JP2024512709A - プロテアーゼ活性化ポリペプチド - Google Patents

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パブロ ウマーニャ，
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Abstract

本発明は概して、新規の単離されたポリペプチド及びイムノコンジュゲートと、それらの使用とに関する。ポリペプチド及びイムノコンジュゲートは、マトリプターゼの基質である、少なくとも１つプロテアーゼ認識配列を含む。【選択図】なし

Description

本発明は、概して新規プロテアーゼ活性化ポリペプチドに関し、特にインターロイキン－２（ＩＬ－２）ポリペプチドに関する。さらに詳細には、本発明は、免疫療法薬剤としての使用のための改善された特性を呈するプロテアーゼ活性化ＩＬ－２ポリペプチドに関する。加えて、本発明は、このようなベクター又はポリヌクレオチド分子を含む、プロテアーゼ活性化ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲート、ポリヌクレオチド、ベクター及び宿主細胞に関する。本発明はさらに、プロテアーゼ活性化ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを生成するための方法、それを含む薬学的組成物、及びその使用に関する。
個々の標的細胞又は特定の標的細胞型の選択的破壊は、様々な臨床現場で望ましい事が多い。例えば、がん治療の主な目標は、健常な細胞及び組織をインタクトで無傷に残しながら、腫瘍細胞を特異的に破壊することである。
これを達成する魅力的な方法は、腫瘍に対する免疫応答を誘導し、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞又は細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）等の免疫エフェクター細胞に腫瘍細胞を攻撃させて破壊させることである。これに関して、標的細胞上の表面抗原に結合するように設計された、インターロイキン－２（ＩＬ－２）バリアントを含むコンジュゲートは、近くのＴエフェクター細胞及びＮＫ細胞を活性化すると考えられている。その標的とインターロイキン－２受容体とに対するこのようなコンジュゲートの同時結合は、標的近くでのＴエフェクター細胞及びＮＫ細胞の活性化を引き起こす（トランスで）か、又は標的がＴエフェクター細胞及びＮＫ細胞上に発現されるとき、結合時にこの細胞が活性化される（シスで）。
インターロイキン－２（ＩＬ－２）は、Ｔ細胞成長因子（ＴＣＧＦ）としても知られ、リンパ球の生成、生存及びホメオスタシスにおいて中心的な役割を果たす１５．５ｋＤａの球状糖タンパク質である。ＩＬ－２は、１３３アミノ酸長であり、その機能に必須の四次構造を形成する４つの平行ではない両親媒性αらせんからなる（Ｓｍｉｔｈ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０，１１６９－７６（１９８８）；Ｂａｚａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７，４１０－４１３（１９９２））。異なる種由来のＩＬ－２の配列は、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ番号ＮＰ０００５７７（ヒト）、ＮＰ０３２３９２（マウス）、ＮＰ４４６２８８（ラット）又はＮＰ５１７４２５（チンパンジー）に認められる。
ＩＬ－２は、最大３個の個別のサブユニットからなるＩＬ－２受容体（ＩＬ－２Ｒ）に会合することによってその作用を媒介し、それらの異なる会合は、ＩＬ－２に対する親和性を異にする受容体形態を生成することができる。α（ＣＤ２５）、β（ＣＤ１２２）及びγ（γｃ、ＣＤ１３２）サブユニットの会合によって、ＩＬ－２の三量体型高親和性受容体が得られる。βサブユニット及びγサブユニットからなる二量体型ＩＬ－２受容体は、中程度親和性ＩＬ－２Ｒと呼ばれる。αサブユニットは、単量体型低親和性ＩＬ－２受容体を形成する。二量体型中程度親和性ＩＬ－２受容体は、三量体型高親和性受容体との比較で約１００分の１という低い親和性でＩＬ－２に結合するが、二量体型及び三量体型ＩＬ－２受容体バリアントの両方は、ＩＬ－２に結合するとシグナルを伝達することができる（Ｍｉｎａｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １１，２４５－２６８（１９９３））。したがって、α－サブユニットＣＤ２５は、ＩＬ－２シグナル伝達に必須ではない。α－サブユニットは、その受容体に高い親和性結合を付与し、一方βサブユニットＣＤ１２２及びγサブユニットは、シグナル伝達にとって極めて重要である（Ｋｒｉｅｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １０７，１１９０６－１１（２０１０））。ＣＤ２５を含む三量体型ＩＬ－２受容体は、（休止状態の）ＣＤ４＋フォークヘッドボックスＰ３（ＦｏｘＰ３）＋制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞によって発現される。これらは、従来の活性化されたＴ細胞でも一時的に誘導され、一方、休止状態では、これら細胞は二量体型ＩＬ－２受容体のみを発現する。Ｔｒｅｇ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで一貫して最も高いレベルのＣＤ２５を発現する（Ｆｏｎｔｅｎｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６，１１４２－５１（２００５））。
ＩＬ－２は、活性化Ｔ細胞、特にＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞によって主に合成される。ＩＬ－２は、Ｔ細胞の増殖及び分化を刺激し、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の生成並びに末梢血リンパ球の細胞毒性細胞及びリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞への分化を誘導し、Ｔ細胞によるサイトカイン及び細胞溶解性分子の発現を促進し、Ｂ細胞の増殖及び分化並びにＢ細胞による免疫グロブリンの合成を容易にし、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の生成、増殖及び活性化を刺激する（例えば、Ｗａｌｄｍａｎｎ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６，５９５－６０１（２００９）；Ｏｌｅｊｎｉｃｚａｋ ａｎｄ Ｋａｓｐｒｚａｋ、Ｍｅｄ Ｓｃｉ Ｍｏｎｉｔ １４，ＲＡ１７９－８９（２００８）；Ｍａｌｅｋ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２６，４５３－７９（２００８）にまとめられている）。
リンパ球の集合をｉｎ ｖｉｖｏで拡張し、これら細胞のエフェクター機能を増加させるＩＬ－２の能力は、ＩＬ－２に抗腫瘍効果を付与し、ＩＬ－２免疫療法を、特定の転移性がんにとって魅力的な治療選択肢にしている。その結果、高用量ＩＬ－２治療は、転移性腎細胞癌及び悪性黒色腫を有する患者における使用について承認された。
しかしながら、ＩＬ－２は、エフェクター細胞の拡張及び活性を媒介するだけでなく、末梢性免疫寛容の維持に大きく関わっているという点で、免疫応答において二重の機能を有する。
末梢性自己トレランスの根底にある主要な機序は、Ｔ細胞におけるＩＬ－２誘導活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）である。ＡＩＣＤは、完全に活性化されたＴ細胞が、ＣＤ９５（Ｆａｓとしても知られる）等の細胞表面で発現するデスレセプター又はＴＮＦ受容体の係合を通してプログラム細胞死を受けるプロセスである。増殖中に高親和性ＩＬ－２受容体を発現する抗原活性化Ｔ細胞（ＩＬ－２に以前に曝露された後の）が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）／ＣＤ３複合体を介して抗原により再刺激されると、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）及び／又は腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の発現が誘導され、細胞が、Ｆａｓ介在性アポトーシスに感受性となる。このプロセスは、ＩＬ－２依存性であり（Ｌｅｎａｒｄｏ、Ｎａｔｕｒｅ ３５３，８５８－６１（１９９１））、ＳＴＡＴ５を介して媒介される。Ｔリンパ球トレランスにおけるＡＩＣＤのプロセスによって、耐性が、自己抗原に対して確立されるだけではなく、腫瘍抗原等の明確に宿主構成物の一部ではない持続性抗原に対しても確立されうる。
さらに、ＩＬ－２は、末梢ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の維持にも関与し（Ｆｏｎｔｅｎｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６，１１４２－５１（２００５）；Ｄ’Ｃｒｕｚ ａｎｄ Ｋｌｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６，１１５２－５９（２００５）；Ｍａｌｏｙ ａｎｄ Ｐｏｗｒｉｅ，Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６，１１７１－７２（２００５））、これらはサプレッサーＴ細胞としても知られる。これら細胞は、エフェクターＴ細胞がその（自己）標的を破壊することを、Ｔ細胞の補助及び活性化を阻害することにより細胞間接触を通して、又はＩＬ－１０若しくはＴＧＦ－β等の免疫抑制性サイトカインの放出を通して、抑制する。Ｔｒｅｇ細胞の枯渇は、ＩＬ－２誘導抗腫瘍免疫を高めることが示された（Ｉｍａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ ９８，４１６－２３（２００７））。
したがって、ＩＬ－２の存在下では、生成されたＣＴＬが、腫瘍を自身として認識してＡＩＣＤを受けるか、又は免疫応答が、ＩＬ－２依存性Ｔｒｅｇ細胞によって阻害されるため、ＩＬ－２は腫瘍増殖の阻害にとって最適ではない。
ＩＬ－２免疫療法に関連するさらなる懸案事項は、組み換えヒトＩＬ－２治療によって生じる副作用である。高用量ＩＬ－２治療を受けている患者は、重篤な心血管、肺、腎臓、肝臓、胃腸、神経、皮膚、血液及び全身の有害事象を頻繁に経験し、これには集中的なモニタリングと入院患者管理が必要となる。これら副作用の大部分は、いわゆる血管（又は毛細血管）漏出症候群（ＶＬＳ）の発生、複数の臓器における流体漏出を引き起こす血管透過性の病的な増加（例えば、肺及び皮膚の浮腫並びに肝細胞の損傷を引き起こす）、血管内の流体枯渇（血圧の低下、心拍の補償的増加を引き起こす）によって説明することができる。ＩＬ－２の使用中止以外のＶＬＳの治療は存在しない。低用量ＩＬ－２レジメンが、ＶＬＳを回避するために患者で試験されたが、最適とはいえない治療結果であった。ＶＬＳは、ＩＬ－２活性化ＮＫ細胞からの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－α等の炎症誘発性サイトカインの放出によって引き起こされると考えられていたが、近年、ＩＬ－２誘導肺浮腫が、低レベルから中程度のレベルの機能性αβγ ＩＬ－２受容体を発現する肺内皮細胞に対するＩＬ－２の直接的な結合によって生じることが示された（Ｋｒｉｅｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０７，１１９０６－１１（２０１０））。
ＩＬ－２免疫療法に関連するこれら問題を克服するために、いくつかの手法が行われてきた。例えば、ＩＬ－２と特定の抗ＩＬ－２モノクローナル抗体との組み合わせは、ｉｎ ｖｉｖｏでＩＬ－２の治療効果を高める（Ｋａｍｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７７，３０６－１４（２００６）；Ｂｏｙｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１１，１９２４－２７（２００６））。代替的な手法では、その毒性を低下させるため、及び／又はその有効性を高めるために、ＩＬ－２を種々の様式で変異させた。Ｈｕ ｅｔ ａｌ．（Ｂｌｏｏｄ １０１，４８５３－４８６１（２００３）、米国特許出願公開第２００３／０１２４６７８号）は、ＩＬ－２の血管浸透活性を排除するために、ＩＬ－２の位置３８のアルギニン残基をトリプトファンにより置換した。Ｓｈａｎａｆｅｌｔ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １８，１１９７－１２０２（２０００））は、ＮＫ細胞よりもＴ細胞に対する選択性を高めるために、アスパラギン８８をアルギニンに変異させた。Ｈｅａｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５３，２５９７－６０２（１９９３）；米国特許第５，２２９，１０９号）は、ＮＫ細胞からの炎症誘発性サイトカインの分泌を減らすために、Ａｒｇ３８Ａｌａ及びＰｈｅ４２Ｌｙｓの２つの変異を導入した。Ｇｉｌｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ．（米国特許出願公開第２００７／００３６７５２号）は、ＶＬＳを減らすために、中程度親和性ＩＬ－２受容体に対する親和性に寄与するＩＬ－２の３つの残基（Ａｓｐ２０Ｔｈｒ、Ａｓｎ８８Ａｒｇ及びＧｌｎ１２６Ａｓｐ）を置換した。Ｇｉｌｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ．（国際公開第２００８／００３４４７３号）はまた、有効性を高めるために、アミノ酸置換Ａｒｇ３８Ｔｒｐ及びＰｈｅ４２ＬｙｓによってＩＬ－２とＣＤ２５との接触面を変異させ、ＣＤ２５との相互作用、及びＴｒｅｇ細胞の活性化を低減させた。同じ目的のために、Ｗｉｔｔｒｕｐ ｅｔ ａｌ．（国際公開第２００９／０６１８５３号）は、ＣＤ２５に対する親和性を高めたが、受容体を活性化せず、したがってアンタゴニストとして作用するＩＬ－２変異体を生成した。導入される変異は、受容体のβサブユニット及び／又はγサブユニットとの相互作用を破壊することを目的としたものであった。
ＩＬ－２免疫療法に関連する上述の問題（ＶＬＳの誘導によって引き起こされる毒性、ＡＩＣＤの誘導によって引き起こされる腫瘍耐性、及びＴｒｅｇ細胞の活性化によって引き起こされる免疫抑制）を克服するために設計された特定の変異ＩＬ－２ポリペプチドが、国際公開第２０１２／１０７４１７号に記載されている。アラニンによる位置４２のフェニルアラニン残基の置換、アラニンによる位置４５のチロシン残基の置換、及びグリシンによるＩＬ－２の位置７２のロイシン残基の置換は、ＩＬ－２受容体（ＣＤ２５）のα－サブユニットに対するこの変異型ＩＬ－２ポリペプチドの結合を本質的に消失させる。
しかしながら、既知のＩＬ－２変異体の中で、ＩＬ－２免疫療法に関連付けられる上述の問題のすべて、すなわちＶＬＳの誘導によって引き起こされる毒性、ＡＩＣＤの誘導によって引き起こされる腫瘍耐性、及びＴｒｅｇ細胞の活性化によって引き起こされる免疫抑制を克服することを示したものはなかった。
上述の手法に加えて、ＩＬ－２免疫療法は、例えば腫瘍細胞に発現された抗原に結合するか又は腫瘍環境内でエフェクター細胞に結合する抗体を含むイムノコンジュゲートの形態で、腫瘍に対してＩＬ－２を選択的に標的化することによって向上させることができる。いくつかのこのようなイムノコンジュゲートが記載されている（例えば、Ｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ（２００４）２７，２３２－２３９；Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０１７）６（３），ｅ１２７７３０６；国際公開第２０１８／１８４９６４号を参照されたい）。
ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１チェックポイント阻害剤の臨床的成功及び前例のない有効性を考慮すると、既存のＴ細胞免疫を有する患者における応答率及び持続期間を増加させる大きな医学的ニーズがさらに残っている。最近の報告は、腫瘍特異的ＣＤ８Ｔ細胞の２つの集団、すなわち枯渇したＴＩＬと、幹様特性を有するそれらの新しく記載されたＴＣＦ１＋ 前駆体であるＴＲｅｓｏｕｒｃｅ細胞は、ＰＤ－１抗体によって標的化される。これら２つのうち、後者は好ましい疾患予後と相関し、抗ＰＤ－１療法に応答する。インターロイキン－２のようなサイトカインはまた、ＴＲｅｓｏｕｒｃｅ細胞の増殖／分化を機能的エフェクターＴ細胞に向かって誘導することが記載されている。
ＩＬ－２は、転移性黒色腫及び腎細胞癌を治療するために使用される最初の有効ながん免疫療法であった。残念なことに、高濃度のＩＬ－２は、血管漏出症候群（ＶＬＳ）を誘導することにより毒性であり、ＣＤ２５への結合に起因して制御性Ｔ細胞を有害に拡大し、活性化誘導性細胞死を誘導する。野生型ＩＬ２／Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎのこれら制限を克服するために、消失したＣＤ２５結合を有するＩＬ－２ｖバリアントが記載されている。しかしながら、ヘテロ二量体の中程度の親和性を通したＩＬ－２シグナル伝達の機序に起因して、ＩＬ－２Ｒｂｇ複合体ＩＬ２ｖ及び他のＩＬ２バリアントは、ＩＬ－２Ｒに出会うとすぐ自動的にＩＬ－２Ｒシグナル伝達を活性化し、その結果、血液、脈管構造及びリンパ組織において腫瘍の外側の非特異的な末梢免疫細胞活性化を媒介し、用量制限毒性をもたらす。結果として、最大の治療効果を達成するために望ましいものと同じ量のＩＬ－２又はＩＬ２ｖを患者に投与することは可能でない。
まとめると、ＰＤ１－ＩＬ２ｖをシスでＰＤ－１＋Ｔ細胞に標的化することにより、ＰＤ１－ＩＬ２ｖのより強力な治療効果を達成することができる。実際に、適切な抗原特異的Ｔ細胞サブセットへのＰＤ１－ＩＬ２ｖのシス標的化は、ＰＤ－１／－Ｌ１阻害と併せて、内因性の免疫を治療的に活用するためによりよい方法であり、がん免疫療法にとって内因性の免疫を解放することが知られている最も強力な免疫調節経路のうちの１つである。しかしながら、ＰＤ１－ＩＬ２ｖについても、ＩＬ２ｖ部分が末梢でＩＬ－２Ｒシグナル伝達をトリガーする可能性があるため、末梢の非腫瘍特異的ＩＬ－２Ｒの活性化により、所望される最大用量を投与することができない。したがって、治療指数は狭い範囲に留まると考えられ、ＭＴＤはヒトで＞１０～３０ｍｇのフラット用量であると予想され、これは完全な経路可能性の利用を制限しうる。代わりに、ＣＤ８Ｔ細胞が、他のＴ細胞標的とともに標的化されうる。
したがって、抗原経験Ｔ細胞にシス標的化された次世代のＩＬ－２分子を、より広い治療指数を有する量で生成することが重要である。
セリンプロテアーゼ（例えばマトリプターゼ）、システインプロテアーゼ（例えばカテプシンＳ）及びマトリックスメタロプロテイナーゼ（例えばＭＭＰ－２及びＭＭＰ－９）は、複数のがんの種類に過剰発現される（Ｄｕｆｆｙ，Ｍ．Ｊ．Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ ａｓ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２，６１３－６１８（１９９６））。マトリプターゼ、マトリックスメタロプロテイナーゼ２（ＭＭＰ－２、ゼラチナーゼＡ）及びマトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ－９、ゼラチナーゼＢ）は、例えば乳癌及び卵巣癌に過剰発現される（ＭｃＧｏｗａｎ，Ｐ．Ｍ．＆ Ｄｕｆｆｙ，Ｍ．Ｊ．Ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｏｕｔｃｏｍｅ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ：ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｄａｔａｂａｓｅ．Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．１９，１５６６－１５７２（２００８））。ＭＭＰ－２及びＭＭＰ－９活性は、子宮頸癌、乳癌及び卵巣癌と、卵巣上皮がん（ＥＯＣ）患者の腹水とに検出されたが、これら患者の血清には検出されなかった（Ｄｅｍｅｔｅｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ａｎｄ ｉｎ ｎｏｎ－ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２５，２８８５－２８８９（２００５））。マトリプターゼは正常上皮細胞に検出されうるが、マトリプターゼ活性は、主にがんに検出される（ＬｅＢｅａｕ，Ａ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｉｍａｇｉｎｇ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １１０，９３－９８（２０１３））。
ＰＤ１／ＰＤＬ１軸に向けられている現行の免疫療法は複数のがんの症候において前例のない有効性を示したが、治療に応答しないか又は再発するかなり多くの患者が存在し、他の腫瘍型はそのような療法に対して大部分が抵抗性のままである。したがって、何らかの種類の既存のＴ細胞免疫応答を有するかなりの数のがん患者に、明らかで満たされていない高いニーズが存在する。ＰＤ１の拮抗作用が客観的応答をもたらした症候の例は、例えば進行性又は転移性黒色腫、メルケル細胞癌、ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、ＲＣＣ、胃がん、肝細胞がん、頭頚部癌、乳がん、卵巣がん、自家造血幹細胞移植及びＨＬ後のＤＬＢＣＬ及びＰＭＢＣＬのようなミスマッチ修復不全対十分なＣＲＣ及び血液系腫瘍である（Ｅｄｉｔｉｏｒｉａｌ：ＰＤ－Ｌｏｍａ：ａ ｃａｎｃｅｒ ｅｎｔｉｔｙ ｗｉｔｈ ａ ｓｈａｒｅｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ｔｈｅ ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ ｐａｔｈｗａｙ ｂｌｏｃｋａｄｅ，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ（２０１９）１２０：３－５；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１４１６－０１８－０２９４－４）。
治療に適したＩＬ－２バリアント及びコンジュゲートを生成するタスクは、有効性、毒性、適用性及び生産性に関連する、満たされなければならない複数の技術的課題を提供する。コンジュゲートが、非標的組織内でも発現される、標的細胞、例えば、がん細胞上の抗原を標的とする場合、毒性が発生する可能性がある。このように、当技術分野には、ＩＬ－２ポリペプチドの治療的有用性をさらに高めるためのニーズが依然として存在している。
本発明は、部分的には、腫瘍環境（ＴＭＥ）が、正常組織と比較して、プロテアーゼを高度に発現すること、及びマスクされた治療剤、好ましくはプロテアーゼ活性化型インターロイキン－２又はプロテアーゼ活性化型インターフェロン－γ又はプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞エンゲージャーが、プロテアーゼにより活性化されると、腫瘍環境において全身性活性及び完全活性を低減するか又は消失させるという認識に基づいている。
したがって、本発明の第１の態様は、プロテアーゼ認識部位を含む単離されたポリペプチドを提供し、このプロテアーゼ認識部位は、マトリプターゼの基質であり、配列番号３２による配列ＰＱＡＲＫ又は配列番号３３によるＨＱＡＲＫを含むか、又は同配列からなる。一実施形態では、単離されたポリペプチドは、プロテアーゼ認識部位を含む１つ又は複数の非構造化リンカーを含む。一実施形態では、そのような１つ又は複数の非構造化リンカーは、二次構造を呈しない。一実施形態では、プロテアーゼ認識部位は、好ましくは配列番号７１、７３、７５、７６、７８、８０、８２からなる群から選択される配列のうちの１つを含む、切断可能部分（ＣＭ）の一部である。一実施形態では、単離されたポリペプチドは、ＣＭ（ＭＮ）のアミノ（Ｎ）末端に位置する部分、ＣＭ（ＭＣ）のカルボキシル（Ｃ）末端に位置する部分、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの部分（Ｍ）を含み、ＭＮ又はＭＣは、抗体又はその抗原結合断片（ＡＢ）、治療剤、抗悪性腫瘍薬、毒剤、薬物、及び検出可能な標識からなる群から選択される。一実施形態では、単離されたポリペプチドは、配列番号１０２によるＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＱＡＲＫＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧ、配列番号１１０によるＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＰＱＡＲＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＳ、及び配列番号１１１によるＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＨＱＡＲＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＳからなる群から選択される配列を含む。
本発明はさらに、プロテアーゼ認識部位の使用を提供し、このプロテアーゼ認識部位は、配列番号３２によるＰＱＡＲＫ又は配列番号３３によるＨＱＡＲＫであり、プロテアーゼ認識部位は、治療剤中に存在する。一実施形態では、治療剤は、単離されたポリペプチドである。一実施形態では、治療剤は、がん治療である。
本発明はさらに、薬学的組成物における本明細書に開示される単離されたポリペプチドの使用を提供する。
本発明はさらに、本明細書に開示される単離されたポリペプチドをコードする１つ又は複数の単離されたポリヌクレオチド、本明細書に開示される１つ又は複数のポリヌクレオチドを含む１つ又は複数の発現ベクター、及び本明細書に開示される１つ又は複数のポリヌクレオチド又は本明細書に開示される１つ又は複数の発現ベクターを含む１つ又は複数の宿主細胞を提供する。
さらに提供されるのは、ポリペプチドを生成する方法であり、この方法は、ポリペプチドの発現に適した条件下で本明細書に開示される宿主細胞を培養することを含む。
さらに提供されるのは、本明細書に開示される方法によって生成された単離されたポリペプチドである。さらに提供されるのは、本明細書に開示される単離されたポリペプチドと、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物である。特に、本発明は、疾患の治療を必要とする個体の疾患の治療における使用のための、単離されたポリペプチドを包含する。特定の実施形態では、前記疾患は、がんである。特定の実施態様では、個体は、ヒトである。
本発明にさらに包含されるのは、疾患の治療を必要とする個体の疾患を治療するための医薬の製造のための、本明細書に開示される単離されたポリペプチドの使用である。
本発明はさらに、個体の疾患を治療する方法を提供し、この方法は、前記個体に対して、薬学的に許容される形態の本明細書に開示される単離されたポリペプチドを含む治療的有効量の組成物を投与することを含む。疾患は、好ましくはがんである。
本発明は、（ｉ）ＩＬ－２ポリペプチドと，（ｉｉ）マスキング部分と、（ｉｉｉ）第１のプロテアーゼ切断部位を含むリンカーとを含むプロテアーゼ活性化型インターロイキン－２（ＩＬ－２）ポリペプチドを提供し、マスキング部分は、リンカーを通してＩＬ－２ポリペプチドに共有結合し、マスキング部分は、ＩＬ－２ポリペプチドに結合することができ、それによりＩＬ－２ポリペプチドを可逆的に隠すことができ、マスキング部分は、第２のプロテアーゼ切断部位を含み、マスキング部分は、第１の及び／又は第２のプロテアーゼ切断部位で切断されると、ＩＬ－２ポリペプチドを隠さない。一実施形態では、マスキング部分は、ＩＬ－２ポリペプチドのアミノ末端又はカルボキシ末端に、リンカーを通して共有結合する。一実施形態では、マスキング部分は、ＩＬ－２アンタゴニストである。一実施形態では、マスキング部分は、ＩＬ－２抗体又はＩＬ－２受容体サブユニットである。一実施形態では、ＩＬ－２抗体は、Ｆａｂ分子を含む。一実施形態では、マスキング部分は、ＭＴ２０４から得られる。一実施形態では、マスキング部分は、ＭＴ２０４である。ＭＴ２０４抗体は、例えばＶｏｌｋｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４４（２００７）１７４３－１７５３、及び国際公開第２００６／１２８６９０号に開示されている。一実施形態では、Ｆａｂ分子は、単鎖Ｆａｂ分子である。一実施形態では、第２のプロテアーゼ切断部位は、Ｆａｂの重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）との間に位置している。一実施形態では、第１のプロテアーゼ切断部位及び第２のプロテアーゼ切断部位は、各々が少なくとも１つのプロテアーゼ認識配列を含む。一実施形態では、第１のプロテアーゼ切断部位のプロテアーゼ認識配列及び／又は第２のプロテアーゼ切断部位のプロテアーゼ認識配列（認識配列）は：（ａ）ＲＱＡＲＶＶＮＧ（配列番号１６）；（ｂ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＧＲＳＲＧＳＦＰ（配列番号１７）；（ｃ）ＲＱＡＲＶＶＮＧＸＸＸＸＸＶＰＬＳＬＹＳＧ（配列番号１８），（Ｘは、いずれかのアミノ酸である）；（ｄ）ＲＱＡＲＶＶＮＧＶＰＬＳＬＹＳＧ（配列番号１９）；（ｅ）ＰＬＧＬＷＳＱ（配列番号２０）；（ｆ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＲＱＡＲＶＶＮＧ（配列番号２１）；（ｇ）ＦＶＧＧＴＧ（配列番号２２）；（ｈ）ＫＫＡＡＰＶＮＧ（配列番号２３）；（ｉ）ＰＭＡＫＫＶＮＧ（配列番号２４）；（ｊ）ＱＡＲＡＫＶＮＧ（配列番号２５）；（ｋ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ（配列番号２６）；（ｌ）ＱＡＲＡＫ（配列番号２７）；（ｍ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＰＭＡＫＫ（配列番号２８）；（ｎ）ＫＫＡＡＰ（配列番号２９）；（ｏ）ＰＭＡＫＫ（配列番号３０）；（ｐ）ＹＡＡＲＫＧＧＩ（配列番号３１）；（ｑ）ＰＱＡＲＫ（配列番号３２）；及び（ｒ）ＨＱＡＲＫ（配列番号３３）からなる群から選択される。
一実施形態では、第１のプロテアーゼ切断部位のプロテアーゼ認識配列は、第２のプロテアーゼ切断部位のプロテアーゼ認識配列とは異なる。一実施形態では、第１のプロテアーゼ切断部位のプロテアーゼ認識配列は、第２のプロテアーゼ切断部位のプロテアーゼ認識配列と同じである。
一実施形態では、第１のプロテアーゼ切断部位のプロテアーゼ認識配列及び／又は第２のプロテアーゼ切断部位のプロテアーゼ認識配列は、ＰＭＡＫＫ（配列番号３０）、ＰＱＡＲＫ（配列番号３２）又はＨＱＡＲＫ（配列番号３３）からなる群から選択される。一実施形態では、第１のプロテアーゼ切断部位のプロテアーゼ認識配列は、ＰＭＡＫＫ（配列番号３０）、ＰＱＡＲＫ（配列番号３２）又はＨＱＡＲＫ（配列番号３３）からなる群から選択される。一実施形態では、第２のプロテアーゼ切断部位のプロテアーゼ認識配列は、ＰＭＡＫＫ（配列番号３０）、ＰＱＡＲＫ（配列番号３２）又はＨＱＡＲＫ（配列番号３３）からなる群から選択される。一実施形態では、第１のプロテアーゼ切断部位のプロテアーゼ認識配列及び第２のプロテアーゼ切断部位のプロテアーゼ認識配列は、ＰＭＡＫＫ（配列番号３０）、ＰＱＡＲＫ（配列番号３２）又はＨＱＡＲＫ（配列番号３３）からなる群から選択される。
一実施形態では、第１のプロテアーゼ切断部位のプロテアーゼ認識配列及び／又は第２のプロテアーゼ切断部位のプロテアーゼ認識配列は、ＰＭＡＫＫ（配列番号３０）である。一実施形態では、第１のプロテアーゼ切断部位のプロテアーゼ認識配列は、ＰＭＡＫＫ（配列番号３０）である。一実施形態では、第２のプロテアーゼ切断部位のプロテアーゼ認識配列は、ＰＭＡＫＫ（配列番号３０）である。一実施形態では、第１のプロテアーゼ切断部位のプロテアーゼ認識配列及び第２のプロテアーゼ切断部位のプロテアーゼ認識配列は、ＰＭＡＫＫ（配列番号３０）である。
一実施形態では、第１のプロテアーゼ切断部位のプロテアーゼ認識配列及び／又は第２のプロテアーゼ切断部位のプロテアーゼ認識配列は、ＰＱＡＲＫ（配列番号３２）である。一実施形態では、第１のプロテアーゼ切断部位のプロテアーゼ認識配列は、ＰＱＡＲＫ（配列番号３２）である。一実施形態では、第２のプロテアーゼ切断部位のプロテアーゼ認識配列は、ＰＱＡＲＫ（配列番号３２）である。一実施形態では、第１のプロテアーゼ切断部位のプロテアーゼ認識配列及び第２のプロテアーゼ切断部位のプロテアーゼ認識配列は、ＰＱＡＲＫ（配列番号３２）である。
一実施形態では、第１のプロテアーゼ切断部位のプロテアーゼ認識配列及び／又は第２のプロテアーゼ切断部位のプロテアーゼ認識配列は、ＨＱＡＲＫ（配列番号３３）である。一実施形態では、第１のプロテアーゼ切断部位のプロテアーゼ認識配列は、ＨＱＡＲＫ（配列番号３３）である。一実施形態では、第２のプロテアーゼ切断部位のプロテアーゼ認識配列は、ＨＱＡＲＫ（配列番号３３）である。一実施形態では、第１のプロテアーゼ切断部位のプロテアーゼ認識配列及び第２のプロテアーゼ切断部位のプロテアーゼ認識配列は、ＨＱＡＲＫ（配列番号３３）である。
一実施形態では、ＩＬ－２ポリペプチドは、野生型ＩＬ－２、好ましくは配列番号１３によるヒトＩＬ－２、又は変異型ＩＬ－２ポリペプチドである。一実施形態では、変異型ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号１３によるヒトＩＬ－２のＴ３Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｌ７２Ｇ、Ｃ１２５Ａの群から洗濯されるいずれかのアミノ酸置換を含む。一実施形態では、変異型ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号１３によるヒトＩＬ－２のアミノ酸置換Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＬ７２Ｇを含む。一実施形態では、変異型ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号１３によるヒトＩＬ－２のアミノ酸置換Ｔ３Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｌ７２Ｇ及びＣ１２５Ａを含む。
一実施形態では、マスキング部分及びリンカーは、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、プロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、ＩＬ－２ポリペプチドはさらに、非ＩＬ－２部分に結合する。一実施形態では、ＩＬ－２ポリペプチドは、カルボキシ末端ペプチド結合をマスキング部分と、及びアミノ末端ペプチド結合を非ＩＬ－２部分と共有するか、又は前記ＩＬ－２ポリペプチドは、アミノ末端ペプチド結合をマスキング部分と、及びカルボキシ末端ペプチド結合を非ＩＬ－２部分と共有する。一実施形態では、非ＩＬ－２部分は、抗原結合部分又はエフェクター細胞結合部分である。
さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載されるプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド、並びに抗原結合部分及び／又はエフェクター細胞結合部分を含むイムノコンジュゲートを提供する。一実施形態では、前記プロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチドは、アミノ末端ペプチド結合又はカルボキシ末端ペプチド結合を、抗原結合部分又はエフェクター細胞結合部分と共有する。一実施態様では、前記イムノコンジュゲートは、第１の抗原結合部分と第２の抗原結合部分、又は第１のエフェクター細胞抗原結合部分と第２のエフェクター細胞抗原結合部分、又は抗原結合部分とエフェクター細胞結合部分を含む。一実施形態では、（ｉ）プロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチドは、アミノ末端ペプチド結合若しくはカルボキシ末端ペプチド結合を前記第１の抗原結合部分と共有し、前記第２の抗原結合部分は、アミノ末端ペプチド結合若しくはカルボキシ末端ペプチド結合を、ａ）前記プロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド若しくはｂ）前記第１の抗原結合部分と共有するか；（ｉｉ）プロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチドは、アミノ末端ペプチド結合若しくはカルボキシ末端ペプチド結合を前記第１のエフェクター細胞結合部分と共有し、前記第２のエフェクター細胞結合部分は、アミノ末端ペプチド結合若しくはカルボキシ末端ペプチド結合を、ａ）前記プロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド若しくはｂ）前記第１のエフェクター細胞結合部分と共有するか；（ｉｉｉ）プロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチドは、アミノ末端ペプチド結合若しくはカルボキシ末端ペプチド結合を抗原結合部分と共有し、エフェクター細胞結合部分は、アミノ末端ペプチド結合若しくはカルボキシ末端ペプチド結合を、ａ）前記プロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド若しくはｂ）前記抗原結合部分と共有するか；又は（ｉｖ）プロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチドは、アミノ末端ペプチド結合若しくはカルボキシ末端ペプチド結合をエフェクター細胞結合部分と共有し、抗原結合部分は、アミノ末端ペプチド結合若しくはカルボキシ末端ペプチド結合を、ａ）前記プロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド若しくはｂ）前記エフェクター細胞結合部分と共有する。
一実施形態では、本明細書に開示されるプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又は本明細書に開示されるイムノコンジュゲートに含まれる抗原結合部分又はエフェクター細胞結合部分は、抗体又は抗体断片である。一実施形態では、本明細書に開示されるプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又は本明細書に開示されるイムノコンジュゲートに含まれる抗原結合部分及びエフェクター細胞結合部分は、抗体又は抗体断片である。一実施形態では、抗原結合部分又はエフェクター細胞結合部分は、Ｆａｂ分子及びｓｃＦｖ分子からなる群から選択される。一実施形態では、抗原結合部分及びエフェクター細胞結合部分は、Ｆａｂ分子及びｓｃＦｖ分子からなる群から選択される。一実施形態では、抗原結合部分又はエフェクター細胞結合部分は、免疫グロブリン分子、特にＩｇＧ分子である。一実施形態では、抗原結合部分及びエフェクター細胞結合部分は、免疫グロブリン分子、特にＩｇＧ分子である。一実施形態では、シス・ターゲティングを達成するために、抗原結合部分が、腫瘍細胞上又は腫瘍細胞環境内に存在する抗原に向けられるか、又は前記エフェクター細胞結合部分が、腫瘍細胞環境内に存在するエフェクター細胞に向けられる。一実施形態では、シス・ターゲティングを達成するために、抗原結合部分が、腫瘍細胞上又は腫瘍細胞環境内に存在する抗原に向けられ、前記エフェクター細胞結合部分が、腫瘍細胞環境内に存在するエフェクター細胞に向けられる。
本発明はさらに、本明細書に記載されるプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又は本明細書に記載されるイムノコンジュゲートをコードする１つ又は複数の単離されたポリヌクレオチド、本明細書に記載されるポリヌクレオチドを含む１つ又は複数の発現ベクター、及び本明細書に記載されるポリヌクレオチド又は本明細書に記載される発現ベクターを含む１つ又は複数の宿主細胞を提供する。
さらに提供されるのは、本明細書に記載されるプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを生成する方法であり、この方法は、プロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートの発現に適した条件下で、本明細書に記載される宿主細胞を培養することを含む。
さらに提供されるのは、本明細書に記載される方法により生成された、本明細書に記載されるプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートである。さらに提供されるのは、本明細書に開示されるプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物である。特に、本発明は、治療を必要とする個体の疾患の治療における使用のための、本明細書に記載されるプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを包含する。特定の実施形態では、前記疾患は、がんである。特定の実施態様では、個体は、ヒトである。
本発明にさらに包含されるのは、治療を必要とする個体の疾患を治療するための医薬の製造のための、本明細書に記載されるプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートの使用である。さらに提供されるのは、個体の疾患を治療する方法であり、この方法は、前記個体に対して、本明細書に記載されるプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを薬学的に許容される形態で含む治療的有効量の組成物を投与することを含む。前記疾患は、好ましくはがんである。
さらに提供されるのは、個体の免疫系を刺激する方法であり、この方法は、前記個体に対して、本明細書に記載されるプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを薬学的に許容される形態で含む、有効量の組成物を投与することを含む。
Ａは、Ｃ末端ＩＬ２ｖを有するマスクされていないコントロールコンストラクトを示している（ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＯＡ）。空のＦｃノブ鎖のＣ末端に融合したＩＬ２ｖを有するこのマスクされていないワンアーム型ＣＤ８標的化ＩｇＧ ＰＧ ＬＡＬＡは、マスクされたコンストラクト及びマトリプターゼマスクされていないコンストラクトとの比較のためのコントロールとして使用された。Ｂは、２つのＰＭＡＫＫマトリプターゼ放出部位を有するｓｃＦｖ ＭＴ２０４マスクされたコンストラクトを示している（ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＭＴ２０４ ２ｘＰＭＡＫＫ）。このコンストラクトでは、ＩＬ２ｖは、Ｆｃノブ鎖のヒンジ領域に融合しており、ＩＬ２ｖのＮ末端に連結したｓｃＦｖ ＭＴ２０４によってマスクされている。２つのＰＭＡＫＫマトリプターゼ放出部位の一方は、ｓｃＦｖ ＭＴ２０４のＶＬドメインとＩＬ２ｖとの間に位置づけられており、２つ目は、ｓｃＦｖ ＭＴ２０４のＶＬドメインとＶＨドメインとの間のリンカーに位置づけられている。Ｃは、マトリプターゼ放出部位を含まないｓｃＦｖ ＭＴ２０４マスクされたコンストラクトを示している（ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＭＴ２０４非切断型）。このコンストラクトは、非切断型リンカーを含んでいることを除いてＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＭＴ２０４ ２ｘＰＭＡＫＫと同様であり、マスクされていない（Ａ及びＥ）及びマトリプターゼマスクされていないＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＭＴ２０４ ２ｘＰＭＡＫＫのコンパレータとして使用された。Ｄは、１つのＭＭＰ９／マトリプターゼ放出部位を有するジスルフィド安定化ｓｃＦｖ ＭＴ２０４マスクされたコンストラクトを示している（ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＭＴ２０４ １ｘＭＭＰ９／マトリプターゼ）。このジスルフィド安定化（ｄｓ）ｓｃＦｖ ＭＴ２０４マスクされたコンストラクトは、アンマスキングのためのプロテアーゼ放出部位を１つだけ含有しており、より正確には、ＭＭＰ９／マトリプターゼ放出部位は、ｄｓ－ｓｃＦｖのＶＬドメインとＩＬ２ｖとの間に位置づけられている。Ｅは、Ｎ末端ＩＬ２ｖを有するマスクされていないコントロールコンストラクトを示している（ＩＬ２ｖ＿ＣＤ８ｖ１１＿Ｆｃ（ｋｉｈ））。このコンストラクトでは、ＩＬ２ｖは、Ｆｃノブ鎖のヒンジ領域に融合している。これは、マスクされたコンストラクトへのコンパレータとして使用された（Ｂ～Ｄ）。 マスクされたマトリプターゼ消化又は未消化ＣＤ８－ＩＬ２ｖコンストラクトで４日間治療したときの、発光により決定されたヒトＮＫ細胞株ＮＫ９２の増殖を示している。 Ａ～Ｃは、マスクされたマトリプターゼ消化又は未消化ＣＤ８－ＩＬ２ｖコンストラクトで５日間治療したときの、フローサイトメトリーによって決定された、ＰＢＭＣ内でのＣＤ４Ｔ細胞、ＣＤ８Ｔ細胞及びＮＫ細胞の増殖を示している。 Ａ～Ｃは、マスクされたマトリプターゼ消化又は未消化ＣＤ８－ＩＬ２ｖコンストラクトで５日間治療したときの、フローサイトメトリーによって決定された、ＰＢＭＣ内でのＣＤ４Ｔ細胞、ＣＤ８Ｔ細胞及びＮＫ細胞の活性化を示している。 マトリプターゼあり及びマトリプターゼなしでインキュベートされた、コンストラクトの非還元ＣＥ－ＳＤＳの電子ジェル（Ａ：ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＯＡ；Ｂ：ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＭＴ２０４ ２ｘＰＭＡＫＫ；Ｃ：ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＭＴ２０４非切断型）を示している。 ＰＱＡＲＫマトリプターゼ部位を含む、マスクされたヒトＰＤ１標的化ＩＬ２ｖコンストラクトと、それぞれのコントロールとを示している。Ａ（Ｐ１ＡＧ９５９７）は、Ｆｃノブ鎖のヒンジ領域のＮ末端に融合したマスクされたＩＬ２ｖとマスクの解除のための２つのＰＱＡＲＫマトリプターゼ部位とを有する、ワンアーム型ヒトＰＤ１標的化ヒトＩｇＧ ＰＧ ＬＡＬＡを示している；Ｂ（Ｐ１ＡＧ０９２９）は、Ｆｃノブ鎖のヒンジ領域のＮ末端に融合したマスクされたＩＬ２ｖを有し、マトリプターゼ放出部位を有さない、ワンアーム型ヒトＰＤ１標的化ヒトＩｇＧ ＰＧ ＬＡＬＡを示している（非切断型コントロール）；Ｃ（Ｐ１ＡＧ３０７１）は、Ｆｃノブ鎖のヒンジ領域のＮ末端に融合したＩＬ２ｖを有する、ワンアーム型ヒトＰＤ１標的化ヒトＩｇＧ ＰＧ ＬＡＬＡを示している（マスクされていないコントロール）；Ｄ（Ｐ１ＡＧ９６０６）は、Ｆｃノブ鎖のＣ末端に融合したマスクされたＩＬ２ｖ（「インライン」）とマスクの解除のための２つのＰＱＡＲＫマトリプターゼ部位とを有する、二価のヒトＰＤ１標的化ヒトＩｇＧ ＰＧ ＬＡＬＡを示している；Ｅ（Ｐ１ＡＧ５７４０）は、Ｆｃノブ鎖のＣ末端に融合したマスクされたＩＬ２ｖ（「インライン」）を有し、マトリプターゼ放出部位を有さない、二価のヒトＰＤ１標的化ヒトＩｇＧ ＰＧ ＬＡＬＡを示している（非切断型コントロール）；Ｆ（Ｐ１ＡＧ５７４１ ＆ Ｐ１ＡＡ７１４６）は、Ｆｃノブ鎖のＣ末端に融合したＩＬ２ｖを有する、二価のヒトＰＤ１標的化ヒトＩｇＧ ＰＧ ＬＡＬＡを示している（マスクされていないコントロール）；Ｇ（Ｐ１ＡＧ９６０７）は、Ｆｃノブ鎖のＣ末端に融合したＩＬ２ｖ及びＦｃホール鎖のＣ末端に融合したマスク（「別々の鎖上にあるＩＬ２ｖとマスク」）とマスクの解除のための２つのＰＱＡＲＫマトリプターゼ部位とを有する、二価のヒトＰＤ１標的化ヒトＩｇＧ ＰＧ ＬＡＬＡを示している。 ＰＱＡＲＫマトリプターゼ部位を含むマスクされたヒトＰＤ１標的化ＩＬ２ｖコンストラクトのマウス代用物と、それぞれのコントロールとを示している。Ａ（Ｐ１ＡＧ９６２９）は、Ｆｃ ＤＤ－鎖のヒンジ領域のＮ末端に融合したマスクされたＩＬ２ｖとマスクの解除のための２つのＰＱＡＲＫマトリプターゼ部位とを有する、ワンアーム型ヒトＰＤ１標的化マウスＩｇＧ ＤＡ ＰＧを示している；Ｂ（Ｐ１ＡＧ０９０５）は、Ｆｃ ＤＤ－鎖のヒンジ領域のＮ末端に融合したマスクされたＩＬ２ｖを有し、マトリプターゼ放出部位を有さない、ワンアーム型ヒトＰＤ１標的化マウスＩｇＧ ＤＡ ＰＧを示している（非切断型コントロール）；Ｃ（Ｐ１ＡＧ３１０８）は、Ｆｃ ＤＤ－鎖のヒンジ領域のＮ末端に融合したＩＬ２ｖを有する、ワンアーム型ヒトＰＤ１標的化マウスＩｇＧ ＤＡ ＰＧを示している（マスクされていないコントロール）；Ｄ（Ｐ１ＡＧ９９８３）は、Ｆｃ ＤＤ－鎖のＣ末端に融合したマスクされたＩＬ２ｖ（「インライン」）とマスクの解除のための２つのＰＱＡＲＫマトリプターゼ部位とを有する、二価のヒトＰＤ１標的化マウスＩｇＧ ＤＡ ＰＧを示している；Ｅ（Ｐ１ＡＧ９９８４）は、Ｆｃ ＤＤ－鎖のＣ末端に融合したマスクされたＩＬ２ｖ（「インライン」）を有し、マトリプターゼ放出部位を有さない、二価のヒトＰＤ１標的化マウスＩｇＧ ＤＡ ＰＧを示している（非切断型コントロール）；Ｆ（Ｐ１ＡＧ７５５２）は、Ｆｃ ＤＤ－鎖のＣ末端に融合したＩＬ２ｖを有する、二価のヒトＰＤ１標的化マウスＩｇＧ ＤＡ ＰＧを示している（マスクされていないコントロール）。 ＰＱＡＲＫマトリプターゼ部位を有するマスクされたマウスＰＤ１標的化ＩＬ２ｖコンストラクトのマウス代用物と、それぞれのコントロールとを示している。Ａ（Ｐ１ＡＧ９６３０）は、Ｆｃ ＤＤ－鎖のヒンジ領域のＮ末端に融合したマスクされたＩＬ２ｖとマスクの解除のための２つのＰＱＡＲＫマトリプターゼ部位とを有する、ワンアーム型マウスＰＤ１標的化マウスＩｇＧ ＤＡ ＰＧを示している；Ｂ（Ｐ１ＡＧ０９０８）は、Ｆｃ ＤＤ－鎖のヒンジ領域のＮ末端に融合したマスクされたＩＬ２ｖを有し、マトリプターゼ放出部位を有さない、ワンアーム型マウスＰＤ１標的化マウスＩｇＧ ＤＡ ＰＧを示している（非切断型コントロール）；Ｃ（Ｐ１ＡＧ３１０９）は、Ｆｃ ＤＤ－鎖のヒンジ領域のＮ末端に融合したＩＬ２ｖを有する、ワンアーム型マウスＰＤ１標的化マウスＩｇＧ ＤＡ ＰＧを示している（マスクされていないコントロール）；Ｄ（Ｐ１ＡＧ９９８９）は、Ｆｃ ＤＤ－鎖のＣ末端に融合したマスクされたＩＬ２ｖ（「インライン」）とマスクの解除のための２つのＰＱＡＲＫマトリプターゼ部位とを有する、二価のマウスＰＤ１標的化マウスＩｇＧ ＤＡ ＰＧを示している；Ｅ（Ｐ１ＡＧ９９９０）は、Ｆｃ ＤＤ－鎖のＣ末端に融合したマスクされたＩＬ２ｖ（「インライン」）を有し、マトリプターゼ放出部位を有さない、二価のマウスＰＤ１標的化マウスＩｇＧ ＤＡ ＰＧを示している（非切断型コントロール）；Ｆ（Ｐ１ＡＧ９９９１）は、Ｆｃノブ鎖のＣ末端に融合したＩＬ２ｖを有する、二価のマウスＰＤ１標的化マウスＩｇＧ ＤＡ ＰＧを示している（マスクされていないコントロール）；Ｇ（Ｐ１ＡＧ９９９４）は、Ｆｃ ＫＫ＋鎖のＣ末端に融合したＩＬ２ｖ及びＦｃ ＤＤ－鎖のＣ末端に融合したマスク（「別々の鎖上にあるＩＬ２ｖとマスク」）とマスクの解除のための２つのＰＱＡＲＫマトリプターゼ部位とを有する、二価のマウスＰＤ１標的化マウスＩｇＧ ＤＡ ＰＧを示している；Ｈ（Ｐ１ＡＧ９９９５）は、Ｆｃ ＫＫ＋鎖のＣ末端に融合したＩＬ２ｖ及びＦｃ ＤＤ－鎖のＣ末端に融合したマスク（「別々の鎖上にあるＩＬ２ｖとマスク」）を有し、マトリプターゼ放出部位を有さない二価のマウスＰＤ１標的化マウスＩｇＧ ＤＡ ＰＧを示している（非切断型コントロール）。 ＰＭＡＫＫマトリプターゼ部位を含むマスクされたヒトＣＤ８標的化ＩＬ２ｖコンストラクトと、それぞれのコントロールとを示している。Ａ（Ｐ１ＡＦ６８８２）は、Ｆｃノブ鎖のヒンジ領域のＮ末端に融合したマスクされたＩＬ２ｖとマスクの解除のための２つのＰＭＡＫＫマトリプターゼ部位とを有する、ワンアーム型ヒトＣＤ８標的化ヒトＩｇＧ ＰＧ ＬＡＬＡを示している；Ｂ（Ｐ１ＡＦ６８８３）は、Ｆｃノブ鎖のヒンジ領域のＮ末端に融合したマスクされたＩＬ２ｖを有し、マトリプターゼ放出部位を有さない、ワンアーム型ヒトＣＤ８標的化ヒトＩｇＧ ＰＧ ＬＡＬＡを示している（非切断型コントロール）；Ｃ（Ｐ１ＡＦ７４６８）は、Ｆｃノブ鎖のヒンジ領域のＮ末端に融合したＩＬ２ｖを有する、ワンアーム型ヒトＣＤ８標的化ヒトＩｇＧ ＰＧ ＬＡＬＡを示している（マスクされていないコントロール）。 ＰＭＡＫＫ又はＹＡＡＲＫＧＧＩマトリプターゼ部位を有するマスクされたヒトＰＤ１標的化ＩＬ２ｖコンストラクトのマウス代用物と、それぞれのコントロールを示している。Ａ（Ｐ１ＡＧ０９０７）は、Ｆｃ ＤＤ－鎖のヒンジ領域のＮ末端に融合したマスクされたＩＬ２ｖとマスクの解除のための２つのＰＭＡＫＫマトリプターゼ部位とを有する、ワンアーム型ヒトＰＤ１標的化マウスＩｇＧ ＤＡ ＰＧを示している；Ｂ（Ｐ１ＡＧ０９０５）は、Ｆｃ ＤＤ－鎖のヒンジ領域のＮ末端に融合したマスクされたＩＬ２ｖを有し、マトリプターゼ放出部位を有さない、ワンアーム型ヒトＰＤ１標的化マウスＩｇＧ ＤＡ ＰＧを示している（非切断型コントロール）；Ｃ（Ｐ１ＡＧ３１０８）は、Ｆｃ ＤＤ－鎖のヒンジ領域のＮ末端に融合したＩＬ２ｖを有する、ワンアーム型ヒトＰＤ１標的化マウスＩｇＧ ＤＡ ＰＧを示している（マスクされていないコントロール）；Ｄ（Ｐ１ＡＥ２７９１）は、Ｆｃ ＤＤ－鎖のＣ末端に融合したマウスＩＬ２ｖを有する、二価のヒトＰＤ１標的化マウスＩｇＧ ＤＡ ＰＧを示している（マウスＩＬ２ｖを有する、さらなるマスクされていないコントロール）；Ｅ（Ｐ１ＡＧ１５４５）は、Ｆｃ ＤＤ－鎖のヒンジ領域のＮ末端に融合したマスクされたＩＬ２ｖとマスクの解除のための２つのＹＡＡＲＫＧＧＩマトリプターゼ部位とを有する、ワンアーム型ヒトＰＤ１標的化マウスＩｇＧ ＤＡ ＰＧを示している。 ＰＢＭＣ内部でのＰＤ１陽性ＣＤ４Ｔ細胞（Ａ）及びＣＤ ８Ｔ細胞（Ｂ）に対する図示のコンストラクトの結合が、フローサイトメトリーによって決定された。分子は、蛍光標識された抗ヒトＦｃ特異的二次抗体を用いて検出された。 図示の分子によって誘導されたヒトＮＫ細胞株ＮＫ９２細胞の増殖が、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏを使用して測定された。Ａは、未消化の物質を示しており、すなわちマトリプターゼは付加されていない。Ｂは、マトリプターゼ消化物質を示している。 ＩＬ２ｖ含有分子で治療したときの、ＰＤ１ブロックＣＤ４Ｔ細胞（Ａ）又はＰＤ１陽性ＣＤ４Ｔ細胞（Ｂ）におけるＳＴＡＴ５リン酸化が、フローサイトメトリーによって決定された。 ＰＢＭＣ内部でのＰＤ１陽性ＣＤ４Ｔ細胞（Ａ）及びＣＤ ８Ｔ細胞（Ｂ）に対する図示のコンストラクトの結合が、フローサイトメトリーによって決定された。分子は、蛍光標識された抗ヒトＦｃ又は抗マウス特異的二次抗体を用いて検出された。 図示の分子によって誘導されたヒトＮＫ細胞株ＮＫ９２細胞の増殖が、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏを使用して測定された。Ａ及びＢは、ＰＭＡＫＫ部位又はＹＡＡＲＫＧＣＣＩ部位でのマトリプターゼ消化マウスＴＡコンストラクトとマトリプターゼ未消化マウスＴＡコンストラクトとの比較を示している。 図示の分子によって誘導されたヒトＮＫ細胞株ＮＫ９２細胞の増殖が、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏを使用して測定された。Ｃ及びＤは、ＰＱＡＲＫ部位を有するマウスＴＡコンストラクト及びヒトＴＡコンストラクトと、それぞれのコントロールコンストラクトを示している。 ＴＡ－ＰＤ１－ＩＬ２ｖ切断型Ｍａｂ（ＰＭＡＫＫ又はＹＡＡＲＫＧＧＩリンカー）、非切断型Ｍａｂ及びマスクされていないＭａｂを単剤として用いた有効性実験の結果を、臨床リードＰＤ１－ＩＬ２ｖとの比較で提示している。ＫＰＣ－４６６２膵臓癌細胞株を、Ｂｌａｃｋ ６－ｈｕＰＤ１ ｔｇマウスに皮下注射し、皮下モデルにおける腫瘍増殖阻害を試験した。腫瘍サイズは、ノギスを使用して測定された。治療法は、腫瘍が２００ｍｍ３に到達した時に開始された。マウス１匹当たりに注射された抗体の量は、１週間に１回の投与で、ＴＡ－ＰＤ１－ＩＬ２ｖ ＰＭＡＫＫ切断型、ＴＡ－ＰＤ１－ＩＬ２ｖ ＹＡＡＲＫＧＧＩ切断型、ＴＡ－ＰＤ１－ＩＬ２ｖマスクなし及びＰＤ１－ＩＬ２ｖについては１ｍｇ／ｋｇであり、ＴＡ－ＰＤ１－ＩＬ２ｖ非切断型については３ｍｇ／ｋｇであった。治療は３週間続けた。ＴＡ－ＰＤ－ＩＬ２ｖ ＹＡＲＲＫＧＧＩは、腫瘍増殖阻害の観点から、ビヒクル、非切断型及びマスクされていないＭａｂの単剤の群と比較して、優れた有効性を媒介した。ＴＡ－ＰＤ－ＩＬ２ｖ ＹＡＲＲＫＧＧＩ切断型リンカーは、ＰＤ１－ＩＬ２ｖ群と同様の腫瘍増殖阻害を示した。 ＭＨＣ１誘導（Ａ）及びＰＤ－Ｌ１誘導（１７Ｂ）を特徴とするマウスインターフェロン－γコンストラクトの活性アッセイを提示している。
定義
別途指定のない限り、本明細書では、当技術分野で一般的に使用される用語を使用する。
本明細書で使用される「インターロイキン－２」又は「ＩＬ－２」という用語は、別途指示がない限り、哺乳動物、例えば霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）を含む、任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＩＬ－２を指す。この用語は、未処理のＩＬ－２と、細胞におけるプロセシングから生じるＩＬ－２の任意の形態を包含する。この用語は、ＩＬ－２の天然に存在するバリアント、例えばスプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。例示的なヒトＩＬ－２のアミノ酸配列を配列番号１３に示す。
本明細書で使用される「ＩＬ－２変異体」又は「変異型ＩＬ－２ポリペプチド」という用語は、完全長ＩＬ－２、ＩＬ－２の切断型、及びＩＬ－２が融合又は化学的コンジュゲーション等によって別の分子に連結した形態を含む、ＩＬ－２分子の種々の形態のあらゆる変異形態を包含することを意図している。「完全長」は、ＩＬ－２に関して使用される場合、成熟した天然の長さのＩＬ－２分子を意味することを意図している。例えば、完全長ヒトＩＬ－２は、１３３個のアミノ酸を有する分子を指す（例えば、配列番号１３参照）。種々の形態のＩＬ－２変異体は、ＩＬ－２とＣＤ２５との相互作用に影響を与える少なくとも１つのアミノ酸変異を有することを特徴とする。この変異は、その位置に通常位置する野生型アミノ酸残基の置換、欠失、トランケーション又は修飾を含みうる。アミノ酸置換によって得られる変異体が好ましい。別途指示がない限り、ＩＬ－２変異体は、ここでは、ＩＬ－２変異体ペプチド配列、ＩＬ－２変異体ポリペプチド、ＩＬ－２変異体タンパク質又はＩＬ－２変異体アナログと呼ばれうる。
ＩＬ－２の種々の形態の命名は、本明細書では、配列番号１３に示される配列に対して行われる。同じ変異を示すために、本明細書では種々の名称が使用されうる。例えば、位置４２でのフェニルアラニンからアラニンへの変異は、４２Ａ、Ａ４２、Ａ４２、Ｆ４２Ａ又はＰｈｅ４２Ａｌａとして示すことができる。
本明細書で使用されるＩＬ－２の「野生型」形態は、野生型形態が、変異型ＩＬ－２ポリペプチドの各アミノ酸位置に野生型アミノ酸を有する以外は、変異型ＩＬ－２ポリペプチドと同じＩＬ－２の形態である。例えば、ＩＬ－２変異体が完全長ＩＬ－２である（すなわちＩＬ－２が、任意の他の分子に融合又はコンジュゲートしていない）場合、この変異体の野生型形態は完全長天然ＩＬ－２である。ＩＬ－２変異体が、ＩＬ－２とＩＬ－２の下流がコードされた別のポリペプチド（例えば抗体鎖）との融合体である場合、このＩＬ－２異性体の野生型形態は、同じ下流のポリペプチドに融合した、野生型アミノ酸配列を有するＩＬ－２である。さらに、ＩＬ－２変異体が、ＩＬ－２の切断型（ＩＬ－２のトランケートされていない部分の中の変異した形態又は修飾された形態）である場合、このＩＬ－２変異体の野生型形態は、同様に、野生型配列を有するトランケートされたＩＬ－２である。種々の形態のＩＬ－２変異体のＩＬ－２受容体結合親和性又は生物活性を、対応するＩＬ－２の野生型形態と比較する目的のために、野生型という用語は、天然に存在する天然ＩＬ－２と比較して、ＩＬ－２受容体結合に影響を与えない１つ又は複数のアミノ酸変異、例えば、ヒトＩＬ－２の残基１２５に対応する位置のシステインのアラニンへの置換を含むＩＬ－２の形態を包含する。いくつかの実施態様では、本発明の目的のための野生型ＩＬ－２は、アミノ酸置換Ｃ１２５Ａを含む。本発明による一部の実施態様では、変異型ＩＬ－２ポリペプチドと比較される野生型ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。
本明細書で使用される「ＣＤ２５」又は「ＩＬ－２受容体のα－サブユニット」という用語は、別途指示がない限り、哺乳動物、例えば霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）を含む、任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＣＤ２５を指す。この用語は、「完全長」の未処理のＣＤ２５と、細胞におけるプロセシングから生じるＣＤ２５の任意の形態を包含する。この用語は、ＣＤ２５の天然に存在するバリアント、例えばスプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。一部の実施態様では、ＣＤ２５はヒトＣＤ２５である。
本明細書で使用される「高親和性ＩＬ－２受容体」という用語は、受容体γサブユニット（一般的なサイトカイン受容体γサブユニット、γｃ、又はＣＤ１３２としても知られる）、受容体βサブユニット（ＣＤ１２２又はｐ７０としても知られる）及び受容体αサブユニット（ＣＤ２５又はｐ５５としても知られる）からなるＩＬ－２受容体のヘテロ三量体形態を指す。「中程度親和性ＩＬ－２受容体」という用語は、対照的に、γサブユニット及びβサブユニットのみを含み、α－サブユニットを含まないＩＬ－２受容体を指す（総説として、例えば、Ｏｌｅｊｎｉｃｚａｋ ａｎｄ Ｋａｓｐｒｚａｋ，Ｍｅｄ Ｓｃｉ Ｍｏｎｉｔ １４，ＲＡ１７９－１８９（２００８）を参照されたい）。
「制御性Ｔ細胞」又は「Ｔｒｅｇ細胞」は、他のＴ細胞の応答を抑制することのできる特殊な種類のＣＤ４＋ Ｔ細胞を意味する。Ｔｒｅｇ細胞は、ＩＬ－２受容体（ＣＤ２５）のα－サブユニット及び転写因子フォークヘッドボックスＰ３（ＦＯＸＰ３）の発現を特徴とし（Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２２，５３１－６２（２００４））、腫瘍によって発現されるものを含む、抗原に対する末梢性セルフトレランスの誘導及び維持に重要な役割を果たす。Ｔｒｅｇ細胞は、その機能及び成長、並びにその抑制特徴の誘導のために、ＩＬ－２を必要とする。
本明細書で使用される「エフェクター細胞」という用語は、ＩＬ－２の細胞毒性効果を媒介するリンパ球の集合を指す。エフェクター細胞には、エフェクターＴ細胞、例えば、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞、ＮＫ細胞、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞及びマクロファージ／単球が含まれる。
本明細書で使用される「抗原結合分子」という用語は、その最も広い意味で、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の例は、免疫グロブリン及び誘導体、例えばそれらの断片である。
「二重特異性」という用語は、抗原結合分子が、少なくとも２つの別個の抗原決定基に特異的に結合することができることを意味する。典型的には、二重特異性抗原結合分子は２つの抗原結合部位を含み、それらの各々が異なる抗原決定基に対して特異的である。一部の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、２つの抗原決定基に、特に２つの異なる細胞上に発現する２つの抗原決定基に同時に結合することができる。
本明細書で使用される用語「価」は、特定数の抗原結合部位が抗原結合分子内に存在することを示すものである。したがって、「抗原に対する一価の結合」という用語は、抗原に特異的な１つ（かつ１つまで）の抗原結合部位が抗原結合分子内に存在することを示すものである。
「抗原結合部位」は、抗原との相互作用を提供する抗原結合分子の部位、すなわち１つ又は複数のアミノ酸残基を指す。例えば、抗体の抗原結合部位は、相補性決定領域（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含む。天然免疫グロブリン分子は、典型的には２つの抗原結合部位を有し、Ｆａｂ分子は、典型的には単一の抗原結合部位を有する。
本明細書で使用される用語「抗原結合部分」は、抗原決定基に特異的に結合するポリペプチド分子を指す。一実施態様では、抗原結合部分は、それが結合する実体（例えば、第２の抗原結合部分）を標的部位へ、例えば特定の型の腫瘍細胞又は抗原決定基を有する腫瘍間質へと方向付けることができる。別の実施態様では、抗原結合部分は、その標的抗原、例えばＴ細胞受容体複合抗原を通して、シグナル伝達を活性化することができる。抗原結合部分は、本明細書にさらに定義される抗体及びその断片を含む。特定の抗原結合部分は、抗体重鎖可変領域と抗体軽鎖可変領域とを含む、抗体の抗原結合ドメインを含む。一部の実施態様では、抗原結合部分は、本明細書でさらに定義され、かつ当技術分野において既知である抗体定常領域を含みうる。有用な重鎖定常領域は、α、δ、ε、γ又はμの５つのアイソタイプのいずれかを含む。有用な軽鎖定常領域は、κ及びλの２つのアイソタイプのいずれかを含む。
本明細書で使用される用語「抗原決定基」は、「抗原」及び「エピトープ」と同義であり、抗原結合部分が結合して抗原結合部分－抗原複合体を形成する、ポリペプチド巨大分子上の部位（例えば、アミノ酸の連続ストレッチ又は非連続アミノ酸の異なる領域から構成される立体構造を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面上に、ウイルス感染細胞の表面上に、他の疾患細胞の表面上に、免疫細胞の表面上に、血清中で遊離して、及び／又は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中に、認めることができる。別途指示がない限り、本明細書において抗原と呼ばれるタンパク質は、霊長類（例えば、ヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）等の哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源由来の天然形態のタンパク質でありうる。特定の実施形態では、抗原は、ヒトタンパク質である。本明細書において特定のタンパク質が言及される場合、この用語は、「完全長」の未処理のタンパク質と、細胞内でのプロセシングにより得られる任意の形態のタンパク質とを包含する。この用語は、タンパク質の天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。特定の抗原決定基に対する抗原結合部分の結合能は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られた他の技術、例えば、表面プラズモン共鳴法（ＢＩＡｃｏｒｅ機器で分析）（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏ Ｊ １７，３２３－３２９（２０００））及び古典的な結合アッセイ（Ｈｅｅｌｅｙ，Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｓ ２８，２１７－２２９（２００２））により測定することができる。一実施形態では、無関係なタンパク質に対する抗原結合部分の結合の程度は、例えば、ＳＰＲによって測定した場合に、抗原に対する抗原結合部分の結合の約１０％未満である。一部の実施態様では、抗原に結合する抗原結合部分、又は抗原結合部分を含む抗原結合分子は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０－８Ｍ以下、例えば、１０－８Ｍから１０－１３Ｍ、例えば、１０－９Ｍから１０－１３Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。
「親和性」は、分子の単一の結合部位（例えば、受容体）と、その結合パートナー（例えば、リガンド）との間の非共有結合的相互作用の合計強度を指す。別途指示がない限り、本明細書で使用される「結合親和性」は、結合対（例えば、抗原結合部分と抗原、又は受容体とそのリガンド）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、概して、解離定数（ＫＤ）によって表すことができ、それは解離速度定数と会合速度定数（それぞれｋｏｆｆ及びｋｏｎ）の比である。したがって、速度定数の比が同じである限り、同等の親和性が異なる速度定数を含みうる。親和性は、本明細書に記載されるものを含む、当技術分野で知られている十分に確立された方法によって測定することができる。親和性を測定するための特定の方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
「結合の低減」、例えばＦｃ受容体に対する結合の低減は、例えばＳＰＲによって測定した場合、それぞれの相互作用に対する親和性の減少を指す。明確性のために、本用語は、親和性のゼロ（又は分析方法の検出限界を下回る）までの低減、すなわち相互作用の完全な消失も含む。逆に、「結合の増加」は、それぞれの相互作用に対する結合親和性の増加を指す。
本明細書で使用される「Ｔ細胞活性化」は、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子の放出、細胞傷害性活性、及び活性化マーカーの発現から選択される１つ又は複数の細胞応答を指す。
本明細書で使用される「標的細胞抗原」は、標的細胞、例えば、がん細胞又は腫瘍間質の細胞等の腫瘍内の細胞の表面に提示される抗原決定基を指す。
本明細書で使用される場合、抗原結合部分等に関する「第１の」及び「第２の」という用語は、各種類の部分が１つより多いときに区別する便宜上使用される。これら用語の使用は、明示的に記述されていない限り、プロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートの特定の順序又は方向を付与することを意図していない。
「Ｆａｂ分子」は、免疫グロブリンの重鎖（「Ｆａｂ重鎖」）のＶＨ及びＣＨ１ドメインと、軽鎖（「Ｆａｂ軽鎖」）のＶＬ及びＣＬドメインとからなるタンパク質を指す。
「ＴＡ」は、腫瘍活性化型を表す。
「融合した」とは、構成成分（例えば、Ｆａｂ分子及びＦｃドメインサブユニット）が、直接的に又は１つ若しくは複数のペプチドリンカーを介して、ペプチド結合によって連結されていることを意味する。
本明細書で使用される「単鎖」という用語は、ペプチド結合によって線状に連結されたアミノ酸単量体を含む分子を指す。一部の実施態様では、抗原結合部分の１つは、単鎖Ｆａｂ分子、すなわちＦａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖がペプチドリンカーにより接続されて一本のペプチド鎖を形成しているＦａｂ分子である。別の用語は、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。このような特定の実施形態では、単鎖Ｆａｂ分子においてＦａｂ軽鎖のＣ末端がＦａｂ重鎖のＮ末端に接続されている。
「クロスオーバー」Ｆａｂ分子（「Ｃｒｏｓｓｆａｂ」とも呼ばれる）は、Ｆａｂ重鎖と軽鎖の可変領域同士又は定常領域同士が交換されているＦａｂ分子を意味し、すなわちクロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変領域と重鎖定常領域から構成されるペプチド鎖及び重鎖可変領域と軽鎖定常領域から構成されるペプチド鎖を含む。明確にするために、Ｆａｂ軽鎖の可変ドメインとＦａｂ重鎖の可変ドメインが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子において、重鎖定常領域を含むペプチド鎖を、本明細書ではクロスオーバーＦａｂ分子の「重鎖」と呼ぶ。逆に、Ｆａｂ軽鎖の定常ドメインとＦａｂ重鎖の定常ドメインが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子において、重鎖可変領域を含むペプチド鎖を、本明細書ではクロスオーバーＦａｂ分子の「重鎖」と呼ぶ。
これに対して、「従来の」Ｆａｂ分子は、その天然フォーマットのＦａｂ分子、すなわち重鎖可変領域及び定常領域（ＶＨ－ＣＨ１）から構成される重鎖と、軽鎖可変領域及び定常領域（ＶＬ－ＣＬ）から構成される軽鎖とを含むＦａｂ分子を意味する。
「免疫グロブリン分子」という用語は、天然に存在する抗体の構造を有するタンパク質を指す。例えば、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンは、ジスルフィド結合した２つの軽鎖と２つの重鎖で構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロテトラマー糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端まで、各重鎖は、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ））と、それに続く、重鎖定常領域とも呼ばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）とを有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端に、各軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）と、それに続く、軽鎖定常領域とも呼ばれる定常軽鎖（ＣＬ）ドメインとを有する。免疫グロブリンの重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５種類のうちの１つに割り当てることができ、これらのいくつかは、サブタイプ、例えば、γ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）及びα２（ＩｇＡ２）にさらに分けることができる。免疫グロブリンの軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２種類のうちの１つに割り当てることができる。免疫グロブリンは、本質的に、免疫グロブリンヒンジ領域を介して連結される２つのＦａｂ分子と１つのＦｃドメインからなる。
「抗体」という用語は、本明細書では最も広い意味で使用され、限定されないが、所望の抗原結合活性を呈する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、及び抗体断片を含む、種々の抗体構造を包含する。
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部分を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨは、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）、及び単一ドメイン抗体が含まれる。一部の抗体断片の総説として、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ９，１２９－１３４（２００３）を参照されたい。ｓｃＦｖ断片の総説としては、例えば、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）；さらには国際公開第９３／１６１８５号；及び米国特許第５，５７１，８９４号及び同第５，５８７，４５８５号を参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期が長くなったＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の説明については、米国特許第５，８６９，０４６号を参照されたい。ダイアボディは、二価又は二重特異性でありうる２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、ＥＰ４０４，０９７；国際公開第１９９３／０１１６１号；Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ９，１２９－１３４（２００３）；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０，６４４４－６４４８（１９９３）を参照されたい。トリアボディ及びテトラボディも、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ９，１２９－１３４（２００３）に記載されている。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部又は一部分又は軽鎖可変ドメインの全部又は一部分を含む抗体断片である。一部の実施態様では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体（Ｄｏｍａｎｔｉｓ、Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；例えば米国特許第６２４８５１６号参照）である。抗体断片は、本明細書に記載される、組み換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による生成、並びにインタクトな抗体のタンパク質分解性消化を含むがこれらに限定されない種々の技術により作製することができる。
用語「抗原結合ドメイン」は、抗原の一部又は全部に特異的に結合し、かつ抗原の一部又は全部に相補的なエリアを含む、抗体の部分を指す。抗原結合ドメインは、例えば、１つ又は複数の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ばれる）によって提供されうる。特に、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）とを含む。
「可変領域」又は「可変ドメイン」という用語は、抗原に対する抗体の結合に関与する抗体重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然の抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、一般に、類似の構造を有しており、各ドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と、３つの超可変領域（ＨＶＲ）とを含む。例えば、Ｋｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，ｐａｇｅ ９１（２００７）を参照されたい。単一のＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するために十分でありうる。
本明細書で使用される用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、配列が超可変である、及び／又は構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの領域の各々を指す。一般に、天然４鎖抗体は、ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、及びＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）、計６つのＨＶＲを含む。一般に、ＨＶＲは、超可変ループ由来及び／又は相補性決定領域（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含み、後者は配列可変性が最も高い、及び／又は抗原認識に関与している。ＶＨにおけるＣＤＲ１を除き、ＣＤＲは、一般に、超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。超可変領域（ＨＶＲ）は、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）とも呼ばれ、これら用語は、本明細書において、抗原結合領域を形成する可変領域の部分に関して交換可能に使用される。この特定の領域は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（１９８３）及びＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９６：９０１－９１７（１９８７）によって記載されており、その定義は、互いに対して比較されたとき、アミノ酸残基の重複又はサブセットを含む。とはいえ、抗体又はそのバリアントのＣＤＲを指すいずれかの定義の適用は、本明細書で定義及び使用される用語の範囲内にあることを意図している。上記引用文献の各々により定義されるＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基を、比較として以下の表１に示す。特定のＣＤＲを包含する正確な残基番号は、ＣＤＲの配列と大きさに応じて変化するであろう。当業者であれば、抗体の可変領域アミノ酸配列を考慮して、どの残基が特定のＣＤＲを含むかを常套的に決定することができる。
Figure 2024512709000001
１ 表１のすべてのＣＤＲ定義の番号付けは、Ｋａｂａｔらによって規定された番号付け規則に従っている（下記を参照）。
２ 表１で使用されている、「ｂ」が小文字の「ＡｂＭ」は、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒの「ＡｂＭ」抗体モデル化ソフトウェアによって定義されているＣＤＲを指す。
Ｋａｂａｔらは、あらゆる抗体に適用可能な可変領域配列の番号付けシステムも定義した。当業者であれば、配列自体を超える実験データに頼らなくとも、この「Ｋａｂａｔ番号付け」のシステムを任意の可変領域配列に明確に割り当てることができる。本明細書で使用される「Ｋａｂａｔ番号付け」は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，”Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９８３）により規定された番号付けシステムを指す。別途指定のない限り、抗体可変領域における特定のアミノ酸残基位置の番号付けへの言及は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによるものである。
配列表のポリペプチド配列は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けされていない。しかしながら、配列表の配列の番号付けをＫａｂａｔ番号付けに変換することは、十分に当業者の通常の技術の範囲内である。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般に、４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４からなる。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は、一般に、ＶＨ（又はＶＬ）中で以下の配列：ＦＲ１－Ｈ１（Ｌ１）－ＦＲ２－Ｈ２（Ｌ２）－ＦＲ３－Ｈ３（Ｌ３）－ＦＲ４で現れる。
抗体又は免疫グロブリンの「クラス」は、抗体又は免疫グロブリンの重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域の種類を指す。抗体には５つの主要なクラス、即ち：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
本明細書中の用語「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部分を含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語には、天然配列Ｆｃ領域及び変異Ｆｃ領域が含まれる。一態様において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から、又はＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端までに及ぶ。しかしながら、宿主細胞によって生成される抗体は、重鎖のＣ末端から１つ又は複数の、特に１つ又は２つの、アミノ酸の翻訳後切断を受けることがある。したがって、完全長重鎖をコードする特定の核酸分子の発現によって、宿主細胞により生成される抗体は、完全長重鎖を含みうるか、又は完全長重鎖の切断されたバリアントを含みうる。これは、重鎖の最後の２つのＣ末端アミノ酸がグリシン（Ｇ４４６）とリジン（Ｋ４４７、ＥＵ番号付けシステム）である場合に当てはまる。したがって、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）又はＣ末端グリシン（Ｇｌｙ４４６）及びリジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在してもよいし、存在しなくてもよい。Ｆｃ領域を含む重鎖のアミノ酸配列は、別途示されない限り、本明細書ではＣ末端のグリシン－リジンジペプチドなしで示される。一態様では、本発明による抗体に含まれる、本明細書に明記されたＦｃ領域を含む重鎖は、さらなるＣ末端グリシン－リジンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、ＥＵ番号付けシステム）を含む。一態様では、本発明による抗体に含まれる、本明細書で明記されるＦｃ領域を含む重鎖は、さらなるＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、番号付けはＥＵインデックスに従う）を含む。本明細書で別途特定されない限り、Ｆｃ領域又は定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載されている、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。本明細書で使用されるＦｃドメインの「サブユニット」は、二量体Ｆｃドメインを形成する２つのポリペプチドのうちの１つ、すなわち安定した自己会合が可能な免疫グロブリン重鎖のＣ末端定常領域を含むポリペプチドを指す。例えば、ＩｇＧ Ｆｃドメインのサブユニットは、ＩｇＧ ＣＨ２及びＩｇＧ ＣＨ３定常ドメインを含む。
「融合した」とは、構成成分（例えばＦａｂ分子及びＦｃドメインサブユニット）がペプチド結合によって、直接又は１つ又は複数のペプチドリンカーを介して連結されることを意味する。
「Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットとの会合を促進する修飾」は、Ｆｃドメインサブユニットを含むポリペプチドと同一のポリペプチドとの会合によるホモダイマーの形成を低減又は防止する、ペプチド骨格の操作又はＦｃドメインサブユニットの翻訳後修飾である。本明細書で使用される会合を促進する修飾は、会合することが望ましい２つのＦｃドメインサブユニット（すなわちＦｃドメインの第１及び第２のサブユニット）の各々に対して行われる別々の修飾を特に含み、この修飾は２つのＦｃドメインサブユニットの会合を促進するために互いに対して相補的である。例えば、会合を促進する修飾は、これらＦｃドメインサブユニットの一方又は両方の構造又は電荷を、それらの会合がそれぞれ立体的に又は静電気的に望ましいものになるように変化させる。したがって、（ヘテロ）二量体化は、第１のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドと、第２のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドとの間で起こり、これらポリペプチドは、サブユニットの各々に融合したさらなる構成成分（例えば抗原結合部分）が同じでないという意味で、同一でない場合がある。いくつかの実施態様では、会合を促進する修飾は、Ｆｃドメイン内のアミノ酸変異、具体的にはアミノ酸置換を含む。特定の実施態様では、会合を促進する修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの各々における別々のアミノ酸変異、具体的にはアミノ酸置換を含む。
「エフェクター機能」という用語は、抗体のアイソタイプによって異なる、抗体のＦｃ領域に起因する生物活性を指す。抗体エフェクター機能の例には：Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞によるイムノコンジュゲート媒介性抗原取り込み、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御、及びＢ細胞活性化が含まれる。
本明細書で使用される用語「操作する、操作された、操作」は、ペプチド骨格の任意の操作、又は天然に存在するポリペプチド若しくは組み換えポリペプチド又はその断片の翻訳後修飾を含むと考えられる。操作には、アミノ酸配列、グリコシル化パターン、又は個々のアミノ酸の側鎖基の修飾、及びこれら手法の組み合わせが含まれる。
本明細書で使用される用語「イムノコンジュゲート」は、少なくとも１つのＩＬ－２ 部分と少なくとも１つ抗原結合部分又はエフェクター細胞結合部分とを含むポリペプチド分子を指す。一部の実施形他では、イムノコンジュゲートは、少なくとも１つのＩＬ－２ 部分と、少なくとも２つの抗原結合部分又は少なくとも２つのエフェクター細胞結合部分とを含む。本発明による特定のイムノコンジュゲートは、本質的に、１つのＩＬ－２部分と、１つ又は複数のリンカー配列によって接合された２つの抗原結合部分とからなる。抗原結合部分は、様々な相互作用により、本明細書に記載される様々な構成で、ＩＬ－２部分に接合させることができる。本発明による特定のイムノコンジュゲートは、本質的に、１つのＩＬ－２部分と、１つ又は複数のリンカー配列によって接合された２つのエフェクター細胞原結合部分とからなる。エフェクター細胞結合部分は、様々な相互作用により、本明細書に記載される様々な構成で、ＩＬ－２部分に接合させることができる。
本明細書で使用される「アミノ酸変異」という用語は、アミノ酸の置換、欠失、挿入、及び修飾を包含することを意味する。最終コンストラクトが所望の特徴、例えば、Ｆｃ受容体への結合の低減又は別のペプチドとの会合の増加を有することを条件に、置換、欠失、挿入及び修飾の任意の組み合わせを、最終コンストラクトに到達するために行うことができる。アミノ酸配列の欠失及び挿入は、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端のアミノ酸の欠失及び挿入を含む。特定のアミノ酸の変異は、アミノ酸置換である。例えば、Ｆｃ領域の結合特性を変化させるためには、非保存的アミノ酸置換、すなわち１つのアミノ酸を異なる構造的及び／又は化学的特性を有する別のアミノ酸で置き換えることが特に好ましい。アミノ酸置換には、天然に存在しないアミノ酸による置き換え、又は２０種類の一般的なアミノ酸の天然に存在するアミノ酸誘導体による置き換えが含まれる（例えば、４－ヒドロキシプロリン、３－メチルヒスチジン、オルニチン、ホモセリン、５－ヒドロキシリジン）。アミノ酸変異は、当技術分野で既知の遺伝的方法又は化学的方法を使用して生成することができる。遺伝的方法には、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成等が含まれうる。化学修飾等の遺伝子工学以外の方法によってアミノ酸の側鎖基を変更する方法も又有用でありうることが企図される。本明細書では、同じアミノ酸変異を示すために、種々の表記が使用されうる。例えば、Ｆｃドメインの位置３２９におけるプロリンからグリシンへの置換は、３２９Ｇ、Ｇ３２９、Ｇ３２９、Ｐ３２９Ｇ又はＰｒｏ３２９Ｇｌｙとして示すことができる。
本明細書で使用される用語「ポリペプチド」は、アミノ結合（ペプチド結合としても知られる）により直鎖状に連結した単量体（アミノ酸）で構成される分子を指す。用語「ポリペプチド」は、２つ以上のアミノ酸の鎖を指すのであって、特定の長さの生成物を指すのではない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」又は２つ以上のアミノ酸の鎖を指すために使用される他の任意の用語は「ポリペプチド」の定義の範囲内に含まれ、用語「ポリペプチド」は、これら用語のいずれかの代わりに、又はこれらのいずれかと互換可能に使用されうる。用語「ポリペプチド」は、ポリペプチドの発現後修飾の生成物を指すことも意図されており、このような生成物には、限定されないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解性切断、又は天然に存在しないアミノ酸による修飾が含まれる。ポリペプチドは、天然の生物学的供給源から誘導されてもよく、又は組み換え技術によって生成されてもよいが、指定の核酸配列から必ずしも翻訳されない。ポリペプチドは、化学合成によるものを含め、任意の様式で生成されうる。本発明のポリペプチドは、約３以上、５以上、１０以上、２０以上、２５以上、５０以上、７５以上、１００以上、２００以上、５００以上、１，０００以上、又は２，０００以上のアミノ酸の大きさであってよい。ポリペプチドは、規定の三次元構造を有することができるが、そのような構造を必ずしも有するものではない。規定の三次元構造を有するポリペプチドは、折りたたまれていると称され、規定の三次元構造を有さずに多数の異なる立体配座を採用することのできるポリペプチドは、折りたたまれていないと称される。
「単離された」ポリペプチド若しくはバリアント又はその誘導体は、その自然の環境にないポリペプチドを意図している。特定のレベルの精製は、必要とされない。例えば、単離されたポリペプチドは、その天然又は自然の環境から取り出すことができる。宿主細胞に発現される組み換え生成されたポリペプチド及びタンパク質は、任意の適切な技術によって、分離されるか、断片化されるか、又は部分的に若しくは実質的に精製された天然ポリペプチド又は組み換えポリペプチドと同様に、本発明の目的のために単離されると考えられる。
参照ポリペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入した後、いかなる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした場合の、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のための整列は、当技術分野の技術の範囲内にある種々の方法において、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア等の公的に入手可能なコンピューターソフトウェアを使用して達成することができる。当業者は、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列アラインメントのための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書の目的のために、％アミノ酸配列同一性の値は、配列比較コンピュータープログラムＡＬＩＧＮ－２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータープログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって作成され、ソースコードは、米国著作権局、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，２０５５９にユーザドキュメントと共に提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７で登録されている。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから公的に入手可能であるか、又はソースコードからコンパイルすることができる。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄを含むＵＮＩＸオペレーティングシステムでの使用のためにコンパイルする必要がある。すべての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ－２プログラムによって設定され、変化しない。ＡＬＩＧＮ－２がアミノ酸配列比較に用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Ｂに対する、アミノ酸配列Ｂとの、又はアミノ酸配列Ｂとの対照での、所与のアミノ酸配列Ａの％アミノ酸配列同一性（代替的に、所与のアミノ酸配列Ｂに対し、アミノ酸配列Ｂと、又はアミノ酸配列Ｂとの対照で、特定の％アミノ酸配列同一性を有するか若しくは含む、所与のアミノ酸配列Ａとして記述することができる）は、以下のように計算される：
１００×分数Ｘ／Ｙ
ここで、Ｘは、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ－２により、ＡとＢのそのプログラムのアラインメントにおいて同一であるとして一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性と等しくないであろうことは理解されるであろう。特に別途既述されない限り、本明細書で使用されるすべての％アミノ酸配列同一性の値は、ＡＬＩＧＮ－２コンピュータープログラムを使用して、直前の段落に記載されるようにして得られる。
用語「ポリヌクレオチド」は、単離された核酸分子又はコンストラクト、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウイルス由来のＲＮＡ、又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、一般的なホスホジエステル結合又は一般的ではない結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるようなアミド結合）を含みうる。用語「核酸分子」は、ポリヌクレオチド中に存在する、任意の１つ又は複数の核酸セグメント、例えば、ＤＮＡ断片又はＲＮＡ断片を指す。
「単離された」核酸分子又はポリヌクレオチドは、その天然環境から取り除かれた核酸分子、ＤＮＡ又はＲＮＡを意図している。例えば、ベクターに含有されるポリペプチドをコードする組み換えポリヌクレオチドは、本発明の目的のために単離されていると考えられる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例には、異種宿主細胞内に維持されている組み換えポリヌクレオチド、又は溶液中の（部分的に又は実質的に）精製されたポリヌクレオチドが含まれる。単離されたポリヌクレオチドには、ポリヌクレオチド分子を通常含む細胞に含まれるポリヌクレオチド分子を含むが、そのポリヌクレオチド分子は、染色体外に、又は天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在している。単離されたＲＮＡ分子は、本発明のｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏＲＮＡ転写物と、陽性及び陰性の鎖形態、及び二本鎖形態を含む。さらに、本発明による単離されたポリヌクレオチド又は核酸には、合成により生成されたそのような分子が含まれる。加えて、ポリヌクレオチド又は核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、又は転写ターミネーター等の調節エレメントであってもよく、又は調節エレメントを含んでいてもよい。
本発明の参照ヌクレオチド配列と、例えば、少なくとも９５％「同一」であるヌクレオチド配列を有する核酸又はポリヌクレオチドとは、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチド配列の１００ヌクレオチド当たり５つまでの点変異を含みうること以外は、参照配列と同一であることを意味する。換言すれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中最大５％のヌクレオチドが欠失しているか又は別のヌクレオチドで置換されていてもよく、あるいは参照配列中の全ヌクレオチドの最大５％の数のヌクレオチドが参照配列に挿入されていてもよい。参照配列のこのような変更は、参照ヌクレオチド配列の５’若しくは３’末端位置で、又はこれら末端位置間のどの位置で起こってもよく、参照配列中の残基間に個々に散在してもよいし、又は参照配列内に１つ若しくは複数の連続した群として散在してもよい。実際の方式として、いずれか特定のポリヌクレオチド配列が、本発明のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるかどうかは、既知のコンピュータープログラム、例えばポリペプチドについて上述したもの（例えば、ＡＬＩＧＮ－２）を使用して、従来通りに決定することができる。
用語「発現カセット」は、標的細胞内の特定の核酸の転写を可能にする一連の特定の核酸エレメントを用いて、組み換え又は合成により生成されたポリヌクレオチドを指す。組み換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス又は核酸断片中に組み込むことができる。典型的には、発現ベクターの組み換え発現カセット部分は、配列の中でも、転写される核酸配列とプロモーターとを含む。一部の実施形態では、本発明の発現カセットは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む。
用語「ベクター」又は「発現ベクター」は、「発現コンストラクト」と同義であり、標的細胞内で作用可能に会合する特定の遺伝子を導入し、その発現を導くために使用されるＤＮＡ分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造体としてのベクター、及びそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。本発明の発現ベクターは、発現カセットを含む。発現ベクターは、安定したｍＲＮＡの大量転写を可能にする。発現ベクターが標的細胞内部に入ると、遺伝子によってコードされるリボ核酸分子又はタンパク質が、細胞転写及び／又は翻訳機構によって生成される。一実施形態において、本発明の発現ベクターは、本発明の二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む発現カセットを含む。
「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養物」という用語は互換的に使用され、外因性核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞には、「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれ、これらには、初代形質転換細胞及び、継代の数に関係なく、それに由来する子孫が含まれる。子孫は、核酸の含有量が親細胞と完全に同一でなくてもよく、変異を含みうる。元の形質転換細胞においてスクリーニング又は選択されたのと同じ機能又は生物活性を有する変異子孫は本明細書に含まれる。宿主細胞は、本発明の二重特異性抗原結合分子を生成するために使用できる任意の種類の細胞系である。宿主細胞には、培養細胞、例えばいくつか例を挙げると、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞等の哺乳動物の培養細胞、又はハイブリドーマ細胞、酵母細胞、昆虫細胞、及び植物細胞が含まれるだけでなく、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養された植物若しくは動物組織内部に含まれる細胞も含まれる。
「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃドメインの係合に続いて、受容体保有細胞を刺激してエフェクター機能を実行するシグナル伝達事象を誘発するＦｃ受容体である。ヒト活性化Ｆｃ受容体には、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）が含まれる。
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、抗体でコーティングされた標的細胞の免疫エフェクター細胞による溶解につながる免疫機構である。標的細胞は、通常Ｆｃ領域に対するＮ末端であるタンパク質部分を介して、Ｆｃ領域を含む抗体又はその誘導体が特異的に結合する細胞である。本明細書で使用される用語「低減したＡＤＣＣ」は、標的細胞を囲む媒質中の所定の抗体濃度において、上記に定義したＡＤＣＣの機構により所定の時間内に溶解する標的細胞数の低減、及び／又はＡＤＣＣの機構により所定の時間内に所定の数の標的細胞を溶解させるために必要な、標的細胞を囲む媒質中の抗体濃度の低下と定義される。ＡＤＣＣの低減は、同じ標準の生成、精製、製剤化及び貯蔵方法（当業者に既知の）を使用して、同じ種類の宿主細胞により生成された同じ抗体が媒介するＡＤＣＣであって、但し操作されていないものに対してである。例えば、ＡＤＣＣを低減させるアミノ酸置換をＦｃドメインに含む抗体によって媒介されるＡＤＣＣの低減は、このようなアミノ酸置換をＦｃドメインに含まない同じ抗体によって媒介されるＡＤＣＣにと対してである。ＡＤＣＣを測定するために適したアッセイは、当技術分野でよく知られている（例えば、国際公開第２００６／０８２５１５号又は同第２０１２／１３０８３１号参照）。
「有効量」の薬剤は、それが投与される細胞又は組織の生理的変化をもたらすために必要な量である。
薬剤、例えば薬学的組成物の「治療的有効量」は、所望の治療的又は予防的結果を達成するために必要な用量及び期間で有効な量を指す。治療有効量の薬剤は、例えば、疾患の有害作用を除去するか、減少させるか、遅延させるか、最小限にするか、又は予防する。
「個体」又は「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物には、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及び非ヒト霊長類、例えばサル）、ウサギ及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）が含まれる。特に、個体又は対象は、ヒトである。
用語「薬学的組成物」は、中に含まれる活性成分の生物活性を有効にするような形態であり、その製剤が投与されるであろう対象にとって許容できないほど毒性である追加の構成成分を何も含有しない調製物を指す。
「薬学的に許容される担体」は、活性成分以外の、薬学的組成物中の成分であって、対象にとって毒性でない成分を指す。薬学的に許容される担体には、限定されないが、バッファー、賦形剤、安定剤又は保存剤が含まれる。
本明細書中で使用されるとき、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」（及び「治療する（ｔｒｅａｔ）」又は「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」等のその文法上の変化形）は、治療される個体の疾患の自然な経過を変える試みにおける臨床的介入を指し、予防のために又は臨床病理の過程で実施することができる。治療の望ましい効果には、限定されないには、疾患の発生又は再発を防止すること、症候の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮小、転移の防止、疾患の進行速度を低下させること、病状の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善が含まれる。いくつかの実施形態では、本発明のプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートは、疾患の発生を遅延させるか又は疾患の進行を遅らせるために使用される。
「添付文書」という用語は、治療用製品の市販パッケージに通例含まれる説明書であって、そのような治療用製品の使用に関する適応症、用法、用量、投与、併用療法、禁忌及び／又は警告についての情報を含む説明書を指すために使用される。
本明細書で使用される「イディオタイプ特異的ポリペプチド」は、抗原結合部分、例えば、ＣＤ３に対する抗原結合部分のイディオタイプを認識するポリペプチドを指す。イディオタイプ特異的ポリペプチドは、抗原結合部分の可変領域に特異的に結合し、それによって抗原結合部分のその同族抗原に対する特異的結合を低減又は防止することができる。抗原結合部分を含む分子と会合すると、イディオタイプ特異的ポリペプチドは、分子のマスキング部分として機能することができる。本明細書において具体的に開示されるのは、抗ＣＤ３結合分子のイディオタイプに特異的な抗イディオタイプ抗体又は抗イディオタイプ結合抗体断片である。
本明細書で使用される「プロテアーゼ」又は「タンパク質分解酵素」は、リンカーを認識部位で切断し、標的細胞によって発現される任意のタンパク質分解酵素を指す。このようなプロテアーゼは、標的細胞によって分泌されても、例えば標的細胞表面に、標的細胞と会合したまま残ってもよい。プロテアーゼの例には、限定されないが、メタロプロテイナーゼ、例えば、マトリックスメタロプロテイナーゼ１～２８、並びにディスインテグリン及びロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭ）２、７～１２、１５、１７～２３、２８～３０及び３３、セリンプロテアーゼ、例えば、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子及びマトリプターゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、並びにカテプシンファミリーのメンバーが含まれる。
インターロイキン－２ポリペプチドに関して本明細書で使用される「プロテアーゼ活性化型」は、インターロイキン－２受容体に対するンターロイキン－２ポリペプチドの結合能を低減する又は消失させるマスキング部分により、インターロイキン－２受容体に対する結合能が低減又は消失したインターロイキン－２ポリペプチドを指す。タンパク質分解性の切断により、例えば、インターロイキン－２ポリペプチドにマスキング部分を接続するリンカーのタンパク質分解性の切断により、及び又はマスキング部分内部で、マスキング部分が解離すると、インターロイキン－２受容体に対する結合が回復し、インターロイキン－２ポリペプチドがそれにより活性化される。
本明細書で使用される「可逆的に隠すこと」は、インターロイキン－２ポリペプチドがその受容体に結合することが防止されるような、インターロイキン－２ポリペプチドに対するマスキング部分の結合を指す。このように隠すことは、例えばプロテアーゼ切断により、及びそれによりインターロイキン－２ポリペプチドが遊離してその受容体に結合することにより、マスキング部分がインターロイキン－２ポリペプチドから解放されうるという点で、可逆的である。
本開示の実施形態
一態様において提供されるのは、プロテアーゼ認識部位を含む単離されたポリペプチドである。一実施形態では、プロテアーゼ認識部位は、マトリプターゼの基質である。一実施形態では、プロテアーゼ認識部位は、配列ＰＱＡＲＫ（配列番号３２）又はＨＱＡＲＫ（配列番号３３）を含むか又はそれからなる。一実施形態では、単離されたポリペプチドは、１つ又は複数の非構造化ペプチドリンカーを含む。一実施形態では、単離されたポリペプチドは、少なくとも１つのリンカーを含み、特に少なくとも１つのリンカーは二次構造を呈さない。
一実施形態では、リンカーは、少なくとも５、好ましくは５から１００、さらに好ましくは１０から５０、最も好ましくは２０から４０アミノ酸長のアミノ酸配列を含むペプチドである。一実施形態では、プロテアーゼ切断型リンカーは、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０アミノ酸長のペプチドである。好ましい実施形態では、プロテアーゼ切断型リンカーは、３３アミノ酸長のペプチドである。一実施形態では、単離されたポリペプチドは、プロテアーゼ切断型リンカーを含む。
一実施形態では、プロテアーゼ切断型リンカーは、プロテアーゼ認識部位を含む。一実施形態では、プロテアーゼ認識配列は、マトリプターゼの基質である。一実施形態では、プロテアーゼ認識部位は、配列ＰＱＡＲＫ（配列番号３２）又はＨＱＡＲＫ（配列番号３３）を含むか又はそれからなる。
一実施形態では、プロテアーゼ切断型リンカーは、非構造化ポリペプチドである。一実施形態では、プロテアーゼ切断型リンカーは、二次構造を呈さない。一実施形態では、プロテアーゼ切断型リンカーは、非構造化確認を促進する少なくとも１つのリンカーを含む。一実施形態では、リンカーは、セリン（Ｓ）及び／又はグリシン（Ｇ）を含む。一実施形態では、プロテアーゼ切断型リンカーは、アミノ酸配列（ＧｘＳ）ｎ又は（ＧｘＳ）ｎＧｍ（Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン）を含む少なくとも１つのリンカーであり，（ｘ＝３、ｎ＝３、４、５又は６、及びｍ＝０、１、２又は３）であるか、又は（ｘ＝４、ｎ＝２、３、４又は５、及びｍ＝０、１、２又は３）であり、好ましくはｘ＝４であり、ｎ＝２又は３であり、さらに好ましくは、ｘ＝４、ｎ＝２である。一実施形態では、プロテアーゼ切断型リンカーは、（Ｇ４Ｓ）２を含む。一実施形態では、プロテアーゼ切断型リンカーは、（Ｇ４Ｓ）３を含む。一実施形態では、プロテアーゼ切断型リンカーは、Ｇ２Ｓを含む。プロテアーゼ切断型リンカーは、任意の位置（例えばリンカーの開始部分、任意の位置内、又は終了位置）にプロテアーゼ認識部位を含む。
一実施形態では、単離されたポリペプチドは、配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＱＡＲＫＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧ（配列番号１０２）を含むか又はそれからなる。一実施形態では、単離されたポリペプチドは、配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＰＱＡＲＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＳ（配列番号１１０）を含むか又はそれからなる。一実施形態では、単離されたポリペプチドは、配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＨＱＡＲＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＳ（配列番号１１１）を含むか又はそれからなる。
一態様において、本発明は、（ｉ）ＩＬ－２ポリペプチドと，（ｉｉ）マスキング部分と、（ｉｉｉ）第１のプロテアーゼ切断部位を含むリンカーとを含むプロテアーゼ活性化型インターロイキン－２（ＩＬ－２）ポリペプチドに関し、マスキング部分は、リンカーを通してＩＬ－２ポリペプチドに共有結合し、マスキング部分は、ＩＬ－２ポリペプチドに結合することができ、それによりＩＬ－２ポリペプチドを可逆的に隠すことができ、マスキング部分は、第２のプロテアーゼ切断部位を含み、マスキング部分は、第１の及び／又は第２のプロテアーゼ切断部位で切断されるとＩＬ－２ポリペプチドを隠さない。
一実施形態では、一態様において、本発明は、（ｉ）ＩＬ－２ポリペプチドと，（ｉｉ）マスキング部分と、（ｉｉｉ）第１のプロテアーゼ切断部位を含むリンカーとを含むプロテアーゼ活性化型インターロイキン－２（ＩＬ－２）ポリペプチドに関し、マスキング部分は、リンカーを通してＩＬ－２ポリペプチドに共有結合し、マスキング部分は、ＩＬ－２ポリペプチドに結合することができ、それによりＩＬ－２ポリペプチドを可逆的に隠すことができ、マスキング部分は、第２のプロテアーゼ切断部位を含み、マスキング部分は、第１の及び第２のプロテアーゼ切断部位で切断されるとＩＬ－２ポリペプチドを隠さない。
一実施形態では、一態様において、本発明は、（ｉ）ＩＬ－２ポリペプチドと，（ｉｉ）マスキング部分と、（ｉｉｉ）第１のプロテアーゼ切断部位を含むリンカーとを含むプロテアーゼ活性化型インターロイキン－２（ＩＬ－２）ポリペプチドに関し、マスキング部分は、リンカーを通してＩＬ－２ポリペプチドに共有結合し、マスキング部分は、ＩＬ－２ポリペプチドに結合することができ、それによりＩＬ－２ポリペプチドを可逆的に隠すことができ、マスキング部分は、第２のプロテアーゼ切断部位を含み、マスキング部分は、第１の又は第２のプロテアーゼ切断部位で切断されるとＩＬ－２ポリペプチドを隠さない。
好ましい実施形態では、プロテアーゼ活性化型インターロイキン－２ポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸配列を含む。
イムノコンジュゲート
一態様において、本発明は、プロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチドと、抗原結合部分及び／又はエフェクター細胞結合部分とを含むイムノコンジュゲートに関する。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号４の配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号２の配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号５の配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
特定の実施形態では、本発明は、配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むイムノコンジュゲートを提供する。
マスキング部分
本発明のプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチドは、少なくとも１つのマスキング部分を含む。
一実施形態では、マスキング部分は、ＩＬ－２ポリペプチドをマスクし、ＭＴ２０４抗体の重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、及び軽鎖ＣＤＲ３のうちの少なくとも１つを含む。一実施形態では、マスキング部分は、ＭＴ２０４抗体の重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、及び軽鎖ＣＤＲ３を含む。
一実施形態では、マスキング部分は、ＩＬ－２ポリペプチドをマスクし、ＭＴ２０４抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のうちの少なくとも１つを含む。一実施形態では、マスキング部分は、ＩＬ－２ポリペプチドをマスクし、ＭＴ２０４抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、マスキング部分は、ＩＬ－２ポリペプチドをマスクし、ＭＴ２０４抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、ＭＴ２０４抗体は単鎖Ｆａｂ分子である。
一実施形態では、マスキング部分は、ＩＬ－２ポリペプチドをマスクし、配列番号１２と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列を含む。一実施形態では、マスキング部分は、ＩＬ－２ポリペプチドをマスクし、配列番号１２のポリペプチド配列を含む。
リンカー
一実施形態では、プロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートは、配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２又は３３と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列を含むプロテアーゼ認識部位を有するリンカーを含む。一実施態様において、プロテアーゼ認識部位は、配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２又は３３のポリペプチド配列を含む。好ましい実施態様において、プロテアーゼ認識部位は、配列番号３０のポリペプチド配列を含む。
一実施態様において、プロテアーゼは、メタロプロテイナーゼ、例えば、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）１～２８、並びにディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭ）２、７～１２、１５、１７～２３、２８～３０及び３３；セリンプロテアーゼ、例えば、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子及びマトリプターゼ；システインプロテアーゼ；アスパラギン酸プロテアーゼ；並びにカテプシンプロテアーゼからなる群から選択される。１つの特定の実施態様では、プロテアーゼは、ＭＭＰ９又はＭＭＰ２である。さらなる特定の実施態様では、プロテアーゼは、マトリプターゼである。
ポリヌクレオチド
本発明は、本明細書に記載されるプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド若しくはイムノコンジュゲート又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドをさらに提供する。
本発明のプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートをコードするポリヌクレオチドは、プロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲート全体をコードする単一のポリヌクレオチドとして、又は共発現される複数の（例えば、２つ以上の）ポリヌクレオチドとして、発現されうる。共発現されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、例えば、ジスルフィド結合又は他の手段を通して会合し、機能的なプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを形成することができる。例えばイムノコンジュゲートの場合、抗原結合部分の軽鎖部分は、イムノコンジュゲートの重鎖、Ｆｃドメインサブユニット及び任意選択的に別の抗原結合部分（の一部）をコードするポリヌクレオチド由来の別個のポリヌクレオチドによってコードされうる。共発現されると、重鎖ポリペプチドは、軽鎖ポリペプチドと結合して抗原結合部分を形成する。別の実施例では、２つのＦｃドメインサブユニットのうちの一方と任意選択的に１つ又は複数の抗原結合部分（の一部）とを含む部分イムノコンジュゲートは、２つのＦｃドメインサブユニットのうちの他方と、任意選択的に抗原結合部分（の一部）とを含むイムノコンジュゲートの部分由来の別個のポリヌクレオチドによってコードされうる。共発現されると、Ｆｃドメインサブユニットは係合して、Ｆｃドメインを形成する。
いくつかの実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に記載される本発明によるイムノコンジュゲート全体をコードする。他の実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に記載される本発明によるイムノコンジュゲートに含まれるポリペプチドをコードする。
別の実施形態では、本発明は、本発明のプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド若しくはイムノコンジュゲート又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドに向けられている。別の実施形態では、本発明は、配列番号９に示されるポリペプチド配列又はその断片をコードする配列をコードする単離されたポリヌクレオチドに向けられている。別の実施形態では、本発明は、配列番号１２に示されるポリペプチド配列又はその断片をコードする配列をコードする単離されたポリヌクレオチドを対象としている。
一部の実施態様では、ポリヌクレオチド又は核酸は、ＤＮＡである。他の実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態の、ＲＮＡである。本発明のＲＮＡは、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。
組み換え法
本発明のＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートは、例えば、固体状態ペプチド合成（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固体相合成）又は組み換え生成によって得ることができる。組み換え生成の場合、例えば、上述のプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドが、宿主細胞でのさらなるクローニング及び／又は発現のために、単離され、１つ又は複数のベクター中に挿入される。このようなポリヌクレオチドは、従来の手順を使用して容易に単離及び配列決定されうる。一実施態様では、本発明のポリヌクレオチドの１つ又は複数を含むベクター、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者に周知の方法を使用して、適切な転写／翻訳制御シグナルとともに、ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートのコード配列を含む発現ベクターを構築することができる。これら方法には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組み換えＤＮＡ技術、合成技術及びｉｎ ｖｉｖｏ組み換え／遺伝子組み換えが含まれる。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ（１９８９）に記載される技術を参照されたい。発現ベクターは、プラスミドの一部、ウイルスとすることができるか、又は核酸断片でありうる。発現ベクターには、プロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートをコードするポリヌクレオチド（すなわちコード化領域）が、プロモーター及び／又は他の転写若しくは翻訳制御エレメントと作動化能に会合してクローニングされる発現カセットが含まれる。本明細書で使用される「コード化領域」は、アミノ酸中に翻訳されたコドンからなる核酸の一部分である。「停止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、又はＴＡＡ）は、アミノ酸中に翻訳されないが、存在する場合はコード化領域の一部であると考えられる。但し、あらゆる隣接配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’及び３’未翻訳領域等は、コード化領域の一部ではない。２つ以上のコード化領域が、単一のポリヌクレオチドコンストラクト中に、例えば単一のベクター上に、又は別々のポリヌクレオチドコンストラクト中に、例えば別々のベクター上に存在することができる。さらに、いかなるベクターも、単一のコード化領域を含んでいても、２つ以上のコード化領域を含んでいてもよく、例えば、本発明のベクターは、タンパク質切断を介して、翻訳後に又は翻訳と同時に最終タンパク質に分離される１つ又は複数のポリペプチドをコードすることができる。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、又は核酸は、発明のプロテアーゼ活性化型本ＩＬ－２ポリペプチド若しくはイムノコンジュゲート、又はそのバリアント若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドに融合しているか、又は融合していない、異種コード化領域をコードすることができる。異種コード化領域には、限定されないが、分泌シグナルペプチド又は異種機能性ドメイン等の特殊なエレメント又はモチーフが含まれる。作動可能な会合は、ポリペプチド等の遺伝子生成物のコード化領域が、遺伝子生成物の発現を１つ以上の調節配列の影響又は制御下に置くような方法で、１つ又は複数の調節配列と会合している場合である。２つのＤＮＡ断片（ポリペプチドコード化領域とそれに関連付けられたプロモーター等）は、プロモーター機能の誘導により、所望の遺伝子生成物をコードするｍＲＮＡが転写される場合、及び２つのＤＮＡ断片間の連結の性質が、遺伝子生成物の発現を指示する発現調節配列の能力を妨げないか、又はＤＮＡテンプレートの転写能力を妨げない場合、「作用可能に会合」している。したがって、プロモーターが、ポリペプチドをコードする核酸の転写を行うことができた場合、プロモーター領域は、その核酸と作用可能に会合しているといえる。プロモーターは、所定の細胞においてのみＤＮＡの実質的な転写を指示する細胞特異的プロモーターでありうる。プロモーター以外の他の転写制御要素、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終結シグナルをポリヌクレオチドと作用可能に会合させて、細胞特異的転写を指示することができる。適切なプロモーター及び他の転写制御領域が本明細書に開示されている。様々な転写制御領域が当業者に知られている。これらには、限定されないが、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域、例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーターセグメント及びエンハンサーセグメント（例えば、イントロンＡと連結した最初期プロモーター）、シミアンウイルス４０（例えば、初期プロモーター）、並びにレトロウイルス（例えば、ラウス肉腫ウイルス）が含まれる。他の転写調節領域には、脊椎動物遺伝子から誘導されるもの、例えば、アクチン、ヒートショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギａ－グロビン、並びに真核細胞において遺伝子発現を制御することができる他の配列が含まれる。さらなる適切な転写制御領域には、組織特異的プロモーター及びエンハンサー、並びに誘導性プロモーター（例えば、テトラサイクリンを誘導可能なプロモーター）が含まれる。同様に、様々な翻訳制御要素が当業者に知られている。これらには、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終結コドン、及びウイルス系由来のエレメント（特に、ＣＩＴＥ配列とも呼ばれる内部リボソーム侵入部位、又はＩＲＥＳ）が含まれる。発現カセットはまた、複製起点、及び／又はレトロウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復（ＩＴＲ）等の染色体組み込み要素といった他の特徴を含みうる。
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コード化領域は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指示する分泌ペプチド又はシグナルペプチドをコードする追加のコード化領域と関連しうる。例えば、ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートの分泌が望まれる場合、シグナル配列をコードするＤＮＡは、本発明のプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド若しくはイムノコンジュゲート又はその断片をコードする核酸の上流に位置しうる。シグナル仮説によれば、哺乳動物細胞によって分泌されるタンパク質は、粗い小胞体を横切る成長中のタンパク質鎖が外に出始めると成熟タンパク質から切断されるシグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有する。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが、通常、ポリペプチドのＮ末端に融合したシグナルペプチドを有し、これが、翻訳されたポリペプチドから切断されて、ポリペプチドの分泌形態又は「成熟」形態を生成することを承知している。一部の実施態様では、天然のシグナルペプチド、例えば、免疫グロブリン重鎖若しくは軽鎖シグナルペプチドが使用されるか、又はそれと作用可能に会合しているポリペプチドの分泌を導く能力を保持するその配列の機能的誘導体が使用される。代替的に、異種哺乳動物シグナルペプチド、又はその機能的誘導体が使用されてもよい。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）又はマウスβ－グルクロニダーゼのリーダー配列で置換されうる。
後の精製を容易にするために使用されうる（例えばヒスチジンタグ）、又は－ＩＬ－２ポリペプチド若しくはイムノコンジュゲートのプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチドの標識を助けうる、短いタンパク質配列をコードするＤＮＡが、ポリヌクレオチドをコードするプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートの内部又は末端に含まれていてもよい。
さらなる実施態様では、本発明の１つ又は複数のポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供される。一部の実施態様では、本発明の１つ又は複数のベクターを含む宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチド及びベクターに、ポリヌクレオチド及びベクターそれぞれに関連して本発明に記載される特徴のいずれかを、単独で又は組み合わせて組み込むことができる。このような一実施形態では、宿主細胞は、本発明のプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲート（の一部）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む（例えば、そのようなべークターで形質転換又はトランスフェクトされている）。本明細書で使用される用語「宿主細胞」は、本発明のプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド若しくはイムノコンジュゲート、又はその断片を生成するように操作することのできる任意の種類の細胞系を指す。プロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートの発現を複製するため及び補助するために適した宿主細胞は、当技術分野で周知である。そのような細胞は、特定の発現ベクターを用いて適宜トランスフェクト又は形質導入することができ、大量のベクター含有細胞を、大規模発酵機に播種するために成長させて、臨床用途に十分な量のＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを得ることができる。適切な宿主細胞は、原核微生物、例えば大腸菌、又は種々の真核細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、又は昆虫細胞等を含む。例えば、ポリペプチドは、特にグリコシル化が必要でないとき、細菌中で生成されうる。発現後、ポリペプチドを、可溶性画分中で細菌細胞ペーストから単離し、さらに精製することができる。原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、菌類及び酵母菌株を含むポリペプチドをコードするベクターのための適切なクローニング宿主又は発現宿主であり、そのグリコシル化経路は「ヒト化」されており、部分的に又は完全にヒトのグリコシル化パターンを有するポリペプチドの生成をもたらす。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２２，１４０９－１４１４（２００４），ａｎｄ Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２４，２１０－２１５（２００６）を参照されたい。（グリコシル化）ポリペプチドの発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）に由来する。無脊椎動物細胞の例には、植物細胞及び昆虫細胞が含まれる。昆虫細胞と組み合わせて、特にスポドプテラ・フルギペルダヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ））細胞のトランスフェクションに使用されうる多数のバキュロウイルス株が同定された。植物細胞培養物も、宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、同第６０４０４９８号、同第６４２０５４８号、同第７１２５９７８号、及び同第６４１７４２９号（トランスジェニック植物において抗体を生成するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載）を参照。脊椎動物細胞も、宿主として使用されうる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合されている哺乳動物細胞株が有用でありうる。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ－７）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚腎臓株（例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ３６，５９（１９７７）に記載される２９３細胞又は２９３Ｔ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えばＭａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ ２３、２４３－２５１（１９８０）に記載されるＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、マウス乳房腫瘍細胞（ＭＭＴ ０６０５６２）、ＴＲＩ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ ３８３、４４－６８（１９８２）に記載される）、ＭＲＣ ５細胞、及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、ｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７７，４２１６（１９８０））を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；及びＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３、及びＳｐ２／０等の骨髄腫細胞株が含まれる。タンパク質生成に適した特定の哺乳動物宿主細胞の総説としては、例えば、Ｙａｚａｋｉ ａｎｄ Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ），ｐｐ．２５５－２６８（２００３）を参照されたい。宿主細胞には、培養細胞、例えば、哺乳動物培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞及び植物細胞が含まれるが、数例を挙げると、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物若しくは動物組織内に含まれる細胞も含まれる。一実施態様では、宿主細胞は、真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞又はリンパ球細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。
これら系で外来遺伝子を発現させるための標準的な技術は、当技術分野で既知である。抗体等の抗原結合ドメインの重鎖又は軽鎖を含むポリペプチドを発現する細胞を、抗体鎖の他方も発現するように操作して、発現生成物が重鎖と軽鎖の両方を有する抗体であるようにしてもよい。
一実施形態では、本発明によるプロテアーゼ－ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートの生成方法が提供され、この方法は、本明細書に提供されるプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、プロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートの発現に適した条件下で培養すること、及びプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを、宿主細胞（又は宿主細胞培地）から回収することを含む。
プロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートの構成成分は、遺伝的に互いに融合している。プロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートは、その構成成分が互いに直接的に又はリンカー配列を通して間接的に融合するように設計することができる。リンカーの組成及び長さは、当技術分野で周知の方法に従って決定することができ、有効性について試験することができる。プロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートの異なる構成成分間のリンカー配列の例は、本明細書に提供される配列に見出される。融合の個々の構成成分を分離するための切断部位を組み込むために、追加の配列、例えばエンドペプチダーゼ認識配列を必要に応じて含めることもできる。
一部の実施形他では、イムノコンジュゲートの１つ又は複数の抗原結合部分は、少なくとも、抗原決定基に結合することのできる抗体可変領域を含む。可変領域は、天然に存在するか又は天然に存在しない抗体及びその断片の一部を形成することができ、かつそれらに由来しうる。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を生成する方法は、当技術分野で周知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８参照）。天然に存在しない抗体は、固相ペプチド合成を使用して構築することができるか、組み換えによって生成することができるか（例えば、米国特許第４，１８６，５６７号に記載されるように）、又は例えば、可変重鎖及び可変軽鎖を含むコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙに対する米国特許第５，９６９，１０８号を参照）構築することができる。
任意の動物種の抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変領域を、本発明のイムノコンジュゲートに使用することができる。本発明において有用な、非限定的な抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変領域は、マウス、霊長類又はヒト起源のものとすることができる。プロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートがヒトでの使用を意図する場合、抗体の定常領域がヒトに由来する抗体のキメラ形態を使用することができる。「ヒト化」又は完全ヒト形態の抗体も、当技術分野で周知の方法に従って調製することができる（例えばＷｉｎｔｅｒへの米国特許第５５６５３３２号を参照）。ヒト化は、様々な方法によって達成することができ、そのような方法には、限定されないが、（ａ）非ヒト（例えば、ドナー抗体）のＣＤＲを、重要なフレームワーク残基（例えば、良好な抗原結合親和性又は抗体機能を維持するために重要なもの）を保持しているか又は保持していないヒト（例えば、レシピエント抗体）のフレームワーク領域及び定常領域に移植すること、（ｂ）非ヒト特異性決定領域（ＳＤＲ又はａ－ＣＤＲ；抗体－抗原相互作用に重要な残基）のみをヒトフレームワーク領域及び定常領域に移植すること、又は（ｃ）非ヒト可変ドメイン全体を移植し、ただし表面残基の置き換えによってそれらをヒト様セクションで「クローキング」することが含まれる。ヒト化抗体及びそれらの作製方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ １３，１６１９－１６３３（２００８）に概説されており、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２，３２３－３２９（１９８８）；Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６，１００２９－１００３３（１９８９）；米国特許第５，８２１，３３７号、同第７，５２７，７９１号、同第６，９８２，３２１号及び同第７，０８７，４０９号；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１，５２２－５２５（１９８６）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８１，６８５１－６８５５（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ｏｉ，Ａｄｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４４，６５－９２（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９，１５３４－１５３６（１９８８）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ Ｉｍｍｕｎ ３１（３），１６９－２１７（１９９４）；Ｋａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６，２５－３４（２００５）（ＳＤＲ（Ａ～ＣＤＲ）移植を記載）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２８，４８９－４９８（１９９１）（「リサーフェシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）を記載）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，方法３６、４３－６０（２００５）（「ＦＲシャフリング」を記載）；並びにＯｓｂｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６，６１－６８（２００５）ａｎｄ Ｋｌｉｍｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ８３，２５２－２６０（２０００）（ＦＲシャフリングに対する「ガイド選択」手法を記載）にさらに記載されている。ヒト抗体及びヒト可変領域は、当技術分野において既知の種々の技術を使用して生成することができる。ヒト抗体は、一般に、ｖａｎ Ｄｉｊｋ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ５，３６８－７４（２００１）及びＬｏｎｂｅｒｇ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０，４５０－４５９（２００８）に記載されている。ヒト可変領域は、ハイブリドーマ法によって作製されたヒトモノクローナル抗体の一部を形成することができ、かつ同抗体に由来しうる（例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１－６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）を参照されたい）。ヒト抗体及びヒト可変領域はまた、抗原チャレンジに応答して、インタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を有するインタクトな抗体を生成するように修飾されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって調製することができる（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２３，１１１７－１１２５（２００５）を参照されたい。ヒト抗体及びヒト可変領域はまた、ヒト由来ファージディスプレイライブラリー（例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８，１－３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ、２００１）；及びＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４８，５５２－５５４；Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２，６２４－６２８（１９９１）を参照されたい）から選択されるＦｖクローン可変領域配列を単離することによって生成されうる。ファージは、一般的には、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片として、又はＦａｂ断片として、抗体断片を提示する。
一部の実施形態では、本発明において有用な抗原結合部分は、例えば、米国特許出願公開第２００４／０１３２０６６号（この内容全体は参照により本明細書に援用される）に開示される方法に従って、増強された結合親和性を有するように操作される。特定の抗原決定基に対する本発明のイムノコンジュゲートの結合能は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られている他の技術、例えば表面プラズモン共鳴技術（ＢＩＡＣＯＲＥ Ｔ １００システムで分析）（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏ Ｊ １７，３２３－３２９（２０００））、及び従来の結合アッセイ（Ｈｅｅｌｅｙ，Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｓ ２８，２１７－２２９（２００２））によって測定することができる。競合アッセイを使用して、特定の抗原に対する結合について参照抗体と競合する抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変ドメインを同定することができる。一部の実施態様では、このような競合抗体は、参照抗体によって結合される同じエピトープ（例えば直鎖状又はコンフォメーションエピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的方法が、Ｍｏｒｒｉｓ（１９９６）“Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，” ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．６６（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）に提供されている。本明細書に記載されるように調製されたプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートは、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、及びサイズ排除クロマトグラフィー等の当技術分野で既知の技術によって精製されうる。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の条件は、正味の電荷、疎水性、親水性等といった要因に部分的に依存し、当業者には明らかであろう。アフィニティークロマトグラフィー精製の場合、抗体、リガンド、受容体又は抗原を、プロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートが結合するものに対して使用することができる。例えば、本発明のプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートのアフィニティークロマトグラフィー精製の場合、プロテインＡ又はプロテインＧを含むマトリックスを使用することができる。連続したプロテインＡ又はＧアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、プロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを単離することができる。プロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートの純度は、ゲル電気泳動、及び高圧液体クロマトグラフィー等を含む様々な周知の分析方法のいずれかにより決定することができる。
アッセイ
本明細書に提供されるプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートは、当技術分野で既知の種々のアッセイにより、その物理的／化学的特性及び／又は生物活性について、同定、スクリーニング、又は特徴づけされうる。
親和性アッセイ
Ｆｃ受容体又は標的抗原に対するイムノコンジュゲートの親和性は、実施例に記載の方法に従って、ＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）等の標準的機器と、組み換え発現により得られるような受容体又は標的タンパク質とを使用する、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により決定することができる。代替的に、異なる受容体又は標的抗原に対するプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートの結合は、特定の受容体又は標的抗原を発現する細胞株を使用して、例えばフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により、評価することができる。結合親和性を測定するための具体的な説明的及び例示的な実施形態が以下に記載される。
一実施態様によれば、ＫＤは、２５℃でＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００マシン（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する表面プラズモン共鳴により測定される。
Ｆｃ部分とＦｃ受容体との間の相互作用を分析するために、Ｈｉｓタグを付した組み換えＦｃ受容体を、固定化した抗Ｐｅｎｔａ Ｈｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ）によりＣＭ５チップ上に捕捉し、二重特異性コンストラクトを被分析物として使用する。簡潔には、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、供給業者の説明書に従って、Ｎ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化する。抗Ｐｅｎｔａ－Ｈｉｓ抗体を、１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）で４０μｇ／ｍｌに希釈した後、５μｌ／分の流速で注入し、約６５００反応単位（ＲＵ）の結合タンパク質を得る。リガンドの注入後、１Ｍのエタノールアミンを注入し、未反応基をブロックする。その後、Ｆｃ受容体を４ｎＭ又は１０ｎＭで６０秒間捕捉する。動力学測定のため、二重特異性コンストラクトの４倍の段階希釈物（５００ｎＭと４０００ｎＭとの間の範囲）を、ＨＢＳ－ＥＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％のＳｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０、ｐＨ７．４）に２５℃で流速３０μｌ／分で１２０秒間注入する。
標的抗原に対する親和性を決定するため、抗Ｐｅｎｔａ－Ｈｉｓ抗体について記載したように、活性化ＣＭ５センサーチップ表面に固定化した抗ヒトＦａｂ特異的抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって二重特異性コンストラクトを捕捉する。結合タンパク質の最終的な量は、約１２０００ＲＵである。二重特異性コンストラクトを３００ｎＭで９０秒間捕捉する。標的抗原を、２５０ｎＭから１０００ｎＭの濃度範囲で３０μｌ／分の流速で１８０秒間フローセルに通過させる。解離を１８０秒間モニタリングする。
バルク屈折率差を、参照フローセルで得られた応答を差し引くことによって補正する。定常状態応答を使用して、ラングミュア結合等温線の非線形カーブフィッティングによって解離定数ＫＤを導出した。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）を、単純な１対１ラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００評価ソフトウェアバージョン１．１．１）を使用して、会合及び解離センサーグラムを同時にフィッティングすることによって、計算する。平衡解離定数（ＫＤ）は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として計算される。例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９３，８６５－８８１（１９９９）を参照されたい。
活性アッセイ
本発明のプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートの生物活性は、実施例に記載される種々のアッセイによって測定することができる。生物活性は、例えば、Ｔ細胞の増殖の誘導、Ｔ細胞におけるシグナル伝達の誘導、Ｔ細胞における活性化マーカーの発現の誘導、Ｔ細胞によるサイトカイン分泌の誘導、腫瘍細胞等の標的細胞の溶解の誘導、及び腫瘍退縮の誘導及び／又は生存率の改善を含む。
組成物、製剤、及び投与経路
さらなる態様では、本発明は、例えば、以下の治療方法のいずれかにおける使用のための、本明細書に提供されるプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートのいずれかを含む薬学的組成物を提供する。一実施形態では、薬学的組成物は、本明細書に提供されるプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートのいずれかと、薬学的に許容される担体とを含む。別の実施態様では、薬学的組成物は、本明細書に提供されるプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートのいずれかと、例えば以下に記載される、少なくとも１つの追加の治療剤とを含む。
さらに提供されるのは、ｉｎ ｖｉｖｏでの投与に適した形態の、本発明のプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを生成する方法であり、この方法は、（ａ）本発明によるプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを得ること、及び（ｂ）プロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを、少なくとも１つ薬学的に許容される担体とともに製剤化し、それによってプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートの調製物をｉｎ ｖｉｖｏでの投与のために製剤化することを含む。
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される担体中に溶解又は分散された治療的有効量の１つ又は複数のプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを含む。「薬学的に許容される又は薬理学的に許容される」という語句は、用いられる投薬量及び濃度でレシピエントに一般に無毒である、すなわち、例えばヒト等の動物に必要に応じて投与されたとき、副作用、アレルギー反応又は他の有害反応を生じない、分子実体及び組成物を指す。少なくとも１つのプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートと、任意選択的に追加の活性成分とを含有する薬学的組成物の調製は、参照により本明細書に援用されるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０により例示されているように、本開示に照らして当業者に既知であろう。さらに、動物（例えば、ヒト）への投与について、製剤は、ＦＤＡ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ又は他の国の対応する機関によって要求される無菌状態、発熱性、一般的な安全性及び純度基準を満たすべきであることが理解されよう。好ましい組成物は、凍結乾燥製剤又は水溶液である。本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」は、当業者に既知である（例えば、参照により本明細書に援用されるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０，ｐｐ．１２８９－１３２９を参照されたい）、任意の及びすべての溶媒、バッファー、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張化剤、吸収遅延剤、塩、防腐剤、抗酸化剤、タンパク質、薬物、薬物安定化剤、ポリマー、ゲル、バインダー、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、香味剤、染料、そのような類似の材料及びこれらの組み合わせを含む。従来の担体が活性成分と不適合でない限り、治療組成物又は薬学的組成物におけるその使用が企図される。
組成物は、それが固体、液体又はエアロゾルの形態で投与されるかどうか、及び注射等の投与経路のために無菌である必要があるかどうかに応じて、異なる種類の担体を含みうる。本発明のプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲート（及び任意の追加の治療剤）は、静脈内に、皮内に、動脈内に、腹腔内に、病巣内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に、脾臓内に、腎臓内に、胸膜内に、気管内に、鼻腔内に、硝子体内に、膣内に、直腸内に、腫瘍内に、筋肉内に、腹腔内に、皮下に、結膜下に、小胞内に、経粘膜で、心膜内に、臍内に、眼内に、経口で、局所的に、局所的に、吸入（例えば、エアロゾル吸入）により、注射により、注入により、持続注入により、標的細胞を直接浸す局所灌流で、カテーテルを介して、洗浄液を介して、クリームで、脂質組成物（例えば、リポソーム）で、又は当業者に既知であろう他の方法若しくは上記の任意の組み合わせによって、投与することができる（例えば、参照によりここに援用されるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０参照）。非経口投与、特に静脈内注入が、本発明のプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド及びイムノコンジュゲート等のポリペプチド分子を投与するために、最も一般的に使用される。
非経口組成物には、注射による投与、例えば皮下、皮内、病巣内、静脈内、動脈内、筋肉内、髄腔内又は腹腔内注射用に設計されたものが含まれる。注射のために、本発明のプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートは、水溶液、好ましくは生理的に適合するバッファー、例えばハンクス溶液、リンゲル液、又は生理食塩水バッファー中において製剤化されうる。溶液は、懸濁剤、安定剤及び／又は分散剤等の調合剤を含んでもよい。代替的に、プロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド及びイムノコンジュゲートは、使用前に、適切なビヒクル、例えば、滅菌パイロジェンフリー水を用いた構成のための粉末形態であってもよい。滅菌注射用溶液は、必要に応じて、以下に列挙する他の様々な成分とともに、本発明のプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを、必要な量で適切な溶媒中に組み込むことによって調製される。無菌状態は、例えば、滅菌濾過膜を通した濾過によって容易に達成されうる。一般に、分散物は、種々の滅菌した活性成分を、塩基性分散媒及び／又は他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液、懸濁液又は乳化物を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、以前に滅菌濾過したその液体媒体から活性成分と任意の追加の所望な成分の粉末が得られる減圧乾燥又は凍結乾燥技術である。液体媒体は、必要に応じて適切に緩衝し、注射に先立ち十分な食塩水又はグルコースで液体希釈剤をまず等張性にするべきである。組成物は、製造及び貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌といった微生物の汚染作用から保護されなければならない。エンドトキシン汚染は安全レベルの最小限に、例えば、０．５ｎｇ／ｍｇタンパク質未満に抑えるべきであることが理解されよう。薬学的に許容される適切な担体には、限定されないが、リン酸、クエン酸、及びその他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（オクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブチル若しくはベンジルアルコール；メチル若しくはプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾール等）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；グルコース、マンノース若しくはデキストリンを含む、単糖類、二糖類、及びその他の糖質；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース若しくはソルビトール等の糖；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が含まれる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を上げる化合物（例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、デキストラン等）を含んでいてもよい。任意に、懸濁液は、好適な安定化剤、又は高度に濃縮した溶液の調製を可能にするために、化合物の溶解度を高める薬剤も含んでいてもよい。さらに、活性化合物の懸濁液は、適切な油注射懸濁液として調製されてもよい。好適な親油性溶媒又はビヒクルには、ゴマ油等の脂肪油、又はオレイン酸エチル（ｅｔｈｙｌ ｃｌｅａｔ）若しくはトリグリセリド等の合成脂肪酸エステル、又はリポソームが挙げられる。
活性成分は、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロエマルジョンにおいて、例えば、コアセルベーション法又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ－（メチルメタクリレート）マイクロカプセルに封入されうる。そのような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）に開示されている。徐放性調製物が調製されてもよい。徐放性調製物の適切な例には、ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリックスは、成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。特定の実施形態において、注射可能組成物の持続性吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン、又はこれらの組み合わせの組成物での使用によってもたらすことができる。
先述の組成物に加えて、プロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートは、持効性製剤として製剤化されてもよい。そのような長時間作用性調製物は、移植（例えば、皮下又は筋肉内）又は筋肉内注射によって投与することができる。したがって、例えば、プロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド及びイムノコンジュゲートは、適切なポリマー材料若しくは疎水性材料（例えば許容されるオイル中のエマルジョンとして）又はイオン交換樹脂を用いて、又はやや難溶性の誘導体、例えば、やや難溶性の塩として、製剤化されうる。
本発明のプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを含む薬学的組成物は、従来の混合、溶解、乳化、カプセル化、封入、又は凍結乾燥の方法により製造されうる。薬学的組成物は、１つ又は複数の生理的に許容される担体、希釈剤、賦形剤又はタンパク質を薬学的に使用することのできる製剤へと加工することを容易にする補助剤を使用して、従来の様式で配合されてもよい。適切な製剤は、選択した投与経路に依存する。
プロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートは、遊離酸若しくは塩基、中性又は塩の形態の組成物へと製剤化されうる。薬学的に許容される塩は、遊離酸又は塩基の生物活性を実質的に保持する塩である。これらには、酸付加塩、例えば、タンパク質性組成物の遊離アミノ基で形成されるもの、又は有機酸で形成されるもの、例えば、塩酸若しくはリン酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、又はマンデル酸等の有機酸が含まれる。また、遊離カルボキシル基と形成される塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム若しくは水酸化第二鉄等の無機塩基；又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン若しくはプロカイン等の有機塩基に由来しうる。薬学的塩は、対応する遊離塩基形態よりも、水性及び他のプロトン性溶媒に溶けやすい傾向がある。
治療方法及び組成物
本明細書に提供されるプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートのいずれもが、治療方法において使用されうる。本発明のプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートは、例えばがんの治療において、免疫療法薬として使用することができる。
治療方法における使用のための、本発明のプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートは、医学行動規範と一致した様式で、製剤化、用量決定、及び投与される。この文脈において考慮すべき要因には、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医療従事者に既知である他の要因が含まれる。
一態様において、医薬としての使用のための本発明のプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートが提供される。さらなる態様では、疾患の治療における使用のための本発明のプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートが提供される。一部の実施形他では、治療方法における使用のための本発明のプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートが提供される。一実施形態では、本発明は、疾患の治療を必要とする個体の疾患の治療における使用のための、本明細書に記載されるプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを提供する。一部の実施形他では、本発明は、個体に対して治療的有効量のプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを投与することを含む、疾患を有する個体の治療方法における使用のためのプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを提供する。一部の実施態様では、治療される疾患は増殖性疾患である。特定の実施態様では、疾患はがんである。一部の実施態様では、本方法は、個体に対して治療的有効量の少なくとも１つの追加の治療剤、例えば、治療される疾患ががんである場合は抗がん剤を投与することをさらに含む。さらなる実施形態では、本発明は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解の誘導における使用のための、本明細書に記載されるプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを提供する。一部の実施態様では、本発明は、個体において、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導する方法における使用のための、プロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを提供し、この方法は、標的細胞の溶解を誘導するために、個体に対して有効量のプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを投与することを含む。上記実施態様のいずれかによる「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトである。
さらなる態様では、本発明は、医薬の製造又は調製における本発明のプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートの使用を提供する。一実施態様では、医薬は、疾患の治療を必要とする個体における疾患の治療のためのものである。さらなる実施態様では、医薬は、疾患を有する個体に対して治療的有効量の医薬を投与することを含む、疾患を治療する方法における使用のためのものである。一部の実施態様では、治療される疾患は、増殖性疾患である。特定の実施態様では、疾患はがんである。一実施態様では、本方法は、治療的有効量の少なくとも１つの追加の治療剤、例えば、治療される疾患ががんである場合は抗がん剤を個体に投与することをさらに含む。さらなる実施態様では、医薬は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導するためのものである。またさらなる実施態様では、医薬は、個体における標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導する方法における使用のためのものであり、この方法は、標的細胞の溶解を誘導するために個体に対して有効量の医薬を投与することを含む。上記実施態様のいずれかによる「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトでありうる。
さらなる態様では、本発明は、疾患を治療するための方法を提供する。一実施形態では、方法は、そのような疾患を有する個体に対して治療的有効量の本発明のプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを投与することを含む。一実施形態では、組成物は、前記個体に対して投与され、薬学的に許容される形態の、本発明のプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを含む。一部の実施態様では、治療される疾患は、増殖性疾患である。特定の実施態様では、疾患はがんである。一部の実施態様では、方法は、個体に対して治療的有効量の少なくとも１つの追加の治療剤、例えば、治療される疾患ががんである場合は抗がん剤を投与することをさらに含む。上記実施態様のいずれかによる「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトでありうる。
さらなる態様では、本発明は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導する方法を提供する。
一部の実施態様では、治療される疾患は、増殖性障害、特にがんである。がんの非限定的な例には、膀胱がん、脳がん、頭頸部がん、膵臓がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、食道がん、結腸がん、結腸直腸がん、直腸がん、胃がん、前立腺がん、血液がん、皮膚がん、扁平上皮癌、骨がん、及び腎臓がんが含まれる。本発明のプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを使用して治療することのできる他の細胞増殖性疾患には、限定されないが、腹部、骨、乳房、消化系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、脳下垂体、睾丸、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭頸部、神経系（中枢及び末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部領域及び泌尿生殖器系に位置する新生物が含まれる。前がん状態又は病変及びがん転移も含まれる。一部の実施態様では、がんは、腎細胞がん、皮膚がん、肺がん、結腸直腸がん、乳がん、脳がん、頭頸部がんからなる群から選択される。当業者であれば、プロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートが、多くの場合、治癒を提供せずに部分的な利益を提供するのみである場合があることを容易に認識する。いくつかの実施形態では、何らかの利益を有する生理的変化も治療的に有益であると考慮される。したがって、いくつかの実施態様では、生理的変化を提供するプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートの量は、「有効量」又は「治療的有効量」と考慮される。治療を必要とする対象、患者、又は個体は、典型的には哺乳動物であり、具体的にはヒトである。
いくつかの実施形態では、有効量の本発明のプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートは、細胞に投与される。他の実施形態では、治療的有効量の本発明のプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートは、疾患の治療のために個体に投与される。
疾患の予防又は治療のために、本発明のプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートの適切な投薬量は（単独で又は１つ若しくは複数の他の追加の治療剤と組み合わせて使用されるとき）、治療される疾患の種類、投与経路、患者の体重、ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートの種類、疾患の重症度及び経過、ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートが予防目的で投与されるか又は治療目的で投与されるか、以前又は現在の治療的介入、患者の病歴及びプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートに対する応答、並びに主治医の判断に依存するであろう。いずれにせよ、投与を担当する施術者は、組成物中の１つ以上の活性成分の濃度及び個々の対象に対する１つ以上の適切な用量を決定する。本明細書では、単回投与又は様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含むがこれらに限定されない種々の投薬スケジュールが企図される。
本明細書に記載される治療的有効量のプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートは、通常、実質的な毒性を引き起こすことなく治療的利益を提供するであろう。プロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートの毒性及び治療的有効性は、細胞培養物又は実験動物における標準的な薬学的手順によって決定することができる。細胞培養アッセイ及び動物研究を使用して、ＬＤ５０（集団の５０％に対する致死量）及びＥＤ５０（集団の５０％で治療的に有効な用量）を決定することができる。毒性効果と治療効果の用量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。大きな治療指数を呈するプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートが好ましい。一実施形態では、本発明によるプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートは、高い治療指数を呈する。細胞培養アッセイ及び動物研究から得られたデータは、ヒトでの使用に適した投薬量の範囲を製剤化するために使用できる。投薬量は、好ましくは、毒性がほとんど又はまったくないＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内にある。投薬量は、種々の要因、例えば、用いられる剤形、利用される投与経路、対象の状態等に応じて、この範囲内で変動しうる。正確な製剤、投与経路及び投薬量は、患者の状態という観点から個々の医師により選択されうる（例えば、その全体が参考により本明細書に援用される、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｃｈ．１，ｐ．１のＦｉｎｇｌ ｅｔ ａｌ．，１９７５を参照されたい）。
本発明のプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２変異体又はイムノコンジュゲートで治療される患者の主治医は、毒性、及び臓器不全等に起因して、どのように及びいつ、投与を中止、中断、又は調整するかを知っているであろう。逆に、主治医は、臨床反応が適切でない場合、治療をより高いレベルに調整することも知っている（毒性を除いて）。対象となる障害の管理における投与用量の大きさは、治療される状態の重症度、及び投与経路等によって変わる。状態の重症度は、例えば、部分的には、標準的な予後評価方法によって評価されうる。さらに、用量及びおそらく投与頻度も、個々の患者の年齢、体重、及び応答に応じて変化するであろう。
他の薬剤及び治療
本発明のプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートは、治療法において、１つ又は複数の他の薬剤と組み合わせて投与することができる。例えば、本発明のプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートは、少なくとも１つの追加の治療剤と共投与されうる。「治療剤」という用語は、そのような治療を必要とする個体の症状又は疾患を治療するために投与される任意の薬剤を包含する。このような追加の治療剤は、治療される特定の適応症に適した任意の活性成分、好ましくは、互いに有害な影響を与えない相補的な活性を有するものを含みうる。一部の実施態様では、追加の治療剤は、免疫調節剤、細胞分裂阻害剤、細胞接着阻害剤、細胞傷害性剤、細胞アポトーシスの活性化因子、又はアポトーシス誘導因子に対する細胞の感受性を高める薬剤である。特定の実施態様では、追加の治療剤は、抗がん剤、例えば微小管破壊剤、抗代謝剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ＤＮＡインターカレーター、アルキル化剤、ホルモン療法、キナーゼ阻害剤、受容体アンタゴニスト、腫瘍細胞アポトーシスの活性化因子、又は抗血管新生剤である。
そのような他の薬剤は、意図した目的に有効な量で組み合わせて適切に存在する。このような他の薬剤の有効量は、使用されるプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートの量、障害又は治療の種類、及び上述の他の因子に依存する。プロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド及びイムノコンジュゲートは、通常、本明細書に記載されるものと同じ投薬量で及び投与経路を用いて、又は本明細書に記載される投薬量の約１から９９％で、又は適切であることが経験的に／臨床的に決定される任意の投薬量で及び任意の経路により、使用される。
上述のこのような併用療法は、併用投与（２つ以上の治療剤が、同じ又は別個の組成物に含まれる）、及び別個の投与を包含し、この場合、本発明のプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートの投与は、追加の治療剤及び／又はアジュバントの投与前、投与と同時に及び／又は投与後に行うことができる。本発明のプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートは、放射線療法と組み合わせて使用することもできる。
製造品
本発明の別の態様において、上述の障害の治療、予防及び／又は診断に有用な材料を含む製造品が提供される。製造品は、容器と、容器に挿入されるか、又は容器に付随するラベル又はパッケージ添付文書とを備えている。適切な容器には、例えば、ボトル、バイアル、注射器、ＩＶ溶液バッグ等が含まれる。容器は、ガラス又はプラスチック等の様々な材料から形成されうる。容器は、それだけで、又は状態を治療、予防及び／又は診断するために有効な別の組成物との組み合わせで組成物を保持し、無菌アクセスポートを有しうる（例えば、容器は、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針によって穿通可能なストッパーを有するバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本発明のプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートである。ラベル又は添付文書は、組成物が、選択される状態を治療するために使用されることを示す。さらに、製造品は、（ａ）中に、本発明のプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチドを含む組成物を有する第１の容器と、（ｂ）中に、さらなる細胞毒性剤又は他の治療剤を含む組成物を有する第２の容器とを含みうる。本発明のこの実施形態における製造品は、組成物が特定の症状を治療するために使用可能であることを示す添付文書をさらに備えてもよい。代替的に、又は追加的に、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化生理食塩水、リンゲル液及びデキストロース溶液を含む第２の（又は第３の）容器をさらに含みうる。製造品は、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む、商業的及びユーザの観点から望ましい他の材料をさらに含みうる。
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本発明のさらなる態様
さらなる態様では、本発明は、（ｉ）マスキング部分と、（ｉｉ）第１のプロテアーゼ切断部位を含むリンカーとを含むマスクを提供し、マスキング部分は、リンカーを通してＩＬ－２ポリペプチドに共有結合可能であり、マスキング部分は、ＩＬ－２ポリペプチドに結合してそれによりＩＬ－２ポリペプチドを可逆的に隠すことができ、マスキング部分は、第２のプロテアーゼ切断部位を含み、マスキング部分は、第１のプロテアーゼ切断部位及び／又は第２のプロテアーゼ切断部位で切断されると、ＩＬ－２ポリペプチドを隠さない。
一実施形態では、マスキング部分は、リンカーを通してＩＬ－２ポリペプチドのアミノ末端又はカルボキシ末端に共有結合可能である。一実施形態では、マスキング部分は、ＩＬ－２アンタゴニストである。一実施形態では、マスキング部分は、ＩＬ－２抗体又はＩＬ－２受容体サブユニットである。一実施形態では、ＩＬ－２抗体は、Ｆａｂ分子を含む。一実施形態では、マスキング部分は、ＭＴ２０４から得られる。一実施形態では、マスキング部分は、ＭＴ２０４である。ＭＴ２０４抗体は、例えばＶｏｌｋｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４４（２００７）１７４３－１７５３、及び国際公開第２００６／１２８６９０号に開示されている。一実施形態では、Ｆａｂ分子は、単鎖Ｆａｂ分子である。一実施形態では、第２のプロテアーゼの切断部位は、Ｆａｂの重鎖（ＶＨ）の可変ドメインと軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインとの間に位置している。一実施形態では、第１のプロテアーゼ切断部位及び第２のプロテアーゼ切断部位の各々は、少なくとも１つプロテアーゼ認識配列を含む。一実施形態では、第１のプロテアーゼ切断部位のプロテアーゼ認識配列及び／又は第２のプロテアーゼ切断部位（認識配列）のプロテアーゼ認識配列は：（ａ）ＲＱＡＲＶＶＮＧ（配列番号１６）；（ｂ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＧＲＳＲＧＳＦＰ（配列番号１７）；（ｃ）ＲＱＡＲＶＶＮＧＸＸＸＸＸＶＰＬＳＬＹＳＧ（配列番号１８），（Ｘは、いずれかのアミノ酸である）；（ｄ）ＲＱＡＲＶＶＮＧＶＰＬＳＬＹＳＧ（配列番号１９）；（ｅ）ＰＬＧＬＷＳＱ（配列番号２０）；（ｆ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＲＱＡＲＶＶＮＧ（配列番号２１）；（ｇ）ＦＶＧＧＴＧ（配列番号２２）；（ｈ）ＫＫＡＡＰＶＮＧ（配列番号２３）；（ｉ）ＰＭＡＫＫＶＮＧ（配列番号２４）；（ｊ）ＱＡＲＡＫＶＮＧ（配列番号２５）；（ｋ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ（配列番号２６）；（ｌ）ＱＡＲＡＫ（配列番号２７）；（ｍ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＰＭＡＫＫ（配列番号２８）；（ｎ）ＫＫＡＡＰ（配列番号２９）；（ｏ）ＰＭＡＫＫ（配列番号３０）；（ｐ）ＹＡＡＲＫＧＧＩ（配列番号３１）；（ｑ）ＰＱＡＲＫ（配列番号３２）；及び（ｒ）ＨＱＡＲＫ（配列番号３３）からなる群から選択される。
一実施形態では、第１のプロテアーゼ切断部位のプロテアーゼ認識配列は、第２のプロテアーゼ切断部位のプロテアーゼ認識配列とは異なる。一実施形態では、第１のプロテアーゼ切断部位のプロテアーゼ認識配列は、第２のプロテアーゼ切断部位のプロテアーゼ認識配列と同じである。
一実施形態では、第１のプロテアーゼ切断部位のプロテアーゼ認識配列及び／又は第２のプロテアーゼ切断部位のプロテアーゼ認識配列は、ＰＭＡＫＫ（配列番号３０）である。一実施形態では、第１のプロテアーゼ切断部位のプロテアーゼ認識配列は、ＰＭＡＫＫ（配列番号３０）である。一実施形態では、第２のプロテアーゼ切断部位のプロテアーゼ認識配列は、ＰＭＡＫＫ（配列番号３０）である。一実施形態では、第１のプロテアーゼ切断部位のプロテアーゼ認識配列及び第２のプロテアーゼ切断部位のプロテアーゼ認識配列は、ＰＭＡＫＫ（配列番号３０）である。
一実施形態では、ＩＬ－２ポリペプチドは、野生型ＩＬ－２、好ましくは配列番号１３によるヒトＩＬ－２、又は変異型ＩＬ－２ポリペプチドである。一実施形態では、変異型ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号１３によるヒトＩＬ－２の群Ｔ３Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｌ７２Ｇ、Ｃ１２５Ａから洗濯されるいずれかのアミノ酸置換を含む。一実施形態では、変異型ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号１３によるヒトＩＬ－２のアミノ酸置換Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＬ７２Ｇを含む。一実施形態では、変異型ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号１３によるヒトＩＬ－２のアミノ酸置換Ｔ３Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｌ７２Ｇ及びＣ１２５Ａを含む。
一実施形態では、マスキング部分及びリンカーを含むマスクは、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。
本開示のさらなる態様
態様１．（ｉ）ＩＬ－２ポリペプチドと，（ｉｉ）マスキング部分と、（ｉｉｉ）第１のプロテアーゼ切断部位を含むリンカーとを含む、プロテアーゼ活性化型インターロイキン－２（ＩＬ－２）ポリペプチドであって、マスキング部分は、リンカーを通してＩＬ－２ポリペプチドに共有結合し、マスキング部分は、ＩＬ－２ポリペプチドに結合することができ、それによりＩＬ－２ポリペプチドを可逆的に隠すことができ、マスキング部分は、第２のプロテアーゼ切断部位を含み、マスキング部分は、第１の及び／又は第２のプロテアーゼ切断部位で切断されると、ＩＬ－２ポリペプチドを隠さない、プロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド。
態様２．マスキング部分が、リンカーを通して、インターロイキン－２ポリペプチドのアミノ末端又はカルボキシ末端に共有結合する、態様１のプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド。
態様３．マスキング部分が、ＩＬ－２ アンタゴニストである、態様１又は２のプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド。
態様４．マスキング部分が、ＩＬ－２抗体又はＩＬ－２受容体サブユニットである、態様１から３のいずれかのプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド。
態様５．Ｆａｂ分子を含む、態様４のプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド。
態様６．マスキング部分が、ＭＴ２０４に由来する抗体、好ましくはＭＴ２０４である、態様１から４のいずれかのプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド。
態様６．Ｆａｂ分子が、単鎖Ｆａｂ分子である、態様５又は６のプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド。
態様７．第２のプロテアーゼ切断部位が、Ｆａｂの重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）との間に位置している、態様６のプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド。
態様８．第１のプロテアーゼ切断部位及び第２のプロテアーゼ切断部位は各々が、少なくとも１つのプロテアーゼ認識配列を含む、態様１～７のいずれかのプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド。
態様９．第１のプロテアーゼ切断部位のプロテアーゼ認識配列及び／又は第２のプロテアーゼ切断部位のプロテアーゼ認識配列が：
（ａ）配列番号１６によるＲＱＡＲＶＶＮＧ；
（ｂ）配列番号１７によるＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＧＲＳＲＧＳＦＰ；
（ｃ）配列番号１８によるＲＱＡＲＶＶＮＧＸＸＸＸＸＶＰＬＳＬＹＳＧ（Ｘは、いずれかのアミノ酸である）；
（ｄ）配列番号１９によるＲＱＡＲＶＶＮＧＶＰＬＳＬＹＳＧ；
（ｅ）配列番号２０によるＰＬＧＬＷＳＱ；
（ｆ）配列番号２１によるＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＲＱＡＲＶＶＮＧ；
（ｇ）配列番号２２によるＦＶＧＧＴＧ；
（ｈ）配列番号２３によるＫＫＡＡＰＶＮＧ；
（ｉ）配列番号２４によるＰＭＡＫＫＶＮＧ；
（ｊ）配列番号２５によるＱＡＲＡＫＶＮＧ；
（ｋ）配列番号２６によるＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ；
（ｌ）配列番号２７によるＱＡＲＡＫ；
（ｍ）配列番号２８によるＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＰＭＡＫＫ；
（ｎ）配列番号２９によるＫＫＡＡＰ；
（ｏ）配列番号３０によるＰＭＡＫＫ；
（ｐ）配列番号３１によるＹＡＡＲＫＧＧＩ；
（ｑ）配列番号３２によるＰＱＡＲＫ；及び
（ｒ）配列番号３３によるＨＱＡＲＫ
からなる群から選択される、態様１～８のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド。
態様１０．第１のプロテアーゼ切断部位のプロテアーゼ認識配列及び／又は第２のプロテアーゼ切断部位のプロテアーゼ認識配列が、ＰＭＡＫＫ（配列番号３０）である、態様８又は９のプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド。
態様１１．野生型ＩＬ－２、好ましくは配列番号１３によるヒトＩＬ－２、又は変異型ＩＬ－２ポリペプチドである、態様１から１１のいずれかのプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド。
態様１２．変異型ＩＬ－２ポリペプチドが、配列番号１３によるヒトＩＬ－２のＴ３Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｌ７２Ｇ、Ｃ１２５Ａの群から選択されるいずれかのアミノ酸置換を含む、態様１１のプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド。
態様１３．変異型ＩＬ－２ポリペプチドが、配列番号１３によるヒトＩＬ－２のアミノ酸置換Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＬ７２Ｇを含む、態様１１又は１２のプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド。
態様１４．変異型ＩＬ－２ポリペプチドが、配列番号１３によるヒトＩＬ－２のアミノ酸置換Ｔ３Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｌ７２Ｇ及びＣ１２５Ａを含む、態様１１から１３のいずれかのプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド。
態様１５．マスキング部分及びリンカーが、配列番号１２の」アミノ酸配列を含む、態様１１から１４のいずれかのプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド。
態様１６．配列番号９のアミノ酸配列を含む、態様１１から１５のいずれかのプロテアーゼ－活性化型ＩＬ－２ポリペプチド。
態様１７．非ＩＬ－２部分にさらに結合している、態様１から１６のいずれかのプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド。
態様１８．カルボキシ末端ペプチド結合をマスキング部分と共有し、アミノ末端ペプチド結合を非ＩＬ－２部分と共有するか、又はアミノ末端ペプチド結合をマスキング部分と共有し、カルボキシ末端ペプチド結合を非ＩＬ－２部分と共有する、態様１７のプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド。
態様１９．前記非ＩＬ－２部分が、抗原結合部分又はエフェクター細胞結合部分である、態様１７又は１８のプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド。
態様２０．態様１から１６のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチドと、抗原結合部分及び／又はエフェクター細胞結合部分とを含むイムノコンジュゲート。
態様２１．アミノ末端ペプチド結合又はカルボキシ末端ペプチド結合を、抗原結合部分又はエフェクター細胞結合部分と共有する、態様２０のイムノコンジュゲート。
態様２２．第１の抗原結合部分と第２の抗原結合部分、又は第１のエフェクター細胞抗原結合部分と第２のエフェクター細胞抗原結合部分、又は抗原結合部分とエフェクター細胞結合部分を含む、請求項２０又は２１に記載のイムノコンジュゲート。
態様２３．（ｉ）前記プロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチドが、アミノ末端ペプチド結合又はカルボキシ末端ペプチド結合を、前記第１の抗原結合部分と共有し、前記第２の抗原結合部分が、アミノ末端ペプチド結合又はカルボキシ末端ペプチド結合を、ａ）前記プロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はｂ）前記第１の抗原結合部分と共有するか；（ｉｉ）前記プロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチドが、アミノ末端ペプチド結合又はカルボキシ末端ペプチド結合を、前記第１のエフェクター細胞結合部分と共有し、前記第２のエフェクター細胞結合部分が、アミノ末端ペプチド結合又はカルボキシ末端ペプチド結合を、ａ）前記プロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はｂ）前記第１のエフェクター細胞結合部分と共有するか；（ｉｉｉ）前記プロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチドが、アミノ末端ペプチド結合又はカルボキシ末端ペプチド結合を、抗原結合部分と共有し、エフェクター細胞結合部分が、アミノ末端ペプチド結合又はカルボキシ末端ペプチド結合を、ａ）前記プロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はｂ）前記抗原結合部分と共有するか；又は（ｉｖ）前記プロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチドが、アミノ末端ペプチド結合又はカルボキシ末端ペプチド結合を、エフェクター細胞結合部分と共有し、抗原結合部分が、アミノ末端ペプチド結合又はカルボキシ末端ペプチド結合を、ａ）前記プロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はｂ）前記エフェクター細胞結合部分と共有する、態様２２のイムノコンジュゲート。
態様２４．前記抗原結合部分又はエフェクター細胞結合部分が、抗体又は抗体断片である、態様１７のプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又は態様２０から２３のいずれか１つのイムノコンジュゲート。
態様２５．前記抗原結合部分及び／又は前記エフェクター細胞結合部分が、Ｆａｂ分子及びｓｃＦｖ分子から選択される、態様１９のプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又は態様２０から２４のいずれか１つのイムノコンジュゲート。
態様２６．前記抗原結合部分及び／又は前記エフェクター細胞結合部分が、免疫グロブリン分子、特にＩｇＧ分子である、態様１９のプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又は態様２０から２５のいずれか１つのイムノコンジュゲート。
態様２７．前記抗原結合部分が、シス・ターゲティングを達成するために、腫瘍細胞上又は腫瘍細胞環境内に存在する抗原に向けられている、及び／又は前記エフェクター細胞結合部分が、腫瘍細胞環境内に存在するエフェクター細胞に向けられている、態様１９の変異型ＩＬ－２ポリペプチド又は態様２０から２６のいずれか１つのイムノコンジュゲート。
態様２８．態様１から２７のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートをコードする単離されたポリヌクレオチド。
態様２９．態様２８のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
態様３０．態様２８のポリヌクレオチド又は態様２９の発現ベクターを含む宿主細胞。
態様３１．態様３０の宿主細胞を、プロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートの発現に適した条件下で培養することを含む、プロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はそのイムノコンジュゲートを生成する方法。
態様３２．態様３１の方法によって生成されたプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲート。
態様３３．態様１から２７のいずれか１つ又は３２のプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
態様３４．疾患の治療を必要とする個体の疾患の治療における使用のための、態様１から２７のいずれか１つ又は３２のプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲート。
態様３５．前記疾患が、がんである、態様３４のプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲート。
態様３６．疾患の治療を必要とする個体の疾患を治療するための医薬の製造のための、態様１から２７のいずれか１つ又は３２のプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートの使用。
態様３７．個体の疾患を治療する方法であって、前記個体に対して、態様１から２７のいずれか１つ又は３２のプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを薬学的に許容される形態で含む治療的有効量の組成物を投与することを含む方法。
態様３８．前記疾患が、がんである、態様３７の方法。
態様３９．個体の免疫系を刺激する方法であって、前記個体に対して、態様１から２７のいずれか１つ又は３２のプロテアーゼ活性化型ＩＬ－２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを薬学的に許容される形態で含む有効量の組成物を投与することを含む方法。
以下は、本発明の方法及び組成物の実施例である。上記で提供された全般的な記載を前提として、他の種々の実施形態が実施されうると理解されたい。
実施例１
マスクされた標的化抗体ＩＬ２ｖ融合物（ｓｃＦｖマスクあり）とコントロールコンストラクトの生成
ワンアーム型ＣＤ８標的化ＩＬ２ｖ融合コンストラクトを生成した。それらは、Ｆｃホール鎖上のＮ末端Ｆａｂ断片を介してヒトＣＤ８に一価で結合し、マスクされていないＣ末端ＩＬ２ｖ（マスクされていないコントロールコンストラクト、配列番号１、２、３；図１Ａ）又はマスクされていないＮ末端ＩＬ２ｖ（配列番号４、２、１４；図１Ｅ）を担持するＦｃノブ鎖とヘテロ二量体化されている。ヘテロ二量体化は、ノブ・イントゥー・ホール技術の適用によって達成され、活性化ヒトＦｃγ受容体と補体構成成分Ｃ１ｑへの結合は、抗体のＦｃ部分におけるＰＧ ＬＡＬＡ変異の導入により無効化された。３つの異なるマスクされたＣＤ８標的化ＩＬ２ｖコンストラクトが生成された。第１のコンストラクトは、２つのＰＭＡＫＫマトリプターゼ認識部位を担持するｓｃＦｖマスクを含み、１つのＰＭＡＫＫマトリプターゼ認識部位はリンカー中でｓｃＦｖマスクのＶＨとＶＬとの間に位置し、１つはリンカー中でｓｃＦｖマスクとＩＬ２ｖとの間に位置している（配列番号４、２、５、図１Ｂ）。第２のコンストラクトは、プロテアーゼ認識部位を１つも担持しないｓｃＦｖマスクを含む（非切断型コントロール；配列番号４、２、６；図１Ｃ）。第３のコンストラクトは、１つのＭＭＰ９／マトリプターゼ認識部位をｓｃＦｖマスクとＩＬ２ｖとの間に担持するジスルフィド安定化ｓｃＦｖマスクを含む（配列番号１、７、８；図１Ｄ）。これらコンストラクトは、図１Ａ～Ｅに模式的に示されている。
マスクされた抗体ＩＬ２ｖ融合物とコントロールコンストラクトの生成
マスクされた抗体ＩＬ２ｖ融合物とコントロールコンストラクトを、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞の一過性のトランスフェクションにより生成した。細胞を、Ｅｘｐｉ２９３培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１４３５１０１）に密度２．５×１０ｅ６／ｍｌで播種した。発現ベクター及びＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅトランスフェクションキット、Ｃａｔ．Ｎｏ．１３３８５５４４）を、ＯｐｔｉＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１１５２０３８６）中で別々に混合した。５分後、両溶液を合わせ、ピペットにより混合し、２５分間室温でインキュベートした。細胞を、ベクター／ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ溶液に加え、５％のＣＯ２雰囲気の振盪インキュベーター内で２４時間３７℃でインキュベートした。トランスフェクションの１日後、補充物（エンハンサー１＋２、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅトランスフェクションキット）を加えた。細胞上清を、４～５日後に、遠心分離及びその後の濾過（０．２μｍフィルター）により回収した。
マスクされた抗体ＩＬ２ｖ融合物とコントロールコンストラクトの精製及び分析
タンパク質を、標準的なプロトコールに従って、濾過した細胞培養上清から精製した。簡潔には、融合タンパク質を、プロテインＡ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（平衡化バッファー：２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５；溶出バッファー：２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０）を使用するプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーとＰＯＲＯＳ ＸＳカラム（２０ｍＭのＮａＰｈｏｓｐｈａｔｅ（０～４５０ｍＭのＮａＣｌグラジエント）ｐＨ７．１）を使用する陽イオン交換クロマトグラフィー（ｃＩＥＸ）との組み合わせにより細胞培養上清から精製した。タンパク質を、遠心分離（ＭＷＣＯ ３０．０００；Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により遠心分離し、凝集したタンパク質を、分取サイズ排除クロマトグラフィーにより単量体タンパク質から分離し、０，０１％のＴｗｅｅｎ２０（ｐＨ６．０）あり又はなしで、２０ｍＭのヒスチジン、１４０ｍＭの塩化ナトリウムへと製剤化した。
代替的に、１つのＭＭＰ９／マトリプターゼ認識部位を、ｓｃＦｖマスクとＩＬ２ｖとの間に担持するｓｃＦｖマスクを含むコンストラクト（ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＭＴ２０４ １ｘＭＭＰ９／マトリプターゼ；配列番号１、７、８）は、プロテインＡ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（平衡化バッファー：１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４；溶出バッファー：５０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０）を使用するプロテインＡ－アフィニティークロマトグラフィーにより精製されたものであり、遠心分離（ＭＷＣＯ ３０．０００；Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により中和及び濃縮した。凝集したタンパク質を、ランニングバッファーとして２０ｍＭのヒスチジン、１４０ｍＭの塩化ナトリウム（ｐＨ６．０）を用いる分取サイズ排除クロマトグラフィー（ＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００）により単量体タンパク質から分離し、その後遠心分離（ＭＷＣＯ ３０．０００；Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により再び遠心分離した。
Ｐａｃｅ、ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９５、４、２４１１－１４２３によるアミノ酸配列に基づいて計算した質量減衰係数を使用して、２８０ｎｍにおける吸収を測定することにより、精製したタンパク質の濃度を決定した。ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ又はＬａｂＣｈｉｐ ＧＸ Ｔｏｕｃｈ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、還元剤の存在下及び非存在下で、ＣＥ－ＳＤＳにより、タンパク質の純度及び分子量を分析した。単量体含有量の決定が、ランニングバッファー（それぞれ、２００ｍＭのアルギニン、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％のＮａＮ３、ｐＨ６．７、又は２００ｍＭのＫ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭのＫＣｌ ｐＨ７．０）中で平衡化した分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ又はＢｉｏＳｕｉｔｅ Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ＳＥＣ）を使用して、ＨＰＬＣクロマトグラフィーにより２５℃で実施された。
実施例２
マトリプターゼでの消化後のマスクされたＣＤ８－ＩＬ２ｖコンストラクトでの治療時のＮＫ９２細胞の増殖
マトリプターゼでの消化後に又は未消化で、ヒトＮＫ細胞株ＮＫ９２の増殖を、２つのＰＭＡＫＫリンカー又は１つのＭＭＰ９／マトリプターゼリンカーを含むＭＴ２０４マスクされたＣＤ８－ＩＬ２ｖコンストラクトで４日間治療したときに評価し、マスクされていないＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＯＡ（ワンアーム型）及びＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＭＴ２０４非切断型コンストラクトの活性と比較した。ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＭＴ２０４ ２ｘＰＭＡＫＫは、マトリプターゼでの消化後に増殖を誘導したが、リンカーがマトリプターゼによって消化されないときにはまったく増殖を誘導しなかった（図２）。対照的に、ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＭＴ２０４ １ｘＭＭＰ９／マトリプターゼは、マトリプターゼでの消化後にまったく増殖を誘導しなかった（図２）。
ＮＫ９２細胞を回収し、係数し、生存率について評価した。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、残留するＩＬ２を除去した。洗浄したＮＫ９２細胞を、ＩＬ２を含まない新鮮な培地（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ１６４０、２％のＦＣＳ、１％のグルタミン）中で、１ｍｌ当たり１６０’０００個の細胞に再懸濁し、１２．５μｌの細胞懸濁液を、３８４ウェル細胞培養物で処理した平底プレートに移した。３０μｇの抗体－サイトカイン融合物を、６μｌのマトリプターゼ（Ｅｎｚｏ ～２．５Ｕ／μｌ（マトリプターゼ：Ｅｎｚｏからのヒト組み換えマトリプターゼ、ＡＬＸ－２０１－２４６－Ｕ２５０）又は未消化コントロールとしてのマトリプターゼなし）で、２時間３７℃で６０μｌのマトリプターゼバッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ、５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ ２０、ｐＨ９．０）中において消化し、１２．５μｌの希釈抗体を、消化後にウェル毎に加え、ウェル当たり２５μｌの最終体積に到達させた。プレートは、インキュベーター内で４日間インキュベートした。
４日後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）試薬及び細胞培養プレートを、室温になるまで平衡状態にした。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ溶液を、製造者の説明書に記載されているように調製し、２５μｌの溶液を各ウェルに加えた。１０分間のインキュベーション後、残った凝集物をピペットにより再懸濁し、４０μｌの混合物を白色平底プレートに移した。発光を、Ｔｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ １０Ｍマルチモードリーダーを用いて測定した。
図２は、ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＭＴ２０４ ２ｘＰＭＡＫＫにより誘導されたＮＫ９２細胞の増殖を、マトリプターゼによる消化後の又は未消化のＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＯＡ、ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＭＴ２０４ １ｘＭＭＰ９／マトリプターゼ及びＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＭＴ２０４非切断型コンストラクトとの比較で示している。増殖は、４日後に測定された。マスクされたＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＭＴ２０４ ２ｘＰＭＡＫＫの増殖は、マトリプターゼによる消化後に誘導された。マトリプターゼによる消化後にＣＤ８－ＩＬ２ｖ １ｘＭＭＰ９／マトリプターゼによって誘導された増殖はなく、このことは、アンマスキング及びその後の活性化のためにｓｃＦｖリンカーのプロテアーゼ放出部位が必要であることを示唆するものであった。
実施例３
マトリプターゼによる消化後のマスクされたＣＤ８－ＩＬ２ｖコンストラクトでの処理によるＰＢＭＣの増殖及び活性化
次に、マスクされたＣＤ８－ＩＬ２ｖコンストラクトを、ＰＢＭＣ上でのそれらの活性について試験し、マスクされていないＣＤ８－ＩＬ２ｖ（ポジティブコントロール）及びマスクされた非切断型ＣＤ８－ＩＬ２ｖ（ネガティブコントロール）と比較した。コンストラクトでの処理の５日後、ＣＤ８Ｔ細胞、ＣＤ４Ｔ細胞及びＮＫ細胞（図３Ａ～Ｃ）の増殖と、ＣＤ８Ｔ細胞、ＮＫ細胞及びＣＤ４Ｔ細胞の活性化のマーカーとしてのＣＤ２５上方制御（図４Ａ～Ｃ）とを、フローサイトメトリーにより測定した。マトリプターゼでの切断後、ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＭＴ２０４ ２ｘＰＭＡＫＫは、ＣＤ８Ｔ細胞及びＮＫ細胞上において、マスクされていないＣＤ８－ＩＬ２ｖに匹敵する増殖及び活性化を誘導した。ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＭＴ２０４ １ｘＭＭＰ９／マトリプターゼは、マトリプターゼによる消化後、ＣＤ４Ｔ細胞、ＣＤ８Ｔ細胞及びＮＫ細胞の増殖及び活性化を誘導しなかった。
健常なドナーから新たに単離したＰＢＭＣを、ＣＦＳＥ（５（６）－カルボキシフルオレセインジアセテートＮ－スクシンイミジルエステル、２１８８８、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で標識した。簡潔には、ＰＢＭＣを、ＰＢＳで１回洗浄した。並行して、ＣＳＦＥストック溶液（ＤＭＳＯ中２ｍＭ）を、ＰＢＳ中で１：２０に希釈した。ＰＢＭＣを、予熱したＰＢＳ中で１Ｍｉｏ／ｍｌに再懸濁し、１ｍｌのＣＦＳＥ溶液を、１ｍｌの細胞懸濁液に加え、細胞を直ちに混合した。最適な標識化のために、細胞を、１５分間３７℃でインキュベートした。次いで、予熱した培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％のＦＣＳ、１％のグルタミン）１０ｍｌを加えて標識反応を停止させた。細胞を４００ｇで１０分間スピンダウンし、新鮮な培地中で１Ｍｉｏ／ｍｌに再懸濁し、さらに３０分間３７℃でインキュベートした。最後に、細胞を、培地で１回洗浄し、新鮮な培地中に再懸濁した。標識したＰＢＭＣ５０μｌを、９６ウェル丸底プレートに播種した（ウェル当たり１００’０００個の細胞）。並行して、４０ｕｇの抗体－サイトカイン融合物を、８μｌのマトリプターゼ（～２．５Ｕ／μｌ，（Ｅｎｚｏからのヒト組み換えマトリプターゼ、ＡＬＸ－２０１－２４６－Ｕ２５０））で消化するか、又は未消化コントロールとして８０μｌのマトリプターゼバッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ、５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ ２０、ｐＨ９．０）中でマトリプターゼなしで２時間３７℃でインキュベートした。示される分子５０μｌをウェル毎に移し、１００μｌの培地をウェルごとに加えて、最終体積２００μｌ／ウェルに到達させた。５日間のインキュベーション後、細胞を、ＦＡＣＳバッファーで１回洗浄し、抗ヒトＣＤ３ ＢＵＶ３５９（５６３５４６、ＢＤ）、抗ヒトＣＤ４ ＰＥ（３００５３９、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、抗ヒトＣＤ８ ＡＰＣ（３４４７２２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗ヒトＣＤ５６ ＢＶ４２１（３１８３２８ 、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）及びＣＤ２５ ＰＥ／Ｃｙ７（３０２６１２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）の混合物３０μｌを用いて、ＦＡＣＳバッファー中で３０分間４℃で染色した。その後、ＰＢＭＣを、ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄した後、ＦＡＣＳバッファー中２％ＰＦＡで固定し、ＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａで蛍光を測定した。ＣＤ８Ｔ細胞、ＣＤ４Ｔ細胞及びＮＫ細胞上において、ＣＤ８Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ８＋）、ＣＤ４Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋）及びＮＫ細胞（ＣＤ３－ＣＤ５６＋）のＣＦＳＥ希釈物を測定することにより増殖を決定し、ＣＤ２５上方制御により活性化を決定した。
図３Ａ～Ｃは、フローサイトメトリーにより決定した、マトリプターゼ消化又は未消化ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＭＴ２０４ ２ｘＰＭＡＫＫ、ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＭＴ２０４ １ｘＭＭＰ９／マトリプターゼ、ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＯＡ又はＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＭＴ２０４非切断型で５日間処理したときの、ＰＢＭＣ内部でのＣＤ４Ｔ細胞、ＣＤ８Ｔ細胞及びＮＫ細胞の増殖を示している。ＣＦＳＥ色素希釈を増殖の指標として使用した。ＣＤ８Ｔ細胞及びＮＫ細胞上において、マトリプターゼ消化後に、ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＭＴ２０４ ２ｘＰＭＡＫＫにより、マスクされていないＣＤ８－ＩＬ２ｖに匹敵する増殖が誘導された。マトリプターゼによる消化後、ＣＤ８－ＩＬ２ｖ １ｘＭＭＰ９／マトリプターゼ及びＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＭＴ２０４非切断型により誘導された増殖はなかった。
図４Ａ～Ｃは、フローサイトメトリーにより決定した、マトリプターゼ消化又は未消化ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＭＴ２０４ ２ｘＰＭＡＫＫ、ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＭＴ２０４ １ｘＭＭＰ９／マトリプターゼ、ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＯＡ又はＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＭＴ２０４非切断型で５日間処理したときの、ＰＢＭＣ内部でのＣＤ４Ｔ細胞、ＣＤ８Ｔ細胞及びＮＫ細胞の活性化を示している。ＮＫ細胞、ＣＤ４Ｔ細胞及びＣＤ８Ｔ細胞上でのＣＤ２５発現を、活性化のマーカーとして使用した。ＣＤ８Ｔ細胞及びＮＫ細胞において、マトリプターゼ消化後に、ＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＭＴ２０４ ２ｘＰＭＡＫＫにより、マスクされていないＣＤ８－ＩＬ２ｖに匹敵する活性化が誘導された。マトリプターゼによる消化後、ＣＤ８－ＩＬ２ｖ １ｘＭＭＰ９／マトリプターゼ及びＣＤ８－ＩＬ２ｖ ＭＴ２０４非切断型により誘導された活性化はなかった。
実施例４
マスクされたコンストラクトのマトリプターゼ消化及び消化されたプローブのＣＥ－ＳＤＳ分析
マスクされたコンストラクトを、ＣＥ－ＳＤＳ分析の前に、マトリプターゼと共に２時間３７°でインキュベートした。タンパク質の純度及び分子量を、製造者の指示に従い、ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸ Ｔｏｕｃｈ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用し、還元剤の存在下及び非存在下において、ＣＥ－ＳＤＳにより分析した。非還元プローブの分子量は記録され、それは表１に示されている。電子ジェルは、図５Ａ～Ｃに示されている。
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実施例４で分析された分子は、マトリプターゼで切断したとき、予想通りに挙動する。マトリプターゼとのインキュベーションは、リンカー配列の特異的な切断をもたらす。非特異的な切断は、マスクを欠くコンストラクトと、非切断型リンカーを有するコンストラクトには観察されなかった（表１、図５Ａ及び５Ｃ）。切断型コンストラクト（２つの切断部位を含む）は２回切断され、その結果、ｓｃＦｖマスクの２つの半分体が、１７ｋＤａで検出され、ＣＥ－ＳＤＳ上で重複する（表１、図５Ｂ）。最終的に、マトリプターゼは、試験されたコンストラクトを、非特異的に切断せず、両予測切断部位においてのみ切断する特異的酵素である。
実施例５Ａ
ｓｃＦｖマスクを有するマスクされたＰＤ１標的化ＩＬ２ｖイムノコンジュゲート及びコントロールコンストラクトの生成
ワンアーム型及び二価のヒトＰＤ１標的化ＩＬ２ｖイムノコンジュゲートを生成した。それらは、Ｆｃホール鎖（ワンアーム型ヒトＰＤ１標的化コンストラクト）上又はＦｃホール及びＦｃノブ鎖（二価のヒトＰＤ１標的化コンストラクト）上の１つ以上のＮ末端Ｆａｂ断片を介してヒトＰＤ１に一価的に又は二価的に結合し、Ｆｃノブ鎖は、マスクされた（マトリプターゼ切断型又はマトリプターゼ非切断型）又はマスクされていないＮ末端若しくはＣ末端ＩＬ２ｖをさらに担持する。Ｃ末端でマスクされたＩＬ２ｖコンストラクトは、同じＦｃノブ鎖上にＩＬ２ｖ及びマスク「インライン」を担持するか、又は代替的に、Ｆｃノブ鎖上にＩＬ２ｖを、Ｆｃホール鎖上にマスクを担持する。ヘテロ二量体化は、ノブ・イントゥー・ホール技術の適用によって達成され、活性化ヒトＦｃγ受容体と補体構成成分Ｃ１ｑへの結合は、抗体のＦｃ部分におけるＰＧ ＬＡＬＡ変異の導入により無効化された。マトリプターゼ切断型Ｎ末端及びＣ末端でマスクされたＩＬ２ｖコンストラクトは、２つのＰＱＡＲＫマトリプターゼ認識部位を担持しており、１つのＰＱＡＲＫマトリプターゼ認識部位は、リンカー中で、ｓｃＦｖマスクのＶＨドメインとＶＬドメインとの間に位置し、もう１つは、リンカー中で、「インライン」コンストラクト中のｓｃＦｖマスクとＩＬ２ｖとの間に位置するか、又は２つの別個の重鎖上にＩＬ２ｖ及びマスクを有するコンストラクト中で、Ｆｃホール鎖のＣ末端とｓｃＦｖマスクとの間に位置する。加えて、それぞれのマトリプターゼ非切断型コントロールコンストラクト（ＰＱＡＲＫマトリプターゼ認識部位なし）及びマスクされていないコントロールコンストラクト（ｓｃＦｖマスクなし）が生成された。これらコンストラクトは、図６Ａ～Ｇに模式的に示されている。
腫瘍を有さないマウス又はがんのマウスモデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏでの忍容性及び有効性の研究を促進するために、マスクされたＰＤ１標的化ＩＬ２ｖイムノコンジュゲートのマウス代用物が生成された。免疫原性を低下させるために、これらコンストラクトのすべての定常抗体ドメインは、マウスの配列に対応する。マウス代用物は、ヒト化マウス若しくはヒトＰＤ１トランスジェニックマウスにおける使用のためのヒトＰＤ１（図７Ａ～Ｆ及び図１０Ａ～Ｅ）又は免疫適格性マウスとの同系マウスモデルにおける使用のためのヒトＰＤ１（図８Ａ～Ｈ）に標的化される。マウスＩＬ２受容体に対するヒトＩＬ２ｖの交差反応性とマウスＩＬ２ｖに対するｓｃＦｖマスクの交差反応性の欠如とにより、ヒトＩＬ２ｖを、１つのコントロールコンストラクト以外のすべてに使用した（図１０Ｄ）。
マウス代用物は、ワンアーム型及び二価のヒト又はマウスＰＤ１標的化ＩＬ２ｖイムノコンジュゲートとして生成した。それらは、Ｆｃ ＫＫ＋鎖（ワンアーム型ヒト又はマウスＰＤ１標的化コンストラクト）上又はＦｃ ＤＤ－及びＦｃ ＫＫ＋鎖（二価のヒト又はマウスＰＤ１標的化コンストラクト）上の１つ以上のＮ末端Ｆａｂ断片を介してヒト又はマウスＰＤ１に一価的に又は二価的に結合し、Ｆｃ ＤＤ－鎖はさらに、マスクされた（マトリプターゼ切断型又は非マトリプターゼ切断型）又はマスクされていないＮ末端又はＣ末端ＩＬ２ｖを担持する。Ｃ末端でマスクされたＩＬ２ｖコンストラクトは、ＩＬ２ｖとマスクとを「インライン」で同じＦｃ ＤＤ－鎖上に担持するか、又は代替的に、ＩＬ２ｖをＦｃ ＫＫ＋鎖上に、マスクをＦｃ ＤＤ－鎖上に担持する。ヘテロ二量体化は、電荷相補性の適用により達成され、活性化マウスＦｃγ受容体への結合は、抗体のＦｃ部分におけるＤＡ ＰＧ変異の導入により無効化された。マトリプターゼ切断型Ｎ末端及びＣ末端でマスクされたＩＬ２ｖコンストラクトは、２つのＰＱＡＲＫ又は２つのＰＭＡＫＫ又は２つのＹＡＡＲＫＧＧＩマトリプターゼ認識部位を担持し、１つのＰＱＡＲＫ又はＰＭＡＫＫ又はＹＡＡＲＫＧＧＩマトリプターゼ認識部位は、リンカー中で、ｓｃＦｖマスクのＶＨドメインとＶＬドメインとの間に位置し、もう１つは、リンカー中で、「インライン」コンストラクト中のｓｃＦｖマスクとＩＬ２ｖとの間に又は２つの別個の重鎖上にＩＬ２ｖとマスクとを有するコンストラクト中で、Ｆｃホール鎖のＣ末端とｓｃＦｖマスクとの間に位置する。加えて、それぞれのマトリプターゼ非切断型コントロールコンストラクト（ＰＱＡＲＫ又はＹＡＡＲＫＧＧＩマトリプターゼ認識部位なし）及びマスクされていないコントロールコンストラクト（ｓｃＦｖマスクなし）が生成された。これらコンストラクトは、図７Ａ～Ｆ、図８Ａ～Ｈ、及び図１０Ａ～Ｅに模式的に示されている。
実施例５Ｂ
マスクされたＰＤ１標的化ＩＬ２ｖイムノコンジュゲート及びコントロールコンストラクトの生成及び精製
ヒト並びにマウス代用物のマスクされたＰＤ１標的化ＩＬ２ｖイムノコンジュゲートとそれぞれのコントロールとが、ＷｕＸｉ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓにより生成及び精製された。それらはＨＥＫ２９３に一活性発現され、２又は３カラムプロセスにおいて精製された：１．洗浄のために加えた０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０での、ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ ＬＸアフィニティークロマトグラフィー（平衡化及び１回目の洗浄：５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４；２回目の洗浄：５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ １００／１１４；溶出：１００ｍＭのＡｒｇ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ３．４；ストリッピング：５０ｍＭのＮａＡｃ－ＨＡｃ、ｐＨ３．０；中和：１ＭのＡｒｇ、ｐＨ９．１）及び必要であれば溶出工程；２．必要であれば、ＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＨＰ陽イオン交換クロマトグラフィー（平衡化及び１回目の洗浄：５０ｍＭのＮａＡｃ－ＨＡｃ、ｐＨ５．５；溶出：５０ｍＭのＮａＡｃ－ＨＡｃ、２ＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．５）、並びに３．Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００サイズ排除クロマトグラフィー（平衡化及び製剤バッファー：２０ｍＭのヒスチジン－ＨＣｌ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０）。純度を、ＳＥＣ－ＨＰＬＣと、還元及び非還元ノギス－ＳＤＳとにより決定した。精製バッチを、低エンドトキシンレベルについて試験し、脱グリコシル化質量の同定を、液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）により確認した。
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実施例６Ａ
Ｔ細胞に対するＴＡ ＰＤ１－ＩＬ２ｖコンストラクトの結合
ＴＡ ＰＤ１－ＩＬ２ｖ分子の３つのフォーマットとそれぞれのコントロールを、ＰＢＭＣ内部での活性化ＰＤ１陽性ＣＤ８Ｔ細胞及びＣＤ４Ｔ細胞に対するそれらの結合能について、それぞれのマスクされていない分子との比較で評価した。
ＰＢＭＣは、健常なドナーに由来するＢｉｏｍｅｘから購入した（Ｌｏｔ ５０００７２９ＰＢ）。ＰＢＭＣをＣＤ３及びＣＤ２８で３日間刺激し、Ｔ細胞上でＰＤ１の上方制御を誘導した。したがって、ＰＢＭＣを、培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％のＦＣＳ、２ｍＭのルタミン）中で、１μｇ／ｍｌのＣＤ３（クローンＯＫＴ３、３０２９１４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で１時間３７℃で被覆した細胞培養物のフラスコ中に播種した。ＣＤ２８を、溶液中でＰＢＭＣに濃度１μｇ／ｍｌで加えた（クローンＣＤ２８．２、３０２９１４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）。３日後、ＰＢＭＣを回収し、９６ウェル丸底プレートに移した（ウェル当たり２００’０００個の細胞）。細胞を、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、２％のＦＢＳ、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２５％のＮａＮ３）で洗浄し、ＦＡＣＳバッファー中３０μｌの対応するＴＡ ＰＤ１－ＩＬ２ｖコンストラクトで３０分間４℃で染色した。染色に先立ち、２０μｇのＴＡ ＰＤ１－ＩＬ２ｖコンストラクトを、４０μｌのマトリプターゼバッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ、５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ ２０、ｐＨ９．０）中において、４μｌのマトリプターゼ（Ｅｎｚｏ ～２．５Ｕ／μｌ、ＡＬＸ－２０１－２４６－Ｕ２５、Ｌｏｔ １２１５２０１５、又はマスクされていないコントロールの場合マトリプターゼなし）で２時間３７℃で消化した。染色後、細胞を、ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、未結合の分子を除去した。次いで３０μｌの希釈したＰＥ抗ヒトＦｃ特異的二次抗体（１：５０希釈、１０９－１１６－１７０、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を細胞に加えた。４℃で３０分のインキュベーション後、細胞を、ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄した。Ｔ細胞を検出するために、ＰＢＭＣを、ＣＤ３ ＰＥ／Ｃｙａｎｉｎｅ７（クローンＵＣＨＴ１、３００４２０、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ４ ＦＩＴＣ（クローンＲＰＡ－Ｔ４、３００５２８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）及びＣＤ８ ＡＰＣ／Ｃｙａｎｉｎｅ７（クローンＨＩＴ８ａ、３００９２６、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）の混合物３０μｌで、３０分間４℃で染色した。未結合の抗体を、ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄することによって除去した。最後に、細胞を、１５０μｌのＦＡＣＳバッファー中に再懸濁し、ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞（ＣＤ４Ｔ細胞）及びＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞（ＣＤ８Ｔ細胞）にＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａゲーティングを使用して測定した。
試験したＴＡ ＰＤ１－ＩＬ２ｖコンストラクトは、それぞれのマスクされていない分子と比較して、活性化ＣＤ４及び活性化ＣＤ８Ｔ細胞上でＰＤ１に対して同様によく結合した。ＰＤ１結合Ｆａｂを１つだけ含有するＮ末端コンストラクトは、２つのＰＤ１結合Ｆａｂを含有する「インライン」及びノブ／ホールフォーマットと比較して、概ね２倍高い結合能を示す（図１１Ａ及び１１Ｂ）。
実施例６Ｂ
ＴＡ ＰＤ１－ＩＬ２ｖコンストラクトによって誘導されたＮＫ９２増殖
異なるフォーマットのＴＡ ＰＤ１－ＩＬ２ｖ、Ｎ末端，「インライン」及びノブ／ホールによるＮＫ９２細胞の増殖の誘導を試験した。コントロールとして、２つのそれぞれのマスクされていないコントロール分子と、Ｎ末端及びインラインフォーマットの非切断型コントロールとを含めた。すべての分子は、未消化で、及び組み換えマトリプターゼで消化して、試験した。
ＮＫ９２細胞を回収し、係数し、生存率について評価した。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、残留するＩＬ２を除去した。洗浄したＮＫ９２細胞を、ＩＬ２を含まない新鮮な培地（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ１６４０、２％のＦＣＳ、１％のグルタミン）中で、１ｍｌ当たり１６０’０００細胞に再懸濁し、１２．５μｌの細胞懸濁液を、３８４ウェル細胞培養物処理平底プレートに映した。１０μｇのＴＡ ＰＤ１－ＩＬ２ｖコンストラクトを、２０μｌのマトリプターゼバッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ、５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ ２０、ｐＨ９．０）中において、２μｌのマトリプターゼ（Ｅｎｚｏ ～２．５Ｕ／μｌ、ＡＬＸ－２０１－２４６－Ｕ２５、Ｌｏｔ １２１５２０１５又は未消化コントロールとしてマトリプターゼなしで）で、２時間３７℃で消化し、ウェル当たり１２．５μｌの抗体を加え、ウェル当たり２５μｌの最終体積に到達させた。プレートは、インキュベーター内で３日間インキュベートした。３日後、細胞Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｇ７５７１、Ｐｒｏｍｅｇａ）試薬及び細胞培養プレートを、室温になるまで平衡状態にした。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ溶液を、製造者の説明書に記載されているように調製し、２５μｌの溶液を各ウェルに加えた。１０分間のインキュベーション後、残った凝集物をピペットにより再懸濁し、４０μｌの混合物を白色平底プレートに映した。発光を、Ｔｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ １０Ｍマルチモードリーダーを用いて測定した。
未消化のＴＡ ＰＤ１－ＩＬ２ｖ「インライン」及びＮ末端フォーマットは、増殖を誘導しない。ノブ／ホールフォーマットは活性のままであるが、活性は、マスクされていないコントロール分子と比較して低下する。組み換えマトリプターゼで消化すると、「インライン」及びノブ／ホールフォーマットは完全な活性を取り戻し、Ｎ末端フォーマットの活性は、マスクされていないコントロールと比較してやや低下する。非切断型分子は、完全に不活性のままである（図１２Ａ及び１２Ｂ）。
実施例６Ｃ
ＴＡ ＰＤ１－ＩＬ２ｖコンストラクトにより誘導されたＳＴＡＴ５リン酸化
マトリプターゼ消化ＴＡ ＰＤ１－ＩＬ２ｖコンストラクトで処理したときの、活性化ＰＤ１陽性ＣＤ４Ｔ細胞におけるＳＴＡＴ５リン酸化の誘導を試験した。
ＰＢＭＣは、健常なドナーに由来するＢｉｏｍｅｘから購入した（Ｌｏｔ ５０００７２９ＰＢ）。ＣＤ４陽性Ｔ細胞を、製造者の説明書に記載されるようにして、ヒトＣＤ４ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（１３０－０４５－１０１、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して単離した。ＣＤ４陽性Ｔ細胞をＣＤ３及びＣＤ２８で４日間刺激し、ＰＤ１の上方制御を誘導した。したがって、ＣＤ４陽性Ｔ細胞を、培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％のＦＣＳ、２ｍＭのグルタミン）中で、１μｇ／ｍｌのＣＤ３（クローンＯＫＴ３、３０２９１４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で１時間３７℃で被覆した細胞培養物のフラスコ中に播種した。ＣＤ２８を溶液中でＣＤ４陽性Ｔ細胞に濃度１μｇ／ｍｌで加えた（クローンＣＤ２８．２、３０２９１４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）。ＳＴＡＴ５リン酸化アッセイ設定の１日前に、ＴＡ ＰＤ１－ＩＬ２ｖコンストラクトを、マトリプターゼ（Ｅｎｚｏ ～２．５Ｕ／μｌ、ＡＬＸ－２０１－２４６－Ｕ２５、Ｌｏｔ １２１５２０１５、又はマスクされていないコントロールについてはマトリプターゼなしで）で消化した。したがって、１５μｇのＴＡ ＰＤ１－ＩＬ２ｖコンストラクトを、３０μｌのマトリプターゼバッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ、５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ ２０、ｐＨ９．０）中において、３μｌのマトリプターゼで２時間３７℃で消化した。消化したコンストラクトを、培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％のＦＣＳ、１％のグルタミン）中で３７℃で一晩インキュベートした。活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞の半分を、ＣＦＳＥ（５（６）－カルボキシフルオレセインジアセテートＮ－スクシンイミジルエステル、２１８８８、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で標識した。したがって、３０００万個のＴ細胞を、ＰＢＳで１回洗浄した。並行して、ＣＦＳＥストック溶液（ＤＭＳＯ中２ｍＭ）を、予熱したＰＢＳ中で１：２０に希釈した。Ｔ細胞を、３０ｍｌの予熱したＰＢＳに再懸濁し、３０μｌのＣＦＳＥ溶液を加え、細胞を直ちに混合した。最適な標識化のために、細胞を、１５分間３７℃でインキュベートした。次いで、予熱した培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％のＦＣＳ、１％のグルタミン）１０ｍｌを加えて標識反応を停止させた。細胞を、４００ｇで１０分間スピンダウンし、２０ｍｌの新鮮な培地に再懸濁し、３７℃でさらに３０分間インキュベートした。最後に、細胞を培地で１回洗浄し、１ｍｌ当たり細胞４００万個の新鮮な培地に再懸濁した。活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞のもう半分を、ＰＤ１ ＩｇＧ（社内生成、ヒトＰＤ１ ０３７６バインダー、Ｐ１ＡＤ４４７６）で染色し、ＰＤ１受容体をブロックした。したがって、Ｔ細胞を、培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％のＦＣＳ、２ｍＭのグルタミン）で洗浄し、３０μｌの培地中１０μｇ／ｍｌのＰＤ１－ＩｇＧで３０分間室温でインキュベートした。細胞を培地で１回洗浄し、１ｍｌ当たり細胞４００万個の新鮮な培地に再懸濁した。等量（各細胞１００’０００個）のＰＤ１ブロック細胞及びＰＤ１陽性細胞を、９６ウェル丸底プレートに播種した。プレートを、３００ｇで１０分間遠心分離処理し、上清を除去した。細胞を、ＴＡ ＰＤ１－ＩＬ２ｖ分子を含有する１００μｌの培地に再懸濁し、２０分間３７℃で刺激した。リン酸化状態を保存するために、等量の予熱したＣｙｔｏｆｉｘバッファー（５５４６５５、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で１０分間３７℃で刺激した後、細胞を直ちに固定した。その後、プレートを、３００ｇで１０分間遠心分離し、上清を除去した。細胞内染色を可能にするために、細胞を、２００μｌのＰｈｏｓｆｌｏｗ ＰｅｒｍバッファーＩＩＩ（５５８０５０、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）中で３０分間４℃で透過処理した。次いで細胞を、１５０μｌの冷たいＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、ＣＤ４ ＰＥ／Ｃｙａｎｉｎｅ７（クローンＳＫ３、５５７８５２、ＢＤ）とｓｔａｔ５ ＡＦ６４７（クローンｐＹ６９４、６１２５９９、ＢＤ）との混合物３０μｌで３０分間４℃で染色した。未結合の抗体を、ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄することにより除去し、次いでウェル当たり１５０μｌのＦＡＣＳバッファーに再懸濁した。分析は、ＰＤ１陽性ＣＤ４Ｔ細胞（ＣＦＳＥ陽性）及びＰＤ１ブロック（ＣＦＳＥ陰性）細胞において、ＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターゲーティングを使用して実施した。
ブロックしたＰＤ１を有するＣＤ４Ｔ細胞では、マスクされた消化コンストラクトによる活性化はなく、マスクされていないコンストラクトによる活性化は最小にすぎない（図１３Ａ）。ＰＤ１陽性ＣＤ４Ｔ細胞では、試験したすべてのコンストラクトは、ＳＴＡＴ５のリン酸化を誘導し、マスクされていないコンストラクトが最大の活性を有し、続く他の３つは同様の活性を示す（図１３Ｂ）。
実施例６Ｄ
Ｔ細胞に対するマウスＴＡ ＰＤ１－ＩＬ２ｖコンストラクトの結合
活性化Ｔ細胞に対するマウスＴＡ ＰＤ１－ＩＬ２ｖ、ＭＴ２０４、２ｘＰＱＡＲＫ「インライン」コンストラクト、非切断型コントロール及びマスクされていないコントロールの結合を試験し、それぞれのヒトコンストラクトと比較した（図１４）。
ＰＢＭＣは、健常なドナーに由来するＢｉｏｍｅｘから購入した（Ｌｏｔ ５０００８９９ＰＢ）。ＰＢＭＣをＣＤ３及びＣＤ２８で３日間刺激し、Ｔ細胞上でＰＤ１の上方制御を誘導した。したがって、ＰＢＭＣを、培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％のＦＣＳ、２ｍＭのグルタミン）中で、１μｇ／ｍｌのＣＤ３（クローンＯＫＴ３、３０２９１４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で１時間３７℃で被覆した細胞培養物のフラスコ中に播種した。ＣＤ２８を溶液中でＰＢＭＣに濃度１μｇ／ｍｌで加えた（クローンＣＤ２８．２、３０２９１４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）。３日後、ＰＢＭＣを回収し、９６ウェル丸底プレートに移した（２００’０００細胞ウェル当たり）。細胞を、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、２％のＦＢＳ、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２５％のＮａＮ３）で洗浄し、ＦＡＣＳバッファー中３０μｌの対応するＴＡ ＰＤ１－ＩＬ２ｖコンストラクトで３０分間４℃で染色した。その後、細胞をＦＡＣＳバッファーで２回洗浄して、非結合色素を除去した。次いで３０μｌの希釈したＦＩＴＣ抗マウスＦｃ特異的二次抗体（１：５０希釈、１１５－０９６－０７１、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）又はヒトコンストラクトについては希釈したＦＩＴＣ抗ヒトＦｃ特異的二次抗体（１：５０希釈、１１５－０９６－０９８、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を、細胞に加えた。４℃で３０分のインキュベーション後、細胞を、ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄した。Ｔ細胞を検出するために、ＰＢＭＣを、ＣＤ３ ＰＥ／Ｃｙａｎｉｎｅ７（クローンＵＣＨＴ１、３００４２０、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ４ ＰＥ（クローンＲＰＡ－Ｔ４、３００５０８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）及びＣＤ８ ＡＰＣ（クローンＳＫ１、３４４７２２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）の混合物３０μｌで３０分間４℃で染色した。未結合の抗体を、ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄することによって除去した。最後に、細胞を、１５０μｌのＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞（ＣＤ４Ｔ細胞）及びＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞（ＣＤ８Ｔ細胞）に対するＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａゲーティングを使用して測定した。
マウスコンストラクトは、活性化ＰＤ１陽性ＣＤ４（図１４Ａ）及びＣＤ８Ｔ細胞（図１４Ｂ）に対して、ヒトコンストラクトと比較して同等によく結合する。
実施例６Ｅ
マウスＴＡ ＰＤ１－ＩＬ２ｖコンストラクトによって誘導されたＮＫ９２増殖
一組のマウスＴＡ ＰＤ１－ＩＬ２ｖコンストラクトを、ＮＫ９２細胞の増殖を誘導する能力について分析した。この分析には、マトリプターゼ消化コンストラクトと未消化コンストラクトとの比較が含まれた。
ＮＫ９２細胞を回収し、係数し、生存率について評価した。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、残留するＩＬ２を除去した。洗浄したＮＫ９２細胞を、ＩＬ２を含まない新鮮な培地（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ１６４０、２％のＦＣＳ、１％のグルタミン）中で、１ｍｌ当たり１６０’０００細胞に再懸濁し、１２．５μｌの細胞懸濁液を、３８４ウェル細胞培養物処理平底プレートに映した。１０μｇのＴＡ ＰＤ１－ＩＬ２ｖコンストラクトを、２μｌのマトリプターゼ（Ｅｎｚｏ ～２．５Ｕ／μｌ、ＡＬＸ－２０１－２４６－Ｕ２５、Ｌｏｔ １２１５２０１５又は未消化コントロールとしてマトリプターゼなしで）で、２時間３７℃で、２０μｌのマトリプターゼバッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ、５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ ２０、ｐＨ９．０）中において消化し、ウェル当たり１２．５μｌの抗体を加え、ウェル当たり．２５μｌの最終体積に到達させた。プレートは、インキュベーター内で３日間インキュベートした。３日後、細胞Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｇ７５７１、Ｐｒｏｍｅｇａ）試薬及び細胞培養プレートを、室温になるまで平衡状態にした。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ溶液を、製造者の説明書に記載されているように調製し、２５μｌの溶液を各ウェルに加えた。１０分間のインキュベーション後、残った凝集物をピペットにより再懸濁し、４０μｌの混合物を白色平底プレートに映した。発光を、Ｔｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ １０Ｍマルチモードリーダーを用いて測定した。
２ｘＰＭＡＫＫ、２ｘＹＡＡＲＫＧＧＩ又は２ｘＰＱＡＲＫを含むマウスＴＡ ＰＤ１－ＩＬ２ｖ、ＭＴ２０４Ｎ末端コンストラクト、並びに非切断型は、活性を示さなかった。マトリプターゼによる消化後、切断部位を含む３つすべてのコンストラクトは活性を取り戻すが、非切断型コンストラクトは不活性のままである（図５Ａ及び５Ｂ）。２ｘＰＱＡＲＫコンストラクトを含む消化されたマウスコンストラクトの活性は、それぞれの消化ヒトコンストラクトに匹敵する（図５Ｃ）。加えて、マトリプターゼで消化したマウスＴＡ ＰＤ１－ＩＬ２ｖ、ＭＴ２０４、２ｘＰＱＡＲＫ、インラインコンストラクトが試験され、それぞれの消化後のヒトコンストラクト及びマスクされていないコンストラクトに匹敵する活性を示した。非切断型コントロール分子は、ＮＫ９２細胞上で活性を有さない（図５Ｄ）。
Figure 2024512709000065
Figure 2024512709000066
実施例７
マウス腫瘍細胞株の同系モデル（ＫＰＣ－４６６２皮下同系モデル）における、マウス化ＴＡ－ＰＤ１－ＩＬ２ｖイムノコンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏでの有効性
マウス化ＴＡ－ＰＤ１－ＩＬ２ｖイムノコンジュゲートを、Ｂｌａｃｋ ６－ｈｕＰＤ１トランスジェニックマウスに皮下注射したマウス膵臓細胞株ＫＰＣ－４６６２において試験した。
ＫＰＣ－４６６２膵臓癌細胞の入手元はＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，ＵＳＡ）であり、増殖後Ｒｏｃｈｅ－Ｇｌｙｃａｒｔの社内細胞バンクに寄託された。腫瘍細胞株は、１０％のＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）及びＧ４１８（Ｇｅｎｉｔｉｃｉｎ；Ｇｉｂｃｏ）を含有するＤＭＥＭ中において、５％のＣＯ２の水飽和雰囲気中で３７℃で常套的に培養された。継代８を、９３．８％の生存率で、移植に使用した。動物１匹当たり３ｘ１０５個の細胞を、１ｍｌのツベルクリン注射器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、１００μｌのＲＰＭＩ細胞培養培地（Ｇｉｂｃｏ）中でマウスの脇腹に皮下注射した。
実験開始時に週齢１０～１１であったメスＢｌａｃｋ ６－ｈｕＰＤ１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒｓ，Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅにおいて飼育）を、採用したガイドライン（ＧＶ－Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従って、１２時間明所／１２時間暗所の日周期の、特定の病原体がない条件下で維持した。この実験研究プロトコールは、地方政府に審査され、承認された（Ｐ １８１／２０２０）。到着後、動物は、新しい環境に慣れさせ、観察するために、１週間維持された。継続的な健康モニタリングが定期的に行われた。
研究０日目にマウスに３ｘ１０５ 個のＫＰＣ－４６６２細胞を皮下注射し、無作為化し、秤量した。腫瘍細胞の注射（腫瘍体積＞２００ｍｍ３）の２週間後、マウスにＴＡ－ＰＤ１－ＩＬ－２ｖ ＰＭＡＫＫ切断型リンカー、ＴＡ－ＰＤ１－ＩＬ－２ｖ ＹＡＡＲＫＧＧＩ切断型リンカー、ＴＡ－ＰＤ１－ＩＬ－２ｖ非切断型リンカー、ＴＡ－ＰＤ１－ＩＬ－２ｖマスクなし又はＰＤ１－ＩＬ－２ｖを、１週間に１回２週にわたってｉ．ｖ．注射した。すべてのマウスに、２００μｌの適切な溶液をｉ．ｖ．注射した。ビヒクル群のマウスには、ヒスチジンバッファーを注射した。２００μｌ当たりの適切な量のイムノコンジュゲートを得るために、必要に応じてストック溶液をヒスチジンバッファーで希釈した。
図１６は、ＴＡ－ＰＤ－ＩＬ２ｖ ＹＡＲＲＫＧＧＩが、腫瘍増殖阻害の観点から、ビヒクル、非切断型及びマスクなしＭａｂ単剤群と比較して、優れた有効性を媒介したことを示している。ＴＡ－ＰＤ－ＩＬ２ｖ ＹＡＲＲＫＧＧＩ切断型リンカーは、ＰＤ１－ＩＬ２ｖグループと同様の腫瘍増殖阻害を示した。
Figure 2024512709000067
実施例８
実施例８．１－マウスインターフェロン－γ（ＩＮＦＧ）コンストラクトの生成
ｅｖｉｔｒｉａでのクローニング及び生成
遺伝子合成、クローニング、トランスフェクション及び回収は、ｅｖｉｔｒｉａ ＡＧ（Ｓｃｈｌｉｅｒｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に外注した。対応するｃＤＮＡを、従来の（非ＰＣＲ系）クローニング技術を使用してｅｖｉｔｒｉａのベクター系にクローニングした。ｅｖｉｔｒｉａのベクタープラスミドを遺伝子合成した。プラスミドＤＮＡを、陰イオン交換クロマトグラフィーに基づく低エンドトキシン条件下で調製した。ＤＮＡ濃度は、波長２６０ｎｍでの吸収を測定することによって決定した。配列の正確性は、サンガー配列決定（プラスミド１つ当たり２つの配列決定反応による）により検証した。懸濁液適合ＣＨＯ Ｋ１細胞（入手元であるＡＴＣＣから受け取ったものを、ｅｖｉｔｒｉａにおいて懸濁培養での無血清増殖に適合させた）を生成に使用した。種子を、既知組成の、動物成分を含まない無血清培地であるｅｖｉＧｒｏｗ培地中で成長させた。細胞を、ｅｖｉＦｅｃｔ（ｅｖｉｔｒｉａの特注の独自のトランスフェクション試薬）でトランスフェクトし、トランスフェクション後、動物成分を含まない無血清培地であるｅｖｉＭａｋｅ２で増殖させた。遠心分離及びその後の濾過（０．２μｍフィルター）により、上清を回収した。回収の直後、Ｒｏｃｈｅ ｃＯｍｐｌｅｔｅＴＭプロテアーゼ 阻害剤カクテルを濃度０．５ｘで加えた。
タンパク質精製
標準的なプロトコールを参照して、濾過した細胞培養上清から化合物を精製した。簡潔には、Ｆｃ含有タンパク質を細胞培養上清からプロテインＡ－アフィニティークロマトグラフィーにより精製した（平衡バッファー：２０ｍＭのクエン酸ナトリウム，２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５；溶出バッファー：２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０）。溶出はｐＨ３．０で達成され、続いて直ちに試料のｐＨが中和された。タンパク質を遠心分離（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）ＵＬＴＲＡ－１５（Ａｒｔ．Ｎｒ．：ＵＦＣ９０３０９６））により濃縮し、凝集タンパク質を、２０ｍＭのヒスチジン、１４０ｍＭの塩化ナトリウム（ｐＨ６．０）中でのサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって単量体タンパク質から分離した。単量体化合物の画分を、プールし、例えば、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（３０ ＭＷＣＯ）遠心濃縮機を使用して濃縮し（必要に応じて）、凍結し、－８０℃で貯蔵した。試料の一部は、例えばＣＥ－ＳＤＳ、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥ－ＨＰＬＣ）及び質量分析（ＬＣ－ＭＳ）によるその後のタンパク質分析及び分析的特徴づけのために提供された。
ＩｇＧ様タンパク質の組成物の分析
Ｐａｃｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５，４，２４１１１４２３によるアミノ酸配列に基づいて計算した質量減衰係数を使用して、２８０ｎｍにおける吸収を測定することにより、精製したタンパク質の濃度を決定した。タンパク質の純度及び分子量を、製造者のプロトコールに従い、ｒａｐｉｄＰＮＧａｓｅ Ｆでの事前処理あり又はなしで、ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ又はＬａｂＣｈｉｐ ＧＸ Ｔｏｕｃｈ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用し、還元剤の存在下及び非存在下で、ＣＥ－ＳＤＳにより分析した。凝集物含有量の決定を、ランニングバッファー（２００ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭのＫＣｌ（ｐＨ６．２）、０．０２％のＮａＮ３）中で平衡化した分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬカラム又はＵＰ－ＳＷ３０００カラム）を使用して、２５℃でＨＰＬＣクロマトグラフィーにより実施した。
ＥＳＩ－ＭＳによる質量決定
インタクト質量の決定のために、ｒａｐｉｄＰＮＧａｓｅ Ｆ酵素キット（Ｒａｐｉｄ ＰＮＧａｓｅＦ非還元、ＮＥＢ ＃Ｐ０７１１Ｓ、Ｌｏｔ．１００８５４７２、１０／２１）に含まれる「非還元」バッファーで試料当たり２５μｇ（１２．５μｇ）を１：４（ｖ／ｖ）に希釈し、２分間８０℃で変性させた。その後、０．３μＬのｒａｐｉｄＰＮＧａｓｅ Ｆ（「非還元」）を加え、化合物を１０分間５０℃で脱グリコシル化した。その後、試料を、再蒸留水で最終体積６２．５μＬ（３１．２５μＬ）に希釈した。還元鎖の質量の決定のために、試料当たり２５μｇ（１２．５μｇ）を、ｒａｐｉｄＰＮＧａｓｅ Ｆ酵素キット（Ｒａｐｉｄ ＰＮＧａｓｅＦ還元、ＮＥＢ ＃Ｐ０７１０Ｓ、Ｌｏｔ．１００７９１６３ ０７／２１）に含まれる１／４（ｖ／ｖ）「還元」バッファー で希釈し、２分間８０℃で変性させた。その後、０．３μＬのｒａｐｉｄＰＮＧａｓｅ Ｆ（「還元」）を加え、化合物を１０分間５０℃で脱グリコシル化した。その後、試料を、再蒸留水で最終体積６２．５μＬ（３１．２５μＬ）に希釈した。試料を、Ｃ４カラム（Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ３００Ｃ４、１ｍｍ ５０ｍｍ、１．７μｍ Ｃｈａｒｇｅ １３３３８０４６１；１５０μＬ／分、７５℃、カラム上１．６μｇ）で逆相クロマトグラフィーにより脱塩し、質量スペクトルを、ＱＴＯＦ型質量分析計（ＭＡＸＩＳ、Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）を使用して記録した。質量分析計は、各試料の配列前に較正し、ロックマス補正を適用して高い質量精度を得た。データ分析は、クロマトグラフピークの質量スペクトルを合計し、ＭａｘＥｎｔによりそれらをデコンボリューションすることにより実施された。同一性及び完全性は、実験上の質量と理論上の質量とを比較することにより検査される。
マスク解除フォーマットでのマウス代用物分子の生成及び精製
マスクされたフォーマットを作るために、マウスＩＦＮＧを、３０のアミノ酸リンカー（リンカー１）を介してマウスＩｇＧ１重鎖のＣ末端に融合した。ＩｇＧ１は、ＦＡＰバインダー（２８Ｈ１、国際公開第２０１２／０２０００６号）と、ＤＡＰＧ変異を含有するＦｃとを含んでいた。マウスＩＦＮＧに特異的なｓｃＦｖに基づくマスクを、マウスＩＦＮＧのＣ末端に、ＰＱＡＲＫ配列を含む３０のアミノ酸リンカー（リンカー２）を介して融合した。化合物は、一過性のＣＨＯ発現系を使用してｅｖｉｔｒｉａに発現された。化合物を、ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ ＨＰを介して捕捉し、ｐＨ３．０までのｐＨグラジエントで溶出した。画分を中和し、組成物についてＣＥ－ＳＤＳにより、及びＨＭＷ含有量についてＳＥ－ＨＰＬＣにより、分析した。最大の単量体含有量を有する画分をプールし、分取ＳＥＣによりさらに精製した。最大の単量体含有量を有する画分は、最終バッチとしてプールされた。最終バッチの組成物分析によって、ＳＥ－ＨＰＬＣ及びＣＥ－ＳＤＳにより＞９５％の単量体含有量が、及びＳＥ－ＨＰＬＣにより＜５％のＨＭＷ含有量が、判明した。ＬＣ－ＭＳによる分析により、配列同一性及び試料純度が確認された。
Figure 2024512709000068
Figure 2024512709000069
Figure 2024512709000070
実施例８．２－マウスインターフェロン－γコンストラクトを用いた活性アッセイ
マトリプターゼによる消化後にマスクされたＦＡＰ－ＩＦＮｇコンストラクトで処理したときのＭＨＣ１及びＰＤＬ１誘導に基づくインターフェロン応答
１つのＰＱＡＲＫリンカーを含むＸＭＧ１．２ ｓｃＦｖマスクＦＡＰ－ＩＦＮｇコンストラクトでの２日間の処理に応答したマウスＭＣ３８－ｈｕＣＥＡ腫瘍細胞株上でのＭＨＣ－Ｉ及びＰＤＬ１の誘導を評価し、マスクされていないＦＡＰ－ＩＦＮｇの活性と比較した。
コンストラクトは、処理に先立ち、組み換えマトリプターゼで２時間３７℃でインキュベートした。ＦＡＰ－ＩＦＮｇ ＸＭＧ１．２ ｓｃＦｖマスクＰＱＡＲＫコンストラクトは、ＰＱＡＲＫリンカーをマトリプターゼで消化したとき、腫瘍細胞株にＭＨＣ１及びＰＤＬ１を誘導した。対照的に、組み換えマトリプターゼでプレインキュベーションしないＦＡＰ－ＩＦＮｇ ＸＭＧ１．２ ｓｃＦｖマスクコンストラクトは、ＭＨＣ－Ｉ又はＰＤＬ１の上方制御を誘導しなかった（図１７Ａ及び１７Ｂ）。
材料及び方法
ＭＣ３８－ｈｕＣＥＡ細胞を、ＤＭＥＭ１０％ＦＣＳ中で培養し、細胞解離バッファーを使用して回収した。細胞を、ＤＭＥＭ１０％ＦＣＳ中で洗浄し、ＤＭＥＭ１０％ＦＣＳに再懸濁し、続いてＥｖｅ細胞カウンタを使用して細胞生存率及び細胞数を評価した。細胞を、ＤＭＥＭ１０％ＦＣＳ中で濃度５０，０００／ｍｌに希釈し、この細胞懸濁液１００ｕＬを、細胞培養物処理した９６Ｆウェルプレートに播種した。細胞を、３７℃、５％のＣＯ２で一晩インキュベートし、細胞を確実に付着させた。選択された濃度のＦＡＰ－ＩＦＮｇコンストラクトを、マトリプターゼバッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ、５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ ２０、ｐＨ９．０）中で、１６３ｎＭ／４．４ｎｇの組み換えマトリプターゼ（４７３５－ＳＥ、ｌｏｔ ＲＩＫ０７１９５１、０．４４ｍｇ／ｍｌ）あり又はなしで、３７Ｃで２時間消化した。インキュベーション後、消化したサイトカインＦｃ融合溶液を、ＤＭＥＭ１０％ＦＣＳで濃度３０ｎＭに希釈し、１００ｕＬのＤＭＥＭ１０％ＦＣＳ中で事前播種した細胞のウェル１つ当たり５０ｕＬを加え、ウェル当たりの最終最大濃度を１０ｎＭにした。サイトカインＦｃ融合溶液を、ウェル当たりの最終最小濃度が０．１ｐＭになるまで、比１：１０に段階希釈した。細胞は、インキュベーター内で４８時間インキュベートした。
４８時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、続いて１０分間５０ｕＬのＴｒｙｐｓｉｎ ＥＤＴＡでインキュベートした。剥離した細胞を、ＤＭＥＭ１０％ＦＣＳに回収し、丸底９６ウェルプレートに移した。細胞を遠心分離し（５００ｇ、２分）、上清を捨て、１５０ｕＬのＰＢＳをウェル毎に加え、続いて遠心分離した（５００ｇ、２分）。細胞を、Ｚｏｍｂｉｅ Ｎｅａｒ ＩＲ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌ１０１１９）を含有する５０ｕＬの染色混合物に再懸濁した。その後、細胞を、ＦＡＣＳバッファーで洗浄し、抗ｍｕＨ－２Ｋｂ／Ｈ－２Ｄ－ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、１１４６０８）及び抗ｍｕＣＤ２７４－ＡＰＣ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、１２４３１２）を含有する５０ｕＬの抗体染色混合物を、２０分間４Ｃで加えた。その後、細胞を、ＰＢＳで洗浄し、１００ｕＬのＰＦＡに再懸濁し、２５分間ＲＴでインキュベートした。その後、細胞を、１００ｕＬのＦＡＣＳバッファーで洗浄し、１００ｕＬのＦＣＳバッファーに再懸濁し、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏで測定した。
実施例９
ＳＰＲを使用したマトリプターゼ切断速度の決定
組み換えマトリプターゼによる切断速度を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器（Ｃｙｔｉｖａ）で表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して調査した。ビオチン化ＣＤ３εを、最終表面密度２０００～４０００応答単位（ＲＵ）でＳｅｒｉｅｓ Ｓ Ｓｅｎｓｏｒｃｈｉｐ ＳＡ（Ｃｙｔｉｖａ、２９１０４９９２）上に固定化した。抗ＣＤ３抗原結合部分をブロックするマスクを含み、それぞれのプロテアーゼ切断型リンカーによりマスクに接合されたプロテアーゼ活性化型抗ＦｏｌＲ１－抗ＣＤ３Ｔ細胞二重特異性抗体（ＦＯＬＲ１ ｐｒｏＴＣＢ）を、マトリプターゼ切断速度を評価するためのモデル系として使用した。濃度１０ｎＭのｐｒｏＴＣＢを、ＰＢＳ－Ｔ（ｐＨ７．４）並びに ＰＢＳ－Ｔ（ｐＨ６．５）中において、５０ｐＭの組み換えマトリプターゼ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、３９４６－ＳＥ）で、３７℃でインキュベートした。ＣＤ３ε結合応答、及びしたがってｐｒｏＴＣＢ活性化速度を、ｐｒｏＴＣＢ／マトリプターゼ混合物を３０秒間５μｌ／分の流速で最大１０時間表面上に継続的に注入することによりモニタリングした。各注入後、ＣＤ３ｅ表面を、１０ｍＭのグリシン（ｐＨ１．５）を流速５μｌ／分で６０秒間注入することにより再生した。同じ実験内において、濃度系列０．１６、０．３１、０．６３、１．２５及び２．５ｎＭのＦＯＬＲ１ ｐｒｏＴＣＢを注入して較正ラインを生成し、得られたｐｒｏＴＣＢの結合応答を、応答単位（ＲＵ）からモル濃度（ｎＭ）に変換した。活性化ｐｒｏＴＣＢのモル濃度を、インキュベーション時間に対してプロットし、切断速度（ｐＭ／分）を、得られた各直線の勾配を決定することにより計算した。結果を表１０に示す。
Figure 2024512709000071
Figure 2024512709000072
Figure 2024512709000073
Figure 2024512709000074
Figure 2024512709000075
先述の発明は、理解を明瞭にする目的で説明及び例示によりある程度詳細に記載されたが、それら記載及び例示は本発明の範囲を限定するものではない。本明細書中に引用されるすべての特許及び科学文献の開示は、その全体が参照により明示的に援用される。

Claims (22)

  1. プロテアーゼ認識部位を含む単離されたポリペプチドであって、プロテアーゼ認識部位が、マトリプターゼの基質であり、配列番号３２による配列ＰＱＡＲＫ又は配列番号３３によるＨＱＡＲＫを含むか又はそれからなる、単離されたポリペプチド。
  2. プロテアーゼ認識部位を含む１つ又は複数の非構造化リンカーを含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
  3. １つ又は複数の非構造化リンカーが、二次構造を呈さない、請求項２に記載の単離されたポリペプチド。
  4. プロテアーゼ認識部位が、好ましくは配列番号７１、７３、７５、７６、７８、８０、８２からなる群から選択される配列のうちの１つを含む、切断型リンカー部分（ＣＭ）の一部である、請求項１から３のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
  5. ＣＭのアミノ（Ｎ）末端に位置する部分（ＭＮ）、ＣＭのカルボキシル（Ｃ）末端に位置する部分（ＭＣ）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの部分（Ｍ）を含み、ＭＮ又はＭＣが、抗体又はその抗原結合断片（ＡＢ）、治療剤、抗悪性腫瘍薬、毒剤、薬物、及び検出可能な標識からなる群から選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
  6. 配列番号１０２によるＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＱＡＲＫＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧ、配列番号１１０によるＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＰＱＡＲＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＳ及び配列番号１１１によるＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＨＱＡＲＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＳからなる群から選択される配列を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
  7. プロテアーゼ認識部位の使用であって、プロテアーゼ認識部位が、配列番号３２によるＰＱＡＲＫ又は配列番号３３によるＨＱＡＲＫであり、プロテアーゼ認識部位が、治療剤中に存在する、使用。
  8. 治療剤が、単離されたポリペプチドである、請求項７に記載の使用。
  9. 治療剤が、がん治療である、請求項７又は８に記載の使用。
  10. 薬学的組成物における、請求項１から６のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチドの使用。
  11. 請求項１から６のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
  12. 請求項１１に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  13. 請求項１１に記載のポリヌクレオチド又は請求項１２に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
  14. 請求項１３に記載の宿主細胞を、ポリペプチドの発現に適した条件下で培養することを含む、ポリペプチドを生成する方法。
  15. 請求項１４の方法によって生成された、単離されたポリペプチド。
  16. 請求項１から６のいずれか一項又は請求項１５に記載の単離されたポリペプチドと、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
  17. 疾患の治療を必要とする個体の疾患の治療における使用のための、請求項１から６のいずれか一項又は請求項１５に記載の単離されたペプチド。
  18. 前記疾患が、がんである、請求項１７に記載の単離されたポリペプチド。
  19. 疾患の治療を必要とする個体の疾患を治療するための医薬の製造のための、請求項１から６のいずれか一項又は請求項１５に記載の単離されたポリペプチドの使用。
  20. 個体の疾患を治療する方法であって、前記個体に対して、請求項１から６のいずれか一項又は請求項１５に記載の単離されたポリペプチドを薬学的に許容される形態で含む、治療有効量の組成物を投与することを含む方法。
  21. 前記疾患が、がんである、請求項２０に記載の方法。
  22. ここに記載されるとおりの発明。
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