CN113474369A - 转铁蛋白受体结合分子、其偶联物和它们的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及结合TfR的仅含重链的骆驼抗体的可变结构域(VHH)分子及其用途，例如在包括癌症在内的病理状况下将具有药物或诊断意义的分子运输到细胞和器官中的用途。

Description

转铁蛋白受体结合分子、其偶联物和它们的用途

本发明涉及转铁蛋白受体(TfR)结合分子及其用途。具体来说，本发明涉及结合细胞膜表面例如血脑屏障(BBB)处的TfR的仅含重链的骆驼抗体的可变结构域(VHH)的分子及其用途，例如将具有药物或诊断意义的分子运输到中枢神经系统或表达TfR的组织或器官例如癌症的细胞中的用途。

背景技术

据全球工业分析师(Global Industry Analysts)统计，2015年全球治疗中枢神经系统(CNS、脑和脊髓)疾病的药物市场规模约为1000亿美元，该量中的近90亿美元代表了源于药物递送技术的产品(Jain,2008，“Jain PharmaBiotech报告，CNS障碍中的药物递送”(Jain PharmaBiotech Report,Drug Delivery in CNS disorder))。因此，神经病学是当今三大治疗领域之一，与心血管医学和肿瘤学并驾齐驱。尽管全世界患有CNS障碍和疾病的人数高于患有心血管疾病或癌症的人数，但神经病学仍然是一个欠发达的市场。这由98％的用于治疗CNS疾病的潜在药物不能跨越BBB这一事实来解释(Pardridge,2003,Mol.Interv.,3,90-105)。

事实上，大脑受到两个主要生理屏障系统的保护而免受潜在有毒物质的侵害：BBB和血脑脊液屏障(BCSFB)。BBB被认为是摄取血浆配体的主要途径。它的表面积大约是BCSFB的5000倍。组成BBB的血管的总长度约为600km。每cm³的大脑皮层含有相当于1km的血管。BBB的总表面积据估计为20m²(De Boer等，2007,Clin.Pharmacokinet.,46(7),553-576)。因此，构成BBB的脑内皮代表了血液与神经组织之间的大的潜在交换表面。然而，这种脑内皮由于其特殊的性质，也是使用药物治疗CNS障碍的主要阻碍。

事实上，BBB由脑毛细血管内皮细胞(BCEC)组成，这些细胞具有独特的特性，在构成其他器官血管系统的有孔内皮细胞中不存在。BCEC形成紧密连接，它们被基底层、星形胶质细胞末端足、周细胞和小神经胶质细胞以及神经元细胞包围，所有这些一起构成了非常具有选择性的屏障，其控制血液与大脑之间的分子交换，维持大脑稳态，并非常有效地保护大脑免受毒素和病原体的侵害。缺点是BBB对包括药物和成像药剂在内的大多数分子来说也是不可渗透的。一般来说，只有大约450至600道尔顿的少数亲脂性小分子可以通过BBB(仅占所有药物候选物的2％)，大多数(如果不是所有的)在治疗CNS障碍的体外研究和动物研究中显示出有希望的结果的更高分子量的分子例如治疗性肽、蛋白质、抗体，不能通过BBB。

因此，BBB被认为是在开发治疗CNS障碍的新疗法中需要克服的主要障碍(Neuwelt等，2008,Lancet Neurol.,7,84-96)。与用于治疗、诊断或成像CNS疾病的分子的发现相关的优先研究课题之一是开发允许/增加活性物质通过BBB的策略。

避开BBB的一种方法是通过直接注射到CNS中(例如脑室内、脑内或鞘内)进行给药，或破坏BBB。然而，这种高度侵入性的方法具有缺点(例如成本高、效果短)和潜在的风险。

已设想了基于向活性物质添加脂质或亲脂性基团(跨细胞亲脂性扩散，TLD)或使用脂质体(Zhou等，1992,J.Control.Release,19,459-486)的药理学策略。然而，脂质或亲脂性基团的添加或脂质体的使用常常产生超过450道尔顿的最佳限度的大型非特异性复合物，这对于跨越BBB来说相对无效(Levin,1980,J.Med.Chem.,23,682-684；Schackert等，1989,Selective Cancer Ther.,5,73-79)。

在所评估的用于将蛋白质治疗剂递送到大脑中的策略中，劫持参与天然营养物和内源性配体跨BBB运输的细胞机制似乎是最安全且最有效的(Fang等，2017；Jones和Shusta，2007；Pardridge等，1992)。大分子跨BBB的运输可以通过受体介导的转胞吞作用(RMT)来促进，这是一种涉及配体与其由BCEC表达的受体的结合，通过内吞作用进行内化，细胞内运输和在分拣内体中从受体解离，然后在BBB的近腔侧释放的生理过程(Tuma和Hubbard，2003；Xiao和Gan，2013)。在这一方面，WO2010/046588和WO2011/131896公开了对LDL受体具有高亲和性的各种不同的肽，它们能够将药物或其他分子跨越BBB运输。

所研究的用于跨越BBB运输药物的另一种受体是转铁蛋白受体(TfR)，它通过其配体转铁蛋白(Tf)参与将铁运输到大脑中(Fishman等，1987)。已显示这种受体在脑内皮中高表达(Jefferies等，1984；Pardridge等，1987)，尽管它在血细胞和肺中也很丰富(Chan和Gerhardt，1992)。尽管已研究了将Tf用作转运蛋白(Chang等，2009；Jain等，2011；Yan等，2013)，但这种分子的转运机制是可饱和的，并与内源Tf竞争。已研究了抗TfR单克隆抗体作为用于脑递送的载体，包括靶向大鼠TfR的OX26抗体((Moos和Morgan，2001；Pardridge等，1991；Ulbrich等，2009)或靶向小鼠TfR的8D3(Pardridge,2015；Zhang和Pardridge，2005；Zhou等，2010)和R17-217抗体(Lee等，2000；Pardridge，2015；Ulbrich等，2009)(也参见WO2012075037、WO2013177062、WO201275037、WO2016077840、WO2016208695)。然而，这些抗体的缺点包括它们无跨物种反应性，尤其是它们不与人类TfR结合，这阻碍了临床前或临床研究。此外，此类抗体有效地跨BBB运输药物的能力仍存在争议。

因此，尽管在本领域中已取得进步，但本领域中对能够改善药物进入CNS的其他有效方法和药剂仍存在着需求。

发明内容

本发明提供了可用于将分子有效地跨越BBB运输的新的结合分子。更具体来说，本发明公开了结合人类和非人类TfR两者，并且可以通过转胞吞作用将药物递送到CNS的VHH分子。本发明证实了本发明的VHH分子可以有效地通过CNS迁移并在体内递送偶联药物或成像药剂。因此，这种VHH代表了用于治疗或诊断方法的有价值的分子。

因此，本发明的一个目的涉及结合人类和非人类TfR的VHH分子。

本发明的另一个目的涉及以基本上相近的亲和性结合人类和非人类(例如啮齿动物例如鼠类或大鼠)TfR两者的VHH分子。

本发明的另一个目的是一种结合人类和非人类TfR并且可以跨越人类血脑屏障(“BBB”)的VHH分子。

本发明的优选VHH结合人类和鼠类TfR两者，可以跨越人类BBB，并且对TfR具有低于10μM、优选地0.1nM至10μM之间的亲和性(Kd)。

本发明还涉及包含偶联到至少一个分子或支架的一个或多个如上所定义的VHH的嵌合药剂(在本文中也可互换地称为“偶联物”)。所述偶联到VHH的分子可以例如是在医学中有用的任何活性化合物，例如药物、病毒、诊断药剂、示踪剂等。除了所述活性化合物之外或代替所述活性化合物，所述嵌合药剂还可以含有稳定化基团(例如Fc或IgG)，以提高所述VHH或偶联物的血浆半衰期。因此，本发明的特定嵌合药剂以任何顺序包含至少一个VHH、稳定化基团和活性化合物(例如偶联物VHH-Fc-治疗剂)。

本发明还提供了药物或诊断组合物，其包含如上所定义的嵌合药剂和任选的适合的赋形剂。

本发明还提供了编码如上所定义的VHH或嵌合药剂的核酸、载体和宿主细胞。

本发明还提供了制造VHH或嵌合药剂的方法，所述方法包括将如上所定义的宿主细胞在允许所述核酸表达的条件下培养。

本发明还提供了制造嵌合药剂的方法，所述方法包括将一个或多个如上所定义的VHH共价或非共价偶联到分子或药剂或支架。

本发明的另一个目的涉及如上所定义的VHH分子或嵌合药剂，其用作药物或诊断药剂。

本发明的另一个目的涉及如上所定义的VHH分子的用途，其用于提高感兴趣的物质的生物活性和/或CNS递送。

本发明的另一个目的涉及一种用于改善或允许分子跨越BBB的方法，所述方法包括将所述分子偶联到如上所定义的VHH。

本发明的另一个目的是一种在对象中治疗疾病的方法，所述方法包括向所述对象给药如上所定义的偶联物。

本发明的另一个目的是一种在对象中对特定细胞类型、靶组织或器官成像的方法，所述方法包括向所述对象给药如上所定义的偶联物。

本发明的另一个目的是一种使用药物在对象中治疗疾病的改进的方法，所述改进在于将所述药物偶联到如上所定义的VHH分子。

本发明可以在任何哺乳动物、特别是任何人类中使用。

附图说明

图1.TfR在BBB处的表达。对来自于小鼠、大鼠、猪和非人类灵长动物(NHP；恒河猴)的脑微血管(BMV)和脑微血管内皮细胞(BMEC)的膜级分进行Western印迹。载样的蛋白质的量在照片下方注明。n-d：未消化的；dig-：消化的。

图2.表达人类或小鼠TfR的CHO细胞系的确认。(A)用于产生CHO-hTfR-EGFP细胞系的质粒构建物的图谱。(B)在37℃下与Tf-Alexa647(250μg/ml，红色)温育1小时的CHO-hTfR-EGFP细胞(绿色)的代表性共聚焦显微照片。细胞核用0.5μg/mL的Hoechst#33342标记(蓝色)。在合并的图片中共标记显示为黄色。(C)使用兔抗TfR抗体(1/1000)或小鼠抗GFP抗体(1/1000)，然后使用HRP偶联的抗兔或抗小鼠第二抗体(1/10000)，对表达hTfR-EGFP和mTfR-EGFP的CHO细胞的细胞膜制备物进行的Western印迹，并与CHO WT进行比较。

图3.VHH A和VHH Z在表达hTfR和mTfR的CHO细胞上的细胞表面结合和内吞作用。在37℃下与20μg/ml的VHH A(A、B)和对照VHH Z(C、D)温育1小时，在PFA固定后并在使用或不使用triton X-100将细胞膜通透化后，用小鼠抗cMyc抗体(1/1000)和Alexa594偶联的抗小鼠第二抗体(1/800，红色)检测的CHO-hTfR-EGFP和CHO-mTfR-EGFP细胞(绿色)的代表性共聚焦显微照片。细胞核用0.5μg/ml的Hoechst#33342标记(蓝色)。在合并的图片中共标记显示为黄色/橙色。

图4.VHH在表达hTfR和mTfR的CHO细胞系上的表观K_d的确定。(A)将CHO-hTfR-EGFP和CHO-mTfR-EGFP细胞与各种不同浓度的VHH在4℃下温育1小时，用小鼠抗6His抗体(1/1000)和Alexa647偶联的抗小鼠第二抗体(1/200或1/400)检测。测量使用流式细胞术进行。将每个点的荧光强度比率用相应的EGFP信号(受体表达)进行归一化并得到任意单位。数据被呈现为3个独立实验的平均值±SEM。(B)所选VHH的特征：分子量(Da)；理论pI；对人类TfR的表观K_d(nM)；对小鼠TfR的表观K_d(nM)。数据被呈现为3个独立实验的平均值±SEM。NB：无结合。

图5.VHH与Tf之间的竞争性测定法。(A)竞争性试验的原理。在第一步中，将CHO-hTfR-EGFP细胞与连续稀释的竞争物在4℃下温育1小时。其次，添加EC90的示踪剂，并在4℃下温育1小时。然后使用适合的揭示系统揭示示踪剂。测量使用流式细胞术进行。将每个点的荧光强度比率用相应的EGFP信号(受体表达)进行归一化并得到任意单位。(B)将CHO-hTfR-EGFP细胞与竞争物(Tf)温育。然后添加EC90的示踪剂(VHH)，并使用小鼠抗cMyc抗体(1/50)和Alexa647偶联的抗小鼠第二抗体(1/200)检测。(C)将CHO-hTfR-EGFP细胞与竞争物(VHH)温育。然后添加EC90的示踪剂(Tf-Alexa647)并直接检测。数据被呈现为3个独立实验的平均值±SEM。

图6.VHH偶联策略。使用化学偶联或重组融合，VHH可用于将非穷举性地包括肽、siRNA、染料、纳米粒子(NP)、脂质体、成像药剂和抗体的所有种类的分子载体化。此外，VHH可用于将分子载体化成单价(VHH)或多价(VHH_n)偶联物。

图7.VHH A-Fc和VHH Z-Fc融合蛋白在表达hTfR和mTfR的CHO细胞上的细胞表面结合和内吞作用。在37℃下与50nM VHH A-Fc(A、B)和对照VHH Z-Fc(C、D)温育1小时，在PFA固定后并在使用或不使用triton X-100将细胞膜通透化后，用Alexa594偶联的抗hFc抗体(1/1000，红色)检测的CHO-hTfR-EGFP和CHO-mTfR-EGFP细胞(绿色)的代表性共聚焦显微照片。细胞核用0.5μg/ml的Hoechst#33342标记(蓝色)。在合并的图片中共标记显示为黄色/橙色。

图8.VHH-Fc和Fc-VHH在表达hTfR和mTfR的CHO细胞系上的表观K_d的确定。(A)将CHO-hTfR-EGFP和CHO-mTfR-EGFP细胞与各种不同浓度的VHH-Fc或Fc-VHH在4℃下温育1小时，用Alexa647偶联的抗hFc抗体(1/400)检测。测量使用流式细胞术进行。将每个点的荧光强度比率用相应的EGFP信号(受体表达)进行归一化并得到任意单位。数据被呈现为3个独立实验的平均值±SEM。(B)所选VHH-Fc和Fc-VHH的特征：分子量(Da)；对人类TfR的表观K_d(nM)；对小鼠TfR的表观K_d(nM)。数据被呈现为3个独立实验的平均值±SEM。NB：对于对照VHH(VHH Z)来说无结合。

图9.VHH A-Fc和VHH B-Fc融合蛋白在体外BBB模型中的摄取和运输。(A)探测大鼠脑微血管内皮细胞(rBMEC)单层对VHH A-Fc和VHH B-Fc的摄取的代表性显微照片，将500nMVHH A-Fc和VHH B-Fc与200nM的Tf-Alexa647(红色)在活细胞上温育2小时，在PFA固定并用triton X-100将细胞膜通透化后，用Alexa488偶联的抗hFc抗体(1/50，绿色)检测。细胞核用0.5μg/ml的Hoechst#33342标记(蓝色)。在合并的图片中共标记显示为黄色。(B)体外BBB模型的示意图，这是一种共培养系统，上层区室(1)中是铺于IV型胶原蛋白/纤连蛋白包被的滤膜上的原代rBMEC，下层区室(2)中是原代星形胶质细胞。(C,D)VHH A-Fc、VHH B-Fc和VHH Z-Fc融合蛋白跨越rBMEC单层从腔内(上方)向近腔(下方)区室的运输。(C)将10nM的VHH A-Fc、VHH B-Fc和VHH Z-Fc在腔内区室中温育24小时，并评估向近腔区室的运输(被命名为24小时)。然后将含有VHH-Fc溶液的插板转移到另一个含有新鲜运输缓冲液的96孔板，用于另一个48小时的向近腔区室的运输时段(被命名为+48小时)。(D)(C)中描述的实验的动力学呈现(72小时运输是24小时和48小时运输时段之和)。近腔区室中Fc片段的含量使用内部自制的抗Fc ELISA测定法来定量。将吸光度单位转换成每个插板的飞摩尔数(96孔板的插板的表面积为0,143cm²)。对每种偶联物来说，分析了至少12个插板的三个独立实验。数据被呈现为平均值±SEM(***p≤0.001)。

图10.在注射后(p.i.)2和24小时，VHH-Fc融合蛋白在WT C57Bl/6小鼠中的分布。将VHH A-Fc、VHH A-Fc-Agly和VHH Z-Fc融合体以5mg/kg的剂量注射到尾静脉中，并在注射后2或24小时，在收集血浆后将小鼠用盐水灌注。在注射后15分钟和6小时，也使用眶后采样收集中间血浆样品。对脑进行处理以将脑实质与毛细血管分离。每种组织中VHH-Fc的量使用内部自制的抗Fc ELISA测定法来评估。数据被呈现为血浆(A)、实质(B)和微血管(C)中VHH-Fc浓度的平均值±SEM或实质与血浆比率(D)和微血管与血浆比率(E)的平均值±SEM。(每个时间点每组4<n<12；*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001)。

图11.VHH A1至A9在稳定表达hTfR和mTfR的CHO细胞系上的表观K_d的确定。(A)将CHO-hTfR-EGFP和CHO-mTfR-EGFP细胞与各种不同浓度的VHH在4℃下温育1小时，用小鼠抗6His抗体(1/1000)和Alexa647偶联的抗小鼠第二抗体(1/400)检测。测量使用流式细胞术进行。将每个点的荧光强度比率用相应的EGFP信号(受体表达)进行归一化并得到任意单位。数据被呈现为3个独立实验的平均值±SEM。(B)VHH的特征：分子量(Da)；理论pI；对人类TfR的表观K_d(nM)；对小鼠TfR的表观K_d(nM)。数据被呈现为3个独立实验的平均值±SEM。NB：无结合；LB：低结合。

图12.VHH A10至A19在稳定表达hTfR和mTfR的CHO细胞系上的表观K_d的确定。(A)将CHO-hTfR-EGFP和CHO-mTfR-EGFP细胞与各种不同浓度的VHH在4℃下温育1小时，用小鼠抗6His抗体(1/1000)和Alexa647偶联的抗小鼠第二抗体(1/400)检测。测量使用流式细胞术进行。将每个点的荧光强度比率用相应的EGFP信号(受体表达)进行归一化并得到任意单位。数据被呈现为3个独立实验的平均值±SEM。(B)VHH的特征：分子量(Da)；理论pI；对人类TfR的表观K_d(nM)；对小鼠TfR的表观K_d(nM)。数据被呈现为3个独立实验的平均值±SEM。NB：无结合。

图13. 13C3-HC-VHH融合体在表达hTfR和mTfR的CHO细胞系上的表观K_d的确定。(A)将CHO-hTfR-EGFP和CHO-mTfR-EGFP细胞与各种不同浓度的13C3融合体在4℃下温育1小时，并用Alexa647偶联的抗小鼠抗体(1/400)检测。测量使用流式细胞术进行。将每个点的荧光强度比率用相应的EGFP信号(受体表达)进行归一化并得到任意单位。数据被呈现为3个独立实验的平均值±SEM。(B)13C3融合体的特征：分子量(Da)；对人类TfR的表观K_d(nM)；对小鼠TfR的表观K_d(nM)。数据被呈现为3个独立实验的平均值±SEM。NB：无结合；LB：低结合。

图14.在注射后(p.i.)2和6小时，13C3单克隆抗体和13C3-HC-VHH融合体在WTC57Bl/6小鼠中的分布。将13C3、13C3-HC-VHH A和13C3-HC-VHH A1以35纳摩尔/kg的剂量注射到尾静脉中，并在注射后2或6小时将小鼠用盐水灌注。对脑进行处理以将脑实质与毛细血管分离。每种组织/区室中13C3和13C3-HC-VHH A/A1的量使用合格的Meso ScaleDiscovery(MSD)直接包被(Abeta)免疫测定法来评估(％CV<20％，并且回收率±30％)。数据被呈现为整个脑(A)和实质(B)中13C3和13C3-HC-VHH A/A1浓度的平均值±SEM(每个时间点每组1<n<4；*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001)。

图15.VHH-siGFPst1生物偶联物的体外基因沉默活性。(A)VHH A-siGFPst1和VHHB-siGFPst1生物偶联物结合hTfR。将CHO-hTfR-EGFP细胞与各种不同浓度的所指示的化合物在4℃下温育1小时。VHH的检测使用小鼠抗6His第一抗体(1/1000)和Alexa647偶联的抗小鼠第二抗体(1/400)来进行。与VHH相关的细胞表面信号的测量使用流式细胞术进行。结果被表示成测试化合物的Alexa647相关的荧光强度与背景荧光的强度之比。(B)VHH A-siGFPst1生物偶联物表现出基因沉默功效。使用Dharmafect 1(Dharmacon)，将CHO-hTfR-EGFP细胞用25nM所指示的化合物在37℃下转染72h。然后使用流式细胞术定量与EGFP蛋白相关的总荧光，并针对未处理的(对照)细胞的荧光(设定为100％)进行有理化。***p<0.001。(C)在直接递送到胞质溶胶中之后，VHH A-siGFPst1生物偶联物在皮摩尔范围内表现出固有的基因沉默活性。使用Dharmafect 1(Dharmacon)，将CHO-hTfR-EGFP细胞用各种不同浓度的VHH A-siGFPst1生物偶联物在37℃下转染120小时。然后使用流式细胞术定量与EGFP蛋白相关的总荧光，并针对未处理的(对照)细胞的荧光(设定为100％)进行有理化。使用GraphPad

软件将数据用非线性回归进行拟合(实线)，以估算IC50(允许GFP蛋白水平降低50％的浓度)和最大效果(底部平台)。(D)VHH A-siGFPst1生物偶联物引发特异性且高效的TfR介导的基因沉默。将CHO-hTfR-EGFP细胞与1μM的所指示的化合物在37℃下温育120小时。如(B)中所述对数据进行处理和分析。***p<0.001，相对于未处理的细胞。(E)hTfR介导的VHH A-siGFPst1生物偶联物的结合和摄取允许胞质溶胶递送和随后在纳摩尔浓度下的基因沉默。将CHO-hTfR-EGFP细胞与各种不同浓度的VHH A-siGFPst1生物偶联物在37℃下温育120小时。然后使用流式细胞术定量与EGFP蛋白相关的总荧光，并针对未处理的(对照)细胞的荧光(设定为100％)进行有理化。如(C)中所述对数据进行处理和分析。(F)VHH A-siGFPst1生物偶联物的基因沉默效果受到与过量游离的结合TfR的VHH A和B而不是与无关的VHH Z的共温育的抑制。将CHO-hTfR-EGFP细胞与30nM的VHH A-siGFPst1单独地或在100X过量的游离VHH A、B或Z存在下在37℃温育120小时。如(C)中所述对数据进行处理和分析。(G)细胞在短的6小时脉冲期间暴露于VHH A-siGFPst1生物偶联物足以引发高效的基因沉默。在短的6小时脉冲期间将CHO-hTfR-EGFP细胞与各种不同浓度的VHH A-siGFPst1生物偶联物温育，然后在无配体培养基中追踪长达120小时。如(B)中所述对数据进行处理和分析。(H)VHH B-siGFPst1生物偶联物的基因沉默效果与使用VHH A-siGFPst1所观察到的效果相似。将CHO-hTfR-EGFP细胞与30nM(基于使用VHH A-siGFPst1获得的IC50的饱和浓度)的VHH A-siGFPst1或VHH B-siGFPst1在37℃下温育120小时。如(C)中所述对数据进行处理和分析。

图16.在成胶质细胞瘤的皮下小鼠模型中VHH A-68Ga生物偶联物的PET成像。(A)VHH A-NODAGA和VHH A-68Ga生物偶联物与未偶联的VHH A化合物同样高效地结合hTfR。将CHO-hTfR-EGFP细胞与各种不同浓度的所指示的化合物在4℃下温育1小时。VHH的检测使用小鼠抗6His第一抗体(1/1000)和Alexa647偶联的抗小鼠第二抗体(1/400)来进行。与VHH相关的细胞表面信号的测量使用流式细胞术来进行。结果被表示成测试化合物的Alexa647相关的荧光强度与背景荧光的强度之比。(B)在用U87-MG细胞移植后第28天，用VHH A-68Ga给药的小鼠的PET成像(注射后2小时)。成胶质细胞瘤用矢状面中的圆圈标注。

具体实施方式

本发明提供了新的TfR结合剂，其可用于跨越BBB运输诸如治疗、成像或诊断药剂的分子。更具体来说，本发明公开了结合TfR的改进的VHH分子及其用途。

TfR参与被其转铁蛋白配体运输的铁的并入以及细胞生长的调控(Neckers和Trepel 1986，Ponka和Lok 1999)。存在两种类型的转铁蛋白受体：TfR1受体和主要在肝脏中表达的同源受体TfR2。在本发明的上下文中，术语TfR被用于表示TfR1同源物。

TfR是一种II型同二聚体跨膜糖蛋白，由通过两个二硫桥相连的两个相同的90kDa亚基构成(Jing和Trowbridge 1987，McClelland等，1984)。每个单体具有61个氨基酸的含有YTRF(酪氨酸-苏氨酸-精氨酸-苯丙氨酸)内化基序的短的胞质N-端结构域、27个氨基酸的单一疏水跨膜区段和670个氨基酸的含有胰蛋白酶切割位点和转铁蛋白结合位点的大的C-端细胞外结构域(Aisen，2004)。每个亚基能够结合转铁蛋白分子。所述细胞外结构域具有一个O-糖基化位点和三个N-糖基化位点，后者对于正确折叠和受体向细胞膜的运输来说特别重要(Hayes等，1997)。在膜内结构域中还存在棕榈酰化位点，其据推测锚定受体并允许其内吞(Alvarez等，1990，Omary和Trowbridge，1981)。此外，存在细胞内磷酸化位点，其功能不确定并且在内吞中不发挥作用(Rothenberger等，1987)。

TfR受体被不论是健康的还是赘生的高增殖细胞高水平表达(Gatter等，1983)。许多研究显示，与健康细胞相比，在癌细胞中TfR的表达水平高。因此，诸如乳腺癌(Yang等，2001)、神经胶质瘤(Prior等，1990)、肺腺癌(Kondo等，1990)、慢性淋巴细胞白血病(DasGupta和Shah，1990)或非霍奇金淋巴瘤(Habeshaw等，1983)的疾病显示出提高的TfR表达，与肿瘤等级和疾病阶段或预后相关。

因此，将药物靶向TfR可能适合于癌症治疗以及跨越BBB。

使用来自于表达高水平hTfR和mTfR的细胞的纯化的膜制备物，我们产生并选择了结合人类和非人类TfR两者的VHH分子。我们显示，当与人类IgG1 Fc区或药物(例如抗体、siRNA)或成像药剂融合时，这些VHH分子保留了TfR结合能力，跨越体外BBB模型迁移，并在体内表现出脑靶向性质。我们还显示，当与siRNA或NODAGA支架融合时，这些VHH分子在体内保留了TfR结合能力和高效的细胞和器官递送。所述VHH分子表现出适合的亲和力和特异性水平，以在TfR结合后经历适合的内吞作用。因此，本发明提供了新的TfR结合分子，其代表了用于药物靶向的有价值的药剂。

因此，本发明的一个目的涉及VHH分子，其中所述VHH分子结合人类和非人类(例如啮齿动物，例如大鼠或鼠类)TfR两者。优选地，所述VHH可以跨越人类BBB或结合表达TfR的组织例如癌症。本发明还涉及包含此类VHH的嵌合药剂、它们的制造、包含它们的组合物及其用途。

VHH分子

VHH分子对应于天然不含轻链的仅含重链的骆驼抗体的可变区。VHH具有15kDa左右的非常小的尺寸。它们含有可以使用单个结构域结合其同源抗原的单链分子。VHH的抗原结合表面与通常平坦或凹陷的常规抗体的抗原结合表面相比通常更加凸起(或突出)。更具体来说，VHH由序列和结构被定义为保守的4个构架区(或FR)和在序列内容和结构构象两方面显示出高度可变性的3个互补决定区(或CDR)组成，所述CDR参与抗原结合并提供抗原特异性。与常规人类抗体VH相比，在VHH的FR2区和互补决定区(CDR)中几个氨基酸被替换。例如，FR2区中高度保守的疏水性氨基酸(例如Val47、Gly49、Leu50和/或Trp52)通常被亲水性氨基酸(Phe42、Glu49、Arg50、Gly52)代替，使整个结构更加亲水，并且对高稳定性、溶解性和对聚集的抗性有贡献。

根据本发明所述的VHH分子是包含仅含重链的抗体(HcAb)的抗原结合结构域(或由所述结构域或基本上由所述结构域构成)的多肽。

为了产生具有适合性质的VHH分子，本发明人测试了来自于通过用TfR免疫原免疫美洲驼而产生的VHH文库的超过700种结合TfR的VHH。在分析所述克隆的结合和特异性后，本发明人进一步选择了具有所需亲和性、特异性和跨物种结合的大约100个克隆。将所述克隆全部测序，并分析和比较它们的结构。通过突变产生了其他具有受控/改进的结合性质的VHH。相关结构域和优选VHH的序列被提供在实验部分和序列表中。VHH及其偶联物的性质也在实验部分中说明。

本发明的VHH分子通常包含下式或由其构成：

FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，

其中FRn表示构架区，CDRn表示互补决定区。

在特定实施方式中，本发明的VHH分子包含的CDR1结构域包含选自SEQ ID NO：1、5、9、13、17、19、67或69的氨基酸序列或其在整个长度范围内与所述序列中的任一者具有至少75％、优选地至少85％的氨基酸同一性的变体，或由所述氨基酸序列或其变体构成，所述变体保留了TfR结合能力。本发明的优选VHH分子包含的CDR1结构域具有选自SEQ ID NO：1、5、9、13、17、19、67或69的氨基酸序列或其具有至多1个氨基酸修饰的变体。

氨基酸(或核酸)序列之间的“同一性％”可以通过本身在本领域中已知的技术来确定。通常，两个核酸或氨基酸序列之间的同一性％利用计算机程序例如提供在GCG程序包中的GAP来确定(Program Manual for the Wisconsin Package,第8版,1996年8月,Genetics Computer Group,575Science Drive,美国威斯康辛州麦迪逊，53711)(Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.，(1970)，Journal of Molecular Biology,48,443-453)。两个序列之间的同一性％是指在所述序列的整个长度范围内的同一性。

本发明的VHH分子的具体实例包含的CDR1序列包含SEQ ID NO：1、5、9、13、17、19、67或69或基本上由它们构成。

在另一个特定实施方式中，本发明的VHH分子包含的CDR2结构域包含选自SEQ IDNO：2、6、10、14、21、23、71、73或75的氨基酸序列或其在整个长度范围内与所述序列中的任一者具有至少70％、优选地至少85％的氨基酸同一性的变体，或由所述氨基酸序列或其变体构成，所述变体保留了TfR结合能力。本发明的优选VHH分子包含的CDR2结构域具有选自SEQ ID NO：2、6、10、14、21、23、71、73或75的氨基酸序列或其具有至多1个氨基酸修饰的变体。

本发明的VHH分子的具体实例包含的CDR2序列包含SEQ ID NO：2、6、10、14、21、23、71、73或75或基本上由它们构成。

在另一个特定实施方式中，本发明的VHH分子包含的CDR3结构域包含选自SEQ IDNO：3、7、11、15、25、27、29、31、33、77、79、81、83或85的氨基酸序列或其在整个长度范围内与所述序列中的任一者具有至少60％、优选地至少80％、更优选地至少85％的氨基酸同一性的变体，或由所述氨基酸序列或其变体构成，所述变体保留了TfR结合能力。本发明的优选VHH分子包含的CDR3结构域具有选自SEQ ID NO：3、7、11、15、25、27、29、31、33、77、79、81、83或85的氨基酸序列或其具有至多1个氨基酸修饰的变体。

本发明的VHH分子的具体实例包含的CDR3序列包含SEQ ID NO：3、7、11、15、25、27、29、31、33、77、79、81、83或85或基本上由它们构成。

在另一个特定实施方式中，本发明的VHH分子包含：

.CDR1结构域，包含选自SEQ ID NO：1、5、9、13、17、19、67或69的氨基酸序列或其在整个长度范围内与所述序列中的任一者具有至少75％、优选地至少85％、更优选地至少95％的氨基酸同一性的变体，或由所述氨基酸序列或其变体构成；和

.CDR2结构域，包含选自SEQ ID NO：2、6、10、14、21、23、71、73或75的氨基酸序列或其在整个长度范围内与所述序列中的任一者具有至少70％、优选地至少85％、更优选地至少95％的氨基酸同一性的变体，或由所述氨基酸序列或其变体构成；和

.CDR3结构域，包含选自SEQ ID NO：3、7、11、15、25、27、29、31、33、77、79、81、83或85的氨基酸序列或其在整个长度范围内与所述序列中的任一者具有至少60％、优选地至少80％、更优选地至少95％的氨基酸同一性的变体，或由所述氨基酸序列或其变体构成，

所述VHH具有TfR结合能力。

在优选实施方式中，本发明的VHH分子包含：

.CDR1结构域，具有选自SEQ ID NO：1、5、9、13、17、19、67或69的氨基酸序列，或其具有至多1个氨基酸修饰的变体；和

.CDR2结构域，具有选自SEQ ID NO：2、6、10、14、21、23、71、73或75的氨基酸序列，或其具有至多1个氨基酸修饰的变体；和

.CDR3结构域，具有选自SEQ ID NO：3、7、11、15、25、27、29、31、33、77、79、81、83或85的氨基酸序列，或其具有至多1个氨基酸修饰的变体。

在更优选实施方式中，本发明的VHH分子包含CDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR1、CDR2和CDR3结构域分别包含下述序列或由其构成：

.SEQ ID NO：1、2和3；或

.SEQ ID NO：17、2和3；或

.SEQ ID NO：19、2和3；或

.SEQ ID NO：67、2和3；或

.SEQ ID NO：69、2和3；或

.SEQ ID NO：1、21和3；或

.SEQ ID NO：1、23和3；或

.SEQ ID NO：1、71和3；或

.SEQ ID NO：1、73和3；或

.SEQ ID NO：1、75和3；或

.SEQ ID NO：1、2和25；或

.SEQ ID NO：1、2和27；或

.SEQ ID NO：1、2和29；或

.SEQ ID NO：1、2和31；或

.SEQ ID NO：1、2和33；或

.SEQ ID NO：1、2和77；或

.SEQ ID NO：1、2和79；或

.SEQ ID NO：1、2和81；或

.SEQ ID NO：1、2和83；或

.SEQ ID NO：1、2和85；或

.SEQ ID NO：5、6和7；或

.SEQ ID NO：9、10和11；或

.SEQ ID NO：13、14和15，或

如上所定义序列的变体。

本发明的优选VHH分子包含如下所定义的FR结构域。

在特定实施方式中，所述FR1结构域包含如下所表示的SEQ ID NO：35或其在整个长度范围内与该序列具有至少85％、优选地至少90％、更优选地至少95％的氨基酸同一性的变体，或由所述序列或其变体构成：

更优选地，所述粗体氨基酸残基存在，并且变异只发生在其他位置上。

在特定实施方式中，第1位中的E可以被Q代替。

在特定实施方式中，第5位中的V可以被Q代替。

在特定实施方式中，第6位中的E可以被Q代替。

在特定实施方式中，第10位中的G可以被K或A代替。

在特定实施方式中，第11位中的L可以被V或E代替。

在特定实施方式中，第23位中的A可以被V或T代替。

更优选地，参比于该序列，在非粗体氨基酸残基中，所述FR1含有至多4个、甚至更优选地至多3个、甚至更优选地至多2个氨基酸修饰。

在另一个特定实施方式中，所述FR1具有选自下面列出的氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列：

EVQLVESGGGVVQPGGSLKLSCVAS(SEQ ID NO：36)

EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAAS(SEQ ID NO：37)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTAS(SEQ ID NO：38)

EVQLVESGGGEVQPGGSLKLSCVAS(SEQ ID NO：39)。

在特定实施方式中，本发明的VHH分子包含的FR2结构域包含如下所表示的SEQ IDNO：40或其在整个长度范围内与该序列具有至少85％、优选地至少90％或至少95％的氨基酸同一性的变体，或由所述序列或其变体构成：

更优选地，所述粗体氨基酸残基存在，并且变异只发生在其他位置上。

在特定实施方式中，第1位中的M可以被I或V代替。

在特定实施方式中，第2位中的R可以被G代替。

在特定实施方式中，第4位中的Y可以被F代替。

在特定实施方式中，第6位中的Q可以被R代替。

在特定实施方式中，第7位中的A可以被R代替。

在特定实施方式中，第11位中的Q可以被E代替。

在特定实施方式中，第14位中的L可以被F或W代替。

在特定实施方式中，第17位中的T可以被G或S代替。

更优选地，参比于该序列，在非粗体氨基酸残基中，所述FR2含有至多6个、甚至更优选地至多5个、至多3个、甚至更优选地至多2个氨基酸修饰。

在特定实施方式中，本发明的VHH分子在FR2结构域中包含至少一个下述氨基酸：Phe42，Glu49，Arg50或Gly52。

在另一个特定实施方式中，所述FR2具有选自下面列出的氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列：

IRWYRQAPGKQREFVAG(SEQ ID NO：41)

MRWYRQAPGKQREWVAG(SEQ ID NO：42)

MGWFRRAPGKERELVAS(SEQ ID NO：43)

VRWYRQRPGKQREWVAG(SEQ ID NO：44)。

在特定实施方式中，本发明的VHH分子包含的FR3结构域包含如下所表示的SEQ IDNO：45或其在整个长度范围内与该序列具有至少85％、优选地至少90％、更优选地至少95％的氨基酸同一性的变体，或由所述序列或其变体构成：

更优选地，所述粗体氨基酸残基存在，并且变异只发生在其他位置上。

在特定实施方式中，第1位中的Y可以被N代替。

在特定实施方式中，第2位中的Y可以被A代替。

在特定实施方式中，第3位中的A可以被P或I代替。

在特定实施方式中，第4位中的D可以被S代替。

更优选地，参比于该序列，在非粗体氨基酸残基中，所述FR3含有至多7个、甚至更优选地至多6个、至多3个、甚至更优选地至多2个氨基酸修饰。

在另一个特定实施方式中，所述FR3具有选自下面列出的氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列：

NYADSMKGRFTISRDNTKNAVYLQIDSLKPEDTAVYYC(SEQ ID NO：46)

NYPDSAKGRFTISRDNAKNTVYLQIDSLKPEDTAVYYC(SEQ ID NO：47)

YAISSVKGRFTISRDNAENTVFLQMNSLKPDDTAVYYC(SEQ ID NO：48)

NYPDSMKGRFTISRDNAKNTVYLQINSLKSEDTAVYYC(SEQ ID NO：49)。

在特定实施方式中，本发明的VHH分子包含的FR4结构域包含如下所表示的SEQ IDNO：50或其在整个长度范围内与该序列具有至少85％、优选地至少90％、更优选地至少95％的氨基酸同一性的变体，或由所述序列或其变体构成：

更优选地，所述粗体氨基酸残基存在，并且变异只发生在其他位置上。

更优选地，参比于该序列，在非粗体氨基酸残基中，所述FR4含有至多4个、甚至更优选地至多3个、甚至更优选地至多2个氨基酸修饰。

FR4序列的具体说明性实例是SEQ ID NO：50。

本发明的结合TfR的VHH分子的具体实例是包含选自以下序列中的任一者的氨基酸序列或由所述氨基酸序列构成的分子：SEQ ID NO：4(VHH A)、8(VHH B)、12(VHH C)、16(VHH D)、18(VHH A1)、20(VHH A2)、22(VHH A3)、24(VHH A4)、26(VHH A5)、28(VHH A6)、30(VHH A7)、32(VHH A8)、34(VHH A9)、68(VHH A10)、70(VHH A11)、72(VHH A12)、74(VHHA13)、76(VHH A14)、78(VHH A15)、80(VHH A16)、82(VHH A17)、84(VHH A18)、86(VHH A19)、87(VHH A20)、88(VHH A21)、89(VHH A22)、90(VHH A23)、91(VHH A24)和92(VHH A25)，其中x是0。

在特定实施方式中，本发明的VHH被人源化。

对于人源化来说，可以通过一个或多个氨基酸替换对一个或多个FR和/或CDR结构域进行(进一步)修饰。

就此而言，在特定实施方式中，所述VHH通过FR1结构域的修饰(例如氨基酸替换)进行人源化。FR1中的典型人源化位置选自19R和23A或两者(参考例如SEQ ID NO：35-39中的任一者或其变体)。因此，这种人源化FR1的具体实例包括SEQ ID NO：36，其中K19和/或V23分别被修饰成19R和23A。

在另一个特定实施方式中，所述VHH通过CDR1结构域的修饰进行人源化。CDR1中的典型人源化位置(参考例如SEQ ID NO：1、5、9、13、17、19、67或69中的任一者或其变体)是8A。

在另一个特定实施方式中，所述VHH通过FR2结构域的修饰进行人源化。FR2中的典型人源化位置选自1M、2S或2H、4V、11G、12L、14W或其组合(参考例如SEQ ID NO：40-44中的任一者或其变体)。因此，这种人源化FR2的具体实例是SEQ ID NO：41，其中I1、R2、Y4、Q11、R12和F14中的一者或多者或全部分别被修饰成1M、2S或2H、4V、11G、12L和14W。

在另一个特定实施方式中，所述VHH通过CDR2结构域的修饰进行人源化。CDR2中的典型人源化位置(参考例如SEQ ID NO：2、6、10、14、21、23、71、73、75中的任一者或其变体)是1I。

在另一个特定实施方式中，所述VHH通过FR3结构域的修饰进行人源化。FR3中的典型人源化位置选自6V、17A、20T、21L、25M、26N、29R或其组合(参考例如SEQ ID NO：45-49中的任一者或其变体)。因此，这种人源化FR3的具体实例包括SEQ ID NO：46，其中M6、T17、A20、V21、I25、D26和K29中的一种或多种或全部分别被修饰成6V、17A、20T、21L、25M、26N和29R。

在另一个特定实施方式中，所述VHH通过CDR3结构域的修饰进行人源化。CDR3中的典型人源化位置(参考例如SEQ ID NO：3、7、11、15、25、27、29、31、33、77、79、81、83、85中的任一者或其变体)是1A或2R或两者。

在另一个特定实施方式中，所述FR1和/或FR2和/或FR3和/或CDR1和/或CDR2和/或CDR3结构域被人源化。

本发明的人源化的结合TfR的VHH分子的具体实例是包含选自以下序列中的任一者的氨基酸序列或由所述氨基酸序列构成的分子：SEQ ID NO：87(VHH A20)、88(VHH A21)、89(VHH A22)、90(VHH A23)、91(VHH A24)和92(VHH A25)，其中x是0。

在另一个特定实施方式中，所述VHH分子还可以包含适合于例如纯化、偶联等的一个或几个标签。此类标签的实例包括His标签(例如His₆)、Q-标签(LQR)或myc标签(EQKLISEEDL)。通常，所述一个或几个标签位于所述VHH的C-端。

作为示例，所述VHH可以在C-端末端处包含下述另外的序列

其中单下划线是myc标签，双下划线是His标签(其余的残基是连接物或由克隆产生)。

本发明的此类带有标签的结合TfR的VHH分子的具体实例是包含选自以下序列中的任一者的氨基酸序列或由所述氨基酸序列构成的分子：SEQ ID NO：4(VHH A)、8(VHH B)、12(VHH C)、16(VHH D)、18(VHH A1)、20(VHH A2)、22(VHH A3)、24(VHH A4)、26(VHH A5)、28(VHH A6)、30(VHH A7)、32(VHH A8)、34(VHH A9)、68(VHH A10)、70(VHH A11)、72(VHHA12)、74(VHH A13)、76(VHH A14)、78(VHH A15)、80(VHH A16)、82(VHH A17)、84(VHH A18)、86(VHH A19)、87(VHH A20)、88(VHH A21)、89(VHH A22)、90(VHH A23)、91(VHH A24)和92(VHH A25)，其中x是1。

作为另一个示例，本发明的VHH可以包含序列LQR的Q-标签，其优选地位于所述VHH的C-端。

作为另一个示例，本发明的VHH可以包含Gly连接物，其优选地位于所述VHH的C-端。所述Gly连接物可以包含例如2-7个、例如3至6个Gly残基的Gly重复序列。Gly连接物的具体实例包括Gly3、Gly4、Gly5或SerGlySerGly5。

在特定实施方式中，本发明的VHH可以包含Gly连接物和Q-标签，它们优选地位于C-端。此类VHH的更具体实例包含下述结构：VHH-Gly连接物-Q标签，其中所述Gly连接物包含2-6个Gly残基，并且所述Q标签含有LQR或由其构成。

作为示例，所述VHH可以在C-端末端包含下述另外的序列

其中下划线是Q-标签，粗体是Gly连接物。

在另一个特定实施方式中，本发明的VHH可以包含Ala连接物、His标签、Gly连接物和Q-标签。优选地，所述连接物和标签位于所述VHH的C-端。在其他实施方式中，至少所述Q标签可以位于所述VHH的N-端。此类VHH的更具体实例包含下述结构：VHH-Ala连接物-His标签-Gly连接物-Q标签，其中所述Ala连接物包含3个残基，所述His标签包含2-7个His残基，所述Gly连接物包含2-6个Gly残基，并且所述Q标签含有LQR或由其构成。

作为示例，所述VHH可以在C-端末端包含下述另外的序列

其中下划线是Q-标签，粗体是Ala和Gly连接物，双下划线是His标签。

本发明的结合TfR的VHH分子的其他具体实例是竞争性抑制如上所定义的VHH与人类和非人类TfR的结合的VHH分子。术语“竞争性抑制”是指所述VHH可以在体外或体内减少或抑制或取代所述参比VHH与TfR的结合。竞争测定可以使用标准的技术例如竞争性ELISA或其他结合测定法来进行。通常，竞争性结合测定法包含任选地结合到固相基材的表达TfR的重组细胞或膜制备物、未标记的测试VHH(或表达它们的噬菌体)和标记的参比VHH(或表达它们的噬菌体)。竞争性抑制通过在所述测试VHH存在下确定结合的标记的VHH的量来测量。通常，所述测试VHH过量存在，例如为参比VHH的量的5至500倍。通常，对于ELISA来说，所述测试VHH过量100倍。当过量存在的测试VHH抑制或取代所述参比VHH与TfR结合的至少70％时，它被认为竞争性抑制所述参比VHH。优选的竞争VHH结合享有共同氨基酸残基的表位。

正如在实验部分中所示，VHH分子能够在体外和体内结合TfR。它们显示出足够的亲和性，表观Kd在0.1nM至10μM之间，特别是1μM至1nM之间。此外，所有这些分子均结合人类和鼠类TfR两者。此外，所述本发明的VHH与人类TfR受体的结合不竞争内源TfR配体转铁蛋白的结合，因此不影响所述配体的正常功能。已进一步显示使用此类VHH分子产生的偶联物在体外结合TfR并在体内跨越BBB运输到CNS中，显示出转胞吞作用。因此，此类VHH代表了用于药物递送或靶向的强效药剂。

本发明的VHH可以通过本领域技术人员已知的任何技术来合成(化学、生物学或遗传合成等)。它们可以原样保存或在感兴趣的物质或任何可接受的赋形剂存在下配制。

对于化学合成来说，使用商业化装置，它们可以并入天然以及非天然氨基酸，例如D对映异构体和侧链具有不同于它们的天然同系物的疏水性和空间位阻的残基(所谓的外来、即非编码氨基酸)，或含有一个或多个模拟肽键(其尤其可以包括亚甲基(-CH₂-)或磷酸酯(-PO₂-)基团、仲胺(-NH-)或氧(-O-)的嵌入)或N-烷基肽的VHH序列。

在合成期间可以引入各种不同的化学修饰，例如在N-端或C-端位置中或在侧链上放置脂质(或磷脂)衍生物或脂质体或纳米粒子的组成成分，以便能够将本发明的VHH并入到脂质膜例如由一个或多个脂质层或双层构成的脂质体或纳米粒子的脂质膜中。

本发明的VHH也可以从编码它们的核酸序列获得，正如下文进一步描述的。

偶联物

本发明的另一个目的涉及包含偶联到至少一个感兴趣的分子或支架的如上所定义的一个或多个VHH的偶联物(在本文中也可互换地称为“嵌合药剂”)。

所述感兴趣的分子可以是任何分子，例如药品或药物、诊断剂、成像分子、示踪剂等。感兴趣的偶联分子的实例包括但不限于任何化学实体，例如化学小分子(例如抗生素、抗病毒剂、免疫调节剂、抗肿瘤剂、抗炎剂、佐剂等)；肽类、多肽和蛋白质(例如酶、激素、神经营养因子、神经肽、细胞因子、载脂蛋白、生长因子、抗原、抗体或抗体部分、佐剂等)；核酸(例如人类、病毒、动物、真核或原核、植物或合成来源等的RNA或DNA，包括例如编码基因、抑制性核酸例如核酶、反义、干扰性核酸、全基因组或其部分、质粒等)；脂质、病毒、标志物或示踪剂等。通常，所述“感兴趣的分子”可以是任何药物活性成分，不论是化学、生物化学、天然还是合成的化合物。通常，表述“化学小分子”是指最大分子量为1000道尔顿、通常在300道尔顿至700道尔顿之间的具有制药意义的分子。

所述偶联的化合物通常是适合于治疗或检测优选为CNS例如脑的神经学、传染性或癌性疾病的药品(例如小药物、核酸或多肽例如抗体或其片段)或成像药剂。

除了所述感兴趣的化合物之外或代替所述化合物，所述嵌合药剂还可以含有稳定化基团以提高所述VHH或偶联物的血浆半衰期。因此，本发明的特定嵌合药剂以任何顺序包含至少一个VHH、稳定化基团和活性化合物。

所述稳定化基团可以是已知具有显著的血浆半衰期(例如至少1小时)并且基本上没有不利生物活性的任何基团。此类稳定化基团的实例包括例如免疫球蛋白的Fc片段或其变体、大的人类血清蛋白例如白蛋白、HSA或IgG或PEG分子。在特定实施方式中，所述稳定化基团是人类IgG1的Fc片段。更优选地，所述稳定化基团是IgG1的无糖基化Fc片段。

所述VHH可以被偶联到所述稳定化基团的N-端或C-端或两者。当所述稳定化基团是Fc片段时，通常通过遗传融合进行偶联。取决于所述稳定化基团的本性，所述得到的蛋白质可以保持为单体药剂，或者多聚体化。在Fc片段的情况下，融合蛋白Fc-VHH或VHH-Fc通常形成同二聚体。

在本发明的偶联化合物中，偶联可以通过任何可接受的成键手段来进行，其中将被偶联实体的化学本质、阻碍和数目考虑在内。因此，偶联可以通过在生理介质中或细胞内可切割或不可切割的一个或多个共价键、离子键、氢键、疏水键或范德华键来进行。此外，偶联可以在各种不同的反应性基团处，尤其是在一个或多个末端和/或一个或多个内部或侧面的反应性基团处做出。偶联也可以使用遗传工程来进行。

优选地，所述相互作用足够强，使得所述VHH在到达活性物质作用部位之前不从所述活性物质解离。因此，本发明的优选偶联是共价偶联，尽管也可以使用非共价偶联。所述感兴趣的化合物可以在一个末端(N-端或C-端)处或序列的组成氨基酸之一的侧链处与所述VHH偶联(Majumdar和Siahaan，Med Res Rev.，付印前的电子版)。所述感兴趣的化合物可以被直接偶联或利用连接物或间隔物间接偶联到VHH。利用或不利用间隔物的共价化学偶联的手段，包括例如选自含有烷基、芳基或肽基团的双功能或多功能试剂被酯类、醛或烷基或芳基酸、酸酐、巯基或羧基、源自于溴化氰或氯化氰的基团、羰基二咪唑、琥珀酰亚胺酯或磺酰卤的偶联。

用于将本发明的VHH偶联到分子或支架的示例性策略公开在图6中。

在特定实施方式中，偶联通过遗传融合来进行。当所述偶联的分子是肽或多肽时，可以使用这种策略。在这种情况下，制备编码与所述分子融合的VHH的核酸分子并在任何适合的表达系统中表达，以产生所述偶联物。

在另一个特定实施方式中，偶联通过酶反应来进行。具体来说，所述VHH上的定点偶联可以使用转谷氨酰胺酶(TGase)来进行。TGase催化在(i)插入到被TGase特异性识别的标签序列(即Q-标签)中的谷氨酰胺残基的侧链与(ii)氨基官能化的供体底物之间形成稳定的异肽键。就此而言，本发明人开发了一种特殊的标签序列(被命名为“Q-标签”)，其被TGase识别，并且可用于将本发明的VHH偶联到任何感兴趣的分子，特别是化学药物或药剂。为此目的，通过遗传融合制备VHH，以串联添加(通常添加到它们的C-端)下述标签：首先是任选的三丙氨酸连接物，然后是任选的His标签，然后是任选的小的三甘氨酸连接物，最后是Q-标签。所述三甘氨酸连接物允许隔开所述Q-标签以允许TGase更好地接近所述谷氨酰胺，而所述His标签旨在便于所述VHH及其进一步官能化的形式的纯化。

开发的通用偶联策略是一种汇集合成，其基于包括下述步骤的方法：

1)在VHH的Q-标签的谷氨酰胺上引入用于进一步偶联到感兴趣的分子的反应性组成部分。在这个目标中，允许具有两个不同反应性末端的异双功能连接物被TGase加工：一个朝向所述TGase的适合的伯胺基团和一个正交的反应性组成部分。这种正交反应性基团的代表性实例包括叠氮化物、约束炔烃例如DBCO(二苯并环辛炔)或BCN(双环[6.1.0]壬炔)、四嗪、TCO(反式环辛烯)、游离或受保护的硫醇等。

2)在所述感兴趣的分子上引入与并入到VHH Q-标签上的反应性组成部分互补的反应性组成部分。这种正交反应性基团的代表性实例包括叠氮化物、约束炔烃例如DBCO或BCN、四嗪、TCO、游离或受保护的硫醇等。

3)由于所述功能化的VHH和分子互补的反应性基团而将它们两者偶联。

这种偶联策略代表了本发明的另一个目的。具体来说，本发明的目的在于一种使用如上所定义的Q-标签通过TGase偶联反应将两个分子偶联的方法。本发明的另一个目的是一种包含Q-标签的VHH。本发明的另一个目的是一种包含连接物例如Gly连接物和Q-标签的VHH分子。本发明的优选VHH具有下述结构：

VHH-连接物-His_m-连接物-LQR，

其中：

VHH是任何VHH分子；

连接物是任何分子连接物例如Ala或Gly连接物(优选地所述两个连接物不同)；并且

m是0至6的整数。

在特定实施方式中，本发明涉及一种偶联物，其包含共价连接到化学实体的VHH。此类偶联物的优选变体含有1个VHH和1个化学实体。

在另一个特定实施方式中，本发明涉及一种偶联物，其包含共价连接到核酸的VHH。所述核酸可以是反义寡核苷酸、核酶、适体、siRNA等。此类偶联物的优选变体含有1个VHH和1个核酸分子。

在另一个特定实施方式中，本发明涉及一种偶联物，其包含共价连接到肽的VHH。所述肽可以是活性分子、诱饵、标签、配体等。此类偶联物的优选变体含有1个VHH和1个肽。

在另一个实施方式中，本发明涉及一种偶联物，其包含共价连接到染料的VHH。

在另一个实施方式中，本发明涉及一种偶联物，其包含共价连接到纳米粒子或脂质体的VHH。所述纳米粒子或脂质体可以装载有活性药剂或用活性药剂功能化。此类偶联物的优选变体含有偶联到每个纳米粒子或脂质体的几个VHH分子。

在其他实施方式中，所述偶联物包含偶联有一个或几个VHH分子的抗体或其片段。通常，VHH分子被偶联到重链或轻链或两者的C-端或N-端，或者被偶联到Fc片段的C-端或N-端。

本发明还涉及一种制备如上所定义的偶联化合物的方法，其特征在于包括优选地通过化学、生物化学或酶途径或通过遗传工程在VHH与分子或支架之间进行偶联的步骤。

在本发明的嵌合药剂中，当存在几个VHH时，它们可能具有相似或不同的结合特异性。

核酸、载体和宿主细胞

本发明的另一方面涉及一种核酸，其编码如上所定义的VHH或其偶联物(当所述偶联的组成部分是氨基酸序列时)。所述核酸可以是单链或双链。所述核酸可以是DNA(cDNA或gDNA)、RNA或其混合物。它可以采取单链形式或双链体形式或两者的混合物。它可以包含修饰的核苷酸，其包含例如修饰的键、修饰的嘌呤或嘧啶碱基或修饰的糖。它可以通过本领域技术人员已知的任何方法来制备，包括化学合成、重组和/或突变。根据本发明所述的核酸可以从根据本发明所述的VHH分子的氨基酸序列推导，并且可以根据所述核酸将在其中转录的宿主细胞来改变密码子用法。这些步骤可以根据本领域技术人员公知的方法来进行，某些所述方法描述在参考手册Sambrook等(Sambrook J,Russell D(2001)，《分子克隆实验指南》(Molecular cloning:a laboratory manual)，第三版，Cold Spring Harbor)中。

此类核酸序列的具体实例包括包含SEQ ID NO：52-64和95-110中的任一者的序列及其互补序列，及其不含任选的编码标签的部分的片段。编码CDR1、CDR2和CDR3的结构域有下划线。编码标签的部分采用粗体。

本发明还涉及一种载体，其含有任选地在调控序列(例如启动子、终止子等)控制之下的此类核酸。所述载体可以是质粒、病毒、粘粒、噬菌粒、人工染色体等。具体来说，所述载体可以包含可操作连接到调控区、即包含一个或多个控制序列的区域的本发明的核酸。任选地，所述载体可以包含可操作连接到几个调控区的几个本发明的核酸。

术语“控制序列”意味着编码区的表达所必需的核酸序列。控制序列可以是内源或异源的。公知的和本领域技术人员当前使用的控制序列是优选的。此类控制序列包括但不限于启动子、信号肽序列和转录终止子。

术语“可操作连接”意味着其中控制序列被放置在相对于编码序列的适合位置处，使得所述控制序列指导所述编码区的表达的配置方式。

本发明还涉及根据本发明所述的核酸或载体的用途，其用于转化、转染或转导宿主细胞。

本发明还提供了一种宿主细胞，其包含一个或几个本发明的核酸和/或一个或几个本发明的载体。

术语“宿主细胞”还涵盖了由于在复制期间的突变而不与亲代宿主细胞一致的所述亲代宿主细胞的任何后代。适合的宿主细胞可以是原核的(例如细菌)或真核的(例如酵母、植物、昆虫或哺乳动物细胞)。此类细胞的具体说明性实例包括大肠杆菌菌株、CHO细胞、酵母菌株、植物细胞、sf9昆虫细胞等。

用途

本发明的VHH分子可以与TfR结合，并因此将分子靶向/递送到表达TfR的细胞或器官。

在本发明的情形中，结合优选为特异的，使得与TfR的结合以比与同一物种中的任何其他抗原的结合更高的亲和性发生。本发明的优选VHH分子结合人类TfR1和鼠类或大鼠TfR。更优选地，所述VHH分子以基本上相近的亲和性结合人类和鼠类受体。

因此，本发明涉及将化合物靶向/递送到/通过表达TfR的细胞或器官的方法，所述方法包括将所述化合物偶联到至少一个本发明的VHH。

本发明还涉及如上所定义的VHH的用途，其用作载体以将化合物运输到/通过表达TfR的细胞或器官。

本发明还涉及如上所定义的VHH的用途，其用于制备能够跨越BBB的药物。

本发明还涉及一种允许或改进分子跨越通过BBB的方法，所述方法包括将所述分子与本发明的VHH偶联。

本发明的VHH可用于运输或递送任何化合物，例如小药物、蛋白质、多肽、氨基酸、脂质、核酸、病毒、脂质体等。

本发明还涉及一种药物组合物，其特征在于包含例如上文所定义的至少一种VHH或VHH-药物偶联物和一种或多种可药用赋形剂。

本发明还涉及一种诊断组合物，其特征在于包含例如上文所定义的VHH或VHH-诊断或医学成像药剂偶联化合物。

所述偶联物可以以任何可药用盐的形式使用。表述“可药用盐”以示例和非限制性的方式表示可药用碱或酸加成盐、水合物、酯类、溶剂化物、前体、代谢物或立体异构体，所述载体或偶联物装载有至少一种感兴趣的物质。

表述“可药用盐”是指通常可以通过将游离碱与适合的有机或无机酸反应而制备的无毒性盐。这些盐保留游离碱的生物有效性和性能。此类盐的代表性实例包括水溶性和水不溶性盐，例如乙酸盐、N-甲基葡萄糖胺铵、氨芪磺酸盐(4,4-二氨基二苯乙烯-2,2’-二磺酸盐)、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、硫酸氢盐、酒石酸氢盐、硼酸盐、氢溴酸盐、溴化物、丁酸盐、樟脑磺酸盐、碳酸盐、盐酸盐、氯化物、柠檬酸盐、克拉维酸盐、二盐酸盐、二磷酸盐、依地酸盐、依地酸钙、乙二磺酸盐、依托酸盐、乙磺酸盐、延胡索酸盐、葡庚糖酸盐、葡萄糖酸盐、谷氨酸盐、羟乙酰基砷酸盐、六氟磷酸盐、己基间苯二酚盐、海巴明盐、羟基萘甲酸盐、碘化物、异硫代硫酸盐、乳酸盐、乳糖醛酸盐、月桂酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基溴化物、甲基硝酸盐、甲基硫酸盐、粘酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、3-羟基-2-萘甲酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐(1,1-亚甲基-双-2-羟基-3-萘甲酸盐或emboate)、泛酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、聚半乳糖醛酸盐、丙酸盐、对甲苯磺酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、碱式乙酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、磺基水杨酸盐、苏拉酸盐、鞣酸盐、酒石酸盐、茶氯酸盐、甲苯磺酸盐、三乙基碘化物、三氟乙酸盐和戊酸盐。

有利情况下，本发明的组合物包含可药用载体或赋形剂。所述可药用载体可以选自根据每种给药方式经典使用的载体。根据设想的给药方式，化合物可以采取固体、半固体或液体形式。对于固体组合物例如散装或包含在明胶胶囊中的片剂、丸剂、粉剂或颗粒剂来说，可以将所述活性物质与下述物质合并：a)稀释剂，例如乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、纤维素和/或甘油；b)润滑剂，例如二氧化硅、滑石、硬脂酸、其镁盐或钙盐和/或聚乙二醇；c)粘合剂，例如硅酸镁和硅酸铝、淀粉糊、明胶、黄耆胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮；d)崩解剂，例如淀粉、琼脂、藻酸或其钠盐或泡腾混合物；和/或d)吸收剂、染料、调味剂和甜味剂。所述赋形剂可以例如是甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁和药物品质的类似物。对于半固体组合物例如栓剂来说，所述赋形剂可以例如是乳液或油性悬液或基于聚亚烷基二醇的，例如聚丙二醇。液体组合物、特别是注射剂或包含在软胶囊中的液体组合物，可以例如通过将所述活性物质溶解、分散等在制药纯的溶剂例如水、生理盐水溶液、右旋糖水溶液、甘油、油及其类似物中来制备。

本发明的组合物或偶联物可以通过任何适合的途径给药，非限制性地包括通过肠胃外途径，例如采取可以通过皮下、静脉内或肌肉内途径注射的制剂的形式；通过口服途径(或经口)，例如采取包衣或非包衣片剂、明胶胶囊、粉剂、球丸、悬液或口服溶液的形式(一种此类用于口服给药的形式可以是立即释放或延长或延迟释放的形式)；通过直肠途径，例如采取栓剂的形式；通过局部途径，特别是通过透皮途径，例如采取贴片、油脂或凝胶的形式；通过鼻内途径，例如采取气溶胶和喷雾剂的形式；通过经舌途径；或通过眼内途径。

所述药物组合物通常包含有效剂量的本发明的VHH或偶联物。当在本文中使用时，“治疗有效剂量”是指对于给定病症和给药计划来说提供治疗效果的剂量。它通常是为了明显改善与疾病或病理状态相关的一些症状而给药的活性物质的平均剂量。例如，在治疗脑或其他组织的癌症、CNS的疾病、病变或障碍时，减少、阻止、延迟、消除或停止所述疾病或障碍的病因或症状之一的活性物质的剂量，是治疗有效的。活性物质的“治疗有效剂量”不一定治愈疾病或障碍，但会对所述疾病或障碍提供治疗，从而延迟、阻碍或阻止其出现，或减轻其症状，或修改或例如减轻其分项，或者加速患者的恢复。

应当理解，对于特定个体来说，“治疗有效剂量”取决于各种不同因素，包括所述活性物质的活性/有效性、它的给药时间、它的给药途径、它的毒性、它的消除率和代谢、药物组合/相互作用和在预防或治愈的基础上治疗的疾病(或障碍)的严重性，以及所述患者的年龄、体重、总体健康、性别和/或饮食。

取决于所偶联的物质，本发明的偶联物和组合物可用于治疗、预防、诊断或成像大量疾病，尤其是影响CNS的疾病、传染病或癌症。本发明的VHH具有靶向表达TfR的细胞的能力，特别是表现出所述受体的显著表达的细胞，例如尤其是癌细胞、神经或非神经组织，并且/或者具有跨越细胞膜，尤其是CNS的生理屏障，更具体来说是癌性神经组织的血液-肿瘤屏障(BTB)的能力。TfR富集在诸如骨髓、胎盘的器官中以及胃肠道中。TfR也在脑内皮细胞中但不在衬于其他组织中的血管的内皮细胞中高表达。已证实TfR在来自于大鼠、小鼠、猪和非人类灵长动物的纯化的脑微血管和培养的内皮细胞的质膜处表达。

就此而言，本发明涉及如上所述的药物偶联物或组合物的用途，其用于治疗或预防CNS疾病或障碍、脑肿瘤或其他癌细胞以及脑或其他组织的细菌、病毒、寄生虫或真菌传染性疾病。

本发明还涉及一种如上所述的VHH、偶联物或组合物，其用于诊断、成像或治疗CNS疾病或障碍、脑肿瘤或其他癌细胞以及脑或其他组织的细菌、病毒、寄生虫或真菌传染性疾病。

本发明还涉及一种如上所述的VHH、偶联物或组合物，其用于治疗、成像和/或诊断脑肿瘤或其他类型的癌症。

本发明涉及如上所定义的VHH、偶联物或组合物，其用于治疗、成像和/或诊断神经变性疾病，例如但不限于阿兹海默氏病、帕金森氏病、中风、克雅氏病、牛海绵状脑病、多发性硬化症、肌萎缩侧索硬化症等。

本发明还涉及如上所定义的VHH、偶联物或组合物，其用于治疗、成像和/或诊断神经科疾病，例如但不限于癫痫、偏头痛、脑炎、CNS痛等。

本发明还涉及如上所定义的VHH、偶联物或组合物，其用于治疗、成像和/或诊断罕见疾病，例如但不限于溶酶体贮积病、法伯病、法布里病、神经节苷脂病GM1和GM2、戈谢病、不同的粘多糖贮积症等。

本发明还涉及如上所定义的VHH、偶联物或组合物，其用于治疗、成像和/或诊断神经精神疾病，例如但不限于抑郁症、自闭症、焦虑症、精神分裂症等。

本发明还涉及如上所定义的VHH、偶联物或组合物，其用于治疗、成像和/或诊断癌症，例如但不限于成胶质细胞瘤、胰腺癌、卵巢癌、肝细胞癌等。

本发明还涉及如上所定义的VHH、偶联物或组合物，其中所述被偶联的药剂是病毒或病毒样粒子例如重组病毒。事实上，本发明可用于提高在基因疗法中使用的重组(例如复制缺陷型或弱化)病毒例如腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、反转录病毒等或病毒样粒子的脑或癌症或任何富含TfR的组织的递送。与病毒或VLP的偶联可以例如通过偶联到所述病毒的衣壳蛋白来进行。

本发明还涉及治疗任何上述病症或疾病的方法，所述方法包括向需要的对象给药本发明的VHH、偶联物或组合物。

本发明还涉及本发明的VHH、偶联物或组合物的用途，其用于制造治疗任何上述病症或疾病的药品。

在考虑下面的实施例后，本发明的其他方面和优点会变得显而易见，所述实施例在本质上仅仅是说明性的，并且不限制本申请的范围。

实施例

实施例IBBB处TfR表达的确认

我们分析了在各种不同物种的脑内皮中TfR的细胞膜表达情况。使用ProteoExtract亚细胞蛋白质组提取试剂盒(Calbiochem,La Jolla,CA,USA)来制备来自于大鼠、小鼠、猪和非人类灵长动物(NHP；恒河猴)的消化或未消化的脑微血管(BMV)和脑微血管内皮细胞(BMEC)的原代培养物的膜提取物(图1)。

将膜提取物用BioRad DC蛋白质测定法(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)按照制造商的说明书定量。将膜蛋白通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)在4-12％的聚丙烯酰胺凝胶上分离，并转移到硝酸纤维素膜(ThermoFisher Scientific)上。将蛋白质用针对TfR的第一抗体(Genetex GTX102596；1/1000)，然后用1/10000稀释的HRP偶联的驴抗兔IgG第二抗体(Jackson ImmunoResearch)探测。最后，使用化学发光检测蛋白质。

如图1中所示，TfR在来自于大鼠、小鼠、猪和非人类灵长动物的消化和未消化的脑微血管中表达。TfR也在来自于小鼠、大鼠和猪的脑内皮细胞中表达(注意对于脑微血管内皮细胞来说在SDS-PAGE上仅载样1μg膜蛋白，与此相比对脑微血管来说为10μg或5μg)。在消化的NHP脑微血管中TfR表达增强。

这些数据证实，TfR代表了设计用于体内应用的分子的有效靶点。

实施例II

稳定表达人类和小鼠TfR的CHO细胞系的构建

结合TfR的VHH的鉴定和表征的先决条件是在真核细胞(中华仓鼠卵巢细胞，CHO)中建立组成性并高水平表达hTfR和mTfR的稳定细胞系。然后将这些细胞系用于：i)在本源构型下与在细胞表面处表达的受体结合的药剂的鉴定和表征；和ii)测试所述受体是否可以通过内吞作用内化此类药剂。

为了构建这些细胞系，使用可以在数据库中获得的数据信息(登记号：NM_003234.3)克隆编码hTfR的cDNA。选择通过RT-PCR进行cDNA扩增所必需的引物(参见下表)，在其末端处(用粗体表示)包含用于克隆到pEGFP-C1表达载体(Clontech)中所必需的限制性位点(EcoRI和SalI)(图2-A)。

将从人类大脑制备的总RNA用于编码hTfR的cDNA片段的RT-PCR扩增。在扩增后，将PCR产物用EcoRI-SalI限制性酶消化，并连接到用相同的限制性酶消化的pEGFP-C1表达载体(Clontech)中。在转染到真核细胞中后，这个载体能够在CMV启动子控制之下表达在EGFP的N-端末端处、即在其细胞内结构域的末端处与其融合的hTfR。在转化大肠杆菌DH5α感受态细菌、获得分离的菌落并制备质粒DNA后，对所述构建物的两条链进行完全测序以便验证。

编码融合到EGFP的mTfR的质粒购自GeneCopoeia(质粒参考号EX-Mm05845-M29)。

在CHO-K1细胞中进行瞬时转染并用于通过有限稀释和对抗生素(G418)的抗性来选择稳定的转染体。在维持选择压力的同时将这些细胞系扩增。

在图2-B中，在使用Alexa647偶联的转铁蛋白(Tf-Alexa647)对固定的(PFA)细胞系进行免疫细胞化学后获得的共聚焦显微照片证实了EGFP(绿色)与Tf-Alexa647(红色)之间的共定位，并因此证实了所述受体的良好表达和功能性结合。

在使用ProteoExtract亚细胞蛋白质组提取试剂盒提取的细胞膜上，通过western印迹检查了预期尺寸的受体的膜表达。抗体针对GFP或针对TfR。通过抗GFP抗体和抗TfR抗体识别对应于EGFP和h/mTfR的合并尺寸(170kDa)的蛋白质(图2-C)。将CHO K1野生型(WT)细胞系用作阴性对照，并且抗体未检测到蛋白质。

这些数据确认了有功能的受体在所述CHO细胞系的细胞表面处的表达。

实施例III

结合TfR的VHH的产生

用来自于表达感兴趣的人类和鼠类受体的CHO稳定细胞系的膜制备物将美洲驼(Lama glama)皮下免疫接种4次。VHH文库构建如以前所述来进行(Alvarez-Rueda等，2007；Behar等，2009)。简单来说，从通过聚蔗糖梯度分离的外周血单核细胞的总RNA，通过RT-PCR扩增编码VHH的mRNA，并克隆到pHEN1噬菌粒中。反复的选择能够分离到呈递对在细胞表面处表达的TfR表现出强亲和性的VHH的噬菌体。

总的来说，筛选了超过700个克隆的结合TfR的能力，并对大约100个克隆进行了测序。

获得了具有改进的结合(与鼠类和人类细胞系两者)、细胞穿透和运输性质的VHH。示例性的VHH是VHH A、VHH B、VHH C、VHH D(也参见序列表)。这些VHH不与对照CHO细胞系的细胞结合。

此外，通过定点突变产生具有适合的改进的结合性质的结合TfR的VHH。更具体来说，进行定点突变以在VHH A互补决定区(CDR)1、2和3中引入单个丙氨酸替换，产生VHH A1至A9。VHH A1和A2在CDR1中突变，VHH A3和A4在CDR2中突变，并且VHH A5至A9在CDR3中突变。此外，还通过将某些CDR氨基酸用结构相近的氨基酸替换，进行了单一定点突变。获得了VHH A10-A19，其中VHH A10和A11在CDR1中突变，VHH A12至A14在CDR2中突变，并且VHH A15至A19在CDR3中突变。

此外，产生了人源化的结合TfR的VHH，以通过例如避免免疫原性来改进体内效能，并被命名为VHH A20-A25。

此外，产生了带有标签的VHH分子，以便于纯化和/或偶联。

每个这些VHH的氨基酸序列提供在序列表中。

实施例IV

本发明的纯化的VHH的结合和内吞作用

为了证实所选VHH分子结合TfR和被内吞的能力，进行了免疫细胞化学实验，其包括将VHH在表达融合到EGFP的TfR的活CHO细胞系上温育，使用小鼠抗cMyc第一抗体(ThermoFisher)、然后使用Alexa594偶联的驴抗小鼠第二抗体(Jackson ImmunoResearch)检测，并使用共聚焦显微镜观察。作为实例示出了使用VHH A获得的结果。

如图3中所示，VHH结合到CHO-hTfR-EGFP(图3-B)和CHO-mTfR-EGFP(图3-A)细胞系，并通过内吞作用并入以在细胞中积累，正如使用triton通透化所显示的，而对于对照VHH(VHH Z)来说情况不是如此(图3-C、D)。

实施例V

结合亲和性的确定

使用流式细胞术测试了对TfR具有亲和性的VHH的结合性质，并确定了表观亲和性(K_{d app})。所有实验在96孔板中，使用2x10⁵个-3x10⁵个细胞/孔，在4℃下振摇进行。将表达与EGFP融合的TfR的CHO细胞系或CHO WT细胞用PBS/BSA 2％溶液饱和30min，以避免非特异性结合，然后与浓度在2μM至1pM范围内的纯化的VHH温育1小时。在PBS/BSA 2％中清洗一次后，将细胞与抗6His标签抗体(小鼠)温育1小时，用PBS/BSA 2％清洗两次，并与Alexa647偶联的抗小鼠第二抗体温育45min。在PBS/BSA 2％中最后清洗两次后，将细胞通过与PBS/PFA2％温育15min进行固定或不固定，用PBS清洗一次，并最后重悬浮在PBS中。使用MACSQuant流式细胞仪(Miltenyi)或Attune NxT流式细胞仪(Thermo Fisher Scientific)评估荧光水平。

在将细胞与对照VHH(VHH Z)温育的对照条件下不存在非特异性标记。所有测试的VHH均诱导信号的浓度依赖性迁移，证实了与感兴趣的受体的结合(图4-A)。使用所有测试的VHH，未检测到CHO WT对照细胞的标记(未示出)。VHH K_{d app}使用GraphPad Prism软件来计算(图4-B)。对于所有VHH来说，K_{d app}在相同的范围内，对于mTfR来说范围为7.5nM(VHH B)至56nM(VHH D)，对于hTfR来说范围为1.6nM(VHH B)至2.7nM(VHH A)。

实施例VI

对TfR具有亲和性的纯化的VHH与天然配体之间的竞争测定

为了评估所选VHH与TfR的天然配体转铁蛋白(Tf)竞争与所述受体结合的能力，使用流式细胞术实验进行了竞争测定。在第一步中，将连续稀释的竞争物在表达与EGFP融合的感兴趣的受体的CHO细胞上在4℃温育1小时。其次，添加EC90的示踪剂并继续温育1小时，然后使用适合的揭示系统检测(图5)。

将结合TfR的VHH用作示踪剂(图5-B)和竞争物(图5-C)。在所有条件下，在VHH与配体Tf之间不存在竞争，表明VHH在不同于Tf的表位上结合到TfR。

实施例VII

VHH A1-A19的结合亲和性的确定

使用流式细胞术测试VHH A1-A19对TfR的结合性质，并确定了表观亲和性(K_{d app})。所有实验在96孔板中，使用2x10⁵个细胞/孔，在4℃下振摇进行。将稳定表达与EGFP融合的hTfR或mTfR的CHO细胞系或CHO WT细胞用PBS/BSA 2％溶液饱和30min，以避免非特异性结合，然后与浓度在50μM至5pM范围内的纯化的VHH温育1小时。在PBS/BSA 2％中清洗一次后，将细胞与抗6His标签抗体(小鼠)温育1小时，用PBS/BSA 2％清洗两次，并与Alexa647偶联的抗小鼠第二抗体温育45min。在PBS/BSA 2％中最后清洗两次后，通过与PBS/PFA 2％温育15min将细胞进行固定，用PBS清洗一次，并最后重悬浮在PBS中并且储存在4℃下。使用Attune NxT流式细胞仪(Thermo Fisher Scientific)评估荧光水平。

在两种细胞系上VHH A1-A19都诱导信号的浓度依赖性迁移(VHH A12除外)，证实了它们与感兴趣的受体的高效结合(图11、12)。尽管VHH A、VHH A1至A4和VHH A10至A15在表达hTfR和mTfR的两种细胞系上显示出相似的B_max(曲线平台)，但VHH A6至A9和VHH A16至A19在两种细胞系上显示出轻微至剧烈降低的B_max以及轻微至强烈的曲线迁移。只有VHHA12与其他VHH Ax相比对表达hTfR的细胞系显示出较低的B_max和强烈的曲线迁移。使用所有测试的VHH，未检测到CHO WT对照细胞的标记(未示出)。

VHH K_{d app}使用GraphPad Prism软件来计算(图11-B、12-B)。

对于与人类TfR的结合来说，VHH A、A1至A4、A6、A9至A11和A13至A17都显示出约3-4nM的相近的K_{d app}。相反，VHH A5、A8、A18和19显示出9.2至25nM的略微更低的亲和性，而VHHA7和A12显示出分别为255nM和363nM的剧烈降低的亲和性。

对于与小鼠TfR的结合来说，VHH A和A9显示出约50nM的相近的K_{d app}，所有其他VHHAx显示出131至259nM的略微更低的亲和性，例外的是VHH A5、A8和A18，它们显示出分别为604nM、427nM和416nM的显著更低的亲和性。

实施例VIII

对TfR具有亲和性的纯化的VHH-Fc融合分子的结合和内吞作用以及亲和性确定

将本发明的抗TfR VHH分子融合到IgG Fc片段。为了产生所述融合蛋白，通过PCR扩增编码VHH(不带有标签)的DNA片段，并将其克隆到pINFUSE-IgG1-Fc2载体(InvivoGen)中，以便编码在其N-端或C-端中包含所述VHH的人类IgG1-Fc片段。融合蛋白使用Expi293表达系统，按照制造商的说明书(Life Technologies)来制备。在转染后72小时，回收上清液并使用蛋白A GraviTrap柱(GE Healthcare)进行纯化。使用内部自制的抗Fc ELISA对所述纯化的融合蛋白进行定量。

在表达与EGFP融合的TfR的CHO细胞系上进行免疫细胞化学实验，其包括将VHH-Fc融合蛋白在活细胞上温育，使用Alexa594偶联的抗hFc抗体(Jackson ImmunoResearch)检测，使用共聚焦显微镜照相，以确认融合蛋白结合感兴趣的靶受体的能力。

结果证实，本发明的偶联物可以结合细胞并被细胞内吞(图7)。在细胞上没有观察到对照VHH-Fc偶联物(VHH Z-Fc)的结合，显示出所述相互作用的特异性。

在流式细胞术实验中测试了对TfR具有亲和性的VHH-Fc和Fc-VHH融合蛋白的结合性质，并确定了表观亲和性(K_{d app})。所有实验在96孔板中，使用2x10⁵个-3x10⁵个细胞/孔，在4℃下振摇进行。将表达与EGFP融合的感兴趣的受体的CHO细胞系或CHO WT细胞用PBS/BSA 2％饱和，然后与浓度在350nM至0.03pM范围内的纯化的VHH-Fc或Fc-VHH温育1小时。在清洗后，将细胞与Alexa647偶联的抗hFc抗体(Jackson ImmunoResearch)温育1小时。在最后清洗3次并将细胞重悬浮在PBS中后，使用MACSQuant流式细胞仪(Miltenyi)立即测量荧光，并使用MACSQuant软件分析结果。

所有VHH-Fc和Fc-VHH融合蛋白均诱导信号的浓度依赖性迁移，证实了与感兴趣的受体的结合。使用GraphPad Prism软件计算VHH-Fc和Fc-VHH的K_{d app}(图8-B)。通过与Fc片段偶联，几乎所有VHH的K_{d app}都得到改进，对于结合TfR的VHH-Fc和Fc-VHH来说K_{d app}范围为0.44nM至51nM。

实施例IX

本发明的VHH在体外BBB模型中的内吞作用和运输

我们使用大鼠或小鼠脑微血管内皮细胞(BMEC)和大鼠或小鼠星形胶质细胞来建立共培养模型。这种类型的体外BBB模型被用于评估大量分子、尤其是药理学药剂跨越BMEC的被动通过或主动运输，并因此通过外推评估它们在体内到达CNS组织的能力。到目前为止开发的不同模型(牛、猪、鼠、人类)具有脑内皮特有的超微结构特性，尤其是紧密连接、无孔、对亲水性分子的渗透性低和高电阻。此外，这些模型已经显示出在体外对各种不同分子进行的测量结果和在体内评估其跨越BBB的性质的之间的牢固相关性。迄今为止，所有获得的数据均表明，这些体外BBB模型通过再现体内存在的细胞环境的某些复杂性来模拟体内情况，同时保留与细胞培养实验相关的优点。

例如，所述体外大鼠BBB模型启用了BMEC和星形胶质细胞的共培养物(Molino等，2014,J.Vis.Exp.88,e51278)。在细胞培养之前，将膜插板(Corning，Transwell 1.0μm孔隙度，用于96孔或12孔板)在上层部分上用IV型胶原蛋白和纤连蛋白处理，以便实现BMEC的最佳粘附并产生基底层的条件。从新生大鼠大脑皮层建立混合星形胶质细胞的原代培养物。简单来说，除去脑膜，并机械解离、然后在胰蛋白酶溶液中酶法解离皮层碎块。将解离的细胞接种到细胞培养瓶中的神经胶质细胞培养基(GCM)中，所述培养基含有增补有10％胎牛血清的DMEM，然后在液氮中冷冻以备晚些时候使用。BMEC的原代培养物从5-6周龄的Wistar大鼠制备。简单来说，将皮层碎块机械解离，然后在胶原酶/分散酶溶液中酶法解离。通过在25％牛血清白蛋白中的密度依赖性离心，分离所述消化的组织。将微血管沉淀物接种到用IV型胶原蛋白和纤连蛋白预包被的培养瓶上的内皮细胞培养基(ECM)中，所述ECM含有DMEM/F12并增补有20％源自于贫血小板牛血浆的血清和2ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。建立共培养物之前5天，将星形胶质细胞解冻并铺于12孔或96孔板(近腔区室)中。然后将BMEC分配在滤膜的上表面(腔内区室)上的共培养物中。在这些条件下，体外模型分化，在3天内表达与连接相关的蛋白，并在接下来的3天内保持最佳分化。

在上述体外大鼠模型上核实了本发明的与人类IgG1抗体的Fc片段偶联的VHH(VHH-Fc)在BBB处的结合/摄取(图9)。将VHH A-Fc或VHH B-Fc与Tf-Alexa647在活的rBMEC单层上在37℃共温育2小时(图9A)。在该共温育后，将所述细胞单层充分清洗，并用4％PFA固定。将所述细胞单层用0.1％triton X-100溶液通透化。使用针对人类Fc片段的抗体进行免疫染色来检测VHH-Fc。然后使用共聚焦显微术来评估VHH A-Fc或VHH B-Fc与Tf-A647的荧光信号之间的共定位(图9A)。

结果显示，在该2小时共温育后，VHH A-Fc和VHH B-Fc被容易地内吞，并与Tf-Alexa647几乎完美地共定位。

这项不同TfR配体(VHH A-Fc、VHH B-Fc和Tf-A647)的共定位的分析证实了本发明的VHH对其靶受体的特异性。

对于跨越rBMEC单层向近腔区室的运输来说，将10nM的VHH-Fc在培养系统的腔内区室中温育24小时至72小时(图9-C、D)。在实验之前，将含有rBMEC单层的过滤插板置于含有新鲜运输缓冲液(腔内区室中75μl，近腔区室中250μl)的96孔板中。为了评估体外BBB的完整性和不存在对内皮细胞的毒性，将VHH-Fc与荧光黄(LY)这种不跨越BBB的小荧光分子共温育。在温育后24小时，将所述插板转移到含有新鲜运输缓冲液的另一个96孔板中，用于另一个48小时的时段。在运输结束时，通过荧光分光光度法定量近腔区室中积累的LY，并将结果表示成以10^-3cm/min为单位的内皮表面渗透率(或Pe)。如果LY的Pe值大于0.6x10^-3cm/min，则所述体外屏障被认为是“可渗透的”或“开放的”。使用欧姆表测量并以ohm.cm²为单位表示的跨内皮电阻(TEER)也使得可以在跨越通过BBB的测试期间测量BBB体外完整性。质量阈值被设定到>400ohm.cm²。进行的实验显示出VHH-Fc不存在毒性，并且对BBB的渗透率性质不存在有害影响(未示出)。在输入时(T0)、运输实验结束时的腔内区室(T72小时、产物回收)和近腔区室(24小时和+48小时的运输时段)中本发明的VHH-Fc的Fc-片段的含量使用内部自制的抗Fc ELISA测定法来定量，灵敏度在0.5-50飞摩尔之间。将吸光度单位转换成每个插片的飞摩尔数(对于96孔板的插板来说表面积为0.143cm²)。

我们的结果显示，VHH B-Fc和VHH A-Fc偶联物显示出比VHH Z-Fc(阴性对照)更高的运输，在24小时时大约10倍，在72小时时5倍。在24小时与72小时之间，这种运输达到表观饱和，进一步表明了特异性和可饱和的受体介导的过程的参与(图9-D)。

实施例X

VHH-Fc偶联物的体内药物动力学和器官摄取

为了评估本发明的VHH-Fc偶联物在体内靶向富含感兴趣的受体的器官的潜力，将偶联物VHH A-Fc、VHH A-Fc-Agly和VHH Z-Fc以5mg/kg的剂量注射到尾静脉中，并在不同时间用盐水灌注小鼠。收集血浆和大脑。通过毛细血管剥离方法对大脑进行加工，以将脑实质与毛细管分离开。使用内部自制的抗Fc ELISA测量血浆、脑实质和微血管中的VHH-Fc的量。结果被呈现为浓度(nM)或器官与血浆的比率(图10)。

结合TfR的偶联物VHH A-Fc和VHH A-Fc-Agly在注射后2小时表现出显著的大脑靶向，对于VHH A-Fc和VHH A-Fc-Agly来说在脑实质中浓度分别为0.25和0.32nM，与此相比对于对照VHH Z-Fc来说为0.07nM(图10-B)。在观察实质与血浆的比率时，确认了明显的优势，特别是在注射后24小时时，此时在脑实质中VHH A-Fc-Agly仍然可测量，而在血浆中仅存在8nM(图10-D)。在微血管中，在注射后2小时时VHH A-Fc和VHH A-Fc-Agly积累显著高于VHHZ-Fc，浓度分别高于9倍和5倍。此外，在注射后24小时时微血管中VHH A-Fc浓度仍然比VHHZ-Fc高3倍(图10-C)。在观察微血管与血浆的比率时，这些结果得到确认(图10-E)。这些结果证实本发明的靶向TfR的VHH可用于有效递送药剂、尤其是蛋白质运载物或改善其药物动力学性质。

实施例XI

与VHH融合的治疗性抗体的设计和生产

将本发明的抗TfR VHH A、A1、A5、A6、A7和A8(不带有标签)融合到对β-淀粉样肽的原纤丝形式具有高特异性亲和性的小鼠IgG1 13C3单克隆抗体(WO2009/065054)。为了产生所述13C3-HC-VHH融合蛋白，合成编码所选VHH的DNA片段，并将其克隆到13C3重链(HC)载体中，以便编码在其C-端中含有融合到所述抗体重链的C-端氨基酸残基的所选VHH序列的13C3-HC-VHH偶联物。在另一组实验中，将编码所选VHH的DNA片段克隆到13C3轻链(LC)载体中，以便编码在其C-端中含有融合到所述抗体轻链的C-端氨基酸残基的所选VHH序列的13C3 LC偶联物。

融合蛋白使用Expi293^TM表达系统，按照制造商的说明书(Life Technologies)来产生。在转染后72小时，回收上清液并使用

蛋白G高效柱(GE Healthcare)进行纯化。使用280nm吸光度测量对所述纯化的融合蛋白进行定量。

13C3-HC-VHHA偶联物的氨基酸序列被提供为SEQ ID NO：93：

粗体是13C3重链可变序列；下划线的是13C3重链恒定序列；粗体且下划线的是Gly连接物；双下划线的由克隆产生并且可以任选被移除的MA和C-端AAA残基。剩余的是VHH。

13C3-LC-VHHA偶联物的氨基酸序列被提供为SEQ ID NO：94：

粗体是13C3κ轻链可变序列；FGGGTK是J区；LEIKR是多克隆位点；下划线的是13C3κ轻链恒定序列；粗体且下划线的是Gly连接物；双下划线的由克隆产生并且可以任选被移除的MA和C-端AAA残基。剩余的是VHH。

结合亲和性的确定

使用流式细胞术测试本发明的13C3偶联物对TfR的结合性质，并确定表观亲和性(K_{d app})。所有实验都在与实施例VII中描述的相同的条件下进行，其中13C3构建物在15μM至7pM范围内的浓度下温育，并使用Alexa647偶联的抗小鼠抗体检测。

所有13C3-HC-VHH融合蛋白在表达hTfR和mTfR的细胞系两者上均诱导信号的浓度依赖性迁移，证实了与所述受体的结合(图13)。所有13C3融合蛋白显示出相同的hTfR结合情况，例外的是VHH A7融合体，其显示出略微更低的B_max。所有融合蛋白对mTfR显示出不同的结合情况，其中13C3-HC-VHH A1融合体与13C3-HC-VHH A相比显示出低2倍的B_max，而A5至A8 13C3融合体显示出非常低的B_max。

使用GraphPad Prism软件计算13C3融合体的K_{d app}(图13-B)。所有融合体对hTfR的亲和性相近，K_{d app}为约10-20nM。尽管B_max不同，但VHH A、A1和A6 13C3 HC融合体显示出10至20nM的相近的亲和性，而13C3-HC-VHH A8和13C3-LC-VHH A融合体分别显示出315nM和106nM的较低的亲和性。

实施例XII

13C3-HC-VHH和13C3-LC-VHH融合体在体内的脑摄取

为了评估本发明的VHH促进抗体的脑摄取的潜力，将13C3-HC-VHH A和13C3-HC-VHH A1偶联物或未载体化的13C3以35纳摩尔/kg的剂量注射到C57Bl6小鼠的尾静脉中。在不同时间将所述小鼠用盐水灌注。在注射后(p.i.)2小时和6小时的时间点收集脑。通过毛细血管剥离法对小鼠脑的一半进行处理，以将毛细血管网络与脑实质分离开，所述方法主要在于将重悬浮的半个脑的匀浆物在20％葡聚糖溶液(Sigma Aldrich)上离心并回收实质级分。对小鼠脑的另一半直接进行处理(匀浆化和裂解)，用于全脑定量。整个脑和脑实质中13C3-HC-VHH偶联物的量使用内部自制的合格的Meso Scale Discovery(MSD)直接包被(Abeta)免疫测定法来测量(CV<20％，并且回收率±30％)。结果被呈现为浓度(nM)(图14)。

结果显示，与未载体化的13C3抗体对照相比，结合TfR的偶联物13C3-HC-VHH A和13C3-HC-VHH A1在注射后2和6小时表现出显著的脑摄取优势(图14-A)。在注射后6小时，13C3-HC-VHH A和13C3-HC-VHH A1的全脑浓度与未载体化的13C3抗体相比分别高出8倍和5倍。

13C3-HC-VHH A和13C3-HC-VHH A1的BBB跨越通过下述事实得以证实，即在注射后6小时，在剥离微毛细血管网络的脑实质中测量到的浓度与未载体化的13C3相比分别高出10倍和9倍(图14-B)。

其他的脑摄取研究进一步证实了13C3-HC-VHH A和13C3-LC-VHH A(轻链载体化版本)在70纳摩尔/kg的剂量下表现出BBB跨越，与未载体化的13C3抗体相比在注射后4小时时实质积累分别高出6倍和5倍。

实施例XIII

VHH-siRNA偶联物的合成

将包含用于产生对核酸酶的高抗性的化学修饰的抗GFP siRNA即siGFPst1偶联到带有标签的VHH A，以产生VHH A-siGFPst1生物偶联物。使用相同的偶联策略将siGFPst1偶联到无关的VHH Z作为阴性对照，其具有与VHH A-siGFPst1偶联物相同的结构和尺寸，但没有靶向TfR的能力。

所述偶联策略涉及汇聚合成，并平行地修饰了：i)VHH，以位点特异性地引入叠氮基连接物；和ii)siGFPst1，以引入与所述叠氮官能团互补的约束的叠氮基组成部分。在最后一步中，使用无铜点击反应将官能化的VHH-叠氮化物和炔烃-siGFPst1前体两者彼此相连。

VHH-叠氮化物的合成

使用基于细菌转谷氨酰胺酶(BTG)的连接策略进行与VHH的位点特异性偶联。所述BTG酶催化插入到被BTG酶特异性识别的标签序列(即Q-标签)中的谷氨酰胺残基与氨基官能化的底物之间的异肽键的形成。所述引入的氨基官能化的底物是异双功能连接物，其在一个末端处含有被我们证明是BTG酶的底物的氨基组成部分，并在另一个末端处含有用于通过无铜点击化学偶联到siGFPst1的叠氮基组成部分。

BTG偶联方案：

将3-叠氮基-1-丙胺(20当量/Gln)溶解在PBS(1X)中，并添加到机构内部生产的带有Q-标签的VHH。然后将BTG(Zedira,Darmstadt,德国)引入到所述混合物中(0.1U/nmol的Gln)，允许其在37℃反应过夜。在Protino Ni-ida 1000预装柱上，按照制造商的说明书通过层析进行粗品混合物的纯化，以将VHH-叠氮化物与过量的起始原料以及可能的副产物分离开。在280nm处读取吸光度，以计算纯化的VHH-叠氮化物构建物的量并由此计算偶联得率(在70-80％的范围内)。

将最终的VHH-叠氮化物通过LCMS分析进行表征，以检查它们的身份和纯度。

炔烃-siGFPst1的合成

siGFPst1购自Dharmacon，在正义链上具有3’胺修饰(N6-siGFPst1)，以允许它被与VHH-叠氮化物的点击化学偶联所需的炔烃组成部分进一步官能化。

siGFPst1官能化方案

将N6-siGFPst1(1当量)溶解在NaB(0.09M；pH 8.5)偶联缓冲液中，以获得0.3至0.8mM之间的终浓度。然后向该溶液添加DBCO-NHS(20当量，DMSO)。将反应混合物在室温搅拌2小时。通过在冷无水乙醇中沉淀来纯化炔烃-siGFPst1。在260nm处读取吸光度，以计算纯化的炔烃-siGFPst1构建物的量并由此计算偶联得率(在40-50％的范围内)。

将最终的炔烃-siGFPst1通过分析HPLC进行表征，以检查它的身份和纯度。

VHH-siGFPst1的合成

将VHH-叠氮化物和炔烃-siGFPst1前体两者通过无铜点击化学反应进行最终偶联，以获得最终偶联物VHH-siGFPst1。

VHH-siGFPst1偶联方案：

将炔烃-siGFPst1(2当量)溶解在PBS(1X)中，并添加到所述VHH-叠氮化物(1当量，在PBS(1X)中的终浓度在100μM范围内)。允许反应混合物在室温搅拌过夜。将最终偶联物首先在Superdex75柱上通过凝胶过滤层析进行纯化，其次使用Amicon超速离心滤器(10K)进行浓缩。在260nm处读取吸光度，以计算纯化的VHH-siGFPst1构建物的量并由此计算偶联得率(总得率在30％的范围内)。

将最终的VHH-siGFPst1(VHH A-siGFPst1和VHH Z-siGFPst1)通过分析SEC-HPLC和琼脂糖凝胶电泳进行表征，以检查它们的身份和纯度。

实施例XIV

VHH-siRNA生物偶联物的体外基因沉默活性

治疗性核酸、特别是siRNA寡核苷酸的特异性细胞靶向和富有成效的细胞内递送仍然是一个重大挑战。这些作为带多个电荷的亲水性寡聚体的分子的结构和物理化学特点阻止了它们在没有得到帮助的情况下进入任何亚细胞区室，本发明的VHH被用于将小干扰RNA(siRNA)跨越细胞膜运输以进入胞质溶胶。

首先，如实施例VII(VHH A1-A19的结合亲和性的确定)中所述，通过在相同的CHO-hTfR-GFP细胞上添加浓度在2μM至30pM范围内的VHH A-siGFPst1和VHH B-siGFPst1生物偶联物，在4℃下1小时，来评估它们的表观hTfR结合亲和性(K_{d app})。细胞表面结合的分子的定量通过抗6His抗体免疫细胞化学来进行，并使用GraphPad

软件将实验数据进行非线性回归拟合。正如以前使用游离的VHH A和VHH B所示，所述VHH A-siGFPst1和VHH B-siGFPst1生物偶联物表现出与细胞表面靶hTfR的浓度依赖性且可饱和的结合，K_{d app}值在与未偶联的VHH A和VHH B相同的低纳摩尔范围内(图15A)。使用对照VHH Z未观察到显著的结合。这进而证实了VHH A和VHH B与siRNA的偶联不改变它们特异且高效地结合hTfR的能力。

其次，在稳定表达与EGFP融合的TfR的活的CHO细胞系(CHO-hTfR-EGFP细胞)中，通过使用Dharmafect 1(Dharmacon)转染25nM的偶联物以直接递送到胞质溶胶中，评估了VHH-siGFPst1生物偶联物的固有沉默活性。在转染后72小时使用流式细胞术定量细胞内GFP的总量。结果证实，所述VHH A-siGFPst1偶联物诱导GFP蛋白质水平大约85％的降低，与未偶联的siGFPst1或对照VHH Z-siGFPst1偶联物相比在相同范围内(图15B)。这证实了所述VHH A或Z的偶联不妨碍所述siRNA经历RISC装载并发挥其沉默活性。在另一系列实验中，将所述VHH A-siGFPst1偶联物以10nM至1pM范围内的浓度在CHO-hTfR-EGFP细胞上转染，并在转染后120小时使用流式细胞术定量细胞内GFP的总量。这导致GFP蛋白质水平的浓度依赖性降低，IC50为50.4pM，并且在这种条件下最大沉默效率为-90.2％(图15C)。

第三，评估了VHH A在与siGFPst1偶联后引发hTfR介导的内吞作用并随后以药理学量递送到靶细胞的胞质溶胶中的能力。将1μM的所述VHH A-siGFPst1或对照VHH Z-siGFPst1生物偶联物在CHO-hTfR-GFP细胞上在37℃温育120小时，以允许自由摄取、递送到胞质溶胶并在mRNA转录本和蛋白质水平上发生基因沉默。这导致使用结合TfR的VHH A-siGFPst1生物偶联物时GFP蛋白质水平大约-70％的显著降低，而使用对照VHH Z-siGFPst1生物偶联物时没有观察到沉默(图15D)。接下来，将VHH A-siGFPst1生物偶联物以3μM至10pM范围内的浓度在CHO-hTfR-GFP细胞上温育120小时。这导致GFP蛋白质水平的浓度依赖性降低，IC50为2.73±0.23nM，并且在这种条件下的最大沉默效率为-61.6±2.9％(图15E)。这证实了与hTfR的细胞表面结合和随后VHH A-siGFPst1生物偶联物的内吞允许它以药理学量递送到胞质溶胶中，并且IC50与所述生物偶联物的hTfR结合亲和性在相同的纳摩尔范围内。

第四，在竞争测定法中确认了hTfR参与所述VHH A-siGFPst1生物偶联物在CHO-hTfR-GFP细胞上自由摄取后观察到的沉默效应。在这个实验中，将VHH A-siGFPst1在如先前实验所定义的30nM的饱和浓度下，单独地或在100X过量的游离VHH A、B或Z存在下在37℃温育120小时。结果证实在游离VHH A或VHH B存在下，GFP蛋白水平的约60％降低几乎被完全废止(GFP蛋白质水平分别被维持在对照水平的85％和96％)。重要的是，当使用过量的无关VHH Z时没有观察到竞争(图15F)。这明确证实了VHH A-siGFPst1生物偶联物的沉默效应确实是由于hfR介导的细胞摄取和随后递送到细胞质中造成的。

第五，使用脉冲-追踪程序，评估了TfR介导的VHH A-siGFPst1生物偶联物的GFP沉默效应。将CHO-hTfR-GFP细胞暴露于浓度在300nM至1pM范围内的VHH A-siGFPst1短的时段(6小时)，然后在无配体培养基中追踪直至120小时的总时长。这个实验允许评估早期细胞摄取对先前通过120小时的连续温育所观察到的沉默效应的贡献。正如使用连续温育观察到的，所述VHH A-siGFPst1生物偶联物同样诱导GFP蛋白质水平的浓度依赖性降低，具有1.24nM的相近的IC50和-54.2％的最大沉默效率(图15G)。这个结果表明先前在120小时连续温育后观察到的效应大部分是由于前6小时内富有成效的TfR介导的摄取造成的。这个发现特别令人感兴趣，因为在通过静脉内或皮下快速浓注给药时，此类生物偶联物的体内血浆药物动力学情况通常允许组织暴露在治疗水平下仅仅几个小时的时长。因此，本文中描述的靶向TfR的VHH代表了用于体内靶向和高效基因沉默的可行工具。

最后，通过将30nM的VHH B-siGFPst1生物偶联物在CHO-hTfR-GFP细胞上温育120小时，评估了VHH B引发hTfR介导的内吞作用和随后的基因沉默的能力。结果显示出与使用VHH A-siGFPst1生物偶联物获得的相近的GFP水平的大约-60％的降低，证实了这些VHH表现出相近的TfR靶向和细胞内递送潜力(图15H)。

据我们所知，通过使用三触角GalNAc作为靶向配体的脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的受体介导的肝细胞摄取，是能够在纳摩尔浓度下引发特异且高效的基因沉默的唯一的配体/受体系统。然而，这种系统在使用治疗性核酸的体内治疗应用中的使用受限于肝脏靶点，因为ASGPR在体内排他地表达在肝细胞中。因此，本发明提供了一种新的配体/受体系统，用于将纳摩尔浓度的治疗性核酸例如siRNA靶向并细胞质内递送到表达TfR的肝外器官和组织中。

实施例XV

VHH-NODAGA偶联物的合成

带有Q-标签的VHH A的设计

在本实施例中，合成了编码在C-端末端中引入有Ala连接物、His标签、Gly连接物和Q-标签(AAA-His标签-GGG-LQR序列)的VHH A的DNA片段，并将其克隆到pHEN1载体中。

基于BTG的VHH A-叠氮化物的制备：

将3-叠氮基-1-丙胺(20当量/Gln)溶解在PBS(1X)中，并添加到机构内部产生的带有LQR标签的VHH A。将BTG(Zedira,Darmstadt,德国)引入到所述混合物(0.1U/nmol的Gln)中。然后允许所述反应混合物在37℃反应过夜。在Protino Ni-ida 1000预装柱上按照制造商的说明书通过层析对所述粗品混合物进行纯化，以将VHH A-叠氮化物与过量的起始原料以及潜在的副产物分离开。在280nm处读取吸光度，以计算纯化的VHH A-叠氮化物构建物的量并由此计算偶联得率(在70-80％的范围内)。将最终的VHH A-叠氮化物通过LCMS分析进行表征，以检查它的身份和纯度。

将VHH A-叠氮化物偶联到商品化炔烃-NODAGA的点击化学反应

允许VHH A-叠氮化物(1当量)与异双功能NODAGA-BCN(5当量)(Chematech,Dijon,法国)在室温下在PBS中反应。反应通过LCMS进行监测。在所述反应完成后，将最终的偶联物在Protino Ni-ida1000预装柱上按照制造商的说明书通过层析进行纯化，以将所述VHH A-叠氮化物与过量的起始原料以及潜在的副产物分离开。在280nm处读取吸光度，以计算纯化的VHH A-NODAGA构建物的量并由此计算偶联得率(在50-60％的范围内)。将最终的VHH A-NODAGA通过LCMS分析进行表征，以检查它的身份和纯度。

实施例XVI

VHH-68Ga生物偶联物在成胶质细胞瘤的皮下小鼠模型中的PET成像

成胶质细胞瘤是最常见的原发性恶性脑肿瘤，并且已知U87细胞系这种人类原代成胶质细胞瘤细胞系表达高水平的TfR。为了评估本发明的VHH的成胶质细胞瘤靶向，将放射性标记的VHH A-NODAGA生物偶联物静脉内给药到先前移植有成胶质细胞瘤细胞的小鼠(异种移植模型)，并进行PET扫描成像。

VHH A-NODAGA的放射性标记和结合亲和性确认

首先，使用68Ga氯化物对VHH A-NODAGA进行放射性标记。镓使用可商购的基于TiO2的68Ge/68Ga发生器(Obninsk)以68Ga3+形式获得。通过将60μg VHH A-NODAGA与74–148MBq(2-4mCi)的68Ga在400μL乙酸铵缓冲液(1M，pH 6)中在25℃反应10分钟，进行放射性标记反应。获得的VHH A-68Ga放射化学纯度(RPC)>95％。

在放射性标记后，如在实施例VII(VHH A1-19的结合亲和性的确定)中所述，通过在相同的CHO-hTfR-GFP细胞上添加2μM至30pM范围内的浓度，在4℃下1小时，评估了VHH A-NODAGA和VHH A-68Ga生物偶联物的表观hTfR结合亲和性(K_{d app})。通过抗6His抗体免疫细胞化学进行细胞表面结合的VHH A生物偶联物的定量，并使用GraphPad

软件对实验数据进行非线性回归拟合。VHH A-NODAGA和VHH A-68Ga生物偶联物与细胞表面靶受体hTfR表现出浓度依赖性和可饱和的结合，K_{d app}值在与未偶联的VHH A相同的低纳摩尔范围内(图16A)。使用对照VHH Z没有观察到显著的结合。这证实了VHH A与NODAGA配体的偶联和放射性标记流程不改变它特异性结合hTfR的能力。

PET扫描成像

动物研究按照由Aix-Marseille Ethic comity批准的方案(Comity 14)进行。4周龄雌性BALB/c裸小鼠从Charles River Inc获得。在小鼠(n＝6)双肩之间皮下移植在100μL含有50％基质胶(Corning)的完全培养基中的U87-MG细胞(2×10⁶个)。在移植后第28天(当肿瘤达到300-700mm³之间的体积时)，将所述动物用剂量为5±1MBq的VHH A-68Ga的静脉内单次浓注进行给药。在给药后，使用PET成像评估在成胶质细胞瘤癌症异种移植物和其他组织中的生物分布。

PET/CT扫描对于3只小鼠来说在2小时期间获取，并且对于另外3只小鼠来说在注射后(p.i.)2小时获取。PET和PET/CT研究在microPET/microCT啮齿类模型扫描仪(

Mediso)上进行。用5％异氟烷诱导麻醉并维持在1.5％。为了提高图像质量，每次静态PET发射扫描(能量窗口400-600keV；时间：一个FOV 20分钟)获取每只小鼠2000万个符合事件。对于双模态PET/CT，获取CT图像(35kVp，曝光时间350ns，中等变焦)，对相应的PET扫描进行解剖配准和校正衰减。对于双模态PET/CT来说，获取CT图像(35kVp，曝光时间350ns，中等变焦)，并对相应的PET扫描应用解剖配准和校正衰减。

注射有VHH A-68Ga的动物的成像照片显示出在肿瘤部位处显著的积累(图16B，1.46％的ID/g)和良好的肿瘤/肌肉比率(4.0)。因此，实验在第28天显示出成胶质细胞瘤被VHH A-68Ga的清楚且选择性的成像和标记，与已知的TfR高表达水平相一致。

序列表

Claims (29)

1.一种式FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的VHH分子，其中所述VHH分子以0.1nM至10μM之间的亲和性(Kd)结合人类和非人类动物TfR两者。

2.根据权利要求1所述的VHH，其中所述VHH能够跨越血脑屏障。

3.根据权利要求1或2所述的VHH，其中所述分子与人类TfR的结合不与转铁蛋白的结合竞争。

4.根据权利要求1至3中的任一项所述的VHH分子，其结合人类和啮齿类TfR1两者。

5.根据权利要求1所述的VHH分子，其包含：

.选自SEQ ID NO：1、5、9、13、17、19、67和69的CDR1序列，和/或

.选自SEQ ID NO：2、6、10、14、21、23、71、73和75的CDR2序列，和/或

.选自SEQ ID NO：3、7、11、15、25、27、29、31、33、77、79、81、83和85的CDR3序列。

6.根据权利要求1所述的VHH分子，其包含SEQ ID NO：1、2和3，或SEQ ID NO：5、6和7，或SEQ ID NO：9、10和11，或SEQ ID NO：13、14和15，或SEQ ID NO：17、2和3，或SEQ ID NO：19、2和3，或SEQ ID NO：1、21和3，或SEQ ID NO：1、23和3，或SEQ ID NO：1、2和25，或SEQ ID NO：1、2和27，或SEQ ID NO：1、2和29，或SEQ ID NO：1、2和31，或SEQ ID NO：1、2和33。

7.根据权利要求1所述的VHH分子，其包含SEQ ID NO：67、2和3，或SEQ ID NO：69、2和3，或SEQ ID NO：1、71和3，或SEQ ID NO：1、73和3，或SEQ ID NO：1、75和3，或SEQ ID NO：1、2和77，或SEQ ID NO：1、2和79，或SEQ ID NO：1、2和81，或SEQ ID NO：1、2和83，或SEQ ID NO：1、2和85。

8.根据权利要求1至7中的任一项所述的VHH分子，其被人源化。

9.根据权利要求5或6所述的VHH分子，其包含选自SEQ ID NO：4、8、12、16、18、20、22、24、26、28、30、32和34中的任一者的氨基酸或由所述氨基酸构成，其中x是0或1。

10.根据权利要求7所述的VHH分子，其包含选自SEQ ID NO：68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、87、88、89、90、91和92中的任一者的氨基酸或由所述氨基酸构成，其中x是0或1。

11.根据权利要求9或10所述的VHH分子，其中x是0。

12.根据前述权利要求中的任一项所述的VHH分子，其还包含序列LQR的Q-标签。

13.根据前述权利要求中的任一项所述的VHH分子，其还包含Gly连接物。

14.根据权利要求1所述的VHH分子，其中所述分子竞争性抑制根据权利要求6至10中的任一项所述的VHH与人类和非人类TfR的结合。

15.根据前述权利要求中的任一项所述的VHH，其以1nM至1μM范围内的亲和性(Kd)与人类TfR1受体结合。

16.一种核酸，其编码根据权利要求1至15中的任一项所述的VHH。

17.一种载体，其包含优选地可操作连接到启动子的根据权利要求16或27所述的核酸。

18.一种重组宿主细胞，其含有根据权利要求16或27所述的核酸或根据权利要求17所述的载体。

19.根据权利要求1至15中的任一项所述的VHH，其被偶联到至少一个分子。

20.一种嵌合药剂，其包含偶联到至少一个分子或支架的一个或多个根据权利要求1至15中的任一项所述的VHH。

21.根据权利要求20所述的嵌合药剂，其中所述至少一个分子是活性化合物，优选为治疗、诊断或成像药剂。

22.根据权利要求20所述的嵌合药剂，其中所述至少一个分子是病毒或病毒样粒子。

23.根据权利要求20或21所述的嵌合药剂，其中所述至少一个分子是稳定化基团。

24.根据权利要求20至23中的任一项所述的嵌合药剂，其以任何顺序包含VHH、稳定化基团和活性化合物。

25.一种药物组合物，其包含根据权利要求21或22所述的嵌合药剂。

26.一种诊断组合物，其包含根据权利要求21所述的嵌合药剂。

27.一种核酸，其编码根据权利要求20所述的嵌合药剂，其中所述分子包含氨基酸序列。

28.一种制造VHH或其偶联物的方法，所述方法包括将根据权利要求18所述的宿主细胞在允许所述核酸表达的条件下培养。

29.一种制造根据权利要求20所述的嵌合药剂的方法，所述方法包括将一个或多个根据权利要求1至15中的任一项所述的VHH共价或非共价地偶联到至少一个分子。

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