JP2022533254A - Ｉｌ－２組成物およびその使用方法 - Google Patents

Ｉｌ－２組成物およびその使用方法 Download PDF

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Abstract

第１のポリペプチド鎖がマスキング部分に融合されたＩＬ－２を含み、第２のポリペプチド鎖がマスキング部分に融合されたＩＬ－２結合タンパク質を含む、少なくとも２つの個別のポリペプチド鎖を含む活性化可能プロタンパク質、ならびに関連する医薬組成物およびその使用方法を提供する。本開示の実施形態は、疾患組織内、例えばがん組織または腫瘍内で活性化され得るＩＬ－２を含む活性化可能プロタンパク質を提供することによって、これらの問題およびより多くの問題に対処する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、２０１９年５月２４日に提出された米国仮特許出願第６２／８５２，７６８号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表に関する声明
本出願に関連する配列表は、紙のコピーではなくてテキストフォーマットで提供され、これにより参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含有するテキストファイルの名称は、ＰＲＶＡ＿００２＿０１ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは約４６４ＫＢであり、２０２０年５月１８日に作成され、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子提出されている。
技術分野
本開示は、第１のポリペプチドがマスキング部分に融合されたＩＬ－２を含み、第２のポリペプチドがマスキング部分に融合されたＩＬ－２結合タンパク質を含む、少なくとも２つの個別のポリペプチド鎖を含む活性化可能プロタンパク質、ならびに関連する医薬組成物およびその使用方法に関する。
関連技術の説明
インターロイキン－２（ＩＬ－２）免疫療法は、悪性黒色腫および腎細胞がんなどのがん、ならびにＨＩＶ感染症などの慢性感染症の処置において有用性が証明されている。
しかし、ほとんどのＩＬ－２療法に関連してある特定の問題が存在する。例えば、現在の形態のＩＬ－２療法は、循環中の半減期が短く、主に免疫抑制性の制御性Ｔ細胞すなわちＴｒｅｇを増大させる（例えば、Arenas-Ramirez et al., Trends in Immunology. 36: 763-777, 2015を参照されたい）。同様に、ＩＬ－２療法の効果は、標的組織に局在するのではなく主に全身性であり、そのために多くの重度の副作用、例えば呼吸の問題、悪心、低血圧、食欲減退、錯乱、重篤な感染症、発作、アレルギー反応、心臓の問題、腎不全、および血管漏出症候群をもたらす。とはいえ、ＩＬ－２療法は有効であり得、これらおよび他の欠点を克服するために当技術分野でアンメットニーズが存在する。
本開示の実施形態は、疾患組織内、例えばがん組織または腫瘍内で活性化され得るＩＬ－２を含む活性化可能プロタンパク質を提供することによって、これらの問題およびより多くの問題に対処する。
Arenas-Ramirez et al., Trends in Immunology. 36: 763-777, 2015
本開示の実施形態は、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含む活性化可能プロタンパク質であって、第１のポリペプチドが、第１のマスキング部分およびＩＬ－２タンパク質を含み、第１のマスキング部分が、第１の結合部分およびＩＬ－２タンパク質に融合された第１のリンカーを含み、第２のポリペプチドが、第２のマスキング部分およびＩＬ－２結合タンパク質を含み、第２のマスキング部分が、第２の結合部分およびＩＬ－２結合タンパク質に融合された第２のリンカーを含み、第１および第２のマスキング部分は、そのそれぞれの第１および第２の結合部分を介して、必要に応じて二量体として互いに結合し、それによってｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで免疫細胞の表面上に存在するＩＬ－２Ｒβ／γｃ鎖に結合するＩＬ－２タンパク質の結合部位を隠し、第１のリンカーまたは第２のリンカーの少なくとも１つが切断可能リンカーである、活性化可能プロタンパク質を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－２タンパク質は、表Ｓ１から選択される配列または配列番号１（全長の野生型ヒトＩＬ－２）のアミノ酸２１～１５３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、それからなり、またはそれから本質的になり、必要に応じて配列番号１によって定義されるＣ１４５Ｘ（Ｘは任意のアミノ酸である）またはＣ１４５Ｓ置換を含む。一部の実施形態では、ＩＬ－２タンパク質は、配列番号２（Ｃ１２５Ｓ置換を有する成熟ヒトＩＬ－２）と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、それからなり、またはそれから本質的になり、必要に応じてＩＬ－２タンパク質は、配列番号２によって定義されるＳ１２５残基を保持する。一部の実施形態では、ＩＬ－２タンパク質は、配列番号２によって定義されるＫ３５Ｃ、Ｒ３８Ｃ、Ｔ４１Ｃ、Ｆ４２Ｃ、Ｅ６１Ｃ、およびＶ６９Ｃから選択される１つまたは複数の置換を含む。一部の実施形態では、ＩＬ－２タンパク質は、必要に応じて請求項４に記載のシステインの１つまたは複数およびＩＬ－２結合タンパク質における１つまたは複数のシステインを介して、ＩＬ－２結合タンパク質とジスルフィド結合を形成する。一部の実施形態では、ＩＬ－２タンパク質は、配列番号２によって定義される６９、７４、または１２８位で１つまたは複数のアミノ酸置換を含み、必要に応じて１つまたは複数のアミノ酸置換は、配列番号２によって定義されるＶ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、およびＩ１２８Ｔから選択される。一部の実施形態では、ＩＬ－２タンパク質は、配列番号２によって定義されるＲ３８、Ｆ４２、Ｙ４５、Ｅ６２、Ｅ６８、および／またはＬ７２位で１つまたは複数のアミノ酸置換を含み、必要に応じて１つまたは複数のアミノ酸置換は、その組合せを含む、Ｒ３８ＡおよびＲ３８Ｋ；Ｆ４２Ａ、Ｆ４２Ｇ、Ｆ４２Ｓ、Ｆ４２Ｔ、Ｆ４２Ｑ、Ｆ４２Ｅ、Ｆ４２Ｎ、Ｆ４２Ｄ、Ｆ４２Ｒ、Ｆ４２Ｋ、およびＦ４２Ｉ；Ｙ４５Ａ、Ｙ４５Ｇ、Ｙ４５Ｓ、Ｙ４５Ｔ、Ｙ４５Ｑ、Ｙ４５Ｅ、Ｙ４５Ｎ、Ｙ４５Ｄ、Ｙ４５Ｒ、およびＹ４５Ｋ；Ｅ６２ＡおよびＥ６２Ｌ；Ｅ６８ＡおよびＥ６８Ｖ；ならびにＬ７２Ａ、Ｌ７２Ｇ、Ｌ７２Ｓ、Ｌ７２Ｔ、Ｌ７２Ｑ、Ｌ７２Ｅ、Ｌ７２Ｎ、Ｌ７２Ｄ、Ｌ７２Ｒ、およびＬ７２Ｋ、必要に応じてＦ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、およびＬ７２Ｇ；Ｒ３８Ｋ、Ｆ４２Ｑ、Ｙ４５Ｎ、Ｅ６２Ｌ、およびＥ６８Ｖ；Ｒ３８Ｋ、Ｆ４２Ｑ、Ｙ４５Ｅ、およびＥ６８Ｖ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ｉ、Ｙ４５Ｎ、Ｅ６２Ｌ、およびＥ６８Ｖ；Ｒ３８Ｋ、Ｆ４２Ｋ、Ｙ４５Ｒ、Ｅ６２Ｌ、およびＥ６８Ｖ；Ｒ３８Ｋ、Ｆ４２Ｉ、Ｙ４５Ｅ、およびＥ６８Ｖ；ならびにＲ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、およびＥ６２Ａから選択される組合せから選択される。一部の実施形態では、ＩＬ－２タンパク質は、配列番号３（成熟ヒトＩＬ－２「Ｄ１０」バリアント）と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、それからなり、またはそれから本質的になり、必要に応じてＩＬ－２タンパク質は、配列番号３によって定義されるＱ７４Ｈ、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、および／またはＩ９２Ｆ置換のうちの任意の１つまたは複数を保持する。
一部の実施形態では、ＩＬ－２結合タンパク質は、ＩＬ－２Ｒαタンパク質、またはＩＬ－２タンパク質に特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合性断片、必要に応じて二重特異性抗体またはその抗原結合性断片である。一部の実施形態では、ＩＬ－２Ｒαタンパク質は、表Ｓ２から選択される配列または配列番号４（全長の野生型ヒトＩＬ－２Ｒα）のアミノ酸２２～１８７と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％であるアミノ酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。一部の実施形態では、ＩＬ－２Ｒαタンパク質は、配列番号６（ヒトＩＬ－２Ｒα Ｓｕｓｈｉ１～Ｓｕｓｈｉ２ドメイン）によって定義されるＤ４Ｃ、Ｄ６Ｃ、Ｎ２７Ｃ、Ｋ３８Ｃ、Ｓ３９Ｃ、Ｌ４２Ｃ、Ｙ４３Ｃ、Ｉ１１８Ｃ、およびＨ１２０Ｃから選択される１つまたは複数のシステイン置換を含む。一部の実施形態では、ＩＬ－２Ｒαタンパク質は、必要に応じて請求項１１に記載のシステインの１つまたは複数、およびＩＬ－２タンパク質における１つまたは複数のシステイン、必要に応じて請求項４に記載のシステインの１つまたは複数、必要に応じてＩＬ２－Ｋ３５ＣおよびＩＬ２Ｒα－Ｄ４Ｃ、ＩＬ２－Ｒ３８ＣおよびＩＬ２Ｒα－Ｄ６Ｃ、ＩＬ２－Ｒ３８ＣおよびＩＬ２Ｒα－Ｈ１２０Ｃ、ＩＬ２－Ｔ４１Ｃ－ＩＬ２Ｒα－Ｉ１１８Ｃ、ＩＬ２－Ｆ４２ＣおよびＩＬ２Ｒα－Ｎ２７Ｃ、ＩＬ２－Ｅ６１ＣおよびＩＬ２Ｒα－Ｋ３８Ｃ、ＩＬ２－Ｅ６１ＣおよびＩＬ２Ｒα－Ｓ３９Ｃ、ならびにＩＬ２－Ｖ６９ＣおよびＩＬ２Ｒα－Ｌ４２Ｃから選択される１つまたは複数のシステイン対を介して、ＩＬ－２タンパク質とジスルフィド結合を形成し、ＩＬ－２タンパク質とＩＬ－２Ｒαタンパク質との間のジスルフィド結合は、Ｔｒｅｇ上に発現されるＩＬ－２Ｒαβγ鎖に優先的に結合するＩＬ－２タンパク質の結合部位を隠す。一部の実施形態では、ＩＬ－２Ｒαタンパク質は、配列番号６によって定義される４９および／または６８位でアラニン置換を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－２タンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片は、全抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、単一特異性Ｆａｂ２、二重特異性Ｆａｂ２、ＦＶ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦＶ－Ｆｃ、ナノボディ、ダイアボディ、ラクダ、およびミニボディのうちの１つまたは複数から選択され、必要に応じて抗体は、ＮＡＲＡ１またはその抗原結合性断片である。
一部の実施形態では、第１のマスキング部分および／または第２のマスキング部分は、ＩＬ－２タンパク質にもＩＬ－２結合タンパク質にも結合しない。一部の実施形態では、第１のマスキング部分および／または第２のマスキング部分は、ＩＬ－２タンパク質に結合する。
一部の実施形態では、第１および第２の結合部分は、1つの少なくとも１つの非共有結合を介して互いに結合し、必要に応じて二量体を形成する。一部の実施形態では、第１および第２の結合部分は、1つの少なくとも１つの共有結合を介して互いに結合し、必要に応じて二量体を形成する。一部の実施形態では、少なくとも１つの共有結合は、少なくとも１つのジスルフィド結合を含む。一部の実施形態では、第１の結合部分および第２の結合部分は、表Ｍ１から選択される。一部の実施形態では、第１の結合部分および／または第２の結合部分は、その抗原結合性断片およびバリアントを含む、免疫グロブリンの抗原結合ドメインを含む。一部の実施形態では、第１の結合部分および／または第２の結合部分は、その断片およびバリアントを含む、免疫グロブリンのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ１ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ１ＣＨ２ＣＨ３、および／またはＣＬドメインを含む。一部の実施形態では、第１の結合部分および／または第２の結合部分は、Ｎ末端からＣ末端方向に：（１）その抗原結合性断片およびバリアントを含む、免疫グロブリンの抗原結合ドメイン；ならびに（２）その断片およびバリアントを含む、免疫グロブリンのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ１ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ１ＣＨ２ＣＨ３、および／またはＣＬドメインを含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、その抗原結合性断片およびバリアントを含む、免疫グロブリンのＶＨまたはＶＬドメインを含む。一部の実施形態では、第１の結合部分および／または第２の結合部分は抗原に結合しない。一部の実施形態では、第１の結合部分は免疫グロブリンのＶＬおよびＣＬドメインを含み、第２の結合部分は、免疫グロブリンのＶＨおよびＣＨ１ドメインを含む。一部の実施形態では、第１の結合部分は、免疫グロブリンのＶＨおよびＣＨ１ドメインを含み、第２の結合部分は、免疫グロブリンのＶＬおよびＣＬドメインを含む。一部の実施形態では、免疫グロブリンは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＭから選択される免疫グロブリンクラスに由来する。一部の実施形態では、第１の結合部分および第２の結合部分は各々、ロイシンジッパーペプチドを含む。一部の実施形態では、第１および第２のマスキング部分は、そのそれぞれの第１および第２の結合部分を介してヘテロ二量体として互いに結合する。一部の実施形態では、第１および第２のマスキング部分は、そのそれぞれの第１および第２の結合部分を介してホモ二量体として互いに結合し、必要に応じて第１および第２の結合部分の各々は、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む。
一部の実施形態では、切断可能リンカーはプロテアーゼ切断部位を含み、必要に応じて切断可能リンカーは表Ｓ４から選択される。一部の実施形態では、プロテアーゼ切断部位は、メタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、およびアスパラギン酸プロテアーゼのうちの１つまたは複数から選択されるプロテアーゼによって切断可能である。一部の実施形態では、プロテアーゼ切断部位は、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ４、ＭＭＰ５、ＭＭＰ６、ＭＭＰ７、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１２、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１４、ＴＥＶプロテアーゼ、マトリプターゼ、ｕＰＡ、ＦＡＰ、レグマイン、ＰＳＡ、カリクレイン、カテプシンＡ、およびカテプシンＢのうちの１つまたは複数から選択されるプロテアーゼによって切断可能である。一部の実施形態では、第１のリンカーおよび／または第２のリンカーは、約１～５０、約１～４０、約１～３０、約１～２０、約１～１０、約１～５、約１～４、約１～３アミノ酸長であるか、または約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、約５０アミノ酸長である。一部の実施形態では、第１のリンカーは切断可能リンカーであり、第２のリンカーは切断不能リンカーである。一部の実施形態では、第１のリンカーが切断、必要に応じてプロテアーゼによって切断されると、活性化可能プロタンパク質から第１のマスキング部分を放出し、それによってｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで免疫細胞の表面上に存在するＩＬ－２Ｒβ／γｃ鎖に結合するＩＬ－２タンパク質の結合部位を露出する。一部の実施形態では、第１のリンカーは切断不能リンカーであり、第２のリンカーは切断可能リンカーである。一部の実施形態では、第２のリンカーが切断、必要に応じてプロテアーゼによって切断されると、活性化可能プロタンパク質から第２のマスキング部分を放出し、それによってｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで免疫細胞の表面上に存在するＩＬ－２Ｒβ／γｃ鎖に結合するＩＬ－２タンパク質の結合部位を露出する。一部の実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、単球、およびマクロファージのうちの１つまたは複数から選択される。
一部の実施形態では、第１のポリペプチドは、第１のマスキング部分の遊離の末端でタンパク質ドメインＡ、および／またはＩＬ－２タンパク質の遊離の末端でタンパク質ドメインＢをさらに含む。一部の実施形態では、第２のポリペプチドは、第２のマスキング部分の遊離の末端でタンパク質ドメインＣ、および／またはＩＬ－２結合タンパク質の遊離の末端でタンパク質ドメインＤをさらに含む。一部の実施形態では、タンパク質ドメインＡ～Ｄは同じであっても異なってもよく、必要に応じて細胞受容体標的化部分、必要に応じて二重特異性標的化部分、抗原結合ドメイン、必要に応じて二重特異性抗原結合ドメイン、細胞膜受容体細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、Ｆｃドメイン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、Ｆｃ結合ドメイン、ＨＳＡ結合ドメイン、サイトカイン、ケモカイン、および可溶性タンパク質リガンドのうちの１つまたは複数から選択される。
一部の実施形態では、第１のポリペプチドは、ＮからＣ末端方向に、第１のマスキング部分およびＩＬ－２タンパク質を含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチドは、ＮからＣ末端方向に、ＩＬ－２タンパク質および第１のマスキング部分を含む。一部の実施形態では、第２のポリペプチドは、ＮからＣ末端方向に、第２のマスキング部分およびＩＬ－２結合タンパク質を含む。一部の実施形態では、第２のポリペプチドは、ＮからＣ末端方向に、ＩＬ－２結合タンパク質および第２のマスキング部分を含む。
一部の実施形態では、第１のポリペプチドは、配列番号９、１３、１７、２１、２５、２９、３３、３７、４１、４５、４９、５３、５７、６１、６５、６９、７３、７７、８１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、または２４５と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、それからなり、またはそれから本質的になり、および第２のポリペプチドはそれぞれ、配列番号８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、または２４６と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。
特定の実施形態では、例えば、追加のドメイン、例えば免疫グロブリン抗原結合ドメイン、例えば軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を含む活性化可能プロタンパク質の場合（例えば図９Ａ～９Ｂを参照されたい）、第１のポリペプチドは、配列番号２４７、２５０、２５３、２５６、２５９、または２６２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、それからなり、またはそれから本質的になり、第２のポリペプチドはそれぞれ、配列番号２４８、２５１、２５４、２５７、または２６３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、それからなり、またはそれから本質的になり、ならびに第３および／または第４のポリペプチドはそれぞれ、配列番号２４９、２５２、２５５、２５８、２６１、または２６４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。特定の実施形態では、追加のドメインは、目的の抗原、例えば線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合する軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を含む。
同様に、本明細書に記載の活性化可能プロタンパク質をコードする組換え核酸分子も含まれ、例えば第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、同じまたは個別の組換え核酸分子上にコードされる。
同様に、本明細書に記載の組換え核酸分子を含むベクターも含まれ、例えば第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、同じまたは個別の組換え核酸分子またはベクター上にコードされる。同様に、本明細書に記載の組換え核酸分子またはベクターを含む宿主細胞も含まれる。
特定の実施形態は、活性化可能プロタンパク質を産生する方法であって、活性化可能プロタンパク質の発現に適した培養条件下で本明細書に記載の宿主細胞を培養するステップ、および培養物から活性化可能プロタンパク質を単離するステップを含む方法を含む。
ある特定の実施形態は、本明細書に記載の少なくとも１つの活性化可能プロタンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を含む。
一部の実施形態は、対象における疾患を処置する方法、および／または対象における免疫応答を増強する方法であって、本明細書に記載の医薬組成物または少なくとも１つの活性化可能プロタンパク質の治療有効量を対象に投与するステップを含む方法を含む。一部の実施形態では、疾患は、がん、ウイルス感染症、および免疫障害のうちの１つまたは複数から選択される。一部の実施形態では、がんは、原発がんまたは転移がんであり、黒色腫（必要に応じて転移性黒色腫）、腎臓がん（必要に応じて腎細胞癌）、膵臓がん、骨がん、前立腺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、中皮腫、白血病（必要に応じてリンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、または再発した急性骨髄性白血病）、多発性骨髄腫、リンパ腫、ヘパトーマ（肝細胞癌）、肉腫、Ｂ細胞悪性腫瘍、乳がん、卵巣がん、結腸直腸がん、神経膠腫、多形性膠芽腫、髄膜腫、下垂体腺腫、前庭神経鞘腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、原始神経外胚葉性腫瘍（髄芽腫）、膀胱がん、子宮がん、食道がん、脳がん、頭頸部がん、子宮頸がん、精巣がん、甲状腺がん、および胃がんのうちの１つまたは複数から選択される。
一部の実施形態では、投与後、活性化可能プロタンパク質は、細胞または組織、必要に応じてがん細胞またはがん組織におけるプロテアーゼによる切断を通して活性化され、プロテアーゼ切断部位を含むマスキング部分を放出し、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで免疫細胞の表面上に存在するＩＬ－２Ｒβ／γｃ鎖に結合するＩＬ－２タンパク質の結合部位を露出し、それによって活性化タンパク質を生成する。一部の実施形態では、活性化タンパク質は、ＩＬ－２タンパク質を介して、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで免疫細胞の表面上に存在するＩＬ－２Ｒβ／γｃ鎖に結合する。一部の実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、単球、およびマクロファージのうちの１つまたは複数から選択される。一部の実施形態では、活性化タンパク質におけるＩＬ－２タンパク質とＩＬ－２結合タンパク質との間の結合（必要に応じて、ＩＬ－２タンパク質とＩＬ－２Ｒαタンパク質との間のジスルフィド結合）は、Ｔｒｅｇ上に発現されるＩＬ－２Ｒα／β／γｃ鎖に結合するＩＬ－２タンパク質の結合部位を隠し、それによってＴｒｅｇに対する活性化タンパク質の結合を妨害する。
一部の実施形態では、活性化可能プロタンパク質の投与および活性化は、対象における免疫応答を、対照と比較して、約もしくは少なくとも約５％、約もしくは少なくとも約１０％、約もしくは少なくとも約１５％、約もしくは少なくとも約２０％、約もしくは少なくとも約２５％、約もしくは少なくとも約３０％、約もしくは少なくとも約３５％、約もしくは少なくとも約４０％、約もしくは少なくとも約４５％、約もしくは少なくとも約５０％、約もしくは少なくとも約６０％、約もしくは少なくとも約７０％、約もしくは少なくとも約８０％、約もしくは少なくとも約９０％、約もしくは少なくとも約１００％、約もしくは少なくとも約２００％、約もしくは少なくとも約３００％、約もしくは少なくとも約４００％、約もしくは少なくとも約５００％、約もしくは少なくとも約６００％、約もしくは少なくとも約７００％、約もしくは少なくとも約８００％、約もしくは少なくとも約９００％、約もしくは少なくとも約１０００％、約もしくは少なくとも約２０００％、またはそれより多く増加させ、必要に応じて免疫応答は、抗がんまたは抗ウイルス免疫応答である。一部の実施形態では、活性化可能プロタンパク質の投与および活性化は、対象における細胞殺滅を、対照と比較して、約もしくは少なくとも約５％、約もしくは少なくとも約１０％、約もしくは少なくとも約１５％、約もしくは少なくとも約２０％、約もしくは少なくとも約２５％、約もしくは少なくとも約３０％、約もしくは少なくとも約３５％、約もしくは少なくとも約４０％、約もしくは少なくとも約４５％、約もしくは少なくとも約５０％、約もしくは少なくとも約６０％、約もしくは少なくとも約７０％、約もしくは少なくとも約８０％、約もしくは少なくとも約９０％、約もしくは少なくとも約１００％、約もしくは少なくとも約２００％、約もしくは少なくとも約３００％、約もしくは少なくとも約４００％、約もしくは少なくとも約５００％、約もしくは少なくとも約６００％、約もしくは少なくとも約７００％、約もしくは少なくとも約８００％、約もしくは少なくとも約９００％、約もしくは少なくとも約１０００％、約もしくは少なくとも約２０００％、またはそれより多く増加させ、必要に応じて細胞殺滅は、がん細胞の殺滅またはウイルス感染細胞の殺滅である。
一部の実施形態では、ウイルス感染症は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｅ型肝炎、カリシウイルス関連下痢、ロタウイルス性下痢、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ型肺炎および侵襲性疾患、インフルエンザ、麻疹、ムンプス、風疹、パラインフルエンザ関連肺炎、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）肺炎、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、ヒトパピローマウイルス、単純ヘルペス２型性器潰瘍、デング熱、日本脳炎、ダニ媒介性脳炎、ウエストナイルイルス関連疾患、黄熱病、エプスタインバーウイルス、ラッサ熱、クリミアコンゴ出血熱、エボラ出血熱、マールブルグ出血熱、狂犬病、リフトバレー熱、天然痘、上気道および下気道感染症、ならびに灰白髄炎のうちの１つまたは複数から選択され、必要に応じて対象はＨＩＶ陽性である。
一部の実施形態では、免疫障害は、Ｉ型糖尿病、血管炎、および免疫不全のうちの１つまたは複数から選択される。
一部の実施形態では、医薬組成物は、非経口投与によって対象に投与される。一部の実施形態では、非経口投与は静脈内投与である。
ある特定の実施形態は、対象における疾患を処置するための、および／または対象における免疫応答を増強するための医薬の調製における本明細書に記載される医薬組成物の使用を含む。一部の実施形態は、対象における疾患の処置、および／または対象における免疫応答の増強に使用するための本明細書に記載の医薬組成物を含む。
図１Ａは、ヒトインターロイキン２（ＩＬ－２）およびヒトインターロイキン２受容体アルファ鎖（ＩＬ－２Ｒα）のタンパク質トポロジーを示し、図１Ｂは、その受容体ＩＬ－２Ｒα（ＣＤ２５）、ＩＬ－２Ｒβ（ＣＤ１２２）、および共通のガンマ鎖（ＣＤ１３２）（ＰＤＢ：２ＥＲＪ）と複合体を形成したＩＬ－２の４次構造を示す。 同上。 図２Ａは、ＩＬ－２ＲαのＮ末端とマスキング部分のＣ末端との融合、およびＩＬ－２のＮ末端とマスキング部分のＣ末端との融合を例証する。そのシグナル伝達ＩＬ－２Ｒβ／γｃ受容体との融合タンパク質におけるＩＬ－２の相互作用部位を、ＩＬ－２Ｒβ／γｃ相互作用界面において示す。図２Ｂは、図２Ａに示す融合体構造の模式図を例証する。この融合タンパク質におけるＩＬ－２は、マスキング部分に起因する立体障害のためにＩＬ－２Ｒβ／γｃ受容体に結合することができず、それを通してシグナルを伝達することができない。図２Ｃは、図２Ａおよび２Ｂに記載のタンパク質のタンパク質配列モチーフおよび立体配置の図を例証する。図２Ｄは、第１のポリペプチド上のＩＬ－２のＣ末端でのタンパク質ドメイン、第１のマスキング部分のＮ末端でのタンパク質ドメイン、第２のポリペプチド上のＩＬ－２結合タンパク質（例えば、ＩＬ－２Ｒα）のＣ末端でのタンパク質ドメイン、および第２のマスキング部分のＮ末端でのタンパク質ドメインとのヘテロ二量体融合体構造の図を例証する。図２Ｅは、より強固なＩＬ－２／ＩＬ－２Ｒα複合体を形成する、ＩＬ－２（またはバリアント）とＩＬ－２Ｒα（またはバリアント）との間のジスルフィド結合を示す。図２Ｆは、ＩＬ－２Ｒα（またはバリアント）のＮ末端とマスキング部分のＣ末端との融合体、およびＩＬ－２（またはバリアント）のＮ末端とマスキング部分のＣ末端との融合体を例証する。 同上。 同上。 図２Ｇは、融合ポリペプチドにおける基質リンカー配列のプロテアーゼによる切断を通しての、マスキング部分を有する活性化可能プロタンパク質（またはプロドラッグ）の活性化の模式図を示す。リンカー１のプロテアーゼ基質配列の例を示す。リンカーにおけるプロテアーゼ基質配列が消化されると、マスキング部分によって課された立体障害を解消し、それによって融合体におけるＩＬ－２がＩＬ２Ｒβ／γｃ受容体に結合し、それを通してシグナルを伝達することができる。 図２Ｈは、融合ポリペプチドにおける基質リンカー配列のプロテアーゼによる切断を通しての、マスキング部分およびＩＬ－２（またはバリアント）とＩＬ－２Ｒα（またはバリアント）との間のジスルフィド結合を有する活性化可能プロタンパク質（またはプロドラッグ）の活性化の模式図を示す。リンカー１のプロテアーゼ基質配列の例を示す。リンカーにおけるプロテアーゼ基質配列が消化されると、マスキング部分によって課された立体障害を解消し、それによって融合体におけるＩＬ－２がＩＬ２Ｒβ／γｃ受容体に結合し、それを通してシグナルを伝達することができる。 図２Ｉは、融合ポリペプチドにおける基質リンカー配列のプロテアーゼによる切断を通しての、マスキング部分を有する活性化可能プロタンパク質（またはプロドラッグ）の活性化の模式図を示す。リンカー２のプロテアーゼ基質配列の例を示す。リンカーにおけるプロテアーゼ基質配列が消化されると、マスキング部分によって課された立体障害を解消し、それによって融合体におけるＩＬ－２がＩＬ２Ｒβ／γｃ受容体に結合し、それを通してシグナルを伝達することができる。 図２Ｊは、融合ポリペプチドにおける基質リンカー配列のプロテアーゼによる切断を通しての、マスキング部分およびＩＬ－２（またはバリアント）とＩＬ－２Ｒα（またはバリアント）との間のジスルフィド結合を有する活性化可能プロタンパク質（またはプロドラッグ）の活性化の模式図を示す。リンカー２のプロテアーゼ基質配列の例を示す。リンカーにおけるプロテアーゼ基質配列が消化されると、マスキング部分によって課された立体障害を解消し、それによって融合体におけるＩＬ－２がＩＬ２Ｒβ／γｃ受容体に結合し、それを通してシグナルを伝達することができる。 図３Ａ～３Ｂは、例示的な活性化可能プロタンパク質におけるマスキング部分としてのＶＨ－ＣＨ１およびＶＬ－ＣＬの例を示す。３Ａは、ＶＨ－ＣＨ１のＣ末端におけるＩＬ－２Ｒαの融合体およびＶＬ－ＣＬのＣ末端におけるＩＬ－２の融合体を示す。３Ｂは、ＶＬ－ＣＬのＣ末端におけるＩＬ－２Ｒαの融合体およびＶＨ－ＣＨ１のＣ末端におけるＩＬ－２の融合体を示す。図３Ｃは、図３Ａに示す活性化可能プロタンパク質の活性化の模式図を示し、図３Ｄは、図３Ｂに示す活性化可能プロタンパク質融合タンパク質の活性化の模式図を示す。 同上。 同上。 図４Ａ～４Ｃは、精製されたタンパク質および切断されたタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を示す。図４Ａは、非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示し、図４Ｂは、還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す。図４Ｃは、ＩＬ－２融合タンパク質のプロテアーゼ（ＴＥＶ）による切断を例証する。「Ｍ」は、タンパク質標準マーカーを表し、「１」はＴＥＶによる切断前のタンパク質を表し、「２」は、ＴＥＶによる切断後のタンパク質を表す。 図５Ａ～５Ｅは、精製タンパク質の代表的なＨＰＬＣ分析結果を例証する。 図６Ａ～６Ｒは、比色分析アッセイ（Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８（ＣＣＫ－８））によって決定したＭ－０７ｅ増殖に及ぼすＩＬ－２融合タンパク質の活性を例証する。 同上。 同上。 図７Ａ～７Ｂは、精製タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を例証する。図７Ｃは、ＩＬ－２融合タンパク質のプロテアーゼ（ＴＥＶ）による切断を例証する。数字の上の「Ｍ」は、タンパク質標準マーカーを表す。数字の上の「１」はＴＥＶによる切断前のタンパク質を表し、「２」は、ＴＥＶによる切断後のタンパク質を表す。図７Ｄは、精製タンパク質のＨＰＬＣ分析結果を例証する。 図８Ａは、比色分析アッセイ（Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８（ＣＣＫ－８））によって決定したＭ－０７ｅ増殖に及ぼす切断されたおよび切断されていないＰ１６１２１６１３の活性を例証する。図８Ｂは、比色アッセイ（Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８（ＣＣＫ－８））によって決定したＭ－０７ｅ増殖に及ぼす切断されたおよび切断されていないＰ１６１２１６１３のＰ１３５９１３６６との活性の比較を示す。 図９Ａ～９Ｂは、複数の鎖を含むプロタンパク質を含む、本明細書に記載の活性化可能プロタンパク質の様々な構造を例証する（図２Ｄも同様に参照されたい）。 同上。 図１０Ａ～１０Ｂは、精製タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を示す。図１０Ａは、非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示し、図１０Ｂは、還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す。「Ｍ」は、タンパク質標準マーカーを表す。 同上。 図１０Ｃ～１０Ｄは、ＩＬ－２融合タンパク質のプロテアーゼによる切断を示す。「Ｍ」は、タンパク質標準マーカーを表す。図１０Ｃでは、「１」は、ＴＥＶによる切断前のタンパク質を表し、「２」はＴＥＶによる切断後のタンパク質を表す。図１０Ｄでは、「１」は、プロテアーゼによる切断前のタンパク質を表し、「２」はｕＰＡによる切断後のタンパク質を表し、「３」は、ＭＭＰ－２による切断後のタンパク質を表し、「４」はマトリプターゼによる切断後のタンパク質を表し、「５」は、レグマインによる切断後のタンパク質を表す。 同上。 図１１Ａ～１１Ｐは、精製タンパク質の代表的なＨＰＬＣ分析結果を表す。 同上。 同上。 図１２Ａ～１２Ｐは、比色分析アッセイ（Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８（ＣＣＫ－８））によって決定したＭ－０７ｅ増殖に及ぼすＩＬ－２融合タンパク質の活性を例証する。 同上。 同上。
特に定義していない限り、本明細書で使用する全ての科学技術用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等に類似または同等の任意の方法、材料、組成物、試薬、細胞を、本開示の主題の実践または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料を記載する。本明細書で引用される特許および特許出願を含むがこれらに限定されない全ての刊行物および参考文献は、各々の個々の刊行物または参考文献が、完全に記載されているとして具体的および個々に参照により本明細書に組み込まれることが示されているかのように、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本出願が優先権を主張する任意の特許出願もまた、刊行物および参考文献に関する上記のようにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養および形質転換に関して、標準的な技術（例えば、電気穿孔、リポフェクション）が使用され得る。酵素反応および精製技術は、製造元の仕様書に従って、または当技術分野で一般的に達成されるように、または本明細書に記載されるように実施され得る。これらおよび関連する技術および手順は一般的に、当技術分野で周知の従来の方法に従って、ならびに本明細書を通して引用および考察される様々な一般的なおよびより具体的な参考文献に記載されるように実施され得る。特定の定義が提供されていない限り、本明細書に記載の分子生物学、分析化学、合成有機化学、ならびに医薬品化学および薬化学に関連して利用される命名法ならびにそれらの実験手順および技術は、当技術分野で周知であり、一般的に使用される。組換え技術、分子生物学、微生物学、化学合成、化学分析、薬学的調製、製剤、および送達、ならびに患者の処置に関して、標準的な技術が使用され得る。
本開示の目的に関して、以下の用語を以下に定義する。
冠詞「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、本明細書において、冠詞の文法上の目的語の１つまたは１つより多く（すなわち少なくとも１つ）を指す。例として、「１つのエレメント（ａ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、「１つのエレメント（ｏｎｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）」、「１つまたは複数のエレメント」、および／または「少なくとも１つのエレメント」を含む。
「約」は、参照の量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さに対して、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％ほど変動する量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さを意味する。
用語「活性化可能プロタンパク質」、「活性化可能プロドラッグ」、「プロドラッグ」、または「プロタンパク質」は、本明細書において互換的に使用され、本明細書に記載の少なくともマスキング部分および活性ドメイン、またはその誘導体／バリアントを含む活性化可能プロタンパク質を指す。一実施形態では、プロタンパク質はまた、１つまたは複数のタンパク質ドメインも含み得る。
用語「抗原」は、選択的結合剤、例えば抗体が結合することが可能な、およびさらにその抗原のエピトープに結合することが可能な抗体を産生するために動物において使用することが可能な分子または分子の部分を指す。抗原は、１つまたは複数のエピトープを有し得る。本明細書で使用される場合、用語「抗原」は、適切な条件下で、物質に対する免疫応答を誘導することが可能な、および免疫応答の産物と反応することが可能な物質を含む。より広義には、用語「抗原」は、物質が免疫原性であるかどうかにかかわらず、抗体が結合する、または抗体が望まれる任意の物質を含む。そのような抗原の場合、抗体は、任意の免疫応答とは無関係に組換え方法によって同定することができる。
「アンタゴニスト」は、別の作用剤または分子の生理的作用を干渉するまたはそうでなければ低減させる生物構造体または化学作用剤を指す。一部の例では、アンタゴニストは、他の作用剤または分子に特異的に結合する。完全なおよび部分的アンタゴニストが含まれる。
「アゴニスト」は、別の作用剤または分子の生理的作用を増加または増強させる生物構造体または化学作用剤を指す。一部の例では、アゴニストは、他の作用剤または分子に特異的に結合する。完全なおよび部分的アゴニストが含まれる。
本明細書で使用される場合、用語「アミノ酸」は、天然に存在するおよび天然に存在しないアミノ酸の両方、ならびにアミノ酸アナログおよび模倣体を意味すると意図される。天然に存在するアミノ酸は、タンパク質生合成の際に利用される２０個の（Ｌ）－アミノ酸、ならびに他のアミノ酸、例えば４－ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリシン、デスモシン、イソデスモシン、ホモシステイン、シトルリンおよびオルニチンを含む。天然に存在しないアミノ酸は、例えば（Ｄ）－アミノ酸、ノルロイシン、ノルバリン、ｐ－フルオロフェニルアラニン、エチオニン等を含み、これらは当業者に公知である。アミノ酸アナログは、天然に存在するおよび天然に存在しないアミノ酸の改変型を含む。そのような改変は、例えばアミノ酸上の化学基および化学部分の置換もしくは置き換え、またはアミノ酸の誘導体化を含み得る。アミノ酸模倣体は、例えば参照アミノ酸の電荷および電荷間隔特徴などの機能的に類似の特性を示す有機構造を含む。例えば、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）を模倣する有機構造は、類似の分子間隔で位置し、天然に存在するＡｒｇアミノ酸の側鎖のｅ－アミノ基と同じ程度の可動性を有する正電荷部分を有することになる。模倣体はまた、アミノ酸またはアミノ酸官能基の最適な間隔および電荷相互作用を維持するように拘束された構造を含む。当業者は、どの構造が機能的に同等なアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣体を構成するかを承知しているかまたは決定することができる。
本明細書で使用される場合、疾患または有害反応を発症する「リスクがある」対象は、検出可能な疾患または疾患の症状を有しても有しなくてもよく、本明細書に記載の処置方法の前に、検出可能な疾患または疾患の症状を示していても示していなくてもよい。「リスクがある」とは、対象が、本明細書で記載されるようにおよび当技術分野で公知であるように、疾患の発生と相関する測定可能なパラメーターである１つまたは複数のリスク因子を有することを示す。これらのリスク因子の１つまたは複数を有する対象は、これらのリスク因子の１つまたは複数を有しない対象よりも、疾患または有害反応を発症する確率が高い。
「生物適合性」は、細胞または対象の生物機能にとって一般的に有害ではなく、アレルギー性状態および疾患状態を含むいかなる程度の許容されない毒性ももたらさない材料または化合物を指す。
用語「結合する」は、例えば塩架橋および水架橋などの相互作用を含む、共有結合、静電結合、疎水性結合、ならびにイオン結合および／または水素結合相互作用による、２つの分子間の直接会合を指す。
「コード配列」は、遺伝子のポリペプチド産物のコードに寄与する任意の核酸配列を意味する。これに対し、用語「非コード配列」は、遺伝子のポリペプチド産物のコードに直接寄与しない任意の核酸配列を指す。
本開示を通して、文脈がそれ以外であることを必要としていない限り、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、記載のステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群を含むが、他のいかなるステップもしくは要素も、ステップもしくは要素の群も除外しないことを意味すると理解される。
「からなる」は、語句「からなる」の後に続くいかなるものも含み、これらに限定されることを意味する。このため、語句「からなる」は、列挙された要素が必要または必須であること、および他の要素は存在してはならないことを示す。「から本質的になる」は、この語句の後に列挙される任意の要素を含み、列挙された要素の開示に明記されていない活性または作用を妨害しないまたはそれらに寄与しない他の要素に限定される任意の要素を含むことを意味する。このように、語句「から本質的になる」は、列挙された要素が必要または必須であるが、他の要素は、必要に応じて存在し、列挙された要素の活性または作用に実質的に影響を及ぼすか否かに応じて存在してもしなくてもよいことを示す。
用語「エンドトキシンフリー」、または「実質的にエンドトキシンフリー」は、一般的に多くても微量の（例えば、対象に対して臨床的に有害な生理的効果を有しない量）のエンドトキシンを含有する、好ましくは検出不能量のエンドトキシンを含有する組成物、溶媒、および／または容器に関する。エンドトキシンは、細菌、典型的にグラム陰性菌などのある特定の微生物に関連する毒素であるが、エンドトキシンは、グラム陽性菌、例えばＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにも見出され得る。最も広く認められるエンドトキシンは、様々なグラム陰性菌の外膜に見出され、これらの細菌が疾患を引き起こす能力において中心的な病原性の特色を表すリポ多糖（ＬＰＳ）またはリポオリゴ糖（ＬＯＳ）である。ヒトにおける少量のエンドトキシンは、他の有害な生理作用の中でも、発熱、血圧の低下、ならびに炎症および凝固の活性化を生じる。
したがって、医薬品生産では、非常に少量であってもヒトにおいて有害な作用を引き起こし得ることから、薬物製品および／または薬物容器からほとんどまたは全ての微量のエンドトキシンを除去することがしばしば望ましい。ほとんどのエンドトキシンを分解するためには典型的に３００℃を超える温度が必要であることから、パイロジェン除去オーブンがこの目的のために使用され得る。例えば、シリンジまたはバイアルなどの一次包装材料に基づき、ガラス温度２５０℃と保持時間３０分の組合せはしばしば、エンドトキシンレベルの３ｌｏｇ低減を達成するために十分である。例えば本明細書で記載され、当技術分野で公知であるクロマトグラフィーおよび濾過方法を含む、エンドトキシンを除去する他の方法が企図される。
エンドトキシンは、当技術分野で公知の日常的な技術を使用して検出することができる。例えば、カブトガニの血液を利用するカブトガニ血球抽出成分（Ｌｉｍｕｌｕｓ Ａｍｏｅｂｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ）アッセイは、エンドトキシンの存在を検出するための非常に感度の高いアッセイである。この試験では、非常に低レベルのＬＰＳが、この反応を増幅する強力な酵素カスケードによりカブトガニ抽出成分の検出可能な凝固を引き起こし得る。エンドトキシンはまた、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によっても定量することができる。実質的にエンドトキシンフリーであるためには、エンドトキシンレベルは、活性化合物１ｍｇあたり約０．００１ＥＵ未満、約０．００５ＥＵ未満、約０．０１ＥＵ未満、約０．０２ＥＵ未満、約０．０３ＥＵ未満、約０．０４ＥＵ未満、約０．０５ＥＵ未満、約０．０６ＥＵ未満、約０．０８ＥＵ未満、約０．０９ＥＵ未満、約０．１ＥＵ未満、約０．５ＥＵ未満、約１．０ＥＵ未満、約１．５ＥＵ未満、約２ＥＵ未満、約２．５ＥＵ未満、約３ＥＵ未満、約４ＥＵ未満、約５ＥＵ未満、約６ＥＵ未満、約７ＥＵ未満、約８ＥＵ未満、約９ＥＵ未満、または約１０ＥＵ未満であり得る。典型的には、リポ多糖（ＬＰＳ）１ｎｇは、約１～１０ＥＵに相当する。
用語「半最大有効濃度」または「ＥＣ５０」は、ベースラインとある指定された曝露時間後の最大値との間の半分の応答を誘導する、本明細書に記載の作用剤（例えば、活性化可能プロタンパク質）の濃度を指す；したがって段階的用量反応曲線のＥＣ５０は、その最大効果の５０％が観察される化合物の濃度を表す。ＥＣ５０はまた、ｉｎ ｖｉｖｏで最大効果の５０％を得るために必要な血漿中濃度も表す。同様に、「ＥＣ９０」は、その最大効果の９０％が観察される作用剤または組成物の濃度を指す。「ＥＣ９０」は、「ＥＣ５０」およびヒル勾配から計算することができ、または当技術分野における日常的な知識を使用してデータから直接決定することができる。一部の実施形態では、作用剤（例えば、活性化可能プロタンパク質）のＥＣ５０は、約０．０１ｎＭ未満、約０．０５ｎＭ未満、約０．１ｎＭ未満、約０．２ｎＭ未満、約０．３ｎＭ未満、約０．４ｎＭ未満、約０．５ｎＭ未満、約０．６ｎＭ未満、約０．７ｎＭ未満、約０．８ｎＭ未満、約０．９ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、約３ｎＭ未満、約４ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約６ｎＭ未満、約７ｎＭ未満、約８ｎＭ未満、約９ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約１１ｎＭ未満、約１２ｎＭ未満、約１３ｎＭ未満、約１４ｎＭ未満、約１５ｎＭ未満、約１６ｎＭ未満、約１７ｎＭ未満、約１８ｎＭ未満、約１９ｎＭ未満、約２０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、約３０ｎＭ未満、約４０ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約６０ｎＭ未満、約７０ｎＭ未満、約８０ｎＭ未満、約９０ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、約２００ｎＭ未満、または約５００ｎＭ未満である。一部の実施形態では、作用剤は、約１ｎＭまたはそれ未満のＥＣ５０値を有する。
「免疫応答」は、細胞および液性、自然および適応免疫系からの応答を含む、免疫系を起源とする任意の免疫学的応答を意味する。例示的な細胞性免疫細胞は、例えばリンパ球、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、好中球、好酸球、樹状細胞、肥満細胞、単球、およびその全てのサブセットを含む。細胞性応答としては例えば、エフェクター機能、サイトカイン放出、食作用、エフェロサイトーシス、トランスロケーション、トラフィッキング、増殖、分化、活性化、抑制、細胞－細胞相互作用、アポトーシス等が挙げられる。液性応答としては、例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ応答およびその対応するエフェクター機能が挙げられる。
作用剤、例えば活性化可能プロタンパク質の「半減期」は、生物の血清もしくは組織への投与時のそのような活性と比較して、または他の任意の規定の時点と比較して、作用剤がその薬理活性、生理活性、または他の活性の半分を失うのに要する時間を指し得る。「半減期」はまた、作用剤の量または濃度が、生物の血清もしくは組織への投与時のそのような量もしくは濃度と比較して、または他の任意の規定の時点と比較して、生物の血清または組織に投与された開始量の半分になるまでに要する時間を指し得る。半減期は、血清中および／または任意の１つまたは複数の選択された組織で測定することができる。
用語「モジュレートする」および「変更する」は、典型的に、対照と比較して、統計学的に有意なまたは生理的に有意な量または程度で「増加させること」、「増強すること」、または「刺激すること」、ならびに「減少させること」または「低減させること」を含む。「増加した」、「刺激された」、または「増強された」量は典型的には、「統計学的に有意な」量であり、組成物なし（例えば、作用剤の非存在下）でまたは対照組成物によって産生された量の１．１倍、１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、またはそれより多く（例えば、５００倍、１０００倍）（その間の全ての整数および範囲、例えば１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍等を含む）の増加を含み得る。「減少した」または「低減された」量は、典型的に「統計学的に有意な」量であり、組成物なし（例えば、作用剤の非存在下）でまたは対照組成物によって産生された量の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の減少（その間の全ての整数および範囲を含む）を含み得る。比較および「統計学的に有意な」量の例を本明細書に記載する。
用語「ポリペプチド」、「タンパク質」、および「ペプチド」は互換的に使用され、任意の特定の長さに限定されないアミノ酸のポリマーを意味する。用語「酵素」は、ポリペプチドまたはタンパク質の触媒を含む。これらの用語は、ミリストイル化、硫酸化、グリコシル化、リン酸化、およびシグナル配列の付加または欠失などの改変を含む。用語「ポリペプチド」または「タンパク質」は、アミノ酸の１つまたは複数の鎖を意味し、各々の鎖はペプチド結合によって共有結合によって連結したアミノ酸を含み、前記ポリペプチドまたはタンパク質は、非共有結合および／またはペプチド結合による共有結合によって互いに連結された複数の鎖を含み得、天然のタンパク質、すなわち天然に存在するおよび具体的には非組み換え細胞によって産生されたタンパク質、または遺伝子操作されたもしくは組換え細胞によって産生されたタンパク質、の配列を有し、天然のタンパク質のアミノ酸配列を有する分子、または天然の配列の１つもしくは複数のアミノ酸の欠失、付加、および／もしくは置換を有する分子を含み得る。ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、細胞内にそうでなければ見出されない異種ポリヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列の組合せで典型的に構成される１つまたは複数の組換えＤＮＡ分子を含む組換え細胞によって産生された「組換え」ポリペプチドである。
用語「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ｃＤＮＡ、およびＤＮＡを含む。用語は典型的に、リボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドのいずれか、またはいずれかのタイプのヌクレオチドの改変型の少なくとも１０塩基の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。用語は、一本鎖および二本鎖形態のＤＮＡを含む。用語「単離されたＤＮＡ」および「単離されたポリヌクレオチド」、および「単離された核酸」は、特定の種の総ゲノムＤＮＡを含まずに単離されている分子を指す。したがって、ポリペプチドをコードする単離されたＤＮＡセグメントは、１つまたは複数のコード配列を含有するが、なおもＤＮＡセグメントが得られる種の総ゲノムＤＮＡから実質的に単離されているかまたは精製されているＤＮＡセグメントを指す。同様に、ポリペプチドをコードしない非コードポリヌクレオチド（例えば、プライマー、プローブ、オリゴヌクレオチド）も含まれる。同様に、例えば発現ベクター、ウイルスベクター、プラスミド、コスミド、ファージミド、ファージ、ウイルス等を含む組換えベクターも含まれる。
追加のコードまたは非コード配列が、本明細書に記載されるポリヌクレオチド内に存在してもよいが必ずしも存在する必要はなく、ポリヌクレオチドは、他の分子および／または支持材料に連結されてもよいが、必ずしも連結される必要はない。したがって、ポリヌクレオチドまたは発現可能なポリヌクレオチドを、コード配列そのもの長さによらず、他の配列、例えば発現制御配列と組み合わせてもよい。
本明細書で言及される用語「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質は、対象のタンパク質が（１）典型的に天然に見出される少なくともいくつかの他のタンパク質を含まない、（２）同じ起源からの、例えば同じ種からの他のタンパク質を本質的に含まない、（３）異なる種からの細胞によって発現される、（４）天然で会合しているポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、もしくは他の材料の少なくとも約５０％から分離されている、（５）「単離されたタンパク質」が天然で会合しているタンパク質の部分に会合していない（共有結合または非共有結合による相互作用によって）、（６）天然で会合していないポリペプチドに作動可能に会合している（共有結合または非共有結合による相互作用によって）、または（７）天然に存在しないことを意味する。そのような単離されたタンパク質は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、もしくは他のＲＮＡによってコードされ得るか、または（of）合成起源のタンパク質であり得るか、あるいはその任意の組合せであり得る。ある特定の実施形態では、単離されたタンパク質は、その天然の環境で見出され、その使用（治療的、診断的、予防的、研究またはそれ以外）を妨害するタンパク質もしくはポリペプチドまたは他の夾雑物を実質的に含まない。
ある特定の実施形態では、組成物中の任意の所定の作用剤（例えば、活性化可能プロタンパク質）の「純度」は、定義され得る。例えば、ある特定の組成物は、例えば、決して限定ではなく、生化学および分析化学において化合物を分離、同定、および定量するためにしばしば使用される周知の形態のカラムクロマトグラフィーである高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって測定した場合に、その間の全ての小数および範囲を含む、タンパク質に基づいてまたは重量－重量に基づいて、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％純粋であるポリペプチド作用剤などの作用剤を含み得る。
用語「参照配列」は、一般的にそれに対して別の配列が比較されている核酸コード配列またはアミノ酸配列を指す。名称によって記載される配列、ならびに表および配列表に記載の配列を含む、本明細書に記載の全てのポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列が参照配列として含まれる。
ある特定の実施形態は、本明細書に記載のタンパク質／ポリペプチド、およびそれらをコードするポリヌクレオチドの生物活性「バリアント」および「断片」を含む。「バリアント」は、参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチド（例えば、表および配列表を参照されたい）と比較して、１つまたは複数の置換、付加、欠失、および／または挿入を含有する。バリアントポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、本明細書に記載の参照配列と少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、またはそれより高い配列同一性または類似性または相同性を有するアミノ酸またはヌクレオチド配列を含み、その参照配列の活性を実質的に保持する。同様に、参照配列からなる配列、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、もしくはそれより多くのアミノ酸もしくはヌクレオチドの付加、欠失、挿入、もしくは置換によって参照配列とは異なり、その参照配列の少なくとも１つの活性を実質的に保持する配列も含まれる。ある特定の実施形態では、付加または欠失は、Ｃ末端および／またはＮ末端の付加および／または欠失を含む。
用語「配列同一性」、または例えば「５０％同一である配列」を含むことは、本明細書で使用される場合、比較ウィンドウにわたってヌクレオチド毎に基づいてまたはアミノ酸毎に基づいて配列が同一である程度を指す。このように、「配列同一性のパーセンテージ」は、２つの最適に整列させた配列を比較ウィンドウにわたって比較するステップ、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）、または同一のアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＣｙｓおよびＭｅｔ）が両方の配列に生じる位置の数を決定してマッチした位置の数を得るステップ、マッチした位置の数を比較ウィンドウにおける位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）で除算するステップ、およびその結果に１００を乗算して配列同一性のパーセンテージを得るステップによって計算され得る。比較ウィンドウを整列させるための配列の最適なアライメントは、コンピューターによるアルゴリズムの実行（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓ．， ＵＳＡ）によって、または検分、および選択された様々な方法のいずれかによって生成された最善のアライメント（すなわち、比較ウィンドウに対して最高のパーセンテージ相同性をもたらす）によって行われ得る。例えば、Altschul et al., Nucl. Acids Res. 25:3389, 1997に開示されるＢＬＡＳＴファミリープログラムも参照してもよい。
用語「溶解度」は、本明細書に提供される作用剤（例えば、活性化可能プロタンパク質）が液体溶媒に溶解して均一な溶液を形成する特性を指す。溶解度は、典型的には溶媒の単位体積あたりの溶質の質量（ｇ溶質／ｋｇ溶媒、ｇ／ｄＬ（１００ｍＬ）、ｍｇ／ｍｌ等）、容量モル濃度、重量モル濃度、モル分率、または他の類似の濃度の記載のいずれかによる濃度として表記される。溶媒の量あたりに溶解することができる溶質の最大平衡量が、温度、気圧、ｐＨ、および溶媒の性質を含む指定された条件下でのその溶媒におけるその溶質の溶解度である。ある特定の実施形態では、溶解度は、生理的ｐＨ、または他のｐＨ、例えばｐＨ５．０、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０、ｐＨ７．４、ｐＨ７．６、ｐＨ７．８、またはｐＨ８．０（例えば、約ｐＨ５～８）で測定される。ある特定の実施形態では、溶解度は、水またはＰＢＳもしくはＮａＣｌ（ＮａＰＯ４を含むまたは含まない）などの生理的緩衝液において測定される。具体的な実施形態では、溶解度は、比較的低いｐＨ（例えば、ｐＨ６．０）および比較的高い塩（例えば、５００ｍＭ ＮａＣｌおよび１０ｍＭ ＮａＰＯ４）で測定される。ある特定の実施形態では、溶解度は、血液または血清などの生物学的流体（溶媒）中で測定される。ある特定の実施形態では、温度は、ほぼ室温（例えば、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃）またはほぼ体温（３７℃）であり得る。ある特定の実施形態では、作用剤は、室温または３７℃で少なくとも約０．１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約０．２ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約０．３ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約０．４ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約０．５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約０．６ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約０．７ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約０．８ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約０．９ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約２ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約３ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約４ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約６ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約７ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約８ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約９ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１２ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１３ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１４ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１６ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１７ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１８ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１９ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約２０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約２５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約４０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約６０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約７０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約８０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約９０ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも約１００ｍｇ／ｍｌの溶解度を有する。
「対象」または「それを必要とする対象」または「患者」または「それを必要とする患者」は、ヒト対象などの哺乳動物対象を含む。
「実質的に」、または「本質的に」は、ほぼ全体的にまたは完全に、例えばある所定の量の９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより多いことを意味する。
「統計学的に有意な」とは、結果が偶然に起こっている可能性が低かったことを意味する。統計学的有意性は、当技術分野で公知の任意の方法によって決定することができる。一般的に使用される有意性の測定は、ｐ値を含み、これは帰無仮設が真である場合に、観察された事象が起こる頻度または確率である。得られたｐ値が有意レベルより小さい場合、帰無仮説は棄却される。単純な例では、有意レベルは、ｐ値が０．０５またはそれ未満として定義される。
「治療応答」は、１つまたは複数の治療剤の投与に基づく症状の改善（持続的であるか否かによらず）を指す。
本明細書で使用される場合、用語「治療有効量」、「治療用量」、「予防的有効量」、または「診断的有効量」は、投与後に所望の生物応答を誘発するために必要な作用剤（例えば、活性化可能プロタンパク質、活性化タンパク質）の量である。
本明細書で使用される場合、対象（例えば、哺乳動物、例えばヒト）または細胞の「処置」は、個体または細胞の自然の経過を変更する試みで使用される任意のタイプの介入である。処置としては、医薬組成物の投与が挙げられるがこれらに限定されず、予防的に、または病的事象の開始後もしくは病因物質との接触後に実施され得る。同様に「予防的」処置も含まれ、これは処置される疾患もしくは状態の進行速度を低減させること、その疾患もしく状態の発症を遅らせること、またはその発症の重症度を低減させることに向けられ得る。「処置」または「予防」は、疾患もしくは状態、またはその関連する症状の完全な根絶、治癒、または防止を必ずしも示す必要はない。
用語「野生型」は、集団において最も頻繁に観察される遺伝子または遺伝子産物（例えば、ポリペプチド）を指し、このため遺伝子の「通常」または「野生型」形態が任意に設計される。
本明細書における各々の実施形態は、それ以外であることを明白に述べていない限り、あらゆる他の実施形態に適用される。
活性化可能プロタンパク質
本開示の実施形態は、プロタンパク質形態では比較的不活性のままであるが、適切な環境と接触すると活性化することができるＩＬ－２タンパク質を含む活性化可能プロタンパク質またはプロドラッグに関する。本明細書に記載の活性化可能プロタンパク質は、非共有結合および／またはある特定の共有結合、例えばジスルフィド結合を介して互いに結合するが、ペプチド結合またはアミド結合を介して結合するわけではない、少なくとも２つの個別のまたは別個のポリペプチド鎖を含む。一般的に、少なくとも１つのポリペプチド鎖がＩＬ－２タンパク質を含み、少なくとも１つのポリペプチド鎖がＩＬ－２結合タンパク質、例えばＩＬ－Ｒαタンパク質を含む。各々のポリペプチド鎖はまた、マスキング部分も含み、これは他の鎖のマスキング部分に結合して、ＩＬ－２タンパク質が細胞上のそのコグネート受容体（複数可）と相互作用するまたは結合するのを立体的に妨害する。典型的には、マスキング部分の少なくとも１つは切断可能リンカーを含み、これは標的組織において切断されると、活性化可能プロタンパク質複合体からそのマスキング部分を放出し（およびその立体障害を解消し）、ＩＬ－２タンパク質の少なくとも１つの活性部位または結合部位を露出することによってＩＬ－２活性を回復する。それによって、活性化されたタンパク質のＩＬ－２部分は、ある特定のそのコグネート受容体、例えば免疫細胞上のＩＬ－２Ｒβ／γｃ受容体鎖と相互作用または結合することができ、それによって下流の免疫細胞シグナル伝達経路に影響を及ぼすことができる。
本明細書に記載の活性化可能プロタンパク質は、免疫系の過剰活性化を引き起こす高い初回の血清中Ｃｍａｘ、ＩＬ－２の分子サイズが小さいことおよび／またはＩＬ－２受容体を発現する多数の免疫細胞による異化が原因の短いＰＫ、短いＰＫおよび／または無効な腫瘍標的化が原因の標的組織（例えばがん、腫瘍）における乏しい蓄積、ならびに正常組織における望ましくない蓄積および免疫活性化を含む、標準的なＩＬ－２療法の欠点の多くに対処する。
このため、本開示の実施形態は、第１のポリペプチド（鎖）および第２のポリペプチド（鎖）を含む活性化可能プロタンパク質（複合体）であって、
第１のポリペプチドが、第１のマスキング部分およびＩＬ－２タンパク質を含み、第１のマスキング部分が、第１の結合部分およびＩＬ－２タンパク質に融合された第１のリンカーを含み、
第２のポリペプチドが、第２のマスキング部分およびＩＬ－２結合タンパク質を含み、第２のマスキング部分が、第２の結合部分およびＩＬ－２結合タンパク質に融合された第２のリンカーを含み、
第１および第２のマスキング部分が、そのそれぞれの第１および第２の結合部分を介して、必要に応じて二量体として互いに結合し、それによってｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで免疫細胞の表面上に存在するＩＬ－２Ｒβ／γｃ鎖に結合するＩＬ－２タンパク質の結合部分を隠し、
第１のリンカーまたは第２のリンカーのうちの少なくとも１つが切断可能リンカーである、活性化可能プロタンパク質を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－２タンパク質およびＩＬ－２結合タンパク質は、例えば非共有結合またはある特定の共有結合（例えば、ジスルフィド結合）を介して相互作用するかまたは互いに結合する。一部の例では、ＩＬ－２タンパク質がＩＬ－２結合タンパク質、例えばＩＬ－２Ｒαタンパク質に結合すると、ＩＬ－２タンパク質が制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）上に発現されるそのコグネートＩＬ－２Ｒα／β／γｃ受容体鎖に結合するのを立体的に遮断するかまたは妨害する。一部の例では、こうした結合障害および立体障害は、タンパク質の活性化形態においても保存され、免疫抑制性のＴｒｅｇの活性化を最小限にし、プロタンパク質および類似の活性タンパク質の消費を低減させるという利点を提供することができる。例示的なＩＬ－２タンパク質およびＩＬ－２結合タンパク質を、本明細書で他所に記載する。
典型的には、上記のように、第１および第２のマスキング部分は、１つまたは結合を介して（via one or bonds）互いに結合し、例えば一緒になって二量体を形成する。そのような結合は典型的には、リンカーではなくて各々のマスキング部分内に含有される結合部分の間で起こる。しかし、リンカーは一部の例では、２つのマスキング部分の間の結合に寄与することができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで免疫細胞の表面に存在するそのコグネート受容体（例えば、ＩＬ－２Ｒβ／γｃ鎖）に対するＩＬ－２タンパク質の結合を立体的に隠すかまたはそうでなければ遮断し、それによって活性化可能プロタンパク質をその比較的不活性形態で維持するのは、２つのマスキング部分の間の相互作用（そのそれぞれの結合部分を介して）である。一部の例では、リンカーは、マスキング部分の立体的マスキングまたは遮断活性に寄与する。
より具体的には、一部の実施形態では、第１および第２のマスキング部分は、少なくとも１つの非共有結合、少なくとも１つの共有結合（例えば、少なくとも１つのジスルフィド結合）、または非共有結合および共有結合の任意の組合せを介して一緒になって二量体を形成する。しかし典型的には、第１および第２のマスキング部分は、ペプチドまたはアミド結合を介して互いに結合せず、二量体も形成しない。一部の実施形態では、マスキング部分は、そのそれぞれの結合部分を介してヘテロ二量体として、すなわち２つの異なる結合部分で構成されるヘテロ二量体として互いに結合する。一部の実施形態では、マスキング部分は、ホモ二量体として、すなわち２つの同一のまたはほぼ同一の結合部分で構成されるホモ二量体として互いに結合する。このように、第１および第２のマスキング部分または第１および第２の結合部分は、同じ（または実質的に同じ）であるかまたは異なり得る。多くの場合、第１および第２のマスキング部分は、ＩＬ－２タンパク質にもＩＬ－２結合タンパク質にも結合しない。しかし一部の例では、マスキング部分の１つまたは両方が、ＩＬ－２タンパク質および／またはＩＬ－２結合タンパク質に結合することができる。
上記のように、ポリペプチド鎖（すなわち、第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチド）の少なくとも１つは、切断可能リンカー、例えばプロテアーゼによって切断可能なリンカーを含む。一部の例では、プロテアーゼは、標的組織または細胞、例えばがん組織またはがん細胞において発現される。その状況でリンカーが切断されると、マスキング部分を放出し、ＩＬ－２タンパク質の立体障害を除去し、正常なまたは健康な組織または細胞と比較して、疾患組織または細胞においてＩＬ－２タンパク質を選択的に活性化することができる。そのような選択的および局所的活性化は、投与されたＩＬ－２の不要な消費を低減させて、それによってその半減期を増加させるのみならず、他の利点の中でもＩＬ－２の望ましくない全身作用を低減させる。結合部分およびリンカーを含む例示的なマスキング部分を本明細書に記載する。
各ポリペプチド鎖の様々な構成成分を、任意の方向に融合することができる。しかし、リンカー領域は、典型的にはＩＬ－２ペプチドとマスキング部分の結合部分の一部との間に位置し、ＩＬ－２結合タンパク質を含むポリペプチド鎖に関しても同様である。例えば、一部の実施形態では、第１のポリペプチドは、ＮからＣ末端方向に、第１のマスキング部分（第１の結合部分および第１のリンカーの順で方向づけられる）およびＩＬ－２タンパク質を含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチドは、ＮからＣ末端方向に、ＩＬ－２タンパク質および第１のマスキング部分（第１のリンカーおよび第１の結合部分の順で方向づけられる）を含む。ある特定の実施形態では、第２のポリペプチドは、ＮからＣ末端方向に、第２のマスキング部分（第２の結合部分および第２のリンカーの順で方向づけられる）およびＩＬ－２結合タンパク質を含む。特定の実施形態では、第２のポリペプチドは、ＮからＣ末端方向に、ＩＬ－２結合タンパク質および第２のマスキング部分（第２のリンカーおよび第２の結合部分の順で方向づけられる）を含む。
ある特定の活性化可能プロタンパク質は、前述のタンパク質鎖の２つのみで構成され、すなわち本明細書に記載の第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドのみで構成される（例えば、図２Ａ～２Ｊおよび図３Ａ～３Ｄにおける様々な構造を参照されたい）。しかし一部の例では、ある特定の活性化可能プロタンパク質は、複数の鎖を含み、例えば、第１および第２のポリペプチド鎖は、その上に追加のまたは高次構造を構築することができる「コア構造」を形成し、様々なコア構造は例えば図９Ａ～９Ｂに例証されるように、必要に応じて追加のタンパク質結合ドメインを介して互いに結合されている。追加のタンパク質結合ドメインの例としては、免疫グロブリンドメイン、例えば軽鎖可変領域、重鎖可変領域、および／またはＦｃ領域を含み、後者は、必要に応じて所望の対の間の特異的結合を改善するためにノブアンドホール構造を含む（図９Ａ～９Ｂを参照されたい）。
活性化可能プロタンパク質の個々の成分を、本明細書において以下により詳細に記載する。
ＩＬ－２タンパク質。本明細書に記載の活性化可能プロタンパク質は、ヒトＩＬ－２タンパク質を含む少なくとも１つの「ＩＬ－２タンパク質」（またはインターロイキン－２タンパク質）を含む。ＩＬ－２は、α（ＣＤ２５）、β（ＣＤ１２２）、およびγ（ＣＤ１３２）鎖と呼ばれる最大３つの鎖で構成される複合体であるＩＬ－２受容体（ＩＬ－２Ｒ）を通してシグナルを伝達するサイトカインである。ＩＬ－２は、抗原刺激または分裂促進刺激に応答してＴ細胞によって産生され、Ｔ細胞増殖および免疫応答の調節にとって極めて重要である他の活性にとって必要である。ＩＬ－２は、他の免疫細胞の中でも、Ｂ細胞、単球、リンフォカイン活性化キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、および神経膠腫細胞を刺激することができる。
ＩＬ－２は、シグナルペプチド（残基１～２０）、および活性な成熟タンパク質（残基２１～１５３）で構成される１５～１６ｋＤＡのタンパク質である。例示的なヒトＩＬ－２アミノ酸配列を以下の表Ｓ１に提供する。
Figure 2022533254000002
Figure 2022533254000003
このように、ある特定の実施形態では、ＩＬ－２タンパク質は、表Ｓ１から選択されるアミノ酸配列、または表Ｓ１から選択される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは１００％同一であるその活性なバリアントもしくは断片を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。一部の実施形態では、「活性な」ＩＬ－２タンパク質または断片もしくはバリアントは、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで免疫細胞の表面上に存在するＩＬ－２Ｒβ／γｃ受容体鎖に結合するその能力、および本明細書に記載のマスキング部分による立体障害の非存在下で下流のシグナル伝達活性を刺激するその能力によって特徴付けられる。下流のシグナル伝達活性の例は、その組合せを含むＪＡＫ－ＳＴＡＴ、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ、およびＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の１つまたは複数を介するＩＬ－２媒介シグナル伝達を含む。全体的に、ＩＬ－２シグナル伝達は、中でもＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、マクロファージ、および腸上皮内リンパ球の発達、機能、および生存において重要な役割を有する、応答に至る一連の下流の経路を刺激する。
特定の実施形態では、ＩＬ－２タンパク質は、配列番号１のアミノ酸２１～１５３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる、ＩＬ－２の成熟型、またはその活性なバリアントもしくは断片である。一部の実施形態では、ＩＬ－２タンパク質は、配列番号１によって定義されるＣ１４５Ｘ置換を含み、Ｘは任意のアミノ酸である。具体的な実施形態では、ＩＬ－２タンパク質は、配列番号１によって定義されるＣ１４５Ｓ置換を含む。
ある特定のＩＬ－２タンパク質は、配列番号２（Ｃ１２５Ｓ置換を有する成熟ヒトＩＬ－２）と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。一部の実施形態では、配列番号２の活性なバリアントまたは断片は、そこで定義されるＳ１２５残基を保持する。
ある特定のＩＬ－２タンパク質は、表Ｓ１における例示的なアミノ酸配列と比較して、１つまたは複数の定義されたアミノ酸置換を含む。例えば、一部のＩＬ－２タンパク質は、配列番号２によって定義されるＫ３５Ｃ、Ｒ３８Ｃ、Ｔ４１Ｃ、Ｆ４２Ｃ、Ｅ６１Ｃ、およびＶ６９Ｃから選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＩＬ－２タンパク質は、Ｋ３５Ｃ、Ｒ３８Ｃ、Ｔ４１Ｃ、Ｆ４２Ｃ、Ｅ６１Ｃ、およびＶ６９Ｃから選択されるシステイン置換の１つまたは複数を介して、ＩＬ－２結合タンパク質（例えば、ＩＬ－２Ｒａ）とジスルフィド結合を形成する。ある特定のＩＬ－２タンパク質は、その組合せを含む、配列番号２によって定義される６９、７４、および／または１２８位で１つまたは複数のアミノ酸置換を含み、例えば１つまたは複数のアミノ酸置換は、配列番号２によって定義されるＶ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、およびＩ１２８Ｔから選択される場合を含む。一部のＩＬ－２タンパク質は、その組合せを含む、配列番号２によって定義されるＲ３８、Ｆ４２、Ｙ４５、Ｅ６２、Ｅ６８、および／またはＬ７２位で１つまたは複数のアミノ酸置換を含み、例えば１つまたは複数のアミノ酸置換は、その組合せを含む、Ｒ３８ＡおよびＲ３８Ｋ；Ｆ４２Ａ、Ｆ４２Ｇ、Ｆ４２Ｓ、Ｆ４２Ｔ、Ｆ４２Ｑ、Ｆ４２Ｅ、Ｆ４２Ｎ、Ｆ４２Ｄ、Ｆ４２Ｒ、Ｆ４２Ｋ、およびＦ４２Ｉ；Ｙ４５Ａ、Ｙ４５Ｇ、Ｙ４５Ｓ、Ｙ４５Ｔ、Ｙ４５Ｑ、Ｙ４５Ｅ、Ｙ４５Ｎ、Ｙ４５Ｄ、Ｙ４５Ｒ、およびＹ４５Ｋ；Ｅ６２ＡおよびＥ６２Ｌ；Ｅ６８ＡおよびＥ６８Ｖ；ならびにＬ７２Ａ、Ｌ７２Ｇ、Ｌ７２Ｓ、Ｌ７２Ｔ、Ｌ７２Ｑ、Ｌ７２Ｅ、Ｌ７２Ｎ、Ｌ７２Ｄ、Ｌ７２Ｒ、およびＬ７２Ｋから選択される場合を含む。具体的な例は、ＩＬ－２タンパク質が、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、およびＬ７２Ｇ；Ｒ３８Ｋ、Ｆ４２Ｑ、Ｙ４５Ｎ、Ｅ６２Ｌ、およびＥ６８Ｖ；Ｒ３８Ｋ、Ｆ４２Ｑ、Ｙ４５Ｅ、およびＥ６８Ｖ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ｉ、Ｙ４５Ｎ、Ｅ６２Ｌ、およびＥ６８Ｖ；Ｒ３８Ｋ、Ｆ４２Ｋ、Ｙ４５Ｒ、Ｅ６２Ｌ、およびＥ６８Ｖ；Ｒ３８Ｋ、Ｆ４２Ｉ、Ｙ４５Ｅ、およびＥ６８Ｖ；ならびにＲ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、およびＥ６２Ａから選択されるアミノ酸置換の１つまたは組合せを含む場合を含む。このように、ＩＬ－２タンパク質は、その組合せを含む前述のアミノ酸置換の任意の１つまたは複数を含み得る。
前述のＩＬ－２タンパク質の任意の１つまたは複数を、本明細書に記載の他の構成成分、例えばＩＬ－２結合タンパク質、例えばＩＬ－２Ｒαタンパク質、結合部分およびリンカーを含むマスキング部分、ならびに他の必要に応じたタンパク質ドメインのいずれかと組み合わせて、１つもしくは複数の活性化可能プロタンパク質またはこれを含むより大きい複数鎖構造を生成することができる。
ＩＬ－２結合タンパク質。本明細書に記載の活性化可能プロタンパク質は、少なくとも１つの「ＩＬ－２結合タンパク質」を含む。ＩＬ－２結合タンパク質の例としては、ヒトＩＬ－２Ｒαタンパク質を含むＩＬ－２Ｒαタンパク質、ならびに本明細書に記載のＩＬ－２タンパク質に結合するその抗体および抗原結合性断片を含む。
特定の実施形態では、ＩＬ－２結合タンパク質は、ヒトＩＬ－２Ｒαタンパク質、またはＩＬ－２タンパク質に結合するそのバリアントもしくは断片である。例示的なヒトＩＬ－２Ｒαアミノ酸配列を以下の表Ｓ２に提供する。
Figure 2022533254000004
このように、ある特定の実施形態では、ＩＬ－２Ｒαタンパク質は、表Ｓ２から選択されるアミノ酸配列、または表Ｓ２から選択される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％同一であり、ＩＬ－２タンパク質に結合するその活性なバリアントもしくは断片を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。一部の実施形態では、ＩＬ－２Ｒαタンパク質は、配列番号４（全長の野生型ヒトＩＬ－２Ｒα）のアミノ酸２２～１８７または２２～２４０に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％であるアミノ酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。
ある特定のＩＬ－２Ｒαタンパク質は、表Ｓ２の例示的なアミノ酸配列と比較して、１つまたは複数の定義されたアミノ酸置換を含む。例えば、一部の例ではＩＬ－２Ｒαタンパク質は、配列番号６（ヒトＩＬ－２Ｒα Ｓｕｓｈｉ１～Ｓｕｓｈｉ２ドメイン）によって定義されるＤ４Ｃ、Ｄ６Ｃ、Ｎ２７Ｃ、Ｋ３８Ｃ、Ｓ３９Ｃ、Ｌ４２Ｃ、Ｙ４３Ｃ、Ｉ１１８Ｃ、およびＨ１２０Ｃから選択される１つまたは複数のシステイン置換を含む。一部の例では、ＩＬ－２Ｒαタンパク質は、配列番号６によって定義される４９および／または６８位でアラニン置換を含む。このように、ＩＬ－２Ｒαタンパク質は、その組合せを含む前述のアミノ酸置換の任意の１つまたは複数を含み得る。
これらおよび関連する実施形態のある特定の実施形態では、ＩＬ－２Ｒαタンパク質は、前述のシステインの１つまたは複数およびＩＬ－２タンパク質における１つまたは複数のシステインを介して、ＩＬ－２タンパク質と少なくとも１つのジスルフィド結合を形成する。具体的な実施形態では、ＩＬ－２ＲαおよびＩＬ－２タンパク質は、ＩＬ２－Ｋ３５ＣおよびＩＬ２Ｒα－Ｄ４Ｃ、ＩＬ２－Ｒ３８ＣおよびＩＬ２Ｒα－Ｄ６Ｃ、ＩＬ２－Ｒ３８ＣおよびＩＬ２Ｒα－Ｈ１２０Ｃ、ＩＬ２－Ｔ４１Ｃ－ＩＬ２Ｒα－Ｉ１１８Ｃ、ＩＬ２－Ｆ４２ＣおよびＩＬ２Ｒα－Ｎ２７Ｃ、ＩＬ２－Ｅ６１ＣおよびＩＬ２Ｒα－Ｋ３８Ｃ、ＩＬ２－Ｅ６１ＣおよびＩＬ２Ｒα－Ｓ３９Ｃ、ならびにＩＬ２－Ｖ６９ＣおよびＩＬ２Ｒα－Ｌ４２Ｃから選択される１つまたは複数のシステイン対の間で、ジスルフィド、少なくとも１つのジスルフィド結合を形成する。特定の実施形態では、上記のように、ＩＬ－２タンパク質とＩＬ－２Ｒαタンパク質との間の結合（例えば、ジスルフィド結合）は、Ｔｒｅｇ上に発現されるＩＬ－２Ｒαβγ鎖に優先的に結合するＩＬ－２タンパク質の結合部位を隠すか、または立体的に妨害する。一部の例では、タンパク質の活性形態または活性化形態は、少なくとも１つのリンカーの切断および対応するマスキング部分の放出後、ＩＬ－２タンパク質とＩＬ－２Ｒαタンパク質との間の結合を保持し、このためＴｒｅｇ上に発現されるＩＬ－２Ｒαβγ鎖に優先的に結合しない。
上記のように、ある特定の実施形態では、ＩＬ－２結合タンパク質は、ＩＬ－２タンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片を含む。例としては、抗体全体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、単一特異性Ｆａｂ２、二重特異性Ｆａｂ２、ＦＶ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦＶ－Ｆｃ、ナノボディ、ダイアボディ、ラクダ、およびミニボディが挙げられる。具体的な実施形態では、抗体は、ＮＡＲＡ１またはその抗原結合性断片である（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Arenas-Ramirez et al., Science Translational Medicine. 8: 367ra166, 2016；および米国特許出願公開第２０１９／００１６７９７号を参照されたい）。特定の実施形態では、および上記と同様に、ＩＬ－２タンパク質と抗ＩＬ－２抗体（またはその抗原結合性断片）との間の結合（例えば、ジスルフィド結合）は、Ｔｒｅｇ上に発現されるＩＬ－２Ｒαβγ鎖に優先的に結合するＩＬ－２タンパク質の結合部位を隠すかまたは立体的に妨害する。一部の例では、タンパク質の活性形態または活性化形態は、少なくとも１つのリンカーの切断および対応するマスキング部分の放出後、ＩＬ－２タンパク質とＩＬ－２Ｒαタンパク質との間の結合を保持し、このためＴｒｅｇ上に発現されたＩＬ－２Ｒαβγ鎖に優先的に結合しない。
本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、インタクトなポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のみならず、その断片（例えば、ｄＡｂ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ）、一本鎖（ＳｃＦｖ）、その合成バリアント、天然に存在するバリアント、必要な特異性の抗原結合性断片を有する抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、および必要な特異性を有する抗原結合部位または断片（エピトープ認識部位）を含む免疫グロブリン分子の他の任意の改変された立体配置も包含する。抗体（およびその抗原結合性断片）のある特定の特色および特徴を、本明細書により詳細に記載する。
抗体または抗原結合性断片は、本質的に任意のタイプのものであり得る。当技術分野で周知であるように、抗体は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つのエピトープ認識部位を通して、標的、例えば免疫チェックポイント分子に特異的に結合することが可能な免疫グロブリン分子である。
用語「抗原結合性断片」は、本明細書で使用される場合、目的の抗原に結合する免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖の少なくとも１つのＣＤＲを含有するポリペプチド断片を指す。この点において、本明細書に記載の抗体の抗原結合性断片は、標的分子に結合する抗体からのＶＨおよびＶＬ配列の１、２、３、４、５、または６個全てのＣＤＲを含み得る。
抗体およびその抗原結合性断片の結合特性は、当技術分野で周知の方法を使用して定量することができる（Davies et al., Annual Rev. Biochem. 59:439-473, 1990を参照されたい）。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、標的分子、例えばＩＬ－２タンパク質またはそのエピトープもしくは複合体に、約または約１０－７Ｍ以下～約１０－８Ｍの範囲である平衡解離定数で特異的に結合する。一部の実施形態では、平衡解離定数は、約または約１０－９Ｍ以下～約１０－１０Ｍ以下の範囲である。ある特定の例示的な実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、約、少なくとも約０．０１ｎＭもしくはそれ未満、約、少なくとも約０．０５ｎＭもしくはそれ未満、約、少なくとも約０．１ｎＭもしくはそれ未満、約、少なくとも約０．２ｎＭもしくはそれ未満、約、少なくとも約０．３ｎＭもしくはそれ未満、約、少なくとも約０．４ｎＭもしくはそれ未満、約、少なくとも約０．５ｎＭもしくはそれ未満、約、少なくとも約０．６ｎＭもしくはそれ未満、約、少なくとも約０．７ｎＭもしくはそれ未満、約、少なくとも約０．８ｎＭもしくはそれ未満、約、少なくとも約０．９ｎＭもしくはそれ未満、約、少なくとも約１ｎＭもしくはそれ未満、約、少なくとも約２ｎＭもしくはそれ未満、約、少なくとも約３ｎＭもしくはそれ未満、約、少なくとも約４ｎＭもしくはそれ未満、約、少なくとも約５ｎＭもしくはそれ未満、約、少なくとも約６ｎＭもしくはそれ未満、約、少なくとも約７ｎＭもしくはそれ未満、約、少なくとも約８ｎＭもしくはそれ未満、約、少なくとも約９ｎＭもしくはそれ未満、約、少なくとも約１０ｎＭもしくはそれ未満、約、少なくとも約１１ｎＭもしくはそれ未満、約、少なくとも約１２ｎＭもしくはそれ未満、約、少なくとも約１３ｎＭもしくはそれ未満、約、少なくとも約１４ｎＭもしくはそれ未満、約、少なくとも約１５ｎＭもしくはそれ未満、約、少なくとも約１６ｎＭもしくはそれ未満、約、少なくとも約１７ｎＭもしくはそれ未満、約、少なくとも約１８ｎＭもしくはそれ未満、約、少なくとも約１９ｎＭもしくはそれ未満、約、少なくとも約２０ｎＭもしくはそれ未満、約、少なくとも約２１ｎＭもしくはそれ未満、約、少なくとも約２２ｎＭもしくはそれ未満、約、少なくとも約２３ｎＭもしくはそれ未満、約、少なくとも約２４ｎＭもしくはそれ未満、約、少なくとも約２５ｎＭもしくはそれ未満、約、少なくとも約２６ｎＭもしくはそれ未満、約、少なくとも約２７ｎＭもしくはそれ未満、約、少なくとも約２８ｎＭもしくはそれ未満、約、少なくとも約２９ｎＭもしくはそれ未満、約、少なくとも約３０ｎＭもしくはそれ未満、約、少なくとも約４０ｎＭもしくはそれ未満、または約、少なくとも約５０ｎＭもしくはそれ未満のＩＬ－２タンパク質（それが特異的に結合する）に対する親和性（ＫｄまたはＥＣ５０）を有する。
ポリペプチドまたは抗体などの分子は、それが代替の細胞または物質またはエピトープに反応または会合するよりも、特定の細胞、物質、または特定のエピトープに頻繁に、迅速に、長い期間、および／または高い親和性で反応または会合する場合、「特異的結合」または「優先的結合」を示すと言われる。抗体は、他の物質またはエピトープに結合するよりも高い親和性、アビディティで、より容易に、および／またはより長い期間、例えば統計学的に有意な量で結合する場合、標的分子またはエピトープに「特異的に結合する」または「優先的に結合する」。典型的には、特異的結合を示す分子の対の１つのメンバーは、分子の対の他方のメンバーに特異的に結合し、したがってその特定の空間的および／または極性機構と相補的であるその表面上の領域または窪みを有する。このため、対のメンバーは、互いに特異的に結合する特性を有する。例えば、特定のエピトープに特異的または優先的に結合する抗体は、それが他のエピトープに結合するよりも高い親和性、アビディティで、より容易に、および／またはより長い期間、特定のエピトープに結合する抗体である。同様に、例えば第１の標的に特異的または優先的に結合する抗体（または部分もしくはエピトープ）は、第２の標的に特異的または優先的に結合しても結合しなくてもよいことは、この定義を読むことによって理解される。この用語はまた、例えばいくつかの抗原が有する特定のエピトープに対して抗体が特異的である場合にも適用可能であり、この場合、抗原結合性断片またはドメインを有する特異的結合メンバーは、エピトープを有する様々な抗原に結合することができ、例えば共通のエピトープを共有する複数の種からのいくつかの異なる形態の標的抗原と交差反応性であり得る。
免疫学的結合は一般的に、免疫グロブリン分子とそれに対して免疫グロブリンが特異的である抗原との間で、例えば例としておよび限定されないが、静電気的、イオン、親水性、および／または疎水性の引力または反発力、立体力、水素結合、ファンデルワールス力、および他の相互作用の結果として起こるタイプの非共有結合による相互作用を指す。免疫学的結合相互作用の強度または親和性は、相互作用の解離定数（Ｋｄ）に関して表記することができ、より小さいＫｄは、より高い親和性を表す。選択されたポリペプチドの免疫学的結合特性は、当技術分野で周知の方法を使用して定量することができる。１つのそのような方法は、抗原結合部位／抗原複合体の形成および解離の速度を測定することを伴い、それらの速度は、複合体パートナーの濃度、相互作用の親和性、および両方向の速度に等しく影響を及ぼす幾何学的パラメーターに依存する。このように、「オンレート定数」（Ｋｏｎ）および「オフレート定数」（Ｋｏｆｆ）の両方を、濃度ならびに実際の会合速度および解離速度の計算によって決定することができる。Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎの比は、親和性に関連しない全てのパラメーターの取り消しを可能にし、このように、解離定数Ｋｄに等しい。本明細書で使用される場合、用語「親和性」は、２つの作用剤の可逆的結合に関する平衡定数を含み、ＫｄまたはＥＣ５０として表記される。ＩＬ－２タンパク質またはエピトープに対する抗体の親和性は、例えば、約１００ナノモル濃度（ｎＭ）～約０．１ｎＭ、約１００ｎＭ～約１ピコモル濃度（ｐＭ）、または約１００ｎＭ～約１フェムトモル濃度（ｆＭ）であり得る。本明細書で使用される場合、用語「アビディティ」は、希釈後の解離に対する２つまたはそれより多くの作用剤の複合体の抵抗性を指す。
抗体は、当業者に公知の多様な技術のいずれかによって調製され得る。例えば、Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988を参照されたい。目的のポリペプチドに対して特異的なモノクローナル抗体は、例えば、Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol. 6:511-519, 1976の技術、およびその改善型を使用して調製され得る。同様に、マウスなどのトランスジェニック動物を利用してヒト抗体を発現させる方法も含まれる。例えば、Neuberger et al., Nature Biotechnology 14:826, 1996；Lonberg et al., Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101, 1994；およびLonberg et al., Internal Review of Immunology 13:65-93, 1995を参照されたい。特定の例は、ＲＥＧＥＮＥＲＥＸ（登録商標）によるＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）プラットフォームを含む（例えば、米国特許第６，５９６，５４１号を参照されたい）。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体およびその抗原結合性断片は、それぞれがＣＤＲに対する支持体を提供し、互いに対してＣＤＲの空間的関係を定義する重鎖および軽鎖フレームワーク領域（ＦＲ）セットの間に介在する重鎖および軽鎖ＣＤＲセットを含む。本明細書で使用される場合、用語「ＣＤＲセット」は、重鎖または軽鎖Ｖ領域の３つの超可変領域を指す。重鎖または軽鎖のＮ末端から順に、これらの領域はそれぞれ、「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、および「ＣＤＲ３」として示される。したがって、抗原結合部位は、重鎖および軽鎖Ｖ領域の各々からのＣＤＲセットを含む６つのＣＤＲを含む。単一のＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３）を含むポリペプチドは、本明細書において「分子認識単位」と呼ばれる。いくつかの抗原－抗体複合体の結晶構造解析により、ＣＤＲのアミノ酸残基は、結合した抗原と広範囲の接触を形成し、最も広範囲な抗原の接触は、重鎖ＣＤＲ３との接触であることが実証されている。このように、分子認識単位は、抗原結合部位の特異性に主に関与する。
本明細書で使用される場合、用語「ＦＲセット」は、重鎖または軽鎖Ｖ領域のＣＤＲセットのＣＤＲの枠組みである４つの隣接するアミノ酸配列を指す。一部のＦＲ残基は、結合した抗原と接触し得る。しかし、ＦＲ、特にＣＤＲに直接隣接するＦＲ残基は、主にＶ領域の抗原結合部位へのフォールディングに関与する。ＦＲ内で、ある特定のアミノ残基（amino residues）およびある特定の構造特色は、非常に高度に保存されている。この点において、全てのＶ領域配列は、およそ９０アミノ酸残基の内部ジスルフィドループを含有する。Ｖ領域が結合部位にフォールディングすると、ＣＤＲは、抗原結合表面を形成する突出したループモチーフとして表示される。正確なＣＤＲのアミノ酸配列によらず、ＣＤＲループのある特定の「典型的な」構造へのフォールディングされた形状に影響を及ぼすＦＲの保存された構造領域が存在することが一般的に認識されている。さらに、ある特定のＦＲ残基が、抗体重鎖および軽鎖の相互作用を安定化させる非共有結合のドメイン間接触に関与することは公知である。
免疫グロブリン可変ドメインの構造および位置は、Kabat, E. A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4th Edition. US Department of Health and Human Services. 1987、およびその更新版を参照して決定され得る。
同様に、均一な抗体集団を指す「モノクローナル」抗体も含まれ、モノクローナル抗体はエピトープの選択的結合に関係するアミノ酸（天然に存在するおよび天然に存在しない）で構成される。モノクローナル抗体は、単一のエピトープに向けられ、非常に特異的である。用語「モノクローナル抗体」は、インタクトなモノクローナル抗体および全長のモノクローナル抗体のみならず、その断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ）、一本鎖（ＳｃＦｖ）、そのバリアント、抗原結合部分を含む融合タンパク質、ヒト化モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、ならびに必要な特異性およびエピトープとの結合能を有する抗原結合性断片（エピトープ認識部位）を含む他の任意の改変された立体配置の免疫グロブリン分子も包含する。抗体の起源またはそれが作製される様式（例えば、ハイブリドーマ、ファージ選択、組換え発現、トランスジェニック動物）に関して制限はないと意図される。用語は、免疫グロブリン全体および「抗体」の定義の下で上記の断片等を含む。
タンパク質分解酵素であるパパインは、ＩｇＧ分子を優先的に切断していくつかの断片を生じ、そのうち２つ（Ｆ（ａｂ）断片）は、各々がインタクトな抗原結合部位を含む共有結合したヘテロ二量体を含む。酵素ペプシンは、ＩｇＧ分子を切断して、両方の抗原結合部位を含むＦ（ａｂ’）２断片を含むいくつかの断片を提供することができる。ある特定の実施形態に従う使用のためのＦｖ断片は、ＩｇＭの優先的タンパク質分解切断によって産生され、まれにＩｇＧまたはＩｇＡ免疫グロブリン分子の切断によって産生することができる。しかし、Ｆｖ断片は、当技術分野で公知の組換え技術を使用してより一般的に誘導される。Ｆｖ断片は、天然の抗体分子の抗原認識能および結合能の多くを保持する抗原結合部位を含む非共有結合ＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体を含む。Inbar et al., PNAS USA. 69:2659-2662, 1972；Hochman et al., Biochem. 15:2706-2710, 1976；およびEhrlich et al., Biochem. 19:4091-4096, 1980を参照されたい。
ある特定の実施形態では、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦＶ）抗体が企図される。例えば、カッパボディ（Ill et al., Prot. Eng. 10:949-57, 1997）；ミニボディ（Martin et al., EMBO J 13:5305-9, 1994）；ダイアボディ（Holliger et al., PNAS 90: 6444-8, 1993）；またはＪａｎｕｓｉｎｓ（Traunecker et al., EMBO J 10: 3655-59, 1991；およびTraunecker et al., Int. J. Cancer Suppl. 7:51-52, 1992）を、所望の特異性を有する抗体の選択に関して本出願の教示に従って標準的な分子生物学技術を使用して調製してもよい。
一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）ポリペプチドは、ペプチドコードリンカーによって連結されたＶＨおよびＶＬコード遺伝子を含む遺伝子融合体から発現される共有結合により連結されたＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体である。Huston et al. (PNAS USA. 85(16):5879-5883, 1988)。抗体Ｖ領域からの天然に凝集しているが化学的に分離した軽鎖および重鎖ポリペプチド鎖を、抗原結合部位の構造と実質的に類似の三次元構造へとフォールディングするｓｃＦｖ分子に変換するための化学構造を識別するいくつかの方法が記載されている。例えば、Ｈｕｓｔｏｎらに対する米国特許第５，０９１，５１３号および第５，１３２，４０５号；ならびにＬａｄｎｅｒらに対する米国特許第４，９４６，７７８号を参照されたい。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合性断片は、「ダイアボディ」の形態である。ダイアボディは、各々のポリペプチドが免疫グロブリン軽鎖の結合領域を含む第１のドメインと、免疫グロブリン重鎖の結合領域を含む第２のドメインとを含むポリペプチドの多量体であり、２つのドメインは連結されているが（例えば、ペプチドリンカーによって）、互いに会合して抗原結合部位を形成することができず、抗原結合部位は、多量体内の１つのポリペプチドの第１のドメインと多量体内の別のポリペプチドの第２のドメインとの会合によって形成される（ＷＯ９４／１３８０４）。抗体のｄＡｂ断片はＶＨドメインからなる（Ward et al., Nature 341:544-546, 1989）。ダイアボディおよび他の多価または多重特異性断片は、例えば遺伝子融合によって構築することができる（ＷＯ９４／１３８０４；およびHolliger et al., PNAS USA. 90:6444-6448, 1993を参照されたい）。
ＣＨ３ドメインに連結したｓｃＦｖを含むミニボディもまた含まれる（Hu et al., Cancer Res. 56:3055-3061, 1996を参照されたい）。同様に、Ward et al., Nature. 341:544-546, 1989：Bird et al., Science. 242:423-426, 1988；Huston et al., PNAS USA. 85:5879-5883, 1988)；ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５；ＷＯ９４／１３８０４；およびReiter et al., Nature Biotech. 14:1239-1245, 1996も参照されたい。
二重特異性抗体を使用する場合、これらは、多様な方法（Holliger and Winter, Current Opinion Biotechnol. 4:446-449, 1993）で製造することができる、例えば化学的にもしくはハイブリッドハイブリドーマから調製することができる従来の二重特異性抗体であり得るか、または上記で言及した二重特異性抗体断片のいずれかであり得る。可変ドメインのみを使用してＦｃ領域を有しないダイアボディおよびｓｃＦｖを構築することができ、潜在的に抗イディオタイプ反応の効果を低減することができる。
二重特異性ダイアボディはまた、二重特異性の全抗体とは対照的に、それらが容易に構築され、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させることができることから、特に有用であり得る。適切な結合特異性を有するダイアボディ（および抗体断片などの他の多くのポリペプチド）を、ファージディスプレイを使用してライブラリから容易に選択することができる（ＷＯ９４／１３８０４）。例えば、抗原Ｘに対して特異的に向けられたダイアボディの１つのアームを一定のままにする場合、他のアームを変化させたライブラリを作製し、適切な特異性の抗体を選択することができる。二重特異性の全抗体は、ノブイントゥホール操作法によって作製され得る（Ridgeway et al., Protein Eng., 9:616-621, 1996）。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体または抗原結合性断片は、ＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）の形態である。ＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）は、ヒンジ領域が除去されたＩｇＧ４抗体である（ＧｅｎＭａｂ Ｕｔｒｅｃｈｔ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ；例えば、ＵＳ２００９０２２６４２１を参照されたい）。この抗体技術は、現在の小さい抗体フォーマットよりも長い治療ウィンドウが予想される安定なより小さい抗体フォーマットを作出する。ＩｇＧ４抗体は不活性であると考えられ、免疫系と相互作用しない。完全なヒトＩｇＧ４抗体を、抗体のヒンジ領域を排除することによって改変し、対応するインタクトなＩｇＧ４（ＧｅｎＭａｂ、Ｕｔｒｅｃｈｔ）と比較して、別個の安定性特性を有する半分子断片を得てもよい。ＩｇＧ４分子を半分にすると、コグネート抗原（例えば、疾患標的）に結合することができる１つのみの領域がＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）上に残り、したがってＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）は、標的細胞上の１つのみの部位に一価で結合する。ある特定のがん細胞表面抗原に関して、この一価の結合は、同じ抗原特異性を有する二価抗体を使用して認められ得るように、がん細胞を刺激して成長させることがなく、したがってＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）技術は、従来の抗体による処置に不応性であり得る一部のタイプのがんの処置選択肢を与え得る。ＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）のサイズが小さいことは、一部の形態のがんを処置する場合に大きい利点であり得、分子をより大きい固形腫瘍に対してより良好に分布させ、おそらく有効性を増加させることができる。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体および抗原結合性断片は、ナノボディの形態である。ミニボディは、単一の遺伝子によってコードされ、ほぼ全ての原核生物および真核生物宿主、例えばＥ．ｃｏｌｉ（米国特許第６，７６５，０８７号を参照されたい）、カビ（例えば、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓまたはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、および酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｍｙｃｅｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、またはＰｉｃｈｉａ（米国特許第６，８３８，２５４号を参照されたい）において効率よく産生されている。産生プロセスは、規模を拡大することが可能で、数キログラムの量のナノボディが産生されている。ナノボディは、長い貯蔵期間を有する使用準備済みの液剤として製剤化され得る。ナノクローン法（ＷＯ０６／０７９３７２を参照されたい）は、Ｂ細胞の自動ハイスループット選択に基づいて所望の標的に対するナノボディを生成するための専有の方法である。
同様に、重鎖二量体、例えばラクダおよびサメ由来の抗体も含まれる。ラクダおよびサメ抗体は、Ｖ様およびＣ様ドメイン（軽鎖を有しない）の２つの鎖のホモ二量体対を含む。ラクダにおける重鎖二量体ＩｇＧのＶＨ領域は、軽鎖と疎水性相互作用をなす必要がないことから、軽鎖に通常接触する重鎖の領域は、ラクダでは親水性アミノ酸残基に変化している。重鎖二量体ＩｇＧのＶＨドメインはＶＨＨドメインと呼ばれる。サメＩｇ－ＮＡＲは、１つの可変ドメイン（Ｖ－ＮＡＲドメインと呼ばれる）および５つのＣ様定常ドメイン（Ｃ－ＮＡＲドメイン）のホモ二量体を含む。
ラクダでは、多様な抗体レパートリーは、ＶＨまたはＶＨＨ領域における相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２、および３によって決定される。ラクダＶＨＨ領域におけるＣＤＲ３は、平均１６アミノ酸の比較的長い長さによって特徴付けられる（Muyldermans et al., 1994, Protein Engineering 7(9): 1129）。これは、他の多くの種の抗体のＣＤＲ３領域とは対照的である。例えば、マウスＶＨのＣＤＲ３は、平均で９アミノ酸を有する。ラクダの可変領域のｉｎ ｖｉｖｏでの多様性を維持するラクダ由来抗体可変領域のライブラリは、例えば２００５年２月１７日に公開された米国特許出願公開第２００５００３７４２１号に開示される方法によって作製することができる。
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片はヒト化される。これらの実施形態は、組換え技術を使用して一般的に調製されたキメラ分子を指し、非ヒト種の免疫グロブリンに由来する抗原結合部位と、ヒト免疫グロブリンの構造および／または配列に基づく分子の残りの免疫グロブリン構造とを有する。抗原結合部位は、定常ドメインに融合された完全な可変ドメイン、または可変ドメインにおける適切なフレームワーク領域にグラフトされたＣＤＲのみのいずれかを含み得る。エピトープ結合部位は、野生型であってもよく、または１つもしくは複数のアミノ酸置換によって改変されてもよい。これは、ヒト個体における免疫原としての定常領域を排除するが、外来の可変領域に対する免疫応答の可能性は残っている（LoBuglio et al., PNAS USA 86:4220-4224, 1989；Queen et al., PNAS USA. 86:10029-10033, 1988；Riechmann et al., Nature. 332:323-327, 1988）。抗体をヒト化するための例示的な方法は、米国特許第７，４６２，６９７号に記載の方法を含む。
別のアプローチは、ヒト由来定常領域を提供することのみならず、可変領域を改変すること、およびヒトの形態に可能な限り近くなるようにそれらを再形成することに集中している。重鎖および軽鎖の両方の可変領域が、問題のエピトープに対する応答が異なり、結合能を決定し、所定の種において比較的保存されて相補性決定領域（ＣＤＲ）の足場を提供すると推定される４つのフレームワーク領域（ＦＲ）に挟まれた３つＣＤＲを含有することは公知である。特定のエピトープに関する非ヒト抗体を調製する場合、非ヒト抗体に由来するＣＤＲを改変されるヒト抗体に存在するＦＲ上にグラフトすることによって、可変領域を「再形成」または「ヒト化」することができる。様々な抗体に対するこのアプローチの応用は、Sato et al., Cancer Res. 53:851-856, 1993；Riechmann et al., Nature 332:323-327, 1988；Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536, 1988；Kettleborough et al., Protein Engineering. 4:773-3783, 1991；Maeda et al., Human Antibodies Hybridoma 2:124-134, 1991；Gorman et al., PNAS USA. 88:4181-4185, 1991；Tempest et al., Bio/Technology 9:266-271, 1991；Co et al., PNAS USA. 88:2869-2873, 1991；Carter et al., PNAS USA. 89:4285-4289, 1992；およびCo et al., J Immunol. 148:1149-1154, 1992によって報告されている。一部の実施形態では、ヒト化抗体は、全てのＣＤＲ配列を保存している（例えば、マウス抗体からの６個全てのＣＤＲを含有するヒト化マウス抗体）。他の実施形態では、ヒト化抗体は、元の抗体に関して変更されている１つまたは複数のＣＤＲ（１、２、３、４、５、または６個）を有し、これはまた、元の抗体からの１つまたは複数のＣＤＲ「に由来する」１つまたは複数のＣＤＲとも呼ばれる。
ある特定の実施形態では、抗体は「キメラ」抗体である。この点において、キメラ抗体は、異なる抗体の異種Ｆｃ部分に作動可能に連結された、またはそうでなければ融合された抗体の抗原結合性断片で構成される。ある特定の実施形態では、Ｆｃドメインまたは異種Ｆｃドメインは、ヒト起源のドメインである。ある特定の実施形態では、Ｆｃドメインまたは異種Ｆｃドメインは、マウス起源のドメインである。他の実施形態では、異種Ｆｃドメインは、ＩｇＡ（サブクラスＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む）、およびＩｇＭを含む、親抗体からの異なるＩｇクラスに由来し得る。さらなる実施形態では、異種Ｆｃドメインは、異なるＩｇクラスの１つまたは複数からのＣＨ２およびＣＨ３ドメインで構成され得る。ヒト化抗体に関して上記のように、キメラ抗体の抗原結合性断片は、本明細書に記載の抗体のＣＤＲの１つまたは複数（例えば、本明細書に記載の抗体の１、２、３、４、５、または６個のＣＤＲ）のみを含み得るか、または全可変ドメイン（ＶＬ、ＶＨ、または両方）を含み得る。
前述のＩＬ－２結合タンパク質の任意の１つまたは複数を、本明細書に記載の他の構成成分、例えばＩＬ－２タンパク質、結合部分およびリンカーを含むマスキング部分、ならびに他の必要に応じたタンパク質ドメインのいずれかと組み合わせて、１つまたは複数の活性化可能プロタンパク質またはそれを含むより大きい複数鎖構造を生成することができる。
マスキング部分。上記のように、本明細書に記載の活性化可能プロタンパク質は、その各々が「マスキング部分」を含む、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含む。すなわち、第１のポリペプチドは第１のマスキング部分を含み、第２のポリペプチドは第２のマスキング部分を含む。任意の所定の活性化可能プロタンパク質における第１および第２のマスキング部分は、同じ（または実質的に同じ）であり得るか、または異なり得る。
一部の例では、マスキング部分の二量体は、ＩＬ－２タンパク質の活性なドメインを隠す。したがって、本明細書に提供される活性化可能プロタンパク質の文脈において、ＩＬ－２／ＩＬ－２結合タンパク質複合体（例えば、ＩＬ－２／ＩＬ－２Ｒα複合体）を含む「活性なドメイン」が、少なくとも１つのマスキング部分の付加（１つまたは複数の切断可能リンカーを介して）によって改変され、標的（例えば、ＩＬ－２Ｒβ／γｃ受容体鎖）の存在下である場合、その標的に対する活性なドメインの結合は、マスキング部分の付加によって改変されていない同等の活性なドメインの特異的結合と比較して、遮断され、低減され、または阻害される。
一部の実施形態では、マスキング部分は、その標的、例えば免疫細胞の表面上のコグネートＩＬ－２Ｒβ／γｃ受容体鎖に対する活性化可能プロタンパク質の結合をアロステリックに阻害する。これらおよび関連する実施形態では、活性化可能プロタンパク質は、その標的に対して結合を示さないかもしくは実質的に結合を示さない、または活性なドメインもしくはＩＬ－２タンパク質単独の結合と比較して、０．００１％以下、０．０１％以下、０．１％以下、１％以下、２％以下、３％以下、４％以下、５％以下、６％以下、７％以下、８％以下、９％以下、１０％以下、１５％以下、２０％以下、２５％以下、３０％以下、３５％以下、４０％以下、または５０％以下の結合を、必要に応じてｉｎ ｖｉｖｏでまたは当技術分野で利用可能な標的置換ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイによって測定した場合に、必要に応じて少なくとも２時間、少なくとも４時間、少なくとも６時間、少なくとも８時間、少なくとも１２時間、少なくとも２８時間、少なくとも２４時間、少なくとも３０時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、少なくとも６０時間、少なくとも７２時間、少なくとも８４時間、少なくとも９６時間、または少なくとも５日間、少なくとも１０日間、少なくとも１５日間、少なくとも３０日間、少なくとも４５日間、少なくとも６０日間、少なくとも９０日間、少なくとも１２０日間、少なくとも１５０日間、少なくとも１８０日間、または少なくとも１ヶ月間、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも４ヶ月間、少なくとも５ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、少なくとも７ヶ月間、少なくとも８ヶ月間、少なくとも９ヶ月間、少なくとも１０ヶ月間、少なくとも１１ヶ月間、少なくとも１２ヶ月間、またはそれより長く示す。
本明細書に記載のマスキング部分は、各々が第１および第２のマスキング部分の間の結合を容易にする「結合部分」と、各々の結合部分をそのそれぞれのＩＬ－２タンパク質またはＩＬ－２結合タンパク質（例えば、ＩＬ－２Ｒαタンパク質）から分離する「リンカー」とを含む。各々の活性化可能プロタンパク質におけるリンカーの少なくとも１つは切断可能リンカーであり、切断後、マスキング部分の少なくとも１つを放出し、それによって必要に応じて腫瘍部位またはがん組織においてＩＬ－２タンパク質の活性部位または結合部位を露出する。第１および第２の結合部分は同じであっても異なっていてもよく、第１および第２のリンカーは同じであっても異なっていてもよい。一部の実施形態では、第１のマスキング部分および／または第２のマスキング部分は、ＩＬ－２タンパク質にもＩＬ－２結合タンパク質にも結合しない。
結合部分の構造特性は、多様な要因、例えばＩＬ－２のその標的に対する結合を妨害するために必要な最小のアミノ酸配列、結合部分とＩＬ－２タンパク質またはＩＬ－２結合タンパク質との間のリンカーの長さ、システイン－システインジスルフィド結合の解離を提供するのに適したＩＬ－２タンパク質またはＩＬ－２結合タンパク質内またはそれに隣接するシステインの有無等に従って変化する。
結合部分の一般的な例を以下の表Ｍ１に提供する。
Figure 2022533254000005
このように、ある特定の実施形態では、第１の結合部分および第２の結合部分は、表Ｍ１から選択される。
特定の実施形態では、第１の結合部分および／または第２の結合部分は、その抗原結合性断片およびバリアント、例えばＶＬドメインおよび／またはＶＨドメインを含む、免疫グロブリンの抗原結合ドメインを含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、抗原、例えばヒト抗原に結合しない。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、抗原、例えばヒト抗原に結合する。
一部の実施形態では、第１の結合部分および／または第２の結合部分は、免疫グロブリンの定常ドメイン、またはその断片もしくはバリアントを含む。例えば、ある特定の実施形態では、第１および／または第２の結合部分は、その断片およびバリアント、ならびにその組合せを含む、免疫グロブリンのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ１ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ１ＣＨ２ＣＨ３、および／またはＣＬドメインを含む。一部の例では、軽鎖（ＣＬ）はラムダまたはカッパ鎖である。一部の実施形態では、本明細書に提供される活性化可能プロタンパク質のマスキング部分または結合部分に存在する定常ドメインは、グリコシル化されている。一部の実施形態では、グリコシル化は、Ｎ－グリコシル化である。一部の実施形態では、グリコシル化は、Ｏ－グリコシル化である。ある特定の実施形態では、マスキング部分は、所望のマスキング部分の対の間の特異的結合を改善するためにノブアンドホール構造を含む（図９Ａ～９Ｂを参照されたい）。例えば、具体的な実施形態では、マスキング部分対のＣＨ３ドメインは、ノブアンドホール構造を含む（例えば、Shatz et al., MAbs. 5(6):872-881, 2013を参照されたい）。
具体的な実施形態では、第１の結合部分および／または第２の結合部分は、ＮからＣ末端方向に：（１）その抗原結合性断片およびバリアントを含む免疫グロブリンの抗原結合ドメイン；ならびに（２）その断片およびバリアントを含む免疫グロブリン定常ドメイン、例えばその組合せを含む、免疫グロブリンのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ１ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ１ＣＨ２ＣＨ３、および／またはＣＬドメインを含む。
本明細書で使用される免疫グロブリンドメイン（抗原結合ドメイン、定常ドメイン）は、必要に応じてＩｇＧドメインを含む。しかし、ある特定の実施形態は、代替の免疫グロブリン、例えばＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥを含む。さらに、様々な免疫グロブリンの全ての可能性があるアイソタイプもまた、本実施形態に包含される。このように、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３等は、結合ドメインにおける全ての可能性がある分子である。免疫グロブリンのタイプおよびアイソタイプの選択に加えて、ある特定の実施形態は、様々なヒンジ領域（またはその機能的同等物）を含む。そのようなヒンジ領域は、本明細書に記載のプロタンパク質の異なるドメイン間でフレキシビリティを提供する。一部の実施形態では、結合ドメイン（またはより大きいマスキング部分）の免疫グロブリン部分は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＭから選択される免疫グロブリンクラスに由来する。
上記のように、一部の実施形態では、第１の結合部分および第２の結合部分は異なり、例えば第１および第２のマスキング部分は、そのそれぞれの第１および第２の結合部分を介してヘテロ二量体として互いに結合する。例えば、一部の実施形態では、第１の結合部分は、免疫グロブリンのＶＬおよびＣＬドメインを含み、第２の結合部分は、免疫グロブリンのＶＨおよびＣＨ１ドメインを含む。一部の実施形態では、第１の結合部分は、免疫グロブリンのＶＨおよびＣＨ１ドメインを含み、第２の結合部分は、免疫グロブリンのＶＬおよびＣＬドメインを含む。このタイプの例示的な構造を図３Ａ～３Ｄに例証する。
特定の実施形態では、第１の結合部分および第２の結合部分は、同じであるかまたは実質的に同じであり、例えば第１および第２のマスキング部分は、そのそれぞれの第１および第２の結合部分を介してホモ二量体として互いに結合する。一例として、一部の実施形態では、第１および第２の結合部分の各々は、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む（例えば、図９Ｂの一番左の構造を参照されたい）。
例示的なマスキング部分の例証される例を以下の表Ｓ３に提供する。
Figure 2022533254000006
上記のように、ある特定の実施形態では、マスキング部分は、リンカー、すなわちペプチドリンカーを含む。一部の実施形態では、リンカーの少なくとも１つは、切断可能リンカー、例えばプロテアーゼ切断部位を含む切断可能リンカーである。一部の実施形態では、リンカーの少なくとも１つは、切断不能リンカー、すなわち生理的に安定なリンカーである。
一部の実施形態では、第１のリンカーおよび／または第２のリンカーは、約１～５０、約１～４０、約１～３０、約１～２０、約１～１０、約１～５、約１～４、約１～３アミノ酸長、または約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、約５０アミノ酸長である。特定の実施形態では、第１のリンカーは切断可能リンカーであり、第２のリンカーは切断不能リンカーである。一部の実施形態では、第１のリンカーは切断不能リンカーであり、第２のリンカーは切断可能リンカーである。
一部の実施形態では、切断可能リンカーは、少なくとも１つのプロテアーゼ切断部位を含む。適したプロテアーゼ切断部位および自己切断ペプチドは、当業者に公知である（例えば、Ryan et al., J. Gener. Virol. 78:699-722, 1997；およびScymczak et al., Nature Biotech. 5:589-594, 2004を参照されたい）。一部の実施形態では、プロテアーゼ切断部位は、メタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、およびアスパラギン酸プロテアーゼのうちの１つまたは複数から選択されるプロテアーゼによって切断可能である。特定の実施形態では、プロテアーゼ切断部位は、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ４、ＭＭＰ５、ＭＭＰ６、ＭＭＰ７、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１２、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１４、ＴＥＶプロテアーゼ、マトリプターゼ、ｕＰＡ、ＦＡＰ、レグマイン、ＰＳＡ、カリクレイン、カテプシンＡ、およびカテプシンＢのうちの１つまたは複数から選択されるプロテアーゼによって切断可能である。
切断可能リンカーの例を以下の表Ｓ４に提供する。
Figure 2022533254000007
Figure 2022533254000008
Figure 2022533254000009
このように、ある特定の実施形態では、切断可能リンカーは、表Ｓ４から選択される。切断可能リンカーの追加の例としては、セリンプロテアーゼ、例えばトロンビン、キモトリプシン、トリプシン、エラスターゼ、カリクレイン、またはサブチリシンによって切断されるアミノ酸配列が挙げられる。トロンビンによって切断可能なアミノ酸配列の例示的な例としては、これらに限定されないが：－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－（配列番号１８５）、－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－、－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ａｓｎ－Ｐｒｏ－（配列番号１８６）、－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｓｅｒ－（配列番号１８７）、－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－（配列番号１８８）、－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－、－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－、および－Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ａｒｇ－が挙げられる。エラスターゼによって切断可能なアミノ酸配列の例示的な例としては、これらに限定されないが：－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｌａ－、－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－（配列番号１８９）、－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－（配列番号１９０）、－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ－（配列番号１９１）、－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－（配列番号１９２）、および－Ａｌａ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－（配列番号１９３）が挙げられる。
切断可能リンカーはまた、マトリクスメタロプロテナーゼ、例えばコラゲナーゼ、ストロメライシン、およびゼラチナーゼによって切断することができるアミノ酸配列も含む。マトリクスメタロプロテナーゼによって切断可能なアミノ酸配列の例示的な例としては、これらに限定されないが；－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｚ－（配列番号１９４）、－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－、Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｚ－（配列番号１９５）、－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｉｌｅ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｚ－（配列番号１９６０、および－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｚ－（配列番号１９７）が挙げられ、式中、ＹおよびＺはアミノ酸である。コラゲナーゼによって切断可能なアミノ酸配列の例示的な例としては、これらに限定されないが：－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｄ－Ａｒｇ－Ｚ－（配列番号１９８）、－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ｚ－（配列番号１９９）、－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－Ｉｌｅ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｔｒｐ－（配列番号２００）、－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｍｅ）－Ｈｉｓ－（配列番号２０１）、－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ａｌａ－（配列番号２０２）、－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｔｒｐ－Ａｌａ－Ａｒｇ－（配列番号２０３）、および－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｔｙｒ－Ｔｒｐ－Ａｌａ－Ａｒｇ－（配列番号２０４）が挙げられ、式中、Ｚはアミノ酸である。ストロメライシンによって切断可能なアミノ酸配列の例示的な例は、－Ｐｒｏ－Ｔｙｒ－Ａｌａ－Ｔｙｒ－Ｔｙｒ－Ｍｅｔ－Ａｒｇ－（配列番号２０５）であり、ゼラチナーゼによって切断可能なアミノ酸配列の例は、－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ｍｅｔ－Ｔｙｒ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ－（配列番号２０６）である。
切断可能リンカーはまた、アンジオテンシン変換酵素によって切断することができるアミノ酸配列、例えば－Ａｓｐ－Ｌｙｓ－Ｐｒｏ－、－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ－Ｐｒｏ－（配列番号２０７）、および－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ－Ｐｒｏ－（配列番号２０８）も含む。切断可能リンカーはまた、カテプシンＢによって分解することができるアミノ酸配列、例えばＶａｌ－Ｃｉｔ、Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－（配列番号２０９）、Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－（配列番号２１０）およびＰｈｅ－Ｌｙｓも含む。
特定の実施形態では、切断可能リンカーは、ｐＨ７．４、２５℃で、例えば生理的ｐＨ、ヒト体温（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ、血清中、所定の組織）で約３０分もしくはそれ未満、約１時間もしくはそれ未満、約２時間もしくはそれ未満、約３時間もしくはそれ未満、約４時間もしくはそれ未満、約５時間もしくはそれ未満、約６時間もしくはそれ未満、約１２時間もしくはそれ未満、約１８時間もしくはそれ未満、約２４時間もしくはそれ未満、約３６時間もしくはそれ未満、約４８時間もしくはそれ未満、約７２時間もしくはそれ未満、または約９６時間もしくはそれ未満の半減期、またはその間の任意の半減期を有する。
典型的に、第１のまたは第２のリンカーのうちの少なくとも１つは切断不能リンカーである。例示的な切断不能リンカーとしては、Maratea et al., Gene 40:39-46, 1985；Murphy et al., PNAS USA. 83:8258-8262, 1986；米国特許第４，９３５，２３３号および米国特許第４，７５１，１８０号に開示されるリンカーが挙げられる。特定の切断不能リンカー配列は、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、および／またはＡｓｎ残基を含有する。他のほぼ中性のアミノ酸、例えばＴｈｒおよびＡｌａもまた、望ましい場合ペプチドリンカー配列に用いてもよい。
ある特定の例示的な切断不能リンカーとしては、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、および／またはＡｓｎ含有リンカーが挙げられ、以下の通りである：［Ｇ］ｘ、［Ｓ］ｘ、［Ｎ］ｘ、［ＧＳ］ｘ、［ＧＧＳ］ｘ、［ＧＳＳ］ｘ、［ＧＳＧＳ］ｘ（配列番号２１１）、［ＧＧＳＧ］ｘ（配列番号２１２）、［ＧＧＧＳ］ｘ（配列番号２１３）、［ＧＧＧＧＳ］ｘ（配列番号２１４）、［ＧＮ］ｘ、［ＧＧＮ］ｘ、［ＧＮＮ］ｘ、［ＧＮＧＮ］ｘ（配列番号２１５）、［ＧＧＮＧ］ｘ（配列番号２１６）、［ＧＧＧＮ］ｘ（配列番号２１７）、［ＧＧＧＧＮ］ｘ（配列番号２１８）リンカー、式中ｘは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０またはそれより大きい。これらおよび関連するアミノ酸の他の組合せは当業者に明らかである。
切断不能リンカーの追加の例としては、以下のアミノ酸配列：Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－（配列番号２１９）；Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－（配列番号２２０）；Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－（配列番号２２１）；Ａｓｐ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｌｙｓ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｌｙｓ－Ａｓｐ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｒｇ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｒｇ－Ａｓｐ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｌｙｓ－（配列番号２２２）；およびＡｓｎ－Ｖａｌ－Ａｓｐ－Ｈｉｓ－Ｌｙｓ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ａｓｎ－Ｔｈｒ－Ｌｙｓ－Ｖａｌ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ－Ａｒｇ－（配列番号２２３）が挙げられる。
切断不能リンカーのさらに非制限的な例としては、ＤＧＧＧＳ（配列番号２２４）；ＴＧＥＫＰ（配列番号２２５）（例えば、Liu et al., PNAS. 94:5525-5530, 1997を参照されたい）；ＧＧＲＲ（配列番号２２６）（Pomerantz et al. 1995）；（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２１４）（Kim et al., PNAS. 93:1156-1160, 1996）；ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＶＤ（配列番号２２７）（Chaudhary et al., PNAS. 87:1066-1070, 1990）；ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号２２８）（Bird et al., Science. 242:423-426, 1988）、ＧＧＲＲＧＧＧＳ（配列番号２２９）；ＬＲＱＲＤＧＥＲＰ（配列番号２３０）；ＬＲＱＫＤＧＧＧＳＥＲＰ（配列番号２３１）；ＬＲＱＫｄ（ＧＧＧＳ）２ＥＲＰ（配列番号２３２）が挙げられる。具体的な実施形態では、リンカーは、３つのグリシン残基を含むＧｌｙ３リンカー配列を含む。特定の実施形態では、フレキシブルリンカーは、ＤＮＡ結合部位およびペプチドそのものの両方をモデリングすることが可能なコンピュータープログラム（Desjarlais & Berg, PNAS. 90:2256-2260, 1993；およびPNAS. 91:11099-11103, 1994）を使用して、またはファージディスプレイ法によって合理的に設計することができる。
一部の実施形態では、リンカーは、免疫グロブリン（Ｉｇ）／抗体ヒンジ領域またはその断片、例えばＩｇＧ１抗体から得たまたはそれに由来するヒンジ領域を含む。一部の実施形態では、用語Ｉｇ「ヒンジ」領域は、必要に応じてジスルフィド結合が免疫グロブリンの２つの重鎖を連結するシステイン残基を含む、天然に存在するＩｇヒンジ領域配列の一部と配列同一性または類似性を共有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。本発明のヒンジ領域リンカーと天然に存在する免疫グロブリンヒンジ領域アミノ酸配列との配列類似性は、少なくとも５０％から約７５～８０％の範囲、および典型的には約９０％より高い類似性であり得る。
一部の実施形態では、リンカーは、切断可能エレメントを切断に関与する酵素により近づきやすくするために、スペーサーエレメントおよび切断可能エレメントを含む。
前述のリンカーの任意の１つまたは複数を、本明細書に記載の結合部分の任意の１つまたは複数と組み合わせて、マスキング部分を形成することができ、これを本明細書に記載のＩＬ－２タンパク質および／またはＩＬ－２結合タンパク質の任意の１つまたは複数と組み合わせて、本開示の活性化可能プロタンパク質を形成することができる。
追加のドメイン。ある特定の活性化可能プロタンパク質は、１つまたは複数の追加のドメイン、例えば結合ドメインを含む（例えば、図２Ｄおよび図９Ａ～９Ｂを参照されたい）。一部の実施形態では、第１のポリペプチドはさらに、第１のマスキング部分の遊離の末端でタンパク質ドメインＡ、および／またはＩＬ－２タンパク質の遊離の末端でタンパク質ドメインＢを含む。一部の実施形態では、第２のポリペプチドはさらに、第２のマスキング部分の遊離の末端でタンパク質ドメインＣ、および／またはＩＬ－２結合タンパク質の遊離の末端でタンパク質ドメインＤを含む。
一部の実施形態では、タンパク質ドメインＡ～Ｄは、同じであるかまたは異なる。特定の実施形態では、タンパク質ドメインＡ～Ｄは、細胞受容体標的化部分、必要に応じて二重特異性標的化部分、抗原結合ドメイン、必要に応じて二重特異性抗原結合ドメイン、細胞膜受容体細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、Ｆｃドメイン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、Ｆｃ結合ドメイン、ＨＳＡ結合ドメイン、サイトカイン、ケモカイン、および可溶性タンパク質リガンドのうちの１つまたは複数から選択される。
一部の実施形態では、１つまたは複数の追加のタンパク質ドメインを使用して、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれより多くの活性化可能プロタンパク質を形成することができ、これらは追加のドメイン（複数可）を介して互いに結合する。そのような複合体の例を図９Ａ～９Ｂに提供する。
活性化可能プロタンパク質およびその予想される切断産物の例示的な例を、以下の表Ｓ５に提供する（実施例も参照されたい）。
Figure 2022533254000010
Figure 2022533254000011
Figure 2022533254000012
Figure 2022533254000013
Figure 2022533254000014
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Figure 2022533254000017
Figure 2022533254000018
Figure 2022533254000019
Figure 2022533254000020
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Figure 2022533254000022
Figure 2022533254000023
Figure 2022533254000024
Figure 2022533254000025
Figure 2022533254000026
Figure 2022533254000027
Figure 2022533254000028
このように、ある特定の実施形態では、活性化可能プロタンパク質は、配列番号９、１３、１７、２１、２５、２９、３３、３７、４１、４５、４９、５３、５７、６１、６５、６９、７３、７７、８１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、または２４５と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる第１のポリペプチド、および配列番号８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、または２４６と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％同一であるアミノ酸配列をそれぞれ含む、それからなる、またはそれから本質的になる第２のポリペプチドを含む。
ある特定の実施形態では、活性化可能プロタンパク質は、配列番号２４７、２５０、２５３、２５６、２５９、または２６２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる第１のポリペプチド、配列番号２４８、２５１、２５４、２５７、または２６３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％同一であるアミノ酸配列をそれぞれ含む、それからなる、またはそれから本質的になる第２のポリペプチド、ならびに配列番号２４９、２５２、２５５、２５８、２６１、または２６４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％同一であるアミノ酸配列をそれぞれ含む、それからなる、またはそれから本質的になる第３および第４のポリペプチド（例えば、免疫グロブリンドメイン、例えば軽鎖可変領域または重鎖可変領域）を含む。具体的な実施形態では、活性化可能プロタンパク質は、目的の抗原、例えば線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合する軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を含む。
ある特定の実施形態では、前述の配列（表Ｓ５からの）の任意の１つまたは複数のＴＥＶプロテアーゼ切断部位を、ヒトプロテアーゼ切断部位、すなわち、ヒトプロテアーゼ、例えばがん組織またはがん細胞において発現されるヒトプロテアーゼによって切断可能な切断部位で置き換える。
使用方法および医薬組成物
ある特定の実施形態は、それを必要とする対象における疾患もしくは状態を処置する、その症状を軽快させる、および／またはその進行を低減する方法であって、本明細書に記載の少なくとも１つの活性化可能プロタンパク質を対象に投与するステップを含む方法を含む。同様に、対象における免疫応答を増強する方法であって、本明細書に記載の少なくとも１つの活性化可能プロタンパク質を対象に投与するステップを含む方法も含まれる。特定の実施形態では、疾患は、がん、ウイルス感染症、および免疫障害のうちの１つまたは複数から選択される。
一部の実施形態では、投与後、活性化可能プロタンパク質は、細胞または組織におけるプロテアーゼによる切断を通して活性化され、これによってプロテアーゼ切断部位を含むマスキング部分が放出され、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで免疫細胞の表面上に存在するＩＬ－２Ｒβ／γｃ鎖に結合するＩＬ－２タンパク質の結合部位を露出し、それによって活性化タンパク質を生成する。特定の実施形態では、プロテアーゼによる切断は、がん細胞もしくはがん組織、またはウイルス感染細胞もしくはウイルス感染組織で起こる。典型的には、活性化タンパク質は、例えばｉｎ ｖｉｖｏで免疫細胞の表面上に存在するＩＬ－２Ｒβ／γｃ鎖に結合することによって、およびそれによって免疫細胞を刺激することによって、少なくとも１つの免疫刺激ＩＬ－２活性を有する。特定の実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、単球、およびマクロファージのうちの１つまたは複数から選択される。
一部の実施形態では、活性化タンパク質を生成するための活性化可能プロタンパク質の投与および活性化は、対象における免疫応答を、対照と比較して、約もしくは少なくとも約５％、約もしくは少なくとも約１０％、約もしくは少なくとも約１５％、約もしくは少なくとも約２０％、約もしくは少なくとも約２５％、約もしくは少なくとも約３０％、約もしくは少なくとも約３５％、約もしくは少なくとも約４０％、約もしくは少なくとも約４５％、約もしくは少なくとも約５０％、約もしくは少なくとも約６０％、約もしくは少なくとも約７０％、約もしくは少なくとも約８０％、約もしくは少なくとも約９０％、約もしくは少なくとも約１００％、約もしくは少なくとも約２００％、約もしくは少なくとも約３００％、約もしくは少なくとも約４００％、約もしくは少なくとも約５００％、約もしくは少なくとも約６００％、約もしくは少なくとも約７００％、約もしくは少なくとも約８００％、約もしくは少なくとも約９００％、約もしくは少なくとも約１０００％、約もしくは少なくとも約２０００％、またはそれより多く増加させる。一部の例では、免疫応答は、抗がんまたは抗ウイルス免疫応答である。一部の実施形態では、活性化タンパク質を生成するための活性化可能プロタンパク質の投与および活性化は、対象における細胞殺滅を、対照と比較して、約もしくは少なくとも約５％、約もしくは少なくとも約１０％、約もしくは少なくとも約１５％、約もしくは少なくとも約２０％、約もしくは少なくとも約２５％、約もしくは少なくとも約３０％、約もしくは少なくとも約３５％、約もしくは少なくとも約４０％、約もしくは少なくとも約４５％、約もしくは少なくとも約５０％、約もしくは少なくとも約６０％、約もしくは少なくとも約７０％、約もしくは少なくとも約８０％、約もしくは少なくとも約９０％、約もしくは少なくとも約１００％、約もしくは少なくとも約２００％、約もしくは少なくとも約３００％、約もしくは少なくとも約４００％、約もしくは少なくとも約５００％、約もしくは少なくとも約６００％、約もしくは少なくとも約７００％、約もしくは少なくとも約８００％、約もしくは少なくとも約９００％、約もしくは少なくとも約１０００％、約もしくは少なくとも約２０００％、またはそれより多く増加させる。一部の実施形態では、細胞殺滅は、がん細胞の殺滅またはウイルス感染細胞の殺滅である。
一部の実施形態では、活性化タンパク質を生成するための活性化可能プロタンパク質の投与および活性化は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）上に発現されるＩＬ－２Ｒα／β／γｃ鎖に対する活性化タンパク質の結合を有意に増加させない。例えば、ある特定の活性化タンパク質において、ＩＬ－２タンパク質とＩＬ－２結合タンパク質との間の結合（例えば、ＩＬ－２タンパク質とＩＬ－２Ｒαタンパク質との間のジスルフィド結合）は、リンカーの切断後に維持され、Ｔｒｅｇ上に発現されるＩＬ－２Ｒα／β／γｃ鎖に結合するＩＬ－２タンパク質の結合部位を隠し、それによってＴｒｅｇに対する活性化タンパク質の結合を妨害する。このように、ある特定の実施形態では、活性化タンパク質は、活性化可能プロタンパク質と比較して、（Ｔｒｅｇ）の増殖および／または活性化を有意に刺激も増強もしない。
一部の実施形態では、疾患はがんであり、すなわちそれを必要とする対象は、がんを有するかまたはがんを有することが疑われる。このため、ある特定の実施形態は、それを必要とする対象におけるがんを処置する、がんの症状を軽快させる、またはがんの進行を阻害する方法であって、本明細書に記載の少なくとも１つの活性化可能プロタンパク質を対象に投与するステップを含む方法を含む。特定の実施形態では、がんは原発がんまたは転移がんである。具体的な実施形態では、がんは、黒色腫（必要に応じて転移性黒色腫）、腎臓がん（必要に応じて腎細胞癌）、膵臓がん、骨がん、前立腺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、中皮腫、白血病（必要に応じてリンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、または再発した急性骨髄性白血病）、多発性骨髄腫、リンパ腫、ヘパトーマ（肝細胞癌）、肉腫、Ｂ細胞悪性腫瘍、乳がん、卵巣がん、結腸直腸がん、神経膠腫、多形性膠芽腫、髄膜腫、下垂体腺腫、前庭神経鞘腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、原始神経外胚葉性腫瘍（髄芽腫）、膀胱がん、子宮がん、食道がん、脳がん、頭頸部がん、子宮頸がん、精巣がん、甲状腺がん、および胃がんのうちの１つまたは複数から選択される。
一部の実施形態では、上記のように、がんは転移がんである。上記のがんに加えて、例示的な転移がんとしては、これらに限定されないが、中でも骨、肝臓、および／または肺に転移している膀胱がん；骨、脳、肝臓、および／または肺に転移している乳がん；肝臓、肺、および／または腹膜に転移している結腸直腸がん；副腎、骨、脳、肝臓、および／または肺に転移している腎臓がん；副腎、骨、脳、肝臓、および／または肺の他の部位に転移している肺がん；骨、脳、肝臓、肺、および／または皮膚／筋肉に転移している黒色腫；肝臓、肺、および／または腹膜に転移している卵巣がん；肝臓、肺、および／または腹膜に転移している膵臓がん；副腎、骨、肝臓、および／または肺に転移している前立腺がん；肝臓、肺、および／または腹膜に転移している胃がん；骨、肝臓、および／または肺に転移している甲状腺がん；ならびに骨、肝臓、肺、腹膜、および／または膣に転移している子宮がんが挙げられる。
がんを処置する方法を、他の治療モダリティと組み合わせることができる。例えば、本明細書に記載の併用療法を、症状に対するケア、放射線療法、手術、移植、ホルモン療法、光線力学的療法、抗生物質療法、またはそのいずれかの組合せを含む他の治療介入の前、間、または後に対象に投与することができる。症状に対するケアは、脳浮腫、頭痛、認知機能障害、および嘔吐を低減するためのコルチコステロイドの投与、ならびに発作を低減するための抗けいれん剤の投与を含む。放射線療法は、全脳照射、分割放射線療法、および放射線手術、例えば定位放射線手術を含み、これらを従来の手術とさらに組み合わせることができる。
このように、ある特定の実施形態は、それを必要とする対象におけるがんを処置する、その症状を軽快させる、またはその進行を阻害する方法を含む、がんを処置するための併用療法であって、本明細書に記載の少なくとも１つの活性化可能プロタンパク質を、少なくとも１つの追加の薬剤、例えば化学療法剤、ホルモン療法剤、および／またはキナーゼ阻害剤と組み合わせて投与するステップを含む併用療法を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの活性化可能プロタンパク質を投与することは、追加の薬剤（例えば、化学療法剤、ホルモン療法剤、およびまたはキナーゼ阻害剤）に対するがんの感受性を、追加の薬剤単独と比較して、約もしくは少なくとも約５％、約もしくは少なくとも約１０％、約もしくは少なくとも約１５％、約もしくは少なくとも約２０％、約もしくは少なくとも約２５％、約もしくは少なくとも約３０％、約もしくは少なくとも約３５％、約もしくは少なくとも約４０％、約もしくは少なくとも約４５％、約もしくは少なくとも約５０％、約もしくは少なくとも約６０％、約もしくは少なくとも約７０％、約もしくは少なくとも約８０％、約もしくは少なくとも約９０％、約もしくは少なくとも約１００％、約もしくは少なくとも約２００％、約もしくは少なくとも約３００％、約もしくは少なくとも約４００％、約もしくは少なくとも約５００％、約もしくは少なくとも約６００％、約もしくは少なくとも約７００％、約もしくは少なくとも約８００％、約もしくは少なくとも約９００％、約もしくは少なくとも約１０００％、約もしくは少なくとも約２０００％、またはそれより多く増強する。
ある特定の併用療法は、１つまたは複数の化学療法剤、例えば、低分子化学療法剤を用いる。化学療法剤の非制限的な例としては、中でもアルキル化剤、抗代謝剤、細胞傷害性抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤（Ｉ型またはＩＩ型）、抗微小管剤が挙げられる。
アルキル化剤の例としては、ナイトロジェンマスタード（例えば、メクロレタミン、シクロホスファミド、ムスチン、メルファラン、クロラムブシル、イホスファミド、およびブスルファン）、ニトロソウレア（例えば、Ｎ－ニトロソ－Ｎ－メチルウレア（ＭＮＵ）、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、セムスチン（ＭｅＣＣＮＵ）、フォテムスチン、およびストレプトゾトシン）、テトラジン（例えば、ダカルバジン、ミトゾロミド、およびテモゾロミド）、アジリジン（例えば、チオテパ、マイトマイシン、およびジアジコン（ＡＺＱ））、シスプラチンおよびその誘導体（例えば、カルボプラチンおよびオキサリプラチン）、ならびに非古典的アルキル化剤（必要に応じてプロカルバジンおよびヘキサメチルメラミン）が挙げられる。
抗代謝剤の例としては、抗葉酸剤（例えば、メトトレキサートおよびペメトレキセド）、フルオロピリミジン（例えば、５－フルオロウラシルおよびカペシタビン）、デオキシヌクレオシドアナログ（例えば、アンシタビン、エノシタビン、シタラビン、ゲムシタビン、デシタビン、アザシチジン、フルダラビン、ネララビン、クラドリビン、クロファラビン、フルダラビン、およびペントスタチン）、およびチオプリン（例えば、チオグアニンおよびメルカプトプリン）が挙げられる。
細胞傷害性抗生物質の例としては、アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ピラルビシン、アクラルビシン、およびミトキサントロン）、ブレオマイシン、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、およびアクチノマイシンが挙げられる。トポイソメラーゼ阻害剤の例としては、カンプトテシン、イリノテカン、トポテカン、エトポシド、ドキソルビシン、ミトキサントロン、テニポシド、ノボビオシン、メルバロン、およびアクラルビシンが挙げられる。
抗微小管剤の例としては、タキサン（例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル）およびビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン）が挙げられる。
本明細書に記載の様々な化学療法剤を、本明細書に記載の活性化可能プロタンパク質の任意の１つまたは複数と組み合わせることができ、本明細書に記載の方法または組成物の任意の１つまたは複数に従って使用することができる。
ある特定の併用療法は、少なくとも１つのホルモン療法剤を用いる。ホルモン療法剤の一般的な例としては、ホルモンアゴニストおよびホルモンアンタゴニストが挙げられる。ホルモンアゴニストの特定の例としては、プロゲストゲン（プロゲスチン）、コルチコステロイド（例えば、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン）、インスリン様成長因子、ＶＥＧＦ由来血管新生因子およびリンパ管新生因子（例えば、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ａ１４５、ＶＥＧＦ－Ａ１６５、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＰＩＧＦ－２）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、ガレクチン、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）－ベータ、アンドロゲン、エストロゲン、ならびにソマトスタチンアナログが挙げられる。ホルモンアンタゴニストの例としては、ホルモン合成阻害剤、例えばそのアナログを含むアロマターゼ阻害剤および性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）アゴニスト（例えば、リュープロリド、ゴセレリン、トリプトレリン、ヒストレリン）が挙げられる。同様に、ホルモン受容体アンタゴニスト、例えば選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ；例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、トレミフェン）および抗アンドロゲン（例えば、フルタミド、ビカルタミド、ニルタミド）が挙げられる。
同様に、ホルモン経路阻害剤、例えばホルモン受容体に対する抗体も含まれる。例としては、ＩＧＦ受容体の阻害剤（例えば、ＩＧＦ－ＩＲ１）、例えばシクスツムマブ、ダロツズマブ、フィギツムマブ、ガニツマブ、イスチラツマブ、およびロバツムマブ；血管内皮成長因子受容体１、２、または３（ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、またはＶＥＧＦＲ３）の阻害剤、例えばアラシズマブペゴル、ベバシズマブ、イクルクマブ、ラムシルマブ；ＴＧＦ－ベータ受容体Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３の阻害剤、例えばフレソリムマブおよびメテリムマブ；ｃ－Ｍｅｔの阻害剤、例えばナキシタマブ；ＥＧＦ受容体の阻害剤、例えばセツキシマブ、デパツキシズマブマホドチン、フツキシマブ、イムガツズマブ、ラプリツキシマブエムタンシン、マツズマブ、モドツキシマブ、ネシツムマブ、ニモツズマブ、パニツムマブ、トムゾツキシマブ、およびザルツムマブ；ＦＧＦ受容体の阻害剤、例えばアプルツマブイキサドチンおよびベマリツズマブ；ならびにＰＤＧＦ受容体の阻害剤、例えばオララツマブおよびトベツマブが挙げられる。
本明細書に記載の様々なホルモン治療剤を、本明細書に記載の様々な活性化可能プロタンパク質の任意の１つまたは複数と組み合わせて、本明細書に記載の方法または組成物の任意の１つまたは複数に従って使用することができる。
ある特定の併用療法は、チロシンキナーゼ阻害剤を含む少なくとも１つのキナーゼ阻害剤を用いる。キナーゼ阻害剤の例としては、これらに限定されないが、アダボセルチブ、アファニチブ、アフリベルセプト、アキシチニブ、ベバシズマブ、ボスチニブ、カボザンチニブ、セツキシマブ、コビメチニブ、クリゾチニブ、ダサチニブ、エントレクチニブ、エルダフィチニブ、エルロチニブ、フォスタマチニブ（fostamitinib）、ゲフィチニブ、イブルチニブ、イマチニブ、ラパチニブ、レンバチニブ、ムブリチニブ、ニロチニブ、パニツムマブ、パゾパニブ、ペガプタニブ、ポナチニブ、ラニビズマブ、レゴラフェニブ、ルキソリチニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、ＳＵ６６５６、トファシチニブ、トラスツズマブ、バンデタニブ、およびベムラフェニブ（vemuafenib）が挙げられる。
本明細書に記載の様々なキナーゼ阻害剤を、本明細書に記載の様々な活性化可能プロタンパク質の任意の１つまたは複数と組み合わせて、本明細書に記載の方法または組成物の任意の１つまたは複数に従って使用することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法および医薬組成物は、対象の生存期間の中央値を４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１５週間、２０週間、２５週間、３０週間、４０週間、またはそれより長く延長する。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法および医薬組成物は、対象の生存期間の中央値を１年、２年、３年、またはそれより長く延長する。一部の実施形態では、方法および医薬組成物は、無増悪生存期間を、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、またはそれより長く延長する。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法および医薬組成物は、無増悪生存期間を１年、２年、３年、またはそれより長く延長する。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法および治療組成物は、生存腫瘍の量の統計学的に有意な減少、例えば腫瘍塊の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、またはそれより多くの減少、または変更された（例えば、統計学的に有意に減少した）スキャン寸法によって示される腫瘍退縮をもたらすために十分である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法および治療組成物は、安定な疾患をもたらすために十分である。
一部の実施形態では、疾患は、ウイルス疾患またはウイルス感染症である。ある特定の実施形態では、ウイルス感染症は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、カリシウイルス関連下痢、ロタウイルス性下痢、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ型肺炎および侵襲性疾患、インフルエンザ、麻疹、ムンプス、風疹、パラインフルエンザ関連肺炎、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）肺炎、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、ヒトパピローマウイルス、単純ヘルペス２型性器潰瘍、デング熱、日本脳炎、ダニ媒介性脳炎、ウエストナイルイルス関連疾患、黄熱病、エプスタインバーウイルス、ラッサ熱、クリミアコンゴ出血熱、エボラ出血熱、マールブルグ出血熱、狂犬病、リフトバレー熱、天然痘、上気道および下気道感染症、ならびに灰白髄炎のうちの１つまたは複数から選択される。具体的な実施形態では、対象はＨＩＶ陽性である。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法および医薬組成物は、抗ウイルス免疫応答を、対照と比較して、約もしくは少なくとも約５％、約もしくは少なくとも約１０％、約もしくは少なくとも約１５％、約もしくは少なくとも約２０％、約もしくは少なくとも約２５％、約もしくは少なくとも約３０％、約もしくは少なくとも約３５％、約もしくは少なくとも約４０％、約もしくは少なくとも約４５％、約もしくは少なくとも約５０％、約もしくは少なくとも約６０％、約もしくは少なくとも約７０％、約もしくは少なくとも約８０％、約もしくは少なくとも約９０％、約もしくは少なくとも約１００％、約もしくは少なくとも約２００％、約もしくは少なくとも約３００％、約もしくは少なくとも約４００％、約もしくは少なくとも約５００％、約もしくは少なくとも約６００％、約もしくは少なくとも約７００％、約もしくは少なくとも約８００％、約もしくは少なくとも約９００％、約もしくは少なくとも約１０００％、約もしくは少なくとも約２０００％、またはそれより多く増加させる。
一部の実施形態では、免疫障害は、１型糖尿病、血管炎、および免疫不全のうちの１つまたは複数から選択される。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法および医薬組成物は、対象における免疫機能を、対照と比較して、例えば約もしくは少なくとも約５％、約もしくは少なくとも約１０％、約もしくは少なくとも約１５％、約もしくは少なくとも約２０％、約もしくは少なくとも約２５％、約もしくは少なくとも約３０％、約もしくは少なくとも約３５％、約もしくは少なくとも約４０％、約もしくは少なくとも約４５％、約もしくは少なくとも約５０％、約もしくは少なくとも約６０％、約もしくは少なくとも約７０％、約もしくは少なくとも約８０％、約もしくは少なくとも約９０％、約もしくは少なくとも約１００％、約もしくは少なくとも約２００％、約もしくは少なくとも約３００％、約もしくは少なくとも約４００％、約もしくは少なくとも約５００％、約もしくは少なくとも約６００％、約もしくは少なくとも約７００％、約もしくは少なくとも約８００％、約もしくは少なくとも約９００％、約もしくは少なくとも約１０００％、約もしくは少なくとも約２０００％、またはそれより多く改善する。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法および治療組成物は、熟練臨床医に公知の特定の疾患兆候の症状の臨床的に適切な低減をもたらすために十分である。
上記のように、ヒトまたは非ヒト哺乳動物疾患の処置または試験のためにｉｎ ｖｉｖｏで使用する場合、本明細書に記載の作用剤は一般的に、投与前に、獣医学での治療組成物を含む１つまたは複数の治療組成物または医薬組成物に一般的に組み入れられる。
このように、ある特定の実施形態は、本明細書に記載の少なくとも１つの活性化可能プロタンパク質を含む医薬組成物または治療組成物に関する。一部の例では、医薬組成物または治療組成物は、薬学的または生理的に許容される担体または賦形剤と組み合わせた本明細書に記載の活性化可能プロタンパク質の１つまたは複数を含む。ある特定の医薬組成物または治療組成物はさらに、少なくとも１つの追加の薬剤、例えば本明細書に記載の化学療法剤、ホルモン療法剤、および／またはキナーゼ阻害剤を含む。
一部の治療組成物は、１つのみの活性化可能プロタンパク質を含む（およびある特定の方法はこれを利用する）。ある特定の治療組成物は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つの異なる活性化可能プロタンパク質の混合物を含む（およびある特定の方法はこれを利用する）。
特定の実施形態では、少なくとも１つの活性化可能プロタンパク質を含む医薬組成物または治療組成物は、タンパク質に基づいてまたは重量－重量に基づいて実質的に純粋であり、例えば組成物は、タンパク質に基づいてまたは重量－重量に基づいて、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の純度を有する。
一部の実施形態では、本明細書に記載の活性化可能プロタンパク質は、当技術分野で公知のように凝集体を形成しない、所望の溶解度を有する、および／またはヒトにおいて使用するのに適した免疫原性プロファイルを有する。このように、一部の実施形態では、活性化可能プロタンパク質を含む治療組成物は、実質的に凝集体を含まない。例えば、ある特定の組成物は、約１０％未満（タンパク質に基づいて）の高分子量凝集タンパク質、または約５％未満の高分子量凝集タンパク質、または約４％未満の高分子量凝集タンパク質、または約３％未満の高分子量凝集タンパク質、または約２％未満の高分子量凝集タンパク質、または約１％未満の高分子量凝集タンパク質を含む。一部の組成物は、その見かけの分子質量に関して、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％単分散である活性化可能プロタンパク質を含む。
一部の実施形態では、活性化可能プロタンパク質は、約もしくは少なくとも約０．１ｍｇ／ｍｌ、約もしくは少なくとも約０．２ｍｇ／ｍｌ、約もしくは少なくとも約０．３ｍｇ／ｍｌ、約もしくは少なくとも約０．４ｍｇ／ｍｌ、約もしくは少なくとも約０．５ｍｇ／ｍｌ、約もしくは少なくとも約０．６、約もしくは少なくとも約０．７、約もしくは少なくとも約０．８、約もしくは少なくとも約０．９、約もしくは少なくとも約１ｍｇ／ｍｌ、約もしくは少なくとも約２ｍｇ／ｍｌ、約もしくは少なくとも約３ｍｇ／ｍｌ、約もしくは少なくとも約４ｍｇ／ｍｌ、約もしくは少なくとも約５ｍｇ／ｍｌ、約もしくは少なくとも約６ｍｇ／ｍｌ、約もしくは少なくとも約７ｍｇ／ｍｌ、約もしくは少なくとも約８ｍｇ／ｍｌ、約もしくは少なくとも約９ｍｇ／ｍｌ、約もしくは少なくとも約１０ｍｇ／ｍｌ、約もしくは少なくとも約１１、約もしくは少なくとも約１２、約もしくは少なくとも約１３、約もしくは少なくとも約１４、または約もしくは少なくとも約１５ｍｇ／ｍｌまで濃縮され、生物療法用途のために製剤化される。
治療組成物または医薬組成物を調製するために、１つまたは複数の作用剤の有効量または所望の量を、特定の作用剤および／または投与様式にとって適切であることが当業者に公知の任意の医薬担体（複数可）または賦形剤と混合する。医薬担体は、液体、半液体、または固体であり得る。非経口、皮内、皮下、または局所的適用のために使用される液剤または懸濁剤としては、例えば、滅菌希釈剤（例えば、水）、食塩水溶液（例えばリン酸緩衝食塩水；ＰＢＳ）、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗菌剤（例えば、ベンジルアルコールおよびメチルパラベン）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸および亜硫酸水素ナトリウム）、およびキレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））；緩衝剤（例えば、酢酸塩、クエン酸塩、およびリン酸塩）が挙げられ得る。静脈内投与される（例えば、ＩＶ注入による）場合、適した担体は、生理食塩水またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ならびに増粘剤および溶解剤、例えばグルコース、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、およびその混合物を含有する溶液を含む。
純粋な形態での、または適切な治療組成物もしくは医薬組成物中の本明細書に記載の作用剤の投与は、類似の有用性を果たすために作用剤の許容される投与様式のいずれかを介して実行することができる。治療組成物または医薬組成物は、作用剤含有組成物を、適切な生理的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせることによって調製することができ、固体、半固体、液体、またはガス様形態の調製物、例えば錠剤、カプセル剤、粉剤・散剤（powder）、顆粒剤、軟膏剤、液剤、坐剤、注射剤、吸入剤、ゲル剤、マイクロスフェア剤、およびエアロゾル剤に製剤化してもよい。加えて、他の薬学的に活性な成分（本明細書の他所で記載される他の低分子を含む）、および／または適した賦形剤、例えば塩、緩衝剤、および安定化剤もまた、組成物内に存在してもよいが、必ずしも存在する必要はない。
投与は、経口、非経口、鼻、静脈内、皮内、筋肉内、皮下、または局所的を含む多様な経路によって達成され得る。好ましい投与様式は、処置または防止される状態の性質に依存する。特定の実施形態はＩＶ注入による投与を含む。
担体は、例えば用いられる投薬量および濃度でそれに曝露される細胞または哺乳動物に対して毒性ではない、薬学的もしくは生理的に許容される担体、賦形剤、または安定化剤を含み得る。しばしば、生理的に許容される担体は、水性ｐＨ緩衝溶液である。生理的に許容される担体の例としては、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、もしくはリシン；単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖アルコール、例えばマンニトールもしくはソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；ならびに／または非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ（登録商標））、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびポロキサマー（ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標））等が挙げられる。
一部の実施形態では、１つまたは複数の薬剤を、例えばコアセルベーション技術または界面重合によって調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセル、およびポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）、コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子、およびナノカプセル）またはマクロエマルションに捕捉することができる。そのような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A., Ed., (1980)に開示されている。粒子またはリポソームは、他の治療剤または診断剤をさらに含み得る。
正確な投薬量および処置の期間は、処置される疾患の関数であり、公知の試験プロトコールを使用して、または当技術分野で公知のモデル系において組成物を試験し、そこから外挿することによって経験的に決定され得る。比較臨床試験もまた実施され得る。投薬量はまた、軽減される状態の重症度によっても変化し得る。医薬組成物は一般的に、望ましくない副作用を最小限にしながら治療的に有用な作用を発揮するように製剤化され、投与される。組成物を１回投与してもよく、または時間間隔を置いて投与されるいくつかのより小さい用量に分割してもよい。任意の特定の対象に関して、具体的な投薬量レジメンは、個体の必要性に応じて経時的に調整され得る。
これらのおよび関連する治療組成物または医薬組成物の典型的な投与経路は、これらに限定されないが、経口、局所的、経皮、吸入、非経口、舌下、頬側、直腸、膣、および鼻腔内を含む。非経口という用語は、本明細書で使用される場合、皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨内注射または注入技術を含む。本開示のある特定の実施形態に従う治療組成物または医薬組成物は、対象または患者への組成物の投与時に、その中に含有される活性成分を生物学的に利用することができるように製剤化される。対象または患者に投与される組成物は、１つまたは複数の投薬単位の形態をとり得、例えば錠剤は単一の投薬単位であり得、エアロゾル形態での本明細書に記載の作用剤の容器は、複数の投薬単位を保持し得る。そのような剤形を調製する実際の方法は、当業者に公知であるか、または明らかであり、例えばRemington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition (Philadelphia College of Pharmacy and Science, 2000)を参照されたい。投与される組成物は典型的には、目的の疾患または状態の処置のために、本明細書に記載の作用剤の治療有効量を含有する。
治療組成物または医薬組成物は、固体または液体の形態であり得る。一実施形態では、担体（複数可）は、微粒子であり、そのため組成物は、例えば錠剤または粉剤・散剤形態である。担体（複数可）は液体であってもよく、この場合、組成物は例えば経口のオイル、注射可能な液体またはエアロゾルであり、これは例えば吸入投与において有用である。経口投与が意図される場合、医薬組成物は、好ましくは固体または液体形態のいずれかであり、半固体、半液体、懸濁液、およびゲルの形態は、固体または液体のいずれかとして本明細書において検討される形態の中に含まれる。ある特定の実施形態は、滅菌注射液剤を含む。
経口投与のための固体組成物として、医薬組成物は、粉剤・散剤、顆粒剤、圧縮錠、丸剤、カプセル剤、ガム剤、ウェハー等に製剤化され得る。そのような固体組成物は典型的に、１つまたは複数の不活性希釈剤または食用担体を含有する。加えて、以下の１つまたは複数が存在してもよい：結合剤、例えばカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、微結晶セルロース、トラガカントゴム、またはゼラチン；賦形剤、例えばデンプン、ラクトース、またはデキストリン、崩壊剤、例えば、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、コーンスターチ等；滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、またはＳｔｅｒｏｔｅｘ；滑剤、例えばコロイド状二酸化ケイ素；甘味料、例えばスクロースまたはサッカリン；香味料、例えばペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ香料；および着色剤。医薬組成物がカプセル剤、例えばゼラチンカプセルの形態である場合、上記のタイプの材料に加えて、液体担体、例えばポリエチレングリコールまたはオイルを含有してもよい。
治療組成物または医薬組成物は、液体の形態、例えばエリキシル剤、シロップ剤、液剤、乳剤、または懸濁剤であり得る。液体は、２つの例として経口投与のためまたは注射による送達のためであり得る。経口投与が意図される場合、好ましい組成物は、本発明の化合物に加えて、甘味料、保存剤、色素／着色料、および香味増強剤のうちの１つまたは複数を含有する。注射によって投与されることが意図される組成物では、界面活性剤、保存剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、緩衝剤、安定化剤、および等張剤のうちの１つまたは複数を含めてもよい。
液体治療組成物または医薬組成物は、それらが溶液、懸濁液、または他の類似の形態であるかどうかによらず、以下の補助剤の１つまたは複数を含み得る：滅菌希釈剤、例えば注射用水、食塩水溶液、好ましくは生理食塩水、リンゲル液、等張塩化ナトリウム、固定油、例えば溶媒または懸濁媒体として役立ち得る合成モノグリセリドまたはジグリセリド、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の溶媒；抗菌剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム、キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸；緩衝剤、例えば酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩、および等張性を調整する剤、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロース。非経口調製物は、アンプル、使い捨てシリンジ、またはガラスもしくはプラスチック製の多用量バイアルに封入することができる。生理食塩水は、好ましい補助剤である。注射用医薬組成物は、好ましくは無菌である。
非経口または経口投与のいずれかが意図される液体の治療組成物または医薬組成物は、適した投薬量が得られるように薬剤の量を含有すべきである。典型的には、この量は、組成物中の目的の薬剤の少なくとも０．０１％である。経口投与が意図される場合、この量は、組成物の重量の０．１～約７０％の間で変動し得る。ある特定の経口治療組成物または医薬組成物は、目的の薬剤の約４％～約７５％を含有する。ある特定の実施形態では、治療組成物または医薬組成物および調製物は、非経口投薬単位が希釈前に目的の薬剤の０．０１～１０重量％を含有するように調製される。
治療組成物または医薬組成物は、局所的投与が意図されてもよく、この場合、担体はふさわしくは溶液、エマルション、軟膏、またはゲル基剤を含み得る。例えば基剤は、以下の１つまたは複数を含み得る：ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、ミツロウ、鉱物油、希釈剤、例えば水およびアルコール、ならびに乳化剤および安定化剤。増粘剤は、局所的投与のための治療組成物または医薬組成物に存在してもよい。経皮投与が意図される場合、組成物は、経皮パッチまたはイオントフォレーシスデバイスを含み得る。
治療組成物または医薬組成物は、例えば直腸内で融解して薬物を放出する坐剤の形態での直腸投与が意図され得る。直腸内投与のための組成物は、適した非刺激性賦形剤としての油性基剤を含有し得る。そのような基剤としては、これらに限定されないが、ラノリン、ココアバター、およびポリエチレングリコールが挙げられる。
治療組成物または医薬組成物は、固体または液体投薬単位の物理的形態を改変する様々な材料を含み得る。例えば、組成物は、活性成分周囲にコーティングシェルを形成する材料を含み得る。コーティングシェルを形成する材料は、典型的には不活性であり、例えば糖、シェラック、および他の腸溶コーティング剤から選択され得る。あるいは、活性成分をゼラチンカプセルに封入してもよい。固体または液体形態の治療組成物または医薬組成物は、作用剤に結合し、それによって化合物の送達を補助する構成成分を含み得る。この能力において作用し得る適した構成成分は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、１つまたは複数のタンパク質またはリポソームを含む。
治療組成物または医薬組成物は、エアロゾルとして投与することができる投薬単位から本質的になり得る。エアロゾルという用語は、コロイド性質の系から加圧包装からなる系に及ぶ多様な系を指すために使用される。送達は、液化もしくは加圧ガスによって、または活性成分を分配する適したポンプ系によって行われ得る。エアロゾルは、活性成分（複数可）を送達するために単相、二相、または三相系で送達され得る。エアロゾルの送達は、必要な容器、アクチベーター、バルブ、サブ容器等を含み、これらは一緒になってキットを形成し得る。当業者は、過度の実験を行うことなく、好ましいエアロゾルを決定し得る。
本明細書に記載の組成物は、持続放出製剤またはコーティングなどの、体からの迅速な排泄に対して作用剤を保護する担体を用いて調製され得る。そのような担体は、埋込物および微小封入送達系、および生物分解性、生物適合性のポリマー、例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、ポリオルトエステル、ポリ乳酸、および当業者に公知の他のものなどの、しかしこれらに限定されない制御放出製剤を含む。
治療組成物または医薬組成物は、薬学的技術分野で周知の方法論によって調製され得る。例えば、注射によって投与されることが意図される治療組成物または医薬組成物は、溶液を形成するために、滅菌蒸留水と共に塩、緩衝剤、および／または安定化剤のうちの１つまたは複数を含み得る。均一な溶液または懸濁液の形成を容易にするために、界面活性剤を添加してもよい。界面活性剤は、水性送達系において作用剤の溶解または均一な懸濁を容易にするために、作用剤と非共有結合により相互作用する化合物である。
治療組成物または医薬組成物は、治療有効量で投与され得るが、これは用いられる具体的な化合物の活性；化合物の代謝安定性および作用期間；対象の年齢、体重、全身健康、性別、および食事；投与様式および投与時間；排泄速度；薬物の組合せ；特定の障害または状態の重症度；ならびに治療を受けている対象を含む多様な要因に応じて変動する。一部の例では、治療的に有効な日用量は、（７０ｋｇの哺乳動物の場合）約０．００１ｍｇ／ｋｇ（すなわち、約０．０７ｍｇ）～約１００ｍｇ／ｋｇ（すなわち、約７．０ｇ）であり；好ましくは、治療有効用量は（７０ｋｇの哺乳動物の場合）約０．０１ｍｇ／ｋｇ（すなわち、約０．７ｍｇ）～約５０ｍｇ／ｋｇ（すなわち、約３．５ｇ）であり；より好ましくは、治療有効用量は、（７０ｋｇの哺乳動物の場合）約１ｍｇ／ｋｇ（すなわち、約７０ｍｇ）～約２５ｍｇ／ｋｇ（すなわち、約１．７５ｇ）である。一部の実施形態では、治療有効用量は、毎週、隔週、または毎月投与される。具体的な実施形態では、治療有効用量は、例えば約１～１０ｍｇ／ｋｇもしくは約１～５ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、もしくは約１０ｍｇ／ｋｇの用量で毎週、隔週、または毎月投与される。
本明細書に記載の併用療法は、活性化可能プロタンパク質および追加の治療剤（例えば、化学療法剤、ホルモン療法剤、キナーゼ阻害剤）を含有する単一の医薬投与製剤の投与、ならびにそれ自身の個別の医薬投与製剤中に活性化可能プロタンパク質および追加の治療剤を含む組成物の投与を含み得る。例えば、活性化可能プロタンパク質および追加の治療剤は、単一の経口投与組成物、例えば錠剤もしくはカプセル剤で一緒に対象に投与することができるか、または各作用剤を個別の経口投与製剤で投与することができる。同様に、活性化可能プロタンパク質および追加の治療剤を、単一の非経口投与組成物、例えば食塩水溶液もしくは他の生理的に許容される溶液中で共に対象に投与することができるか、または各作用剤を個別の非経口投与製剤で投与することができる。別の例として、細胞に基づく治療に関して、活性化可能プロタンパク質を投与前に細胞と混合する、個別の組成物の一部として投与する、またはその両方を行うことができる。個別の投与製剤を使用する場合、組成物を本質的に同じ時間、すなわち併せて、または個々に交互の時間に、すなわち連続的および任意の順序で投与することができ；併用療法は、これらの全てのレジメンを含むと理解される。
同様に、（ａ）本明細書に記載の少なくとも１つの活性化可能プロタンパク質；および必要に応じて（ｂ）少なくとも１つの追加の薬剤（例えば、化学療法剤、ホルモン療法剤、キナーゼ阻害剤）を含む患者のケアキットも含まれる。ある特定のキットでは、（ａ）および（ｂ）は、個別の治療組成物に存在する。一部のキットでは、（ａ）および（ｂ）は同じ治療組成物に存在する。
本明細書に記載のキットはまた、処置される適応症にとってまたは望ましい診断用途にとって、適したまたは望ましい１つまたは複数の追加の治療剤または他の構成成分も含み得る。本明細書に記載のキットはまた、意図される送達様式を容易にするために必要なまたは望ましい１つまたは複数のシリンジまたは他の構成成分（例えば、ステント、植込み型デポー等）も含み得る。
一部の実施形態では、患者のケアキットは、組成物（複数可）および情報資料（複数可）のための個別の容器、仕切り、または区画を含有する。例えば、組成物（複数可）は、ボトル、バイアル、またはシリンジに含有され、情報資料（複数可）を容器に付随して含有することができる。一部の実施形態では、キットの個別の要素は、単一の仕切りのない容器内に含有される。例えば、組成物は、情報資料がラベルの形態でそれに添付されているボトル、バイアル、またはシリンジに含有される。一部の実施形態では、キットは、複数の（例えば、パックの）個々の容器を含み、各々は活性化可能プロタンパク質の１つまたは複数の単位剤形（例えば、本明細書に記載の剤形）および必要に応じて少なくとも１つの追加の治療剤を含有する。例えば、キットは、各々が単一単位用量の活性化可能プロタンパク質および必要に応じて少なくとも１つの追加の治療剤を含有する、複数のシリンジ、アンプル、ホイルパケット、またはブリスターパックを含む。キットの容器は、気密性、防水性（例えば、水分の変化または蒸発に対して不透過性）、および／または遮光性であり得る。
患者ケアキットは、必要に応じて組成物の投与に適したデバイス、例えばシリンジ、吸入器、点滴器（例えば、点眼器）、スワブ（例えば、綿棒または木製スワブ）、または任意のそのような送達デバイスを含む。一部の実施形態では、デバイスは、作用剤（複数可）の一定用量を分配する植込み型デバイスである。同様に、例えば本明細書に記載の構成成分を組み合わせることによって、キットを提供する方法も含まれる。
発現および精製系
ある特定の実施形態は、本明細書に記載の活性化可能プロタンパク質を発現させるおよび精製するための方法および関連組成物を含む。そのような組換え活性化可能プロタンパク質は、例えばSambrook, et al., （1989、上記）、特に１６および１７章；Ausubel et al., （1994、上記）、特に１０および１６章；ならびにColigan et al., Current Protocols in Protein Science (John Wiley & Sons, Inc. 1995-1997)、特に１、５および６章に記載されている標準的なプロトコールを使用して、簡便に調製することができる。１つの一般的な例として、活性化可能プロタンパク質は、以下のステップ：（ａ）１つまたは複数の調節エレメントに作動可能に連結した、第１のポリペプチド（すなわち、ＩＬ－２タンパク質およびマスキング部分を含む第１のポリペプチド鎖）、および第２のポリペプチド（すなわち、ＩＬ－２結合タンパク質およびマスキング部分を含む第２のポリペプチド鎖）をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチド配列を含む１つまたは複数のベクターまたは構築物を調製するステップ；（ｂ）１つまたは複数のベクターまたは構築物を１つまたは複数の宿主細胞に導入するステップ；（ｃ）１つまたは複数の宿主細胞を培養して、互いに結合して活性化可能プロタンパク質を形成する第１および第２のポリペプチドを発現させるステップ；ならびに（ｄ）宿主細胞から活性化可能プロタンパク質を単離するステップ、の１つまたは複数を含む手順によって調製され得る。あるいは、第１および第２のポリペプチドを個別の宿主細胞において産生させ、個々に単離した後、組み合わせて活性化可能プロタンパク質を形成することができる。
所望のポリペプチドを発現させるために、活性化可能プロタンパク質の第１および／または第２のポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を、適切な発現ベクター、すなわち、挿入されたコード配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含有するベクターに挿入してもよい。当業者に周知の方法を使用して、目的のポリペプチドをコードする配列ならびに適切な転写および翻訳制御エレメントを含有する発現ベクターを構築してもよい。これらの方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子組換えを含む。そのような技術は、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989)、およびAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1989)に記載されている。
多様な発現ベクター／宿主系が公知であり、ポリヌクレオチド配列を含有および発現させるために利用され得る。これらとしては、これらに限定されないが、微生物、例えば組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターによって形質転換された細菌；酵母発現ベクターによって形質転換された酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）によって、もしくは細菌発現ベクター（例えば、ＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）によって形質転換した植物細胞系；または哺乳動物細胞およびより具体的にはヒト細胞系を含む動物細胞系が挙げられる。
発現ベクターに存在する「制御エレメント」または「調節配列」は、転写および翻訳を実行するために宿主細胞タンパク質と相互作用するベクターの非翻訳領域、すなわちエンハンサー、プロモーター、５’および３’非翻訳領域である。そのようなエレメントは、その強度および特異性が異なり得る。利用されるベクター系および宿主に応じて、構成的および誘導型プロモーターを含む任意の数の適した転写および翻訳エレメントを使用してもよい。例えば、細菌系においてクローニングする場合、誘導型プロモーター、例えばＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴファージミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）またはＰＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍｄ．）のハイブリッドｌａｃＺプロモーター等を使用してもよい。哺乳動物細胞系では、哺乳動物遺伝子からのまたは哺乳動物ウイルスからのプロモーターが一般的に好ましい。ポリペプチドをコードする配列の複数のコピーを含有する細胞系を生成する必要がある場合、ＳＶ４０またはＥＢＶに基づくベクターは、適切な選択可能マーカーと共に都合よく使用され得る。
細菌系では、発現されるポリペプチドが意図された使用に応じて、いくつかの発現ベクターを選択してもよい。例えば、大量に必要である場合、容易に精製される融合タンパク質の高レベル発現を方向付けるベクターを使用してもよい。そのようなベクターとしては、これらに限定されないが、多機能のＥ．ｃｏｌｉクローニングおよび発現ベクター、例えば目的のポリペプチドをコードする配列がアミノ末端Ｍｅｔの配列とその後のβ－ガラクトシダーゼの７残基とインフレームでベクターにライゲーションされ、ハイブリッドタンパク質が産生され得るＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐＩＮベクター（Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 264:5503 5509 (1989)）等が挙げられる。ｐＧＥＸベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）もまた、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させるために使用され得る。一般的に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン－アガロースビーズに吸着させた後、遊離のグルタチオンの存在下で溶出させることによって、溶解した細胞から容易に精製することができる。そのような系で作製されたタンパク質を、目的のクローニングされたポリペプチドをＧＳＴ部分から意のままに放出させることができるように、ヘパリン、トロンビン、またはＸＡ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計してもよい。
ある特定の実施形態は、Ｅ．ｃｏｌｉに基づく発現系（例えば、Structural Genomics Consortium et al., Nature Methods. 5:135-146, 2008を参照されたい）を用いる。これらおよび関連する実施形態は、適した発現ベクターを産生するためにライゲーション非依存性クローニング（ＬＩＣ）に部分的または完全に依存し得る。具体的な実施形態では、タンパク質発現は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ｐＥＴベクターシリーズ）によって制御され得る。これらおよび関連する実施形態は、発現宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）、すなわちＴ７媒介発現を支持し、標的タンパク質の安定性を改善させるためにｌｏｎおよびｏｍｐＴプロテアーゼが欠損しているＢＬ２１のλＤＥ３溶原菌を利用してもよい。同様に、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてまれに使用されるｔＲＮＡをコードするプラスミドを有する発現宿主株、例えばＲＯＳＥＴＴＡ（商標）（ＤＥ３）およびＲｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）株も含まれる。細胞の溶解および試料の取り扱いはまた、商標ＢＥＮＺＯＮＡＳＥ（登録商標）ヌクレアーゼおよびＢＵＧＢＵＳＴＥＲ（登録商標）タンパク質抽出試薬として販売される試薬を使用して改善され得る。細胞培養に関して、自己誘導培地は、ハイスループット発現系を含む多くの発現系の効率を改善することができる。このタイプの培地（例えば、ＯＶＥＲＮＩＧＨＴ ＥＸＰＲＥＳＳ（商標）自己誘導システム）は、ＩＰＴＧなどの人工誘導剤を添加することなく、代謝シフトを通してタンパク質発現を徐々に誘発する。特定の実施形態は、ヘキサヒスチジンタグ（例えば、商標ＨＩＳ・ＴＡＧ（登録商標）融合体として販売されるタグ）の後に固定された金属アフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）精製または関連技術を用いる。しかし、ある特定の態様では、臨床等級のタンパク質を、アフィニティタグを使用することなく（without or without）、Ｅ．ｃｏｌｉ封入体から単離することができる（例えば、Shimp et al., Protein Expr Purif. 50:58-67, 2006を参照されたい）。さらなる例として、ある特定の実施形態は、低温でのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおけるタンパク質の過剰発現が、その溶解度および安定性を改善することから、寒冷ショック誘導Ｅ．ｃｏｌｉ高収量産生系を用いてもよい（例えば、Qing et al., Nature Biotechnology. 22:877-882, 2004を参照されたい）。
同様に、高密度細菌発酵系も含まれる。例えば、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａの高細胞密度培養は、１５０ｇ／Ｌを超える細胞密度でのタンパク質産生を可能にし、組換えタンパク質は、１０ｇ／Ｌを超える力価で発現される。
酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでは、構成的または誘導型プロモーター、例えばアルファ因子、アルコールオキシダーゼ、およびＰＧＨを含有するいくつかのベクターを使用してもよい。総説に関しては、Ausubel et al. （上記）およびGrant et al., Methods Enzymol. 153:516-544 (1987)を参照されたい。同様に、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｎｄｏｒｉｓ発現系（例えば、Li et al., Nature Biotechnology. 24, 210-215, 2006；およびHamilton et al., Science, 301:1244, 2003を参照されたい）も含まれる。ある特定の実施形態は、中でもヒト化されたＮ－グリコシル化経路を有する酵母を含む、タンパク質を選択的にグリコシル化するように操作された酵母系を含む（例えば、Hamilton et al., Science. 313:1441-1443, 2006；Wildt et al., Nature Reviews Microbiol. 3:119-28, 2005；およびGerngross et al., Nature-Biotechnology. 22:1409 -1414, 2004；米国特許第７，６２９，１６３号；第７，３２６，６８１号；および第７，０２９，８７２号を参照されたい）。単なる例として、組換え酵母培養物を、中でもＦｅｒｎｂａｃｈフラスコまたは１５Ｌ、５０Ｌ、１００Ｌ、および２００Ｌ発酵槽で成長させることができる。
植物発現ベクターを使用する場合、ポリペプチドをコードする配列の発現は、いくつかのプロモーターのいずれかによって駆動され得る。例えば、ウイルスプロモーター、例えばＣａＭＶの３５Ｓおよび１９Ｓプロモーターを単独で、またはＴＭＶからのオメガリーダー配列と組み合わせて使用してもよい（Takamatsu, EMBO J. 6:307-311 (1987)）。あるいは、植物プロモーター、例えばＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットまたは熱ショックプロモーターを使用してもよい（Coruzzi et al., EMBO J. 3:1671-1680 (1984)；Broglie et al., Science 224:838-843 (1984)；およびWinter et al., Results Probl. Cell Differ. 17:85-105 (1991)）。これらの構築物を、直接ＤＮＡ形質転換または病原体媒介トランスフェクションによって植物細胞に導入することができる。そのような技術は、一般的に利用可能ないくつかの総説に記載されている（例えば、Hobbs in McGraw Hill, Yearbook of Science and Technology, pp. 191-196 (1992)を参照されたい）。
昆虫系もまた、目的のポリペプチドを発現させるために使用され得る。例えば１つのそのような系では、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多核体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）をベクターとして使用して、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ細胞において外来遺伝子を発現させる。ポリペプチドをコードする配列を、ウイルスの非必須領域、例えばポリへドリン遺伝子にクローニングし、ポリへドリンプロモーターの制御下に置く。ポリペプチドコード配列の挿入が成功すれば、ポリへドリン遺伝子は不活性となり、コートタンパク質を欠如する組換えウイルスを産生する。次に、組換えウイルスを使用して、例えば、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ細胞に感染させ、目的のポリペプチドを発現させてもよい（Engelhard et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:3224-3227 (1994)）。同様に、ＳＦ９、ＳＦ２１、およびＴ．ｎｉ細胞を利用する系を含むバキュロウイルス発現系（例えば、Murphy and Piwnica-Worms, Curr Protoc Protein Sci. Chapter 5:Unit5.4, 2001を参照されたい）も含まれる。昆虫系は、哺乳動物系と類似の翻訳後修飾を提供することができる。
哺乳動物宿主細胞では、いくつかのウイルスに基づく発現系が一般的に利用可能である。例えば、アデノウイルスを発現ベクターとして使用する場合、目的のポリペプチドをコードする配列を、後期プロモーターおよび三分節（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー配列からなるアデノウイルス転写／翻訳複合体にライゲーションしてもよい。ウイルスゲノムの非必須Ｅ１またはＥ３領域における挿入を使用して、感染した宿主細胞においてポリペプチドを発現させることが可能な生存ウイルスを得てもよい（Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:3655-3659 (1984)）。加えて、転写エンハンサー、例えばラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーを使用して、哺乳動物宿主細胞において発現を増加させてもよい。
有用な哺乳動物宿主細胞系の例としては、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎ＣＶ１細胞系（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胎児腎細胞系（２９３または浮遊培養で成長させるためにサブクローニングした２９３細胞、Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)）；ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)）；サル腎細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲ１細胞（Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)）；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒトヘパトーマ系（Ｈｅｐ Ｇ２）が挙げられる。他の有用な哺乳動物宿主細胞系としては、ＤＨＦＲ－ＣＨＯ細胞を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Urlaub et al., PNAS USA 77:4216 (1980)）；ならびに骨髄腫細胞系、例えばＮＳＯおよびＳｐ２／０が挙げられる。タンパク質産生に適したある特定の哺乳動物宿主細胞系の総説に関して、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K.C Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), pp. 255-268を参照されたい。ある特定の好ましい哺乳動物細胞発現系は、ＣＨＯおよびＨＥＫ２９３細胞に基づく発現系を含む。哺乳動物発現系は、当技術分野で公知の中でも、例えばＴ－フラスコ、ローラーボトル、もしくは細胞工場における接着細胞系、または例えば１Ｌおよび５Ｌスピナー、５Ｌ、１４Ｌ、４０Ｌ、１００Ｌ、および２００Ｌ攪拌タンクバイオリアクター、もしくは２０／５０Ｌおよび１００／２００Ｌ ＷＡＶＥバイオリアクターにおける浮遊培養を利用することができる。
同様に、タンパク質の無細胞発現も含まれる。これらおよび関連する実施形態は、典型的には精製されたＲＮＡポリメラーゼ、リボソーム、ｔＲＮＡおよびリボヌクレオチドを利用する；これらの試薬は、細胞からまたは細胞に基づく発現系からの抽出によって産生され得る。
具体的な開始シグナルもまた、目的のポリペプチドをコードする配列のより効率的な翻訳を達成するために使用され得る。そのようなシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接する配列を含む。ポリペプチドをコードする配列、その開始コドン、および上流の配列が適切な発現ベクターに挿入されている場合、追加の転写または翻訳制御シグナルは必要ではない。しかし、コード配列またはその一部のみを挿入する場合、ＡＴＧ開始コドンを含む外因性の翻訳制御シグナルを提供すべきである。さらに、開始コドンは、インサート全体の翻訳を確実にするために正しいリーディングフレームにあるべきである。外因性の翻訳エレメントおよび開始コドンは、天然および合成の両方の様々な起源のものであり得る。発現効率は、文献に記載されるエンハンサーなどの、使用される特定の細胞系にとって適切なエンハンサーを含めることによって増強され得る（Scharf. et al., Results Probl. Cell Differ. 20:125-162 (1994)）。
加えて、宿主細胞株を、それが挿入された配列の発現をモジュレートする能力または発現されたタンパク質を所望の様式で処理する能力に関して選択してもよい。ポリペプチドのそのような改変としては、これらに限定されないが、翻訳後改変、例えばアセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質付加、およびアシル化が挙げられる。タンパク質の「プレプロ」型を切断する翻訳後プロセシングもまた、正確な挿入、フォールディング、および／または機能を容易にするために使用され得る。細菌細胞に加えて、そのような翻訳後活性のための特異的細胞機構および特徴的機序を有するまたは欠如する異なる宿主細胞、例えば酵母、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、およびＷ１３８を選択して、外来タンパク質の正確な修飾およびプロセシングを確実にしてもよい。
組換えタンパク質を長期間、高収率で産生するためには、安定な発現が一般的に好ましい。例えば、目的のポリヌクレオチドを安定に発現する細胞系を、同じまたは個別のベクター上にウイルスの複製開始点および／または内因性の発現エレメントおよび選択可能なマーカー遺伝子を含有し得る発現ベクターを使用して形質転換してもよい。ベクターの導入後、細胞を富化培地中で約１～２日間成長させた後、培地を選択培地に切り替えてもよい。選択可能マーカーの目的は、選択に対する抵抗性を付与することであり、その存在によって、導入された配列の発現に成功した細胞の成長および回収が可能となる。安定に形質転換された細胞の抵抗性クローンを、細胞タイプにとって適切な組織培養技術を使用して増殖させてもよい。例えば一過性のトランスフェクションまたは感染による一過性の産生も、同様に用いることができる。一過性の産生に適した例示的な哺乳動物発現系は、ＨＥＫ２９３およびＣＨＯに基づく系を含む。
任意の数の選択系を使用して、形質転換または形質導入された細胞系を回収してもよい。これらとしては、これらに限定されないが、それぞれ、ｔｋ－またはａｐｒｔ－細胞において用いることができる単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wigler et al., Cell 11:223-232 (1977)）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowy et al., Cell 22:817-823 (1990)）遺伝子が挙げられる。同様に、代謝拮抗剤、抗生物質、または除草剤抵抗性；例えば、メトトレキサートに対する抵抗性を付与するｄｈｆｒ（Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77:3567-70 (1980)）；アミノグリコシドであるネオマイシンおよびＧ－４１８に対する抵抗性を付与するｎｐｔ（Colbere-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150:1-14 (1981)）；ならびにクロルスルフロンおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する抵抗性をそれぞれ付与するａｌｓまたはｐａｔ（Ｍｕｒｒｙ、上記）を選択の基礎として使用することができる。追加の選択可能遺伝子、例えば、トリプトファンの代わりにインドールを細胞に利用させるｔｒｐＢ、またはヒスチジンの代わりにヒスチノールを細胞に利用させるｈｉｓＤ（Hartman & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:8047-51 (1988)）が記載されている。可視マーカーの使用は、普及してきており、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）および他の蛍光タンパク質（例えば、ＲＦＰ、ＹＦＰ）、アントシアニン、β－グルクロニダーゼおよびその基質ＧＵＳ、ならびにルシフェラーゼおよびその基質ルシフェリンなどのマーカーは、形質転換体を同定するためのみならず、特異的ベクター系に起因する一過性または安定なタンパク質発現量を定量するためにも広く使用されている（例えば、Rhodes et al., Methods Mol. Biol. 55:121-131 (1995)を参照されたい）。
同様に、ハイスループットタンパク質産生系またはマイクロ産生系も含まれる。ある特定の態様は、例えば、金属キレート改変スライド表面またはＭａｇｎｅＨｉｓ Ｎｉ粒子上のタンパク質発現および精製のためにヘキサヒスチジン融合タグを利用してもよい（例えば、Kwon et al., BMC Biotechnol. 9:72, 2009；およびLin et al., Methods Mol Biol. 498:129-41, 2009を参照されたい）。同様に、ハイスループット無細胞タンパク質発現系も含まれる（例えば、Sitaraman et al., Methods Mol Biol. 498:229-44, 2009を参照されたい）。
産物に対して特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体などの結合剤または抗体を使用して、ポリヌクレオチドコード産物の発現を検出および測定するための多様なプロトコールが、当技術分野で公知である。例としては、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンイムノブロット、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）が挙げられる。これらおよび他のアッセイは、中でもHampton et al., Serological Methods, a Laboratory Manual (1990)およびMaddox et al., J. Exp. Med. 158:1211-1216 (1983)に記載される。
広く多様な標識およびコンジュゲーション技術が当業者に公知であり、様々な核酸およびアミノ酸アッセイにおいて使用され得る。ポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための標識されたハイブリダイゼーションまたはＰＣＲプローブを産生する手段は、標識されたヌクレオチドを使用するオリゴ標識、ニックトランスレーション、末端標識またはＰＣＲ増幅を含む。あるいは、配列またはその任意の部分を、ｍＲＮＡプローブの産生のためにベクターにクローニングしてもよい。そのようなベクターは、当技術分野で公知であり、市販されており、これらを使用して、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６などの適切なＲＮＡポリメラーゼおよび標識ヌクレオチドの添加によってｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブを合成してもよい。これらの手順は、多様な市販のキットを使用して実施してもよい。使用され得る適したレポーター分子または標識としては、放射性核種、酵素、蛍光、化学発光、または発色剤、および基質、補因子、阻害剤、磁性粒子等が挙げられる。
目的の１つまたは複数のポリヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培養からのタンパク質の発現および回収に適した条件下で培養され得る。ある特定の具体的な実施形態は、無血清細胞発現系を利用する。例としては、無血清培地中で成長することができるＨＥＫ２９３細胞およびＣＨＯ細胞が挙げられる（例えば、Rosser et al., Protein Expr. Purif. 40:237-43, 2005；および米国特許第６，２１０，９２２号を参照されたい）。
組換え細胞によって産生される活性化可能プロタンパク質は、使用される配列および／またはベクターに応じて分泌され得るか、または細胞内に含有され得る。当業者によって理解されるように、ポリヌクレオチドを含有する発現ベクターは、原核細胞膜または真核細胞膜を通してコードされたポリペプチドの分泌を方向付けるシグナル配列を含有するように設計され得る。他の組換え構築を使用して、可溶性タンパク質の精製および／または検出を容易にするポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列に、目的のポリペプチドをコードする配列を連結してもよい。そのようなドメインの例としては、切断可能および切断不能なアフィニティ精製およびエピトープタグ、例えばアビジン、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジンタグ（例えば、６×Ｈｉｓ）、ｃＭｙｃタグ、Ｖ５タグ、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグなどが挙げられる。
組換え細胞によって産生されたタンパク質は、当業者に公知の多様な技術に従って精製および特徴付けすることができる。タンパク質精製を実施するためおよびタンパク質純度を分析するための例示的な系は、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）（例えば、ＡＫＴＡおよびＢｉｏ－Ｒａｄ ＦＰＬＣ系）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（例えば、ＢｅｃｋｍａｎおよびＷａｔｅｒｓ ＨＰＬＣ）が挙げられる。精製のための例示的な化学としては、当技術分野で公知の中でも、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、Ｑ、Ｓ）、サイズ排除クロマトグラフィー、塩勾配、アフィニティ精製（例えば、Ｎｉ、Ｃｏ、ＦＬＡＧ、マルトース、グルタチオン、プロテインＡ／Ｇ）、ゲル濾過、逆相、セラミックＨＹＰＥＲＤ（登録商標）イオン交換クロマトグラフィー、および疎水性相互作用カラム（ＨＩＣ）が挙げられる。同様に、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（例えば、クマシー、銀染色）、イムノブロット、ブラッドフォード、およびＥＬＩＳＡなどの分析法も含まれ、これらは、典型的にはタンパク質組成物の純度を測定するために、産生または精製プロセスのいずれかのステップの間に利用され得る。
同様に、活性化可能プロタンパク質を濃縮する方法、および濃縮された可溶性の活性化可能プロタンパク質を含む組成物も含まれる。一部の態様では、少なくとも１つの（at least tone）活性化可能プロタンパク質のそのような濃縮溶液は、約もしくは少なくとも約５ｍｇ／ｍＬ、約もしくは少なくとも約８ｍｇ／ｍＬ、約もしくは少なくとも約１０ｍｇ／ｍＬ、約もしくは少なくとも約１５ｍｇ／ｍＬ、約もしくは少なくとも約２０ｍｇ／ｍＬ、またはそれより高い濃度でタンパク質を含む。
一部の態様では、そのような組成物は、実質的に単分散であり得、このことは、活性化可能プロタンパク質が、例えばサイズ排除クロマトグラフィー、動的光散乱、または分析用超遠心分離によって評価した場合に、１つの見かけの分子量形態で主に（すなわち、少なくとも約９０％またはそれより多く）存在することを意味する。
一部の態様では、そのような組成物は、少なくとも約９０％の純度（タンパク質に基づいて）、または一部の態様では少なくとも約９５％の純度、または一部の実施形態では、少なくとも９８％の純度を有する。純度は、当技術分野で公知の任意の日常的な分析方法を介して決定され得る。
一部の態様では、そのような組成物は、存在するタンパク質の全量と比較して、約１０％未満の高分子量凝集体含有量を有するか、または一部の実施形態ではそのような組成物は、約５％未満の高分子量凝集体含有量を有するか、または一部の態様ではそのような組成物は約３％未満の高分子量凝集体含有量を有するか、または一部の実施形態ではそのような組成物は約１％未満の高分子量凝集体含有量を有する。高分子量凝集体含有量は、例えばサイズ排除クロマトグラフィー、動的光散乱、または分析用超遠心分離を含む多様な分析技術を介して決定され得る。
本明細書に企図される濃縮アプローチの例としては凍結乾燥を含み、これは、溶液が目的のタンパク質以外に少しの可溶性構成成分を含有する場合に典型的に用いられる。凍結乾燥はしばしば、ＨＰＬＣのラン後に実施され、混合物からほとんどまたは全ての揮発性成分を除去することができる。同様に、タンパク質溶液を濃縮するために１つまたは複数の選択的透過性膜を典型的に用いる、超遠心分離技術も含まれる。膜は、水および低分子を通過させ、タンパク質を保持する；溶液を、他の技術の中でも機械的ポンプ、ガス圧、または遠心分離によって膜に押しつけることができる。
ある特定の実施形態では、組成物中の活性化可能プロタンパク質は、当技術分野で日常的な技術に従って測定した場合に、少なくとも約９０％の純度を有する。診断組成物またはある特定の医薬組成物もしくは治療組成物などのある特定の実施形態では、活性化可能プロタンパク質組成物は、少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％の純度を有する。参照または研究試薬として使用される場合などの一部の実施形態では、活性化可能プロタンパク質は、より低い純度の活性化可能プロタンパク質であり得、少なくとも約５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、または少なくとも８０％の純度を有し得る。純度は、全体として、または他のタンパク質などの選択された構成成分に関連して測定することができ、例えばタンパク質に基づく純度であり得る。
精製された活性化可能プロタンパク質はまた、その生物学的特徴に従って特徴付けすることもできる。結合親和性および結合速度論を、当技術分野で公知の多様な技術、例えば非標識相互作用体のリアルタイムでの検出を可能にする光学現象である、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用するＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）および関連技術に従って測定することができる。ＳＰＲに基づくバイオセンサーを、親和性および速度論の両方に関する能動的濃縮、スクリーニング、および特徴付けの決定において使用することができる。１つまたは複数の生物活性の存在またはレベルは、少なくとも１つのＩＬ－２受容体を利用するアッセイを含む、細胞に基づくアッセイに従って測定することができ、これは、必要に応じて本明細書に記載されるように生物活性の蛍光または発光指標などの読み出しまたは指標に機能的に連結されている。
ある特定の実施形態では、上記のように、活性化可能プロタンパク質組成物は、例えば、約９５％エンドトキシンフリー、好ましくは約９９％エンドトキシンフリー、より好ましくは約９９．９９％エンドトキシンフリーを含む、実質的にエンドトキシンフリーである。エンドトキシンの存在は、本明細書に記載されるように、当技術分野で日常的な技術に従って検出することができる。具体的な実施形態では、活性化可能プロタンパク質組成物は、実質的に無血清培地中で哺乳動物またはヒト細胞などの真核細胞から作製される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるように、活性化可能プロタンパク質組成物は、約１０ＥＵ／ｍｇ活性化可能プロタンパク質未満、または約５ＥＵ／ｍｇ活性化可能プロタンパク質未満、約３ＥＵ／ｍｇ活性化可能プロタンパク質未満、または約１ＥＵ／ｍｇ活性化可能プロタンパク質未満のエンドトキシン含有量を有する。
ある特定の実施形態では、活性化可能プロタンパク質組成物は、約１０ｗｔ／ｗｔ％未満の高分子量凝集体、または約５ｗｔ／ｗｔ％未満の高分子量凝集体、または約２ｗｔ／ｗｔ％未満の高分子量凝集体、または約１ｗｔ／ｗｔ％未満の（less than about or less than about 1% wt/wt）高分子量凝集体を含む。
同様に、例えば他の特徴の中でもタンパク質の純度、サイズ、溶解度、および凝集の程度を評価するために使用することができる、タンパク質に基づく分析アッセイおよび方法も含まれる。タンパク質の純度は、いくつかの方法で評価することができる（can be assessed a number of ways）。例えば、純度は、一次構造、高次構造、サイズ、電荷、疎水性、およびグリコシル化に基づいて評価することができる。一次構造を評価するための方法の例は、ＮおよびＣ末端シーケンシングおよびペプチドマッピング（例えば、Allen et al., Biologicals. 24:255-275, 1996を参照されたい）が挙げられる。高次構造を評価するための方法の例としては、円偏光二色性（例えば、Kelly et al., Biochim Biophys Acta. 1751:119-139, 2005を参照されたい）、蛍光分光法（例えば、Meagher et al., J. Biol. Chem. 273:23283-89, 1998を参照されたい）、ＦＴ－ＩＲ、アミド水素－重水素交換速度論、示差走査熱量測定、ＮＭＲ分光法、立体構造感受性抗体との免疫反応性が挙げられる。高次構造はまた、ｐＨ、温度、または付加された塩などの多様なパラメーターの関数として評価することもできる。サイズなどのタンパク質特徴を評価するための方法の例としては、分析用超遠心分離およびサイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）が挙げられ、電荷を測定するための例示的な方法としては、イオン交換クロマトグラフィーおよび等電点電気泳動（isolectric focusing）が挙げられる。疎水性は、例えば、逆相ＨＰＬＣおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーＨＰＬＣによって評価することができる。グリコシル化は、薬物動態（例えば、クリアランス）、立体構造または安定性、受容体結合、およびタンパク質機能に影響を及ぼし得、例えば質量分析法および核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法によって評価することができる。
上記のように、ある特定の実施形態は、純度、サイズ（例えば、サイズの均一性）もしくは凝集の程度などのタンパク質特徴を評価するために、および／または他の使用の中でもタンパク質を精製するために、ＳＥＣ－ＨＰＬＣの使用を含む。ゲル濾過クロマトグラフィー（ＧＦＣ）およびゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）も含むＳＥＣは、そのサイズ、またはより具体的にはその流体力学的体積、拡散係数、および／もしくは表面特性に基づいて多孔性材料中で溶液中の分子が分離されるクロマトグラフィー方法を指す。プロセスは一般的に、生物学的分子を分離するために、およびポリマーの分子量および分子量分布を決定するために使用される。典型的には、生物試料またはタンパク質試料（例えば、本明細書に提供されるおよび当技術分野で公知のタンパク質発現方法に従って産生されたタンパク質抽出物）を、定義された静止相（多孔性材料）、好ましくは試料中のタンパク質と相互作用しない相を有する選択されたサイズ排除カラムにロードする。ある特定の態様では、静止相は、ガラスまたはスチール製のカラム内で密な三次元マトリックスとなるように充填された不活性粒子で構成される。移動相は、純水、水性緩衝液、有機溶媒、またはその混合物であり得る。静止相粒子は典型的に、ある特定のサイズより小さい分子のみが中に入ることができる小さい孔および／またはチャネルを有する。したがって、大きい粒子はこれらの孔およびチャネルから排除され、静止相とのその限定的な相互作用によって、それらは実験の最初に「完全に排除された」ピークとして溶出する。孔に適合することができるより小さい分子は、流動する移動相から除去され、それらが静止相の孔に固定されて留まる時間は、部分的にそれらが浸透する孔までの距離に依存する。移動相流からのその除去は、それらがカラムから溶出するためにより長い時間を要し、その結果そのサイズの差に基づく粒子間の分離をもたらす。所定のサイズ排除カラムは、分離することができる分子量範囲を有する。全体として、上限より大きい分子は、静止相に捕捉されず、下限より小さい分子は固相に完全に入り、単一のバンドとして溶出し、範囲内の分子は、流体力学的体積などのその特性によって定義された様々な速度で溶出する。薬学的タンパク質の実践におけるこれらの方法の例としては、Bruner et al., Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 15: 1929-1935, 1997を参照されたい。
臨床応用のためのタンパク質純度もまた、例えばAnicetti et al. (Trends in Biotechnology. 7:342-349, 1989)によって考察されている。タンパク質の純度を分析するためのより最近の技術としては、タンパク質および核酸の迅速な分析のための自動プラットフォームであるＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩが挙げられるがこれに限定されるわけではなく、これはタンパク質の力価、サイジング、および純度分析のハイスループット分析を提供する。ある特定の非制限的な実施形態では、臨床等級の活性化可能プロタンパク質は、他の方法の中でも少なくとも２つの直交ステップでクロマトグラフィー材料の組合せを利用することによって得ることができる（例えば、Therapeutic Proteins: Methods and Protocols. Vol. 308, Eds., Smales and James, Humana Press Inc., 2005を参照されたい）。典型的には、タンパク質作用剤（例えば、活性化可能プロタンパク質）は、当技術分野で公知のおよび本明細書に記載の技術に従って測定した場合に、実質的にエンドトキシンフリーである。
タンパク質溶解度アッセイも同様に含まれる。そのようなアッセイは、例えば組換え産生のための最適な成長および精製条件を決定するために、バッファー（複数可）の選択を最適にするために、ならびに活性化可能プロタンパク質およびそのバリアントの選択を最適にするために利用することができる。溶解度または凝集は、温度、ｐＨ、塩、および他の添加剤の存在または非存在を含む多様なパラメーターに従って評価することができる。溶解度スクリーニングアッセイの例としては、これらに限定されないが、中でもエンドポイントとして濁度もしくは他の尺度を使用してタンパク質の溶解度を測定するマイクロプレートに基づく方法、精製組換えタンパク質の溶解度の分析のためのハイスループットアッセイ（例えば、Stenvall et al., Biochim Biophys Acta. 1752:6-10, 2005を参照されたい）、ｉｎ ｖｉｖｏでタンパク質のフォールディングおよび溶解度をモニターおよび測定するための遺伝子マーカータンパク質の構造相補を使用するアッセイ（例えば、Wigley et al., Nature Biotechnology. 19:131-136, 2001を参照されたい）、ならびに走査型電気化学顕微鏡法（ＳＥＣＭ）を使用したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおける組換えタンパク質の溶解度の電気化学的スクリーニング（例えば、Nagamine et al., Biotechnology and Bioengineering. 96:1008-1013, 2006を参照されたい）が挙げられる。溶解度が増加した（または凝集が低減した）活性化可能プロタンパク質は、タンパク質溶解度に関する単純なｉｎ ｖｉｖｏアッセイ（例えば、Maxwell et al., Protein Sci. 8:1908-11, 1999を参照されたい）を含む、当技術分野で日常的な技術に従って同定または選択することができる。
タンパク質溶解度および凝集はまた、動的光散乱技術によっても測定することができる。凝集は、可溶性／不溶性、共有結合／非共有結合、可逆的／非可逆的、ならびに天然／変性した相互作用および特徴を含むいくつかのタイプの相互作用または特徴を包含する一般的な用語である。タンパク質治療薬の場合、凝集体の存在は、凝集体が免疫原性反応を引き起こし得る（例えば、小さい凝集体）、または投与の際に有害事象を引き起こし得る（例えば、微粒子）という懸念から、典型的に望ましくないと考えられる。動的光散乱は、懸濁液中の小さい粒子または溶液中のタンパク質などのポリマーのサイズ分布プロファイルを決定するために使用することができる技術を指す。この技術は、光子相関分光法（ＰＣＳ）または準弾性光散乱法（ＱＥＬＳ）とも呼ばれ、散乱光を使用してタンパク質粒子の拡散速度を測定する。溶液中の分子および粒子のブラウン運動による散乱強度の変動を観察することができる。この運動データを従来のように処理して試料のサイズ分布を誘導することができ、この場合、サイズはタンパク質粒子のストークス半径または流体力学的半径によって与えられる。流体力学的サイズは、質量および形状（立体構造）の両方に依存する。動的散乱は、大きい質量範囲を含有する試料においても、凝集したタンパク質の非常に少量（＜０．０１重量％）の存在を検出することができる。同様に、これを使用して、例えば上昇した温度での変化のリアルタイムモニタリングに依存する応用を含む、異なる製剤の安定性を比較することができる。したがって、ある特定の実施形態は、本開示の活性化可能プロタンパク質を含有する試料中の溶解度および／または凝集体の存在を分析するための動的光散乱の使用を含む。
前述の実施形態は、理解を明快にする目的のために例証および例によって一部詳細に記載してきたが、ある特定の変化および改変を、添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく本開示に行うことができることは、本開示の教示に照らして当業者に容易に明らかとなる。以下の実施例は例証のみのために提供されるのであって、限定のためではない。当業者は、変化または改変することができるが本質的に類似の結果を生じる多様な重要ではないパラメーターを容易に認識する。
（実施例１）
ＬＣ－ＩＬ－２／Ｆｄ－ＩＬ－２Ｒα融合タンパク質の操作
ＩＬ－２関連治療薬の毒性を低減するため、ＬＣ－リンカー－ＩＬ－２／Ｆｄ－リンカー－ＩＬ－２Ｒα融合タンパク質を、プロドラッグ（すなわち、本明細書の他所に記載の活性化可能プロタンパク質）として生成した。プロドラッグは非常に低い活性を有する。ＩＬ－２の活性を回復するために、ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を使用して概念を証明し、ＦｄとＩＬ－２Ｒαとの間のリンカーに導入した。プロドラッグ内で設計されたプロテアーゼ特異的リンカー配列のプロテアーゼによる切断により、完全な活性を回復することができる。各々の活性化可能プロタンパク質の名称および対応する配列識別子を、以下の表Ｅ１に提供する。
Figure 2022533254000029
Figure 2022533254000030
ＩＬ－２とＩＬ－２Ｒαとの間のジスルフィド形成を確認するために、ハーセプチンＦａｂにおけるジスルフィド結合を、軽鎖上のＣ末端システインをセリンに変異させ、ヒンジ領域におけるシステインを除外することによって排除した。望ましくないＩＬ－２鎖間ジスルフィド形成を回避するために、Ｃ１２５Ｓ点変異をＩＬ－２に導入した。例示的なタンパク質はＰ１３５４１３６２である。
より堅固なＩＬ－２／ＩＬ－２Ｒα複合体を形成するために、単一のシステイン変異をＩＬ－２またはＩＬ－２Ｒαに個別に導入し、ＩＬ－２とＩＬ－２Ｒαとの間でジスルフィド形成をさせた。ＩＬ－２において設計されたシステイン変異は以下の通りであった：Ｋ３５Ｃ、Ｒ３８Ｃ、Ｔ４１Ｃ、Ｆ４２Ｃ、Ｅ６１Ｃ、およびＶ６９Ｃ。ＩＬ－２Ｒαにおいて設計されたシステイン変異は以下の通りであった：Ｄ４Ｃ、Ｄ６Ｃ、Ｎ２７Ｃ、Ｋ３８Ｃ、Ｓ３９Ｃ、Ｌ４２Ｃ、Ｙ４３Ｃ、Ｉ１１８Ｃ、およびＨ１２０Ｃ。例示的なタンパク質は、Ｐ１３５５１３６３、Ｐ１３５６１３６４、Ｐ１３５６１３７１、Ｐ１３５７１３７０、Ｐ１３５８１３６５、Ｐ１３５８１３６９、Ｐ１３５９１３６６、Ｐ１３５９１３６７、およびＰ１３６０１３６８である。
ＩＬ－２Ｒαに対してより高い結合親和性を有するＩＬ－２の三重ムテイン（Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、およびＩ１２８Ｔ置換）を、プロドラッグフォーマットで試験した。例示的なタンパク質は、Ｐ１３６１１３６２、Ｐ１６８４１３６２、およびＰ１６８５１３６３である。
ＬＣとＩＬ－２との間の異なるリンカーの長さもまた設計して、プロテアーゼによる切断後のＩＬ－２活性に及ぼす効果を評価した。例示的なタンパク質は、Ｐ１５０７１３６６、Ｐ１５０８１３６６、およびＰ１５０９１３６６である。
ＩＬ－２スーパーカイン（Ｄ１０）もまた、プロドラッグフォーマットで調製した。例示的なタンパク質はＰ１５１０１３６６である。
ＩＬ－２Ｒαにおける潜在的Ｎグリコシル化部位をアラニンに変異させて、グリコシル化を排除した。例示的なタンパク質は、Ｐ１３５９１６２７、Ｐ１３５９１６２８、およびＰ１３５９１６２９である。
ＬＣ－リンカー－ＩＬ－２／Ｆｄ－リンカー－ＩＬ－２Ｒα－Ｆｃフォーマットもまた試験した。例示的なタンパク質はＰ１６８４１６８７である。
ハーセプチン－ＬＣ－リンカー－ＩＬ－２（またはバリアント）およびハーセプチン－Ｆｄ－ＴＥＶ－ＩＬ－２Ｒα（またはバリアント）をコードするプラスミドを、標準的な遺伝子合成によって構築し、次いでｐＴＴ５発現ベクターにサブクローニングした。
産生、精製、および物理的特徴付け。Ｆａｂ－ＩＬ－２／ＩＬ－２Ｒα融合タンパク質を、Ｅｘｐｉ２９３細胞における一過性のトランスフェクションによって産生し、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＩｇＧ－ＣＨ１アフィニティマトリックス（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）およびサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を含む２ステップ精製プロセスによって精製した。
精製タンパク質を、純度の評価のためにＳＤＳ－ＰＡＧＥによって特徴付けしたところ、良好な純度が示された（図４Ａ～４Ｂおよび図１０Ａ～１０Ｂを参照されたい）。Ｐ１３５４１３６２およびＰ１３６１１３６２ではＩＬ－２とＩＬ－２Ｒαとの間にジスルフィド結合は形成されなかった。ジスルフィド結合は、タンパク質：Ｐ１３５６１３６４、Ｐ１３５７１３７０、Ｐ１３５８１３６５、Ｐ１３５８１３６９、およびＰ１３６０１３６８では、ＩＬ－２とＩＬ－２Ｒαとの間で部分的に形成された。ジスルフィド結合は、タンパク質：Ｐ１３５５１３６３、Ｐ１３５６１３７１、Ｐ１３５９１３６６、Ｐ１３５９１３６７、Ｐ１５０７１３６６、Ｐ１５０８１３６６、Ｐ１５０９１３６６、Ｐ１５１０１３６６、Ｐ１３５９１６２７、Ｐ１３５９１６２８、およびＰ１３５９１６２９では、ＩＬ－２とＩＬ－２Ｒαとの間で完全に形成された。精製タンパク質は、図４Ｃおよび図１０Ｃで示されるようにＴＥＶによって完全または部分的に切断され得る。
精製タンパク質をまた、均一性の評価のために高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によっても特徴付けした。ＨＰＬＣ分析を、Ｎａｎｏｆｉｌｍ ＳＥＣ－２５０カラム（Ｓｅｐａｘ）およびＡｇｉｌｅｎｔ １２６０を使用して製造元の指示に従って実施した。代表的なＨＰＬＣ結果を図５Ａ～５Ｅおよび図１１Ａ～１１Ｆに示す。融合タンパク質の一部は、図５Ａ～５Ｃに示されるように二量体と単量体の混合物であった。融合タンパク質の一部は、図５Ｄ～５Ｅに示されるように単量体の主ピークおよび二量体の低い左の肩部分を示した。
機能的増殖アッセイ。増殖アッセイを、ＴＥＶによる切断前および後の精製タンパク質について実施した。Ｍ－０７ｅ細胞（ＩＬ－２Ｒβ／γｃ）を、２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、および１０％５６３７細胞培養上清を補充したＲＰＭＩ１６４０中で培養した。サイトカイン依存的細胞増殖を測定するために、Ｍ－０７ｅ細胞を、対数成長期で収集し、ＰＢＳによって２回洗浄した。細胞浮遊液（細胞２×１０４個／ウェル）９０μｌを、９６ウェルプレートに播種し、アッセイ培地（１０％ＦＢＳおよび１％ＮＥＡＡを補充したＲＰＭＩ１６４０）中、３７℃および５％ＣＯ２でサイトカイン枯渇のために４時間インキュベートした。アッセイにおいて使用したＩＬ－２および精製タンパク質試料を、アッセイ培地中で初回濃度３００ｎＭに調製し、その後１／３の連続希釈を行った。希釈したタンパク質１０μｌを対応するウェルに添加し、３７℃および５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。細胞計数キット－８（ＣＣＫ－８、Ｄｏｊｉｎｄｏ、ＣＫ０４）を使用する比色分析アッセイを実施し、生存細胞の量を測定した。結果を、図６Ａ～６Ｒおよび図１２Ａ～１２Ｆに示す。Ｆａｂ－ＩＬ－２／ＩＬ－２Ｒα活性化可能プロタンパク質は、ＴＥＶによる切断前は非常に低い機能的活性を示したかまたは機能的活性を示さなかったが、ＴＥＶによる切断後は有意に増加した活性を示した。
（実施例２）
ＬＣ－ＩＬ－２Ｒα／Ｆｄ－ＩＬ－２融合タンパク質の操作
ＬＣ－ＩＬ－２Ｒα／Ｆｄ－ＩＬ－２フォーマットを有する活性化可能プロタンパク質を、設計および試験した。ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を使用して概念を証明し、ＬＣとＩＬ－２Ｒαとの間のリンカーに導入した。ＩＬ－２とＩＬ－２Ｒαとの間のジスルフィド結合を形成するために、Ｅ６１Ｃ変異をＩＬ－２に導入し、Ｋ３８ＣをＩＬ－２Ｒαに導入した。例示的なタンパク質はＰ１６１２１６１３である。
ハーセプチン－ＬＣ－リンカー－ＩＬ－２Ｒα（またはバリアント）およびハーセプチン－Ｆｄ－ＴＥＶ－ＩＬ－２（またはバリアント）をコードするプラスミドを、標準的な遺伝子合成によって構築した後、ｐＴＴ５発現ベクターにサブクローニングした。
産生、精製、および物理的特徴付け。活性化可能プロタンパク質を、実施例１のように産生および特徴付けした。精製Ｐ１６１２１６１３は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおいて良好な純度を示し（図７Ａ～７Ｂ）、ＴＥＶによって切断することができた（図７Ｃ）。Ｐ１６１２１６１３は、単量体の１つの主ピークおよび二量体の低い左の肩部分を示した（図７Ｄ）。
機能的増殖アッセイ。増殖アッセイを、実施例１に記載のように、ＴＥＶによる切断の前および後に精製Ｐ１６１２１６１３について実施した。結果を図８Ａ～８Ｂに要約し、これはＰ１３５９１３６６（８Ｂ）との比較を含む。Ｐ１６１２１６１３は、野生型ＩＬ－２と比較して、ＴＥＶによる切断前に低い活性を示し、ＴＥＶによる切断後にほぼ完全な活性を示した。Ｐ１３５９１３６６と比較すると、Ｐ１６１２１６１３は、ＴＥＶによる切断前ではいくぶん高いバックグラウンド活性を示したが、切断後はより高い活性を示した。
（実施例３）
ＩＬ－２および抗ＩＬ－２抗体融合タンパク質の操作
ＬＣ－ＩＬ－２／Ｆｄ－抗ＩＬ－２－ｓｃＦｖフォーマットを有する活性化可能プロタンパク質を設計し、試験した。ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を使用して概念を証明し、Ｆｄと抗ＩＬ－２－ｓｃＦｖとの間のリンカーに導入した。例示的なタンパク質は、Ｐ１６９３１６９４およびＰ１６９３１６９５である（抗ＩＬ－２－ｓｃＦｖのＣ末端でＦｃを有する）。
抗ＩＬ－２抗体の軽鎖のＮ末端でＩＬ－２を有する活性化可能プロタンパク質を設計し、試験した。プロテアーゼ切断部位をＩＬ－２と軽鎖との間のリンカーに導入した。例示的なタンパク質は、Ｐ１７０８１７１０およびＰ１７０９１７１０である。
ＬＣ－ＩＬ－２／Ｆｄ－抗ＩＬ－２－ｓｃＦｖフォーマットおよびＩＬ－２－抗ＩＬ－２抗体フォーマットをコードするプラスミドを、標準的な遺伝子合成によって構築した後、ｐＴＴ５発現ベクターにサブクローニングした。
産生、精製、物理的特徴付け。活性化可能プロタンパク質を、実施例１のように産生し、特徴付けした。精製タンパク質は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおいて良好な純度を示し（図１０Ａ～１０Ｂ）、プロテアーゼによって切断することができた（図１０Ｃ～１０Ｄ）。Ｐ１６９３１６９４およびＰ１６９３１６９５は、良好な均一性を示した（図１１Ｇ～１１Ｈ）。Ｐ１７０８１７１０およびＰ１７０９１７１０は、単量体の１つの主ピークおよび二量体の低い左の肩部分を示した（図１１Ｉ～１１Ｊ）。
機能的増殖アッセイ。増殖アッセイを、実施例１に記載のように、プロテアーゼによる切断の前および後で精製タンパク質に関して実施した。結果を図１２Ｇ～１２Ｊに要約する。Ｐ１６９３１６９４およびＰ１６９３１６９５は、ＴＥＶによる切断前に低い活性を示し、ＴＥＶによる切断後に部分的活性を示した。Ｐ１７０８１７１０およびＰ１７０９１７１０は、プロドラッグとして低い活性を示した。
（実施例４）
ＨＣ１－ＩＬ－２／ＨＣ２－ＩＬ－２Ｒα融合タンパク質の操作
ＨＣ１－ＩＬ－２／ＨＣ２－ＩＬ－２Ｒαフォーマットを有する活性化可能プロタンパク質を設計し、試験した。プロテアーゼ切断部位を、重鎖とＩＬ－２Ｒαとの間のリンカーに導入した。例示的なタンパク質は、Ｐ１４５３１８２１２４、Ｐ１４５３１８２７３０、Ｐ２４９２９６２１５８、Ｐ２４９２９７２１５８、Ｐ２４９２９８２１５８、およびＰ２４９３９６２１５８である。
ＨＣ１－ＩＬ－２／ＨＣ２－ＩＬ－２Ｒα融合タンパク質をコードするプラスミドを、標準的な遺伝子合成によって構築した後、ｐＴＴ５発現ベクターにサブクローニングした。
産生、精製、および物理的特徴付け。活性化可能プロタンパク質を、実施例１のように産生および特徴付けした。精製タンパク質は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおいて良好な純度を示し（図１０Ａ～１０Ｂ）、プロテアーゼによって部分的または完全に切断することができた（図１０Ｄ）。精製タンパク質は、単量体の１つの主ピークおよび二量体の低い左の肩部分を示した（図１１Ｋ～１１Ｐ）。
機能的増殖アッセイ。増殖アッセイは、実施例１に記載のように、プロテアーゼによる切断の前および後に精製タンパク質に関して実施した。結果を、図１２Ｋ～１２Ｐに要約する。精製タンパク質は、プロテアーゼによる切断前に低い活性を示し、プロテアーゼによる切断後に高い活性を示した。
本明細書において引用した全ての刊行物、特許出願、および発行された特許は、各々の個々の刊行物、特許出願、または発行された特許が具体的および個々に参照により本明細書に組み込まれるかのように、参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (68)

  1. 第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含む活性化可能プロタンパク質であって、
    前記第１のポリペプチドが、第１のマスキング部分およびＩＬ－２タンパク質を含み、前記第１のマスキング部分が、第１の結合部分および前記ＩＬ－２タンパク質に融合された第１のリンカーを含み、
    前記第２のポリペプチドが、第２のマスキング部分およびＩＬ－２結合タンパク質を含み、前記第２のマスキング部分が、第２の結合部分および前記ＩＬ－２結合タンパク質に融合された第２のリンカーを含み、
    前記第１および第２のマスキング部分が、そのそれぞれの第１および第２の結合部分を介して、必要に応じて二量体として互いに結合し、それによってｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで免疫細胞の表面上に存在するＩＬ－２Ｒβ／γｃ鎖に結合する前記ＩＬ－２タンパク質の結合部位を隠し、
    前記第１のリンカーまたは前記第２のリンカーの少なくとも１つが切断可能リンカーである、活性化可能プロタンパク質。
  2. 前記ＩＬ－２タンパク質が、表Ｓ１から選択される配列または配列番号１（全長の野生型ヒトＩＬ－２）のアミノ酸２１～１５３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、それからなり、またはそれから本質的になり、必要に応じて配列番号１によって定義されるＣ１４５Ｘ（Ｘは任意のアミノ酸である）またはＣ１４５Ｓ置換を含む、任意の請求項１に記載の活性化可能プロタンパク質。
  3. 前記ＩＬ－２タンパク質が、配列番号２（Ｃ１２５Ｓ置換を有する成熟ヒトＩＬ－２）と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、それからなり、またはそれから本質的になり、必要に応じて前記ＩＬ－２タンパク質が、配列番号２によって定義されるＳ１２５残基を保持する、請求項１または２に記載の活性化可能プロタンパク質。
  4. 前記ＩＬ－２タンパク質が、配列番号２によって定義されるＫ３５Ｃ、Ｒ３８Ｃ、Ｔ４１Ｃ、Ｆ４２Ｃ、Ｅ６１Ｃ、およびＶ６９Ｃから選択される１つまたは複数の置換を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の活性化可能プロタンパク質。
  5. 前記ＩＬ－２タンパク質が、必要に応じて請求項４に記載のシステインの１つまたは複数および前記ＩＬ－２結合タンパク質における１つまたは複数のシステインを介して、前記ＩＬ－２結合タンパク質とジスルフィド結合を形成する、請求項４に記載の活性化可能プロタンパク質。
  6. 前記ＩＬ－２タンパク質が、配列番号２によって定義される６９、７４、または１２８位で１つまたは複数のアミノ酸置換を含み、必要に応じて前記１つまたは複数のアミノ酸置換が、配列番号２によって定義されるＶ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、およびＩ１２８Ｔから選択される、請求項１から５のいずれか一項に記載の活性化可能プロタンパク質。
  7. 前記ＩＬ－２タンパク質が、配列番号２によって定義されるＲ３８、Ｆ４２、Ｙ４５、Ｅ６２、Ｅ６８、および／またはＬ７２位で１つまたは複数のアミノ酸置換を含み、必要に応じて前記１つまたは複数のアミノ酸置換が、その組合せを含む、Ｒ３８ＡおよびＲ３８Ｋ；Ｆ４２Ａ、Ｆ４２Ｇ、Ｆ４２Ｓ、Ｆ４２Ｔ、Ｆ４２Ｑ、Ｆ４２Ｅ、Ｆ４２Ｎ、Ｆ４２Ｄ、Ｆ４２Ｒ、Ｆ４２Ｋ、およびＦ４２Ｉ；Ｙ４５Ａ、Ｙ４５Ｇ、Ｙ４５Ｓ、Ｙ４５Ｔ、Ｙ４５Ｑ、Ｙ４５Ｅ、Ｙ４５Ｎ、Ｙ４５Ｄ、Ｙ４５Ｒ、およびＹ４５Ｋ；Ｅ６２ＡおよびＥ６２Ｌ；Ｅ６８ＡおよびＥ６８Ｖ；ならびにＬ７２Ａ、Ｌ７２Ｇ、Ｌ７２Ｓ、Ｌ７２Ｔ、Ｌ７２Ｑ、Ｌ７２Ｅ、Ｌ７２Ｎ、Ｌ７２Ｄ、Ｌ７２Ｒ、およびＬ７２Ｋ、必要に応じてＦ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、およびＬ７２Ｇ；Ｒ３８Ｋ、Ｆ４２Ｑ、Ｙ４５Ｎ、Ｅ６２Ｌ、およびＥ６８Ｖ；Ｒ３８Ｋ、Ｆ４２Ｑ、Ｙ４５Ｅ、およびＥ６８Ｖ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ｉ、Ｙ４５Ｎ、Ｅ６２Ｌ、およびＥ６８Ｖ；Ｒ３８Ｋ、Ｆ４２Ｋ、Ｙ４５Ｒ、Ｅ６２Ｌ、およびＥ６８Ｖ；Ｒ３８Ｋ、Ｆ４２Ｉ、Ｙ４５Ｅ、およびＥ６８Ｖ；ならびにＲ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、およびＥ６２Ａから選択される組合せから選択される、請求項１から６のいずれか一項に記載の活性化可能プロタンパク質。
  8. 前記ＩＬ－２タンパク質が、配列番号３（成熟ヒトＩＬ－２「Ｄ１０」バリアント）と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、それからなり、またはそれから本質的になり、必要に応じて前記ＩＬ－２タンパク質が、配列番号３によって定義されるＱ７４Ｈ、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、および／またはＩ９２Ｆ置換のうちの任意の１つまたは複数を保持する、請求項１から７のいずれか一項に記載の活性化可能プロタンパク質。
  9. 前記ＩＬ－２結合タンパク質が、ＩＬ－２Ｒαタンパク質、または前記ＩＬ－２タンパク質に特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合性断片、必要に応じて二重特異性抗体またはその抗原結合性断片である、請求項１から８のいずれか一項に記載の活性化可能プロタンパク質。
  10. 前記ＩＬ－２Ｒαタンパク質が、表Ｓ２から選択される配列または配列番号４（全長の野生型ヒトＩＬ－２Ｒα）のアミノ酸２２～１８７と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％であるアミノ酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる、請求項９に記載の活性化可能プロタンパク質。
  11. 前記ＩＬ－２Ｒαタンパク質が、配列番号６（ヒトＩＬ－２Ｒα Ｓｕｓｈｉ１～Ｓｕｓｈｉ２ドメイン）によって定義されるＤ４Ｃ、Ｄ６Ｃ、Ｎ２７Ｃ、Ｋ３８Ｃ、Ｓ３９Ｃ、Ｌ４２Ｃ、Ｙ４３Ｃ、Ｉ１１８Ｃ、およびＨ１２０Ｃから選択される１つまたは複数のシステイン置換を含む、請求項９または１０に記載の活性化可能プロタンパク質。
  12. 前記ＩＬ－２Ｒαタンパク質が、必要に応じて請求項１１に記載のシステインの１つまたは複数、および前記ＩＬ－２タンパク質における１つまたは複数のシステイン、必要に応じて請求項４に記載のシステインの１つまたは複数、必要に応じてＩＬ２－Ｋ３５ＣおよびＩＬ２Ｒα－Ｄ４Ｃ、ＩＬ２－Ｒ３８ＣおよびＩＬ２Ｒα－Ｄ６Ｃ、ＩＬ２－Ｒ３８ＣおよびＩＬ２Ｒα－Ｈ１２０Ｃ、ＩＬ２－Ｔ４１Ｃ－ＩＬ２Ｒα－Ｉ１１８Ｃ、ＩＬ２－Ｆ４２ＣおよびＩＬ２Ｒα－Ｎ２７Ｃ、ＩＬ２－Ｅ６１ＣおよびＩＬ２Ｒα－Ｋ３８Ｃ、ＩＬ２－Ｅ６１ＣおよびＩＬ２Ｒα－Ｓ３９Ｃ、ならびにＩＬ２－Ｖ６９ＣおよびＩＬ２Ｒα－Ｌ４２Ｃから選択される１つまたは複数のシステイン対を介して、前記ＩＬ－２タンパク質とジスルフィド結合を形成し、
    前記ＩＬ－２タンパク質と前記ＩＬ－２Ｒαタンパク質との間のジスルフィド結合が、Ｔｒｅｇ上に発現されるＩＬ－２Ｒαβγ鎖に優先的に結合する前記ＩＬ－２タンパク質の前記結合部位を隠す、請求項１から１１のいずれか一項に記載の活性化可能プロタンパク質。
  13. 前記ＩＬ－２Ｒαタンパク質が、配列番号６によって定義される４９および／または６８位でアラニン置換を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の活性化可能プロタンパク質。
  14. 前記ＩＬ－２タンパク質に特異的に結合する前記抗体またはその抗原結合性断片が、全抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、単一特異性Ｆａｂ２、二重特異性Ｆａｂ２、ＦＶ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦＶ－Ｆｃ、ナノボディ、ダイアボディ、ラクダ、およびミニ抗体のうちの１つまたは複数から選択され、必要に応じて前記抗体が、ＮＡＲＡ１またはその抗原結合性断片である、請求項９に記載の活性化可能プロタンパク質。
  15. 前記第１のマスキング部分および／または前記第２のマスキング部分が、前記ＩＬ－２タンパク質にも前記ＩＬ－２結合タンパク質にも結合しない、請求項１から１４のいずれか一項に記載の活性化可能プロタンパク質。
  16. 前記第１のマスキング部分および／または前記第２のマスキング部分が、前記ＩＬ－２タンパク質に結合する、請求項１から１４のいずれか一項に記載の活性化可能プロタンパク質。
  17. 前記第１および第２の結合部分が、１つの少なくとも１つの非共有結合を介して互いに結合し、必要に応じて二量体を形成する、請求項１から１６のいずれか一項に記載の活性化可能プロタンパク質。
  18. 前記第１および第２の結合部分が、１つの少なくとも１つの共有結合を介して互いに結合し、必要に応じて二量体を形成する、請求項１から１７のいずれか一項に記載の活性化可能プロタンパク質。
  19. 前記少なくとも１つの共有結合が、少なくとも１つのジスルフィド結合を含む、請求項１８に記載の活性化可能プロタンパク質。
  20. 前記第１の結合部分および前記第２の結合部分が、表Ｍ１から選択される、請求項１から１９のいずれか一項に記載の活性化可能プロタンパク質。
  21. 前記第１の結合部分および／または前記第２の結合部分が、その抗原結合性断片およびバリアントを含む、免疫グロブリンの抗原結合ドメインを含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載の活性化可能プロタンパク質。
  22. 前記第１の結合部分および／または前記第２の結合部分が、その断片およびバリアントを含む、免疫グロブリンのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ１ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ１ＣＨ２ＣＨ３、および／またはＣＬドメインを含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載の活性化可能プロタンパク質。
  23. 前記第１の結合部分および／または前記第２の結合部分が、ＮからＣ末端方向に：（１）その抗原結合性断片およびバリアントを含む、免疫グロブリンの抗原結合ドメイン；ならびに（２）その断片およびバリアントを含む、免疫グロブリンのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ１ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ１ＣＨ２ＣＨ３、および／またはＣＬドメインを含む、請求項２１または２２に記載の活性化可能プロタンパク質。
  24. 前記抗原結合ドメインが、その抗原結合性断片およびバリアントを含む、免疫グロブリンのＶＨまたはＶＬドメインを含む、請求項２１から２３のいずれか一項に記載の活性化可能プロタンパク質。
  25. 前記第１の結合部分および／または前記第２の結合部分が抗原に結合しない、請求項１から２４のいずれか一項に記載の活性化可能プロタンパク質。
  26. 前記第１の結合部分が、免疫グロブリンのＶＬおよびＣＬドメインを含み、前記第２の結合部分が、免疫グロブリンのＶＨおよびＣＨ１ドメインを含む、請求項１から２５のいずれか一項に記載の活性化可能プロタンパク質。
  27. 前記第１の結合部分が、免疫グロブリンのＶＨおよびＣＨ１ドメインを含み、前記第２の結合部分が、免疫グロブリンのＶＬおよびＣＬドメインを含む、請求項１から２５のいずれか一項に記載の活性化可能プロタンパク質。
  28. 前記免疫グロブリンが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＭから選択される免疫グロブリンクラスに由来する、請求項２１から２７のいずれか一項に記載の活性化可能プロタンパク質。
  29. 前記第１の結合部分および前記第２の結合部分が各々、ロイシンジッパーペプチドを含む、請求項１から２８のいずれか一項に記載の活性化可能プロタンパク質。
  30. 前記第１および第２のマスキング部分が、そのそれぞれの第１および第２の結合部分を介してヘテロ二量体として互いに結合する、請求項１から２９のいずれか一項に記載の活性化可能プロタンパク質。
  31. 前記第１および第２のマスキング部分が、そのそれぞれの第１および第２の結合部分を介してホモ二量体として互いに結合し、必要に応じて前記第１および第２の結合部分の各々が、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む、請求項１から２９のいずれか一項に記載の活性化可能プロタンパク質。
  32. 前記切断可能リンカーがプロテアーゼ切断部位を含み、必要に応じて前記切断可能リンカーが表Ｓ４から選択される、請求項１から３１のいずれか一項に記載の活性化可能プロタンパク質。
  33. 前記プロテアーゼ切断部位が、メタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、およびアスパラギン酸プロテアーゼのうちの１つまたは複数から選択されるプロテアーゼによって切断可能である、請求項３２に記載の活性化可能プロタンパク質。
  34. 前記プロテアーゼ切断部位が、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ４、ＭＭＰ５、ＭＭＰ６、ＭＭＰ７、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１２、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１４、ＴＥＶプロテアーゼ、マトリプターゼ、ｕＰＡ、ＦＡＰ、レグマイン、ＰＳＡ、カリクレイン、カテプシンＡ、およびカテプシンＢのうちの１つまたは複数から選択されるプロテアーゼによって切断可能である、請求項３２または３３に記載の活性化可能プロタンパク質。
  35. 前記第１のリンカーおよび／または前記第２のリンカーが、約１～５０、約１～４０、約１～３０、約１～２０、約１～１０、約１～５、約１～４、約１～３アミノ酸長であるか、または約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、約５０アミノ酸長である、請求項１から３４のいずれか一項に記載の活性化可能プロタンパク質。
  36. 前記第１のリンカーが切断可能リンカーであり、前記第２のリンカーが切断不能リンカーである、請求項１から３５のいずれか一項に記載の活性化可能プロタンパク質。
  37. 前記第１のリンカーが切断、必要に応じてプロテアーゼによって切断されると、前記活性化可能プロタンパク質から前記第１のマスキング部分を放出し、それによってｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで前記免疫細胞の前記表面上に存在する前記ＩＬ－２Ｒβ／γｃ鎖に結合する前記ＩＬ－２タンパク質の前記結合部位を露出する、請求項３６に記載の活性化可能プロタンパク質。
  38. 前記第１のリンカーが切断不能リンカーであり、前記第２のリンカーが切断可能リンカーである、請求項１から３５のいずれか一項に記載の活性化可能プロタンパク質。
  39. 前記第２のリンカーが切断、必要に応じてプロテアーゼによって切断されると、前記活性化可能プロタンパク質から前記第２のマスキング部分を放出し、それによってｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで前記免疫細胞の前記表面上に存在する前記ＩＬ－２Ｒβ／γｃ鎖に結合する前記ＩＬ－２タンパク質の前記結合部位を露出する、請求項３８に記載の活性化可能プロタンパク質。
  40. 前記免疫細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、単球、およびマクロファージのうちの１つまたは複数から選択される、請求項１から３９のいずれか一項に記載の活性化可能プロタンパク質。
  41. 前記第１のポリペプチドが、前記第１のマスキング部分の遊離の末端でタンパク質ドメインＡ、および／または前記ＩＬ－２タンパク質の遊離の末端でタンパク質ドメインＢをさらに含む、請求項１から４０のいずれか一項に記載の活性化可能プロタンパク質。
  42. 前記第２のポリペプチドが、前記第２のマスキング部分の遊離の末端でタンパク質ドメインＣ、および／または前記ＩＬ－２結合タンパク質の遊離の末端でタンパク質ドメインＤをさらに含む、請求項１から４１のいずれか一項に記載の活性化可能プロタンパク質。
  43. 前記タンパク質ドメインＡ～Ｄが同じまたは異なり、必要に応じて細胞受容体標的化部分、必要に応じて二重特異性標的化部分、抗原結合ドメイン、必要に応じて二重特異性抗原結合ドメイン、細胞膜受容体細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、Ｆｃドメイン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、Ｆｃ結合ドメイン、ＨＳＡ結合ドメイン、サイトカイン、ケモカイン、および可溶性タンパク質リガンドのうちの１つまたは複数から選択される、請求項４０または４１に記載の活性化可能プロタンパク質。
  44. 前記第１のポリペプチドが、ＮからＣ末端方向に、前記第１のマスキング部分および前記ＩＬ－２タンパク質を含む、請求項１から４３のいずれか一項に記載の活性化可能プロタンパク質。
  45. 前記第１のポリペプチドが、ＮからＣ末端方向に、前記ＩＬ－２タンパク質および前記第１のマスキング部分を含む、請求項１から４３のいずれか一項に記載の活性化可能プロタンパク質。
  46. 前記第２のポリペプチドが、ＮからＣ末端方向に、前記第２のマスキング部分および前記ＩＬ－２結合タンパク質を含む、請求項１から４５のいずれか一項に記載の活性化可能プロタンパク質。
  47. 前記第２のポリペプチドが、ＮからＣ末端方向に、前記ＩＬ－２結合タンパク質および前記第２のマスキング部分を含む、請求項１から４５のいずれか一項に記載の活性化可能プロタンパク質。
  48. 前記第１のポリペプチドが、配列番号９、１３、１７、２１、２５、２９、３３、３７、４１、４５、４９、５３、５７、６１、６５、６９、７３、７７、８１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、もしくは２４５と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含み、それからなり、もしくはそれから本質的になり、および前記第２のポリペプチドがそれぞれ、配列番号８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、もしくは２４６と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含み、それからなり、もしくはそれから本質的になり；または
    前記第１のポリペプチドが、配列番号２４７、２５０、２５３、２５６、２５９、もしくは２６２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含み、それからなり、もしくはそれから本質的になり、前記第２のポリペプチドがそれぞれ、配列番号２４８、２５１、２５４、２５７、もしくは２６３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、それからなり、もしくはそれから本質的になり、ならびに第３および／または第４のポリペプチドがそれぞれ、配列番号２４９、２５２、２５５、２５８、２６１、もしくは２６４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる、請求項１から４７のいずれか一項に記載の活性化可能プロタンパク質。
  49. 必要に応じて前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドが、同じまたは個別の組換え核酸分子上にコードされる、請求項１から４８のいずれか一項に記載の活性化可能プロタンパク質をコードする組換え核酸分子。
  50. 必要に応じて前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドが、同じまたは個別の組換え核酸分子またはベクター上にコードされる、請求項４９に記載の組換え核酸分子を含むベクター。
  51. 請求項４４に記載の組換え核酸分子または請求項５０に記載のベクターを含む宿主細胞。
  52. 活性化可能プロタンパク質を産生する方法であって、前記活性化可能プロタンパク質の発現に適した培養条件下で請求項５１に記載の宿主細胞を培養するステップ、および培養物から前記活性化可能プロタンパク質を単離するステップを含む方法。
  53. 請求項１から４８のいずれか一項に記載の活性化可能プロタンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
  54. 対象における疾患を処置する方法、および／または対象における免疫応答を増強する方法であって、請求項５３に記載の医薬組成物の治療有効量を前記対象に投与するステップを含む方法。
  55. 前記疾患が、がん、ウイルス感染症、および免疫障害のうちの１つまたは複数から選択される、請求項５４に記載の方法。
  56. 前記がんが、原発がんまたは転移がんであり、黒色腫（必要に応じて転移性黒色腫）、腎臓がん（必要に応じて腎細胞癌）、膵臓がん、骨がん、前立腺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、中皮腫、白血病（必要に応じてリンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、または再発した急性骨髄性白血病）、多発性骨髄腫、リンパ腫、ヘパトーマ（肝細胞癌）、肉腫、Ｂ細胞悪性腫瘍、乳がん、卵巣がん、結腸直腸がん、神経膠腫、多形性膠芽腫、髄膜腫、下垂体腺腫、前庭神経鞘腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、原始神経外胚葉性腫瘍（髄芽腫）、膀胱がん、子宮がん、食道がん、脳がん、頭頸部がん、子宮頸がん、精巣がん、甲状腺がん、および胃がんのうちの１つまたは複数から選択される、請求項５５に記載の方法。
  57. 投与後、前記活性化可能プロタンパク質が、細胞または組織、必要に応じてがん細胞またはがん組織におけるプロテアーゼによる切断を通して活性化され、前記プロテアーゼ切断部位を含む前記マスキング部分を放出し、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで前記免疫細胞の表面上に存在する前記ＩＬ－２Ｒβ／γｃ鎖に結合する前記ＩＬ－２タンパク質の前記結合部位を露出し、それによって活性化タンパク質を生成する、請求項５４から５６のいずれか一項に記載の方法。
  58. 前記活性化タンパク質が、前記ＩＬ－２タンパク質を介してｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで免疫細胞の前記表面上に存在する前記ＩＬ－２Ｒβ／γｃ鎖に結合する、請求項５７に記載の方法。
  59. 前記免疫細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、単球、およびマクロファージのうちの１つまたは複数から選択される、請求項５８に記載の方法。
  60. 前記活性化タンパク質における前記ＩＬ－２タンパク質と前記ＩＬ－２結合タンパク質との間の結合（必要に応じて前記ＩＬ－２タンパク質と前記ＩＬ－２Ｒαタンパク質との間のジスルフィド結合）が、Ｔｒｅｇ上に発現されるＩＬ－２Ｒα／β／γｃ鎖に結合する前記ＩＬ－２タンパク質の前記結合部位を隠し、それによってＴｒｅｇに対する前記活性化タンパク質の結合を妨害する、請求項５７から５９のいずれか一項に記載の方法。
  61. 前記活性化可能プロタンパク質の投与および活性化が、前記対象における免疫応答を、対照と比較して、約もしくは少なくとも約５％、約もしくは少なくとも約１０％、約もしくは少なくとも約１５％、約もしくは少なくとも約２０％、約もしくは少なくとも約２５％、約もしくは少なくとも約３０％、約もしくは少なくとも約３５％、約もしくは少なくとも約４０％、約もしくは少なくとも約４５％、約もしくは少なくとも約５０％、約もしくは少なくとも約６０％、約もしくは少なくとも約７０％、約もしくは少なくとも約８０％、約もしくは少なくとも約９０％、約もしくは少なくとも約１００％、約もしくは少なくとも約２００％、約もしくは少なくとも約３００％、約もしくは少なくとも約４００％、約もしくは少なくとも約５００％、約もしくは少なくとも約６００％、約もしくは少なくとも約７００％、約もしくは少なくとも約８００％、約もしくは少なくとも約９００％、約もしくは少なくとも約１０００％、約もしくは少なくとも約２０００％、またはそれより多く増加させ、必要に応じて前記免疫応答が、抗がんまたは抗ウイルス免疫応答である、請求項５４から６０のいずれか一項に記載の方法。
  62. 前記活性化可能プロタンパク質の投与および活性化が、前記対象における細胞殺滅を、対照と比較して、約もしくは少なくとも約５％、約もしくは少なくとも約１０％、約もしくは少なくとも約１５％、約もしくは少なくとも約２０％、約もしくは少なくとも約２５％、約もしくは少なくとも約３０％、約もしくは少なくとも約３５％、約もしくは少なくとも約４０％、約もしくは少なくとも約４５％、約もしくは少なくとも約５０％、約もしくは少なくとも約６０％、約もしくは少なくとも約７０％、約もしくは少なくとも約８０％、約もしくは少なくとも約９０％、約もしくは少なくとも約１００％、約もしくは少なくとも約２００％、約もしくは少なくとも約３００％、約もしくは少なくとも約４００％、約もしくは少なくとも約５００％、約もしくは少なくとも約６００％、約もしくは少なくとも約７００％、約もしくは少なくとも約８００％、約もしくは少なくとも約９００％、約もしくは少なくとも約１０００％、約もしくは少なくとも約２０００％、またはそれより多く増加させ、必要に応じて前記細胞殺滅が、がん細胞の殺滅またはウイルス感染細胞の殺滅である、請求項５４から６１のいずれか一項に記載の方法。
  63. 前記ウイルス感染症が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｅ型肝炎、カリシウイルス関連下痢、ロタウイルス性下痢、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ型肺炎および侵襲性疾患、インフルエンザ、麻疹、ムンプス、風疹、パラインフルエンザ関連肺炎、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）肺炎、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、ヒトパピローマウイルス、単純ヘルペス２型性器潰瘍、デング熱、日本脳炎、ダニ媒介性脳炎、ウエストナイルイルス関連疾患、黄熱病、エプスタインバーウイルス、ラッサ熱、クリミアコンゴ出血熱、エボラ出血熱、マールブルグ出血熱、狂犬病、リフトバレー熱、天然痘、上気道および下気道感染症、ならびに灰白髄炎のうちの１つまたは複数から選択され、必要に応じて前記対象がＨＩＶ陽性である、請求項５５に記載の方法。
  64. 前記免疫障害が、Ｉ型糖尿病、血管炎、および免疫不全のうちの１つまたは複数から選択される、請求項５５に記載の方法。
  65. 前記医薬組成物が、非経口投与によって前記対象に投与される、請求項５４から６４のいずれか一項に記載の方法。
  66. 前記非経口投与が静脈内投与である、請求項６５に記載の方法。
  67. 対象における疾患を処置するための、および／または対象における免疫応答を増強するための医薬の調製における請求項５３に記載の医薬組成物の使用。
  68. 対象における疾患の処置において、および／または対象における免疫応答の増強に使用するための請求項５３に記載の医薬組成物。
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