，第185卷(D.V.Goeddel編)，1990,New York：Academic Press中。
通常，用於任何宿主細胞中之表現載體將含有用於質體維持及用於選殖及表現外源性核苷酸序列之序列。在某些實施例中，總稱為「側接序列」之該等序列通常將包括一或多個以下核苷酸序列：啟動子、一或多個強化子序列、複製起點、轉錄終止序列、含有供者及受者剪接位點之完整內含子序列、編碼用於多肽分泌之前導序列的序列、核糖體結合位點、聚腺苷酸化序列、用於插入編碼待表現多肽之聚核苷酸的多酶切點接頭區域及可選擇標記元件。以下討論各個此等序列。
載體可視情況含有「標籤」編碼序列，即位於PAC1結合蛋白編碼序列之5'或3'端之寡核苷酸分子；寡核苷酸序列編碼多聚組胺酸(諸如六聚組胺酸)或另一「標籤」，諸如FLAG®、HA(血球凝集素流感病毒)或myc，針對該等標籤存在可在市面上購得之抗體。此標籤通常在多肽表現後與多肽融合，且可充當用於PAC1結合蛋白自宿主細胞中親和純化或偵測之方法。親和力純化可例如使用針對標籤之抗體作為親和基質藉由管柱層析來實現。可隨後藉由各種手段(諸如使用某些裂解用肽酶)視情況將標籤自經純化之PAC1結合蛋白中移除。
側接序列可為同源(亦即來自與宿主細胞相同之物種及/或菌株)、異源(亦即來自不同於宿主細胞物種或品系之物種)、雜交(亦即來自一個以上來源之側接序列的組合)、合成或原生序列。因此，側接序列之來源可為任何原核或真核生物體、任何脊椎動物或無脊椎動 物生物體或任何植物，其限制條件為側接序列在宿主細胞機構中有功能且可由宿主細胞機構活化。
適用於載體中之側接序列可藉由此項技術中所熟知之若干方法中之任一者獲得。通常，適用於本文中之側接序列將已藉由測繪及/或藉由限制性核酸內切酶消化預先識別且因此可使用適當限制性核酸內切酶自適當組織來源中分離。在一些情況下，可已知側接序列之全核苷酸序列。在本文中，可使用本文中所述用於核酸合成或選殖之方法來合成側接序列。
無論已知側接序列之全部或僅一部分，其均可使用聚合酶鏈反應(PCR)及/或藉由用適合探針(諸如來自相同或不同物種之寡核苷酸及/或側接序列片段)篩選基因組文庫來獲得。當側接序列為未知時，含有側接序列之DNA片段可自可含有例如編碼序列或甚至其他基因之較大片DNA分離。可藉由限制性核酸內切酶消化實現分離，以產生適當DNA片段，隨後使用瓊脂糖凝膠純化、Qiagen®管柱層析(Chatsworth,CA)或熟習此項技術者所已知之其他方法來分離。選擇合適之酶來實現此目的對於一般技術者將顯而易知。
複製起點通常為在市面上購得之彼等原核表現載體的一部分，且該起點有助於載體在宿主細胞中擴增。若所選載體不含複製起點位點，則其可基於已知序列化學合成且接入載體中。舉例而言，來自質體pBR322(New England Biolabs,Beverly,MA)之複製起點適合於大部分革蘭氏陰性細菌(gram-negative bacteria)，且各種病毒起點(例如SV40、多瘤病毒、腺病毒、水泡性口炎病毒(VSV)或乳頭狀瘤病毒(諸如HPV或BPV))適用於在哺乳動物細胞中選殖載體。哺乳動物表現載體一般不需要複製起點組分(例如通常僅使用SV40起點，因為其亦含有病毒早期啟動子)。
轉錄終止序列通常位於多肽編碼區末端之3'方向且用以終止轉 錄。通常，原核細胞中之轉錄終止序列為富含G-C之片段，其後為聚T序列。儘管序列易於自文庫選殖或甚至以載體之部分形式市售，但其亦可使用核酸合成方法(諸如本文所述之核酸合成方法)輕易合成。
可選擇標記基因編碼在選擇性培養基中生長之宿主細胞之存活及生長所必需之蛋白質。典型選擇標記基因編碼如下蛋白質：(a)賦予對抗生素或其他毒素(例如用於原核宿主細胞之安比西林(ampicillin)、四環素(tetracycline)或康黴素(kanamycin))之抗性；(b)補充細胞之營養缺陷；或(c)供應無法自複合培養基或限定培養基獲得之關鍵營養物。特定可選擇標記為康黴素抗性基因、安比西林抗性基因及四環素抗性基因。有利的為，新黴素(neomycin)抗性基因亦可用於原核與真核宿主細胞中之選擇。
其他可選擇基因可用於擴增將表現之基因。擴增為使產生對於生長或細胞存活為關鍵之蛋白質所需之基因在連續數代重組細胞之染色體中串聯重複的過程。適合於哺乳動物細胞之可選擇標記的實例包括二氫葉酸還原酶(DHFR)及無啟動子胸苷激酶基因。將哺乳動物細胞轉化體置於選擇壓力下，其中由於載體中存在可選擇基因而使僅轉化體唯一適應得以存活。選擇壓力藉由在其中培養基中選拔劑濃度連續增加之條件下培養轉化細胞而施加，由此引起可選基因與編碼另一基因(諸如與PAC1結合之抗體)之DNA的擴增。因此，諸如抗體之多肽之增加量自擴增之DNA合成。
核糖體結合位點通常為mRNA之轉譯起始所必需且特徵為夏因-達爾加諾(Shine-Dalgarno)序列(原核生物)或克紮克(Kozak)序列(真核生物)。該元件通常位於啟動子之3'及待表現多肽之編碼序列之5'。
在一些情況下，諸如當真核宿主細胞表現系統中需要糖基化時，可操作各種前序列或原序列來改良糖基化或產量。舉例而言，可改變特定信號肽之肽酶裂解位點，或添加原序列，其亦可影響糖基 化。最終蛋白質產物可能在-1位置(相對於成熟蛋白質之第一胺基酸)具有一或多個附帶表現之額外胺基酸，其可尚未完全移除。舉例而言，最終蛋白質產物可具有在肽酶裂解位點所見之一或兩個胺基酸殘基，其連接至胺基端。或者，使用一些酶裂解位點可產生所需多肽之稍微截短的形式，若該酶在成熟多肽中之該區域切割。
表現及選殖將通常含有由宿主生物體識別且可操作地連接於編碼PAC1結合蛋白之分子的啟動子。啟動子為位於結構基因起始密碼子之上游(亦即5')的非轉錄序列(一般在約100至1000bp內)，其控制該結構基因之轉錄。啟動子習知地分為兩類之一：誘導性啟動子及組成性啟動子。誘導性啟動子回應於培養條件之一些變化(諸如存在或不存在營養物或溫度變化)引發在其控制下自DNA之轉錄量增加。另一方面，組成性啟動子均一地轉錄其可操作地連接之基因，亦即對基因表現之控制極小或無控制。熟知大量可由多種潛在宿主細胞所識別之啟動子。藉由利用限制酶分解及將所需啟動子序列插入載體中自源DNA中移除啟動子，可使合適之啟動子可操作地連接於編碼包含PAC1結合蛋白之重鏈或輕鏈之DNA。
此項技術中亦熟知適用於酵母宿主之啟動子。酵母強化子宜與酵母啟動子一起使用。適合用於哺乳動物宿主細胞之啟動子為人所熟知，且包含(但不限於)自諸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(諸如腺病毒2)、牛乳頭狀瘤病毒、鳥肉瘤病毒、巨細胞病毒、反轉錄病毒、B型肝炎病毒及猴病毒40(SV40)之病毒的基因組獲得之啟動子。其他合適之哺乳動物啟動子包括異源哺乳動物啟動子，例如熱休克啟動子及肌動蛋白啟動子。
其他所關注之啟動子可包括(但不限於)：SV40早期啟動子(Benoist及Chambon,1981,Nature 290：304-310)；CMV啟動子(Thornsen等人，1984,Proc.Natl.Acad.U.S.A.81：659-663)；包含在勞 斯氏肉瘤病毒之3'長末端重複序列中之啟動子(Yamamoto等人，1980,Cell 22：787-797)；疱疹胸苷激酶啟動子(Wagner等人，1981,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：1444-1445)；來自金屬硫蛋白基因之啟動子及調節序列(Prinster等人，1982,Nature 296：39-42)；及諸如β內醯胺酶啟動子之原核啟動子(Villa-Kamaroff等人，1978,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75：3727-3731)；或tac啟動子(DeBoer等人，1983,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：21-25)。所關注之啟動子亦為以下動物轉錄控制區，其展現組織特異性及已用於轉殖基因動物中：在胰腺腺泡細胞中有活性之彈性蛋白酶I基因控制區(Swift等人，1984,Cell 38：639-646；Ornitz等人，1986,Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol. 50：399-409；MacDonald,1987,Hepatology 7：425-515)；在胰腺β細胞中有活性之胰島素基因控制區(Hanahan,1985,Nature 315：115-122)；在淋巴細胞中有活性之免疫球蛋白基因控制區(Grosschedl等人，1984,Cell 38：647-658；Adames等人，1985,Nature 318：533-538；Alexander等人，1987,Mol.Cell.Biol. 7：1436-1444)；在睾丸、乳房、淋巴及肥大細胞中有活性之小鼠乳房腫瘤病毒控制區(Leder等人，1986,Cell 45：485-495)；在肝臟中有活性之白蛋白基因控制區(Pinkert等人，1987,Genes and Devel.1：268-276)；在肝臟中有活性之α-胎兒蛋白基因控制區(Krumlauf等人，1985,Mol.Cell.Biol. 5：1639-1648；Hammer等人，1987,Science 253：53-58)；在肝臟中有活性之α1抗胰蛋白酶基因控制區(Kelsey等人，1987,Genes and Devel.1：161-171)；在骨髓細胞中有活性之β血球蛋白基因控制區(Mogram等人，1985,Nature 315：338-340；Kollias等人，1986,Cell 46：89-94)；在大腦中之少突細胞中有活性之髓鞘鹼性蛋白基因控制區(Readhead等人，1987,Cell 48：703-712)；在骨胳肌肉中有活性之肌球蛋白輕鏈-2基因控制區(Sani,1985,Nature 314：283-286)；及在丘腦下部中有活性之促性腺素釋放激素基 因控制區(Mason等人，1986,Science 234：1372-1378)。
強化子序列可插入載體中以增加高等真核生物之編碼包含人類PAC1結合蛋白之輕鏈或重鏈之DNA的轉錄。強化子為DNA之順式作用元件，通常長度為約10-300bp，其作用於啟動子以增加轉錄。強化子相對不依賴於取向及位置，已發現其位於轉錄單元之5'與3'方向的位置。可自哺乳動物基因獲得之若干個強化子序列為已知的(例如血球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-胎兒蛋白及胰島素)。然而，通常使用來自病毒之強化子。此項技術中已知之SV40強化子、細胞巨大病毒早期啟動子強化子、多瘤病毒強化子及腺病毒強化子為用於活化真核啟動子之例示性強化元件。當強化子可位於載體中編碼序列之5'或3'方向時，其通常位於啟動子5'之位點。編碼適當原生或異源信號序列(前導序列或信號肽)之序列可併入表現載體中以促進抗體之細胞外分泌。信號肽或前導序列之選擇視待產生抗體之宿主細胞的類型而定，且異源信號序列可置換原生信號序列。在哺乳動物宿主細胞中具有功能之信號肽的實例包括以下：美國專利第4,965,195號中所述之介白素-7的信號序列；Cosman等人，1984,Nature 312：768中所述之介白素-2受體的信號序列；EP專利第0367 566號中所述之介白素-4受體信號肽；美國專利第4,968,607號中所述之I型介白素-1受體信號肽；EP專利第0 460 846號中所述之II型介白素-1受體信號肽。
所提供之表現載體可自起始載體(諸如市售載體)建構。該等載體可含有或可不含所有所需側接序列。當本文所述之一或多個側接序列尚不存在於載體中時，其可個別地獲得且連接於載體中。用於獲得各側接序列之方法為熟習此項技術者所熟知。
在已建構載體且已將編碼包含PAC1抗原結合序列之輕鏈、重鏈或輕鏈及重鏈的核酸分子插入載體之適當位點中之後，可將完成的載體插入合適之宿主細胞中以便擴增及/或多肽表現。抗體之表現載體 轉化進選擇宿主細胞中可藉由以下熟知方法實現，包括轉染、侵染、鈣磷酸鹽共沈澱、電穿孔、顯微注射、脂質體轉染、DEAE聚葡萄糖介導轉染或其他已知技術。所選方法將部分地隨所用宿主細胞之類型而變。此等方法及其他合適之方法為熟習此項技術者所熟知，且陳述於例如Sambrook等人，2001，同前文獻中。
宿主細胞當在適當條件下培養時合成抗體，其可隨後自培養基中收集(若宿主細胞將其分泌至培養基中)或直接自產生其之宿主細胞中收集(若其不被分泌)。適當宿主細胞之選擇將視多種因素而定，諸如所需表現量、活性所需或必需之多肽修飾(諸如糖基化或磷酸化)及摺疊成生物活性分子之容易性。
可獲得用作表現宿主的哺乳動物細胞株為此項技術中所熟知且包括(但不限於)購自美國菌種保存中心(American Type Culture Collection，ATCC)之永生化細胞株，包括(但不限於)中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、海拉細胞(HeLa cell)、幼倉鼠腎(BHK)細胞、猴腎細胞(COS)、人類肝細胞癌細胞(例如Hep G2)及許多其他細胞株。在某些實施例中，可經由測定哪些細胞株具有高表現量且組成性地產生具有PAC1結合特性之抗體來選擇細胞株。在其他實施例中，可選擇來自不能產生其自身抗體但能夠產生及分泌異源抗體之B細胞譜系的細胞株
人類PAC1抗體用於診斷及治療目的之用途
抗體適用於偵測生物樣品中之PAC1及鑑別產生PAC1之細胞或組織。舉例而言，PAC1抗體可用於診斷分析，例如結合分析以偵測及/或定量組織或細胞中所表現之PAC1。與PAC1特異性結合之抗體亦可用於治療有需要之患者中與PAC1相關之疾病。另外，PAC1抗體可用於抑制PAC1形成與其配位體PACAP(例如PACAP-38)之複合物，由此調節細胞或組織中之生物活性。可調節之活性之實例包括(但不限於) 抑制血管擴張及/或降低神經性炎症。與PAC1結合之抗體由此可調變及/或阻斷其與其他結合化合物之相互作用且因而可具有改善與PAC1相關之疾病的治療用途。
適應症
與人類PAC1相關之疾病或病症包括在患者中發作之任何疾病或病症，其至少部分由PAC1與其配位體(PACAP(例如PACAP-38))相互作用所造成。疾病或病症之嚴重度亦可藉由PAC1與PACAP(例如PACAP-38)之相互作用增加或降低。可經本文所述之抗體治療之疾病及病症的實例包括頭痛(諸如叢集頭痛、包括偏頭痛頭痛之偏頭痛)、慢性疼痛、II型糖尿病、炎症(例如神經性炎症)、心血管疾病及與內毒血症及敗血症相關之血液動力學紊亂。
特定言之，本文所述之抗體可用於治療偏頭痛，如在偏頭痛攻擊已開始之後進行急性治療及/或如例如按每天、每週、每兩週、每月、每兩月、每兩年投藥進行預防治療以防止或降低症狀(例如與偏頭痛攻擊攻擊相關之疼痛症狀)之頻率及/或嚴重度。
注射PAC1受體促效劑PACAP在偏頭痛患者中引起偏頭痛狀頭痛，其表明阻斷PAC1可適用於治療偏頭痛。支持本發明在食蟹獼猴中所進行之免疫組織化學研究經確定PACAP及PAC1在通過蝶齶骨神經節(SPG；亦稱為翼突齶神經節)之副交感神經路徑中的位置，該蝶齶骨神經節亦刺激硬腦膜脈管活動。副交感神經路徑為獨立的且平行於亦控制硬腦膜脈管緊張性之感覺路徑，因此其可能在偏頭痛病理生理學中起作用。支持本發明所進行之其他實驗展示選擇性PAC1 Ab阻斷電刺激之三叉宮頸複合體(TCC)的激活，已據報導與臨床偏頭痛功效相關之電生理模型。綜合而言，證據支持將具有如本文所述之選擇性拮抗劑(諸如抗PAC1抗體)的PAC1定向用於治療偏頭痛。抗PAC1治療用於治療人類患者中偏頭痛之預期功效進一步藉由已公佈的論文支 持，包括例如Schytz,H.W.等人，「The PACAP receptor：a novel target for migraine treatment」,Neurotherapeutics.2010年4月；7(2)：191-6；Olesen J.等人，「Emerging migraine treatments and drug targets」,Trends Pharmacol Sci.2011年6月；32(6)：352-9；及Schytz,H.W.等人，「PACAP38 induces migraine-like attacks in patients with migraine without aura」,Brain(2009)132(1)：16-25。
叢集性頭痛為涉及一邊、巨大程度之疼痛(作為最突出特徵)之病症。一些醫生及科學家已將由叢集頭痛產生之疼痛描述為人類可忍受之最強烈的疼痛，其比生產、灼痛或骨折更糟。叢集頭痛通常週期性出現：自動緩解中斷疼痛之作用週期。叢集性頭痛發作之平均年齡為約30-50歲。在男性中更為普遍，其中雄性與雌性比變化為2.5：1或3.5：1。SPG刺激已用於治療叢集性頭痛。最近，Autonomic Technologies已開發ATITM神經刺激系統來傳遞低水準(但高頻，生理阻斷)電刺激以提供急性SPG刺激治療，其目的為減輕叢集性頭痛之急性使人衰弱的疼痛。已在其最新的臨床試驗中顯示強大的功效(NCT01616511；Schoenen J等人，「Stimulation of the sphenopalatine ganglion(SPG)for cluster headache treatment.Pathway CH-1：A randomized,sham-controlled study」,Cephalalgia.2013；33(10)：816-30)。鑒於上文且由於PACAP為SPG中主要神經傳遞素中之一者，因此諸如本文所述之抗PAC1抗體之PAC1受體拮抗劑預期對治療人類中叢集性頭痛具有功效。
診斷方法
本文所述之抗體出於診斷目的可用於偵測、診斷或監測與PAC1相關之疾病及/或病症。亦提供用於偵測樣品中PAC1之存在的方法，使用為熟習此項技術者所知的經典免疫組織化學方法(例如Tijssen,1993,Practice and Theory of Enzyme Immunoassays，第15卷(R.H. Burdon及P.H.van Knippenberg編，Elsevier,Amsterdam)；Zola,1987,Monoclonal Antibodies：A Manual of Techniques，第147-158頁(CRC Press,Inc.)；Jalkanen等人，1985,J.Cell.Biol. 101：976-985；Jalkanen等人，1987,J.Cell.Biol. 105：3087-3096)。PAC1偵測可在活體內或活體外進行。
本文提供之診斷應用包括使用抗體用於偵測PAC1表現及配位體與PAC1之結合。適用於偵測PAC1之存在之方法的實例包括免疫分析，諸如酶聯結免疫吸附劑分析(ELISA)及放射免疫分析(RIA)。
對於診斷應用，通常將用可偵測標記基團標記抗體。合適之標記基團包含(但不限於)以下標記基團：放射性同位素或放射性核素(例如3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、螢光基團(例如FITC、若丹明、鑭系元素磷光體)、酶促基團(例如辣根過氧化酶、β半乳糖、螢光素酶、鹼性磷酸酶)、化學發光基團、生物素基團或由二次報導體識別之預定多肽抗原決定基(例如白胺酸拉鏈對序列、二級抗體之結合位點、金屬結合域、抗原決定基標籤)。在一些實施例中，標記基團經由各種長度之間隔臂與抗體偶合以降低潛在位阻。用於標記蛋白質之各種方法為此項技術中已知的且可使用。
在另一態樣中，抗體可用於鑑別表現PAC1之細胞(cell/cells)。在特定實施例中，用標記基團標記抗體且偵測經標記之抗體與PAC1之結合。在另一特定實施例中，在活體內偵測抗體與PAC1之結合。在另一特定實施例中，PAC1抗體使用此項技術中已知之技術分離及量測。參見例如Harlow及Lane,1988,Antibodies：A Laboratory Manual,New York：Cold Spring Harbor(1991版及週期增刊)；John E.Coligan編，1993,Current Protocols In Immunology New York：John Wiley及Sons。
另一態樣提供偵測與提供之抗體競爭結合PAC1之測試分子的存 在。一種該分析之實例將涉及在測試分子存在或不存在之情況下偵測含有一定量PAC1之溶液中游離抗體之量。游離抗體(亦即不與PAC1結合之抗體)之量增加將表明測試分子能夠與抗體競爭性結合PAC1。在一個實施例中，用標記基團標記抗體。或者，標記測試分子且在抗體存在及不存在之情況下監測游離測試分子之量。
治療之方法：醫藥調配物，投藥路線
亦提供使用抗體之方法。在一些方法中，將抗體提供至患者。抗體抑制PACAP(例如PACAP-38)與人類PAC1結合。
亦提供包含治療有效量之一個或複數個抗體之醫藥組合物及醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑、增溶劑、乳化劑、防腐劑及/或佐劑。另外，包括藉由投與該醫藥組合物治療患者例如偏頭痛之方法。術語「患者」包括人類患者。
可接受之調配物質在所用劑量及濃度下對接受者無毒性。在特定實施例中，提供包含治療有效量之人類PAC1抗體之醫藥組合物。
在某些實施例中，可接受之調配物質較佳在所採用之劑量及濃度下對接受者無毒。在某些實施例中，醫藥組合物可包含調配物質供修飾、維持或保存(例如)該組合物之pH值、容積滲透濃度、黏度、澄清度、顏色、等張性、氣味、無菌度、穩定性、溶解或釋放速率、吸附或穿透。在該等實施例中，合適之調配物質包含(但不限於)胺基酸(諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、精胺酸或離胺酸)；抗菌劑；抗氧化劑(諸如抗壞血酸、亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉)；緩衝劑(諸如硼酸鹽、碳酸氫鹽、Tris-HCl、檸檬酸鹽、磷酸鹽或其他有機酸)；膨化劑(諸如甘露醇或甘胺酸)；螯合劑(諸如乙二胺四乙酸(EDTA))；複合劑(諸如咖啡鹼、聚乙烯吡咯啶酮、β環糊精或羥丙基-β環糊精)；填充劑；單醣；雙醣；及其他碳水化合物(諸如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白質(諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白)；著色、調味及稀釋 劑；乳化劑；親水性聚合物(諸如聚乙烯吡咯啶酮)；低分子量多肽；鹽形成相對離子(諸如鈉)；防腐劑(諸如苯紮氯銨、苯甲酸、水楊酸、硫柳汞、苯乙基醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或過氧化氫)；溶劑(諸如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(諸如甘露醇或山梨醇)；懸浮劑；界面活性劑或潤濕劑(諸如普洛尼克(pluronic)、PEG、脫水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯(諸如聚山梨醇酯20)、聚山梨醇酯、特立通(triton)、緩血酸胺、卵磷脂、膽固醇、泰洛沙泊(tyloxapal))；穩定性強化劑(諸如蔗糖或山梨醇)；張力強化劑(諸如鹼金屬鹵化物(較佳氯化鈉或氯化鉀)、甘露醇山梨醇)；傳遞媒劑；稀釋劑；賦形劑及/或醫藥佐劑。參見REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES,18"版，(A.R.Genrmo編)，1990,Mack Publishing Company。
在某些實施例中，最佳醫藥組合物將由熟習此項技術者視例如預期投與途徑、傳遞型式及所需劑量確定。參見例如REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES，同前。在某些實施例中，該等組合物可影響所揭示之抗體的物理狀態、穩定性、活體內釋放速率及活體內清除速率。在某些實施例中，醫藥組合物中之原始媒劑或載劑天然可為含水或不含水的。舉例而言，合適之媒劑或載劑可為可能以非經腸投與之組合物中共有之其他材料補充的注射用水、生理食鹽水溶液或人工腦脊液。中性緩衝生理食鹽水或與血清白蛋白混合之生理食鹽水為另外的例示性媒劑。在特定實施例中，醫藥組合物包含pH值約為7.0-8.5之Tris緩衝劑或pH值約為4.0-5.5之醋酸鹽緩衝劑，其可進一步包括山梨糖醇或其合適之替代物。在某些實施例中，可藉由將具有所需純度之所選組合物與視情況呈凍乾餅狀或水溶液形式之調配劑(REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES，同前文獻)混合來製備人類PAC1抗體組合物以便儲存。另外，在某些實施例中，可使 用適當的賦形劑(諸如蔗糖)將人類PAC1抗體調配成凍乾物。
可選擇醫藥組合物用於非經腸傳遞。或者，組合物可經選擇用以吸入或經由消化道(諸如經口)傳遞。該等醫藥學上可接受之組合物之製備在此項技術範圍內。
調配組分較佳以投藥部位可接受之濃度存在。在某些實施例中，緩衝劑用以將組合物維持在生理pH值或略微較低之pH值，通常在約5至約8之pH值範圍內。
當考慮非經腸投與時，可以於醫藥學上可接受之媒劑中之包含所需人類PAC1結合蛋白之不含熱原質非經腸可接受之水溶液形式提供治療組合物。尤其適合於非經腸注射之媒劑為無菌蒸餾水，其中人類PAC1抗體調配成恰當保存之無菌等滲溶液。在某些實施例中，製備可涉及所需分子與諸如可注射微球、生物易侵蝕粒子、聚合化合物(諸如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠粒或脂質體之試劑一起調配，該試劑可提供可經由積存注射傳遞之產物的受控或持續釋放。在某些實施例中，亦可使用玻尿酸，具有促進循環之持久性持續的作用。在某些實施例中，可使用可植入藥物傳遞裝置以引入所需抗體。
調配某些醫藥組合物用於吸入。在一些實施例中，將人類PAC1抗體調配成乾燥、可吸入式的粉末。在特定實施例中，亦可用推進劑調配人類PAC1抗體吸入溶液以便進行氣溶膠傳遞。在某些實施例中，溶液可經霧化。因此經肺投與及調配方法進一步描述於國際專利申請案第PCT/US94/001875號中，其以引用的方式併入且描述經肺傳遞化學改質蛋白質。一些調配物可經口投與。以此方式投與之人類PAC1抗體可用或不用通常用於混配固體劑型(諸如錠劑及膠囊)之載劑來調配。在某些實施例中，可設計膠囊以於使胃腸道中生物可用性最大化及使體循環前降解最小化時之時刻釋放調配物之活性部分。可包括其他藥劑以促進人類PAC1抗體之吸收。亦可採用稀釋劑、調味 劑、低熔點蠟、植物油、潤滑劑、懸浮劑、錠劑崩解劑及黏合劑。
一些醫藥組合物包含呈與適合於製造錠劑之無毒賦形劑之混合物形式的有效量之一種或複數種人類PAC1抗體。藉由將錠劑溶解於無菌水或其他適當之媒劑中，可製備單位劑型之溶液。合適之賦形劑包括(但不限於)：惰性稀釋劑，諸如碳酸鈣、碳酸鈉或碳酸氫鈉、乳糖或磷酸鈣；或黏合劑，諸如澱粉、明膠或阿拉伯膠；或潤滑劑，諸如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。
對於熟習此項技術者其他醫藥組合物將顯而易見，包括在持續或受控傳遞之調配物中涉及人類PAC1抗體的調配物。用來調配多種其他持續或受控制傳遞手段(諸如脂質體載劑、生物可侵蝕微粒或多孔珠粒及積存注射劑)之技術，亦為熟習此項技術者所已知。見例如國際專利申請案PCT/US93/00829，其描述供傳遞醫藥組合物之多孔聚合微粒之受控釋放。持續釋放製劑可包括呈成形物品(例如膜或微囊)形式之半滲透性聚合物基質。持續釋放基質可包括聚酯、水凝膠、聚乳酸交酯(如美國專利第3,773,919號及歐洲專利申請公開案第EP 058481號中所揭示，其各自以引用的方式併入)、L-麩胺酸與γ乙基-L-麩胺酸之共聚物(Sidman等人，1983,Biopolymers 2：547-556)、聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)(Langer等人，1981,J.Biomed.Mater.Res. 15：167-277及Langer,1982,Chem.Tech. 12：98-105)、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等人，1981，同前文獻)或聚-D(-)-3-羥基丁酸(歐洲專利申請公開案第EP 133,988號)。持續釋放組合物亦可包括可藉由此項技術中已知之若干方法中之任一者製備之脂質體。參見例如Eppstein等人，1985,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：3688-3692；歐洲專利申請公開案第EP 036,676號；第EP 088,046號及第EP 143,949號，其以引用的方式併入。
用於活體內投與之醫藥組合物通常以無菌製劑形式提供。可藉 由經由無菌過濾膜過濾實現滅菌。當組合物經凍乾時，使用該方法之殺菌操作可於凍乾及復水之前或之後執行。用於非經腸投與之組合物可以凍乾形式或溶液形式儲存。一般將非經腸組合物置放於具有無菌取孔(access port)之容器中，例如具有可藉由皮下注射針接合之塞子之靜脈溶液袋或小瓶。
在某些實施例中，表現如本文所揭示之重組抗體的細胞經囊封用於傳遞(見Invest.Ophthalmol Vis Sci 43：3292-3298,2002及Proc.Natl.Acad.Sciences 103：3896-3901,2006)。
在某些調配物中，抗體具有至少10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml、100mg/ml或150mg/ml之濃度。一些調配物含有緩衝液、蔗糖及聚山梨醇酯。調配物之實例為含有50-100mg/ml抗體、5-20mM乙酸鈉、5-10% w/v蔗糖及0.002-0.008% w/v聚山梨醇酯之調配物。舉例而言，某些調配物在9-11mM乙酸鈉緩衝液中含有之65-75mg/ml抗體、8-10% w/v蔗糖及0.005-0.006% w/v聚山梨醇酯。某些該等調配物之pH值在4.5-6範圍內。其他調配物之pH值為5.0-5.5(例如pH值為5.0、5.2或5.4)。
醫藥組合物一經調配，即可以溶液、懸浮液、凝膠、乳液、固體或脫水或凍乾粉末儲存於無菌小瓶中。該等調配物可以即用形式或需要於投與前復水之形式(例如凍乾形式)儲存。亦提供用於產生單劑量投與單元之套組。某些套組含有具有乾燥蛋白質之第一容器及具有含水調配物之第二容器。在某些實施例中，提供含有單室及多室預填充注射器(例如液體注射器及冷凍乾燥物注射器)之套組。待使用之含有人類PAC1抗體之醫藥組合物之治療有效量將視例如治療環境及目標而定。熟習此項技術者應瞭解，治療之適當劑量水準將部分地視所傳遞分子、使用人類PAC1抗體之適應症、投藥途徑及患者之尺寸(體 重、體表或器官尺寸)及/或條件(年齡及整體健康)而變化。在某些實施例中，臨床醫師可滴定劑量及修改投藥途徑以獲得最優治療性效果。
典型劑量可由約1μg/kg至多達約30mg/kg或更多變動，此視以上所提及之因子而定。在特定實施例中，劑量可在10μg/kg高至約30mg/kg、視情況0.1mg/kg高至約30mg/kg或者0.3mg/kg高至約20mg/kg範圍內。在一些應用中，劑量為0.5mg/kg至20mg/kg。在一些情況下，抗體按0.3mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、3mg/kg、10mg/kg或20mg/kg給藥。在一些治療方案中，劑量時程按0.3mg/kg qW、0.5mg/kg qW、1mg/kg qW、3mg/kg qW、10mg/kg qW或20mg/kg qW之劑量。
給藥頻率將視所用調配物中特定人類PAC1抗體之藥物動力學參數而定。通常，臨床醫生投與組合物直至達到達成理想效果之劑量。因此，組合物可隨時間以單次劑量或以兩次或兩次以上劑量(其可含有或可不含相同量之所需分子)投與，或經由植入裝置或導管以連續輸注形式投與。合適的劑量可經由使用合適的劑量-反應資料來確定。在某些實施例中，可在整個延長時段中向患者投與抗體。長期投與抗體使通常與不為純人類抗體(例如抗非人類動物中之人抗原的抗體，例如在非人類中產生之非全人抗體或非人類抗體)相關之不良免疫或過敏反應減至最少。
醫藥組合物之投藥途徑係根據已知方法，例如經口；經由靜脈內、腹膜內、腦內(實質內)、腦室內、肌肉內、眼內、動脈內、門靜脈內或病灶內途徑之注射；藉由持續釋放系統或藉由植入裝置。在某些實施例中，可藉由快速注射或藉由連續輸液或藉由植入裝置投與組合物。
亦可經由已吸收或囊封有所需分子之膜、海綿或另一適當材料 之植入來局部投與組合物。在某些實施例中，當使用植入裝置時，可將裝置植入任何合適之組織或器官中，且所需要分子之傳遞可經由擴散、定時釋放丸劑或連續投藥。
活體外使用人類PAC1抗體醫藥組合物亦可為所需的。在該等情況下，已自患者中移除之細胞、組織或器官曝露於人類PAC1抗體醫藥組合物，其後細胞、組織及/或器官隨後植回患者中。
特定言之，人類PAC1抗體可藉由使用諸如本文所述之彼等方法之方法植入已經基因工程改造之某些細胞來傳遞，從而表現及分泌多肽。在某些實施例中，該等細胞可為動物或人類細胞，且可為自體、異種或異基因。在某些實施例中，細胞可經永生化。在其他實施例中，為減少免疫學反應之機會，可包裹該等細胞以避免浸潤周圍組織。在另外的實施例中，包裹物質通常為生物相容、半滲透之聚合殼或膜，其容許該(等)蛋白質產物釋放但防止患者免疫系統或其他來自周圍組織之有害因子破壞該等細胞。
以下實例(包括所進行之實驗及所達成之結果)僅出於說明性目的提供且不應理解為限制隨附申請專利範圍之範疇。
實例1 PAC1抗體 A.產生抗PAC1抗體
抗體經由使用標準方法(例如實質上如美國專利公開案US 2010-0172895 A1中詳述)，用PAC1細胞外域蛋白質、用T細胞抗原決定基標籤標記之DNA、表現全長人類PAC1之L1.2細胞及其他hPAC1抗原對XENOMOUSE動物進行免疫接種而產生。
B.篩檢抗PAC1抗體
篩檢融合瘤上清液用於與PAC1結合以及用於分析功能拮抗劑活性，偵測其藉由用PACAP(例如PACAP-27或PACAP-38)或選擇性、外 源性肽配位體(Maxadilan)激活PAC1來阻斷cAMP產生之能力，且隨後針對相關受體VPAC1及VPAC2進行逆向篩檢。彼等具有所需功能及選擇性之上清液針對功能及選擇性同樣使用標準方法進行測序及選殖、重組表現、純化及測試，例如實質上如美國專利公開案US 2010-0172895 A1中詳述，其以引用的方式併入本文中。
C.PAC1促效劑之選擇性
進行實驗以分析針對相關受體PAC1、VPAC1及VPAC2之三種PAC1促效劑(PACAP、VIP及Maxadilan)之活性及選擇性。來自此等實驗之資料展示於以下表7中，且顯示PACAP對所有三個受體具有類似促效劑活性，VIP對PAC1具有一定活性但對VPAC1及VPAC2具有更高活性(約10-100×)，及Maxadilan對於PAC1相較於VPAC1及VPAC2具有高度選擇性。
實例2 在cAMP功能分析中PAC1特異性阻斷單株抗體之活性 A.抗PAC1抗體之活性
在活體外PAC1介導cAMP分析中篩檢如本文所述之所選擇的hPAC1抗體以確定內在效能。分析採用SH-SY-5Y，一種內源性表現hPAC1之人神經母細胞瘤細胞株(Biedler,J.L.等人，1978,「Multiple neurotransmitter synthesis by human neuroblastoma cell lines and clones」.Cancer Res.38(11 Pt 1)：3751-7；Lutz,E.M.等人，「Characterization of novel splice variants of the PAC1 receptor in human neuroblastoma cells：consequences for signaling by VIP and PACAP」Mol Cell Neurosci 2006；31：193-209)，及表現具有以下寄存編號之重組PAC1、VPAC1及VPAC2結構的若干細胞株：人類PAC1(hPAC1)：NM_001118.4；短hPAC1(89-109胺基酸殘基缺失(使用範圍：1-88，110-468)之hPAC1)：NM_001199637.1；獼猴PAC1：XM_005549858.1；大鼠PAC1：NM_133511.2；小鼠PAC1：NM_001025372.2；人VPAC1(hVPAC1)：NM_004624.3；人VPAC2(hVPAC2)：NM_003382.4；大鼠VPAC2：NM_017238.1；小鼠VPAC2：NM_009511.2。
SHSY-5Y細胞在初代細胞培養液(MEM)(Invitrogen 11095-072)及漢姆氏F12營養混合物(Invitrogen 11765-047)之1：1混合物、10%胎牛血清(Invitrogen 10099-141)、1×青黴素-鏈黴素-麩醯胺酸(Invitrogen 10378016)及1×MEM非必需胺基酸(Invitrogen 11140-050)中生長。PAC1-CHO、大鼠PAC1及獼猴PAC1細胞在杜爾貝科氏改良伊格爾培養基(DMEM)(Gibco目錄號11965)、10%經透析之FBS(Invitrogen 26400044)、1%MEM非必需胺基酸(Invitrogen 11140-050)、1%丙酮酸鈉(Invitrogen 11360070)、1%麩醯胺酸/青黴素/鏈黴素(Invitrogen 10378016)中生長。CHO-Trex-大鼠及小鼠VPAC2R穩定之細胞株在基本培養基中生長：F12(Invitrogen 11765-047)、1×P/S/G(Invitrogen 10378016)、10%加熱失活FBS(Invitrogen 10100147)、5μg/ml殺稻瘟菌素(Invitrogen R21001)及400μg/ml潮黴素(Invitrogen 10687010)。用3.5μg/ml之四環素(Sigma 87128)誘導細胞，在分析之前24小時添加。hPAC1-CHO-K1細胞(Perkin Elmer；ES-272-A)在漢姆氏F12(Invitrogen 11765-047)、10%FBS(Invitrogen 10099-141)、1×青黴素-鏈黴素(Invitrogen 15140122)、400μg/ml G418(儲備液：50mg/ml=>8ml/L培養基)(Invitrogen 10131027)、250μg/ml勻黴素(儲備液：100mg/ml=>2.5ml/L培養基)(Invitrogen R25005)中生長。 VPAC1/CHO-CRE-BLA(Invitrogen；促效劑：VIP)細胞在杜爾貝科氏改良伊格爾培養基(DMEM)(Gibco目錄號11965)、10%經透析之FBS(Invitrogen 26400044)、1×NEAA(Invitrogen 11140-050)、1×青黴素/鏈黴素(Invitrogen 15140122)、25mM HEPES(pH 7.3)(Invitrogen 15630130)中生長。VPAC2/CHO-CRE-BLA(Invitrogen；促效劑：VIP)細胞如以上關於VPAC1細胞所述生長，其中添加5μg/ml殺稻瘟菌素(Invitrogen R21001)及500μg/ml遺傳黴素(G418)(Invitrogen 10131027)SK-N-MC細胞在MEM(Invitrogen 11095-072)、10%FBS(Invitrogen 10099-141)、1×NEAA(Invitrogen 11140-050)、1×丙酮酸鈉(Invitrogen 11360070)、1×麩醯胺酸/青黴素/鏈黴素(Invitrogen 10378016)中生長。L6細胞在杜爾貝科氏改良伊格爾培養基(DMEM)(Gibco目錄號11965)、10%胎牛血清(Gibco目錄號10099-141)、1×麩醯胺酸/青黴素/鏈黴素(Gibco目錄號10378-016)中生長。
細胞在上文所述之條件下生長且以80-90%匯合收集。對於SHSY5Y細胞，用VERSENE(1：5000，Invitrogen，15040-060)；0.05%胰蛋白酶-EDTA(1×)、酚紅(Invitrogen,25300054)解離細胞，且隨後在Beckman GS-6R裝置中在4℃下以1000rpm離心5分鐘。集結粒用細胞凍存培養基(Invitrogen,12648010)再懸浮。隨後使用Z1庫爾特粒子計數器對細胞進行計數且調節至所需濃度(5E6/ml或2E6/ml)，且將等分試樣儲存在-80℃下或液氮中直至使用。對於PAC1細胞hVPAC1/2 CHO濃度為4K/10μl；其他為2K/10μl；對於SKNMC及L6，濃度為1K/10μl。
LANCE Ultra cAMP分析套組(PerkinElmer,Boston,MA)用於篩檢。分析按一式三份在白色Optiplates半面積96孔板(Costar 3642)中以40μL總體積進行。簡言之，冷凍細胞之小瓶藉由在下37℃在水浴中孵育解凍。解凍細胞用分析緩衝液洗滌(F12、0.1%BSA、1mM IBMX)一次且將細胞濃度調節為2K/10μl。細胞懸浮液以10μl等分試樣分佈於96半面積白色板中。隨後添加五微升拮抗劑(例如如本文中所述抗PAC1抗體)且溫和搖動使樣品在室溫下孵育30分鐘。隨後添加五微升促效劑(例如PACAP38)且同樣溫緩搖動使樣品在室溫下孵育另外15分鐘。隨後添加十微升4×Eu-cAMP示蹤劑工作溶液及十微升4×ULight-抗-cAMP工作溶液且在室溫下孵育樣品另外45分鐘。
在EnVision儀器上在Em665/615nM下分析樣品。資料藉由GraphPad Prism軟體(版本5/6)(GraphPad Inc.,La Jolla,CA)處理以展示隨測試拮抗劑抗PAC1抗體濃度而變之POC(控制百分比)，且符合標準非線性回歸曲線以得到IC50值。POC如下計算：
本文所述及分析中所測試之所有抗體具有約0.1nM與約1000nM之間的IC50活性；許多具有0.1nM與200nM之間的活性；大部分具有約1nM與約100nM之間的活性。類似實驗使用如上所述表現獼猴PAC1之重組細胞及表現大鼠PAC1之大鼠細胞進行。使用人及獼猴PAC1獲得之IC50為相似的，然而測試抗體似乎不與大鼠PAC1良好地進行均勻交叉反應，另外，表現相關受體hVPAC1(CRE-Bla-CHO-K1/Invitrogen)及hVPAC2(-Bla-CHO-K1/Invitrogen)之細胞用於進一步分析測試抗體之選擇性。沒有測試抗體在測試範圍內針對hVPAC1或hVPAC2具有顯著抑制活性(在所有情況下IC50>10,000nM)。例示性資料展示於以下表8中。
人類PAC1與人VPAC1及VPAC2受體之間的IC50之差異說明PAC1之此等抗體對相關受體之高選擇性。
實例3 放射性配位體結合分析用於阻斷抗體之受體的Ki測定
自Perkin Elmer(Billerica,MA)獲得之標記125I之PAC-1抗體(用於PAC1結合分析)或標記125I之PEG-PACAP38(用於PACAP38結合分析)二者及由hPAC-1 AequoScreen CHO(PerkinElmer Life and Analytical Sciences,Boston,Massachusetts)製備之細胞膜用於放射性配位體結合實驗，在測試抗體之各種濃度存在下以測定相應Ki值。
細胞膜製備
細胞生長以匯合於40×T225燒瓶中，其中含漢姆氏F12、10%FBS、100μg/ml鏈黴素、400μg/ml G418(受體表現選擇)及勻黴素(發光蛋白質表現選擇)。燒瓶用1×不含Ca/Mg之PBS洗滌。澈底移除PBS。向各燒瓶中添加5ml VERSENE且等待約5分鐘。在側面輕敲燒瓶且使所有細胞變位。將來自所有燒瓶之VERSENE/細胞懸浮液轉移至50ml圓錐形管中且置放於冰上。為收集任何剩餘細胞，用不含Ca/Mg，含蛋白酶抑制劑之冰冷的PBS沖洗燒瓶且將溶液添加至管中的細胞。管子在1000rpm下經短暫離心10分鐘。集結粒儲存在-80℃下。
在細胞膜製備期間，稱重細胞集結粒且在冰上溶解。集結粒再懸浮(10ml/公克集結粒)於10mM TrisHCl(pH7.4)、1mM EDTA、羅氏蛋白酶抑制劑(1錠劑/50毫升)中且採用電動杜恩斯(dounce)勻漿器經30次敲擊均勻化。細胞勻漿在4℃下在2500rpm(約1000g)下離心10分鐘。將上清液轉移至Beckman離心機管中且保持在冰上。集結粒用 15毫升緩衝液再均勻化且重複旋轉步驟。將兩次上清液合併且在48,400g下離心30分鐘。在15毫升緩衝液中使集結粒再懸浮且經18G注射器剪切以使集結粒破碎。經20次敲擊使集結粒均勻化且在48,400g下離心30分鐘。在約6ml不含BSA之PACAP結合緩衝液(20mM Tris HCl、5mM MgSO4+蛋白酶抑制劑)中使集結粒再懸浮。使用18G注射器使集結粒再懸浮、杜恩斯均勻化、等分及儲存在-70℃下。總膜蛋白質濃度經微板BCA蛋白質分析(Pierce)測定。
結合分析
PAC1結合分析在室溫下在中96孔板中建立，該96孔板含有120μl結合緩衝液(20mM Tris-HCl，pH 7.5、5.0mM MgSO4、150mM NaCl、0.1%BSA(Sigma)、1錠劑CompleteTM/50毫升緩衝液(蛋白酶抑制劑))；10μl測試化合物(20×)；50μl人類PAC1 CHO膜懸浮液(每孔0.2μg)；及20μl 125I-PAC-1抗體(10×；用於PAC1結合分析)或125I-PEG-PACAP 38(10×；用於PACAP38結合分析)。
非特異性結合藉由向指定板中添加10μl(20×)20μM PACAP 6-38來判定。板在室溫下在60rpm下搖動孵育2小時，且隨後各孔之內容物用經0.5%聚乙二亞胺(PEI)處理(持續至少兩個小時)之GF/C 96孔濾板過濾。GF/C濾板用冰冷的50mM Tris(pH 7.5)洗滌五次且在55℃下在烘箱中乾燥1小時。GF/C板之底部隨後密封。向各孔中添加40μl MicroscintTM 20，GF/C板之頂部用TopSealTM-A(一種壓貼黏著劑密封膜)密封，且GF/C板用TopCount NXT(Packard)計數。資料使用Prizm(GraphPad Software Inc.)分析。
如上所述獲得之展示Ki值之例示性資料展示於以下表9中。來自PAC1結合分析之資料與指定標記125I之PAC-1抗體展示在不同行中且測試抗體如不同列中所展示。來自不同生產批次之樣品經測試抗體中之一些進行操作，如01A、26A、39A所示。結果表明在實例2中所述 之cAMP分析中具有生物活性之測試的抗PAC1抗體競爭結合PAC1之促效劑(標記125I之PEG-PACAP38)，以及彼此交叉競爭hPAC1上之相同或類似抗原決定基。
實例4 藉由KINEXA量測結合KD A.使用表現hPAC1之全部細胞進行之實驗。
用KinExA測試抗Pac1抗體與CHOK1/huPac1細胞之結合。簡言之，UltraLink Biosupport(Pierce目錄號53110)預先塗佈有抗山羊huFc(Jackson Immuno Research目錄號109-005-098)且用BSA封閉。將10pM、30pM、100pM及300pM抗Pac1抗體與不同密度(1.7×101-9×106個細胞/mL)之表現huPac1之CHOK1細胞在含有1% FBS及0.05%疊 氮化鈉之培養基F12中孵育。在4℃下，220g離心5分鐘之前將含有抗Pac1抗體之樣品與全部細胞在室溫下旋轉孵育4個小時，以使全部細胞及抗Pac1抗體-細胞複合物與未結合抗Pac1抗體分離。在裝載至KinExA上塗佈有抗山羊huFc之珠粒之前，將不含抗Pac1抗體之上清液經由0.22μm濾紙過濾。結合珠粒之抗Pac1抗體的量藉由螢光(Alexa Fluor 647)標記抗huIgG(H+L)抗體(Jackson Immuno Research目錄號109-605-088)定量。在各細胞密度下結合信號與溶液中之游離抗Pac1抗體之濃度成比例。平衡解離常數(KD)藉由KinExATM Pro軟體(Sapidyne Instruments,Inc.,Boise,ID)中正態曲線分析估計。
B.使用hPAC1細胞外結構域(ECD；hPAC1 1-135)進行之實驗。
用KinExA測試抗Pac1 Ab與huPac1(1-135)：：6×His之結合。簡言之，UltraLink Biosupport(Thermo Fisher Scientific目錄號53110)預先塗佈有huPac1(1-135)：：6×His且如上所述用BSA封閉。在通過塗佈有huPac1(1-135)：：6×His之珠粒之前，將30、100及300pM Ab與不同濃度之huPac1(1-135)：：6×His在室溫下孵育至少8小時。結合珠粒之Ab的量藉由螢光(DyLight 649)標記抗山羊huIgG(H+L)抗體(Jackson Immuno Research目錄號109-495-088)定量。在結合平衡下結合信號與游離Ab之濃度成比例。平衡解離常數(KD)由使用單點均質結合模型(KinExATM Pro software)之競爭曲線的非線性回歸獲得。
測試樣品與CHOK1/huPac1細胞及huPac1(1-135)：：6×His之平衡解離常數之概述展示於以下表10中(平均值後面為(範圍))。
實例5 血小板吞噬作用分析
為解決任何可能的由Fc γ受體誘導之血小板減少，採用吞噬作用分析測試本文所述之一部分抗體。
A.製備周邊血液白血球(PBL)及血小板
如先前所述製備人及獼猴二者之血小板(Semple,J.W.等人，Blood(2007)109：4803-4805)。簡言之，來自健康獼猴供體之全血樣品在170×g下離心15分鐘而無制動。自上層收集富含血小板之血漿(PRP)。樣品之底層在2000×g下離心10分鐘以獲得貧血小板血漿(PPP)及白血球層。PRP部分中之血小板用20μM Cell Tracker Green CMFDA在室溫下標記30分鐘。經標記的血小板用PBS洗滌、重新懸浮於含有10%FBS之RPMI-1640中且調節至1×108個細胞/mL濃度。PBL自由相同供體獲得之白血球層製備。紅血球採用BD Pharm-lyse遵循供應商提供之方案進行溶解。溶解之後，PBL用含有10% FBS之RPMI-1640洗滌兩次且將最終濃度調節至5×106個細胞/ml。
B.吞噬作用分析
吞噬作用反應藉由在暗處孵育100μL各個經CMFDA標記之血小板及PBMC與測試樣品而引發。在孵育六個小時後，藉由將板置放在冰上停止反應。胞外螢光藉由用0.1%錐蟲藍孵育2分鐘來淬滅。在用冰冷的PBS洗滌兩次後，將細胞與碘化丙錠及抗CD14在4℃下孵育30分鐘。在洗滌後，細胞藉由BD LSRII流式細胞儀分析(圖2)。基於先前經歷，單核細胞吞噬血小板具有至少為負對照(a-SA a-DNP)的2倍 或比其更高的CMFDA平均螢光強度值(2)。
例示性資料展示於以下表11中。結果展示當在高達14mg/mL之抗體濃度下進行測試時，沒有經分析之去糖基化IgG1變異體(以「B」或「C」結束之抗體，儘管在此研究中僅對「B」進行測試)激活人或獼猴全血中之血小板。類似地，在高達及包括所測試之最高濃度(3mg/ml)下在活體外血小板吞噬作用上未見有影響。在所測試之任何濃度下未提到活體外激活嗜中性白血球。
所識別之所有專利及其他公開案係出於描述及揭示之目的明確地以引用的方式併入本文中，例如描述於該等公開案中之方法可與本文所揭示之標的物結合使用。在本申請案之申請日期之前僅提供此等公開案之揭示內容。就此而言不應將任何物視為承認藉助於先前發明或因任何其他原因而使發明者未提前授權於該揭示案。關於日期之所有陳述或關於此等文獻之內容的表述係基於本申請者可用的資訊且不構成任何關於此等文獻之日期或內容的正確性的承認。
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<212> PRT
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<221> VARIANT
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<221> misc_feature
<222> (1)..(17)
<223> /備註=「序列中所給之變異殘基與其變異位置處註釋之變異殘基沒有優先關係」
<400> 260
<210> 261
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /備註=「人工序列之描述：合成CDRH2-C3肽」
<220>
<221> VARIANT
<222> (3)..(4)
<223> /替換=「Thr」
<220>
<221> VARIANT
<222> (8)..(8)
<223> /替換=「Asn」
<220>
<221> VARIANT
<222> (14)..(14)
<223> /替換=「Lys」
<220>
<221> VARIANT
<222> (15)..(15)
<223> /替換=「Leu」
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(17)
<223> /備註=「序列中所給之變異殘基與其變異位置處註釋之變異殘基沒有優先關係」
<400> 261
<210> 262
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /備註=「人工序列之描述：合成CDRH3-C1肽」
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)..(2)
<223> /替換=「Thr」或「Val」
<220>
<221> VARIANT
<222> (3)..(3)
<223> /替換=「Trp」或「Phe」
<220>
<221> VARIANT
<222> (4)..(4)
<223> /替換=「Lys」或「Tyr」或「Leu」
<220>
<221> VARIANT
<222> (5)..(5)
<223> /替換=「Gln」或「Ser」
<220>
<221> VARIANT
<222> (6)..(6)
<223> /替換=「Leu」或「Lys」
<220>
<221> VARIANT
<222> (7)..(7)
<223> /替換=「Trp」
<220>
<221> VARIANT
<222> (8)..(8)
<223> /替換=「Phe」或「Ala」
<220>
<221> VARIANT
<222> (9)..(9)
<223> /替換=「Leu」或「Phe」
<220>
<221> VARIANT
<222> (11)..(11)
<223> /替換=「His」或「Ile」
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(11)
<223> /備註=「序列中所給之變異殘基與其變異位置處註釋之變異殘基沒有優先關係」
<400> 262

Claims (26)

  1. 一種特異性結合人類垂體腺苷酸環化酶活化多肽I型受體(PAC1)之經分離抗體或其抗原結合片段，其包含(A)輕鏈CDR1(CDRL1)，其包含SEQ ID NO：196或SEQ ID NO：197的胺基酸序列；(B)輕鏈CDR2(CDRL2)，其包含SEQ ID NO：209的胺基酸序列；(C)輕鏈CDR3(CDRL3)，其包含SEQ ID NO：215的胺基酸序列；(D)重鏈CDR1(CDRH1)，其包含SEQ ID NO：223的胺基酸序列；(E)重鏈CDR2(CDRH2)，其包含SEQ ID NO：237的胺基酸序列；及(F)重鏈CDR3(CDRH3)，其包含SEQ ID NO：247的胺基酸序列。
  2. 如請求項1之經分離抗體或其抗原結合片段，其包含輕鏈可變區及重鏈可變區，其中該輕鏈可變區包含與選自SEQ ID NOs：152至159之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列，及該重鏈可變區包含與選自SEQ ID NOs：172至182之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列。
  3. 如請求項1之經分離抗體或其抗原結合片段，其中該CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：223、SEQ ID NO：237及SEQ ID NO：247之序列；及該CDRL1、CDRL2、CDRL3分別具有SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：209及SEQ ID NO：215之序列。
  4. 如請求項1之經分離抗體或其抗原結合片段，其中該CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：223、SEQ ID NO：237及SEQ ID NO：247之序列；及該CDRL1、CDRL2、CDRL3分別具有SEQ ID NO：196、SEQ ID NO：209及SEQ ID NO：215之序列。
  5. 如請求項1之經分離抗體或其抗原結合片段，其包含輕鏈可變區及重鏈可變區，其中：(a)該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：152之序列及該重鏈可變區包含SEQ ID NO：172之序列；(b)該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：153之序列及該重鏈可變區包含SEQ ID NO：172之序列；(c)該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：154之序列及該重鏈可變區包含SEQ ID NO：172之序列；(d)該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：152之序列及該重鏈可變區包含SEQ ID NO：173之序列；(e)該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：152之序列及該重鏈可變區包含SEQ ID NO：174之序列；(f)該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：155之序列及該重鏈可變區包含SEQ ID NO：173之序列；(g)該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：155之序列及該重鏈可變區包含SEQ ID NO：174之序列；(h)該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：155之序列及該重鏈可變區包含SEQ ID NO：172之序列；(i)該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：152之序列及該重鏈可變區包含SEQ ID NO：175之序列；(j)該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：153之序列及該重鏈可變區包含SEQ ID NO：174之序列；(k)該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：156之序列及該重鏈可變區包含SEQ ID NO：174之序列；(l)該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：157之序列及該重鏈可變區包含SEQ ID NO：174之序列；(m)該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：153之序列及該重鏈可變區包含SEQ ID NO：176之序列；(n)該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：153之序列及該重鏈可變區包含SEQ ID NO：177之序列；(o)該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：157之序列及該重鏈可變區包含SEQ ID NO：176之序列；(p)該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：157之序列及該重鏈可變區包含SEQ ID NO：177之序列；(q)該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：157之序列及該重鏈可變區包含SEQ ID NO：178之序列；(r)該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：153之序列及該重鏈可變區包含SEQ ID NO：178之序列；(s)該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：153之序列及該重鏈可變區包含SEQ ID NO：179之序列；(t)該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：156之序列及該重鏈可變區包含SEQ ID NO：179之序列；(u)該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：153之序列及該重鏈可變區包含SEQ ID NO：180之序列；(v)該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：153之序列及該重鏈可變區包含SEQ ID NO：181之序列；(w)該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：153之序列及該重鏈可變區包含SEQ ID NO：182之序列；或(x)該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：156之序列及該重鏈可變區包含SEQ ID NO：182之序列。
  6. 如請求項5之經分離抗體或其抗原結合片段，其中該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：153之序列及該重鏈可變區包含SEQ ID NO：182之序列。
  7. 如請求項1之經分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含：(a)輕鏈，其包含SEQ ID NO：78之序列；及重鏈，其包含選自SEQ ID NOs：101至112之序列；(b)輕鏈，其包含SEQ ID NO：79之序列；及重鏈，其包含選自SEQ ID NOs：101至103、107至109及113至133之序列；(c)輕鏈，其包含SEQ ID NO：80之序列；及重鏈，其包含選自SEQ ID NOs：101至103之序列；(d)輕鏈，其包含SEQ ID NO：81之序列；及重鏈，其包含選自SEQ ID NOs：101至109之序列；(e)輕鏈，其包含SEQ ID NO：82之序列；及重鏈，其包含選自SEQ ID NOs：107至109、122至124及131至133之序列；或(f)輕鏈，其包含SEQ ID NO：83之序列；及重鏈，其包含選自SEQ ID NOs：107至109及113至121之序列。
  8. 如請求項7之經分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含輕鏈，其包含SEQ ID NO：79之序列；及重鏈，其包含SEQ ID NO：131之序列。
  9. 如請求項7之經分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含輕鏈，其包含SEQ ID NO：79之序列；及重鏈，其包含SEQ ID NO：132之序列。
  10. 如請求項7之經分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含輕鏈，其包含SEQ ID NO：79之序列；及重鏈，其包含SEQ ID NO：133之序列。
  11. 如請求項1至10中任一項之經分離抗體或其抗原結合片段，其中該經分離抗體或其抗原結合片段為單株抗體、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、雙功能抗體或單鏈抗體。
  12. 如請求項11之經分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體係選自純人類抗體、人類化抗體或嵌合抗體之單株抗體。
  13. 如請求項12之經分離抗體或其抗原結合片段，其中該單株抗體為純人類單株抗體。
  14. 如請求項11之經分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體為IgG1型、IgG2型、IgG3型或IgG4型抗體。
  15. 如請求項14之經分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體為去糖基化IgG1抗體。
  16. 如請求項15之經分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體在其重鏈中包含位於位置N297之突變。
  17. 如請求項16之經分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體在其重鏈中包含N297G突變。
  18. 如請求項16之經分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體在其重鏈中進一步包含R292C及V302C突變。
  19. 一種經分離聚核苷酸，其編碼如請求項1至18中任一項之抗體或其抗原結合片段。
  20. 一種表現載體，其包含如請求項19之聚核苷酸。
  21. 一種細胞株，其經如請求項20之表現載體進行轉化。
  22. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至18中任一項之抗體或其抗原結合片段及醫藥學上可接受之賦形劑。
  23. 一種如請求項1至18中任一項之抗體或其抗原結合片段之用途，其用於製造治療患者頭痛的藥物。
  24. 如請求項23之用途，其中該頭痛為偏頭痛或叢集性頭痛。
  25. 如請求項24之用途，其中該偏頭痛為間歇性偏頭痛或慢性偏頭痛。
  26. 如請求項23至25中任一項之用途，其中該治療包含預防性治療。
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