KR102355310B1 - 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체-특이적 항체 및 그의 용도 - Google Patents

인슐린-유사 성장 인자 1 수용체-특이적 항체 및 그의 용도 Download PDF

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메디 아르바비-가로우디
베르나르드 마씨
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Abstract

혈액-뇌 장벽 (BBB)은 혈액으로부터 뇌로의 500 돌턴을 초과하는 분자의 수송을 방해한다. 수용체-매개 세포질통과이동 (RMT)은 BBB를 형성하는 뇌 내피 세포상 수용체에 결합하는 특정 분자의 BBB를 횡단하는 수송을 촉진한다. RMT에 의해 BBB를 횡단이동하는 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체 (IGF1R)-결합 항체 또는 그의 단편이 식별되었다. 상기 항체 또는 단편은 BBB를 횡단하여 적재물 분자를 전달하는 데에 사용되는데, 여기서 적재물 분자는 치료제 또는 검출가능 작용제일 수 있다. 상기 항체는 933개-아미노산 IGF1R 폴리펩티드를 사용하여 라마를 면역화하는 것에 의해 제조된 낙타류 VHH이다. 낙타류 VHH의 인간화된 형태도 생성된다.

Description

인슐린-유사 성장 인자 1 수용체-특이적 항체 및 그의 용도{INSULIN-LIKE GROWTH FACTOR 1 RECEPTOR-SPECIFIC ANTIBODIES AND USES THEREOF}
본 발명은 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체-특이적 항체, 그의 단편 및 이들의 용도에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 혈액-뇌 장벽을 횡단이동하는 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체-특이적 항체 및 그의 단편, 그리고 이들의 용도에 관한 것이다.
알츠하이머병 및 파킨슨병과 같은 신경변성 질환들은 현대 노령 사회에서 점증하는 부담이 되고 있는데, 이러한 무력화 이상에 대한 효과적인 치료가 현재 존재하지 않기 때문이다. 뇌에서 기원하는 이들 및 기타 질환의 치료는 물론 조기 진단도 과제로 남아있는데, 적합한 치료용 분자 및 진단제들의 대부분이 견고하고 고도로 제한적인 혈액-뇌 장벽 (BBB)을 통과할 수 없기 때문이다 (문헌 [Abbott, 2013]). BBB는 혈관을 라이닝하며 견고한 연결을 통하여 서로 연결되어 있는 뇌 내피 세포 (BEC)에 의해 형성되는 물리적 방책을 구성한다 (문헌 [Abbott, 2013]). BEC들 사이에 형성되는 견고한 연결은 BBB의 완전성에 필수적이며, 500 돌턴 (Da)보다 더 큰 분자의 세포주위 수송을 방해한다. 뇌 내피 세포가 매우 낮은 음세포작용 속도를 나타내기 때문에 (문헌 [Abbott, 2013]), 더 큰 분자의 세포횡단(transcellular) 수송은 고도로 특이적인 수용체 매개 세포질통과이동(transcytosis) (RMT) 경로, 및 수동적인 전하-기반 흡착 매개 세포질통과이동으로 제한된다 (문헌 [Abbott, 2013]; [Pardridge, 2002]). 또한, P-당단백질 또는 다중-약물 내성 단백질-1 (MDR-1)과 같은 고밀도의 유출 펌프가 뇌로부터의 원치 않는 물질의 제거를 담당한다 (문헌 [Abbott, 2013]).
이러한 모든 특징들이 병원체 및 독소로부터 뇌를 보호하기는 하지만, 그것은 대부분 치료제들의 진입도 동일하게 방해한다. 그것이 특이적으로 '운반', 즉 수송체 분자와 커플링되지 않는 한, 사실상 소형 분자 치료제 중 5 % 미만이 약학적으로 적절한 (즉 중추 신경계 (CNS) 표적에 관여하여 약학적/치료적 반응을 도출하기에 충분하게) 농도로 BBB를 횡단할 수 있으며, 더 큰 치료제는 사실상 횡단할 수 없다. BBB를 횡단하여 분자를 수송하기 위한 효과적인 '운반체'의 결핍으로 인하여, 신경변성 질환에 대한 수많은 약물들이 더 이상의 개발로부터 '사장'되거나 배제되었는데, 그것이 충분한 양으로 뇌에 전달될 수 없었기 때문이다.
더 큰 분자를 뇌로 전달하기 위한 다른 접근법들이 탐색되어 왔다. 예를 들면, BBB의 완전성이 붕괴됨으로써 누출성의 BBB를 생성시키고, 그것은 다시 더 큰 분자의 뇌로의 제한적이지 않은 세포주위 진입을 가능케 할 수 있다. 견고한 연결은 다양한 접근법에 의해 성공적으로 느슨해지거나 붕괴될 수 있다. 예를 들면, 혈류에의 삼투 충격을 유도하는 물질 (예를 들면 만니톨, 고장성 용액)의 주입은 세포 수축을 야기하고 견고한 연결의 붕괴를 초래함으로써, BBB를 심각하게 훼손한다 (문헌 [Guillaume, 2010]). 견고한 연결의 다른 조절인자에는 알킬글리세롤, 브라디키닌 및 이들의 몇 가지 유사체는 물론, 견고한 연결을 유지하는 데에 연관되어 있는 단백질의 발현을 조절하는 바이러스가 포함된다 (문헌 [Erdlenbruch et al., 2003]; [Preston et al., 2008]; [Gan et al., 2013]). BBB의 더 국소적인 붕괴는 초음파의 적용을 통하여 가능하다 (문헌 [Nhan et al., 2013]). 그러나, BBB가 붕괴되는 동안의 기간은 뇌 항상성을 변경하고, 유해 화학물질, 독소 및 병원체가 뇌에 진입하는 것을 가능케 하기에 충분한데; 이는 심각한 부작용, 예컨대 발작 및 뇌 팽창, 감염 및 어쩌면 영구적인 신경병리학적 변화를 초래할 수 있다. 통상의 기술자라면 알고 있을 바와 같이, 다수의 뇌 영역에 영향을 주는 만성 및 확산성 뇌 질환에 대한 이러한 기술들을 사용한 반복 치료는 실용적이지 않다. 이러한 치료들 대부분은 비용이 들며, 입원을 필요로 하고, 일부 접근법은 마취를 필요로 한다.
BBB를 우회하는 또 다른 접근법은 뇌척수액 (CSF), 실질 공간 또는 기타 뇌 부분에의 치료용 분자의 직접적인 주사이다. 하기를 포함하여, 몇 가지 전달 방법들이 개발되어 있다: 주입 또는 운반-강화 확산(convection-enhanced diffusion) (CED) 펌프를 통한 뇌내 (실질-내), 뇌실내 및 수막강내 전달. 그러나, 뇌 또는 뇌내 이식물에의 어떠한 유형의 직접적인 주사도 침습성이며 비용이 드는 절차가 되는데, 그것이 입원, 마취, 그리고 종종 수술을 필요로 하기 때문이다. 또한, 뇌 실질 내에서의 치료제, 특히 대형 생물제제의 저조한 확산 속도는 주사/이식 부위 주변의 작은 영역으로만 치료제의 침투를 제한한다. 주사, 카테터 및 이식물의 올바른 위치지정은 까다로우면서도 뇌의 표적 영역으로의 약물의 확산을 달성하는 데에는 중요하다. 또한, 카테터 및 이식물은 감염 및/또는 외래 물질에 대한 면역 반응의 부위를 제공한다.
BBB를 횡단하는 전달을 증가시키기 위한 또 다른 시도에서는, CNS 약물이 그의 뇌 흡수가 증가되도록 변형된 바 있다. 그와 같은 변형에는 그의 표면 전하의 변화, 분자 크기의 감소, 및 약물 친지질성의 변화가 포함될 수 있다. 그러나, 뇌 침투를 증가시키기 위한 모든 변형은 원하는 그의 활성 및/또는 특이성을 포함한 약물의 전체적인 약학도 마찬가지로 변경시킨다. 또한, 친지질성 분자는 P-당단백질 유출 펌프를 통하여 뇌로부터 외수송되기가 더 쉽다.
마지막으로, BBB를 횡단하는 내인성 수송 기작이 활용된 바 있다. BBB를 횡단하는 대형 분자의 수송을 가능케 하는 생리학적 기작은 고도 특이성 수용체 매개 세포질통과이동 (RMT) 및 비-특이적 전하-기반 흡착 매개 세포내이입 경로로 나누어질 수 있다. 세포내이입은 각각 해당 수용체에 대한 특정 리간드의 결합시, 또는 양이온성 리간드 또는 약물과 뇌 내피 세포 표면상 (내강 측) 음이온성 관능기 사이의 정전기적 상호작용시 촉발된다. 이어서, 새롭게 형성되는 엔도좀이 세포를 횡단하여 내강외 측으로 세포질통과이동됨으로써 그의 적재물을 방출한다.
흡착 매개 세포질통과이동은 비-특이적인 전하-매개 상호작용이기 때문에, 모든 혈관 상 및 기관에서 그것이 발생함으로써, 뇌 전달에 있어서의 약물의 가용성을 제한한다. 따라서, RMT 경로를 활용하는 것이 고도로 수용체-특이적인 뇌 전달 방법이면서도 유일하게 생리학적이고 비-침습성인 것으로 남게 된다.
현재 하기 몇 가지 수용체만이 BBB에서 RMT에 적용되어 그의 자연상 리간드를 횡단 '운반'하는 것으로 알려져 있다: 충분히 연구되어 있는 트랜스페린 수용체 (TfR), 인슐린 수용체 (IR), 저-밀도 지질단백질 수용체 관련 단백질 1 및 2 (LRP-1 및 -2), 디프테리아 독소 수용체 및 TMEM30A. 이러한 수용체들에 결합하여 (문헌 [Pardridge et al., 1991]; [Yu et al., 2011]; [Muruganandam et al., 2001]; [Abulrob et al., 2005]; [Demeule, 2008]; [Sumbria et al., 2013]), 내인성 RMT 경로를 이용하는 약물-대-뇌 수송체로 기능하는 펩티드, 천연 리간드, 및 항체 또는 항체 단편들이 개발되어 있다. 그러나, 오늘날까지, 하나의 펩티드 (안지오펩(Angiopep) ANG1005, LRP-1을 표적으로 함)만이 단계 I 임상 연구에서 분석되어 있으며, 반면 다른 후보들은 실험실 환경에서 연구 중에 있다. RMT 경로가 뇌에의 약물 수송을 위한 가장 유망한 경로인 것으로 보이기는 하지만, 현재의 접근법들은 하기를 포함한 한계들을 가지고 있다: BBB에서의 표적 수용체의 비-선택성인 발현, 수용체에 대한 운반체와 자연상 리간드 사이의 경쟁, 수용체의 비효과적인 세포질통과이동은 물론, 세포내이입된 운반체의 리소좀 분해 (문헌 [Xiao and Gun, 2013]).
고-용량 및 고도-특이성인 BBB 운반체의 결핍은 뇌 종양 및 신경변성 질환을 포함한 뇌에서 기원하는 질환들을 위한 새로운 치료제 및 진단제의 개발을 지연시키고 있다. BBB의 생리학 및 항상성을 붕괴시키지 않으면서, 뇌에 약학적으로 효능있는 투여량으로 소형 및 대형 치료제 및 진단제 분자를 전달하기 위한 비-침습성인 방법에 대한 필요성이 분명하게 존재한다.
[발명의 개요]
본 발명은 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체 (IGF1R)-특이적 항체 및 그의 용도에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 혈액-뇌 장벽을 횡단이동하는 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체-특이적 항체 및 그의 단편, 그리고 이들의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체 (IGF1R) 항원결정인자에 특이적으로 결합하는 단리 또는 정제된 항체, 또는 그의 단편을 제공하는 바, 여기서 상기 항체 또는 그의 단편은 혈액-뇌 장벽을 횡단이동하며, 상기 항원결정인자는 서열식별번호(SEQ ID NO): 5의 항체에 의해 특이적으로 결합된다. 상기 IGF1R 항원결정인자는 IGF1R의 세포외 도메인에 존재할 수 있다.
본 발명은 또한 하기를 포함하는 단리 또는 정제된 항체, 또는 그의 단편을 제공하는 바, 상기 항체 또는 그의 단편은 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체 (IGF1R)에 특이적으로 결합한다:
상보성 결정 영역 (CDR) 1 서열
Figure 112016095163814-pct00001
(서열식별번호: 1);
CDR2 서열
Figure 112016095163814-pct00002
(서열식별번호: 2); 및
CDR3 서열
Figure 112016095163814-pct00003
(서열식별번호: 3).
예를 들면, 어떠한 방식으로도 제한하고자 하는 것은 아니나, IGF1R에 대하여 특이적인 상기 단리 또는 정제된 항체, 또는 그의 단편은 하기 또는 그와 실질적으로 동일한 서열일 수 있다:
Figure 112016095163814-pct00004
(여기서 X1은 E 또는 Q이며; X2는 K 또는 Q이고; X3는 V 또는 E이며; X4는 A 또는 P이고; X5는 A 또는 E이며; X6는 V 또는 A이고; X7은 V 또는 F이며; X8은 G 또는 E이고; X9은 L 또는 R이며; X10은 F 또는 W이고; X11은 G 또는 S이며; X12는 V 또는 Y이고; X13은 D 또는 G이며; X14는 N 또는 S이고; X15는 A 또는 S이며; X16은 L 또는 V이고; X17은 K 또는 R이며; X18은 A 또는 S이고; X19는 L 또는 Q임). 더 구체적인 비-제한적 예에서, 단리 또는 정제된 항체는 하기로 구성되는 군에서 선택되는 서열:
Figure 112016095163814-pct00005
Figure 112016095163814-pct00006
Figure 112016095163814-pct00007
Figure 112016095163814-pct00008
Figure 112016095163814-pct00009
또는 그와 실질적으로 동일한 서열을 포함할 수 있다.
상기한 바와 같은 단리 또는 정제된 항체, 또는 그의 단편은 단일-도메인 항체 (sdAb)일 수 있으며; 상기 sdAb는 낙타류(camelid) 기원의 것일 수 있다.
본 발명의 단리 또는 정제된 항체, 또는 그의 단편은 다가 구현 체재(multivalent display format)로 제공될 수 있다. 다가 구현 체제에서, 항체 또는 그의 단편은 Fc 단편에 연결될 수 있는데; 상기 Fc 단편은 마우스 Fc2b 또는 인간 Fc1이다. 예를 들면, 어떠한 방식으로도 제한하고자 하는 것은 아니나, 다가 구현의 단리 또는 정제된 항체, 또는 그의 단편은 서열식별번호: 10 (본원에서는 IGF1R-4 공통-Fc 융합체로 지칭됨), 서열식별번호: 39 (본원에서는 Fc-IGF1R-4 공통 융합체로 지칭됨) 또는 11 (본원에서는 IGF1R-4-Fc 융합체로 지칭됨)의 서열을 포함할 수 있다.
본원에서 기술되는 바와 같은 단리 또는 정제된 항체, 또는 그의 단편은 혈액-뇌 장벽을 횡단이동할 수 있다.
본 발명은 또한 본원에서 기술되는 바와 같은 단리 또는 정제된 항체, 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 상기한 바와 같은 핵산 분자를 포함하는 벡터 역시 제공된다.
본원에서 기술되는 바와 같은 단리 또는 정제된 항체, 또는 그의 단편은 표면상에 고정될 수 있다.
본 발명은 또한 적재물 분자에 연결된 본원에서 기술되는 바와 같은 단리 또는 정제된 항체, 또는 그의 단편을 제공하는 바; 상기 적재물 분자는 약 1 kD 내지 약 200 kDa 범위의 분자량을 가질 수 있다. 항체 또는 그의 단편에 연결되는 적재물 분자는 검출가능 작용제, 치료제, 약물, 펩티드, 성장 인자, 시토카인, 수용체 트랩(trap), 화합물, 탄수화물 잔기, 효소, 항체 또는 그의 단편, DNA-기반 분자, 바이러스 벡터 또는 세포독성 작용제; 검출가능 작용제, 치료제, 약물, 펩티드, 효소, 항체 또는 그의 단편, DNA-기반 분자, 바이러스 벡터 또는 세포독성 작용제가 적재된 1종 이상의 리포좀 또는 나노운반체; 또는 1종 이상의 나노입자, 나노와이어, 나노튜브 또는 양자점(quantum dot)일 수 있다.
또한, 본 발명은 1종 이상의 본원에서 기술되는 바와 같은 단리 또는 정제된 항체, 또는 그의 단편, 및 제약상-허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 조성물을 제공한다.
IGF1R의 시험관내 검출 방법도 제공되는 바, 상기 방법은 하기를 포함한다:
a) 조직 샘플을 검출가능 작용제에 연결된 1종 이상의 본원에서 기술되는 바와 같은 단리 또는 정제된 항체, 또는 그의 단편과 접촉시키는 단계; 및
b) 조직 샘플 중 IGF1R에 결합된 항체 또는 그의 단편에 연결된 검출가능 작용제를 검출하는 단계.
상기한 방법에서, 샘플은 인간 또는 동물 대상체로부터의 혈청 샘플, 혈관 조직 샘플, 종양 조직 샘플 또는 뇌 조직 샘플일 수 있다. 기술되어 있는 바와 같은 방법에서, 검출 단계 (단계 b))는 광학적 영상화, 면역조직화학, 분자 진단 영상화, ELISA, 영상화 질량 분광측정법 또는 기타 적합한 방법을 사용하여 수행될 수 있다.
추가적으로 제공되는 것은 대상체에서의 IGF1R 발현의 생체내 검출 방법으로써, 상기 방법은 하기를 포함한다:
a) 검출가능 작용제에 연결된 1종 이상의 본원에서 기술되는 바와 같은 단리 또는 정제된 항체, 또는 그의 단편을 대상체에게 투여하는 단계; 및
b) IGF1R에 결합된 항체 또는 그의 단편에 연결된 검출가능 작용제를 검출하는 단계.
상기한 방법에서, 검출 단계 (단계 b))는 PET (양전자 방출 단층촬영), SPECT (단일-광자 방출 컴퓨터 단층촬영), 형광 영상화 또는 임의의 기타 적합한 방법을 사용하여 수행될 수 있다.
이어서 제공되는 것은 1종 이상의 항체 또는 그의 단편이 BBB를 횡단하여 해당 분자를 운반하는, 혈액-뇌 장벽 (BBB)을 횡단하는 해당 분자의 수송 방법으로써, 상기 방법은 하기를 포함한다:
a) 해당 분자에 연결된 1종 이상의 본원에서 기술되는 바와 같은 단리 또는 정제된 항체, 또는 그의 단편을 대상체에게 투여하는 단계로써, 상기 항체 또는 그의 단편이 혈액-뇌 장벽을 횡단이동하는 단계.
상기한 바와 같은 방법에서, 해당 분자는 약 1 kDa 내지 약 200 kDa 범위의 분자량을 가질 수 있으며; 해당 분자는 검출가능 작용제, 치료제, 약물, 펩티드, 성장 인자, 시토카인, 수용체 트랩, 화합물, 탄수화물 잔기, 효소, 항체 또는 그의 단편, DNA-기반 분자, 바이러스 벡터 또는 세포독성 작용제; 검출가능 작용제, 치료제, 약물, 펩티드, 효소, 항체 또는 그의 단편 또는 세포독성 작용제가 적재된 1종 이상의 리포좀 또는 나노운반체; 또는 1종 이상의 나노입자, 나노와이어, 나노튜브 또는 양자점일 수 있다. 상기한 바와 같은 방법에서, 투여는 정맥내 (iv), 피하 (sc) 또는 근육내 (im)의 것일 수 있다.
본 발명은 또한 적재물 분자가 1종 이상의 본원에서 기술되는 바와 같은 단리 또는 정제된 항체, 또는 그의 단편에 연결되는, 대상체의 BBB를 횡단하여 전달되는 적재물 분자 양의 정량 방법을 포괄하는 바, 상기 방법은 하기를 포함한다:
a) 대상체로부터 뇌척수액 (CSF)을 수집하는 단계; 및
b) 표적화된 단백질체학적 방법(targeted proteomics method)을 사용하여, CSF 중 1종 이상의 단리 또는 정제된 항체, 또는 단편에 연결된 적재물 분자의 양을 정량하는 단계.
상기 적재물 분자는 이전에 기술된 적재물 분자들을 포함한 임의의 원하는 분자일 수 있으며; 상기 항체 또는 그의 단편은 BBB를 횡단이동하고; 상기 분자는 이전에 기술된 바와 같이 항체 또는 그의 단편에 "연결"될 수 있다. 상기 방법에서, CSF는 관련 기술분야에 알려져 있는 임의의 적합한 방법을 사용하여 대상체로부터 수집된다. 단계 b)의 표적화된 단백질체학적 방법에 필요한 CSF의 양은 약 1 내지 10 μl 사이일 수 있다. 적재물 분자에 연결된 1종 이상 항체 또는 그의 단편의 양을 정량하는 데에 사용되는 표적화된 단백질체학적 방법은 관련 기술분야에 알려져 있는 임의의 적합한 방법일 수 있다. 예를 들면, 제한하고자 하는 것은 아니나, 표적화된 단백질체학적 방법은 질량 분광측정법, 예컨대 다중 반응 모니터링 - 동형 표지 내부 표준 (MRM-ILIS)일 수 있다.
견고하며 고도로 선택성인 BBB를 횡단하는 진단제 또는 약물의 저조한 전달은 비제한적으로 뇌 종양 및 신경변성 질환과 같은 뇌 질환을 위한 치료의 개발을 어렵게 한다. BBB를 횡단하여 분자를 수송하는 운반체의 결핍은 해당 질환을 위한 새로운 치료제 및 진단제의 개발을 지연시킨다. 본원에서 기술되는 바와 같이, 뇌의 해당 표적으로의 BBB를 횡단하는 항체에 접합된 약물의 전달을 위한 효과적인 수송 플랫폼을 제공하는 IGF1R-결합 VHH가 제조되었다. 본원에서 기술되는 항체는 BBB-형성 뇌 내피 세포의 내강 측으로부터 내강외 측으로의 IGF1R의 자연상 RMT 경로를 활용한다. IGF1R에의 항체의 결합 후, RMT가 개시되며, 접합된 분자 (적재물)와 함께, 항체가 세포를 통하여 내강외 측으로 세포질통과이동되고, 거기에서 모두 뇌 미세환경으로 방출된다. 상기 항-IGF1R VHH는 IGF1R에 결합한 후 (도 3c), BBB 세포로 내재화되어 (도 4), 시험관내 BBB 모델의 내강외 측으로 횡단한다는 (도 6b) 것이 확인되었다. 생체내 약물-대-뇌 전달 연구 역시 IGF1R VHH가 접합된 펩티드 (갈라닌; 약 3 kDa)는 물론, 대형 단백질 융합체 (약 80 kDa)도 BBB를 횡단하여 '운반'한다는 것을 보여주었다 (도 9a 및 b; 도 9c).
결과는 항-IGF1R VHH가 Fc (결정화가능한 단편) 단편과의 융합체로 발현됨으로써 약 75배까지 순환 반감기를 연장할 수 있다는 것도 보여준다 (VHH 단독의 약 20분에 비해 약 25시간). 이와 같은 고분자량 융합 구축물 (약 80 kDa) 역시 BBB를 횡단하여 효율적으로 수송된다. 긴 혈장 반감기는 IGF1R VHH-mFc (mFc = 마우스 Fc)접합체의 CSF 노출을 VHH 단독에 비해 상당히 증가시키기 때문에, CNS에 표적이 있는 만성 질환의 치료를 위한 BBB 전달 운반체로서 유용하다. 상기 접합체는 면역형광 검출을 사용하여 뇌 실질에서 용이하게 검출된다. 상기 결과는 IGF1R VHH 운반체가 BBB를 횡단하여 대형 분자 (하기와 크기가 유사한 것: 항체, 효소, 성장 인자, 펩티드, 시토카인, 수용체 트랩)를 "운반"할 수 있다는 것을 입증하고 있다.
이에 따라, 상기 항체-전달은 단기 치료 (예컨대 간질 발작)에 유용할 수 있을 뿐만 아니라, 중기 (예컨대 암) 및 장기 (예컨대 알츠하이머병 또는 파킨슨병) 치료에도 유용할 수 있다.
본 발명의 추가적인 측면 및 장점들은 하기의 상세한 설명에서 드러나게 될 것이다. 본 발명의 바람직한 실시양태를 나타내는 것이기는 하지만, 상세한 설명 및 실시예는 단지 예시로 제공되는 것으로써, 본 발명의 교시에 비추어, 본 발명의 영역 내인 다양한 변화 및 변형들이 통상의 기술자에게 드러나게 될 것이기 때문이다.
본 발명의 이들 및 기타 특징들은 지금부터 첨부된 도면을 참조하여 예로써 기술될 것인 바, 하기이다:
도 1은 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체 (IGF1R)의 개략도이다. IGF1R은 세포 표면에서 발견되며, 알파 서브유닛 및 베타 서브유닛의 2개 서브유닛을 포함한다. 알파 서브유닛 (인슐린-유사 성장 인자 1 결합 부위를 포함하는 세포외 부분을 포함함)은 디술피드 결합에 의해 베타 서브유닛 (소형 세포외 도메인, 막횡단 영역 및 세포내 부분을 포함함)에 연결된다. IGF1 수용체는 이량체를 형성할 수 있다. 회색 박스 내로 표시된 바와 같이 알파 서브유닛, 및 베타 서브유닛의 세포외 부분을 포함하는 933개 아미노산 길이 단편 (M1-F933, 스위스프롯 등재 번호 P08069; 도 2 참조)을 재조합으로 제조하고, 라마의 면역화에 사용하였다.
도 2는 IGF1R (스위스프롯 등재 번호 P08069)의 서열을 나타낸다. 면역화 및 패닝에 사용되는 933개 아미노산 길이 단백질 단편을 굵게 나타내었는데; 전체 엑토도메인은 2개 아미노산 더 길다. 알파 서브유닛과 베타 서브유닛을 분리하는 퓨린(furin) 절단 부위은 이탤릭체 소문자로 나타내었다. 신호 펩티드는 굵은 이탤릭체로 나타내었다.
도 3a는 수퍼덱스 75 컬럼을 통하여 전개된 IGF1R-결합 VHH IGF1R-4 및 그의 인간화된 변이들 (H1, H2, H3, H4, H5, H6)의 크기 배제 크로마토그램을 나타낸다. 프로파일은 IGF1R H1을 제외한 모든 VHH가 단량체성이며, 비-응집성이라는 것을 암시한다. 도 3b는 IGF1R-4 VHH 및 그의 인간화된 변이들 (H2, H3, H4, H5, H6)에 대하여 원형이색성 (CD)에 의해 측정한 융점 (Tm)을 나타낸다. 단백질을 90 ℃ 초과로 가열하고, CD 기기에서 측정을 수행함으로써, 용융 곡선 (상부 곡선) 및 Tm을 측정하였다. 이어서, 단백질을 실온으로 냉각하고, 한번 더 가열한 후, CD에 의해 분석하였다 (IGF1R-4 VHH의 저부 곡선; 인간화된 변이의 경우 재접힘 0 % 부근의 선 또는 점). 이는 재접힘된 단백질의 분율 측정을 가능케 하였는데, 인간화된 버전에 대해서는 그것이 0이었으며, IGF1R-4의 경우 80 %이었다. 도 3c는 인간 IGF1R 단편의 재조합 세포외 부분에 대한 0.1-5 nM IGF1R-4 VHH 및 그의 인간화된 변이들 (H2, H3, H4, H5, H6)의 결합의 표면 플라스몬 공명 (SPR) 센소그램 중첩도(overlay)를 나타낸다. 데이터는 1:1 모델과 잘 맞는다. 도 3d는 IGF1 존재하에서의 인간 IGF1R 단편의 재조합 세포외 부분에 대한 IGF1R-4 VHH 결합의 SPR 센소그램을 나타낸다. 100-배 과량인 IGF1이 IGF1R-4 VHH 결합에 영향을 주지 않음으로써, 양자가 수용체상의 서로 다른 항원결정인자에 결합한다는 것을 보여주었다. 도 3e는 IGF1R-4 VHH가 SPR 표면상에 고정된 인간 인슐린 수용체 (IR)의 재조합 세포외 부분에 결합하지 않는 반면, 인간 IGF1R의 대조 표면에는 결합한다는 것을 보여주었다.
도 4는 Cy-5.5-표지된 IGF1R-4 VHH 및 대조 VHH의 세포 흡수 영상화 결과를 나타낸다. Cy5.5-표지된 IGF1R-4 VHH (또는 양성 대조로서의 FC5 VHH; 문헌 [Muruganandam et al., 2002]; [Haqqani et al., 2012])를 4 ℃ (상부 패널) 또는 37 ℃ (저부 패널)에서 SV40 무한증식 래트 뇌 내피 세포 (svARBEC)과 함께 인큐베이팅함으로써, IGF1R-4가 수동으로 (4 ℃) 또는 능동 기작 (37 ℃), 예컨대 수용체 매개 세포내이입을 통하여 내재화되는지를 평가하였다. 맥아 아글루티닌 및 DAPI와의 공동-염색을 수행함으로써, 각각 세포 표면 및 핵을 가시화하였다. 상부 패널: 4 ℃에서 인큐베이팅되는 경우, IGF1R-4 및 FC5 VHH는 세포 외부 (화살표 헤드)에서 세포 막에 결합된 채로 발견되었다 (맥아 아글루티닌과 공동-위치지정됨). 저부 패널: 37 ℃에서, FC5 및 IGF1R-4 VHH 양자는 세포 내부의 엔도좀과 같은 소포-유사 구조 (화살표 헤드)에 축적됨으로써, 능동 수송 기작을 통한 내재화를 암시하였다.
도 5a는 뮤린 Fc 단편과의 IGF1R-4 VHH의 C-말단 융합체 (IGF1R-4-mFc)의 서열을 나타낸다. 조립된 융합 단백질의 개략적 표시를 도 5b에 나타내었다. 도 5a 및 b에서, IGF1R-4 VHH는 흑색으로 나타내었으며, 뮤린 Fc (CH2 및 CH3)는 회색으로 나타내었다.
도 6a는 BBB를 횡단하는 다양한 VHH들의 능력을 평가하기 위한 시험관내 BBB 모델의 사용을 요약하는 흐름도이다. 등몰량 (5.6 μM 또는 1.25 μM)의 양성 (FC5) 및 음성 대조 (클로스트리듐 디피실레 (Clostridium difficile ) 독소 A-결합 VHH인 A20.1; 및 EGFR 결합 VHH인 EG2) VHH 및 IGF1R-4를 동시에 래트 시험관내 BBB 모델을 횡단하는 그의 능력에 대하여 시험하였다. 성체 래트로부터의 SV40-무한증식 뇌 내피 세포 (svARBEC)를 저부 챔버에서는 래트 별아교세포-컨디셔닝된 배지의 존재하에, 그리고 상부 챔버에서는 표준 배지의 존재하에 삽입물의 막상에서 단층으로 성장시켰다. BBB 모델 내강 측에의 등몰량의 다양한 VHH의 공동-첨가 후, 15, 30 및 60분 후에 저부 챔버로부터 샘플을 취하였다. 다음에, 질량 분광측정법 (다중 반응 모니터링 - 동형 표지 내부 표준; MRM-ILIS)에 의해 이들 샘플에서 각 VHH의 농도를 정량하였다. BBB를 횡단하는 분자의 능력을 측정하는 데에는, 보통 Papp 값 [Qr/dt = 수용기 구획에서의 누적 양 대 시간; A = 세포 단층의 면적; C0 = 투여 용액의 개시 농도]이 사용된다. 도 6b는 4종의 공동-투여된 VHH의 Papp 값들을 나타낸다. IGF1R-4는 FC5에 비해 상당히 더 높은 Papp 값을 가지는 반면, 양 음성 대조들은 낮은 Papp 값을 가짐으로써, 대조 VHH의 낮은 비-특이적 수송 또는 세포주위 수송에 비교하여 FC5 및 IGF1R-4 VHH의 촉진된 수송을 표시하였다. 도 6c는 동일한 웰에서 대조로서 시험된 (평균 A20.1 값은 회색 점선으로 표시하였음) A20.1 VHH (회색 막대)와 비교한 인간화된 IGF1R-4 단일-도메인 항체 (H2, H3, H4, H5, H6) (흑색 막대)의 Papp 값을 나타낸다. 결과는 IGF1R에 결합하는 것 (인간화 6 변이 (H6)에서 나타난 것과 같음)만으로는 BBB의 횡단이동을 촉발하기에 충분하지 않다는 것을 분명하게 표시하고 있다. 도 6d는 동일한 웰에서 시험되었으며 매우 낮은 Papp 값을 가지는 A20.1-마우스 Fc (A20.1mFc) (회색)와 비교한 마우스 Fc에 대한 IGF1R-4 VHH의 C-말단 융합 (흑색)의 Papp 값을 보여준다. IGF1R-4-mFc는 FC5-mFc (회색 점선에 의해 표시되는 바와 같이 통상적으로 180 cm/분 가량)에 비해 상당히 더 높은 Papp 값을 가진다. 또 다른 IGF1R-결합 VHH로써 Fc와 융합 상태인 IGF1R-1은 내부 음성 대조인 A20.1 VHH에 비해 약간만 더 높은 Papp 값을 가진다. 이와 같은 결과 역시 모든 IGF1R-결합 항체가 BBB를 횡단이동하는 것은 아님을 입증하고 있다. 데이터는 또한 IGF1R-4-mFc가 1가 IGF1R-4 VHH와 비교하였을 때 유사하게 높은 BBB 횡단 수송 속도를 가진다는 것을 보여준다. 결과는 3-6회 개별 실험에서 수득된 평균 Papp 값이다. FC5 (VHH) 및 A20.1 (VHH)의 평균 Papp 값도 비교를 위하여 점선으로 표시하였다.
도 7 (상부 패널)은 PBS (미접촉), 또는 2.5 mg/kg의 Cy5.5-IGF1R-4 VHH 또는 Cy5.5-A20.1 VHH 중 어느 하나가 정맥내로 주사되고 (주사된 분자의 개략도를 상부에 나타내었음), 주사 30분 후에 엑스플로어 옵틱스(eXplore Optix) 시간-도메인 광학 영상화기에서 스캐닝된 CD-1 마우스의 생체내 전체 신체 영상을 나타낸다. 저부 패널은 VHH 주사 1시간 후 및 순환으로부터 항체를 제거하기 위한 경심 관류 후 수득된 동일 동물의 신체외 뇌 영상을 나타낸다. 화살표는 Cy5.5-IGF1R-4가 주사된 동물의 두부 및 뇌 생체외에서의 형광 추적자의 높은 광학 신호 (밝은 회색)을 나타내는 반면, Cy5.5-A20.1 대조가 주사된 동물에서는 그것이 검출될 수 없었다 (흑색).
도 8a는 IGF1R-4 VHH-갈라닌 접합체의 화학적 합성의 개략도를 나타낸다. 먼저, IGF1R-4를 술포-SMCC 가교-링커의 NHS 기에 접합시키고 (1); 다음에, 말레이미드-활성화된 IGF1R-4-술포-SMCC를 갈라닌의 환원된 시스테인에 접합시켰다 (2). 도 8b는 IGF1R-4 (레인 2), IGF1R-4-SMCC (레인 3) 및 IGF1R-4-갈라닌 접합체 (레인 4)의 SDS-PAGE 겔을 나타낸다. '밴드화' 패턴은 IGF1R-4 당 1-2개 갈라닌 분자의 결합을 표시한다. 갈라닌을 IGF1R-mFc와 연결하는 데에도 동일한 접합 방법을 사용하였다.
도 9는 화학적으로 접합된 펩티드 갈라닌의 IGF1R-4-매개 뇌 전달을 나타낸다. 도 9a는 하그리브스 통증 모델을 사용하여 뇌에 약학적으로 효능 있는 투여량의 진통 펩티드 갈라닌 (3.2 kD)을 전달하는 IGF1R-4의 능력을 보여주는 그래프이다. 이와 같은 모델에서는, 좌측 발바닥 표면에 100 μl의 적격 프로인트 아주반트 (CFA)를 주사하여 수시간 이내에 국소적 염증을 야기하는 것에 의해, 국소화된 만성 통증이 수컷 위스타 래트 (4-6주령)에서 유도된다. BBB 운반체 VHH-약물 접합체 또는 갈라닌 단독의 꼬리 정맥 주사 후, 유리 표면상에 세워진 플렉시글라스 울타리에 래트를 위치시킨다. 각진 거울을 통하여 열적 자극을 염증화된 발 또는 반대측 발에 집중한다. 자극 적용과 발 철회 (발을 핥거나 때리기) 사이의 잠복기가 진통 효과 (열적 통각과민의 억제)의 척도로 해석된다. 1 mg/kg 갈라닌 (채워진 흑색 삼각형)의 전신 (꼬리-정맥) 주사 후 진통 효과의 결핍에 의해 입증되는 바와 같이, 펩티드 갈라닌 단독은 BBB를 통과할 수 없다. IGF1R-4-갈라닌 접합체 (3 mg/kg)의 전신 주사는 열적 통각과민을 억제하는데, 투여 30분 후에 최대 반전에 도달함으로써 (채워진 흑색 원); FC5-갈라닌 접합체 6 mg/kg (백색 빈 사각형)에서 관찰된 것에 비해 효과가 더 현저하였다. 도 9b는 최대 가능 효과 (MPE; 대조 발)에 비교한 반응의 곡선하 면적 (AUC)으로 이러한 결과를 보여준다. 도 9c는 iv 투여된 IGF1R-4-mFc-갈라닌 접합체에 의한 하그리브스(Hargreaves) 염증성 통증 모델에서의 열적 통각과민의 투여량-의존성 (2 mg/kg 및 5 mg/kg) 억제를 보여준다. 반면, A20.1-mFc-갈라닌 (5 mg/kg)은 열적 통각과민의 어떠한 반전도 유도하지 않았다. 도 9d는 다양한 투여량의 A20.1-mFc-갈라닌 및 IGF1R-4-mFc-갈라닌을 사용하여 달성되는 최대 반응에서의 열적 통각과민의 % 반전 (Emax)을 나타낸다.
도 10은 각 항체 6 mg/kg의 전신 (꼬리 정맥) 공동-투여 30분 후 IGF1R-4, 및 '양성' 대조 VHH인 FC5 및 '음성' 대조 VHH인 A20.1의 혈장 및 CSF 수준을 나타낸다. CSF는 대수조(cisterna magna)로부터 수집하였다. 특정 단백질 펩티드 시그니처를 '추적'하여 정량하는 MRM-ILIS 방법을 사용하여, IGF1R-4, FC5 및 A20.1의 혈장 및 CSF 수준을 측정하였다. 동시에, CSF 중 알부민 수준도 MRM에 의해 측정하였다. 1500 미만인 혈장/CSF 비를 가지는 모든 CSF 샘플은 잠재적으로 혈액-오염된 것으로 배제하였다. FC5의 0.9 % 및 A20.1의 0.017 %에 비해, IGF1R-4의 CSF/혈청 비는 1.2 %이었다.
도 11은 6 mg/kg 투여량의 꼬리-정맥 투여 24시간 후 뇌 절편에서의 IGF1R-4mFc의 면역-검출을 나타낸다. 래트에서 PBS를 사용한 희생 관류를 수행하고, 진동절편기를 사용하여 뇌 절편 (12 ㎛)을 수득하였다. 항-마우스 Fc 항체 (적색; 삽입물에서만 보이는 적색 채널)를 사용하여, IGF1R-4mFc를 면역-검출하였다. 렉틴 RCA1 (녹색)을 사용하여, 뇌 절편의 혈관 (치아 이랑, A; 전두 피질, B)을 검출하였다. 화살표 헤드에 의해 표시되는 바와 같이, IGF1R-4mFc는 혈관 및 혈관 외부 (즉 뇌 실질, BBB를 횡단하여 횡단이동된 것) 모두에서 검출될 수 있었다.
도 12는 IGF1R-4가 인슐린 수용체 또는 IGF1R 중 어느 하나를 통한 인슐린 또는 IGF-1 신호전달을 방해하지 않는다는 것을 보여준다. 도 12a는 IGF1R-4는 물론, 시험된 다른 항-IGF1R VHH (IGF1R-1, -3, -5 또는 -6) 중 어느 것도 100 nM의 농도에서 단독으로 하류 Akt 인산화를 유도하지는 않는다는 것을 보여주는 대표적인 웨스턴 블럿이다. 100 nM의 IGF1R-4는 물론, 다른 항-IGF1R VHH 중 어느 것의 존재도 인슐린 10 ㎍/ml에 의해 유도되었을 때의 Akt 인산화를 억제하지 않는다. 3회 개별 실험으로부터의 웨스턴 블럿 밴드 밀도의 정량을 겔 영상 아래에 막대 그래프 (평균 +/- SD)로 나타내었다. 도 12b는 IGF1R-4는 물론, 시험된 다른 항-IGF1R VHH (IGF1R -3, -5 또는 -6) 중 어느 것도 100 nM에서 그 자체로는 Akt의 인산화를 유도하지 않으며, IGF-1 200 ng/ml를 사용한 자극시 유도되는 IGF-1 유도 Akt 인산화 (즉 신호전달)를 억제하지도 않는다는 것을 보여주는 대표적인 웨스턴 블럿이다. 3회 개별 실험으로부터의 웨스턴 블럿 밴드 밀도의 정량을 겔 영상 아래에 막대 그래프 (평균 +/- SD)로 나타내었다. 도 12c는 인산화된 IGF1R에 대하여 조사된 웨스턴 블럿을 나타낸다. 100 nM 또는 500 nM 중 어느 하나의 IGF1R-4-mFc, 또는 다른 항-IGF1R VHH-mFc 융합체 (IGF1R-1, -3 또는 -4-mFc) 중 어느 것 단독과 함께 세포를 인큐베이팅하거나, 또는 각 IGF1R-VHH-mFc 융합 단백질의 존재하에 200 ng/ml의 IGF-1을 사용하여 자극하였다. 웨스턴 블럿은 융합 구축물 중 어느 것도 IGF-1 유도 IGF1R 인산화를 억제하지 않음은 물론, 그 자체로 수용체 인산화를 유도하지도 않는다는 것을 나타내었다.
본 발명은 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체-특이적 항체, 그의 단편 및 이들의 용도에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 혈액-뇌 장벽을 횡단이동하는 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체-특이적 항체 및 그의 단편, 그리고 이들의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체 (IGF1R) 항원결정인자에 특이적으로 결합하는 단리 또는 정제된 항체, 또는 그의 단편을 제공하는 바, 여기서 상기 항체 또는 그의 단편은 혈액-뇌 장벽을 횡단이동하며, 상기 항원결정인자는 서열식별번호: 5의 항체에 의해 특이적으로 결합된다. 상기 IGF1R 항원결정인자는 IGF1R의 세포외 도메인에 존재할 수 있다.
본 발명은 하기를 포함하는 단리 또는 정제된 항체, 또는 그의 단편을 제공하는 바, 상기 항체 또는 그의 단편은 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체 (IGF1R)에 특이적으로 결합한다:
상보성 결정 영역 (CDR) 1 서열
Figure 112016095163814-pct00010
(서열식별번호: 1);
CDR2 서열
Figure 112016095163814-pct00011
(서열식별번호: 2); 및
CDR3 서열
Figure 112016095163814-pct00012
(서열식별번호: 3).
"항체"라는 용어는 관련 기술분야에서 "이뮤노글로불린" (Ig)으로도 지칭되며, 본원에서 사용될 때에는 쌍을 이룬 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드로 구성되는 단백질을 지칭하는데; IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM을 포함하여, 다양한 Ig 동형들이 존재한다. 항체가 올바르게 접히는 경우, 각 사슬은 더 선형인 폴리펩티드 서열에 의해 연결된 수많은 별개의 구형 도메인들로 접힌다. 예를 들면, 이뮤노글로불린 경쇄는 가변 (VL) 및 불변 (CL) 도메인으로 접히는 반면, 중쇄는 가변 (VH) 및 3개의 불변 (CH, CH2, CH3) 도메인으로 접힌다. 중쇄와 경쇄 가변 도메인 (VH와 VL)의 상호작용은 항원 결합 영역 (Fv)의 형성을 초래한다. 각 도메인은 통상의 기술자에게 친숙한 잘 알려져 있는 구조를 가진다.
경쇄 및 중쇄 가변 영역은 표적 항원에 결합하는 것을 담당하며, 그에 따라 항체들 간에 상당한 서열 다양성을 나타낼 수 있다. 불변 영역은 더 작은 서열 다양성을 나타내며, 중요한 생화학적 사례들을 도출하는 수많은 자연상 단백질에 결합하는 것을 담당한다. 항체의 가변 영역은 분자의 항원-결합 결정인자를 포함하며, 그에 따라 그의 표적 항원에 대한 항체의 특이성을 결정한다. 서열 가변성의 대부분은 가변 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL) 당 각각 3개인 6개의 초가변 영역에서 발생하는데; 초가변 영역들은 합쳐서 항원-결합 부위를 형성함으로써, 항원 결정인자의 결합 및 인식에 기여한다. 해당 항원에 대한 항체의 특이성 및 친화성은 초가변 영역의 구조는 물론, 그의 크기, 형상, 및 그것이 항원에 대하여 제시하는 표면의 화학에 의해 결정된다. 초가변성 영역의 식별을 위한 다양한 체계들이 존재하는데, 가장 일반적인 두 가지는 문헌 [Kabat] 및 [Chothia and Lesk]의 것이다. 문헌 [Kabat et al (1991)]은 VH 및 VL 도메인 항원-결합 영역에서의 서열 가변성을 기준으로 "상보성-결정 영역" (CDR)을 정의하고 있다. 문헌 [Chothia and Lesk (1987)]은 VH 및 VL 도메인의 구조적 루프 영역의 위치를 기준으로 "초가변 루프" (H 또는 L)를 정의하고 있다. 이러한 개별 체계들이 인접하거나 중복되는 CDR 및 초가변 루프 영역들을 정의하고 있기 때문에, 항체 기술분야의 통상의 기술자들은 종종 "CDR"과 "초가변 루프"라는 용어를 호환가능하게 이용하는 바, 본원에서도 그들이 그렇게 사용될 수 있다. 본원에서 CDR/루프는 가변 도메인들의 비교를 용이하게 하기 위하여 개발된 더 최근의 IMGT 번호지정 시스템 (문헌 [Lefranc, M.-P. et al., 2003])에 따라 지칭된다. 이와 같은 시스템에서, 보존된 아미노산 (예컨대 Cys23, Trp41 , Cys104, Phe/Trp118, 및 위치 89의 소수성 잔기)은 항상 동일한 위치를 가진다. 또한, 프레임워크 영역 (FR1: 위치 1 내지 26; FR2: 39 내지 55; FR3: 66 내지 104; 및 FR4: 118 내지 129) 및 CDR (CDR1: 27 내지 38, CDR2: 56 내지 65; 및 CDR3: 105 내지 117)의 표준화된 한계가 제공된다.
본원에서 지칭될 때의 "항체 단편"에는 관련 기술분야에 알려져 있는 어떠한 적합한 항원-결합 항체 단편도 포함될 수 있다. 항체 단편은 자연-발생 항체 단편일 수 있거나, 또는 자연-발생 항체의 조작에 의해, 또는 재조합 방법을 사용하는 것에 의해 수득될 수 있다. 예를 들면, 항체 단편에는 Fv, 단일-사슬 Fv (scFv; 펩티드 링커를 사용하여 연결된 VL 및 VH로 구성되는 분자), Fab, F(ab')2, 단일 도메인 항체 (sdAb; 단일 VL 및 VH로 구성되는 단편), 및 이들 중 어느 것의 다가 제시가 포함될 수 있으나, 이제 제한되는 것은 아니다. 상기한 것들과 같은 항체 단편들은 단편들의 서로 다른 부분을 연결하기 위한 링커 서열, 디술피드 결합, 또는 기타 유형의 공유 결합을 필요로 할 수도 있는데; 통상의 기술자라면, 그의 구성을 위한 상이한 단편 유형들 및 다양한 접근법들의 요건과 친숙할 것이다.
비-제한적인 예에서, 항체 단편은 자연-발생 공급원으로부터 유래하는 sdAb일 수 있다. 낙타류 기원의 중쇄 항체 (문헌 [Hamers-Casterman et al, 1993])에는 경쇄가 결핍되어 있으며, 그에 따라 그의 항원 결합 부위는 VHH로 지칭되는 하나의 도메인으로 구성된다. sdAb는 상어에서도 관찰된 바 있는데, VNAR로 지칭된다 (문헌 [Nuttall et al, 2003]). 다른 sdAb는 인간 Ig 중쇄 및 경쇄 서열을 바탕으로 조작될 수 있다 (문헌 [Jespers et al, 2004]; [To et al, 2005]). 본원에서 사용될 때, "sdAb"라는 용어에는 파지 디스플레이 또는 다른 기술을 통하여 임의 기원의 VH, VHH, VL 또는 VNAR 저장소로부터 직접 단리된 sdAb, 상기언급된 sdAb 유래의 sdAb, 재조합으로 제조된 sdAb는 물론, 인간화, 친화성 성숙화, 안정화, 가용화, 낙타화(camelization) 또는 다른 항체 조작 방법에 의한 상기 sdAb의 추가적인 변형을 통하여 생성된 sdAb가 포함된다. 역시 본 발명에 의해 포괄되는 것은 sdAb의 항원-결합 기능 및 특이성을 보유하는 동종체, 유도체 또는 단편이다.
sdAb는 높은 열안정성, 높은 세제 내성, 프로테아제에 대한 상대적으로 높은 내성 (문헌 [Dumoulin et al, 2002]) 및 높은 제조 수율 (문헌 [Arbabi-Ghahroudi et al, 1997])과 같은 바람직한 항체 분자의 특성들을 보유하고 있으며; 면역 라이브러리로부터의 단리에 의해 (문헌 [Li et al, 2009]), 또는 시험관내 친화성 성숙화에 의해 (문헌 [Davies & Riechmann, 1996]) 매우 높은 친화성을 가지도록 조작될 수도 있다. 비-정준(non-canonical) 디술피드 결합의 도입 (문헌 [Hussack et al, 2011]; [Kim et al, 2012])과 같은 안정성을 증가시키기 위한 다른 변형들이 sdAb에 도입될 수도 있다.
통상의 기술자라면, 단일-도메인 항체의 구조를 잘 알고 있을 것이다 (예를 들면 프로테인 데이터 뱅크(Protein Data Bank)의 3DWT, 2P42 참조). sdAb는 이뮤노글로불린 접힘을 보유하는 단일 이뮤노글로불인 도메인을 포함하는데; 매우 특이하게도, 겨우 3개의 CDR/초가변 루프가 항원-결합 부위를 형성한다. 그러나, 통상의 기술자라면 알고 있을 바와 같이, 항원에 결합하는 데에 모든 CDR이 필요한 것은 아닐 수 있다. 예를 들어, 제한하고자 하는 것은 아니나, 1개, 2개 또는 3개의 CDR이 본 발명에 따른 sdAb에 의한 항원의 결합 및 인식에 기여할 수 있다. sdAb 또는 가변 도메인의 CDR은 본원에서 CDR1, CDR2 및 CDR3로 지칭되며, 문헌 [Lefranc, M.-P. et al. (2003)]에 의해 정의된 바와 같이 번호지정된다.
본 발명의 항체 또는 그의 단편은 세포 표면에서 발견되는 수용체인 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체 (IGF1R)에 대하여 특이적이다. IGF1R은 인슐린-유사 성장 인자 1 결합 부위를 가지는 세포외 부분을 포함하며, 디술피드 결합에 의해 소형의 세포외 도메인, 막횡단 영역 및 세포내 부분을 포함하는 베타 서브유닛에 연결되는 알파 서브유닛을 포함한다. IGF1 수용체는 단일-이량체로 조립되거나, 또는 인슐린 수용체와 이종이량체를 형성할 수 있다. IGF1R의 서열은 도 2에 나타낸 것 (스위스프롯(SwissProt) 등재 번호 P08069; 서열식별번호: 12) 또는 그와 실질적으로 동일한 서열일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에서 기술되는 바와 같은 항체 또는 그의 단편은 인슐린 수용체 (IR) 또는 IGF1R을 통한 신호전달을 방해해서는 아니 된다. 구체적으로, 본원에서 기술되는 바와 같은 항체 또는 그의 단편은 인슐린에 의해 유도되는 AKT 인산화를 억제해서는 아니 되며, 그것이 그 자체에서의 IR의 인산화를 유도하거나 인슐린-유도 신호전달을 억제해서도 아니되고; 또한 본원에서 기술되는 바와 같은 항체 또는 그의 단편은 IGF1R의 IGF-1-유도 인산화를 억제해서는 아니 된다. 또한, 그것은 인슐린 수용체에 결합해서는 아니 된다.
이전에 언급된 바와 같이, 항체 또는 그의 단편은 sdAb일 수 있다. 상기 sdAb는 낙타류 기원의 것이거나 낙타류 VHH로부터 유래할 수 있으며, 그에 따라 낙타류 프레임워크 영역을 바탕으로 할 수 있고; 대안적으로는 상기한 CDR이 VNAR, VHH, VH 또는 VL 프레임워크 영역상에 그래프팅될 수도 있다. 또 다른 대안에서는, 상기한 초가변 루프가 임의 공급원 (예를 들면 마우스)의 다른 유형 항체 단편 (Fv, scFv, Fab)의 프레임워크 영역, 또는 CDR이 그래프팅될 수 있는 유사한 크기 및 특성의 단백질 (예컨대 문헌 [Nicaise et al, 2004] 참조)상에 그래프팅될 수 있다.
본 발명은 또한 관련 기술분야에 알려져 있는 임의의 적합한 방법, 예를 들면 비제한적으로 CDR 그래프팅 및 베니어링(veneering)을 사용하여 "인간화된" 항체 또는 단편을 포괄한다. 항체 또는 항체 단편의 인간화는 인간 공통 서열에서 발견되는 것과 같은 해당 인간 상대물을 사용하여 항원-결합 능력 또는 특이성의 손실 없이 서열 중 아미노산을 대체하는 것을 포함하는데; 이와 같은 접근법은 인간 대상체에 도입되었을 때 항체 또는 그의 단편의 면역원성을 감소시킨다. CDR 그래프팅 과정에서는, 본원에서 정의되는 CDR 중 1종 이상이 인간 가변 영역 (VH 또는 VL), 다른 인간 항체 (IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM), 다른 인간 항체 단편 프레임워크 영역 (Fv, scFv, Fab), 또는 CDR이 그래프팅될 수 있는 유사한 크기 및 특성의 다른 단백질 (문헌 [Nicaise et al, 2004])에 융합 또는 그래프팅될 수 있다. 그와 같은 경우, 상기 하나 이상 초가변 루프의 입체형태는 보존될 가능성이 있으며, 해당 표적 (즉 IGF1R)에 대한 sdAb의 친화성 및 특이성이 최소한으로 영향을 받을 가능성이 있다. CDR 그래프팅에 대해서는 관련 기술분야에 알려져 있으며, 적어도 하기에 기술되어 있다: US 특허 제6180370호, US 특허 제5693761호, US 특허 제6054297호, US 특허 제5859205 및 유럽 특허 제626390호. 관련 기술분야에서 "가변 영역 재표면화(resurfacing)"로 지칭되기도 하는 베니어링은 항체 또는 단편의 용매-노출 위치를 인간화하는 것을 포함하는데; 이에 따라 CDR 입체구조에 중요할 수 있는 매립되어 있는 비-인간화 잔기는 보존되는 반면, 용매-노출 영역에 대한 면역학적 반응의 가능성은 최소화된다. 베니어링에 대해서는 관련 기술분야에 알려져 있으며, 적어도 하기에 기술되어 있다: US 특허 제5869619호, US 특허 제5766886호, US 특허 제5821123호 및 유럽 특허 제519596호. 통상의 기술자라면, 그와 같은 인간화된 항체 단편을 제조하고 아미노산 위치를 인간화하는 방법들과도 충분히 친숙할 것이다.
예를 들면, 어떠한 방식으로도 제한하고자 하는 것은 아니나, IGF1R에 대하여 특이적인 상기 단리 또는 정제된 항체, 또는 그의 단편은 하기 또는 그와 실질적으로 동일한 서열일 수 있다:
Figure 112016095163814-pct00013
(여기서 X1은 E 또는 Q이며; X2는 K 또는 Q이고; X3는 V 또는 E이며; X4는 A 또는 P이고; X5는 A 또는 E이며; X6는 V 또는 A이고; X7은 V 또는 F이며; X8은 G 또는 E이고; X9은 L 또는 R이며; X10은 F 또는 W이고; X11은 G 또는 S이며; X12는 V 또는 Y이고; X13은 D 또는 G이며; X14는 N 또는 S이고; X15는 A 또는 S이며; X16은 L 또는 V이고; X17은 K 또는 R이며; X18은 A 또는 S이고; X19는 L 또는 Q임). 대안적으로, 단리 또는 정제된 항체는 하기로 구성되는 군에서 선택되는 서열:
Figure 112016095163814-pct00014
Figure 112016095163814-pct00015
Figure 112016095163814-pct00016
Figure 112016095163814-pct00017
Figure 112016095163814-pct00018
또는 그와 실질적으로 동일한 서열을 포함할 수 있다.
실질적으로 동일한 서열은 하나 이상의 보존성인 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다. 참조 서열에 대한 하나 이상의 보존성 아미노산 돌연변이가 참조 서열과 비교하였을 때 생리학적, 화학적, 물리-화학적 또는 기능적 특성에 있어서 실질적인 변화가 없는 돌연변이 펩티드를 산출할 수 있다는 것이 관련 기술분야에 알려져 있는데; 그와 같은 경우, 참조 서열과 돌연변이 서열은 "실질적으로 동일한" 폴리펩티드로 간주되게 된다. 보존성 아미노산 치환은 본원에서 일 아미노산 잔기의 유사한 화학적 특성 (예컨대 크기, 전하 또는 극성)을 가지는 또 다른 아미노산 잔기에 대한 치환으로 정의된다. 이러한 보존성 아미노산 돌연변이는 상기에서 열거한 CDR 서열, 및 항체 또는 단편 CDR의 전체적인 구조는 유지하면서 sdAb의 프레임워크 영역에 대하여 이루어질 수 있으며; 그에 따라 항체의 특이성 및 결합은 유지된다.
비-제한적인 예에서, 보존성 돌연변이는 아미노산 치환일 수 있다. 그와 같은 보존성 아미노산 치환은 염기성, 중성, 소수성 또는 산성인 아미노산을 동일한 군의 또 다른 것 대신 치환할 수 있다. "염기성 아미노산"이라는 용어는 7을 초과하는 측쇄 pK 값을 가지며, 생리학적 pH에서 통상적으로 양으로 하전되어 있는 친수성 아미노산을 의미한다. 염기성 아미노산에는 히스티딘 (His 또는 H), 아르기닌 (Arg 또는 R) 및 리신 (Lys 또는 K)이 포함된다. "중성 아미노산" (또한 "극성 아미노산")이라는 용어는 생리학적 pH에서 하전되지 않는 측쇄를 가지나, 2개 원자에 의해 공통으로 공유되는 전자 쌍이 원자들 중 하나에 의해 더 가깝게 보유되는 하나 이상의 결합을 가지는 친수성 아미노산을 의미한다. 극성 아미노산에는 세린 (Ser 또는 S), 트레오닌 (Thr 또는 T), 시스테인 (Cys 또는 C), 티로신 (Tyr 또는 Y), 아스파라긴 (Asn 또는 N) 및 글루타민 (Gln 또는 Q)이 포함된다. "소수성 아미노산" (또한 "비-극성 아미노산")이라는 용어는 문헌 [Eisenberg (1984)]의 표준화된 공통 소수성 척도에 따른 0을 초과하는 소수성을 나타내는 아미노산을 포함하여 의미한다. 소수성 아미노산에는 프롤린 (Pro 또는 P), 이소류신 (Ile 또는 I), 페닐알라닌 (Phe 또는 F), 발린 (Val 또는 V), 류신 (Leu 또는 L), 트립토판 (Trp 또는 W), 메티오닌 (Met 또는 M), 알라닌 (Ala 또는 A) 및 글리신 (Gly 또는 G)이 포함된다. "산성 아미노산"은 7 미만의 측쇄 pK 값을 가지며, 생리학적 pH에서 통상적으로 음으로 하전되어 있는 친수성 아미노산을 지칭한다. 산성 아미노산에는 글루타메이트 (Glu 또는 E) 및 아스파르테이트 (Asp 또는 D)가 포함된다.
2개 서열의 유사성을 평가하는 데에는 서열 동일성이 사용되는데; 그것은 2개 서열이 잔기 위치들 사이의 최대 상응성으로 정렬되었을 때 동일한 잔기의 %를 계산하는 것에 의해 측정된다. 어떠한 공지의 방법도 서열 동일성을 계산하는 데에 사용될 수 있는데; 예를 들면 컴퓨터 소프트웨어가 서열 동일성을 계산하는 데에 가용하다. 제한하고자 하는 것은 아니나, 서열 동일성은 바이오인포매틱스(Bioinformatics) 스위스 연구소에 의해 유지되는 (그리고 ca.expasy.org/tools/blast/에서 찾아볼 수 있는 바와 같은) NCBI 블라스트(BLAST)2 서비스, 블라스트-P, 블라스트-N 또는 파스타(FASTA)-N과 같은 소프트웨어, 또는 관련 기술분야에 알려져 있는 임의의 다른 적절한 소프트웨어에 의해 계산될 수 있다.
본 발명의 실질적으로 동일한 서열은 90 % 이상 동일할 수 있는데; 또 다른 예에서는 실질적으로 동일한 서열이 본원에서 기술되는 서열에 대하여 아미노산 수준에서 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100 %, 또는 이들 사이의 임의의 백분율로 동일할 수 있다. 중요한 것은 실질적으로 동일한 서열이 참조 서열의 활성 및 특이성을 보유한다는 것이다. 비-제한적인 실시양태에서, 서열 동일성의 차이는 보존성 아미노산 돌연변이(들)로 인한 것일 수 있다. 비-제한적인 예에서, 본 발명은 본원에서 기술되는 항체의 것과 95 %, 98 % 또는 99 % 이상 동일한 서열을 포함하는 항체 또는 그의 단편에 관한 것일 수 있다.
본 발명의 항체 또는 그의 단편은 재조합 항체 또는 그의 단편의 발현, 검출 또는 정제를 돕기 위한 추가적인 서열을 포함할 수도 있다. 통상의 기술자에게 알려져 있는 어떠한 그와 같은 서열 또는 태그도 사용될 수 있다. 예를 들면, 제한하고자 하는 것은 아니나, 항체 또는 그의 단편은 표적화 또는 신호 서열 (예컨대 비제한적으로 ompA), 검출/정제 태그 (예컨대 비제한적으로 c-Myc, His5 또는 His6) 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 상기 추가 서열은 크로난(Cronan) 등의 WO 95/04069호 또는 보그스(Voges) 등의 WO/2004/076670호에 기술되어 있는 것과 같은 바이오틴 인식 부위일 수 있다. 또한, 통상의 기술자에게 알려져 있는 바와 같이, 링커 서열이 상기 추가 서열 또는 태그와 함께 사용될 수 있거나, 검출/정제 태그로 사용될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 그의 단편은 본원에서 다가 제시(multivalent presentation)로도 지칭되는 다가 구현 체재로 존재할 수도 있다. 다량체화는 관련 기술분야에 알려져 있는 어떠한 적합한 방법에 의해서도 달성될 수 있다. 예를 들면, 어떠한 방식으로도 제한하고자 하는 것은 아니나, 다량체화는 문헌 [Zhang et al (2004a; 2004b)] 및 WO 2003/046560호에 기술되어 있는 것들과 같은 자가-조립 분자를 사용하여 달성될 수 있는데, 본 발명의 항체 또는 그의 단편, 및 AB5 독소 족의 B-서브유닛의 오량체화 도메인 (문헌 [Merritt & Hol, 1995])을 포함하는 융합 단백질을 발현시키는 것에 의해 오량체가 생성된다. 문헌 [Zhu et al. (2010)]에 기술되어 있는 다량체화 도메인을 사용하여 다량체가 형성될 수도 있는데; 본원에서 "컴바디(combody)"로 지칭되는 이와 같은 형태는 다량체 분자로 이어지는 본 발명 항체 또는 단편의 나선형-코일 펩티드와의 융합체이다 (문헌 [Zhu et al., 2010]). 다른 형태의 다가 구현 역시 본 발명에 의해 포괄된다. 예를 들면, 제한하고자 하는 것은 아니나, 항체 또는 그의 단편은 이량체, 삼량체 또는 임의의 다른 적합한 올리고머로 제공될 수 있다. 이는 관련 기술분야에 알려져 있는 방법, 예를 들면 직접 연결 결합 (문헌 [Nielson et al, 2000]), c-jun/Fos 상호작용 (문헌 [de Kruif & Logtenberg, 1996]), "놉-인투-홀(knob into hole)" 상호작용 (문헌 [Ridgway et al, 1996])에 의해 달성될 수 있다.
다량체화용으로 관련 기술분야에 알려져 있는 또 다른 방법은 Fc 도메인, 예를 들면 비제한적으로 인간 Fc 도메인을 사용하여 항체 또는 그의 단편을 이량체화하는 것이다. Fc 도메인은 비제한적으로 IgG, IgM를 포함한 다양한 클래스, 또는 비제한적으로 IgG1, IgG2 등을 포함한 다양한 하위클래스에서 선택될 수 있다. 이와 같은 접근법에서는, Fc 유전자가 sdAb 유전자와 함께 벡터에 삽입됨으로써 sdAb-Fc 융합 단백질을 생성시키고 (문헌 [Bell et al, 2010]; [Iqbal et al, 2010]); 융합 단백질이 재조합으로 발현된 다음, 정제된다. 예를 들면, 어떠한 방식으로도 제한하고자 하는 것은 아니나, 다가 구현 체재는 Fc 도메인에 연결된 항-IGF1R-4 VHH의 키메라 체재, 또는 고유의 항원결정인자를 인식하는 2 또는 3개의 항-IGF1R-4 VHH를 가지는 2- 또는 3-특이적 항체 융합체를 포괄할 수 있다. 그와 같은 항체들은 조작하고 생성시키기가 용이하며, sdAb의 혈청 반감기를 크게 연장할 수 있어서, 뛰어난 종양 영상화 시약이 될 수 있다 (문헌 [Bell et al., 2010]).
상기한 바와 같은 다량체 복합체 중 Fc 도메인은 관련 기술분야에 알려져 있는 임의의 적합한 Fc 단편일 수 있다. 상기 Fc 단편은 임의의 적합한 공급원으로부터의 것일 수 있는데; 예를 들면 Fc는 마우스 또는 인간 기원의 것일 수 있다. 구체적인 비-제한적 예에서, Fc는 마우스 Fc2b 단편 또는 인간 Fc1 단편일 수 있다 (문헌 [Bell et al, 2010]; [Iqbal et al, 2010]). Fc 단편은 본 발명의 항-IGF1R-3 VHH 또는 인간화된 버전의 N-말단 또는 C-말단 단부에 융합될 수 있다. 구체적인 비-제한적 예에서는, 상기한 바와 같은 다량체화된 단리 또는 정제된 항체 또는 단편이 서열식별번호: 10, 38 또는 11의 서열을 포함할 수 있다.
상기한 다량체의 각 서브유닛은 동일하거나 상이한 특이성을 가질 수 있는 동일하거나 상이한 본 발명의 항체 또는 그의 단편들을 포함할 수 있다. 또한, 다량체화 도메인은 필요에 따라 링커를 사용하여 항체 또는 항체 단편에 연결될 수 있는데; 그와 같은 링커는 2개 분자의 유연성 있는 결합을 제공하기에 충분한 길이 및 적절한 조성을 가져야 하나, 항체의 항원-결합 특성을 방해해서는 아니 된다.
본원에서 기술되는 바와 같은 항체 또는 그의 단편은 혈액뇌 장벽을 건너 횡단이동할 수 있다. 뇌는 혈액-뇌 장벽 (BBB)으로 알려져 있는 특수한 내피 조직에 의해 나머지 신체로부터 분리되어 있다. BBB의 내피 세포들은 견고한 연결에 의해 연결되어 있어서, 많은 치료용 화합물들이 뇌에 진입하는 것을 효율적으로 방해한다. 낮은 소포 수송 속도 이외에, 한 가지 구체적인 BBB의 특징은 효소 장벽(들)의 존재, 그리고 뇌로부터 혈류로 다양한 분자들을 능동 수송하는 (문헌 [Samuels, 1993]) P-당단백질을 포함한 BBB 내강외 (뇌) 측에서의 ATP-의존성 수송체의 높은 발현 수준(들) (문헌 [Gottesman et al., 1993]; [Watanabe, 1995])이다. 소형이며 (< 500 돌턴) 소수성인 (문헌 [Pardridge, 1995]) 분자만이 더 용이하게 BBB를 횡단할 수 있다. 따라서, 표면 수용체에 특이적으로 결합하고 뇌 내피 세포로 내재화되며 리소좀 분해를 회피하여 BBB를 횡단하는 세포질통과이동에 적용되는 상기한 바와 같은 항체 또는 그의 단편의 능력은 신경학 분야에 유용하다.
본 발명은 본원에서 기술되는 바와 같은 분자들을 코딩하는 핵산 서열도 포괄한다. 통상의 기술자라면 용이하게 이해할 바와 같이, 유전자 코드의 축퇴성을 고려하면, 수많은 뉴클레오티드 서열들이 폴리펩티드를 코딩하는 효과를 가지게 된다. 상기 핵산 서열들은 다양한 미생물에서의 발현용으로 코돈-최적화될 수 있다. 본 발명은 또한 상기한 바와 같은 핵산을 포함하는 벡터를 포괄한다. 또한, 본 발명은 기술된 바와 같은 핵산 및/또는 벡터를 포함하는 세포를 포괄한다.
본 발명은 또한 다양한 방법론을 사용하여 표면상에 고정된 단리 또는 정제된 항체, 또는 그의 단편을 포괄하는 바; 예를 들면, 제한하고자 하는 것은 아니나, 항체 또는 단편이 His-태그 커플링, 바이오틴 결합, 공유 결합, 흡착 등을 통하여 표면에 연결 또는 커플링될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 그의 단편의 고정은 단백질을 포획, 정제 또는 단리하기 위한 다양한 적용분야에서 유용할 수 있다. 고체 표면은 임의의 적합한 표면, 예를 들면 비제한적으로 미량역가 플레이트의 웰 표면, 표면 플라스몬 공명 (SPR) 센서칩의 채널, 막, 비드 (예컨대 자석-기재 또는 세파로스-기재 비드 또는 기타 크로마토그래피 수지), 유리, 플라스틱, 스테인리스강, 필름, 또는 임의의 다른 유용한 표면 예컨대 나노입자, 나노와이어 및 캔틸레버 표면일 수 있다.
본 발명은 또한 적재물 분자에 연결된 상기한 바와 같은 항체 또는 그의 단편을 포괄한다. 상기 적재물 분자는 항체 또는 그의 단편에 의해 BBB를 횡단하여 전달되는 임의의 적합한 분자일 수 있다. 적재물 분자는 약 1 kDa 내지 약 200 kDa 범위의 분자량을 가질 수 있는데; 예를 들면 적재물 분자는 약 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195 또는 200 kDa의 분자량, 또는 이들 사이의 임의 분자량, 또는 상기언급된 중량 임의 2개에 의해 한정되는 임의의 분자량 범위를 가질 수 있다. 구체적인 비-제한적 예에서, 적재물 분자는 1 kDa (예컨대 비제한적으로 소형 분자 예컨대 Cy5.5), 1-10 kDa (예컨대 비제한적으로 펩티드 예컨대 갈라닌, 3 kDa), 약 80 kDa (예컨대 비제한적으로 Fc 단편, 효소, 단백질, 항체 등), 또는 약 200 kDa (예컨대 비제한적으로 단일클론 항체)의 분자량을 가질 수 있다.
예를 들면, 어떠한 방식으로도 제한하고자 하는 것은 아니나, 적재물 분자는 검출가능 작용제, 치료제, 약물, 펩티드, 효소, 성장 인자, 시토카인, 수용체 트랩, 항체 또는 그의 단편 (예컨대 IgG, scFv, Fab, VHH, VH, VL 등), 화합물, 탄수화물 잔기, DNA-기반 분자 (안티-센스 올리고뉴클레오티드, microRNA, siRNA, 플라스미드), 세포독성 작용제, 바이러스 벡터 (아데노-, 렌티-, 레트로), 전기 언급된 유형의 적재물 분자들 중 어느 것이 적재된 1종 이상의 리포좀 또는 나노운반체, 또는 1종 이상의 나노입자, 나노와이어, 나노튜브 또는 양자점일 수 있다. 상기한 바와 같은 적재물 분자는 검출가능 작용제일 수 있다. 예를 들면, IGF1R-특이적 항체 또는 그의 단편은 방사성동위원소, 상자성 표지, 형광단, 형광제, 근적외선 (NIR; 예컨대 Cy5.5) 형광색소 또는 염료, 반향성 미세기포, 친화성 표지, 검출가능 단백질 기반 분자, 뉴클레오티드, 양자점, 나노입자, 나노와이어, 또는 나노튜브, 또는 영상화 방법에 의해 검출될 수 있는 임의의 다른 적합한 작용제에 연결될 수 있다. 항체 또는 그의 단편은 관련 기술분야에 알려져 있는 임의의 방법 (재조합 기술, 화학적 접합 등)을 사용하여 적재물 분자에 연결될 수 있다.
본원에서 기술되는 바와 같은 적재물 분자는 관련 기술분야에 알려져 있는 임의의 적합한 방법에 의해 항체 또는 그의 단편에 연결 (본원에서는 "접합"으로도 지칭됨)될 수 있다. 예를 들면, 제한하고자 하는 것은 아니나, 적재물 분자는 공유 결합 또는 이온 상호작용에 의해 펩티드에 연결될 수 있다. 상기 연결은 화학적 가교-결합 반응을 통하여, 또는 세균, 효모 또는 포유동물 세포-기반 시스템과 같은 임의의 펩티드 발현 시스템과 조합된 재조합 DNA 방법론을 사용한 융합을 통하여 달성될 수 있다. 적재물 분자를 항체 또는 그의 단편에 접합시키는 경우, 적합한 링커가 사용될 수도 있다. 항체 또는 그의 단편을 치료제 또는 검출가능 작용제와 같은 적재물 분자에 연결하기 위한 방법에 대해서는 통상의 기술자에게 잘 알려져 있을 것이다.
비-제한적인 일 예에서, 적재물 분자는 검출가능한 표지, 방사성동위원소, 상자성 표지 예컨대 가돌리늄 또는 산화 철, 형광단, 근적외선 (NIR) 형광색소 또는 염료, 반향성 미세기포, 치화성 표지 (예컨대 바이오틴, 아비딘 등), 효소, 또는 진단 영상화 방법에 의해 검출될 수 있는 임의의 다른 적합한 작용제일 수 있다. 구체적인 비-제한적 예에서, 항-IGF1R-4 또는 그의 단편은 근적외선 형광 (NIRF) 영상화 염료, 예를 들면 제한하고자 하는 것은 아니나 Cy5.5, 알렉사(Alexa)680, 다이라이트(Dylight)680 또는 다이라이트800에 연결될 수 있다.
이에 따라, 본 발명은 또한 조직 샘플을 검출가능 작용제에 연결된 본 발명의 1종 이상의 단리 또는 정제된 항체, 또는 그의 단편과 접촉시키는 단계를 포함하는, IGF1R의 시험관내 검출 방법을 제공한다. IGF1R-항체 복합체는 이후 관련 기술분야에 알려져 있는 검출 및/또는 영상화 기술을 사용하여 검출될 수 있다. 상기한 바와 같은 방법의 조직 샘플은 임의의 적합한 조직 샘플, 예를 들면 비제한적으로 혈청 샘플, 혈관 조직 샘플, 종양 조직 샘플 또는 뇌 조직 샘플일 수 있으며; 상기 조직 샘플은 인간 또는 동물 대상체로부터의 것일 수 있다. 접촉 단계는 항체 또는 그의 단편과 IGF1R 사이의 복합체 형성용으로 통상의 기술자에게 알려져 있는 적합한 조건하에서 수행된다. 검출 단계는 관련 기술분야에 알려져 있는 임의의 적합한 방법, 예를 들면 비제한적으로 광학적 영상화, 면역조직화학, 분자 진단 영상화, ELISA, 영상화 질량 분광측정법 또는 기타 적합한 방법에 의해 달성될 수 있다. 예를 들면, 어떠한 방식으로도 제한하고자 하는 것은 아니나, 검출가능 작용제에 연결된 단리 또는 정제된 항체, 또는 그의 단편은 비제한적으로 효소 IA (EIA), ELISA, "급속 항원 포획", "급속 크로마토그래피 IA" 및 "급속 EIA". (예컨대 문헌 [Planche et al, 2008]; [Sloan et al, 2008]; [Russmann et al, 2007]; [Musher et al, 2007]; [Turgeon et al, 2003]; [Fenner et al, 2008] 참조)를 포함한 면역검정 (IA)에 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 대상체에서의 IGF1R 발현의 생체내 검출 방법을 제공한다. 상기 방법은 검출가능 작용제에 연결된 1종 이상의 본원에서 기술되는 바와 같은 단리 또는 정제된 항체, 또는 그의 단편을 대상체에게 투여하는 단계, 및 다음에 IGF1R에 결합된 표지된 항체 또는 그의 단편을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 검출 단계는 관련 기술분야에 알려져 있는 임의의 적합한 방법, 예를 들면 비제한적으로 PET, SPECT 또는 형광 영상화, 또는 임의의 다른 적합한 방법을 포함할 수 있다. 상기한 바와 같은 방법은 혈관 또는 조직, 예를 들면 비제한적으로 종양 조직에서 IGF1R의 발현을 검출하는 데에 유용할 수 있다.
상기한 방법의 생체내 검출 단계는 질환의 진행 또는 치료 처방계획에 대한 숙주 반응을 평가하기 위한 정량적 방식인 진단 목적의 전체 신체 영상화, 또는 특정 부위, 예컨대 비제한적으로 뇌 혈관 또는 뇌 종양 혈관의 국소적 영상화일 수 있다. 상기한 바와 같은 방법의 검출 단계는 면역조직화학, 또는 비제한적으로 하기를 포함한 비-침습성 (분자) 진단 영상화 기술일 수 있다:
* 광학적 영상화;
* 검출가능 작용제가 11C, 13N, 15O, 18F, 64Cu, 62Cu, 124I, 76Br, 82Rb 및 68Ga와 같은 동위원소이며, 18F가 가장 많이 임상적으로 이용되는, 양전자 방출 단층촬영 (PET);
* 검출가능 작용제가 구체적인 적용분야에 따라 99mTc, 111In, 123I, 201Tl, 133Xe과 같은 방사성추적자인, 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영 (SPECT);
* 검출가능 작용제가 예를 들면 비제한적으로 가돌리늄, 산화 철 나노입자, 및 탄소-코팅됨으로써 플라크(plaque)의 검출을 위한 MRI의 감도를 증가시킨 철-코발트 나노입자일 수 있는, 자기 공명 영상화 (MRI);
* 검출가능 작용제가 1종 이상의 음향학적으로 활성이며 기체-충전된 미세기포인, 대조-강화 초음파촬영술 (CEUS) 또는 초음파. 초음파는 인간 질환의 스크리닝 및 조기 검출을 위한 광범위한 기술임. 그것은 MRI 또는 섬광조영술에 비해 덜 비싸며, 그것이 조사를 포함하지 않기 때문에 방사성핵종 영상화와 같은 분자 영상화 양식에 비해 더 안전함.
본 발명은 또한 혈액-뇌 장벽을 횡단하는 해당 분자의 수송 방법을 제공한다. 상기 방법은 본원에서 기술되는 바와 같은 항체 또는 그의 단편에 연결된 상기 분자를 대상체에게 투여하는 단계로써, 상기 항체 또는 그의 단편이 혈액-뇌 장벽을 횡단이동하는 단계를 포함한다. 상기 분자는 전기한 바와 같은 적재물 분자를 포함한 임의의 원하는 분자일 수 있으며; 상기 분자는 비제한적으로 접합 또는 융합 단백질에서의 발현을 포함한 임의의 적합한 방법을 사용하여 항체 또는 그의 단편에 "연결"될 수 있다. 투여는 임의의 적합한 방법, 예를 들면 비제한적으로 정맥내 (iv), 피하 (sc) 및 근육내 (im) 투여를 포함한 비경구 투여에 의할 수 있다. 이와 같은 방법에서, 본 발명의 항체 또는 그의 단편은 BBB를 횡단하여 그의 뇌 표적으로 해당 분자를 '운반'한다.
본 발명은 또한 1종 이상의 본원에서 기술되는 바와 같은 단리 또는 정제된 항체, 또는 그의 단편을 포함하는 조성물을 포괄한다. 상기 조성물은 상기한 바와 같은 단일 항체 또는 단편을 포함할 수 있거나, 항체 또는 단편들의 혼합물일 수 있다. 또한, 본 발명 항체 또는 단편들의 혼합물을 포함하는 조성물에서, 항체들은 동일한 특이성을 가질 수 있거나, 또는 그의 특이성이 다를 수 있는데; 예를 들면, 어떠한 방식으로도 제한하고자 하는 것은 아니나, 조성물은 IGF1R에 특이적인 항체 또는 그의 단편들 (동일하거나 상이한 항원결정인자)을 포함할 수 있다.
상기 조성물은 제약상 허용되는 희석제, 부형제 또는 담체를 포함할 수도 있다. 상기 희석제, 부형제 또는 담체는 관련 기술분야에 알려져 있는 임의의 적합한 희석제, 부형제 또는 담체일 수 있는데, 조성물 중 다른 성분들과 상용성이어야 하며, 조성물의 전달 방법에 부합해야 하고, 조성물의 수용자에게 유해하지 않아야 한다. 조성물은 임의의 적합한 형태일 수 있는데; 예를 들면 조성물은 현탁액 형태, 분말 형태 (예를 들면 비제한적으로 동결건조 또는 캡슐화된 것), 캡슐 또는 정제 형태로 제공될 수 있다. 예를 들면, 제한하고자 하는 것은 아니나, 조성물이 현탁액 형태로 제공되는 경우, 상기 담체는 물, 식염수, 적합한 완충제, 또는 용해도 및/또는 안정성을 향상시키기 위한 첨가제를 포함할 수 있으며; 항체 또는 그의 단편의 생존력을 보장하기에 적합한 pH의 완충제 중에서 현탁액을 생성시키기 위한 재구성이 수행된다. 건조 분말은 안정성을 향상시키기 위한 첨가제 및/또는 체적/부피를 증가시키 위한 담체를 포함할 수도 있는데; 예를 들면, 제한하고자 하는 것은 아니나, 건조 분말 조성물은 수크로스 또는 트레할로스를 포함할 수 있다. 구체적인 비-제한적 예에서, 조성물은 대상체의 위장관로로 항체 또는 그의 단편을 전달하도록 제제화될 수 있다. 이에 따라, 조성물은 항체 또는 그의 단편의 전달을 위한 캡슐화, 시간-방출 또는 다른 적합한 기술을 포함할 수 있다. 본 발명의 화합물을 포함하는 적합한 조성물을 제조하는 것은 통상 기술자의 능력에 속하게 된다.
본 발명은 또한 적재물 분자가 1종 이상의 본원에서 기술되는 바와 같은 단리 또는 정제된 항체, 또는 그의 단편에 연결되는, 대상체의 BBB를 횡단하여 전달되는 적재물 분자 양의 정량 방법을 포괄하는 바, 상기 방법은 하기를 포함한다:
a) 대상체로부터 뇌척수액 (CSF)을 수집하는 단계; 및
b) 표적화된 단백질체학적 방법을 사용하여, CSF 중 1종 이상의 항체, 또는 그의 단편에 연결된 적재물 분자의 양을 정량하는 단계.
상기 적재물 분자는 이전에 기술된 바와 같은 적재물 분자들을 포함한 임의의 원하는 분자일 수 있으며; 상기 단리 또는 정제된 항체 또는 그의 단편은 혈액-뇌 장벽을 횡단이동하고; 상기 분자는 이전에 기술된 바와 같이 비제한적으로 접합 또는 융합 단백질에서의 발현을 포함한 임의의 적합한 방법을 사용하여 항체 또는 그의 단편에 "연결"될 수 있다. 상기 방법에서, CSF는 관련 기술분야에 알려져 있는 임의의 적합한 방법을 사용하여 대상체로부터 수집된다. 단계 b)의 표적화된 단백질체학적 방법에 필요한 CSF의 양은 약 1 내지 10 μl 사이일 수 있는데; 예를 들면 필요한 CSF의 양은 약 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5 또는 10 μl, 또는 이들 사이의 임의의 양, 또는 상기한 양에 의해 한정되는 임의의 범위일 수 있다. 적재물 분자에 연결된 항체 또는 단편은 CSF의 수집 전에 대상체에게 투여되었을 수 있다. 투여와 BBB를 횡단하는 적재물 분자에 연결된 항체 또는 단편의 전달 사이의 적합한 지연은 필수적일 수 있다. 상기 지연은 적재물 분자에 연결된 항체 또는 단편의 투여 후 30분 이상일 수 있는데; 예를 들면, 어떠한 방식으로도 제한하고자 하는 것은 아니나, 상기 지연은 30분, 1시간, 1.5시간, 2시간, 2.5시간, 3시간, 3.5시간, 4시간, 4.5시간 또는 5시간 이상일 수 있다. 적재물 분자에 연결된 1종 이상 항체 또는 그의 단편의 양을 정량하는 데에 사용되는 표적화된 단백질체학적 방법은 관련 기술분야에 알려져 있는 임의의 적합한 방법일 수 있다. 예를 들면, 제한하고자 하는 것은 아니나, 표적화된 단백질체학적 방법은 질량 분광측정법, 예컨대 비제한적으로 동위원소 표지된 내부 표준을 사용한 다중 반응 모니터링 (MRM-ILIS; 예를 들면 문헌 [Haqqani et al., 2013] 참조)일 수 있다. MRM은 생물학적 샘플에서 그것이 표지되지 않은 표적화된 피분석물 (예컨대 본원에서 기술되는 바와 같은 항체 또는 그의 단편)의 빠르고, 민감하며, 특이적인 정량을 가능케 한다는 점에서 유리하다. 검정의 다중화 능력은 항체 또는 그의 단편과 적재물 분자 모두의 정량을 가능케 할 수 있다.
[실시예]
하기의 실시예에서 본 발명이 추가적으로 예시될 것이다. 그러나, 이들 실시예는 단지 예시 목적의 것으로써, 어떠한 방식으로도 본 발명의 영역을 제한하는 데에 사용되어서는 아니 된다는 것이 이해되어야 한다.
실시예 1: IGF1R 재조합 단편의 정제
IGF1R 세포외 도메인의 933개 아미노산 길이 재조합 단편 (도 1에 회색 박스로 나타냄; 서열식별번호: 12의 아미노산 1-933도 참조)을 제조하였다. 상기 단편은 N-말단 30개 아미노산 신호 펩티드, 전체 알파 서브유닛, 퓨린(furin) 절단 부위 (RKRR, 서열식별번호: 13; 알파 서브유닛과 베타 서브유닛을 분리)는 물론, 베타 서브유닛의 대부분의 세포외 부분을 포함하였다 (도 1 및 2).
클로닝. 하기의 프라이머들을 사용한 PCR에 의해, 해당 IGF1R 엑토도메인(ectodomain)의 서열을 증폭한 후, Puc19의 Smal 부위에 서브클로닝하였다:
Figure 112016095163814-pct00019
(정방향; 서열식별번호: 14)
Figure 112016095163814-pct00020
(역방향; 서열식별번호: 15).
다음에, IGF1R933 서열을 pCDN4/myc-His (인비트로겐(Invitrogen) 사)에 서브-클로닝함으로써, 이전에 기술된 바와 같이 (문헌 [Samani et al. 2004]) His-태그화된 엑토도메인의 발현을 가능케 하는 pIGF1R933-His를 생성시켰다.
일시적 형질감염. 이전에 상술된 바와 같이 (문헌 [Broussau et al., 2008]) 패키지화 세포주 293SF-PacLV에서 IGF1R933-His를 발현하는 렌티바이러스 입자를 생성시켰다. 간단하게 말하자면, 폴리에틸렌이민을 사용하여 세포를 벡터로 형질감염시켰다. 형질감염 5시간 후, 1 ㎍/ml의 독시사이클린 및 10 ㎍/ml의 쿠메이트를 함유하는 새로운 배지 (LC-SFM)를 세포에 첨가하고, 48-72시간 후, LV 입자를 함유하는 상청액을 수집한 후, 20 % 수크로스 쿠션에서 4 ℃로 2시간 동안 100,000×g에서의 원심분리에 의해 농축하고 (문헌 [Gaillet B et al. 2007]), 1 % FBS가 보충된 LC-SFM 배지에 재-현탁하여, 사용시까지 -70 ℃로 저장하였다.
안정한 발현. 이전에 기술된 프로토콜 (문헌 [Gaillet B. et al. 2010])을 사용하여, 각 렌티바이러스 입자로 293SF-cum2 세포주를 형질도입함으로써, 안정한 세포주 293SF-cum2-CR5-IGF1R-His를 생성시켰다. 간단하게 말하자면, 0.5-1.0 × 105개의 293SF-cum2 세포를 24 웰 플레이트의 덱스트란 술페이트가 없는 LC-SFM 배지 200 μl에 접종하였다. 200-500 μL의 LV를 8 ㎍/mL의 폴리브렌과 혼합하고, 37 ℃에서 30분 동안 그것을 인큐베이팅함으로써, LV 현탁액을 제조하였다. 접종 4시간 후, 새롭게 제조된 LV 현탁액을 세포에 첨가하였다. 24시간 후, 덱스트란 술페이트가 보충된 500 μL의 배지를 세포에 첨가하였다. 발현 수준을 증가시키기 위하여, 세포 회수 3-4일 후 동일한 프로토콜을 사용하여 6회까지 세포를 재-형질도입하였다. 최종적으로, 6-웰 플레이트 및 진탕기 플라스크에서 세포를 성장시켰다.
대규모 단백질 제조 및 정제. 최고의 생산자로 식별된 클론을 진탕기 또는 스피너(spinner) 플라스크에서 성장시켰다. 새로운 배지에서 1 ㎍/ml 쿠메이트의 첨가에 의해 단백질 생성을 개시한 후, 이어서 37 ℃에서 24시간 인큐베이팅하고, 30 ℃에서 4-8일 인큐베이팅하였다. 원심분리에 의해 세포를 제거하고, 접선 유동 여과 시스템 (펠리콘(Pellicon) 한외여과 카세트, EMD 밀리포어(Millipore) 사)을 사용하여 상청액을 여과 농축하였다 (10×).
히스프렙(HisPrep) 컬럼 (GE 헬스케어(Healthcare) 사)을 사용하여 제조자의 지침에 따라 IGF1R933-His를 정제하였다. 간단하게 말하자면, 농축된 샘플을 히스-프렙 FF (16/10) 컬럼 (GE 헬스케어 사)에 적용하고, 평형화한 후, 50 mM 나트륨 포스페이트, 300 mM NaCl, 5 mM 이미다졸 pH 7.5를 사용하여 세척하고, 50 mM 나트륨 포스페이트, 300 mM NaCl, 500 mM 이미다졸 pH 7.5를 사용하여 용리하였다. 0.1 M 나트륨 시트레이트 pH 4.5 내지 pH 2.5에 의한 단계적 용리를 사용하여 단백질을 용리하고, 피크 분획을 혼합수집하였다. 50 kDa 컷-오프 막을 사용한 한외여과, 또는 50 mM 나트륨 포스페이트, 150 mM NaCl 및 0.01 % 트윈(Tween)-80 pH 7.2를 함유하는 완충제를 사용한 탈염 컬럼에 의해 완충제 교환을 수행하였다. SDS-PAGE에 의해 양 단백질의 순도를 확인하고, 그것을 사용시까지 -80 ℃에서 저장하였다 (이후 실시예 참조).
실시예 2: 라마 면역화 및 혈청 반응
IGF1R의 세포외 도메인을 표적으로 하는 VHH를 단리하기 위하여, 실시예 1에서 수득된 재조합 IGF1R933-His 단편을 사용하여 라마를 면역화하였다.
IGF1R933-His 재조합 항원 (실시예 1)의 피하 허리 주사에 의해 한 마리의 수컷 라마 (라마 글라마 (Lama glama ))를 면역화하였다. 1일차에, PBS 중에 1 ml로 희석된 200 ㎍의 항원을 1 ml의 프로인트 완전 아주반트(Freund's Complete Adjuvant) (시그마(Sigma) 사, 미주리 세인트루이스 소재)와 함께 주사하였다. 22, 36 및 50일차에, 3회의 추가적인 IGF1R933-His 항원 더하기 프로인트 불완전 아주반트 (시그마 사) 100 ㎍ 주사를 수행하였다. 77일차에는, 아주반트가 없는 항원 100 ㎍의 최종 주사를 수행하였다. 1일차의 첫 번째 주사 전에 면역-전 혈액을 취출하여, 음성 대조로 사용하였다. 29, 43, 57 및 84일차에 혈액 (10-15 ml)을 수집하였다. 84일차의 혈액은 즉시 처리하여 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 단리하였다. 혈액을 포스페이트 완충된 식염수 (PBS)와 1:1로 희석하고, 림포프렙 튜브(Lymphoprep Tube) (악시스 쉴드(Axis Shield) 사)를 사용하여 혈액으로부터 PBMC를 정제하였다. 세포를 계수하고, 미래의 사용을 위하여 -80 ℃에서 약 1×107개 세포의 분취량으로 저장하였다.
57일차에, ELISA에 의해 IGF1R933-His 항원에 대한 특이적 반응에 대하여 면역-전 및 면역-후 총 혈청을 분석하였다. 84일차의 라마 혈청을 이전에 기술된 바와 같이 (문헌 [Doyle et al, 2008]) 분별하였다. 생성 분획인 A1 (HCAb), A2 (HCAb), G1 (HCAb) 및 G2 (clgG)를 ELISA에 의해 IGF1R933-His 항원에 대한 특이적 결합에 대하여 분석하였다. 간단하게 말하자면, PBS 중에 희석된 5 ㎍의 IGF1R933-His 재조합 항원을 96 웰 막시소르프(Maxisorp) 플레이트 (날진, 눈크(Nalgene, Nunc) 사)에서 밤새 (100 μl/웰, 18시간, 4 ℃) 인큐베이팅함으로써, 플레이트를 코팅하였다. 플레이트를 소 혈청 알부민 (BSA)으로 블로킹하고, PBS-T (PBS + 0.05 % (v/v) 트윈-20)으로 세척한 후, 면역-전 총 혈청, 면역-후 총 혈청 (57일차) 및 분별된 혈청 (84일차)의 연속 희석물을 적용하였다. 실온에서 1.5시간 동안 인큐베이팅하고, 플레이트를 PBS-T로 세척한 후, 염소 항-라마 IgG (PBS 중 1:1,000)를 첨가하고, 플레이트를 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. PBS-T를 사용한 세척 후, 돼지 항-염소 IgG-HRP 접합체 (PBS 중 1:3,000)를 첨가하고, 플레이트를 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 최종 PBS-T 세척을 수행한 후, 100 μl/웰의 TMB 기질 (KPL 사, 메릴랜드 가이터스부르그 소재)을 첨가하고; 기질을 10분 동안 인큐베이팅하였다. 100 μl/웰의 1 M H3PO4를 사용하여 반응을 중지시켰다. 450 nm에서 흡광도를 해독하였다.
실시예 3: IGF1R -결합 V H H의 라이브러리 구성 및 선택
실시예 2의 PBMC로부터 단리된 RNA를 기반으로 과다면역화된 라마 VHH 라이브러리를 구성하였다.
라이브러리 구성 및 패닝(panning)은 본질적으로 이전에 기술된 바와 같이 (문헌 [Arbabi-Ghahroudi et al, 2009a, 2009b]; [Tanha et al, 2003]) 수행하였다. 키아앰프(QIAamp) RNA 혈액 미니 키트 (키아젠(Qiagen) 사)를 사용하여 면역화 (실시예 2)-후 84일차에 수집된 대략 107개의 PBMC로부터 총 RNA를 단리하였다. 약 5 ㎍의 총 RNA를 제1-가닥 cDNA 합성 키트 (GE 헬스케어 사)를 사용한 올리고 dT 프라이머에 의한 제1 가닥 cDNA 합성을 위한 주형으로 사용하였다. 하기 3종 가변 영역-특이적 센스 프라이머들:
Figure 112016095163814-pct00021
Figure 112016095163814-pct00022
Figure 112016095163814-pct00023
그리고 하기 2종 안티센스 CH2-특이적 프라이머들의 등몰 혼합물에 의해, cDNA를 증폭하였다:
Figure 112016095163814-pct00024
Figure 112016095163814-pct00025
.
간단하게 말하자면, 하기의 성분들을 사용하여 50 μl의 총 부피로 PCR 반응 혼합물을 구성하였다: 1-3 μl의 cDNA, 5 pmol의 MJ1-3 프라이머 혼합물, 5 pmol의 CH2 또는 CH2B3 프라이머, 5 μl의 10× 반응 완충제, 1 μl의 10 mM dNTP, 2.5 단위의 Taq DNA 폴리머라제 (호프만-라로셰(Hoffmann-LaRoche)). PCR 프로토콜은 (i) 94 ℃에서 3분 동안의 개시 단계, (ii) 이어지는 94 ℃ 1분, 55 ℃ 30초, 72 ℃ 30초의 30 주기, 및 (iii) 72 ℃에서 7분 동안의 최종 연장 단계로 구성하였다. 증폭된 PCR 생성물을 2 % 아가로스 겔상에서 전개하였는데, 하기 2개의 주 밴드가 관찰되었다: 통상적인 IgG에 상응하는 약 850 bp의 밴드, 및 낙타화 중쇄 항체의 VHH-CH2 영역에 상응하는 600 bp 가량의 제2 밴드. 더 작은 밴드를 절단한 후, 키아퀵(QIAquick) 겔 추출 키트 (키아젠 사)를 사용하여 정제하고, 총 부피 50 μl의 제2 PCR에서 1 μl (30 ng)의 DNA 주형, 각각 5 pmol의 MJ7 프라이머 (
Figure 112016095163814-pct00026
서열식별번호: 21) 및 MJ8 프라이머 (5'-
Figure 112016095163814-pct00027
서열식별번호: 22), 5 μl의 10× 반응 완충제, 1 μl의 10 mM dNTP, 2.5 단위의 Taq DNA 폴리머라제를 사용하여 재-증폭하였다. PCR 프로토콜은 (i) 94 ℃에서 3분 동안의 개시 단계, (ii) 이어지는 94 ℃ 30초, 57 ℃ 30초 및 72 ℃ 1분의 30 주기, 및 (iii) 72 ℃에서 7분 동안의 최종 연장 단계로 구성하였다. 340 bp 내지 420 bp 사이 범위이며 중쇄 항체의 VHH 단편에 상응하는 증폭된 PCR 생성물을 키아퀵 PCR 정제 키트 (키아젠 사)를 사용하여 정제한 후, SfiI 제한 효소 (뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England BioLabs) 사)로 분해하고, 동일한 키트를 사용하여 재-정제하였다.
80 ㎍의 pMED1 파지미드 벡터 (문헌 [Arbabi-Ghahroudi et al, 2009b])를 SfiI를 사용하여 50 ℃에서 밤새 분해하였다. 자가-결찰을 최소화하기 위하여, 20 단위의 XhoI 및 PstI 제한 효소를 첨가함으로써, 절제된 단편을 절단하고, 분해 반응물을 37 ℃에서 추가 2시간 동안 인큐베이팅하였다. 리가패스트(LigaFast) 급속 DNA 결찰 시스템 (프로메가(Promega) 사)을 사용하여 제조자의 지침에 따라 실온에서 3시간 동안 60 ㎍의 분해된 파지미드 DNA를 6 ㎍의 분해된 (50 ℃에서 5시간 동안 SfiI) VHH 단편과 (몰비 1:1) 결찰시켰다. 키아퀵 PCR 정제 키트 (키아젠 사)를 사용하여 결찰된 플라스미드를 정제하고, 100 μl의 최종 부피로 용리한 후, 기술된 바와 같이 (문헌 [Arbabi-Ghahroudi et al, 2009b]) 형질전환 반응 당 5 μl의 결찰된 DNA 분취량을 사용하여 전기적격(electrocompetent) TG1 이 . 콜리 (E. coli ) (스트라타진(Stratagene) 사)에 형질전환시켰다. 문헌 [Arbabi-Ghahroudi et al, 2009b]에 기술되어 있는 바와 같이, 라이브러리의 크기는 5×107개인 것으로 측정되었다. 20개의 클론을 서열분석하였는데, 모든 고유한 VHH 서열들을 포함하였다. 라이브러리를 포함하는 이. 콜리를 2 % (w/v) 글루코스의 존재하에 37 ℃, 250 rpm으로 2-3시간 동안 성장시켰다. 다음에, 세균을 펠렛화하고, 35 % (v/v) 글리세롤을 사용하여 2×YT/Amp/Glu (100 ㎍/ml의 암피실린 및 2 % (w/v) 글루코스를 포함하는 2×YT 배지)에 재현탁한 후, 소량 분취량으로 -80 ℃에서 저장하였다.
패닝 실험은 본질적으로 문헌 [Arbabi et al, 1997]에 기술되어 있는 바와 같이 수행하였다. 2 밀리리터의 라이브러리 (2.0×1010개의 세균)를 얼음상에서 해동하고, 37 ℃로 약 2시간 동안 2×YT/Amp/Glu에서 성장시켰다 (A600 = 0.4-0.5). 이후 20× 과량의 M13KO7 헬퍼 파지 (뉴 잉글랜드 바이오랩스 사)를 사용하여 37 ℃로 1시간 동안 이 . 콜리를 감염시켰다. 다음에, 배양물을 4 ℃에서 원심분리하고, 감염된 세균 펠렛을 50 ㎍/ml의 카나마이신을 포함하는 200 ml의 2×YT/Amp에 재-현탁한 후, 37 ℃ 및 250 rpm에서 인큐베이팅하였다. 얼음상에서 1/5 부피의 20 % PEG 8000/2.5 M NaCl을 사용하여 1시간 동안 배양 상청액 중 파지 입자를 인큐베이팅한 후, 10,000 rpm으로 15분 동안 원심분리하였다. 파지 펠렛을 1.5 ml의 멸균 PBS에 재-현탁한 후, 적정하여, 패닝용 투입 파지로 사용하였다. 패닝 라운드 1을 위하여, 4 ℃에서 밤새, 100 μl의 PBS 중에서 웰 당 10 ㎍의 재조합 IGF1R933-His로 96-웰 막시소르프™ 플레이트를 코팅하였다. 웰을 PBS로 세정하고, PBS 더하기 1 % (w/v) 카세인을 사용하여 37 ℃로 2시간 동안 블로킹하였다. 대략 1012개 파지를 블로킹된 웰에 첨가하고, 37 ℃에서 2시간 동안 인큐베이팅하였다. PBS/0.1 % (v/v) 트윈 20을 사용한 10× 세척 후, 0.1 M 트리에틸아민을 사용하여 결합된 파지를 용리하고, 중화한 후 (50 μl의 1 M 트리스(Tris)-HCl, pH 7.4), 지수 성장하는 TG1 이 . 콜리와 혼합하였다. 용리된 파지의 적정을 수행하고, 감염된 세균을 M13K07로 중복감염시킨 후, 37 ℃에서 밤새 성장시켰다. 밤샘 배양으로부터의 정제된 파지를 다음 패닝 라운드용 투입물로 사용하였다. 3회의 추가 라운드 동안 패닝을 계속하였다. 플레이트를 코팅하는 데에 사용된 재조합 항원의 양이 제2, 제3 및 제4 패닝 라운드에서 각각 7 ㎍, 5 ㎍ 및 5 ㎍으로 감소되었다는 것 이외에는, 상기한 바와 동일한 프로토콜을 사용하였다.
미량역가 플레이트를 코팅하는 데에 5 ㎍/ml의 IGF1R933-His 재조합 항원을 사용하였다는 것 이외에는 본질적으로 다른 곳에서 기술된 바와 같이 (문헌 [Doyle et al, 2008]), 제4 패닝 라운드 후 수득된 개별 TG1 콜로니들을 파지 ELISA 스크리닝에 적용하였다. 모든 양성 클론들을 DNA 서열분석용으로 전송하였다. 높은 파지 ELISA 신호를 나타낸 고유 클론들을 공지의 방법 (실시예 4 참조)을 사용한 대-규모 발현 및 정제용으로 선택하였다. IGF1R-4로 지정된 클론을 추가 연구용으로 식별하였는데; 그 서열을 하기에 나타낸다:
Figure 112016095163814-pct00028
실시예 4: IGF1R -4의 인간화
치료제의 BBB 운반체로 적용하였을 때의 라마-유래 IGF1R-4의 잠재적 면역원성을 회피하기 위하여, VHH 중 "낙타류" 잔기들의 돌연변이에 의해 낙타류-유래 sdAb를 "인간화"하였다. 인간화의 목적상, CDR 잔기들의 식별에는 카바트(Kabat) 번호지정 (문헌 [Kabat et al, 1991])을 사용하였다는 것에 유의해야 한다.
낙타류 V H H의 3D-구조 모델링. 단백질 데이터 뱅크(Protein Data Bank) (PDB)에 대한 블라스트 서치를 사용하여, IGF1R-4 VHH와 유사한 주형 구조를 식별하였다. IGF1R-4의 3D 구조는 4FHB｜D로부터의 추가 정보와 함께 주 주형으로서의 4KRP｜B (PDB 코드｜사슬 ID)를 바탕으로 하는 상동성 모델링을 사용하여 개산하였다. 다음에, 주 주형 구조를 IGF1R-4 서열로 돌연변이시킴으로써, IGF1R-4 VHH 구조를 구축하였는데; 여기에는 다양한 위치에서의 35개 돌연변이가 포함되었다. 다음에, 앰버 역장(AMBER force-field), 및 먼저 이완되는 CDR 루프로부터 마지막 단계에서만 완전히 이완되는 프레임워크 영역의 백본 중질 원자까지 범위의 단계적 제약 해제를 사용하는 에너지 최소화에 의해, IGF1R-4 VHH 모델을 세부화하였다. 다음에, CDR-H3 영역의 이면체 각도를 샘플링한 후 에너지 최소화가 이어지는 몬테-카를로-최소화(Monte-Carlo-minimization) (MCM) 입체형태 샘플링에 의해, VHH 모델의 CDR-H3 루프를 세부화하였다.
낙타류 CDR용 인간 중쇄 프레임워크의 선택. 인간 생식선 데이터베이트 (VBASE), 다른 서열 데이터베이스 (진뱅크(Genbank) 및 스위스프로트(SwissProt)), 및 인간 프레임워크 공통 서열에 대한 표준 서열 상동성 비교에 의해, 인간 중쇄 프레임워크를 선택하였다. 블라스트 서치를 수행함으로써, CDR의 길이를 일치시키면서 프레임워크 영역에서만 (즉 CDR 배제) 최고 상동성을 가지는 서열 일치를 탐색하였다. IGF1R-4 VHH에 대하여 식별된 가장 가까운 인간 프레임워크는 인간 VH-3 하위군에 해당하였다. 인간 VH-3 공통 서열 이외에, IGF1R-4 VHH와 가장 유사하였던 몇 가지 인간 생식선 VH-3 프레임워크 서열도 유지하였다. 100 % 프레임워크 인간화를 위한 공통 인간 VH-3 서열에 도달하기 위하여, IGF1R-4 VHH 프레임워크 서열은 18개의 돌연변이를 필요로 하였다.
역-돌연변이용 프레임워크 잔기의 식별. 인간성 지수, 항원 접촉 경향 지수를 평가하고 CDR, 정준 잔기, 비정상 프레임워크 잔기, 잠재적 글리코실화 부위, 매립 잔기, 베르니어(Vernier) 구역 잔기, 및 CDR에 대한 근접도를 기술하기 위하여, IGF1R-4 VHH 모델 및 그의 완전-인간화 상대물을 특성화하였다. 이들 데이터의 분석은 각 변이가 다양한 위치에서의 모 낙타류 잔기로의 가변적인 수의 역-돌연변이를 가지는 항-IGF1R VHH의 몇 가지 인간화된 변이에 대한 설계를 제안하였다. IGF1R-4 VHH에 대한 6종의 인간화 변이들이 설계되었는데 (IGF1R-4_H1 내지 IGF1R-4_H6), 변이들은 10개까지의 역-돌연변이를 포함하였다. 이러한 낙타류 역-돌연변이 잔기들 중 일부는 VHH 도메인 코어 내부에 매립되어 있으며, 그에 따라 면역 반응을 유도할 것으로 예상되지 않는다.
실시예 5: 선택된 V H H 구축물의 발현 및 정제
단백질 발현 및 정제를 위하여, 실시예 3에서 식별된 IGF1R-4 및 실시예 4에서 구성된 인간화 버전 (본원에서는 집합적으로 "VHH 구축물"로 지칭됨)을 발현 플라스미드로 서브-클로닝하였다.
미니프렙 키트 (키아젠 사)를 사용하여, VHH IGF1R-4 클론의 DNA를 포함하는 파지미드 벡터를 정제하였다. pMED1 파지미드 벡터로부터 IGF1R-결합 VHH IGF1R-4를 PCR 증폭하고, 하기의 프라이머를 사용하여 N-말단 BbsI 절단 부위 및 C-말단 BamHI 절단 부위를 첨가하였다:
Figure 112016095163814-pct00029
(정방향: 서열식별번호: 23)
Figure 112016095163814-pct00030
(역방향: 서열식별번호: 24)
PCR 단편 및 pSJF2H 발현 벡터를 BbsI 및 BamHI 제한 효소 (NEB 사)를 사용하여 제조자의 지침에 따라 분해하였다. 분해 후, 문헌 [Arbabi-Ghahroudi et al. (2009b)]에 기술되어 있는 것과 유사한 방법을 사용하여, 각 분해된 IGF1R-4 VHH 단편을 분해된 pSJF2H 발현 벡터에 결찰시킨 다음; 결찰 생성물을 전기-적격 TG1 이 . 콜리로 형질전환시켰다. LB 아가 플레이트 + 100 ㎍/ml 암피실린에서 클론들을 선택하고, DNA 서열분석에 의해 확인하였다.
상기와 유사하게 인간화된 클론들을 합성하고 바로 pSJF2H로 클로닝한 후, 이어서 이. 콜리 TG1으로 형질전환시키고, 상기한 바와 같이 선택하였다.
단백질 발현. 모든 IGF1R-4 VHH 구축물은 TG1 이 . 콜리에서 발현시켰다. LB/amp/glu 배지 (100 ㎍/ml의 암피실린 및 1 % 글루코스가 보충된 LB 배지)에서의 밤샘 배양물을 1 L의 LB/amp/glu에서 1:100 희석으로 하위배양하였다. 0.8-0.9의 OD600에서 최종 농도 0.2 mM로의 IPTG의 첨가에 의해 단백질 발현을 유도하였다. 배양물을 37 ℃에서 220 rpm으로 밤새 성장시켰다. 6000 rpm에서 12분 동안 원심분리하는 것에 의해 세균을 펠렛화하고; 펠렛을 35 ml의 저온 TES 완충제 (0.2 M 트리스-Cl pH 8.0, 20 % 수크로스, 0.5 mM EDTA)에 재-현탁하였다. 현탁액을 얼음상에서 인큐베이팅하면서, 1시간 동안 10분마다 보르텍싱하였다. 다음에, 45 ml의 저온 TES (총 부피의 1/8 부피)를 첨가하고, 즉시 1분 및 이후 1시간 동안 10분마다 15초 동안 보르텍싱함으로써, 주변세포질로부터 단백질을 추출하였다. VHH를 함유하는 생성 상청액을 0.22 ㎛ 막을 통하여 여과하고, 고정된 금속-친화성 크로마토그래피 (IMAC) 완충제 A (10 mM 헤페스(HEPES) pH 7.0, 500 mM NaCl)로 밤새 투석하였다. 이전에 기술된 바와 같이 (문헌 [Arbabi-Ghahroudi 2009b]), 하이트랩(HiTrap) 킬레이팅 HP 컬럼 (GE 헬스케어 사)을 사용하여 단백질을 정제하였다. 용리된 단백질 분획들을 SDS-PAGE 및 웨스턴 블러팅에 의해 분석한 후, 이전에 기술된 바와 같이 (문헌 [Arbabi-Ghahroudi 2009b]) PBS에 대하여 투석하였다. 정제된 단백질 분획들을 혼합수집하고, PBS + 3 mM EDTA에 대하여 투석한 후, 단백질 농도를 측정하였다.
실시예 6: 항- IGF1R V H H IGF1R -4의 생물물리학적 특성화
실시예 4에서 발현 및 정제된 항-IGF1R VHH IGF1R-4 구축물을 크기 배제 크로마토그래피, 융점 분석 및 표면 플라스몬 공명을 사용하여 특성화하였다.
크기 배제 크로마토그래피: 표면 플라스몬 공명 (SPR) 분석 전에, 수퍼덱스(Superdex)™ 75 (GE 헬스케어 사)를 사용하는 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 임의의 있을 수 있는 응집체를 제거하였다. 사용된 전개 완충제는 150 mM NaCl, 3 mM EDTA 및 0.005 % P20를 함유하는 10 mM 헤페스, pH 7.4이었다. SPR 분석에 사용된 분획들의 농도는 280 nm 파장에서의 흡광도를 측정하는 것에 의해 측정하였다. SEC 분석은 H1을 제외한 모든 IGF1R-4 VHH 구축물이 표준과 비교한 용리 부피로 볼 때 단량체성이라는 것을 암시하였다 (도 3a). 따라서, IGF1R-4 H1은 추가 평가에서 배제하였다.
융점: CD 분광법에 의한 융점 (Tm) 측정을 사용하여, IGF1R-4 VHH 및 인간화 구축물의 열적 안정성을 평가하였다. 펠티에르(Peltier) 열전 유형 온도 조절 시스템이 장착된 자스코(Jasco) J-815 분광편광측정기 (자스코 사, 미국 메릴랜드 이스턴 소재)를 사용하여 실험을 수행하였다. 1 mm의 경로 길이를 가지는 CD 큐벳을 사용하였다. 50 nm/분의 스캐닝 속도, 4초의 디지털 통합 시간 (DIT), 1 nm의 밴드 폭, 1 nm의 데이터 핏치(pitch) 및 1초의 통합 시간으로, 180-260 nm의 파장 범위에 걸쳐 스펙트럼을 기록하였다. 융점 또는 Tm을 측정하기 위하여 (문헌 [Greenfield, 2006a; 2006b]), 30 ℃ 내지 96 ℃의 온도 범위에 걸쳐 CD 스펙트럼을 기록하였다. 모든 CD 스펙트럼을 완충제 스펙트럼에 상응하는 바탕으로부터 차감하였다. 100 mM 나트륨 포스페이트 완충제 pH 7.4 중 50 ㎍/mL VHH의 농도로 측정을 수행하였다. 모든 변이에 대하여 210 nm에서 열-유도 단백질 변성을 모니터링하였다. 기술된 바와 같은 (문헌 [Greenfield, 2006a; 2006b]) 수학식에 의해 접힌 분율(fraction folded) (ff)을 수득하였다:
<수학식 I>
Figure 112016095163814-pct00031
(식 중, [θ]T는 임의 온도에서의 몰 타원율(molar ellipticity)이며, [θ]F는 30 ℃에서의 완전히 접힌 단백질의 몰 타원율이고, [θ]U는 90 ℃에서의 접힘해제된 단백질의 몰 타원율임). 융점 (Tm)은 그래프화 소프트웨어인 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) (윈도우용 버전 4.02)을 사용하여, 비선형 회귀 곡선 피팅 (볼츠만(Boltzman) S자 방정식)에 의해, 접힘해제 곡선 (접힌 분율 (ff) 대 온도)의 중앙점으로 수득하였다. VHH의 융점 (Tm)은 변성으로의 급격한 전이에 해당하는 관찰된 변성 곡선과 일치하는 2-상태 시스템을 가정한 타원율 데이터를 바탕으로 측정하였다. Tm 값은 접힌 분율 (ff) 대 온도의 S자형 변성 곡선의 중앙점에서 취하였다.
결과는 도 3b에 나타내었다. 인간화된 VHH인 H3, H4 및 H5의 융점이 IGF1R-4 VHH에 비해 개선 (더 높아짐)됨으로써, 개선된 생물물리학적 특성을 암시하였다. 인간화된 구축물 H2 및 H6는 IGF1R-4 VHH에 비해 저조한 융점을 가졌다. IGF1R-4 VHH와 달리, 인간화된 VHH들 중 어느 것도 열 노출 후 재접힘되지 않았다.
표면 플라스몬 공명 (SPR): 비아코어(BIACORE) 3000 (GE 헬스케어 사)을 사용하는 SPR에 의해, 고정된 재조합 인간 IGF1R (실시예 1)에 대한 단량체성 IGF1R-4 VHH 구축물의 결합을 측정하였다. 대략 3000 공명 단위 (RU)의 재조합 인간 IGF1R을 센서 칩 CM5상에 고정하였다. 고정은 제조자에 의해 공급되는 아민 커플링 키트를 사용하여 pH 4.0에서 10 mM 아세테이트 중 10 ㎍/ml의 농도로 수행하였다. 나머지 결합 부위는 1 M 에탄올아민 pH 8.5를 사용하여 블로킹하였다. 에탄올아민 블로킹된 표면은 참조 표면으로 사용하였다. 결합 연구를 위하여, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA 및 0.005 % 계면활성제 P20 (폴리옥시에틸렌소르비탄; GE 헬스케어 사)을 함유하는 10 mM 헤페스 pH 7.4에서 25 ℃로 분석을 수행하였다. 다양한 농도의 IGF1R-4 VHH를 20 μl/분의 유량으로 고정된 인간 IGF1R 및 참조 표면상에 주사하였다. 24초의 접촉 시간으로 10 mM 글리신 pH 2.0을 사용하여 표면을 재생시켰다. 비아이밸류에이션(BIAevaluation) 4.1 소프트웨어 (GE 헬스케어 사)를 사용하여 데이터를 분석하였다. 도 3c의 센소그램은 하기 표 1에 나타낸 KD 및 '오프-레이트(off-rate)'를 제공하는 1:1 모델과 데이터가 잘 맞는다는 것을 보여준다. 이는 IGF1R-4 및 인간화 변이가 인간 IGF1R의 세포외 도메인에 결합하는 고도-친화성 단일-도메인 항체라는 것을 나타낸다.
<표 1>
표 1. 표면 플라스몬 공명에 의해 측정하였을 때의 인간 IGF1R에 대한 IGF1R-4 구축물의 친화성
Figure 112016095163814-pct00032
SPR 분석을 추가적으로 사용하여 IGF1R-4 VHH가 자연 리간드 IGF-1와 동일한 수용체상 항원결정인자에 결합하지 않는다는 것을 입증하였다 (도 3d). 상기한 바와 같이 실험을 구성, 수행 및 분석하였다. 모두 농도 25×KD, 유량 20 μl/분 및 주사 시간 5분에서의 25×KD 농도에서의 인간 IGF1 리간드의 주사 후 이어지는 IGF1R-4의 공동-주사에 의해, 새로 고정된 인간 IGF1R 표면에 대한 결합을 연구하였다. 전개 완충제를 사용하여 세척하는 것에 의해 표면을 재생시켰다. 자연 리간드 IGF-1은 70 RU에서 포화에 도달하도록 수용체에 결합하였으며; IGF1R-4 VHH는 예상되었던 ~265 RU (상대적 단위; 결합 포화)로 IGF1R-IGF-1 복합체에 결합하였다. 수용체에 대한 IGF1R-4 VHH와 IGF-1 양자의 동시 결합은 양자가 서로 다른 항원결정인자에 결합한다는 것을 입증한다.
SPR을 사용하여, 인간 인슐린 수용체에 결합하는 IGF1R-4의 교차-반응성도 평가하였다. 상기한 바와 같이 실험을 구성, 수행 및 분석하였다. 간단하게 말하자면, 인간 IGF1R 이외에, 대략 4000 공명 단위 (RU)의 재조합 인간 인슐린 수용체 (R&D 시스템즈(Systems) 사)를 센서 칩 CM5의 별도의 셀상에 고정하였다. 이어서, 상이한 농도의 IGF1R-4를 표면상으로 유동시켰다 (0.5-50 nM). IGF1R에 대한 결합은 0.5 nM IGF1R-4에서 벌써 관찰될 수 있었던 반면, 50 nM에서도 인슐린 수용체 표면에 대한 결합은 관찰되지 않음으로써 (도 3e), IGF1R-5가 인슐린 수용체에 결합할 수 없다는 것을 암시하였다.
실시예 7: 뇌 내피 세포에 의한 IGF1R -4의 내재화
IGF1R-4가 세포로 내재화되는지 여부를 측정하기 위하여, svARBEC 세포를 Cy5-5-표지된 IGF1R-4와 함께 인큐베이팅하였다.
IGF1R-4 VHH를 NHS-Cy5.5로 표지하였다. 표지는 일차 아민 (단백질 N-말단 및/또는 리신 측쇄 상의 것)과 NHS 에스테르 사이의 안정한 아민 결합을 통하여 수행하였다. 통상적으로, 10 % v/v의 1 M 카르보네이트/비카르보네이트 완충제 (759 mM 비카르보네이트, 258 mM 카르보네이트) pH 9.3을 PBS (1.06 mM KH2PO4, 154 mM NaCl, 5.6 mM Na2HPO4) pH 7.4 중에 제조된 4 mg의 VHH에 첨가하고, 4 mg/mL의 최종 농도로 조정하였다. 10 mg/mL로 DMSO에 용해된 NHS-Cy5.5를 2×의 염료 대 단백질 몰비로 첨가하였다. 1.5 mL 미세원심분리 튜브에서 몇 가지 버전과 함께, 혼합물을 실온으로 2시간 동안 인큐베이팅하였다. 인큐베이션 후, 제바 스핀(Zeba Spin) 탈염 컬럼 7K MWCO (피어스(Pierce) 사)를 사용하여 비결합 염료 및 반응 부산물을 여과하고, 베크만(Beckman) DU530 분광광도측정기 (베크만 쿨터(Beckman Coulter) 사)를 사용하여 측정하였다. Cy5.5-표지된 IGF1R-4 또는 양성 대조로서의 FC5 (1 mg/ml)를 4 ℃ (도 4, 상부 패널)에서 SV40 무한증식 래트 뇌 내피 세포 (svARBEC)과 함께 인큐베이팅함으로써, 수동적인 비-특이적 수송 기작만이 이루어지는 것을 가능케 하거나, 또는 37 ℃에서는 (도 4, 저부 패널) 수용체 매개 세포내이입과 같은 능동 수송이 이루어지는 것을 가능케 하였다. 맥아 아글루티닌 및 DAPI를 사용한 공동-염색을 수행하여 각각 세포 표면 및 핵을 가시화하였다. 형광 현미경하에서 세포를 관찰하고, 영상을 포착하였다.
4 ℃에서 인큐베이팅한 경우, IGF1R-4는 맥아 아글루티닌으로 염색된 세포 막과 공동-위치지정되는 세포 외부에서 발견되었다. 반면, 37 ℃에서 인큐베이팅한 경우, IGF1R-4는 엔도좀과 같은 세포 내부의 소포에 축적됨으로써, 항체가 능동 수송 기작을 통하여 세포로 내재화되었음을 암시하였다. 이미 클라트린-코팅된 소포를 통한 에너지-의존성 세포내이입에 의해 세포에 진입하는 것으로 나타난 (문헌 [Abulrob et al. 2005]) FC5에 대해서도 유사한 거동이 관찰되었다.
실시예 8: IGF1R -4-mFc 구축물의 제조
뮤린 항체 결정화가능 단편 (Fc; mFc2b)에 융합된 IGF1R-4 VHH을 포함하는 구축물을 제조, 발현 및 단리하였다. IGF1R-4-mFc 구축물의 서열을 도 5a에 나타내었으며, 분자의 개략도를 도 5b에 나타내었다. 융합 단백질은 도 5a의 서열에는 나타나 있지 않은 N-말단 신호 펩티드 (
Figure 112016095163814-pct00033
서열식별번호: 37)도 포함하였다.
IGF1R-4 cDNA를 마우스 Fc2b 단편을 포함하는 포유동물 발현 벡터 pTT5 (문헌 [Durocher, 2002])로 클로닝하였다. 모두 F17 배지 중에서 제조된 187.5 ㎍ pTT5-IR5mFc2b, 56.25 ㎍ pTT-AKTdd (단백질 키나제 B의 활성화된 돌연변이), 18.75 ㎍ pTTo-GFP (형질감염 효율을 모니터링하기 위함) 및 112.5 ㎍의 연어 고환 DNA (시그마-알드리치 사)를 함유하는 플라스미드 DNA 용액 25 ml와 1.125 mg의 PEIproTM을 함유하는 PEI 용액 (폴리플러스 트랜스펙션(PolyPlus Transfection)) 25 ml를 혼합함으로써, 생성 벡터의 다중체를 예비-형성시켰다. 상기 혼합물을 세포 배양물에의 첨가 전에 10분 동안 인큐베이팅하였다. 감축된 EBNA1 단백질 (CHO-3E7)을 안정하게 발현하며 F17 배지 (인비트로겐 사)에서 성장시킨 450 ml의 CHO 세포 배양물을 50 ml의 다중체로 형질감염시켰다. 형질감염 24시간 후, 배양물에 12.5 ml의 40 % (w/v) 트립톤 N1 (오르가노테크니(Organotechnie)) 용액 및 1.25 ml의 200 mM 발프로산 용액을 공급하였다. 형질감염 8일 후 배양물을 수확하고, 원심분리에 의해 투명화하였다. 0.22 ㎛ 막을 통하여 투명화된 배지를 여과한 후, 5 ml의 단백질-A 마브셀렉트 수레(MabSelect SuRe) 수지 (GE 헬스케어 사)가 충전된 컬럼에 그것을 적용하였다. 적재 후, 컬럼을 5 부피의 포스페이트-완충된 식염수 pH 7.1 (PBS)로 세척하고, 100 mM 나트륨 시트레이트 완충제 pH 3.0을 사용하여 항체를 용리하였다. 용리된 항체를 함유하는 분획들을 혼합수집하고, PBS 중에서 평형화된 탈염 이코노-팩(Econo-Pac) 컬럼 (바이오래드(BioRad) 사)에 적재하는 것에 의해 완충제 교환을 수행하였다. 다음에, 밀렉스(Millex) GP (밀리포어 사) 필터 단위 (0.22 ㎛)를 통과시킴으로써, 탈염된 항체를 멸균-여과하고, 분취하였다.
실시예 9: 시험관내 혈액 뇌 장벽 모델을 횡단하는 IGF1R -4의 수송
IGF1R-4 VHH, 그의 인간화된 버전 (H2 내지 H6) 및 IGF1R-4-mFc (실시예 8)가 혈액-뇌 장벽을 횡단이동하는지 여부를 평가하기 위하여, 하기하는 바와 같이 시험관내 검정을 사용하였다. 실험을 요약하는 흐름도를 도 6a에 나타내었다.
SV40-무한증식 성체 래트 뇌 내피 세포 (Sv-ARBEC)를 사용하여, 기술된 바와 같은 (문헌 [Garberg et al., 2005]; [Haqqani et al., 2012]) 시험관내 혈액-뇌 장벽 (BBB) 모델을 생성시켰다. 성장 배지 1 ml 중 0.1 mg/mL의 래트 꼬리 콜라겐 유형 I-코팅된 조직 배양 삽입물 (세공 크기 - 1 ㎛; 표면적 0.9 cm2, 팔콘(Falcon) 사)상에 Sv-ARBEC (80,000개 세포/막)을 접종하였다. 삽입물 조립체의 저부 챔버는 1:1 (v/v) 비로 무한증식 신생아 래트 별아교세포-컨디셔닝된 배지가 보충된 2 ml의 성장 배지를 포함하였다. 등몰량 (5.6 μM)의 양성 (FC5) 또는 음성 대조 (클로스트리듐 디피실레 (Clostridium difficile ) 독소 A 결합 VHH인 A20.1; 및 EGFR 결합 VHH인 EG2), IGF1R-4 VHH, 인간화 버전 (H2-H6) 또는 IGF1R-4-mFc를 이와 같은 래트 시험관내 BBB 모델을 횡단하는 그의 능력에 대하여 시험하였다. BBB 내강 측에 대한 등몰량 sdAb의 노출에 이어, 15, 30분 및 60분 후에 내강외 측으로부터 샘플을 취하였다. 다음에, 문헌 [Haqqani et al.(2012)]에 기술되어 있는 바와 같이 질량 분광측정법 (다중 반응 모니터링 - 동형 표지된 내부 표준; MRM-ILIS)에 의해 각 샘플의 sdAb 함량을 정량하였다 (하기의 방법 설명 참조).
겉보기 투과도 계수의 측정: 정량 값은 직접적으로 플롯팅될 수 있거나, 또는 주어진 수학식 (도 6a)을 사용하여 Papp (겉보기 투과도 계수) 값이 결정된 후, 플로팅될 수 있다. Papp 값은 보통 BBB를 횡단하는 분자의 능력을 측정하는 데에 사용된다 [Qr/dt = 수용기 구획에서의 누적 양 대 시간; A = 세포 단층의 면적; C0 = 투여 용액의 개시 농도]. Papp 값은 뇌 내피 단층을 횡단하는 화합물 고유 투과도의 척도이다.
결과는 도 6b-d에 나타내었다. 제시된 결과는 수회의 개별 실험으로부터 수득된 평균 Papp 값이다. 양 음성 대조는 매우 낮은 Papp 값을 가짐으로써, BBB 모델을 횡단하는 이러한 VHH의 비-특이적 수송 또는 세포주위 수송이 최소한이라는 것을 나타내고 있다. IGF1R-4 VHH는 높은 Papp 값을 가짐으로써, 시험관내 BBB 모델을 횡단하는 높은 수송 속도를 나타낸다. IGF1R-4 VHH의 Papp는 양성 대조 - BBB-투과성 VHH FC5 (WO 02/057445호) -의 것에 비해 4-배 더 높다. 상기 결과는 IGF1R-4가 시험관 내에서 뇌 내피 세포를 횡단하는 촉진되는 세포-횡단 수송을 겪으며, 생체 내에서 유사한 특성을 가질 수 있음에 대한 강한 암시를 제공한다. 인간화된 IGF1R-4 VHH 변이 H3, H4 및 H5는 IGF1R-4 VHH와 유사하거나 (H3) 그에 비해 약간 더 낮은 Papp 값을 나타내었으며; H2 변이는 상당히 약화된 시험관내 BBB 모델 횡단 능력을 나타낸 반면, H6 변이는 내부 대조 VHH인 A20.1와 동일한 Papp 값을 나타냄으로써 (도 6c) 이와 같은 능력을 완전히 상실하였으므로, 추가 연구에서 배제하였다. IGF1R-4mFc의 Papp 값 (도 6d)은 6배 더 적은 IGF1R-4 VHH의 것과 유사해서 (도 6b), IGF1R-4가 BBB를 횡단하여 대형 (항체-크기) 분자를 '운반'할 수 있음을 표시하였다. 양성 대조인 FC5mFc의 Papp 값은 IGF1R-4mFc의 것에 비해 3-배 더 낮았다. 적재물 분자에 연결된 IGF1R-5 또는 인간화된 버전을 포함하는 구축물 (MW ~110 kDa 또는 180 kDa) 역시 BBB를 횡단하여 운반된 것으로 나타났음에 주목할만한 가치가 있다 (데이터 미도시).
또 다른 IGF1R-결합 VHH인 IGF1R-1도 이와 같은 검정에서 mFc 융합체로서 시험하였다. IGF1R-1mFc는 대조인 A20.1 VHH에 비해 약간만 더 높은 Papp 값을 가짐으로써 (도 6d), 면역 라마 라이브러리로부터 단리된 IGF1R-결합 VHH들의 하위세트만이 BBB-횡단이동 특성을 가진다는 것을 표시하였다.
MRM - ILIS 방법을 사용한 V H H의 절대 정량. 방법은 모두 문헌 [Haqqani et al. (2012)]에 기술되어 있는 바와 같다. 간단하게 말하자면, VHH에 대한 SRM (다중 반응 모니터링 (MRM)으로도 알려져 있는 선택된 반응 모니터링) 검정을 개발하기 위하여, 데이터-의존성 획득을 사용하는 나노LC-MS/MS에 의해 먼저 각 VHH를 분석함으로써, 모든 이온화가능 펩티드들을 식별하였다. 각 펩티드에 대하여, 3 내지 5개의 가장 강한 단편 이온을 선택하였다. 아토몰 분해량 (약 100-300 amol)으로 이러한 단편들을 모니터링하는 개시 SRM 검정을 개발하였다. 적은 양에서 재현가능한 강도 비를 나타내는 단편 (즉 더 많은 양에 비해 ≥0.95인 피어슨(Pearson) r2를 가짐)을 안정한 것으로 간주하고, 최종 SRM 검정용으로 선택하였다. 검정을 추가적으로 최적화하기 위하여, 각 펩티드의 용리 시간도 포함시켰는데, 가까운 m/z (질량-대-전하 비) 및 용리 시간을 가지는 펩티드는 선택하지 않도록 신중을 기하였다.
세포 배지 또는 체액 (혈청 또는 뇌척수액 (CSF))에서의 VHH의 통상적인 다중화된 SRM 분석은 알려져 있는 양의 ILIS (0.1-10 nM)를 첨가한 후, 이어서 100-400 ng의 CSF 또는 배양된 배지 단백질 (0.3-1 μL) 또는 약 50-100 ng의 혈청 단백질 (1-3 나노리터)을 나노LC-MS 시스템에 주사하는 것을 포함한다. 이온 트랩 (및 나머지 비관련 이온은 폐기하였음)에서 표적의 특정 용리 시간으로 각 표적 펩티드 이온의 전구체 m/z을 선택한 후, 이어서 충돌 유도 해리 (CID) 단편화, 및 검출자에 의한 모니터링을 위한 이온 트랩에서의 원하는 단편 이온만의 선택을 수행하였다. 정량 분석을 위하여, LTQ (서모피셔(ThermoFisher) 사)에 의해 생성된 미가공 파일을 표준 질량 분광측정법 데이터 체재 mzXML로 전환한 후, 매치(Match)Rx 소프트웨어의 변형된 버전인 Q-MRM (정량-MRM; 문헌 [Haqqani et al. 2012] 참조)로 지칭되는 사내 소프트웨어를 사용하여 강도를 추출하였다. 각 VHH에 대하여, 전체 용리 시간에 걸친 0.25 Da의 단편 m/z 내의 합쳐진 강도들로 구성되는 추출-이온 크로마토그램을 그의 단편 이온 각각에 대하여 생성시켰다. 각 단편의 최종 강도 값을 수득하기 위하여, 예상 체류 시간 0.5분 이내의 모든 강도들을 합계하였다. 해당 펩티드들 중 하나 이상의 단편이 예상 강도 비를 나타낸 경우, 즉 최종 강도 값이 그의 상응하는 순수 VHH의 최종 강도 값과 비교하였을 때 r ≥ 0.95 및 p < 0.05의 강한 피어슨 상관을 나타내었을 때, VHH를 샘플 중에서 검출가능한 것으로 정의하였다.
VHH의 혼합물을 함유하는 샘플 (배지, 혈청, CSF)을 이전에 기술된 바와 같이 (문헌 [Haqqani et al., 2012]; [Gergov et al., 2003]) 환원, 알킬화 및 트립신-분해시켰다. 아세트산 (5 % 최종 농도)을 사용하여 분해물 (트립신분해 펩티드)을 산성화하고, LTQ XL ETD 또는 LTQ 오비트랩(Orbitrap) ETD 질량 분광측정기 (서모피셔 사, 매사추세츠 왈탐 소재)에 커플링된 역-상 나노액퀴티(nanoAcquity) UPLC (워터스(Waters) 사, 매사추세츠 밀포드 소재)에서 분석하였다. 300 ㎛ I.D. × 0.5 mm 3 ㎛ PepMaps C18 트랩 (서모피셔 사)에 원하는 분취량의 샘플을 주사하여 적재한 다음, 400 nL/분의 유량으로 1분 이내의 0 %-20 % 아세토니트릴 (0.1 % 포름산 중), 16분 이내의 20 %-46 %, 및 1분 이내의 46 %-95 % 구배를 사용하여, 100 ㎛ I.D. × 10 cm 1.7 ㎛ BEH130C18 나노LC 컬럼 (워터스 사)로 용리하였다. 펩티드 이온의 단편화를 위한 CID를 사용한 MS/MS 및 SRM 분석을 위하여, 전기분무 이온화 (ESI)에 의해 질량 분광측정기로 용리된 펩티드를 이온화하였다. CID는 35 %의 표준화된 충돌 에너지 및 30 ms의 활성화 시간으로 충돌 기체로서의 헬륨을 사용하여 수행하였다. 선형 이온 트랩으로의 이온 주사 시간은 6×103의 자동 이득 조절 (AGC) 표적 값 및 200 ms의 최대 축적 시간을 사용하는 기기에 의해 조정하였다.
다중화 검정에서의 각 VHH의 검출 및 정량에 사용된 VHH - 특정 펩티드를 하기 표 2에 나타내었다.
<표 2>
표 2. FC5, FC5-ILIS, EG2, A20.1, IGF-1R-5 및 알부민의 나노LC-SRM 검출에 사용된 펩티드. (a) 기술되는 다양한 연구에서는, 동일 샘플에서의 동시 모니터링을 위한 상이한 조합으로 검정을 다중화하였음; (b) 중질-표지 펩티드; (c) 1.5-2.5 ng/ml의 범위인 각 펩티드에 있어서의 SRM 검정의 검출 및 정량의 한계. 1 ng/mL는 VHH 약 60-70 pM에 해당함. A20.1은 문헌 [Hussack et al, 2011b]에 기술되어 있는 바와 같으며; EG2는 문헌 [Iqbal et al, 2010]에 기술되어 있는 바와 같음.
Figure 112016095163814-pct00034
실시예 10: 생체내 및 생체외 광학 영상화
정맥내 (iv) 주사 후 IGF1R-4 VHH가 뇌에 축적되는지 여부를 측정하기 위하여, IGF1R-4 VHH 및 음성 대조 A20.1 VHH를 근-적외선 형광 추적자인 Cy5.5에 접합시키고, 실시예 7에 기술되어 있는 바와 같이 정제하였다. 2.5 mg/kg의 IGF1R-Cy5.5 또는 A20.1 Cy5.5 (150 μl 부피) 중 어느 하나를 꼬리 정맥을 통하여 CD-1 누드 마우스에 주사하고, 주사 30분 후에 엑스플로어 옵틱스 전임상 영상화기 MX2 (어드밴스드 리서치 테크놀로지스(Advanced Research Technologies) 사, QC 소재)에서 포복 자세로 그것을 산채 영상화하였다. 주사 1시간 후, 2 % 이소플루란 (박스터 캐나다(Baxter Canada) 사, 캐나다 온타리오 미씨싸우가 소재)을 사용하여 동물을 마취하고, 심장 천자를 수행한 후, 동일한 바늘을 사용하여 2 mL/분으로 1 EU/mL의 헤파린 (오르가논(Organon) 사, 캐나타 온타리오 토론토 소재)이 보충된 10 mL의 식염수 (박스터 캐나다 사, 캐나다 온타리오 미씨싸우가 소재)를 관류함으로써, 혈액을 제거하였다 (우측 심실 절개 부위에서의 무혈액 출현으로 확인). 관류된 뇌를 제거한 후, 엑스플로어 옵틱스를 사용하여 생체외 영상화하였다. 영상화 프로토콜은 문헌 [Iqbal et al., 2011]에 상세하게 기술되어 있는 바와 같다.
결과는 도 7에 나타내었다. Cy5.5-IGF1R-4가 주사된 마우스는 관류 후 생체내 (상부 패널, 화살표) 및 생체외 뇌의 두부 영역에서 강화된 광학 신호를 나타낸 반면 (저부 패널, 화살표), Cy5.5-A20.1-주사된 마우스는 낮은 바탕 신호만을 나타내었다. 데이터는 IGF1R-4 VHH가 생체내에서 혈액-뇌 장벽을 횡단하여 영상화 작용제 (Cy5.5, 1 kD)를 전달할 수 있다는 것을 암시하고 있다.
실시예 11: 갈라닌에 대한 IGF1R -4의 접합
IGF1R-4 VHH가 생체 내에서 혈액-뇌 장벽 (BBB)을 횡단하고 그 자체로는 BBB를 횡단할 수 없는 분자를 BBB를 횡단하여 '운반'할 수 있는지 여부를 측정하기 위하여, 신경펩티드인 갈라닌을 IGF1R-4 VHH 또는 IGF1R4-mFc에 화학적으로 접합시킨 후, 전신 투여하였다. 갈라닌은 뇌 조직에서 발현되는 GalR1 및 GalR2에 결합함으로써 진통을 유발하는 신경활성 펩티드이다. 말초로 제공될 경우, 갈라닌은 진통 효과를 나타내지 않는데, 그것이 그 자체로는 BBB를 횡단할 수 없기 때문이다 (문헌 [Robertson et al., 2011]).
IGF1R-4 VHH를 시스테아미드(cysteamide) 변형된 C-말단을 포함하는 래트 갈라닌 (Gal) 단편 (바이오매틱(Biomatic) 사) (
Figure 112016095163814-pct00035
-시스테아미드, 서열식별번호: 36)에 접합시켰다. 접합 반응식은 도 8a에 나타내었다.
간단하게 말하자면, 0.5× PBS 중 5 mg의 IGF1R-4 VHH (실시예 4), [2 mg/ml]의 2.5 mM EDTA를 436.4 μl의 2.5 mg/ml 술포숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트 (술포-SMCC) (7.5× 과량 몰비)와 혼합하였다. 다음에, 혼합물을 질소 기체로 플러싱하고, 실온 (RT)에서 30분 동안 인큐베이팅함으로써, 술포-SMCC의 NHS 에스테르 암이 VHH상의 아민과 반응하도록 하였다. 이어서, 10 ml의 7K 제바(Zeba) 컬럼 (피어스(Pierce) 사)을 사용하여, 미반응 술포-SMCC를 말레이미드-활성화된 IGF1R-5 VHH로부터 제거하였다. 샘플 적재 전에, 5 ml의 PBS를 사용하여 컬럼을 3회 세척하고, 1000×g로 2분 동안 회전시켰다. 샘플 적재 후에는, 200 μl의 PBS를 사용하여 컬럼을 충전하고, 1000×g로 2분 동안 회전시켰다. IGF1R-Fc 구축물의 경우, 5 mg을 상기한 바와 동일한 방식으로 ~68 μl의 술포-SMCC (6.5× 과량 몰비)와 반응시켰다.
별도로 동시에, 10 ml의 무내독소수에 10 mg의 동결건조 분말을 용해시켜 1 mg/ml 모액을 제조하는 것에 의해, 시스테아미드 변형된 C-TERM 갈라닌 (Gal-cya)을 제조하였다 (갈라닌-cya 분말은 정제 동안의 디술피드 가교 형성을 방지하기 위하여 소량의 DTT를 포함함). 마지막으로, 100 μl의 0.5 M EDTA를 첨가하였다 (5 mM 최종 농도).
0.5× PBS, 2.5 mM EDTA를 사용하여 정제된 말레이미드-활성화 IGF1R-4 VHH 및 IGF1R-Fc 구축물 (2.6 ml)을 5 ml로 희석한 다음, 보르텍싱하면서 각각 5 ml 또는 1 ml의 Gal-cya를 첨가하였다. 샘플을 질소로 플러싱하고, 밀봉한 후, 4 ℃에서 밤새 인큐베이팅하였다. 다음날, 각각 아미콘(Amicon)-15 10K 및 30K 컬럼 (밀리포어 사)을 사용하여 미반응 Gal-cya를 제거하였다. 샘플을 컬럼에 첨가하고, 부피가 5 ml로 감소될 때까지 4000×g로 7분 동안 회전시켰다. 5 ml의 0.5× PBS, 2.5 mM EDTA를 컬럼 삽입물 중 나머지 5 ml 샘플에 첨가하고, 다시 샘플이 4 ml로 감소될 때까지 회전시켰다. 다음에, 접합된 샘플을 상기한 바와 같이 제조된 10 ml의 7K 제바 컬럼 (피어스 사)에 첨가한 다음, 1000×g로 2분 동안 회전시켰다.
다음에, 접합된 IGF1R-4-Gal 및 IGF1R-4 Fc-Gal 샘플을 16 % 또는 10 % SDS-PAGE 비-환원성 겔상에서 전개하고 은 염색함으로써, 접합 후의 분자량 크기 이동을 확인하였다. VHH 또는 IGF1R-Fc 구축물 당 ~1 내지 2개 갈라닌 분자를 달성하도록 반응을 적정하였다. 결과는 IGF1R-4 VHH상의 갈라닌 적재물을 확인해 주었다 (도 8b 참조).
내독소 제거 및 내독소 농도 측정: 아미콘 울트라-분자량 컷-오프 (MWCO) 셀룰로스 막 회전 컬럼 (밀리포어 사)을 사용하여 내독소를 제거하였다. 먼저, 15 ml의 VHH 조제물을 4000×g에서의 10분 동안의 원심분리에 의해 아미콘-15-50K MWCO 컬럼으로 통과시키고; 용리물을 수집하였다. 다음에, 상기 용리물을 아미콘-15-10K MWCO 컬럼에 첨가하고, 4000×g로 7-10분 동안 회전시킴으로써, 15 ml로부터 7.5 ml로의 상청액 부피 감소를 초래하였다. PBS를 첨가함으로써, 컬럼 내 상청액 부피를 다시 15 ml로 조정하였다. 상기한 바와 같이 다시 컬럼을 회전시켰다. 상청액을 수집한 후, 10-0.1 EU/ml의 감도 범위를 가지는 카트리지를 사용하는 엔도사페(EndoSafe)-PTS 시스템 (찰스 리버 라보래토리즈 인터내셔널(Charles River Laboratories International) 사)으로 내독소 농도를 측정하였다. 카트리지상 4개의 웰 각각에 25 μl의 샘플을 적재하고, 필요할 경우 희석하였다. 1 mg 당 <1의 EU를 가지는 샘플만을 동물 연구에 사용하였다.
실시예 12: 하그리브스 모델을 사용한 IGF1R -4-Gal의 수송
IGF1R-4-Gal 또는 IGF1R-4-mFc-Gal (실시예 11)이 혈액-뇌 장벽을 횡단이동하는지 여부를 평가하기 위하여, 국제 특허 출원 제 WO 2011/127580호에서 이전에 기술된 생체내 검정을 이용하였다.
문헌 [Hargreaves et al. (1988)]에 기술되어 있는 것과 유사한 염증성 통각과민의 래트 모델을 사용하였다. 폴리프로필렌 케이지 당 3마리의 군 (하그리브스 모델)으로 동물들을 수용하고, 식품 및 물에 대한 자유로운 접근을 허용하였다. 24 ℃의 온도 및 50±5 %의 상대 습도에서, 12시간 명/암 주기로 실험을 수행하였다. 모든 동물 절차는 NRC 동물 관리 위원회에 의해 승인을 받았으며, 캐나다 협회 동물 관리 지침에 부합하였다.
이와 같은 모델에서는, 수컷 위스타 래트 6-8주령 (체중 범위 230-250 g 범위)의 우측 뒷발(hind paw)에 간단한 이소플루란 마취 (3 %)하에 적은 부피 (30-게이지 바늘 사용 100 μl)의 완전 프로인트 아주반트 (CFA; 오일:식염수 1:1 에멀션에 현탁된 열-사멸된 엠. 투버큘로시스 (M. tuberculosis) (시그마 사))를 주사하였다. CFA는 통각수용기를 활성화하여 만성 통증 상태 및 통각과민 (유해 열에 대한 제고된 민감성)을 야기하는 염증유발 물질들의 방출을 유도한다. 발 자극을 위한 발바닥 진통 측정기 장비 (IITC Model # 336TG 라이프 사이언스(Life Science), Inc. 사)를 사용하여 양 뒷발의 발바닥 표면에서의 방사 자극 (염증화 및 비-염증화 대조 발)의 적용에 의해, 발 철회 잠복기를 측정하였다. 해당 발을 핥거나 때리는 것에 의한 동물이 반응하는 데에 걸리는 시간을 양성 반응 (발 철회 잠복기)으로 해석하였다. CFA 투여 전에, 양 뒷발에서 17 내지 20초 사이의 기준선 발 철회 잠복기를 도출하도록 광-강도 램프를 조정하였다. 20초 이내에 철회 반응이 발생하지 않을 경우, 조직 손상을 방지하기 위하여 광선을 자동으로 작동중지시키고, 발에 최대 점수를 할당하였다.
CFA 주사 2일 후, 화합물 투여 전에, 스트레스를 감소시키고 거짓 양성 반응을 방지할 목적으로, 동물들을 조작하여 60분 이상 동안 진통 측정기 장비에 순응시켰다. 양 발에서 기준선을 측정하여 통증 발생 (열적 통각과민)을 확인하고; 비-염증화 발을 주사된 발에 대한 대조로 사용하였다. "염증화된 발"에서 6초 초과 및 "정상 발"에서 17초 미만인 발 철회 잠복기를 가지는 동물은 실험에서 배제하였다.
IGF1R-4-Gal이 혈액 뇌 장벽을 횡단하여 전달됨으로써 뇌 실질의 표적 수용체 (GalR1 및 2)와 연관될 수 있는지 여부를 측정하기 위하여, CFA 주사 3일 후에, IGF1R-4-갈라닌 (3 mg/kg) 또는 IGF1R-4mFc-갈라닌 (2 mg/kg 또는 5 mg/kg) 또는 대조 화합물의 1회 꼬리 정맥 주사를 래트에 투여하였다. 3시간 동안 15분마다, 각 뒷발 (염증화 및 비-염증화)에 대하여 발 철회 잠복기 (PWL)를 시험하였다. 증가된 발 철회 잠복기는 IGF1R-4에 의한 뇌 실질로의 갈라닌의 성공적인 전달을 통하여서만 수득될 수 있는 열적 통각과민의 억제를 표시한다. 갈라닌은 뇌 실질에 존재할 경우에만 진통을 유도할 수 있으며, 그 자체로는 무손상 BBB를 횡단할 수 없다 (문헌 [Robertson et al., 2011]).
발 철회 잠복기 (PWL, 초) 대 시간 (분 또는 시간)의 시간 과정으로서 결과를 분석하였다 (도 9a 및 c). 도 9b는 결과를 곡선하 면적 (AUC)로 나타내고, 그것을 최대 가능 효과 중 % (%MPE)와 비교한다. 도 9d는 최대 반응 (Emax)에서의 (열적 통각과민의) % 반전으로 결과를 나타낸다.
결과는 정맥내 투여된 갈라닌이 PBS에 비해 통증을 감소시키지 않는다는 것을 보여준다. 반면, FC5-Gal 또는 IGF1R4-Gal의 단일 주사는 측정가능한 진통 효과를 생성시킴으로써, 이와 같은 VHH가 BBB를 횡단하여 갈라닌을 '운반'함으로써, 뇌 실질에서 GalR1 및/또는 2에 결합하여 진통 효과를 생성시킨다는 것을 암시하였다. IGF1R-4-갈라닌의 효과는 FC5-Gal에 의해 유도되는 것에 비해 상당히 더 현저하였는데, IGF1R 수용체가 추정상의 FC5 수용체보다 더 높은 BBB 수송 속도를 가지고 있다는 것을 암시한다. 결과는 IGF1R-4 VHH가 수용체-매개 세포질통과이동 경로를 사용하여 BBB를 횡단하는 3000 Da 이상의 분자 (항체-펩티드 접합체의 합쳐진 MW는 약 18 kDa)를 '운반'할 수 있다는 것을 입증하고 있다. BBB가 0.5 kDa를 초과하는 모든 친수성 분자의 통과를 방해하는 것으로 알려져 있기 때문에, 능동인 수용체 매개 수송이 필요한 것이다. 마찬가지로, IGF1R4-mFc-갈라닌은 열적 통각과민의 투여량-의존성 억제를 생성시키는 반면, A20.1.mFc-갈라닌은 비효과적이었다. 이는 IGF1R-4 VHH가 BBB를 횡단하여 항체와 크기가 유사한 분자 (~80 kD)를 운반할 수 있다는 것을 암시한다. IGF1R-4mFc-갈라닌은 열적 통각과민을 억제함에 있어서 IGF1R-4-갈라민에 비해 약 5-배 더 강력해서, 2-가 구현 및 연장된 혈장 반감기가 뇌 전달 효능 향상에 기여한다는 것을 암시하였다.
실시예 13: CSF 및 혈장에서의 IGF1R -4 농도
IGF1R-4 VHH가 뇌로, 특히 뇌척수액 (CSF)으로 횡단할 수 있는지를 측정함은 물론, CSF 및 혈청에서의 그의 존재를 정량하기 위하여, 생체내 검정을 수행하였다.
동물들을 폴리프로필렌 케이지에 단독으로 수용하고, 식품 및 물에 자유롭게 접근하도록 허용하였다. 24 ℃의 온도 및 50±5 %의 상대 습도에서, 12시간 명/암 주기로 실험을 수행하였다. 모든 동물 절차는 NRC 동물 관리 위원회(NRC's Animal Care Committee)에 의해 승인을 받았으며, 캐나다 협회 동물 관리 지침(Animal Care guideline)에 부합하였다.
수컷 위스타(Wistar) 래트 8-10주령 (체중 범위 230-250 g 범위)을 사용하였다. CSF를 샘플링하기 위하여, 동물의 목 및 두부 영역상 털을 면도한 다음, 그들을 플렉시글라스(Plexiglas) 챔버에 위치시키고, 3 % 이소플루란을 사용하여 적절히 마취한 후; 본질적으로 문헌 [Nirogi et al (2009)]에 기술되어 있는 바와 같이 CSF를 수집하였다. 마취된 래트를 금속 프레임 기기 (멕시코 소재 신베스타브(CINVESTAV) 사의 닥터 빈시오 그라나도스-소토(Vinicio Granados-Soto)의 친절 제공)에 위치시키고, 이어바(earbar)를 사용하여 고정하였다. 동물 두부의 위치를 대략 45°로 아래로 유지하였다. 해당 표면상에 에탄올 (75 %) 중에 매립된 면을 문지르는 것에 의해, 뒤통수 융기와 꼬리뼈 척추 사이의 마름모꼴 외관을 가지는 하락가능 표면을 가시화하였다. 절개 형성 없는 CSF 수집을 위하여, 길이 10 cm의 PE-10 관류 (벡톤 디킨슨(Becton Dickinson)사, 캐나다 온타리오 미씨싸우가 소재)가 덮여 있으며 100 cc 인슐린 주사기에 연결되어 있는 27G 바늘을 수평으로 그리고 중앙으로 대수조에 삽입하였다. 피부의 인열 및 환추-후두 막의 찢어짐으로 인하여, 바늘 경로를 따라 2개의 저항점 (딸깍함)이 쉽게 감지될 수 있다. 바늘이 두 번째 저항점을 통과하였을 때, 인슐린 주사기의 약한 흡인을 적용함으로써, 바늘을 통하여 CSF를 수집하였다 (40-100 μL). CSF 샘플링 후, 개흉술 후 심장 천자에 의해 상응하는 혈액을 수집하고, 응고 활성화제 및 겔과 함께 진공채혈관 (벡톤 디킨슨사, 캐나다 온타리오 미씨싸우가 소재)에 위치시킨 다음, 3,000×g로 15분 동안 원심분리하였다. 마이크로피펫을 사용하여 혈청을 제거하고, 추가 분석시까지 -80 ℃에서 급속 냉동시켰다.
실시예 9에서 기술된 바와 같은 질량 분광측정법 및 나노LC-SRM 기반 정량에 의해, 혈청 및 CSF 샘플을 분석하였다.
CSF 수집은 CSF가 혈액에 의해 쉽게 오염될 수 있는 섬세한 절차이다. VHH의 양이 혈액에 비해 CSF에서 훨씬 더 적을 것으로 (< 0.1 %) 예상되기 때문에, 혈액에 의한 약간의 오염도 개별 CSF 샘플의 가치를 심각하게 훼손할 수 있다. 따라서, 혈액-오염된 CSF 샘플에 대한 엄격한 배제 기준을 개발하는 것이 필요하였다. 혈액-CSF 알부민 비를 평가하기 위하여, 혈장 및 CSF에서의 알부민 농도를 정량하기 위한 나노LC-SRM 방법을 개발하였다. 다중 검정에서 다른 펩티드 피크에 의한 방해를 최소한으로 받기 위하여, 해당 고유 체류 시간 및 m/z 값 (몰 팜(Mol Pharm))을 기준으로 알부민 펩티드
Figure 112016095163814-pct00036
(서열식별번호: 37)을 선택하였다. 상기한 바와 같은 SRM을 사용하여, CSF 및 혈장 샘플 모두에서 펩티드의 강도를 정량하였다. 각 래트에 대하여 하기와 같이 알부민 비를 계산하였다:
알부민 비 = 분석되는 혈장의 nL 당 강도 / 분석되는 CSF의 nL 당 강도
1500 이하의 비이면 혈액이 오염된 것으로 간주하였다.
결과는 도 10에 나타내었다. 각각 6 mg/kg의 IGF1R-4, FC5 또는 A20.1을 동물들에 공동-주사하고, 주사 30분 후에 CSF 및 혈청을 수집하였다. 도면은 FC5의 0.98 % 및 A20.1의 0.017 %에 비해 IGF1R-4의 CSF/혈청 비가 1.2 %라는 것을 보여주는데, IGF1R-4 및 FC5 모두가 공동-주사되는 대조 항체 A20.1보다 더 높은 CSF 침투 및 뇌 노출을 나타낸다는 것을 암시하고 있다.
실시예 14: IGF1R -4-mFc의 면역검출
말초 투여 후 CSF에서 검출되는 높은 IGF1R-4mFc의 농도가 적어도 부분적으로 실질 세포외 공간으로부터 기원한다는 것, 다른 말로 하면, 무손상인 구축물이 BBB를 횡단하였다는 것을 확인하기 위하여, 래트 뇌에서의 IGF1R-4-mFc의 면역검출을 수행하였다.
간단하게 말하자면, IGF1R-4-mFc 또는 A20.1mFc 중 어느 하나의 6 mg/kg 꼬리-정맥 주사 24시간 후의 PBS를 사용한 동물 관류 직후에, 동물의 뇌를 수확하였다. 뇌를 냉동시키고, 냉동절편기에서 12 ㎛ 절편으로 절제하였다. 절편들을 RT에서 10분 동안 100 % 메탄올 중에 고정하고, PBS 중에서 3× 세척한 후, 1× PBS 중 0.3 % 트리톤X-100을 함유하는 10 % 표준 염소 혈청 (NGS) 중에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 1× PBS 중 0.3 % 트리톤X-100을 함유하는 5 % NGS 중 1:200 염소 항-m-IgG Fcγ-cy3 (Cat#115-165-071, 잭슨 이뮤노 리서치(Jackson Immuno Research) 사, lot#106360)을 4 ℃에서 밤새 적용하였다. 1×로 절편들을 3회 세척한 다음, 1× PBS 중 1:500 혈관구조-염색 렉틴 RCAI (Cat# FL-1081, 벡터(Vector) 사)를 10분 동안 첨가하였다. 1× PBS를 사용한 3회 세척 후, 다코(Dako) 형광 마운팅(mounting) 배지 (Cat#S3023, 다코 사)에서 커버 슬립을 사용하여 절편들을 덮고, 2 ㎍/mL의 훽스트(Hoechst) (Cat#H3570, 인비트로겐 사)를 첨가함으로써, 핵을 염색하였다. 표 3에 나타낸 바와 같은 10× 및 60× 대물렌즈 및 채널을 사용하는 올림푸스 1×81 형광 현미경으로 영상을 포착하였다.
<표 3>
표 3. 형광 현미경법에 사용된 대물렌즈 및 채널
Figure 112016095163814-pct00037
결과를 도 11에 나타내었다. 마우스 Fc의 면역검출은 여러 뇌 영역에 걸친 뇌 혈관들의 강한 염색은 물론, 혈관주위 뇌 실질의 염색을 나타냄으로써, IGF1R-4-mFc가 뇌 혈관에 축적되며, 또한 주위의 뇌 실질을 향하여 BBB를 횡단이동한다는 것을 표시하였다. 반면, A20.1mFc-주사 동물에서는 mFc-특이적 염색을 검출할 수 없었다. 상기 결과는 IGF1R-4-mFc의 증가된 CSF 농도가 BBB를 횡단하는 구축물 횡단이동의 지표라는 주장을 지지한다. 이는 IGF1R-4에 연결된 갈라닌이 실질 GalR1 및 GalR2 수용체에서 약학적 반응 (진통)을 유도하였다는 관찰에 의해서도 추가적으로 강하게 지지된다. 집합적으로, 시험관내 BBB 횡단이동 결과, 생체내 약동학 (혈청/CSF 농도) 및 약역학 (하그리브스 모델) 결과들은 IGF1R-4 VHH가 IGF1R 항원결정인자에 대한 그의 결합에 의해 촉발되는 능동 수용체-매개 세포질통과이동을 통하여 다른 VHH에 비해 상당히 더 높은 속도로 무손상 BBB를 횡단이동한다는 것, 및 그것이 일정 범위(1-80 kD)의 그렇지 않을 경우 비-투광성인 분자를 혈액-뇌 장벽을 횡단하여 '운반'할 수 있다는 것을 입증하고 있다.
실시예 15: IGF1R의 '생리학적' 기능에 대한 IGF1R -4 효과
안전성 관점에서, 본 발명의 항체가 수용체-매개 세포질통과이동을 통한 약물 전달을 위하여 그의 수용체와 연관될 때 수용체의 생리학적 기능 - 즉 그의 자연 리간드인 IGF-1에 의해 유도되는 신호전달 -을 방해하지 않는다는 것을 보이는 것이 중요하다. 이와 같은 관점에서, IGF1R-4 VHH 또는 IGF1R-4-mFc가 그의 자연 리간드에 의해 유도되는 IGF1R 또는 관련 인슐린 수용체 (IR)를 통한 생리학적 신호전달을 방해하지 않는다는 것을 입증하는 것은 중요하다.
IGF1R-4가 IGF1R 또는 IR 단독을 통한 신호전달을 유도하거나, 또는 수용체의 자연 리간드인 IGF-1 또는 인슐린에 의해 자극될 때의 신호전달을 방해하는지 여부를 측정하기 위하여, SV-ARBEC 세포에서 수용체 자체 또는 수용체-자극 하류 키나제인 Akt의 인산화에 대한 그의 효과를 측정하였다.
SV-ARBEC을 합류(confluence)시까지 관련 기술분야에 알려져 있는 방법에 따라 펩톤, D-글루코스, BME 아미노산, BME 비타민, 항생제/항진균제 용액 및 소 태아 혈청이 보충된 M199 기본 배지에서 성장시켰다. 세포를 처리 18시간 전에 무혈청 배지로 전환시켰다. IGF1R-4 VHH 또는 IGF1R-4-Fc 융합체 (100 nM 또는 500 nM)를 200 ng/ml의 IGF-1, 10 ㎍/ml의 인슐린 또는 비히클 중 어느 하나의 첨가 1시간 전에 세포에 첨가하였다. 세포를 리간드 또는 비히클과 함께 20분 동안 인큐베이팅한 다음, 행크 균형 염 용액에서 2회 세척하였다. 이후, 1 % 트리톤-X 100 및 프로테아제 억제제 칵테일 (시그마 사)이 보충된 1× RIPA 완충제 (셀 시그널링 테크놀로지(Cell Signaling Technology) 사)를 사용하여 세포를 용해시켰다. 수조 초음파발생기에서의 2×20초의 파열을 세포에 제공하고, 14,000 rpm에서의 10분 동안의 원심분리에 의해 용해질을 투명화하였다. DC 단백질 검정 시스템 (바이오-래드 라보래토리즈 사)을 사용하여 단백질 농도를 측정하였다. 동일 ㎍의 단백질 샘플을 4-20 % 구배 SDS 폴리아크릴아미드 겔상에서 125 V로 해상하고, PVDF 막으로 옮겼다. 이와 같은 표적에 대한 일차 항체 (셀 시그널링 테크놀로지 사)의 1:1000 희석물에서의 밤샘 인큐베이션 후 이어지는 염소 항-토끼 IgG-HRP 이차 항체와의 1시간 인큐베이션, 다음의 ECL 플러스 시약과의 반응 및 자가방사선술 필름상에서의 가시화에 의해, 포스포-Akt (Ser 473)를 검출하였다. Un-스캔-잇 소프트웨어 (실크 사이언티픽(Silk Scientific) Inc. 사)를 사용하여, 밀도측정 값을 측정하였다.
결과를 도 12에 나타내었다. Akt 인산화의 웨스턴 블럿 분석은 100 nM의 IGF1R-4 또는 IGF1R-4-mFc, 또는 500 nM의 IGF1R-4-mFc와 함께 공동-적용되었을 때, IGF1R-4가 10 ㎍/ml의 인슐린 또는 200 ng/ml의 IGF-1에 의해 유도되는 Akt 인산화를 억제하지 않는다는 것을 보여주었다. VHH 또는 Fc 융합체 중 어느 것도 그 자체로는 Akt 신호전달을 유도하지 않았다 (도 12a, 12b 및 12c, "-4"로 표지). 결과는 Fc 융합체 체재의 2가 구현에서도 IGF1R-4가 수용체 이량체화 및 하류 신호전달을 촉발하지 않으며, 그에 따라 자연 리간드 존재하에서의 수용체 기능을 방해하지 않는다는 것을 입증하고 있다. IGF1R-4의 이와 같은 특징 ('침묵 바인더')은 치료제용 BBB 운반체로서의 그의 적용에 중요한데, 그것이 바람직한 안전성 프로파일을 부여하기 때문이다.
본원에서 기술된 실시양태 및 실시예들은 예시적인 것으로써, 청구되는 바와 같은 본 발명의 영역을 제한하는 것을 의미하지는 않는다. 대안, 변형 및 등가물을 포함한 전기 실시양태들의 변이들은 본 발명자들에 의해 첨구범위에 포괄되는 것으로 하고자 한다. 또한, 논의된 특징들의 조합이 본 발명의 해결책에 필요하지 않을 수도 있다.
[참고문헌]
본원에서, 그리고 적용시에 언급되는 모든 특허, 특허 출원 및 공개들은 의거 참조로써 개재된다.
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<222> (79)..(79) <223> Xaa is Leu or Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (87)..(87) <223> Xaa is Lys or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (88)..(88) <223> Xaa is Ala or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (119)..(119) <223> Xaa is Leu or Gln <400> 10 Xaa Val Xaa Leu Xaa Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Xaa Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Xaa Xaa Ser Gly Gly Thr Val Ser Pro Thr 20 25 30 Ala Met Gly Trp Xaa Arg Gln Ala Pro Gly Lys Xaa Xaa Glu Xaa Val 35 40 45 Xaa His Ile Thr Trp Ser Arg Gly Thr Thr Arg Xaa Ala Ser Ser Val 50 55 60 Lys Xaa Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Xaa Xaa Lys Asn Thr Xaa Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Xaa Xaa Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Ser Thr Phe Leu Arg Ile Leu Pro Glu Glu Ser Ala Tyr Thr 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Xaa Val Thr Val Ser Ser Met Thr Val Asp 115 120 125 Lys Lys Leu Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro Cys Pro 130 135 140 Pro Cys Lys Glu Cys His Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Glu Gly Gly 145 150 155 160 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<211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> IGF1R-4 peptide <400> 25 Glu Phe Val Gly His Ile Thr Trp Ser Arg 1 5 10 <210> 26 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> IGF1R-4 peptide <400> 26 Leu Ser Cys Glu Val Ser Gly Gly Thr Val Ser Pro Thr Ala Met Gly 1 5 10 15 Trp Phe Arg <210> 27 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> FC5 and FC5-ILIS peptide <400> 27 Ile Thr Trp Gly Gly Asp Asn Thr Phe Tyr Ser Asn Ser Val Lys 1 5 10 15 <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> A20.1 peptide <400> 28 Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 <210> 29 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> A20.1 peptide <400> 29 Glu Phe Val Ala Ala Gly Ser Ser Thr Gly Arg 1 5 10 <210> 30 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> A20.1 peptide <400> 30 Thr Phe Ser Met Asp Pro Met Ala Trp Phe Arg 1 5 10 <210> 31 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> A20.1 peptide <400> 31 Asp Glu Tyr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 15 Gly Gln Ala Gly Gln Gly Ser Glu Gln Lys 20 25 <210> 32 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> EG2 peptide <400> 32 Asp Phe Ser Asp Tyr Val Met Gly Trp Phe Arg 1 5 10 <210> 33 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> EG2 peptide <400> 33 Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp Ser Leu Arg 1 5 10 15 <210> 34 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> EG2 peptide <400> 34 Asn Met Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala 1 5 10 15 Val Tyr Tyr Cys Ala Val Asn Ser Ala Gly Thr Tyr Val Ser Pro Arg 20 25 30 <210> 35 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Albumin peptide <400> 35 Ala Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Ala Ala Arg 1 5 10 <210> 36 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Galanin-cysteamide <400> 36 Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Pro His Ala Ile 1 5 10 15 Asp Asn His Arg Ser Phe Ser Asp Lys His Gly Leu Thr 20 25 <210> 37 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Signal peptide <400> 37 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys <210> 38 <211> 371 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Fc-IGF1R-4 consensus fusion <220> <221> MISC_FEATURE <222> (248)..(248) <223> Xaa is Glu or Gln <220> <221> MISC_FEATURE <222> (250)..(250) <223> Xaa is Lys or Gln <220> <221> MISC_FEATURE <222> (252)..(252) <223> Xaa is Val or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (261)..(261) <223> Xaa is Ala or Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (270)..(270) <223> Xaa is Ala or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (271)..(271) <223> Xaa is Val or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (284)..(284) <223> Xaa is Val or Phe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (291)..(291) <223> Xaa is Gly or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (292)..(292) <223> Xaa is Leu or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (294)..(294) <223> Xaa is Phe or Trp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (296)..(296) <223> Xaa is Gly or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (307)..(307) <223> Xaa is Val or Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (313)..(313) <223> Xaa is Asp or Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (321)..(321) <223> Xaa is Asn or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (322)..(322) <223> Xaa is Ala or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (326)..(326) <223> Xaa is Leu or Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (334)..(334) <223> Xaa is Lys or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (335)..(335) <223> Xaa is Ala or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (366)..(366) <223> Xaa is Leu or Gln <400> 38 Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro Cys Pro Pro Cys Lys 1 5 10 15 Glu Cys His Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Glu Gly Gly Pro Ser Val 20 25 30 Phe Ile Phe Pro Pro Asn Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Thr 35 40 45 Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp 50 55 60 Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln 65 70 75 80 Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser 85 90 95 Thr Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys 100 105 110 Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile 115 120 125 Ser Lys Ile Lys Gly Leu Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Ile Leu Pro 130 135 140 Pro Pro Ala Glu Gln Leu Ser Arg Lys Asp Val Ser Leu Thr Cys Leu 145 150 155 160 Val Val Gly Phe Asn Pro Gly Asp Ile Ser Val Glu Trp Thr Ser Asn 165 170 175 Gly His Thr Glu Glu Asn Tyr Lys Asp Thr Ala Pro Val Leu Asp Ser 180 185 190 Asp Gly Ser Tyr Phe Ile Tyr Ser Lys Leu Asn Met Lys Thr Ser Lys 195 200 205 Trp Glu Lys Thr Asp Ser Phe Ser Cys Asn Val Arg His Glu Gly Leu 210 215 220 Lys Asn Tyr Tyr Leu Lys Lys Thr Ile Ser Arg Ser Pro Gly Gly Gly 225 230 235 240 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Xaa Val Xaa Leu Xaa Glu Ser Gly Gly 245 250 255 Gly Leu Val Gln Xaa Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Xaa Xaa Ser 260 265 270 Gly Gly Thr Val Ser Pro Thr Ala Met Gly Trp Xaa Arg Gln Ala Pro 275 280 285 Gly Lys Xaa Xaa Glu Xaa Val Xaa His Ile Thr Trp Ser Arg Gly Thr 290 295 300 Thr Arg Xaa Ala Ser Ser Val Lys Xaa Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp 305 310 315 320 Xaa Xaa Lys Asn Thr Xaa Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Xaa Xaa Glu 325 330 335 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ser Thr Phe Leu Arg Ile Leu 340 345 350 Pro Glu Glu Ser Ala Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Xaa Val Thr 355 360 365 Val Ser Ser 370

Claims (28)

  1. 하기를 포함하며, 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체(IGF1R)에 대하여 특이적인, 단리 또는 정제된 단일-도메인 항체, 또는 그의 항원-결합 단편:
    상보성 결정 영역(CDR) 1 서열
    Figure 112021032028338-pct00038
    (서열식별번호: 1);
    CDR2 서열
    Figure 112021032028338-pct00039
    (서열식별번호: 2); 및
    CDR3 서열
    Figure 112021032028338-pct00040
    (서열식별번호: 3).
  2. 제1항에 있어서, 하기의 서열을 포함하는, 단리 또는 정제된 단일-도메인 항체, 또는 그의 항원-결합 단편:
    Figure 112021032028338-pct00041

    (여기서 X1은 E 또는 Q이며; X2는 K 또는 Q이고; X3는 V 또는 E이며; X4는 A 또는 P이고; X5는 A 또는 E이며; X6는 V 또는 A이고; X7은 V 또는 F이며; X8은 G 또는 E이고; X9은 L 또는 R이며; X10은 F 또는 W이고; X11은 G 또는 S이며; X12는 V 또는 Y이고; X13은 D 또는 G이며; X14는 N 또는 S이고; X15는 A 또는 S이며; X16은 L 또는 V이고; X17은 K 또는 R이며; X18은 A 또는 S이고; X19는 L 또는 Q임).
  3. 제1항에 있어서,
    Figure 112021032028338-pct00073

    로 구성되는 군에서 선택되는 서열 또는 90% 이상의 서열 동일성을 갖되 여기서 CDR1 내지 CDR3 서열은 변이 없이 포함되는 서열을 포함하는, 단리 또는 정제된 단일-도메인 항체, 또는 그의 항원-결합 단편.
  4. 제1항에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 다가 구현 체재인, 단리 또는 정제된 단일-도메인 항체, 또는 그의 항원-결합 단편.
  5. 제4항에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 Fc 단편에 연결되는, 단리 또는 정제된 단일-도메인 항체, 또는 그의 항원-결합 단편.
  6. 제2항에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 다가 구현 체재인, 단리 또는 정제된 단일-도메인 항체, 또는 그의 항원-결합 단편.
  7. 제6항에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 Fc 단편에 연결되는, 단리 또는 정제된 단일-도메인 항체, 또는 그의 항원-결합 단편.
  8. 제3항에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 다가 구현 체재인, 단리 또는 정제된 단일-도메인 항체, 또는 그의 항원-결합 단편.
  9. 제8항에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 Fc 단편에 연결되는, 단리 또는 정제된 단일-도메인 항체, 또는 그의 항원-결합 단편.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 혈액-뇌 장벽을 횡단이동하는, 단리 또는 정제된 단일-도메인 항체, 또는 그의 항원-결합 단편.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 단리 또는 정제된 단일-도메인 항체, 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 핵산 분자.
  12. 제11항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  13. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 표면상에 고정되는, 단리 또는 정제된 단일-도메인 항체, 또는 그의 항원-결합 단편.
  14. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 적재물 분자에 연결되는, 단리 또는 정제된 단일-도메인 항체, 또는 그의 항원-결합 단편.
  15. 제14항에 있어서, 적재물 분자가 1 kDa 내지 200 kDa 범위의 분자량을 가지는, 단리 또는 정제된 단일-도메인 항체, 또는 그의 항원-결합 단편.
  16. 제14항에 있어서, 적재물 분자가 검출가능 작용제, 치료제, 약물, 펩티드, 성장 인자, 시토카인, 수용체 트랩, 화합물, 탄수화물 잔기, 효소, 항체 또는 그의 단편, DNA-기반 분자, 바이러스 벡터 또는 세포독성 작용제; 검출가능 작용제, 치료제, 약물, 펩티드, 효소, 항체 또는 그의 단편, DNA-기반 분자, 바이러스 벡터 또는 세포독성 작용제가 적재된 1종 이상의 리포좀 또는 나노운반체; 또는 1종 이상의 나노입자, 나노와이어, 나노튜브 또는 양자점인, 단리 또는 정제된 단일-도메인 항체, 또는 그의 항원-결합 단편.
  17. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 1종 이상의 단리 또는 정제된 단일-도메인 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 및 제약상-허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하며, 여기서 1종 이상의 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 혈액-뇌 장벽(BBB)을 횡단하여 적재물 분자를 운반하는 것인, BBB를 횡단하는 적재물 분자의 수송을 위한 조성물.
  18. a) 조직 샘플을 검출가능 작용제에 연결된 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 1종 이상의 단리 또는 정제된 단일-도메인 항체, 또는 그의 항원-결합 단편과 접촉시키는 단계; 및
    b) 조직 샘플 중 IGF1R에 결합된 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 연결된 검출가능 작용제를 검출하는 단계
    를 포함하는, IGF1R의 시험관내 검출 방법.
  19. 검출가능 작용제에 연결된 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 1종 이상의 단리 또는 정제된 단일-도메인 항체, 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는, 대상체에서의 IGF1R 발현의 생체내 검출을 위한 조성물.
  20. 제1항에 따른 1종 이상의 단리 또는 정제된 단일-도메인 항체, 또는 그의 항원-결합 단편에 연결된 적재물 분자가 대상체의 BBB를 횡단하여 전달된 양을 정량하는 방법으로, 표적화된 단백질체학적 방법을 사용하여, 대상체로부터 수집된 뇌척수액(CSF) 중 1종 이상의 단리 또는 정제된 항체, 또는 그의 항원-결합 단편에 연결된 적재물 분자의 양을 정량하는 단계를 포함하는, 방법.
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