ES2677111T3 - Mejora del transporte de moléculas terapéuticas a través de la barrera hematoencefálica - Google Patents

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Abstract

Una molécula de unión que es una proteína quimérica que comprende al menos un agente farmacológicamente activo, al menos dos sitios de unión comprendidos en anticuerpos de dominio único que se unen a TMEM30A, y una región Fc que comprende un primer resto Fc y un segundo resto Fc, donde al menos dos sitios de unión que se unen a TMEM30A se fusionan cada uno i) directamente o ii) mediante una secuencia de aminoácidos intermedia al extremo N-terminal del primer resto Fc y el segundo resto Fc, respectivamente, donde la región Fc se une específicamente al receptor de FcRn.

Description

DESCRIPCION
Mejora del transporte de moleculas terapeuticas a traves de la barrera hematoencefalica 5 Antecedentes de la invencion
La distribucion de macromoleculas en todo el cuerpo generalmente esta mediada por difusion con macromoleculas en la sangre que se difunden en los tejidos a traves de revestimientos de celulas endoteliales altamente fenestradas de la vasculatura capilar. La difusion libre de macromoleculas no existe en el cerebro altamente vascularizado. Las 10 celulas endoteliales capilares del cerebro carecen de las fenestraciones que se observan en el resto del sistema circulatorio y tienen uniones intracelulares altamente especializadas para celulas endoteliales. Estas uniones estrechas sirven para prevenir la difusion libre de moleculas de mas de 400 kDa desde el lado luminal hasta el lado abluminal del capilar. Ademas, los capilares contienen varios sistemas transportadores tales como los transportadores de aniones organicos (OATS) y los sistemas de resistencia multifarmaco (MDR) que establecen de 15 manera activa gradientes de transporte de moleculas que de otra manera podrfan difundirse a traves de las celulas endoteliales. La combinacion de barreras restrictivas impide la entrada de agentes adventicios, incluidas toxinas y virus, por ejemplo, y limita la difusion de entidades terapeuticas. Ademas, estas barreras hematoencefalicas (BHE) bloquean de manera efectiva la administracion pasiva de protefnas, peptidos y pequenas moleculas potencialmente terapeuticas en el parenquima cerebral a dosis farmacologicamente terapeuticas.
20
Una estrategia efectiva para lograr el transporte de moleculas terapeuticas a traves de las celulas endoteliales de BHE ha sido aprovechar la transcitosis mediada por receptor (TMR). Esta estrategia utiliza anticuerpos o moleculas que se unen especfficamente a protefnas en celulas endoteliales en la BHE que normalmente estan involucradas en el transporte de moleculas a traves de las celulas endoteliales de la BHE. Dichos anticuerpos se usan como 25 moleculas transportadoras para administrar cargas utiles adheridas mientras experimentan transcitosis a traves de las celulas endoteliales de la BHE. Los ejemplos de las aplicaciones de esta tecnologfa incluyen el uso de anticuerpos contra el receptor de transferrina y los receptores de insulina (Yu y col. 2011. Science Translational Medicine. Volumen 3). En estos dos casos, los anticuerpos para TMR se fusionaron C-terminalmente con dominios proteicos terapeuticos y se ha demostrado que transportan moleculas a traves de la BHE. Desafortunadamente, las 30 dianas de la TMR que se usan habitualmente, la transferrina y los receptores de insulina se expresan alta y ampliamente en numerosos tejidos. Esta amplia expresion de la diana da como resultado una semivida circulante corta, que a su vez limita el tiempo de exposicion a las celulas endoteliales de la BHE y, por lo tanto, la dosificacion de la molecula en el cerebro. Ademas, estos anticuerpos se dirigen a funciones celulares metabolicamente crfticas, creando asf un riesgo potencial de seguridad.
35
Los restos de direccionamiento mejorados que hacen uso de moleculas de transporte para BHE activas para cruzar la BHE, p.ej., sitios de union derivados de moleculas de anticuerpo que transmigran a traves de la BHE, serfan de gran beneficio para la administracion de agentes terapeuticos en el cerebro.
40 Abulrob y col (International Congress Series, Excerpta Medica, 2005, vol. 1277: 212-223 ) describen el anticuerpo anti-TME30A de dominio unico FC5 que es un conjugado qufmico con una protefna de fusion HRP-IgG, asf como una protefna de fusion que comprende FC5 y restos de verotoxina.
Resumen de la invencion
45
La materia en cuestion de la invencion se define en las reivindicaciones. La invencion se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que una protefna de fusion que comprende un anticuerpo que transmigra la barrera hematoencefalica (BHE), p. ej., se descubrio que un anticuerpo que se une a TMEM30A (CDC-50A) (como, p.ej., el anticuerpo de dominio unico FC5) mejora en gran medida el transporte a traves de la BHE en comparacion con Vhh 50 monovalente. Los experimentos de union inicial y de transporte endotelial en la BHE mostraron que FC5, un anticuerpo de Vhh de dominio unico de llama (sdAb), podrfa facilitar el transporte a traves de una capa de celulas endoteliales de la BHE (vease, p.ej., la patente de los Ee. UU. N.° 7,943,129). Se sabe que la semivida circulante de un Vhh es corta debido al bajo peso molecular y la falta de un dominio Fc (Jain, M., Kamal, N., y Batra, S. K. (2007) Trends in biotechnology 25(7), 307-316;Batra, S. K., Jain, M., Wittel, U. A., Chauhan, S. C., y Colcher, D. (2002) 55 Current opinion in biotechnology 13(6), 603-608). Sorprendentemente, la semivida circulante de esta construccion se mejoro en gran medida fusionando un anticuerpo de dominio unico que transmigra la BHE al extremo N-terminal de una Fc humana dando como resultado una construccion de tipo anticuerpo divalente. La incorporacion de dicho sitio de union en una construccion Fc crea una molecula divalente, con el potencial de union divalente a cada resto de union unido a la diana supuesta, por ejemplo, TMEM30A, expresada en la superficie celular. La union divalente 60 puede provocar un cambio significativo en la aparente afinidad de union debido a un efecto de avidez (Reynolds, J.
A. (1979) Biochemistry 18(2), 264-269;Hubble, J. (1999) Molecular immunology 36(1), 13-18). Como se demuestra en el presente documento, la afinidad de la interaccion se incremento. Dado este aumento de afinidad, no se esperaba el descubrimiento de que la adicion de Fc para formar una molecula divalente aumentaba significativamente el transporte a traves de la BHE. El aumento del transporte no se esperaba porque, aunque la 5 adicion de un dominio Fc puede extender la farmacocinetica en fase beta debido al aumento de la masa que previene la filtracion renal de la molecula y la promocion del reciclado de anticuerpos in vivo mediante la union a FcRn, el incremento aparente de afinidad podrfa tambien haber tenido el efecto opuesto debido a la eliminacion de moleculas de union circulantes al unirse a una diana altamente expresada. Mas sorprendentemente, sin embargo, como se demuestra en este documento, se encontro que las protefnas de fusion en la conformacion del sitio de 10 union-Fc (del extremo amino al carboxi, es decir, el sitio de union fusionado al extremo N-terminal de Fc) tenfan una actividad mayor que las de la formacion del sitio de union a Fc (sitio de union fusionado al extremo C-terminal de Fc). Esto fue cierto a pesar del hecho de que las protefnas de fusion del sitio de union a Fc (sitio de union fusionado al extremo C-terminal de Fc) mostraron una union incrementada a las celulas endoteliales en los experimentos iniciales realizados in vitro. Tambien se proporcionan versiones homovalentes de las construcciones del sitio de union-Fc.
15
Por consiguiente, en un aspecto, la divulgacion proporciona una molecula de union que comprende al menos un agente farmacologicamente activo y al menos un sitio de union, por ejemplo, un sitio de union de transmigracion de la BHE, que se une a TMEM30A, en la que el al menos un sitio de union que se une a TMEM30A se fusiona i) directamente o ii) mediante una secuencia de aminoacidos intermedia al extremo N-terminal de un resto Fc. La union 20 de la invencion comprende al menos dos sitios de union.
En un aspecto de la divulgacion, el al menos un sitio de union comprende la secuencia de aminoacidos FC5. En un aspecto de la divulgacion, la molecula de union comprende al menos dos o al menos tres (por ejemplo, dos o tres) sitios de union que se unen a TMEM30A. En un aspecto de la divulgacion, la molecula de union comprende al 25 menos tres o al menos cuatro (por ejemplo, tres o cuatro) sitios de union que se unen a TMEM30A.
En un aspecto de la divulgacion, el al menos un sitio de transmigracion de la BHE (por ejemplo, un sitio de union derivado de moleculas de anticuerpo que transmigran a traves de la BHE) esta geneticamente fusionado directamente al resto Fc.
30
En un aspecto de la divulgacion, el al menos un sitio de transmigracion de la BHE (por ejemplo, un sitio de union derivado de moleculas de anticuerpo que transmigran a traves de la BHE) esta geneticamente fusionado al resto Fc mediante una secuencia de aminoacidos intermedia que comprende un conector peptfdico.
35 En un aspecto de la divulgacion, el al menos un sitio de transmigracion de la BHE (por ejemplo, un sitio de union derivado de moleculas de anticuerpo que transmigran a traves de la BHE) esta geneticamente fusionado al resto Fc mediante una secuencia de aminoacidos intermedia que consiste en un conector peptfdico.
En un aspecto de la divulgacion, dos sitios de transmigracion de la BHE (p. ej., sitios de union derivados de 40 moleculas de anticuerpo que transmigran a traves de la BHE) se fusionan al extremo N-terminal de dos restos Fc diferentes de una region Fc completa mediante una secuencia de aminoacidos que comprende un conector peptfdico.
En un aspecto de la divulgacion, el al menos un sitio de transmigracion de la BHE (por ejemplo, un sitio de union 45 derivado de moleculas de anticuerpo que transmigran a traves de la BHE) esta fusionado al extremo N-terminal de una molecula scFc.
En una realizacion, el al menos un agente farmacologicamente activo se fusiona con el extremo C-terminal de la region Fc.
50
En una realizacion, el al menos un agente farmacologicamente activo es una entidad qufmica pequena.
En una realizacion, la entidad qufmica pequena se fusiona a la molecula de union en un residuo de cistefna. En una realizacion, el residuo de cistefna es un residuo de cistefna disenado.
55
En una realizacion, el al menos un agente farmacologicamente activo es un polipeptido.
En una realizacion, el al menos un agente farmacologicamente activo comprende un sitio de union a antfgeno (por ejemplo, un sitio de union a antfgeno derivado de un anticuerpo que no transmigra la BHE).
En una realizacion, el agente farmacologicamente activo se selecciona del grupo constituido por una molecula scFv, una molecula Fab y un anticuerpo de dominio unico.
En una realizacion, el al menos un agente farmacologicamente activo esta fusionado geneticamente a la molecula 5 de union.
En una realizacion, el al menos un agente farmacologicamente activo esta unido covalentemente a la molecula de union.
10 En un aspecto de la divulgacion, el sitio de transmigracion de la BHE esta geneticamente fusionado mediante una secuencia de aminoacidos intermedia que comprende el dominio VH de una molecula de anticuerpo.
En un aspecto de la divulgacion, el sitio de transmigracion de la BHE esta geneticamente fusionado mediante una secuencia de aminoacidos intermedia que comprende el dominio VL de una molecula de anticuerpo.
15
En un aspecto de la divulgacion, al menos un sitio de transmigracion de la BHE esta geneticamente fusionado al extremo N-terminal de un dominio VH de una molecula de anticuerpo intacta.
En un aspecto de la divulgacion, al menos un sitio de transmigracion de la BHE esta geneticamente fusionado al 20 extremo N-terminal de un dominio VL de una molecula de anticuerpo intacta.
En un aspecto de la divulgacion, dos sitios de transmigracion de la BHE estan geneticamente fusionados al extremo N-terminal de un dominio VH y un dominio VL de una molecula de anticuerpo intacta.
25 En una realizacion, la secuencia de aminoacidos intermedia comprende ademas un conector peptfdico.
En una realizacion, el agente farmaceuticamente activo se selecciona del grupo constituido por: un peptido neuroactivo, una pequena entidad qufmica y una region variable de un anticuerpo que se une a una diana en el sistema nervioso central.
30
En una realizacion, la invencion se refiere a una molecula de union de la invencion para uso en un procedimiento para tratar un trastorno neurologico, que comprende administrar la molecula de union de la invencion a un sujeto.
En una realizacion, el trastorno neurologico es un trastorno de almacenamiento. En una realizacion, el trastorno 35 neurologico es dolor cronico. En una realizacion, el trastorno neurologico es epilepsia. En una realizacion, el trastorno neurologico es esclerosis multiple. En una realizacion, el trastorno neurologico es proteinopatfa. En una realizacion, el trastorno neurologico es un trastorno desmielinizante.
En otra realizacion, la invencion se refiere al uso de una molecula de union de la invencion en la fabricacion de un 40 medicamento para el tratamiento de un trastorno neurologico.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 muestra representaciones esquematicas del anticuerpo de dominio unico pesado FC5 (a) solo, (b) 45 fusionado o bien N-terminalmente (FC5-Fc) o (c) C-terminalmente (Fc-FC5) a un dominio Fc de IgG1 humana y tambien como posibles construcciones similares a anticuerpos que incorporan como resto farmaceuticamente activo un dominio que no transmigra la BHE (d, e). Las moleculas (f) y (g) ilustran la adicion de anticuerpo de dominio unico pesado FC5 a una molecula de anticuerpo completa; el anticuerpo de dominio unico pesado puede fusionarse, por ejemplo, al dominio VL o VH, o a ambos.
50
Figura 2. Se muestra la electroforesis de 2,5 pg de cada protefna purificada en un Bis-Tris SDS PAGE del 4 al 12 %. Los patrones de peso molecular en SDS PAGE de 10 a 220 kD estan marcados en cada gel. En el Panel A se muestra FC5 sin agente reductor en el carril (1) y con agente reductor en el carril (2), en el Panel B FC5-Fc sin agente reductor en el carril (1) y con agente reductor en el carril (2), y en el Panel C Fc-FC5 sin agente reductor en el 55 carril (1) y con agente reductor en el carril (2).
Figura 3. Muestra la mayor velocidad de transporte de FC5Fc, FcFC5 y FC5 a traves de una lfnea de celulas endoteliales de BHE de rata transformada in vitro con SV40 en comparacion con los anticuerpos de control 12F6A (hIgG1), CRL2434 (mIgG1) y C37H (Vhh solo).
Figura 4a-c. El panel 4 (a) muestra la union de FC5-Fc (o), Fc-FC5 (■) o un camelido Vhh de control irrelevante fusionado en los extremos N-terminales de un dominio huFc agly (Vhh-Fc) (A) a una lmea de celulas endoteliales de BHE de rata transformada con SV40. El panel (4b) muestra la union de FC5-Fc (o) y Fc-FC5 (■) a una lmea celular endotelial de BHE primaria de rata. El panel 4c muestra la union de FC5-Fc a TMEM30A de rata (□) o de humano (0) 5 y de Fc-FC5 a TMEM30A de rata (▲) o de humano (•) expresado transitoriamente en celulas EBNA293.
Figura 5a-c. El Panel 5a muestra la capacidad de FC5 reticulado covalentemente a dalargina (FC5-Dal) de suprimir el dolor en el modelo animal de Hargreaves. La tasa de retirada de la pata se expresa como porcentaje del efecto maximo posible (% de EMP) en base a un marco de tiempo de 20 segundos. El control negativo muestra la tasa de 10 retirada de la pata para la pata de control contralateral no inflamada (•) y el control positivo muestra la tasa de retirada rapida de la pata de la pata inflamada cuando a la rata se le inyecta IV solo PBS (o). La eficacia de una sola dosis IV (■) de FC5-Dal a 21 mg/Kg (mpk) se compara con tres dosis IV de FC5-Dal a 7 mpk (□) para suprimir la tasa de retirada de la pata en el animal de Hargreaves. El Panel 5b muestra el area promedio bajo la curva para el porcentaje de EMP de respuesta en funcion del tiempo para cada pata evaluada. El Panel 5c muestra experimentos 15 de control negativo adicionales en los que las ratas se inyectan IV con tres dosis en el tiempo 0, 1 h y 2 h con 7 mpk de un VHH-Dal irrelevante (cajas grises) o FC5 solo (cajas abiertas). Tambien se muestra la pata de control contralateral (drculos cerrados). El porcentaje de EMP para la supresion de la tasa de retirada de la pata se determino en el animal de Hargreaves.
20 Figura 6a-d. La eficacia de Fc-FC5-Dal se evaluo en el modelo de Hargreaves. Las ratas se dosificaron IV a 2 mpk a tiempo 0 en el Panel 6a y en el tiempo 0 y 2 h en el panel 6B. En los paneles 6C y 6D, se administraron IV a cada rata 6,5 mpk en el tiempo 0.
Figura 7a-d. La eficacia de FC5-Fc-Dal en el modelo de Hargreaves se comparo con un control negativo Fc-Dal. A 25 las ratas se les administro IV en el tiempo 0 una concentracion unica de FC5-Fc-Dal o Fc-Dal a 0,5, 2,5 o 6,0 mpk. Los datos se presentan en los paneles 7a y 7b como el porcentaje del efecto maximo posible (EMP) en el momento dado o en los paneles 7c y 7d como el area porcentual bajo la curva.
Descripcion detallada de la invencion
30
Se encontro que una protema de fusion que comprende al menos un anticuerpo de dominio unico que transmigra la BHE, por ejemplo, que se une a TMEM30A (CDC-50A) (como un dominio unico FC5) mejora en gran medida el transporte a traves de la BHE en comparacion con Vhh monovalente. En particular, la conformacion del sitio de union-Fc (del extremo amino al extremo carboxi) demostro actividad mejorada. Basado, al menos en parte, en este 35 transporte significativamente aumentado, se describen en el presente documento las moleculas con transporte incrementado a traves de la barrera hematoencefalica, los procedimientos para aumentar el transporte a traves de la barrera hematoencefalica y los procedimientos de tratamiento que usan dichas moleculas.
Antes de una descripcion adicional de la invencion, por conveniencia, se describen ciertos terminos a continuacion: 40
I. Definiciones
Como se usa en la presente memoria, el termino "protema" o "polipeptido" se refiere a un polfmero de dos o mas de los aminoacidos naturales o aminoacidos no naturales.
45
El termino "aminoacido" incluye alanina (Ala o A); arginina (Arg o R); asparagina (Asn o N); acido aspartico (Asp o D); cistema (Cys o C); glutamina (Gln o Q); acido glutamico (Glu o E); glicina (Gly o G); histidina (His o H); isoleucina (Ile o I): leucina (Leu o L); lisina (Lys o K); metionina (Met o M); fenilalanina (Phe o F); prolina (Pro o P); serina (Ser o S); treonina (Thr o T); triptofano (Trp o W); tirosina (Tyr o Y); y valina (Val o V). Los aminoacidos no tradicionales 50 tambien estan dentro del alcance de la invencion e incluyen norleucina, omitina, norvalina, homoserina y otros analogos de residuos de aminoacidos tales como los descritos enEllman y col. Meth. Enzym. 202:301-336 (1991). Para generar dichos residuos de aminoacidos no naturales, se pueden usar los procedimientos deNoren y col. Science 244:182 (1989) y Ellman y col.,supra. En resumen, estos procedimientos implican activar qmmicamente un ARNt supresor con un residuo de aminoacido no natural seguido de transcripcion y traduccion in vitro del ARN. La 55 introduccion del aminoacido no tradicional tambien puede lograrse usando qmmicas de peptidos conocidas en la tecnica. Como se usa en la presente memoria, el termino "aminoacido polar" incluye aminoacidos que tienen carga neta cero, pero tienen cargas parciales distintas de cero en diferentes partes de sus cadenas laterales (por ejemplo, M, F, W, S, Y, N, Q, C). Estos aminoacidos pueden participar en interacciones hidrofobicas e interacciones electrostaticas. Como se usa en la presente memoria, el termino "aminoacido cargado" incluye aminoacidos que 60 pueden tener una carga neta diferente de cero en sus cadenas laterales (por ejemplo, R, K, H, E, D). Estos
aminoacidos pueden participar en interacciones hidrofobicas e interacciones electrostaticas.
Como se usa en la presente memoria, el termino "peptido conector" se refiere a secuencias de aminoacidos que conectan o unen dos secuencias polipeptfdicas, p. ej., que unen dos dominios polipeptfdicos, cuyas secuencias de 5 aminoacidos no conectan o unen los dos dominios polipeptfdicos de forma natural en la naturaleza. En una realizacion, un peptido conector es sintetico. Como se usa en la presente memoria, el termino "sintetico" se refiere a secuencias de aminoacidos que no son de origen natural.
Los peptidos conectores de la invencion conectan dos secuencias de aminoacidos mediante enlaces peptfdicos. En 10 una realizacion, un peptido conector conecta un resto que transmigra la BHE a un segundo resto, por ejemplo, un dominio o region de un resto Fc. En una realizacion, un peptido conector de la invencion conecta un resto farmacologicamente activo con un segundo resto en una secuencia lineal, por ejemplo, un segundo resto que es un resto que transmigra la BHE o un dominio o region de un resto Fc. En otra realizacion, un peptido conector conecta dos restos farmacologicamente activos. En una realizacion, un peptido conector conecta o fusiona geneticamente 15 uno o mas dominios Fc o regiones a un resto no Fc.
En el contexto de polipeptidos, una "secuencia lineal" o una "secuencia" es el orden de los aminoacidos en un polipeptido en una direccion amino a carboxilo terminal en la que los residuos que se encuentran en la secuencia son contiguos en la estructura primaria del polipeptido.
20
Como se usa en el presente documento, los terminos "unido", "fusionado" o "fusion" se usan indistintamente. Estos terminos se refieren a la union de dos o mas elementos o componentes, por cualquier medio, incluida la conjugacion qmmica o medios recombinantes. Como se usa en el presente documento, la expresion "fusionado de forma covalente" o "acoplado de forma covalente" significa que los restos especificados estan unidos de forma covalente 25 directamente entre sf, o si no, estan unidos de forma covalente indirectamente entre sf por medio de un resto o restos intermedios, tales como un peptido o resto que actuan de union. En una realizacion preferida, los restos se fusionan de forma covalente. Un tipo de enlace covalente es un enlace peptfdico. Los procedimientos de conjugacion qmmica (por ejemplo, mediante agentes de reticulacion heterobifuncionales) son conocidos en la tecnica. Los restos fusionados tambien pueden estar fusionados geneticamente. Como se usa en el presente 30 documento, el termino "fusionado geneticamente", "unido geneticamente" o "fusion genetica" se refiere al enlace colinear y covalente o union de dos o mas protemas, polipeptidos o fragmentos de los mismos a traves de sus cadenas peptfdicas individuales, a traves de expresion genetica de una sola molecula de polinucleotido que codifica esas protemas, polipeptidos o fragmentos. Dicha fusion genetica da como resultado la expresion de una unica secuencia genetica contigua. Las fusiones geneticas preferidas estan en fase, es decir, dos o mas marcos de lectura 35 abiertos (ORF) se fusionan para formar un ORF continuo mas largo, de una manera que mantiene el marco de lectura correcto de los ORF originales. De este modo, la protema de fusion recombinante resultante es un unico polipeptido que contiene dos o mas segmentos de protema que corresponden a polipeptidos codificados por los ORF originales (cuyos segmentos normalmente no estan tan unidos en la naturaleza). En este caso, el unico polipeptido se escinde durante el procesamiento para producir moleculas dimericas que comprenden dos cadenas 40 polipeptfdicas.
Los polipeptidos sujeto comprenden al menos un resto farmacologicamente activo. Un resto farmacologicamente activo se refiere a un resto capaz de realizar una accion o una reaccion en un contexto biologico. Por ejemplo, el termino "resto farmacologicamente activo" se refiere a moleculas farmacologicamente activas o partes de las 45 mismas que se unen a componentes de un sistema biologico (por ejemplo, protemas en fluidos biologicos o en la superficie de celulas o en la matriz celular) y cuya union da como resultado una efecto biologico (por ejemplo, medido por un cambio en el resto activo y/o el componente al que se une (por ejemplo, una escision del resto activo y/o del componente al que se une, la transmision de una senal, o el aumento o inhibicion de una respuesta biologica en una celula o en un sujeto)). Los restos farmaceuticamente activos preferidos son restos terapeuticos.
50
Los ejemplos de restos farmacologicamente activos pueden comprender, por ejemplo, un farmaco, un fragmento de union a antfgeno de una molecula de anticuerpo o una parte del mismo (por ejemplo, F(ab), scFv, un dominio VH o un dominio VL) (p. ej., transmitir, inducir o bloquear una respuesta biologica), una porcion de union a ligando de un receptor o una porcion de union a receptor de un ligando, una enzima, etc. En una realizacion, un resto 55 farmacologicamente activo comprende la forma madura de una protema. En otra realizacion, un resto farmacologicamente activo comprende una parte de una protema de longitud completa que retiene actividad biologica. Otros ejemplos de restos farmacologicamente activos incluyen aminoacidos, peptidos, protemas, acidos nucleicos terapeuticamente utiles, que incluyen, pero no se limitan a, polinucleotidos, oligonucleotidos, carbohidratos y lfpidos. Los ejemplos de restos farmacologicamente activos de la presente invencion incluyen factores 60 neurotroficos, factores de crecimiento, enzimas, anticuerpos, neurotransmisores, neuromoduladores, antibioticos,
agentes antivirales, agentes antifungicos, agentes para la formacion de imageries medicas o detectables, isotopos y agentes quimioterapeuticos y similares. Los restos farmacologicamente activos de la presente invencion tambien incluyen farmacos, profarmacos y precursores que pueden activarse cuando el agente terapeutico se administra al tejido diana. El termino "restos farmacologicamente activos" no pretende incluir un resto que transmigra la BHE. Los 5 agentes farmacologicamente activos son restos que no transmigran la BHE.
Las moleculas de union de la invencion son protefnas "quimericas" o "de fusion". Dichas protefnas comprenden una primera secuencia de aminoacidos unida a una segunda secuencia de aminoacidos a la que no esta unida de forma natural en la naturaleza. Las secuencias de aminoacidos pueden existir normalmente en protefnas separadas que se 10 juntan en el polipeptido de fusion o pueden existir normalmente en la misma protefna pero se situan en una nueva disposicion en el polipeptido de fusion. Se puede crear una protefna quimerica mediante procedimientos bien conocidos en la tecnica, por ejemplo, mediante sfntesis qufmica, o creando y traduciendo un polinucleotido en el que las regiones peptfdicas estan codificadas en la relacion deseada.
15 Los polipeptidos de la divulgacion son moleculas de union, es decir, que comprenden dominios de union o sitios de union derivados de anticuerpos que transmigran la BHE. Un anticuerpo que transmigra la BHE facilita la transmigracion a traves de la BHE de un resto unido al mismo. Ejemplos de los sitios de union a anticuerpos que transmigran la BHE se describen en la patente de los EE. UU. N.° 7,943,129. En un aspecto, un anticuerpo que transmigra la BHE se une a TMEM30A.
20 Los terminos "dominio de union" o "sitio de union", como se usan en la presente memoria, se refieren a la parte, region o sitio del polipeptido que media la union especffica con una molecula diana (por ejemplo, un sitio de union a TMEM30A u otro sitio que facilita la transmigracion de la BHE). Los ejemplos de dominios de union incluyen un sitio de union a antfgeno (por ejemplo, un dominio VH y/o VL) o moleculas que comprenden dicho sitio de union (por ejemplo, un anticuerpo o un anticuerpo de dominio unico).
25
Los polipeptidos de la divulgacion son monovalentes o multivalentes con respecto al resto que transmigra la BHE, por ejemplo, comprenden al menos 1, 2, 3, 4, 5 o mas restos que transmigran la BHE,.
Los restos farmacologicamente activos como se describen en el presente documento tambien pueden incluir 30 dominios de union o sitios de union, por ejemplo, derivados de una molecula de anticuerpo (por ejemplo, un dominio VH y/o VL de un anticuerpo que no transmigra a traves de la BHE), moleculas que comprenden dicho sitio de union (por ejemplo, un anticuerpo o anticuerpo de dominio unico), un dominio de union a receptor de un ligando, un dominio de union a ligando de un receptor o un dominio catalftico. El termino "dominio de union a ligando" como se usa en el presente documento se refiere a un receptor nativo (por ejemplo, receptor de superficie celular) o una 35 region o derivado del mismo que retiene al menos una capacidad de union de ligando cualitativa, y preferentemente la actividad biologica del receptor nativo correspondiente. El termino "dominio de union a receptor" como se usa en el presente documento se refiere a un ligando nativo o una region o derivado del mismo que retiene al menos una capacidad de union al receptor cualitativa, y preferentemente la actividad biologica del ligando nativo correspondiente.
40
En una realizacion, los polipeptidos de la invencion son anticuerpos modificados. Como se usa en el presente documento, el termino "anticuerpo modificado" incluye formas sinteticas de anticuerpos que estan alterados de tal manera que no son de origen natural, por ejemplo, anticuerpos que comprenden al menos dos porciones de cadena pesada pero no dos cadenas pesadas completas (tales como anticuerpos con dominios eliminados o minicuerpos); 45 formas multiespecfficas de anticuerpos (por ejemplo, biespecfficos, triespecfficos, etc.) alterados para unirse a dos o mas antfgenos diferentes, p. ej., a TMEM30A y un sitio de union diana terapeuticamente relevante) unidos a restos Fc, dominios, regiones o regiones scFc.
Como se usa en el presente documento, el termino "region Fc" se definira como la parte de un polipeptido que 50 corresponde a la region Fc de la inmunoglobulina nativa, es decir, como se forma por la asociacion dimerica de los respectivos dominios Fc (o restos Fc) de sus dos cadenas pesadas. Una region Fc nativa es homodimerica y comprende dos cadenas polipeptfdicas. Por el contrario, el termino "region Fc fusionada geneticamente" o "region Fc monocatenaria" (region scFc), como se usa en el presente documento, se refiere a una region Fc sintetica dimerica compuesta de dominios Fc (o restos Fc) geneticamente unidos dentro de una unica cadena polipeptfdica (es decir, 55 codificada en una unica secuencia genetica contigua) como se describe, por ejemplo, en la solicitud estadounidense N.° 20110243966. En un aspecto, cuando se usa una region scFc, la molecula de union es monovalente con respecto al resto que transmigra la BHE.
Como se usa en el presente documento, el termino "dominio Fc" se refiere a la parte de una unica cadena pesada de 60 inmunoglobulina que comienza en la region de bisagra justo cadena arriba del sitio de escision de papafna (es decir,
el residuo 216 en IgG, tomando el primer resto de la region constante de cadena pesada como 114) y termina en el extremo C-terminal del anticuerpo. Por consiguiente, un dominio Fc completo comprende al menos un dominio de bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3. Como se usa en la presente memoria, el termino "region Fc" se refiere a dominios Fc dimerizados que se asemejan a la region Fc de anticuerpos nativos (por ejemplo, ya sea en el formato 5 tradicional de dos cadenas polipeptfdicas o como una region Fc de cadena unica).
Como se usa en la presente memoria, el termino "parte del dominio Fc" o "resto Fc" incluye una secuencia de aminoacidos de un dominio Fc o derivada de un dominio Fc. En ciertos aspectos, un resto Fc comprende al menos una de las siguientes opciones: un dominio de bisagra (por ejemplo, region bisagra superior, media y/o inferior), un 10 dominio CH2, un dominio CH3, un dominio CH4, o una variante, parte o fragmento de los mismos. En otras realizaciones, un resto Fc comprende un dominio Fc completo (es decir, un dominio de bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3). En un aspecto, un resto Fc comprende un dominio de bisagra (o una parte del mismo) fusionado a un dominio CH3 (o una parte del mismo). En otra realizacion, un resto Fc comprende un dominio CH2 (o una parte del mismo) fusionado a un dominio CH3 (o una parte del mismo). En otro aspecto, un resto Fc consiste en un dominio 15 CH3 o una parte del mismo. En otro aspecto, un resto Fc consiste en un dominio de bisagra (o una parte del mismo) y un dominio CH3 (o una parte del mismo). En otro aspecto, un resto Fc consiste en un dominio CH2 (o una parte del mismo) y un dominio CH3 (o una parte del mismo). En otro aspecto, un resto Fc consiste en un dominio de bisagra (o una parte del mismo) y un dominio CH2 (o una parte del mismo). En un aspecto, un resto Fc carece de al menos una parte de un dominio CH2 (por ejemplo, todo o parte de un dominio CH2).
20
En una realizacion, una molecula de union de la invencion comprende una region Fc completa, o bien puede estar presente como una cadena polipeptfdica (una molecula scFc) o en forma de tipo salvaje como dos cadenas polipeptfdicas.
25 Especfficamente unido se refiere a dos moleculas que forman un complejo que es relativamente estable en condiciones fisiologicas. La union especffica se caracteriza por una alta afinidad y una capacidad baja a moderada a diferencia de la union inespecffica que generalmente tiene una baja afinidad con una capacidad de moderada a alta. Normalmente, la union se considera especffica cuando la constante de afinidad KA es superior a 106M-1, o mas preferiblemente superior a 108M-1. Si es necesario, la union no especffica se puede reducir sin afectar 30 sustancialmente a la union especffica variando las condiciones de union. Las condiciones de union apropiadas tales como concentracion de las moleculas, fuerza ionica de la solucion, temperatura, tiempo permitido para la union, concentracion de un agente bloqueante (por ejemplo, albumina serica, casefna de leche), etc., pueden ser optimizadas por un experto en la tecnica mediante tecnicas rutinarias. Un resto Fc de la invencion comprende al menos la parte de una molecula de Fc conocida en la tecnica que se requiere para la union a FcRn, denominada en 35 la presente memoria companero de union del receptor neonatal (FcRn). Un companero de union a FcRn es una molecula o una porcion de la misma al que se puede unir especfficamente el receptor FcRn con el consiguiente transporte activo por el receptor FcRn del companero de union a FcRn.
Los companeros de union a FcRn de la presente invencion abarcan moleculas a las que se puede unir 40 especfficamente el receptor de FcRn e incluyen IgG completa, el fragmento de Fc de IgG y otros fragmentos que incluyen la region de union completa del receptor de FcRn. En otra realizacion, un dominio o region del resto Fc de una molecula de union de la invencion se modifica de manera que muestra una union reducida o minima a FcRn. La region de la porcion Fc de IgG que se une al receptor FcRn se ha descrito basandose en cristalograffa de rayos X (Burmeister y col. 1994, Nature 372:379). El area de contacto principal del Fc con el FcRn esta cerca de la union de 45 los dominios CH2 y CH3. Los contactos Fc-FcRn estan todos dentro de una sola cadena pesada de Ig. Los companeros de union a FcRn incluyen IgG completa, el fragmento Fc de IgG, y otros fragmentos de IgG que incluyen la region de union completa de FcRn. Los principales sitios de contacto incluyen los residuos de aminoacidos 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311, y 314 del dominio CH2 y los residuos de aminoacidos 385-387, 428, y 433-436 del dominio CH3. Las referencias a la numeracion de aminoacidos de inmunoglobulinas o 50 fragmentos de inmunoglobulinas, o regiones, se basan en Kabat y col. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Public Health, Bethesda, Md.
La region Fc de IgG puede modificarse de acuerdo con procedimientos bien reconocidos tales como mutagenesis de sitio dirigido, y similares, para producir fragmentos modificados de IgG o Fc o porciones de los mismos, que se 55 uniran por FcRn. Dichas modificaciones incluyen modificaciones alejadas de los sitios de contacto de FcRn, asf como modificaciones dentro de los sitios de contacto que preservan o incluso mejoran la union a FcRn. Por ejemplo, los siguientes residuos de aminoacidos individuales en Fc de IgG1 humano (Fc y1) pueden sustituirse sin perdida
significativa de afinidad de union a Fc por FcRn: P238A, S239A, K246A, K248A, D249A, M252A, T256A, E258A,
T260A, D265A, S267A, H268A, E269A, D270A, E272A, L274A, N276A, Y278A, D280A, V282A, E283A, H285A,
60 N286A, T289A, K290A, R292A, E293A, E294A, Q295A, Y296F, N297A, S298A, Y300F, R301A, V303A, V305A,
T307A, L309A, Q311A, D312A, N315A, K317A, E318A, K320A, K322A, S324A, K326A, A327Q, P329A, A330Q,
P331A, E333A, K334A, T335A, S337A, K338A, K340A, Q342A, R344A, E345A, Q347A, R355A, E356A, M358A,
T359A, K360A, N361A, Q362A, Y373A, S375A, D376A, A378Q, E380A, E382A, S383A, N384A, Q386A, E388A,
N389A, N390A, Y391F, K392A, L398A, S400A, D401A, D413A, K414A, R416A, Q418A, Q419A, N421A, V422A,
5 S424A, E430A, N434A, T437A, Q438A, K439A, S440A, S444A, y K447A, donde, por ejemplo, P238A representa la prolina de tipo salvaje sustituida por alanina en la posicion numero 238.
Algunas de las mutaciones anteriores pueden conferir nuevas funcionalidades al resto de Fc. Por ejemplo, una realizacion incorpora N297A, que elimina un sitio de N-glicosilacion altamente conservado. El efecto de esta 10 mutacion es reducir la glucosilacion, lo que reduce la funcion efectora y/o la inmunogenicidad. Como ejemplo adicional de la nueva funcionalidad que surge a partir de las mutaciones descritas anteriormente, la afinidad por FcRn puede aumentar en algunos casos mas alla de la de tipo salvaje. Esta afinidad aumentada puede reflejar un aumento de la frecuencia "activada", una disminucion de la frecuencia "inactiva" o tanto un aumento de la frecuencia "activada" como una disminucion de la frecuencia "inactiva". Las mutaciones que se cree que proporcionan una 15 mayor afinidad por FcRn incluyen T256A, T307A, E380A, y N434A (Shields y col. 2001, J. Biol. Chem. 276:6591).
En una realizacion, el companero de union a FcRn es un polipeptido que incluye la secuencia PKNSSMISNTP (SEQ ID NO: ) y opcionalmente ademas incluye una secuencia seleccionada de entre HQSLGTQ (SEQ ID NO: ), HQNLSDGK (SEQ ID NO: ), HQNISDGK (SEQ ID NO: ), o VISSHLGQ (SEQ ID NO: ) (patente estadounidense N°. 20 5,739,277).
Los expertos en la tecnica estaran familiarizados con muchos otros mutantes Fc o analogos de los mismos que exhiben una funcion efectora alterada y/o union a FcRn. Ademas, los medios para modificar qufmicamente regiones constantes de inmunoglobulina (por ejemplo, pegiladas), o fragmentos de las mismas (vease, p.ej.,Aslam y Dent 25 1998, Bioconjugation: Protein Coupling Techniques For the Biomedical Sciences Macmilan Reference, London) se conocen bien en la tecnica, por ejemplo, en lasolicitud estadounidense N.° 20120003210.
En una realizacion, un resto Fc se aglicosila mediante procedimientos conocidos en la tecnica, por ejemplo, mutando residuos que normalmente estan glicosilados o alterando la expresion del polipeptido de manera que no se produce 30 la glicosilacion. Por ejemplo, una realizacion especffica, incorpora la mutacion N297A, que elimina un sitio de N- glicosilacion altamente conservado. En otra realizacion, un resto Fc incorpora una mutacion en la posicion 299, por ejemplo, una mutacion T299 a otro aminoacido como se describe enen la patente de EE. UU. N.° 7,863,419. Ademas de alanina, otros aminoacidos se pueden sustituir por los aminoacidos de tipo salvaje en las posiciones especificadas anteriormente o conocidas en la tecnica para reducir la funcion Fc.
35
En otra realizacion, las mutaciones descritas en Armour, K.L., Clark, M.R., Hadley, A.G. y Williamson L.M. (1999), Eur J Immunol 29: 2613-2624 se pueden introducir en las moleculas de union sujeto.
Las mutaciones pueden introducirse individualmente en Fc dando lugar a mas de cien restos de Fc distintos del Fc 40 nativo. Ademas, las combinaciones de dos, tres o mas de estas mutaciones individuales se pueden introducir juntas, dando lugar a cientos de regiones Fc potenciales adicionales. Ademas, uno de los restos Fc de una construccion de la invencion puede estar mutado y el otro resto Fc no estar mutado, o ambos pueden estar mutados pero con diferentes mutaciones.
45 Tambien se contemplan mimeticos peptfdicos de al menos una parte de una region constante de inmunoglobulina, por ejemplo, un mimetico peptfdico de un fragmento Fc o un mimetico peptfdico de un companero de union a FcRn. En un aspecto, el mimetico peptfdico se identifica mediante la tecnica de expresion en fago o mediante el cribado de bibliotecas qufmicas (vease p.ej.,McCafferty y col. 1990, Nature 348:552,Kang y col. 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4363;EP 0 589 877 B1).
50
En otro aspecto, una region Fc de la invencion (por ejemplo, una region scFc) comprende al menos la parte de una molecula Fc conocida en la tecnica porque se la requiere para la union a FcyR.
En otro aspecto, una region Fc de la invencion (por ejemplo, una region scFc) comprende al menos la parte de una 55 molecula Fc conocida en la tecnica porque se la requiere para la union a protefna A. En otro aspecto, una region Fc de la invencion (por ejemplo, una region scFc) comprende al menos la parte de una molecula Fc conocida en la tecnica porque se la requiere para la union a protefna G. En un aspecto, dicha molecula no se une a FcRn.
Tal y como se describe en el presente documento, un experto habitual en la materia entendera que un dominio Fc 60 tambien puede modificarse incluyendo uno o mas cambios de aminoacidos (sustituciones, adiciones o deleciones)
de manera que varfe en la secuencia de aminoacidos de un resto Fc de tipo silvestre. Muchos de estos cambios o alteraciones son conocidos en la tecnica. En ciertas realizaciones ejemplares, el resto Fc conserva una funcion efectora (por ejemplo, union a FcyR) y en ciertas realizaciones, el resto Fc carece o tiene una funcion efectora reducida.
5
Los dominios Fc o restos de un polipeptido de la invencion pueden ser de cualquier isotipo (A, E, G o M) y pueden derivarse de diferentes moleculas de inmunoglobulina. Por ejemplo, un dominio Fc o resto de un polipeptido puede comprender un dominio CH2 y/o CH3 derivado de una molecula IgG1 y una region bisagra derivada de una molecula IgG3. En otro ejemplo, un dominio o resto Fc puede comprender una region bisagra quimerica derivada, en parte, de 10 una molecula de IgG1 y, en parte, de una molecula de IgG3. En otro ejemplo, un dominio o resto Fc puede comprender una bisagra quimerica derivada, en parte, de una molecula de IgG1 y, en parte, de una molecula de IgG4.
Los polipeptidos que comprenden los peptidos conectores de la invencion pueden prepararse usando tecnicas que 15 son conocidas en la tecnica. En una realizacion, los polipeptidos de la invencion se producen de "manera recombinante", es decir, se producen usando tecnologfa de ADN recombinante. Las tecnicas a modo de ejemplo para fabricar los polipeptidos de la invencion se exponen con mas detalle en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, el termino "vehfculo farmaceuticamente aceptable" significa una 20 composicion o compuesto qufmico con el que se puede combinar un ingrediente activo y que, despues de la combinacion, se puede usar para administrar el ingrediente activo a un sujeto. Como se usa en la presente memoria, el termino ester o sal "fisiologicamente aceptable" significa un ester o forma de sal del ingrediente activo que es compatible con cualquier otro ingrediente de la composicion farmaceutica, que no sea nocivo para el sujeto al que se administrara la composicion. Como se usa en la presente memoria, "vehfculo farmaceuticamente aceptable" tambien 25 incluye, pero no se limita a, uno o mas de las siguientes opciones: excipientes; agentes tensioactivos; agentes dispersantes; diluyentes inertes; agentes de granulacion y desintegracion; agentes de union; agentes lubricantes; agentes edulcorantes; agentes aromatizantes; agentes colorantes; conservantes; composiciones fisiologicamente degradables tales como gelatina; vehfculos acuosos y solventes; vehfculos y solventes aceitosos; agentes de suspension; agentes dispersantes o humectantes; agentes emulsionantes, demulcentes; tampones; sales; agentes 30 espesantes; materiales de relleno; agentes emulsionantes; antioxidantes; agentes estabilizantes; y materiales polimericos o hidrofobos farmaceuticamente aceptables. Otros "ingredientes adicionales" que pueden incluirse en las composiciones farmaceuticas de la invencion son conocidos en la tecnica y se describen, por ejemplo, enGenaro, ed., 1985, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa. Como se usa en el presente documento, "una cantidad efectiva" es una cantidad suficiente para producir una respuesta terapeutica.
35
Como se usa en el presente documento, el termino "proteinopatfa" se refiere a trastornos caracterizados por protefnas plegadas incorrectamente o protefnas agregadas y esos trastornos tienen un componente genetico.
II. Anticuerpos que transmigran la BHE
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En un aspecto, un resto que transmigra la BHE es como se describe en la patente de los EE. UU. N.°. 7,943,129. Por ejemplo, en una realizacion, un resto que transmigra la BHE comprende una secuencia de aminoacidos expuesta en una secuencia seleccionada del grupo que constituido por: SEQ ID NO:85 (FC5), SEQ ID NO:86 (fC44), and SEQ ID NO:87 (FC7) tal como se expone en la patente de los EE. UU. N.° 7,943,129. En una 45 realizacion, un resto que transmigra la BHE es un resto FC5. FC5 es un anticuerpo de cadena pesada (HCA, tambien conocido como anticuerpo de dos cadenas, de dos cadenas pesadas, Vhh o anticuerpo de dominio unico) derivado de un camelido. En comparacion con las inmunoglobulinas convencionales de cuatro cadenas de tipo IgG, que tambien son producidas por los camelidos, estos anticuerpos carecen de las cadenas ligeras y los dominios CH1 de las inmunoglobulinas convencionales. Una de las caracterfsticas principales de estos anticuerpos de cadena 50 pesada de origen natural es la presencia predominante de Glu, Arg y Gly que se situan en el interfaz VL 44, 45 y 47 (numeracion de Kabat), respectivamente, de su dominio variable (denominado Vhh). Las mismas posiciones en el dominio variable de la cadena pesada de anticuerpos de cuatro cadenas convencionales (denominadas VH) estan ocupadas casi exclusivamente por Gly, Leu y Trp. Se cree que estas diferencias son responsables de la alta solubilidad y estabilidad del dominio variable HCA (Vhh) de camelidos, en comparacion con la insolubilidad relativa 55 del dominio VH de los anticuerpos convencionales de cuatro cadenas. Otras dos caracterfsticas clave de los dominios Vhh de los camelidos son su CDR3 comparativamente mas larga y la alta incidencia de pares de cistefna en las CDR. Parece que los pares de cistefna median en la formacion de un puente disulfuro y, por lo tanto, estan implicados en la modulacion de la topologfa superficial del sitio de combinacion del anticuerpo. En la estructura cristalina de un complejo sdAb-lisozima de camello, un bucle rfgido que sobresale del sdAb y que esta parcialmente 60 estabilizado por un enlace disulfuro de la CDR se extiende fuera del sitio de combinacion y penetra profundamente
en el sitio activo de la lisozima (Desmyter y col., Nature Struct. Biol., 3, 803-811 (1996)).
En un aspecto, un anticuerpo que transmigra la BHE se une a TMEM30A (C6orf67, CDC50A). Los restos ejemplares que se unen a TMEM30A son conocidos o pueden prepararse mediante procedimientos bien conocidos en la 5 tecnica. Por ejemplo, una secuencia de aminoacidos que comprende la secuencia de aminoacidos de TMEM30A o una parte de la misma se puede usar para producir anticuerpos que reconocen especfficamente la secuencia de aminoacidos TMEM30A o para seleccionar restos de union que se unen especfficamente a TMEM30A de una biblioteca de sitios de union. Los sitios de union de dichos anticuerpos o derivados de bibliotecas se pueden usar en una molecula de union de la invencion. La secuencia de aminoacidos de TMEM30A se muestra a continuacion:
10
10
20 A 40 50 60
MAMNYNAKDE
VDGGPPCAPG GTAKTRRPDN TAFKQQRLPA WQPILTAGTV LPIFFIIGLI
70
80 90 100_ no 120
FIPIGIGIFV
TSNNIREIEI DYTGTEPSSP CNKCLSPDVT PCFCTINFTL EKSFEGNVFM
130
140 150 160_ 1 ~0. 180
YYGLSNFYQN
HRRYVKSRDD SQLNGDSSAL LNPSKECEPY RRNEDKPIAP CGAIANSMFN
190
2 00 210 220 23_0 240
DTLELFLIGN
DSYPIPIALK KKGIAWWTDK NVKFRNPPGG DNLEERFKGT TKPVNWLKPV
25 0
260 270 2 8 0^ 2 90 300
YMLDSDPDNN
GFINEDFIVW MRTAALPTFR KLYRLIERKS DLHPTLPAGR YSLNVTYNYP
310
320 330 3 4_0 3 50 360
VHYFDGRKRM
ILSTISWMGG KNPFLGIAYI AVGSISFLLG WLLVINHRY RNSSNTADIT
Los polipeptidos de la invencion pueden comprender una region variable o parte de la misma (por ejemplo, un dominio VL y/o VH) derivada de un anticuerpo que se une a TMEM30A usando protocolos reconocidos en la tecnica. 15 Por ejemplo, el dominio variable puede derivarse de un anticuerpo producido en un mamffero no humano, por ejemplo, murino, cobaya, primate, conejo o rata, mediante inmunizacion del mamffero con el antfgeno o un fragmento del mismo. Vease Harlow y Lane, supra. La inmunoglobulina puede generarse mediante multiples inyecciones subcutaneas o intraperitoneales del antfgeno relevante (por ejemplo, antfgenos purificados asociados a tumores o celulas o extractos celulares que comprenden tales antfgenos) y un adyuvante. Esta inmunizacion 20 normalmente provoca una respuesta inmune que comprende la produccion de anticuerpos reactivos contra antfgenos a partir de esplenocitos o linfocitos activados.
Si bien la region variable puede derivarse de anticuerpos policlonales cosechados a partir del suero de un mamffero inmunizado, a menudo es deseable aislar linfocitos individuales del bazo, de los nodulos linfaticos o de la sangre 25 periferica para proporcionar preparaciones homogeneas de anticuerpos monoclonales (MAb) a partir de los cuales se deriva la region variable deseada. Para producir anticuerpos policlonales, normalmente se usan conejos o conejillos de indias. Para producir anticuerpos monoclonales, se usan normalmente ratones. Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar contra un fragmento inyectando un fragmento de antfgeno en un raton, preparando "hibridomas" y seleccionando los hibridomas para un anticuerpo que se une especfficamente al 30 antfgeno. En este procedimiento ya conocido en la tecnica (Kohler y col., (1975), Nature, 256:495) los linfocitos relativamente effmeros o mortales del raton que se han inyectado con el antfgeno se fusionan con una lfnea celular tumoral inmortal (por ejemplo, una lfnea celular de mieloma), produciendo asf celulas hfbridas o "hibridomas" que son inmortales y capaces de producir el anticuerpo geneticamente codificado por la celula B. Los hfbridos resultantes se segregan en cepas geneticas individuales por seleccion, dilucion y recrecimiento con cada cepa 35 individual que comprende genes especfficos para la formacion de un unico anticuerpo. Producen anticuerpos que son homogeneos contra un antfgeno deseado y, en referencia a su origen genetico puro, se denominan "monoclonales".
Las celulas de hibridoma preparadas de esa manera se pueden sembrar y cultivar en un medio de cultivo adecuado 40 que preferentemente contiene una o mas sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las celulas de mieloma parentales no fusionadas. Los expertos en la tecnica apreciaran que los reactivos, las lfneas celulares y los medios para la formacion, seleccion y crecimiento de hibridomas estan disponibles en el mercado a partir de varias fuentes y que los protocolos estandarizados estan bien establecidos. Generalmente, el medio de cultivo en el que se cultivan las celulas de hibridoma se somete a ensayo para la produccion de anticuerpos monoclonales contra el
antfgeno deseado. Preferentemente, la especificidad de union de los anticuerpos monoclonales producidos por celulas de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitacion o mediante un ensayo in vitro, tal como un radioinmunoensayo (RIA) o un ensayo de inmunoabsorcion ligado a enzimas (ELISA). Despues de identificar las celulas de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones se 5 pueden subclonar mediante procedimientos de dilucion limitante y cultivar mediante procedimientos estandar (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pags. 59-103 (Academic Press, 1986)). Se apreciara ademas que los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se pueden separar del medio de cultivo, fluido de ascitis o suero mediante procedimientos de purificacion convencionales tales como, por ejemplo, cromatograffa de afinidad (por ejemplo, cromatograffa de afinidad con protefna A, protefna G o protefna L), 10 cromatograffa de hidroxiapatita, electroforesis en gel o dialisis.
Opcionalmente, los anticuerpos pueden cribarse para unirse a una region especffica o fragmento deseado del antfgeno sin unirse a otros fragmentos no solapantes del antfgeno. El ultimo cribado puede realizarse determinando la union de un anticuerpo a una coleccion de mutantes de delecion del antfgeno y determinando que mutantes de 15 delecion se unen al anticuerpo. La union se puede evaluar, por ejemplo, mediante transferencia Western o ELISA. El fragmento mas pequeno para mostrar la union especffica al anticuerpo define el epftopo del anticuerpo. Como alternativa, puede determinarse la especificidad de los epftopos mediante un ensayo de competicion en el que una prueba y un anticuerpo de referencia compiten por la union al antfgeno. Si la prueba y los anticuerpos de referencia compiten, entonces se unen al mismo epftopo o epftopos suficientemente proximal, de manera que la union de un 20 anticuerpo interfiere con la union del otro.
El ADN que codifica el anticuerpo monoclonal deseado puede aislarse y secuenciarse facilmente usando cualquiera de los procedimientos convencionales descritos para el aislamiento de secuencias de dominio de region constante (por ejemplo, usando sondas de oligonucleotidos que son capaces de unirse especfficamente a genes que codifican 25 las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos murinos). Las celulas de hibridoma aisladas y subclonadas sirven como una fuente preferida de dicho ADN. Mas particularmente, el ADN aislado (que puede ser sintetico como se describe en la presente memoria) puede usarse para clonar las secuencias de la region variable deseada para la incorporacion en los polipeptidos de la invencion.
30 En otras realizaciones, el sitio de union se deriva de un anticuerpo completamente humano. Se pueden generar anticuerpos humanos o sustancialmente humanos en animales transgenicos (por ejemplo, ratones) que son incapaces de producir inmunoglobulinas endogenas (vease, por ejemplo, las patentes de los EE. UU. N.° 6,075,181,5,939,598,5,591,669 y 5,589,369, cada uno de los cuales se incorpora en el presente documento por referencia). Por ejemplo, se ha descrito que la delecion homocigotica de la region de union de la cadena pesada del 35 anticuerpo en ratones mutantes quimericos y de la lfnea germinal da como resultado la inhibicion completa de la produccion de anticuerpos endogenos. La transferencia de una matriz de genes de inmunoglobulina humana a tales ratones mutantes de la lfnea germinal dara como resultado la produccion de anticuerpos humanos tras la exposicion al antfgeno. Otro medio preferido para generar anticuerpos humanos usando ratones SCID se describe en la patente de los Estados Unidos N.° 5,811,524. Se apreciara que el material genetico asociado con estos anticuerpos 40 humanos tambien se puede aislar y manipular como se describe en el presente documento.
Aun otro medio altamente eficiente para generar anticuerpos recombinantes es descrito porNewman, Biotechnology, 10: 1455-1460 (1992)). Especfficamente, esta tecnica da como resultado la generacion de anticuerpos primatizados que contienen dominios variables de mono y secuencias constantes humanas. Esta bibliograffa se incorpora por 45 referencia en su totalidad en el presente documento. Ademas, esta tecnica tambien se describe en las patentes de los Estados Unidos N.° 5,658,570,5,693,780 y 5,756,096 asignadas comunmente. En otra realizacion, se pueden seleccionar los linfocitos mediante micromanipulacion y aislar los genes variables. Por ejemplo, las celulas mononucleares de sangre periferica pueden aislarse de un mamffero inmunizado y cultivarse durante aproximadamente 7 dfas in vitro. Los cultivos pueden examinarse para detectar anticuerpos especfficos que 50 cumplan los criterios de seleccion. Las celulas de pocillos positivos se pueden aislar. Las celulas B productoras de Ig individuales pueden aislarse mediante FACS o identificarlas en un ensayo en placa hemolftica mediada por el complemento. Las celulas B productoras de Ig pueden micromanularse en un tubo y los genes de VH y VL pueden amplificarse usando, por ejemplo, RT-PCR. Los genes VH y VL pueden clonarse en un vector de expresion de anticuerpo y transfectarse en celulas (por ejemplo, celulas eucarioticas o procariotas) para su expresion.
55
Como alternativa, los dominios variables (V) se pueden obtener a partir de bibliotecas de secuencias genicas variables de un animal de eleccion. Las bibliotecas que expresan combinaciones aleatorias de dominios, por ejemplo, dominios VH y/o VL, pueden cribarse con un antfgeno deseado para identificar elementos que tienen caracterfsticas de union deseadas. Procedimientos de dicho cribado se conocen bien en la tecnica. Por ejemplo, los 60 repertorios de genes de anticuerpos se pueden clonar en un vector de expresion de bacteriofagos A (Huse, WD y
col. (1989). Science, 2476:1275). Ademas, se pueden cribar celulas (Francisco y col. (1994), PNAS, 90:10444;Georgiou y col. (1997), Nat. Biotech., 15:29; Boder y Wittrup (1997) Nat. Biotechnol. 15:553; Boder y col.(2000), PNAS, 97:10701;Daugtherty, P. y col. (2000) J. Immunol. Methods. 243:211) o virus (p. ej.,Hoogenboom, HR. (1998), Immunotechnology 4:1;Winter y col. (1994). Annu. Rev. Immunol. 12:433;Griffiths, aD. (1998). Curr.
5 Opin. Biotechnol. 9:102) que expresan anticuerpos en su superficie.
Los expertos en la tecnica apreciaran tambien que los dominios variables de anticuerpo que codifican ADN tambien pueden derivarse de librerfas de anticuerpos expresadas en fagos, levaduras o bacterias mediante procedimientos conocidos en la tecnica. Procedimientos ejemplares se exponen, por ejemplo,en el documento EP 368 684 B1;la 10 patente de los EE. UU. N.° 5,969,108;Hoogenboom y col., (2000) Immunol. Today 21:371;Nagy y col. (2002) Nat. Med. 8:801;Huie y col. (2001), PNAS, 98:2682;Lui y col. (2002), J. Mol. Biol. 315:1063. Varias publicaciones (p.ej.,Marks y col. (1992), Bio/Technology 10:779-783) han descrito la produccion de anticuerpos humanos de alta afinidad mediante barajado de cadenas, asf como la infeccion combinatoria y la recombinacion in vivo como una estrategia para construir grandes bibliotecas de fagos. En otra realizacion, se puede usar la presentacion en 15 ribosomas para reemplazar el bacteriofago como plataforma de presentacion (vease, p.ej.,Hanes, y col. (1998), PNAS 95:14130;Hanes y Pluckthun. (1999), Curr. Top. Microbiol. Immunol. 243:107; He y Taussig. (1997), Nuc. Acids Res., 25:5132; Hanes y col. (2000), Nat. Biotechnol. 18:1287; Wilson y col. (2001), PNAS, 98:3750; oIrving y col. (2001) J. Immunol. Methods 248:31).
20 Las bibliotecas ejemplares para cribado son bibliotecas de genes variables humanos. Tambien se pueden usar los dominios Vl y Vh de una fuente no humana. Las bibliotecas pueden ser de sujetos no inmunizados, de sujetos inmunizados o semisinteticas (Hoogenboom y Winter. (1992). J. Mol. Biol. 227:381;Griffiths y col. (1995) EMBO J. 13:3245;de Kruif y col. (1995). J. Mol. Biol. 248:97;Barbas y col. (1992), PNAS, 89:4457). En una realizacion, pueden realizarse mutaciones en dominios de inmunoglobulina para crear una biblioteca de moleculas de acido nucleico que 25 tienen una mayor heterogeneidad (Thompson y col. (1996), J. Mol. Biol. 256:77; Lamminmaki y col. (1999), J. Mol. Biol. 291:589; Caldwell y Joyce. (1992), PCR Methods Appl. 2:28; Caldwell y Joyce. (1994), PCR Methods Appl. 3:S136). Se pueden usar procedimientos de seleccion estandar para seleccionar variantes de alta afinidad. En otra realizacion, los cambios en las secuencias Vh y Vl pueden aumentar la avidez del anticuerpo, por ejemplo, usando informacion obtenida de estructuras cristalinas mediante tecnicas conocidas en la tecnica.
30
Otro ejemplo de biblioteca es una biblioteca de camelidos que comprende anticuerpos de dominio unico. Los ejemplos de moleculas de un solo dominio incluyen un dominio aislado y variable de cadena pesada (VH) de un anticuerpo, es decir, un dominio variable de cadena pesada, sin un dominio variable de cadena ligera, y un dominio aislado y variable de cadena ligera (Vl) de un anticuerpo, es decir, cadena ligera de dominio variable, sin un dominio 35 variable de cadena pesada. Los ejemplos de anticuerpos de dominio unico empleados en las moleculas de union de la invencion incluyen, por ejemplo, el dominio variable de la cadena pesada de camelidos (de aproximadamente 118 a 136 residuos de aminoacido) como se describe en Hamers-Casterman, y col., Nature 363:446-448 (1993), y Dumoulin, y col., Protein Science 11:500-515 (2002). Otros ejemplos de anticuerpos de dominio unico incluyen dominios VH o VL unicos, tambien conocidos como Dabs® (Domantis Ltd., Cambridge, Reino Unido). Otros 40 anticuerpos mas de dominio unico incluyen anticuerpos de tiburon (por ejemplo, Ig-NAR de tiburon). Los Ig-NAR de tiburon comprenden un homodfmero de un dominio variable (V-NAR) y cinco dominios constantes tipo C (C-NAR), en los que la diversidad se concentra en una region alargada de CDR3 que tiene una variacion de longitud de 5 a 23 residuos. En especies de camelidos (por ejemplo, llamas), la region variable de la cadena pesada, denominada Vhh, forma el dominio de union al antfgeno completo. Las principales diferencias entre las regiones Vhh variables de 45 camelidos y las derivadas de anticuerpos convencionales (VH) incluyen (a) aminoacidos mas hidrofobos en la superficie de contacto de la cadena ligera de VH en comparacion con la region correspondiente en Vhh, (b) una cDR3 mas larga en Vhh, y (c) la frecuente aparicion de un enlace disulfuro entre cDR1 y CDR3 en Vhh. Los procedimientos para preparar moleculas de union de dominio unico se describen en las patentes de los EE. UU. N.° 6,005,079 y 6,765,087, ambas se incorporan por referencia en el presente documento. Los anticuerpos de dominio 50 unico ejemplares que comprenden dominios Vhh incluyen Nanobodies® (Ablynx NV, Gante, Belgica).
Ademas, las secuencias de region variable utiles para producir los polipeptidos de la presente invencion se pueden obtener a partir de varias fuentes diferentes. Por ejemplo, como se indica anteriormente, una variedad de secuencias de genes humanos estan disponibles en forma de depositos de acceso publico. Se han publicado muchas 55 secuencias de anticuerpos y genes que codifican anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos de los que se sabe que tienen propiedades clfnicamente beneficiosas) y se pueden sintetizar secuencias de region variable adecuadas (por ejemplo, secuencias VL y VH) a partir de estas secuencias mediante tecnicas reconocidas en la tecnica.
En otra realizacion, un dominio de union de un polipeptido de la invencion consiste en un dominio Vh, por ejemplo, 60 derivado de camelidos, que es estable en ausencia de una cadena de Vl (Hamers-Casterman y col. (1993). Nature,
363:446;Desmyter y col. (1996). Nat. Struct. Biol. 3: 803;Decanniere y col. (1999). Structure, 7:361;Davies y col. (1996). Protein Eng., 9:531;Kortt y col. (1995). J. Protein Chem., 14:167).
Un polipeptido de la invencion puede comprender un dominio variable o CDR derivado de un anticuerpo 5 completamente murino, completamente humano, quimerico, humanizado, de primates no humanos o primatizado. Los anticuerpos no humanos, o fragmentos o dominios de los mismos, se pueden alterar para reducir su inmunogenicidad mediante tecnicas reconocidas en la tecnica. Los anticuerpos humanizados son anticuerpos derivados de anticuerpos no humanos, que se han modificado para retener o retener sustancialmente las propiedades de union del anticuerpo parental, pero que son menos inmunogenicos en humanos que los anticuerpos 10 parentales no humanos. En el caso de anticuerpos diana humanizados, esto puede lograrse mediante diversos procedimientos, que incluyen (a) injertar los dominios variables no humanos completos en regiones constantes humanas para generar anticuerpos diana quimericos; (b) injertar al menos una parte de una o mas de las regiones determinantes de la complementariedad no humana (CDR) en un marco humano y regiones constantes con o sin retencion de residuos estructurales crfticos; (c) trasplantar los dominios variables no humanos completos, pero 15 "enmascararlos" con una seccion de tipo humano mediante el reemplazo de residuos superficiales. Dichos procedimientos se describen en Morrison y col., (1984), PNAS. 81: 6851-5;Morrison y col., (1988), Adv. Immunol. 44: 65-92;Verhoeyen y col., (1988), Science 239: 1534-1536;Padlan, (1991), Molec. Immun. 28: 489-498;Padlan, (1994), Molec. Immun. 31: 169-217; y las patentes de los EE. UU. N.° 5,585,089, 5,693,761y5,693,762. Tambien se puede usar la desinmunizacion para disminuir la inmunogenicidad de un polipeptido de la invencion. Como se usa en el 20 presente documento, el termino "desinmunizacion" incluye la modificacion de epftopos de celulas T (vease, p.ej., los documentos WO9852976A1,WO0034317A2). Por ejemplo, las secuencias VH y VL se analizan y se genera un "mapa" epitopico de celulas T humano de cada region V que muestra la ubicacion de los epftopos en relacion con las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) y otros residuos clave dentro de la secuencia. Los epftopos de celulas T individuales del mapa de epftopos de celulas T se analizan con el fin de identificar sustituciones de 25 aminoacidos alternativas con un riesgo bajo de alterar la actividad del anticuerpo final. Se disena una serie de secuencias de VH y VL alternativas que comprenden combinaciones de sustituciones de aminoacidos y estas secuencias se incorporan posteriormente en una serie de polipeptidos de la invencion cuya funcionalidad se analiza. Normalmente, se generan y prueban entre 12 y 24 anticuerpos variantes. Los genes completos de la cadena pesada y ligera que comprenden las regiones V y C humanas modificadas se clonan a continuacion en vectores de 30 expresion y los plasmidos posteriores se introducen en lfneas celulares para la produccion de anticuerpo completo. Luego se comparan los anticuerpos en ensayos bioqufmicos y biologicos adecuados, y se identifica la variante optima.
En una realizacion, los dominios variables empleados en un polipeptido de la invencion se alteran mediante al 35 menos una sustitucion parcial de una o mas CDR. En otra realizacion, los dominios variables pueden alterarse opcionalmente, por ejemplo, mediante una sustitucion parcial de una region de marco y un cambio de secuencia. Al preparar una region variable humanizada, las CDR pueden derivarse de un anticuerpo de la misma clase o incluso una subclase como el anticuerpo del que se derivan las regiones estructurales, sin embargo, se preve que las CDR se derivaran de un anticuerpo de una clase diferente y preferentemente de un anticuerpo de una especie diferente. 40 Puede que no sea necesario reemplazar todas las cDr con las CDR completas de la region variable del donante para transferir la capacidad de union del antfgeno de un dominio variable a otro. Por el contrario, puede que solo sea necesario transferir los residuos que son necesarios para mantener la actividad del dominio de union. Dadas las explicaciones expuestas en las patentes de los EE. UU. N.° 5,585,089,5,693,761 y 5,693,762, sera de la competencia de los expertos en la tecnica, obtener un sitio funcional de union a antfgeno con inmunogenicidad 45 reducida, ya sea llevando a cabo la experimentacion de rutina o mediante pruebas de ensayo y error.
FC5 es un resto de union a TMEM30A ejemplar que puede incorporarse en un polipeptido de la invencion. La secuencia de aminoacidos de FC5 se expone a continuacion:
50
EVQLQASGGGLVQAGGSLRLSCAASGFKITHYTM GWFRQAP GKE REF VSR I TWGGDNT F Y SN SVKGRF TISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTADYYCAAGSTS TATPLRV---DYWGKGTQVTVSS
III. Peptidos conectores opcionales
Los polipeptidos de la invencion comprenden opcionalmente al menos un peptido conector. En una realizacion, dos 55 o mas peptidos conectores estan presentes en un polipeptido del polipeptido de la invencion. En otra realizacion, un polipeptido de la invencion comprende 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 peptidos conectores.
WWLos peptidos conectores de la invencion pueden aparecer una vez en una posicion dada, o pueden ocurrir multiples veces (es decir, la secuencia del peptido conector puede repetirse x veces en la secuencia) en una posicion dada en un polipeptido recombinante. Por ejemplo, en una realizacion, un peptido conector de la invencion 5 se repite entre 1 y 10 veces (inclusive) en una posicion dada en un polipeptido. En otra realizacion, un peptido conector se da 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 veces en una posicion dada en un polipeptido.
Los peptidos conectores de la invencion pueden ser de diferentes longitudes. En una realizacion, un peptido conector de la invencion tiene una longitud de aproximadamente 5 a aproximadamente 75 aminoacidos. En otra 10 realizacion, un peptido conector de la invencion tiene una longitud de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 aminoacidos. En otra realizacion, un peptido conector de la invencion tiene una longitud de aproximadamente 10 a aproximadamente 40 aminoacidos. En otra realizacion, un peptido conector de la invencion tiene una longitud de aproximadamente 15 a aproximadamente 35 aminoacidos. En otra realizacion, un peptido conector de la invencion tiene una longitud de aproximadamente 15 a aproximadamente 20 aminoacidos. En otra realizacion, un peptido 15 conector de la invencion tiene una longitud de aproximadamente 15 aminoacidos.
Los peptidos conectores se usan con tanta frecuencia en la ingenierfa de protefnas que se han convertido en piezas de ensamblaje estandar en biologfa sintetica (vease p. ej.,Anderson, J.C., y col. Journal of Biological Engineering 2010. 4:1y el sitio web de registro de partes que enumera las partes biologicas estandar que se usan en 20 construcciones geneticas).
Algunos ejemplos de usos actuales reconocidos en la tecnica para peptidos conectores incluyen usos en: moleculas scFv (Freund y col. FEBS 1993. 320:97); moleculas de inmunoglobulina monocatenarias (Shu y col. 1993. PNAS. USA 90:7995); minicuerpos (Hu y col. 1996 Cancer Res. 56:3055); anticuerpos con el dominio CH2 eliminado 25 (Mueller, B.M., y col. 1990 pNaS USA. 87:5702); anticuerpos biespecfficos monocatenarios (Schlereth y col. 2005 Cancer Res. 65:2882); anticuerpos biespecfficos tipo IgG de longitud completa (Marvin, J.S. Y col.2005 Acta Pharmacol Sin 26:649 y la bibliograffa citada en esos documentos, asf como Michaelson, J.S., y col. 2009 MAbs.1:128 y Orcutt K.D. y col. 2010 Protein Eng Des Sel. 23:221); protefnas de fusion scFv (deGraaf y col. 2002 British Journal of Cancer 86:811); el desarrollo ensayos de complementacion de fragmentos de protefnas (Remy, I. y 30 col. 2007 BioTechiques 42:137).
Otros peptidos conectores ejemplares incluyen aquellos que reducen la xilosa (p. ej., como se describe en el documento WO2012088461) pueden emplearse en las moleculas de union instantanea.
35 Los peptidos conectores se pueden unir al extremo N-terminal o al extremo C-terminal (o ambos) de los polipeptidos a los que estan unidos.
IV. Ejemplos de restos farmaceuticamente activos
40 Dependiendo de la enfermedad o trastorno o condicion diana, se puede administrar una variedad de cargas de farmacos, por ejemplo, agentes farmacologicamente activos o, de forma equivalente, restos farmaceuticamente activos, con exito in vivo usando moleculas de union de la invencion. Como se usa en el presente documento, los terminos "resto farmaceuticamente activo" y "compuesto farmacologico" se referiran a cualquier resto o compuesto util en el tratamiento o la mejora de los efectos de una enfermedad o trastorno. Por ejemplo, las enfermedades o 45 trastornos que incluyen enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington, la esclerosis lateral amiotrofica (ELA, enfermedad de Lou Gehrig), la epilepsia del dolor, las enfermedades de almacenamiento y la esclerosis multiple pueden ser la diana.
Las moleculas farmaceuticamente activas ejemplares incluyen: factor de crecimiento nervioso (NGF), factor 50 neurotrofico derivado del cerebro (BDNF), factor neruotrofico ciliar (CNTF), factor neurotrofico de la lfnea celular glial (GDNF) y factor de crecimiento similar a la insulina (IGF). Ademas, otros compuestos que han demostrado tener potencial terapeutico y que pueden administrarse mediante anticuerpos son neuropeptidos, que incluyen, pero no se limitan a, Sustancia P, neuropeptido Y, dalargina, alfa sinuclefna, peptido intestinal vasoactivo (VIP), gamma-amino acido butfrico (GABA), dopamina, colecistoquinina (CCK), endorfinas, encefalinas y hormona liberadora de 55 tirotropina (TRH). Otros ejemplos terapeuticos pueden incluir citoquinas, agentes ansiolfticos, anticonvulsivos, polinucleotidos y transgenes, que incluyen, por ejemplo, ARN de interferencia pequeno que pueden usarse para dichos trastornos neuronales, que incluyen, pero no se limitan a, enfermedades psiquiatricas, tales como, por ejemplo, ansiedad , depresion, esquizofrenia y trastornos del sueno, asf como epilepsias, trastornos convulsivos, apoplejfa y trastornos cerebrovasculares, encefalitis y meningitis, trastornos de la memoria y la cognicion, dolor 60 agudo o cronico (por ejemplo, refractario) y trauma ffsico.
En una realizacion, un resto farmaceuticamente activo comprende un sitio de union a antfgeno que no se une a TMEM30A. En ciertas realizaciones, los polipeptidos de la invencion tienen al menos un sitio de union especffico para una molecula diana diferente de TMEm3oA que media un efecto biologico. En una realizacion, el sitio de union 5 modula la activacion o inhibicion celular (por ejemplo, uniendose a un receptor de superficie celular y dando como resultado la transmision de una senal activadora o inhibidora). En una realizacion, el sitio de union es capaz de iniciar la transduccion de una senal que produce la muerte de la celula (por ejemplo, mediante una via inducida por senal celular, por fijacion del complemento o exposicion a una carga util (por ejemplo, una carga toxica) presente en el molecula de union), o que modula una enfermedad o trastorno en un sujeto (por ejemplo, mediando o 10 promoviendo la muerte celular, promoviendo la lisis de un coagulo de fibrina o promoviendo la formacion de coagulos, o modulando la cantidad de una sustancia que es biodisponible). En otra realizacion, los polipeptidos de la invencion tienen al menos un sitio de union especffico para un antfgeno dirigido para reduccion o eliminacion, por ejemplo, un antfgeno de superficie celular o un antfgeno soluble).
15 En otras realizaciones mas, un polipeptido de la invencion se une a una molecula que es util en el tratamiento de una enfermedad o trastorno neurologico. Por ejemplo, un polipeptido se puede unir a un antfgeno presente en una celula neuronal (por ejemplo, una neurona, una celula glial, o a). En ciertas realizaciones, el antfgeno asociado con un trastorno neurologico puede ser un trastorno autoinmune o inflamatorio descrito anteriormente. Como se usa en el presente documento, el termino "enfermedad o trastorno neurologico" incluye trastornos o afecciones en un sujeto 20 en el que el sistema nervioso o bien degenera (por ejemplo, trastornos neurodegenerativos, asf como trastornos en los que el sistema nervioso no se desarrolla adecuadamente o no se regenera despues de una lesion; por ejemplo, una lesion de la medula espinal). Los ejemplos de trastornos neurologicos que pueden ser diagnosticadas, prevenidas o tratadas con composiciones de la presente invencion incluyen, pero no se limitan a, esclerosis multiple, enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, dolor neuropatico, lesion cerebral 25 traumatica, sfndrome de Guillain-Barre y polineuropatfa desmielinizante inflamatoria cronica (CIDP).
A continuacion se analizan otros restos farmacologicamente activos adicionales:
i. Porciones de union a antfgeno
30
En ciertas realizaciones, un resto farmaceuticamente activo comprende al menos una porcion de union a antfgeno (sitio de union), por ejemplo, de un anticuerpo o anticuerpo de dominio unico. En una realizacion, la porcion de union a antfgeno dirige la composicion a un tipo o tejido de celula particular.
35 En otras realizaciones, un sitio de union de un resto farmaceuticamente activo de la invencion puede comprender una parte o fragmento de union a antfgeno. El termino "porcion de union a antfgeno" se refiere a un fragmento polipeptfdico de una inmunoglobulina, anticuerpo o variante de anticuerpo que se une al antfgeno o compite con el anticuerpo intacto (es decir, con el anticuerpo intacto del que derivaban) para la union al antfgeno (es decir, una union especffica). Por ejemplo, los fragmentos de union a antfgeno se pueden derivar de anticuerpos o variantes de 40 anticuerpos descritos. Las porciones de union a antfgeno se pueden producir por procedimientos recombinantes o bioqufmicos que son bien conocidos en la tecnica. Los ejemplos de fragmentos de union a antfgeno incluyen VH y/o VL (si cualquier region variable sola es suficiente para unir el antfgeno), Fv, Fab, Fab' y (Fab')2.
En otras realizaciones, un resto farmaceuticamente activo de la invencion puede comprender un sitio de union de 45 una molecula de union monocatenaria (por ejemplo, una region variable de cadena unica o scFv). Las tecnicas descritas para la produccion de anticuerpos monocatenarios (patente de los EE. UU. N.°. 4,694,778;Bird, Science 242:423-442 (1988);Huston y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988); y Ward y col., Nature 334:544554 (1989)) pueden adaptarse para producir moleculas de union monocatenarias. Los anticuerpos monocatenarios se forman uniendo los fragmentos de cadena pesada y ligera de la region Fv por medio de un puente de 50 aminoacidos, dando como resultado un anticuerpo monocatenario. Tambien se pueden usar tecnicas para el ensamblaje de fragmentos Fv funcionales en E. coli. (Skerra y col., Science 242:1038-1041 (1988)).
En ciertas realizaciones, un resto farmaceuticamente activo de la invencion comprende uno o mas sitios de union o regiones que comprenden o consisten en una secuencia de region variable de cadena unica (scFv). Las secuencias 55 de la region variable de cadena unica comprenden un unico polipeptido que tiene uno o mas sitios de union a antfgeno, por ejemplo, un dominio de VL unido por un peptido conector a un dominio de VH. Los dominios VL y/o VH pueden derivarse de anticuerpos conocidos en la tecnica o variantes de los mismos. Las moleculas ScFv se pueden construir en una orientacion VH-conector-VL o VL-conector-VH.
60 En ciertas realizaciones, una molecula de scFv empleada en un resto farmaceuticamente activo de la invencion es
una molecula de scFv estabilizada. En una realizacion, la molecula scFv estabilizada puede comprender un peptido conector interpuesto entre un dominio Vh y un dominio Vl, en el que los dominios Vh y Vl estan unidos por un enlace disulfuro entre un aminoacido en el dominio Vh y un aminoacido en el dominio Vl. En otras realizaciones, la molecula scFv estabilizada puede comprender un conector scFv con una longitud o composicion optimizada. En otras formas 5 de realizacion mas, la molecula scFv estabilizada puede comprender un dominio Vh o Vl que tiene al menos una sustitucion de aminoacido estabilizador. En otra realizacion mas, una molecula de scFv estabilizada puede tener al menos dos de las caracterfsticas de estabilizacion enumeradas anteriormente.
Las moleculas scFv estabilizadas tienen una estabilidad proteica mejorada o imparten estabilidad proteica mejorada 10 al polipeptido al que estan operativamente unidos. Ejemplos de moleculas scFv estabilizadas que pueden estar presentes en los polipeptidos de la invencion se describen enla patente de los EE. UU. N.° 7,951,918. En ciertas realizaciones ejemplares, los restos farmaceuticamente activos de la invencion comprenden al menos una molecula de scFv que esta operativamente unida mediante un peptido conector al extremo C-terminal y/o al extremo N- terminal de una region Fc.
15
En una realizacion, un resto farmaceuticamente activo de la invencion comprende al menos una CDR de un anticuerpo que reconoce una diana deseada. En otra realizacion, un resto farmaceuticamente activo de la presente invencion comprende al menos dos CDR de un anticuerpo que reconoce una diana deseada. En otra realizacion, un resto farmaceuticamente activo de la presente invencion comprende al menos tres CDR de un anticuerpo que 20 reconoce una diana deseada. En otra realizacion, un resto farmaceuticamente activo de la presente invencion comprende al menos cuatro CDR de un anticuerpo que reconoce una diana deseada. En otra realizacion, un resto farmaceuticamente activo de la presente invencion comprende al menos cinco CDR de un anticuerpo que reconoce una diana deseada. En otra realizacion, un resto farmaceuticamente activo de la presente invencion comprende las seis CDR de un anticuerpo que reconoce una diana deseada. En una realizacion, un resto farmaceuticamente activo 25 de la invencion comprende la secuencia de aminoacidos completa de una molecula de anticuerpo que reconoce una diana deseada (por ejemplo, en el caso de una molecula de anticuerpo tetravalente biespecffica).
Los ejemplos de anticuerpos a partir de los cuales pueden derivarse sitios de union para el uso en un resto farmaceuticamente activo de la invencion son conocidos en la tecnica. Por ejemplo, los anticuerpos actualmente 30 aprobados por la FDA para su uso en el tratamiento pueden usarse para derivar sitios de union. En una realizacion, un sitio de union ejemplar se deriva de un anticuerpo anti-Lingo (vease, p.ej.,WO2008086006). En otros aspectos, un resto farmaceuticamente activo de la invencion puede comprender una molecula de anticuerpo modificada o un sitio de union a antfgeno (o partes del mismo) derivado de una forma modificada de un anticuerpo. Los ejemplos de tales formas incluyen, p. ej., minicuerpos, diacuerpos, triacuerpos, nanoanticuerpos, camelidos, Dabs, anticuerpos 35 tetravalentes, intradiacuerpos (p.ej.,Jendreyko y col. 2003. J. Biol. Chem. 278:47813), protefnas de fusion (p.ej., protefnas de fusion de citocinas de anticuerpos, protefnas fusionadas a al menos una parte de un receptor de Fc), y anticuerpos biespecfficos. Se describen otros anticuerpos modificados, por ejemplo, en la patente de eE. UU. N.° N.° 4,745,055;EP 256,654;Faulkner y col., Nature 298:286 (1982);EP 120,694;EP 125,023;Morrison, J. Immun. 123:793 (1979);Kohler y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197 (1980);Raso y col., Cancer Res. 41:2073 (1981);Morrison y 40 col., Ann. Rev. Immunol. 2:239 (1984); Morrison, Science 229:1202 (1985); Morrison y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851 (1984); EP 255,694; EP 266,663; y WO 88/03559. Tambien se conocen cadenas de inmunoglobulinas reasignadas. Vease, por ejemplo, la patente de los EE. UU. N.° 4,444,878;WO 88/03565; y EP 68,763 y la bibliograffa citada en esos documentos.
45 En otra realizacion, un resto farmaceuticamente activo de la invencion comprende un sitio o region de union a antfgeno que es un diacuerpo o un sitio de union a antfgeno derivado del mismo. Los diacuerpos son moleculas dimericas, tetravalentes y cada una tiene un polipeptido similar a las moleculas scFv, pero normalmente tienen un conector de residuos de aminoacidos corto (por ejemplo, menos de 10 y preferentemente de 1 a 5) que conecta ambos dominios variables, de manera que los dominios VL y VH en la misma cadena de polipeptidos no pueden 50 interactuar. En cambio, el dominio Vl y Vh de una cadena polipeptfdica interactua con el dominio Vh y Vl (respectivamente) en una segunda cadena polipeptfdica (vease, por ejemplo, el documento WO 02/02781). En una realizacion, un resto farmaceuticamente activo de la invencion comprende un diacuerpo que esta unido operativamente al extremo N-terminal y/o al extremo C-terminal de al menos una region Fc fusionada geneticamente (es decir, region scFc).
55
En ciertas realizaciones, un resto farmaceuticamente activo de la invencion comprende un sitio de union de anticuerpo que no transmigra la BHE (por ejemplo, una molecula de union de dominio unico que no se une a TEME30A, tal como un anticuerpo de dominio unico).
60 ii. Moleculas de union no inmunogiobuifnicas
En ciertas otras realizaciones, un resto farmaceuticamente activo de la invencion comprende uno o mas sitios de union derivados de una molecula de union que no es una inmunoglobulina. Como se usa en el presente documento, el termino "moleculas de union no inmunoglobulfnicas" son moleculas de union cuyos sitios de union comprenden 5 una secuencia de aminoacidos derivada de un polipeptido distinto de una inmunoglobulina. Los ejemplos de moleculas de union que comprenden sitios de union no derivados de moleculas de anticuerpo incluyen sitios de union a receptor y sitios de union a ligando que se analizan con mas detalle mas adelante.
Los restos farmaceuticamente activos no inmunoglobulfnicos pueden comprender secuencias de aminoacidos que 10 se derivan de un miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas que no es una inmunoglobulina (por ejemplo, un receptor de celulas T o una protefna de adhesion celular (por ejemplo, CTLA-4, N-CAM, telokin)). En otras realizaciones, las secuencias de aminoacidos pueden comprender una topologfa de protefna que no se basa en el pliegue de inmunoglobulina (por ejemplo, protefnas de repeticion de anquirina o fibronectinas) pero que, no obstante, son capaces de unirse especfficamente a una diana.
15
Los restos farmaceuticamente activos no inmunoglobulfnicos se pueden identificar mediante seleccion o aislamiento de una variante de union a diana a partir de una biblioteca de moleculas de union que tienen sitios de union diversificados artificialmente. Se pueden generar bibliotecas diversificadas usando enfoques completamente aleatorios (por ejemplo, PCR propensa a error, mezcla aleatoria de exones o evolucion dirigida) o ayudadas por 20 estrategias de diseno reconocidas en la tecnica. Por ejemplo, las posiciones de aminoacidos que generalmente estan involucradas cuando el sitio de union interactua con su molecula diana analoga se pueden aleatorizar mediante la insercion de codones degenerados, trinucleotidos, peptidos aleatorios o bucles enteros en posiciones correspondientes dentro del acido nucleico que codifica el sitio de union (vease p. ej., la Pub. de EE. UU., N°. 20,040,132,028). La ubicacion de las posiciones de aminoacidos se puede identificar mediante la investigacion de la 25 estructura cristalina del sitio de union en complejo con la molecula diana. Las posiciones candidatas para la aleatorizacion incluyen bucles, superficies planas, helices y cavidades de union del sitio de union. En ciertas realizaciones, los aminoacidos dentro del sitio de union que son candidatos probables para la diversificacion pueden identificarse por su homologfa con el pliegue de inmunoglobulina. Por ejemplo, los residuos dentro de los bucles de fibronectina similares a CDR pueden aleatorizarse para generar una biblioteca de moleculas de union a fibronectina 30 (vease, p.ej.,Koide y col., J. Mol. Biol., 284: 1141-1151 (1998)). Otras partes del sitio de union que pueden aleatorizarse incluyen superficies planas. La seleccion puede lograrse mediante procedimientos reconocidos en la tecnica, como la presentacion en fagos, la presentacion en levadura o la presentacion en ribosomas.
En una realizacion, un resto farmaceuticamente activo de la invencion comprende un sitio de union de una molecula 35 de union a fibronectina. Las moleculas de union a fibronectina (por ejemplo, moleculas que comprenden los dominios de fibronectina de tipo I, II o III) muestran bucles similares a CDR que, a diferencia de las inmunoglobulinas, no dependen de enlaces disulfuro intracatenarios. Los procedimientos para fabricar polipeptidos de fibronectina se describen, por ejemplo, en el documento WO 01/64942 y en las patentes de los EE.uU. N.° 6,673,901,6,703,199,7,078,490, y 7,119,171. En una realizacion a modo de ejemplo, el polipeptido de fibronectina es 40 AdNectin® (Adnexus Therpaeutics, Waltham, MA).
En otra realizacion, un resto farmaceuticamente activo de la invencion comprende un sitio de union de un Affibody® (Abcam, Cambridge, MA). Los affibody se derivan de los dominios de union a inmunoglobulina de la protefna A estafilococica (SPA) (vease p.ej.,Nord y col., Nat. Biotechnol., 15: 772-777 (1997)). Los procedimientos para 45 preparar sitios de union de affibody se describen en las patentes de los EE. UU. N.° 6,740,734 y 6,602,977y en el documento WO 00/63243.
En otra realizacion, un resto farmaceuticamente activo de la invencion comprende un sitio de union de un Anticalin® (Pieris AG, Friesing, Alemania). Las anticalinas (tambien conocidas como lipocalinas) son miembros de una familia 50 diversa de protefnas p-barril cuya funcion es unir moleculas diana en su region de barril/bucle. Los sitios de union a lipocalina pueden disenarse aleatorizando secuencias de bucle conectando los filamentos del barril (vease, p.ej.,Schlehuber y col., Drug Discov. Today, 10: 23-33 (2005); Beste y col., PNAS, 96: 1898-1903 (1999)). Los sitios de union a anticalina empleados en las moleculas de union de la invencion se pueden obtener partiendo de polipeptidos de la familia de las lipocalinas que estan mutados en cuatro segmentos que corresponden a las 55 posiciones de secuencias de la secuencia polipeptfdica lineal que comprende las posiciones de aminoacidos 28 a 45, 58 a 69, 86 a 99 y 114 a 129 de la protefna de union a bilina (BBP) de Pieris brassica. Otros procedimientos para preparar sitios de union a anticalina se describen en los documentos WO99/16873 y WO 05/019254.
En una realizacion, un resto farmaceuticamente activo de la invencion comprende un sitio de union de un polipeptido 60 rico en cistefna. Los dominios ricos en cistefna empleados en la practica de la presente invencion normalmente no
forman una estructura de helice a, lamina p o barril p. Tfpicamente, los enlaces disulfuro promueven el plegamiento del dominio en una estructura tridimensional. Habitualmente, los dominios ricos en cistefna tienen al menos dos enlaces disulfuro, mas tfpicamente al menos tres enlaces disulfuro. Un polipeptido rico en cistefna ejemplar es una protefna de dominio A. Los dominios A (a veces llamados "repeticiones tipo complemento") contienen de 5 aproximadamente 30 a 50 o 30 a 65 aminoacidos. En algunas realizaciones, los dominios comprenden de aproximadamente 35 a 45 aminoacidos y en algunos casos aproximadamente 40 aminoacidos. En los 30-50 aminoacidos, hay aproximadamente 6 residuos de cistefna. De las seis cistefnas, los enlaces disulfuro se encuentran normalmente entre las siguientes cistefnas: C1 y C3, C2 y C5, C4 y C6. El dominio A constituye un resto de union a ligando. Los residuos de cistefna del dominio estan unidos por disulfuro para formar un resto compacto, 10 estable, funcionalmente independiente. Los grupos de estas repeticiones forman un dominio de union a ligando, y el agrupamiento diferencial puede impartir especificidad con respecto a la union del ligando. Los ejemplos de protefnas que contienen dominios A incluyen, por ejemplo, componentes del complemento (por ejemplo, C6, C7, C8, C9 y Factor I), serina proteasas (por ejemplo, enteropeptidasa, matriptasa y corina), protefnas transmembrana (por ejemplo, ST7, LRP3, LRP5 y LRP6) y receptores endocfticos (por ejemplo, receptor relacionado con sortilina, 15 receptor LDL, VLDLR, LRP1, LRP2 y ApoER2). Los procedimientos para fabricar protefnas de dominio A de una especificidad de union deseada se describen, por ejemplo, en los documentos WO 02/088171andWO 04/044011.
En otra realizacion, un resto farmaceuticamente activo de la invencion comprende un sitio de union de una protefna con repeticiones. Las protefnas con repeticiones son protefnas que contienen copias consecutivas de unidades 20 estructurales pequenas (por ejemplo, de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 aminoacidos) o repeticiones que se acumulan para formar dominios contiguos. Las protefnas con repeticiones se pueden modificar para adaptarlas a un sitio de union diana especffico ajustando el numero de repeticiones en la protefna. Los ejemplos de protefnas con repeticiones incluyen protefnas con repeticiones de anquirina disenadas (es decir, un DARPins®, Molecular Partners, Zurich, Suiza) (vease, p. ej., Binz y col., Nat. Biotechnol., 22: 575-582 (2004)) o protefnas con 25 repeticiones ricas en leucina (es decir, LRRP) (vease, p.ej., Pancer y col., Nature, 430: 174-180 (2004)). Todas las estructuras terciarias determinadas hasta ahora de unidades repetitivas de anquirina comparten una caracterfstica compuesta por una horquilla p seguida de dos helices a antiparalelas y terminando con un bucle que conecta la unidad de repeticion con la siguiente. Los dominios construidos de unidades repetitivas de anquirina se forman apilando las unidades repetitivas en una estructura extendida y curva. Los sitios de union a LRRP forman parte del 30 sistema inmune adaptativo de lampreas de mar y otros peces sin mandfbula y se asemejan a los anticuerpos en que se forman por la recombinacion de un conjunto de genes repetidos ricos en leucina durante la maduracion de linfocitos. Los procedimientos para preparar DARpins o sitios de union a LRRP se describen en los documentos WO 02/20565 y WO 06/083275.
35 Otros sitios de union no inmunoglobulfnicos que pueden emplearse en moleculas de union de la invencion incluyen sitios de union derivados de dominios de homologfa de Src (por ejemplo, dominios SH2 o SH3), dominios PDZ, beta- lactamasa, inhibidores de proteasa de alta afinidad o andamios de protefna de union a disulfuro pequenos como las toxinas del escorpion. Los procedimientos para preparar sitios de union derivados de estas moleculas se han descrito en la tecnica, vease p.ej.,Silverman y col., Nat. Biotechnol., 23(12): 1493-4 (2005);Panni y col, J. Biol. 40 Chem., 277: 21666-21674 (2002),Schneider y col., Nat. Biotechnol., 17: 170-175 (1999);Legendre y col., Protein Sci., 11:1506-1518 (2002); Stoop y col., Nat. Biotechnol., 21: 1063-1068 (2003); y Vita y col., PNAS, 92: 6404-6408 (1995)). Otros sitios de union mas pueden derivarse de un dominio de union seleccionado del grupo constituido por un dominio similar a EGF, un dominio Kringle, un dominio PAN, un dominio Gla, un dominio SRCR, un dominio inhibidor de tripsina pancreatica de Kunitz/bovino, un dominio del inhibidor de la serina proteasa de tipo Kazal, un 45 dominio de tipo trebol (tipo P), un dominio tipo C de von Willebrand, un dominio similar a anafilatoxina, un dominio CUB, una repeticion tipo I de tiroglobulina, un dominio clase A del receptor LDL, un dominio sushi, un dominio de enlace, un dominio de tipo I de trombospondina, un dominio de tipo inmunoglobulina, un dominio de lectina de tipo C, un dominio MAM, un dominio de tipo A de von Willebrand, un dominio B de somatomedina, un dominio de cuatro nucleos de disulfuro de tipo WAP, un dominio C de tipo F5/8, un dominio de hemopexina, un dominio similar a EGF 50 de tipo laminina, un dominio C2, un dominio CTLA-4 y otros dominios similares conocidos por los expertos en la tecnica, asf como derivados y/o variantes de los mismos. Los polipeptidos no inmunoglobulfnicos adicionales incluyen Avimers® (Avidia, Inc., Mountain View, CA, vease la publicacion PCT internacional N.° WO 06/055689 y la patente de los EE.UU. N.° 2006/0234299), Telobodies® (Biotech Studio, Cambridge, MA), Evibodies® (Evogenix, Sydney, Australia, vease la patente de los EE. UU. N.° 7,166,697), y Microbodies® (Nascacell Technologies, Munich, 55 Alemania).
iii. Porciones de union de receptores o ligandos
En otros aspectos, un resto farmaceuticamente activo de la invencion es una porcion de union a ligando de un 60 receptor y/o una porcion de union a un ligando de un receptor.
En otras realizaciones ejemplares, un resto farmaceuticamente activo de la invencion puede comprender uno o mas dominios de union a ligando o dominios de union a receptor derivados de una o mas de las siguientes protemas:
5 a. Citoquinas y receptores de citoquinas
Las citoquinas tienen efectos pleiotropicos sobre la proliferacion, la diferenciacion y la activacion funcional de los linfocitos. Diversas citoquinas, o porciones de union a receptores de las mismas, se pueden utilizar en las protemas de fusion de la invencion. Las citocinas ejemplares incluyen las interleuquinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-
10 5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-11, IL-12 , IL-13 e IL-18), los factores estimulantes de colonias (CSF) (por ejemplo, CSF
de granulocitos (G-CSF), CSF de granulocitos-macrofagos (GM-CSF) y CSF de macrofagos de monocitos (M-CSF)) factor de necrosis (TNF) alfa y beta, antfgeno 4 de linfocitos T citotoxicos (CTLA-4) e interferones tales como interferon-a, p o y (patentes de los EE.UU. N.° 4,925,793 y 4,929,554).
15 Los receptores de citocina tfpicamente consisten en una cadena alfa espedfica de ligando y una cadena beta
comun. Los receptores de citoquina ejemplares incluyen los de GM-CSF, IL-3 (patente de los EE. UU. N.°
5,639,605), IL-4 (patente de los EE. UU. N.° 5,599,905), IL-5 (patente de los EE.UU. N.° 5,453,491), IL10 receptor, IFNy (EP0240975), y la familia de receptores TNF (p.ej., TNFa (p.ej.,TNFR-1 (EP 417, 563), TNFR-2 (EP 417,014) receptor de linfotoxina beta).
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b. Protemas de adhesion
Las moleculas de adhesion son protemas unidas a la membrana que permiten que las celulas interactuen entre sf Diversas protemas de adhesion, que incluyen receptores de homing leucocitarios y moleculas de adhesion celular, o 25 porciones de union a receptores de las mismas, pueden incorporarse en una protema de fusion de la invencion. Los receptores de homing leucocitarios se expresan en las superficies de las celulas leucocitarias durante la inflamacion e incluyen las integrinas p-1 (por ejemplo, VLA-1, 2, 3, 4, 5 y 6) que median la union a los componentes de la matriz extracelular y las integrinas p2 (p. ej., LFA-1, LPAM-1, CR3 y CR4) que se unen a las moleculas de adhesion celular (CAM) en el endotelio vascular. Los ejemplos de CAM incluyen IcAM-1, ICAM-2, VCAM-1 y MAdCAM-1. Otras CAM 30 incluyen las de la familia de las selectinas, incluida la E-selectina, L-selectina y P-selectina.
c. Quimioquinas
Las quimiocinas, protemas quimiotacticas que estimulan la migracion de leucocitos hacia un sitio de infeccion, 35 tambien se pueden incorporar en una protema de fusion de la invencion. Las quimiocinas ejemplares incluyen protemas inflamatorias de macrofagos (MIP-1-a y MIP-1-p), el factor quimiotactico de neutrofilos y RANTES (regulado en la activacion normalmente expresada y secretada por celulas T).
d. Hormonas
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Las hormonas de crecimiento ejemplares para uso como restos farmacologicamente activos en las protemas de fusion de la invencion incluyen renina, hormona de crecimiento humano (HGH;patente de los Ee. UU. N.° 5,834,598), hormona de crecimiento humano N-metionil; hormona de crecimiento bovina; factor de liberacion de la hormona del crecimiento; hormona paratiroidea (PTH); hormona estimulante de la tiroides (TSH); tiroxina; proinsulina 45 e insulina (patentes de los EE. UU. N.° 5,157,021 y 6,576,608); hormona estimuladora folicular (FSH); calcitonina, hormona luteinizante (LH), leptina, glucagon; bombesina; somatropina; sustancia inhibidora de Muller; relaxina y prorelaxina; peptido asociado a gonadotropina; prolactina; lactogeno placentario; protema OB; o sustancia inhibidora de Muller.
50 e. Receptores y ligandos
En una realizacion, un resto farmaceuticamente activo de la invencion combina el(los) sitio(s) de union del ligando o receptor (por ejemplo, el dominio extracelular (ECD) de un receptor) con al menos una region Fc fusionada geneticamente (es decir, region scFc). En ciertas realizaciones, el sitio de union o dominio de la porcion de union a 55 ligando de un receptor puede derivarse de un receptor unido por un anticuerpo o variante de anticuerpo. En otras realizaciones, la porcion de union a ligando de un receptor se deriva de un receptor seleccionado del grupo constituido por un receptor de la superfamilia de inmunoglobulina (Ig) (por ejemplo, un receptor de celula T soluble, por ejemplo, mTCR® (Medigene AG, Munich, Alemania), un receptor de la superfamilia del receptor de TNF descrito anteriormente (por ejemplo, un receptor de TNFa soluble de una inmunoadhesina), un receptor de la familia de 60 receptores del factor neurotrofico derivado de celulas gliales (GDNF) (por ejemplo, GFRa3), un receptor de la
superfamilia de receptores acoplados a la protefna G (GPCR), un receptor de la superfamilia tirosina quinasa (TK), un receptor de la superfamilia activada por ligandos (LG), un receptor de receptores de quimiocinas, IL-1/receptor de tipo Toll (superfamilia TLR) y una superfamilia citocinas.
5
En otras realizaciones, el sitio de union o dominio de la porcion de union a receptor a un ligando puede derivarse de un ligando unido por un anticuerpo o variante del anticuerpo. Por ejemplo, el ligando puede unirse a un receptor seleccionado del grupo constituido por un receptor de la superfamilia de inmunoglobulinas (Ig), un receptor de la superfamilia de receptores de TNF, un receptor de la superfamilia de receptores acoplados a protefnas G (GPCR), 10 un receptor de la superfamilia del receptor de tirosina quinasa (TK), un receptor de la superfamilia activada por ligandos (LG), un receptor de la superfamilia de receptores de quimiocinas, la superfamilia del receptor IL-1/receptor de tipo Toll (TLR) y una superfamilia de receptores de citoquinas. En una realizacion ejemplar, el sitio de union de la porcion de union a receptor de un ligando se deriva de un ligando que pertenece a la superfamilia de ligando de TNF (por ejemplo, CD40L).
15
Los factores de crecimiento o sus receptores (o la union al receptor o porciones de union a ligando de los mismos) se pueden incorporar en las protefnas de fusion de la invencion. Los factores de crecimiento ejemplares incluyen el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y sus isoformas (patente de los EE. UU. N.° 5,194,596); factores de crecimiento fibroblastico (FGF), que incluyen a FGF y bFGF; factor natriuretico atrial (ANF); factores de crecimiento 20 hepaticos (HGF;patentes de eE. UU N.° 5,227,158 y 6,099,841), factores neurotroficos tales como el factor neurotrofico derivado de hueso (BDNF), ligandos del factor neurotrofico derivados de celulas gliales (p. ej., GDNF, neuturina, artemina y persefina), neurotrofina-3, -4, -5 o -6 (NT-3, NT-4, NT-5 o NT-6) o un factor de crecimiento nervioso como el factor de crecimiento derivado de plaquetas NGF-p (PDGF)(patentes de los EE.UU. N.° 4,889,919,4,845,075,5,910,574, y 5,877,016); factores de crecimiento transformantes (TGF) como TGF-alfa y TGF- 25 beta (WO 90/14359), factores osteoinductores, incluida la protefna morfogenetica osea (BMP); factores de crecimiento tipo insulina-I y II (IGF-I y IGF-II; patentes de los EE. UU. N.° 6,403,764 y 6,506,874); eritropoyetina (EPO); trombopoyetina (TPO, factor de celulas madre (SCF), trombopoyetina (TPO, ligando c-Mpl) y los polipeptidos de Wnt (patente de los EE.UU. N.° 6,159,462).
30 Los ejemplos de los receptores de factores de crecimiento que pueden usarse como restos farmacologicamente activos de la invencion incluyen receptores de EGF; receptores de VEGF (por ejemplo, Flt1 o Flk1/KDR), receptores de PDGF (WO 90/14425); receptores de HGF (patentes de los EE. UU. N.° 5,648,273, y5,686,292), y receptores neurotroficos que incluyen el receptor de baja afinidad (LNGFR), tambien denominado p75NTR o p75, que se une a NGF, BDNF y NT-3, y receptores de alta afinidad que son miembros de la familia trk del receptor tirosina quinasas 35 (p.ej., trkA, trkB (EP 455,460), trkC (EP 522,530)).
f. Farmacos
En otra realizacion, un agente farmacologicamente activo es un principio activo que se usa en el tratamiento, cura, 40 prevencion o diagnostico de la enfermedad o que se usa para mejorar de otro modo el bienestar ffsico o mental. Dichos farmacos pueden ser entidades qufmicas y ejemplos de dichas entidades se describen con mas detalle en el presente documento.
La presente invencion se puede aplicar para administrar otros agentes para el tratamiento de trastornos que afectan 45 al sistema nervioso y tambien se puede aplicar con fines diagnosticos. Las clases preferidas de agentes para el tratamiento de trastornos del SNC incluyen:
Farmacos que actuan en sitios de union sinaptica y neuroefectoras; analgesicos y anestesicos generales y locales tales como analgesicos y antagonistas opioides; hipnoticos y sedantes; medicamentos para el tratamiento de 50 trastornos psiquiatricos tales como depresion, esquizofrenia; antiepilepticos y anticonvulsivos; enfermedad de Huntington, envejecimiento y enfermedad de Alzheimer; agentes neuroprotectores (tales como antagonistas de aminoacidos excitadores y factores neurotropicos) y agentes neurorregenerativos; factores troficos tales como el factor neurotrofico derivado del cerebro, el factor neurotrofico ciliar o el factor de crecimiento nervioso; medicamentos dirigidos al tratamiento del trauma del SNC o apoplejfa; y medicamentos para el tratamiento de la 55 adiccion y el abuso de drogas; autacoides y medicamentos antiinflamatorios; agentes quimioterapeuticos para infecciones parasitarias y enfermedades microbianas; agentes inmunosupresores y farmacos contra el cancer; hormonas y antagonistas de hormonas; metales pesados y antagonistas de metales pesados; antagonistas para agentes toxicos no metalicos; agentes citostaticos para el tratamiento del cancer; sustancias de diagnostico para su uso en medicina nuclear, y agentes inmunoactivos e inmunorreactivos de radioterapia; y un numero de otros agentes 60 tales como transmisores y sus respectivos receptores-agonistas y antagonistas, sus respectivos precursores o
de receptores de la superfamilia de de receptores de
metabolitos; antibioticos, antiespasmodicos, antihistamfnicos, antinauseantes, relajantes, estimulantes, oligonucleotidos "sentido" y "antisentido", dilatadores cerebrales, psicotropicos, antimanfacos, dilatadores y constrictores vasculares, antihipertensivos, tratamientos para la migrana, hipnoticos, agentes hiper o hipoglucemiantes, agentes minerales o nutricionales, medicamentos contra la obesidad, anabolicos y antiasmaticos.
5
Los ingredientes activos tfpicos (por ejemplo, medicamentos) pueden ser cualquier sustancia que afecte el sistema nervioso o que se use para pruebas de diagnostico del sistema nervioso. Estos han sido descritos por Gilman y col. (1990), "Goodman and Gilman's--The Pharmacological Basis of Therapeutics", Pergamon Press, New York, e incluyen los siguientes agentes:
10 acetilcolina y esteres de colina sinteticos, alcaloides colinomimeticos naturales y sus congeneres sinteticos, agentes anticolinesterasicos, estimulantes ganglionares, atropina, escopolamina y farmacos antimuscarfnicos relacionados, catecolaminas y farmacos simpaticomimeticos, como epinefrina, norepinefrina y dopamina, agonistas adrenergicos, antagonistas de los receptores adrenergicos, transmisores tales como GABA, glicina, glutamato, acetilcolina, dopamina, 5-hidroxitriptamina e histamina, peptidos neuroactivos;
15 analgesicos y anestesicos tales como analgesicos opioides y antagonistas; medicamentos preanestesicos y anestesicos como benzodiazepinas, barbituricos, antihistamfnicos, fenotiazinas y butilfenonas; opioides; antiemeticos; farmacos anticolinergicos tales como atropina, escopolamina o glicopirrolato; cocafna; derivados de cloral; etilclorovinol; glutetimida; metiprilon; meprobamato; paraldehfdo; disulfiram; morfina, fentanilo y naloxona; agentes antitusivos de accion central;
20 farmacos psiquiatricos tales como fenotiazinas, tioxantenos y otros compuestos heterocfclicos (por ejemplo, halperiodol); antidepresivos tricfclicos tales como desimipramina e imipramina; antidepresivos atfpicos (por ejemplo, fluoxetina y trazodona), inhibidores de la monoaminooxidasa tales como isocarboxazida; sales de litio; ansiolfticos tales como clordiazepoxido y diazepam;
antiepilepticos que incluyen hidantofnas, barbituricos anticonvulsivos, iminostilbinas (como carbamazepina),
25 succinimidas, acido valproico, oxazolidindionas y benzodiazepinas.
medicamentos contra el Parkinson tales como L-DOPA/CARBIDOPA, apomorfina, amantadina, ergolinas, selegilina, ropinorol, mesilato de bromocriptina y agentes anticolinergicos; agentes antiespasticidad tales como baclofeno, diazepam y dantroleno;
agentes neuroprotectores, tales como antagonistas de aminoacidos excitadores, factores neurotroficos y factor
30 neurotrofico derivado del cerebro, factor neurotrofico ciliar o factor de crecimiento nervioso; neurotrofina (NT) 3 (NT3); NT4 y NT5; gangliosidos; agentes neurorregenerativos;
los farmacos para el tratamiento de la adiccion y el abuso de drogas incluyen antagonistas opioides y antidepresivos; autacoides y farmacos antiinflamatorios tales como histamina, bradiquinina, calidina y sus agonistas y antagonistas respectivos;
35 agentes quimioterapeuticos para infecciones parasitarias y enfermedades microbianas;
farmacos anticancer que incluyen agentes alquilantes (por ejemplo, nitrosoureas) y antimetabolitos; mostazas nitrogenadas, etilenaminas y metilmelaminas; alquilsulfonatos; analogos de acido folico; analogos de pirimidina, analogos de purina, alcaloides de vinca; y antibioticos.
40 La presente invencion tambien es util para la administracion de medicamentos anti-nausea, relajantes, estimulantes, oligonucleotidos "sentido" y "antisentido", dilatadores cerebrales, psicotropicos, dilatadores y constrictores vasculares, antihipertensivos, tratamientos para la migrana, agentes hiper o hipoglicemicos, agentes minerales o nutricionales, farmacos contra la obesidad, anabolicos y antiasmaticos, farmacos antiinflamatorios tales como fenilbutazona, indometacina, naproxeno, ibuprofeno, flurbiprofeno, diclofenaco, dexametasona, prednisona y
45 prednisolona; vasodilatadores cerebrales tales como soloctidilum, vincamina, oxalato de naftidrofurilo, mesilato de codergocrina, ciclandelato, papaverina, acido nicotfnico, agentes antiinfecciosos tales como estearato de eritromicina y cefalexina;
hormona adrenocorticotropica, adenosina deaminasa ribonucleasa, fosfatasa alcalina, angiotensina, anticuerpos, arginasa, arginina deaminasa, asparaginasa, caerulefna, calcitonina, quimiotripsina, colecistoquinina, factores de
50 coagulacion, dinorfinas, endorfinas, endorfinas, encefalinas, encefalinas, eritropoyetina, peptido liberador de gastrina, glucagon, hemoglobina, factores de liberacion hipotalamica, interferon, katacalcina, motilina, neuropeptido Y, neurotensina, opioides no naturales, oxitosina, papafna, hormona paratiroidea, peptidos prolactina, CD-4 soluble, somatomedina, somatostatina, somatostatina, somatotropina, superoxido dismutasa, hormona estimulante de la tiroides, activador del plasminogeno tisular, tripsina, vasopresina y analogos de tales peptidos, asf como otras
55 enzimas, hormonas, protefnas, polipeptidos, conjugados enzima-protefna, conjugados anticuerpo-hapteno, epftopos vfricos, etc. adecuados.
V. Formatos de polipeptidos ejemplares
60 Los ejemplos de formatos de moleculas de union se exponen en las figuras adjuntas. Por ejemplo, la Fig. 1 incluye
ejemplos en los que el resto farmaceuticamente activo no se ilustra (por ejemplo, las estructuras de FC5Fc y FcFC5 a las que se pueden anadir restos farmaceuticamente activos) asf como los ejemplos en los que el resto farmaceuticamente activo es un sitio de union del anticuerpo. Por ejemplo, en una realizacion, una estructura de una molecula de union (es decir, una construccion a la que puede anadirse un resto farmaceuticamente activo) 5 comprende dos restos que transmigran la BHE unidos covalentemente (por ejemplo, fusionados geneticamente) a una region, dominio o resto Fc. Los restos que transmigran la BHE se pueden unir directamente o mediante un peptido conector. En un aspecto preferido, los restos que transmigran la BHE pueden estar unidos al extremo N- terminal de la region, dominio o resto Fc. En un aspecto, los restos de union adicionales (por ejemplo, restos farmacologicamente activos diferentes de TMEM30A en forma de moleculas scFv) tambien se pueden unir al 10 extremo C-terminal de la region, dominio o resto Fc.
En otro aspecto, los restos que transmigran la BHE pueden estar unidos al extremo C-terminal de la region, dominio o resto Fc. Los restos que transmigran la BHE se pueden unir directamente o mediante un peptido conector.
15 En otro aspecto, una molecula de union comprende un resto que transmigra la BHE fusionado en el extremo N- terminal al dominio VH de una molecula de anticuerpo intacta. En otro aspecto, una molecula de union comprende un resto que transmigra la BHE fusionado en el extremo N-terminal al dominio VL de una molecula de anticuerpo intacta. En otro aspecto adicional, una molecula de union comprende dos restos que transmigran la BHE fusionado en el extremo C-terminal a una molecula de anticuerpo intacta. Los restos que transmigran la BHE se pueden unir 20 directamente o mediante un peptido conector.
Se entendera que los restos farmaceuticamente activos (o restos farmacologicamente activos adicionales) se pueden unir a cualquiera de estos constructos mediante procedimientos conocidos en la tecnica.
25 En una realizacion, los polipeptidos de la invencion comprenden solo un resto farmaceuticamente activo (que crea una molecula que es monomerica con respecto al resto farmaceuticamente activo, pero que es multimerica (por ejemplo, dimerica) con respecto a los restos que transmigran la BHE). En otra realizacion, un polipeptido de la invencion comprende mas de un resto farmacologicamente activo, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas restos farmacologicamente activos. Los restos farmaceuticamente activos pueden ser iguales o diferentes.
30
En una realizacion de la invencion, un resto farmaceuticamente activo esta unido operativamente mediante un peptido enlazador al extremo N-terminal de un dominio, region o resto Fc. En otra realizacion, el resto farmacologicamente activo esta unido operativamente mediante un peptido enlazador al extremo C-terminal de un dominio, region o resto Fc.
35
En otras realizaciones, dos o mas restos farmaceuticamente activos estan unidos entre si (p. ej., mediante un peptido conector) en serie. En una realizacion, la matriz tandem de restos farmaceuticamente activos esta operativamente unida mediante un peptido conector al extremo C-terminal o al extremo N-terminal de una region, dominio o resto Fc.
40
Otros procedimientos para conjugar, unir y acoplar protefnas a compuestos farmacologicamente activos son bien conocidos en el campo. Por ejemplo, vease Wu A M, Senter P D, Arming antibodies: prospects and challenges for immunoconjugates, Nat. Biotechnol. 2005 Septiembre; 23(9):1137-46 y Trail P A, King H D, Dubowchik G M, Monoclonal antibody drug immunoconjugates for targeted treatment of cancer, Cancer Immunol Immunother. 2003 45 Mayo; 52(5):328-37;Saito G, Swanson J A, Lee K D. Drug delivery strategy utilizing conjugation via reversible disulfide linkages: role and site of cellular reducing activities, Adv Drug Deliv Rev. 2003 Feb. 10; 55(2):199-215. Ademas, los presentes anticuerpos pueden proporcionarse en combinacion con liposomas, nanopartfculas u otros vehfculos analogos cargados con un compuesto farmaceuticamente activo. Los procedimientos de preparacion de dichas composiciones son conocidos en el campo (vease, por ejemplo,Sugano y col., Antibody Targeting of 50 Doxorubicin-loaded Liposomes Suppresses the Growth and Metastatic Spread of Established Human Lung Tumor Xenografts in Severe Combined Immunodeficient Mice Cancer Research 60, 6942-6949, Dec. 15, 2000 y Martin y col., Nanomaterials in Analytical Chemistry, Analytical Chemistry News & Features, 1 de mayo, 1998; pags. 322 A- 327 A).
55 Muchas moleculas efectoras carecen de grupos funcionales adecuados a los que se pueden unir polipeptidos de union. En una realizacion, una molecula efectora, por ejemplo, un farmaco o profarmaco esta unido al polipeptido mediante una molecula de union. En una realizacion, la molecula de union contiene un enlace qufmico que permite la activacion de la citotoxicidad en un sitio particular. Los enlaces qufmicos adecuados son bien conocidos en la tecnica e incluyen enlaces disulfuro, enlaces labiles frente a acidos, enlaces fotolabiles, enlaces labiles frente a 60 peptidasa, enlaces tioeter formados entre grupos sulfhidrilo y maleimida, y enlaces labiles frente a esterasa. Mas
preferentemente, la molecula de enlace comprende un enlace disulfuro o un enlace tioeter. De acuerdo con la invencion, la molecula de enlace comprende preferentemente un grupo qufmico reactivo. Los grupos qufmicos reactivos particularmente preferidos son esteres de N-succinimidilo y esteres de N-sulfosuccinimidilo. En una realizacion preferida, el grupo qufmico reactivo se puede unir covalentemente al efector por enlace disulfuro entre 5 grupos tiol. En una realizacion, se modifica una molecula efectora para que comprenda un grupo tiol. Un experto habitual en la materia apreciara que un grupo tiol contiene un atomo de azufre unido a un atomo de hidrogeno y normalmente tambien se denomina en la tecnica como grupo sulfhidrilo, que se puede indicar como "--SH" o "RSH".
En una realizacion, se puede usar una molecula de union para unir una molecula efectora con un polipeptido de la 10 invencion. La molecula de enlace puede ser escindible o no escindible. En una realizacion, la molecula de union escindible es una molecula de union escindible por redox, de manera que la molecula de union sea escindible en entornos con un potencial redox inferior, tal como el citoplasma y otras regiones con concentraciones mas altas de moleculas con grupos sulfhidrilo libres. Los ejemplos de moleculas de union que pueden escindirse debido a un cambio en el potencial redox incluyen aquellos que contienen disulfuros. El estfmulo de escision puede 15 proporcionarse tras la absorcion intracelular de la protefna de union de la invencion en la que el potencial redox inferior del citoplasma facilita la escision de la molecula de union. En otra realizacion, una disminucion del pH desencadena la liberacion de la carga del maitansinoide en la celula diana. La disminucion del pH esta implicada en muchos procesos fisiologicos y patologicos, como el trafico de endosomas, el crecimiento tumoral, la inflamacion y la isquemia miocardica. El pH desciende desde un valor fisiologico de 7,4 a 5-6 en los endosomas o de 4-5 en los 20 lisosomas. Los ejemplos de moleculas de union sensibles a los acidos que pueden usarse para atacar los lisosomas o los endosomas de las celulas cancerosas incluyen aquellos con enlaces escindibles por acido, como los que se encuentran en acetales, cetales, ortoesteres, hidrazonas, tritiles, cis-aconitilos o tiocarbamoilos (vease, por ejemplpo, Willner y col., (1993), Bioconj. Chem., 4: 521-7;Patente;patente de los EE. UU. N.° 4,569,789,4,631,190,5,306,809, y 5,665,358). Otros ejemplos de moleculas de union sensibles a acidos comprenden 25 secuencias dipeptfdicasPhe-Lys y Val-Lys (King y col., (2002), J. Med. Chem., 45: 4336-43). El estfmulo de escision puede proporcionarse despues del trafico de captacion intracelular a compartimentos endosomicos de pH bajo (por ejemplo, lisosomas). Otras ejemplos de moleculas de union escindibles por acido son las moleculas que contienen dos o mas enlaces escindibles por acido para la union de dos o mas maitansinoides (King y col., (1999), Bioconj. Chem., 10: 279-88;WO 98/19705).
30
Las moleculas de union escindibles pueden ser sensibles a agentes de escision suministrados biologicamente que estan asociados con una celula diana particular, por ejemplo, enzimas lisosomicas o asociadas a tumores. Los ejemplos de moleculas de union que pueden escindirse enzimaticamente incluyen, pero sin limitacion, peptidos y esteres. Los ejemplos de moleculas de union escindibles por enzimas incluyen aquellas que son sensibles a las 35 proteasas asociadas a tumores tales como la catepsina B o la plasmina.(Dubowchik y col., (1999), Pharm. Ther., 83: 67-123; Dubowchik y col., (1998), Bioorg. Med. chem. Lett., 8: 3341-52;de Groot y col., (2000), J. Med. Chem., 43: 3093-102; de Groot y col.,(1999)m 42: 5277-83). Los sitios escindibles por catepsina B incluyen las secuencias dipeptfdicas valina-citrulina y fenilalanina-lisina (Doronina y col., (2003), Nat. Biotech., 21(7): 778-84); Dubowchik y col., (2002), Bioconjug. Chem., 13: 855-69). Otros ejemplos de sitios escindibles por enzimas incluyen aquellos 40 formados por secuencias oligopeptidas de 4a16 aminoacidos (por ejemplo, Suc-p-Ala-Leu-Ala-Leu) que son reconocidos por proteasas de trouse como la oliogopeptidasa Thimet (TOP), una enzima que es liberada preferentemente por neutrofilos, macrofagos y otros granulocitos.
En ciertos aspectos particulares, un polipeptido de union de la invencion es multiespecffico, por ejemplo, tiene al 45 menos un sitio de union que se une a una primera molecula o epftopo de una molecula y al menos un segundo sitio de union que se une a una segunda molecula o a un segundo epitope de la primera molecula. Las moleculas de union multiespecfficas de la invencion pueden comprender al menos dos sitios de union. En ciertas realizaciones, al menos dos sitios de union de una molecula de union multiespecffica de la invencion son sitios de transmigracion de la BHE.
50
VI. Sfntesis de moleculas de union
Habiendo seleccionado el formato de un polipeptido de la invencion, estan disponibles una variedad de procedimientos para producir el polipeptido. Dichos procedimientos incluyen, pero no se limitan a, tecnicas de 55 sfntesis qufmica y tecnicas de expresion de ADN recombinante.
En un aspecto, la descripcion se refiere a una construccion de acido nucleico que comprende una secuencia de acido nucleico que codifica una molecula polipeptfdica de la invencion. Se entendera que debido a la degeneracion del codigo, una variedad de secuencias de acido nucleico codificara la secuencia de aminoacidos del polipeptido. El 60 polinucleotido deseado puede producirse mediante procedimientos conocidos en la tecnica (por ejemplo, por sfntesis
de ADN en fase solida de novo o mediante mutagenesis por PCR de un polinucleotido preparado anteriormente que codifica el polipeptido diana).
La mutagenesis mediada por oligonucleotidos es un procedimiento para preparar una sustitucion, insercion en marco 5 o alteracion (por ejemplo, codon alterado) para introducir un codon que codifica una sustitucion de aminoacido (por ejemplo, en un resto variante de Fc). Por ejemplo, el ADN polipeptfdico de partida se altera hibridando un oligonucleotido que codifica la mutacion deseada con un molde de ADN monocatenario. Despues de la hibridacion, se usa una ADN polimerasa para sintetizar una segunda hebra complementaria completa de la plantilla que incorpora el cebador oligonucleotfdico. En un aspecto, la ingenierfa genetica, por ejemplo, la mutagenesis por PCR 10 basada en cebadores, es suficiente para incorporar una alteracion, como se define en el presente documento, para producir un polinucleotido que codifica un polipeptido de la invencion.
Para la produccion recombinante, se inserta una secuencia de polinucleotidos que codifica el polipeptido en un vehfculo de expresion apropiado, es decir, un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripcion y 15 traduccion de la secuencia de codificacion insertada, o en el caso de un vector de ARN viral, los elementos necesarios para la replicacion y la traduccion.
El acido nucleico que codifica el polipeptido se inserta en el vector en el marco de lectura correcto. El vector de expresion se transfecta a continuacion en una celula diana adecuada que expresara el polipeptido. Las tecnicas de 20 transfeccion conocidas en la tecnica incluyen, pero no se limitan a, precipitacion de fosfato calcico (Wigler y col. 1978, Cell 14: 725) y electroporacion (Neumann y col. 1982, EMBO, J. 1: 841). Se puede usar una variedad de sistemas de vectores de expresion del huesped para expresar el polipeptido descrito en el presente documento en celulas eucarioticas. En un aspecto, la celula eucariotica es una celula animal, que incluye celulas de mamffero (por ejemplo, celulas CHO, BHK, Cos, HeLa). Cuando el polipeptido se expresa en una celula eucariota, el ADN que 25 codifica el polipeptido tambien puede codificar una secuencia senal que permitira que el polipeptido se secrete. Un experto en la tecnica entendera que, mientras que la protefna se traduce, la secuencia senal es escindida por la celula para formar el polipeptido maduro. En una realizacion, la invencion se refiere a polipeptidos maduros que comprenden un peptido conector de la invencion. Como alternativa, cuando no se incluye una secuencia senal, se puede recuperar el polipeptido al lisar las celulas.
30
El polipeptido de la invencion tambien se puede sintetizar en un animal transgenico, tal como un roedor, cabra, oveja, cerdo o vaca. El termino "animales transgenicos" se refiere a animales no humanos que han incorporado un gen extrano en su genoma. Dado que este gen esta presente en los tejidos de la lfnea germinal, se pasa de padres a hijos. Los genes exogenos se introducen en embriones unicelulares (Brinster y col. 1985, Proc. Natl. Acad.Sci. 35 USA 82: 4438). Los procedimientos para producir animales transgenicos son conocidos en la tecnica, incluidos los transgenicos que producen moleculas de inmunoglobulina (Wagner y col. 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 6376; McKnight y col. 1983, Cell 34: 335; Brinster y col. 1983, Nature 306: 332; Ritchie y col. 1984, Nature 312: 517; Baldassarre y col. 2003, Theriogenology 59: 831; Robl y col. 2003, Theriogenology 59: 107; Malassagne y col. 2003, Xenotransplantation 10 (3): 267).
40
Los vectores de expresion pueden codificar etiquetas que permitan una facil purificacion o identificacion del polipeptido producido de manera recombinante. Los ejemplos incluyen, pero sin limitacion, el vector pUR278 (Ruther y col. 1983, EMBO J. 2: 1791) en el que el polipeptido descrito en la presente memoria, la secuencia codificante puede ligarse en el vector en fase con la region codificante lac z, de manera que se produce una protefna hfbrida; 45 los vectores pGEX pueden usarse para expresar protefnas con una etiqueta de glutation S-transferasa (GST). Estas protefnas son generalmente solubles y pueden purificarse facilmente de las celulas por adsorcion a las columnas de glutation-agarosa, seguidas de elucion en presencia de glutation libre. Los vectores incluyen sitios de escision (por ejemplo PresCission Protease (Pharmacia, Peapack, N. J.)) para la eliminacion facil de la etiqueta despues de la purificacion.
50
Para los propositos de la presente invencion, se pueden emplear numerosos sistemas diferentes de vectores de expresion reconocidos en la tecnica.
Estos vectores de expresion son normalmente replicables en los organismos hospedadores como episomas o como 55 parte integral del ADN cromosomico del huesped. Los vectores de expresion pueden incluir secuencias de control de la expresion que incluyen, pero no se limitan a, promotores (por ejemplo, promotores heterologos o asociados de forma natural), potenciadores, secuencias senal, senales de empalme, elementos potenciadores y secuencias de terminacion de la transcripcion. Preferentemente, las secuencias de control de la expresion son sistemas promotores eucarioticos en vectores capaces de transformar o transfectar celulas hospedadoras eucariotas. Los vectores de 60 expresion tambien pueden utilizar elementos de ADN que se derivan de virus animales tales como virus del papiloma
bovino, virus del polioma, adenovirus, virus vaccinia, baculovirus, retrovirus (RSV, MMTV o MOMLV), citomegalovirus (CMV) o virus SV40. Otros implican el uso de sistemas policistronicos con sitios de union a ribosomas internos.
5 Habitualmente, los vectores de expresion contienen marcadores de seleccion (por ejemplo, resistencia a ampicilina, resistencia a higromicina, resistencia a tetraciclina o resistencia a neomicina) para permitir la deteccion de aquellas celulas transformadas con las secuencias de ADN deseadas (vease, p. ej., Itakura y col., patente de los EE. UU. N.° 4,704,362). Las celulas que han integrado el ADN en sus cromosomas se pueden seleccionar introduciendo uno o mas marcadores que permitan la seleccion de celulas hospedadoras transfectadas. El marcador puede proporcionar 10 prototroffa a un hospedador auxotrofo, resistencia a biocidas (por ejemplo, antibioticos) o resistencia a metales pesados tales como cobre. El gen marcador seleccionable se puede unir directamente a las secuencias de ADN que se van a expresar, o introducir en la misma celula mediante cotransformacion. Los polipeptidos de la presente invencion se pueden expresar mediante construcciones policistronicas. En estos sistemas de expresion, pueden producirse multiples productos genicos de interes, tales como multiples polipeptidos de protefna de union a 15 multfmeros, a partir de una unica construccion policistronica. Estos sistemas usan ventajosamente un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) para proporcionar niveles relativamente altos de polipeptidos de la invencion en celulas hospedadoras eucariotas. Las secuencias de IRES compatibles se describen en la patente de los EE. UU. N.° 6,193,980 que tambien se incorpora a la presente memoria. Los expertos en la tecnica apreciaran que dichos sistemas de expresion se pueden usar para producir de forma efectiva la gama completa de polipeptidos descritos 20 en la presente solicitud.
Mas en general, una vez que se ha preparado el vector o la secuencia de ADN que codifica un polipeptido, el vector de expresion se puede introducir en una celula hospedadora apropiada. Es decir, las celulas hospedadoras pueden transformarse. La introduccion del plasmido en la celula hospedadora se puede llevar a cabo mediante diversas 25 tecnicas bien conocidas por los expertos en la tecnica. Estos incluyen, pero no se limitan a, transfeccion (que incluye electroforesis y electroporacion), fusion de protoplastos, precipitacion con fosfato de calcio, fusion celular con ADN con envoltura, microinyeccion e infeccion con virus intactos. Vease,Ridgway, A. A. G. "Mammalian Expression Vectors" Chapter 24.2, pags. 470-472 Vectors, Rodriguez y Denhardt, eds. (Butterworths, Boston, Mass. 1988). Lo mas preferible es la introduccion del plasmido en el anfitrion por electroporacion. Las celulas transformadas se 30 cultivan en condiciones adecuadas para la produccion de cadenas ligeras y cadenas pesadas, y se someten a ensayo para la sfntesis de protefnas de cadena pesada y/o ligera. Las tecnicas de ensayo ejemplares incluyen ensayo de inmunoabsorcion ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), o analisis de clasificador de celulas activado por fluorescencia (FACS), inmunohistoqufmica y similares.
35 Como se usa en el presente documento, el termino "transformacion" se usara en un sentido amplio para referirse a la introduccion de ADN en una celula hospedadora receptora que cambia el genotipo y en consecuencia da como resultado un cambio en la celula receptora.
En la misma lfnea, "celulas hospedadoras" se refiere a celulas que se han transformado con vectores construidos 40 mediante tecnicas de ADN recombinante y que codifican al menos un gen heterologo. En las descripciones de procedimientos para el aislamiento de polipeptidos de huespedes recombinantes, los terminos "celula" y "cultivo celular" se usan indistintamente para indicar la fuente del polipeptido, a menos que se especifique claramente lo contrario. En otras palabras, la recuperacion del polipeptido de las "celulas" puede significar tanto de celulas enteras centrifugadas, como del cultivo celular que contiene tanto el medio como las celulas suspendidas.
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La lfnea celular hospedadoras que se usa para la expresion de protefnas es muy preferentemente de origen mamffero; a los expertos en la tecnica se les atribuye la capacidad de determinar de forma preferente lfneas celulares hospedadoras particulares que son las mas adecuadas para que el producto genico deseado se exprese en ellas. Ejemplos de lfneas celulares hospedadoras incluyen, pero no estan limitadas a, DG44 y DUXB11 (lfneas de 50 ovario de hamster chino, DHFR minus), HELA (carcinoma de cuello uterino humano), CVI (lfnea de rinon de mono), COS (un derivado de CVI con antfgeno T de sV40) , R1610 (fibroblasto de hamster chino) BALBC/3T3 (fibroblastos de raton), HAK (lfnea de rinon de hamster), SP2/O (mieloma de raton), P3x63-Ag3.653 (mieloma de raton), BFA- 1c1BPT (celulas endoteliales de bovino), RAJI (linfocito humano) y 293 (rinon humano). Las celulas CHO son particularmente preferidas. Por lo general, las lfneas celulares hospedadoras estan disponibles en los servicios 55 comerciales, la American Tissue Culture Collection o la bibliograffa publicada.
Los genes que codifican los polipeptidos de la invencion tambien pueden expresarse en celulas que no son de mamffero tales como bacterias o levaduras o celulas vegetales. A este respecto, se apreciara que tambien pueden transformarse diversos microorganismos unicelulares no mamfferos, tales como bacterias; es decir, aquellos que 60 pueden crecer en cultivos o fermentacion. Las bacterias, que son susceptibles de transformacion, incluyen miembros
de las enterobacteriaceas, tales como cepas de Escherichia coli o Salmonella; Bacillaceae, tal como Bacillus subtilis; Pneumococcus; Streptococcus y Haemophilus influenzae. Se apreciara adicionalmente que, cuando se expresan en bacterias, los polipeptidos normalmente se vuelven parte de los cuerpos de inclusion. Los polipeptidos se deben aislar, purificar y luego ensamblar en moleculas funcionales.
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Ademas de procariotas, tambien pueden usarse microbios eucariotas. Saccharomyces cerevisiae, o la levadura de panaderfa comun, es el que mas habitualmente se usa entre los microorganismos eucariotas, aunque varias otras cepas estan disponibles habitualmente. Para la expresion en Saccharomyces, se usa habitualmente el plasmido YRp7, por ejemplo, (Stinchcomb y col., Nature, 282:39 (1979);Kingsman y col., Gene, 7:141 (1979);Tschemper y 10 col., Gene, 10:157 (1980)). Este plasmido ya contiene el gen TRP1 que proporciona un marcador de seleccion para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de crecer en triptofano, por ejemplo, N.° 44076 o PEP4-1 (Jones, Genetics, 85:12 (1977)). La presencia de la lesion trpl como una caracterfstica del genoma de la celula hospedadora de la levadura proporciona entonces un entorno efectivo para detectar la transformacion por crecimiento en ausencia de triptofano. Tambien se pueden emplear otros huespedes de levadura tales como Pichia. 15 Vectores de expresion de levadura que tienen secuencias de control de la expresion (por ejemplo, promotores), un origen de replicacion, secuencias de terminacion y similares segun se desee. Los promotores tfpicos incluyen 3- fosfoglicerato quinasa y otras enzimas glicolfticas. Los promotores de levadura inducibles incluyen, entre otros, promotores de la alcohol deshidrogenasa, el citocromo C y las enzimas responsables de la utilizacion de metanol, maltosa y galactosa.
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Como alternativa, las secuencias de nucleotidos que codifican los polipeptidos pueden incorporarse en transgenes para la introduccion en el genoma de un animal transgenico y la posterior expresion en la leche del animal transgenico (vease, p.ej.,Deboer y col., US 5,741,957,Rosen, uS 5,304,489, yMeade y col., US 5,849,992). Los transgenes adecuados incluyen secuencias codificantes para polipeptidos en enlace operable con un promotor y 25 potenciador de un gen especffico de glandula mamaria, tal como casefna o beta lactoglobulina.
La produccion in vitro permite la ampliacion para dar grandes cantidades de los polipeptidos deseados. Las tecnicas para el cultivo de celulas a gran escala de mamfferos en condiciones de cultivo tisular son conocidas en la tecnica e incluyen un cultivo en suspension homogeneo, p. ej., en un reactor de transporte aereo o en un reactor de agitacion 30 continua, o cultivo celular inmovilizado o atrapado, p. ej., en fibras huecas, microcapsulas, microperlas de agarosa o cartuchos ceramicos. Si es necesario y/o se desea, las soluciones de polipeptidos pueden purificarse mediante los metodos de cromatograffa habituales, por ejemplo filtracion en gel, cromatograffa de intercambio ionico, cromatograffa en DEAE-celulosa o cromatograffa de (inmuno)afinidad, por ejemplo, despues de la biosfntesis preferente de un polipeptido de una region de bisagra sintetica o antes o despues de la etapa de de interaccion 35 hidrofobica (HIC) descrita en el presente documento. Una secuencia de etiqueta de afinidad (por ejemplo, una etiqueta His (6)) se puede unir o incluir opcionalmente dentro de la secuencia polipeptfdica para facilitar la purificacion cadena abajo.
Un experto en la tecnica puede sintetizar facilmente peptidos mas pequenos para su uso en relacion con la 40 invencion. Los procedimientos estandar para preparar peptidos sinteticos son bien conocidos en la tecnica. Los peptidos se pueden sintetizar usando el metodo de sfntesis de peptidos en fase solida (SPPS) de Merrifield (J. Am. Chem. Soc., 85:2149 (1964)) o mediante metodos de solucion estandar bien conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, Bodanzsky, M., Principles of Peptide Synthesis 2a revision ed. (Springer-Verlag, 1988 y 1993)). Como alternativa, se pueden usar tecnicas simultaneas de sfntesis de peptidos multiples (SMPS) bien conocidas en la 45 tecnica. Los peptidos preparados mediante el procedimiento de Merrifield se pueden sintetizar usando un sintetizador de peptidos automatico tal como el sintetizador de peptidos 431 A-01 de Applied Biosystems (Mountain View, CA) o mediante la tecnica manual de sfntesis de peptidos descrita por Houghten, Proc. Nat. Acad. Sci., USA 82:5131( 1985). Los peptidos se pueden sintetizar usando aminoacidos o analogos de aminoacidos, cuyos grupos activos estan protegidos segun sea necesario mediante, por ejemplo, un grupo t-butildicarbonato (t-BOC) o un grupo 50 fluorenilmetoxi carbonilo (FMOC). Los aminoacidos y analogos de aminoacidos pueden adquirirse comercialmente (Sigma Chemical Co. Advanced Chemtec) o sintetizarse mediante procedimientos conocidos en la tecnica. Los peptidos sintetizados mediante el metodo de fase solida se pueden unir a resinas que incluyen 4- metilbenzhidrilamina (MBHA), 4-(oximetil)-fenilacetamidometilo y 4-(hidroximetil)fenoximetil-copoli (estireno-1 % de divinilbenceno) (resina de Wang), todos ellos estan disponibles comercialmente, o al polfmero de p-nitrobenzofenona 55 oxima (resina de oxima), que se puede sintetizar como esta descrito por De Grado y Kaiser, J. Org. Chem. 47:3258 (1982).
VII. Purificacion de moleculas de union
60 Una vez expresados, los polipeptidos de la invencion se pueden purificar segun los procedimientos estandar en la
tecnica, que incluyen, por ejemplo, precipitacion con sulfato de amonio, cromatograffa en columna de afinidad, purificacion por HPLC, electroforesis en gel y similares (vease en terminos generales Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., (1982)). Un peptido recien sintetizado tambien puede purificarse mediante un procedimiento como la cromatograffa lfquida de alta resolucion en fase inversa (RP-HPLC) u otros procedimientos de separacion 5 basados en el tamano o la carga del peptido. Ademas, el peptido purificado puede caracterizarse usando estos y otros procedimientos bien conocidos tales como el analisis de aminoacidos y la espectrometrfa de masas.
Se prefieren protefnas sustancialmente puras de al menos aproximadamente un 90 a un 95 % de homogeneidad, y mas preferentemente de un 98 a un 99 % o mas de homogeneidad, para usos farmaceuticos.
10 VIII. Metodos de administracion
Los procedimientos para preparar polipeptidos de la invencion y administrarlos a un sujeto son bien conocidos o pueden determinarse facilmente por los expertos en la tecnica.
15 Las composiciones para administracion a un sujeto incluyen moleculas de acido nucleico que comprenden una secuencia de nucleotidos que codifica una molecula de union de la invencion (para aplicaciones de terapia genica) asf como moleculas de polipeptido.
Los metodos de introduccion incluyen, pero no se limitan a, vfas intradermica, intramuscular, intraperitoneal,
20 intravenosa, subcutanea, intranasal, epidural y oral. Los conjugados pueden administrarse mediante cualquier ruta conveniente, por ejemplo, mediante infusion o inyeccion en bolo, mediante absorcion a traves de revestimientos epiteliales o mucocutaneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y se pueden administrar junto con otros agentes farmacologicamente activos. La administracion puede ser sistemica o local.
25 En ciertas circunstancias, puede ser deseable introducir las composiciones farmaceuticas de la invencion directamente en el sistema nervioso central por cualquier ruta adecuada, que incluye inyeccion intraventricular e intratecal; la inyeccion intraventricular puede ser facilitada por un cateter intraventricular, por ejemplo, unido a un deposito, tal como un deposito de Ommaya.
30 La administracion pulmonar o nasal tambien puede emplearse, por ejemplo, mediante el uso de un inhalador o nebulizador, y la formulacion con un agente aerosolizante.
En otra realizacion, los conjugados se pueden administrar en un sistema de liberacion controlada. En una realizacion, se puede usar una bomba (vease Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987);
35 Buchwald y col., Surgety 88:507 (1980);Saudek y col., N. Engl. J. Med. 321:574 (1989)). En otra realizacion mas, se puede colocar un sistema de liberacion controlada cerca de la diana terapeutica, es decir, el cerebro, requiriendo asf solo una fraccion de la dosis sistemica (vease, p.ej., Goodson, en Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pags. 115-138 (1984)).
40 Otros sistemas de liberacion controlada se describen en la revision de Langer (Science 249:1527-1533 (1990)).
El sujeto es preferentemente un animal, que incluye, pero no se limita a, animales tales como vacas, cerdos, caballos, pollos, gatos, perros, etc., y es preferentemente un mamffero, y lo mas preferentemente humano.
45 Habitualmente, una composicion farmaceutica adecuada para inyeccion puede comprender un tampon (por ejemplo, tampon de acetato, fosfato o citrato), un tensioactivo (por ejemplo, polisorbato), opcionalmente un agente estabilizador (por ejemplo, albumina humana), etc. Sin embargo, en otros procedimientos compatibles con las ensenanzas en la presente memoria, los polipeptidos pueden administrarse directamente en el sitio de la poblacion celular adversa, aumentando asf la exposicion del tejido enfermo al agente terapeutico.
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Las preparaciones para administracion parenteral incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas esteriles. Los ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva y esteres organicos inyectables tales como oleato de etilo. Los portadores acuosos incluyen agua, soluciones, emulsiones y suspensiones alcoholicas/acuosas, incluyendo solucion salina y medios
55 tamponados. En la presente invencion, los vehfculos farmaceuticamente aceptables incluyen, pero sin limitacion, tampon de fosfato 0,01 a 0,1 M y preferentemente 0,05 M de tampon de fosfato o solucion salina al 0,8 %. Otros vehfculos parenterales comunes incluyen soluciones de fosfato de sodio, dextrosa de Ringer, cloruro de dextrosa y de sodio, solucion lactica de Ringer, y aceites fijos. Los vehfculos intravenosos incluyen reponedores de fluidos y nutrientes, reponedores de electrolitos como aquellos basados en dextrosa de Ringer y similares. Tambien pueden
60 estar presentes conservantes y otros aditivos tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes
quelantes y gases inertes y similares.
Mas particularmente, las composiciones farmaceuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas esteriles (cuando son solubles en agua) o dispersiones y polvos esteriles para la preparacion extemporanea de 5 disoluciones o dispersiones inyectables esteriles. En tales casos, la composicion debe ser esteril y debe ser fluida en la medida en que exista facilidad de inyeccion. Debe ser estable en las condiciones de fabricacion y almacenamiento y preferentemente se conservara frente a la accion contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El portador puede ser un disolvente o medio de dispersion que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol lfquido y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La 10 fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamano de partfcula requerido en el caso de dispersiones y mediante el uso de tensioactivos.
La prevencion de la accion de los microorganismos se puede lograr mediante la adicion de varios agentes antibacterianos y antifungicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, acido ascorbico, timerosal y similares. En 15 muchos casos, sera preferible incluir agentes isotonicos, por ejemplo, azucares, polialcoholes, tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composicion. La absorcion prolongada de las composiciones inyectables puede conseguirse incluyendo en la composicion un agente que retrasa la absorcion, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
20 En cualquier caso, las soluciones inyectables esteriles se pueden preparar incorporando un compuesto activo (por ejemplo, un polipeptido por si mismo o en combinacion con otros agentes activos) en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con un ingrediente o una combinacion de ingredientes enumerados en el presente documento, segun se requiera, seguido de esterilizacion por filtracion. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo a un vehfculo esteril, que contiene un medio de dispersion basico y los otros ingredientes 25 requeridos de aquellos enumerados anteriormente. En el caso de los polvos esteriles para la preparacion de soluciones inyectables esteriles, los procedimientos de preparacion preferidos son secado a vacfo y liofilizacion, que producen un polvo de un ingrediente activo mas cualquier ingrediente adicional deseado de una solucion previamente esterilizada por filtracion de los mismos. Las preparaciones para inyecciones se procesan, se introducen en recipientes tales como ampollas, bolsas, botellas, jeringas o viales, y se sellan en condiciones 30 asepticas de acuerdo con procedimientos conocidos en la tecnica. Ademas, las preparaciones se pueden envasar y vender en forma de un kit que preferentemente tendra etiquetas o prospectos que indiquen que las composiciones asociadas son utiles para tratar a un sujeto que padece o esta predispuesto a trastornos autoinmunes o neoplasicos.
Las dosis efectivas de las composiciones de la presente invencion para el tratamiento de afecciones varfan 35 dependiendo de muchos factores diferentes, que incluyen medios de administracion, el sitio diana, el estado fisiologico del paciente, si el paciente es humano o animal, otros medicamentos administrados, y si el tratamiento es profilactico o terapeutico. Habitualmente, el paciente es un ser humano pero los mamfferos no humanos que incluyen mamfferos transgenicos tambien pueden ser tratados.
40 Las dosis de tratamiento se pueden valorar mediante procedimientos de rutina conocidos por los expertos en la tecnica para optimizar la seguridad y la eficacia. En una realizacion, un polipeptido de la invencion es uno que se ha administrado previamente a pacientes, pero que se ha modificado para que comprenda un peptido conector de la invencion en lugar de un peptido conector tradicional. En tales casos, la dosificacion del polipeptido administrado sera consistente con la que se descubrio anteriormente que es segura y efectiva, es decir, el estandar de cuidado.
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Los polipeptidos de la invencion se pueden administrar en multiples ocasiones. Los intervalos entre dosis unicas pueden ser semanales, mensuales o anuales. Los intervalos tambien pueden ser irregulares, como se indica al medir los niveles en sangre de polipeptido, polipeptido diana o antfgeno en el paciente. En algunos procedimientos, la dosificacion se ajusta para alcanzar una concentracion particular in vivo. Como alternativa, los polipeptidos se 50 pueden administrar como una formulacion de liberacion sostenida, en cuyo caso se requiere una administracion menos frecuente. La dosis y la frecuencia varfan dependiendo de la semivida del polipeptido en el paciente.
La dosificacion y la frecuencia de administracion pueden variar dependiendo de si el tratamiento es profilactico o terapeutico. En aplicaciones profilacticas, las composiciones que contienen los polipeptidos de la invencion o un 55 coctel de los mismos se administran a un paciente que aun no esta en el estado de enfermedad para potenciar la resistencia del paciente. Dicha cantidad se define como una "dosis efectiva profilactica". Se puede administrar una dosificacion relativamente baja a intervalos relativamente infrecuentes durante un perfodo de tiempo largo. Algunos pacientes continuan recibiendo tratamiento durante el resto de sus vidas.
60 En aplicaciones terapeuticas, a veces se puede administrar una dosificacion relativamente alta a intervalos
relativamente cortos hasta que la progresion de la enfermedad se reduzca o termine, y preferentemente hasta que el paciente muestre una mejona parcial o completa de los smtomas de la enfermedad.
Se apreciara ademas que las moleculas de la presente invencion se pueden usar en conjuncion o en combinacion 5 con un agente o agentes (por ejemplo, para proporcionar un regimen terapeutico combinado). Los ejemplos de agentes con los que se puede combinar una molecula de la invencion incluyen agentes que representan el estandar de cuidado actual para un trastorno particular que se esta tratando. Dichos agentes pueden ser de naturaleza qmmica o biologica. El termino "biologico" o "agente biologico" se refiere a cualquier agente farmaceuticamente activo fabricado a partir de organismos vivos y/o sus productos que se pretende usar como un agente terapeutico.
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Los polipeptidos de la invencion pueden administrarse opcionalmente en combinacion con otros agentes que son eficaces en el tratamiento del trastorno o afeccion que necesitan tratamiento (por ejemplo, profilactico o terapeutico). Como se usa en el presente documento, la administracion de polipeptidos de la invencion en conjuncion o combinacion con una terapia adjunta significa la administracion o aplicacion secuencial, simultanea, coextensiva, 15 concurrente, concomitante o contemporanea de la terapia y los polipeptidos descritos. Los expertos en la tecnica apreciaran que la administracion o la aplicacion de los diversos componentes del regimen terapeutico combinado se puede programar para mejorar, en general, la eficacia del tratamiento. Por ejemplo, los agentes quimioterapeuticos o biologicos podnan administrarse en cursos de tratamiento estandar y bien conocidos junto con las moleculas de union sujeto. Un experto en la tecnica (por ejemplo, un medico) podna ser capaz de discernir regfmenes 20 terapeuticos combinados eficaces sin una experimentacion excesiva basada en la terapia adjunta seleccionada y las ensenanzas de la presente memoria descriptiva.
En una realizacion, puede producirse un polipeptido en un paciente mediante la administracion como una molecula de acido nucleico. Las moleculas de acido nucleico pueden administrarse mediante tecnicas conocidas en la tecnica, 25 que pueden ser mediante vector, plasmido, liposoma, inyeccion de ADN, electroporacion, pistola de genes, inyeccion intravenosa o infusion de la arteria hepatica. Los vectores para su uso en realizaciones de terapia genica son conocidos en la tecnica.
La cantidad de agente para su uso en combinacion con los polipeptidos de la presente invencion puede variar segun 30 el sujeto o puede administrarse de acuerdo con lo conocido en la tecnica. Vease, por ejemplo, Bruce A Chabner y col., Antineoplastic Agents, en GOODMAN & GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS 1233-1287 ((Joel G. Hardman y col., eds., 9a ed. 1996). En otra realizacion, se administra una cantidad de dicho agente conforme al estandar de cuidado.
35 Como se ha descrito anteriormente, los polipeptidos de la presente invencion se pueden administrar en una cantidad farmaceuticamente efectiva para el tratamiento in vivo de trastornos de mairnferos. A este respecto, se apreciara que la molecula de la invencion se puede formular para facilitar la administracion y promover la estabilidad del agente activo. Preferentemente, las composiciones farmaceuticas de acuerdo con la presente invencion comprenden un vehmulo esteril, no toxico y farmaceuticamente aceptable tal como una solucion salina fisiologica, tampones no 40 toxicos, conservantes y similares. Para los fines de la presente solicitud, se debe considerar que una cantidad farmaceuticamente efectiva de un polipeptido de la invencion, conjugado o no conjugado con un agente terapeutico, significa una cantidad suficiente para lograr la union efectiva a un antfgeno y para lograr un beneficio, por ejemplo, para mejorar los smtomas de una enfermedad o trastorno o para detectar una sustancia o una celula. En el caso de las celulas tumorales, el polipeptido sera preferentemente capaz de interactuar con antfgenos inmunorreactivos 45 seleccionados en celulas neoplasicas o inmunorreactivas y proporcionar un aumento en la muerte de esas celulas. Por supuesto, las composiciones farmaceuticas de la presente invencion se pueden administrar en dosis unicas o multiples para proporcionar una cantidad farmaceuticamente efectiva del polipeptido.
De acuerdo con el alcance de la presente descripcion, la molecula de la invencion puede administrarse a un ser 50 humano u otro animal de acuerdo con los procedimientos de tratamiento mencionados anteriormente en una cantidad suficiente para producir un efecto terapeutico o profilactico.
La manera de administracion y las formas de dosificacion afectaran, por supuesto, a las cantidades terapeuticas de los compuestos que son deseables y eficaces para la aplicacion de tratamiento dada. Una cantidad 55 terapeuticamente efectiva es una cantidad necesaria para prevenir, retrasar o reducir la gravedad del inicio de la enfermedad, o una cantidad necesaria para detener o reducir la gravedad de una enfermedad en curso. Sera evidente para un experto en la tecnica que esta cantidad variara en funcion de factores tales como el peso y la salud del receptor, el tipo de celulas que se transforman, el modo de administracion de las presentes composiciones y el tipo de trastorno medico que se esta tratando.
La invencion tambien proporciona un paquete o kit farmaceutico que comprende uno o mas recipientes llenos con uno o mas de los ingredientes de las composiciones farmaceuticas de la invencion. Opcionalmente, asociado con dicho(s) contenedor(es) puede estar un aviso en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricacion, uso o venta de productos farmaceuticos o biologicos, cuyo aviso refleja la aprobacion por parte de la 5 agencia de fabricacion, uso o venta para administracion humana.
La presente invencion se ilustra, ademas, por los siguientes ejemplos, los cuales no deben construirse como limitantes.
10 EJEMPLOS
Expresion, purificacion y caracterizacion de las moleculas FC5: FC5 se expreso en E. coli y se purifico mediante choque osmotico para liberar la protefna soluble del espacio periplasmico. A continuacion, se capturo el FC5 marcado con His soluble del lisado en una columna de nfquel, mediante intercambio cationico en fractogel SE, 15 seguido de filtracion en gel en Superdex 200. El camelido Vhh se caracterizo por SDS PAGE (Fig. 2a-c). FC5-Fc, Fc- FC5 y FC5-scram-Fc se expresaron en lfneas celulares DG44 CHO segun los procedimientos descritos previamente. Las protefnas que contienen hFc deseadas se purificaron a partir del medio de fermentacion de celulas CHO (1 L) ajustando el pH a 7,0 y capturando la protefna en una columna HiTrap rProteinA FF de 5 ml (GE heathcare) que se habfa equilibrado previamente. Todas las protefnas purificadas se caracterizaron por niveles de endotoxina antes de 20 la inyeccion para garantizar que no se produjera ninguna apertura de la BHE generalizada dependiente de endotoxina. Los resultados se muestran en la Tabla I. Los peptidos neuroactivos, dalargina, galanina o NPY se unieron a la molecula deseada (FC5, FC5-Fc) usando sulfosuccinimidil-4-(N-maleidometilo)ciclohexano-1-carboxilato (SMCC) un conector qufmico bifuncional mediante los procedimientos que se describen en Utoy col. 1991 (Uto, I., Ishimatsu, T., Hirayama, H., Ueda, S., Tsuruta, J., y Kambara, T. (1991) Journal of immunological methods 138(1), 25 87-94). Cada peptido que se pretendfa unir se sintetizo con un analogo de cisteamida en el extremo C-terminal que permitio la reticulacion C-terminal del peptido por medio de la cadena libre de cistefna a las cadenas laterales de lisina en la protefna utilizando la qufmica de reticulacion bifuncional de SMCC. Despues de la reticulacion, se purifico cada una de las moleculas marcadas por filtracion en gel preparativa S-200 para eliminar cualquier agregado formado durante la reaccion de reticulacion. El numero promedio de peptidos dalargina, NPY o Galanina vinculados 30 a cada dominio FC5 o dominios FC5-Fc se determino mediante espectrometrfa de masas. La Tabla I muestra el numero promedio de peptidos unidos por dominio FC5, FC5-Fc o Fc-FC5.
Farmacocinetica en circulacion de moleculas que contienen FC5: Para entender la exposicion del endotelio de la BHE a cada uno de los anticuerpos que contienen FC5, se determino la farmacocinetica de las moleculas en ratas. 35 Los animales fueron dosificados intraperitonealmente a 3 mpk con el FC5 Vhh fusionado N-terminalmente (FC5-Fc) o C-terminalmente (Fc-FC5) a un dominio humano Fc. Las concentraciones de FC5-Fc o Fc-FC5 en el plasma se determinaron en varios puntos temporales por ELISA. Los resultados fueron analizados para determinar la semivida en fase beta de cada constructo (Tabla II). Los resultados demostraron que la semivida de FC5-Fc y de Fc-FC5 es significativamente mas larga cuando se fusiona con un Fc humano que cuando se fusiona con el FC5 Vhh solo, ya 40 que es bien conocido que Fc proporciona reciclado y la mayor masa evitarfa la filtracion renal (Holt, L. J., Herring, C., Jespers, L. S., Woolven, B. P., y Tomlinson, I. M. (2003) Trends in biotechnology 21(11), 484-490).
La velocidad de transporte in vitro de moleculas que contienen FC5: Se utilizo una capa de celulas endoteliales de BHE in vitro para modelar las tasas de flujo que cruzan la BHE in vivo para cada FC5 que contiene protefna. El 45 modelo in vitro usa una monocapa de celulas endoteliales adultas inmortalizadas del cerebro de rata (SV-ARBEC) en un sistema de ensayo monocapa validado para la estanqueidad con moleculas pequenas (Garberg, P., Ball, M., Borg, N., Cecchelli, R., Fenart, L., Hurst, R. D., Lindmark, T., Mabondzo, A., Nilsson, J. E., Raub, T. J., Stanimirovic, D., Terasaki, T., Oberg, J. O., y Osterberg, T. (2005) Toxicol In Vitro 19(3), 299-334). Los procedimientos para las determinaciones de la tasa de vitroflujo son casi identicos a los descritos en (Caram-Salas, N., Boileau, E., 50 Farrington, G. K., Garber, E., Brunette, E., Abulrob, A., y Stanimirovic, D. Methods in molecular biology 763, ed. 2010, 383-401). Los indices de entrada se determinaron para FC5, FC5-Fc y Fc-FC5 a traves de la capa de celulas SV-ARBEC y los resultados se muestran en la Figura 3.
Afinidad de union de moleculas FC5 para TMEM30A: La afinidad de union de cada molecula se evaluo en ensayos 55 de citometrfa de flujo fluorescente por separado usando celulas endoteliales de BHE de rata recien aisladas, celulas endoteliales BHE de rata transformadas con SV40 (Caram-Salas, N., Boileau, E., Farrington, G. K., Garber, E., Brunette, E., Abulrob, A., y Stanimirovic, D. Methods in molecular biology 763, ed. 2010, 383-401) y celulas Hek293 transfectadas transitoriamente con la diana TMEM30A identificada previamente. Las curvas de union a cada lfnea celular se muestran en la Figura 4A-C, y los valores de afinidad calculados estan en la Tabla III. Los resultados 60 muestran que la union de FC5Fc a celulas endoteliales de BHE primarias de rata tiene una afinidad de 11 nM,
mientras que la union a la linea celular transformada con SV40 da como resultado un valor de EC50 de 75 nM, una union aproximadamente 7 veces mas debil. Mientras que la union a la linea celular Hek293 transformada transitoriamente con TMEM30A de rata produce una afinidad de aproximadamente 1700 nM, casi 170 veces mas debil que la union a la linea de celulas endoteliales de BHE primaria. Estos datos muestran que FC5-Fc tiene un 5 aumento sustancial en la afinidad aparente sobre FC5 Vhh solo cuando se mide por citometrfa de flujo, lo que sugiere que el FC5-Fc se une con avidez bidentada a las celulas que expresan TMEM-30A.
Evaluacion de eficacia en modelos animales: para evaluar que efecto tendrfa la dimerizacion del dominio Vhh de FC5 sobre la capacidad de la molecula para funcionar como transportador para entregar una carga util molecular a 10 traves de la BHE a traves de la TMR, se evaluo la actividad de estas moleculas en modelos animales. Se sabe que numerosos factores pueden afectar la eficiencia del transporte, por ejemplo, se ha informado que disminuir la afinidad de un anticuerpo contra el receptor de transferrina incluso varias veces tuvo un impacto positivo en la capacidad de la molecula para someterse efectivamente a la transmigracion de la BHE (Yu, Y. J., Zhang, Y., Kenrick, M., Hoyte, K., Luk, W., Lu, Y., Atwal, J., Elliott, J. M., Prabhu, S., Watts, R. J., y Dennis, M. S. Science translational 15 medicine 3(84), 84ra44). De acuerdo con este concepto, una mejora de afinidad significativa tras la dimerizacion de Fc del FC5 Vhh podrfa predecirse como un impacto negativo sobre la capacidad del FC5 Vhh para funcionar como una molecula efectiva de transporte de la bHe. Por lo tanto, la potencia de las moleculas a las que se habfa vinculado el peptido neuroactivo, teniendo cada molecula una valencia de FC5 diferente, se evaluo en un modelo in vivo.
20
El modelo de Hargreaves mide la sensibilidad aumentada al dolor termico inducido por la inyeccion del adyuvante de Freud en una pata. El dolor termico se puede suprimir tras la union de dalargina, un peptido de seis aminoacidos, a los receptores de dolor mu expresados en la parte periaqueductal del cerebro. La dalargina inyectada por via intravenosa no puede cruzar la BHE y no produce supresion del dolor, sin embargo, la inyeccion de ICV permite que 25 la dalargina se difunda a los receptores mu y bloquee los receptores mu y bloquee de esa manera el dolor. Por lo tanto, la dalargina inyectada por via intravenosa debe estar vinculado a un transportador mediado por receptor para permitir el transporte a traves de la BHE y la supresion del dolor. Para evaluar el transporte de dalargina mediado por moleculas que contienen FC5 a traves de la BHE, se utilizo el modelo animal de Hargreaves para comparar la potencia de diversas formas moleculares de FC5 Vhh ligadas a dalargina. La molecula de control negativo para FC5- 30 Dalargina fue EG2-Dalargina y para FC5-Fc-Dalargina lo fue Fc-FC5-Dalargina.
Para asegurar la comparabilidad de los artfculos de prueba positivos y negativos, FC5-Dal y EG2-Dal se caracterizaron por espectrometrfa de masas para mostrar que la relacion de peptidos de dalargina vinculados a cada Vhh era comparable (Tabla I).
35
Antes de la inyeccion intravenosa (IV), cada molecula se probo inicialmente mediante inyeccion intracerebroventricular (ICV) como un control positivo para asegurar que todas las moleculas unidas sean funcionalmente activas y capaces de inducir la supresion del dolor. Se esperarfa que tanto el control negativo como las moleculas de prueba positiva supriman el dolor tras la inyeccion de ICV, ya que las moleculas se inyectan 40 directamente en el lfquido cefalorraqufdeo y pueden difundir y bloquear los receptores periaqueductales de dolor mu. En todos los casos, cuando se evaluo mediante inyeccion de ICV, FC5-Dal, EG2-Dal, FC5-Fc-Dal, Fc-FC5-Dal o solo dalargina dieron una potencia similar en funcion de la cantidad de dalargina administrada. A continuacion, se evaluo la eficacia de cada molecula marcada con dalargina y la correspondiente protefna de control marcada con dalargina tras la administracion IV. Inicialmente, se comparo la eficacia de FC5-Dal frente al control (EG2-Dal). Los 45 resultados muestran una supresion total del dolor similar al nivel de supresion que se puede observar con la morfina sola (Figuras 5a y b). Es interesante observar que tres dosis de FC5-Dal a 7,5 mg por kg (mpk) por dosis son necesarias antes de observar la supresion inicial del dolor. Ademas, el grupo de control no mostro supresion del dolor incluso despues de que los animales recibieron una dosis similar tres veces a 7,5 mg por kg (mpk). Estos datos demuestran y confirman que FC5 es capaz de funcionar como transportador mediado por receptor, transportando 50 dalargina a traves de la bHe al parenquima cerebral y permitiendo que dalargina se una y bloquee los receptores de dolor mu, mientras que el control EG2-Dalargina no mostro supresion del dolor. Estos datos se resumen en la Tabla IV.
Las formas FC5 dimerizadas, FC5-Fc y Fc-FC5, demostraron afinidades de union muy diferentes para TMEM 30A en 55 celulas endoteliales de la BHE (Tabla III). Para determinar si la afinidad mejorada se correlacionaba con una potencia mejorada en el modelo de dolor de Hargreaves, se evaluo tanto FC5-Fc-dal como Fc-FC5-dal para la supresion del dolor. Despues de la inyeccion IV, Fc-FC5-dal no mostro eficacia (Figura 6a-d), mientras que FC5-Fc- dal (Figuras 7a y 7c) fue altamente eficaz en la supresion del dolor. Ademas, el control negativo de Fc-Dal no mostro eficacia in vivo (Figuras 7b y 7d). FC5-Fc mostro eficacia en la reduccion del dolor en la primera hora, incluso con 60 una dosis unica inicialmente a 0,5 mpk, con un promedio de EMP del 50 % despues de las primeras 0,5 h.
Comparando la potencia de FC5-dal con FC5-Fc-dal, los resultados mostraron que una dosis unica de FC5-dal a 21 mpk daba aproximadamente el mismo nivel de supresion del dolor que FC5-Fc-Dal a 0,5 mpk. En base a la relacion molar de dalargina inyectada, FC5Fc-Dal muestra una potencia 80 veces mayor que FC5-Dal en la capacidad de suprimir el dolor en el modelo de Hargreaves. Una segunda dosis de FC5-Fc-Dal a 2,5 mpk fue 5 suficiente en un animal para proporcionar la maxima supresion posible del dolor. La actividad biologica potenciada de FC5-Fc-Dal, Fc-FC5-Dal y FC5-Dal observada en el modelo de dolor de Hargreaves correlaciona la mayor afinidad y mayor eficacia de FC5-Fc que se resume en la Tabla II.
Ademas, se pueden lograr eficacias similares para la supresion del dolor mediante otros peptidos neuroactivos. Por 10 ejemplo, galanina, un peptido de 3,2 kDa de 29 aminoacidos unido a FC5 o FC5-Fc, con una qufmica identica a la descrita anteriormente, suprimio el dolor cronico en el modelo de Hargreaves. Por el contrario, la galanina vinculada al Fc solo no fue capaz de proporcionar un alivio efectivo del dolor. Los resultados para el control positivo de ICV y las inyecciones IV se resumen en la Tabla VI. Para validar la actividad de la galanina enlazada para unirse a sus receptores afines GalRI y GalR2 y suprimir el dolor tanto en el control negativo como en las moleculas de prueba, se 15 probaron todas las moleculas y se demostro que suprimfan el dolor despues de la inyeccion ICV (Tabla VI). Cuando se inyecto IV, solo la galanina unida a las moleculas que contenfan FC5, FC5 o FC5-Fc pudieron suprimir el dolor in vivo. Hubo una diferencia significativa en la dosificacion de galanina unida a FC5 frente a FC5-Fc requerida para reducir el dolor en el modelo animal de Hargreaves. El galanina-FC5 en una dosis unica de 6 mpk (Tabla VI) dio como resultado un EMP del 8 %, mientras que una dosis unica de FC5-Fc-Gal dio como resultado un EMP del 45 %.
20
La administracion intraperitoneal de pentilenotetrazol (PTZ) induce convulsiones en ratas y se ha usado como modelo de ataques eplilepticos (Chen, J.W.; Naylor, D.E.; Wasterlain, C.G. Advances in the pathophysiology of status epilepticus. Acta Neurol. Scand. Suppl., 2007, 186, 7-15.; Werner, F.M.; Covenas, R. Neuropeptides involved in schizophrenia, Curr. Top. Neurochem., 2005, 4, 35-49.; Werner, F.M.; Covenas, R. En: Focus on Neuropeptide 25 Research, Covenas, Mangas and Narvaez, Eds.; Transworld Reasearch Network: Trivandrum, 2007; pags. 299-339; Werner, F.M.; Covenas, R. Classical neurotransmiters and neuropeptides involved in major depression. Int. J. Neurosci., 2010, 120, 455-70). Se sabe que los peptidos neuroactivos tales como galanina y neuropeptido Y proporcionan proteccion contra las convulsiones inducidas por PTZ (Mazarati 1998a;Mazarati, A M., Hohmann, J. G., Bacon, A, Liu, H., Sankar, R., Steiner, R. A, Wynick, D., y col. Modulation of hippocampal excitability and seizures by 30 galanin. The Journal of neuroscience : la revista oficial de la Sociedad de Neurociencia, 2000, 20(16), 6276-81). Mazarati y col. (Mazarati A, Liu H, Soomets U, Sankar R, Shin D, Katsumori H, Langel U, Wasterlain CG Galanin modulation of seizures and seizure modulation of hippocampal galanin in animal models of status epilepticus. J Neurosci 1998, 18:10070 -10077.). Estos estudios mostraron que el agotamiento de galanina del hipocampo de la rata se asocia con el desarrollo del estado epileptico autosostenible. Ademas, la inyeccion de galanina en la region 35 del hipocampo del cerebro puede suprimir las convulsiones (Mazarati A, Liu H, Soomets U, Sankar R, Shin D, Katsumori H, Langel U, Wasterlain CG Galanin modulation of seizures and seizure modulation of hippocampal galanin in animal models of status epilepticus. J Neurosci 1998, 18:10070 -10077.;Mazarati AM, Halaszi E, Telegdy G Anticonvulsive effects of galanin administered into the central nervous system upon the picrotoxinkindled seizure syndrome in rats. Brain Res 1992, 589:164 -166.). Sin embargo, los peptidos neuroactivos administrados por via 40 intravenosa no pueden atravesar la BHE y tienen una semivida breve debido a su pequeno tamano (Jain, Kamal y Batra. Trends Biotechnol. Vol 25. ed.: 2007:307-16, Batra, Jain, Wittel, Chauhan y Colcher. Curr Opin Biotechnol. Vol 13. ed.: 2002:603-8). La eficacia de galanina en el modelo PTZ se evaluo probando galanina unida tanto a FC5, el anticuerpo de dominio unico, como a FC5-Fc. Aunque se espera que ambas construcciones mejoren el transporte a traves de la BHE, la construccion FC5-Fc mostro una mayor afinidad practica debido a la union avida a su supuesta 45 diana TMEM30A y a tener una semivida mucho mas larga debido al aumento del tamano y al reciclado dependiente de Fc.
En el modelo de convulsion inducido por PTZ, se inyecta el agente de interes por via intravenosa o por inyeccion directa en el hipocampo. La inyeccion en el hipocampo libera al agente directamente en el sitio de accion 50 permitiendo que la galanina se una a sus receptores afines y bloquee el inicio de las convulsiones. Ademas, la inyeccion directa en el hipocampo de cada una de las moleculas sirve como un control positivo para mostrar que la galanina unido a cada una de las moleculas, Fc, FC5 o FC5-Fc, retiene la actividad supresora de las convulsiones. Las dosis de cada molecula administrada se variaron para dar dosis equivalentes de galanina casi molares. Para el estudio de control positivo, las ratas Wistar macho (4-6 semanas de edad) recibieron una inyeccion intrahipocampal 55 de una de las siguientes opciones: Acido valproico, Gal-Cya o FC5-Gal en un volumen final de 5 pL, seguido 15 minutos mas tarde por una inyeccion IP de 50 mpk de PTZ para inducir las convulsiones.
Para evaluar la efectividad de la galanina unida a FC5, FC5-Fc o Fc para cruzar la BHE, se inyecto cada una de estas moleculas sistemicamente tal como se detalla en la Figura 7A y 7B. Para el estudio sistemico, las ratas 60 recibieron 1, 2 o 3 inyecciones intravenosas (a traves de la vena de la cola) de Gal-Cya o FC5-Gal, o una dosis unica
de FC5-Fc-Gal o Fc-Gal. En cada caso, despues de la inyeccion IP de PTZ a una dosis de 50 mpk, se administro por via intraperitoneal y se registraron los movimientos de la rata durante 30 minutos.
Todos los movimientos registrados fueron revisados y el tiempo hasta el inicio de las convulsiones y los tiempos de 5 duracion de las convulsiones fueron medidos por un investigador imparcial para cada uno de los tres cambios conductuales caracterfsticos: primer espasmo mioclonico (FMJ, que se caracteriza por tics de orejas, cabeza y hombros), primera convulsion clonica (FCj; que se caracteriza por convulsiones mfnimas, clonus de los musculos de la cabeza y extremidades anteriores, movimientos involuntarios de todo el cuerpo y movimientos de salto con reflejo de enderezamiento) y primera extension tonica generalizada (TGE; que se caracteriza por la perdida de la capacidad 10 de enderezamiento, flexion o extension de miembros anteriores y posteriores y clonus de todo el cuerpo).
La Tabla Vila muestra los resultados de las inyecciones intrahipocampales de cada molecula. La inyeccion IP de la PTZ a 50 mpk dio como resultado el inicio rapido de cada tipo de convulsion, mioclonico, clonico y tonico generalizado con una progresion muy rapida desde la FMJ menos grave hasta la forma mas comun de convulsion 15 mas generalizada. El acido valproico, una molecula pequena de la que se sabe que suprime parcialmente el inicio de convulsiones inducidas por PTZ, (Pollack G.M., Shen D.D. J Pharmacol Methods. (1985) Apr;13(2):135-46) retraso significativamente los tres tipos de convulsiones, pero no previno completamente el inicio de las convulsiones, con un retraso de aproximadamente 100 segundos en el inicio de las convulsiones mioclonicas y clonicas observadas. La inyeccion intrahipocampal de galanina sola o ligada a FC5 dio como resultado un retraso significativo de las 20 convulsiones mioclonicas y la prevencion completa de las convulsiones clonicas mas serias y tonicas generalizadas.
Los resultados obtenidos con la dosificacion intravenosa de cada molecula se muestran en la Tabla Vllb. La PTZ conduce a un inicio rapido de cada tipo de convulsion y el acido valproico a una dosis de 11,2 mpk IV suprime la aparicion de las convulsiones mioclonicas y clonicas. Galanina intravenosa y Galanina-Fc, una version de semivida 25 corta y larga del peptido neuroactivo, dieron como resultado una demora nula o muy leve del inicio de la convulsion, respectivamente. FC5-galanina dosificada a 6 mpk, 1 h antes de la dosificacion de PTZ dio como resultado un retraso significativo de la convulsion mioclonica y la supresion completa de las convulsiones clonicas y clonicas generalizadas. Una dosis unica de FC5-Fc-Galanina dos horas antes de la dosificacion de PTZ tambien dio como resultado un retraso significativo de la convulsion mioclonica y la supresion completa de las convulsiones clonicas y 30 clonicas generalizadas.
De estos resultados, se pueden extraer varias conclusiones. La galanina unida a FC5, Fc o FC5-Fc retiene actividad equivalente como se muestra cuando se dosifica ICV en el modelo de Hargreaves (Tablas IV y V), ademas la Tabla Vila muestra que FC5-galanina mostro una actividad equivalente sobre una base molar a galanina solo cuando se 35 inyecta en el hipocampo de ratas en el modelo de convulsiones de PTZ. Por el contrario, la galanina sola o como una molecula de larga vida unida a la molecula de hFc no cruza la barrera hematoencefalica de manera efectiva ni suprime las convulsiones inducidas por PTZ. Solo cuando se acopla a FC5, ya sea como FC5-Galanina o como FC5-Fc-Galanina, la galanina puede cruzar el BHE y demorar y suprimir efectivamente las convulsiones inducidas por PTZ. La galanina unida a FC5-Fc es mucho mas efectiva que la galanina unida a FC5 solo en la reduccion de las 40 convulsiones en base a una comparacion de dosificacion molar; especfficamente, es al menos dieciseis veces mas potente. Ademas, FC5-Fc Galanina mostro un mayor retraso en el tiempo hasta el inicio de la primera convulsion mioclonica cuando se comparo FC5-Galanina. Estos resultados indican que la semivida mejorada y el aumento de la afinidad practica del FC5-Fc hacia su diana mejora la entrega de galanina a traves de la BHE y da como resultado una reduccion mas eficaz de las convulsiones en el modelo de convulsion de PTZ que FC5 Galanina.
45
Tabla I. Caracterizacion de moleculas expresadas y purificadas.
Molecula plasmido
FC5(I)(EAG2333) FC5- Fc(2)(EAG2345) Fc- FC5(2)(EAG2304) Fc
Peso molecular calculado (Dalton)
15.375 78.725 78.924 51.896
Endotoxina (EU/mg)
<1 <1 <1 <1
Peso molecular calculado LS (Dalton)
16.860 77.530 78.950 57.800
% del area de pureza del pico en la Sec analftica
99,7 98,9 95,0 99,7
Peptidos de
1,5 1,5 1,5 1,0
dalargina unidos
en promedio (3) __________________________________________________________
(1) contiene la etiqueta myc EQKLISEEDL, extremos C-terminales (pm 1202), etiqueta His 5H en el extremo C-terminal (2) Los dominios Fc son IgG1 humana y agly (todos los dominios Fc contienen una mutacion puntual T299A en la secuencia hIgG para eliminar la N-glicosilacion de Fc) (3) evaluado por EM, para determinar el numero promedio de dalarginas unidas covalentemente a los dominios FC5-Fc.
Tabla II. Determinaciones de semivida farmacocinetica de dominios FC5 fusionados a una hFc.
FC5-Fc Fc-FC5 hIgG1
Formato de ensayo
Fluorescencia ELISA Fluorescencia Fluorescencia ELISA
Semivida en fase beta (h)
39,4 35,7 38,6 43,5 48
5 La semivida se determino mediante deteccion por ELISA del Fc humano a partir de suero de rata o con moleculas marcadas con AL680 y la fluorescencia se determino a partir de los sueros. No se observo ninguna diferencia entre las moleculas en las que la semivida se determino mediante fluorescencia frente a ELISA. Las moleculas se inyectaron por via intraperitoneal a 3 mpk.
10 Tabla III. Resumen de las afinidades de union y eficacia relativa de FC5-Dal, FC5-Fc-Dal y Fc-FC5-Dal en el modelo de ^ Hargreaves, que muestra la correlacion de la eficacia y afinidad con celulas endoteliales de la BHE.
Molecula
Afinidad (nM)
FC5 FC5- Fc-
Fc FC5
Celulas endoteliales de BHE de rata primarias
>2000 11 1700
SV-ARBEC
75 ND
Celulas endoteliales de la aorta de rata
1700
Potencia en numero de veces comparado con FC5-Dal en el modelo de Hargreaves
1 80 <0,1
Tabla IV. Resumen de la supresion del dolor cronico en el modelo de Hargreaves por dalargina sola o unida a FC5.
ICV IV
molecula
Dosis (|jg) % de EMP Dosis (mg/kg) % de EMP
PBS
5 0 ± 0,8 800 (jL) 0 ± 0,6
Dalargina
2 35 ± 1 0,34 x 3 iny. 0,3 ± 0,3
FC5
69,75 0 ± 2 7 x 3 iny. 1,9 ± 0,3
EG2
69,75 0 ± 2 7 x 3 iny. 0 ± 1,3
A20.1
7,84 x 3 iny. 2,2 ± 0,3
FC5-Dalargina
74,4 47 ± 2 7 x 3 iny. 41 ± 0,5
EG2-Dalargina
74,4 31 ± 1 7 x 3 iny. 2,0 ± 0
A20.1-Dalargina
2,49 x 3 iny. 3,1 ± 0
FC5 + Dalargina
(0,65 jg + 7 mg/Kg) x 3 iny 0 ± 1,6
15 La supresion del dolor cronico se expresa como el porcentaje del efecto maximo posible (% de EMP). El valor se basa en el area bajo la curva para el animal con supresion del dolor en relacion con la pata de control contralateral durante el marco de tiempo de medicion. La eficacia de las moleculas inyectadas, ya sea ICV o IV se muestra como un porcentaje del efecto maximo posible (% de EMP) en el modelo de Hargreaves. A20.1 y EG2 son anticuerpos de dominio unico no relacionados con FC5, que no tienen afinidad aparente por las celulas endoteliales de la BHE. La 20 dosis en mpk para los valores de dosificacion intravenosa (IV) se indica por inyeccion seguida del numero de inyecciones.
Tabla V. Resumen de la supresion del dolor cronico en el modelo de Hargreaves por dalargina unida a Fc o ____________________________dalargina unida a FC5-Fc.____________________________
ICV IV
molecula
Dosis (jg) % de EMP Dosis (mg/kg) % de EMP
FC5-Fc-Dal
11,5 43 ± 3 6 46 ± 2
Fc Dal
9,3 55 ± 2 6 5 ± 2
FC5-Fc + FC5-Fc-Dal
2,5+ 6 32 ± 7
En el segundo experimento, se inyecto una dosis intravenosa de FC5-Fc no unido IV antes de la adicion de FC5-Fc- Dal a las concentraciones indicadas.
5 Tabla VI. Supresion cronica del dolor en el modelo de Hargreaves^ por galanina unida a Fc, FC5-Fc o FC5.
ICV IV
molecula
Dosis (|jg) % de EMP (mg/kg) % de EMP
Galanina
2 54 ± 1 1 0 ± 1
Fc-Gal
11,2 49 ± 1 6 2 ± 1
FC5-Gal
10,87 49 ± 2 6 8 ± 1
FC5-Fc-Gal
11,4 49 ± 2 6 45 ± 2
En el caso de dosis multiples para FC5-Gal, las dosis se espaciaron con 1 h de diferencia. En el tercer experimento, se inyecto una dosis intravenosa de FC5-Fc no unido IV antes de la adicion de FC5-Fc-Dal a las concentraciones indicadas.
10
Tabla VII. : Comparacion del tiempo hasta el inicio de las convulsiones con inyeccion en el hipocampo (a) o _____________________inyeccion IV (b) en el modelo de PTZ de rata ^____________________
a) Inyeccion en el hipocampo.
| |
Tiempo en segundos hasta el inicio de la convulsion
molecula
Dosis (jg) Mioclonica (seg) Clonica Tonica generalizada
Solo PTZ
50 mg/kg 0 ± 2 0 ± 6 0 ± 0,5
Acido valproico
11,2 100 ± 6 100 ± 9 2 ± 1
Galanina
1,82 104 ± 0 evitada evitada
FC5-Galanina
11,9 82 ± 4 evitada evitada
b) Inyeccion intravenosa.
Tiempo en segundos hasta el inicio de la convulsion
molecula
Dosis (mg/kg) Mioclonica (seg) Clonica Tonica generalizada
Solo PTZ
50 mg/kg 0 ± 1 0 ± 3 0 ± 0,5
Acido valproico
11,2 100 ± 3 100 ± 3 100 ± 0
Galanina
1 x 2 iny. 0,5 ± 5 0 ± 2 2 ± 4
Fc-Gal
6 2 ± 1 18 ± 2 17 ± 2
FC5-Galanina
6 x 3 iny. 47 ± 3 evitada evitada
FC5-Fc-Galanina
6 101 ± 28 evitada evitada
Despues de la administracion IP de ratas con PTZ, el tiempo hasta el inicio para cada tipo de convulsion indicado a 15 continuacion; Se evaluaron FMJ, FCJ y TGE. Los tipos de convulsiones se han descrito con mas detalle anteriormente. (a) PTZ administrado IP determina el tiempo de control para cada tipo de convulsion. La inyeccion hipocampal de acido valproico, galanina o FC5-Galanina antes de la inyeccion IP de PTZ determina el efecto maximo que cada una de estas moleculas puede tener en el tiempo para cada tipo de convulsion. (b) Dosis IV de acido valproico, el control positivo, galanina (dosis de inyeccion 1 x 3, cada dosis separada por 1 hora 45 min antes 20 de la administracion de PTZ) o FC5-galanina (1 x 3 dosis, cada dosis separada por 1 hora 45 min antes de administracion de PTZ), FC5-Fc-Gal o Fc-Gal se dosificaron 2 h antes de que la inyeccion IP de PTZ midiera el efecto que cada una de estas moleculas puede tener tras la administracion IV. Fc-Gal sirve como control negativo, ya que la molecula carece del fragmento FC5 F(ab), pero tiene una PK in vivo similar a FC5-Fc.
25 Seq1: La secuencia de FC5-agly (T299A)hFc. (pEAG2345)
DVQLQASGGGLVQAGGSLRLSCAASGFKITHYTMGWFRQAPGKEREFVSRITW
GGDNTFYSNSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTADYYCAAGSTSTATP
LRVD Y WGKGTQ VT V S S AEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPS VFLFPPKPKDTLM
ISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSAYRVVSV
LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELT
KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD
KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Seq2: La secuencia de agly (T299A) hFc-FC5. (pEAG2403)
EPKSSDKTHTCPPCPAPEFFGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDP
EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSAYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK
VSNKALPAPIEKT1SKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA
VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEA
LHNHYTQKSLSLSPGGGGGSDVQLQASGGGLVQAGGSLRLSCAASGFKITHYT
MGWFRQAPGKEREFVSRITWGGDNTFYSNSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSL
KPEDT ADYY CA AGSTST ATPLR VDYWGKGTQVTVSS
Seq3: La secuencia de FC5-agly (T299A)hFc (pYL605) desordenada
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDP
EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSAYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK
VSNKALPAPIEKT1SKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA
VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEA
FHNHYTQKSLSLSPGGGGGSDVQLQASGGGLVQAGGSLRLSCAASGFKITHYT
MGWFRQAPGKEREFVSRITWGGDNTFYSNSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSL
KPEDTADYYCAADAGSTGSYGSFDYWGKGTQVTVSS________________________________
Equivalentes
Los expertos en la tecnica reconoceran, o seran capaces de determinar usando no mas que una experimentacion de 10 rutina, muchos equivalentes a las realizaciones especfficas de la invencion descrita en el presente documento.

Claims (16)

  1. REIVINDICACIONES
    I. Una molecula de union que es una protefna quimerica que comprende al menos un agente farmacologicamente activo, al menos dos sitios de union comprendidos en anticuerpos de dominio unico que se
    5 unen a TMEM30A, y una region Fc que comprende un primer resto Fc y un segundo resto Fc, donde al menos dos sitios de union que se unen a TMEM30A se fusionan cada uno i) directamente o ii) mediante una secuencia de aminoacidos intermedia al extremo N-terminal del primer resto Fc y el segundo resto Fc, respectivamente, donde la region Fc se une especfficamente al receptor de FcRn.
    10 2. La molecula de union de la reivindicacion 1, donde el primer resto Fc y el segundo resto Fc
    comprenden cada uno un dominio CH2 y un dominio CH3.
  2. 3. La molecula de union de las reivindicaciones 1 o 2, donde el primer resto Fc y el segundo resto Fc comprenden cada uno un dominio CH2 y un dominio CH3.
    15
  3. 4. La molecula de union de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la region Fc es de un anticuerpo IgG.
  4. 5. La molecula de union de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde 20 (a) los al menos dos sitios de union comprenden la secuencia de aminoacidos FC5, o
    (b) los al menos dos sitios de union consisten en la secuencia de aminoacidos FC5.
  5. 6. La molecula de union de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el primer y/o el segundo resto Fc esta aglicosilado.
    25
  6. 7. La molecula de union de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende la SEQ ID NO:1.
  7. 8. La molecula de union de la reivindicacion 1, donde la molecula de union comprende al menos tres 30 sitios de union comprendidos en anticuerpos de dominio unico que se unen a TMEM30A, mas preferentemente en
    los que la molecula de union comprende al menos cuatro sitios de union compuestos por anticuerpos de dominio unico que se unen a TMEM30A.
  8. 9. La molecula de union de la reivindicacion 1, donde
    35 (a) los al menos dos sitios de union estan geneticamente fusionados directamente al primer y segundo resto Fc, respectivamente,
    (b) los al menos dos sitios de union estan geneticamente fusionados al primer y segundo resto Fc, respectivamente, mediante una secuencia de aminoacidos intermedia que comprende un conector peptfdico, o
    (c) los al menos dos sitios de union estan geneticamente fusionados al primer y segundo resto Fc, respectivamente, 40 mediante una secuencia de aminoacidos intermedia constituida por un conector peptfdico.
  9. 10. La molecula de union de la reivindicacion 1, donde los al menos dos sitios de union estan fusionados con el extremo N-terminal del primer y segundo resto Fc, respectivamente, mediante una secuencia de aminoacidos que comprende un conector peptfdico, y donde (a) el primer y el segundo resto Fc se derivan de diferentes
    45 inmunoglobulinas, (b) uno de los restos Fc esta mutado y el otro resto Fc no esta mutado o (c) ambos restos Fc estan mutados pero con diferentes mutaciones.
    II. La molecula de union de la reivindicacion 1, donde
    (a) uno de los al menos dos sitios de union esta fusionado al extremo N-terminal de una molecula scFc, o 50 (b) el al menos un agente farmacologicamente activo esta fusionado con el extremo C-terminal de la region Fc.
  10. 12. La molecula de union de la reivindicacion 1, donde el al menos un agente farmacologicamente activo es una entidad qufmica pequena, preferentemente en la que la entidad qufmica pequena esta fusionada con la molecula de union en un residuo de cistefna, mas preferentemente en la que el resto de cistefna es un residuo de
    55 cistefna disenado.
  11. 13. La molecula de union de la reivindicacion 1, donde el al menos un agente farmacologicamente activo es un polipeptido, preferentemente en la que al menos un agente farmacologicamente activo comprende un sitio de union a antfgeno, mas preferentemente en la que el sitio de union a antfgeno se deriva de un anticuerpo que no se
    60 une a TMEM30.
  12. 14. La molecula de union de la reivindicacion 13, donde el agente farmacologicamente activo se
    selecciona del grupo constituido por una molecula scFv, una molecula Fab y un anticuerpo de dominio unico.
    5 15. La molecula de union de la reivindicacion 1, donde el al menos un agente farmacologicamente activo
    esta geneticamente fusionado a la molecula de union, preferentemente donde los al menos dos sitios de union estan geneticamente fusionados mediante una secuencia de aminoacidos intermedia que comprende el dominio VH de una molecula de anticuerpo, o donde los al menos dos sitios de union estan fusionados geneticamente mediante una secuencia de aminoacidos intermedia que comprende el dominio VL de una molecula de anticuerpo, 10 preferentemente en la que la secuencia de aminoacidos intermedia comprende ademas un conector peptfdico.
  13. 16. La molecula de union de la reivindicacion 1, donde el al menos un agente farmacologicamente activo
    esta unido covalentemente a la molecula de union.
    15 17. La molecula de union de la reivindicacion 15, donde
    (a) los al menos dos sitios de union estan geneticamente fusionados al extremo N-terminal de un dominio VH de una molecula de anticuerpo intacta, o
    (b) los al menos dos sitios de union estan geneticamente fusionados con el extremo N-terminal de un dominio VL de una molecula de anticuerpo intacta.
    20
  14. 18. La molecula de union de la reivindicacion 1, donde los al menos dos sitios de union estan geneticamente fusionados al extremo N-terminal de un dominio VH y un dominio VL de una molecula de anticuerpo intacta.
    25
  15. 19. La molecula de union de la reivindicacion 1, donde el agente farmaceuticamente activo se selecciona del grupo constituido por un peptido neuroactivo, una entidad qufmica pequena y una region variable de un anticuerpo que se une a una diana en el sistema nervioso central.
    30 20. La molecula de union de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 para el tratamiento de un
    trastorno neurologico.
  16. 21. La molecula de union segun la reivindicacion 20, donde el trastorno neurologico es un trastorno de
    almacenamiento, dolor cronico, epilepsia, esclerosis multiple, una proteinopatfa o un trastorno desmielinizante.
    35
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