BR112014028838A2 - Usos de um anticorpo, método para fazer um anticorpo e anticorpos - Google Patents

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Abstract

métodos para aprimorar a segurança de transporte da barreira hematoencefálica. a presente invenção refere-se a composições e métodos para aprimorar a segurança de transporte da barreira hematoencefálica mediada por receptor de barreira hematoencefálica.

Description

“USOS DE UM ANTICORPO, MÉTODO PARA FAZER UM ANTICORPO E ANTICORPOS”
Campo da Invenção [001] A presente invenção refere-se a composições e métodos para aprimorar a segurança de transporte da barreira hematoencefálica mediada por receptor de barreira hematoencefálica.
Antecedentes da Invenção [002] A penetração de drogas com grandes moléculas no cérebro é severamente limitada pela barreira hematoencefálica (BBB) amplamente impermeável. Entre as diversas estratégias para superar esse obstáculo está a utilização das vias de tráfico de transcitose de receptores endógenos expressos no endotélio capilar do cérebro. Proteínas recombinantes como anticorpos monoclonais foram projetados contra esses receptores para permitir a distribuição mediada por receptor de grandes moléculas para o cérebro. Estratégias para maximizar a absorção no cérebro, ao mesmo tempo minimizando a transcitose reversa de volta ao sangue, e também para maximizar o grau de acúmulo após dosagem terapêutica, foram abordadas com a descoberta de que anticorpos com baixa afinidade para receptores BBB oferecem o potencial para aumentar substancialmente o transporte na BBB e retenção no CNS de componentes terapêuticos associados/moléculas em relação aos anticorpos de alta afinidade típicos para esses receptores (Atwal et al., Sei. Transi. Med. 3, 84ra43 (2011); Yu et al., Sei. Transi. Med. 25 de maio de 2011: Vol. 3, Edição 84, p. 84ra44). No entanto, a segurança da administração desses anticorpos e conjugados não foi totalmente explorada.
Descrição Resumida da Invenção [003] Anticorpos monoclonais têm grande potencial terapêutico para tratamento de doenças neurológicas ou do sistema nervoso central (CNS),
Petição 870160021356, de 19/05/2016, pág. 46/217
2/171 mas a passagem dos mesmos para o cérebro é limitada pela barreira hematoencefálica (BBB). Estudos anteriores demonstraram que uma porcentagem muito pequena (aproximadamente 0,1%), de uma IgG circulante na circulação sanguínea atravessa a BBB no CNS (Felgenhauer, Klin. Wschr. 52: 1158-1164 (1974)), onde a concentração do anticorpo no CNS pode ser insuficiente para permitir um efeito forte. Descobriu-se anteriormente que a porcentagem do anticorpo que distribui no CNS poderia ser aprimorada por exploração dos receptores da BBB (isto é, receptor de transferrina, receptor de insulina, proteína 8 relacionada ao receptor de lipoproteína de baixa densidade, transportador 1 de glicose (Glutl) e similares) (consulte, por exemplo, documento WO 9502421). Por exemplo, o anticorpo anti-receptor BBB pode ser produzido como multiespecífico para atingir um ou mais antígenos desejados no CNS, ou uma ou mais moléculas heterólogas podem ser acopladas ao anticorpo anti-receptor BBB; em ambos os casos, o anticorpo anti-receptor BBB pode auxiliar na distribuição de uma molécula terapêutica no CNS através da BBB.
[004] No entanto, o direcionamento de um receptor de BBB com um anticorpo de alta afinidade específico tradicional geralmente resultou no aumento limitado no transporte da BBB. Mais tarde, foi descoberto pelos requerentes que a magnitude de absorção de anticorpo e a distribuição no CNS está inversamente relacionada à sua afinidade de ligação para o receptor de BBB entre os anticorpos anti-BBB estudados. Por exemplo, um anticorpo de baixa afinidade ao receptor de transferrina (TfR) dosado em níveis de dose terapêutica aprimora muito o transporte na BBB e retenção no CNS do anticorpo anti-TfR em relação a um anticorpo anti-TfR de maior afinidade, e torna possível alcançar mais facilmente concentrações terapêuticas no CNS (Atwal et al., Sei. Transi. Med. 3, 84ra43 (2011)). A prova desse transporte na BBB foi obtida com o uso de um anticorpo biespecífico que se liga tanto ao TfR
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3/171 como à enzima de divagem da proteína precursora do amiloide (APP), βsecretase (BACE1). Uma dose sistêmica única do anticorpo anti-TfR/BACE1 biespecífico elaborado geneticamente com o uso da metodologia da invenção não apenas resultou na absorção significativa do anticorpo no cérebro, como também reduziu dramaticamente os níveis de Αβ-Μο em comparação ao antiBACE1 biespecífico isoladamente, sugerindo que a penetração na BBB afeta a potência do anti-BACE1. (Atwal et al., Sei. Transi. Med. 3, 84ra43 (2011); Yu et al., Sei. Transi. Med. 3, 84ra44 (2011)).
[005] Esses dados e experimentos destacaram vários mecanismos causadores por trás do aumento da absorção de um anticorpo no CNS com o uso de uma abordagem de anticorpo com afinidade menor. Primeiro, anticorpos anti-receptor BBB de alta afinidade (BBB-R) (por exemplo, anti-TfRa) limitam a absorção no cérebro pela rápida saturação do BBB-R na vasculatura cerebral, reduzindo assim a quantidade total de anticorpo absorvido no cérebro e também restringindo sua distribuição na vasculatura. Visivelmente, diminuindo a afinidade para o BBB-R melhora a absorção e distribuição no cérebro, com uma forte mudança observada na localização da vasculatura para neurônios e neurópilos associados distribuídos no CNS. Segundo, é proposto que a menor afinidade do anticorpo para o BBB-R prejudica a capacidade do anticorpo para voltar ao lado vascular da BBB através do BBB-R a partir do lado da membrana do CNS, devido à afinidade total do anticorpo para o BBB-R ser baixa e a concentração local do anticorpo no lado do CNS da BBB não saturar devido à rápida dispersão do anticorpo no compartimento do CNS. Terceiro, in vivo, e como observado para o sistema TfR, anticorpos com menos afinidade para o BBB-R não são depurados do sistema de forma eficiente, como aqueles com maior afinidade para o BBB-R, e assim mantêm concentrações circulantes maiores que a sua contraparte de maior afinidade. Isso é vantajoso porque os níveis de anticorpos circulantes do
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4/171 anticorpo de menor afinidade são sustentados em níveis terapêuticos por um período de tempo maior do que o anticorpo de maior afinidade, o que consequentemente melhora a absorção do anticorpo no cérebro por um período de tempo mais longo. Além disso, esse aprimoramento tanto na exposição do plasma como do cérebro pode reduzir a frequência da dosagem na clínica, o que teria benefício potencial não apenas para a adesão do paciente ao tratamento e conveniência, mas também para atenuar eventuais efeitos colaterais ou efeitos fora do alvo do anticorpo e/ou de um composto terapêutico acoplado ao mesmo.
[006] Os anticorpos BBB-R de baixa afinidade descritos no trabalho referenciado acima foram selecionados/elaborados geneticamente para evitar interferência na ligação natural entre transferrina e TfR, e assim evitar potenciais efeitos colaterais relacionados ao transporte de ferro. No entanto, após a administração desses determinados anticorpos em camundongos, alguns efeitos colaterais fortes foram observados. Os camundongos exibiram uma resposta primária de uma depleção forte da população de reticulócitos acompanhada pelo rápido início de sintomas clínicos agudos, conforme descrito nos Exemplos. Ainda, estudos in vitro com o uso de uma linhagem celular de eritroblasto humano e células primárias da medula óssea tratadas com anticorpos anti-TfR demonstraram que uma forte depleção de células eritroides positivas para TfR é também observável em sistemas de células humanas (consulte, por exemplo, Exemplo 7). Embora os camundongos recuperados tanto a partir dos sintomas clínicos agudos como dos níveis de reticulócitos diminuídos no devido tempo, evitar ou de outro modo mitigar esse impacto nos reticulócitos é claramente desejável para um anticorpo anti-TfR ser capaz de ser usado de maneira segura como molécula terapêutica.
[007] Consequentemente, a invenção fornece composições e
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5/171 métodos que reduzem ou eliminam reduções indesejáveis na população de reticulócitos mediante administração de anti-TfR, enquanto ainda permitindo o transporte melhorado na BBB, distribuição aumentada no CNS e retenção no CNS fornecida por anticorpos anti-TfR de baixa afinidade administrados em concentrações terapêuticas. Os resultados descritos no presente pedido mostram que a principal resposta à administração de anti-TfR (forte depleção de reticulócitos e sinais clínicos agudos) é dirigida em grande parte pela atividade de citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) do anticorpo, enquanto o efeito de depleção de reticulócito residual é mediado pela via de complemento. Várias abordagens gerais para mitigar o efeito observado dos anticorpos anti-TfR tanto na depleção primária como residual de reticulócitos são fornecidas no presente pedido, e podem ser usadas individualmente ou em combinação.
[008] Em uma abordagem, a função efetora do anticorpo antiBBB-R é reduzida ou eliminada, a fim de reduzir ou eliminar a atividade de ADCC. Em outra abordagem, a afinidade do anticorpo anti-BBB-R para o BBBR é ainda mais reduzida, de modo que as interações do anticorpo com a população de reticulócitos sejam menos prejudiciais para essa população. Uma terceira abordagem é direcionada para reduzir a quantidade de anticorpo antiBBB-R que está presente no plasma, para reduzir a exposição da população de reticulócitos a concentrações potencialmente prejudiciais ao anticorpo. Uma quarta abordagem busca proteger, estabilizar e/ou reconstituir a população de reticulócitos, de modo que qualquer depleção potencial da população de reticulócitos pela administração do anticorpo anti-BBB-R seja evitada, diminuída ou mitigada.
[009] A redução ou eliminação da função efetora, conforme descrito no presente pedido, pode ser realizada através de: (I) redução ou eliminação de glicosilação de mamífero tipo selvagem do anticorpo, (por
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6/171 exemplo, por produção do anticorpo em um ambiente onde essa glicosilação não pode ocorrer, por mutação de um ou mais pontos de fixação de carboidrato, de modo que o anticorpo não possa ser glicosilado, ou por remoção química ou enzimática de um ou mais carboidratos do anticorpo após este ter sido glicosilado); (ii) por redução ou eliminação da capacidade de ligação ao receptor Fc (por exemplo, por mutação da região Fc, por deleção dentro da região Fc ou eliminação da região Fc); ou (iii) por utilização de um isotipo de anticorpo conhecido por ter pouca ou nenhuma função efetora (isto é, incluindo, mas não se limitando a lgG4).
[0010] A diminuição da ativação de complemento do anticorpo, conforme descrito no presente pedido, pode ser feita por redução ou eliminação da capacidade de ligação a C1q do anticorpo anti-BBB-R (por exemplo, por mutação, deleção ou eliminação da região Fc, ou por modificação da porção não Fc do anticorpo anti-BBB-R), ou de outro modo por supressão da ativação ou atividade do sistema de complemento (por exemplo, por coadministração de uma ou mais ativação da via de complemento ou inibidores da atividade da via de complemento).
[0011] Quando a ligação do anticorpo anti-BBB-R ao BBB-R nos reticulócitos ou outros tipos celulares aciona sua depleção, como os anticorpos anti-TfR exemplificados no presente pedido, a redução da ligação dos anticorpos ao BBB-R nos reticulócitos ou outros tipos celulares deveria, por sua vez, diminuir a quantidade de depleção de reticulócitos ou de outros tipos celulares observados após administração do anticorpo. De fato, isso foi demonstrado no presente pedido (consulte, por exemplo, Figura 6B). A afinidade do anticorpo anti-BBB-R para o BBB-R pode ser modificada com o uso de qualquer um dos métodos descritos no presente pedido e conforme mostrado nos Exemplos.
[0012] A redução da quantidade de anticorpo anti-BBB-R presente
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7/171 no plasma, a fim de reduzir a exposição da população de reticulócitos a concentrações potencialmente prejudiciais do anticorpo, pode ser realizada de várias maneiras. Um método é simplesmente diminuir a quantidade do anticorpo que é dosado, enquanto potencialmente também aumentando a frequência da dosagem, de modo que a concentração máxima no plasma seja diminuída, mas um nível sérico suficiente é mantido para eficácia, embora ainda abaixo do limiar do efeito colateral de depleção celular. Outro método, que pode ser combinado com modificações de dosagem é selecionar ou elaborar geneticamente um anticorpo anti-TfR que tem ligação sensível ao pH para TfR, de modo que se ligue à superfície celular de TfR no plasma em pH 7,4, desejavelmente com baixa afinidade conforme descrito no presente pedido, mas mediante interiorização em um compartimento endossomal, essa ligação a TfR é rápida e significativamente reduzida em pH relativamente menor desse compartimento (pH 5,5 a 6,0). Essa dissociação pode proteger o anticorpo da depuração mediada pelo antígeno, ou aumento da quantidade de anticorpo que é distribuída para o CNS ou reciclada através da BBB - em ambos os casos, a concentração efetiva do anticorpo é aumentada em relação a um anticorpo anti-TfR que não compreende essa sensibilidade de pH, sem aumentar a dose administrada do anticorpo.
[0013] Proteger, estabilizar e/ou recompor as populações de reticulócitos pode ser realizado com o uso de medicamentos ou métodos físicos. Além do anticorpo anti-BBB-R, pelo menos um agente terapêutico adicional pode ser coadministrado (simultânea ou sequencialmente) que mitiga efeitos colaterais negativos do anticorpo nas populações de reticulócitos. Exemplos desses agentes terapêuticos incluem, mas não se limitam a, eritropoietina (EPO), suplementos de ferro, vitamina C, ácido fólico e vitamina B12. A recomposição física de glóbulos vermelhos (isto é, reticulócitos) também é possível, por exemplo, por transfusão de células similares, que
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8/171 podem ser de outro indivíduo de tipo sanguíneo similar ou podem ter sido extraídas do sujeito para o qual o anticorpo anti-BBB-R é administrado.
[0014] Um técnico no assunto irá apreciar que qualquer combinação dos métodos anteriores pode ser empregada para elaborar geneticamente um anticorpo (e/ou regime de dosagem para a mesmo) com um equilíbrio ótimo entre (!) a baixa afinidade desejável para o BBB-R que irá maximizar o transporte do anticorpo e quaisquer compostos conjugados para o CNS; (ii) a afinidade dos compostos conjugados (incluindo, como exemplo não limitante, uma segunda ou especificidade de ligação de antígeno adicional no anticorpo antí-TfR) para seu antígeno CNS, visto que isso é relevante para a quantidade do composto que precisa estar presente no CNS para ter um efeito terapêutico; (iii) a taxa de depuração do anticorpo anti-BBB-R; e (iv) o impacto nas populações de reticulócitos.
[0015] Também será apreciado que o efeito reconhecido de depleção dos reticulócitos no presente pedido de administração de anticorpo antí-TfR pode ser útil no tratamento de qualquer doença ou disfunção onde a superproliferação de reticulócitos é problemática. Por exemplo, em policitemia congênita ou policitemia vera neoplásica, o aumento da contagem de glóbulos vermelhos devido à hiperproliferação de, por exemplo, reticulócitos, resulta no espessamento de sangue e os sintomas fisiológicos concomitantes. A administração de um anticorpo antí-TfR da invenção em que pelo menos a função efetora parcial do anticorpo foi preservada permitiría remoção seletiva de reticulócitos imaturos sem afetar o transporte normal de transferrina no CNS. A dosagem desse anticorpo podería ser modulada, de modo que esses sintomas clínicos agudos poderíam ser minimizados (isto é, por dosagem de uma dose muito baixa ou em intervalos amplamente espaçados), como bem entendido na técnica.
[0016] Cada um dos anti-TfR/BACE1 e anti-TfR/Abeta é um
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9/171 candidato terapêutico novo e promissor para o tratamento da doença de Alzheimer. Além disso, a tecnologia de direcionamento biespecífico baseado em transporte mediado por receptor (RMT) abre a porta para uma grande variedade de possibilidades terapêuticas para doenças do CNS. A invenção fornece métodos de terapêuticos elaborados geneticamente de penetração na BBB que melhoram muito o transporte através da BBB e distribuição no CNS do terapêutico sem depleção de reticulócitos.
[0017] Consequentemente, em uma primeira realização, a invenção fornece um método de transporte de um composto através da barreira hematoencefálica em um sujeito, que compreende expor um anticorpo que se liga com baixa afinidade a um receptor da barreira hematoencefálica (BBB-R) acoplado a um composto para a barreira hematoencefálica, de modo que o anticorpo transporta o composto acoplado a este através da barreira hematoencefálica, em que a redução dos níveis de glóbulos vermelhos no sujeito mediante administração do anticorpo para o sujeito é diminuída ou eliminada. Em um aspecto, o BBB-R é selecionado a partir do grupo que consiste em receptor de transferrina (TfR), receptor de insulina, receptor do fator de crescimento similar à insulina (receptor IGF), proteína 8 relacionada ao receptor de lipoproteína de baixa densidade (LRP8), proteína 1 relacionada ao receptor de lipoproteína de baixa densidade (LRP1), transportador 1 de glicose (Glutl) e fator de crescimento similar ao fator de crescimento epidérmico de ligação à heparina (HB-EGF). Em outro aspecto, o BBB-R é um BBB-R humano. Em um aspecto, o BBB-R é TfR. Em outro aspecto, o BBB-R é TfR, e o anticorpo não inibe a atividade de TfR. Em outro aspecto, o BBB-R é TfR, e o anticorpo não inibe a atividade de TfR à transferrina.
[0018] Em outro aspecto, os glóbulos vermelhos são glóbulos vermelhos imaturos. Em outro aspecto, os glóbulos vermelhos imaturos são reticulócitos. Em outro aspecto, a redução dos níveis de reticulócitos é
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10/171 acompanhada por sintomas clínicos agudos. Em outro aspecto, o método ainda compreende a etapa de monitoramento do sujeito por depleção de glóbulos vermelhos.
[0019] Em outro aspecto, uma ou mais propriedades do anticorpo foram modificadas para reduzir o impacto do anticorpo nos níveis de reticulócitos e/ou reduzir a gravidade ou presença de sintomas clínicos agudos no sujeito. Em um aspecto, a afinidade do anticorpo para o BBB-R é modificada, isto é, diminuída. Em outro aspecto, a função efetora da região Fc do anticorpo é modificada. Em um aspecto, a função efetora foi reduzida ou eliminada em relação à função efetora de um anticorpo tipo selvagem do mesmo isotipo. Em outro aspecto, a função efetora é reduzida ou eliminada por redução de glicosilação do anticorpo. Em outro aspecto, a glicosilação do anticorpo é reduzida por produção do anticorpo em um ambiente que não permite a glicosilação tipo selvagem. Em um aspecto, o anticorpo é produzido em um sistema de produção em células de não mamíferos. Em outro aspecto, o anticorpo é produzido sinteticamente. Em outro aspecto, a glicosilação do anticorpo é reduzida por remoção de grupos carboidrato já presentes no anticorpo. Em outro aspecto, a glicosilação do anticorpo é reduzida por modificação do anticorpo de modo que a glicosilação tipo selvagem não ocorra. Em outro aspecto, região Fc do anticorpo compreende uma mutação na posição 297, de modo que o resíduo de asparagina tipo selvagem nessa posição seja substituído por outro aminoácido que interfere na glicosilação nessa posição. Em outro aspecto, a função efetora é reduzida ou eliminada por modificação do isotipo do anticorpo para um isotipo que naturalmente tem função efetora reduzida ou eliminada.
[0020] Em outro aspecto, a região Fc é modificada para reduzir ou eliminar a função efetora. Em um aspecto, a função efetora é reduzida ou eliminada por pelo menos uma modificação da região Fc. Em um aspecto, a
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11/171 modificação é uma mutação de ponto da região Fc para prejudicar a ligação a um ou mais receptores Fc selecionados a partir das seguintes posições: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 265, 268, 269, 270, 272, 278, 289, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 301,303, 322, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 414, 416, 419, 434, 435, 437, 438 e 439. Em outro aspecto, a modificação é eliminação de algumas ou de todas as regiões Fc. Em outro aspecto, a função efetora é reduzida ou eliminada por deleção de toda ou de uma porção da região Fc, ou por elaboração genética do anticorpo, de modo que este não inclua uma região Fc competente para função efetora. Em um aspecto, o anticorpo é selecionado a partir de um Fab ou de um anticorpo de cadeia única.
[0021] Em um aspecto, a região Fc e/ou região não Fc do anticorpo é modificada para reduzir ou eliminar a ativação da via de complemento pelo anticorpo. Em um aspecto, a modificação é uma mutação de ponto da região Fc para prejudicar a ligação a C1q, selecionada a partir das seguintes posições: 270, 322, 329 e 321. Em outro aspecto, a modificação é eliminação de algumas ou de todas as regiões Fc. Em outro aspecto, a função de ativação de complemento é reduzida ou eliminada por deleção de toda ou de uma porção da região Fc, ou por elaboração genética do anticorpo, de modo que este não inclua uma região Fc que se engaje na via de complemento. Em um aspecto, o anticorpo é selecionado a partir de um Fab ou de um anticorpo de cadeia única. Em outro aspecto, a região não Fc do anticorpo é modificada para reduzir ou eliminar ativação da via de complemento pelo anticorpo. Em um aspecto, a modificação é uma mutação de ponto da região CH1 para prejudicar ligação a C3. Em um aspecto, a mutação de ponto está na posição 132 (consulte, por exemplo, Vidarte et al., (2001) J. Biol. Chem. 276(41): 3821738223).
[0022] Em outro aspecto, a quantidade de dose e/ou frequência de
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12/171 administração do anticorpo é modulada para reduzir a concentração do anticorpo à qual os glóbulos vermelhos são expostos. Em outro aspecto, o anticorpo é modificado para compreender ligação ao BBB-R sensível ao pH.
[0023] Em outro aspecto, um composto adicional é administrado em adição ao anticorpo e ao composto acoplado. Em um aspecto, o composto adicional é responsável ou contribui para a falta de redução dos níveis de reticulócitos. Em outro aspecto, o composto adicional inibe ou previne a ativação ou atividade da via de complemento (consulte, por exemplo, Mollnes e Kirschfink (2006) Molec. Immunol. 43:107-121). Em outro aspecto, o composto ainda protege reticulócitos de depleção relacionada ao anticorpo. Em outro aspecto, o composto adicional apoia o crescimento, desenvolvimento ou restabelecimento de reticulócitos. Em outro aspecto, o composto adicional é selecionado a partir de eritropoietina (EPO), um suplemento de ferro, vitamina C, ácido fólico e vitamina B12. Em outro aspecto, o composto adicional são glóbulos vermelhos ou reticulócitos do mesmo sujeito. Em outro aspecto, o composto adicional são glóbulos vermelhos ou reticulócitos de outro sujeito.
[0024] Em outro aspecto, o composto é uma droga de disfunção neurológica. Em outro aspecto, o composto é um agente de formação de imagens. Em outro aspecto, o composto é marcado. Em outro aspecto, o anticorpo é marcado. Em outro aspecto, o anticorpo não prejudica a ligação do BBB-R a um ou mais de seus ligantes nativos. Em outro aspecto, o anticorpo se liga especificamente ao TfR, de modo que não iniba a ligação do TfR à transferrina. Em outro aspecto, a BBB está em um mamífero. Em outro aspecto, o mamífero é um humano. Em outro aspecto, o mamífero tem uma disfunção neurológica. Em outro aspecto, a disfunção neurológica é selecionada a partir do grupo que consiste em doença de Alzheimer (AD), acidente vascular cerebral, demência, distrofia muscular (MD), esclerose múltipla (MS), esclerose lateral amiotrófica (ALS), fibrose cística, síndrome de
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Angelman, sindrome de Liddle, doença de Parkinson, doença de Pick, doença de Paget, câncer e lesão cerebral traumática. Em outro aspecto, a BBB está em um humano.
[0025] Em outro aspecto, o anticorpo tem um IC50 para o BBB-R de cerca de 1 nM a cerca de 100 μΜ. Em outro aspecto, o IC50 é de cerca de 5 nM a cerca de 100 μΜ. Em outro aspecto, o IC50 é de cerca de 50 nM a cerca de 100 μΜ. Em outro aspecto, o IC50 é de cerca de 100 nM a cerca de 100 μΜ. Em outro aspecto, o anticorpo tem uma afinidade para o BBB-R de cerca de 5 nM a cerca de 50 μΜ. Em outro aspecto, o anticorpo tem uma afinidade para o BBB-R de cerca de 30 nM a cerca de 30 μΜ. Em outro aspecto, o anticorpo, quando acoplado a um composto, tem uma afinidade para o BBB-R de cerca de 30 nM a cerca de 1 μΜ. Em outro aspecto, o anticorpo, quando acoplado a um composto, tem uma afinidade para o BBB-R de cerca de 50 nM a cerca de 1 μΜ. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao complexo se liga especificamente ao TfR e tem uma afinidade para TfR entre as afinidades observadas para o anticorpo anti-TfRA/BACE1 e o anticorpo anti-TfRE/BACE1. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao complexo se liga especificamente ao TfR e tem uma afinidade para TfR entre as afinidades observadas para o anticorpo anti-TfRD/BACE1 e o anticorpo anti-TfRE/BACE1. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao complexo se liga especificamente ao TfR e tem um IC50 para TfR entre os IC50s observados para o anticorpo anti-TfRA/BACE1 e o anticorpo anti-TfRE/BACE1. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao complexo se liga especificamente ao TfR e tem um IC50 para TfR entre os IC50s observados para o anticorpo anti-TfRD/BACE1 e o anticorpo antiTfRE/BACE1. Em um aspecto, a afinidade do anti-BBB-R ou anti-BBBR/composto para o BBB-R é medida com o uso de análise de Scatchard. Em outro aspecto, a afinidade do anti-BBB-R ou anti-BBB-R/composto para o BBBR é medida com o uso de análise BIACORE. Em outra aspecto, a afinidade do
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14/171 anti-BBB-R ou anti-BBB-R/composto para o BBB-R é medida com o uso de ELISA de competição.
[0026] Em outro aspecto, a meia-vida de dissociação do anticorpo do BBB-R ao qual especificamente ele se liga é de cerca de 30 segundos a cerca de 30 minutos. Em outro aspecto, a meia vida de dissociação é de cerca de 30 segundos a cerca de 20 minutos. Em outro aspecto, a meia vida de dissociação é de cerca de 30 segundos a cerca de 10 minutos. Em outro aspecto, a meia vida de dissociação é de cerca de 30 segundos a cerca de 5 minutos. Em outro aspecto, a meia vida de dissociação é de cerca de 30 segundos a cerca de 3 minutos. Em outro aspecto, a meia vida de dissociação é de cerca de 30 segundos a cerca de 2 minutos. Em outro aspecto, a meia vida de dissociação é de cerca de 2 minutos. Em outro aspecto, a meia vida de dissociação é de 1 minuto ou menos. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao composto se liga especificamente ao TfR e tem uma meia-vida de dissociação para TfR entre as meias-vidas de dissociação observadas para o anticorpo anti-TfRA7BACE1 e o anticorpo anti-TfRE/BACE1 de suas respectivas ligações a TfR. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao composto se liga especificamente ao TfR e tem uma meia-vida de dissociação para TfR entre as meias-vidas de dissociação observadas para o anticorpo anti-TfRD/BACE1 e o anticorpo anti-TfRE/BACE1 de suas respectivas ligações a TfR. Em outro aspecto, a meia-vida de dissociação do anti-BBB-R ou anti-BBB-R/composto para o BBB-R é medida com o uso de análise BIACORE. Em outro aspecto, a meia-vida de dissociação do anti-BBB-R ou anti-BBB-R/composto para o BBBR é medida com o uso de um ensaio de ligação de competição, como um ELISA de competição. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao composto é administrado em uma dose terapêutica. Em um aspecto, a dose terapêutica é uma dose que satura o BBB-R ao qual o anticorpo se liga especificamente. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao composto é administrado em uma dose
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15/171 e uma frequência de dose que minimiza a interação de glóbulos vermelhos com o anticorpo acoplado ao composto embora que ainda facilite a distribuição do composto através da BBB no CNS em níveis terapêuticos.
[0027] Em outro aspecto, o composto é covalentemente acoplado ao anticorpo. Em um aspecto, o composto é unido ao anticorpo por um ligante. Em um aspecto, o ligante é clivável. Em outro aspecto, o ligante não é clivável. Em outro aspecto, o composto é ligado diretamente ao anticorpo. Em um aspecto, o anticorpo é um anticorpo multiespecífico e o composto opcionalmente forma uma porção do anticorpo multiespecífico. Em outro aspecto, o anticorpo multiespecífico compreende um primeiro sítio de ligação de antígeno que se liga ao BBB-R e um segundo sítio de ligação de antígeno que se liga a um antígeno cerebral. Em outro aspecto, o antígeno cerebral é selecionado a partir do grupo que consiste em: beta-secretase 1 (BACE1), Abeta, receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano (HER2), Tau, apolipoproteína E4 (ApoE4), alfa-sinucleína, CD20, huntingtina, proteína príon (PrP), quinase rica em repetição leucina 2 (LRRK2), parquina, presenilina 1, presenilina 2, gama secretase, receptor 6 de morte (DR6), proteína precursora amiloide (APP), receptor de neurotrofina p75 (p75NTR), receptor 6 de interleucina (IL6R), receptor 1 de TNF (TNFR1), beta 1 interleucina e caspase 6. Em outro aspecto, o anticorpo multiespecífico se liga tanto ao TfR como a BACE1. Em outro aspecto, o anticorpo multiespecífico se liga tanto a TfR como a Abeta. Em outro aspecto, o anticorpo multiespecífico é marcado. Em outro aspecto, o composto é reversivelmente acoplado ao anticorpo, de modo que o composto seja liberado do anticorpo junto ou após o transporte na BBB.
[0028] Será apreciado que qualquer um dos aspectos anteriormente mencionados possa ser aplicado individualmente ou em combinação com a realização anteriormente mencionada.
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16/171 [0029] Em outra realização, a invenção fornece um método para aumentar a exposição no CNS de um sujeito a um composto, em que o composto é acoplado a um anticorpo que se liga com baixa afinidade a um BBB-R, através disso aumentando a exposição no CNS ao composto, e em que a redução dos níveis de glóbulos vermelhos no sujeito mediante administração do anticorpo acoplado ao composto para o sujeito é diminuída ou eliminada. Em um aspecto, o BBB-R é selecionado a partir do grupo que consiste em receptor de transferrina (TfR), receptor de insulina, receptor do fator de crescimento similar à insulina (receptor IGF), proteína 8 relacionada ao receptor de lipoproteína de baixa densidade (LRP8), proteína 1 relacionada ao receptor de lipoproteína de baixa densidade (LRP1), transportador 1 de glicose (Glutl) e fator de crescimento similar ao fator de crescimento epidérmico de ligação à heparina (HB-EGF). Em outro aspecto, o BBB-R é um BBB-R humano. Em um aspecto, o BBB-R é TfR. Em outro aspecto, o BBB-R é TfR, e o anticorpo não inibe a atividade de TfR. Em outro aspecto, o BBB-R é TfR, e o anticorpo não inibe a atividade de TfR à transferrina.
[0030] Em outro aspecto, os glóbulos vermelhos são glóbulos vermelhos imaturos. Em outro aspecto, os glóbulos vermelhos imaturos são reticulócitos. Em outro aspecto, a redução dos níveis de reticulócitos é acompanhada por sintomas clínicos agudos. Em outro aspecto, o método ainda compreende a etapa de monitoramento do sujeito por depleção de glóbulos vermelhos.
[0031] Em outro aspecto, uma ou mais propriedades do anticorpo foram modificadas para reduzir o impacto do anticorpo nos níveis de reticulócitos e/ou reduzir a gravidade ou presença de sintomas clínicos agudos no sujeito. Em um aspecto, a afinidade do anticorpo para o BBB-R é modificada, isto é, diminuída. Em outro aspecto, a função efetora da região Fc do anticorpo é modificada. Em um aspecto, a função efetora foi reduzida ou
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17/171 eliminada em relação à função efetora de um anticorpo tipo selvagem do mesmo isotipo. Em outro aspecto, a função efetora é reduzida ou eliminada por redução de glicosilação do anticorpo. Em outro aspecto, a glicosilação do anticorpo é reduzida por produção do anticorpo em um ambiente que não permite a glicosilação tipo selvagem. Em um aspecto, o anticorpo é produzido em um sistema de produção em células de não mamíferos. Em outro aspecto, o anticorpo é produzido sinteticamente. Em outro aspecto, a glicosilação do anticorpo é reduzida por remoção de grupos carboidrato já presentes no anticorpo. Em outro aspecto, a glicosilação do anticorpo é reduzida por modificação do anticorpo de modo que a glicosilação tipo selvagem não ocorra. Em outro aspecto, a região Fc do anticorpo compreende uma mutação na posição 297, de modo que o resíduo de asparagina tipo selvagem nessa posição seja substituído por outro aminoácido que interfere na glicosilação nessa posição. Em outro aspecto, a função efetora é reduzida ou eliminada por modificação do isotipo do anticorpo para um isotipo que naturalmente tem função efetora reduzida ou eliminada.
[0032] Em outro aspecto, a região Fc é modificada para reduzir ou eliminar a função efetora. Em outro aspecto a função efetora é reduzida ou eliminada por pelo menos uma modificação da região Fc. Em um aspecto, a modificação é uma mutação de ponto da região Fc para prejudicar a ligação a um ou mais receptores Fc selecionados a partir das seguintes posições: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 265, 268, 269, 270, 272, 278, 289, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 301,303, 322, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 414, 416, 419, 434, 435, 437, 438 e 439. Em outro aspecto, a modificação é eliminação de algumas ou de todas as regiões Fc. Em outro aspecto, a função efetora é reduzida ou eliminada por deleção de toda ou de uma porção da região Fc, ou por elaboração genética do anticorpo, de modo que este não inclua uma região Fc competente para função efetora. Em um
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18/171 aspecto, o anticorpo é selecionado a partir de um Fab ou de um anticorpo de cadeia única.
[0033] Em um aspecto, a região Fc e/ou região não Fc do anticorpo é modificada para reduzir ou eliminar a ativação da via de complemento pelo anticorpo. Em um aspecto, a modificação é uma mutação de ponto da região Fc para prejudicar a ligação a C1q, selecionada a partir das seguintes posições: 270, 322, 329 e 321. Em outro aspecto, a modificação é eliminação de algumas ou de todas as regiões Fc. Em outro aspecto, a função de ativação de complemento é reduzida ou eliminada por deleção de toda ou de uma porção da região Fc, ou por elaboração genética do anticorpo, de modo que este não inclua uma região Fc que se engaje na via de complemento. Em um aspecto, o anticorpo é selecionado a partir de um Fab ou de um anticorpo de cadeia única. Em outro aspecto, a região não Fc do anticorpo é modificada para reduzir ou eliminar ativação da via de complemento pelo anticorpo. Em um aspecto, a modificação é uma mutação de ponto da região CH1 para prejudicar ligação a C3. Em um aspecto, a mutação de ponto está na posição 132 (consulte, por exemplo, Vidarte et aí, (2001) J. BioL Chem. 276(41): 3821738223).
[0034] Em outro aspecto, a quantidade de dose e/ou frequência de administração do anticorpo é modulada para reduzir a concentração do anticorpo à qual os glóbulos vermelhos são expostos. Em outro aspecto, o anticorpo é modificado para compreender ligação ao BBB-R sensível ao pH.
[0035] Em outro aspecto, um composto adicional é administrado em adição ao anticorpo e ao composto acoplado. Em um aspecto, o composto adicional é responsável ou contribui para a falta de redução dos níveis de reticulócitos. Em outro aspecto, o composto adicional inibe ou previne a ativação ou atividade da via de complemento (consulte, por exemplo, Mollnes e Kirschfink (2006) Molec. Immunol. 43:107-121). Em outro aspecto, o composto
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19/171 ainda protege reticulócitos de depleção relacionada ao anticorpo. Em outro aspecto, o composto adicional apoia o crescimento, desenvolvimento ou restabelecimento de reticulócitos. Em outro aspecto, o composto adicional é selecionado a partir de eritropoietina (EPO), um suplemento de ferro, vitamina C, ácido fólico e vitamina B12. Em outro aspecto, o composto adicional são glóbulos vermelhos ou reticulócitos do mesmo sujeito. Em outro aspecto, o composto adicional são glóbulos vermelhos ou reticulócitos de outro sujeito.
[0036] Em outro aspecto, o composto é uma droga de disfunção neurológica. Em outro aspecto, o composto é um agente de formação de imagens. Em outro aspecto, o composto é marcado. Em outro aspecto, o anticorpo é marcado. Em outro aspecto, o anticorpo não prejudica a ligação do BBB-R a um ou mais de seus ligantes nativos. Em outro aspecto, o anticorpo se liga especificamente ao TfR, de modo que não iniba a ligação do TfR à transferrina. Em outro aspecto, o composto acoplado ao anticorpo é administrado a um mamífero. Em outro aspecto, o mamífero é um humano. Em outro aspecto, o mamífero tem uma disfunção neurológica. Em outro aspecto, a disfunção neurológica é selecionada a partir do grupo que consiste em doença de Alzheimer (AD), acidente vascular cerebral, demência, distrofia muscular (MD), esclerose múltipla (MS), esclerose lateral amiotrófica (ALS), fibrose cística, síndrome de Angelman, síndrome de Liddle, doença de Parkinson, doença de Pick, doença de Paget, câncer e lesão cerebral traumática.
[0037] Em outro aspecto, o aumento na exposição no CNS ao composto é medido em relação à exposição no CNS de um composto acoplado a um anticorpo típico que não tem afinidade diminuída para o BBB-R. Em outro aspecto, o aumento na exposição no CNS ao composto é medido como uma razão da quantidade do composto encontrado no CNS em relação à quantidade encontrada no soro após a administração. Em outro aspecto, o aumento na exposição no CNS resulta em uma taxa maior que 0,1%. Em outro
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20/171 aspecto, o aumento na exposição no CNS ao composto é medido em relação à exposição do CNS de um composto na ausência de um anticorpo acoplado. Em outro aspecto, o aumento na exposição no CNS ao composto é medido por formação de imagens. Em outro aspecto, o aumento na exposição no CNS ao composto é medido por uma leitura indireta, como uma modificação de um ou mais sintomas fisiológicos.
[0038] Em outro aspecto, o anticorpo tem um IC50 para o BBB-R de cerca de 1 nM a cerca de 100 μΜ. Em outro aspecto, o IC50 é de cerca de 5 nM a cerca de 100 μΜ. Em outro aspecto, o IC50 é de cerca de 50 nM a cerca de 100 μΜ. Em outro aspecto, o IC50 é de cerca de 100 nM a cerca de 100 μΜ. Em outro aspecto, o anticorpo tem uma afinidade para o BBB-R de cerca de 5 nM a cerca de 50 μΜ. Em outro aspecto, o anticorpo tem uma afinidade para o BBB-R de cerca de 30 nM a cerca de 30 μΜ. Em outro aspecto, o anticorpo, quando acoplado a um composto, tem uma afinidade para o BBB-R de cerca de 30 nM a cerca de 1 μΜ. Em outro aspecto, o anticorpo, quando acoplado a um composto, tem uma afinidade para o BBB-R de cerca de 50 nM a cerca de 1 μΜ. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao complexo se liga especificamente ao TfR e tem uma afinidade para TfR entre as afinidades observadas para o anticorpo anti-TfRA7BACE1 e o anticorpo anti-TfRE/BACE1. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao complexo se liga especificamente ao TfR e tem uma afinidade para TfR entre as afinidades observadas para o anticorpo anti-TfRD/BACE1 e o anticorpo anti-TfR^BACEI. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao complexo se liga especificamente ao TfR e tem um IC50 para TfR entre os IC50s observados para o anticorpo anti-TfRA/BACE1 e o anticorpo anti-TfRE/BACE1. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao complexo se liga especificamente ao TfR e tem um IC50 para TfR entre os IC50s observados para o anticorpo anti-TfRD/BACE1 e o anticorpo antiTíRe/BACE1. Em um aspecto, a afinidade do anti-BBB-R ou anti-BBB
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R/composto para o BBB-R é medida com o uso de análise de Scatchard. Em outro aspecto, a afinidade do anti-BBB-R ou anti-BBB-R/composto para o BBBR é medida com o uso de análise BIACORE. Em outro aspecto, a afinidade do anti-BBB-R ou anti-BBB-R/composto para o BBB-R é medida com o uso de ELISA de competição.
[0039] Em outro aspecto, a meia-vida de dissociação do anticorpo do BBB-R ao qual especificamente ele se liga é de cerca de 30 segundos a cerca de 30 minutos. Em outro aspecto, a meia vida de dissociação é de cerca de 30 segundos a cerca de 20 minutos. Em outro aspecto, a meia vida de dissociação é de cerca de 30 segundos a cerca de 10 minutos. Em outro aspecto, a meia vida de dissociação é de cerca de 30 segundos a cerca de 5 minutos. Em outro aspecto, a meia vida de dissociação é de cerca de 30 segundos a cerca de 3 minutos. Em outro aspecto, a meia vida de dissociação é de cerca de 30 segundos a cerca de 2 minutos. Em outro aspecto, a meia vida de dissociação é de cerca de 2 minutos. Em outro aspecto, a meia vida de dissociação é de 1 minuto ou menos. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao composto se liga especificamente ao TfR e tem uma meia-vida de dissociação para TfR entre as meias-vidas de dissociação observadas para o anticorpo anti-TfRA/BACE1 e o anticorpo anti-TfRE/BACE1 de suas respectivas ligações a TfR. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao composto se liga especificamente ao TfR e tem uma meia-vida de dissociação para TfR entre as meias-vidas de dissociação observadas para o anticorpo anti-TfRD/BACE1 e o anticorpo anti-TfRE/BACE1 de suas respectivas ligações a TfR. Em outra aspecto, a meia-vida de dissociação do anti-BBB-R ou anti-BBB-R/composto para o BBB-R é medida com o uso de análise BIACORE. Em outro aspecto, a meia-vida de dissociação do anti-BBB-R ou anti-BBB-R/composto para o BBBR é medida com o uso de um ensaio de ligação de competição, como um ELISA de competição.
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22/171 [0040] Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao composto é administrado em uma dose terapêutica. Em um aspecto, a dose terapêutica é uma dose que satura o BBB-R ao qual o anticorpo se liga especificamente. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao composto é administrado em uma dose e uma frequência de dose que minimiza a interação de glóbulos vermelhos com o anticorpo acoplado ao composto embora que ainda facilite a distribuição do composto através da BBB no CNS em níveis terapêuticos.
[0041] Em outro aspecto, o composto é covalentemente acoplado ao anticorpo. Em um aspecto, o composto é unido ao anticorpo por um ligante. Em um aspecto, o ligante é clivável. Em outro aspecto, o ligante não é clivável. Em outro aspecto, o composto é ligado diretamente ao anticorpo. Em um aspecto, o anticorpo é um anticorpo multiespecífico e o composto opcionalmente forma uma porção do anticorpo multiespecífico. Em outro aspecto, o anticorpo multiespecífico compreende um primeiro sítio de ligação de antígeno que se liga ao BBB-R e um segundo sítio de ligação de antígeno que se liga a um antígeno cerebral. Em outro aspecto, o antígeno cerebral é selecionado a partir do grupo que consiste em: beta-secretase 1 (BACE1), Abeta, receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano (HER2), Tau, apolipoproteína E4 (ApoE4), alfa-sinucleína, CD20, huntingtina, proteína príon (PrP), quinase rica em repetição leucina 2 (LRRK2), parquina, presenilina 1, presenilina 2, gama secretase, receptor 6 de morte (DR6), proteína precursora amiloide (APP), receptor de neurotrofina p75 (p75NTR), receptor 6 de interleucina (IL6R), receptor 1 de TNF (TNFR1), beta 1 interleucina e caspase 6. Em outro aspecto, o anticorpo multiespecífico se liga tanto ao TfR como a BACE1. Em outro aspecto, o anticorpo multiespecífico se liga tanto a TfR como a Abeta. Em outro aspecto, o anticorpo multiespecífico é marcado. Em outro aspecto, o composto é reversivelmente acoplado ao anticorpo, de modo que o composto seja
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23/171 liberado do anticorpo junto ou após o transporte na BBB.
[0042] Será apreciado que qualquer um dos aspectos anteriormente mencionados possa ser aplicado individualmente ou em combinação com a realização anteriormente mencionada.
[0043] Em outra realização, a invenção fornece um método para diminuir a liberação de um composto administrado a um sujeito, em que o composto é acoplado a um anticorpo que se liga com baixa afinidade a um BBB-R, de modo que a liberação do composto seja diminuída, e em que a redução dos níveis de glóbulos vermelhos no sujeito mediante administração do anticorpo acoplado ao composto para o sujeito é diminuída ou eliminada. Em um aspecto, o BBB-R é selecionado a partir do grupo que consiste em receptor de transferrina (TfR), receptor de insulina, receptor do fator de crescimento similar à insulina (receptor IGF), proteína 8 relacionada ao receptor de lipoproteína de baixa densidade (LRP8), proteína 1 relacionada ao receptor de lipoproteína de baixa densidade (LRP1), transportador 1 de glicose (Glutl) e fator de crescimento similar ao fator de crescimento epidérmico de ligação à heparina (HB-EGF). Em outra aspecto, o BBB-R é um BBB-R humano. Em um aspecto, o BBB-R é TfR. Em outra aspecto, o BBB-R é TfR, e o anticorpo não inibe a atividade de TfR. Em outro aspecto, o BBB-R é TfR, e o anticorpo não inibe a atividade de TfR à transferrina.
[0044] Em outro aspecto, os glóbulos vermelhos são glóbulos vermelhos imaturos. Em outro aspecto, os glóbulos vermelhos imaturos são reticulócitos. Em outro aspecto, a redução dos níveis de reticulócitos é acompanhada por sintomas clínicos agudos. Em outro aspecto, o método ainda compreende a etapa de monitoramento do sujeito por depleção de glóbulos vermelhos.
[0045] Em outro aspecto, uma ou mais propriedades do anticorpo foram modificadas para reduzir o impacto do anticorpo nos níveis de
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24/171 reticulócitos e/ou reduzir a gravidade ou presença de sintomas clínicos agudos no sujeito. Em um aspecto, a afinidade do anticorpo para o BBB-R é modificada, isto é, diminuída. Em outro aspecto, a função efetora da região Fc do anticorpo é modificada. Em um aspecto, a função efetora foi reduzida ou eliminada em relação à função efetora de um anticorpo tipo selvagem do mesmo isotipo. Em outro aspecto, a função efetora é reduzida ou eliminada por redução de glicosilação do anticorpo. Em outro aspecto, a glicosilação do anticorpo é reduzida por produção do anticorpo em um ambiente que não permite a glicosilação tipo selvagem. Em um aspecto, o anticorpo é produzido em um sistema de produção em células de não mamíferos. Em outro aspecto, o anticorpo é produzido sinteticamente. Em outro aspecto, a glicosilação do anticorpo é reduzida por remoção de grupos carboidrato já presentes no anticorpo. Em outro aspecto, a glicosilação do anticorpo é reduzida por modificação do anticorpo de modo que a glicosilação tipo selvagem não ocorra. Em outro aspecto, a região Fc do anticorpo compreende uma mutação na posição 297, de modo que o resíduo de asparagina tipo selvagem nessa posição seja substituído por outro aminoácido que interfere na glicosilação nessa posição. Em outro aspecto, a função efetora é reduzida ou eliminada por modificação do isotipo do anticorpo para um isotipo que naturalmente tem função efetora reduzida ou eliminada.
[0046] Em outro aspecto, a região Fc é modificada para reduzir ou eliminar a função efetora. Em outro aspecto a função efetora é reduzida ou eliminada por pelo menos uma modificação da região Fc. Em um aspecto, a modificação é uma mutação de ponto da região Fc para prejudicar a ligação a um ou mais receptores Fc selecionados a partir das seguintes posições: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 265, 268, 269, 270, 272, 278, 289, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 301,303, 322, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 414, 416, 419, 434, 435, 437, 438 e 439. Em outro aspecto, a
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25/171 modificação é eliminação de algumas ou de todas as regiões Fc. Em outro aspecto, a função efetora é reduzida ou eliminada por deleção de toda ou de uma porção da região Fc, ou por elaboração genética do anticorpo, de modo que este não inclua uma região Fc competente para função efetora. Em um aspecto, o anticorpo é selecionado a partir de um Fab ou de um anticorpo de cadeia única.
[0047] Em um aspecto, a região Fc e/ou região não Fc do anticorpo é modificada para reduzir ou eliminar a ativação da via de complemento pelo anticorpo. Em um aspecto, a modificação é uma mutação de ponto da região Fc para prejudicar a ligação a C1q, selecionada a partir das seguintes posições: 270, 322, 329 e 321. Em outro aspecto, a modificação é eliminação de algumas ou de todas as regiões Fc. Em outro aspecto, a função de ativação de complemento é reduzida ou eliminada por deleção de toda ou de uma porção da região Fc, ou por elaboração genética do anticorpo, de modo que este não inclua uma região Fc que se engaje na via de complemento. Em um aspecto, o anticorpo é selecionado a partir de um Fab ou de um anticorpo de cadeia única. Em outro aspecto, a região não Fc do anticorpo é modificada para reduzir ou eliminar ativação da via de complemento pelo anticorpo. Em um aspecto, a modificação é uma mutação de ponto da região CH1 para prejudicar ligação a C3. Em um aspecto, a mutação de ponto está na posição 132 (consulte, por exemplo, Vidarte et aí, (2001) J. BioL Chem. 276(41): 3821738223).
[0048] Em outro aspecto, a quantidade de dose e/ou frequência de administração do anticorpo é modulada para reduzir a concentração do anticorpo à qual os glóbulos vermelhos são expostos. Em outro aspecto, o anticorpo é modificado para compreender ligação ao BBB-R sensível ao pH.
[0049] Em outro aspecto, um composto adicional é administrado em adição ao anticorpo e ao composto acoplado. Em um aspecto, o composto
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26/171 adicional é responsável ou contribui para a falta de redução dos níveis de reticulócitos. Em outro aspecto, o composto adicional inibe ou previne a ativação ou atividade da via de complemento (consulte, por exemplo, Mollnes e Kirschfink (2006) Molec. Immunol. 43:107-121). Em outro aspecto, o composto ainda protege reticulócitos de depleção relacionada ao anticorpo. Em outro aspecto, o composto adicional apoia o crescimento, desenvolvimento ou restabelecimento de reticulócitos. Em outro aspecto, o composto adicional é selecionado a partir de eritropoietina (EPO), um suplemento de ferro, vitamina C, ácido fólico e vitamina B12. Em outro aspecto, o composto adicional são glóbulos vermelhos ou reticulócitos do mesmo sujeito. Em outro aspecto, o composto adicional são glóbulos vermelhos ou reticulócitos de outro sujeito.
[0050] Em outro aspecto, o composto é uma droga de disfunção neurológica. Em outro aspecto, o composto é um agente de formação de imagens. Em outra aspecto, o composto é marcado. Em outro aspecto, o anticorpo é marcado. Em outro aspecto, o anticorpo não prejudica a ligação do BBB-R a um ou mais de seus ligantes nativos. Em outro aspecto, o anticorpo se liga especificamente ao TfR, de modo que não iniba a ligação do TfR à transferrina. Em outro aspecto, o sujeito é um mamífero. Em outro aspecto, o mamífero é um humano. Em outro aspecto, o mamífero tem uma disfunção neurológica. Em outro aspecto, a disfunção neurológica é selecionada a partir do grupo que consiste em doença de Alzheimer (AD), acidente vascular cerebral, demência, distrofia muscular (MD), esclerose múltipla (MS), esclerose lateral amiotrófica (ALS), fibrose cística, síndrome de Angelman, síndrome de Liddle, doença de Parkinson, doença de Pick, doença de Paget, câncer e lesão cerebral traumática.
[0051] Em outro aspecto, a diminuição na depuração do composto é medida em relação à depuração de um composto acoplado a um anticorpo típico que não tem afinidade diminuída para o BBB-R. Em outro aspecto, a
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27/171 diminuição na depuração do composto é medida em relação à depuração do composto na ausência de um anticorpo acoplado.
[0052] Em outro aspecto, o anticorpo tem um IC50 para o BBB-R de cerca de 1 nM a cerca de 100 μΜ. Em outro aspecto, o IC50 é de cerca de 5 nM a cerca de 100 μΜ. Em outro aspecto, o IC50 é de cerca de 50 nM a cerca de 100 μΜ. Em outro aspecto, o IC50 é de cerca de 100 nM a cerca de 100 μΜ. Em outro aspecto, o anticorpo tem uma afinidade para o BBB-R de cerca de 5 nM a cerca de 50 μΜ. Em outro aspecto, o anticorpo tem uma afinidade para o BBB-R de cerca de 30 nM a cerca de 30 μΜ. Em outro aspecto, o anticorpo, quando acoplado a um composto, tem uma afinidade para o BBB-R de cerca de 30 nM a cerca de 1 μΜ. Em outro aspecto, o anticorpo, quando acoplado a um composto, tem uma afinidade para o BBB-R de cerca de 50 nM a cerca de 1 μΜ. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao complexo se liga especificamente ao TfR e tem uma afinidade para TfR entre as afinidades observadas para o anticorpo anti-TfRA7BACE1 e o anticorpo anti-TfRE/BACE1. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao complexo se liga especificamente ao TfR e tem uma afinidade para TfR entre as afinidades observadas para o anticorpo anti-TfRD/BACE1 e o anticorpo anti-TfR^BACEI. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao complexo se liga especificamente ao TfR e tem um IC50 para TfR entre os IC50s observados para o anticorpo anti-TfRA/BACE1 e o anticorpo anti-TfRE/BACE1. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao complexo se liga especificamente ao TfR e tem um IC50 para TfR entre os IC50s observados para o anticorpo anti-TfRD/BACE1 e o anticorpo antiTíRe/BACE1. Em um aspecto, a afinidade do anti-BBB-R ou anti-BBBR/composto para o BBB-R é medida com o uso de análise de Scatchard. Em outro aspecto, a afinidade do anti-BBB-R ou anti-BBB-R/composto para o BBBR é medida com o uso de análise BIACORE. Em outro aspecto, a afinidade do anti-BBB-R ou anti-BBB-R/composto para o BBB-R é medida com o uso de
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ELISA de competição.
[0053] Em outro aspecto, a meia-vida de dissociação do anticorpo do BBB-R ao qual especificamente ele se liga é de cerca de 30 segundos a cerca de 30 minutos. Em outro aspecto, a meia vida de dissociação é de cerca de 30 segundos a cerca de 20 minutos. Em outro aspecto, a meia vida de dissociação é de cerca de 30 segundos a cerca de 10 minutos. Em outro aspecto, a meia vida de dissociação é de cerca de 30 segundos a cerca de 5 minutos. Em outro aspecto, a meia vida de dissociação é de cerca de 30 segundos a cerca de 3 minutos. Em outro aspecto, a meia vida de dissociação é de cerca de 30 segundos a cerca de 2 minutos. Em outro aspecto, a meia vida de dissociação é de cerca de 2 minutos. Em outro aspecto, a meia vida de dissociação é de 1 minuto ou menos. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao composto se liga especificamente ao TfR e tem uma meia-vida de dissociação para TfR entre as meias-vidas de dissociação observadas para o anticorpo anti-TfRA/BACE1 e o anticorpo anti-TfRE/BACE1 de suas respectivas ligações a TfR. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao composto se liga especificamente ao TfR e tem uma meia-vida de dissociação para TfR entre as meias-vidas de dissociação observadas para o anticorpo anti-TfRD/BACE1 e o anticorpo anti-TfRE/BACE1 de suas respectivas ligações a TfR. Em outro aspecto, a meia-vida de dissociação do anti-BBB-R ou anti-BBB-R/composto para o BBB-R é medida com o uso de análise BIACORE. Em outro aspecto, a meia-vida de dissociação do anti-BBB-R ou anti-BBB-R/composto para o BBBR é medida com o uso de um ensaio de ligação de competição, como um ELISA de competição.
[0054] Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao composto é administrado em uma dose terapêutica. Em um aspecto, a dose terapêutica é uma dose que satura o BBB-R ao qual o anticorpo se liga especificamente. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao composto é administrado em uma dose
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29/171 e uma frequência de dose que minimiza a interação de glóbulos vermelhos com o anticorpo acoplado ao composto embora que ainda facilite a distribuição do composto através da BBB no CNS em níveis terapêuticos.
[0055] Em outro aspecto, o composto é covalentemente acoplado ao anticorpo. Em um aspecto, o composto é unido ao anticorpo por um ligante. Em um aspecto, o ligante é clivável. Em outro aspecto, o ligante não é clivável. Em outro aspecto, o composto é ligado diretamente ao anticorpo. Em um aspecto, o anticorpo é um anticorpo multiespecífico e o composto opcionalmente forma uma porção do anticorpo multiespecífico. Em outro aspecto, o anticorpo multiespecífico compreende um primeiro sítio de ligação de antígeno que se liga ao BBB-R e um segundo sítio de ligação de antígeno que se liga a um antígeno cerebral. Em outro aspecto, o antígeno cerebral é selecionado a partir do grupo que consiste em: beta-secretase 1 (BACE1), Abeta, receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano (HER2), Tau, apolipoproteína E4 (ApoE4), alfa-sinucleína, CD20, huntingtina, proteína príon (PrP), quinase rica em repetição leucina 2 (LRRK2), parquina, presenilina 1, presenilina 2, gama secretase, receptor 6 de morte (DR6), proteína precursora amiloide (APP), receptor de neurotrofina p75 (p75NTR), receptor 6 de interleucina (IL6R), receptor 1 de TNF (TNFR1), beta 1 interleucina e caspase 6. Em outro aspecto, o anticorpo multiespecífico se liga tanto ao TfR como a BACE1. Em outro aspecto, o anticorpo multiespecífico se liga tanto a TfR como a Abeta. Em outro aspecto, o anticorpo multiespecífico é marcado. Em outro aspecto, o composto é reversivelmente acoplado ao anticorpo, de modo que o composto seja liberado do anticorpo junto ou após o transporte na BBB.
[0056] Será apreciado que qualquer um dos aspectos anteriormente mencionados possa ser aplicado individualmente ou em combinação com a realização anteriormente mencionada.
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30/171 [0057] Um método, para aumentar a retenção no CNS de um composto administrado a um sujeito, em que o composto é acoplado a um anticorpo que se liga com baixa afinidade a um BBB-R, de modo que a retenção no CNS do composto seja aumentada, e em que a redução dos níveis de glóbulos vermelhos no sujeito mediante administração do anticorpo acoplado ao composto para o sujeito é diminuída ou eliminada. Em um aspecto, o BBB-R é selecionado a partir do grupo que consiste em receptor de transferrina (TfR), receptor de insulina, receptor do fator de crescimento similar à insulina (receptor IGF), proteína 8 relacionada ao receptor de lipoproteína de baixa densidade (LRP8), proteína 1 relacionada ao receptor de lipoproteína de baixa densidade (LRP1), transportador 1 de glicose (Glutl) e fator de crescimento similar ao fator de crescimento epidérmico de ligação à heparina (HB-EGF). Em outro aspecto, o BBB-R é um BBB-R humano. Em um aspecto, o BBB-R é TfR. Em outro aspecto, o BBB-R é TfR, e o anticorpo não inibe a atividade de TfR. Em outro aspecto, o BBB-R é TfR, e o anticorpo não inibe a atividade de TfR à transferrina.
[0058] Em outro aspecto, os glóbulos vermelhos são glóbulos vermelhos imaturos. Em outro aspecto, os glóbulos vermelhos imaturos são reticulócitos. Em outro aspecto, a redução dos níveis de reticulócitos é acompanhada por sintomas clínicos agudos. Em outro aspecto, o método ainda compreende a etapa de monitoramento do sujeito por depleção de glóbulos vermelhos.
[0059] Em outro aspecto, uma ou mais propriedades do anticorpo foram modificadas para reduzir o impacto do anticorpo nos níveis de reticulócitos e/ou reduzir a gravidade ou presença de sintomas clínicos agudos no sujeito. Em um aspecto, a afinidade do anticorpo para o BBB-R é modificada, isto é, diminuída. Em outro aspecto, a função efetora da região Fc do anticorpo é modificada. Em um aspecto, a função efetora foi reduzida ou
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31/171 eliminada em relação à função efetora de um anticorpo tipo selvagem do mesmo isotipo. Em outro aspecto, a função efetora é reduzida ou eliminada por redução de glicosilação do anticorpo. Em outro aspecto, a glicosilação do anticorpo é reduzida por produção do anticorpo em um ambiente que não permite a glicosilação tipo selvagem. Em um aspecto, o anticorpo é produzido em um sistema de produção em células de não mamíferos. Em outro aspecto, o anticorpo é produzido sinteticamente. Em outro aspecto, a glicosilação do anticorpo é reduzida por remoção de grupos carboidrato já presentes no anticorpo. Em outro aspecto, a glicosilação do anticorpo é reduzida por modificação do anticorpo de modo que a glicosilação tipo selvagem não ocorra. Em outro aspecto, a região Fc do anticorpo compreende uma mutação na posição 297, de modo que o resíduo de asparagina tipo selvagem nessa posição seja substituído por outro aminoácido que interfere na glicosilação nessa posição. Em outro aspecto, a função efetora é reduzida ou eliminada por modificação do isotipo do anticorpo para um isotipo que naturalmente tem função efetora reduzida ou eliminada.
[0060] Em outro aspecto, a região Fc é modificada para reduzir ou eliminar a função efetora. Em outro aspecto a função efetora é reduzida ou eliminada por pelo menos uma modificação da região Fc. Em um aspecto, a modificação é uma mutação de ponto da região Fc para prejudicar a ligação a um ou mais receptores Fc selecionados a partir das seguintes posições: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 265, 268, 269, 270, 272, 278, 289, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 301,303, 322, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 414, 416, 419, 434, 435, 437, 438 e 439. Em outro aspecto, a modificação é eliminação de algumas ou de todas as regiões Fc. Em outro aspecto, a função efetora é reduzida ou eliminada por deleção de toda ou de uma porção da região Fc, ou por elaboração genética do anticorpo, de modo que este não inclua uma região Fc competente para função efetora. Em um
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32/171 aspecto, o anticorpo é selecionado a partir de um Fab ou de um anticorpo de cadeia única.
[0061] Em um aspecto, a região Fc e/ou região não Fc do anticorpo é modificada para reduzir ou eliminar a ativação da via de complemento pelo anticorpo. Em um aspecto, a modificação é uma mutação de ponto da região Fc para prejudicar a ligação a C1q, selecionada a partir das seguintes posições: 270, 322, 329 e 321. Em outro aspecto, a modificação é eliminação de algumas ou de todas as regiões Fc. Em outro aspecto, a função de ativação de complemento é reduzida ou eliminada por deleção de toda ou de uma porção da região Fc, ou por elaboração genética do anticorpo, de modo que este não inclua uma região Fc que se engaje na via de complemento. Em um aspecto, o anticorpo é selecionado a partir de um Fab ou de um anticorpo de cadeia única. Em outro aspecto, a região não Fc do anticorpo é modificada para reduzir ou eliminar ativação da via de complemento pelo anticorpo. Em um aspecto, a modificação é uma mutação de ponto da região CH1 para prejudicar ligação a C3. Em um aspecto, a mutação de ponto está na posição 132 (consulte, por exemplo, Vidarte et a!., (2001) J. BioL Chem. 276(41): 3821738223).
[0062] Em outro aspecto, a quantidade de dose e/ou frequência de administração do anticorpo é modulada para reduzir a concentração do anticorpo à qual os glóbulos vermelhos são expostos. Em outro aspecto, o anticorpo é modificado para compreender ligação ao BBB-R sensível ao pH.
[0063] Em outro aspecto, um composto adicional é administrado em adição ao anticorpo e ao composto acoplado. Em um aspecto, o composto adicional é responsável ou contribui para a falta de redução dos níveis de reticulócitos. Em outro aspecto, o composto adicional inibe ou previne a ativação ou atividade da via de complemento (consulte, por exemplo, Mollnes e Kirschfink (2006) Molec. Immunol. 43:107-121). Em outro aspecto, o composto
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33/171 ainda protege reticulócitos de depleção relacionada ao anticorpo. Em outro aspecto, o composto adicional apoia o crescimento, desenvolvimento ou restabelecimento de reticulócitos. Em outro aspecto, o composto adicional é selecionado a partir de eritropoietina (EPO), um suplemento de ferro, vitamina C, ácido fólico e vitamina B12. Em outro aspecto, o composto adicional são glóbulos vermelhos ou reticulócitos do mesmo sujeito. Em outro aspecto, o composto adicional são glóbulos vermelhos ou reticulócitos de outro sujeito.
[0064] Em outro aspecto, o composto é uma droga de disfunção neurológica. Em outro aspecto, o composto é um agente de formação de imagens. Em outro aspecto, o composto é marcado. Em outro aspecto, o anticorpo é marcado. Em outro aspecto, o anticorpo não prejudica a ligação do BBB-R a um ou mais de seus ligantes nativos. Em outro aspecto, o anticorpo se liga especificamente ao TfR, de modo que não iniba a ligação do TfR à transferrina. Em outro aspecto, o composto é administrado a um mamífero. Em outro aspecto, o mamífero é um humano. Em outro aspecto, o mamífero tem uma disfunção neurológica. Em outro aspecto, a disfunção neurológica é selecionada a partir do grupo que consiste em doença de Alzheimer (AD), acidente vascular cerebral, demência, distrofia muscular (MD), esclerose múltipla (MS), esclerose lateral amiotrófica (ALS), fibrose cística, síndrome de Angelman, síndrome de Liddle, doença de Parkinson, doença de Pick, doença de Paget, câncer e lesão cerebral traumática.
[0065] Em outro aspecto, o aumento na retenção no CNS do composto é medido em relação à retenção no CNS de um composto acoplado a um anticorpo típico que não tem afinidade diminuída para o BBB-R. Em outro aspecto, o aumento na retenção no CNS do composto é medido como uma razão da quantidade do composto encontrado no CNS em relação à quantidade encontrada no soro em um ou mais pontos no tempo após a administração. Em outro aspecto, o aumento na retenção no CNS resulta em
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34/171 uma taxa maior que 0,1% em um ou mais pontos no tempo após a administração. Em outro aspecto, o aumento na retenção no CNS ao composto é medido em relação à exposição no CNS de um composto na ausência de um anticorpo acoplado. Em outro aspecto, o aumento na retenção no CNS do composto é medido por formação de imagens. Em outro aspecto, o aumento na retenção no CNS do composto é medido por uma leitura indireta, como uma modificação de um ou mais sintomas fisiológicos.
[0066] Em outro aspecto, o anticorpo tem um IC50 para o BBB-R de cerca de 1 nM a cerca de 100 μΜ. Em outro aspecto, o IC50 é de cerca de 5 nM a cerca de 100 μΜ. Em outro aspecto, o IC50 é de cerca de 50 nM a cerca de 100 μΜ. Em outro aspecto, o IC50 é de cerca de 100 nM a cerca de 100 μΜ. Em outro aspecto, o anticorpo tem uma afinidade para o BBB-R de cerca de 5 nM a cerca de 50 μΜ. Em outro aspecto, o anticorpo tem uma afinidade para o BBB-R de cerca de 30 nM a cerca de 30 μΜ. Em outro aspecto, o anticorpo, quando acoplado a um composto, tem uma afinidade para o BBB-R de cerca de 30 nM a cerca de 1 μΜ. Em outra aspecto, o anticorpo, quando acoplado a um composto, tem uma afinidade para o BBB-R de cerca de 50 nM a cerca de 1 μΜ. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao complexo se liga especificamente ao TfR e tem uma afinidade para TfR entre as afinidades observadas para o anticorpo anti-TíRA/BACE1 e o anticorpo anti-TfRE/BACE1. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao complexo se liga especificamente ao TfR e tem uma afinidade para TfR entre as afinidades observadas para o anticorpo anti-TfRD/BACE1 e o anticorpo anti-TfRE/BACE1. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao complexo se liga especificamente ao TfR e tem um IC50 para TfR entre os IC50s observados para o anticorpo anti-TfRA/BACE1 e o anticorpo anti-TfRE/BACE1. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao complexo se liga especificamente ao TfR e tem um IC50 para TfR entre os IC50s observados para o anticorpo anti-TfRD/BACE1 e o anticorpo anti
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TíRe/BACE1. Em um aspecto, a afinidade do anti-BBB-R ou antí-BBBR/composto para o BBB-R é medida com o uso de análise de Scatchard. Em outro aspecto, a afinidade do anti-BBB-R ou anti-BBB-R/composto para o BBBR é medida com o uso de análise BIACORE. Em outro aspecto, a afinidade do anti-BBB-R ou anti-BBB-R/composto para o BBB-R é medida com o uso de ELISA de competição.
[0067] Em outro aspecto, a meia-vida de dissociação do anticorpo do BBB-R ao qual especificamente ele se liga é de cerca de 30 segundos a cerca de 30 minutos. Em outro aspecto, a meia vida de dissociação é de cerca de 30 segundos a cerca de 20 minutos. Em outro aspecto, a meia vida de dissociação é de cerca de 30 segundos a cerca de 10 minutos. Em outro aspecto, a meia vida de dissociação é de cerca de 30 segundos a cerca de 5 minutos. Em outro aspecto, a meia vida de dissociação é de cerca de 30 segundos a cerca de 3 minutos. Em outro aspecto, a meia vida de dissociação é de cerca de 30 segundos a cerca de 2 minutos. Em outro aspecto, a meia vida de dissociação é de cerca de 2 minutos. Em outro aspecto, a meia vida de dissociação é de 1 minuto ou menos. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao composto se liga especificamente ao TfR e tem uma meia-vida de dissociação para TfR entre as meias-vidas de dissociação observadas para o anticorpo anti-TfRA7BACE1 e o anticorpo anti-TfRE/BACE1 de suas respectivas ligações a TfR. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao composto se liga especificamente ao TfR e tem uma meia-vida de dissociação para TfR entre as meias-vidas de dissociação observadas para o anticorpo anti-TfRD/BACE1 e o anticorpo anti-TfRE/BACE1 de suas respectivas ligações a TfR. Em outro aspecto, a meia-vida de dissociação do anti-BBB-R ou anti-BBB-R/composto para o BBB-R é medida com o uso de análise BIACORE. Em outro aspecto, a meia-vida de dissociação do anti-BBB-R ou anti-BBB-R/composto para o BBBR é medida com o uso de um ensaio de ligação de competição, como um
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ELISA de competição.
[0068] Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao composto é administrado em uma dose terapêutica. Em um aspecto, a dose terapêutica é uma dose que satura o BBB-R ao qual o anticorpo se liga especificamente. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao composto é administrado em uma dose e uma frequência de dose que minimiza a interação de glóbulos vermelhos com o anticorpo acoplado ao composto embora que ainda facilite a distribuição do composto através da BBB no CNS em níveis terapêuticos.
[0069] Em outro aspecto, o composto é covalentemente acoplado ao anticorpo. Em um aspecto, o composto é unido ao anticorpo por um ligante. Em um aspecto, o ligante é clivável. Em outro aspecto, o ligante não é clivável. Em outro aspecto, o composto é ligado diretamente ao anticorpo. Em um aspecto, o anticorpo é um anticorpo multiespecífico e o composto opcionalmente forma uma porção do anticorpo multiespecífico. Em outro aspecto, o anticorpo multiespecífico compreende um primeiro sítio de ligação de antígeno que se liga ao BBB-R e um segundo sítio de ligação de antígeno que se liga a um antígeno cerebral, beta-secretase 1 (BACE1), Abeta, receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano (HER2), tau, apolipoproteína E4 (ApoE4), alfa-sinucleína, CD20, huntingtina, proteína príon (PrP), quinase rica em repetição leucina 2 (LRRK2), parquina, presenilina 1, presenilina 2, gama secretase, receptor 6 de morte (DR6), proteína precursora amiloide (APP), receptor de neurotrofina p75 (p75NTR) caspase 6. Em outro aspecto, o anticorpo multiespecífico se liga tanto ao TfR como a BACE1. Em outro aspecto, o anticorpo multiespecífico se liga tanto a TfR como a Abeta. Em outro aspecto, o anticorpo multiespecífico é marcado. Em outro aspecto, o composto é reversivelmente acoplado ao anticorpo, de modo que o composto seja liberado do anticorpo junto ou após o transporte na BBB.
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37/171 [0070] Será apreciado que qualquer um dos aspectos anteriormente mencionados possa ser aplicado individualmente ou em combinação com a realização anteriormente mencionada.
[0071] Em outra realização, a invenção fornece um método para otimizar as farmacocinéticas e/ou farmacodinâmicas de um composto para ser eficaz no CNS de um sujeito, caracterizado pelo fato do composto ser acoplado a um anticorpo que se liga com baixa afinidade a um BBB-R, e o anticorpo ser selecionado de modo que sua afinidade para o BBB-R após o acoplamento ao composto resulte em uma quantidade de transporte do anticorpo conjugado ao composto através da BBB que otimiza a farmacocinética e/ou farmacodinâmica do composto no CNS, em que a redução dos níveis de glóbulos vermelhos no sujeito mediante administração do anticorpo acoplado ao composto para o sujeito é diminuída ou eliminada. Em um aspecto, o BBB-R é selecionado a partir do grupo que consiste em receptor de transferrina (TfR), receptor de insulina, receptor do fator de crescimento similar à insulina (receptor IGF), proteína 8 relacionada ao receptor de lipoproteína de baixa densidade (LRP8), proteína 1 relacionada ao receptor de lipoproteína de baixa densidade (LRP1), transportador 1 de glicose (Glutl) e fator de crescimento similar ao fator de crescimento epidérmico de ligação à heparina (HB-EGF). Em outro aspecto, o BBB-R é um BBB-R humano. Em um aspecto, o BBB-R é TfR. Em outro aspecto, o BBB-R é TfR, e o anticorpo não inibe a atividade de TfR. Em outro aspecto, o BBB-R é TfR, e o anticorpo não inibe a atividade de TfR à transferrina.
[0072] Em outro aspecto, os glóbulos vermelhos são glóbulos vermelhos imaturos. Em outro aspecto, os glóbulos vermelhos imaturos são reticulócitos. Em outro aspecto, a redução dos níveis de reticulócitos é acompanhada por sintomas clínicos agudos. Em outro aspecto, o método ainda compreende a etapa de monitoramento do sujeito por depleção de glóbulos
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38/171 vermelhos.
[0073] Em outro aspecto, uma ou mais propriedades do anticorpo foram modificadas para reduzir o impacto do anticorpo nos níveis de reticulócitos e/ou reduzir a gravidade ou presença de sintomas clínicos agudos no sujeito. Em um aspecto, a afinidade do anticorpo para o BBB-R é modificada, isto é, diminuída. Em outro aspecto, a função efetora da região Fc do anticorpo é modificada. Em um aspecto, a função efetora foi reduzida ou eliminada em relação à função efetora de um anticorpo tipo selvagem do mesmo isotipo. Em outro aspecto, a função efetora é reduzida ou eliminada por redução de glicosilação do anticorpo. Em outro aspecto, a glicosilação do anticorpo é reduzida por produção do anticorpo em um ambiente que não permite a glicosilação tipo selvagem. Em um aspecto, o anticorpo é produzido em um sistema de produção em células de não mamíferos. Em outro aspecto, o anticorpo é produzido sinteticamente. Em outro aspecto, a glicosilação do anticorpo é reduzida por remoção de grupos carboidrato já presentes no anticorpo. Em outro aspecto, a glicosilação do anticorpo é reduzida por modificação do anticorpo de modo que a glicosilação tipo selvagem não ocorra. Em outro aspecto, a região Fc do anticorpo compreende uma mutação na posição 297, de modo que o resíduo de asparagina tipo selvagem nessa posição seja substituído por outra aminoácido que interfere na glicosilação nessa posição. Em outro aspecto, a função efetora é reduzida ou eliminada por modificação do isotipo do anticorpo para um isotipo que naturalmente tem função efetora reduzida ou eliminada.
[0074] Em outro aspecto, a região Fc é modificada para reduzir ou eliminar a função efetora. Em outro aspecto a função efetora é reduzida ou eliminada por pelo menos uma modificação da região Fc. Em um aspecto, a modificação é uma mutação de ponto da região Fc para prejudicar a ligação a um ou mais receptores Fc selecionados a partir das seguintes posições: 238,
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239, 248, 249, 252, 254, 265, 268, 269, 270, 272, 278, 289, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 301,303, 322, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 414, 416, 419, 434, 435, 437, 438 e 439. Em outro aspecto, a modificação é eliminação de algumas ou de todas as regiões Fc. Em outro aspecto, a função efetora é reduzida ou eliminada por deleção de toda ou de uma porção da região Fc, ou por elaboração genética do anticorpo, de modo que este não inclua uma região Fc competente para função efetora. Em um aspecto, o anticorpo é selecionado a partir de um Fab ou de um anticorpo de cadeia única.
[0075] Em um aspecto, a região Fc e/ou região não Fc do anticorpo é modificada para reduzir ou eliminar a ativação da via de complemento pelo anticorpo. Em um aspecto, a modificação é uma mutação de ponto da região Fc para prejudicar a ligação a C1q, selecionada a partir das seguintes posições: 270, 322, 329 e 321. Em outro aspecto, a modificação é eliminação de algumas ou de todas as regiões Fc. Em outro aspecto, a função de ativação de complemento é reduzida ou eliminada por deleção de toda ou de uma porção da região Fc, ou por elaboração genética do anticorpo, de modo que este não inclua uma região Fc que se engaje na via de complemento. Em um aspecto, o anticorpo é selecionado a partir de um Fab ou de um anticorpo de cadeia única. Em outro aspecto, a região não Fc do anticorpo é modificada para reduzir ou eliminar ativação da via de complemento pelo anticorpo. Em um aspecto, a modificação é uma mutação de ponto da região CH1 para prejudicar ligação a C3. Em um aspecto, a mutação de ponto está na posição 132 (consulte, por exemplo, Vidarte et a/., (2001) J. Biol. Chem. 276(41): 3821738223).
[0076] Em outro aspecto, a quantidade de dose e/ou frequência de administração do anticorpo é modulada para reduzir a concentração do anticorpo à qual os glóbulos vermelhos são expostos. Em outro aspecto, o
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40/171 anticorpo é modificado para compreender ligação ao BBB-R sensível ao pH.
[0077] Em outro aspecto, um composto adicional é administrado em adição ao anticorpo e ao composto acoplado. Em um aspecto, o composto adicional é responsável ou contribui para a falta de redução dos níveis de reticulócitos. Em outro aspecto, o composto adicional inibe ou previne a ativação ou atividade da via de complemento (consulte, por exemplo, Mollnes e Kirschfink (2006) Molec. Immunol. 43:107-121). Em outro aspecto, o composto ainda protege reticulócitos de depleção relacionada ao anticorpo. Em outro aspecto, o composto adicional apoia o crescimento, desenvolvimento ou restabelecimento de reticulócitos. Em outro aspecto, o composto adicional é selecionado a partir de eritropoietina (EPO), um suplemento de ferro, vitamina C, ácido fólico e vitamina B12. Em outro aspecto, o composto adicional são glóbulos vermelhos ou reticulócitos do mesmo sujeito. Em outro aspecto, o composto adicional são glóbulos vermelhos ou reticulócitos de outro sujeito.
[0078] Em outro aspecto, o composto é uma droga de disfunção neurológica. Em outro aspecto, o composto é um agente de formação de imagens. Em outro aspecto, o composto é marcado. Em outro aspecto, o anticorpo é marcado. Em outro aspecto, o anticorpo não prejudica a ligação do BBB-R a um ou mais de seus ligantes nativos. Em outro aspecto, o anticorpo se liga especificamente ao TfR, de modo que não iniba a ligação do TfR à transferrina. Em outro aspecto, a BBB está em um mamífero. Em outro aspecto, o mamífero é um humano. Em outro aspecto, o mamífero tem uma disfunção neurológica. Em outro aspecto, a disfunção neurológica é selecionada a partir do grupo que consiste em doença de Alzheimer (AD), acidente vascular cerebral, demência, distrofia muscular (MD), esclerose múltipla (MS), esclerose lateral amiotrófica (ALS), fibrose cística, síndrome de Angelman, síndrome de Liddle, doença de Parkinson, doença de Pick, doença de Paget, câncer e lesão cerebral traumática. Em outro aspecto, a BBB está
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41/171 em um humano.
[0079] Em um aspecto, a otimização pode incluir a geração de uma série de complexos anticorpo-composto em que cada anticorpo tem uma afinidade diferente para o BBB-R, e que avalia as farmacocinéticas e/ou farmacodinâmicas de cada um no SNC. Em outro aspecto, a otimização pode ser relativa a um padrão conhecido, como, mas não se limitando às farmacocinéticas e/ou farmacodinâmicas do composto quando introduzido diretamente no CNS ou quando introduzido ao sujeito na ausência de um anticorpo anti-BBB-R acoplado.
[0080] Em outro aspecto, o anticorpo tem um IC50 para o BBB-R de cerca de 1 nM a cerca de 100 μΜ. Em outro aspecto, o IC50 é de cerca de 5 nM a cerca de 100 μΜ. Em outro aspecto, o IC50 é de cerca de 50 nM a cerca de 100 μΜ. Em outro aspecto, o IC50 é de cerca de 100 nM a cerca de 100 μΜ. Em outro aspecto, o anticorpo tem uma afinidade para o BBB-R de cerca de 5 nM a cerca de 50 μΜ. Em outro aspecto, o anticorpo tem uma afinidade para o BBB-R de cerca de 30 nM a cerca de 30 μΜ. Em outro aspecto, o anticorpo, quando acoplado a um composto, tem uma afinidade para o BBB-R de cerca de 30 nM a cerca de 1 μΜ. Em outro aspecto, o anticorpo, quando acoplado a um composto, tem uma afinidade para o BBB-R de cerca de 50 nM a cerca de 1 μΜ. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao complexo se liga especificamente ao TfR e tem uma afinidade para TfR entre as afinidades observadas para o anticorpo anti-TfRA/BACE1 e o anticorpo anti-TfRE/BACE1. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao complexo se liga especificamente ao TfR e tem uma afinidade para TfR entre as afinidades observadas para o anticorpo anti-TfRD/BACE1 e o anticorpo anti-TfRE/BACE1. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao complexo se liga especificamente ao TfR e tem um IC50 para TfR entre os IC50s observados para o anticorpo anti-TfRA/BACE1 e o anticorpo anti-TfRE/BACE1. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao
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42/171 complexo se liga especificamente ao TfR e tem um IC50 para TfR entre os IC50s observados para o anticorpo anti-TfRD/BACE1 e o anticorpo antiTíRe/BACE1. Em um aspecto, a afinidade do anti-BBB-R ou anti-BBBR/composto para o BBB-R é medida com o uso de análise de Scatchard. Em outro aspecto, a afinidade do anti-BBB-R ou anti-BBB-R/composto para o BBBR é medida com o uso de análise BIACORE. Em outro aspecto, a afinidade do anti-BBB-R ou anti-BBB-R/composto para o BBB-R é medida com o uso de ELISA de competição.
[0081] Em outro aspecto, a meia-vida de dissociação do anticorpo do BBB-R ao qual especificamente ele se liga é de cerca de 30 segundos a cerca de 30 minutos. Em outro aspecto, a meia vida de dissociação é de cerca de 30 segundos a cerca de 20 minutos. Em outro aspecto, a meia vida de dissociação é de cerca de 30 segundos a cerca de 10 minutos. Em outro aspecto, a meia vida de dissociação é de cerca de 30 segundos a cerca de 5 minutos. Em outro aspecto, a meia vida de dissociação é de cerca de 30 segundos a cerca de 3 minutos. Em outro aspecto, a meia vida de dissociação é de cerca de 30 segundos a cerca de 2 minutos. Em outro aspecto, a meia vida de dissociação é de cerca de 2 minutos. Em outro aspecto, a meia vida de dissociação é de 1 minuto ou menos. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao composto se liga especificamente ao TfR e tem uma meia-vida de dissociação para TfR entre as meias-vidas de dissociação observadas para o anticorpo anti-TfRA7BACE1 e o anticorpo anti-TfRE/BACE1 de suas respectivas ligações a TfR. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao composto se liga especificamente ao TfR e tem uma meia-vida de dissociação para TfR entre as meias-vidas de dissociação observadas para o anticorpo anti-TfRD/BACE1 e o anticorpo anti-TfRE/BACE1 de suas respectivas ligações a TfR. Em outro aspecto, a meia-vida de dissociação do anti-BBB-R ou anti-BBB-R/composto para o BBB-R é medida com o uso de análise BIACORE. Em outro aspecto, a
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43/171 meia-vida de dissociação do anti-BBB-R ou anti-BBB-R/composto para o BBBR é medida com o uso de um ensaio de ligação de competição, como um ELISA de competição.
[0082] Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao composto é administrado em uma dose terapêutica. Em um aspecto, a dose terapêutica é uma dose que satura o BBB-R ao qual o anticorpo se liga especificamente. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao composto é administrado em uma dose e uma frequência de dose que minimiza a interação de glóbulos vermelhos com o anticorpo acoplado ao composto embora que ainda facilite a distribuição do composto através da BBB no CNS em níveis terapêuticos.
[0083] Em outro aspecto, o composto é covalentemente acoplado ao anticorpo. Em um aspecto, o composto é unido ao anticorpo por um ligante. Em um aspecto, o ligante é clivável. Em outro aspecto, o ligante não é clivável. Em outro aspecto, o composto é ligado diretamente ao anticorpo. Em um aspecto, o anticorpo é um anticorpo multiespecífico e o composto opcionalmente forma uma porção do anticorpo multiespecífico. Em outro aspecto, o anticorpo multiespecífico compreende um primeiro sítio de ligação de antígeno que se liga ao BBB-R e um segundo sítio de ligação de antígeno que se liga a um antígeno cerebral, beta-secretase 1 (BACE1), Abeta, receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano (HER2), tau, apolipoproteína E4 (ApoE4), alfa-sinucleína, CD20, huntingtina, proteína príon (PrP), quinase rica em repetição leucina 2 (LRRK2), parquina, presenilina 1, presenilina 2, gama secretase, receptor 6 de morte (DR6), proteína precursora amiloide (APP), receptor de neurotrofina p75 (p75NTR) caspase 6. Em outro aspecto, o anticorpo multiespecífico se liga tanto ao TfR como a BACE1. Em outro aspecto, o anticorpo multiespecífico se liga tanto a TfR como a Abeta. Em outro aspecto, o anticorpo multiespecífico é marcado. Em outro aspecto, o composto é reversivelmente acoplado ao
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44/171 anticorpo, de modo que o composto seja liberado do anticorpo junto ou após o transporte na BBB.
[0084] Será apreciado que qualquer um dos aspectos anteriormente mencionados possa ser aplicado individualmente ou em combinação com a realização anteriormente mencionada.
[0085] Em outra realização, a invenção fornece um método para tratar uma disfunção neurológica em um mamífero, que compreende tratar o mamífero com um anticorpo que se liga a um BBB-R e é acoplado a um composto, em que o anticorpo foi selecionado para ter baixa afinidade ao BBBR e, através disso, melhora a absorção no CNS do anticorpo e do composto acoplado, e em que a redução dos níveis de glóbulos vermelhos no sujeito mediante administração do anticorpo acoplado ao composto para o sujeito é diminuída ou eliminada. Em um aspecto, o BBB-R é selecionado a partir do grupo que consiste em receptor de transferrina (TfR), receptor de insulina, receptor do fator de crescimento similar à insulina (receptor IGF), proteína 8 relacionada ao receptor de lipoproteína de baixa densidade (LRP8), proteína 1 relacionada ao receptor de lipoproteína de baixa densidade (LRP1), transportador 1 de glicose (Glutl) e fator de crescimento similar ao fator de crescimento epidérmico de ligação à heparina (HB-EGF). Em outro aspecto, o BBB-R é um BBB-R humano. Em um aspecto, o BBB-R é TfR. Em outro aspecto, o BBB-R é TfR, e o anticorpo não inibe a atividade de TfR. Em outro aspecto, o BBB-R é TfR, e o anticorpo não inibe a atividade de TfR à transferrina.
[0086] Em outro aspecto, os glóbulos vermelhos são glóbulos vermelhos imaturos. Em outro aspecto, os glóbulos vermelhos imaturos são reticulócitos. Em outro aspecto, a redução dos níveis de reticulócitos é acompanhada por sintomas clínicos agudos. Em outro aspecto, o método ainda compreende a etapa de monitoramento do sujeito por depleção de glóbulos
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45/171 vermelhos.
[0087] Em outro aspecto, uma ou mais propriedades do anticorpo foram modificadas para reduzir o impacto do anticorpo nos níveis de reticulócitos e/ou reduzir a gravidade ou presença de sintomas clínicos agudos no sujeito. Em um aspecto, a afinidade do anticorpo para o BBB-R é modificada, isto é, diminuída. Em outro aspecto, a função efetora da região Fc do anticorpo é modificada. Em um aspecto, a função efetora foi reduzida ou eliminada em relação à função efetora de um anticorpo tipo selvagem do mesmo isotipo. Em outro aspecto, a função efetora é reduzida ou eliminada por redução de glicosilação do anticorpo. Em outro aspecto, a glicosilação do anticorpo é reduzida por produção do anticorpo em um ambiente que não permite a glicosilação tipo selvagem. Em um aspecto, o anticorpo é produzido em um sistema de produção em células de não mamíferos. Em outro aspecto, o anticorpo é produzido sinteticamente. Em outro aspecto, a glicosilação do anticorpo é reduzida por remoção de grupos carboidrato já presentes no anticorpo. Em outro aspecto, a glicosilação do anticorpo é reduzida por modificação do anticorpo de modo que a glicosilação tipo selvagem não ocorra. Em outro aspecto, a região Fc do anticorpo compreende uma mutação na posição 297, de modo que o resíduo de asparagina tipo selvagem nessa posição seja substituído por outra aminoácido que interfere na glicosilação nessa posição. Em outro aspecto, a função efetora é reduzida ou eliminada por modificação do isotipo do anticorpo para um isotipo que naturalmente tem função efetora reduzida ou eliminada.
[0088] Em outro aspecto, a região Fc é modificada para reduzir ou eliminar a função efetora. Em outro aspecto a função efetora é reduzida ou eliminada por pelo menos uma modificação da região Fc. Em um aspecto, a modificação é uma mutação de ponto da região Fc para prejudicar a ligação a um ou mais receptores Fc selecionados a partir das seguintes posições: 238,
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239, 248, 249, 252, 254, 265, 268, 269, 270, 272, 278, 289, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 301,303, 322, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 414, 416, 419, 434, 435, 437, 438 e 439. Em outro aspecto, a modificação é eliminação de algumas ou de todas as regiões Fc. Em outro aspecto, a função efetora é reduzida ou eliminada por deleção de toda ou de uma porção da região Fc, ou por elaboração genética do anticorpo, de modo que este não inclua uma região Fc competente para função efetora. Em um aspecto, o anticorpo é selecionado a partir de um Fab ou de um anticorpo de cadeia única.
[0089] Em outro aspecto, a quantidade de dose e/ou frequência de administração do anticorpo é modulada para reduzir a concentração do anticorpo à qual os glóbulos vermelhos são expostos. Em outro aspecto, o anticorpo é modificado para compreender ligação ao BBB-R sensível ao pH.
[0090] Em outro aspecto, um composto adicional é administrado em adição ao anticorpo e ao composto acoplado. Em um aspecto, o composto adicional é responsável ou contribui para a falta de redução dos níveis de reticulócitos. Em outro aspecto, o composto adicional inibe ou previne a ativação ou atividade da via de complemento (consulte, por exemplo, Mollnes e Kirschfink (2006) Molec. Immunol. 43:107-121). Em outro aspecto, o composto ainda protege reticulócitos de depleção relacionada ao anticorpo. Em outro aspecto, o composto adicional apoia o crescimento, desenvolvimento ou restabelecimento de reticulócitos. Em outro aspecto, o composto adicional é selecionado a partir de eritropoietina (EPO), um suplemento de ferro, vitamina C, ácido fólico e vitamina B12. Em outro aspecto, o composto adicional são glóbulos vermelhos ou reticulócitos do mesmo sujeito. Em outro aspecto, o composto adicional são glóbulos vermelhos ou reticulócitos de outro sujeito.
[0091] Em outro aspecto, o composto é uma droga de disfunção neurológica. Em outro aspecto, o composto é um agente de formação de
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47/171 imagens. Em outro aspecto, o composto é marcado. Em outro aspecto, o anticorpo é marcado. Em outro aspecto, o anticorpo não prejudica a ligação do BBB-R a um ou mais de seus ligantes nativos. Em outro aspecto, o anticorpo se liga especificamente ao TfR, de modo que não iniba a ligação do TfR à transferrina. Em um aspecto, o mamífero é um humano. Em outro aspecto, o mamífero tem uma disfunção neurológica. Em outro aspecto, a disfunção neurológica é selecionada a partir do grupo que consiste em doença de Alzheimer (AD), acidente vascular cerebral, demência, distrofia muscular (MD), esclerose múltipla (MS), esclerose lateral amiotrófica (ALS), fibrose cística, síndrome de Angelman, síndrome de Liddle, doença de Parkinson, doença de Pick, doença de Paget, câncer e lesão cerebral traumática.
[0092] Em um aspecto, o tratamento resulta em redução ou eliminação de sintomas da disfunção. Em outro aspecto, o tratamento resulta em melhoria da disfunção neurológica.
[0093] Em outro aspecto, o anticorpo tem um IC50 para o BBB-R de cerca de 1 nM a cerca de 100 μΜ. Em outro aspecto, o IC50 é de cerca de 5 nM a cerca de 100 μΜ. Em outro aspecto, o IC50 é de cerca de 50 nM a cerca de 100 μΜ. Em outro aspecto, o IC50 é de cerca de 100 nM a cerca de 100 μΜ. Em outro aspecto, o anticorpo tem uma afinidade para o BBB-R de cerca de 5 nM a cerca de 50 μΜ. Em outro aspecto, o anticorpo tem uma afinidade para o BBB-R de cerca de 30 nM a cerca de 30 μΜ. Em outro aspecto, o anticorpo, quando acoplado a um composto, tem uma afinidade para o BBB-R de cerca de 30 nM a cerca de 1 μΜ. Em outro aspecto, o anticorpo, quando acoplado a um composto, tem uma afinidade para o BBB-R de cerca de 50 nM a cerca de 1 μΜ. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao complexo se liga especificamente ao TfR e tem uma afinidade para TfR entre as afinidades observadas para o anticorpo anti-TfRA7BACE1 e o anticorpo anti-TfRE/BACE1. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao complexo se liga especificamente
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48/171 ao TfR e tem uma afinidade para TfR entre as afinidades observadas para o anticorpo anti-TfRD/BACE1 e o anticorpo anti-TfR^BACEI. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao complexo se liga especificamente ao TfR e tem um IC50 para TfR entre os IC50s observados para o anticorpo anti-TfRA/BACE1 e o anticorpo anti-TfRE/BACE1. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao complexo se liga especificamente ao TfR e tem um IC50 para TfR entre os IC50s observados para o anticorpo anti-TfRD/BACE1 e o anticorpo antiTíRe/BACE1. Em um aspecto, a afinidade do anti-BBB-R ou anti-BBBR/composto para o BBB-R é medida com o uso de análise de Scatchard. Em outro aspecto, a afinidade do anti-BBB-R ou anti-BBB-R/composto para o BBBR é medida com o uso de análise BIACORE. Em outro aspecto, a afinidade do anti-BBB-R ou anti-BBB-R/composto para o BBB-R é medida com o uso de ELISA de competição.
[0094] Em outra aspecto, a meia-vida de dissociação do anticorpo do BBB-R ao qual especificamente ele se liga é de cerca de 30 segundos a cerca de 30 minutos. Em outro aspecto, a meia vida de dissociação é de cerca de 30 segundos a cerca de 20 minutos. Em outro aspecto, a meia vida de dissociação é de cerca de 30 segundos a cerca de 10 minutos. Em outro aspecto, a meia vida de dissociação é de cerca de 30 segundos a cerca de 5 minutos. Em outro aspecto, a meia vida de dissociação é de cerca de 30 segundos a cerca de 3 minutos. Em outro aspecto, a meia vida de dissociação é de cerca de 30 segundos a cerca de 2 minutos. Em outro aspecto, a meia vida de dissociação é de cerca de 2 minutos. Em outro aspecto, a meia vida de dissociação é de 1 minuto ou menos. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao composto se liga especificamente ao TfR e tem uma meia-vida de dissociação para TfR entre as meias-vidas de dissociação observadas para o anticorpo anti-TfRA/BACE1 e o anticorpo anti-TfRE/BACE1 de suas respectivas ligações a TfR. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao composto se liga
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49/171 especificamente ao TfR e tem uma meia-vida de dissociação para TfR entre as meias-vidas de dissociação observadas para o anticorpo anti-TfRD/BACE1 e o anticorpo anti-TfRE/BACE1 de suas respectivas ligações a TfR. Em outro aspecto, a meia-vida de dissociação do anti-BBB-R ou anti-BBB-R/composto para o BBB-R é medida com o uso de análise BIACORE. Em outro aspecto, a meia-vida de dissociação do anti-BBB-R ou anti-BBB-R/composto para o BBBR é medida com o uso de um ensaio de ligação de competição, como um ELISA de competição.
[0095] Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao composto é administrado em uma dose terapêutica. Em um aspecto, a dose terapêutica é uma dose que satura o BBB-R ao qual o anticorpo se liga especificamente. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao composto é administrado em uma dose e uma frequência de dose que minimiza a interação de glóbulos vermelhos com o anticorpo acoplado ao composto embora que ainda facilite a distribuição do composto através da BBB no CNS em níveis terapêuticos.
[0096] Em outro aspecto, o composto é covalentemente acoplado ao anticorpo. Em um aspecto, o composto é unido ao anticorpo por um ligante. Em um aspecto, o ligante é clivável. Em outro aspecto, o ligante não é clivável. Em outro aspecto, o composto é ligado diretamente ao anticorpo. Em um aspecto, o anticorpo é um anticorpo multiespecífico e o composto opcionalmente forma uma porção do anticorpo multiespecífico. Em outro aspecto, o anticorpo multiespecífico compreende um primeiro sítio de ligação de antígeno que se liga ao BBB-R e um segundo sítio de ligação de antígeno que se liga a um antígeno cerebral, beta-secretase 1 (BACE1), Abeta, receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano (HER2), tau, apolipoproteína E4 (ApoE4), alfa-sinucleína, CD20, huntingtina, proteína príon (PrP), quinase rica em repetição leucina 2 (LRRK2), parquina, presenilina 1, presenilina 2, gama secretase, receptor 6 de
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50/171 morte (DR6), proteína precursora amiloide (APP), receptor de neurotrofina p75 (p75NTR) caspase 6. Em outro aspecto, o anticorpo multiespecífico se liga tanto ao TfR como a BACE1. Em outro aspecto, o anticorpo multiespecífico se liga tanto a TfR como a Abeta. Em outro aspecto, o anticorpo multiespecífico é marcado. Em outro aspecto, o composto é reversivelmente acoplado ao anticorpo, de modo que o composto seja liberado do anticorpo junto ou após o transporte na BBB.
[0097] Será apreciado que qualquer um dos aspectos anteriormente mencionados possa ser aplicado individualmente ou em combinação com a realização anteriormente mencionada.
[0098] Em outra realização, a invenção fornece um método para aprimorar a segurança em um sujeito de um anticorpo que se liga a um BBB-R, que compreende modificar uma ou mais propriedades do anticorpo, de modo que a administração do anticorpo diminua ou elimine a redução dos níveis de glóbulos vermelhos no sujeito observado após a administração do anticorpo não modificado. Em um aspecto, o BBB-R é selecionado a partir do grupo que consiste em receptor de transferrina (TfR), receptor de insulina, receptor do fator de crescimento similar à insulina (receptor IGF), proteína 8 relacionada ao receptor de lipoproteína de baixa densidade (LRP8), proteína 1 relacionada ao receptor de lipoproteína de baixa densidade (LRP1), transportador 1 de glicose (Glutl) e fator de crescimento similar ao fator de crescimento epidérmico de ligação à heparina (HB-EGF). Em outro aspecto, o BBB-R é um BBB-R humano. Em um aspecto, o BBB-R é TfR. Em outro aspecto, o BBB-R é TfR, e o anticorpo não inibe a atividade de TfR. Em outro aspecto, o BBB-R é TfR, e o anticorpo não inibe a atividade de TfR à transferrina.
[0099] Em outro aspecto, os glóbulos vermelhos são glóbulos vermelhos imaturos. Em outro aspecto, os glóbulos vermelhos imaturos são reticulócitos. Em outro aspecto, a redução dos níveis de reticulócitos é
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51/171 acompanhada por sintomas clínicos agudos.
[00100] Em outro aspecto, uma ou mais propriedades do anticorpo foram modificadas para reduzir o impacto do anticorpo nos níveis de reticulócitos e/ou reduzir a gravidade ou presença de sintomas clínicos agudos no sujeito. Em um aspecto, a afinidade do anticorpo para o BBB-R é modificada, isto é, diminuída. Em outro aspecto, a modificação da afinidade do anticorpo é medida em relação a um anticorpo tipo selvagem do mesmo isotipo não tendo afinidade modificada (isto é, diminuída) para o BBB-R. Em outro aspecto, a função efetora da região Fc do anticorpo é modificada. Em um aspecto, a função efetora foi reduzida ou eliminada em relação à função efetora de um anticorpo tipo selvagem do mesmo isotipo. Em outro aspecto, a função efetora é reduzida ou eliminada por redução de glicosilação do anticorpo. Em outro aspecto, a glicosilação do anticorpo é reduzida por produção do anticorpo em um ambiente que não permite a glicosilação tipo selvagem. Em um aspecto, o anticorpo é produzido em um sistema de produção em células de não mamíferas. Em outro aspecto, o anticorpo é produzido sinteticamente. Em outra aspecto, a glicosilação do anticorpo é reduzida por remoção de grupos carboidrato já presentes no anticorpo. Em outra aspecto, a glicosilação do anticorpo é reduzida por modificação do anticorpo de modo que a glicosilação tipo selvagem não ocorra. Em outra aspecto, a região Fc do anticorpo compreende uma mutação na posição 297, de modo que o resíduo de asparagina tipo selvagem nessa posição seja substituído por outro aminoácido que interfere na glicosilação nessa posição. Em outro aspecto, a função efetora é reduzida ou eliminada por modificação do isotipo do anticorpo para um isotipo que naturalmente tem função efetora reduzida ou eliminada.
[00101] Em outro aspecto, a região Fc é modificada para reduzir ou eliminar a função efetora. Em outro aspecto a função efetora é reduzida ou eliminada por pelo menos uma modificação da região Fc. Em um
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52/171 aspecto, a modificação é uma mutação de ponto da região Fc para prejudicar a ligação a um ou mais receptores Fc selecionados a partir das seguintes posições: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 265, 268, 269, 270, 272, 278, 289, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 301,303, 322, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 414, 416, 419, 434, 435, 437, 438 e 439. Em outro aspecto, a modificação é eliminação de algumas ou de todas as regiões Fc. Em outro aspecto, a função efetora é reduzida ou eliminada por deleção de toda ou de uma porção da região Fc, ou por elaboração genética do anticorpo, de modo que este não inclua uma região Fc competente para função efetora. Em um aspecto, o anticorpo é selecionado a partir de um Fab ou de um anticorpo de cadeia única.
[00102] Em um aspecto, a região Fc e/ou região não Fc do anticorpo é modificada para reduzir ou eliminar a ativação da via de complemento pelo anticorpo. Em um aspecto, a modificação é uma mutação de ponto da região Fc para prejudicar a ligação a C1q, selecionada a partir das seguintes posições: 270, 322, 329 e 321. Em outro aspecto, a modificação é eliminação de algumas ou de todas as regiões Fc. Em outro aspecto, a função de ativação de complemento é reduzida ou eliminada por deleção de toda ou de uma porção da região Fc, ou por elaboração genética do anticorpo, de modo que este não inclua uma região Fc que se engaje na via de complemento. Em um aspecto, o anticorpo é selecionado a partir de um Fab ou de um anticorpo de cadeia única. Em outro aspecto, a região não Fc do anticorpo é modificada para reduzir ou eliminar ativação da via de complemento pelo anticorpo. Em um aspecto, a modificação é uma mutação de ponto da região CH1 para prejudicar ligação a C3. Em um aspecto, a mutação de ponto está na posição 132 (consulte, por exemplo, Vidarte et al., (2001) J. Biol. Chem. 276(41): 3821738223).
[00103] Em outro aspecto, a quantidade de dose e/ou
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53/171 frequência de administração do anticorpo é modulada para reduzir a concentração do anticorpo à qual os glóbulos vermelhos são expostos. Em outro aspecto, o anticorpo é modificado para compreender ligação ao BBB-R sensível ao pH.
[00104] Em outro aspecto, o anticorpo é acoplado a um composto terapêutico. Em outro aspecto, o composto é uma droga de disfunção neurológica. Em outro aspecto, o composto é um agente de formação de imagens. Em outro aspecto, o composto é marcado. Em outro aspecto, o anticorpo é marcado. Em outro aspecto, o anticorpo não prejudica a ligação do BBB-R a um ou mais de seus ligantes nativos. Em outro aspecto, o anticorpo se liga especificamente ao TfR, de modo que não iniba a ligação do TfR à transferrina. Em outro aspecto, a BBB está em um mamífero. Em outro aspecto, o mamífero é um humano. Em outro aspecto, o mamífero tem uma disfunção neurológica. Em outro aspecto, a disfunção neurológica é selecionada a partir do grupo que consiste em doença de Alzheimer (AD), acidente vascular cerebral, demência, distrofia muscular (MD), esclerose múltipla (MS), esclerose lateral amiotrófica (ALS), fibrose cística, síndrame de Angelman, síndrame de Liddle, doença de Parkinson, doença de Pick, doença de Paget, câncer e lesão cerebral traumática. Em outro aspecto, a BBB está em um humano.
[00105] Em outro aspecto, o anticorpo tem um IC50 para o BBB-R de cerca de 1 nMa cerca de 100 μΜ. Em outra aspecto, o IC50 é de cerca de 5 nM a cerca de 100 μΜ. Em outro aspecto, o IC50 é de cerca de 50 nM a cerca de 100 μΜ. Em outro aspecto, o IC50 é de cerca de 100 nM a cerca de 100 μΜ. Em outro aspecto, o anticorpo tem uma afinidade para o BBB-R de cerca de 5 nM a cerca de 50 μΜ. Em outro aspecto, o anticorpo tem uma afinidade para o BBB-R de cerca de 30 nM a cerca de 30 μΜ. Em outra aspecto, o anticorpo, quando acoplado a um composto, tem uma afinidade para
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54/171 o BBB-R de cerca de 30 nM a cerca de 1 μΜ. Em outro aspecto, o anticorpo, quando acoplado a um composto, tem uma afinidade para o BBB-R de cerca de 50 nM a cerca de 1 μΜ. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao complexo se liga especificamente ao TfR e tem uma afinidade para TfR entre as afinidades observadas para o anticorpo anti-TfRA/BACE1 e o anticorpo antiTíRe/BACE1. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao complexo se liga especificamente ao TfR e tem uma afinidade para TfR entre as afinidades observadas para o anticorpo anti-TfRc7BACE1 e o anticorpo anti-TfRE/BACE1. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao complexo se liga especificamente ao TfR e tem um IC50 para TfR entre os IC50s observados para o anticorpo anti-TfRA/BACE1 e o anticorpo anti-TfRE/BACE1. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao complexo se liga especificamente ao TfR e tem um IC50 para TfR entre os IC50s observados para o anticorpo anti-TfRD/BACE1 e o anticorpo anti-TfRE/BACE1. Em um aspecto, a afinidade do anti-BBB-R ou anti-BBBR/composto para o BBB-R é medida com o uso de análise de Scatchard. Em outro aspecto, a afinidade do anti-BBB-R ou anti-BBB-R/composto para o BBBR é medida com o uso de análise BIACORE. Em outro aspecto, a afinidade do anti-BBB-R ou anti-BBB-R/composto para o BBB-R é medida com o uso de ELISA de competição.
[00106] Em outro aspecto, a meia-vida de dissociação do anticorpo do BBB-R ao qual especificamente ele se liga é de cerca de 30 segundos a cerca de 30 minutos. Em outro aspecto, a meia vida de dissociação é de cerca de 30 segundos a cerca de 20 minutos. Em outro aspecto, a meia vida de dissociação é de cerca de 30 segundos a cerca de 10 minutos. Em outro aspecto, a meia vida de dissociação é de cerca de 30 segundos a cerca de 5 minutos. Em outro aspecto, a meia vida de dissociação é de cerca de 30 segundos a cerca de 3 minutos. Em outro aspecto, a meia vida de dissociação é de cerca de 30 segundos a cerca de 2 minutos. Em outro aspecto, a meia
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55/171 vida de dissociação é de cerca de 2 minutos. Em outro aspecto, a meia vida de dissociação é de 1 minuto ou menos. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao composto se liga especificamente ao TfR e tem uma meia-vida de dissociação para TfR entre as meias-vidas de dissociação observadas para o anticorpo anti-TfRA./BACE1 e o anticorpo anti-TfRE/BACE1 de suas respectivas ligações a TfR. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao composto se liga especificamente ao TfR e tem uma meia-vida de dissociação para TfR entre as meias-vidas de dissociação observadas para o anticorpo anti-TfRD/BACE1 e o anticorpo anti-TfRE/BACE1 de suas respectivas ligações a TfR. Em outro aspecto, a meia-vida de dissociação do anti-BBB-R ou anti-BBB-R/composto para o BBB-R é medida com o uso de análise BIACORE. Em outro aspecto, a meia-vida de dissociação do anti-BBB-R ou anti-BBB-R/composto para o BBBR é medida com o uso de um ensaio de ligação de competição, como um ELISA de competição.
[00107] Em outro aspecto, o anticorpo é selecionado a partir de um painel de anticorpos com base na afinidade do anticorpo selecionado. Em outro aspecto, o anticorpo é elaborado geneticamente para ter a afinidade desejada. Em um aspecto, o anticorpo é gerado com o uso de qualquer metodologia de elaboração genética de proteína conhecida na técnica incluindo, mas não se limitando a, exibição por fago, exibição por levedura, mutagênese aleatória e mutagênese sítio-dirigida.
[00108] Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao composto é administrado em uma dose terapêutica. Em um aspecto, a dose terapêutica é uma dose que satura o BBB-R ao qual o anticorpo se liga especificamente. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao composto é administrado em uma dose e uma frequência de dose que minimiza a interação de glóbulos vermelhos com o anticorpo acoplado ao composto embora que ainda facilite a distribuição do composto através da BBB no CNS em níveis
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56/171 terapêuticos.
[00109] Em outro aspecto, o composto é covalentemente acoplado ao anticorpo. Em um aspecto, o composto é unido ao anticorpo por um ligante. Em um aspecto, o ligante é clivável. Em outro aspecto, o ligante não é clivável. Em outro aspecto, o composto é ligado diretamente ao anticorpo. Em um aspecto, o anticorpo é um anticorpo multiespecífico e o composto opcionalmente forma uma porção do anticorpo multiespecífico. Em outro aspecto, o anticorpo multiespecífico compreende um primeiro sítio de ligação de antígeno que se liga ao BBB-R e um segundo sítio de ligação de antígeno que se liga a um antígeno cerebral. Em outro aspecto, o antígeno cerebral é selecionado a partir do grupo que consiste em: beta-secretase 1 (BACE1), Abeta, receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano (HER2), Tau, apolipoproteína E4 (ApoE4), alfa-sinucleína, CD20, huntingtina, proteína príon (PrP), quinase rica em repetição leucina 2 (LRRK2), parquina, presenilina 1, presenilina 2, gama secretase, receptor 6 de morte (DR6), proteína precursora amiloide (APP), receptor de neurotrofina p75 (p75NTR), receptor 6 de interleucina (IL6R), receptor 1 de TNF (TNFR1), beta 1 interleucina e caspase 6. Em outro aspecto, o anticorpo multiespecífico se liga tanto ao TfR como a BACE1. Em outro aspecto, o anticorpo multiespecífico se liga tanto a TfR como a Abeta. Em outro aspecto, o anticorpo multiespecífico é marcado. Em outro aspecto, o composto é reversivelmente acoplado ao anticorpo, de modo que o composto seja liberado do anticorpo junto ou após o transporte na BBB.
[00110] Será apreciado que qualquer um dos aspectos anteriormente mencionados possa ser aplicado individualmente ou em combinação com a realização anteriormente mencionada.
[00111] Em outra realização, a invenção fornece um método para produzir um anticorpo útil para transportar um composto através da BBB
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57/171 com segurança aprimorada, caracterizado pelo fato de compreender selecionar um anticorpo específico para um receptor de barreira hematoencefálica (BBBR) que tem baixa afinidade desejável para o BBB-R, e modificar uma ou mais propriedades do anticorpo, de modo que a administração do anticorpo diminua ou elimine a redução dos níveis de glóbulos vermelhos no sujeito, observada mediante administração de um anticorpo não modificado. Em um aspecto, o BBB-R é selecionado a partir do grupo que consiste em receptor de transferrina (TfR), receptor de insulina, receptor do fator de crescimento similar à insulina (receptor IGF), proteína 8 relacionada ao receptor de lipoproteína de baixa densidade (LRP8), proteína 1 relacionada ao receptor de lipoproteína de baixa densidade (LRP1), transportador 1 de glicose (Glutl) e fator de crescimento similar ao fator de crescimento epidérmico de ligação à heparina (HB-EGF). Em outro aspecto, o BBB-R é um BBB-R humano. Em um aspecto, o BBB-R é TfR. Em outro aspecto, o BBB-R é TfR, e o anticorpo não inibe a atividade de TfR. Em outro aspecto, o BBB-R é TfR, e o anticorpo não inibe a atividade de TfR à transferrina.
[00112] Em outro aspecto, os glóbulos vermelhos são glóbulos vermelhos imaturos. Em outro aspecto, os glóbulos vermelhos imaturos são reticulócitos. Em outro aspecto, a redução dos níveis de reticulócitos é acompanhada por sintomas clínicos agudos.
[00113] Em outro aspecto, uma ou mais propriedades do anticorpo foram modificadas para reduzir o impacto do anticorpo nos níveis de reticulócitos e/ou reduzir a gravidade ou presença de sintomas clínicos agudos no sujeito. Em um aspecto, a afinidade do anticorpo para o BBB-R é modificada, isto é, diminuída. Em outro aspecto, a modificação da afinidade do anticorpo é medida em relação a um anticorpo tipo selvagem do mesmo isotipo não tendo afinidade modificada (isto é, diminuída) para o BBB-R. Em outro aspecto, a função efetora da região Fc do anticorpo é modificada. Em um
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58/171 aspecto, a função efetora foi reduzida ou eliminada em relação à função efetora de um anticorpo tipo selvagem do mesmo isotipo. Em outro aspecto, a função efetora é reduzida ou eliminada por redução de glicosilação do anticorpo. Em outro aspecto, a glicosilação do anticorpo é reduzida por produção do anticorpo em um ambiente que não permite a glicosilação tipo selvagem. Em um aspecto, o anticorpo é produzido em um sistema de produção em células de não mamíferos. Em outro aspecto, o anticorpo é produzido sinteticamente. Em outro aspecto, a glicosilação do anticorpo é reduzida por remoção de grupos carboidrato já presentes no anticorpo. Em outro aspecto, a glicosilação do anticorpo é reduzida por modificação do anticorpo de modo que a glicosilação tipo selvagem não ocorra. Em outro aspecto, a região Fc do anticorpo compreende uma mutação na posição 297, de modo que o resíduo de asparagina tipo selvagem nessa posição seja substituído por outro aminoácido que interfere na glicosilação nessa posição. Em outro aspecto, a função efetora é reduzida ou eliminada por modificação do isotipo do anticorpo para um isotipo que naturalmente tem função efetora reduzida ou eliminada.
[00114] Em outro aspecto, a região Fc é modificada para reduzir ou eliminar a função efetora. Em outro aspecto a função efetora é reduzida ou eliminada por pelo menos uma modificação da região Fc. Em um aspecto, a modificação é uma mutação de ponto da região Fc para prejudicar a ligação a um ou mais receptores Fc selecionados a partir das seguintes posições: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 265, 268, 269, 270, 272, 278, 289, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 301,303, 322, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 414, 416, 419, 434, 435, 437, 438 e 439. Em outro aspecto, a modificação é eliminação de algumas ou de todas as regiões Fc. Em outro aspecto, a função efetora é reduzida ou eliminada por deleção de toda ou de uma porção da região Fc, ou por elaboração genética do anticorpo, de modo que este não inclua uma região Fc competente para função efetora. Em um
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59/171 aspecto, o anticorpo é selecionado a partir de um Fab ou de um anticorpo de cadeia única.
[00115] Em um aspecto, a região Fc e/ou região não Fc do anticorpo é modificada para reduzir ou eliminar a ativação da via de complemento pelo anticorpo. Em um aspecto, a modificação é uma mutação de ponto da região Fc para prejudicar a ligação a C1q, selecionada a partir das seguintes posições: 270, 322, 329 e 321. Em outro aspecto, a modificação é eliminação de algumas ou de todas as regiões Fc. Em outro aspecto, a função de ativação de complemento é reduzida ou eliminada por deleção de toda ou de uma porção da região Fc, ou por elaboração genética do anticorpo, de modo que este não inclua uma região Fc que se engaje na via de complemento. Em um aspecto, o anticorpo é selecionado a partir de um Fab ou de um anticorpo de cadeia única. Em outro aspecto, a região não Fc do anticorpo é modificada para reduzir ou eliminar ativação da via de complemento pelo anticorpo. Em um aspecto, a modificação é uma mutação de ponto da região CH1 para prejudicar ligação a C3. Em um aspecto, a mutação de ponto está na posição 132 (consulte, por exemplo, Vidarte et aí, (2001) J. BioL Chem. 276(41): 3821738223).
[00116] Em outro aspecto, a quantidade de dose e/ou frequência de administração do anticorpo é modulada para reduzir a concentração do anticorpo à qual os glóbulos vermelhos são expostos. Em outro aspecto, o anticorpo é modificado para compreender ligação ao BBB-R sensível ao pH.
[00117] Em outro aspecto, o anticorpo é acoplado a um composto terapêutico. Em outro aspecto, o composto é uma droga de disfunção neurológica. Em outro aspecto, o composto é um agente de formação de imagens. Em outro aspecto, o composto é marcado. Em outro aspecto, o anticorpo é marcado. Em outro aspecto, o anticorpo não prejudica a
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60/171 ligação do BBB-R a um ou mais de seus ligantes nativos. Em outro aspecto, o anticorpo se liga especificamente ao TfR, de modo que não iniba a ligação do TfR à transferrina. Em outro aspecto, a BBB está em um mamífero. Em outro aspecto, o mamífero é um humano. Em outro aspecto, o mamífero tem uma disfunção neurológica. Em outro aspecto, a disfunção neurológica é selecionada a partir do grupo que consiste em doença de Alzheimer (AD), acidente vascular cerebral, demência, distrofia muscular (MD), esclerose múltipla (MS), esclerose lateral amiotrófica (ALS), fibrose cística, síndrome de Angelman, síndrome de Liddle, doença de Parkinson, doença de Pick, doença de Paget, câncer e lesão cerebral traumática. Em outro aspecto, a BBB está em um humano.
[00118] Em outro aspecto, o anticorpo tem um IC50 para o BBB-R de cerca de 1 nM a cerca de 100 μΜ. Em outro aspecto, o IC50 é de cerca de 5 nM a cerca de 100 μΜ. Em outro aspecto, o IC50 é de cerca de 50 nM a cerca de 100 μΜ. Em outro aspecto, o IC50 é de cerca de 100 nM a cerca de 100 μΜ. Em outro aspecto, o anticorpo tem uma afinidade para o BBB-R de cerca de 5 nM a cerca de 50 μΜ. Em outro aspecto, o anticorpo tem uma afinidade para o BBB-R de cerca de 30 nM a cerca de 30 μΜ. Em outro aspecto, o anticorpo, quando acoplado a um composto, tem uma afinidade para o BBB-R de cerca de 30 nM a cerca de 1 μΜ. Em outro aspecto, o anticorpo, quando acoplado a um composto, tem uma afinidade para o BBB-R de cerca de 50 nM a cerca de 1 μΜ. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao complexo se liga especificamente ao TfR e tem uma afinidade para TfR entre as afinidades observadas para o anticorpo anti-TfRA/BACE1 e o anticorpo antiTíRe/BACE1. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao complexo se liga especificamente ao TfR e tem uma afinidade para TfR entre as afinidades observadas para o anticorpo anti-TfRD/BACE1 e o anticorpo anti-TfRE/BACE1. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao complexo se liga especificamente
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61/171 ao TfR e tem um IC50 para TfR entre os IC50s observados para o anticorpo anti-TfRA/BACE1 e o anticorpo anti-TfRE/BACE1. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao complexo se liga especificamente ao TfR e tem um IC50 para TfR entre os IC50s observados para o anticorpo anti-TfRD/BACE1 e o anticorpo anti-TfRE/BACE1. Em um aspecto, a afinidade do anti-BBB-R ou anti-BBBR/composto para o BBB-R é medida com o uso de análise de Scatchard. Em outro aspecto, a afinidade do anti-BBB-R ou anti-BBB-R/composto para o BBBR é medida com o uso de análise BIACORE. Em outro aspecto, a afinidade do anti-BBB-R ou anti-BBB-R/composto para o BBB-R é medida com o uso de ELISA de competição.
[00119] Em outro aspecto, a meia-vida de dissociação do anticorpo do BBB-R ao qual especificamente ele se liga é de cerca de 30 segundos a cerca de 30 minutos. Em outro aspecto, a meia vida de dissociação é de cerca de 30 segundos a cerca de 20 minutos. Em outro aspecto, a meia vida de dissociação é de cerca de 30 segundos a cerca de 10 minutos. Em outro aspecto, a meia vida de dissociação é de cerca de 30 segundos a cerca de 5 minutos. Em outro aspecto, a meia vida de dissociação é de cerca de 30 segundos a cerca de 3 minutos. Em outro aspecto, a meia vida de dissociação é de cerca de 30 segundos a cerca de 2 minutos. Em outro aspecto, a meia vida de dissociação é de cerca de 2 minutos. Em outro aspecto, a meia vida de dissociação é de 1 minuto ou menos. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao composto se liga especificamente ao TfR e tem uma meia-vida de dissociação para TfR entre as meias-vidas de dissociação observadas para o anticorpo anti-TfRA7BACE1 e o anticorpo anti-TfRE/BACE1 de suas respectivas ligações a TfR. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao composto se liga especificamente ao TfR e tem uma meia-vida de dissociação para TfR entre as meias-vidas de dissociação observadas para o anticorpo anti-TfRD/BACE1 e o anticorpo anti-TfRE/BACE1 de suas respectivas ligações a TfR. Em outro
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62/171 aspecto, a meia-vida de dissociação do anti-BBB-R ou anti-BBB-R/composto para o BBB-R é medida com o uso de análise BIACORE. Em outro aspecto, a meia-vida de dissociação do anti-BBB-R ou anti-BBB-R/composto para o BBBR é medida com o uso de um ensaio de ligação de competição, como um ELISA de competição.
[00120] Em outro aspecto, o anticorpo é selecionado a partir de um painel de anticorpos com base na afinidade do anticorpo selecionado. Em outro aspecto, o anticorpo é elaborado geneticamente para ter a afinidade desejada. Em um aspecto, o anticorpo é gerado com o uso de qualquer metodologia de elaboração genética de proteína conhecida na técnica incluindo, mas não se limitando a, exibição por fago, exibição por levedura, mutagênese aleatória e mutagênese sítio-dirigida.
[00121] Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao composto é administrado em uma dose terapêutica. Em um aspecto, a dose terapêutica é uma dose que satura o BBB-R ao qual o anticorpo se liga especificamente. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao composto é administrado em uma dose e uma frequência de dose que minimiza a interação de glóbulos vermelhos com o anticorpo acoplado ao composto embora que ainda facilite a distribuição do composto através da BBB no CNS em níveis terapêuticos.
[00122] Em outro aspecto, o composto é covalentemente acoplado ao anticorpo. Em um aspecto, o composto é unido ao anticorpo por um ligante. Em um aspecto, o ligante é clivável. Em outro aspecto, o ligante não é clivável. Em outro aspecto, o composto é ligado diretamente ao anticorpo. Em um aspecto, o anticorpo é um anticorpo multiespecífico e o composto opcionalmente forma uma porção do anticorpo multiespecífico. Em outro aspecto, o anticorpo multiespecífico compreende um primeiro sítio de ligação de antígeno que se liga ao BBB-R e um segundo sítio de ligação de
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63/171 antígeno que se liga a um antígeno cerebral, beta-secretase 1 (BACE1), Abeta, receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano (HER2), tau, apolipoproteína E4 (ApoE4), alfasinucleína, CD20, huntingtina, proteína príon (PrP), quinase rica em repetição leucína 2 (LRRK2), parquina, presenilina 1, presenilina 2, gama secretase, receptor 6 de morte (DR6), proteína precursora amiloide (APP), receptor de neurotrofina p75 (p75NTR) caspase 6. Em outro aspecto, o anticorpo multiespecífico se liga tanto ao TfR como a BACE1. Em outro aspecto, o anticorpo multiespecífico se liga tanto a TfR como a Abeta. Em outro aspecto, o anticorpo multiespecífico é marcado. Em outro aspecto, o composto é reversivelmente acoplado ao anticorpo, de modo que o composto seja liberado do anticorpo junto ou após o transporte na BBB.
[00123] Será apreciado que qualquer um dos aspectos anteriormente mencionados possa ser aplicado individualmente ou em combinação com a realização anteriormente mencionada.
[00124] Em outra realização, a invenção fornece um anticorpo que se liga a um receptor da barreira hematoencefálica (BBB-R), em que a afinidade do anticorpo ao BBB-R é de cerca de 5 nM a cerca de 50 μΜ, e em que uma ou mais propriedades do anticorpo foram modificados para reduzir pelo menos um efeito colateral indesejado nos glóbulos vermelhos. Em um aspecto, o BBB-R é selecionado a partir do grupo que consiste em receptor de transferrina (TfR), receptor de insulina, receptor do fator de crescimento similar à insulina (receptor IGF), proteína 8 relacionada ao receptor de lipoproteína de baixa densidade (LRP8), proteína 1 relacionada ao receptor de lipoproteína de baixa densidade (LRP1), transportador 1 de glicose (Glutl) e fator de crescimento similar ao fator de crescimento epidérmico de ligação à heparina (HB-EGF). Em outro aspecto, o BBB-R é um BBB-R humano. Em um aspecto, o BBB-R é TfR. Em outro aspecto, o BBB-R é TfR, e o anticorpo não inibe a
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64/171 atividade de TfR. Em outro aspecto, o BBB-R é TfR e o anticorpo não inibe a ligação de TfR à transferrina.
[00125] Em outro aspecto, os glóbulos vermelhos são glóbulos vermelhos imaturos. Em outro aspecto, os glóbulos vermelhos imaturos são reticulócitos. Em outro aspecto, a redução dos níveis de reticulócitos é acompanhada por sintomas clínicos agudos.
[00126] Em outro aspecto, uma ou mais propriedades do anticorpo foram modificadas para reduzir o impacto do anticorpo nos níveis de reticulócitos e/ou reduzir a gravidade ou presença de sintomas clínicos agudos no sujeito. Em um aspecto, a afinidade do anticorpo para o BBB-R é modificada, isto é, diminuída. Em outro aspecto, a modificação da afinidade do anticorpo é medida em relação a um anticorpo tipo selvagem do mesmo isotipo não tendo afinidade modificada (isto é, diminuída) para o BBB-R. Em outro aspecto, a função efetora da região Fc do anticorpo é modificada. Em um aspecto, a função efetora foi reduzida ou eliminada em relação à função efetora de um anticorpo tipo selvagem do mesmo isotipo. Em outro aspecto, a função efetora é reduzida ou eliminada por redução de glicosilação do anticorpo. Em outro aspecto, a glicosilação do anticorpo é reduzida por produção do anticorpo em um ambiente que não permite a glicosilação tipo selvagem. Em um aspecto, o anticorpo é produzido em um sistema de produção em células de não mamíferos. Em outro aspecto, o anticorpo é produzido sinteticamente. Em outro aspecto, a glicosilação do anticorpo é reduzida por remoção de grupos carboidrato já presentes no anticorpo. Em outro aspecto, a glicosilação do anticorpo é reduzida por modificação do anticorpo de modo que a glicosilação tipo selvagem não ocorra. Em outro aspecto, a região Fc do anticorpo compreende uma mutação na posição 297, de modo que o resíduo de asparagina tipo selvagem nessa posição seja substituído por outro aminoácido que interfere na glicosilação nessa posição. Em outro aspecto, a função efetora
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65/171 é reduzida ou eliminada por modificação do isotipo do anticorpo para um isotipo que naturalmente tem função efetora reduzida ou eliminada.
[00127] Em outro aspecto, a região Fc é modificada para reduzir ou eliminar a função efetora. Em outro aspecto a função efetora é reduzida ou eliminada por pelo menos uma modificação da região Fc. Em um aspecto, a modificação é uma mutação de ponto da região Fc para prejudicar a ligação a um ou mais receptores Fc selecionados a partir das seguintes posições: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 265, 268, 269, 270, 272, 278, 289, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 301,303, 322, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 414, 416, 419, 434, 435, 437, 438 e 439. Em outro aspecto, a modificação é eliminação de algumas ou de todas as regiões Fc. Em outro aspecto, a função efetora é reduzida ou eliminada por deleção de toda ou de uma porção da região Fc, ou por elaboração genética do anticorpo, de modo que este não inclua uma região Fc competente para função efetora. Em um aspecto, o anticorpo é selecionado a partir de um Fab ou de um anticorpo de cadeia única.
[00128] Em um aspecto, a região Fc e/ou região não Fc do anticorpo é modificada para reduzir ou eliminar a ativação da via de complemento pelo anticorpo. Em um aspecto, a modificação é uma mutação de ponto da região Fc para prejudicar a ligação a C1q, selecionada a partir das seguintes posições: 270, 322, 329 e 321. Em outro aspecto, a modificação é eliminação de algumas ou de todas as regiões Fc. Em outro aspecto, a função de ativação de complemento é reduzida ou eliminada por deleção de toda ou de uma porção da região Fc, ou por elaboração genética do anticorpo, de modo que este não inclua uma região Fc que se engaje na via de complemento. Em um aspecto, o anticorpo é selecionado a partir de um Fab ou de um anticorpo de cadeia única. Em outro aspecto, a região não Fc do anticorpo é modificada para reduzir ou eliminar ativação da via de complemento pelo anticorpo. Em um
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66/171 aspecto, a modificação é uma mutação de ponto da região CH1 para prejudicar ligação a C3. Em um aspecto, a mutação de ponto está na posição 132 (consulte, por exemplo, Vidarte et al., (2001) J. Biol. Chem. 276(41): 3821738223).
[00129] Em outro aspecto, o anticorpo é acoplado a um composto terapêutico. Em outro aspecto, o composto é uma droga de disfunção neurológica. Em outro aspecto, o composto é um agente de formação de imagens. Em outro aspecto, o composto é marcado. Em outro aspecto, o anticorpo é marcado. Em outro aspecto, o anticorpo não prejudica a ligação do BBB-R a um ou mais de seus ligantes nativos. Em outro aspecto, o anticorpo se liga especificamente ao TfR, de modo que não iniba a ligação do TfR à transferrina. Em outro aspecto, a BBB está em um mamífero. Em outro aspecto, o mamífero é um humano. Em outro aspecto, o mamífero tem uma disfunção neurológica. Em outro aspecto, a disfunção neurológica é selecionada a partir do grupo que consiste em doença de Alzheimer (AD), acidente vascular cerebral, demência, distrofia muscular (MD), esclerose múltipla (MS), esclerose lateral amiotrófica (ALS), fibrose cística, síndrome de Angelman, síndrome de Liddle, doença de Parkinson, doença de Pick, doença de Paget, câncer e lesão cerebral traumática. Em outro aspecto, a BBB está em um humano.
[00130] Em outro aspecto, o anticorpo tem um IC50 para o BBB-R de cerca de 30 nM a cerca de 30 μΜ. Em outro aspecto, o anticorpo, quando acoplado a um composto, tem uma afinidade para o BBB-R de cerca de 30 nM a cerca de 1 μΜ. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao complexo se liga especificamente ao TfR e tem uma afinidade para TfR entre as afinidades observadas para o anticorpo anti-TfRA/BACE1 e o anticorpo antiTfRE/BACE1. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao complexo se liga especificamente ao TfR e tem uma afinidade para TfR entre as afinidades
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67/171 observadas para o anticorpo anti-TfRD/BACE1 e o anticorpo anti-TfRE/BACE1. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao complexo se liga especificamente ao TfR e tem um IC50 para TfR entre os IC50s observados para o anticorpo anti-TfRA/BACE1 e o anticorpo anti-TfRE/BACE1. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao complexo se liga especificamente ao TfR e tem um IC50 para TfR entre os IC50s observados para o anticorpo anti-TfRD/BACE1 e o anticorpo anti-TfRE/BACE1. Em um aspecto, a afinidade do anti-BBB-R ou anti-BBBR/composto para o BBB-R é medida com o uso de análise de Scatchard. Em outro aspecto, a afinidade do anti-BBB-R ou anti-BBB-R/composto para o BBBR é medida com o uso de análise BIACORE. Em outro aspecto, a afinidade do anti-BBB-R ou anti-BBB-R/composto para o BBB-R é medida com o uso de ELISA de competição.
[00131] Em outro aspecto, a meia-vida de dissociação do anticorpo do BBB-R ao qual especificamente ele se liga é de cerca de 30 segundos a cerca de 30 minutos. Em outro aspecto, a meia vida de dissociação é de cerca de 30 segundos a cerca de 20 minutos. Em outra aspecto, a meia vida de dissociação é de cerca de 30 segundos a cerca de 10 minutos. Em outro aspecto, a meia vida de dissociação é de cerca de 30 segundos a cerca de 5 minutos. Em outro aspecto, a meia vida de dissociação é de cerca de 30 segundos a cerca de 3 minutos. Em outro aspecto, a meia vida de dissociação é de cerca de 30 segundos a cerca de 2 minutos. Em outro aspecto, a meia vida de dissociação é de cerca de 2 minutos. Em outro aspecto, a meia vida de dissociação é de 1 minuto ou menos. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao composto se liga especificamente ao TfR e tem uma meia-vida de dissociação para TfR entre as meias-vidas de dissociação observadas para o anticorpo anti-TfRA7BACE1 e o anticorpo anti-TfRE/BACE1 de suas respectivas ligações a TfR. Em outro aspecto, o anticorpo acoplado ao composto se liga especificamente ao TfR e tem uma meia-vida de dissociação para TfR entre as
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68/171 meias-vidas de dissociação observadas para o anticorpo anti-TfRD/BACE1 e o anticorpo anti-TfRE/BACE1 de suas respectivas ligações a TfR. Em outro aspecto, a meia-vida de dissociação do anti-BBB-R ou anti-BBB-R/composto para o BBB-R é medida com o uso de análise BIACORE. Em outro aspecto, a meia-vida de dissociação do anti-BBB-R ou anti-BBB-R/composto para o BBBR é medida com o uso de um ensaio de ligação de competição, como um ELISA de competição.
[00132] Em outro aspecto, o anticorpo é selecionado a partir de um painel de anticorpos com base na afinidade do anticorpo selecionado. Em outro aspecto, o anticorpo é elaborado geneticamente para ter a afinidade desejada. Em um aspecto, o anticorpo é gerado com o uso de qualquer metodologia de elaboração genética de proteína conhecida na técnica incluindo, mas não se limitando a, exibição por fago, exibição por levedura, mutagênese aleatória e mutagênese sítio-dirigida.
[00133] Em outro aspecto, um composto é covalentemente acoplado ao anticorpo. Em um aspecto, o composto é unido ao anticorpo por um ligante. Em um aspecto, o ligante é clivável. Em outro aspecto, o ligante não é clivável. Em outro aspecto, o composto é ligado diretamente ao anticorpo. Em um aspecto, o anticorpo é um anticorpo multiespecífico e o composto opcionalmente forma uma porção do anticorpo multiespecífico. Em outro aspecto, o anticorpo multiespecífico compreende um primeiro sítio de ligação de antígeno que se liga ao BBB-R e um segundo sítio de ligação de antígeno que se liga a um antígeno cerebral. Em outra aspecto, o antígeno cerebral é selecionado a partir do grupo que consiste em: beta-secretase 1 (BACE1), Abeta, receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano (HER2), Tau, apolipoproteína E4 (ApoE4), alfa-sinucleína, CD20, huntingtina, proteína príon (PrP), quinase rica em repetição leucina 2 (LRRK2), parquina, presenilina 1, presenilina 2, gama
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69/171 secretase, receptor 6 de morte (DR6), proteína precursora amiloide (APP), receptor de neurotrofina p75 (p75NTR), receptor 6 de interleucina (IL6R), receptor 1 de TNF (TNFR1), beta 1 interleucina e caspase 6. Em outro aspecto, o anticorpo multiespecífico se liga tanto ao TfR como a BACE1. Em outro aspecto, o anticorpo multiespecífico se liga tanto a TfR como a Abeta. Em outro aspecto, o anticorpo multiespecífico é marcado. Em outro aspecto, o composto é reversivelmente acoplado ao anticorpo, de modo que o composto seja liberado do anticorpo junto ou após o transporte na BBB.
[00134] Será apreciado que qualquer um dos aspectos anteriormente mencionados possam ser aplicados individualmente ou em combinação com a realização anteriormente mencionada.
[00135] Em outra realização, a invenção fornece o uso de um anticorpo que se liga com baixa afinidade a um BBB-R e que não reduz os níveis de glóbulos vermelhos, para a fabricação de um medicamento para o tratamento de uma disfunção neurológica. Qualquer um dos anticorpos antiBBB-R de baixa afinidade descritos anteriormente ou qualquer um dos anticorpos anti-BBB-R de baixa afinidade descritos em outro lugar pode ser usado no método.
[00136] Em outra realização, a invenção fornece um anticorpo que se liga com baixa afinidade a um BBB-R e que não reduz os níveis de glóbulos vermelhos, para uso em tratamento uma disfunção neurológica. Qualquer um dos anticorpos anti-BBB-R de baixa afinidade descritos anteriormente ou qualquer um dos anticorpos anti-BBB-R de baixa afinidade descritos em outro lugar pode ser usado no método.
[00137] Em outra realização, a invenção fornece um método para transportar um composto terapêutico, como uma droga de disfunção neurológica, através da barreira hematoencefálica que compreende expor o anticorpo anti-BBB-R acoplado a uma droga de disfunção neurológica de modo
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70/171 que o anticorpo transporte a droga de disfunção neurológica acoplada ao mesmo através da barreira hematoencefálica, sendo que o anticorpo não reduz os níveis de glóbulos vermelhos.
[00138] A invenção adicionalmente fornece um método para tratar uma disfunção neurológica em um mamífero que compreende tratar o mamífero com um anticorpo multiespecífico que se liga tanto a um receptor da barreira hematoencefálica (BBB-R) como a um antígeno cerebral, em que o anticorpo anti-BBB-R foi selecionado para ter uma baixa afinidade ao BBB-R e, através disso, aprimora a absorção no cérebro do anticorpo anti-antígeno cerebral, e sendo que a administração do anticorpo não diminui os níveis de glóbulos vermelhos.
[00139] A invenção adicionalmente fornece um método para tratar uma doença ou disfunção associada ou causada por níveis elevados de glóbulos vermelhos em um sujeito, caracterizado pelo fato de compreender administrar um anticorpo anti-TfR que compreende pelo menos função efetora parcial para o sujeito. Em um aspecto, a etapa de administração é em uma dose e/ou frequência de dose calibrada para minimizar sintomas clínicos agudos da administração do anticorpo.
[00140] Entende-se que qualquer um dos métodos anteriormente mencionados e composições da invenção podem ser combinados um com o outro e/ou com os aspectos adicionais da invenção descrita no relatório descritivo no presente pedido.
Breve Descrição das Figuras [00141] As Figuras 1A a 1E representam os resultados de experimentos avaliando as afinidades de receptor anti-transferrina (TfR”) e variantes de anti-TfR/beta-secretase (“BACE1”) para TfR, bem como concentrações do anticorpo e Αβ1-40 após administração em camundongos, conforme descrito no Exemplo 1. Os resultados do ensaio ELISA competitivo
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71/171 na Figura 1A mostra que os variantes de anti-DTR/BACE1 e anti-TfR têm afinidades distintas para DTR. As Figuras 1B e 1D mostram, respectivamente, as concentrações médias de anticorpo no soro e cérebro em camundongos tipo selvagem após uma única injeção intravenosa de 50 mg/kg de IgG de controle, anti-BACE1, ou um variante de anti-TfR/BACE1 (n = 6 por grupo). As Figuras 10 e 1E mostram, respectivamente, as concentrações no plasma e cérebro e Αβι-40 nesses mesmos camundongos tratados, como um marcador da atividade do anticorpo injetado.
[00142] A Figura 2A é uma representação esquemática da maturação de glóbulos vermelhos (RBC) na medula óssea, mostrando progressão a partir de pró-eritroblasto (Pro-EB), para eritroblasto basofílico (Baso-EB), eritroblasto policromático (Poli-EB), eritroblasto ortocromático (OrtoEB) e finalmente para reticulócitos. Os reticulócitos são liberados da medula óssea para a circulação onde amadurecem para RBCs. Durante os estágios de maturação na medula óssea, precursores eritroides sintetizam a proteína hemoglobina contendo ferro, o que necessita de um aumento concomitante na expressão de TfR. Receptores de transferrina são dispersos com a cessação da síntese de hemoglobina e a proliferação celular conforme as células amadurecem no estágio de reticulócito, de modo que RBCs maduros não expressem TfR. O número relativo de TfR presente em cada estágio celular de maturação de RBC é indicado no gráfico na parte superior da figura, com base nos dados de lacpetta et at, Biochim. Blophys. Acta 687: 204-210 (1982). As Figuras 2B e 2C representam os resultados de experimentos avaliando o impacto da administração de anti-TfR e anti-TfR/BACE1 nos reticulócitos em camundongos, conforme descrito no Exemplo 2A. A Figura 2B representa os resultados de experimentos que testam o impacto de anti-TfRD, antiTfRD/BACE1 ou IgG de controle, administrado por via intravenosa na porcentagem dos reticulócitos imaturos da fração de sangue total de
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72/171 camundongos tipo selvagem em 1 hora pós-dose (n = 6 por grupo). A Figura 2C representa os resultados de experimentos que testam o impacto de antiTíRa/BACE1, antiTfRD/BACE1 ou IgG de controle, administrado por via intravenosa na contagem dos reticulócitos totais no sangue total de camundongos tipo selvagem em 24 hora ou 7 dias pós-dose (n = 6 por grupo). Todos os dados são mostrados como média ±SEM. As Figuras 2D e 2E representam concentrações de Abeta-Mo em camundongos tipo selvagem após uma única injeção intravenosa de 50 mg/kg de IgG de controle ou 5 mg/kg, 25 mg/kg ou 50 mg/kg de injeções de anti-TfRD/BACE1 (Figura 2D) ou antiTíRa/BACE1 (Figura 2E) (n = 6 por grupo). As Figuras 2F a 2H representam os resultados de experimentos avaliando a farmacocinética de anti-TfRA/BACE1 e anti-TfRD/BACE1 em comparação com o controle em níveis de doses de 5 mg/kg, 25 mg/kg ou 50 mg/kg. A Figura 2F fornece medições da concentração de anticorpos no cérebro nos pontos no tempo indicados. A Figura 2G fornece medições da concentração de anticorpos o plasma nos pontos no tempo indicados. A Figura 2H fornece medições de níveis Abeta no plasma nos pontos no tempo indicados.
[00143] As Figuras 3A a 3E representam os resultados de experimentos avaliando o impacto de eliminação da função efetora (Figuras 3A a 3C) ou da eliminação da função de complemento (Figuras 3D e 3E) na depleção de reticulócitos por vários anticorpos anti-TfR, conforme descrito no Exemplo 2B. As contagens totais de reticulócitos no sangue total são mostradas a partir de camundongos selvagens (Figuras 3A e 3C), camundongos Εογ“Λ (B6.129P2-Fcer1gtm1 Rav N12) (Figure 3B), ou camundongos C3“ (Figura 3D), 24 horas após a injeção intravenosa de anticorpo na dose indicada, em comparação ao o grupo de controle IgG (n = 6 por grupo). A Figura 3E representa os resultados de experimentos avaliando o efeito da deficiência do sistema de complemento na depleção observada
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73/171 anteriormente de reticulócitos por antí-TfR. Camundongos selvagens ou C3 knockout foram administrados por via intravenosa com 50 mg/kg de um IgG de controle ou anti-TfRD/mistura de IgG de controle (n = 6 por grupo).
[00144] As Figuras 4A e 4B representam os resultados de experimentos in vitro avaliando a indução de citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) (Figura 4A) ou citotoxidade dependente de complemento (CDC) (Figura 4B) por anti-TfRA, anti-TfRA/BACE1 ou IgG de controle em blastos eritroleucêmicos de camundongos a uma faixa de concentração de anticorpo, conforme descrito no Exemplo 2B.
[00145] As Figuras 5A a 5C mostram os resultados de experimentos avaliando se a eliminação da ligação a Fc ou ligação a BACE1 impacta a depleção de reticulócitos por anticorpos anti-TfR monoespecíficos ou biespecíficos, conforme descrito no Exemplo 2C. As contagens totais de reticulócitos são mostradas para camundongos tipo selvagem (n = 6 por grupo) 24 horas após injeção intravenosa do F(ab’)2 indicado ou IgG de controle (Figuras 5A e 5B) ou anticorpo biespecífico (Figura 5C).
[00146] As Figuras 6A a 6C representam os resultados de experimentos avaliando o impacto da redução de afinidade para TfR na depleção de reticulócitos e expressão de TfR no cérebro, conforme descrito no Exemplo 3. As Figuras 6A e 6B representam as contagens totais de reticulócitos em camundongos tipo selvagem 24 horas após injeção intravenosa do anticorpo variante anti-TfR/BACE1 indicado, em comparação ao IgG de controle. A Figura 6C mostra a quantificação do nível de expressão de TfR no cérebro por Western blot dos lisados totais de cérebro de camundongo, 4 dias após uma injeção intravenosa de IgG de controle, anti-TfRÃ/BACE1 ou anti“TfRD/BACE1 na dose indicada (n = 3 por grupo). A quantificação da expressão de TfR foi normalizada para actina e os dados são mostrados como média ± SEM.
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74/171 [00147] As Figuras 7A a 7C representam os resultados de experimentos avaliando se o tratamento com anticorpo TfR afetou a permeabilidade da barreira hematoencefálica, conforme descrito no Exemplo 4. Camundongos tipo selvagem foram administrados por via intravenosa a 50 mg/kg de IgG de controle ou 25 mg/kg de cada uma das combinações de anticorpo coinjetadas. A média de absorção de anticorpo no cérebro 24 horas após injeção intravenosa foi medida com o uso de um ELISA-Fc humano genérico (Figura 7-A) ou um ELISA de ectodomínio de BACE1 (Figura 7B). A Figura 7C mostra uma quantificação de concentrações de Αβι.40 no cérebro de camundongo após injeção intravenosa de IgG de controle ou coinjeção de anticorpos (n = 6 por grupo).
[00148] As Figuras 8A a 8F mostram os resultados de experimentos avaliando o impacto de doses múltiplas de anti-TfRD/BACE1 nos níveis de reticulócitos em camundongos tratados, conforme descrito no Exemplo 5. Camundongos tipo selvagem foram dosados por via intravenosa uma vez por semana com 25 mg/kg de IgG de controle ou anti-TfRD/BACE1. As Figuras 8A e 8B, respectivamente, representam concentrações de anticorpo observados no plasma e cérebro em 24 horas, 4 dias e 7 dias após duas ou quatro doses de anticorpo. Deve-se notar que a escala do eixo Y na Figura 8A é em μΜ, enquanto a escala do eixo Y na Figura 8B é em nM. As concentrações médias de Αβ-ι.^correspondentes no plasma (Figura 8C) e no cérebro (Figura 8D) também foram medidas. A Figura 8E mostra a contagem de reticulócito total em camundongos 24 horas após a segunda e quarta dose, e 7 dias após a quarta dose de IgG de controle ou anti-TfRD/BACE1. A Figura 8F mostra um gráfico representando os resultados de uma quantificação do nível de expressão de TfR no cérebro por Western blot de lisados totais de cérebro de camundongo após 4 doses semanais de IgG de controle ou antiTfRD/BACE1. A quantificação da expressão de TfR foi normalizada para actina
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75/171 e os dados são mostrados como média ± SEM.
[00149] As Figuras 9A a 9B e 10A a 10D representam os resultados de experimentos avaliando o impacto de um anticorpo antiTÍR/BACE1 menos efetor nas subpopulações de eritrócitos no sangue e medula óssea em camundongos. Populações distintas de linhagens de eritrócitos positivos para Ter119, tanto no sangue (Figure 9A) como nos ossos (Figura 9B), são diferenciadas por sua expressão de TfR e tamanho celular (conforme determinado por perfil de dispersão frontal) com o uso de citometria de fluxo (Paniga et a/., PLoS One 6, 9 (2011)). Subconjuntos de células positivas para Ter119 na medula óssea foram definidos como EryA^ grande, eritroblastos basofílicos iniciais positivos para TfR, EryB^ pequeno, eritroblastos policromáticos positivos para TfR, EryC- eritrócitos maduros negativos para TfR. As Figuras 9C e 9D mostram uma evolução temporal da população de eritrócito positivo para Ter119 (reticulócitos e glóbulos vermelhos; 9C) e reticulócitos positivos para TfR (9D) no sangue após dosagem com antiTfRD/BACE1, em comparação ao IgG de controle (n = 6/grupo). As Figuras 10A a 10D fornecem gráficos da quantificação de subpopulações distintas de eritrócitos (EryA, EryB, EryC) na medula óssea após anti-TfRD/BACE1 ou dosagem de IgG de controle (n = 6/grupo).
[00150] As Figuras 11A a 11B e 12A a 12D representam os resultados de experimentos analisando o impacto de uma função efetora de um anticorpo anti-TfR/BACE1 nas populações de eritrócitos no sangue e medula óssea em camundongos. As Figuras 11A a 11B mostram a quantificação de populações de eritrócitos positivos para Ter119 (Figura 11 A) e populações de reticulócitos positivos para TfR (Figura 11B) no sangue após antiTfRA/BACE1 (Fc-) e anti-TfRD/BACE1 (Fc-) menos efetor, e anti-TfRD/BACE1 (Fc+) com função efetora completa, ou dosagem de IgG de controle (n = 6/grupo). As Figuras 12A a 12D fornecem a quantificação de subpopulações de eritrócitos
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76/171 distintas (linhagem de eritrócito positiva para Ter119 na Figura 12A; EryA na Figura 12B; EryB na Figura 12C; e EryC na Figura 12D) na medula óssea após dosagem de anti-TfRA/BACE1 (Fc-) menos efetor e anti-TfRD./BACE1 (Fc-), antiTfRD/BACE1 (Fc+) com função efetora completa, ou dosagem de IgG de controle (n = 6/grupo).
[00151] As Figuras 13A a B e Figuras 14A a B representam os resultados de experimentos avaliando o impacto do estado da função efetora na atividade de ADCC de anticorpos anti-humano TfR (anti-hTFR”) em uma linhagem celular de eritroblasto humano ou células mononucleares primárias da medula óssea, conforme descrito no Exemplo 7.
[00152] As Figuras 15A-B representam as sequências de aminoácidos da cadeia leve e pesada do clone YW412.8 anti-BACE1, obtido a partir de uma espécie virgem da biblioteca de exibição por fago de diversidade natural e formas de afinidade madura de YW412.8. A Figura 15A representa os alinhamentos de sequências da variável leve (VL) (SEQ ID NOs. 1-6). A Figura 13B representa os alinhamentos de sequências da variável pesada (VH) (SEQ ID NOs. 7-8). Em ambas as figuras, as sequências de HVR para cada clone são indicadas pelas regiões em caixas, com a primeira caixa indicando HVR-L1 (Figura 15A) ou HVR-H1 (Figura 15B), a segunda caixa indicando HVR-L2 (Figura 15A) ou HVR-H2 (Figura 15B), e a terceira caixa indicando HVR-L3 (Figura 15A) ou HVR-H3 (Figura 15B).
[00153] As Figuras 16A-B representam as sequências de aminoácidos das cadeias leve e pesada do clone Fab 12 do anticorpo antiBACE1, obtidas a partir de uma espécie virgem de uma biblioteca de exibição por fago de diversidade sintética e formas de afinidade madura de Fab 12. A Figura 16A representa os alinhamentos de sequências da cadeia leve (SEQ ID NOs. 9-12). A Figura 16B representa os alinhamentos de sequências da cadeia pesada (SEQ ID NO. 13). Em ambas as figuras, as sequências de HVR para
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77/171 cada clone são indicadas pelas regiões em caixas, com a primeira caixa indicando HVR-L1 (Figura 16A) ou HVR-H1 (Figura 16B), a segunda caixa indicando HVR-L2 (Figura 16A) ou HVR-H2 (Figura 16B), e a terceira caixa indicando HVR-L3 (Figura 16A) ou HVR-H3 (Figura 16B).
[00142] As Figuras 17A-B representam a cadeia pesada (Figura 17A; SEQ ID NO. 14 e cadeia leve (Figura 17B; SEQ ID NO. 15) de um anticorpo anti-Abeta exemplar.
Descrição Detalhada das Realizações da Hnvenção
L Definições [00143] A ‘‘barreira hematoencefálica” ou ‘‘BBB” refere-se à barreira fisiológica entre a circulação periférica e o cérebro e medula espinhal (isto é, o CNS) que é formado por junções apertadas dentro das membranas plasmáticas endoteliais capilares do cérebro, criando uma forte barreira que restringe o transporte de moléculas no cérebro, mesmo moléculas muito pequenas como ureia (60 Daltons). A barreira hematoencefálica dentro do cérebro, a barreira sangue-medula espinhal dentro da medula espinal e a barreira hemato-retiniana dentro da retina são barreiras capilares contíguas dentro do CNS e no presente pedido são coletivamente citadas como uma barreira hematoencefálica ou BBB. A BBB também engloba a barreira hematoliquórica (plexo coroide) onde a barreira é compreendida de células ependimais ao invés de células endoteliais capilares.
[00144] O “sistema nervoso central” ou “CNS” refere-se ao complexo de tecidos nervosos que controlam funções corporais, e inclui o cérebro e a medula espinhal.
[00145] Um “receptor da barreira hematoencefálica” (abreviado como “BBB-R” no presente pedido) é uma proteína do receptor transmembrana expressa em células endoteliais do cérebro que é capaz de transportar moléculas através da barreira hematoencefálica. Exemplos de BBB
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R incluem, mas não se limitam a: receptor de transferrina (TFR), receptor de insulina, receptor do fator de crescimento similar à insulina (IGF-R), receptores de lipoproteínas de baixa densidade incluindo sem limitação proteína 1 relacionada ao receptor de lipoproteína de baixa densidade (LRP1) e proteína 8 relacionada ao receptor de lipoproteína de baixa densidade (LRP8), transportador de glicose 1 (Glutl) e fator de crescimento similar ao fator de crescimento epidérmico de ligação à heparina (HB-EGF). Um BBB-R exemplar no presente pedido é receptor de transferrina (TfR).
[00146] O “receptor de transferrina” é uma glicoproteína transmembrana (com um peso molecular de aproximadamente 180.000) composta de duas subunidades ligadas a bissulfeto (cada uma com peso molecular aparente de cerca de 90.000) envolvidas na absorção de ferro nos vertebrados. Em uma realização, o TfR no presente pedido é TfR humano que compreende a sequência de aminoácidos conforme apresentada em Schneider et al. Nature 311: 675 - 678 (1984), por exemplo.
[00147] Uma disfunção neurológica, “como usado no presente pedido”, refere-se a uma doença ou disfunção que afeta o CNS e/ou que tem uma etiologia no CNS. Doenças ou disfunções do CNS exemplares incluem, mas não se limitam a, neuropatia, amiloidose, câncer, doença ou disfunção ocular, infecção viral ou microbiana, inflamação, isquemia, doença neurodegenerativa, convulsão, disfunções de comportamento, doença de depósito lisossômico. Para os propósitos do presente pedido, o CNS será entendido como incluindo olho, que normalmente é separado do resto do corpo pela barreira hemato-retiniana. Exemplos específicos de disfunções neurológicas incluem, mas não se limitam a, doenças neurodegenerativas (incluindo, mas não se limitando a, doença do corpo de Lewy, síndrome póspoliomielite, síndrome de Shy-Draeger, atrofia olivopontocerebelar, doença de Parkinson, atrofia de múltiplos sistemas, degeneração estriatonigral, tauopatias
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79/171 incluindo, mas não se limitando a, doença de Alzheimer e paralisia supranuclear), doenças priônicas (incluindo, mas não se limitando a, encefalopatia espongiforme bovina, scrapie, síndrome de Creutzfeldt-Jakob, kuru, doença de Gerstmann-Straussler-Scheinker, doença da debilidade crônica e insônia familiar fatal), paralisia bulbar, doença do neurônio motor e disfunções heterodegenerativas do sistema nervoso (incluindo, mas não se limitado a, doença de Canavan, doença de Huntington, lipofuscinoses ceroides neuronals, doença de Alexander, síndrome de Tourette, síndrome de cabelos crespos de Menkes, síndrome de Cockayne, síndrome Halervorden-Spatz, doença de Lafora, síndrome de Rett, degeneração hepatolenticular, síndrome de Lesch-Nyhan e síndrome de Unverricht-Lundborg), demência (incluindo, mas não se limitado a, doença de Pick e ataxia espinocerebelar), câncer (por exemplo, do CNS, incluindo metástases cerebrais resultantes de câncer em algum lugar no corpo).
[00148] Uma “droga de disfunção neurológica” é uma droga ou agente terapêutico que trata uma ou mais disfunção(ões) neurológica(s). Drogas para disfunção neurológica da invenção incluem, mas não se limitam a, anticorpos, peptídeos, proteínas, ligantes naturais de um ou mais CNS alvo(s), versões modificadas de ligantes naturais de um ou mais CNS alvo(s), aptâmeros, ácidos nucleicos inibidores (isto é, RNAs inibidores pequenos (siRNA) e RNAs de grampo curto (shRNA)), ribozimas, e moléculas pequenas ou fragmentos ativos de qualquer um dos anteriormente mencionados. Drogas para disfunção neurológica exemplares da invenção são descritas no presente pedido e incluem, mas não se limitam a: anticorpos, aptâmeros, proteínas, peptídeos, ácidos nucleicos inibitórios e moléculas pequenas e fragmentos ativos de qualquer um dos anteriormente mencionados que são tanto eles próprios como especificamente reconhecem e/ou atuam sob (isto é, inibem, ativam ou detectam) um antígeno do CNS ou molécula alvo como, mas não
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80/171 limitado a, proteína precursora amiloide ou porções das mesmas, beta amiloide, beta-secretase, gama-secretase, tau, alfa-sinucleína parquina, huntingtina, DR6, presenilina, ApoE, glioma ou outros marcadores de câncer do CNS e neurotrofinas. Exemplos não limitantes de drogas de disfunções neurológicas e das disfunções que elas podem ser usadas para tratar são fornecidos na Tabela 1 a seguir:
Tabelai
Exemplos Não Lsmítantes de Drogas de Dssfunções Neurológicas e suas
Dísfunções Correspondentes que Podem ser Usadas para Tratar
Droga Disfunção neurológica
Anticorpo Anti-BACE1 Lesão cerebral aguda e crônica de Alzheimer, acidente vascular cerebral
Anticorpo Anti-Abeta Doença de Alzheimer
Anticorpo Anti-Tau Doença de Alzheimer, taupatias
Neurotrofina Acidente vascular cerebral, lesão cerebral aguda, lesão de medula espinhal
Fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), fator de crescimento de fibroblastos 2 (FGF-2) Lesão cerebral crônica (Neurogênese)
Receptor do fator de crescimento antiepidérmico (EGFR)-anticorpo Câncer de cérebro
Fator neural derivado da linhagem de célula glial (GDNF) Doença de Parkinson
Fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) Esclerose lateral amiotrófica, depressão
Enzima lisossomal Disfunções de armazenamento lisossomal do cérebro
Fator neurotrófico ciliar (CNTF) Esclerose lateral amiotrófica
Neuregulina-1 Esquizofrenia
Anticorpo anti-HER2 (por exemplo, Metástase cerebral a partir de câncer
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Droga Disfunção neurológica
trastuzumabe, pertuzumabe, etc.) HER2-positivo
Anticorpo anti-VEGF (por exemplo, bevacizumabe) Glioblastoma recém diagnosticado ou recorrente, glioma maligno recorrente, metástase cerebral
[00149] Um “agente de formação de imagens” é um composto que tem uma ou mais propriedades que permitem sua presença e/ou localização a ser detectada diretamente ou indiretamente. Exemplos desses agentes de formação de imagens incluem proteínas e compostos de moléculas pequenas que incorpora um componente marcado que permite detecção.
[00150] Um “antígeno CNS” ou “antígeno cerebral” é um antígeno expresso no CNS, incluindo o cérebro, que pode ser direcionado com um anticorpo ou uma pequena molécula. Exemplos desses antígenos incluem, sem limitação: beta-secretase 1 (BACE1), amiloide beta (Abeta), receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano (HER2), tau, apolipoproteína E4 (ApoE4), alfa-sinucleína, CD20, huntingtina, proteína príon (PrP), quinase rica em repetição leucina 2 (LRRK2), parquina, presenilina 1, presenilina 2, gama secretase, receptor 6 de morte (DR6), proteína precursora amiloide (APP), receptor de neurotrofina p75 (p75NTR), receptor 6 de interleucina (IL6R), receptor 1 de TNF (TNFR1), beta 1 interleucina e caspase 6. Em uma realização, o antígeno é BACE1.
[00151] O termo “BACE1”, como usado no presente pedido, refere-se a qualquer beta-secretase 1 nativa (também chamada de enzima 1 de divagem de proteína precursora de amiloide do sítio β, protease 2 aspártica associada à membrana, memapsina 2, aspartil protease 2 ou Asp2) de qualquer fonte de vertebrados, incluindo mamíferos, como primatas (por exemplo, humanos) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), a menos que indicado de outra forma. O termo engloba BACE1 inteira” não processada,
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82/171 bem como qualquer forma de BACE1 que resulta do processamento na célula. O termo também engloba variantes de BACE1 que ocorrem naturalmente, por exemplo, variantes de splicing ou variantes alélicas. A sequência de aminoácidos de um polipeptídeo BACE1 exemplar é a sequência para BACE1 humano, isoforma A conforme relatado em Vassar et al., Science 286:735-741 (1999), que é integralmente incorporada ao presente pedido como referência. Existem várias outras isoformas de BACE1 humano incluindo isoformas B, C e D.Consulte UniProtKB/Swiss-Prot Entrada P56817, que é integralmente incorporada ao presente pedido como referência.
[00152] Os termos ‘‘anticorpo anti-beta-secretase”, ‘‘anticorpo anti-BACE1”, “um anticorpo que se liga a beta-secretase” e “um anticorpo que se liga a BACE1” referem-se a um anticorpo que é capaz de se ligar a BACE1 com afinidade suficiente de modo que o anticorpo seja útil como um agente de diagnóstico e/ou terapêutico no direcionamento de BACE1. Em uma realização, o grau de ligação de um anticorpo anti-BACE1 a uma proteína não-BACE1 não relacionada é menor que cerca de 10% da ligação do anticorpo a BACE1 conforme medido, por exemplo, por um radioimunoensaio (RIA). Em certas realizações, um anticorpo que se liga a BACE1 tem uma constante de dissociação (Kd) < 1μΜ, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM ou < 0,001 nM (por exemplo, 1O‘8 M ou menos, por exemplo, de 10'3 M a 10'13 M, por exemplo, de 1O'& M a 1O'i3 M). Em certas realizações, um anticorpo antiBACE1 se liga a um epítopo de BACE1 que é conservado entre BACE1 de diferentes espécies e isoformas. Em uma realização, é fornecido um anticorpo que se liga ao epítopo em BACE1 ligado pelo anticorpo anti-BACE1 YW412.8.31. Em outras realizações, é fornecido um anticorpo que se liga a um exosítio dentro de BACE1 localizado no domínio catalítico de BACE1. Em uma realização, é fornecido um anticorpo que compete com os peptídeos identificados em Kornacker et al., Biochem. 44:11567-11573 (2005), que é
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83/171 integralmente incorporado ao presente pedido como referência (isto é, peptídeos 1,2,3,1 a 11, 1 a 10, 1 a 9, 1 a 8, 1 a 7, 1 a 6, 2 a 12, 3 a 12, 4 a 12, 5 a 12, 6 a 12, 7 a 12, 8 a 12, 9 a 12, 10 a 12, 4, 5, 6, 5 a 10, 5 a 9, misturados, Y5A, P6A, Y7A, F8A, I9A, P10A e L11 A) para ligação a BACE1. As sequências de anticorpos BACE1 exemplares são representadas na Figura 15A-B e Figura 16A-B. Um anticorpo exemplar no presente pedido compreende os domínios variáveis do anticorpo YW412.8.31 (por exemplo, como nas Figuras 15A-B).
[00149] Uma proteína de “sequência nativa” no presente pedido refere-se a uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos de uma proteína encontrada na natureza, incluindo variantes da proteína que ocorrem naturalmente. O termo como usado no presente pedido inclui a proteína conforme isolada a partir de uma fonte natural ou conforme produzida recombinantemente.
[00150] O termo “anticorpo” no presente pedido é usado no mais amplo senso e especificamente abrange anticorpos monoclonais, anticorpos poiiclonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) formados por pelo menos dois anticorpos intactos e fragmentos de anticorpos, contanto que eles exibam a atividade biológica desejada.
[00151] Fragmentos de anticorpos” no presente pedido compreendem uma porção de um anticorpo intacto que mantém a capacidade de se ligar ao antígeno. Exemplos de fragmentos de anticorpos são bem conhecidos na técnica (consulte, por exemplo, Nelson, MAbs (2010) 2(1): 7783) e incluem, mas não se limitam a Fab, Fab’, F(ab')2, e fragmentos Fv; diacorpos; anticorpos lineares, moléculas de anticorpos de cadeia única que incluindo, mas não se limitando a fragmentos variáveis de cadeia única (scFv), fusões de luz e/ou domínios de ligação de antígeno da cadeia pesada com ou sem um ligante (e opcionalmente em tandem); e moléculas de ligação de
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84/171 antígenos monoespecíficos ou multíespecíficos formadas a partir de fragmentos de anticorpos (incluindo, mas não se limitando a anticorpos multiespecíficos construídos a partir de domínios variáveis múltiplos que faltam em regiões Fc).
[00152] O termo ‘‘anticorpo monoclonal” como usado no presente pedido refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos e/ou se ligam ao mesmo epítopo, exceto por possíveis variantes que podem aparecer durante a produção do anticorpo monoclonal, essas variantes geralmente estando presentes em menores quantidades. Em contrapartida a preparações de anticorpos policlonais que tipicamente incluem diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um único determinante no antígeno. Além disso, para suas especificidades, os anticorpos monoclonais são vantajosos, pois eles não estão contaminados por outras imunoglobulinas. O modificador “monoclonal” indica o caráter do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogênea e não é para ser interpretado como uma exigência de produção do anticorpo por qualquer método específico. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados de acordo com a presente invenção podem ser produzidos pelo método de hibridoma, primeiro descrito por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), ou podem ser produzidos pelos métodos de DNA recombinante (consulte, por exemplo, patente US 4.816.567). Os “anticorpos monoclonais” também podem ser isolados a partir de bibliotecas de anticorpos em fago que utilizam as técnicas descritas em Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) e Marks et al., J. Mol. Blol., 222:581-597 (1991), por exemplo. Exemplos específicos de anticorpos monoclonais no presente pedido incluem anticorpos quiméricos, anticorpos
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85/171 humanizados e anticorpos humanos, incluindo fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos.
[00153] Os anticorpos monoclonais no presente pedido especificamente incluem anticorpos “quiméricos” (imunoglobulinas) nos quais uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga às sequências correspondentes nos anticorpos derivados de uma espécie específica ou pertencente a uma classe ou subclasse de anticorpo específico, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é(são) idêntica(s) ou homóloga(s) às sequências correspondentes em anticorpos derivados de outra espécie ou pertencentes à outra classe ou subclasse de anticorpo, bem como fragmentos desses anticorpos, contanto que eles exibam a atividade biológica desejada (patente US 4.816.567; Morrison et at., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81:6851-6855 (1984)). Anticorpos quiméricos de interesse no presente pedido incluem anticorpos “primatizados” que compreendem sequências de ligação de antígeno de domínio variável derivadas a partir de um primata não humano (por exemplo, Macaco do Velho Mundo, como babuíno, macaco rhesus ou cynomolgus) e sequências de região constante humana (patente US 5.693.780).
[00154] Formas “humanizadas” de anticorpos não humanos (por exemplo, murino) são anticorpos quiméricos que contêm sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Em sua maioria, anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor), nos quais resíduos de uma região hipervariável do receptor são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo doador), como camundongo, rato, coelho ou primata não humano que tem a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, resíduos da região de estrutura (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, anticorpos humanizados
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86/171 podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Essas modificações são ainda feitas para refinar o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado irá compreender substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que todos ou substancialmente todas as regiões hipervariáveis correspondem às de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as FRs são as de uma sequência de imunoglobulina humana, exceto para substituição(ões) FR como apontado acima. O anticorpo humanizado opcionalmente irá também compreender pelo menos uma porção de uma região constante da imunoglobulina, tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Para detalhes adicionais, consulte Jones etal., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et ai, Nature 332:323-329 (1988); e Presta, Cure Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).
[00155] Um “anticorpo humano”, conforme descrito no presente pedido, é aquele que compreende uma estrutura de sequência de aminoácidos que corresponde a uma estrutura de sequência de aminoácidos de um anticorpo obtido a partir de uma célula B humana, e inclui fragmentos de ligação de antígeno de anticorpos humanos. Esses anticorpos podem ser identificados ou fabricados por uma variedade de técnicas, incluindo, mas não se limitando a: produção por animais transgênicos (por exemplo, camundongos) que são capazes, mediante imunização, de produzir anticorpos humanos na ausência da produção de imunoglobulina endógena (consulte, por exemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); e patentes US 591.669, 5.589.369 e 5,545,807)); seleção a partir de bibliotecas de fago que expressam anticorpos humanos ou fragmentos de anticorpo humano (consulte, por exemplo, McCafferty et ai, Nature 348:552-553 (1990); Johnson et ai, Current Opinion in Structural
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Biology 3:564-571 (1993); Clackson et al., Nature, 352.624-628 (1991): Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991); Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993); patentes US. 5.565.332 e 5,573,905); geração através de células B ativadas in vitro (consulte patentes US 5.567.610 e 5,229,275); e isolamento a partir de hibridomas que produzem anticorpo humano.
[00156] Um ‘‘anticorpo multiespecífico” no presente pedido é um anticorpo que tem especificidades de ligação por pelo menos dois epítopos diferentes. Anticorpos multiespecíficos exemplares podem se ligar tanto a um BBB-R como a um antígeno cerebral. Anticorpos multiespecíficos podem ser preparados como anticorpos inteiros ou fragmentos de anticorpos (por exemplo, anticorpos biespecíficos F(ab’)2). Anticorpos elaborados geneticamente com dois, três ou mais (por exemplo, quatro) sítios de ligação de antígeno funcionais também são contemplados (consulte, por exemplo, pedido de patente US 2002/0004587 A1, Miller et al.). Anticorpos multiespecíficos podem ser preparados como anticorpos inteiros ou como fragmentos de anticorpos.
[00157] Os anticorpos no presente pedido incluem “sequências de aminoácidos variantes” com ligação de antígeno ou atividade biológica alterada. Exemplos dessas alterações de aminoácidos incluem anticorpos com afinidade aumentada para antígeno (por exemplo, anticorpos de ‘‘afinidade madura”), e anticorpos com região Fc alterada, se presente, por exemplo, com citotoxicidade celular dependente de anticorpo alterada e/ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC) (consulte, por exemplo, documento WO 00/42072. Presta, L. e documento WO 99/51642, Iduosogie et al.); e/ou meia-vida no soro aumentada ou diminuída (consulte, por exemplo, documento WO 00/42072, Presta, L).
[00158] Uma ‘‘variante de afinidade modificada” tem uma ou mais regiões hipervariáveis substituídas ou resíduos de estrutura de um
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88/171 anticorpo parental (por exemplo, de um anticorpo quimérico, humanizado ou humano parental) que altera (aumenta ou diminuí) afinidade. Uma maneira conveniente para gerar essas variantes substitucionais usa exibição por fago. Resumidamente, vários sítios de região hipervariável (por exemplo, sítios 6 a 7) são mutados para gerar todas as possíveis substituições de aminoácidos em cada sítio. Os anticorpos variantes dessa forma gerados são exibidos em um modo monovalente a partir de partículas de fago filamentoso, como fusões para o gene III produto de M13 empacotado no interior de cada partícula. As variantes de fago exibidas são então selecionadas para suas atividades biológicas (por exemplo, afinidade de ligação). Com o objetivo de identificar sítios de região hipervariável candidatos para modificações, pode ser realizada mutagênese de varredura de alanina para identificar resíduos de região hipervariável que contribuam significativamente para ligação do antígeno. De maneira alternativa ou adicionalmente, pode ser benéfico analisar uma estrutura cristalina do complexo antígeno-anticorpo para identificar pontos de contato entre o anticorpo e seu alvo. Esses resíduos de contato e resíduos vizinhos são candidatos para substituição de acordo com as técnicas elaboradas no presente pedido. Uma vez que essas variantes são geradas, o painel de variantes é submetido a seleção e anticorpos com afinidade alterada podem ser selecionados para posterior desenvolvimento.
[00159] Um “anticorpo variante sensível ao pH” é um anticorpo variante que tem uma afinidade de ligação diferente para um antígeno alvo em um primeiro pH do que tem para o antígeno alvo em um pH diferente. Como exemplo não limitante, um anticorpo anti-TfR da invenção pode ser selecionado ou elaborado geneticamente para ter ligação sensível ao pH para TfR, de modo que se ligue desejavelmente com baixa afinidade (conforme descrito no presente pedido) à superfície celular de TfR no plasma em pH 7,4, mas mediante internalização em um compartimento endossomal,
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89/171 rapidamente se dissocia do TfR em pH relativamente menor (pH 5,5 a 6,0); essa dissociação pode proteger o anticorpo de depuração mediada pelo antígeno, e aumentar a quantidade de anticorpo que é tanto distribuída para o CNS como reciclada através da BBB - em ambos os casos, a concentração efetiva do anticorpo é aumentada em relação a um anticorpo anti-TfR que não compreende essa sensibilidade de pH (consulte, por exemplo, ChaparroRiggers et at. J. Biol. Chem. 287(14): 11090-11097; Igawa et al., Nature Biotechnol. 28(11): 1203-1208). A combinação de afinidades desejada em um pH no soro e o pH do compartimento endossomal pode ser facilmente determinada por um BBB-R específico e composto conjugado por um técnico no assunto.
[00160] O anticorpo no presente pedido pode ser conjugado com uma “molécula heteróloga”, por exemplo para aumentar a meia-vida ou estabilidade, ou de outra modo, melhorar o anticorpo. Por exemplo, o anticorpo pode ser ligado a uma variedade de polímeros não proteináceos, por exemplo, polietileno glicol (PEG), polipropileno glicol, polioxialquilenos, ou copolímeros de polietileno glicol e polipropileno glicol. Fragmentos de anticorpo, como Fab’, ligados a uma ou mais moléculas de PEG são uma realização exemplar da invenção. Em outro exemplo, a molécula heteróloga é um composto terapêutico ou um agente de visualização (isto é, um marcador detectável), e o anticorpo está sendo usado para transporte dessa molécula heteróloga através da BBB. Exemplos de moléculas heterólogas incluem, mas não se limitam a, um composto químico, um peptídeo, um polímero, um lipídeo, um ácido nucleico e uma proteína.
[00161] O anticorpo no presente pedido pode ser um “variante de glicosilação”, de modo que qualquer carboidrato fixado à região Fc, se presente, é alterado, tanto modificado na presença/ausência, como modificado no tipo. Por exemplo, anticorpos com uma estrutura de carboidrato
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90/171 madura que são desprovidos de fucose ligados a uma região Fc do anticorpo são descritos no pedido de patente US 2003/0157108 (Presta, L). Consulte também patente US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Anticorpos com uma N-acetilglicosamina dividida (GlcNAc) no carboidrato ligado a uma região Fc do anticorpo estão referidos no documento WO 2003/011878, JeanMairet et al., e patente US 6.602.684, Umana et al. Anticorpos com pelo menos um resíduo de galactose no oligossacarídeo ligado a uma região Fc do anticorpo são relatados no documento WO 1997/30087, Patel et al. Consulte, também, documento WO 1998/58964 (Raju, S.) e documento WO 1999/22764 (Raju, S.) com referência a anticorpos com carboidrato alterado ligado à região Fc do mesmo. Consulte, também, patente US 2005/0123546 (Umana et al.) que descreve anticorpos com glicosilação modificada. Mutação da sequência de glicosilação consenso na região Fc (Asn-X-Ser/Thr nas posições 297 a 299, onde X não pode ser prolina), por exemplo, por mutação de Asn dessa sequência para qualquer outro aminoácido, por colocação de uma Pro na posição 298, ou por modificação da posição 299 para qualquer aminoácido, exceto Ser ou Thr, deveria anular a glicosilação nessa posição (consulte, por exemplo, Fares Al-Ejeh et al., Clin. Cancer Res. (2007) 13:5519s-5527s; Imperial! e Shannon, Biochemistry (1991) 30(18): 4374-4380; Katsuri, Biochem J. (1997) 323(Pt 2): 415-419; Shakin-Eshleman et al., J. Biol. Chem. (1996) 271: 6363-6366).
[00154] O termo “região hipervariável”, quando usado no presente pedido, refere-se aos resíduos de aminoácidos de um anticorpo que são responsáveis pela ligação de antígeno. A região hipervariável compreende resíduos de aminoácidos de uma “região determinante de complementaridade” ou “CDR” (por exemplo, resíduos 24 a 34 (L1), 50 a 56 (L2) e 89 a 97 (L3) no domínio variável da cadeia leve, e 31 a 35 (H1), 50 a 65 (H2) e 95 a 102 (H3) no domínio variável da cadeia pesada (Kabat et al.. Sequences of Proteins of
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Immunological interest, 5- Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) e/ou esses resíduos de uma “alça hipervariável” (por exemplo, resíduos 26 a 32 (L1), 50 a 52 (L2) e 91 a 96 (L3) no domínio variável da cadeia leve, e 26 a 32 (H1), 52A a 55 (H2) e 96 a 101 (H3) no domínio variável da cadeia pesada (Chothia e Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Resíduos de “estrutura” ou “FR” são aqueles resíduos do domínio variável, exceto os resíduos da região hipervariável, conforme definido no presente pedido.
[001] Um “anticorpo de comprimento total” é aquele que compreende uma região variável de ligação de antígeno assim como um domínio constante de cadeia leve (CL) e domínios constantes de cadeia pesada, CH1, CH2 e CH3. Os domínios constantes podem ser domínios constantes de sequência nativa (por exemplo domínios constantes de sequência nativa humana) ou variantes de sequência de aminoácido destes.
[00155] Um “anticorpo nu” é um anticorpo (conforme definido no presente pedido) que não é conjugado a uma molécula heteróloga, como um componente citotóxico, polímero ou radiomarcador.
[00156] Funções efetoras” de anticorpo referem-se a essas atividades biológicas de um anticorpo que resultam na ativação do sistema imune, exceto ativação da via de complemento. Essas atividades são amplamente encontradas na região Fc (uma região Fc de sequência nativa ou uma região Fc de sequência de aminoácido variante) de um anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpos incluem, por exemplo, ligação ao receptor Fc e citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC). Em uma realização, o anticorpo no presente pedido é essencialmente desprovido de função efetora. Em outra realização, o anticorpo no presente pedido mantém função efetora mínima. Métodos para modificar ou eliminar função efetora são bem conhecidos na técnica e incluem, mas não se limitam
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92/171 a, eliminar toda ou uma parte da região Fc responsável pela função efetora (isto é, com o uso de um anticorpo ou fragmento de anticorpo em um formato desprovido de toda ou de uma porção da região Fc, como, mas não se limitando a, um Fab fragmento, um anticorpo de cadeia única, e similares, conforme descrito no presente pedido e conhecido na técnica; modificar a região Fc em uma ou mais posições de aminoácidos para eliminar a função efetora (impacto de ligação a Fc: posições 238, 239, 248, 249, 252, 254, 265, 268, 269, 270, 272, 278, 289, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 301,303, 322, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 414, 416, 419, 434, 435, 437, 438 e 439; e modificar a glicosilação do anticorpo (incluindo, mas não se limitando a, produzir o anticorpo em um ambiente que não permita a glicosilação tipo selvagem de mamífero, remover um ou mais grupos carboidratos de um anticorpo já glicosilado, e modificar o anticorpo em uma ou mais posições de aminoácidos para eliminar a capacidade do anticorpo ser glicosilado nessas posições (incluindo, mas não se limitando a N297G e N297A).
[00157] Funções de “ativação de complemento” do anticorpo, ou propriedades de um anticorpo que permitem ou acionam “ativação da via de complemento” são usadas de modo intercambiável, e referem-se a atividades biológicas de um anticorpo que se engaja ou estimula a via de complemento do sistema imune em um sujeito. Essas atividades incluem, por exemplo, ligação de Clq e citotoxicidade dependente de complemento (CDC), e pode ser mediada tanto pela porção Fc como pela porção não Fc do anticorpo. Métodos para modificar ou eliminar a função de ativação de complemento são bem conhecidos na técnica e incluem, mas não se limitam a, eliminar toda ou uma porção da região Fc responsável por ativação de complemento (isto é, com o uso de um anticorpo ou fragmento de anticorpo em um formato desprovido de toda ou uma porção da região Fc,
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93/171 como, mas não se limitando a, um fragmento Fab, um anticorpo de cadeia única, e similares conforme descrito no presente pedido e como é conhecido na técnica, ou modificando a região Fc em uma ou mais posições de aminoácidos para eliminar ou atenuar interações com componentes do complemento ou a capacidade para ativar componentes do complemento, como as posições 270, 322, 329 e 321 conhecidas por estarem envolvidas na ligação C1q), e modificando ou eliminando uma porção da região não Fc responsável por ativação de complemento (isto é, modificando a região CH1 na posição 132 (consulte, por exemplo, Vidarte et al., (2001) J. Biol. Chem. 276(41): 3821738223)).
[00158] Dependendo da sequência de aminoácido do domínio constante de suas cadeias pesadas, anticorpos de comprimento total podem ser designados para diferentes “classes”. Existem cinco classes principais de anticorpos de comprimento total: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias dessas podem ainda serem divididas em “subclasses” (isotipos), por exemplo, lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgA e lgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de anticorpos são chamados de alfa, delta, epsilon, gama e mi, respectivamente. As estruturas de subunidades e configurações tridimensionais de diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas.
[00159] O termo “anticorpo recombinante”, como definido no presente pedido, refere-se a um anticorpo (por exemplo, quimérico, humanizado, anticorpo humano ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo) que é expresso por uma célula hospedeira recombinante que compreende ácido nucleico que codifica o anticorpo. Exemplos de “células hospedeiras” para produzir anticorpos recombinantes incluem: (1) células de mamíferos, por exemplo, células de Ovário de Hamster Chinês (CHO), COS, células de mieloma (incluindo células Y0 e NS0), rim de filhotes de hamster
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94/171 (BHK), células Hela e Vero; (2) células de inseto, por exemplo, sf9, sf21 e Tn5; (3) células vegetais, por exemplo, plantas que pertencem ao gênero Nicotians (por exemplo, Nicotiana tabacurrí); (4) células de levedura, por exemplo, as que pertencem ao gênero Saccharomyces (por exemplo, Saccharomyces cerevisiaé) ou o gênero Aspergillus (por exemplo, Aspergillus nigery, (5) células bacterianas, por exemplo, células de Escherichia coll ou células de Bacillus subtilis, etc.
[00159] Como usado no presente pedido, “que se liga especificamente” ou “se liga especificamente a” refere-se a um anticorpo que se liga seletivamente ou preferencialmente a um antígeno. A afinidade de ligação é geralmente determinada com o uso de um ensaio padrão, como análise de Scatchard ou técnica de ressonância plasmônica de superfície (por exemplo, utilizando BIACORE®).
[001] Um “anticorpo que se liga ao mesmo epítopo”, como um anticorpo de referência, refere-se a um anticorpo que bloqueia a ligação do anticorpo de referência ao seu antígeno em um teste competitivo em 50% ou mais, e inversamente, o anticorpo de referência bloqueia a ligação do anticorpo ao seu antígeno em um ensaio de competição em 50% ou mais. Em uma realização, um anticorpo anti-BACE1 se liga ao epítopo BACE1 ligado por YW412.8.31.
[002] O termo “agente citotóxico”, como usado no presente pedido, refere-se a uma substância que inibe ou previne a função celular e/ou causa morte ou destruição das células. Agentes citotóxicos incluem, mas não se limitam a, isótopos radioativos (por exemplo, At211, l13i, I125, Y90, Re186, Re188, Smio3, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioativos de Lu); agentes quimioterapêuticos ou drogas, por exemplo, metotrexato, adriamicina, alcalóides da vinca (vincristina, vinblastina, etoposídeo), doxorrubicina, melfalano, mitomicina C, clorambucila, daunorrubicina ou outros agentes
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95/171 intercalantes); agentes inibidores do crescimento; enzimas e fragmentos dos mesmos como enzimas nucleolíticas; antibióticos; toxinas como toxinas de molécula pequena ou toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, incluindo fragmentos e/ou variantes dos mesmos; e os vários agentes antitumor ou anticâncer divulgados abaixo.
[003] Uma “quantidade efetiva” de um agente, por exemplo, uma formulação farmacêutica, refere-se a uma quantidade efetiva nas dosagens e por períodos de tempo necessários para alcançar o resultado terapêutico ou profilático desejado.
[004] O termo “região Fc” no presente pedido é usado para definir uma região C-terminal de uma cadeia pesada da imunoglobulina que contém pelo menos uma porção da região constante. O termo inclui regiões Fc de sequência nativa e regiões Fc variantes. Em uma realização, uma região Fc da cadeia pesada de imunoglobulina humana se estende a partir de Cys226 ou de Pro230 até a terminação carboxila da cadeia pesada. No entanto, a lisina Cterminal (Lys447) da região Fc pode ou não estar presente. A menos que especificado de outra forma no presente pedido, a numeração de resíduos de aminoácidos na região Fc ou região constante é de acordo com o sistema de numeração EU, também chamada de índice EU, conforme descrito em Kabat et aí, Sequences of Proteins of Immunological interest, 5- Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
[005] “Região de estrutura” ou “FR” refere-se a resíduos de domínio variável, exceto resíduos da região hipervariável (HVR). A FR de um domínio variável geralmente consiste em quatro domínios FR: FR1, FR2, FR3 e FR4. Consequentemente, as sequências de HVR e FR geralmente aparecem na seguinte sequência em VH (ou VL): FR1-H1 (L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)~ FR4.
[006] Um “imunoconjugado” é um anticorpo conjugado a uma ou
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96/171 mais molécula(s) heteróloga(s) incluindo, mas não se limitando a um marcador ou agente citotóxico. Opcionalmente, essa conjugação é através de um ligante.
[007] Um “ligante” como usado no presente pedido é uma estrutura que se conecta covalentemente ou não covalentemente o anticorpo anti-BBB-R à molécula heteróloga. Em certas realizações, um ligante é um peptídeo. Em outras realizações, um ligante é um ligante químico.
[008] Um “marcador” é um marcador acoplado com o anticorpo no presente pedido e usado para detecção ou formação de imagens. Exemplos desses marcadores incluem: radiomarcadores, um fluoróforo, um cromóforo ou um marcador de afinidade. Em uma realização, o marcador é um radiomarcador usado para formação de imagens, por exemplo, tc99m ou 1123, ou um marcador de spin (spin labei} para formação de imagem por ressonância magnética nuclear (NMR) (também conhecida como formação de imagem por ressonância magnética, mri), como iodo-123 novamente, iodo-131, índio-111, flúor-19, carbono-13, nitrogênio-15, oxigênio-17, gadolínio, manganês, ferro, etc.
[009] Um “indivíduo” ou sujeito” é um mamífero. Mamíferos incluem, mas não se limitam a, animais domesticados (por exemplo, vacas, ovelhas, gatos, cães e cavalos), primatas (por exemplo, primatas humanos e não humanos como macacos), coelhos e roedores (por exemplo, camundongos e ratos). Em certas realizações, o indivíduo ou sujeito é um humano.
[0010] Um anticorpo “isolado” é aquele que foi separado a partir de um componente de seu ambiente natural. Em algumas realizações, um anticorpo é purificado para mais de 95% ou 99% de pureza, conforme determinado, por exemplo, por eletroforese (por exemplo, SDS-PAGE, focalização isoelétrica (IEF), eletroforese por capilaridade) ou métodos cromatográficos (por exemplo, troca iônica ou HPLC de fase reversa). Para revisão de métodos para avaliação de pureza de anticorpo consulte, por
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97/171 exemplo, Flatman etal., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007).
[0011]O termo “bula” é usado para se referir às instruções incluídas como de costume em embalagens comerciais de produtos terapêuticos, que contêm informações sobre as indicações, uso, dosagem, administração, terapia de combinação, contra indicações e/ou advertências referentes ao uso desses produtos terapêuticos.
[0012] O termo “formulação farmacêutica” refere-se a uma preparação que está em tal forma a permitir a atividade biológica de um ingrediente ativo contido na mesma ser efetiva, e que não contém componentes adicionais que são inaceitavelmente tóxicos para um sujeito ao qual a formulação seria administrada.
[0013] Um carreador farmaceuticamente aceitável” refere-se a um ingrediente em uma formulação farmacêutica, exceto um ingrediente ativo, que é não tóxico a um sujeito. Um carreador farmaceuticamente aceitável inclui, mas não se limita a, um tampão, excipiente, estabilizante ou conservante.
[0014] Como usado no presente pedido, “tratamento” (e variações gramaticais do mesmo como “tratar” ou “tratando”) refere-se à intervenção clínica em uma tentativa de alterar o curso natural do indivíduo sendo tratado, e pode ser realizado tanto para profilaxia como durante o curso da patologia clínica. Efeitos desejados de tratamento incluem, mas não se limitam a, prevenção de ocorrência ou recorrência da doença, alívio de sintomas, diminuição de quaisquer consequências patológicas diretas ou indiretas da doença, prevenção de metástase, diminuição da taxa de progressão da doença, melhora ou alívio do estado da doença e remissão ou prognósticos de melhora. Em algumas realizações, os anticorpos da invenção são usados para retardar o desenvolvimento de uma doença ou reduzir a progressão de uma doença.
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IL Composições e Métodos
A. Produção de Anticorpos Antí-BBB-R e Conjugados dos Mesmos [00160] Os métodos e artigos de fabricação da presente invenção usam, ou incorporam, um anticorpo que se liga a um BBB-R. O antígeno do BBB-R a ser usado para a produção ou triagem dos anticorpos pode ser, por exemplo, uma forma solúvel de uma porção do mesmo (por exemplo, o domínio extracelular) do BBB-R contendo o epítopo desejado. De maneira alternativa ou adicionalmente, células que expressam BBB-R em suas superfícies celulares podem ser usadas para gerar ou selecionar anticorpos. Outras formas e apresentações de BBB-R úteis para geração de anticorpos serão evidentes para os técnicos no assunto. Exemplos de BBB-Rs no presente pedido incluem receptor de transferrina (TfR), receptor de insulina, receptor do fator de crescimento similar à insulina (IGF-R), proteína 1 relacionada ao receptor de lipoproteína de baixa densidade (LRP1) e LRP8 etc, transportador 1 de glicose (Glutl) e fator de crescimento similar ao fator de crescimento epidérmico de ligação à heparina (HB-EGF).
[00161] De acordo com a presente invenção, um anticorpo anti-BBB-R de baixa afinidade” (por exemplo, anti-TfR) é selecionado com base nos dados no presente pedido que demonstram que esses anticorpos exibem absorção no CNS melhorada (por exemplo, cérebro). A fim de identificar esses anticorpos de baixa afinidade, vários ensaios para medição de afinidade de anticorpo estão disponíveis, incluindo, sem limitação: Ensaio de Scatchard e ressonância plasmônica de superfície (por exemplo, com o uso de BIACORE®). De acordo com uma realização da invenção, o anticorpo tem uma afinidade para o antígeno BBB-R (por exemplo, para TfR) de cerca de 5 nM, ou de cerca de 20 nM, ou de cerca de 100 nM, de cerca de 50 μΜ, ou de cerca de 30 μΜ, ou de cerca de 10 μΜ, ou de cerca de 1 μΜ, ou de cerca de 500 nM. Dessa forma, a afinidade pode estar na faixa de cerca de 5 nM a cerca de 50
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99/171 μΜ, ou na faixa de cerca de 20 nM a cerca de 30 μΜ, ou na faixa de cerca de 30 nM a cerca de 30 μΜ, ou na faixa de cerca de 50 nM a cerca de 1 μΜ, ou na faixa de cerca de 100 nM a cerca de 500 nM, por exemplo, conforme medido pela análise Scatchard ou BIACORE® Em outra realização da invenção, o anticorpo tem uma meia-vida de dissociação do antígeno BBB-R (por exemplo, para TfR) menor que 1 minuto, menor que 2 minutos, menor que 3 minutos, menor que quatro minutos, menor que 5 minutos, ou menor que 10 minutos a cerca de 20 minutos, ou até cerca de 30 minutos, conforme medido pela análise de ligação de competição BIACORE® [00162] Dessa forma, a invenção fornece um método para produzir um anticorpo útil para transportar uma droga para disfunção neurológica através da barreira hematoencefálica, que compreende selecionar um anticorpo de um painel de anticorpos contra um receptor da barreira hematoencefálica (BBB-R), porque ele tem uma afinidade para o BBB-R que está na faixa de cerca de 5 nM, ou de cerca de 20 nM, ou de cerca de 100 nM, a cerca de 50 μΜ, ou a cerca de 30 μΜ, ou a cerca de 10 μΜ, ou a cerca de 1 μΜ, ou a cerca de 500 mM. Dessa forma, a afinidade pode estar na faixa de cerca de 5 nM a cerca de 50 μΜ, ou na faixa de cerca de 20 nM a cerca de 30 μΜ, ou na faixa de cerca de 30 nM a cerca de 30 μΜ, ou na faixa de cerca de 50 nM a cerca de 1 μΜ, ou na faixa de cerca de 100 nM a cerca de 500 nM, por exemplo, conforme medido pela análise Scatchard ou BIACORE® Como é entendido por um técnico no assunto, a conjugação de uma molécula/composto heterólogo a um anticorpo, muitas vezes diminui a afinidade do anticorpo para seu alvo devido, por exemplo, ao impedimento estérico ou mesmo a eliminação de um braço de ligação se o anticorpo é produzido multiespecífico com um ou mais braços de ligação a um antígeno diferente do alvo original do anticorpo. Em uma realização, um anticorpo de baixa afinidade da invenção, específico para TfR conjugado a BACE1 tinha um Kd para TfR, conforme medido por
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BIACORE, de cerca de 30 nM. Em outra realização, um anticorpo de baixa afinidade da invenção, específico para TfR conjugado a BACE1 tinha um Kd para TfR, conforme medido por BIACORE, de cerca de 600 nm. Em outra realização, um anticorpo de baixa afinidade da invenção, específico para TfR conjugado a BACE1 tinha um Kd para TfR, conforme medido por BIACORE, de cerca de 20 μΜ. Em outra realização, um anticorpo de baixa afinidade da invenção, específico para TfR conjugado a BACE1 tinha um Kd para TfR, conforme medido por BIACORE, de cerca de 30 μΜ.
[00163] Um ensaio exemplar para avaliar a afinidade do anticorpo é pela análise Scatchard. Por exemplo, o anticorpo anti-BBB-R de interesse pode ser iodado com o uso do método de lactoperoxidase (Bennett e Horuk, Methods in Enzymology 288 pág.134-148 (1997)). Um anticorpo antiBBB-R radiomarcado é purificado a partir de 125l-Na por filtração em gel com o uso de uma coluna NAP-5 e sua atividade específica é medida. As misturas de reação de competição de 50 μι. contendo uma concentração fixa de anticorpo iodado e concentrações decrescente de anticorpo não marcado diluído em série são colocadas em placas de 96 poços. Células que expressam BBB-R temporariamente são cultivadas em meio de cultura consistindo em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Genentech) suplementado com FBS 10%, L-glutamina 2 mM e penicilina-estreptomicina 1 mM a 37aC em CO2 5%. As células são separadas dos pratos com o uso da Solução de Dissociação Celular Sigma e lavadas com tampão de ligação (DMEM com albumina de soro bovino 1%, HEPES 50 mM, pH 7,2 e azida de sódio 0,2%). As células lavadas são adicionadas a uma densidade aproximada de 200.000 células em 0,2 mL de tampão de ligação às placas de 96 poços contendo 50 pL de mistura de reação de competição. A concentração final do anticorpo não marcado na reação de competição com células é variada, partindo de 1000 nM e então diminuindo para diluições 1:2 vezes para 10 concentrações e incluindo um zero
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101/171 adicionado, amostra apenas tampão. Reações de competição com células para cada concentração de anticorpo não marcado são avaliadas em triplicata. Reações de competição com células são incubadas por 2 horas em temperatura ambiente. Após 2 horas de incubação, as reações de competição são transferidas para uma placa de filtro e lavadas quatro vezes com tampão de ligação para separar o anticorpo livre do anticorpo iodado ligado. Os filtros são contadas pelo contador gama e os dados de ligação são avaliados com o uso do algoritmo de ajuste de Munson e Rodbard (1980) para determinar a afinidade de ligação do anticorpo.
[00164] Uma análise de Scatchard exemplar com o uso das composições da invenção pode ser realizada como a seguir. Anti-TFRA foi iodado com o uso do método de lactoperoxidase (Bennett e Horuk, Methods in Enzymology 288 pág.134-148 (1997)). Anti-TFRA radiomarcado foi purificado a partir de 12bl-Na por filtração em gel, com o uso de uma coluna NAP-5; antiTFRa purificado tinha uma atividade específica de 19,82 pCi/pg. As misturas de reação de competição de 50 pL contendo uma concentração fixa de anticorpo iodado e concentrações decrescente de anticorpo não marcado diluído em série foram colocadas em placas de 96 poços. Células 293 que expressam TfR murino temporariamente foram cultivadas em meio de cultura consistindo em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Genentech) suplementado com FBS 10%, L-glutamina 2 mM e penicilina-estreptomicina 1 mM a 37SC em CO2 5%. As células foram separadas dos pratos com o uso da Solução de Dissociação Celular Sigma e lavadas com tampão de ligação (DMEM com albumina de soro bovino 1%, HEPES 50 mM, pH 7,2 e azida de sódio 0,2%). As células lavadas foram adicionadas a uma densidade aproximada de 200.000 células em 0,2 mL de tampão de ligação às placas de 96 poços contendo 50 pL de mistura de reação de competição. A concentração final do anticorpo iodado em cada reação de competição com células foi de 100 pM
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102/171 (134.000 cpm por 0,25 mL). A concentração final do anticorpo não marcado na reação de competição com células variou, partindo de 1000 nM e então diminuindo para diluições 1:2 vezes para 10 concentrações e incluindo um zero adicionado, amostra apenas tampão. Reações de competição com células para cada concentração de anticorpo não marcado foram avaliadas em triplicata. Reações de competição com células foram incubadas por 2 horas em temperatura ambiente. Após 2 horas de incubação, as reações de competição foram transferidas para uma placa de filtro Millipore Multiscreen e lavadas quatro vezes com tampão de ligação para separar o anticorpo livre do anticorpo iodado ligado. Os filtros foram contados em um contador Wallac Wizard 1470 gamma (PerkinElmer Life and Analytical Sciences; Waltham, MA). Os dados de ligação foram avaliados com o uso de um programa de computação New Ligand (Genentech), que usa o algoritmo de ajuste de Munson e Rodbard (1980) para determinar a afinidade de ligação do anticorpo.
[00165] Uma análise BIACORE® exemplar com o uso das composições da invenção podem ser realizadas como a seguir. Kd foi medido com o uso de ensaios de ressonância plasmônica de superfície com o uso de BIACORE®-2000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 259C, usando-se um kit Fc anti-humano (BIAcore Inc., Piscataway, NJ). Resumidamente, chips biosensores de dextrano carboximetilado (CM5, BIACORE Inc.) foram ativados com /V-etil-A/’ cloreto de (3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) e Nhidroxisuccinimida (NHS), de acordo com as instruções do fornecedor. O anticorpo anti-Fc humano foi diluído com acetato de sódio 10 mM, pH 4,0, a 5 pg/mL antes da injeção a uma taxa de fluxo de 50 μΙ/minuto para atingir aproximadamente 10000 unidades de resposta (RU) de proteína acoplada. Após a injeção de anticorpo, foi injetado etanolamina 1M para bloquear grupos não reagidos. Para medições cinéticas, anticorpos variantes anti-TfR monoespecíficos ou multiespecíficos foram injetados em HBS-P para alcançar
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103/171 cerca de 220 RU, então diluições em série em duas vezes de MuTfR-His (0,61 nM a 157 nM) foram injetadas em HBS-P a 25SC com uma taxa de fluxo de aproximadamente 30 μΙ/min. As taxas de associação (kon) e taxas de dissociação (koff) foram calculadas com o uso de um modelo de ligação Langmuir um para um simples (Programa de Computação de Avaliação BIACORE® versão 3.2) ajustando simultaneamente os sensorgramas de associação e dissociação. A constante de equilíbrio de dissociação (Kd) foi calculada como a razão koff/kon. Consulte, por exemplo, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999) [00166] De acordo com outra realização, Kd é medido com o uso de ensaios de ressonância plasmônica de superfície com um dispositivo BIACORE®-2000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25aC, usando-se um kit Fc anti-humano (BIAcore Inc., Piscataway, NJ). Resumidamente, chips biossensor dextrano carboximetilado (CM5, BIACORE Inc.) são ativados com hidrocloreto de N-etil-N1- (3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) e /V-hidroxisuccinimida (NHS), de acordo com as instruções do fornecedor. O anticorpo anti-Fc humano é diluído com acetato de sódio 10 mM, pH 4,0, a 5 pg/mL antes da injeção a uma taxa de fluxo de 50 μΙ/minuto para atingir aproximadamente 10000 unidades de resposta (RU) de proteína acoplada. Após a injeção de anticorpo, é injetado etanolamina 1M para bloquear grupos não reagidos. Para medições cinéticas, anticorpos variantes anti-BBBR-R são injetados em HBS-P para alcançar cerca de 220 RU, então diluições em série em duas vezes de BBB-R-His (0,61 nM a 157 nM) são injetadas em HBS-P a 25aC com uma taxa de fluxo de aproximadamente 30 pl/min. As taxas de associação (kon) e taxas de dissociação (koff) são calculadas com o uso de um modelo de ligação Langmuir um para um simples (Programa de Computação de Avaliação BIACORE® versão 3.2) ajustando simultaneamente os sensorgramas de associação e dissociação. A constante de equilíbrio de dissociação (Kd) é
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104/171 calculada como a razão koff/kon. Consulte, por exemplo, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999).
[00167] Uma medição substituta para a afinidade de um ou mais anticorpos para o BBB-R é metade da sua concentração inibitória máxima (IC50), uma medida de quanto do anticorpo é necessário para inibir a ligação de um ligante BBB-R conhecido ao BBB-R em 50%. Vários métodos para determinar o IC50 para um determinado composto são conhecidos na técnica; uma abordagem comum é a realização de um ensaio de ligação de competição, como o descrito no presente pedido nos exemplos, isto é, em relação à Figura 1A. Em geral, um IC50 alto indica que algo mais do anticorpo é necessário para inibir ligação do ligante conhecido, e dessa forma a afinidade do anticorpo para o ligante é relativamente baixa. De modo contrário, um IC50 baixo indica que algo a menos do anticorpo é necessário para inibir ligação do ligante conhecido, e dessa forma a afinidade do anticorpo para o ligante é relativamente alta.
[00168] Um ensaio ELISA competitivo exemplar para medir IC50 é aquele em que o aumento das concentrações de antígeno anti-TfR ou anti-TfR/cérebro (isto é, anti-TfR/BACE1, anti-TfR/Abeta e similares) de anticorpos variantes são usados para competir contra TfRA biotinilada para ligação a TfR. O ELISA de competição anti-TfR foi realizado em placas Maxisorp (Neptune, N.J.) revestidas com 2,5 pg/mL de domínio extracelular TfR murino purificado em PBS a 4SC durante a noite. As placas foram lavadas com PBS/Tween 20 0,05% e bloqueadas com o uso de tampão de bloqueio Superblock em PBS (Thermo Scientific, Hudson, NH). A titulação de cada antígeno anti-TfR ou anti-TfR/cérebro individual (isto é, TÍR/BACE1 ou antiTfR/Abeta) (diluição serial 1:3) foi combinada com anti-TfRA biotinilado (concentração final 0,5 nM) e adicionada à placa por 1 hora à temperatura ambiente. As placas foram lavadas com PBS/Tween 20 0,05% e foi adicionado
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HRP-estreptavidina (Southern Biotech, Birmingham) à placa e incubado por 1 hora à temperatura ambiente. As placas foram lavadas com PBS/Tween 20 0,05% e anti-TfRA biotinilado ligado à placa foi detectado com o uso de substrato TMB (BioFX Laboratories, Owings Mills).
[00169] Em uma realização, o anticorpo anti-BBB-R de baixa afinidade no presente pedido é acoplado a um marcador e/ou droga de disfunção neurológica ou agente de formação de imagens a fim de transportar mais eficientemente o marcador e/ou droga ou agente de formação de imagens através da BBB. Esse acoplamento pode ser alcançado por produtos químicos reticulantes ou gerando proteínas de fusão, etc.
[00170] A conjugação covalente pode ser tanto direta como através de um ligante. Em certas realizações, a conjugação direta é por construção de uma proteína fusão (isto é, por fusão genética dos dois genes que codificam o anticorpo BBB-R e a droga de disfunção neurológica e expressão como uma proteína única). Em certas realizações, a conjugação direta é por formação de uma ligação covalente entre um grupo reativo em uma das duas porções do anticorpo anti-BBB-R e um grupo correspondente ou aceitante na droga neurológica. Em certas realizações, a conjugação direta é por modificação (isto é, modificação genética) de uma das duas moléculas que será conjugada para incluir um grupo reativo (como exemplos não limitantes, um grupo sulfidril ou um grupo carboxila) que forma uma ligação covalente em outra molécula que será conjugada em condições apropriadas. Como um exemplo não limitante, uma molécula (isto é, um aminoácido) com um grupo reativo desejado (isto é, um resíduo de cisteína) pode ser introduzida, por exemplo, no anticorpo anti-BBB-R e uma ligação bissulfeto formada na droga neurológica. Métodos para conjugação covalente de ácidos nucleicos a proteínas também são conhecidos na técnica (isto é, fotoreticulação, consulte, por exemplo, Zatsepin et al. Russ. Chem. Rev. 74: 77-95 (2005)). A conjugação
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106/171 não covalente pode ser qualquer meio de fixação não covalente, incluindo ligações hidrofóbicas, ligações iônicas, interações eletrostáticas, e similares, como será facilmente entendido por um técnico no assunto. A conjugação também pode ser realizada com o uso de uma variedade de ligantes. Por exemplo, um anticorpo anti-BBB-R e uma droga neurológica podem ser conjugados com o uso de uma variedade de agentes de acoplamento de proteína bifuncionais como propionate de N-succinimidil-S-iS-piridilditio) (SPDP), succinimidil-4-(Nmaleimidometil) ciclohexano-1 -carboxilato, iminotiolano (IT), derivados de imidoésteres bifuncionais (como dimetil adipimidato HCI), ésteres ativos (como disuccinimidil suberato), aldeídos (como glutaraldeído), compostos bis-azido (como bis-(p-azidobenzoil) hexanediamina), derivados de bis-diazônio (como bis-(p-diazoniumbenzoil)etilenediamina), diísocianatos (como tolueno 2,6-diísocianato) e compostos de flúor bis-ativo (como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Também podem ser usados ligantes peptídicos, compreendidos por um a vinte aminoácidos unidos por pontes peptídicas. Em certas realizações, os aminoácidos são selecionados a partir dos vinte que aminoácidos ocorrem naturalmente. Em certas realizações, um ou mais dos aminoácidos são selecionados a partir de glicina, alanina, prolina, asparagina, glutamina e lisina. O ligante pode ser um “ligante clivável” que facilita a liberação da droga neurológica mediante distribuição ao cérebro. Por exemplo, um ligante ácido-lábil, ligante sensível a peptidase, ligante fotolábil, ligante dimetil ou ligante que contém bissulfeto (Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992); patente US 5.208.020) pode ser usado.
[00171] A invenção no presente pedido contempla expressamente, mas não se limita a esses conjugados preparados com reagentes reticulantes incluindo, mas não se limitando a, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB,
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SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfoSMCC, e sulfo-SMPB, e SVSB (succinimidíl-(4-vinilsulfona) benzoato) que são comercialmente disponíveis (por exemplo, junto à Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., E.U.A).
[00172] Para uma disfunção de neuropatia, uma droga neurológica pode ser selecionada, que é um analgésico incluindo, mas não se limitando a, um analgésico narcótico/opioide (isto é, morfina, fentanil, hidrocodona, meperidina, metadona, oximorfona, pentazocina, propoxifeno, tramadol, codeína e oxicodona), uma droga anti-inflamatória não esteróide (NSAID) (isto é, ibuprofeno, naproxeno, diclofenaco, diflunisal, etodolac, fenoprofeno flurbiprofeno, indometacina, cetorolaco, ácido mefenâmico, meloxicam, nabumetona, oxaprozin, piroxicam, sulindaco e tolmentin), um corticosteroide (isto é, cortisona, prednísona e prednisolona, dexametasona, metilprednisolona e triancinolona), um agente anti-migrânea (isto é, sumatriptino, almotriptano, frovatriptano, sumatriptano, rizatriptano, eletriptano, zolmitriptano, diidroergotamina, eletriptano e ergotamina), acetaminofeno, um salicilato (isto é, aspirina, colina salicilato, magnésio salicilato, diflunisal e salsalato), um anticonvulsivo (isto é, carbamazepina, clonazepam, gabapentina, lamotrigina, pregabalina, tiagabina e topiramate), um anestésico (isto é, isoflurano, tricloroetileno, halotano, sevoflurano, benzocaína, cloroprocaína, cocaína, ciclometicaína, dimetocaína, propoxicaína, procaína, novocaína, proparacaína, tetracaína, articaína, bupivacaína, carticaína, cinchocaína, etidocaína, levobupivacaína, lidocaína, mepivacaína, piperocaína, prilocaína, ropivacaína, trimecaína, saxitoxina e tetrodotoxina) e a inibidor de cox-2 (isto é, celecoxibe, rofecoxibe e valdecoxibe). Para uma disfunção de neuropatia com envolvimento de vertigem, uma droga neurológica que pode ser selecionada é um agente anti-vertigem incluindo, mas não se limitando a, meclizina, difenidramina, prometazina e diazepam. Para uma disfunção de
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108/171 neuropatia com envolvimento de náusea, uma droga neurológica que pode ser selecionada é um agente anti-náusea incluindo, mas não se limitando a, prometazina, clorpromazina, proclorperazina, trimetobenzamida e metoclopramida. Para uma doença neurodegenerativa, uma droga neurológica que pode ser selecionada é um hormônio de crescimento ou fator neurotrófico; exemplos incluem, mas não se limitam a, fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), fator de crescimento do nervo (NGF), neurotrofinas-4/5, fator de crescimento de fibroblasto-2 (FGF) e outros FGFs, neurotrofina-3 (NT), eritropoietina (EPO), fator de crescimento do hepatócito (HGF), fator de crescimento epidérmico (EGF), fator transformador de crescimento-alfa (TGF), TGF-beta, fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), antagonista do receptor da interleucina-1 (IL-1ra), fator neurotrófico ciliar (CNTF), fator neurotrófico derivado da glia (GDNF), neurturina, fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), heregulina, neuregulina, artemina, persefina, interleucinas, fator neurotrófico derivado de linhagem celular glial (GFR), fator estimulador de colônias de granulócitos (SCF), CSF de macrófagos e granulócitos, netrinas, cardiotrofina-1, hedgehogs, fator inibitório de leucemia (LIF), midkine, pleiotrofina, proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs), netrinas, saposinas, semaforinas e fator de célula-tronco (SCF).
[00173] Para câncer, pode ser selecionada uma droga neurológica que é um agente quimioterápico. Exemplos de agentes quimioterapêuticos incluem agentes alquiladores como tiotepa e ciclosfosfamida CYTOXAN®; alquil sulfonados como busulfan, improsulfan e piposulfan; aziridinas como benzodopa, carboquona, meturedopa, e uredopa; etileniminas e metilamelaminas incluindo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida e trimetilolomelamina;
acetogeninas (especialmente bulatacin e bulatacinona); delta-9tetraidrocanabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapacona; lapacol;
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109/171 colchicinas; ácido betulínico; uma camptotecina (incluindo a sintética análoga topotecan (HYCAMTIN®), CPT-11 (irinotecan, CAMPTOSAR®), acetilcamptotecina, scopolectina, e 9-aminocamptotecina); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluindo suas análogas adozelesina, carzelesina e bizelesina sintética); podofilotoxina; ácido podofilínico; teniposida; criptoficinas (particularmente criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluindo as sintéticas análogas, KW-2189 e CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; uma sarcodictina; espongistatina; mostardas de nitrogênio como clorambucila, clornafazina, clorofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, hidrocloreto óxido de mecloretamina, melfalan, novembiquin, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracil; nitrosureias como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, e ranimnustina; antibióticos como os antibióticos enedina (por exemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gama 11 e caliqueamicina ômega 11 (consulte, por exemplo, Agnew, Chem Intl. Ed. EngL, 33: 183-186 (1994)); dinemicina, incluindo dinemicina A; uma esperamicina; bem como cromóforos de neocarzinostatina e cromóforos de antiobióticos enedina cromoproteínas relacionadas), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L· norleucina, doxorubicina ADRIAMYCIN® (incluindo morfolino-doxorubicina, cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicina e desoxidoxorubicina), epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabólitos como metotrexato e 5-fluorouracil (5-FU); análogos de ácido fólico como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina como
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110/171 fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocítabina, floxuridina; andrógenos como calusterona, propionate de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenais como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; ácido fólico restabelecedor como ácido frolínico; aceglatona; glicosídeo de aldofosfamida; ácido amínolevulínico; eniluracil; ansacrina; bestrabucila; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptinio; uma epotilona; etoglucídeo; nitrato de gálio; hidroxiurea; lentinan; lonidainina; maitansinoides como maitansina e ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; losoxantrona; 2-etil hidrazida; procarbazina; complexos polissacarídeos PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoxana; rizoxina; sizofirana; spirogermanio; ácido tenuazonico; triaziquona; 2,2’,2”-tricloro trietil amina; tricotecenos (especialmente toxina T2, verracurina A, roridina A e anguidina); uretano; vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®); dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromana; gacitosina; arabinosida (“Ara-C”); tiotepa; taxoides, por exemplo, paclitaxel TAXOL® (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANE™ livre de Cremofor, formulação de paclitaxel de nanopartículas de albumina elaborada (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois) e doxetaxel TAXOTERE® (Rhône-Poulenc Rorer, Antony, França); cloranbucila; gencitabina (GEMZAR®); 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos da platina como cisplatina e carboplatina; vimblastina (VELBAN®); platina; etoposide (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina (ONCOVIN®); oxaliplatina; leucovovina; vinorelbina (NAVELBINE®); novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina; ibandronato; inibidor topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides como ácido retinoico; capecitabina (XELODA®); sais
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111/171 farmaceuticamente aceitáveis, ácidos ou derivados de qualquer dos acima; bem como combinações de dois ou mais dos acima como CHOP, uma abreviação para uma terapia combinada de ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina e prednisolona, e FOLFOX, uma abreviação para um regime de tratamento com oxaliplatina (ELOXATIN™) combinado com 5-FU e leucovorina.
[00174] Também incluídos nesta definição de agentes quimioterapêuticos estão os agentes anti-hormonais que agem para regular, reduzir, bloquear ou inibir os efeitos de hormônios que podem promover o crescimento do câncer, e estão frequentemente sob a forma de tratamento sistêmico ou do corpo inteiro. Eles podem ser os próprios hormônios. Exemplos incluem antiestrógenos e moduladores seletivos do receptor de estrógeno (SERMs), incluindo, por exemplo, tamoxifeno (incluindo tamoxifeno NOLVADEX®), raloxifene EVISTA®, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trloxlfeno, queoxifeno, LY117018, onapristona e toremifeno FARESTON®; antiprogesteronas; infrarreguladores de receptores de estrógeno (ERDs); agentes de função de supressão ou bloqueio dos ovários, por exemplo, agonistas de hormônios que liberam hormônio luteinizante (LHRH) como acetato de leuprolida LUPRON® e ELIGARD®, acetato de goserelina, acetato de buserelina e tripterelina; outros antiandrogênicos como flutamida, nilutamida e bicalutamida; e inibidores aromatase que inibem a enzima aromatase, que regula a produção de estrógeno nas glândulas adrenals como, por exemplo, 4(5)-imidazolas, aminoglutetimida, acetato de megestrol MEGASE®, exemestano AROMASIN®, formestano, fadrozola, vorozola RIVISOR®, letrozola FEMARA® e anastrozola ARIMIDEX®. Além disso, essa definição de agentes quimioterapêuticos inclui os bisfosfonatos como clodronato (por exemplo, BONEFOS® ou OSTAC®), DIDROCAL® etidronato, NE-58095, ZOMETA® ácido zoledrônico/zoledronato, FOSAMAX®alendronato, AREDIA® pamidronato,
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SKELID® tiludronato ou ACTONEL® risedronate; bem como troxacitabina (um análogo del ,3-dioxolano citosina nucleosideo); oligonucleotideos antisense, particularmente aqueles que inibem a expressão de genes nas vias de sinalização envolvidas na proliferação celular anormal como, por exemplo, PKC-alfa, Raf, H-Ras, e receptor do fator de crescimento epidérmico (EGF-R); vacinas como vacina THERATOPE® e vacina de terapia gênica, por exemplo, vacina ALLOVECTIN®, vacina LEUVECTIN® e vacina VAXID®; inibidor da topoisomerase 1 LURTOTECAN % rmRH ABARELIX®; Iditosilato de apatinibe (um inibidor de molécula pequena de tirosina quinase duplo de ErbB-2 e EGFR também conhecido como GW572016); e sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidos ou derivados de qualquer um dos acima.
[00175] Outro grupo de compostos que pode ser selecionado como dragas neurológicas tratamento ou prevenção de câncer são imunoglobulinas anticâncer (incluindo, mas não se limitando a, trastuzumabe, pertuzumabe, bevacizumabe, alentuxumabe, cetuximabe, gemtuzumabe ozogamicina, ibritumomabe tiuxetano, panitumumabe e rituximabe). Em alguns casos, os anticorpos em conjunto com um marcador ou conjugado tóxico pode ser usado para direcionar e destruir células desejadas (isto é, células cancerosas), incluindo, mas não se limitando a, tositumomabe com um radiomarcador13 Ί ou trastuzumabe entansina.
[00176] Para uma doença ou disfunção ocular, uma droga neurológica que pode ser selecionado é um agente oftálmico antiangiogênico (isto é, bevacizumabe, ranibizumabe e pegaptanibe), um agente oftálmico de glaucoma (isto é, carbacoi, epinefrina, brometo de demecarium, apraclonidina, brimonidina, brinzolamida, levobunolol, timolol, betaxolol, dorzolamida, bimatoprost, carteolol, metipranolol, dipivefrina, travoprosta e latanoprost), um inibidor da anídrase carbônica (isto é, metazolamida e acetazolamida), antihistamínicos oftálmico (isto é, nafazolina, fenilefrina e tetrahidrozolina), um
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113/171 lubrificante ocular, um esteroide oftálmico (isto é, fluorometolona, prednisolona, loteprednol, dexametasona difluprednato, rimexolona, fluocinolona, medrisona e triancinolona), um anestésico oftálmico (isto é, lidocaína, proparacaína e tetracaína), um anti-infeccioso oftálmico (isto é, levofloxacina, gatifloxacina, ciprofloxacina, ofloxacina, cloranfenicol, bacitracina/polimixina b, sulfacetamida, tobramicina, azitromicina, besifloxacina, norfloxacina, sulfisoxazola, gentamicina, idoxuridina, eritromicina, natamicina, gramicidina, neomicina, ofloxacina, trifluridina, ganciclovir, vidarabina), um agente anti-inflamatório oftálmico (isto é, nepafenaco, cetorolaco flurbiprofeno, suprofeno, ciclosporina, triancinolona, diclofenaco e bronfenaco), e um anti-histamínico ou descongestionante oftálmico (isto é, cetotifeno, olopatadina, epinastina, nafazolina, cromolina, tetrahidrozolina, pemirolast, bepotastina, nafazolina, fenilefrina, nedocromil, lodoxamida, fenilefrina, emedastina e azelastina).
[00177] Para uma epilepsia, uma droga neurológica que pode ser selecionada é um anticonvulsivo ou antieplético incluindo, mas não se limitando a, anticonvulsivos barbitúricos (isto é, primidona, metarbital, mefobarbital, alobarbital, amobarbital, aprobarbital, alfenal, barbital, bralobarbital e fenobarbital), anticonvulsivos benzodiazepinas (isto é, diazepam, clonazepam e lorazepam), anticonvulsivos carbamate (isto é, felbamato), anticonvulsivos inibidores da anídrase carbônica (isto é, acetazolamida, topiramato e zonisamida), anticonvulsivo dibenzazepina (isto é, rufinamida, carbamazepina e oxcarbazepina), anticonvulsivos derivados do ácido graxo (isto é, divalproex e ácido valpróico), análogos de ácido gamaaminobutírico (isto é, pregabalina, gabapentina e vigabatrina), inibidores de recaptação de ácido gama-aminobutírico (isto é, tiagabina), inibidores de ácido gama-aminobutírico transaminase (isto é, vigabatrina), anticonvulsivo hidantoína (isto é, fenitoína, etotoína, fosfenitoína e mefenitoína), anticonvulsivos diversos (isto é, lacosamida e sulfato de magnésio),
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114/171 progestinas (isto é, progesterona), anticonvulsivo oxazolidinediona (isto é, parametadiona e trimetadiona), antíconvulsivos pirrolidina (isto é, levetiracetam), antíconvulsivos succinimida (isto é, etosuximida e methsuximida), antíconvulsivos triazina (isto é, lamotrigina), e antíconvulsivos de ureia (isto é, fenacemida e feneturida).
[00178] Para uma doença de depósito lisossômico, pode ser selecionada uma droga neurológica que é ela própria ou de outro modo imita a atividade da enzima que é prejudicada pela doença. Enzimas recombinantes exemplares para o tratamento de disfunções de depósito lisossômico incluem, mas não se limitam aos apresentados, por exemplo, na publicação de pedido de patente US 2005/0142141 (isto é, alfa-L-iduronidase, iduronato-2-sulfatase, N-sulfatase, alfa-N-acetilglicosaminidase, N-acetil-galactosamina-6-sulfatase, beta-galactosidase, arilsulfatase B, beta-glicuronidase, ácido alfa-glicosidase, glicocerebrosidase, alfa-galactosidase A, hexosaminidase A, ácido esfingomielinase, beta-galactocerebrosidase, beta-galactosidase, arilsulfatase A, ácido ceramidase, aspartoacilase, palmitoil-proteína tioesterase 1 e tripeptidil amino peptidase 1).
[00179] Para amiloidose, uma droga neurológica que pode ser selecionada inclui, mas não se limita a, um anticorpo ou outra molécula de ligação (incluindo, mas não se limitando a, uma molécula pequena, um peptídeo, um aptâmero, ou outra proteína ligante) que se liga especificamente a um alvo selecionado a partir de: beta secretase, tau, presenilina, proteína precursora amiloide ou porções das mesmas, peptídeo beta amilóide, oligômeros ou fibrilas dos mesmos, receptor de morte 6 (DR6), receptor para rodutos finais de glicação avançada (RAGE), parkin e huntingtina; um inibidor da colinesterase (isto é, galantamina, donepezil, rivastigmina e tacrina); um antagonista do receptor NMDA (isto é, memantina), um depletor de monoamina (isto é, tetrabenazina); um mesilato ergoloide; um agente antiparkinsonismo
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115/171 anticolinérgico (isto é, prociclidina, difenidramina, triexilfenidil, benztropina, biperideno e triexifenidil); um agente antiparkinsonismo dopaminérgico (isto é, entacapona, selegilina, pramipexola, bromocriptina, rotigotina, selegilina, ropinirola, rasagilina, apomorfina, carbidopa, levodopa, pergolida, tolcapona e amantadina); a tetrabenazina; um anti-inflamatório (incluindo, mas não se limitando a, uma droga anti-inflamatória não esteroide (isto é, indometicina e outros compostos listados acima), um hormônio (isto é, estrogênio, progesterona e leuprolida); uma vitamina (isto é, folato e nicotinamida); uma dimebolina; uma homotaurina (isto é, ácido 3-aminopropanosulfônico; 3APS); um modulador de atividade do receptor de serotonina (isto é, xaliprodeno); um interferon e um glicocorticoide.
[00180] Para uma doença viral ou microbiana, uma droga neurológica que pode ser selecionada inclui, mas não se limita a, um composto antiviral (incluindo, mas não se limitando a, um antiviral adamantano (isto é, rimantadina e amantadina), um antiviral interferon (isto é, peginterferon alfa2b), um antagonista do receptor de quimiocina (isto é, maraviroc), um inibidor de transferência de fita da integrase (isto é, raltegravir), um inibidor de neuraminidase (isto é, oseltamivir e zanamivir), um inibidor da transcriptase reversa não nucleosídico (isto é, efavirenz, etravirina, delavirdina e nevirapina), um inibidor da transcriptase reversa nucleosídico (tenofovir, abacavir, lamivudina, zidovudina, estavudina, entecavir, emtricitabina, adefovir, zalcitabina, telbivudina e didanosina), um inibidor da protease (isto é, darunavir, atazanavir, fosamprenavir, tipranavir, ritonavir, nelfinavir, amprenavir, indinavir, saquinavir), uma purina nucleosídeo (isto é, valaciclovir, fanciclovir, aciclovir, ribavirina, ganciclovir, valganciclovir e cidofovir), e um antiviral variado (isto é, enfuvirtida, foscarnet, palivizumabe e fomivirsen)), um antibiótico (incluindo, mas não se limitando a, uma aminopenicilina (isto é, amoxicilina, ampicilina, cloranfenicol, nafcilina, cloxacilina, dicloxacilina, flucoxacilina, temocilina,
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116/171 azlocilina, carbenicilina, ticarcilina, mezlocilina, piperacilina e bacampicilina), uma cefalosporina (isto é, cefazolina, cefalexina, cefalotina, cefamandola, ceftriaxona, cefotaxima, ceftazidima, cefadroxil, cefradina, loracarbef, cefotetan, cefuroxima, cefprozil, cefaclor e cefoxitina), um carbapenem/penem (isto é, imipenem, meropenem, ertapenem, faropenem e doripenem), um monobactam (isto é, aztreonam, tigemonam, norcardícina A e tabtoxinina-beta-lactâmico, um inibidor de beta-lactamases (isto é , ácido clavulânico, tazobactam e sulbactam), em conjunto com outro antibiótico beta-lactâmico, um aminoglicosídeo (isto é, amicacina, gentamicina, canamicina, neomicina, netilmicina, estreptomicina, tobramicina e paromomicina), uma ansamicina (isto é, geldanamicina e herbimicina), um carbacefem (isto é, loracarbef), um glicopeptídeo (isto é, teicoplanina e vancomicina), um macrolídeo (isto é, azitromicina, claritromicina, diritromicina, eritromicina, roxitromicina, troleandomicina, telitromicina e espectinomicina), um monobactam (isto é, aztreonam), uma quinolona (isto é, ciprofloxacina, enoxacina, gatifloxacina, levofloxacina, lomefloxacina, moxifloxacina, norfloxacina, ofloxacina, trovafloxacina, grepafloxicina, esparfloxacina e temafloxacina), uma sulfonamida (isto é, mafenida, sulfonamidocrisoidina, sulfacetamida, sulfadiazina, sulfametizola, sulfanilamida, sulfasalazina, sulfisoxazola, sulfametoxazola, trimetoprima e sulfametoxazola), tetraciclina (isto é, tetraciclina, demeclociclina, doxiciclina, minociclina e oxitetraciclina), um antibiótico antineoplásico ou citotóxico (isto é, doxorrubicina, mitoxantrona, bleomicina, daunorrubicina, dactinomicina, epirrubicina, idarrubicina, plicamicina, mitomicina, pentostatina e valrrubicina) e compostos antibacterianos variados (isto é, bacitracina, colistina e polimixina B)), um antifúngico (isto é, metronidazola, nitazoxanida, tinidazola, cloroquina, iodoquinol e paromomicina), e um antiparasitário (incluindo, mas não se limitando a, quinina, cloroquina, amodiaquina, pirimetamina, sulfadoxina,
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117/171 proguanil, mefloquina, atovaquona, primaquina, artemesinina, halofantrina, doxiciclina, clindamicina, mebendazol, pamoato de pirantel, tiabendazola, dietilcarbamazina, ivermectina, rifampina, anfotericina B, melarsoprol, efornitina e albendazola).
[00181] Para isquemia, uma droga neurológica que pode ser selecionada inclui, mas não se limita a, um trombolítico (isto é, uroquinase, alteplase, reteplase e tenecteplase), inibidor de agregação de plaqueta (isto é, aspirina, cilostazol, clopidogrel, prasugrel e dipiridamola), uma estatina (isto é, lovastatina, pravastatina, fluvastatina, rosuvastatina, atorvastatina, sinvastatina, cerivastatina e pitavastatina), e um composto para aprimorar o fluxo sanguíneo ou flexibilidade vascular, incluindo, por exemplo, medicações de pressão sanguínea.
[00182] Para uma disfunção comportamental, uma droga neurológica que pode ser selecionada a partir de um composto que modifica o comportamento incluindo, mas não se limitando a, um antipsicótico atípico (isto é, risperidona, olanzapina, apripiprazola, quetiapina, paliperidona, asenapina, clozapina, iloperidona e ziprasidona), um antipsicótico fenotiazina (isto é, proclorperazina, clorpromazina, flufenazina, perfenazina, trifluoperazina, tioridazina e mesoridazina), um tioxanteno (isto é, tiotixeno), um antipsicótico variado (isto é, pimozida, lítio, molindona, haloperidol e loxapina), um inibidor seletivo de recaptação de serotonina (isto é, citalopram, escitalopram, paroxetina, fluoxetina e sertralina), um inibidor de recaptação serotoninanorepinefrina (isto é, duloxetina, venlafaxina, desvenlafaxina, um antidepressivo tricíclico (isto é, doxepina, clomipramina, amoxapina, nortriptilina, amitriptilina, trimipramina, imipramina, protriptilina e desipramina), um antidepressivo tetracíclico (isto é, mirtazapina e maprotilina), um antidepressivo fenilpiperazina (isto é, trazodona e nefazodona), um inibidor da monoamina oxidase (isto é, isocarboxazida, fenelzina, selegilina e
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118/171 tanilcipromina), uma benzodiazepina (isto é, alprazolam, estazolam, flurazeptam, clonazepam, lorazepam e diazepam), um inibidor de recaptação de noradrenalina-dopamina (isto é, bupropiona), um estimulante do CNS (isto é, fentermina, dietilpropiona, metanfetamina, dextroanfetamina, anfetamina, metilfenidato, dexmetilfenidato, lisdexamfetamina, modafinila, pemolina, fendimetrazina, benzofetamina, fendimetrazina, armodafinila, dietilpropiona, cafeína, atomoxetina, doxapram e mazindol), um ansiolítico/sedativo/hipnótico (incluindo, mas não se limitando a, um barbiturate (isto é, secobarbital, fenobarbital e mefobarbital), uma benzodiazepina (conforme descrito acima), e um ansiolíticos/sedativo/hipnótico variado (isto é, difenidramina, oxibato de sódio, zaleplon, hidroxizina, hidrato de cloral, aolpidem, buspirona, doxepina, eszopiclona, ramelteon, meprobamate e etclorvinol)), uma secretina (consulte, por exemplo, Ratliff-Schaub et al. Autism 9: 256-265 (2005)), um peptídeo opioide (consulte, por exemplo, Cowen et a/., J. Neurochem. 89:273-285 (2004)), e um neuropeptídeo (consulte, por exemplo, Hethwa et al. Am. J. Physiol. 289: E301-305 (2005)).
[00183] Para inflamação do CNS, pode ser selecionada uma droga neurológica que se dirige à própria inflamação (isto é, um antiinflamatório não esteroide, como ibuprofeno ou naproxeno) ou um que trata as causas subjacentes da inflamação (isto é, um agente antiviral e anticâncer).
[00184] De acordo com uma realização da invenção, o “acoplamento” é obtido por geração de um anticorpo multiespecífico (por exemplo, um anticorpo biespecífico). Os anticorpos multiespecíficos são anticorpos monoclonais que têm especificidades de ligação para pelo menos dois antígenos ou epítopos diferentes. Em uma realização, o anticorpo multiespecífico compreende um primeiro sítio de ligação de antígeno que se liga ao BBB-R e um segundo sítio de ligação de antígeno que se liga ao antígeno cerebral, como beta-secretase 1 (BACE1) ou Abeta e os outros
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119/171 antígenos cerebrais divulgados no presente pedido.
[00185] Um antígeno cerebral exemplar ligado pelo anticorpo multiespecífico/biespecífico é BACE1, e um anticorpo exemplar que se liga ao mesmo é o anticorpo YW412.8.31 nas Figuras 9A-B no presente pedido.
[00186] Em outra realização, o antígeno cerebral é Abeta, exemplares como anticorpos que são descritos nos documentos WO 2007068412, W02008011348, W020080156622 e W02008156621, expressamente incorporados ao presente pedido como referência, com um anticorpo Abeta exemplar que compreende MABT5102A lgG4 que compreende as sequências de aminoácidos da cadeia pesada e leve nas Figuras 11A e 11B, respectivamente.
[00187] As técnicas para fabricação de anticorpos multiespecíficos incluem, mas não se limitam a, coexpressão recombinante de dois pares da cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina que têm especificidades diferentes (consulte, Milstein e Cuello, Nature 305: 537 (1983)), documento WO 93/08829, e Traunecker et at., EMBO J. 10: 3655 (1991)), e elaboração de “protuberância em orifício” (consulte, por exemplo, patente US 5.731.168). Anticorpos multiespecíficos também podem ser produzidos por elaboração de efeitos de direcionamento eletrostáticos para produção de anticorpo de moléculas heterodiméricas Fc (documento WO 2009/089004A1); reticulação de dois ou mais anticorpos ou fragmentos (consulte, por exemplo, patente US 4.676.980, e Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); com o uso de zíperes de leucina para produzir anticorpos biespecíficos (consulte, por exemplo, Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)); com o uso de tecnologia diacorpo” para produzir fragmentos de anticorpos biespecíficos (consulte, por exemplo, Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:64446448 (1993)); e com o uso de dimeros Fv de cadeia única (sFv) (consulte, por exemplo, Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)); e preparando anticorpos
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120/171 triespecíficos conforme descrito, por exemplo, em Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).
[00188] Anticorpos elaborados geneticamente com três ou mais sítios de ligação de antígeno funcionais, incluindo “anticorpos polvo” ou “imunoglobulinas de domínio variável duplo” (DVDs) , também são incluídos no presente pedido (consulte, por exemplo, patente US 2006/0025576A1 e Wu et al. Nature Biotechnology (2007)).
[00189] O anticorpo ou fragmento no presente pedido também inclui um “FAb de Ação Dupla” ou “DAF” que compreende um sítio de ligação de antígeno que se liga ao BBB-R (por exemplo, TfR) bem como a um antígeno cerebral (por exemplo, BACE1) (consulte, patente US 2008/0069820, por exemplo).
[00190] Em uma realização, o anticorpo é um fragmento de anticorpo, sendo vários desses fragmentos divulgados acima. Em outra realização, o anticorpo é um anticorpo intacto ou inteiro. Dependendo da sequência de aminoácidos do domínio constante de suas cadeias pesadas, anticorpos intactos podem ser designados para diferentes classes. Existem cinco classes principais de anticorpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias dessas podem ainda serem divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgA e lgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de anticorpos são chamados de α, δ, ε, γ, e μ, respectivamente. As estruturas de subunidades e configurações tridimensionais de diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas. Em uma realização, o anticorpo intacto é desprovido de função efetora. Em uma realização, o anticorpo intacto tem função efetora reduzida.
[00191] São conhecidas técnicas para gerar anticorpos e exemplos fornecidos acima na seção de definições deste documento. Em uma
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121/171 realização, o anticorpo é um anticorpo quimérico, humanizado ou humano, ou fragmento de ligação de antígeno dos mesmos.
[00192] Várias técnicas estão disponíveis para determinação de ligação do anticorpo ao BBB-R. Um desses ensaios é um ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA) para confirmar a capacidade de se ligar ao BBB-R humano (e antígeno cerebral). De acordo com esse ensaio, placas revestidas com antígeno (por exemplo, BBB-R recombinante) são incubadas com uma amostra que compreende o anticorpo anti-BBB-R e é determinada a ligação do anticorpo ao antígeno de interesse.
[00193] Em um aspecto, um anticorpo da invenção é testado quanto à sua atividade de ligação de antígeno, por exemplo, por métodos conhecidos como ELISA, Western blot, etc.
[00194] Ensaios para avaliar absorção de anticorpo administrado sistemicamente e outras atividades biológicas do anticorpo podem ser realizados conforme divulgado nos exemplos ou como é conhecida para o anticorpo antígeno anti-CNS de interesse.
[00195] Ensaios exemplares de onde o anticorpo multiespecífico se liga a BACE1 deve ser descrito agora.
[00196] Ensaios de competição podem ser usados para identificar um anticorpo que compete com qualquer um dos anticorpos antiBACE1 ou Fabs descritos no presente pedido, por exemplo, YW412.8, YW412.8.31, YW412.8.30, YW412.8.2, YW412.8.29, YW412.8.51, Fab12, LC6, LC9, LC10 para ligação a BACE1. Em certas realizações, esse anticorpo de competição se liga ao mesmo epítopo (por exemplo, um epítopo linear ou um conformacional) que é ligado por qualquer um dos anticorpos anti-BACE1 ou Fabs descritos no presente pedido, por exemplo, YW412.8, YW412.8.31, YW412.8.30, YW412.8.2, YW412.8.29, YW412.8.51, Fab12, LC6, LC9, LC10. Métodos exemplares detalhados para mapear um epítopo ao qual um anticorpo
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122/171 se liga são fornecidos em Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols”, em Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ).
[00197] Em um ensaio de competição exemplar, o BACE1 imobilizado é incubado em uma solução que compreende um primeiro anticorpo marcado que se liga a BACE1 (por exemplo, YW412.8, YW412.8.31, YW412.8.30, YW412.8.2, YW412.8.29, YW412.8.51, Fab12, LC6, LC9, LC10) e um segundo anticorpo não marcado que está sendo testado quanto à sua capacidade para competir com o primeiro anticorpo para ligação a BACE1. O segundo anticorpo pode estar presente em um sobrenadante de hibridoma. Como controle, BACE1 imobilizado é incubado em uma solução que compreende o primeiro anticorpo marcado, mas não o segundo anticorpo não marcado. Após incubação mediante condições permissivas para ligação do primeiro anticorpo a BACE1, o excesso de anticorpo não ligado é removido e a quantidade de marcador associado com BACE1 imobilizado é medida. Se a quantidade de marcador associado a BACE1 imobilizado é substancialmente reduzida na amostra de teste em relação à amostra controle, então isso indica que o segundo anticorpo está competindo com o primeiro anticorpo para ligação a BACE1. Consulte Harlow e Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, capítulo 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
[00198] Em um aspecto, são fornecidos ensaios para identificar anticorpos anti~BACE1 dos mesmos que têm atividade biológica. Atividade biológica pode incluir, por exemplo, inibição de atividade de aspartil protease BACE1. Os anticorpos que têm como atividade biológica in vivo e/ou in vitro também são fornecidos, por exemplo, conforme avaliado por ensaio de fluorescência resolvida em tempo homogêneo HTRF ou um ensaio eletroforético por capilaridade microfluídica (MCE) com o uso de peptídeos de substrato sintético, ou in vivo em linhagens celulares que expressam substratos BACE1 como APP.
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123/171 [00199] O anticorpo (incluindo o anticorpo multiespecífico) no presente pedido é opcionalmente produzido recombinantemente em uma célula hospedeira transformada com sequências de ácidos nucleicos que codificam suas cadeias pesadas e/ou leves (por exemplo, onde a célula hospedeira ou células hospedeiras foram transformadas por um ou mais vetores com o ácido nucleico nesse). A(s) célula(s) hospedeira(s) é(são) uma célula de mamífero, por exemplo, uma Célula de Ovário de Hamster Chinês (CHO).
B. Formulações Farmacêuticas [00200] Formulações terapêuticas de anticorpos usados de acordo com a presente invenção são preparadas para armazenamento pela mistura do anticorpo que tem o grau desejado de purificação com veículos opcionais farmaceuticamente aceitáveis, excipientes ou estabilizantes, (Remington’s Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A. Ed. (1980)), sob a forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Carreadores, excipientes ou estabilizantes aceitáveis não são tóxicos para receptores nas dosagens e concentrações empregadas e incluem tampões como fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (como octadecildimetilbenzil cloreto de amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, butil ou álcool benzil; alquil parabenos como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos que aproximadamente 10 resíduos); proteínas, como albumina de soro, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos como polivinilpirrolidona; aminoácidos como glicina, glutamina, asparagina, arginina, ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes como EDTA; açúcares como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; formação de sais de contra íons como sódio; complexos metálicos (por exemplo, complexo Zn-proteína); e/ou
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124/171 tensoativos não-iônicos como TWEEN™, PLURONICS™ ou polietileno glicol (PEG).
[00201] A formulação no presente pedido também pode conter mais que um composto ativo, opcionalmente aqueles com atividades complementares que não afetem contrariamente um ao outro. O tipo e quantidades efetivas de tais medicamentos dependem, por exemplo, da quantidade de anticorpo presente na formulação, e parâmetros clínicos dos sujeitos. Exemplos desses medicamentos são discutidos abaixo.
[00202] Os ingredientes ativos também podem ficar retidos em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsula de poli-(metilmetacilato), respectivamente, em sistemas de distribuição de droga coloidal (por exemplo, lipossomos, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Essas técnicas são divulgadas, por exemplo, em Remington’s Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A. Ed. (1980). Um ou mais agentes terapêuticos podem ser encapsulados em lipossomos que são acoplados ao anti-BBB-R (consulte, por exemplo, publicação de pedido de patente US 20020025313).
[00203] Podem ser preparadas preparações de liberação sustentada. Exemplos adequados de preparações de liberação contínua incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contêm o anticorpo, cujas matrizes estão na forma de artigos modelados, por exemplo, filmes ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de liberação sustentada incluem poliésteres, hidrogeis (por exemplo, poli(2-hidroxietilmetacrilato) ou poli(álcool vinílico), polilactídeos (patente US copolímeros de ácido L-glutâmico e γ-etil-L-glutamato, acetato de etileno vinil não degradável, copolímeros de ácido lático-ácido glicólico degradáveis como o LUPRON
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DEPOT™ (microesferas injetáveis compostas de copolímeros ácido láticoácido glicólico e acetato de leuprolida), e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.
[00204] As formulações a serem usadas para administração in vivo devem ser estéreis. Isso é facilmente realizado por filtração, através de membranas de filtração estéreis.
[00205] Em uma realização, a formulação é isotônica.
C. USOS TERAPÊUTiCOS DE ÃNTiCORPOS ANThBBB-R [00206] Os anticorpos anti-BBB-R (incluindo anticorpos multiespecíficos que compreendem os mesmos) da invenção podem ser utilizados em uma variedade de métodos in vivo. Por exemplo, a invenção fornece um método de transporte de um compostos terapêutico através da barreira hematoencefálica com impacto reduzido ou eliminado sobre populações de glóbulos vermelhos do sangue, que compreende expor o anticorpo anti-BBB-R acoplado a um composto terapêutico (por exemplo, um anticorpo multiespecífico que se liga tanto ao BBB-R como a um antígeno cerebral) para a BBB, de modo que o anticorpo transporte o composto terapêutico acoplado a esse, através da BBB. Em outro exemplo, a invenção fornece um método de transporte de uma droga para disfunção neurológica através da barreira hematoencefálica, que compreende expor um anticorpo anti-BBB-R da invenção acoplado a uma droga para disfunção cerebral (por exemplo, um anticorpo multiespecífico que se liga tanto ao BBB-R como a um antígeno cerebral) para a BBB, de modo que o anticorpo transporte a droga para disfunção neurológica acoplada a esse com impacto reduzido ou eliminado nas populações de glóbulos vermelhos. Em uma realização, a BBB do presente pedido está em um mamífero (por exemplo, um humano), por exemplo, um que tenha uma disfunção neurológica, incluindo, sem limitação: doença de Alzheimer (AD), acidente vascular cerebral, demência, distrofia muscular (MD), esclerose múltipla (MS), esclerose lateral amiotrófica (ALS),
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126/171 fibrose cística, síndrome de Angelman, sindrome de Liddle, doença de Parkinson, doença de Pick, doença de Paget, câncer, lesão cerebral traumática, etc.
[00207] Em uma realização, a disfunção neurológica é selecionada a partir de: neuropatia, amiloidose, câncer (por exemplo, envolvendo o CNS ou cérebro), uma doença ou disfunção ocular, uma infecção viral ou microbiana, inflamação (por exemplo, do CNS ou no cérebro), isquemia, doença neurodegenerativa, convulsão, distúrbio de comportamento, doença de depósito lisossômico, etc.
[00208] Disfunções de neuropatia são doenças ou anormalidades do sistema nervosas caracterizadas por sinalização do nervo inadequada ou descontroladas ou a falta da mesma, e incluem, mas não se limitam a, dor crônica, (incluindo dor nociceptiva) dor causada por uma lesão nos tecidos do corpo, incluindo dor relacionada ao câncer, dor neuropática (dor causada por anormalidades nos nervos, medula espinhal ou cérebro) e dor psicogênica (completamente ou principalmente relacionada a uma disfunção psicológica), dor de cabeça, enxaqueca, neuropatia e sintomas e síndromes que muitas vezes acompanham essas disfunções de neuropatia como vertigem ou náusea.
[00209] Amiloidoses são um grupo de doenças e disfunções associadas com os depósitos proteicos extracelulares no CNS, que incluem, mas não se limitam a amiloidose secundária, amiloidose relacionada com a idade, doença de Alzheimer (AD), comprometimento cognitivo leve (MCI), demência de corpo de Lewy, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose (tipo holandesa), complexo Parkinson-Demência de Guam, angiopatia amiloide cerebral, doença de Huntington, paralisia supranuclear progressiva, esclerose múltipla, doença de Creutzfeld Jacob, doença de Parkinson, a encefalopatia espongiforme transmissível, demência
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127/171 relacionada ao HIV, esclerose lateral amiotrófica (ALS), miosite com corpo de inclusão (IBM) e doenças oculares relacionadas à deposição de beta-amiloide (isto é, degeneração macular, neuropatia óptica relacionada às drusas e cataratas).
[00210] Cânceres do CNS são caracterizados por proliferação anormal de uma ou mais células do CNS (isto é, uma célula neural) e incluem, mas não se limitam a, glioma, glioblastoma multiforme, meningioma, astrocitoma, neuroma acústico, condroma, oligodendroglioma, meduloblastoma, ganglioglioma, Schwannoma, neurofibroma, neuroblastoma e extradural, tumores intramedular ou intradural.
[00211] Doenças ou disfunções oculares são doenças ou disfunções do olho, que para os propósitos no presente pedido é considerado um órgão do CNS segregado pela BBB. Doenças ou disfunções oculares incluem, mas não se limitam a, disfunções da esclera, córnea, íris e corpo ciliar (isto é, esclerite, queratite, úlcera de córnea, abrasão da córnea, cegueira da neve, olho de arco, ceratopatia superficial ponteada de Thygeson, neovascularização da córnea, distrofia de Fuchs, ceratocone, ceratoconjuntivite sicca, irite e uveíte), disfunções das lentes (isto é, catarata), disfunções de coroide e retina (isto é, deslocamento de retina, retinosquise, retinopatia hipertensiva, retinopatia diabética, retinopatia, retinopatia de prematuridade, degeneração macular relacionada à idade, degeneração macular (seca ou molhada), membrana epiretiniana, retinite pigmentosa e edema macular), glaucoma, moscas volantes, disfunções do nervo óptico e vias visuais (isto é, neuropatia óptica hereditária de Leber e drusas do disco óptico), doenças dos músculos oculares/acomodação e retração do movimento binocular (isto é, estrabismo, oftalmoparesia, oftalmoplegia externa progressiva, esotropia, exotropia, hipermetropia, miopia, astigmatismo, anisometropia, presbiopia e oftalmoplegia), perturbações visuais e cegueira (isto é, ambliopia, amaurose
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128/171 congênita de Lever, escotoma, daltonismo, acromatopsia, nictalopia, cegueira, cegueira dos rios e micro- oftalmia/coloboma), olhos vermelhos, pupila de Argyll Robertson, ceratomicose, xeroftalmia e aniridia.
[00212] Infecções virais ou microbianas do CNS incluem, mas não se limitam a, infecções por vírus (isto é, influenza, HIV, poliovirus, rubéola), bactérias (isto é, Neisseria sp., Streptococcus sp., Pseudomonas sp., Proteus sp., E. coii, S. aureus, Pneumococcus sp., Meningococcus sp., Haemophilus sp. e Mycobacterium tuberculosis) e outros microrganismos como fungos (isto é, levedura, Cryptococcus neoformans), parasitas (isto é, Toxoplasma gondii) ou amebas que resultam em patofisiologias do CNS, que incluem, mas não se limitam a, meningite, encefalite, mielite, vasculite e abscesso, que pode ser aguda ou crônica.
[00213] Inflamação do CNS, inclui, mas não se limita a, inflamação que é causada por uma lesão do CNS, que pode ser uma lesão física (isto é, devido a acidentes, cirurgia, trauma craniano, lesão da medula espinhal, concussão) e uma lesão devido a ou relacionada a uma ou mais outras doenças ou disfunções do CNS (isto é, abscesso, câncer, infecção viral ou microbiana).
[00214] Isquemia do CNS, como usado no presente pedido, refere-se a um grupo de disfunções relacionadas ao fluxo de sangue ou comportamento vascular aberrante no cérebro ou as causas para isso, e incluem, mas não se limitam a: isquemia cerebral focal, isquemia cerebral global, acidente vascular cerebral (isto é, hemorragia subaracnoidea ou hemorragia intracerebral) e aneurisma.
[00215] Doenças neurodegenerativas são um grupo de doenças e disfunções associadas a perda da função ou morte de células neurais no CNS, e incluem, mas não se limitam a: adrenoleucodistrofia, doença de Alexander, doença de Alper, esclerose lateral amiotrófica, ataxia
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129/171 telangiectasia, doença de Batten, síndrome de Cockayne, degeneração corticobasal, degeneração causada por ou associada a uma amiloidose, ataxia de Friedreich, degeneração lobar frontotemporal, doença de Kennedy, atrofia de múltiplos sistemas, esclerose múltipla, esclerose lateral primária, paralisia supranuclear progressiva, atrofia muscular espinhal, mielite transversa, doença de Refsum e ataxia espinocerebelar.
[00216] Doenças e disfunções de convulsão do CNS envolvem condução elétrica inapropriada e/ou anormal no CNS, e incluem, mas não se limitam a, epilepsia (isto é, convulsões de ausência, convulsões atônicas, epilepsia rolândica benigna, ausência da infância, convulsões crônicas, convulsões parciais complexas, epilepsia do lobo frontal, convulsões febris, espasmos infantis, epilepsia mioclônica juvenil, epilepsia da ausência juvenil, síndrome de Lennox-Gastaut, síndrome de Landau-Kleffner, síndrome de Dravet, síndrome de Otahara, síndrome de West, convulsões mioclônicas, disfunções mitocondriais, epilepsia mioclônica progressiva, convulsões psicogênicas, epilepsia reflexa, síndrome de Rasmussen, convulsões parciais simples, convulsões secundariamente generalizadas, epilepsia do lobo temporal, convulsões tônico-clônicas, convulsões tônicas, convulsões psicomotoras, epilepsia límbica, convulsões de início parcial, convulsões de início generalizado, estado de mal epiléptico, epilepsia abdominal, convulsões acinéticas, convulsões autonômicas, mioclonias bilaterais maciças, epilepsia catamenial, queda de convulsões, convulsões emocionais, convulsões focais, convulsões gelásticas, convulsões Jacksonianas, doença de Lafora, convulsões motoras, convulsões multifocais, convulsões noturnas, convulsão fotossensível, pseudo convulsões, convulsões sensoriais, convulsões sutis, convulsões de Sylvan, convulsões de abstinência e convulsões reflexas visuais).
[00217] Disfunções comportamentais são disfunções do
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CNS caracterizadas por comportamento aberrante por parte do sujeito afligido e incluem, mas não se limitam a, disfunções do sono (isto é, insônia, parasônias, terrores noturnos, disfunções do ritmo circadiano do sono e narcolepsia), disfunções do humor (isto é, depressão, depressão suicida, ansiedade, doenças crônicas afetivas, fobias, ataques de pânico, transtorno obsessivo compulsivo, transtorno de déficit de atenção e hiperatividade (ADHD), transtorno de déficit de atenção (ADD), síndrome de fadiga crônica, agorafobia, transtorno de estresse pós-traumático, transtorno bipolar), transtornos alimentares (isto é, anorexia ou bulimia), psicoses, disfunções de comportamento de desenvolvimento (isto é, autismo, síndrome de Rett, síndrome de Aspberger), disfunções de personalidade e disfunções psicóticas (isto é, esquizofrenia, transtorno delirante e similares).
[00218] Disfunções de depósito lisossômico são disfunções metabólicas que estão, em alguns casos, associadas com o CNS ou têm sintomas específicos no CNS; essas disfunções incluem, mas não se limitam a: Doença de Tay-Sachs, doença de Gaucher, doença de Fabry, mucopolissacaridose (tipos I, II, III, IV, V, VI e VII), doenças de depósito de glicogênio, GM1-gangliosidose, leucodistrafia metacromáticas, doença de Farber, leucodistrafia de Canavan e lipofuscinoses ceroides neuronais tipos 1 e 2, doença de Niemann-Pick, doença de Pompe e doença de Krabbe.
[00219] Em outra realização, doenças relacionadas ou causadas por superprodução inapropriada de glóbulos vermelhos, ou em que a superprodução de glóbulos vermelhos é um efeito da doença, podem ser prevenidas ou tratadas pelo efeito de depleção de reticulócitos reconhecidos no presente pedido de anticorpos anti-TfR que mantêm pelo menos uma função efetora parcial. Por exemplo, em policitemia vera congênita ou neoplásica, a contagem de glóbulos vermelhos elevada devido à hiperproliferação, por exemplo, de reticulócitos, resulta no espessamento do sangue e sintomas
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131/171 fisiológicos concomitantes. Lab. Haematol. (1996) Suppl. 1: 29-34). A administração de um anticorpo anti-TfR da invenção em que pelo menos a função efetora parcial do anticorpo foi preservada permitiría remoção seletiva de reticulócitos imaturos sem afetar o transporte normal de transferrina no CNS. A dosagem desse anticorpo podería ser modulada, de modo que esses sintomas clínicos agudos poderíam ser minimizados (isto é, por dosagem de uma dose muito baixa ou em intervalos amplamente espaçados), como bem entendido na técnica.
[00220] Em um aspecto, um anticorpo da invenção é usado para detectar uma disfunção neurológica antes do início dos sintomas e/ou para avaliar a gravidade ou duração da doença ou disfunção. Em um aspecto, o anticorpo permite a detecção e/ou formação de imagens da disfunção neurológica, incluindo formação de imagens por radiografia, tomografia ou formação de imagens por ressonância magnética (MRI).
[00221] Em um aspecto, é fornecido um anticorpo anti-BBBR de baixa afinidade d\ invenção para uso como um medicamento. Em aspectos adicionais, é fornecido um anticorpo anti-BBB-R de baixa afinidade para uso no tratamento de uma doença ou disfunção neurológica (por exemplo, doença de Alzheimer) sem depleção de glóbulos vermelhos (isto é, reticulócitos). Em certas realizações, é fornecido um anticorpo anti-BBB-R de baixa afinidade modificado para uso em um método de tratamento, conforme descrito no presente pedido. Em certas realizações, a invenção fornece um anticorpo anti-BBB-R modificado para aprimorar sua segurança para uso em um método de tratamento de um indivíduo que tem uma doença ou disfunção neurológica, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade efetiva do anticorpo anti-BBB-R (opcionalmente acoplado a uma droga para disfunção neurológica). Nessa realização, o método ainda compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de pelo menos um agente terapêutico
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132/171 adicional. Em realizações adicionais, a invenção fornece um anticorpo antiBBB-R modificado para aprimorar sua segurança para uso em redução ou inibição de formação de placa amiloide em um paciente em risco ou que sofre de uma doença ou disfunção neurológica (por exemplo, doença de Alzheimer). Um “indivíduo”, de acordo com qualquer uma das realizações acima é opcionalmente um humano. Em certos aspectos, o anticorpo anti-BBB-R da invenção para uso nos métodos da invenção aprimora a absorção da droga para disfunção neurológica com a qual está acoplado.
[00222] Em um aspecto adicional, a invenção fornece o uso de um anticorpo anti-BBB-R de baixa afinidade da invenção na fabricação ou preparação de um medicamento. Em uma realização, o medicamento é para tratamento de doença ou disfunção neurológica. Em uma realização adicional, o medicamento é para uso em um método de tratamento de doença ou disfunção neurológica que compreende administrar a um indivíduo que tem doença ou disfunção neurológica uma quantidade eficaz do medicamento. Nessa realização, o método ainda compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de pelo menos um agente terapêutico adicional.
[00223] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um método para tratar doença de Alzheimer. Em uma realização, o método compreende administrar a um indivíduo que tem doença de Alzheimer, uma quantidade efetiva de um anticorpo multiespecífico da invenção que se liga tanto a BACE1 como TfR, ou a ambos, Abeta e TfR. Nessa realização, o método ainda compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de pelo menos um agente terapêutico adicional. Um “indivíduo”, de acordo com qualquer uma das realizações acima pode ser um humano.
[00224] Os anticorpos anti-BBB-R da invenção podem ser usados tanto sozinhos como em combinação com outros agentes em uma terapia. Por exemplo, o anticorpo anti-BBB-R da invenção pode ser
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133/171 coadministrado com pelo menos um agente terapêutico adicional. Em certas realizações, um agente terapêutico adicional é um agente terapêutico efetivo para tratar a mesmo ou uma disfunção neurológica diferente, como o anticorpo anti-BBB-R está sendo empregado para tratar. Agentes terapêuticos adicionais exemplares incluem, mas não se limitam a: várias drogas neurológicas descritas acima, inibidores de colinesterase como donepezil, galantamina, rovastigmina e tacrina), antagonistas de receptores NMDA (como memantina), inibidores de agregação de peptídeo beta amiloide, antioxidantes, moduladores de γ-secretase, terapia gênica NGF ou miméticos de fator de crescimento do nervo (NGF) imita, agonistas de PPARy, inibidores de HMS-CoA redutase (estatinas), ampaquinas, bloqueadores de canal de cálcio, antagonistas do receptor GABA, inibidores de glicogênio sintase quinase, imunoglobulina intravenosa, agonistas de receptor muscarínico, modulador de receptor nicrotínico, imunização de peptídeo beta amiloide ativo ou passivo, inibidores de fosfodiesterase, antagonistas do receptor de serotonina e anticorpos antipeptídeo beta amiloide. Em certas realizações, pelo menos um agente terapêutico adicional é selecionado quanto à sua capacidade para mitigar um ou mais efeitos colaterais da droga neurológica.
[00225] Conforme exemplificado no presente pedido, certos anticorpos anti-BBB-R podem ter efeitos colaterais que impactam negativamente populações de reticulócitos em um sujeito tratado com o anticorpo anti-BBB-R. Dessa forma, em certas realizações, pelo menos um agente terapêutico adicional selecionado quanto à sua capacidade para mitigar esses efeitos colaterais negativos em populações de reticulócitos é coadministrado com um anticorpo anti-BBB-R da invenção. Exemplos desses agentes terapêuticos incluem, mas não se limitam a, agentes para aumentar populações de glóbulos vermelhos (isto é, reticulócitos), agentes para apoiar o crescimento e o desenvolvimento de glóbulos vermelhos (isto é, reticulócitos), e
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134/171 agentes para proteger populações de glóbulos vermelhos dos efeitos do anticorpo anti-BBB-R; esses agentes incluem, mas não se limitam a, eritropoietina (EPO), suplementos de ferro, vitamina C, ácido fólico e vitamina B12, bem como substituição física de glóbulos vermelhos (isto é, reticulócitos), por exemplo, por transfusão de células similares que podem ser de outro indivíduo de tipo sanguíneo similar ou podem ter sido previamente extraídos do sujeito para o qual o anticorpo anti-BBB-R é administrado. Será entendido por um técnico no assunto que, em alguns casos, agentes existentes destinados a proteger os glóbulos vermelhos (ou seja, os reticulócitos) são preferencialmente administrados ao sujeito, antes ou simultaneamente à terapia de anticorpo anti-BBB-R, enquanto os agentes destinados a apoiar ou dar início ao crescimento renovado/desenvolvimento dos glóbulos vermelhos ou populações de glóbulos vermelhos (isto é, reticulócitos ou populações de reticulócitos) são preferencialmente administrados simultaneamente com ou após a terapia de anticorpo anti-BBB-R, de modo que as hemácias possam ser repostas após o tratamento com anticorpo anti-BBB-R.
[00226] Em outras realizações, pelo menos um agente terapêutico adicional é selecionado quanto à sua capacidade para inibir ou prevenir a ativação da via de complemento mediante administração do anticorpo anti-BBB-R. Exemplos desses agentes terapêuticos incluem, mas não se limitam a, agentes que interferem na capacidade do anticorpo anti-BBBR se ligar ou ativar a via de complemento e agentes que inibem uma ou mais interações moleculares na via de complemento, e são descritos geralmente em Mollnes e Kirschfink (2006) Molec. Immunol. 43:107-121, cujos conteúdos deste são expressamente incorporados ao presente pedido como referência.
[00227] Essas combinações de terapia apontadas acima englobam administração combinada (quando dois ou mais agentes terapêuticos estão incluídos na mesma formulação ou separados), e
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135/171 administração separada, nesse caso, a administração do anticorpo da invenção pode ocorrer antes, simultaneamente e/ou após a administração do agente terapêutico adicional e/ou adjuvante. Anticorpos da invenção também podem ser usados em combinação com outras terapias de intervenção como, mas não se limitando a, radioterapia, terapia comportamental ou outras terapias conhecidas na técnica e apropriadas para a dísfunção neurológica a ser tratada ou prevenida.
[00228] O anticorpo anti-BBB-R da invenção (e qualquer agente terapêutico adicional) pode ser administrado por qualquer meio adequado, incluindo parenteral, intrapulmonar e intranasal, e se desejado, para tratamento local, administração intralesional. Infusões parenterais incluem administração por via intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal ou subcutânea. A dosagem pode ser por qualquer rota adequada, por exemplo, por injeções, como injeções intravenosa ou subcutânea, dependendo em parte, se a administração é breve ou contínua. Várias programações de dosagem incluindo, mas não se limitando a, administrações únicas ou múltiplas durante vários pontos no tempo, administração em bolus e infusão de pulso são contempladas no presente pedido.
[00229] Anticorpos da invenção são formulados, dosados e administrados de um modo consistente com as boas práticas médicas. Os fatores para consideração nesse contexto incluem a dísfunção específica a ser tratada, o mamífero específico a ser tratado, a condição clínica de cada paciente, a causa da dísfunção, o local de distribuição do agente, o método de administração, o cronograma de administração e outros fatores conhecidos pelos médicos especialistas. O anticorpo não precisa ser, mas é opcionalmente formulado com um ou mais agentes atualmente usados para prevenir ou tratar a dísfunção em questão ou para prevenir, mitigar ou melhorar um ou mais efeitos colaterais de administração do anticorpo. A quantidade eficaz desses
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136/171 outros agentes depende da quantidade de anticorpo presente na formulação, do tipo de disfunção ou tratamento e dos outros fatores discutidos acima. Esses são geralmente usados nas mesmas dosagens e com rotas de administração conforme descritas no presente pedido, ou cerca de 1 a 99% das dosagens descritas no presente pedido, ou em qualquer dosagem e por qualquer rota que seja empiricamente/clínicamente determinada a ser apropriada.
[00230] Para a prevenção ou tratamento de doença, a dosagem apropriada de um anticorpo da invenção (quando usado sozinho ou em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais) dependerá do tipo de doença a ser tratada, do tipo de anticorpo, da severidade e curso da doença, se o anticorpo é administrado para propósitos preventivos ou terapêuticos, terapias prévias, o histórico clínico do paciente e a resposta ao anticorpo, e do diagnóstico do médico. O anticorpo é adequadamente administrado ao paciente de uma vez ou no decorrer de uma série de tratamentos. Dependendo do tipo e da severidade da doença, cerca de 1 pg/kg a 15 mg/kg (por exemplo, 0,1 mg/kg a 10 mg/kg) de anticorpo pode ser uma dosagem candidata inicial para administrar ao paciente, por exemplo, tanto por uma ou mais administrações separadas como por infusão contínua. Uma dosagem diária típica pode variar de cerca de 1 pg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Para administrações repetidas no decorrer de vários dias ou mais tempo, dependendo da condição, o tratamento seria geralmente mantido até ocorrer uma supressão desejada dos sintomas da doença. Uma dosagem exemplar do anticorpo seria na faixa de cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 10 mg/kg. Dessa forma, uma ou mais doses de cerca de 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg ou 10 mg/kg (ou qualquer combinação das mesmas) podem ser administradas ao paciente. Essas doses podem ser administradas intermitentemente, por exemplo, a cada semana ou a cada três
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137/171 semanas (por exemplo, de modo que o paciente receba cerca de duas a cerca de vinte ou, por exemplo, cerca de seis doses do anticorpo). Pode ser administrada uma dose de carga inicial mais alta, seguida por uma ou mais doses mais baixas. No entanto, outros regimes de dosagem podem ser úteis. Será apreciado que um método para reduzir o impacto na população de reticulócitos por administração de anticorpos anti-TfR é modificar a quantidade ou período das doses, de modo que, em geral, menores quantidades de anticorpos circulantes estão presentes na corrente sanguínea para interagir com reticulócitos. Em um exemplo não limitante, uma dose menor dos anticorpos anti-TfR pode ser administrada com maior frequência do que seria uma dose maior. A dosagem usada pode ser equilibrada entre a quantidade de anticorpo necessária para ser entregue ao CNS (ele mesmo relacionado com a afinidade da porção do anticorpo específica para o antígeno no CNS), a afinidade do anticorpo para TfR, e se compostos protegem ou não os glóbulos vermelhos (isto é, reticulócitos), estimulam o crescimento e o desenvolvimento, ou inibem a via de complemento estão sendo coadministrados ou em série com o anticorpo. O progresso dess terapia é facilmente monitorado por técnicas convencionais e ensaios, conforme descrito no presente pedido e como conhecido na técnica.
[00231] Entende-se que qualquer uma das formulações ou métodos terapêuticos acima podem ser executados com o uso de um imunoconjugado da invenção no lugar de, ou em adição a um anticorpo antibb-rí
D. Artígos de Fabrscação [00232] Em outro aspecto da invenção, é fornecido um artigo de fabricação que contém materiais úteis para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico das disfunções descritas acima. O artigo de fabricação compreende um recipiente e um rótulo, ou uma bula associada ao recipiente.
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Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, bolsas para solução IV, etc. Os recipientes podem ser fabricados a partir de uma variedade de materiais como vidro ou plástico. O recipiente contém uma composição que é por si mesma ou combinada com outra composição, eficaz para tratamento, prevenção e/ou diagnóstico da condição e pode ter um orifício de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco que tem uma tampa perfurável para uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição é um anticorpo da invenção. O rótulo ou bula indicam que a composição é usada para tratar a condição recomendada. Além disso, o artigo de fabricação pode compreender (a) um primeiro recipiente com uma composição contida no mesmo, em que a composição compreende um anticorpo da invenção; e (b) um segundo recipiente com uma composição contida no mesmo, em que a composição compreende um agente citotóxico adicional ou de outro modo um agente terapêutico. O artigo de fabricação nessa realização da invenção pode, além disso, compreender uma bula indicando que as composições podem ser usadas para tratar uma condição específica. De maneira alternativa ou adicionalmente, o artigo de fabricação pode, ainda, compreender um segundo (ou terceiro) recipiente que compreende um tampão farmaceuticamente aceitável, como água bacteriostática para injeção (BWFI), fosfato tamponado salino, solução de Ringer e solução de dextrose. Além disso, pode incluir outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.
[00233] Deve-se entender que qualquer um dos artigos de fabricação acima podem incluir um imunoconjugado da invenção no lugar de, ou em adição a um anticorpo anti-BBB-R.
[00234] O artigo de fabricação opcionalmente compreende ainda uma bula com instruções para tratar uma disfunção neurológica em um
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139/171 sujeito, em que as instruções indicam que o tratamento com o anticorpo, conforme divulgado no presente pedido, trata a disfunção neurológica, e opcionalmente indica que o anticorpo tem absorção aprimorada através da BBB devido à sua baixa afinidade para o BBB-R.
Exemplos
Exemplo 1
Geração e Caracterização de Artscorpos Anti-TfR de Baixa Afimdade [00235] O campo reconheceu que a capacidade natural do receptor de transferrina (TfR) para transporte de transferrina através da barreira hematoencefálica (BBB) pode ser explorado para permitir o transporte de moléculas heterólogas no cérebro a partir da corrente sanguínea (consulte, por exemplo, documento WO 9502421). Os requerentes desenvolveram anteriormente uma modificação importante deste sistema, (Sei. Transi. Med. 3, 84ra43 (2011)) em outras palavras, que o transporte ao cérebro e a retenção no cérebro de uma molécula heteróloga conjugada com um anticorpo receptor de anti-transferrina (anti-TfR) foi substancialmente melhorada pela diminuição da afinidade do anti-TfR com o receptor de transferrina, dentro de uma determinada faixa.
[00236] Um painel de anticorpos anti-TfR foi gerado com uma diminuição progressiva das afinidades para com o TfR murino, três dos quais (designados anti-TfRA, anti-TfRD, e anti-TfRE) foram posteriormente modificados em um formato biespecífico com outro braço de anticorpo sendo específico para BACE1. Cada anticorpo monoespecífico e biespecífico foi avaliado em um ensaio ELISA de competição por suas afinidades para TfR murino. Resumidamente, os ensaios foram realizados em placas maxisorp (Neptune, N. J.) com camada de 2,5 pg/mL de muTfR purificado marcado com marcador hexahistidina (muTfR-His) em PBS a 4eC durante a noite. As placas foram lavadas com PBS/Tween 20 0,05% e bloqueadas com o uso de tampão
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140/171 de bloqueio super-bloqueador em PBS (Thermo Scientific, Hudson, NH). Um IgG titulado a 1:3 bivalente serial (anti-TfRA, anti-TfRD, anti-TfRE) ou Ab biespecifico (anti-TfRA/BACE1, anti-TfRD/BACE1, ou anti-TfRE/BACE1) fol combinado com anti-TfRA biotinilado 1nM e adicionado à placa por 1 hora à temperatura ambiente. As placas foram lavadas com PBS/Tween 20 0,05% e HRP-estreptavidina (SouthernBiotech, Birmingham) foi adicionada à placa e incubada por 1 hora à temperatura ambiente, As placas foram lavadas com PBS/Tween 20 0,05% foi o anti-TfRA biotinilado ligado à placa foi detectado com o uso de substrato ΤΜΒ (BioFX Laboratories, Owings Mills). (Figura 1 A). Os valores IC50 observados para a ligação de cada anticorpo monoespecífico ou biespecifico ao TfR murino no ensaio são mostrados na Tabela 2.
Tabela 2
Valores IC50 para Ligação de Anticorpo por Competição ELISA
Anticorpo ÍC50
TfRA 1 nM
TfRD 66 nM
TfRE 20 μΜ
TíRa/BACE1 14 nM
TíRd/BACE1 1,6 μΜ
TíRe/BACE1 95 μΜ
[00237] A distribuição do anticorpo após uma única administração em camundongos foi realizada como a seguir. Camundongos fêmea tipo selvagem C57B/6 de idades de 6 a 8 semanas foram usados em todos os estudos. O cuidado dos animais foi conforme as diretrizes institucionais. Os camundongos foram injetados intravenosamente com 50 mg/kg ou de uma IgG de controle, anti-BACE1 ou uma variante antiTÍR/BACE1. O volume total de injeção não excedeu 250 uL e os anticorpos foram diluídos em D-PBS quando necessário (Invitrogen). Após 0 tempo indicado, os camundongos foram perfusados com D-PBS em uma taxa de 2
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141/171 mL/min por 8 minutos. Os cérebros foram extraídos e o córtex e o hipocampo isolados, homogeneizados em NP-40 a 1% (Cal-Biochem) em PBS contendo comprimidos de coquetel inibidor de protease livres de EDTA Mini Completos (Roche Diagnosis). As amostras de cérebro homogeneizado foram rotacionadas a 4SC por 1 hora antes do giro a 14.000 rpm por 20 minutos. O sobrenadante foi isolado para a medição do anticorpo cerebral. O sangue total foi coletado antes da perfusão em tubos microtainer com EDTA (BD Diagnostics), permitido assentar por 30 minutos à temperatura ambiente e girado para baixo a 5000x g por 10 minutos. Uma camada superior de plasma foi transferida para novos tubos para medição de anticorpos e APi^ode ratos.
[00238] As concentrações totais de anticorpos no plasma de dos ratos e amostras de cérebros foram medidas com o uso de um ELISA antihuFc/anti-huFc. Imunoplacas Maxisorp NUNC de 284 poços (Neptune, NJ) foram revestidas com fragmentos F(ab’)2 de IgG de jumento anti-humano e anticorpo policlonal específico do fragmento Fc (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), durante a noite a 4SC. As placas foram bloqueadas com PBS, BSA a 0,5% por 1 hora a 25SC; Cada anticorpo (IgG de controle, anti-BACE1, e variantes biespecíficas de anti-TfR/BACE1) foram usados como um padrão para quantificar as respectivas concentrações de anticorpos. As placas foram lavadas com PBS, 0,05% Tween-20 com o uso de um lavador de microplacas (Bio-Tek Instruments, Inc., Winooski, VT), e padrões e amostras diluídos em PBS contendo BSA 0,5%, NaCI 0,35 M, CHAPS 0,25%, EDTA 5 mM, Tween20 0,05% e 15 ppm de Proclin® (Sigma-Aldrich) foram adicionados por duas horas a 25aC. A ligação do anticorpo foi detectada com IgG anti-humano de cabra F(ab’)s conjugada com peroxidase de rábano-silvestre e um anticorpo policlonal específico de Fc (Jackson ImmunoResearch). As amostras foram desenvolvidas com o uso de 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina (TMB) (KPL, Inc., Gaithersburg, MD) e a absorbância medida em um leitor de 450 nm Multiskan
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Ascent (Thermo Scientific, Hudson, NH). As concentrações foram determinadas a partir da curva padrão com o uso de um programa de regressão não linear de quatro parâmetros. O ensaio apresentou os valores de limite inferior de quantificação (LLOQ) de 3,12 ng/mL no soro e 12,81 ng/g no cérebro. A análise estatística das diferenças entre os grupos experimentais foi realizada com o uso de um teste t não pareado bicaudal.
[00239] Os resultados são mostrados nas Figuras 1B e 1 D. Tanto a IgG de controle e o anticorpo anti-BACE1 apresentaram uma absorção limitada no cérebro, que persistiu ao longo do período de medição de 10 dias, enquanto suas concentrações plasmáticas foram as mais altas de quaisquer das moléculas testadas em todos os pontos no tempo, apesar da depuração gradual ao longo do tempo. Das três variantes anti-TfR/BACE1 avaliadas, tanto a anti-TfRA/BACE1 e a anti-TfRD/BACE1 demonstraram concentrações entre 35 e 40 nM no cérebro e 1 dia após a dose (7 a 8 vezes maior que a IgG de controle, Figura 1D). Contudo, a concentração de anti-TfRA/BACE1 no cérebro diminuiu rapidamente após o dia 2 e retomou aos níveis de controle no dia 6. O Anti-TfRD/BACE1 persistiu por mais tempo no cérebro que o anti“TfRA/BACE1, com um declínio mais gradual nas concentrações cerebrais; contudo, pelo dia 10 a concentração combinou com a de controle. O Anti-TfRE/BACE1 apresentou uma entrada muito mais moderada no cérebro (2 a 3 vezes o controle), mas declinou ao longo dos dias subsequentes, que foi muito menor que a das outras duas variantes do anticorpo. Os níveis plasmáticos de todas as três variantes do anticorpo (Figura 1B) declinaram ao longo do tempo. O antiTfRA/BACE1 foi completamente liberado do plasma pelo dia 4, enquanto que o anti-TfRD/BACE1 foi totalmente liberado pelo dia 10 e o anti-TfRE/BACE1 ainda persistiu no plasma em um nível comparável à IgG de controle ou ao antiBACE1.
[00240] Tomadas em conjunto, estas constatações foram
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143/171 consistentes com a descoberta anterior de que uma redução na afinidade de um anticorpo para o TFR realmente melhora sua retenção no cérebro, na medida em que o anticorpo de maior afinidade usado (anti-TfRA/BACE1) foi liberado mais rapidamente do cérebro e o anticorpo de menor afinidade usado (anti-TfRE/BACE1) persistiu por mais tempo no cérebro. Contudo, também estava claro a partir dos dados que a quantidade total de anti-TfRD/BACE1 que foi transportada ao cérebro ao longo do tempo foi muito maior que a de antiTfRE/BACE1, sugerindo que há uma afinidade ótima entre o anti-TfRD/BACE1 e o anti-TfRE/BACE1 para maximizar tanto o transporte através da BBB como a persistência no cérebro.
[00241] A presença e persistência da molécula transportada no cérebro e no plasma é apenas uma medida da eficácia em potencial; de interesse posterior é a atividade da molécula nestes compartimentos. Consequentemente, a atividade enzimática de BACE1 foi ensaiada em ambos os compartimentos, através da medição da quantidade de Αβ-Μο (um subproduto de divagem da atividade enzimática de BACE1 sobre a proteína precursora amiloide (APP)). Resumidamente, o tratamento com anticorpos e as perfusões foram realizados em camundongos tipo selvagem conforme especificado acima. Para as medições de Αβ-|.4Ο hemisférios cerebrais foram homogeneizados em tampão de hidrocloreto de guanidina e as amostras rotacionadas por 3 horas à temperatura ambiente antes da diluição (1:10) em caseína a 0,25%, 5mM EDTA (pH 8,0) em PBS contendo aprotinina (20mg/mL) e leupeptina (10mg/mL) recém adicionadas. Homogenatos diluídos foram rotadonados para baixo a 14.000 rpm por 20 min. e os sobrenadantes foram isolados para medição de Αβι_40. O plasma foi preparado conforme descrito acima. As concentrações de Αβ1.40 total de rato no plasma e no cérebro foram determinadas com o uso de um ELISA sanduíche seguindo procedimentos similares aos descritos acima. Hemisférios cerebrais para medição de Αβν40
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144/171 foram homogeneizados em NP-40 a 1% (Cal-Biochem) e rotacionados por 1 hora à temperatura ambiente antes do giro a 14.000 rpm por 20 minutos. Anticorpo policlonal de Coelho específico para a terminação C de Αβι-4ο (Millipore, Bedford, MA) foi revestido nas placas e o anticorpo monoclonal M3.2 Αβ anti-rato biotinilado (Covance, Dedham, MA) foi usado para a detecção. O ensaio apresentou valores de LLOQ de 1,96 pg/mL no plasma e 39,1 pg/g no cérebro. A análise estatística das diferenças entre os grupos experimentais foi realizada com o uso de um teste t não pareado bicaudal.
[00242] Os resultados para plasma e cérebro são mostrados nas Figuras 1C e 1E, respectivamente, sendo consistentes com a quantidade de anticorpo presente em cada compartimento no tempo indicado (consulte as Figuras 1B e 1D). De forma importante, a quantidade de Αβ-Μο observada no cérebro ao longo do tempo foi a mais baixa ao longo do maior período nos camundongos tratados com anti-TfRD/BACE1.
Exemplo 2a
Efeito da Dosagem de Αντι-TfR em Reticulócitos [00243] Inesperadamente, no tratamento de camundongos com anti-TfRA ou anti-TfRD monoespecífico, todos os níveis de dose de 1 mg/kg ou maior, foram observados sinais clínicos e agudos que não foram observados em camundongos tratados com anti-TfRA/BACE1 ou antiTfRD/BACE1 biespecífico (consulte Tabela 3).
Tabela 3
Sintomas Observados em Camundongos Após a Administração do Anticorpo
Anticorpo Dose (mg/kg) Sinais Clínicos Agudos
IgG de Controle (isotipo 50* Nenhum
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Anticorpo Dose (mg/kg) Sinais Clínicos Agudos
combinado)
Anti-TfRD (compreendendo função efetora) 0,01* Nenhum
0,1
1 Letargia profunda após a dose dentro de 5 minutos Movimentos espasmódicos ocasionais em alguns animais. Aparência desorganizada, arquejada por 20 a 25 minutos pós-dose. Urina vermelha observada em alguns camundongos Completamente reversível dentro de horas
5
25
50
Anti-TfRc7Bace (não compreendendo função efetora) 1* Nenhum
5*
25
50
200
[00244] ANão foi observada diminuição de reticulócitos nestes níveis de doses [00245] Especificamente, os camundongos tratados de forma monoespecífica exibiram letargia após a dose dentro de 5 minutos do tratamento, onde se tomaram imóveis e não-responsivos (com movimentos espasmódicos ocasionais em alguns animais), seguido do desenvolvimento de uma aparência desorganizada, arqueada por 20 a 25 minutos após a dose. Todos esses efeitos observados desapareceram dentro de horas após o tratamento. Determinados camundongos tratados com anticorpo
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146/171 monoespecífico também aparentaram apresentar a presença ocasional de sangue na urina, bem como aparente hipotensão em 1 hora após a dose, com base na dificuldade da coleta de sangue cardíaco terminal comparado com a coleta em animais tratados com o biespecífico. Devido a ser conhecido que os glóbulos vermelhos imaturos de ratos expressam TfR (consulte a Figura 2A), existindo na corrente sanguínea periférica e os efeitos observados em camundongos podem ser explicados se tais células sanguíneas foram lesionadas, o impacto do tratamento de anticorpos sobre glóbulos vermelhos imaturos (reticulócitos) foi investigado em camundongos.
[00246] Os camundongos foram dosados intravenosamente com uma única injeção de 1 mg/kg, 5 mg/kg, ou 50 mg/kg de anti-TfRD ou antiTfRD/BACE1, ou com uma única injeção de controle IgG de 50 mg/kg, com o uso do mesmo procedimento conforme descrito no Exemplo 1, e foram tomadas amostras de sangue total em 1 hora pós-dose e colocadas em tubos de coleta contendo EDTA potássio. As contagens e índices de glóbulos vermelhos e reticulócitos foram determinadas nestas amostras de sangue com o uso do Sysmex XT2000ÍV (Sysmex, Kobe, Japão), conforme as instruções do fabricante. Resumidamente, o Sysmex detecta e classifica os reticulócitos totais, bem como a fração de reticulócitos imaturos (soma de reticulócitos fluorescentes altos e médios/intermediários), por citometria de fluxo, com o uso de um corante de polimetina fluorescente por ligação ao RNA celular e medindo as características de dispersão de luz celular resultantes.
[00247] Em 1 hora pós-dose, o anti-TfRD reduziu os níveis de reticulócitos imaturos em todos os níveis de dose testados, aproximadamente na mesma extensão, independentemente da dose. Camundongos tratados em cada grupo de dosagem de anti-TfRD também demonstraram sinais clínicos agudos de gravidade e penetrância similares (consulte a Figura 2B). Em contraste, amostras de sangue de camundongos tratados com 1 mg/kg e 5
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147/171 mg/kg de anti“TfRD/BACE1 apresentaram frações similares de reticulócitos imaturos como aquelas amostras tratadas com IgG de controle. Os camundongos tratados com 50 mg/kg de anti-TfRD/BACE1 demonstraram uma redução marcante nos reticulócitos (para cerca de 50% das quantidades de controle) (Figura 2B), mas esta redução não foi acompanhada por quaisquer sinais clínicos agudos. Desta forma, o anticorpo biespecífico contendo antiTfRD tem um impacto menor sobre os níveis de reticulócitos que o anti-TfRD monoespecífico e não obtém sinais clínicos adversos agudos.
[00248] O experimento foi repetido, incluindo então um segundo anticorpo biespecífico de uma afinidade diferente com o TfR. Os camundongos foram dosados intravenosamente com uma única injeção de 5 mg/kg, 25 mg/kg, ou 50 mg/kg de anti-TfRA ou anti-TfRD/BACE1, ou com uma única injeção de controle IgG de 50 mg/kg, com o uso do mesmo procedimento conforme descrito no Exemplo 1, e foram tomadas amostras de sangue total em 24 hora e 7 dias após a dose. As contagens de reticulócitos foram medidas no sangue total conforme descrito acima. Os resultados são mostrados na Figura 2C. Em 24 horas após a dose, todas as amostras de ratos tratados com anti“TfRA/BACE1 demonstraram reduções marcantes similares na contagem total de reticulócitos. As amostras tratadas com 25 mg/kg e 50 mg/kg de antiTfRD/BACE1 demonstraram contagens de reticulócitos similarmente baixas como as amostras tratadas com anti-TfRA/BACE1. Contudo, as amostras tratadas de 5 mg/kg de anti~TfRD/BACE1 demonstraram apenas uma redução modesta nos números de reticulócitos relativas com a amostra de controle IgG em 24 horas após a dose. Após 7 dias da dose, todos os grupos mostraram níveis normais de reticulócitos (Figura 2C), sugerindo recuperação da depleção inicial de reticulócitos, com exceção da amostra de 50 mg/kg de antiTfRD/BACE1, que demonstrou uma redução sustentada nos níveis de reticulócitos (aproximadamente 50%) relativa às quantidades de controle.
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Desta forma, apenas a dose mais baixa testada de anti-TfRD/BACE1 apresentou um impacto moderado sobre os reticulócitos, enquanto que todas as demais doses testadas levaram a uma perda quase completa de reticulócitos em 24 horas após a dose, indicando que a redução da afinidade do anticorpo (anti-TfRD relativo ao anti-TfRA) e a dose atenuam as preocupações de segurança relacionadas à perda de reticulócitos. Em 7 dias após a dose, contudo, apenas a dose mais alta de anti-TfRD/BACE1 apresentou algum impacto mensurável sobre os níveis de reticulócitos, enquanto que todas as outras doses testadas demonstraram uma recuperação das contagens de reticulócitos para níveis similares aqueles dos camundongos de controle de IgG. Notavelmente, a afinidade absoluta do anticorpo com TfR em 7 dias após a dose não foi tão importante quanto a persistência do anticorpo na corrente sanguínea para os pontos de tempo mais importantes. Independentemente da afinidade muito maior do anti-TfRA7BACEl com TfR (Tabela A), camundongos tratados com doses altas de anti-TfRA7BACE1 demonstraram uma recuperação dos números de reticulócitos em 7 dias, que corresponderam com a liberação mais rápida deste anticorpo a partir da circulação relativa ao anti-TfRD/BACE1 (conforme mostrado no Exemplo 1, Figura 1B).
[00249] Na medida em que uma resposta à dose foi observada na depleção dos reticulócitos, experimentos foram realizados para determinar se foi possível correlacionar vários níveis de doses com uma capacidade associada de reduzir Abeta no cérebro. Resumidamente, camundongos C57B/6 fêmea tipo selvagem com idades de 6-8 semanas foram usados em todos os estudos. Camundongos foram injetados intravenosamente com 50 mg/kg ou de IgG de controle, ou anti-TfR/BACE1. O volume total de injeção não excedeu 250 pL e os anticorpos foram diluídos em D-PBS (Invitrogen) quando necessário. Após o tempo indicado, os camundongos
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149/171 foram perfusados com D-PBS em uma taxa de 2mL/min por 8 minutos. Os cérebros foram extraídos e o córtex e o hipocampo isolados, homogeneizados em NP-40 a 1% (Cal-Biochem) em PBS contendo comprimidos de coquetel inibidor de protease livres de EDTA Mini Completos (Roche Diagnosis). As amostras de cérebro homogeneizado foram rotacionadas a 4aC por 1 hora antes do giro a 14.000 rpm por 20 minutos. O sobrenadante foi isolado para a medição do anticorpo cerebral. O sangue total foi coletado antes da perfusão em tubos microtainer com EDTA (BD Diagnostics), permitido assentar por 30 minutos à temperatura ambiente e girado para baixo a 5000x g por 10 minutos. Uma camada superior de plasma foi transferida para novos tubos para medição de anticorpos e Αβ-Μοόθ ratos.
[00250] As concentrações totais de anticorpos no plasma de dos ratos e amostras de cérebros foram medidas com o uso de um ELISA antihuFc/anti-huFc. Imunoplacas Maxisorp NUNC de 384 poços (Neptune, NJ) foram revestidas com fragmentos F(ab’)2 de IgG de jumento anti-humano e anticorpo policlonal específico do fragmento Fc (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), durante a noite a 4SC. As placas foram bloqueadas com PBS, BSA a 0.5% por 1 hora a 25aC; Cada anticorpo foi usado com um padrão para quantificar as respectivas concentrações de anticorpos. As placas foram lavadas com PBS, 0,05% Tween-20 com o uso de um lavador de microplacas (Bio-Tek Instruments, Inc., Winooski, VT), e padrões e amostras diluídos em PBS contendo BSA 0,05%, 0,35 M NaCI, CHAPS a 0,25%, EDTA 5 mM, Tween-20 0,05% e 15 ppm de Proclin® foram adicionados por duas horas a 25aC. A ligação do anticorpo foi detectada com IgG anti-humano de cabra conjugado com peroxidase de rábano Silvestre, anticorpo policlonal específico de Fc, desenvolvidos com o uso de 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina (TMB) (KPL, Inc., Gaithersburg, MD) e a absorbância medida em um leitor de 450 nm Multiskan Ascent reader (Thermo Scientific, Hudson, NH). As concentrações
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150/171 foram determinadas a partir da curva padrão com o uso de um programa de regressão não linear de quatro parâmetros. O ensaio apresentou os valores de limite inferior de quantificação (LLOQ) de 3,12 ng/mL no soro e 12,81 ng/g no cérebro. A análise estatística das diferenças entre os grupos experimentais foi realizada com o uso de um teste t não pareado bicaudal.
[00251] Abetai-40 também foi detectado no cérebro e no plasma. Resumidamente, camundongos foram tratados com anticorpo e perfusados conforme o método descrito acima. Para as medições de hemisférios cerebrais Αβι-40 foram homogeneizados em 5M de tampão de hidrocloreto de guanidina e as amostras rotacionadas por 3 horas à temperatura ambiente antes da diluição (1:10) em caseína a 0,25%, 5mM EDTA (pH 8,0) em PBS contendo aprotinina (20 mg/mL) e leupeptina (10 mg/mL) recém adicionadas. Homogenatos diluídos foram rotacionados para baixo a 14.000 rpm por 20 min. e os sobrenadantes foram isolados para medição de Αβι.4Ο. O plasma foi preparado conforme descrito acima. As concentrações de Αβν40 total de rato no plasma e no cérebro foram descritas com o uso de um ELISA sanduíche seguindo procedimentos similares aos descritos acima. Anticorpo policlonal de Coelho específico para a terminação C de Αβ-|..4ο (Millipore, Bedford, MA) foi revestido nas placas e o anticorpo monoclonal M3.2 Αβ anti-rato biotinilatado (Covance, Dedham, MA) foi usado para a detecção. O ensaio apresentou valores de LLOQ de 1,96 pg/mL no plasma e 39,1 pg/g no cérebro. A análise estatística de diferenças entre grupos experimentais foi realizada com o uso de um teste t não pareado bicaudal.
[00252] Uma robusta e sustentada redução no Abeta cerebral, tanto em níveis de doses de 25 e 50 mg/kg para o anti-TfRD/BACE1 foi observada (Figura 2D), enquanto que o anti-TfRA/BACE1 demonstrou uma robusta, mas aguda redução no Abeta cerebral em todos os três níveis de doses (Figura 2E). Estes dados foram considerados com a farmacocinética
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151/171 observada dos compostos tanto na periferia como no cérebro (Figura 2F-2H). A partir destes dados, foi aparente que um nível de dosagem de 25 mg/kg do anti-TfRD/BACE1 é suficiente para reduzir significativamente os níveis de Abeta cerebral destes estudos.
[00253] A depleção de reticulócitos por espécies do anticorpo anti-TfR pode ser devido à uma variedade de diferentes processos naturais, incluindo citotoxina mediada por células dependente de função efetora/anticorpo (ADCC), citotoxina dependente de complemento (CDC), lise/apoptose mediada por alvo direto, e/ou fagocitose de reticulócitos opsonizados por macrófagos. Uma série de experimentos foi realizada para compreender melhor os mecanismos responsáveis pela depleção reticulócita observada após a administração de anticorpo anti-TfR.
Examplo 2b
Impacto da Função Efetora Modulante [00254] Além de diferir na afinidade e na valência para o TfR, os anticorpos monoespecíficos e biespecíficos anti-TfR usados nos experimentos precedentes também diferiram no grau de suas funções efetoras. Os anticorpos anti-TfR monoespecíficos foram produzidos em células CHO e tinham glicosilação tipo mamífero e função efetora tipo selvagem. Os anticorpos anti-TfR/BACE1 apresentaram uma capacidade gravemente reduzida ou eliminada de interação com receptores Fcy com o uso de um ou mais dos métodos a seguir de técnicas conhecidas: Anulação da glicosilação devido à presença de mutação N297G ou N297A na região Fc (Atwal etal., Sei. Transi. Med. 3, 84ra43 (2011); Fares Al-Ejeh et al., Clin. Cancer Res. (2007) 13:5519s-5527s), modificação da região Fc do anticorpo para conter um ácido aspártico para a mutação da alanina na posição 265 (D265A), conhecida por anular completamente a função efetora (consulte, por exemplo, a patente US 7.332.581), ou produzindo o anticorpo de uma forma que preveniu a
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152/171 glicosilação mamífera tipo selvagem, como na produção em E. coli.
[00255] Os estudos em ratos realizados no Exemplo 2A foram repetidos com estes anticorpos modificados para Fc e também em diferentes linhagens de ratos, ou faltando os receptores Fcy ou o complemento C3, para avaliar os mecanismos em potencial de depleção dos reticulócitos, incluindo ADCC ou CDC orientado por efetor, respectivamente; amostras de sangue total foram avaliadas pelas contagens de reticulócitos totais 24 horas após a injeção intravenosa do anticorpo. No primeiro experimento, a administração de um 1 mg/kg ou 25mg/kg de anti-TfRD monoespecífico faltando a função efetora para camundongos tipo selvagem apresentou o mesmo efeito depletive sobre as contagens de reticulócitos que um anticorpo anti-TfR0 com função efetora total (compare a Figura 3A com a Figura 2B). Contudo, não foram observados sinais clínicos agudos em camundongos tratados com anticorpo anti-TfRD sem efetor, em contraste agudo com aqueles tratados com anticorpo anti-TfR0 positivo para efetor (Exemplo 2A). Similarmente, quando o anti-TfRD positivo para efetor foi administrado em camundongos faltando o receptor Fcy (para eliminar os mecanismos ADCC que podem ser acionados pela função efetora), os níveis de reticulócito foram reduzidos para quase zero após uma dose de 25 mg/kg, mas não foram observados sinais clínicos agudos (Figura 3B).
[00256] O impacto de anticorpos anti-TfRD/BACE1 D265A biespecíficos faltando a função efetora sobre os níveis de reticulócitos também foi avaliado em camundongos knockout Fcy (Figura 3B). Mesmo a anulação total da função efetora do anticorpo e a ausência de receptor Fcy nos camundongos não mitigou a depleção de reticulócitos quando administrado em um nível de dose de 25 mg/kg. Consistente com outros experimentos com o uso de anticorpos anti-TfR/BACE1 sem efetor, biespecíficos em camundongos tipo selvagem, não foram observados sinais clínicos adversos em
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153/171 camundongos knockout Fcy tratados.
[00257] Para determinar se a presença da função efetora é suficiente para conduzir a sintomas clínicos agudos, e posteriormente caracterizar a contribuição da função efetora para a depleção dos reticulócitos, os experimentos foram repetidos em camundongos tipo selvagem comparando uma dose baixa (5 mg/kg) de anti-TfRD/BACE1 D265A sem efetor com uma dose equivalente de anti-TfRD/BACE1 positiva para efetor total (Figura 3C). Sinais clínicos agudos foram observados na introdução da função efetora no anticorpo biespecífico. Além disto, a depleção robusta dos reticulócitos foi observada com anticorpos positivos para efetor no menor nível de dose relativo à versão sem efetor do anticorpo (Figuras 3C e 2C). A partir destes dados combinados, a função efetora não é necessária para dirigir a depleção dos reticulócitos, mas visivelmente contribui para esta depleção, particularmente nos menores níveis de doses. De forma importante, os sintomas clínicos agudos observados em camundongos estão ligados ao estado efetor do anticorpo, de modo que os anticorpos sem efetor ou os camundongos knockout Fcy possam ambos mitigarem completamente estes sintomas.
[00258] Para determinar se a cascata do complemento foi envolvida ou nos sintomas clínicos ou na perda de reticulócitos, os experimentos foram realizados novamente em camundongos deficientes no complemento C3 (por exemplo, camundongos faltando a cascata normal do complemento). Conforme mostrado na Figura 3D, o anti-TfRA positivo para efetor causou tanto depleção profunda nos reticulócitos como sintomas clínicos agudos robustos nestes camundongos, indicando que o complemento C3 e a cascata associada do complemento não desempenham um papel principal na condução ou dos efeitos observados quando o anticorpo administrado possui função efetora total. Para testar se os mesmos resultados poderíam ser obtidos na ausência da função efetora total, camundongos knockout C3 foram dosados
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154/171 com anticorpos anti-TfRD/BACE1 sem efetor para determinar se o complemento media a depleção residual dos reticulócitos. Os resultados são mostrados na Figura 3E. De fato, a depleção residual dos reticulócitos é resgatada quanto tanto a função efetora como a cascata do complemento são eliminadas pela dosagem em camundongos knockout C3 com anticorpos biespecíficos anti-TfR sem efetor em níveis altos de dose terapêutica (50 mg/kg). Desta forma, o complemento aparenta agir como um mecanismo de depleção dos reticulócitos seguido da administração de anticorpos anti-TfR sem efetor em camundongos.
[00259] Um ensaio in vitro de citotoxina dependente do complemento (CDC) também foi realizado. Resumidamente, os ensaios CDC foram realizados usando primariamente células da medula óssea de ratos ou linfoblastos eritroleucêmicos de ratos (HPA Cultures, UK) como células alvo e complemento derivado de soro de coelhos (EMD Chemicals, Gibbstown NJ). As células foram contadas e a viabilidade determinada no Vi-Cell™ (Beckman Coulter, Fullerton, CA). Anticorpos anti-TfRA/BACE1, anti-TfRA ou anticorpos de controle negativos ou positivos (IgG ou anti-H2Kb, respectivamente) foram diluídos em série em meio de ensaio (meio RPMI-1640 complementado com 20 mM HEPES, pH 7,2 e FBS a 1%) e distribuídos em uma placa de cultura de tecidos branca, de fundo liso de 96 poços (Costar; Corning, Acton MA). Após a adição de complemento de soro diluído em 1:3 no meio de ensaio e das células alvo (2 x 105 células/poço), a placa foi incubada com CO2 a 5% por 2 horas a 37 aC. As placas então foram deixadas à temperatura ambiente por 10 minutos com agitação constante. A extensão da lise celular foi quantificada pela mediação da intensidade de luminescência com um leitor de placas SpectroMax™ M5. Os valores de luminescência das diluições das amostras foram plotados contra a concentração do anticorpo e as curvas de resposta à dose foram adaptadas para um modelo de quatro parâmetros com o uso do
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Graph Pad™ (Graph Pad Software Inc.).
[00260] De modo interessante, nem o anti-TfRA monoespecífico competente de função efetora nem o anti-TfRA/BACE1 biespecífico sem efetor de tratamento de células de ratos na presença do complemento de soro resultaram em lise mediada por complemento das células, enquanto que o controle positivo anti-H2Kb demonstrou lise celular significativa (Figura 4A). Particularmente, a atividade diferenciadora do efetor dos anticorpos não aparentou influenciar sua capacidade de retirar a atividade CDC. Uma explicação não limitante é que o complemento pode mediar depleção de reticulócitos in vivo através de opsonização dos reticulócitos em circulação através dos macrófagos esplênicos e hepáticos (Garratty (2008), Transfusion Med. 18(6): 321-334; Mantovani et al, (1972) J. Exp. Med. 135: 780-792; Molina et al., (2002) Blood 100 (13): 4544-4549), um mecanismo que deve permanecer intacto com fragmentos de anti-TfR F(ab’)2.
[00261] Experimentos similares in vitro também foram realizados para confirmar os resultados in vivo descritos anteriormente, apoiando uma ligação entre a citotoxina mediada por células dependente de anticorpo mediada por função efetora (ADCC), sintomas clínicos agudos e depleção reticulócita. Ensaios ADCC foram realizados com o uso de PBMCs recém isolados de doadores saudáveis como células efetoras e células da medula óssea primária de ratos ou linfoblastos eritroleucêmico de ratos (HPA Cultures, UK) como células alvo. Para minimizar as variações de doadores a partir das diferenças alotípicas na posição 158 de resíduo de FcyRIIIA, os doadores de sangue foram limitados aqueles carregando o genótipo heterozigótico FcyRIIIA (F/V158). Resumidamente, as PBMCs foram isoladas por centrifugação de gradiente de densidade com o uso de um tubo de separação sanguínea Uni-Sep (Accurate Chemical & Scientific; Westbury, NY). As células alvo foram pré-marcadas com solução 1,4mM de calceína AM
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156/171 (Sondas Moleculares) e foram semeadas em uma placa de fundo redondo de 96 poços (BD Biosciences; Mississauga, Ontario; Canada) em 4 x 104/poço. As diluições seriais de anti-TfR/BACE1, anti-TfR e do anticorpo de controle foram adicionadas a placas contendo as células alvo, seguido por incubação a 37SC com dióxido de carbono a 5% por 30 minutos para permitir opsonização. As concentrações finais de anticorpos variaram de 1.000 a 0,004 ng/mL após diluições seriais em 4 vezes. Após a incubação, 1 x 10b PBMC de células efetoras em 100 pL de meio de ensaio foram adicionadas para fornecer uma razão de 25:1 de efetor para células alvo e as placas foram incubadas por um adicional de 3 horas. As placas foram centrifugadas ao final da incubação e os sinais fluorescentes nos sobrenadantes foram medidos com o uso de um leitor de microplacas SpectraMax™ M5, com excitação em 485 nm e emissão em 520 nm. Os sinais de poços contendo apenas as células alvo representaram a liberação espontânea de calceína AM das células marcadas (liberação espontânea), enquanto que os poços contendo células alvo dissolvidas com Triton™ X-100 forneceram o sinal máximo disponível (lise máxima). A citotoxina celular independente do anticorpo (AICC) foi medida em poços contendo células alvo e efetoras sem a adição de anticorpos. A extensão de ADCC específico foi calculada como a seguir:
[00262] % de ADCC - 100 x (Sinal de amostra - AICC) :· (lise máxima - liberação espontânea) [00263] Os valores de ADCC das diluições das amostras foram plotados contra a concentração do anticorpo e a curva de resposta à dose foi adaptada para um modelo de quatro parâmetros com o uso do Graph Pad™ (Graph Pad Software Inc.).
[00264] O anti-TfRA usado neste ensaio tinha ação efetora, enquanto que o anti-TfRA7BACE1 usado no ensaio não tinha função efetora. Conforme mostrado na Figura 4B, o anticorpo com função efetora induziu
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ADCC, enquanto que o anticorpo anti-TfRA/BACE1 com função efetora faltando não, correlacionando com os resultados de experimentos anteriores em ratos. Estes dados ainda suportam a ideia de que sinais clínicos agudos em camundongos tratados são devido à atividade de ADCC produzida pelos anticorpos positivos para efetor se ligando aos reticulócitos em circulação, e eu o ADCC conduzido por efetor pode também contribuir para a depleção do reticulócito seguida à administração de anticorpos (Figura 3C).
Examplo 2c
Impacto de Fc de Modulação ou Ligação BACE1 [00265] O papel do braço Fc e do braço BACE1 foram examinados cada um separadamente por seu envolvimento em potencial na mediação da depleção de reticulócitos. Anti-TfR monoespecíficos e biespecíficos com regiões Gc de lgG1 tipo selvagem tendo função efetora total e glicosilação normal foram gerados. Resumidamente, semi-anticorpos TfR (orifício) e IgG (protuberância) foram expressos separadamente em CHO e anelados in vitro, conforme descrito (Carter, P. (2001) J. Immunol. Methods 248, 7-15: Ridgway, J. B., Presta, L. G., e Carter, P. (1996) Protein Eng. 9, 617-621; Merchant, A. M., Zhu, Z., Yuan, J. Q., Goddard, A., Adams, C. W., Presta, L. G., e Carter, P. (1998) Nat. Biotechnol. 16, 677-681; Atwell, S., Ridgway, J. B„ Wells, J. A., e Carter, P. (1997) J. Mol. Biol. 270, 26-35). Fragmentos de F(ab’)2 foram gerados a partir de anticorpos anti-TfR IgG, antiTfR/IgG ou anti-TfR/BACE1 pela digestão com pepsina imobilizada. O anticorpo foi reconstituído em 100 mM de acetato de sódio, pH 4.2 e incubado com resina de pepsina imobilizada (0,3 mL de gel assentado/mg IgG) durante a noite a 37QC com rotação. Após a incubação, a amostra foi centrifugada para separar a pepsina imobilizada da mistura F(ab’)2 digerida. O fragmento F(ab’)s foi então purificado com o uso de uma SP sefarose, resina de troca catiônica forte (coluna de 1 mL HiTrap™ (Supelco)). A amostra foi carregada em 50 mM
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158/171 de NaOAc pH 5,0 e eluida com um gradiente de 0-0,5 M de NaCI ao longo de 20 volumes de coluna, após o qual a amostra foi dialisada contra PBS, pH 7,4. Experimentos em ratos foram realizados com estes anticorpos e F(ab’)2 com o uso dos mesmos procedimentos conforme acima e uma dose intravenosa de 25 mg/kg de F(ab’)2 monoespecífico ou uma dose intravenosa de F(ab’)2 biespecífico ou de controle, ou anticorpo; amostras de sangue total foram avaliadas para as contagens de reticulócitos totais 24 horas após a injeção intravenosa do anticorpo/F(ab’)2. Os resultados são mostrados nas Figura 5A-5C.
[00266] A administração de anti-TfRD F(ab’)2 tem um efeito de depleção reticulócita muito similar à administração do anticorpo anti-TfRD (comparar Figura 5A com Figuras 3A e 3B), indicando que a porção Fc do anticorpo não é necessária para a depleção de reticulócitos observada nos níveis de dose avaliados. Apesar de moléculas F(ab’)2 biespecíficas demonstrarem uma leve atenuação da depleção de reticulócitos relativa aos anticorpos IgG biespecíficos de extensão total (comparar Figura 5B com Figura 2C), deve ser observado que isto é mais provável devido à liberação mais rápida em geral de F(ab’)2 relativa à IgG (Covell et. AL, (1986) Cancer Res. 46:3969-3978), levando a uma exposição geral reduzida de anticorpo ao longo do intervalo de 24 horas após a dose. Não obstante, a depleção de reticulócitos observada após a administração de anticorpos F(ab’)2 biespecíficos ainda enfatiza a conclusão que a região Fc não é necessária para a depleção de reticulócitos ocorrer. Anticorpos biespecíficos faltando no braço BACE1 (antiTfRD/lgG de controle) depletaram os reticulócitos ao mesmo grau que o antiTfRD/BACE1 (Figura 5C), demonstrando que o braço BACE1 também não contribui para a eliminação de reticulócitos.
Exemplo 3
Elaboração Adicional de Afinidade de Ligação [00267] Alguns dos resultados acima sugeriram que houve
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159/171 uma afinidade e o componente da dose do grau observado de depleção de reticulócitos (Figura 20). Para compreender melhor como a afinidade e a dose impactam na depleção dos reticulócitos, os experimentos de dosagem de ratos realizados no Exemplo 2 foram repetidos com anticorpos anti-TfR de baixa atividade adicionais, especificamente antí-TfRE/BACE1 em dois níveis diferentes de dose (25 mg/kg e 50 mg/kg). O Anti-TfRE em qualquer uma das doses testadas essencialmente não apresentou impacto sobre os reticulócitos (Figura 6A), enquanto que doses similares de anti-TfRA/BACE1 ou antiTfRD/BACE1 depletaram os reticulócitos. A partir dos resultados discutidos no Exemplo 1, foi observado que o anti-TfRE/BACE1 apresentou melhor exposição sustentada no plasma e persistência no cérebro, mas menos transporte robusto através da barreira hematoencefálica e então anti-TfRD/BACE1. Dado que a administração de anti-TfRc7BACE1 resultou em depleção dos reticulócitos, mas a administração de anti-TfRE/BACE1 não, foram geradas variantes anti-TfRs com afinidades entre as quais o anti-TfRD e o anti-TfRE para TfR para observar se o perfil de segurança do anticorpo pode ser melhorado sem sacrificar o transporte BBB e a persistência no cérebro.
[00268] Resumidamente, a mutagênese direcionada ao sítio foi empregada para combinar os dois pontos de mutação representando as variantes anti-TfRD e anti-TfRB respectivamente em um único anticorpo antiTfRDb designada, com o uso de técnicas padrão de mutagênese. Similarmente, os dois pontos de mutação representando as variantes anti-TfRD e anti-TfRc respectivamente em um único anticorpo anti-TfRDc designado. Ambos os anticorpos foram produzidos em um formato biespecífico com anti-BACE1 com o uso de tecnologia de protuberância e orifício, conforme descrito no Exemplo 2C. As afinidades de ambos os anticorpos foram entre aquelas dos anticorpos anti-TfRD e anti-TfR^ para TfR, e o anticorpo anti-TfRDb/BACE1 apresentou uma afinidade aproximadamente três vezes maior para o TfR que a do anticorpo
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160/171 anti-TfRDc/BACE1. O experimento de administração em ratos/depleção de reticulócitos foi repetido com estas novas variantes e os resultados são mostrados na Figura 6B. Ambas as variantes demonstraram uma depleção de reticulócitos notadamente melhorada que o anticorpo anti-TfRD/BACE1 no mesmo nível de dose e os níveis de reticulócitos aproximadamente como aqueles de camundongos tratados para controle em 24 horas após a dose. Conforme esperado, a concentração plasmática de anticorpos de ambas novas variantes de anticorpos ao longo do tempo, a concentração cerebral de anticorpos (tanto o valor máximo como a diminuição ao longo do tempo) e a redução de Αβι.4Ο foi entre aquela de anti-TfRD/BACE1 e anti-TfRE/BACE1 quando administrados nos mesmos níveis de doses.
[00269] O impacto da afinidade e a dose sobre a expressão de TfR na barreira hematoencefálica também foram examinados. Camundongos foram tratados com uma única dose anti~TfRA/BACE1 ou antiTfRD/BACE1 em 5, 25 ou 50 mg/kg, e a expressão de TfR no cérebro foi avaliada em 4 dias após a dose através de Western blot. Os cérebros dos camundongos tratados com anticorpos foram perfusados com PBS antes da extração e o córtex e o hipocampo isolados, homogeneizados em NP-40 a 1% (Cal-Biochem) em PBS contendo comprimidos de coquetel inibidor de protease livres de EDTA Mini Completos (Roche Diagnosis). Os cérebros homogeneizados foram relacionados a 4SC por 1 hora antes do giro a 14.000 rpm por 20 minutos. O sobrenadante foi isolado e concentrações iguais de proteína foram separadas por gel 4-12% Novex Bis-Tris (Invitrogen). As membranas foram incubadas com anticorpos anti-TfR (Invitrogen) e anti-actina (Abeam) durante a noite a 4aC, seguido de anticorpos secundários IRDye® (LiCor Biosciences) à temperatura ambiente por 2 horas. Immunoblots foram fotografadas e bandas foram quantificadas por densitometria com o uso do programa de computação Odyssey Infrared Imaging System™ (Li-Cor
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Biosciences, Lincoln, NE). Quatro dias após a dose, a expressão de TfR em todas as três amostradas tratadas com anti-TfRD/BACE1 foi similar, apesar de ligeiramente deprimida a partir dos níveis de controle em níveis de dose maiores (Figura 6C). Em contraste, aumentar as doses do anticorpo antiTíRa/BACE1 resultou em uma diminuição considerável na expressão de TfR na barreira hematoencefálica 4 dias após a dose. Desta forma, a redução da afinidade do anticorpo anti-TfR também melhora a redução dependente da dose na expressão do TfR cerebral, potencialmente contribuindo ainda para melhorar o perfil geral de segurança do anticorpo.
Exemplo 4
Avaliação da Permeabilidade da BBB [00270] Uma preocupação da exploração de um receptor de transporte da barreira hematoencefálica para o transporte de moléculas heterólogas ao cérebro é que a BBB em si pode ser prejudicado. Consequentemente, a permeabilidade da BBB aos anticorpos na dosagem com anti-TfR foi investigada. Camundongos tipo selvagem foram administrados intravenosamente com 50 mg/kg de IgG de controle, ou 25 mg/kg de cada uma das combinações indicadas de anticorpos coinjetados. A absorção média de anticorpo no cérebro 24 horas após a injeção intravenosa foi avaliada com o uso de um ELISA Fc humano genérico conforme o Exemplo 1, ou com o uso de um ELISA específico de anti-BACE1 segundo procedimentos similares aqueles descritos no Exemplo 1. O domínio extracelular do BACE1 foi usado como a camada proteica e a detecção foi realizada com IgG anti-humano de cabra F(ab’)2 conjugado com peroxidase de rábano silvestre, anticorpo policlonal específico de Fc. Este ensaio apresentou valores de LLOQ de aproximadamente 2,56 ng/g para o anti-BACE1 e 12,8 ng/g para o antiTfRD/BACE1. Os níveis de Αβ-^ο cerebral foram medidos após a administração com o uso do mesmo procedimento apresentado no Exemplo 1.
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162/171 [00271] Os resultados são mostrados nas Figuras 7A - 7C. A exposição ao anticorpo cerebral foi a mais alta no IgG de controle + camundongos tratados com anti-TfR0/BACE1, mas também substancial nos camundongos tratados com combinações de anticorpos contendo anti-TfR0 (Figura 7A). Isto se correlaciona com os resultados no Exemplo 1, em que a forma biespecífica de afinidade mais baixa de anti-TfR0 é tomada e persiste no cérebro por mais tempo do que a forma monoespecífica de afinidade maior do anti-TfR0 Anticorpos coadministrados com o anticorpo anti-TfR não foram tomados no cérebro em quantidades substanciais; o único anti-BACE1 observado em quantidade substancial no cérebro foi aquele conjugado diretamente ao anti-TfR0 (Figura 7B). Similarmente, a única atividade do antiBACE1 observada foi em camundongos tratados com anti-TfRD/BACE1 (Figura 7C). Tomados em conjunto, estes dados indicam que a permeabilidade da barreira hematoencefálica aos anticorpos não foi afetada pelo tratamento antiTfR.
Exemplo 5
Impacto de Dosagem Múltipla sobre os Níveis de Reticulócitos [00272] Os estudos anteriormente mencionados focaram em uma única dose de anticorpo anti-TfR e no impacto resultante sobre os níveis de reticulócitos e nos sintomas clínicos agudos concomitantes. Para averiguar se foram observados efeitos diferentes a seguir a doses múltiplas ao longo de um período de tempo maior, foram realizados estudos posteriores. Os mesmos protocolos, conforme descritos nos exemplos precedentes foram usados, com exceção que, ao invés de uma única dose intravenosa, os camundongos foram dosados intravenosamente uma vez por semana com 25 mg/kg de antiTfRD/BACE1 ou um controle de IgG, por um total de quatro semanas; Tecido/sangue foi coletado em 1,4 ou 7 dias após a segunda injeção e após a quarta injeção e processado com o uso dos protocolos descritos acima. Além
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163/171 disto, a bilirrubina direta, ferro sérico e total e capacidade de ligação ao ferro não saturado foram determinadas para amostras de soro por ensaios colorimétricos com o uso do Integra™ 400 (Roche, Indianapolis, IN) conforme as instruções do fabricante. Seis camundongos foram usados para cada ponto de tempo e grupo de tratamento.
[00273] A concentração de anticorpos no soro para o antiTíRD/BACE1 foi similar ao longo do tempo após 2 ou 4 doses, sugerindo que a liberação na corrente sanguínea de ratos não difere substancialmente após a dosagem repetida (Figura 8A). Contudo, uma leve diminuição na exposição geral do anticorpo foi aparente 4 dias após a quarta dose relativa ao mesmo tempo após a segunda dose, sugestiva da ocorrência de anticorpos antidroga de rato (ADAs) para os anticorpos IgG humanos administrados. Similar às concentrações séricas de anticorpos, as concentrações cerebrais de anticorpos diminuíram por 4 dias após a quarta dose, apesar da persistência de anticorpos presentes no cérebro ao longo do tempo, espelhando o que foi observado após a segunda dose (Figura 8B). Os níveis plasmáticos (Figura 8C) e cerebrais (Figura 8D) do poço correlacionado com as quantidades observadas de antiTfRD/BACE1 presente no soro e no cérebro após 2 ou 4 doses.
[00274] Também relevante, não foi observada exacerbação da toxicidade dos reticulócitos no contexto multidose. Conforme mostrado na Figura 8E, os números de reticulócitos absolutos melhoraram dramaticamente a partir do dia 1 após a segunda dose até 7 dias após a quarta dose (onde os valores retomaram a ou excederam os níveis de controle). Não houve evidência de diminuição de massa de glóbulos vermelhos ou alterações no ferro sérico e na capacidade total de ligação do ferro (um parâmetro substituto para a transferrina do soro) em quatro semanas. Também não houve evidência de alterações histopatológicas ou níveis alterados de ferro corável em quaisquer tecidos avaliados. Sem ser ligado por teoria, é proposto que uma
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164/171 resposta regenerativa melhorada da medula óssea obtida através da administração da dose inicial e sustentada ao longo do período de dosagem pode ser responsável pela melhoria da diminuição geral de reticulócitos observada após a quarta dose. Adicionalmente, a presença suspeita de ADAs ainda reduziu os níveis gerais de anticorpos em circulação com dosagem repetida, contribuindo também para a mitigação da depleção dos reticulócitos observada na semana 4. Finalmente, a expressão cerebral de TfR não diferiu em camundongos tratados com o anti-TfRD/BACE1 e a IgG de controle em 1,4 ou 7 dias após a quarta dose (Figura 8F).
Exemplo 6
Impacto de Células Progenitoras Erstroides Contendo Efetor e Bsespecífícas Sem Efetor no Sangue e na Medula Óssea [00275] Experimentos adicionais foram realizados para elucidar o impacto dos anticorpos dosando sobre populações de células progenitoras eritroides na medula óssea. Primeiramente, para examinar o curso de tempo da perda de reticulócitos após a dosagem de anti-TfR/BACE1, sangue e medula óssea foram isolados em 1, 4, 16 e 24 horas após camundongos tipo selvagem serem injetados intravenosamente com 50 mg/kg de IgG de controle ou anti-TfRD/BACE1 faltando a função efetora como um único bolus em 200 pL em PBS estéril(n=6/grupo). Sangue e medula óssea foram coletados de animais nos pontos no tempo indicados pós-dose. Sangramentos orbitais foram usados para extração de sangue após a anestesia de isoflurano e medula óssea a partir de um fêmur foi colhida e foram preparadas suspensões de células únicas. As células então foram filtradas através de uma peneira celular de 70 micra. As células foram lavadas e ressuspensas em um volume definido de PBS. Um volume fixo de suspensão celular foi adicionado a uma concentração fixa de microesferas fluorescentes marcadas com FITC e analisado em um citômetro de fluxo, coletando 5000
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165/171 eventos de microesferas por amostra para obter as contagens celulares. A análise quantitativa das populações de eritroides foi determinada através de citometria de fluxo. Tanto no sangue como na medula óssea, foram controladas populações distintas de células eritroides através de sua expressão do marcador Ter119 (um marcador que foi determinado como sendo expressado apenas em eritrócitos maduros murinos e células precursoras de eritroides), expressão de TfR e perfil de dispersão lateral (como descrito anteriormente em Paniga et al., ‘‘Expression of Prion Protein in Mouse Erythroid Progenitors and Differentiating Murine Erythroleukemia Cells.” PLoS One 6, 9 (2011); Figs. 9A e 9B). Resumidamente, amostras foram incubadas por 20 minutos no gelo com Ter119-PE anti-rato (eBioscience) e TfR anti-rato biotinilatado, seguido por estreptavidina eFluor450 (eBioscience). Amostras forma lavadas com PBS contendo BSA a 0,5%, 2mM EDTA e passada em um citômetro de fluxo multicores BD LSR Fortessa e analisadas com o uso do programa de computação FlowJo (Ashland, OR).
[00276] O tratamento com anti-TfRD/BACE1 faltando a função efetora não alterou o número total de eritrócitos no sangue comparados com a IgG de controle (Fig. 9C), mas no entanto reduziu rápida e significativamente a circulação de reticulócitos expressando TfR no sangue (Fig. 9D). Em contraste com as constatações no sangue, o anti-TfRD/BACE1 não apresentou efeito sobre nenhuma das populações progenitoras de eritroides na medula óssea (Fig. 10CA-C), incluindo populações com expressão alta de TfR (populações EryA e EryB) (Fig. 10B-C), e eritrócitos maduros negativos para TfR (população EryC) (Fig. 10D). Em conjunto, estes resultados demonstraram que o anti-TfRD/BACE1 sem efetor apenas deplete os reticulócitos expressando TfR no sangue em camundongos, sem impactar outras subpopulações de células eritroides na medula óssea após uma única dose.
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166/171 [00277] Para investigar o impacto da função efetora total, anticorpos sobre subpopulações de eritrócitos tanto no sangue como na medula óssea e para determinar se a afinidade desempenha um papel na depleção de células eritroides, camundongos tipo selvagem receberam uma dose IV única de 25 mg/kg de anti-TfRA/BACE1 (Fc-), anti-TfRD/BACE1 (Fc-), anti-TfRD/BACE1 (Fc+), ou IgG de controle (onde “Fc-” indica um anticorpo sem efetor devido à presença das mutações D265A e N297G ou a falta de glicosilação e “Fc+” indica um anticorpo com função efetora tipo selvagem), seguindo o mesmo processo de injeção e coleta da amostra como acima. Nem a presença da função efetora nem a afinidade com o TfR afetaram o número total de eritrócitos maduros em circulação no sangue após a dosagem de anticorpos, comparado com a IgG de controle (Fig. 11 A). Confirmando a observação anterior, a dosagem com anticorpos anti-TfR/BACE1 sem efetor resultou em uma diminuição rápida e prolongada nos reticulócitos expressando TfR no sangue (Fig. 11B, comparar com a Fig. 9D). Além disto, a afinidade com o TfR não alterou a extensão na qual os anticorpos biespecíficos conduziram à perda de reticulócitos, na medida em que não houve diferenças significativas no curso do tempo nem na magnitude da diminuição de reticulócitos entre animais dosados com anti-TfRÃ/BACE1 (Fc-) ou anti-TfRD/BACE1 (Fc-) (Fig. 11B). Contudo, a dosagem com anti-TfRD/BACE1 de função efetora total (Fc+) resultou em uma exacerbação da perda de reticulócitos, conforme comparada com os anticorpos biespecíficos sem efetor (Fig. 11B), sugerindo que a função efetora desempenha um papel importante na gravidade da depleção dos reticulócitos após a dosagem de anticorpo.
[00278] Na medula óssea, nem o anticorpo biespecífico antiTfR sem efetor (Fc-) alterou o número total de células eritroides, comparado com a IgG de controle (Fig. 11 A). Contudo, o anti-TfRD/BACE1 com função efetora total (Fc+) reduziu o número total de células eritroides em 24 horas
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167/171 após a dose (Hg. 12A). Especificamente, as células precursoras de eritroides positivas para TfR (populações EryA e EryB) foram significativa e robustamente reduzidas na presença de uma função efetora total, enquanto que os anticorpos anti-TfR/BACE1 sem efetor não apresentaram efeito sobre subpopulações de células eritroides positivas para TfR comparadas com a IgG de controle. (Fig. 12B-C). De forma notável, o número de eritrócitos maduros foi aumentado transitoriamente após a dosagem com anti-TfRD/BACE1 de função efetora total (Fc+) em 4 a 16 horas após a dose, comparado com os anticorpos anti-TfR/BACE1 sem efetor (Fc-) e a IgG de controle (Fig. 12D). Em uma interpretação não limitante, este aumento temporário pode ser devido a um mecanismo de compensação secundário dirigindo a maturação acelerada de eritrócitos em resposta à depleção das células precursoras de eritroides. Em conjunto, estes dados sugerem que um anticorpo anti-TfR/BACE1 sem efetor mitiga a perda de células eritroides positivas para TfR na medula óssea.
Exemplo 7
Impacto de Anticorpos Monoespecíficos e Biespecíficos Contendo Efetor e Sem Efetor em uma Linhagem Celular de Erstroleucemina Humana e CÉLULAS MONONUCLEARES DA MEDULA ÓSSEA PRIMÁRIA [00276] Os exemplos mencionados anteriormente usaram anticorpos TfR anti-murina, que não reconhecem especificamente o TfR humano. Para certificar se a depleção reticulócita observada nos estudos em ratos era exclusiva ao sistema murino, experimentos posteriores foram realizados com o uso de anti-TfR que se liga ao TfR humano.
[00277] Ensaios ADCC foram realizados com o uso de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de doadores humanos saudáveis como células efetoras. Uma linhagem celular de eritroleucemina humana (HEL, ATCC) e células mononucleares de medula óssea humana primária (AllCells, Inc.) foram usadas como células alvo. Para minimizar a
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168/171 variabilidade entre doadores que poderia potencialmente criar diferenças alotópicas na posição 158 de resíduo em FcyRIIIA, os doadores de sangue foram limitados aqueles portando genótipo RcyRIIIA heterozigótico (F/V158) no primeiro conjunto de experimentos (Figura 13A-B). Para o segundo conjunto de experimentos (Figurai 4A-B), apenas células HEL foram usadas como células alvo, com PMBCs de doadores humanos saudáveis portando ou o genótipo F/V 158 ou o genótipo FcyRIIIA V/V 158. O genótipo V/V158 também foi incluído neste ensaio devido à associação conhecida com atividade ADCC aumentada mediada por células NK, bem como capacidade de se ligar aos anticorpos lgG4 (Bowles e Weiner, 2005; Bruhns et al. 2008). As células foram contadas e a viabilidade determinada no Vi-Cell™ (Beckman Coulter, Fullerton, CA), seguindo as instruções do fabricante.
[00278] Os PBMCs foram isolados por centrifugação de gradiente de densidade com o uso de tubos de separação sanguínea UniSep™ (Accurate Chemical & Scientific; Westbury, NY). As células alvo em 50 pL de meio de ensaio (RPMI-1640 com BSA a 1% e 100 unidades/mL de penicilina e estreptomicina) foram semeadas em uma placa de fundo redondo de 96 poços, com 4 x 104/poço. As diluições seriais do teste e do anticorpo de controle (50 pL/poço) foram adicionadas a placas contendo as células alvo, seguido por incubação a 37SC com dióxido de carbono a 5% por 30 minutos para permitir opsonização. As concentrações finais de anticorpos variaram de 0,0051 to 10.000 ng/mL após diluições seriais em 5 vezes para um total de 10 pontos de dados. Após a incubação, 1,0 x 106 PBMC de células efetoras em 100 pL de meio de teste foram adicionadas a cada poço para dar uma razão de 25:1 de efetor: as células alvo e as placas foram incubadas por um adicional de 4 horas. As placas foram centrifugadas ao final da incubação e os sobrenadantes foram testados por atividade de desidrogenase de lactato (LDH) com o uso de um Kit™ de Detecção de Citotoxicidade (Roche Applied Scinece;
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Indianapolis, IN). A mistura de reação de LDH foi adicionada aos sobrenadantes e as placas foram incubadas à temperatura ambiente por 15 minutos com agitação constante. A reação foi terminada com 1 Μ H3PO4 e a absorbância foi medida em 490 nm (0 fundo, medido em 650 nm, foi subtraído para cada poço), com 0 uso de um leitor de microplaca SpectraMax Plus. A absorbância dos poços contendo apenas as células alvo serviu como controle para 0 fundo (controle baixo), enquanto que os poços contendo células alvo dissolvidas com Triton-X 100 forneceram 0 sinal máximo disponível (controle alto). A citotoxina celular independente do anticorpo (AICC) foi medida em poços contendo células alvo e efetoras sem a adição de anticorpos. A extensão de ADCC específico foi calculada como a seguir:
A490 (Amostra) — A490 (AICC) % ADCC - 100 x -------------------------------A490 (Controle Alto) · Α490 (Controle Baixo) [00279] Os valores de ADCC das diluições das amostras foram plotados contra a concentração do anticorpo e as curvas de resposta à dose foram adaptadas para um modelo de quatro parâmetros com 0 uso do SoftMax Pro.
[00280] Em um primeiro conjunto de experimentos, a atividade do ADCC de diversos constructos de TfR anti-humano foi avaliada usando tanto uma linhagem celular de eritroleucemia humana (células HEL) como células mononucleares de medula óssea humana primária. O anticorpo 15G11 TfR1 anti-humano competente de função efetora lgG1 bivalente e uma forma biespecífica deste anticorpo com 0 mesmo braço anti-BACE1 usado nos exemplos anteriores em um formato lgG1 humano com as mutações D265A e N297G anulando a função efetora (consulte Exemplo 6) foram testados em diversas concentrações no ensaio ADCC, com 0 uso de lgG1 WT anti-gD como controle negativo e HLA anti-humano de murina (classe I) como um controle
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170/171 positivo. Os resultados são mostrados nas Figuras 13A e 13B. Ou com as células HEL como alvos (Fig. 13A) ou com as células mononucleares de medula óssea como alvos (Fig. 13B), o anticorpo 15G11 TfR anti-humano monoespecífico obteve uma atividade ADCC significativa. Esta atividade foi similar à dos anticorpos HLA anti-humanos de controle positivo sobre as células HEL e em um nível robusto ainda inferior ao controle positivo sobre as células mononucleares de medula óssea. O nível algo mais baixo observado no experimento com células mononucleares de medula óssea é provavelmente devido ao fato que apenas uma porção da mistura heterogênea de células PBMC de linhagem mielóide e eritroide usadas no experimento expressam níveis altos de TfR, enquanto que as células HEL apresentam uma expressão de TfR consistentemente alta ao longo da população celular clonal. Em um contraste agudo, o anticorpo anti-humano TÍR/BACE1 sem efetor biespecífico não demonstrou nenhuma atividade de ADCC nem nas células HEL nem nas mononucleares de medula óssea, similar ao controle negativo.
[00281] Em um Segundo conjunto de experimentos, o impacto da comutação do isotipo do anticorpo neste sistema de ensaio foi avaliado. O procedimento do ensaio ADCC foi idêntico ao descrito acima, com exceção de que todas as células alvo foram células HEL e as células efetoras foram PMBCs de doadores humanos saudáveis, ou portando o genótipo FcyRllla-V/F158 heterozigótico ou o genótipo FcyRllla-V/V158 homozigótico. Todos os TfR anti-humanos testados foram biespecíficos com anti-gD, com três diferentes cadeias principais Ig: lgG1 humano tipo selvagem, IgGl humano com a mutação N297G e lgG4 humano. Um anticorpo anti-Abeta com cadeia principal lgG4 humana também foi testado e um HLA anti-humano de rato (classe I) serviu como controle positivo. Os resultados são mostrados nas Figuras 14A e 14B. Conforme antecipado, com base na associação conhecida entre a ativação de células efetoras e o genótipo V/V 158 (Bowles e Weiner
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2005), a atividade de ADCC foi mais robustamente obtida por doador V/V 158 de PBMCs (aproximadamente 45% das células alvo impactadas) relativa aos doadores F/V (aproximadamente 25% de células alvo impactadas) (comparar a Fig. 14A com a Fig. 14B). Anti-TfR/gD com o lgG1 tipo selvagem induziu ADCC robusta em células HEL, enquanto que o anti-TfR/gD com a lgG1 sem efetor não demonstrou nenhuma atividade de ADCC em células HEL, replicando os resultados a partir do primeiro conjunto de experimentos. Notavelmente, em concentrações de 100 ng/mL ou maiores, o anti-TfR/gD do isotipo lgG4 demonstrou uma atividade ADCC branda. Esta atividade não foi observada nos resultados de anti-Abeta lgG4, indicando que a ligação do TfR foi necessária para a atividade do ADCC. Esta constatação é correlacionada com o relatório anterior que a lgG4 apresenta função efetora mínima, mas mensurável (Adolffson et al., J. Neuroses'. 32(28):9677-9689 (2012); van der Zee et al. Clin Exp. Immunol. 64: 415-422 (1986)); Tao et al., J. Exp. Med. 173:1025-1028 (1991)).
[00282] Desta forma, as constatações incorporadas ao presente pedido que a depleção de células de linhagem eritroide em camundongos ocorrem de uma forma dependente de TfR e de função efetora, sendo diretamente traduzível ao sistema humano. Embora a invenção acima mencionada tenha sido descrita com algum detalhe a título de ilustração e exemplos para propósitos de clareza de entendimento, as descrições e exemplos não devem ser interpretados como limitação ao escopo da invenção. As divulgações de todas as patentes e literaturas científicas citadas no presente pedido são expressamente incorporadas em sua totalidade como referência.

Claims (55)

  1. Remndícações
    1. USO DE UM ANTICORPO, que se liga a um receptor transferrina (TfR), caracterizado por ser para transportar um composto através da barreira hematoencefálica, em que o anticorpo é acoplado ao composto, e em que o anticorpo liga ao TfR com baixa afinidade e em que uma ou mais propriedades do anticorpo tenham sido modificadas para reduzir o impacto do anticorpo nos níveis de reticulócitos e/ou reduzir a gravidade ou presença de sintomas clínicos agudos no sujeito, tal como redução dos níveis de glóbulos vermelhos no sujeito mediante administração é diminuída ou eliminada.
  2. 2. USO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser para tratar um distúrbio neurológico em um sujeito.
  3. 3. USO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pela disfunção neurológica ser selecionada a partir do grupo que consiste em doença de Alzheimer (AD), acidente vascular cerebral, demência, distrofia muscular (MD), esclerose múltipla (MS), esclerose lateral amiotrófica (ALS), fibrose cística, síndrome de Angelman, síndrome de Liddle, doença de Parkinson, doença de Pick, doença de Paget, câncer e lesão cerebral traumática.
  4. 4. USO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo sujeito ser um humano.
  5. 5. USO, de acordo com uma das reivindicações 2 a 4, caracterizado por uma ou mais propriedades serem selecionadas a partir da função efetora da região Fc do anticorpo e da função de ativação de complemento do anticorpo, e em que a função efetora ou função de ativação de complemento foi reduzida ou eliminada em relação a um anticorpo do tipo selvagem do mesmo isotipo.
  6. 6. USO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pela função efetora ser reduzida ou eliminada por um método selecionado a partir
    Petição 870160021356, de 19/05/2016, pág. 36/217 de redução de glicosilação do anticorpo, modificação do isotipo do anticorpo para um isotipo que tem naturalmente função efetora reduzida ou eliminada, e modificação da região Fc.
  7. 7. USO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pela glicosilação do anticorpo ser reduzida por um método selecionado a partir de: produção do anticorpo em um ambiente que não permite a glicosilação do tipo selvagem, remoção de grupos carboidrato já presentes no anticorpo, e modificação do anticorpo de modo que a glicosilação do tipo selvagem não ocorra.
  8. 8. USO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo anticorpo ser produzido em um sistema de produção de células de não mamíferos, ou onde o anticorpo é produzido sinteticamente.
  9. 9. USO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pela região Fc do anticorpo compreender uma mutação na posição 297, de modo que o resíduo de asparagina do tipo selvagem nessa posição seja substituído por outro aminoácido que interfere com glicosilação nessa posição.
  10. 10. USO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pela função efetora ou função de ativação de complemento ser reduzida ou eliminada pela deleção de todo ou uma parte da região Fc, ou pela elaboração do anticorpo de modo a não incluir uma região Fc ou não região Fc competente para função efetora ou função de ativação de complemento, ou em que a modificação é selecionada a partir de: uma mutação de ponto da região Fc para prejudicar a ligação a um ou mais receptores Fc selecionados a partir das seguintes posições: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 265, 268, 269, 270, 272, 278, 289, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 301,303, 322, 324, 327, 329, 333, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 414, 416, 419, 434, 435, 437, 438 e 439; uma mutação de ponto da região Fc para prejudicar a ligação a Clq
    Petição 870160021356, de 19/05/2016, pág. 37/217 selecionada a partir das seguintes posições: 270, 322, 329 e 321; eliminação de alguma ou toda região Fc, e uma mutação de ponto na posição 132 do domínio CH1.
  11. 11. USO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo anticorpo acoplado ao composto, ser administrado com um composto adicional selecionado a partir de eritropoietina (EPO), um suplemento de ferro, vitamina C, ácido fólico e vitamina B12, ou em que o composto adicional é glóbulos vermelhos ou reticulócitos do mesmo ou de outro sujeito.
  12. 12. USO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo sujeito ser monitorado por depleção de glóbulos vermelhos.
  13. 13. USO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo composto ser uma droga para disfunção neurológica ou um agente de imagem.
  14. 14. USO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo anticorpo não impactar na ligação da TfR a transferrina.
  15. 15. USO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo anticorpo possuir um IC50 para o TfR de cerca de 1 nM a cerca de 100 μΜ, ou de cerca de 5 nM a cerca de 100 μΜ, ou de cerca de 50 nM a cerca de 100 μΜ, ou de cerca de 100 nM a cerca de 100 μΜ.
  16. 16. USO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo anticorpo possuir uma afinidade para o TfR de cerca de 5 nM a cerca de 50 μΜ.
  17. 17. USO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo anticorpo acoplado ao composto possuir uma afinidade para o TfR de cerca de 30 nM a cerca de 30 μΜ, ou de cerca de 30 nM a cerca de 1 μΜ.
  18. 18. USO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 17,
    Petição 870160021356, de 19/05/2016, pág. 38/217
    4/10 caracterizado pelo anticorpo acoplado ao composto, possuir uma possuir uma meia vida de dissociação para o TfR de cerca de 30 segundos a cerca de 5 minutos, ou de cerca de 30 segundos a cerca de 2 minutos.
  19. 19. USO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo anticorpo ser um anticorpo multiespecífico e o composto opcionalmente formar uma porção do anticorpo multiespecífico.
  20. 20. USO, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo anticorpo multiespecífico compreender um primeiro sítio de ligação de antígeno que liga o TfR e um segundo sítio de ligação de antígeno que liga um antígeno cerebral.
  21. 21. USO, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo antígeno cerebral ser selecionado a partir do grupo que consiste em: betasecretase 1 (BACE1), Abeta, receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano (HER2), tau, apolipoproteína E4 (ApoE4), alfa-sinucleína, CD20, huntingtina, proteína príon (PrP), quinase rica em repetição leucina 2 (LRRK2), parquina, presenilina 1, presenilina 2, gama secretase, receptor 6 de morte (DR6), proteína precursora amiloide (APP), receptor de neurotrofina p75 (p75NTR) e caspase 6.
  22. 22. USO, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo anticorpo multiespecífico se ligar tanto a TfR e BACE1 ou, em que o anticorpo multiespecífico se liga tanto a TfR e Abeta.
  23. 23. MÉTODO PARA FAZER UM ANTICORPO útil para transportar um composto através da BBB com segurança aprimorada, caracterizado por compreender selecionar um anticorpo específico para um receptor de transferrina (TfR) que possui baixa afinidade para o TfR, e modificar uma ou mais propriedades do anticorpo para reduzir o impacto do anticorpo nos níveis de reticulócito e/ou reduzir a gravidade ou presença de sintomas clínicos agudos em um sujeito, tal como redução de níveis de
    Petição 870160021356, de 19/05/2016, pág. 39/217 glóbulos vermelhos em um sujeito, mediante administração do anticorpo, é diminua ou eliminada, comparado ao anticorpo não modificado.
  24. 24. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por uma ou mais propriedades serem selecionadas a partir da função efetora da região Fc do anticorpo e a função de ativação de complemento do anticorpo, e em que, a função efetora ou a função de ativação de complemento foi reduzida ou eliminada em relação a um anticorpo do tipo selvagem do mesmo isotipo.
  25. 25. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pela função efetora ser reduzida ou eliminada por um método selecionado a partir de redução de glicosilação do anticorpo, modificação do isotipo do anticorpo para um isotipo que tenha naturalmente função efetora reduzida ou eliminada, e modificação da região Fc.
  26. 26. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pela glicosilação do anticorpo ser reduzida por um método selecionado de: produção do anticorpo em um ambiente que não permita glicosilação do tipo selvagem, remoção de grupos carboidrato já presentes no anticorpo, e modificação do anticorpo de modo que a glicosilação do tipo selvagem não ocorra.
  27. 27. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo anticorpo ser produzido em um sistema de produção de células de não mamíferos, ou onde o anticorpo é produzido sinteticamente.
  28. 28. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pela região FC do anticorpo compreender uma mutação na posição 297, de modo que o resíduo de asparagina do tipo selvagem nessa posição seja substituído por outro aminoácido que interfere com a glicosilação nessa posição.
  29. 29. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado
    Petição 870160021356, de 19/05/2016, pág. 40/217 pela função efetora ou a função de ativação de complemento ser reduzida ou eliminada pela deleção de todo ou uma parte da região Fc, ou pela elaboração do anticorpo de modo a não incluir uma região Fc competente para função efetora ou função de ativação de complemento, ou a modificação ser selecionada a partir de: uma mutação de ponto da região Fc para prejudicar a ligação a um ou mais receptores Fc selecionados a partir das seguintes posições: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 265, 268, 269, 270, 272, 278, 289, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 301,303, 322, 324, 327, 329, 333, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 414, 416, 419, 434, 435, 437, 438 e 439; uma mutação de ponto da região Fc para prejudicar a ligação a 01 q selecionada a partir das seguintes posições: 270, 322, 329 e 321; eliminação de alguma ou toda a região Fc, e uma mutação de ponto na posição 132 do domínio CH1.
  30. 30. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 23 a 29, caracterizado pelo anticorpo possuir um IC50 para o TfR de cerca de 1 nM a cerca de 100 μΜ, ou de cerca de 5 nM a cerca de 100 μΜ, ou de cerca de 50 nM a cerca de 100 μΜ, ou de cerca de 100 nM a cerca de 100 μΜ.
  31. 31. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 23 a 30, caracterizado pelo anticorpo ser acoplado com um composto terapêutico.
  32. 32. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo composto terapêutico ser uma droga para disfunção neurológica.
  33. 33. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 23 a 30, caracterizado pelo anticorpo ser um anticorpo multiespecífico que compreende um primeiro sítio de ligação de antígeno que liga o TfR e um segundo sítio de ligação de antígeno que liga um antígeno cerebral.
  34. 34. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo antígeno cerebral ser selecionado a partir do grupo que consiste em: betasecretase 1 (BACE1), Abeta, receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano (HER2), tau,
    Petição 870160021356, de 19/05/2016, pág. 41/217
    7/10 apolipoproteína E4 (ApoE4), alfa-sinucleína, CD20, huntingtina, proteína príon (PrP), quinase rica em repetição leucina 2 (LRRK2), parquina, presenilina 1, presenilina 2, gama secretase, receptor 6 de morte (DR6), proteína precursora amiloide (APP), receptor de neurotrofina p75 (p75NTR) e caspase 6.
  35. 35. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo anticorpo multiespecífico se ligar tanto a TfR e BACE1, ou (ii) o anticorpo multiespecífico se ligar tanto a TfR e Abeta.
  36. 36. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 23 a 35, caracterizado pelo anticorpo possuir uma afinidade para o TfR de cerca de 5 nM a cerca de 50 μΜ.
  37. 37. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 23 a 36, caracterizado pelo anticorpo possuir uma meia vida de dissociação para o TfR de cerca de 30 segundos a cerca de 5 minutos, ou cerca de 30 segundos a cerca de 2 minutos.
  38. 38. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 23 a 37, caracterizado pelo anticorpo não inibir a ligação de TfR a transferrina.
  39. 39. ANTICORPO, caracterizado por se ligar a um TfR, em que a afinidade do anticorpo para o TfR ser de cerca de 5 nM a cerca de 50 μΜ ou a meia vida de dissociação do anticorpo para o TfR ser de cerca de 30 segundos a cerca de 2 minutos, e em que uma ou mais propriedades do anticorpo tenha sido modificada para reduzir o impacto do anticorpo nos níveis de reticulócitos e/ou reduzir a severidade ou presença de sintomas clínicos agudos.
  40. 40. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado por uma ou mais propriedades ser selecionada a partir da função efetora da região Fc do anticorpo e a função de ativação de complemento do anticorpo, e em que a função efetora ou função de ativação de complemento tenha sido reduzida ou eliminada em relação a um anticorpo do tipo selvagem
    Petição 870160021356, de 19/05/2016, pág. 42/217 do mesmo isotipo.
  41. 41. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pela função efetora ser reduzida ou eliminada por um método selecionado a partir da produção do anticorpo em um ambiente que não permite glicosilação do tipo selvagem; remoção de grupos carboidrato já presentes no anticorpo, e modificação do anticorpo de modo que a glicosilação tipo selvagem não ocorra.
  42. 42. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo anticorpo ser produzido em um sistema de produção de células de não mamíferos, ou onde o anticorpo é produzido sinteticamente.
  43. 43. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pela região Fc do anticorpo compreender uma mutação na posição 297, de modo que o resíduo de asparagina do tipo selvagem nessa posição seja substituído por outro aminoácido que interfere com glicosilação nessa posição.
  44. 44. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pela função efetora ou função da ativação complementar ser reduzida ou eliminada pela deleção de toda ou uma parte da região Fc, ou pela elaboração do anticorpo de modo a não incluir uma região Fc competente para função efetora, ou em que a modificação é selecionada a partir de: uma mutação de ponto da região Fc para prejudicar a ligação a um ou mais receptores Fc selecionados a partir das seguintes posições: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 265, 268, 269, 270, 272, 278, 289, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 301,303, 322, 324, 327, 329, 333, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 414, 416, 419, 434, 435, 437, 438 e 439; uma mutação de ponto da região Fc para prejudicar a ligação a C1q selecionada a partir das seguintes posições: 270, 322, 329 e 321; eliminação de alguma ou toda a região Fc, e uma mutação de ponto na posição 132 do domínio CH1.
    Petição 870160021356, de 19/05/2016, pág. 43/217
  45. 45. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 39 a
    44, caracterizado pelo anticorpo ser acoplado com um composto terapêutico.
  46. 46. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo composto terapêutico ser uma droga para disfunção neurológica.
  47. 47. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo anticorpo ser um anticorpo multiespecífico e o composto opcionalmente formar uma porção do anticorpo multiespecífico.
  48. 48. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo anticorpo ser um anticorpo multiespecífico que compreende um primeiro sítio de ligação de antígeno que liga o TfR e um segundo sítio de ligação de antígeno que liga um antígeno cerebral.
  49. 49. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo antígeno cerebral ser selecionado a partir do grupo que consiste em: beta-secretase 1 (BACE1), Abeta, receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano (HER2), tau, apolipoproteína E4 (ApoE4), alfa-sinucleína, CD20, huntingtina, proteína príon (PrP), quinase rica em repetição leucina 2 (LRRK2), parquina, presenilina 1, presenilina 2, gama secretase, receptor 6 de morte (DR6), proteína precursora amiloide (APP), receptor de neurotrofina p75 (p75NTR) e caspase 6.
  50. 50. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo anticorpo multiespecífico se ligar tanto a TfR e BACE1, ou em que o anticorpo multiespecífico se liga tanto a TfR e Abeta.
  51. 51. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 39 a
    50, caracterizado pelo anticorpo não inibir a ligação de TfR a transferrina.
  52. 52. USO DE UM ANTICORPO que se liga com baixa afinidade a um TfR, conforme definido em uma das reivindicações 1 a 51, caracterizado
    Petição 870160021356, de 19/05/2016, pág. 44/217
    10/10 por ser para a fabricação de um medicamento para tratar um distúrbio neurológico, em que uma ou mais propriedades do anticorpo tenha sido modicada para reduzir o impacto do anticorpo nos níveis de reticulócitos e/ou reduzir a gravidade ou presença de sintomas clínicos agudos.
  53. 53. USO DE UM ANTICORPO, conforme definido em uma das reivindicações 39 a 51, caracterizado por ser para a fabricação de um medicamento para tratar uma disfunção neurológica.
  54. 54. ANTICORPO, que se liga com baixa afinidade a um TfR, caracterizado por ser para uso em tratamento de uma disfunção neurológica, em que uma ou mais propriedades do anticorpo tenha sido modificada para reduzir o impacto do anticorpo nos níveis de reticulócitos e/ou reduzir a gravidade ou presença de sintomas clínicos agudos.
  55. 55. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 39 a
    51, caracterizado por ser para uso no tratamento de um distúrbio neurológico.
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