TR201809743T4 - Kan beyin bariyerinden terapötik moleküllerin taşınmasının arttırılması. - Google Patents

Kan beyin bariyerinden terapötik moleküllerin taşınmasının arttırılması. Download PDF

Info

Publication number
TR201809743T4
TR201809743T4 TR2018/09743T TR201809743T TR201809743T4 TR 201809743 T4 TR201809743 T4 TR 201809743T4 TR 2018/09743 T TR2018/09743 T TR 2018/09743T TR 201809743 T TR201809743 T TR 201809743T TR 201809743 T4 TR201809743 T4 TR 201809743T4
Authority
TR
Turkey
Prior art keywords
binding
domain
antibody
molecule
binding molecule
Prior art date
Application number
TR2018/09743T
Other languages
English (en)
Inventor
k farrington Graham
Sisk William
Original Assignee
Biogen Ma Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biogen Ma Inc filed Critical Biogen Ma Inc
Publication of TR201809743T4 publication Critical patent/TR201809743T4/tr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/22—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Buluş, kısmen bir BBB-transmigrasyon antikorunun (örneğin, TEMEMAA (CDC-50A) bağlanma antikoru, FC5) dimerik bir versiyonunun, monovalent FC5 VHH ile karşılaştırıldığında BBB?ye taşınmasını büyük ölçüde geliştirdiğinin bulunmasına bağlıdır. Buluş, diğerleri arasında, kan beyin bariyerine farmakolojik olarak aktif ajanların taşınmasını artıran moleküller, kan beyin bariyerine taşımayı artıran yöntemler ve nörolojik bir bileşene sahip rahatsızlıklar ve hastalıkların tedavisinin yöntemlerini sağlar.

Description

TARIFNAME KAN BEYIN BARIYERINDEN TERAPÖTIK MOLEKÜLLERIN TASINMASININ ARTTIRILMASI Bulusun Alt-Yapisi Vücut boyunca makro-moleküllerin dagilimi genel olarak, kapiler vaskülatürün hayli fenestre endotelyal hücre astarlarini geçerek dokularin içine difüz eden kandaki makro- moleküler ile aracilik edilen difüzyondur. Makro-moleküllerin serbest difüzyonu, hayli vaskülarize olmus beyinde gerçeklesmez. Beyin kapiler endotelyal hücreleri, dolasim sisteminin geri kalaninda görülen fenestrasyonlardan ve hayli Özellesmis endotelyal hücre siki intraselüler baglanti- yerlerinden yoksundur. Bu siki baglanti-yerleri, 400 kDa'dan daha büyük olan moleküllerin kapilerin lüminal tarafindan ablüminal tarafina serbest difüzyonunu önleme görevi görür.
Buna ek olarak, kapilerler çesitli transporter sistemler, örnegin, Organik Anyon Transpörterler (OATS) ve aksi durumda endotelyal hücreler yoluyla difüz edebilen moleküllerin aktif bir sekilde tasima gradyanlarini olusturan Çok-Ilaca Direnç (MDR) sistemlerini içerir. Sinirlayici bariyerlerin kombinasyonu, örnegin, toksinleri ve virüsleri içeren, advantisyöz ajanlarin girisini önler ayni zamanda terapötik varliklarin difüzyonunu sinirlandirir. Buna ek olarak, bu sinirlayici kan beyin bariyerleri (BBB) potansiyel olarak terapötik proteinlerin, peptitlerin ve küçük moleküllerin farmakolojik olarak terapötik dozlarda beyin parankimasina pasif aktarimini etkili bir sekilde bloke eder.
Terapötik moleküllerin BBB endotelyal hücrelerini geçerek tasinmasini saglamak için basarili bir strateji, reseptör aracili transsitoz (RMT) avantajini kullanmaktir. Bu strateji, BBB endotelyal hücreleri üzerinde, moleküllerin BBB endotelyal hücrelerini geçerek tasinmasina tipik olarak dahil edilen, proteinleri spesifik olarak baglayan antikorlari veya molekülleri kullanir. Bu tarz antikorlar, BBB endotelyal hücrelerini geçerek transsitoz gerçeklestirirken tutturulmus yükleri aktarmak için mekik molekülleri olarak kullanilir. Bu teknolojinin uygulamalarinin örnekleri, transferrin reseptörü ve insülin reseptörleri için antikorlarin kullanimini içerir (Yu et al., 2011. Science Translational Medicine. Volume 3).
Bu iki durumda, RMT antikorlar terapötik protein alanlarina C- ucundan kaynastirilmistir ve molekülleri BBB'yi geçerek tasidigi gösterilmistir. Ne yazik ki, yaygin sekilde kullanilan RMT hedefleri transferrin ve insülin reseptörleri çok sayida dokuda hayli ve genis bir sekilde eksprese edilir.
Bu genis hedef ekspresyon sonuçlari, bir kisa. dolasini yari- ömrü ile sonuçlanir, yani nihayetinde BBB endotelyal hücrelerine maruziyet ve böylece molekülün beyin içine dozlanma süresini sinirlandirir. Buna ek olarak, bu antikorlar metabolik olarak kritik hücresel fonksiyonlari hedef alir, böylece bir potansiyel güvenlik riski olusturur.
BBB'yi geçmek için aktif BBB tasima moleküllerinden faydalanan iyilestirilmis hedefleme kisimlarinin, örnegin, BBB'yi geçerek trans-göç-eden antikor moleküllerinden türetilen baglama yerlerinin, terapötiklerin beyne aktarimi için büyük bir yarari olacaktir.
Abulrob et al., (International Congress Series, Excerpta proteinine kimyasal konjugat olan anti-TMEBOA tek alanli antikor FC5'i ayni zamanda FC5 ve verotoksin-kisimlari içeren Bulusun Kisa Açiklamasi Bulusun ana konusu, istemler ile tanimlanir. Bulus, en azindan kismen, bir kan beyin bariyerini (BBB) trans-göç-eden antikor, Örnegin, bir TMEMBOA (CDC-SOA) baglama antikoru (mesela, Örnegin, tek alanli antikor FC5), içeren bir füzyon proteininin tek-degerlikli Vw'ye kiyasla BBB'yi geçerek tasimayi büyük ölçüde güçlendirdiginin bulundugu bulgusuna dayanir. Ilk baglama ve BBB endotelyal tasima deneyleri, FCS'in, bir lama tek alanli Vmi antikorunun (sdAb), bir` BBB endotelyal hücre katmanini geçen tasimayi kolaylastirabildigini göstermistir (bakiniz, örnegin, 7,943,129 U.S. Patenti). Bir Vw'nin dolasimdaki yari-ömrünün, düsük inoleküler agirligindan ve bir` FC alaninin yoklugundan dolayi kisa oldugu bilinir (Jain, M., Kamal, N. ve Batra, 8.
K., Jain, M., Wittel, U. A., Chauhan, S. C. ve Colcher, D.
Ilginç bir sekilde, bu yapinin dolasimdaki yari-ömrü bir BBB- trans-göç-eden tek alanli antikoru, bir iki-degerlikli antikor benzeri yapi ile sonuçlanarak, bir insan Fc'sinin N-ucuna kaynastirma ile büyük ölçüde arttirilmistir. Bu tarz bir baglama yerinin bir PC yapisina katilmasi, hücresel yüzey üzerinde eksprese edilen, varsayimsal hedefe, örnegin, TMEM30A'ya, baglanmis her' bir* baglama kismini iki-degerlikli baglama potansiyeli ile, bir iki-degerlikli molekül olusturur.
Iki-degerlikli baglama, bir avidite etkisinden dolayi görünür baglama afinitesinde bir anlamli degisime yön verebilir gösterildigi üzere, etkilesimin afinitesi arttirilmistir. Bu afinite artisi hesaba katildiginda, Fc'nin bir iki-degerlikli molekül olusturmak için eklenmesinin BBB'yi geçerek tasimayi anlamli bir sekilde arttirdigi bulgusu beklenmemistir. Bir FC alaninin eklenmesinin molekülün böbrek filtrasyonunu önleyen arttirilmis kütlesinden ve FcRn'yi baglama ile antikor geri- dönüsümünün in vivo tesvik edilmesinden dolayi beta-fazi farmakokinetiklerini uzatabilmesine ragmen, güçlendirilmis görünür` afinite artisinin ayrica bir hayli eksprese edilmis hedefi baglama üzerine dolasimdaki baglama moleküllerinin eliminasyonundan dolayi karsi etkiye de sahip olabileceginden, arttirilmis tasima beklenmemistir. Bununla birlikte, en ilginci, burada gösterildigi üzere, baglama yeri-FC konformasyonundaki (amino ucundan karboksi ucuna dogru, yani, Fc'nin N-ucuna kaynastirilmis baglama yeri) füzyon proteinlerinin, Fc-baglama yeri konformasyonundakilere (Fc'nin C-ucuna kaynastirilmis baglama yeri) kiyasla daha yüksek aktiviteye sahip oldugu bulunmustur. Bu, Fc-baglama yeri füzyon proteinlerinin (Fc'nin C-ucuna kaynastirilmis baglama yeri) in vitro yapilan ilk deneylerde endotelyal hücreleri arttirilmis baglama gösterdigi gerçegine ragmen dogrudur.
Baglama yeri-FC yapilarinin tek-degerlikli versiyonlari da saglanir.
Bu dogrultuda, bir` yönünde, açiklama en az bir farmakolojik olarak aktif ajan ve TMEM30A'yi baglayan en az bir baglama yeri, örnegin, bir BBB trans-göç-etme baglama yeri, içeren bir baglama molekülü saglar, burada TMEM3OA'yi baglayan en az bir baglama yeri i) dogrudan veya ii) bir araya-giren amino asit dizisi vasitasiyla bir FC kisminin N-ucuna kaynastirilir.
Bulusun baglamasi, en az iki baglama yeri içerir.
Açiklamanin bir yönünde, en az bir baglamar yeri, FC5 amino asit dizisi içerir. Açiklamanin bir yönünde, baglama molekülü, TMEM3OA'yi baglayan en az iki veya en az üç (örnegin, iki veya üç) baglama yeri içerir. Bir uygulamada, baglama molekülü, TMEM3OA'yi baglayan en az üç veya en az dört (örnegin, üç veya dört) baglama yeri içerir.
Açiklamanin bir yönünde, en az bir BBB trans-göç-etme yeri (örnegin, BBB'yi geçerek trans-göç-eden antikor moleküllerinden türetilen baglama yeri), Fc kismina genetik Açiklamanin bir yönünde, en az bir BBB trans-göç-etme yeri (örnegin, BBB'yi geçerek trans-göç-eden antikor moleküllerinden türetilen baglama yeri), bir peptit baglayici içeren bir araya-giren amino asit dizisi vasitasiyla Fc kismina genetik olarak kaynastirilir.
Açiklamanin bir yönünde, en az bir BBB trans-göç-etme yeri (örnegin, BBB'yi geçerek trans-göç-eden antikor moleküllerinden türetilen baglama yeri), bir peptit baglayicidan olusan bir araya-giren amino asit dizisi vasitasiyla Fc kismina genetik olarak kaynastirilir.
Açiklamanin bir yönünde, iki BBB trans-göç-etme yeri (örnegin, BBB'yi geçerek trans-göç-eden antikor moleküllerinden türetilen. baglama. yerleri), bir` peptit. baglayici içeren bir amino asit dizisi vasitasiyla bir tam Fc bölgesinin iki farkli Fc kisminin N ucuna kaynastirilir.
Açiklamanin bir yönünde, en az bir BBB trans-göç-etme yeri (örnegin, BBB'yi geçerek trans-göç-eden antikor moleküllerinden türetilen baglama yerleri), bir scFc molekülünün N ucuna kaynastirilir.
Bir uygulamada, en az bir farmakolojik olarak aktif ajan Fc bölgesinin C-ucuna kaynastirilir.
Bir uygulamada, en az bir farmakolojik olarak aktif ajan bir küçük kimyasal varliktir.
Bir uygulamada, küçük kimyasal varlik, baglama molekülüne bir sistein rezidüsünde kaynastirilir. Bir uygulamada, sistein rezidüsü, bir mühendislik uygulanmis sistein rezidüsüdür.
Bir uygulamada, en az bir farmakolojik olarak aktif ajan bir polipeptittir.
Bir uygulamada, en az bir farmakolojik olarak aktif ajan bir antijen baglama yeri (örnegin, bir BBB-trans-göç-etmeyen antikordan türetilen bir antijen baglama yeri) içerir.
Bir uygulamada, farmakolojik olarak aktif ajan, bir scFV molekülünden, bir Fab molekülünden ve bir tek alanli antikordan olusan gruptan seçilir.
Bir uygulamada, en az bir farmakolojik olarak aktif ajan baglama molekülüne genetik olarak kaynastirilir.
Bir uygulamada, en az bir farmakolojik olarak aktif ajan baglama molekülüne kovalent olarak baglanir.
Açiklamanin bir yönünde, BBB trans-göç-etme yeri bir antikor molekülünün VH alanini içeren bir araya-giren amino asit dizisi vasitasiyla genetik olarak kaynastirilir.
Açiklamanin bir yönünde, BBB trans-göç-etme yeri bir antikor molekülünün VL alanini içeren bir araya-giren amino asit dizisi vasitasiyla genetik olarak kaynastirilir.
Açiklamanin bir yönünde, en az bir BBB trans-göç-etme yeri bir aynen antikor molekülünün bir VH alaninin N ucuna genetik olarak kaynastirilir.
Açiklamanin bir yönünde, en az bir BBB trans-göç-etme yeri bir aynen antikor molekülünün bir VL alaninin N ucuna genetik olarak kaynastirilir.
Açiklamanin bir yönünde, iki BBB trans-göç-etme yeri bir aynen antikor molekülünun bir VH alaninin ve bir VL alaninin N ucuna genetik olarak kaynastirilir.
Bir uygulamada, araya-giren amino asit dizisi ilaveten bir peptit baglayici içerir.
Bir uygulamada, farmasötik olarak aktif ajan, asagidakilerden olusan gruptan seçilir: bir nöroaktif peptit, bir küçük kimyasal varlik ve santral sinir sisteminde bir hedefi baglayan bir antikorun bir degisken bölgesi.
Bir uygulamada, bulus bir nörolojik bozuklugu tedavi etmenin, bulusun, baglama` molekülünü bir süjeye uygulamayi içeren bir yönteminde kullanim için bulusun bir baglama molekülü ile Bir uygulamada, nörolojik bozukluk bir depolama bozuklugudur.
Bir uygulamada, nörolojik bozukluk kronik agridir. Bir uygulamada, nörolojik bozukluk, epilepsidir. Bir uygulamada, nörolojik bozukluk multipl sklerozdur. Bir uygulamada, nörolojik bozukluk proteinopati hastaligidir. Bir uygulamada, nörolojik bozukluk bir demiyelinizan bozukluktur.
Bir baska uygulamada, bulus bir nörolojik bozuklugun tedavisi için bir ilacin imalatinda bulusun bir baglama molekülünün kullanimi ile ilgilidir.
Sekillerin Kisa Açiklamasi Sekil 1, (a) tek basina, (b) N-ucundan (FCS-Fc) veya (o) C-ucundan (Fc-FCS) bir insan IgGl agli Fc alanina kaynastirilmis FCS tek agir alanli antikorun ayni zamanda bir farmasötik olarak aktif kisim olarak bir BBB-trans- göç-etmeyen alani katan olasi antikor-benzeri yapilarin (d, e) diyagram seklindeki temsillerini gösterir.
Moleküller (f) ve (g), bir FC5 tek agir alanli antikorün bir tam antikor molekülüne eklenmesini gösterir; tek agir alanli antikor, Örnegin, VL veya VH alanina veya her ikisine, kaynastirilabilir.
Sekil 2, Her bir saflastirilmis proteinin 2,5 pg'inin bir gösterir. 10-220 kD araligindaki SDS PAGE moleküler agirlik standartlari her bir jel üzerinde etiketlenir.
Panel A'da indirgememe (1) ve indirgeme sütunu (2) FC5, Panel B'de indirgememe (1) ve indirgeme sütünü (2) FC5-FC ve Panel C'de indirgememe (1) ve indirgeme sütunu (2) Fc- FC5 gösterilir.
Sekil 3, FC5Fc'nin, FcFCS'in ve FC5'in l2F6A (hIgGl), CRL2434 (mIgGl) ve C37H (yalnizca Vw) kontrol antikorlari ile karsilastirildiginda bir in vitro SV40 siçan BBB transforme edilmis endotelyal hücre hattini geçerek tasinmasinin arttirilmis hizini gösterir.
Sekil 4a-c. Panel 4(a), FC5-PC'nin (O), Fc-FCS'in (I) ve bir hch agli alaninin (Vm1 -Fc) (A) N-uçlarina kaynastirilmis bir ilgisi olmayan kontrol kamelid Vw'sinin bir SV4O siçan BBB transforme edilmis endotelyal hücre hattini baglamasini gösterir. Panel (4b), FC5-PC'nin (O) ve Fc-FCS'in (I) bir primer siçan BBB endotelyal hücre hattini baglamasini gösterir. Panel 4c, FC5-PC'nin siçan (D) veya insan (0) ve Fc-FCS'in EBNA293 hücrelerinde geçici olarak eksprese edilen siçan (A) veya insan (o) TMEM3OA'sini baglamasini gösterir.
Sekil 5a-c. Panel 5a, Dalargin'e kovalent olarak çapraz- baglanmis FC5'in (FC5-Dal) Hargreaves hayvan modelinde agriyi baskilama yetisini gösterir. Pati geri-çekme hizi, bir 20 saniyelik zaman çerçevesine göre maksimum olasi etkinin yüzdesi (MPE'nin %'si) olarak ifade edilir.
Negatif kontrol kontralateral enflamasyon-meydana gelmeyen kontrol patisi için pati geri-çekme hizini gösterir (o) ve pozitif kontrol siçana yalnizca PBS IV enjekte edildiginde enflamasyon-meydana gelen patinin çabuk pati geri-çekme hizini gösterir (O). 21 mg/Kg'da (mpk) FCS-Dal'in bir tek çekme hizini baskilamak için '7 mpk'da ECS-Dal'in üç IV dozu (E) ile karsilastirilir. Panel 5b, degerlendirilen her bir pati için zamana karsi MPE yanit %'si için egri altinda kalan ortalama alani gösterir. Panel 50, burada siçanlara 7 mpk bir ilgisi olmayan Vw-Dal'in (gir kutularin) veya tek basina FC5'in (içi bos kutular) zaman O'da, l sa'te ve 2 sa'te üç doz ile IV enjekte edildigi ilave negatif kontrol deneylerini gösterir. Kontralateral kontrol patisi de gösterilir (içi dolu daireler). Pati geri-çekme hizinin supresyonu için MPE'nin s'si Hargreaves hayvanda belirlenmistir.
Sekil 6a-d. Fc-FCS-Dal'in etkinligi Hargreaves modelinde degerlendirilmistir. Siçanlar` Panel 6a'da zaman O'da ve Panel 6B'de zaman O'da ve 2 sa'te 2 mpk'da IV dozlanmistir. Paneller 6C'de ve 6D'de her bir siçan zaman O'da 6,5 mpk'da IV dozlanmistir.
Sekil 7a-d. FCS-Fc-Dal'in Hargreaves modelinde etkinligi, bir negatif kontrol Fc-Dal ile karsilastirilmistir. Zaman O'da siçanlar 0,5, 2,5 veya 6,0 mpk'da FCS-Fc-Dal'in veya FC-Dal'in bir tek konsantrasyonu ile IV dozlanmistir.
Veriler paneller 7a'da ve 7b'de, verilen zamanda maksimum olasi etki yüzdesi (MPE) olarak veya paneller 7c'de ve 7d'de egri altinda kalan alan yüzdesi olarak sunulur.
Bulusun Detayli Açiklamasi En az bir BBB trans-göç-eden, örnegin, TMEM3OA'yi baglayan (CDC-50A), tek alanli antikor (örnegin, bir FC5 tek alani) içeren bir füzyon proteininin, tek-degerlikli Vm1 ile karsilastirildiginda BBB'yi geçen tasima büyük ölçüde arttirdigi bulunmustur. Özel olarak, baglama yeri-FC konformasyonu (amino ucundan karboksi ucuna) güçlendirilmis aktivite göstermistir. En azindan kismen, bu anlamli bir sekilde arttirilmis tasimaya dayanarak, kan beyin bariyerini geçen arttirilmis tasinmasi olan moleküller, kan beyin bariyerini geçen tasimayi arttirmak için yöntemler ve bu tarz molekülleri kullanan tedavi yöntemleri burada tarif edilir.
Bulusun ilave açiklamasindan önce, kolaylik olmasi için, belirli terimler asagida tarif edilir: Burada kullanildigi sekliyle, "protein" veya "polipeptit" terimi, dogal amino asitlerin veya dogal-olmayan amino asitlerin ikisinin veya daha fazlasinin bir polimerini ifade R); asparajini (Asn veya N); aspartik. asidi (Asp veya D): sisteini (Cys veya C): glutamini (Gln veya Q); glutamik asidi (Glu veya E); glisini (Gly veya 6); histidini (His veya H); izolösini (Ile veya I): lösini (Leu veya L): lizini (Lys veya K); metiyonini (Met veya M); fenilalanini (Phe veya E); prolini (Pro veya P); serini (Ser veya 8); treonini (Thr veya T); triptofani (Trp veya W); tirozini (Tyr veya Y) ve valini (Val veya V) içerir. Geleneksel-olmayan amino asitler de bulusun kapsami içindedir ve norlösini, omitini, norvalini, homoserini ve diger amino asit rezidüsü analoglarini, örnegin, tarif edilenleri, içerir. Bu tarz dogal olusumlu-olmayan amino asit rezidülerini üretmek için, Noren et al., Science 244zl82 (1989) ve Ellman et al., supra, prosedürleri kullanilabilir. Özet olarak, bu prosedürler, bir supresör tRNA'yi bir dogal olusumlu-olmayan amino asit rezidüsü ile kimyasal olarak aktive etmeyi, akabinde in vitro transkripsiyonu, ve RNA'nin translasyonunu içerir. Geleneksel-olmayan amino asidin uygulanmasi ayrica, teknikte bilinen peptit kimyalari kullanilarak da basarilabilir. Burada kullanildigi sekliyle, bunlarin yan zincirlerinin farkli kisimlarinda sifir-olmayan parsiyel yüklere sahip olan amino asitleri (örnegin, M, F, W, 8, Y, N, Q, C) içerir. Bu amino asitler hidrofobik etkilesimlerin ve elektrostatik etkilesimlerin parçasi olabilir. Burada kullanildigi sekliyle, "yüklü amino asit" terimi, bunlarin yan zincirleri üzerinde sifir-olmayan net yüke sahip olabilen amino asitleri (örnegin, R, K, H, E, ID içerir. Bu amino asitler hidrofobik etkilesimlerin ve elektrostatik etkilesimlerin parçasi olabilir.
Burada kullanildigi sekliyle, "baglayici peptit" terimi, iki polipeptit dizisini birlestiren veya baglayan, örnegin, iki polipeptit alanini baglayan, amino asit dizilerini ifade eder, bu amino asit dizileri iki polipeptit alanini dogada dogal olarak birlestirmez veya baglamaz. Bir uygulamada, bir baglayici peptit sentetiktir. Burada kullanildigi sekliyle, dizilerini ifade eder.
Bulusun baglayici peptitleri, iki amino asit dizisini peptit baglari vasitasiyla birlestirir. Bir uygulamada, bir baglayici peptit, bir BBB trans-göç-etme kismini bir ikinci kisma, Örnegin, bir FC kismina, alanina veya bölgesine, birlestirir.
Bir uygulamada, bulusun bir baglayici peptidi, bir farmakolojik olarak aktif kismi bir lineer dizi halinde bir ikinci kisma, örnegin, bir BBB trans-göç-etme kismi veya bir Fc kismi alani veya bölgesi olan bir ikinci kisma, birlestirir. Bir baska uygulamada, bir* baglayici peptit iki farmakolojik olarak aktif kismi birlestirir. Bir uygulamada, bir baglayici peptit, bir veya birden fazla Fc kismi alanini veya bölgesini bir Fc-olmayan kisma birlestirir veya genetik olarak kaynastirir.
Polipeptitler baglaminda, bir "lineer dizi" veya bir "dizi", bir amino ucundan karboksil ucuna dogru olan yönde bir polipeptit içindeki amino asitlerin sirasidir, burada dizi içinde birbirine komsu olan rezidüler polipeptidin primer yapisi içinde bitisiktir.
Burada kullanildigi sekliyle, "baglanmis", "kaynastirilmis" veya "füzyon" terimleri birbiri ile degistirilebilir bir sekilde kullanilir. Bu terimler, kimyasal konjugasyonu veya rekombinant araçlari içeren herhangi bir araç ile, iki veya daha fazla elemanin veya bilesenin birbirine birlestirilmesini ifade eder. Burada kullanildigi sekliyle, "kovalent olarak kaynastirilmis" veya "kovalent olarak kuple edilmis" terimi, belirtilen kisimlarin bir digerine dogrudan kovalent olarak baglandigi veya baska sekilde bir araya-giren kisim veya kisimlar, örnegin, bir baglama peptidi veya kisim, yoluyla bir digerine dolayli olarak kovalent olarak. baglandigi anlamina gelir. Bir tercih edilen uygulamada, kisimlar kovalent olarak kaynastirilir. Kovalent baglantinin bir tipi bir peptit bagidir. (Örnegin, heterobifonksiyonel çapraz-baglama ajanlari kullanilan) kimyasal konjugasyon yöntemleri teknikte bilinir.
Kaynastirilmis kisimlar ayrica genetik olarak da kaynastirilabilir. Burada kullanildigi sekliyle, "genetik olarak kaynastirilmis", "genetikr olarakr baglanmis" veya fragmanlari sifreleyen bir tek polinükleotid molekülünün genetik ekspresyonu yoluyla, bunlarin münferit peptit omurgalari vasitasiyla iki veya daha fazla proteinin, polipeptidin veya bunlarin fragmanlarinin ko-lineer, kovalent baglantisini veya tutturulmasini ifade eder. Bu tarz genetik füzyon, bir tek bitisik genetik dizinin ekspresyonu ile sonuçlanir. Tercih edilen genetik füzyonlar çerçeve içindedir, yani, iki veya daha fazla açik okuma çerçevesi (ORF), orijinal ORF'lerin dogru okuma çerçevesini idame ettiren bir sekilde, bir sürekli daha uzun ORF olusturmak için kaynastirilir.
Böylelikle, elde edilen rekombinant füzyon proteini, orijinal ORF'ler tarafindan Sifrelenen polipeptitlere karsilik gelen iki veya daha fazla protein segmentini içeren bir tek polipeptittir (bu segmentler, dogada normal olarak bu sekilde birlestirilmez). Bu durumda, tek polipeptit, iki polipeptit zinciri içeren dimerik. moleküller üretmek için isleme sirasinda yarilir.
Söz konusu polipeptitler, en az bir farmakolojik olarak aktif kisim içerir. Bir farmakolojik olarak aktif kisim, bir biyolojik baglamda bir etki veya bir reaksiyon gerçeklestirebilen bir kismi ifade eder. Örnegin, sistemin bilesenlerini (örnegin, biyolojik sivi içindeki veya hücrelerin yüzeyi üzerindeki veya hücresel matriks içindeki proteinleri) baglayan farmakolojik olarak aktif molekülleri veya bunlarin kisimlarini ifade eder ve bu baglama (örnegin, aktif kisimda ve/veya bunun bagladigi bilesende (örnegin, aktif kismin bir klevajinda ve/veya bunun bagladigi bilesende, bir sinyal aktariminda veya bir hücrede veya bir süjede bir biyolojik yanitin arttirilmasinda veya inhibisyonunda bir degisim. ile Ölçüldügü üzere) bir biyolojik etki ile sonuçlanir. Tercih edilen farmasötik olarak aktif kisimlar, terapötik kisimlardir.
Emsal farmakolojik olarak aktif kisimlar, örnegin, bir ilaç, bir antikor` molekülünün bir antijen baglama fragmanini veya bunun kismini (örnegin, F(ab), scFV, bir VH alani veya bir VL alani) (Örnegin, bir biyolojik yaniti vermek, indüklemek veya bloke etmek için), bir reseptörün bir ligand baglama kismini veya bir ligandin bir reseptör baglama kismini, bir enzimi, vb. içerebilir. Bir uygulamada, bir farmakolojik olarak aktif kisim, bir proteinin matür formunu içerir. Bir baska uygulamada, bir farmakolojik olarak aktif kisim, bir tam boy proteinin biyolojik aktiviteyi muhafaza eden bir kismini içerir. Diger emsal farmakolojik olarak aktif kisimlar, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, polinükleotidleri, oligonükleotidleri, karbonhidratlari ve lipitleri içeren, terapötik olarak yararli amino asitleri, peptitleri, proteinleri, nükleik asitleri içerir. Mevcut bulusun emsal farmakolojik olarak aktif kisimlari, nörotrofik faktörleri, büyüme faktörlerini, enzimleri, antikorlari, nörotransmitterleri, nöromodülatörleri, antibiyotikleri, antiviral ajanlari, antifungal ajanlari, görüntüleme ajanlarini veya saptanabilen ajanlari, izotoplari ve kemoterapötik ajanlari ve benzerlerini içerir. Mevcut bulusun farmakolojik olarak aktif kisimlari ayrica, terapötik ajan hedef dokuya aktarildiginda aktive edilebilen ilaçlari, ön- ilaçlari ve öncülleri de içerir. "Farmakolojik olarak aktif kisimlar" terimi, bir BBB trans-göç-etme kismini içerdigi anlamina gelmez. Farmakolojik olarak aktif ajanlar, BBB-trans- göç-etmeme kisimlaridir.
Bulusun baglama molekülleri, "kimerik" proteinlerdir veya dogal olarak bagli olmadigi bir ikinci amino asit dizisine baglanmis bir birinci amino asit dizisini içerir. Amino asit dizileri normal olarak, füzyon polipeptidi içinde bir araya getirilen ayri proteinler halinde bulunabilir veya bunlar normal olarak, ayni protein içinde bulunabilir, ancak füzyon polipeptidinde yeni bir dizilimde yerlestirilir. Bir kimerik protein, teknikte iyi bilinen yöntemler kullanilarak, örnegin, kimyasal sentez ile veya burada peptit bölgelerinin arzu edilen iliski içinde sifrelendigi bir polinükleotidi olusturma ve aktarma ile, olusturulabilir.
Açiklamanin polipeptitleri, baglama molekülleridir, yani, BBB- trans-göç-eden antikorlardan türetilen baglama alanlari veya baglama yerleri içerir. Bir BBB trans-göç-eden antikor, buna tutturulmus olan bir kismin BBB'yi geçerek trans-göçünü kolaylastirir. Emsal BBB trans-göç-eden antikor baglama yerleri, 7,943,129 Numarali U.S. Patenti'nde tarif edilir. Bir yönünde, bir BBB trans-göç-eden antikor, TMEM3OA'yi baglar.
Burada kullanildigi sekliyle, "baglama alani" veya "baglama yeri" terimleri, polipeptidin bir hedef molekül ile spesifik baglamaya aracilik eden kismini, bölgesini veya yerini (Örnegin, bir TMEM3OA baglama yerini veya BBB trans-göçünü kolaylastiran bir baska yeri) ifade eder. Emsal baglama alanlari, bir antijen baglama yerini (örnegin, bir VH ve/Veya VL alanini) veya bu tarz bir baglama yerini içeren molekülleri (örnegin, bir antikoru veya bir tek alanli antikoru) içerir.
Açiklamanin polipeptitleri, BBB trans-göç-etme kismi açisindan tek-degerliklidir veya çok-degerliklidir, örnegin, en az 1, 2, 3, 4, 5 veya daha fazla BBB trans-göç-etme kismi içerir.
Burada tarif edildigi üzere farmakolojik olarak aktif kisimlar ayrica, örnegin, bir antikor molekülünden türetildigi sekilde, baglama alanlarini veya baglama yerlerini (örnegin, BBB'den trans-göç-etmeyen bir antikordan bir VH ve/veya VL alanini), bu tarz bir baglama yerini içeren nwlekülleri (örnegin, bir antikoru veya tek degerlikli antikoru), bir liganin bir reseptör baglama alanini, bir reseptörün bir ligand. baglama alanini veya bir katalitik alani da içerebilir. Burada kullanildigi sekliyle, "ligand baglama alani" terimi, bir natif reseptörü (örnegin, hücre yüzeyi reseptörünü) veya bunun en az bir kalitatif ligand baglama yetisini ve tercihen karsilik. gelen natif reseptörün biyolojik aktivitesini, muhafaza eden bir bölgesini veya türevini ifade eder. Burada kullanildigi sekliyle, “reseptör baglama alani" terimi, bir natif ligandi veya bunun en az bir kalitatif reseptör baglama yetisini ve tercihen karsilik gelen natif ligandin biyolojik aktivitesini, muhafaza eden bölgesini veya türevini ifade Bir uygulamada, bulusun› polipeptitleri modifiye edilmis antikorlardir. Burada kullanildigi sekliyle, "modifiye edilmis antikor" terimi, antikorlarin, bunlarin dogal olusumlu olmadigi sekilde degistirildigi, sentetik formlarini, örnegin, en az iki agir zincir kismi içeren, ancak iki tam agir zincir içermeyen antikorlari (örnegin, alani silinmis antikorlari veya minibodileri): iki veya daha fazla farkli antijeni, örnegin, TMEM3OA'yi ve Pc kisimlarina, alanlarina, bölgelerine veya scFc bölgelerine birlestirilmis bir terapötik olarak ilgili hedef baglama yerini) baglamasi için degistirilmis antikorlarin multispesifik formlarini (örnegin, bispesifik, trispesifik, vb.), içerir.
Burada kullanildigi sekliyle, "FC bölgesi" terimi, bir polipeptidin, natif immünoglobülinin Fc bölgesine karsilik gelen, kismi olarak, yani, bunun iki agir zincirinin ilgili Fc alanlarinin (veya Fc kisimlarinin) dimerik birlesmesi ile olusturuldugu seklinde, tanimlanmalidir. Bir natif Fc bölgesi homodimeriktir ve iki polipeptit zinciri içerir. Aksine, burada kullanildigi sekliyle, "genetik olarak-kaynastirilmis Fc bölgesi" veya "tek-Zincirli Fc bölgesi" (scFc bölgesi) edildigi üzere bir tek polipeptit zinciri içinde genetik olarak baglanmis (yani, bir tek sürekli genetik dizi içinde sifrelenen) Fc alanlarindan (veya Fc kisimlarindan) olusan bir sentetik dimerik Fc bölgesini ifade eder. Bir yönünde, bir scFc bölgesi kullanildiginda, baglama molekülü BBB trans-göç- etme kismi açisindan tek-degerliklidir.
Burada kullanildigi sekliyle, "Fc alani" terimi, bir tek immünoglobülin agir zincirinin mentese bölgesinde papain klevaj yerine hemen upstream (yani, agir zincir sabit bölgesinin birinci rezidüsü 114 olarak alindiginda, IgG'de rezidü 216'dan) baslayan ve antikorun C-ucunda biten kismini ifade eder. Bu dogrultuda, bir tam Fc alani, en az bir mentese bölgesi, bir CH2 alani ve bir CH3 alani içerir. Burada kullanildigi sekliyle, "Fc bölgesi" terimi, natif antikorlarin (örnegin, geleneksel iki polipeptit zincirli formatta veya bir tek zincirli Fc bölgesi olarak yapilan) Fc bölgesine benzeyen dimerize edilmis Fc alanlarini ifade eder.
Burada kullanildigi sekliyle, "Fc alani kismi" veya "Fc kismi", bir Fc alaninin veya bir Fc alanindan türetilmis bir amino asit dizisini içerir. Belirli yönlerinde, bir PC kismi, asagidakilerin en az birini içerir: bir mentese (örnegin, üst, orta ve/veya alt Hentese bölgesi) alani, bir CH2 alani, bir CH3 alani, bir CH4 alani veya bunlarin. bir varyanti, kismi veya fragmani. Diger uygulamalarda, bir Fc kismi, bir tam Fc alani (yani, bir mentese alani, bir CH2 alani ve bir CH3 alani) içerir. Bir yönünde, bir Fc kismi, bir CH3 alanina (veya. bunun kismina) kaynastirilmis bir` mentese alani (veya bunun kismini) içerir. Bir baska uygulamada, bir Fc kismi, bir CH3 alanina (veya bunun kismina) kaynastirilmis bir CH2 alani (veya bunun kismini) içerir. Bir baska yönünde, bir Fc kismi, bir CH3 alanindan veya bunun kismindan olusur. Bir baska yönünde, bir Fc kismi bir mentese alanindan (veya bunun kismindan) ve bir CH3 alanindan (veya bunun kismindan) olusur.
Bir baska yönünde, bir Fc kismi, bir CHZ alanindan (veya bunun kismindan) ve bir CH3 alanindan olusur. Bir baska yönünde, bir PC kismi bir mentese alanindan (veya bunun kismindan) ve bir CH2 alanindan (veya bunun kismindan) olusur. Bir yönünde, bir PC kismi, bir CH2 alaninin en az bir kismindan (örnegin, bir CH2 alaninin tümünden veya parçasindan) yoksundur.
Bir uygulamada, bulusun bir baglama molekülü, bir polipeptit zinciri (bir scFc molekülü) olarak veya iki polipeptit zinciri halinde dogal-tip formunda bulunan, bir tam Fc bölgesi içerir.
Spesifik olarak baglanmis, bir kompleks olusturan, fizyolojik kosullar altinda görece kararli olan iki molekülü ifade eder.
Spesifik baglama, genel olarak bir orta ila yüksek derecede kapasite ile düsük bir afiniteye sahip olan spesifik-olmayan baglamadan ayirt edildigi üzere, bir yüksek afinite ve bir düsük ila orta derecede kapasite ile karakterize edilir. Tipik olarak, afinite sabiti KA, 106 bfi'den büyük oldugunda 4veya daha tercihen lO8 Mü'den büyük oldugunda, baglamanin spesifik oldugu düsünülür. Gerektiginde, spesifik-olmayan baglama, baglama kosullarini çesitlendirme ile spesifik baglamayi büyük ölçüde etkilemeden azaltilabilir. Uygun baglama kosullari, örnegin, moleküllerin konsantrasyonu, çözeltinin iyonik yitiligi, sicaklik, baglama için verilen süre, bir bloke etme ajaninin (örnegin, serum albümininin, süt kaseininin) konsantrasyonu, Vb., uzmanligi olan kisi tarafindan rutin teknikler kullanilarak optimize edilebilir. Bulusun bir Fc kismi, en azindan bir Fc nwlekülünün teknikte FcRn baglamasi için gerekli oldugu bilinen, burada bir neonatal reseptörü (FcRn) baglama partneri olarak ifade edilen, kismini içerir.
Bir FcRn baglama partneri, FcRn baglama partnerinin FcRn reseptörü tarafindan müteakip aktif tasima ile FcRn reseptörü tarafindan spesifik olarak baglanabilen bir moleküldür veya bunun kismidir.
Mevcut bulusun FcRn baglama partnerleri, FcRn reseptörü tarafindan spesifik olarak baglanabilen, tam IgG'yi, IgG'nin Fc fragmanini ve FcRn reseptörunün tam baglama bölgesini içeren diger fragmanlari içeren molekülleri kapsar. Bir baska uygulamada, bulusun bir baglama molekülünün bir FC kismi alani veya bölgesi, bunun FcRn'yi azaltilmis veya minimal baglama gösterdigi sekilde modifiye edilir. IgG'nin Fc kisminin FcRn reseptörünü baglayan bölgesi, X-isini kristalografisine göre Fc'nin FcRn ile majör temas alani, CH2 ve CH3 alanlarinin baglanti yerine yakindir. Fc-FcRn temaslarinin tümü, bir tek bölgesini içeren diger fragmanlarini içerir. Majör temas Immünoglobülinlerin veya immünoglobülin fragmanlarinin amino asit. numaralandirmasina yapilan referanslarin tümü, Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Public Health, Bethesda, Md, kaynagina göredir. edilmis IgG veya Fc fragmanlari veya bunlarin kisimlarini üretmek için iyi bilinen prosedürlere, örnegin, yere yönlendirilmis mutajeneze ve benzerlerine, göre modifiye edilebilir. Bu tarz modifikasyonlar, FcRn temas yerlerinden uzak modifikasyonlari ayni zamanda FoRn'yi baglamayi koruyan veya hatta güçlendiren temas yerleri içindeki modifikasyonlari içerir. Örnegin, insan IgGl'i Fc'sindeki (FC yl) asagidaki tek amino asit rezidüleri FcRn için FC baglama afinitesinin anlamli kaybi olmadan sübstüte edilebilir: P238A, 8239A, K447A, burada, örnegin, P238A pozisyon numarasi 238'de alanin ile sübstüte edilmis dogal-tip prolini temsil eder.
Yukaridaki mutasyonlarin bazilari, Fc kismi üzerinde yeni islevsellik saglayabilir. Örnegin, bir uygulama, bir hayli korunmus N-glikosilasyon yerini uzaklastiran, N297A'yi katar.
Bu mutasyonun etkisi, glikosilasyonu azaltmaktir, böylece efektör fonksiyonu ve/veya immünojenisiteyi azaltmaktir.
Yukarida tarif edilen mutasyonlardan kaynaklanan yeni islevselligin bir ilave örnegi olarak, FcRn için afinite bazi durumlarda dogal tipinkinin ötesine arttirilabilir. Bu arttirilmis afinite, bir arttirilmis "baglama" hizini, bir azaltilmis "ayrilma" hizini veya hem bir arttirilmis "baglama" hizini beni de bir azaltilmis "ayrilma" hizini yansitabilir.
FcRn için bir arttirilmis afinite sagladigina inanilan Bir uygulamada, FcRn baglama partneri, PKNSSMISNTP (SEQ ID NO:) dizisini içeren ve opsiyonel olarak ilaveten HQSLGTQ (SEQ VISSHLGQ (SEQ ID NO:) arasindan seçilen bir diziyi içeren bir polipeptittir (5,739,277 Numarali U.S. Patenti).
Teknikte uzmanligi olan kisiler, degistirilmis efektör fonksiyon ve/veya FcRn baglama gösteren çok sayida baska FC mutantina veya analoguna asina olacaktir. Buna ek olarak, immünoglobülin sabit bölgelerini (örnegin, pegile edilmis) veya bunlarin fragmanlarini kimyasal olarak modifiye etme araçlari (bakiniz, örnegin, Aslam ve Dent 1998, Bioconjugation: Protein Coupling Techniques For the Biomedical Sciences Macmilan Reference, London), teknikte, örnegin, Bir uygulamada, bir Fc kismi, teknikte bilinen yöntemler kullanilarak, örnegin, normal olarak glikosile edilmis rezidüleri mutasyona ugratma ile veya polipeptidin ekspresyonunu, böylece glikosilasyonun gerceklesmedigi sekilde, degistirme ile, aglikosile edilir. Bir örnek olarak, bir spesifik uygulama, bir hayli korunmus N-glikosilasyon yerini uzaklastiran, N297A mutasyonunu katar. Bir baska uygulamada, bir Fc kismi, pozisyon 299'da bir mutasyon, örnegin, 7,863,419 U.S. Patenti'nde tarif edildigi üzere bir baska amino aside bir T299 mutasyonunu, katar. Alanine ek olarak, diger amino asitler Fc fonksiyonunu azaltmak için yukarida belirtilen veya teknikte bilinen pozisyonlarda dogal- tip amino asitler için sübstüte edilebilir.
Bir baska uygulamada, Armour, K.L., Clark, M.R., Hadley, A.G. kaynaginda açiklanan mutasyonlar söz konusu baglama moleküllerine uygulanabilir.
Mutasyonlar Fc içine tek bir sekilde uygulanabilir, bu natif Fc'den farkli olan yüzden fazla Fc kismina sebebiyet verir. Ek olarak, bu münferit mutasyonlarin ikisinin, üçünün veya daha fazlasinin kombinasyonlari birlikte uygulanabilir, böylece yüzlerce fazla potansiyel FC bölgesine sebebiyet verilir.
Dahasi, bulusun bir yapisinin Fc kisimlarinin biri, mutasyona ugratilabilir ve diger Fc kismi hiç bir sekilde mutasyona ugratilmayabilir veya bunlarin her ikisi mutasyonla ugratilabilir, ancak farkli mutasyonlar kullanilir.
Bir immünoglobülin sabit bölgesinin en az bir kisminin peptit mimetikleri, Örnegin, bir PC fragmaninin bir peptit mimetigi veya bir FcRn baglama partnerinin bir peptit mimetigi, de tasarlanir. Bir yönünde, peptit mimetigi faj gösterimi kullanilarak veya kimyasal kütüphane taramasi vasitasiyla tanimlanir (bakiniz, örnegin, McCafferty et al., 1990, Nature Bir baska yönünde, bulusun bir FC bölgesi (Örnegin, bir scFC bölgesi) en azindan bir FC molekülünün teknikte FcyR baglamasi için gerekli oldugu bilinen kismini içerir.
Bir yönünde, bulusun bir FC bölgesi (Örnegin, bir scFC bölgesi) en azindan bir FC molekülünün teknikte Protein A baglamasi için gerekli oldugu bilinen kismini içerir. Bir yönünde, bulusun bir FC bölgesi (örnegin, bir scFC bölgesi) en azindan bir FC molekülünün teknikte Protein G baglamasi için gerekli oldugu bilinen kismini içerir. Bir yönünde, bu tarz Burada izah edildigi üzere, bir FC alaninin ayrica bir veya birden fazla amino asit degisimi (substitüsyonu, ilavesi veya silinmesi) içerme ile, böylece bunun bir dogal tip FC kismina kiyasla amino asit dizisi açisindan çesitlilik gösterdigi sekilde, de modifiye edilebilecegi teknikte normal uzmanligi olan bir kisi tarafindan anlasilacaktir. Bu tarz çok sayida degisim veya degistirme teknikte bilinir. Belirli emsal uygulamalarda, FC kismi bir efektör fonksiyonu (örnegin, FcyR baglamayi) muhafaza eder` ve belirli uygulamalarda, FC kismi efektör fonksiyondan yoksundur veya azaltilmis efektör fonksiyona sahiptir.
Bulusun bir polipeptidinin FC alanlari veya kisimlari, herhangi bir izotipten (A, E, (3 veya M) elde edilebilir ve farkli immünoglobülin Hmleküllerinden türetilebilir. Örnegin, bir polipeptidin bir FC alani veya kismi, bir IgGl10 molekülünden türetilen bir CH2 ve/veya CH3 alani ve bir IgG3 molekülünden türetilen bir mentese bölgesi içerebilir. Bir baska örnekte, bir PC alani veya kismi, kismen bir lgGl molekülünden ve kismen bir IgG3 molekülünden türetilen bir kimerik mentese bölgesi içerebilir. Bir baska örnekte, bir FC alani veya kismi, kismen bir IgGl molekülünden ve kismen bir Bulusun baglayici peptitlerini içeren polipeptitler, teknikte bilinen teknikler kullanilarak yapilabilir. Bir uygulamada, bulusun polipeptitleri, "rekombinant olarak üretilir", yani, rekombinant DNA teknolojisi kullanilarak üretilir. Bulusun polipeptitlerini yapmak için emsal teknikler burada daha detayli bir sekilde izah edilir.
Burada kullanildigi sekliyle, "farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyici" terimi, bir etken maddenin bununla birlestirilebildigi ve kombinasyonu takiben, etken maddeyi bir süjeye uygulamak için kullanilabilen bir kimyasal bilesim veya bilesik anlamina gelir. Burada kullanildigi sekliyle, etken maddenin farmasötik bilesimin herhangi bir baska içerik maddesi ile uyumlu olan, bilesimin uygulanacagi süje için zararli olmayan bir ester veya tuz formu anlamina gelir.
Burada kullanildigi sekliyle, "farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyici" ayrica, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, asagidakilerin birini veya birden fazlasini, da içerir: eksipiyanlar; yüzey aktif ajanlar; dagitma ajanlari; inert diluentler; granüle etme ve parçalama ajanlari; baglama ajanlari; yaglama ajanlari; tatlandirma ajanlari; aroma verme ajanlari; renklendirme ajanlari; koruyucular; fizyolojik olarak parçalanabilen bilesimler, örnegin, jelatin; sulu vehiküller ve çözücüler; yagli vehiküller ve çözücüler; süspanse etme ajanlari; dagitma veya islatma ajanlari; emülsifiye etmek ajanlari; demulsentler; tamponlar; tuzlar; kivamlastirma ajanlari; dolgular; emülsifiye etme ajanlari; antioksidanlar; stabilize etme ajanlari ve farmasötik olarak kabul edilebilir polimeri veya hidrofobik materyaller. Bulusun farmasötik bilesimlerine dahil edilebilen diger "ilave içerik maddeleri" teknikte bilinir ve örnegin, Genaro, ed., 1985, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., kaynaginda tarif edilir. Burada kullanildigi sekliyle, "bir etkili miktar" bir terapötik yanit üretmek için yeterli olan bir miktardir.
Burada kullanildigi sekliyle, "proteinopati" terimi, yanlis- katlanmis proteinler veya agregat olusturmus proteinler ile karakterize edilen, bir genetik bilesene sahip olan, bozukluklari ifade eder.
Bir yönünde, bir BBB trans-göç-etme kismi 7,943,129 U.S.
Patenti'nde tarif edildigi sekildedir. Örnegin, bir uygulamada, bir BBB trans-göç-etme kismi, asagidakilerden olusan gruptan seçilen bir dizide izah edilen bir amino asit dizisi içerir: 7,943,129 U.S. Patenti'nde tarif edildigi üzere Bir uygulamada, bir BBB trans-göç-etme kismi, bir FC5 kismidir. FC5, bir kamelidden türetilen bir agir zincir antikorudur (HCA, ayni zamanda iki-Zincirli, iki-Zincirli agir zincir antikoru, Vmi veya tek alanli antikor olarak da ifade edilir). Yine kamelidler tarafindan da üretilen IgG-tipi geleneksel dört-Zincirli immünoglobülinler ile karsilastirildiginda, bu antikorlar geleneksel immünoglobülinlerin. hafif zincirlerinden. ve CHl alanlarindan yoksundur. Bu dogal olusumlu agir zincir antikorlarinin göz çarpan özelliklerinin biri, bunlarin degisken alaninda (Vma olarak gösterilir) sirasiyla 44, 45 ve 47 VL ara yüz pozisyonlarinda (Kabat numaralandirmasi) göze çarpan Glu, Arg ve Gly varligidir. Geleneksel dört-Zincirli antikorlarin (VH olarak gösterilir) degisken alanindaki ayni pozisyonlar neredeyse özellikle Gly, Leu› ve Trp ile mesgul edilir. Bu farkliliklarin, geleneksel dört-Zincirli antikorlarin VH alaninin görece çözünmezligi ile karsilastirildiginda, kamelid HCA degisken alaninin (an yüksek çözünürlügünden ve kararliligindan sorumlu oldugu düsünülür. Vmq alanlarinin iki daha önemli özelligi, bunlarin karsilastirilabilir bir sekilde daha uzun CDR3'üdür ve CDR'lerde sistein çiftlerinin yüksek insidansidir. Sistein çiftlerinin bir disülfit köprüsünün olusumuna aracilik ettigi ve bundan dolayi antikor birlestirme yerinin yüzey topolojisini modüle etmeye dahil edildigi görülür. Bir deve sdAb-lizozomal kompleksinin kristal yapisinda, sdAb'den çikinti yapan ve kismen bir CDR disülfit baglantisi tarafindan stabilize edilen bir bükülmez kivrim, birlestirme yerinin disina uzanir ve lizozomal aktif yerin içine derinlemesine nüfuz eder (Desmyter et al., Nature Bir yönünde, bir BBB trans-göç-eden antikor, TMEM3OA'yi (C6orf67, CDCSOA) baglar. TMEM3OA'yi baglayan emsal kisimlar bilinir ve teknikte iyi bilinen yöntemler kullanilarak yapilabilir. Örnegin, TMEM3OA amino asit dizisini veya bunun bir kismini içeren bir amino asit dizisi, TMEMBOA amino asit dizisini spesifik olarak taniyan antikorlar yapmak için veya TMEM3OA'yi spesifik olarak baglayan baglama kisimlari için baglama yerlerinin bir kütüphanesinden taramak için kullanilabilir. Bu tarz kütüphanelerden elde edilen veya kütüphanelerden türetilen baglama yerleri bulusun bir baglama molekülünde kullanilabilir. TMEM3OA'nin amino asit dizisi asagida gösterilir: Bulusun polipeptitleri, TMEMBOA'yi baglayan bir antikordan teknikte bilinen protokoller kullanilarak. türetilen bir degisken bölge veya bunun kismini (örnegin, bir VL ve/Veya VH alanini) içerebilir. Örnegin, degisken alan, bir insan-olmayan memelide, örnegin, mürinde, gine domuzunda, primatta, tavsanda veya siçanda, memeliyi antijen veya bunun bir fragmani ile immünize etme ile üretilen antikordan türetilebilir. Bakiniz, Harlow & Lane, supra. Immünoglobülinler ilgili antijenin (örnegin, saflastirilmis tümör iliskili antijenlerin veya hücrelerin veya bu tarz antijenleri içeren hücresel ekstraktlarin) ve bir adjuvanin çok sayida subkütan veya intraperitoneal enjeksiyonu ile üretilebilir. Bu immünizasyon tipik olarak, aktive edilmis splenositlerden veya lenfositlerden antijen-reaktif antikorlarin üretilmesini içeren bir immün yanit meydana getirir.
Degisken bölge bir immünize edilmis hayvanin serumundan hasat edilen poliklonal antikorlardan türetilebilirken, arzu edilen degisken bölgenin bundan türetildigi monoklonal antikorlarin (MAb'lerin) homojen preparasyonlarini saglamak için dalaktan, lenf nodlarindan veya periferik kandan nünferit lenfositleri izole etmek siklikla arzu edilebilir. Tavsanlar veya gine domuzlari tipik olarak, poliklonal antikorlar yapmak için kullanilir. Fareler tipik olarak, monoklonal antikorlar yapmak için kullanilir. Monoklonal antikorlar, bir antijen fragmanini bir fareye enjekte etme, "hibridomlar" hazirlama ve hibridomlari antijeni spesifik olarak baglayan bir antikor için tarama ile bir fragmana karsi hazirlanabilir. Bu iyi antijen enjekte edilmis olan fareden elde edilen görece kisa- ömürlü veya ölümlü, lenfositler bir ölümsüz tümör hücre hatti (örnegin, bir miyelom hücre hatti) ile kaynastirilir, böylece, hem ölümsüz olan hem de B lnkxesi tarafindan genetik olarak sifrelenen antikoru üretebilen hibrit hücreler veya seyreltme ve bir tek antikorun olusumu için spesifik genleri içeren her bir münferit sus ile yeniden-büyütme ile tek genetik suslara ayrilir. Bunlar, bir arzu edilen antijene karsi homojen olan ve bunlarin saf genetik ebeveynligine atfen, "monoklonal" olarak adlandirilan antikorlar üretir.
Bu sekilde hazirlanan hibridom hücreleri, tercihen kaynastirilmamis, parental miyelom hücrelerinin büyümesini veya sag kalimini inhibe eden bir veya birden fazla madde içeren bir uygun kültür vasati içine ekilebilir ve burada büyütülebilir. Teknikte uzmanligi olan kisiler, hibridomlarin olusumu, seleksiyonu ve büyümesi için reaktiflerin, hücre hatlarinin ve vasatlarin çok sayida kaynak tarafindan piyasada satildigini ve standardize edilmis protokollerin iyi belirlendigini anlayacaktir. Genel olarak, burada hibridom hücrelerinin büyütüldügü kültür vasati arzu edilen antijene karsi monoklonal antikorlarin üretimi için analiz edilir.
Tercihen, hibridom hücreleri tarafindan üretilen monoklonal antikorlarin baglama özgüllügü immünopresipitasyon ile veya bir in vitro analiz, Örnegin, bir radyoimmünoanaliz (RIA) veya enzime bagli bagisiklik analizi (ELISA), ile belirlenir. Arzu edilen özgüllügü, afinitesi ve/veya aktivitesi olan antikorlari üreten hibridom hücreleri tanimlandiktan sonra, klonlar sinirli seyreltme prosedürleri ile alt-klonlanabilir ve standart yöntemler ile büyütülebilir (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp 59-103 (Academic Press, 1986)). Alt-klonlar tarafindan salgilanan monoklonal antikorlarin geleneksel saflastirma prosedürleri, örnegin, mesela, afinite kromatografisi (örnegin, protein-A, protein-G veya Protein-L afinite kromatografisi), hidroksilapatit kromatografisi, jel elektroforezi veya diyaliz, ile kültür vasatindan, assitler sivisindan veya serumdan ayrilabilecegi ilaveten anlasilacaktir.
Opsiyonel olarak, antikorlar antijenin diger kesismeyen fragmanlarini baglamadan antijenin bir spesifik bölgesini veya arzu edilen fragmanini baglama için seçilebilir. Son bahsedilen tarama, bir antikorun antijenin silinme mutantlarinin bir koleksiyonunu baglamasini belirleme ve hangi silinme mutantlarinin antikoru bagladigini belirleme ile tamamlanabilir. Baglama, örnegin, Western blot veya ELISA, ile degerlendirilebilir. Antikoru spesifik baglama gösteren en küçük fragman, antikorun epitopunu tanimlar. Alternatif olarak, epitop özgüllügü, bir test ve referans antikorunun antijeni baglama için rekabet ettigi bir kompetisyon analizi ile belirlenebilir. Test ve referans antikorlari rekabet ettiginde, akabinde bunlar ayni epitopu veya bir antikorun baglamasinin digerinin baglamasina müdahale ettigi sekilde yeterli yakinlikta olan epitoplari baglar.
Arzur edilen monoklonal antikoru sifreleyen DNA, sabit. bölge alani dizilerinin (örnegin, mürin antikorlarin agir ve hafif Zincirlerini sifreleyen genleri spesifik olarak baglayabilen oligonükleotid. problarinin kullanilmasi ile) izolasyonu için supra tarif edilen geleneksel prosedürlerin herhangi biri kullanilarak kolaylikla izole edilebilir ve dizilenebilir.
Izole edilmis ve alt-klonlanmis hibridoni hücreleri, bu tarz DNA'nin bir tercih edilen kaynagi görevi görebilir. Daha özel olarak, (burada tarif edildigi üzere sentetik olabilen) izole edilmis DNA bulusun polipeptitlerine katilma amaciyla arzu edilen degisken bölge dizilerini klonlamak için kullanilabilir.
Diger uygulamalarda, baglama yeri, bir tam olarak insan antikorundan türetilir. Insan veya büyük ölçüde insan antikorlari, endojen immünoglobülin üretimi yapamayan transgenik hayvanlarda (örnegin, farelerde) üretilebilir (bakiniz, örnegin, her biri burada referans olarak eklenmis U.S. Patentleri). Örnegin, kimerik ve germ-hatti mutant farelerde antikor agir-zincir birlestirme bölgesinin homozigot silinmesinin endojen antikor üretiminin tam inhibisyonu ile sonuçlandigi tarif edilmistir. Bir insan immünoglobülin gen diziliminin bu tarz germ hatti mutant farelere transferi, antijen yüklemesi üzerine insan antikorlarinin üretimi ile sonuçlanacaktir. SCID fareleri kullanilarak insan antikorlari üretmenin bir` baska tercih edilen araci, 5,811,524 Numarali U.S. Patenti'nde açiklanir. Bu insan antikorlari ile iliskili olan genetik materyalin ayrica burada tarif edildigi üzere izole edilebilecegi ve manipüle edilebilecegi de anlasilacaktir.
Rekombinant antikorlar üretmek için daha bir baska hayli kaynaginda açiklanir. Spesifik olarak, bu teknik, maymun degisken alanlari ve insan sabit dizileri içeren primatlastirilmis antikorlarin üretimi ile sonuçlanir. Bu referans, burada bunun bütünüyle referans olarak eklenir.
Dahasi, bu teknik ayrica, yaygin olarak atfedilen 5,658,570, edilir. Bir baska uygulamada, lenfositler mikro-manipülasyon ile seçilebilir ve degisken genler izole edilebilir. Örnegin, periferik kan mononükleer hücreleri bir immünize edilmis memeliden izole edilebilir ve in vitro yaklasik 7 gün boyunca kültürlenebilir. Kültürler` tarama kriterlerini karsilayan spesifik antikorlar için taranabilir. Pozitif kuyucuklardan elde edilen hücreler izole edilebilir. Munferik. Ig-üreten B hücreleri FACS ile veya bunlari bir kompleman-aracili hemolitik plak analizinde tanimlamak ile izole edilebilir. Ig- üreten B hücreleri bir tüp içine mikro-manipüle edilebilir ve VH ve VL genleri, örnegin, RT-PCR, kullanilarak çogaltilabilir. VH ve VL genleri bir antikor ekspresyon vektörüne klonlanabilir ve ekspresyon için hücrelere (örnegin, Ökaryotik veya prokaryotik hücrelere) transfekte edilebilir.
Alternatif olarak, degisken (V) alanlar seçilen bir hayvandan degisken gen dizilerinin kütüphanelerinden elde edilebilir.
Alanlarin, örnegin, VH ve/veya VL alanlarinin, rastgele kombinasyonlarini eksprese eden kütüphaneler, arzu edilen baglama karakteristiklerine sahip olan elemanlari tanimlamak için arzu edilen bir antijen ile taranabilir. Bu tarz tarama yöntemleri teknikte iyi bilinir. Örnegin, antikor geni repertuvarlari, bir A bakteriyofaj ekspresyon vektörüne Buna ek olarak, bunlarin yüzeyi üzerinde antikorlar eksprese Georgiou et al., (1997), Nat. Biotech., 15:29; Boder ve Methods. 243z211) veya Virüsler (örnegin, Hoogenboom, HR.
Rev. Immunol. 12:433; Griffiths, AD. (1998). Curr. Opin.
Biotechnol. 9:102) taranabilir.
Teknikte uzmanligi olan kisiler ayrica, antikor degisken alanlarini sifreleyen DNA'nin ayrica fajda, mayada veya bakterilerde eksprese edilen antikor kütüphanelerinden teknikte bilinen yöntemler kullanilarak türetilebilecegini de anlayacaktir. Emsal yöntemler, örnegin, EP 368 684 B1; Huie et al., (, J. Mol.
Biol. 315:1063 kaynaklarinda, izah edilir. Bir kaç yayin zincir karma ile yüksek afiniteli insan antikorlarinin üretimini ayni zamanda büyük faj kütüphaneleri yapmak için bir strateji olarak kombinasyonel enfeksiyonu ve in vivo rekombinasyonu tarif etmistir. Bir baska uygulamada, ribozomal gösterim, bakteriyofaji gösterim platformu olarak degistirmek için kullanilabilir (bakiniz, örnegin, Hanes et al., (1998), (2001) J. Immunol. Methods 248z3l).
Tarama için emsal kütüphaneler, inan degisken gen kütüphaneleridir. Bir insan-disi kaynaktan VL ve VE alanlari da kullanilabilir. Kütüphaneler` naif olabilir, immünize edilmis süjelerden elde edilebilir veya yari-sentetik olabilir 89:4457). Bir uygulamada, mutasyonlar daha büyük heterojenlige sahip olan nükleik asit moleküllerinin bir kütüphanesini olusturmak için immünoglobülin alanlarina yapilabilir (Thompson et al., (1996), J. Mol. Biol. 256z77; Lamminmaki et PCR Methods Appl. 2:28; Caldwell ve Joyce. (1994), PCR Methods Appl. 3:8136). Standart taramam prosedürleri, yüksek afiniteli varyantlari seçmek için kullanilabilir. Bir baska uygulamada, VH ve V1 dizilerine degisimler, örnegin, teknikte bilinen teknikler kullanilarak kristal yapilarindan elde edilen bilgi kullanilarak, antikor aviditesini arttirmak için yapilabilir.
Bir baska emsal kütüphane, tek alanli antikorlar içeren bir kamelid kütüphanesidir. Emsal tek alanli moleküller, bir antikorun bir izole edilmis agir zincir degisken alanini (VH), yani, bir hafif zincir degisken alani olmadan, bir agir zincir degisken alanini ve bir antikorun bir izole edilmis hafif zincir degisken alanini (VL), yani, bir agir zincir degisken alani olmadan, bir hafif zincir degisken alanini, içerir.
Bulusun baglama moleküllerinde kullanilan emsal tek-alanli antikorlar, örnegin, Hamers-Casterman et al., Nature 363z446- (2002), kaynaklarinda tarif edildigi üzere Kamelid agir zincir degisken alanini (yaklasik 118 ila 136 arasindaki amino asit rezidülerini), içerir. Diger emsal tek alanli antikorlar, VH veya VL alanlari içerir, bunlar ayrica Dabs® (Domantis Ltd., Cambridge, BK) olarak da bilinir. Daha bir baska tek alanli antikorlar, köpek baligi antikorlarini (örnegin, köpek baligi lg-NAR'larini) içerir. Köpek baligi Ig-NAR'lari, bir degisken alanin (V-NAR) ve bes C-benzeri sabit alanin (C-NAR) bir homodimerini içerir, burada çesitlilik 5 ila 23 rezidü uzunlugu arasinda çesitlilik gösteren bir uzatilmis CDR3 bölgesinde yogunlasir. Kamelid türlerinde (örnegin, lamalarda), Vw olarak ifade edilen agir zincir degisken bölgesi, tüm antijen-baglama alanini olusturur. Kamelid Vw degisken bölgeleri ve geleneksel antikorlardan türetilenler (VH) arasindaki ana farkliliklar, (a) \hm'de karsilik gelen bölgeye kiyasla VH'nin hafif zincir temas yüzeyinde daha çok hidrofobik amino asit, (b) Vw'de bir daha uzun CDR3 ve (c) Vw'de CDRl ve CDR3 arasinda bir disülfit bagin sik meydana gelisini içerir. Tek alanli baglama. molekülleri yapmak için yöntemler, her ikisi de burada referans olarak eklenmis olan, edilir. Vm1 alanlari içeren emsal tek alanli antikorlar, Nanobodies®'i (Ablynx NV, Ghent, Belçika) içerir.
Dahasi, mevcut bulusun polipeptitlerini üretmek için kullanisli olan degisken bölge dizileri, çok sayida farkli kaynaktan elde edilebilir. Örnegin, yukarida tartisildigi üzere, çesitli insan geni dizileri halka açik depolar formunda erisilebilir sekildedir. Antikorlarin ve antikor-sifreleyen genlerin (örnegin, klinik olarak yararli özelliklere sahip oldugu bilinen antikorlarin) çok sayida dizisi yayimlanmistir Ve uygun degisken bölge dizileri (örnegin, VL ve VH dizileri) teknikte bilinen teknikler kullanilarak bu dizilerden sentezlenebilir.
Bir baska uygulamada, bulusun bir polipeptidinin bir baglama alani, örnegin, kamelidlerden türetilen, bir VL zinciri yoklugunda kararli olan, bir VH alanindan olusur (Hamers- Kortt et al., (1995). J. Protein Chem., 14:167).
Bulusun bir polipeptidi, bir tam olarak mürin, tam olarak insan, kimerik, beserilestirilmis, insan-olmayan primat veya primatlastirilmis antikordan türetilen bir degisken alan veya CDR (CDR'ler) içerebilir. Insan-olmayan antikorlar veya bunlarin fragmanlari veya alanlari, teknikte bilinen teknikler kullanilarak bunlarin immünojenisitesini azaltmak için degistirebilir. Beserilestirilmis antikorlar, insan-olmayan antikorlardan türetilen, ana antikorun baglama özelliklerini muhafaza etmesi veya büyük ölçüde muhafaza etmesi için modifiye edilmis olan, ancak ana, insan-olmayan antikorlara kiyasla insanlarda daha az immünojenik olan antikorlardir.
Beserilestirilmis hedef antikorlar durumda, bu (a) kimerik hedef antikorlar üretmek için tüm insan-olmayan degisken alanlari insan sabit bölgelerine grefte etmeyi; (b) insan- olmayan tamamlayicilik belirleme bölgelerinin (CDR'lerin) birinin veya birden fazlasinin en azindan bir parçasini kritik Çerçeve rezidülerinin alikonmasi ile veya bu tarz alikonma olmadan bir insan çerçeve ve sabit bölgelerine grefte etmeyi; (c) tüm insan-olmayan degisken alanlari transplante etmeyi, ancak bunlari yüzey rezidülerinin degistirilmesi ile bir insan-benzeri kesit ile "gizlemeyi" içeren çesitli yöntemler ile basarilabilir. Bu tarz yöntemler, Morrison et al., (1984), Numarali U.S. Patentleri, kaynaklarinda açiklanir. De- immünizasyon ayrica, bulusun bir polipeptidinin immünojenisitesini azaltmak için de kullanilabilir. Burada kullanildigi sekliyle, "de-immünizasyon" terimi, T hücresi epitoplarinin modifikasyonunu içerir (bakiniz, örnegin, WO. Örnegin, VH ve VL dizileri analiz edilir ve tamamlayicilik-belirleme bölgeleri (CDR'ler) ve dizi içindeki diger önemli rezidüler ile iliskili olan epitoplarin lokasyonunu gösteren her bir V bölgesinden bir insan T hücresi epitopu "haritasi" üretilir. T hücresi epitopu haritasindan münferit T hücresi epitoplari, nihai antikorun aktivitesini degistirmenin düsük bir riski ile alternatif amino asit sübstitüsyonlarini tanimlamak için analiz edilir. Amino asit sübstitüsyonlarinin kombinasyonlarini içeren bir dizi alternatif VH ve VL dizisi tasarlanir ve bu diziler bunu takiben fonksiyon için test edilen bulusun bir dizi polipeptidine katilir. Tipik olarak, 12 ila 24 varyant antikor üretilir ve test edilir. Modifiye edilmis V ve insan C bölgeleri içeren tam agir ve hafif zincir genleri akabinde ekspresyon vektörlerine klonlanir ve nüteakip plazmidler tam antikorun üretilmesi için hücre hatlarina uygulanir.
Antikorlar akabinde, uygun biyokimyasal ve biyolojik analizlerde karsilastirilir ve optimal varyant tanimlanir.
Bir uygulamada, bulusun bir polipeptidinde kullanilan degisken alanlar, bir veya birden fazla CDR'nin en azindan parsiyel degisimi ile degistirilir. Bir baska uygulamada, degisken alanlar, örnegin, parsiyel çerçeve bölgesi degisimi ve dizi degisimi ile, opsiyonel olarak degistirilebilir. Bir beserilestirilmis degisken bölge yapmada, CDR'ler çerçeve bölgelerinin bundan türetildigi antikor ile ayni siniftan veya hatta alt-siniftan bir antikordan türetilebilir, bununla birlikte, CDR'lerin farkli siniftaki bir antikordan ve tercihen farkli bir türden bir antikordan aktarilacagi tasavvur edilir. Bir degisken alanin antijen baglama kapasitesini bir baskasina transfer etmek için CDR'lerin tümünü donör degisken bölgesinden tam CDR'ler ile degistirmek gerekli olmayabilir. Daha ziyade yalnizca, baglama alaninin aktivitesini idame ettirmek için gerekli olan rezidüleri ,693,762 Numarali U.S. Patentleri'nde izah edilen açiklamalar hesaba katildiginda, azaltilmis immünojenisitesi olan bir fonksiyonel antijen baglama yeri elde etmek için rutin deneyleri yürütme ile veya deneme ve yanilma testleri ile teknikte uzmanligi olan kisilerin yeterliligi içinde olacaktir.
FCS, bulusun bir polipeptidine katilabilen bir emsal TMEM3OA baglama kismidir. FC5'in amino asit dizisi, asagida izah EVQLQASG GLX-”QAGGSLRLSCAÃSGFKITHYTM GNFRQAPGKEREFVSRITWGGDNTFYSNSVKGRF T 15 RDIJAIâNI VY LQBINS LK PE DT AD yy CAIÄGS TS IATPLRV---DYWGKGTQVTVSS Bulusun. polipeptitleri opsiyonel olarak. en az bir baglayici peptit içerir. Bir uygulamada, iki veya daha fazla baglayici peptit, bulusun polipeptidinin bir polipepitidinde bulunur.
Bir baska uygulamada, bulusun bir polipeptidi, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 veya 10 baglayici peptit içerir.
Bulusun baglayici peptitleri, verilen bir pozisyonda bir kere bulunabilir veya bir rekombinant polipeptit içinde verilen bir pozisyonda birden fazla kere bulunabilir (yani, baglayici peptidin dizisi, dizi içinde x kere tekrar edilebilir). Örnegin, bir uygulamada, bulusun bir baglayici peptidi bir polipeptit içinde verilen bir pozisyonda 1 ila 10 kere (1 ve dahil) tekrar edilir. Bir baska uygulamada, bir baglayici peptit, bir polipeptit içinde verilen bir pozisyonda 2, 3, 4, , 6, 7, 8, 9 veya 10 kere bulunur.
Bulusun baglayici peptitleri çesitli uzunluklarda olabilir.
Bir uygulamada, bulusun bir baglayici peptidi, yaklasik 5 ila yaklasik 75 amino asit uzunlugundadir. Bir baska uygulamada, bulusun bir baglayici peptidi, yaklasik 5 ila yaklasik 50 amino asit uzunlugundadir. Bir baska uygulamada, bulusun bir baglayici peptidi, yaklasik 10 ila yaklasik 40 amino asit uzunlugundadir. Bir baska uygulamada, bulusun bir baglayici peptidi yaklasik 15 ila yaklasik 35 amino asit uzunlugundadir.
Bir baska uygulamada, bulusun bir baglayici peptidi, yaklasik ila yaklasik 20 amino asit uzunlugundadir. Bir baska uygulamada, bulusun bir baglayici peptidi, yaklasik 15 amino asit uzunlugundadir.
Baglayici peptitler, protein mühendisliginde bunlarin sentetik biyolojide standart birlestirme parçalari haline geldigi sekilde siklikla kullanilir (bakiniz, Örnegin, Anderson, J.C. et al., Journal of Biological Engineering 2010. 4:1 ve genetik yapilardar kullanilan standart biyolojikr parçalari listeleyen partsregistry internet sitesi).
Baglayici peptitler için güncel, teknikte bilinen kullanimlarin bazi örnekleri asagidakilerdeki kullanimlari içerir: scFv molekülleri (Freund et al., FEBS 1993. 320:97); tek Zincirli immünoglobülin molekülleri (Shu et al., 1993. 56:3055); CH2 alani silinmis antikorlar (Mueller, B.M. et al., benzeri bispesifik antikorlar (Marvin, J.S. et al., 2005 Acta Pharmacol Sin 26:649 ve orada alinti yapilan referanslar ayni zamanda Michaelson, J.S. et al., 2009 MAbs.1:128 ve Orcutt K.D. et al., 2010 Protein Eng Des Sel. 23:221); scFv füzyon proteinleri (deGraaf et. al., 2002 British. Journal of Cancer 862811): gelismekte olan protein-fragman komplementasyon analizleri (Remy, I. et al., 2007 BioTechiques 42:137). açiklandigi üzere) diger emsal baglayici peptitler, mevcut baglama moleküllerinde kullanilabilir.
Baglayici peptitler, bunlarin tutturuldugu. polipeptitlerin N veya C ucuna (veya her iki ucuna) tutturulabilir.
Tedavi edilen hastaliga veya bozukluga veya rahatsizliga bagli olarak, çesitli ilaç kargolari, örnegin, farmakolojik olarak aktif ajanlar veya es-deger bir sekilde, farmasötik olarak aktif kisimlar, bulusun baglama molekülleri kullanilarak in vivo basarili bir sekilde aktarilabilir. Burada kullanildigi sekliyle, "farmasötik olarak aktif kisim" ve "farmakolojik bilesik" terimleri, bir hastaligin veya bozuklugun etkilerini tedavi etmede veya sagaltmada yararli olan herhangi bir kismi veya bilesigi ifade etmelidir. Örnegin, nörodejeneratif hastaliklari, örnegin, Alzheimer hastaligini, Parkinson hastaligini, Huntington hastaligini, amiyotrofik lateral sklerozu (ALS'yi, Lou Gehrig hastaligini), agri epilepsisini, depolama hastaliklarini ve multipl sklerozu, içeren hastaliklar veya bozukluklar hedef alinabilir.
Emsal farmasötik olarak aktif moleküller asagidakileri içerir: sinir büyüme faktörü (NGF), beyin kaynakli nörotrofik faktör (BDNF), siliyer nörotrofik faktör (CNTF), gliyal hücre-hatti nörotrofik faktör (GDNF) ve insülin-benzeri büyüme faktörü (IGF). Buna ek olarak, terapötik potansiyele sahip oldugu gösterilmis olan ve antikorlar tarafindan aktarilabilen diger bilesikler, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, Madde P'yi, nöropeptit Y'yi, dalarjini, alfa sinükleini, vazoaktif intestinal peptidi (VIP), gama-amino-bütirik asidi (GABA), dopamini, kolesistokinini (CCK), endorfinleri, enkefalinleri ve tirotropin salim hormonunu (TRH), içeren nöropeptitlerdir.
Ilave emsal terapötikler, sitokinleri, anksiyolitik ajanlari, antikonvülsanlari, polinükleotidleri ve örnegin, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, psikiyatrik hastaliklari, örnegin, mesela, anksiyeteyi, depresyonu, sizofreniyi ve uyku bozukluklarini ayni zamanda epilepsileri, nöbet bozukluklarini, inmeyi ve serebrovasküler bozukluklari, ensefaliti ve menenjiti, hafiza ve bilis bozukluklarini, akut ve kronik agriyi (örnegin, refrakter) ve fiziksel travmayi içeren tarzda nöronal bozukluklar için kullanilabilen küçük- girisimli RNA'lari içeren, transgenleri içerebilir.
Bir uygulamada, bir farmasötik olarak aktif kisim, TMEM3OA'yi baglamayan bir antijen baglama yeri içerir. Belirli uygulamalarda, bulusun polipeptitleri, bir biyolojik etkiye aracilik eden bir TMEM3OA olmayan hedef moleküle spesifik olan en az bir baglamar yerine sahiptir. Bir uygulamada, baglama yeri (örnegin, bir hücre yüzeyi reseptörünü baglama ve bir aktive etme sinyalinin veya inhibitör sinyalin iletimi ile sonuçlanma ile) hücresel aktivasyona veya inhibisyona aracilik eder. Bir uygulamada, baglama yeri (örnegin, bir hücre sinyali indüklü yol ile, kompleman fiksasyonu veya baglama, molekülü üzerinde bulunan bir yüke (örnegin, bir toksik yüke) maruziyet ile) hücrenin ölümü ile sonuçlanan veya (örnegin, hücre öldürmeye aracilik etme veya hücre öldürmeyi tesvik etme ile, bir fibrin pihtisinin lizisini tesvik etme veya pihti olusumunu tesvik etme ile veya biyoyararlanilabilir olan bir maddenin miktarini modüle etme ile) bir süjede bir hastaliga veya bozukluga aracilik eden bir sinyalin iletimini baslatabilir. Bir baska uygulamada, bulusun polipeptitleri, azaltma veya eliminasyon için hedef alinan bir antijene, örnegin, bir hücre yüzeyi antijenine veya bir çözünebilen antijene spesifik olan en az bir baglama yerine sahiptir.
Daha baska uygulamalarda, bulusun bir polipeptidi, bir nörolojik hastaligi veya bozuklugu tedavi etmede yararli olan bir molekülü baglar. Örnegin, bir polipeptit bir nöronal hücre (örnegin, bir nöron, bir gliyal hücre veya bir) üzerinde bulunan bir antijeni baglayabilir. Belirli uygulamalarda, bir nörolojik bozukluk ile iliskili olan antijen, supra tarif edilen bir otoimmün veya enflamatuvar bozukluk olabilir.
Burada kullanildigi sekliyle, "nörolojik hastalik veya bozukluk" terimi, bir süjede sinir sisteminin dejenere oldugu bozukluklari veya rahatsizliklari (Örnegin, nörodejeneratif bozukluklari ayni zamanda, sinir sisteminin uygun sekilde gelisemedigi veya yaralanmayi, örnegin, omurilik yaralanmasini, takiben yenilenemedigi bozukluklari) içerir.
Mevcut bulusun bilesimleri ile tanisi koyulabilen, önlenebilen veya tedavi edilebilen nörolojik bozukluklarin örnekleri, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, Multipl Sklerozu, Huntington Hastaligi'ni, Alzheimer Hastaligi'ni, Parkinson Hastaligi'ni, nöropatik agriyi, travmatik beyin yaralanmasini, Guillain-Barré sendromunu ve kronik enflamatuvar demiyELISAn Ilave emsal farmakolojik olarak aktif kisimlar, asagida ilaveten tartisilir: i) Antijen Baglama Kisimlari Belirli uygulamalarda, farmasötik olarak aktif kisim, örnegin, bir antikorun veya basit alanli antikorun, en az bir antijen baglama kismini (baglama yerini) içerir. Bir uygulamada, antijen baglama kismi bilesimi özel bir hücre tipine veya dokuya hedefler.
Diger uygulamalarda, bulusun bir farmasötik olarak aktif kisminin bir baglama yeri, bir antijen baglama kismi veya fragmani içerebilir. "Antijen-baglama kismi" terimi, bir immünoglobülinin, antikorun veya antikor varyantinin, antijeni baglayan veya aynen antikor ile (yani, bunlarin bundan türetildigi aynen antikor ile) antijen baglama (yani, spesifik baglama) için rekabet eden bir polipeptit fragmanini ifade eder. Örnegin, antijen baglama fragmanlari, supra tarif edilen antikorlardan veya antikor varyantlarindan türetilebilir.
Antijen baglama kisimlari teknikte iyi bilinen rekombinant veya biyokimyasal yöntemler ile üretilebilir. Emsal antijen- baglama fragmanlari, (her bir degisken bölge tek basina antijeni baglamak için yeterli oldugunda) VH'yi ve/veya VL'yi, Fv'yi, Fab'i, (Fab')'i ve F(ab')2'yi içerir.
Diger uygulamalarda, bulusun bir farmasötik olarak aktif kismi, tek Zincirli baglama molekülünden (örnegin, bir tek Zincirli degisken bölgeden veya scFV'den) bir baglama yeri içerebilir. Tek Zincirli antikorlarin üretilmesi için tarif edilen teknikler (4,694,778 Numarali U.S. Patenti; Bird, 554 (1989)), tek Zincirli baglama molekülleri üretmek için uyarlanabilir. Tek Zincirli antikorlar, FV bölgesinin agir ve hafif zincir fragmanlarini bir amino asit köprüsü vasitasiyla baglama, böylece bir tek Zincirli antikor ile sonuçlanma, ile olusturulur. E. coli'de fonksiyonel Fv fragmanlarinin birlesimi için teknikler de kullanilabilir (Skerra et al., Belirli uygulamalarda, bulusun bir farmasötik olarak aktif kismi, bir veya birden fazla baglama yeri veya bir tek zincirli degisken bölge dizisi (scFv) içeren veya bundan Olusan bölge içerir. Tek Zincirli degisken bölge dizileri, bir veya birden fazla antijen baglama yerine, örnegin, bir baglayici peptit ile bir VH alanina baglanmis bir VL alanina, sahip olan bir tek polipeptit içerir. VL ve/Veya VH alanlari, teknikte bilinen. antikorlardan. veya bunlarin varyantlarindan türetilebilir. ScFV molekülleri bir VH-baglayici-VL oryantasyonunda veya VL-baglayici-VH oryantasyonunda yapilabilir.
Belirli uygulamalarda, bulusun bir farmasötik olarak aktif kisminda kullanilan bir scFv Hmlekülü, bir stabilize edilmis scFv molekülüdür. Bir uygulamada, stabilize edilmis scFv molekülü, bir VH alani ve bir `VL alani arasina koyulan bir baglayici peptit içerebilir, burada VH ve VL alanlari, VH içindeki bir amino asit ve VL alani içindeki bir amino asit arasinda bir disülfit bag ile baglanir. Diger uygulamalarda, stabilize edilmis scFv molekülü, bir optimize edilmis boya veya bilesime sahip olan bir scFv baglayici içerebilir. Daha baska uygulamalarda, stabilize edilmis scFV' molekülü, en az bir stabilize etme amino asit sübstitüsyonuna (sübstitüsyonlarina) sahip olan bir VA veya VL alani içerebilir. Daha baska bir uygulamada, bir stabilize edilmis scFv molekülü, yukarida listelenen stabilize etme özelliklerinin en az ikisine sahip olabilir.
Stabilize edilmis scFv molekülleri, bunun operatif olarak bagli oldugu polipeptide iyilestirilmis protein kararliligina sahiptir veya iyilestirilmis protein kararliligi verir.
Bulusun polipeptitlerinde bulunabilen emsal stabilize edilmis scFv molekülleri 7,951,918 U.S. Patenti'nde tarif edilir.
Belirli emsal uygulamalarda, bulusun farmasötik olarak aktif kisimlari, bir PC bölgesinin C-ucuna ve/veya N-ucuna bir baglayici peptit vasitasiyla operatif olarak bagli olan en az bir scFv molekülü içerir.
Bir uygulamada, bulusun bir farmasötik olarak aktif kismi, arzu edilen bir hedefi taniyan bir antikordan en az bir CDR içerir. Bir baska uygulamada, mevcut bulusun bir farmasötik olarak aktif kismi, arzu edilen bir hedefi taniyan bir antikordan en az iki CDR içerir. Bir baska uygulamada, mevcut bulusun bir farmasötik olarak aktif kismi, arzu edilen bir hedefi taniyan bir antikordan en az üç CDR içerir. Bir baska uygulamada, mevcut bulusun bir farmasötik olarak aktif kismi, arzu edilen bir hedefi taniyan bir antikordan en az dört CDR içerir. Bir baska uygulamada, mevcut. bulusun, bir farmasötik olarak aktif kismi, arzu edilen bir hedefi taniyan bir antikordan en az bes CDR içerir. Bir baska uygulamada, mevcut bulusun bir farmasötik olarak aktif kismi, arzu edilen bir hedefi taniyan bir antikordan en az alti CDR içerir. Bir uygulamada, bulusun bir farmasötik olarak aktif kismi, (Örnegin, bir bispesifik, dört-degerlikli antikor molekulü durumunda) bir antikor molekülünün bir arzu edilen hedefi taniyan tam amino asit dizisini içerir.
Baglama yerlerinin bulusun bir farmasötik olarak aktif kisminda kullanim için bunlardan türetilebildigi emsal antikorlar teknikte bilinir. Örnegin, tedavide kullanim için FDA tarafindan güncel olarak onaylanan antikorlar baglama yerlerini türetmek için kullanilabilir. Bir uygulamada, bir emsal baglama yeri, bir anti-Lingo antikorundan (bakiniz, bir farmasötik olarak aktif kismi, bir modifiye edilmis antikor molekülü veya antikorun bir modifiye edilmis formundan türetilen bir antijen baglama yeri (veya bunun kisimlarini) içerebilir. Bu tarz emsal formlar, örnegin, minibodileri, diabodileri, triabodileri, nanobodileri, kamelidleri, Dab'lari, dört-degerlikli antikorlari, intradiabodileri füzyon proteinlerini (örnegin, antikor sitokin füzyon proteinlerini, bir FC reseptörünün en az bir kismina kaynastirilmis proteinleri) ve bispesifik antikorlari, içerir.
Diger modifiye edilmis antikorlar, örnegin, 4,745,055 Numarali al., Ann. ReV. Immunol. 21239 (1984); Morrison, Science kaynaklarinda, tarif edilir. Yeniden-dagitilmis immünoglobülin zincirleri de bilinir. Bakiniz, örnegin, 4,444,878 Numarali yapilan referanslar.
Bir baska uygulamada, bulusun bir farmasötik olarak aktif kismi, bir antijen baglama yeri veya bir diabodi olan bölge veya bundan türetilen bir antijen baglama yeri içerir.
Diabodiler, her biri scFV moleküllerine benzeyen bir polipeptide sahip olan, ancak genel olarak her iki degisken alani baglayan bir kisa (örnegin, 10'dan daha az ve tercihen 1-5) amino asit rezidüsüne sahip olan, böylece ayni polipeptit zinciri üzerindeki V1 ve V5 alanlarinin etkilesime giremedigi, dimerik, dört-degerlikli moleküllerdir. Bunun yerine, bir polipeptit zincirinin vb ve VH alani, bir ikinci polipeptit zinciri üzerindeki (sirasiyla) VH ve VL alani ile etkilesime girer (bakiniz, örnegin, WO 02/02781). Bir uygulamada, bulusun bir farmasötik olarak aktif kismi, en az bir genetik olarak- kaynastirilmis Fc bölgesinin (yani, scFc bölgesinin) N-ucuna ve/Veya C-ucuna operatif olarak baglanmis bir diabodi içerir.
Belirli uygulamalarda, bulusun bir farmasötik olarak aktif kismi, bir BBB-trans-göç-etmeyen antikor baglama yeri (örnegin, bir TEME3OA-baglamayan tek alanli baglama molekülü, örnegin, bir tek alanli antikor) içerir. ii) immünoglobülin-Olmayan Baglama Molekülleri Belirli diger uygulamalarda, bulusun bir farmasötik olarak aktif kismi, bir immünoglobülin-olmayan baglama. molekülünden türetilen bir veya birden fazla baglama yeri içerir. Burada kullanildigi sekliyle, "immünoglobülin-olmayan baglama molekülleri" terimi, baglama yerleri bir immünoglobülin disindaki bir` polipeptitten türetilen bir amino asit dizisi içeren baglama molekülleridir. Antikor moleküllerinden türetilmemis olan baglama yerleri içeren baglama moleküllerinin örnekleri, infra daha detayli bir sekilde tartisilan reseptör baglama yerlerini ve ligand baglama yerlerini içerir.
Immünoglobülin-olmayan farmasötik olarak aktif kisimlar, immünoglobülin süper-familyasinin bir üyesinden türetilen, bir immünoglobülin olmayan (örnegin, bir T-hücresi reseptörü veya bir hücre-adezyon proteini (örnegin, CTLA-4, N-CAM, telokin)) amino asit dizileri içerebilir. Diger uygulamalarda, amino asit dizileri, immünoglobülin katlanmasina dayanmayan (örnegin, mesela, ankirin tekrar proteinleri veya fibronektinler), ancakr bununla beraber bir hedefi spesifik olarak baglayabilen bir protein topolojisi içerebilir.
Immünoglobülin-olmayan temelli farmasötik olarak aktif kisimlar, yapay olarak çesitlendirilmis baglama yerlerine sahip olan baglama moleküllerinin bir kütüphanesinden bir hedef-baglama varyantinin seleksiyonu veya izolasyonu ile tanimlanabilir. Çesitlendirilmis kütüphaneler, tamamen rastgele yaklasimlar (örnegin, hataya-egimli PCR, ekzon karma veya yönlendirilmis evrim) kullanilarak veya teknikte-bilinen tasarim stratejileri yardimiyla üretilebilir. Örnegin, baglama yeri bunun soydas hedef molekülü ile etkilesime girdiginde genel olarak. dahil edilen amino asit pozisyonlari, dejenere kodonlarin, trinükleotidlerin, rastgele peptitlerin veya tüm kivrimlarin baglama yerini Sifreleyen nükleik asit içinde karsilik. gelen pozisyonlardan içeri yerlestirilmesi ile U.S. Yayini). Amino asi pozisyonlarinin lokasyonu, hedef molekül ile kompleks halindeki baglama yerinin kristal yapisinin arastirilmasi ile tanimlanabilir. Randomizasyon için aday pozisyonlar, kivrimlari, düz yüzeyleri heliksleri ve baglama yerinin baglama kavitelerini içerir. Belirli uygulamalarda, baglama yeri içinde çesitlendirme için büyük olasilikla adaylar olan amino asitler bunlarin immünoglobülin katlanmasi ile homolojisi ile tanimlanabilir. Örnegin, fibronektinin CBR-benzeri kivrimlari içindeki rezidüler fibronektin baglama moleküllerinin bir kütüphanesini üretmek için randomize edilebilir (bakiniz, örnegin, Koide et al., J. edilebilen diger` kisimlari düz yüzeyleri içerir. Seleksiyon, teknikte-bilinen yöntemler, örnegin, faj gösterimi, maya gösterimi veya ribozom gösterimi, ile basarilabilir.
Bir uygulamada, bulusun bir farmasötik olarak aktif kismi, bir fibronektin baglama molekülünden bir baglama yeri içerir.
Fibronektin baglama Hmlekülleri (örnegin, Fibronektin tip I, aksine, intra-zincir disülfit baglara dayanmayan, CDR-benzeri kivrimlar gösterir. Fibronektin polipeptitleri yapmak için edilir. Bir emsal uygulamada, fibronektin polipeptidi, AdNectin®'dir (Adnexus Therpaeutics, Waltham, MA).
Bir baska uygulamada, bulusun bir farmasötik olarak aktif kismi, bir .Affibody®'den (Abcam, Cambridge, MA) bir` baglama yeri içerir. Affibodiler, stafilokoksal Protein A'nin (SPA) immünoglobülin baglama alanlarindan (bakiniz, Örnegin, Nord et U.S. Patentleri'nde ve WO 00/63243'te tarif edilir. Bir baska uygulamada, bulusun bir farmasötik olarak aktif kismi, bir Anticalin®'den bir baglama yeri içerir (Pieris AG, Friesing, Almanya). Antikalinler (ayni zamanda lipokalinler olarak da bilinir), fonksiyonu bunlarin varil/kivrim bölgesindeki hedef molekülleri baglamak olan bir çesitli ß-varil proteini familyasinin üyeleridir. Lipokalin baglama yerlerine, varilin sarmallarini baglayan kivrim dizilerini randomize etme ile mühendislik uygulanabilir (bakiniz, örnegin, Schlehuber et kullanilan antikalin baglama yerleri, Pieris brassica'nin 99 ve 114 ila 129 arasindaki amino asit pozisyonlarini içeren lineer polipeptit dizisinin dizi pozisyonlarina karsilik gelen dört segment içinde mutasyona ugratilmis lipokalin familyasinin polipeptitlerinden baslayarak elde edilebilir.
Antikalin baglama yerlerini yapmak için diger yöntemler, uygulamada, bulusun. bir farmasötik olarak aktif kismi, bir sistein açisindan zengin polipeptitten bir baglama yeri içerir. Mevcut bulusun tatbikinde kullanilan sistein açisindan zengin alanlar tipik olarak, bir d-heliks, bir ß yaprak veya bir ß-Varil yapisi olusturmaz. Tipik olarak, disülfit baglar, alanin bir üç-boyutlu yapiya katlanmasini tesvik eder. Genel olarak, sistein açisindan zengin alanlar, en az iki disülfit baga, daha tipik olarak en az üç disülfit baga, sahiptir. Bir emsal sistein açisindan zengin polipeptit, bir A alani proteinidir. A-alanlari (bazen, "kompleman-tipi tekrarlar" olarak adlandirilir", yaklasik 30-50 veya 30-65 amino asit içerir. Bazi uygulamalarda, alanlar, yaklasik 35-45 amino asit ve bazi durumlarda yaklasik 40 amino asit içerir. 30-50 amino asit içinde, yaklasik 6 sistein rezidüsü vardir. Alti sistein rezidüsünün, disülfit baglari tipik olarak asagidaki sisteinler arasinda bulunur: C1 ve C3, C2 ve C5, C4 ve C6. A alani, bir ligand. baglama kismini olusturur; Alanin. sistein rezidüleri, bir kompakt, kararli, fonksiyonel olarak bagimsiz kisim olusturmak için disülfit baglanir. Bu tekrarlarin kümeleri, bir ligand baglama alanini yapar ve diferansiyel kümelenme, ligand baglama açisindan özgüllük verebilir. A- alanlari içeren emsal proteinler, örnegin, kompleman bilesenlerini (örnegin, C6, C7, C8, C9 ve Faktör I), serin proteazlarini (örnegin, enteropeptidazi, matriptazi ve korini), transmembran proteinleri (örnegin, ST7, LRP3, LRPS ve LRP6) ve endositik reseptörleri (örnegin, Sortilin ile ilgili reseptörü, LDL-reseptörünü, VLDLR'yi, LRPl'i, LRP2'yi ve ApoERZ'yi), içerir. Arzu edilen bir baglama özgüllügü olan A alani proteinleri yapmak için yöntemler, örnegin, WO uygulamalarda, bulusun bir farmasötik olarak aktif kismi, bir tekrar proteininden bir baglama alani içerir. Tekrar proteinleri, küçük (örnegin, yaklasik 20 ila yaklasik 40 amino asitlik rezidülerin) yapisal birimlerinin ardisik kopyalarini veya sürekli alanlar olusturmak için birlikte istiflenen tekrarlar içeren proteinlerdir. Tekrar proteinleri, protein içindeki tekrarlarin sayisini ayarlama ile bir özel hedef baglama yerine uymasi için modifiye edilebilir. Emsal tekrar proteinleri, Tasarlanmis Ankirin Tekrar Proteinleri'ni (yani, bir DARPin®`1eri, Molecular Partners, Zurich, Isviçre) (bakiniz, örnegin, Binz et al., Nat. Biotechnol., 22: 575-582 (2004)) veya lösin açisindan zengin tekrar proteinlerini (yani, LRRP'leri) (bakiniz, Örnegin, Pancer et al., Nature, simdiye kadar belirlenmis tersiyer yapilarinin tümü, bir ß- keskin-dönüsten akabinde iki anti-paralel d-heliksten olusan Ve tekrar birimini sonraki tekrar birimine baglayan bir kivrim ile sonlanan bir karakteristik paylasir. Ankirin tekrar birimlerinden insa edilen alanlar, tekrar birimlerini bir uzatilmis ve kavisli yapi halinde istifleme ile olusturulur.
Bofa baliklarinin ve diger çenesiz baliklarin adaptif immün sisteminin parçasindan elde edilen LRRP baglama yerleri, lenfosit nwtürasyonu sirasinda lösin açisindan zengin tekrar genlerinin bir takiminin rekombinasyonu ile olusturulmasi açisindan antikorlara benzer. DARpin veya LRRP baglama yerleri edilir. bulusun baglama moleküllerinde kullanilabilen diger immünoglobülin-olmayan baglama yerleri, Src homoloji alanlarindan (örnegin, SHZ veya SH3 alanlarindan), PDZ alanlarindan, beta-laktamazdan, yüksek afiniteli proteaz inhibitörlerinden veya küçük disülfit baglama proteini iskelelerinden, örnegin, akrep toksinlerinden türetilen baglama yerleri içerir. Bu moleküllerden türetilen baglama yerleri yapmak için yöntemler, teknikte açiklanmistir, bakiniz, örnegin, Silverman et al., Nat. Biotechnol., 23(12): yerleri, bir EGP-benzeri alandan, bir Kringle-alanindan, bir PAN alanindan, bir Gla alanindan, bir SRCR alanindan, bir Kunitz/Bovin pankreatik tripsin Inhibitörü alanindan, bir Kazal-tipi serin proteazi inhibitörü alanindan, bir Trefoil (P-tipi) alanindan, bir von Willebrand faktörü tip C alanindan, bir Anafilatoksin-benzeri alandan, bir CUB alanindan, bir tiroglobülin tip 2[ tekrarindan, LDL-reseptörü sinif A alanindan, bir Sushi alanindan, bir Link alanindan, bir Trombospondin tip I alanindan, bir Immünoglobülin-benzeri alandan, bir C-tipi lektin alanindan, bir MAM alanindan, bir von Willebrand faktörü tip A alanindan, bir Somatomedin B alanindan, bir WAP-tipi dört disülfit çekirdekli alandan, bir F5/8 tipi C alanindan, bir Hemopeksin alanindan, bir Laminin- tipi EGE-benzeri alandan, bir C2 alanindan, bir CTLA-4 alanindan ve teknikte normal uzmanligi olan kisiler tarafindan bilinen bu tarz diger alanlardan ayni zamanda bunlarin türevlerinden ve/veya varyantlarindan olusan gruptan seçilen bir baglama alanindan türetilebilir. Ilave immünoglobülin- olmayan polipeptitler, Avimers®'i (Avidia, Inc., Mountain View, CA -bakiniz, WO 06/055689 Numarali Uluslararasi PCT (Biotech Studio, Cambridge, MA), Evibodies®'i (Evogenix, Sydney, Avustralya -bakiniz, 7,166,697 Numarali U.S. Patenti) ve Microbodies®'i (Nascacell Technologies, Munich, Almanya) iii) Reseptörlerin veya Ligandlarin Baglama Kisimlari Diger yönlerinde, bulusun bir farmasötik olarak aktif kismi, bir reseptörün bir ligand baglama kismidir ve/veya bir ligandin bir reseptör baglama kismidir.
Diger emsal uygulamalarda, bulusun bir farmasötik olarak aktif kismi, asagidaki proteinlerin birinden veya birden fazlasindan türetilen bir veya birden fazla ligand. baglama alani veya reseptör baglama alani içerebilir: a. Sitokinler ve Sitokin Reseptörleri Sitokinler, lenfositlerin proliferasyonu, farklilasmasi ve fonksiyonel aktivasyonu üzerinde pleyiotropik etkilere sahiptir. Çesitli sitokinlerden veya bunlarin reseptör baglama kisimlarindan bulusun füzyon proteinlerinde yararlanilabilir.
Emsal sitokinler, interlökinleri (örnegin, IL-l, IL-2, IL-3, granülosit CSF'yi (G-CSF), granülosit-makrofaj CSF'yi (GM-GSF) ve monosit makrofaj CSF'yi (M-CSF)), tümör nekroz faktörünü (TNF) alfa ve beta, sitotoksik T lenfosit antijeni 4'ü (CTLA- 4) ve interferonlari, Örnegin, interferon-a'yi, ß'yi veya y'yi Sitokin reseptörleri tipik olarak, bir ligand-spesifik alfa zincirinden ve bir ortak beta zincirinden olusur. Emsal sitokin reseptörleri, GM-CSF, IL-3 (5,639,605 Numarali U.S.
Patenti), IL-4 (5,599,905 Numarali U.S. Patenti), IL-5 (5,453,491 Numarali U.S. Patenti), IL10 reseptorü, IFNY (EP0240975) ve reseptörlerin TNF familyasi (örnegin, TNFa (örnegin, TNFR-l (EP lenfotoksin beta reseptörü) için olanlari içerir. b. Adezyon Proteinleri Adezyon moleküller, hücrelerin birbiri ile etkilesim kurmasina izin veren membrana bagli proteinlerdir. Lökosit yuvalanma reseptörlerini ve hücresel adezyon moleküllerini içeren çesitli adezyon proteinleri veya bunlarin reseptör baglama kisimlari bulusun bir füzyon proteinine katilabilir. Lökosit yuvalanma reseptörleri, enflamasyon sirasinda lökosit hücre yüzeyleri üzerinde eksprese edilir ve ekstraselüler matriks bilesenlerini baglamaya aracilik eden ß-l integrinleri (örnegin, VLA-l, 2, 3, 4, 5 ve 6) ve vasküler endotelyum üzerindeki hücresel adezyon moleküllerini (CAM'lari) baglayan ßZ-integrinleri (örnegin, LFA-l, LPAM-l, CR3 ve CR4 içerir.10 Emsal CAM'lar ICAM-l'i, ICAM-Z'yi, VCAM-l'i ve MAdCAM-l'i içerir. Diger CAM'lar E-selektini, L-selektini ve P-selektini içeren selektin familyasininkileri içerir. c. Kemokinler Kemokinler, lökositlerin bir enfeksiyon yerine dogru göçünü stimüle eden kemotaktik proteinler, de bulusun bir füzyon proteinine katilabilir. Emsal kemokinler, Makrofaj enflamatuvar proteinleri (MIP-l-d ve MIP-l-ß), nötrofil kemotaktik faktörünü ve RANTES'i (aktivasyon üzerine regüle edilmis, normal olarak T-hücresi eksprese edilmis ve salgilanmis) içerir. d. Hormonlar Bulusun füzyon proteinlerde farmakolojik olarak aktif kisimlar olarak kullanim. için emsal büyüme hormonlari, renini, insan büyüme hormonunu (HGH; 5,834,598 Numarali U.S. Patenti), N- metiyonil insan büyüme hormonunu; bovin büyüme hormonunu; büyüme hormonu salim faktörünü; paratiroit hormonunu (PTH); tiroit stimüle etme hormonunu (TSH); tiroksini; proinsülini ve folikül stimüle etme hormonunu (FSH); kalsitonini, lüteinleyici hormonu (LH), leptini, glukagonlari; bombesini; somatropini; müllerien-inhibe etme maddesini; relaksini ve prorelaksini; gonadotropin-iliskili peptidi; prolaktini; plasental laktojeni; OB proteinini veya müllerien-inhibe etme maddesini içerir. e. Reseptörler ve Ligandlar Bir uygulamada, bulusun bir farmasötik olarak aktif kismi, ligandin veya reseptörün baglama yerini (yerlerini) (örnegin, bir reseptörün ekstraselüler alanini (ECD)) en az bir genetik olarak kaynastirilmis FC bölgesi (yani, scFc bölgesi) ile birlestirir. Belirli uygulamalarda, bir reseptörün ligand- baglama kisminin› baglama yeri veya alani, bir antikor veya antikor varyanti tarafindan baglanmis bir reseptörden türetilebilir. Diger uygulamalarda, bir reseptörün ligand baglama kismi, Immünoglobülin (Ig) süperfamilyasinin bir reseptöründen (örnegin, bir çözünebilen T-hücresi reseptöründen, örnegin, mTCR® (Medigene AG, Munich, Almanya), supra tarif edilen TNF reseptörü süperfamilyasinin bir reseptöründen (Örnegin, bir immünoadhesinin bir çözünebilen TNFd reseptöründen), Gliyal Hücre-Kaynakli Nörotrofik Faktör (GDNF) reseptörü familyasinin bir reseptöründen (Örnegin, GFRd3'ten), G-proteinine kuple edilmis reseptör (GPCR) süperfamilyasinin bir reseptöründen, Tirozin Kinaz (TK) reseptörü süperfamilyasinin bir reseptöründen, Ligand- Kapilanmis (LG) süperfamilyanin bir reseptöründen, kemokin reseptörü süperfamilyasinin bir reseptöründen, IL-l/Toll- benzeri Reseptör (TLR) süperfamilyasindan ve bir sitokin reseptörü süperfamilyasindan olusan gruptan seçilen bir reseptörden türetilir.
Diger uygulamalarda, bir ligandin reseptör-baglama kisminin baglama yeri veya alani, bir antikor veya antikor varyanti tarafindan baglanmis bir liganddan türetilebilir. Örnegin, ligand Immünoglobülin (Ig) süperfamilyasinin bir reseptöründen, TNF reseptörü süperfamilyasinin bir reseptöründen, G-proteinine kuple edilmis reseptör (GPCR) süperfamilyasinin bir reseptöründen, Tirozin Kinaz (TK) reseptörü süperfamilyasinin bir reseptöründen, Ligand- Kapilanmis (LG) süperfamilyanin bir reseptöründen, kemokin reseptörü süperfamilyasinin. bir reseptöründen, IL-l/Toll- benzeri Reseptör (TLR) süperfamilyasindan ve bir sitokin reseptörü süperfamilyasindan olusan gruptan seçilen bir reseptörü baglayabilir. Bir emsal uygulamada, bir ligandin reseptör-baglama kisminin baglama yeri, TNF ligandi süperfamilyasina ait olan bir liganddan (örnegin, CD4OL) türetilir.
Büyüme faktörleri veya bunlarin reseptörleri (veya bunlarin reseptör baglama veya ligand baglama kisimlari) bulusun füzyon proteinlerine katilabilir. Emsal büyüme faktörleri, Vasküler Endotelyal Büyüme Faktörü'nü (VEGF) ve bunun izoformlarini (5,194,596 Numarali U.S. Patentl): aFGF'yi ve bFGF'yi içeren; Fibroblastik Büyüme Faktörleri'ni (FGF), atriyal natriüretik faktörü (ANF); hepatik büyüme faktörlerini (HGF'leri; faktörleri, örnegin, kemik-kaynakli nörotrofik faktörü (BDNF), gliyal hücre kaynakli nörotrofik faktör ligandlarini (örnegin, GDNF'yi, nötürini, artemini ve persefini), nörotrofin-B'ü, - 4'ü, -S'i veya -6'yi (NT-3, NT-4, NT-5 veya NT-6) veya bir sinir büyüme faktörünü, örnegin, NGF-ß platelet-kaynakli ,877,016 Numarali U.S. Patentleri); transforme etme büyüme faktörlerini (TGF), örnegin, TGF-alfa'yi ve TGF-beta'yi (WO osteoindüktif faktörleri; insülin-benzeri büyüme faktörleri- Numarali U.S. Patentleri); Eritropoietini (EPO); Trombopoeitini (TPO: kök-hücre faktörü (SCF), trombopoietini (TPO, c-Mpl ligandini) ve Wnt polipeptitlerini (6,159,462 Bulusun farmakolojik olarak aktif kisimlari olarak kullanilabilen emsal büyüme faktörü reseptörleri, EGF reseptörlerini; VEGF reseptörlerini (Örnegin, Fltl veya Flkl/KDR), PDGF reseptörlerini (WO 90/14425); HGF Patentleri) ve NGF'yi, BDNF'yi ve NT-3'ü baglayan, p75NTR veya p75 olarak da adlandirilan, düsük afiniteli reseptörü (LNGFR) ve reseptör tirozin kinazlarinin trk familyasinin üyeleri olan afiniteli reseptörleri içeren nörotrofik reseptörleri içerir. f. Ilaçlar Bir baska uygulamada, bir farmakolojik olarak aktif ajan, hastaligin tedavisinde, küründe, önlenmesinde veya tanisinda kullanilan veya aksi durumda fiziksel veya ruhsal iyilik- halini arttirmak için kullanilan bir etkin maddedir. Bu tarz ilaçlar kimyasal varliklar olabilir ve bu tarz emsal varliklar burada daha detayli bir sekilde tarif edilir.
Mevcut bulus, sinir sistemini etkileyen bozukluklarin tedavisi amaciyla baska ajanlari aktarmak için uygulanabilir ve bu ayrica, tanisal amaçlar için de uygulanabilir. SSS bozukluklarinin tedavisi için ajanlarin tercih edilen siniflari asagidakileri içerir: Sinaptik ve nöroefektör baglantisal yerlerde etki eden ilaçlar; genel ve lokal analjezikler ve anestetikler, Örnegin, opioid analjezikleri ve antagonistleri; hipnotikler ve sedatifler; psikiyatrik bozukluklarin, örnegin, depresyonun, sizofreninin, tedavi için ilaçlar; anti-epileptikler ve antikonvülsanlar; Huntington hastaligi, yaslanma ve Alzheimer hastaligi; nöro-koruyucu ajanlar (örnegin, eksitatör amino asit antagonistleri ve nörotropik faktörler) ve nörorejeneratif ajanlar; trofik faktörler, örnegin, beyin kaynakli nörotrofik faktör, siliyer nörotrofik faktör veya sinir büyüme faktörü; SSS travmasinin veya inmenin tedavisinde amaçlanan ilaçlar ve bagimliligin ve ilaç suiistimalinin tedavisi için ilaçlar; otakaidler ve anti-enflamatuvar ilaçlar; parazitik enfeksiyonlar ve mikrobiyal hastaliklar için kemoterapötik ajanlar; immünosüpresif ajanlar ve anti-kanser ilaçlari; hormonlar ve hormon antagonistleri; agir metaller ve agir metal antagonistleri; metalik-olmayan toksik ajanlar için antagonistler; kanserin tedavisi için sitostatik ajanlar; nükleer tipta ve radyasyon terapisinde kullanim için tanisal maddeler, immüno-aktif ve immüno-reaktif ajanlar ve çok sayida baska ajan, örnegin, aktaricilar ve bunlarin ilgili reseptör-agonistleri ve -antagonistleri, bunlarin ilgili öncülleri veya metabolitler; antibiyotikler, antispazmodikler, antihistaminler, anti-kusturucu ilaçlar, gevseticiler, stimülanlar, "yolcu" ve "rehber" oligonükleotidler, serebral dilatörler, psikotropikler, anti-manikler, vasküler dilatörler ve konstriktörler, anti-hipertansifler, migren tedavileri, hipnotikler, hiper- veya hipo-glisemik ajanlar, mineral veya besinsel ajanlar, anti-obezite ilaçlari, anabolikler ve anti- astmatikler.
Tipik etken maddeler (örnegin, ilaçlar) sinir sistemini etkileyen. herhangi. bir madde olabilir` veya sinir sisteminin tanisal testleri için kullanilabilir. Bunlar Gilman et al., (1990), "Goodman andv Gilman's--The Pharmacological Basis of Therapeutics", Pergamon Press, New York, tarafindan tarif edilir ve asagidaki ajanlari içerir: asetilkolin ve sentetik kolin esterleri, dogal olusumlu kolinomimetik alkaloidler ve bunlar sentetik türdesleri, antikolinesteraz ajanlar, gangliyonik stimülanlar, atropin, skopolamin ve ilgili antimuskarinik ilaçlar, katekolaminler ve sempatomimetik ilaçlar, örnegin, epinefrin, norepinefrin ve dopamin, adrenerjik agonistler, adrenerjik reseptör antagonistleri, aktaricilar, örnegin, GABA, glisin, glutamat, asetilkolin, dopamin, 5- hidroksitriptamin ve histamin, nöroaktif peptitler; analjezikler ve anestetikler, örnegin, analjezikleri ve antagonistleri; preanestetik ve anestetik ilaçlar, örnegin, benzodiazepinler, barbitüratlar, antihistaminler, fenotiyazinler ve bütilfenonlar; opioidler; antiemetikler; antikolinerjik ilaçlar, örnegin, atropin, skopolamin veya glikopirrolat; kokain; kloral türevleri; etiklorvinol; glutetimie; metiprilon; meprobamat; paraldehit; disülfiram; morfin, fentanil ve nalokson; santral olarak aktif antitüssif ajanlar; psikiyatrik ilaçlar, Örnegin, fenotiyazinler, tiyoksantenler ve diger heterosiklik bilesikler (örnegin, halperiodol); trisiklik antidepresanlar, örnegin, desimipramin ve imipramin; atipik antidepresanlar (örnegin, floksetin ve trazodon), monoamin oksidaz inhibitörleri, örnegin, izokarboksazid; lityum tuzlari; anksiyolitikler, örnegin, klordiazepoksid ve diazepam; hidantoinleri içeren anti-epileptikler, antikonvülsan barbitüratlar, iminostilbinler (örnegin, karbamazepin), süksinimidler, valproik asit, okzazolidinedionlar ve benzodiazepinler. anti-Parkinson ilaçlari, örnegin, L-DOPA/CARBIDOPA, apomorfin, amantadin, ergolinler, selegelin, ropinorol, bromokriptin mesilat ve antikolinerjik ajanlar; antispastisite ajanlari, örnegin, baklofen, diazepam ve dantrolen; nöro-koruyucu ajanlar, örnegin, eksitatör amino asit antagonistleri, nörotrofik faktörler ve beyin kaynakli nörotrofik faktör, siliyer nörotrofik faktör veya sinir büyüme faktörü; nörotrofin(NT) 3 (NT3); NT4 ve NT5; gangliyositler; nörorejeneratif ajanlar; bagimliligin ve ilaç suiistimalinin tedavisi için ilaçlar, opioid antagonistlerini ve antidepresanlari içerir; otakaidler ve anti-enflamatuvar ilaçlar, örnegin, histamin, bradikinin, kallidin ve bunlarin ilgili parazitik enfeksiyonlar ve mikrobiyal hastaliklar için kemoterapötik ajanlar; alkilleme ajanlarini (örnegin, nitrozoüreleri) ve antimetabolitleri içeren anti-kanser ilaçlari; nitrojen mustardlari, etilenaminler ve metilmelaminler; alkilsülfonatlar; folik asit analoglari; pirimidin analoglari, pürin analoglari, Vinka alkaloidleri ve antibiyotikler.
Mevcut bulus ayrica, anti-kusturucu ilaçlarin, gevseticilerin, stimülanlarin, "yolcu" ve "rehber" oligonükleotidlerin, serebral dilatörlerin, psikotropiklerin, vasküler dilatörlerin ve konstriktörlerin, anti-hipertansiflerin, migren tedavilerinin, hiper- veya hipo-glisemik ajanlarin, mineral veya besinsel ajanlarin, anti-obezite ilaçlarinin, anaboliklerin ve anti-astmatiklerin, anti-enflamatuvar ilaçlarin, örnegin, fenilbütazonun, indometasinin, naproksenin, ibuprofenin, flurbiprofenin, diklofenagiin, deksametazonun, prednisonun ve prednisolonun; serebral vazodilatörlerin, örnegin, soloktidilumun, vinkaminin, naftidrofüril okzalatin, ko-dergokrin mesilatin, siklandelatin, papaverinin, nikotinik asidin, anti-enfektif ajanlarin, örnegin, eritromisin stearatin ve sefaleksinin, adrenokortikotropik hormonun, adenosin deaminaz ribonükleazin, alkalin fosfatazin, anjiyotensinin, antikorlarin, arjinazin, arjinin deamineain, asparajinazin, seruleinin, kalsitoninin, kemotripsinin, kolesistokininin, pihtilasma faktörlerinin, dinorfinlerin, endorfinlerin, endorfinlerin, enkefalinlerin, enkefalinlerin, eritropoietinin, gastrin-salim peptidinin, glukagonun, hemoglobinin, hipotalmik salim faktörlerinin, interferonun, katakalsinin, motilinin, nöropeptit Y'nin, nörotensinin, dogal olusumlu olmayan opioidlerin, oksitosinin, papainin, paratiroit hormonunun, peptitlerin, prolaktinin, çözünebilen CD-4'ün, somatomedinin, somatostatinin, somatostatinin, somatotropinin, süperoksit dismutazin, tiroit stimülan hormonun, doku plazminojen aktivatörünün, tripsinin, vasopressinin ve bu tarz peptitlerin analoglarinin ayni zamanda baska uygun enzimlerin, hormonlarin, proteinlerin, polipeptitlerin, enzim-protein konjugatlarinin, antikor-hapten konjugatlarinin, Viral epitoplarin, Vb. aktarimi için de yararlidir.
V. Polipeptitlerin Emsal Formatlari Baglama moleküllerinin emsal formatlari, eslik eden Sekiller'de izah edilir. Örnegin, Sekil 1, burada farmasötik olarak aktif kismin gösterilmedigi örnekleri (örnegin, farmasötik olarak aktif kisimlarin buna eklenebildigi FCSFC ve FcFCS iskelelerini) ayni zamanda burada farmasötik olarak aktif kismin bir antikor baglama yeri oldugu örnekleri içerir. Örnegin, bir uygulamada, bir baglama molekülünün bir iskelesi (yani, bir farmasötik olarak aktif kismin buna eklenebildigi bir yapi), bir PC bölgesine, alanina veya kismina kovalent olarak baglanmis (örnegin, genetik olarak kaynastirilmis) iki BBB trans-göç-etme kismi içerir. BBB trans-göç-etme kisimlari, dogrudan veya bir baglayici peptit vasitasiyla baglanabilir.
Bir tercihi edilen yönünde, BBB trans-gÖç-etme kisimlari FC bölgesinin, alaninin veya kisminin N ucuna baglanabilir. Bir yönünde, ilave baglama kisimlari (örnegin, scFV' molekülleri formunda TMEM3OA-olmayan farmakolojik olarak aktif kisimlar) ayrica, FC bölgesinin, alaninin veya kisminin C ucuna da baglanabilir.
Bir baska yönünde, ilave BBB trans-göç-etme kisimlari, FC bölgesinin, alaninin veya kisminin C ucuna baglanabilir. BBB trans-göç-etme kisimlari dogrudan veya bir baglayici peptit vasitasiyla baglanabilir.
Bir baska yönünde, bir baglama molekülü, bir aynen antikor molekülünün VH alanina N-ucundan kaynastirilmis olan bir BBB trans-göç-etme kismi içerir. Bir baska yönünde, bir baglama molekülü, bir aynen antikor molekülünün VL alanina N-ucundan kaynastirilmis olan bir BBB trans-göç-etme kismi içerir. Daha baska yönünde, bir baglama molekülü, bir aynen antikor molekülüne C-ucundan kaynastirilmis iki BBB trans-göç-etme kismi içerir. BBB trans-göç-etme kisimlari dogrudan veya bir baglayici peptit vasitasiyla baglanabilir.
Farmasötik. olarak aktif kisimlarin (veya ilave farmakolojik olarak aktif kisimlarin) teknikte bilinen yöntemler kullanilarak bu yapilarin herhangi birine tutturabilecegi anlasilacaktir.
Bir uygulamada, bulusun polipeptitleri (farmasötik olarak aktif kisim açisindan monomerik olan, ancak BBB trans-göç-etme kisimlari açisindan multimerik (örnegin, dimerik) olan bir molekül olusturan) yalnizca bir farmasötik olarak aktif kisim içerir. Bir baska uygulamada, bulusun bir polipeptidi, birden fazla farmakolojik olarak aktif kisim, örnegin, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 veya daha fazla farmakolojik olarak aktif kisim, içerir. Farmasötik. olarak. aktif kisimlari ayni veya farkli olabilir.
Bulusun bir uygulamasinda, bir farmasötik olarak aktif kisim, bir Fc alaninin, bölgesinin veya kisminin N-ucuna bir baglayici peptit vasitasiyla operatif olarak baglanir. Bir baska uygulamada, farmakolojik olarak aktif kisim, bir Fc alaninin, bölgesinin veya kisminin C-ucuna bir baglayici peptit vasitasiyla operatif olarak baglanir.
Diger uygulamalarda, iki veya daha fazla farmasötik olarak aktif kisim, seri halde (örnegin, bir baglayici peptit vasitasiyla) birbirine baglanir. Bir uygulamada, farmasötik olarak aktif kisimlarin tandem dizilimi, bir Fc bölgesinin, alaninin veya kisminin C-ucuna veya N-ucuna bir baglayici peptit vasitasiyla operatif olarak baglanir.
Proteinleri farmakolojik olarak aktif bilesiklere konjuge etmenin, baglamanin ve kuple etmenin diger yöntemleri alanda iyi bilinir. Örnegin, bakiniz, Wu A M, Senter* P D, Arming antibodies: prospects and challenges for immunoconjugates, King H D, Dubowchik G M, Monoclonal antibody drug immunoconjugates for targeted treatment of cancer, Cancer A, Lee K D. Drug delivery strategy utilizing conjugation via reversible disulfide linkages: role and site of cellular reducing activities, Adv Drug Deliv Rev. 2003 Feb. 10; 55(2):l99-215. Ayrica, mevcut antikorlar, bir farmasötik olarak aktif bilesik ile yüklenmis lipozom, nano-parçaciklar veya baska analog tasiyicilar ile kombinasyon halinde saglanabilir. Bu tarz bilesimleri hazirlamanin yöntemleri alanda bilinir (bakiniz, örnegin, Sugano et al., Antibody Targeting of Doxorubicin-loaded Liposomes Suppresses the Growth and Metastatic Spread of Established Human Lung Tumor Xenografts in Severe Combined Immunodeficient Mice Cancer Nanomaterials in Analytical Chemistry, Analytical Chemistry Çok sayida efektör molekül, baglama polipeptitlerinin bunlara baglanabildigi uygun fonksiyonel gruplardan yoksundur. Bir uygulamada, bir efektör leekül, örnegin, bir ilaç veya ön- ilaç, bir baglama molekülü yoluyla polipeptide tutturulur. Bir uygulamada, baglama molekülü, özel bir yerde sitotoksisitenin aktivasyonuna izin veren bir kimyasal bag içerir. Uygun kimyasal baglar teknikte iyi bilinir ve disülfit baglar, asit labil baglar, fotolabil baglar, peptidaz labil baglar, sülfidril ve nmleimid gruplari arasinda olusturulan tiyoeter baglar ve esteraz labil baglar içerir. En tercihen, baglama molekülü bir disülfit bag veya bir tiyoeter bag içerir. Bulusa uygun sekilde, baglama molekülü tercihen, bir reaktif kimyasal grup içerir. Özel olarak tercih edilen reaktif kimyasal gruplar, N-süksinimidil esterleridir ve N-sülfosüksinimidil esterleridir. Bir tercih edilen uygulamada, reaktif kimyasal grup, tiyol gruplari arasinda disülfit baglama vasitasiyla efektöre kovalent olarak baglanabilir. Bir uygulamada, bir efektör molekül bir tiyol grubu içermesi için modifiye edilir.
Teknikte normal uzmanligi olan bir kisi, bir tiyol grubunun bir hidrojen atomuna baglanmis bir sülfür atomu içerdigini ve ayrica tipik olarak teknikte "--SH" veya "RSH" olarak gösterilebilen bir sülfidril grubu olarak da ifade edildigini anlayacaktir.
Bir uygulamada, bir baglama molekülü, bir efektör molekülü bulusun bir polipeptidi ile birlestirmek için kullanilabilir.
Baglama molekülü, yarilabilen veya yarilamayan molekül olabilir. Bir uygulamada, yarilabilen baglama molekülü bir redoks ile yarilabilen baglama molekülüdür, böylece baglama molekülü bir düsük redoks potansiyeli olan ortamlarda, Örnegin, serbest sülfidril gruplari olan moleküllerin daha yüksek konsantrasyonlarini içeren sitoplazmada ve diger bölgelerde, yarilabilir. Redoks potansiyelindeki bir degisimden dolayi yarilabilen baglama moleküllerinin örnekleri, disülfitler içerenleri içerir. Klevaj stimulusu, bulusun baglama proteininin intraselüler alimi üzerine saglanabilir, burada sitoplazmanin düsük. redoks potansiyeli, baglama molekülünün klevajini kolaylastirir. Bir baska uygulamada, pH'taki bir düsüs, maytansinoid kargosunun hedef hücre içine salimini tetikler. pH'taki düsüs, çok sayidaki fizyolojik ve patolojik proseste, örnegin, endozom tasimaciliginda, tümör büyümesinde, enflamasyonda ve miyokardiyal iskemiden, gösterilir. pH, bir fizyolojik 7,4'ten endozomlarda 5-6'ya veya lizozomlarda 4-5'e düser. Kanser hücrelerinin lizozomlarini veya endozomlarini hedef almak için kullanilabilen asit duyarli baglama moleküllerinin örnekleri, asit ile yarilabilen baglari olanlari, örnegin, asetallarda, ketallarda, ortoesterlerde, hidrazonlarda, tritillerde, cis- akonitillerde veya tiyokarbamoillerde bulunabilenleri bulunanlari, içerir (bakiniz, örnegin, Willner et al., (1993), ,665,358 Numarali U.S. Patentleri). Diger emsal asit-duyarli baglama molekülleri, Phe-Lys ve Val-Lys dipeptit dizilerini Klvaj stimulusu, düsük pH endozomal kompartimanlara (örnegin, lizozomlara) intraselüler alim tasimaciligi üzerine saglanabilir. Diger emsal asit ile yarilabilen baglama molekülleri, iki veya. daha fazla. maytansinoidin tutturulmasi için iki veya daha fazla asit ile yarilabilen bag içeren moleküllerdir (King et al., (1999), Bioconj. Chem., 10: 279- 88; WO 98/19705).
Yarilabilen baglama molekülleri, bir özel hedef hücre, örnegin, lizozomal veya tümör-iliskili enzimler, ile iliskili olan biyolojik olarak saglanan klevaj ajanlarina duyarli olabilir. Enzimatik olarak yarilabilen baglama moleküllerinin örnekleri, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, peptitleri ve esterleri, içerir. Emsal enzim ile yarilabilen baglama molekülleri, tümör-iliskili proteazlara duyarli olanlari, örnegin, Katepsin B'yi veya plazmini, içerir (Dubowchik et 42: 5277-83). Katepsin B ile yarilabilen yerler, valin- sitrüllin ve fenilalanin-lizin dipeptit dizilerini içerir emsal enzim ile yarilabilen yerler, trouse proteazlari, örnegin, Thimet Oligopeptidaz (TOP), nötrofiller, makrofajlar ve diger granülositler tarafindan tercihli bir sekilde salinan bir enzim, tarafindan taninan 4 ila 16 amino asitlik oligopeptit dizileri (örnegin, Suc-ß-Ala-Leu-Ala-Leu) tarafindan olusturulanlari içerir.
Belirli özel yönlerinde, bulusun bir baglama polipeptidi, multispesifiktir, örnegin, bir birinci molekülü veya bir molekülün epitopunu baglayan en az bir baglama yerine ve bir ikinci molekülü veya birinci molekülün bir ikinci epitopunu baglayan en az bir ikinci baglama` yerine sahiptir. Bulusun multispesifik baglama molekülleri en az iki baglama yeri içerebilir. Belirli uygulamalarda, bulusun bir mulispesifik baglama molekülünün en az iki baglama yeri, BBB trans-göç-etme yerleridir.
VI. Baglama Moleküllerinin Sentezi Bulusun bir polipeptidinin formati seçildiginde, polipeptit üretmek için çesitli yöntemler mevcuttur. Bu tarz yöntemler, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, kimyasal sentez tekniklerini ve rekombinant DNA ekspresyonu tekniklerini, Bir yönünde, açiklama bulusun bir polipeptit molekülünü sifreleyen bir nükleik asit dizisi içeren bir nükleik asit yapisi ile ilgilidir. Kodun denejere olmasindan dolayi, çesitli nükleik asit dizilerinin polipeptidin amino asit dizisini sifreleyecegi anlasilacaktir. Arzu edilen polinükleotid, teknikte bilinen yöntemler kullanilarak (örnegin, de novo kati-faz DNA sentezi ile veya hedef polipeptidi sifreleyen bir erkenden hazirlanmis polinükleotidin PCR mutajenezi ile) üretilebilir.
Oligonükleotid-aracili mutajenez, (Örnegin, bir FC varyant kismi içine) bir amino asit sübstitüsyonunu sifreleyen bir kodonu uygulamak amaciyla bir sübstitüsyonu, çerçeve-içi içeri-yerlestirmeyi veya degistirmeyi (örnegin, degistirilmis kodonu) hazirlamak için bir yöntemdir. Örnegin, baslangiç polipeptit DNA'si, arzu edilen mutasyonu sifreleyen bir oligonükleotidi bir tek-sarmalli DNA sablonuna hibridize etme ile degistirilir. Hibridizasyondan sonra, bir DNA polimeraz, oligonükleotid primerini katan sablonun bir tüm ikinci komplementer sarmalini sentezlemek için kullanilir. Bir yönünde, genetik mühendisligi, örnegin, primer-temelli PCR mutajenezi, bulusun bir polipeptidini sifreleyen bir polinükleotidi üretmek için, burada tanimlandigi üzere, bir degisimi katmak için yeterlidir.
Rekombinant üretim için, polipeptidi sifreleyen bir polinükleotid dizisi, uygun bir ekspresyon vehikülü, yani, içeri yerlestirilen kodlama dizisinin transkripsiyonu ve translasyonu için gerekli olan elemanlari veya bir RNA viral vektörü durumunda, replikasyon ve translasyon için gerekli olan elemanlari içeren bir vektör, içine yerlestirilir.
Polipeptidi sifreleyen nükleik asit, uygun okuma çerçevesi içinde vektör içine yerlestirilir. Ekspresyon vektörü akabinde, polipeptidi eksprese edecek olan uygun bir hedef hücre içine transfekte edilir. Teknikte bilinen transfeksiyon teknikleri, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, kalsiyum fosfat presipitasyonunu (Wigler et al., 1978, Cell 14: 725) ve elektroporasyonu (Neumann et al., , içerir. Çesitli konak-ekspresyon vektörü sistemlerinden, ökaryotik hücrelerde burada tarif edilen polipeptidi eksprese etmek için yararlanilabilir. Bir yönünde, ökaryotik hücre, memeli hücrelerini içeren bir hayvan hücresidir (örnegin, CHO, BHK, Cos, HeLa hücreleridir). Polipeptit bir ökaryotik hücre içinde eksprese edildiginde, polipeptidi sifreleyen DNA ayrica, polipeptidin salgilanmasina izin verecek olan bir sinyal dizisini de kodlayabilir. Teknikte uzmanligi olan bir kisi, protein aktarildiginda, sinyal dizisinin matür polipeptidi olusturmak için hücre tarafindan yarildigini anlayacaktir. Bir uygulamada, bulus, bulusun bir baglayici peptidini içeren matür polipeptitler ile ilgilidir. Alternatif olarak, bir sinyal dizisi dahil edilmedigine, polipeptit hücreleri lize etme ile geri-kazanilabilir.
Bulusun polipeptidi ayrica, bir transgenik hayvanda, örnegin, bir kemirgende, keçide, koyunda, domuzda veya inekte, de sentezlenebilir. "Transgenik hayvan" terimi, bunlarin genomu için bir yabanci gen katmis olan insan-olmayan hayvanlari ifade eder. Bu gen germ-hatti dokularinda bulundugundan, bu ebeveynden yavruya geçirilir. Ekzojen genler, tek-hücreli embriyolara uygulanir (Brinster et al., 1985, Proc. Natl.
Acad.Sci. USA 82: 4438). Immünoglobülin molekülleri üreten transgenikleri içeren, transgenik hayvanlari üretmenin yöntemleri teknikte bilinir (Wagner et al., 1981, Proc. Natl.
Ekspresyon vektörleri, rekombinant bir sekilde üretilen polipeptidin kolay saflastirilmasina veya tanimlanmasina izin veren etiketleri kodlayabilir. Örnekler, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, diziyi kodlayan burada tarif edilen polipeptidin burada lac z kodlama bölgesi ile çerçeve içi vektör içine baglanabildigi, böylece bir hibrit proteinin l79l), içerir; pGEX vektörleri, bir glutatyon S-transferaz (GST) etiketi ile proteinleri eksprese etmek için kullanilabilir. Bu proteinler genel olarak çözünebilir ve glutatyon-agaroz bilyelere adsorpsiyon, akabinde serbest glutatyon varliginda elüsyon ile hücrelerden kolaylikla saflastirilabilir. Vektörler, saflastirmadan sonra etiketin kolay uzaklastirilmasi için klevaj yerleri (Örnegin, PreCission Protease (Pharmacia, Peapack, N. J.)) içerir.
Bu bulusun amaçlari için, teknikte bilinen çok sayida farkli ekspresyon vektörü sistemi kullanilabilir.
Bu ekspresyon vektörleri tipik olarak, epizomlar olarak veya konak kromozomal DNA'sinin bir integral parçasi olarak konak organizmalar içinde kopyalanabilir. Ekspresyon vektörleri, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, promotörleri (örnegin, dogal olarak iliskili veya heterolog promotörleri), hizlandiricilari, sinyal dizilerini, uç-birlestirme sinyallerini, hizlandirici elemanlari ve transkripsiyon sonlandirma dizilerini, içeren ekspresyon kontrol dizileri içerebilir. Tercihen, ekspresyon kontrol dizileri, ökaryotik konak hücreleri transforme veya transfekte edebilen vektörlerdeki ökaryotik promotör sistemleridir. Ekspresyon vektörleri ayrica, hayvan virüslerinden, örnegin, bovin papillom Virüsünden, poliyom Virüsünden, adenovirüsten, vaksiniya virüsünden, bakulovirüsten, retrovirüslerden (RSV, MMTV veya MOMLV), sitomegalovirüsten (CMV) veya SV4O Virüsünden, türetilen DNA elemanlarindan da yararlanabilir.
Digerleri, iç ribozom baglama yerleri içeren polisistronik sistemlerin kullanimini içerir.
Yaygin olarak, ekspresyon vektörleri, arzu edilen DNA dizileri ile transforme edilmis bu hücrelerin saptanmasina olanak saglamak için seleksiyon belirteçleri (örnegin, ampisilin- direnci, higromisin-direnci, tetrasiklin direnci veya neomisin direnci) içerir (bakiniz, örnegin, Itakura et al., 4,704,362 U.S. Patenti). DNA'yi bunlarin kromozomlari içine entegre etmis olan hücreler, transfekte edilmis konak hücrelerin seleksiyonuna izin veren bir veya birden fazla belirteci uygulama ile seçilebilir. Belirteç bir oksotrofik konaga prototrofi, biyosit direnci (örnegin, antibiyotikler) veya agir metallere, örnegin, bakira, direnç saglayabilir.
Seçilebilen belirteç geni, eksprese edilecek olan DNA dizilerine dogrudan baglanabilir veya ayni hücre içine kotransformasyon ile uygulanabilir. Mevcut bulusun polipeptitleri polisistronik yapilari kullanilarak eksprese edilebilir. Bu ekspresyon sistemlerinde, söz konusu çok sayida gen ürünü, örnegin, multimer baglama. proteininin. çok sayida polipeptidi, bir tek polisistronik yapidan üretilebilir. Bu sistemler ökaryotik konak hücrelerde bulusun polipeptitlerin görece yüksek düzeylerini saglamak için bir iç ribozom giris yerini (IRES) avantajli bir sekilde kullanilir. Uygun IRES dizileri, ayrica burada da eklenmis olan 6,193,980 Numarali U.S. Patenti'nde açiklanir. Teknikte uzmanligi olan kisiler, bu tarz ekspresyon sistemlerinin mevcut basvuruda açiklanan polipeptitlerin tam araligini etkili bir sekilde üretmek için kullanilabilecegini anlayacaktir.
Daha genel olarak, bir polipeptidi sifreleyen vektör veya DNA dizisi hazirlandiginda, ekspresyon vektörü uygun bir konak hücre içine uygulanabilir. Yani, konak hücreler transforme edilebilir. Plazmidin konak hücre içine uygulanmasi, teknikte uzmanligi olan kisiler tarafindan iyi bilinen çesitli teknikler ile basarili bir sekilde tamamlanabilir. Bunlar, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, (elektroforezi ve elektroporasyonu içeren) transfeksiyonu, protoplast füzyonunu, kalsiyum fosfat presipitasyonunu, zarf içine alinmis DNA ile hücre füzyonunu, mikro-enjeksiyonu ve aynen Virüs ile enfeksiyonu, içerir. Bakiniz, Ridgway, A. A. G. "Mammalian Rodriguez and Denhardt, Eds. (Butterworths, Boston, Mass. l988). En tercihen, konak içine plazmid uygulanmasi elektroporasyon vasitasiyladir. Transforme edilmis hücreler, hafif zincirlerin ve agir zincirlerin üretilmesi için uygun olan kosullar altinda büyütülür ve agir ve/veya hafif zincir protein sentezi için analiz edilir. Emsal analiz teknikleri, enzime bagli bagisiklik analizini (ELISA), radyoimmünoanalizi (RIA) veya flüoresans-aktive edilmis hücre ayirici analizi (FACS), immünohistokimyayi ve benzerlerini içerir.
Burada kullanildigi sekliyle, "transformasyon" terimi, DNA'nin bir alici konak hücre içine uygulanmasini, bunun genotipi degistirdigini ve sonuç olarak alici hücrede bir degisim ile sonuçlandigini, ifade etmek için genis bir anlamda kullanilmalidir.
Bu ayni hatlar boyunca, "konak hücreler", rekombinant DNA teknikleri kullanilarak yapilan ve en az bir heterolog' geni sifreleyen vektörler ile transforme edilmis hücreleri ifade eder. Polipeptitlerin rekombinant konaklardan izolasyonu için proseslerin açiklamalarinda, "hücre" ve "hücre kültürü" terimleri, bu açik bir sekilde aksini ifade etmedikçe, polipeptidin kaynagini göstermek için birbiri ile degistirilebilir bir sekilde kullanilir. Bir baska ifadeyle, polipeptidin "hücrelerden" geri-kazanilmasi, tam hücrelerin asagi çökecek sekilde döndürülmesinden veya hem vasati hem de süspanse edilmis hücreleri içeren hücre kültüründen geri- kazanilma anlamina gelebilir.
Protein ekspresyonu için kullanilan konak hücre hatti en tercihen, memeli orijinlidir; teknikte uzmanligi olan kisilerin burada eksprese edilecek olan arzu edilen gen ürünü için en uygun olan özel konak hücreyi tercihli bir sekilde belirleme yetisine sahip olduguna inanilir. Emsal konak hücre hatlari, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, DG44'ü ve DUXBll'i (Çin Hamsteri Over hatlari, DHFR eksi), HELA'yi (insan servikal karsinomu), CVI'yi (maymun böbrek hatti), COS'u (CVI'nin. SV4O T antijeni tasiyan. bir türevi), Rl6lO'u (Çin hamsteri fibroblasti) BALBC/3T3'ü (fare fibroblasti), HAK (hamster böbrek hatti), SP2/O'yi (fare miyelomu), P3x63- Ag3.653'ü (fare miyelomu), BFA-lclBPT'yi (bovin endotelyal hücreleri), RAJI'yi (insan lenfositi) ve 293'ü (insan böbregi), içerir. CHO hücreleri özel olarak tercih edilir.
Konak hücre hatlarina tipik olarak, ticari kaynaklardan, Amerikan Doku Kültürü Koleksiyonu'ndan veya yayimlanmis literatürden erisilebilir.
Bulusun polipeptitlerini sifreleyen genler ayrica, memeli- olmayan hücrelerde, örnegin, bakterilerde veya maya veya bitki hücrelerinde, de eksprese edilebilir. Bu açidan, çesitli tek- hücreli memeli-olmayan mikroorganizmalarin, örnegin, bakterilerin, yani, kültürlerde veya fermantasyonda büyütülebilenlerin, transforme edilebilecegi anlasilacaktir.
Transformasyona duyarli olan bakteriler, enterobacteriaceae, örnegin Escherichia coli veya Salmonella suslarini; Bacillaceae, örnegin, Bacillus subtilis; Pneumococcus; Streptococcus ve Haemophilus influenzae, üyelerini içerir.
Bakteriler içinde eksprese edildiginde, ilaveten polipeptitlerin tipik olarak inklüzyon cisimciklerinin parçasi haline geldigi de anlasilacaktir. Polipeptitlerin izole edilmesi, saflastirilmasi ve akabinde fonksiyonel moleküller halinde birlestirilmesi gerekir.
Prokaryotlara ek olarak, ökaryotik mikroplar da kullanilabilir. Çok sayida baska susun yaygin bir sekilde erisilebilir olmasina ragmen, Saccharomyces cerevisiae veya yaygin ekmek mayasi ökaryotik mikroorganizmalar arasinda en yaygin sekilde kullanilir. Saccharomyces içinde ekspresyon için, örnegin, YRp7 plazmidi (Stinchcomb et al., Nature, et al., Gene, 10:157 (1980)) yaygin bir sekilde kullanilir. Bu plazmid, triptofan içinde büyüme yetisinden yoksun olan mayanin bir mutant susu için bir seleksiyon belirteci saglayan TRPl genini halihazirda içerir, örnegin, ATCC No. 44076 veya PEP. Maya konak hücresi genomunun bir karakteristigi olarak trpI lezyonunun varligi, triptofan yoklugunda büyüme ile transformasyonu saptamak için etkili bir ortam saglar. Diger maya konaklari, örnegin, Pichia, da kullanilabilir. Ekspresyon kontrol dizilerine (örnegin, promotörlere), bir replikasyon orijinine, sonlandirma dizilerine ve arzu edildigi üzere benzerlerine sahip olan maya ekspresyon vektörleri. Tipik promotörler, 3- fosfogliserat kinaz ve baska glikolitik enzimler içerir.
Indüklenebilen maya promotörleri, digerleri arasinda, alkol dehidrojenazdan, izositokrom C'den ve metanolden, maltozdan ve galaktozdan yararlanmadan sorumlu olan enzimlerden promotörler, içerir.
Alternatif olarak, polipeptit-kodlayan nükleotid dizileri, bir transgenik hayvanin genomu içine uygulama ve transgenik hayvanin sütünde müteakip ekspresyon için transgenlere katilabilir (bakiniz, örnegin, Deboer et al., US 5,741,957, transgenler, bir mamari bezi spesifik genden, örnegin, kaseinden veya beta laktoglobülinden, bir promotör ve hizlandirici ile operatif baglanti halinde polipeptitler için kodlama dizileri içerir.
In vitro üretim, arzu edilen polipeptitlerin büyük miktarlarini vermesi için ölçek-büyütmeye olanak saglar. Doku kültürü kosullari altinda büyük-ölçekte memeli hücre kültivasyonu için teknikler teknikte bilinir ve örnegin, bir hava-basma reaktörü içinde veya bir sürekli karistiricili reaktör içinde, homojen süspansiyon kültürünü veya örnegin, içi bos lifler, mikro-kapsüller içinde, agaroz mikro-bilyeler veya seramik kartuslar üzerinde, immobilize edilmis veya kistirilmis hücre kültürünü içerir. Gerektiginde ve/veya arzu edildiginde, polipeptitlerin çözeltileri, örnegin, bir sentetik mentese bölgesi polipeptidinin tercihli biyosentezinden sonra veya burada tarif edilen HIC kromatografi adimi öncesinde veya sirasinda, geleneksel kromatografi yöntemleri, örnegin, jel filtrasyonu, iyon- degisim kromatografisi, DEAE-selüloz üzerinde kromatografi ve/Veya (immüno-)afinite kromatografisi, ile saflastirilabilir. Bir afinite etiket dizisi (Örnegin, bir His(6) etiketi) opsiyonel olarak, downstream saflastirmayi kolaylastirmak için polipeptit dizisine tutturulabilir veya dahil edilebilir.
Teknikte uzmanligi olan kisiler bulus ile baglantili sekilde kullanim için daha küçük peptitleri kolaylikla sentezleyebilir. Sentetik. peptitlert hazirlamak için standart prosedürler teknikte iyi bilinir. Peptitler Merrifield'in kati faz peptit sentezi (SPPS) yöntemi (J. Am. Chem. Soc., 85:2149 (1964)) kullanilarak veya teknikte iyi bilinen standart Çözelti yöntemleri kullanilarak (bakiniz, örnegin, Bodanzsky, M., Principles of Peptide Synthesis 2nd revised ed. (Springer- Verlag, 1988 ve 1993)) sentezlenebilir. Alternatif olarak, teknikte iyi bilinen es-zamanli çok sayida peptit sentezi (SMPS) teknikleri kullanilabilir. Merrifield yöntemi ile hazirlanan peptitler, bir otomatiklestirilmis peptit sentezleyici, örnegin, Applied Biosystems 431 A-Ol Peptide Synthesizer (Mountain View, Calif.), kullanilarak veya tarif edilen manüel peptit sentezi teknigi kullanilarak sentezlenebilir. Peptitler, aktif gruplari, örnegin, bir t- bütildikarbonat (t-BOC) grubu veya bir florenilmetoksi karbonil (FMOC) grubu, kullanilarak gerektigi sekilde korunan amino asitler veya amino asit analoglari kullanilarak sentezlenebilir veya teknikte bilinen yöntemler kullanilarak sentezlenebilir. Kati faz yöntemi kullanilarak sentezlenen peptitler, tümü piyasada satilan 4-metilbenzhidrilamin (MBHA), 4-(oksimetil)-fenilasetamidometil ve 4- (hidroksimetil)fenoksimetil-kopoli(stiren-%l divinilbenzen) içeren reçinelere (Wang reçinesine) veya De Grado ve Kaiser, sentezlenebilen p-nitrobenzofenon oksim polimere (oksim reçinesine) tutturulabilir.
VII. Baglama Moleküllerinin Saflastirilmasi Eksprese edildiginde, bulusun polipeptitleri, örnegin, amonyum sülfat presipitasyonunu, afinite kolon kromatografisini, HPLC saflastirmasini, jel elektroforezini ve benzerlerini, içeren, teknikteki standart prosedürlere göre saflastirilabilir (bakiniz genel olarak, Scopes, Protein Purification (Springer- Verlag, N.Y., (1982)). Bir yeni sentezlenmis peptit ayrica, bir yöntem, örnegin, ters faz yüksek performansli sivi kromatografisi (RP-HPLC) veya peptidin boyutuna veya yüküne dayanan diger ayirma yöntemleri kullanilarak da saflastirilabilir. Dahasi, saflastirilmis peptit, bu ve diger iyi bilinen yöntemler, örnegin, amino asit analizi ve kütle spektrometrisi, kullanilarak karakterize edilebilir.
Farmasötik kullanimlar için, en az yaklasik %90 ila 95 homojenligi olan büyük ölçüde saf proteinler tercih edilir ve VIII. Uygulama Yöntemleri Bulusun polipeptitlerini hazirlamanin ve bir süjeye uygulamanin yöntemleri teknikte uzmanligi olan kisiler tarafindan iyi bilinir veya kolaylikla belirlenir.
Bir süjeye uygulama için bilesimler, bulusun bir baglama molekülünü sifreleyen bir nükleotid dizisi içeren nükleik asit moleküllerini (gen terapisi uygulamalari için) ayni zamanda polipeptit moleküllerini içerir.
Uygulama yöntemleri, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, intradermal, intramüsküler, intraperitoneal, intravenöz, subkütan, intranazal, epidural ve oral yollari, içerir.
Konjugatlar, herhangi bir uygun yol ile, örnegin, infüzyon veya bolus enjeksiyon ile, epitelyal veya mukokütanöz astarlar (örnegin, oral mukoza, rektal ve intestinal mukoza, Vb.) yoluyla emilim ile uygulanabilir ve diger farmakolojik olarak aktif ajanlar ile birlikte uygulanabilir. Uygulama sistemik veya lokal olabilir.
Belirli durumlarda, bulusun farmasötik bilesimlerini intraventriküler ve intratekal enjeksiyonu içeren, herhangi bir uygun yol ile santral sinir sistemine dogrudan uygulamak arzu edilebilir; intraventriküler enjeksiyon, örnegin, bir rezervuara, örnegin, bir Ommaya rezervuarina, tutturulmus, bir intraventriküler kateter ile kolaylastirilabilir.
Pulmoner veya nazal uygulama ayrica, örnegin, bir solunum cihazi veya nebülizör ve bir aerosolize etme ajani ile formülasyon kullanimi ile, de kullanilabilir.
Bir baska uygulamada, konjugatlar, bir kontrollü salim sistemi içinde aktarilabilir. Bir uygulamada, bir pompa kullanilabilir (bakiniz, Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. et al., N. Engl. J. Med. 3Zlz574 (1989)). Daha baska bir uygulamada, bir kontrollü salim. sistemi, terapötik hedefe, yani, beyne, yakin yerlestirilebilir, böylece sistemik dozun yalnizca bir fraksiyonuna gerek duyulur (bakiniz, örnegin, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, Diger kontrollü salim sistemleri, Langer (Science 249:1527- 1533 (1990)) tarafindan derlemede tartisilir.
Süje tercihen, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, hayvanlari, örnegin, inekleri, domuzlari, atlari, tavuklari, kedileri, köpekleri, Vb., içeren bir hayvandir ve tercihen bir memelidir ve en tercihen insandir.
Genel olarak, enjeksiyon için uygun bir farmasötik bilesim bir tampon (Örnegin, asetat, fosfat veya sitrat tamponu), bir sürfaktan (örnegin, Polisorbat), opsiyonel olarak bir stabilazör ajan (örnegin, insan albümini), Vb., içerebilir.
Bununla birlikte, burada ögretiler ile uyumlu olan diger yöntemlerde, polipeptitler advers hücresel popülasyon yerine dogrudan aktarilabilir, böylece hastalikli dokunun terapötik ajana maruziyeti arttirilabilir.
Parenteral uygulama için preparasyonlar, steril sulu veya sulu-olmayan çözeltileri, süspansiyonlari ve emülsiyonlari içerir. Sulu-olmayan çözücülerin örnekleri, propilen glikoldur, polietilen glikoldür, bitkisel sivi yaglardir, örnegin, zeytinyagidir ve enjektabl organik esterlerdir, örnegin, etil oleattir. Sulu tasiyicilar, salini ve tamponlanmis vasatlari içeren, suyu, alkolik/sulu çözeltileri, emülsiyonlari veya süspansiyonlari içerir. Söz konusu bulusta, farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyicilar, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, 0,0l-0,1M ve tercihen 0,05 M fosfat tamponu veya %O,8 salin, içerir. Diger yaygin parenteral vehiküller, sodyum fosfat çözeltilerini, Ringer dekstrozunu, dekstrozu ve sodyum klorürü, laktatlanmis Ringer'i veya fikse edilmis sivi yaglari içerir. Intravenöz vehiküller, sivi ve besinsel tazeleyicileri, elektrolit tazeleyicilerini, örnegin, Ringer dekstrozu temelli olanlari ve benzerlerini içerir.
Koruyucular ve baska katki maddeleri, örnegin, mesela, antimikrobiyaller, antioksidanlar, selatlama ajanlari ve inert gazlar ve benzerleri, de bulunabilir.
Daha özel olarak, enjektabl kullanim için uygun farmasötik bilesimler, (suda çözünebilir oldugunda) steril sulu çözeltileri veya dispersiyonlari ve steril enjektabl çözeltilerin veya dispersiyonlarin ekstamporane preparasyonu için steril tozlari içerir. Bu tarz durumlarda, bilesimin steril olmasi gerekir ve bilesim kolay enjekte edilebilirligin gerçeklesecegi derecede sivi olmalidir. Bu, üretim ve saklama kosullari altinda kararli olmalidir ve tercihen mikroorganizmalarin, örnegin, bakterilerin ve funguslarin, kotanime etme etkisine karsi korunacaktir. Tasiyici, örnegin, suyu, etanolü, poliolü (örnegin, gliserolü, propilen glikolü ve sivi polietilen glikolü ve benzerlerini), içeren bir çözücü veya dispersiyon vasati ve bunlarin uygun karisimlari olabilir. Uygun akiskanlik, örnegin, bir kaplama, örnegin, lesitin, kullanimi ile, dispersiyon durumunda gerekli olan parçacik boyutunun idamesi ile ve sürfaktanlarin kullanimi ile, idame ettirilebilir.
Mikroorganizmalarin etkisinin önlenmesi, çesitli antibakteriyel ve antifungal ajanlar, örnegin, parabenler, klorobütanol, fenol, askorbik. asit, timerosal, ve benzerleri, ile basarilabilir. Çogu durumda, bilesimin izotonik ajanlar, örnegin, sekerler, polialkoller, örnegin, mannitol, sorbitol veya sodyum klorür, içermesi tercih edilebilir olacaktir.
Enjektabl bilesimlerin uzatilmis emilimi, bilesime emilimi geciktiren bir ajani, örnegin, alüminyum monostearati ve jelatini, dahil etme ile gerçeklestirilebilir.
Herhangi bir durumda, steril enjektabl çözeltiler' bir aktif bilesimi (örnegin, kendi basina veya diger aktif ajanlar ile kombinasyon halinde bir polipeptidi) burada listelenen içerik maddelerinin biri veya bir kombinasyonu ile uygun bir çözücü içinde gerekli olan miktarda katma, gerektigi üzere, akabinde filtrelenmis sterilizasyon, ile hazirlanabilir. Genel olarak, dispersiyonlar aktif bilesigi bir bazik dispersiyon vasati ve yukarida listelenenlerden gerekli olan diger içerik maddelerini içeren bir steril vehiküle katma ile hazirlanir.
Steril enjektabl çözeltilerin preparasyonu için steril tozlar durumunda, preparasyonun tercih edilen yöntemleri, bir etken maddenin arti bunun bir önceden steril-filtreden geçirilmis çözeltisinden herhangi bir ilave arzu edilen içerik maddesinin bir tozunu üreten, vakum ile kurutmadir ve dondurarak- kurutmadir. Enjeksiyonlar için preparasyonlar teknikte iyi bilinen yöntemlere göre aseptik kosullar altinda islenir, kaplar, örnegin, ampuller, paketler, siseler, enjektörler veya Viyaller, içine doldurulur ve sizdirmaz hale getirilir.
Ilaveten, preparasyonlar, tercihen ilgili bilesimlerin otoimmün veya neoplastik bozuklarindan muzdarip olan veya otoimmün veya neoplastik bozuklarina yatkin olan bir süjeyi tedavi etmek için yararli oldugunu gösteren, etiketlere veya kullanma talimatina sahip olacak olan bir kit formunda ambalajlanabilir ve satilabilir.
Mevcut bulusun bilesimlerinin, rahatsizliklarin tedavisi için, etkili dozlari uygulama araçlarini, hedef yeri, hastanin fizyolojik durumunu, hastanin insan veya bir hayvan olmasini, uygulanan diger ilaçlari ve tedavinin profilaktik veya terapötik olmasini içeren çok sayida farkli faktöre bagli olarak çesitlilik gösterebilir. Genel olarak, hasta bir insandir, ancak transgenik memelileri içeren insan-olmayan memeliler de tedavi edilebilir.
Tedavi dozajlari, güvenligi ve etkinligi optimize etmek için teknikte uzmanligi olan kisiler tarafindan bilinen rutin yöntemler kullanilarak titre edilebilir. Bir uygulamada, bulusun bir polipeptidi, hastalara önceden uygulanmis olan, ancak bir geleneksel baglayici peptit yerine bulusun bir baglayici peptidini içermesi için. modifiye edilmis olan bir polipeptittir. Bu tarz durumlarda, polipeptidin uygulanan dozaji, önceden güvenli ve etkili oldugu bulunan, yani, bakim standardi, ile uyumlu olacaktir.
Bulusun polipeptitleri, çok sayida çok sayida defada uygulanabilir. Tek dozajlar arasindaki araliklar, haftalik, aylik veya yillik olabilir. Araliklar ayrica, hastada polipeptidin, polipeptit hedefinin veya antijenin kan düzeylerini ölçme ile gösterildigi üzere düzensiz de olabilir.
Bazi yöntemlerde, dozaj bir özel in vivo konsantrasyonu basarmak için uygulanabilir. Alternatif olarak, polipeptitler, burada olgunun daha az sik uygulamaya gerek duydugu, bir sürdürülmüs salimli formülasyon olarak uygulanabilir. Dozaj ve siklik, hastada polipeptidin yari-ömrüne bagli olarak çesitlilik gösterir.
Uygulamanin dozaji ve sikligi, tedavinin profilaktik veya terapötik olmasina bagli olarak çesitlilik gösterebilir.
Profilaktik uygulamalarda, bulusun polipeptitlerini veya bunlarin bir kokteylini içeren bilesimler` hastanin direncini güçlendirmek için halihazirda hastalik halinde olmayan bir hastaya uygulanir. Bu tarz bir miktar, bir "profilaktik etkili doz" olarak tanimlanir. Bir görece düsük dozaj, uzun bir zaman periyodu boyunca görece sik-olmayan araliklarla uygulanabilir.
Bazi hastalar, yasamlarinin kalani boyunca tedaviyi almaya devam eder.
Terapötik uygulamalarda, bir görece kisa araliklarla bir görece yüksek dozaj uygulanabilir, bazen hastaligin progresyonu azaltilana veya sonlandirilana kadar ve tercihen hasta hastaligin semptomlarinin parsiyel veya tam sagaltilmasini gösterene kadar gerekli olabilir.
Ilaveten, mevcut bulusun moleküllerinin (örnegin, bir birlestirilmis terapötik rejim, saglamak. için) bir ajan veya ajanlar ile baglantili olarak veya kombinasyon halinde kullanilabilecegi ilaveten anlasilacaktir. Bulusun bir molekülünün bunlarla birlestirilebilecegi emsal ajanlar, tedavi edilmekte olan özel bir bozukluk için güncel bakim standardini temsil eden ajanlari içerir. Bu tarz ajanlar, dogada kimyasal veya biyolojik olabilir. "Biyolojik" veya herhangi bir farmasötik olarak aktif ajani ve/veya bunlarin bir terapötik olarak kullanim için amaçlanan ürünlerini ifade Bulusun polipeptitleri opsiyonel olarak, tedaviye (örnegin, profilaktik veya terapötik) ihtiyaci olan bozuklugu veya rahatsizligi tedavi etmede etkili olan diger ajanlar ile kombinasyon halinde uygulanabilir. Burada kullanildigi sekliyle, bulusun polipeptitlerinin bir adjuvan terapi ile baglantili olarak veya kombinasyon halinde uygulanmasi, terapinin ve açiklanan polipeptitlerin sirali, simultane, es- süreli, es-zamanli, birlikte veya ayni zamanda uygulanmasi veya tatbiki anlamina gelir. Teknikte uzmanligi olan kisiler, birlestirilmis terapötik rejimin çesitli bilesenlerinin uygulanmasinin. veya tatbikinin, tedavinin genel etkililigini güçlendirmek için zamanlanabilecegini anlayacaktir. Örnegin, kemoterapötik veya biyolojik ajanlar, söz konusu baglama molekülleri ile baglantili bir sekilde tedavinin standart, iyi bilinen süreçlerinde uygulanabilir. Uzmanligi olan bir kisi (örnegin, bir hekim), seçilen yardimci terapiye ve mevcut spesifikasyonun ögretilerine göre gereksiz deneyler olmadan etkili birlestirilmis terapötik rejimleri kolaylikla ayirt edebilecektir.
Bir uygulamada, bir polipeptit bir nükleik asit molekülü olarak uygulama ile bir hastada üretilebilir. Nükleik asit molekülleri, vektör, plazmid, lipozom, DNA, enjeksiyonu, elektroporasyon, gen tabancasi, intravenöz olarak enjeksiyon veya hepatik arter infüzyonu vasitasiyla olanlari içeren, teknikte bilinen teknikler kullanilarak uygulanabilir. Gen terapisi uygulamalarinda kullanim için vektörler teknikte Mevcut bulusun polipeptitleri ile kombinasyon halinde kullanilacak olan ajanin miktari, süjeden süjeye çesitlilik gösterebilir veya teknikte bilinene göre uygulanabilir.
Bakiniz, örnegin, Bruce A Chabner et al., Antineoplastic Agents, in GOODMAN & GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAI. BASIS OF THERAPEUTICS 1233-l287 ((Joel G. Hardman et al., eds., 9th ed. l996). Bir baska uygulamada, bu tarz bir ajanin bakim standardi ile tutarli olan bir miktari uygulanir. Önceden tartisildigi üzere, mevcut bulusun polipeptitleri, memeli bozukluklarinin in vivo tedavi için bir farmasötik olarak etkili miktarda uygulanabilir. Bu açidan, bulusun molekülünün uygulamayi kolaylastirmak ve aktif ajanin kararliligini tesvik etmek için formüle edilebilecegi anlasilacaktir. Tercihen, mevcut bulusa uygun sekilde farmasötik bilesimler, bir farmasötik olarak kabul edilebilir, toksik-olmayan, steril tasiyici, örnegin, fizyolojik salin, toksik-olmayan tamponlar, koruyucular ve benzerlerini içerir.
Mevcut basvurunun amaçlari için, bir terapötik ajana konjuge edilmis veya konjuge edilmemis, bulusun bir polipeptidinin bir farmasötik olarak etkili miktari, bir antijeni etkili baglama saglamak için ve bir yarar saglamak için, örnegin, bir hastaligin veya bozuklugun semptomlarini sagaltmak için veya bir maddeyi veya bir hücreyi saptamak için yeterli olan bir miktar anlamina geldigi kabul edilmelidir. Tümör hücreleri durumunda, polipeptit tercihen, neoplastik veya immünoreaktif hücreler üzerinde seçilmis immünoreaktif antijenler ile etkilesime girebilecektir ve bu hücrelerin ölümünde bir artis saglayacaktir. Elbette, mevcut bulusun farmasötik bilesimleri, polipeptidin bir farmasötik olarak etkili miktarini saglamak için tekli veya çoklu dozlar halinde uygulanabilir.
Mevcut açiklamanin kapsamina uygun olarak, bulusun molekülü bir terapötik veya profilaktik etki üretmek için yeterli olan bir miktarda tedavinin yukarida-bahsedilen yöntemlerine uygun sekilde bir insana veya baska hayvana uygulanabilir.
Uygulama modu ve dozaj formlari elbette, bilesiklerin verilen tedavi uygulamasi için arzu edilebilir ve etkili olan terapötik miktarlarini etkileyecektir. Bir terapötik olarak etkili miktar, hastaligin baslamasini önlemek, geciktirmek veya siddetini azaltmak için gerekli olan miktardir veya bir devam eden hastaligi durdurmak veya azaltmak için gerekli olan bir miktardir. Bu miktarin faktörlere, örnegin, alicinin agirligina ve sagligina, transforme edilmekte olan hücrelerin tipine, mevcut bilesimlerin uygulama moduna ve tedavi edilmekte olan tibbi bozuklugun tipine, bagli olarak çesitlilik gösterecegi teknikte uzmanligi olan bir kisi için halihazirda asikar olacaktir.
Bulus ayrica, bulusun farmasötik bilesimlerinin içerik maddelerinin biri veya birden fazlasi ile doldurulmus bir veya birden fazla kap içeren bir farmasötik paket veya kit de saglar. Farmasötiklerin veya biyolojik ürünlerin imalatini, kullanimini veya satisini düzenleyen bir devlet dairesi tarafindan reçete edilmis formda, ajans tarafindan insan uygulamasi için imalat, kullanim veya satis onayini yansitan, bir bildiri bu tarz kap (kaplar) ile opsiyonel olarak iliskilendirilebilir.
Bu bulus ilaveten, sinirlayici olarak anlam çikarilmamasi gereken asagidaki örnekleri ile açiklanir. Örnekler FC5 moleküllerinin ekspresyonu, saflastirilmasi ve karakterizasyonu: FC5, E. coli'de eksprese edilmistir ve çözünebilen proteini periplazmik bosluktan salmak için ozmotik sok kullanilarak saflastirilmistir. Çözünebilen, His etiketli FCS akabinde, bir nikel kolon üzerinde lizattan fraktojel SE üzerinde katyon degisimi ile yakalanmistir, bunu superdex 200 üzerinde jel filtrasyonu izlemistir. Kamelid th, SDS-PAGE ile karakterize edilmistir (Sekil 2a-c). FC5-Fc, Fc-FCS ve FC5- scram-Fc önceden tarif edilen yöntemlere göre DG44 CHO hücre hatlarinda eksprese edilmistir. Arzu edilen hFc'yi içeren proteinler, pH'i 7,0'a ayarlama ve proteini önceden dengelenmis bir 5ml HiTrap rProteinA FF kolonu (GE Healthcare) üzerinde yakalama ile CHO hücresi fermantasyon vasatindan (1L) saflastirilmistir. Saflastirilmis tüm proteinler, hiç jeneralize endotoksin bagimli BBB açikligi gerçeklesmeyecegini garanti etmek için enjeksiyondan önce endotoksinin düzeyleri için karakterize edilmistir. Sonuçlar Tablo 1'de gösterilir.
Nöroaktif peptitler, Dalargin, Galanin veya NPY, Uto et al., 1991 (Uto, I., Ishimatsu, T., Hirayama, H., Ueda, S., Tsuruta, J. ve Kambara, T. (1991) Journal of immunological methods 138(l), 87-94) kaynaklarinda tarif edilen yöntemler kullanilarak bir` süksinimidil-4-(N-maleimidometil)siklohekzan- l-karboksilat (SMCC) bifonksiyonel kimyasal baglayici kullanilarak arzu edilen moleküle (FC5, FC5-Fc) baglanmistir.
Baglanacak. olan her bir peptit C-ucu üzerinde bir sisteamid analogu ile sentezlenmistir, bu SMCC bifonksiyonel çapraz- baglama kimyasini kullanarak peptidin serbest sistein vasitasiyla protein üzerindeki lizin yan Zincirlerini C-ucu çapraz-baglamasina izin vermistir. Çapraz-baglamayi takiben, her bir etiketlenmis molekül, çapraz-baglama reaksiyonu sirasinda olusturulan herhangi bir agregati elimine etmek için S-ZOO preparatif jel filtrasyonu ile saflastirilmistir. Her bir FC5 alanina veya FC5-FC alanlarina baglanmis Dalargin, NPY veya Galanin peptitlerinin ortalama sayisi kütle spektrometiris ile belirlenmistir. Tablo I, her bir FC5, FC5- Fc veya Fc-FCS alanina baglanmis peptitlerin ortalama sayisini gösterir.
FC5 içeren moleküllerin dolasimdaki farmakokinetikleri: BBB endotelyumunun FCS içeren antikorlarin her birine maruziyetinin farmakokinetiklerini anlamak için, moleküller siçanlarda belirlenmistir. Hayvanlar, bir insan Fc alanina N- ucundan (FCS-Fc) veya C-ucundan (FC-FC5) kaynastirilmis olan FCS th ile 3 mpk'da intraperitoneal olarak dozlanmistir. FC5- Fc'nin veya Fc-FCS'in plazma içinde konsantrasyonlari, ELISA ile çesitli zaman noktalarinda belirlenmistir. Sonuçlar, her bir yapinin beta-fazi yari-ömürlerini belirlemek için analiz edilmistir (Tablo II). Sonuçlar, Fc'nin geri-dönüsüm sagladigi iyi bilindiginden ve daha büyük kütle böbrek filtrasyonunu önleyeceginden, tek basina FC5 th için olana kiyasla bir insan Fc'sine kaynastirildiginda FCS-Fc'nin ve Fc-FCS'in yari- ömrünün anlamli olarak daha uzun oldugunu göstermistir (Holt, L. J., Herring, C., Jespers, L. S., Woolven, B. P. ve Tomlinson, I. M. (2003) Trends in biotechnology 21(ll), 484- 490).
FC5 içeren moleküllerin in vitro tasinma hizi: Her` bir FCS içeren protein için in vivo BBB'yi geçen aki hizlarini modellemek için bir in vitro BBB endotelyal hücre katmani kullandik. In vitro model, küçük moleküller ile geçirimlilik için dogrulanmis bir tek-katmanli analiz sisteminde ölümsüz hale getirilmis eriskin siçan beyni endotelyal hücrelerinin (SV-ARBEC) bir tek-katmanini kullanir (Garberg, P., Ball, M., Borg, N., Cecchelli, R., Fenart, L., Hurst, R. D., Lindmark, T., Mabondzo, A., Nilsson, J. E., Raub, T. J., Stanimirovic, D., Terasaki, T., Oberg, J. O. ve Osterberg, T. (2005) Toxicol In vitro l9(3), 299-334). In vitro aki hizi belirlemeleri için yöntemler, (Caram-Salas, N., Boileau, E., Farrington, G. K., Garber, E., Brunette, E., Abulrob, A. ve Stanimirovic, D. kaynaklarinda tarif edilenlere neredeyse özdestir. Içeri-aki hizlari, SV-ARBEC hücre katmanini geçen FC5, FCS-Fc ve Fc-FCS için belirlenmistir ve sonuçlar Sekil 3'te gösterildigi sekildedir.
FC5 moleküllerinin TMEM30A için baglama afinitesi: Her bir molekülün baglama afinitesi, taze izole edilmis siçan BBB endotelyal hücreleri, SV4O transforme edilmis siçan BBB endotelyal hücreleri (Caram-Salas, N., Boileau, E., Farrington, G. K., Garber, E., Brunette, E., Abulrob, A. ve Stanimirovic, D. Methods in molecular biology 763, ed. 2010, 383-401) ve önceden tanimlanmis hedef TMEM3OA ile geçici bir sekilde transfekte edilmis Hek293 hücreleri kullanilarak ayri Flüoresan Akis Sitometrisi analizinde degerlendirilmistir. Her bir hücre hatti için baglama egrileri, Sekil 4A-C'e gösterilir ve hesaplanan afinite degerleri Tablo III'tedir. Sonuçlar, FCSFc'nin primer siçan BBB endotelyal hücrelerini baglamasinin ll nM olan bir afiniteye sahip oldugunu gösterirken, SV40 transforme edilmis hücre hattini baglama 75 nM olan bir ECSO degeri, yaklasik 7 kat daha zayif baglama, ile sonuçlanir.
Siçan TMEMBOA. geçici bir sekilde transforme edilmis Hek293 hücre-hattini baglama 1700 nM civarinda bir afinite ile sonuçlanirken, bu primer BBB endotelyal hücre hattini baglamaya kiyasla neredeyse 170 kat daha zayiftir. Bu veriler, FCS-Fc'nin akis sitometrisi ile ölçüldügünde tek. basina FC5 th ile karsilastirildiginda görünür afinitede kayda deger bir artisa sahip oldugunu gösterir, bu FC5-Fc'nin TMEM-3OA eksprese eden hücreleri iki-disli avidite ile bagladigini öne Hayvan modellerinde etkinlik degerlendirmesi: FC5 th alani dimerizasyonunun molekülün RMT vasitasiyla BBB'yi geçen bir moleküler yükü aktarmak için bir transpörter olarak islev gösterme yetisi üzerinde etkiye sahip olacak olmasinin neyi etkileyecegini degerlendirmek için, bu moleküllerin aktivitesi hayvan modellerinde degerlendirilmistir. Çok sayida faktörün tasimanin etkililigini etkileyebilecegi bilinir, örnegin, bir anti-transferrin reseptörü antikorunun bir kaç kat bile olsa afinitesini düsürmenin molekülün etkili bir sekilde BBB trans- göçü gerçeklestirme yetisi üzerinde bir pozitif etkiye sahip oldugu bildirilmistir (Yu, Y. J., Zhang, Y., Kenrick, M., Hoyte, K., Luk, W., Lu, Y., Atwal, J., Elliott, J. M., Prabhu, S., Watts, R. J. ve Dennis, M. 8. Science translational medicine 3(84), 84ra44). Bu kavrama göre, FC5 th'nin Fc dimerizasyonu üzerine anlamli afinite güçlenmesinin FCS th'nin bir etkili BBB tasima molekülü olarak islev gösterme yetisini negatif bir sekilde etkiledigi tahmin edilecektir.
Bundan dolayi, nöroaktif peptidin buna baglanmis oldugu, her bir molekülün farkli bir FCS valansina sahip oldugu, moleküllerin potensi bir in vivo modelde degerlendirilmistir.
Hargreaves modeli, bir patide Freud adjuvaninin enjeksiyonu ile indüklenmis termal agriya arttirilmis duyarliligi ölçer.
Termal agri, bir alti amino asitlik peptit olan Dalargin'in beynin peri-akuaduktal kisminda eksprese edilen mu agri reseptörlerini baglamasi üzerine baskilanabilir. Intravenöz olarak enjekte edilmis Dalargin, BBB'yi geçemez ve agri supresyonu ile sonuçlanmaz, bununla birlikte, ICV enjeksiyonu Dalargin'in mu reseptörlerine difüz etmesine ve mu reseptörlerini bloke etmesine, böylece agriyi bloke etmesine olanak saglar. Böylelikle, intravenöz olarak enjekte edilmis Dalargin'in, BBB'yi geçerek tasimaya ve agrinin supresyonuna olanak saglamak için bir reseptör aracili transpörtere baglanmasi gerekir. Dalargin'in FC5 içeren moleküller tarafindan aracilik edilen BBB'yi geçerek tasinmasina degerlendirmek için, Hargreaves hayvan modeli, Dalargin'e baglanmis çesitli FC5 th moleküler formlarinin potensini karsilastirmak için kullanilmistir. PCS-Dalargin için negatif kontrol molekülü, EGZ-Dalargin'dir ve FCS-Fc-Dalargin için Pc- FC5-Dalargin'dir.
Pozitif ve negatif test maddelerinin karsilastirilabilirligini garanti etmek için FC5-Dal ve EGZ-Dal, her bir th'ye baglanmis Dalargin. peptitlerinin oraninin. karsilastirilabilir oldugunu. göstermek için kütle spektrometrisi ile karakterize edilmistir (Tablo I).
Intravenöz (IV) enjeksiyondan önce, her bir molekül baslangiçta, tüm baglanmis moleküllerin fonksiyonel olarak aktif olmasini ve agri supresyonunu indükleyebilmesini garanti etmek için bir pozitif kontrol olarak intraserebroventriküler (ICV) enjeksiyon ile test edilmistir. Moleküller dogrudan beyin omurilik sivisinin içine enjekte edildiginden ve periakuaduktal mu agri reseptörlerine difüz edebildiginden ve periakuaduktal mu agri reseptörlerini bloke edebildiginden, hem, negatif' kontrol hem. de pozitif test moleküllerinin ICV enjeksiyon üzerine agriyi baskilamasi beklenecektir. ICV enjeksiyon ile degerlendirildiginde, tüm olgularda, tek basina FCS-Dal, EGZ-Dal, FCS-Fc-Dal, Fc-FCS-Dal veya Dalargin, Dalargin'in aktarilan miktarina göre benzer potens vermistir.
Sonra, her bir Dalargin etiketli. molekül ve karsilik gelen Dalargin etiketli kontrol proteini, IV uygulama üzerine etkinlik için degerlendirilmistir. Baslangiç olarak, kontrole (EGZ-Dal) kiyasla FC5-Dal'in etkinligi karsilastirilmistir.
Sonuçlar, tek basina morfin ile gözlenebilen supresyonun düzeyine benzer tam agri supresyonunun basarildigini gösterir (Sekil Sa & b). Baslangiç agri supresyonunu gözlemlemeden önce gerekli oldugu üzere FCS-Dal'in her bir doz için her bir kg için 7,5 mg'da (mpk) üç dozunu bildirmek ilginçtir. Buna ek olarak, hayvanlar her bir kg için 7,5 mg'da (mpk) benzer sekilde üç kere dozlandiktan sonra bile, kontrol grubu agrinin supresyonunu göstermemistir. Bu sonuçlar, FC5'in bir reseptör aracili transporter olarak islev gösterebildigini, Dalargin'i BBB'yi geçerek beyin parankimasi içine tasiyabildigini ve Dalargin'in mu agri reseptörlerini baglamasina ve bloke etmesine olanak saglayabildigini gösterirken ve konfirme ederken, kontrol EGZ-Dalargin agri supresyonu göstermemistir.
Bu sonuçlar Tablo IV'te özetlenir.
Dimerize edilmis FC5 formlari, FCS-Fc ve Fc-FC5, BBB endotelyal hücreleri üzerinde TMEM3OA için çok farkli baglama afiniteleri göstermistir (Tablo III). Hargreaves agri modelinde güçlendirilmis afinitenin iyilestirilmis potens ile korele olup olmadigini belirlemek için, hem FC5-Fc-dal hem de Fc-FCS-dal agri supresyonu için degerlendirilmistir. IV enjeksiyonu takiben, Fc-FCS-dal, etkinlik göstermemis iken (Sekil 6a-d), FC5-Fc-dal (Sekil 7a & 7c) agri supresyonunda hayli etkilidir. Ek olarak, negatif kontrol Fc-Dal, in Vivo etkinlik göstermemistir (Sekil 'H3 & 7d). FCS-Fc, baslangiçta 0,5 mpk'da bir tek doz ile bile, ilk 0,5 sa'ten sonra %50'lik bir ortalama MPE ile, birinci saat içinde agriyi azaltmada etkinlik göstermistir. FC5-dal'in potensini FC5-Fc-dal ile karsilastirma, 21 mpk'da bir tek ECS-dal dozunun 0,5 mpk'a FCS-Fc-Dal ile yaklasik ayni düzeyde agri supresyonu verdigini göstermistir. Enjekte edilmis Dalargin'in molar oranina göre, FCS-Fc-Dal, Hargreaves modelinde agriyi baskilama yetisinde PCS-Dal ile karsilastirildiginda yaklasik 80 kat daha büyük olan bir potens gösterir. FC5-Fc-Dal'in 2,5 mpk'daki bir ikinci dozu, olasi maksimum agri supresyonunu vermesi için bir hayvanda yeterli olmustur. Hargreaves agri modelinde gözlenen FC5-Fc-Dal'in, Fc-FCS-Dal'in ve FC5-Dal'in gözlenen güçlendirilmis biyolojik aktivitesi, Tablo Il'de özetlendigi üzere FC5-Fc'nin daha yüksek afinitesi ve daha yüksek etkinligi ile koreledir.
Buna ek olarak, agri supresyonu için benzer etkinlikler baska nöroaktif peptitler kullanilarak basarilabilir. Örnegin, FC5'e veya FC5-PC'ye baglanmis, yukarida tarif edilene özdes kimyasi olan, bir` 29 amino asitlik 3,2 kD'luk. peptit olan Galanin, Hargreaves modelinde kronik agriyi baskilamistir. Aksine, tek basina Fc'ye baglanmis Galanin etkili agri rahatlatmasi saglayamamistir. Hem ICV pozitif kontrol hem de IV enjeksiyonlari için sonuçlar Tablo VI'da özetlenir. Bagli Galanin'in bunun soydas reseptörleri GalRl'i ve GalR2'yi baglama. ve hem. negatif kontrolde heHi de test Inoleküllerinde agriyi baskilama aktivitesini dogrulamak için, tüm moleküller test edilmistir ve bunlarin ICV -enjeksiyonundan sonra agriyi baskiladigi gösterilmistir (Tablo VI). IV enjekte edildiginde, yalnizca, FC5 içeren moleküllere, FC5'e veya FC5-PC'ye, baglanmis Galanin agriyi in Vivo baskilayabilmistir. FC5-Fc'ye kiyasla FCS'e baglanmis Galanin'in Hargreaves hayvan modelinde agriyi azaltmak için gerekli olan dozlaminda anlamli bir farklilik vardir. 6 mpk olan bir tek dozdaki Galanin-FCS (Tablo VI) %8'lik bir MPE ile sonuçlanirken, FC5-Fc-Gal'in bir tek dozu %45'lik bir MPE ile sonuçlanmistir.
Pentilentetrazolün (PTZ) intraperitoneal uygulanmasi, siçanlarda nöbetleri indükler ve Epileptik nöbetlerin bir modeli olarak kullanilmaktadir (Chen, J.W.; Naylor, D.E.; Wasterlain, C.G. Advances in the pathophysiology of status Werner, F.M.; Covenas, R. Neuropeptides involved in schizophrenia, Curr. Top. Neurochem., 2005, 4, 35-49.; Werner, F.M.; Covenas, R. In: Focus on Neuropeptide Research, Covenas, Mangas and Narvaez, Eds.: Transworld Reasearch Network: Classical neurotransmiters and neuropeptides involved in major peptitlerin, örnegin, Galanin'in ve Nöropeptit Y'nin, PTZ indüklü nöbetlerden koruma sagladigi bilinir (Mazarati l998a; Mazarati, A M., Hohmann, J. G., Bacon, A, Liu, H., Sankar, R., Steiner, R. A, Wynick, D. et al., Modulation of hippocampal excitability and. seizures by galanin. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for (Mazarati A, Liu H, Soomets U, Sankar R, Shin D, Katsumori H, Langel U, Wasterlain CG Galanin modulation of seizures and seizure modulation of hippocampal galanin in animal models of sonuçlar, Galanin'in siçan hipokampüsünden deplesyonunun kendi kendine devam eden epileptikus halinin gelismesi ile iliskili oldugunu göstermistir. Buna ek olarak, Galanin'in beynin hipokampal bölgesine enjeksiyonu nöbetleri baskilayabilir (Mazarati A, Liu H, Soomets U, Sankar R, Shin D, Katsumori H, Langel U, Wasterlain CG Galanin modulation of seizures and seizure modulation of hippocampal galanin in animal models of AM, Halaszi E, Telegdy G Anticonvulsive effects of galanin administered into the central nervous system upon the picrotoxinkindled. seizure syndrome in rats. Brain, Res 1992, 589zl64 -l66). Bununla birlikte, intravenöz olarak verilen nöroaktif peptitler BBB'yi geçemez ve bunlarin küçük boyutundan dolayi kisa bir yari-ömre sahiptir (Jain, Kamal ve Jain, Wittel, Chauhan ve Colcher. Curr Opin Biotechnol. Vol FCS'e, tek alanli antikora, hem de FCS-Fc'ye baglanmis Galanin'i test etme ile degerlendirilmistir. Her iki yapinin da BBB tasimasini güçlendirmesinin beklenmesine ragmen, FC5-Fc yapisinin burada, bunun varsayimsal hedefi TMEM3OA'yi istekli baglamasindan dolayi arttirilmis pratik afiniteye sahip oldugu ve arttirilmis boyuttan ve FC bagimli geri-dönüsümden dolayi çok daha uzun bir yari-ömre sahip oldugu gösterilmistir.
PTZ indüklü nöbet modelinde, söz konusu ajan IV veya direkt hipokampal enjeksiyon ile enjekte edilir. Hipokampal enjeksiyon ajani dogrudan etki yerine aktarir, bu Galanin'in bunun soydas reseptörlerini baglamasina ve nöbetin baslamasini önlemesine olanak saglar. Buna ek olarak, her bir molekülün direkt hipokampal enjeksiyonu, her bir moleküle, Fc'ye, FC5'e veya FC5-Fc'ye, baglanmis Galanin'in nöbet baskilayici aktiviteyi muhafaza ettigini göstermek için bir pozitif kontrol görevi görür. Her bir molekülün uygulanan dozu, yakin molar es-deger Galanin dozlari vermesi için çesitlendirilmistir. Pozitif kontrol çalismasi için, erkek Wistar siçanlari (4-6 haftalik), asagidakilerin birinin bir intrahipokampal enjeksiyonunu almistir: 5 uL'lik bir nihai hacimde valproik asit, Gal-Cya veya FC5-Gal, akabinde 15 dakika sonra, nöbetleri indüklemek için 50 mpk PTZ'nin bir IP enjeksiyonu.
FCS'e, FCS-Fc'ye veya Fc'ye baglanmis Galanin'in BBB'yi geçmek için etkililigini degerlendirmek amaciyla, bu moleküllerin her biri Sekil 7A'da ve 7B'de detaylandirildigi üzere sistemik olarak enjekte edilmistir. Sistemik çalisma için, siçanlar Gal-Cya'nin veya FCS-Gal'in (kuyruk veni yoluyla) l, 2 veya 3 intravenöz enjeksiyonunu veya FCS-Fc-Gal'in veya Fc-Gal'in bir tek dozunu almistiru Her` bir olguda, IP'yi takiben, 50 mpk olan bir dozda PTZ enjeksiyonu intraperitoneal olarak uygulanmistir ve siçanlarin hareketleri 30 dakika boyunca kaydedilmistir.
Kaydedilmis tüm hareketler akabinde incelenmistir ve nöbetlerin baslama zamani ve nöbet süreci süresi asagidaki üç karakteristik davranissal degisimin her biri için bir Önyargisiz arastirmaci tarafindan ölçülmüstür: birinci miyoklonik hareketler (FMJ; kulak, bas ve omuz segirmeleri ile karakterize edilir), birinci klonik nöbet (FCJ; minimal nöbetler, bas kaslarinin Ön-ayaklarin klonüsü, tüm Vücudun istemsiz hareketleri ve dogrultma refleksi ile ziplama hareketleri ile karakterize edilir) ve birinci tonik jeneralize ekstansiyon (TGE; dogrultma yetisinin kaybi, ön- ve arka-ayaklarin fleksiyonu veya ekstansiyonu ve tüm vücudun klonüsü ile karakterize edilir).
Tablo VIIa, her bir nmlekülün intrahipokampal enjeksiyonlari için sonuçlari gösterir. 50 npk. PTZ'nin IP enjeksiyonu, her bir nöbet tipinin, en az ciddi FMJ'den en ciddi nöbet formu jeneralize tonige çok çabuk progresyon ile miyoklonik, klonik ve jeneralize tonigin, çabuk baslamasi ile sonuçlanmistir. PTZ indüklü nöbet baslamasini parsiyel olarak baskiladigi bilinen bir küçük molekül olan Valproik asit (Pollack G.M., Shen D.D. klonik nöbetlerin baslamasinda gözlenen yaklasik bir 100 saniyelik gecikme ile, üç nöbet tipinin tümünü anlamli bir sekilde geciktirmistir, ancak nöbet baslamasini tamamen önlememistir. Tek basina veya FC5'e baglanmis Galanin'in intrahipokampal enjeksiyonu, miyoklonik nöbetlerin anlamli gecikmesi ve aha ciddi klonik ve jeneralize tonik nöbetlerin tam önlenmesi ile sonuçlanmistir.
Her bir molekülün intravenöz dozlami ile elde edilen sonuçlar, Tablo VIIb'de gösterilir. PTZ, her bir nöbet tipinin çabuk baslamasina yol açar ve 11,2 mpk TV dozlam Valproik asit miyoklonik ve klonik nöbetlerin baslamasini baskilar. intravenöz Galanin ve Galanin-Fc, nöroaktif peptidin bir kisa ve uzun yari-ömürlü versiyonu, nöbet baslamasinin sirasiyla hiç gecikmemesi veya çok az gecikmesi ile sonuçlanmistir. PTZ dozlamindan 1 saat önce, 6 mpk'da dozlanan FC5-galanin miyoklonik nöbetin anlamli gecikmesi ve klonik ve jeneralize klonik nöbetlerin tam supresyonu ile sonuçlanmistir. PTZ dozlamindan iki saat önce FC5-Fc-Galanin'in bir tek dozu da, miyoklonik nöbetin anlamli bir gecikmesi ve klonik ve jeneralize klonik nöbetlerin tam supresyonu ile sonuçlanmistir.
Bu sonuçlardan bir kaç neticeye ulasilabilir. FCS', Fc'ye veya FCS-Fc'ye baglanmis Galanin, Hargreaves modelinde ICV dozlandiginda gösterildigi üzere es-deger aktiviteyi muhafaza eder (Tablolar IV & V), buna ek olarak Tablo VIIa, PTZ nöbet modelinde siçanlarin hipokampüsüne enjekte edildiginde tek basina Galanin'e bir molar temelde es-deger aktivite göstermistir. Aksine, tek basina veya hFc molekülüne tutturulmus bir uzun ömürlü molekül olarak Galanin kan-beyin bariyerini etkili bir sekilde geçmez ve PTZ indüklü nöbetleri baskilar. Yalnizca, PCS-Galanin olarak veya FCS-Fc-Galanin olarak, FC5'e tutturuldugunda, Galanin BBB'yi geçebilir ve PTZ indüklü nöbetleri etkili bir sekilde geciktirebilir ve baskilayabilir. FCS-Fc'ye baglanmis Galanin bir molar dozlam karsilastirmasina göre nöbetlerin azalmasinda tek basina FC5'e baglanmis Galanin'e kiyasla çok daha fazla etkilidir; spesifik olarak, bu en az on alti kat daha güçlüdür. Buna ek olarak, FC5-Fc Galanin, FC5-Galanin ile karsilastirildiginda. birinci miyoklonik nöbetin baslamasi için geçen sürede daha büyük bir gecikmesi göstermistir. Bu sonuçlar, FCS-Fc'nin iyilestirilmis yari-ömrünün ve bunun hedefi için pratik afinite artisinin, Galanin'in BBB'yi geçerek aktarimini iyilestirdigini ve FC5 Galanin'e kiyasla PTZ nöbet modelinde daha etkili nöbet azalmasi ile sonuçlandigini gösterir.
Tablo I. Eksprese edilmis ve saflastirilmis moleküllerin karakterizasyonu.
Molekül FC5(”(EAG2333) FC5- Fc- FC plazmid FcQ>(EAG Molekül FC5(D(EAG2333) FC5- FC- FC plazmid FcQ)(EAG (moleküler agirlik) (Dalton) Endotoksin <1 <1 <1 <1 (moleküler agirlik) (Dalton) Analitik SEC'de pikin Ort. bagli Dalargin peptitleriß) 1.5 1.5 1.5 1.0 (1) myc etiketi EQKLISEEDL, C-uçlari (1202 mwt), C-terminal His etiketi SH içerir. (2) Fc alanlari, insan IgGl'idir ve agli'dir (tüm FC alanlari, FC N-glikosilasyonunu elimine etmek için hIgG dizisinde bir T299A nokta mutasyonu içerir) (3) FC5-Fc alanlarina kovalent olarak baglanmis olan Dalargin'lerin ortalama sayisini belirlemek için MS ile degerlendirilmistir.
Tablo 11. Bir hFc'ye kaynastirilmis FC5 alanlarinin farmakokinetik yari-ömür belirlemeleri.
FC5-Fc Fc-FCS hIgGl Analiz Flüoresans ELISA.Flüoresans Flüoresans ELISA FC5-Fc Fc-FCS hIgGl formati yari ömür Yari-ömür, siçan serumundan insan Fc'sinin ELISA saptamasi ile veya AL68O etiketli moleküller ile belirlenmistir ve flüoresans serumlardan belirlenmistir. Burada yari-ömrün ELISA'ya kiyasla flüoresans ile belirlendigi moleküller arasinda farklilik gözlenmemistir. Moleküller 3 mpk'da intraperitoneal olarak enjekte edilmistir.
Tablo III. Hargreaves modelinde FCS-Dal'in, FCS-Fc-Dal'in ve Fc-FCS-Dal'in baglama afinitelerinin ve bagil etkinliginin, etkinligin ve BBB endotelyal hücrelerine afinitenin Afinite (nM) Molekül FCS- FC_ Primer siçan BBB EC >2000 ll l7OO SV-ARBEC 75 ND Siçan Aortik endotelyal 1700 kiyasla potens kati Tablo IV. Tek basina veya FC5'e baglanmis Dalargin ile Hargreaves modelinde kronik agri supresyonunun özeti Molekül Doz MPE Doz (mg/kg) MPE Molekül Doz MPE Doz (mg/kg) MPE 0,8 0,6 A20.1 7,84 x 3 enj 2,2 ± Dalargin 0,5 Dalargin O A20.l- 2,49 x 3 enj 3,1 ± Dalargin O FC5 + (0,65 pg + 7 0 ± Dalargin mg/Kg) x 3 enj 1,6 Kronik agri supresyonu, maksimuni olasi etkinin yüzdesi (MPE Deger, ölçüm zaman çerçevesi boyunca kontralateral kontrol patisine kiyasla agri baskilanmis hayvan için egri altinda kalan alana göredir. ICV 'veya IV enjekte edilmis moleküller etkinligi, Hargreaves modelinde maksimum olasi etkinin bir yüzdesi (MPE %'si) olarak gösterilir. A20.1 ve EG2, FC5 ile ilgisi olmayan, BBB endotelyal hücreleri için görünür afiniteye sahip olmayan, tek alanlari antikorlardir.
Intravenöz (IV) dozlam degerleri için mpk cinsinden doz, her bir enjeksiyon için miktar akabinde enjeksiyonlarin sayisi olarak gösterilir.
Tablo V. Fc'ye baglanmis Dalargin ve FC5-Fc'ye baglanmis Dalargin ile Hargreaves modelinde kronik agri supresyonunun molekül Doz MPE Doz MPE (119) 96 ' si (mg/kg) % ' si Ikinci deneyde, baglanmamis FCS-Fc'nin bir IV dozu gösterilen konsantrasyonlarda FCS-Fc-Dal eklenmesinden önce IV enjekte edilmistir.
Tablo VI. Fc'ye, FCS-Fc'ye veya FC5'e baglanmis Galanin ile Hargreaves modelinde kronik agri supresyonu. molekül Doz (pg) MPE %'si (mg/kg) MPE %'si Galanin 2 54 ± 1 1 O ± 1 FCS-Gal için çoklu dozlar durumunda, dozlar 1 saat araliklarla uygulanmistir. Üçüncü deneyde, baglanmamis FCS-Fc'nin bir IV dozu gösterilen konsantrasyonlarda FCS-Fc-Dal eklenmesinden önce IV enjekte edilmistir.
Tablo VII: Siçan PTZ modelinde hipokampal enjeksiyon (a) veya sürenin karsilastirmasi a) Hipokampal enjeksiyon.
Nöbet baslamasi için geçen saniye cinsinden süre molekül Doz (ug) Miyoklonik Klonik Tonik (s) Jeneralize yalnizca 50 mg/kg 0 ± 2 0 ± 6 0 ± 0.5 b) Intravenöz enjeksiyon.
Nöbet baslamasi için geçen saniye cinsinden süre molekül Doz Miyoklonik Klonik Tonik (mg/kg) (S) Jeneralize yalnizca 50 mg/kg O ± 1 0 i 3 O ± 0.5 FCS- 6 X 3 47 ± 3 önlendi önlendi Galanin enj a) Hipokampal enjeksiyon.
Nöbet baslamasi için geçen saniye cinsinden süre molekül Doz (pg) Miyoklonik Klonik Tonik (s) Jeneralize FC5-Fc- 6 101 ± 28 önlendi Önlendi Siçanlarin PTZ ile IP dozlamini takiben, her bir nöbet tipinin baslamasi için geçen süre asagida gösterilmistir; FMJ, FCJ ve TGE test edilmistir. Nöbet tipleri supra daha detayli bir sekilde tarif edilir. (a) IP uygulanmis PTZ, her bir nöbet tipi için geçen kontrol süresini olusturur. PTZ'nin IP enjeksiyonundan önce Valproik Asit'in, Galanin'in veya FCS- Galanin'in hipokampal enjeksiyonu, maksimum etkiyi olusturur, bu moleküllerin her biri her bir nöbet tipi için süreye sahip olabilir. (b) Valproik Asit'in, pozitif kontrol, Galanin'in (1 x 3 enjeksiyon doz, her bir doz 1 saat aralikladir, PTZ dozlamindan 45 dakika önce tamamlanmistir) veya FCS-Galanin'in (1 x 3 doz, her bir doz 1 saat aralikladir, PTZ dozlamindan 45 dakika önce tamamlanmistir) IV` dozlami, FC5-Fc-Gal veya Fc- Gal, her ikisi de IP PTZ enjeksiyonunun ölçümlerinden 2 saat önce dozlanmistir, bu moleküllerin her biri IV dozlam üzerine etkiye sahip olabilir. Fc-Gal, molekül FCS F(ab) fragmanindan yoksun oldugundan, ancak FCS-Fc'ye bir benzer in Vivo PK'ya sahip oldugundan, negatif kontrol görevi görür.
Dizil: FCS-agli (T dizisi DVQLQASGGGLVQAGGSLRLSCAASGFKITHYTMGWFRQAPGKEREFVSRITW GGDNTFYSNSVKGRFTSRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTADYYCAAßßTSTATP LRVCÜWVGKGTQVTVSSAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLM BRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSAYRVVSV LTV LHQDWLNGKEYKCKVSN KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELT KNQVSLTCLVKGFYPSDDNVEWESNGQPENNYKITPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Dizi2: agli (T dizisi EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDP EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSAYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSRD ELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVM HEA LHNHYTQKSLSLSPGGGGGSDVQLQASGGGLVQAGGSLRLSCAASGFKITHYT MGWFRQAPGKEREFVSRITWGGDNTFYSNSVKGRFTIS RDNAKNTVYLQMNSL KPEDTADYYCAAGSTSTATPLRVDYWGKGTQVTVSS Dizi3: Scrambled FCS-agli (T299A)hFc (pYL605) dizisi EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDP EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSAYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVM HEA LHNHYTQKS LSLSPGGGGGSDVQLQASGGGLVQAGGSLRLSCAASGFKITHYT MGWFRQAPG KEREF VS RITWGGDNTFYSNSVKGRFTIS RDNAKNTVY LQMNSL KPEDTADYYCAADAG STGSYGSFDYWGKGTQVTVSS Eg-degerler Teknikte uzmanligi olan kisiler, rutin deneylerden fazlasini kullanmadan, burada tarif edilen bulusun spesifik uygulamalari için çok sayida es-degeri fark edecektir veya meydana çikarabilecektir.

Claims (1)

  1. ISTEMLER .En az bir farmakolojik olarak aktif ajan, TMEM3OA'yi baglayan tek alanli antikorlara dahil edilen en az iki baglama yeri ve bir birinci FC kismi ve bir ikinci Fc kismi içeren bir FC bölgesi içeren bir kimerik protein olan bir baglama molekülü olup, özelligi TMEM3OA'yi baglayan en az iki baglama yerinin her biri i) dogrudan veya ii) bir araya-giren amino asit dizisi vasitasiyla sirasiyla birinci FC kismina ve ikinci FC kisminin N- ucuna kaynastirilirmasidir, burada FC bölgesi spesifik olarak FcRn reseptörünü baglar. .Istem l'e göre baglama molekülü olup, özelligi birinci Fc kisminin ve ikinci FC kisminin her biri bir CH2 alani ve bir CH3 alani içermesidir. .Istemler l'e veya Z'ye göre baglama molekülü olup, özelligi birinci FC kisminin ve ikinci FC kisminin her biri, bir mentese bölgesi, bir CHZ alani ve bir CH3 alani içermesidir. .Istemler 1 ila 3'ten herhangi birine göre baglama molekülü olup, özelligi FC bölgesi, bir IgG antikorundan olmasidir. .Önceki istemlerin herhangi birine göre baglama molekülü olup, özelligi (a) en az iki baglama yeri, FC5 amino asit dizisini içermesidir veya (b) en az iki baglamar yeri, FC5 amino asit dizisinden .Önceki istemlerin herhangi birine göre baglama molekülü olup, özelligi birinci ve/veya ikinci Fc kismi aglikösile edilmesidir. .Önceki istemlerin herhangi birine göre baglama Hmlekülü olup, özelligi SEQ ID NO: l'i içermesidir. . Isteni 1'e göre baglama molekülü olup, özelligi baglama molekülü TMEM3OA'yi baglayan tek alanli antikorlara dahil edilen en az üç baglama yeri içermesidir, daha tercihen burada baglama molekülü TMEM3OA'yi baglayan tek alanli antikorlara dahil edilen en az dört baglama yeri içerir. .Istem l'e göre baglama molekülü olup, özelligi (a) en az iki baglama yeri sirasiyla birinci ve ikinci Fc kismina dogrudan genetik olarak kaynastirilirmasidir, (b) en az iki baglama yeri sirasiyla birinci ve ikinci Fc kismina bir peptit baglayici içeren bir araya-giren amino asit dizisi vasitasiyla genetik olarak kaynastirilir veya (c) en az iki baglama yeri sirasiyla birinci ve ikinci Fc kismina bir peptit baglayicidan olusan bir araya-giren amino asit dizisi vasitasiyla genetik olarak kaynastirilir. Istem 1'e göre baglama molekülü olup, özelligi en az iki baglama yeri sirasiyla birinci ve ikinci Fc kisimlarinin N ucuna bir peptit baglayici içeren bir amino asit dizisi vasitasiyla kaynastirilirmasidir ve burada (a) birinci ve ikinci FC kisimlari farkli immünoglobülinlerden türetilir, (b) Fc-kisimlarinin. biri mutasyona ugratilir ve diger Fc kismi mutasyona ugratilmaz veya (c) her iki FC kismi mutasyona ugratilir ancak farkli mutasyonlar kullanilir. Istem l'e göre baglama molekülü olup, özelligi (a) en az iki baglama yerinin biri, bir scFc molekülünün N-ucuna kaynastirilirmasidir veya (b) en az bir farmakolojik olarak aktif ajan, FC bölgesinin C-ucuna kaynastirilir. Istem l'e göre baglama molekülü olup, özelligi en az bir farmakolojik› olarak aktif ajan, bir küçük› kimyasal varlik olmasidir, tercihen burada küçük kimyasal varlik, baglama molekülüne bir sistein rezidüsünde kaynastirilir, daha tercihen burada sistein rezidüsü, bir mühendislik uygulanmis sistein rezidüsüdür. Istem l'e göre baglama molekülü olup, özelligi en az bir farmakolojik olarak aktif ajan, bir polipeptit olmasidir, tercihen burada en az bir farmakolojik olarak aktif ajan, bir antijen baglama yeri içerir, daha tercihen burada antijen baglama yeri bir TMEM30-olmayan baglama antikorundan türetilir. Istem 13'e göre baglama molekülü olup, özelligi farmakolojik olarak aktif ajan, bir scFV' molekülünden, bir Fab molekülünden ve bir tek alanli antikordan olusan gruptan seçilmesidir. Istem l'e göre baglama molekülü olup, özelligi en az bir farmakolojik olarak aktif ajan baglama molekülüne genetik olarak kaynastirilirmasidir, tercihen burada en az iki baglama. yeri bir antikor* molekülünün. VH alanini içeren bir araya-giren amino asit dizisi vasitasiyla genetik olarak kaynastirilir veya burada en az iki baglama yeri bir antikor molekülünün VL alanini içeren bir araya-giren amino asit dizisi vasitasiyla genetik olarak kaynastirilir, tercihen burada araya-giren amino asit dizisi ilaveten bir peptit baglayici içerir. l6. Istem l'e göre baglama molekülü olup, özelligi en az bir farmakolojik olarak aktif ajan baglama molekülüne kovalent olarak baglanir. l7. Istem 15'e göre baglama molekülü olup, özelligi (a) en az iki baglama yeri bir aynen antikor molekülünün bir VH alaninin N ucuna genetik olarak kaynastirilirmasidir veya (b) en az iki baglama yeri bir aynen antikor molekülünün bir VL alaninin N ucuna genetik olarak kaynastirilir l8. Istem l'e göre baglama molekülü olup, özelligi en az iki baglama yeri, bir aynen antikor molekülünün bir VH alaninin ve bir VL alaninin N ucuna genetik olarak kaynastirilirmasidir. l9. Istem l'e göre baglama molekülü olup, özelligi farmasötik olarak aktif ajan, bir nöroaktif peptitten, bir küçük kimyasal varliktan ve santral sinir sistemindeki bir hedefi baglayan bir antikorun bir degisken bölgesinden olusan gruptan seçilmesidir. 20. Istemler l-l9'dan herhangi birine göre baglama molekülü olup, özelligi bir nörolojik bozuklugunu tedavi etmede kullanima yöneliktir. 21. Istem 20'ye göre kullanim için baglama molekülü olup, özelligi nörolojik bozukluk, bir depolama bozuklugu, kronik agri, epilepsi, multipl skleroz, bir proteinopati veya bir demiyelinizan bozuklugu olmasidir.
TR2018/09743T 2012-01-10 2013-01-10 Kan beyin bariyerinden terapötik moleküllerin taşınmasının arttırılması. TR201809743T4 (tr)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261585039P 2012-01-10 2012-01-10

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TR201809743T4 true TR201809743T4 (tr) 2018-07-23

Family

ID=47633561

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TR2018/09743T TR201809743T4 (tr) 2012-01-10 2013-01-10 Kan beyin bariyerinden terapötik moleküllerin taşınmasının arttırılması.

Country Status (25)

Country Link
US (1) US9676849B2 (tr)
EP (1) EP2802606B1 (tr)
JP (1) JP6247226B2 (tr)
KR (1) KR102104686B1 (tr)
CN (1) CN104159922B (tr)
AU (1) AU2013207927B2 (tr)
BR (1) BR112014016887A2 (tr)
CA (1) CA2860579A1 (tr)
CY (1) CY1120419T1 (tr)
DK (1) DK2802606T3 (tr)
EA (1) EA201491346A1 (tr)
ES (1) ES2677111T3 (tr)
HK (1) HK1203977A1 (tr)
HR (1) HRP20180937T1 (tr)
HU (1) HUE039033T2 (tr)
IL (1) IL233246B (tr)
LT (1) LT2802606T (tr)
MX (1) MX350378B (tr)
NZ (1) NZ626620A (tr)
PL (1) PL2802606T3 (tr)
PT (1) PT2802606T (tr)
SI (1) SI2802606T1 (tr)
TR (1) TR201809743T4 (tr)
WO (1) WO2013106577A2 (tr)
ZA (1) ZA201404873B (tr)

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014006124A1 (en) 2012-07-04 2014-01-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Covalently linked antigen-antibody conjugates
CA2930154A1 (en) 2014-01-03 2015-07-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Covalently linked helicar-anti-helicar antibody conjugates and uses thereof
BR112016014945A2 (pt) 2014-01-03 2018-01-23 F. Hoffmann-La Roche Ag conjugado, formulação farmacêutica e uso
CA2933384A1 (en) * 2014-01-03 2015-07-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific anti-hapten/anti-blood brain barrier receptor antibodies, complexes thereof and their use as blood brain barrier shuttles
UA120048C2 (uk) * 2014-03-06 2019-09-25 Нешнл Рісеч Каунсіл Оф Канада Антигензв'язуючий фрагмент антитіла, який специфічно зв'язується з рецептором інсуліноподібного фактора росту 1 (igf1r)
KR102355310B1 (ko) * 2014-03-06 2022-01-24 내셔날 리서치 카운실 오브 캐나다 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체-특이적 항체 및 그의 용도
CN106536555B (zh) * 2014-03-06 2019-10-18 加拿大国家研究委员会 胰岛素样生长因子1受体特异性抗体及其用途
JP6391318B2 (ja) * 2014-06-27 2018-09-19 学校法人順天堂 アルツハイマー病予防治療薬のスクリーニング法
JP2018505662A (ja) 2014-12-19 2018-03-01 メッドイミューン・リミテッド 血液脳関門輸送分子およびそれらの使用
EP3250595B1 (en) 2015-01-29 2024-04-24 Technophage, Investigação E Desenvolvimento Em Biotecnologia, SA Antibody molecules and peptide delivery systems for use in alzheimer's disease and related disorders
FR3038517B1 (fr) * 2015-07-06 2020-02-28 Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Utilisation de fragments fc modifies en immunotherapie
BR112019000220A2 (pt) * 2016-07-06 2019-04-24 National Research Council Of Canada anticorpos humanizados que transmigram a barreira hematoencefálica e usos dos mesmos
EP3484518B1 (en) 2016-07-07 2024-08-14 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Antibody adjuvant conjugates
CA3046906A1 (en) 2016-12-12 2018-06-21 National Research Council Of Canada Antibody variants transmigrating the blood-brain barrier and uses thereof
CA3052058A1 (en) * 2017-01-30 2018-08-02 National Research Council Of Canada Blood-brain barrier transmigrating compounds and uses thereof
CA3073062A1 (en) 2017-08-18 2019-02-21 Adrx, Inc. Tau aggregation peptide inhibitors
CA3082280A1 (en) * 2017-12-28 2019-07-04 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Single-domain antibodies and variants thereof against tigit
US10688191B2 (en) 2018-01-19 2020-06-23 Hr Biomed, Llc Delivery of a chemotherapy agent across the blood-brain barrier
CA3089279A1 (en) 2018-02-07 2019-08-15 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Cell-permeable stapled peptide modules for cellular delivery
CA3102036A1 (en) * 2018-06-18 2019-12-26 Anwita Biosciences, Inc. Cytokine fusion proteins and uses thereof
US20210161993A1 (en) * 2018-09-12 2021-06-03 Pvp Labs Pte. Ltd. Method for accelerated healing of burn wounds
CA3115071A1 (en) 2018-10-04 2020-04-09 University Of Rochester Improvement of glymphatic delivery by manipulating plasma osmolarity
MX2021004772A (es) * 2018-10-29 2021-08-16 Biogen Ma Inc Variantes de fc5 humanizado y estabilizado para mejorar el transporte de la barrera hematoencefalica.
CN113993549A (zh) 2019-03-15 2022-01-28 博尔特生物治疗药物有限公司 靶向her2的免疫缀合物
CN113284553B (zh) * 2021-05-28 2023-01-10 南昌大学 一种用于治疗药物成瘾的药物靶点结合能力测试方法
EP4440615A1 (en) * 2021-12-02 2024-10-09 Linno Pharmaceuticals Inc. Transferrin binding antibodies and use thereof

Family Cites Families (84)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1166947A (en) 1914-10-05 1916-01-04 Paramount Hosiery Form Drying Company Hosiery-finishing apparatus.
US4704362A (en) 1977-11-08 1987-11-03 Genentech, Inc. Recombinant cloning vehicle microbial polypeptide expression
US4631190A (en) 1981-06-26 1986-12-23 Shen Wei C Acidity-sensitive spacer molecule to control the release of pharmaceuticals from molecular carriers
US4474893A (en) 1981-07-01 1984-10-02 The University of Texas System Cancer Center Recombinant monoclonal antibodies
AU561343B2 (en) 1981-10-19 1987-05-07 Genentech Inc. Human immune interferon by recombinant dna
US4444878A (en) 1981-12-21 1984-04-24 Boston Biomedical Research Institute, Inc. Bispecific antibody determinants
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4694778A (en) 1984-05-04 1987-09-22 Anicon, Inc. Chemical vapor deposition wafer boat
US4542225A (en) 1984-08-29 1985-09-17 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Acid-cleavable compound
US4849407A (en) 1986-08-13 1989-07-18 Zymogenetics, Inc. Biologically active mosaic proteins
US4766073A (en) 1985-02-25 1988-08-23 Zymogenetics Inc. Expression of biologically active PDGF analogs in eucaryotic cells
US5157021A (en) 1985-03-15 1992-10-20 Novo Nordisk A/S Insulin derivatives and pharmaceutical preparations containing these derivatives
US4745055A (en) 1985-05-07 1988-05-17 California Biotechnology Inc. Fused protein for enzyme immunoassay system
IL78444A (en) 1986-04-08 1992-05-25 Yeda Res & Dev Human gamma interferon-specific receptor protein,antibody against said protein,and compositions containing said protein and antibody
ATE143052T1 (de) 1986-07-07 1996-10-15 Centocor Inc Chimärisches murine-mensch-immunoglobulin, spezifisch für tumorassoziertes 17-1a antigen
NO873164L (no) 1986-07-30 1988-02-01 Teijin Ltd Muse-humane kimaere antistoffer.
IL84285A (en) 1986-10-27 1993-03-15 Int Genetic Engineering Chimeric antibody with specificity to human tumor antigen
GB8626412D0 (en) 1986-11-05 1986-12-03 Clark M R Antibodies
CA1339445C (en) 1986-11-12 1997-09-09 The General Hospital Corporation Recombinant hybrid immunoglobulin molecules and method of use
EP0832981A1 (en) 1987-02-17 1998-04-01 Pharming B.V. DNA sequences to target proteins to the mammary gland for efficient secretion
AU643427B2 (en) 1988-10-31 1993-11-18 Immunex Corporation Interleukin-4 receptors
DE68913658T3 (de) 1988-11-11 2005-07-21 Stratagene, La Jolla Klonierung von Immunglobulin Sequenzen aus den variablen Domänen
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
WO1990014425A1 (en) 1989-05-22 1990-11-29 Zymogenetics, Inc. PDGF α-RECEPTOR
US5061786A (en) 1989-05-25 1991-10-29 Genentech, Inc. Biologically active polypeptides based on transforming growth factor-β
US5194596A (en) 1989-07-27 1993-03-16 California Biotechnology Inc. Production of vascular endothelial cell growth factor
JPH0396383A (ja) 1989-09-08 1991-04-22 Riso Kagaku Corp 画像形成装置
EP1132471A3 (de) 1989-09-12 2001-11-28 F. Hoffmann-La Roche Ag TNF-bindende Proteine
US5633076A (en) 1989-12-01 1997-05-27 Pharming Bv Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo
US5648273A (en) 1989-12-27 1997-07-15 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Hepatic growth factor receptor is the MET proto-oncogene
JP3068180B2 (ja) 1990-01-12 2000-07-24 アブジェニックス インコーポレイテッド 異種抗体の生成
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
CA2040099A1 (en) 1990-05-01 1991-11-02 Mariano Barbacid Tyrosine kinase negative trkb
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5453491A (en) 1990-09-11 1995-09-26 Kiyoshi Takatsu Murine interleukin-5 receptor
DK0564531T3 (da) 1990-12-03 1998-09-28 Genentech Inc Berigelsesfremgangsmåde for variantproteiner med ændrede bindingsegenskaber
JPH04334377A (ja) 1990-12-31 1992-11-20 Akzo Nv 酸−不安定性リンカー分子
WO1992018628A1 (en) 1991-04-19 1992-10-29 Schering Corporation Subunit of the human interleukin-3 receptor
US5227158A (en) 1991-06-10 1993-07-13 Genentech, Inc. Method of stimulating hepatocyte proliferation by administration of hepatocyte growth factor and gamma-interferon
US5348856A (en) 1991-07-08 1994-09-20 E. R. Squibb & Sons, Inc. DNA encoding TRKC protein
MX9204374A (es) 1991-07-25 1993-03-01 Idec Pharma Corp Anticuerpo recombinante y metodo para su produccion.
US5756096A (en) 1991-07-25 1998-05-26 Idec Pharmaceuticals Corporation Recombinant antibodies for human therapy
WO1993016177A1 (en) 1992-02-11 1993-08-19 Cell Genesys, Inc. Homogenotization of gene-targeting events
US6765087B1 (en) 1992-08-21 2004-07-20 Vrije Universiteit Brussel Immunoglobulins devoid of light chains
US6005079A (en) 1992-08-21 1999-12-21 Vrije Universiteit Brussels Immunoglobulins devoid of light chains
US5556623A (en) 1993-03-30 1996-09-17 Eli Lilly And Company Antibody-drug conjugates
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
US6740734B1 (en) 1994-01-14 2004-05-25 Biovitrum Ab Bacterial receptor structures
US5877016A (en) 1994-03-18 1999-03-02 Genentech, Inc. Human trk receptors and neurotrophic factor inhibitors
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5686292A (en) 1995-06-02 1997-11-11 Genentech, Inc. Hepatocyte growth factor receptor antagonist antibodies and uses thereof
US5811524A (en) 1995-06-07 1998-09-22 Idec Pharmaceuticals Corporation Neutralizing high affinity human monoclonal antibodies specific to RSV F-protein and methods for their manufacture and therapeutic use thereof
PT848755E (pt) 1995-09-08 2003-12-31 Genentech Inc Proteina relacionada com o vegf
GB9524973D0 (en) 1995-12-06 1996-02-07 Lynxvale Ltd Viral vectors
JP2000515735A (ja) 1996-07-03 2000-11-28 ジェネンテック インコーポレーテッド 肝細胞成長因子レセプターアゴニスト
US6159462A (en) 1996-08-16 2000-12-12 Genentech, Inc. Uses of Wnt polypeptides
JP2001505194A (ja) 1996-11-05 2001-04-17 ブリストル―マイヤーズ・スクイブ・カンパニー 分枝ペプチド・リンカー
JP2002512624A (ja) 1997-05-21 2002-04-23 バイオベーション リミテッド 非免疫原性タンパク質の製造方法
CA2293632C (en) 1997-06-12 2011-11-29 Research Corporation Technologies, Inc. Artificial antibody polypeptides
DE19742706B4 (de) 1997-09-26 2013-07-25 Pieris Proteolab Ag Lipocalinmuteine
AUPP221098A0 (en) 1998-03-06 1998-04-02 Diatech Pty Ltd V-like domain binding molecules
EP1051432B1 (en) 1998-12-08 2007-01-24 Biovation Limited Method for reducing immunogenicity of proteins
US6818418B1 (en) 1998-12-10 2004-11-16 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
WO2000040612A1 (en) 1999-01-06 2000-07-13 Genentech, Inc. Insulin-like growth factor (igf) i mutant variants
AU762351B2 (en) 1999-01-06 2003-06-26 Genentech Inc. Insulin-like growth factor (IGF) I mutant variants
SE9901379D0 (sv) 1999-04-19 1999-04-19 Pharmacia & Upjohn Ab Receptor structures
US6602977B1 (en) 1999-04-19 2003-08-05 Biovitrum Ab Receptor structures
US7943129B2 (en) 2000-05-26 2011-05-17 National Research Council Of Canada Single-domain brain-targeting antibody fragments derived from llama antibodies
WO2002002781A1 (en) 2000-06-30 2002-01-10 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Heterodimeric fusion proteins
ES2335861T3 (es) 2000-09-08 2010-04-06 Universitat Zurich Grupos de proteinas repetitivas que comprenden modulos repetitivos.
ATE472609T1 (de) 2001-04-26 2010-07-15 Amgen Mountain View Inc Kombinatorische bibliotheken von monomerdomänen
US20030157561A1 (en) 2001-11-19 2003-08-21 Kolkman Joost A. Combinatorial libraries of monomer domains
WO2005018572A2 (en) 2003-08-22 2005-03-03 Biogen Idec Ma Inc. Improved antibodies having altered effector function and methods for making the same
EP1658308A1 (en) 2003-08-25 2006-05-24 Pieris ProteoLab AG Muteins of a bilin-binding protein with affinity for a given target
CA2545603A1 (en) 2003-11-12 2005-05-26 Biogen Idec Ma Inc. Neonatal fc receptor (fcrn)-binding polypeptide variants, dimeric fc binding proteins and methods related thereto
NZ550772A (en) 2004-05-21 2009-10-30 Uab Research Foundation Variable lymphocyte receptors, related polypeptides and nucleic acids, and uses thereof
EP1824796A4 (en) 2004-11-16 2010-02-17 Avidia Res Inst PROTEIN SKELETONS AND USES THEREOF
EP1943341A4 (en) * 2005-09-27 2010-07-07 Ca Nat Research Council HEMATOENCEPHALIC BARRIER EPITOPES AND USES THEREOF
MX2008010561A (es) * 2006-02-15 2009-03-02 Imclone Systems Inc Anticuerpos funcionales.
CN101802197A (zh) * 2007-05-14 2010-08-11 比奥根艾迪克Ma公司 单链FC（ScFc）区、包含其的结合多肽及与其相关的方法
CN102781962B (zh) 2010-03-03 2014-12-10 阿布林克斯公司 双互补位A-β结合多肽
EP2558503B1 (en) * 2010-04-14 2015-12-09 National Research Council of Canada Compositions and methods for brain delivery of analgesic peptides

Also Published As

Publication number Publication date
ZA201404873B (en) 2018-12-19
JP2015509097A (ja) 2015-03-26
SI2802606T1 (en) 2018-08-31
AU2013207927A1 (en) 2014-07-17
ES2677111T3 (es) 2018-07-30
HRP20180937T1 (hr) 2018-08-10
CA2860579A1 (en) 2013-07-18
IL233246B (en) 2018-07-31
WO2013106577A2 (en) 2013-07-18
LT2802606T (lt) 2018-10-10
MX2014008365A (es) 2014-10-06
NZ626620A (en) 2016-07-29
US20150210762A1 (en) 2015-07-30
WO2013106577A3 (en) 2013-11-21
JP6247226B2 (ja) 2017-12-13
KR20140112497A (ko) 2014-09-23
EP2802606B1 (en) 2018-04-25
CN104159922B (zh) 2018-03-02
CY1120419T1 (el) 2019-07-10
MX350378B (es) 2017-09-05
PT2802606T (pt) 2018-07-13
IL233246A0 (en) 2014-08-31
EP2802606A2 (en) 2014-11-19
EA201491346A1 (ru) 2014-11-28
US9676849B2 (en) 2017-06-13
HUE039033T2 (hu) 2018-12-28
BR112014016887A2 (pt) 2018-08-14
HK1203977A1 (en) 2015-11-06
PL2802606T3 (pl) 2018-09-28
AU2013207927B2 (en) 2017-11-02
KR102104686B1 (ko) 2020-04-24
DK2802606T3 (en) 2018-06-25
CN104159922A (zh) 2014-11-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TR201809743T4 (tr) Kan beyin bariyerinden terapötik moleküllerin taşınmasının arttırılması.
US11242388B2 (en) ROR1 antibody compositions and related methods
WO2021063336A1 (zh) 靶向cldn18.2的抗体及其制备方法和应用
US9409950B2 (en) Linker peptides and polypeptides comprising same
US10233252B2 (en) pH-dependent antibodies targeting the transferrin receptor and methods of use thereof to deliver a therapeutic agent
CN108136012B (zh) 靶向分子的抗原结合构建体
CN103998468B (zh) 抗原结合蛋白及其用作治疗癌症的定位产品的用途
JP7427046B2 (ja) Ｂｄｎｆを含む融合蛋白質
CN106559993B (zh) 胰岛素样生长因子1受体特异性抗体及其用途
JP2019502363A (ja) 抗ｒｏｒ１抗体
CN107849150B (zh) 含有bdnf的融合蛋白
JP2021073279A (ja) Ｉｇｆ−１ｒ抗体および癌処置のためのアドレッシングビヒクルとしてのその使用
KR20110127224A (ko) 개선된 항-혈청 알부민 결합 변이체
WO2021155635A1 (zh) 抗cd3和cd123双特异性抗体及其用途
JP2016027801A (ja) 改良された抗血清アルブミン結合変異体
KR20230034944A (ko) Abcb5에 특이적인 항체 및 그의 용도
CN114222586A (zh) 免疫检查点阻断性双特异性分子
RU2784586C2 (ru) Человеческие антитела, связывающиеся с ror2
EA040195B1 (ru) Усиление транспорта терапевтических молекул через гематоэнцефалический барьер
KR20240024061A (ko) 항-EGFRvIII 항체 약물 접합체 및 이의 용도
CN117460749A (zh) 抗EGFRvIII抗体药物缀合物及其用途