TWI756164B - 活化ｔ細胞之雙特異性抗原結合分子 - Google Patents

活化ｔ細胞之雙特異性抗原結合分子 Download PDF

Info

Publication number
TWI756164B
TWI756164B TW104138283D TW104138283D TWI756164B TW I756164 B TWI756164 B TW I756164B TW 104138283 D TW104138283 D TW 104138283D TW 104138283 D TW104138283 D TW 104138283D TW I756164 B TWI756164 B TW I756164B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
cells
seq
antigen binding
domain
bispecific antigen
Prior art date
Application number
TW104138283D
Other languages
English (en)
Inventor
瑪麗娜 巴凱克
彼得 布朗克
葛倫雪伯 安 富雷摩捨
雷夫 賀司
克里斯汀 克萊
艾克哈得 摩斯納
帕伯羅 優瑪那
提娜 溫席爾
Original Assignee
瑞士商赫孚孟拉羅股份公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 filed Critical 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司
Application granted granted Critical
Publication of TWI756164B publication Critical patent/TWI756164B/zh

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/66—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a swap of domains, e.g. CH3-CH2, VH-CL or VL-CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/74—Inducing cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本發明大體上關於用於T細胞活化及再定向於特定目標細胞的新穎雙特異性抗原結合分子。另外，本發明係關於編碼此雙特異性抗原結合分子的聚核苷酸，以及包含此聚核苷酸的載體及宿主細胞。本發明進一步關於用於製造本發明之雙特異性抗原結合分子的方法，及使用此等雙特異性抗原結合分子於治療疾病的方法。

Description

活化T細胞之雙特異性抗原結合分子 序列表
本申請案含有序列表，該序列表已以ASCII格式、以電子方式提交且以全文引用的方式併入本文中。於2015年11月9日產生之該ASCII複本命名為32186_SL.txt且大小為445,570個位元組。
本發明大體上關於用於活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，尤其關於靶向CD3及葉酸受體1(FolR1)之雙特異性抗體。另外，本發明係關於編碼此類雙特異性抗原結合分子的聚核苷酸，以及包含此類聚核苷酸的載體及宿主細胞。本發明進一步關於製造本發明之雙特異性抗原結合分子的方法，及使用此等雙特異性抗原結合分子治療疾病的方法。
多個臨床背景中經常需要選擇性摧毀個別細胞或特定細胞類型。舉例而言，癌症療法的主要目標為特異性地摧毀腫瘤細胞、同時使健康細胞及組織完整且不受損害。
達成此目標的一種有吸引力之方式為誘導針對腫瘤的免疫反應，以使免疫效應細胞(諸如天然殺手(NK)細胞或細胞毒性T淋巴細胞(CTL))攻擊及摧毀腫瘤細胞。CTL構成免疫系統之最強效應細胞，然而其不能藉由習知治療抗體之Fc域介導的效應機制活化。
就此而言，設計成以一個「臂」結合至目標細胞上之表面抗原且以第二「臂」結合至T細胞受體(TCR)複合物之活化非變異組分的雙特異性抗體近年來已變得受人關注。此類抗體同時結合至其兩個目標將迫使目標細胞與T細胞之間產生暫時性相互作用，引起任何細胞毒性T細胞活化及隨後目標細胞溶解。從而使免疫反應再定向於目標細胞且不依賴於目標細胞呈遞肽抗原或不依賴於T細胞之特異性，此與CTL之正常MHC限制性活化有關。在此情形中，關鍵的是，CTL僅在目標細胞將雙特異性抗體呈遞給CTL時，亦即模擬免疫學突觸時得到活化。特別需要的是，雙特異性抗體不需要淋巴細胞預處理或共刺激以便誘發目標細胞發生有效溶解。
FOLR1表現於各種來源之上皮腫瘤細胞上，例如卵巢癌、肺癌、乳癌、腎癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌。用諸如伐吐珠單抗(farletuzumab)之治療抗體、抗體藥物結合物或用於使腫瘤成像之過繼性T細胞療法來靶向FOLR1的若干方法已有描述(Kandalaft等人，J Transl Med.2012年8月3日；10：157.doi：10.1186/1479-5876-10-157；van Dam等人，Nat Med.2011年9月18日；17(10)：1315-9.doi：10.1038/nm.2472；Clifton等人，Hum Vaccin.2011年2月；7(2)：183-90.電子版2011年2月1日；Kelemen等人，Int J Cancer.2006年7月15日；119(2)：243-50；Vaitilingam等人，J Nucl Med.2012年7月；53(7)；Teng等人，2012年8月；9(8)：901-8.doi：10.1517/17425247.2012.694863.電子版2012年6月5日)。已若干次嘗試用靶向葉酸受體及CD3之構築體來靶向葉酸受體陽性腫瘤(Kranz等人，Proc Natl Acad Sci U S A.1995年9月26日；92(20)：9057-9061；Roy等人，Adv Drug Deliv Rev.2004年4月29日；56(8)：1219-31；Huiting Cui等人Biol Chem.2012年8月17日；287(34)：28206-28214；Lamers等人，Int.J.Cancer.60(4)：450(1995)；Thompson等人，MAbs.2009年7月-8月；1(4)：348-56.電子版 2009年7月19日；Mezzanzanca等人，Int.J.Cancer,41,609-615(1988))。然而，迄今為止所用之方法均具有諸多缺點。迄今為止所用之分子無法容易地且可靠地製造，因為其需要化學交聯。同樣地，雜合分子不能大規模製造為人類蛋白質且需要使用大鼠、鼠類或在投與至人類時具有高度免疫原性的其他蛋白質，且因此治療價值有限。此外，現有分子中多數保留FcgR結合。
因此，仍然存在對用於目標性T細胞介導之免疫療法的新穎改良式雙特異性抗體的需要。本發明提供針對目標性T細胞活化所設計之雙特異性抗原結合分子，特定言之適合作為有效且安全的療法的雙特異性抗原結合分子，其能夠容易地製造且給藥。
在一個態樣中，本發明提供一種活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其包含(i)第一抗原結合部分，其為能夠特異性結合至CD3之Fab分子，且其包含至少一個選自由SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38及SEQ ID NO：39組成之群的重鏈互補決定區(CDR)胺基酸序列及至少一個選自SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34之群的輕鏈CDR；及(ii)能夠特異性結合至葉酸受體1(FolR1)之第二抗原結合部分。
在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含第一抗原結合部分，該第一抗原結合部分包含含SEQ ID NO：36之胺基酸序列的可變重鏈及含SEQ ID NO：31之胺基酸序列的可變輕鏈。在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子另外包含(iii)能夠特異性結合至FolR1之第三抗原結合部分。在一個實施例中，能夠特異性結合至FolR1之第二及第三抗原結合部分包含一致的重鏈互補決定區(CDR)及輕鏈CDR序列。在一個實施例中，第三抗原結合部分與 第二抗原結合部分一致。
在以上實施例之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子的一個實施例中，第二及第三抗原結合部分中之至少一者為Fab分子。在一個實施例中，以上實施例之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子另外包含由能夠穩定結合之第一及第二亞單元構成的Fc域。在一些實施例中，第一抗原結合部分及第二抗原結合部分各自在Fab重鏈之C端連接至Fc域之第一或第二亞單元之N端。在一些實施例中，第三抗原結合部分在Fab重鏈之C端視情況經由肽連接子融合至第一抗原結合部分之Fab重鏈的N端。
在以上實施例之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子的一個實施例中，能夠特異性結合至葉酸受體1(FolR1)之抗原結合部分包含至少一個選自由SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18組成之群的重鏈互補決定區(CDR)胺基酸序列及至少一個選自SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34之群的輕鏈CDR。在一個實施例中，能夠特異性結合至葉酸受體1(FolR1)之抗原結合部分包含含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的可變重鏈及含SEQ ID NO：31之胺基酸序列的可變輕鏈。在一個實施例中，能夠特異性結合至葉酸受體1(FolR1)之抗原結合部分包含至少一個選自由SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：56及SEQ ID NO：57組成之群的重鏈互補決定區(CDR)胺基酸序列及至少一個選自SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：65之群的輕鏈CDR；在一個實施例中，能夠特異性結合至葉酸受體1(FolR1)之抗原結合部分包含含SEQ ID NO：55之胺基酸序列的可變重鏈及含SEQ ID NO：64之胺基酸序列的可變輕鏈。
在另一實施例中，能夠特異性結合至葉酸受體1(FolR1)之抗原結合部分包含至少一個選自由SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：50組成之群的重鏈互補決定區(CDR)胺基酸序列及至少一個選自 SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54之群的輕鏈CDR。在一個實施例中，能夠特異性結合至FolR1之抗原結合部分包含(a)SEQ ID NO：8之互補決定區重鏈1(CDR-H1)胺基酸序列；(b)SEQ ID NO：9之CDR-H2胺基酸序列；(c)SEQ ID NO：50之CDR-H3胺基酸序列；(d)SEQ ID NO：52之互補決定區輕鏈1(CDR-L1)胺基酸序列；(e)SEQ ID NO：53之CDR-L2胺基酸序列，及(f) SEQ ID NO：54之CDR-L3胺基酸序列。在一個實施例中，能夠特異性結合至FolR1之抗原結合部分包含含SEQ ID NO：49之胺基酸序列的可變重鏈及含SEQ ID NO：51之胺基酸序列的可變輕鏈。
在另一實施例中，能夠特異性結合至葉酸受體1(FolR1)之抗原結合部分包含至少一個選自由SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：275及SEQ ID NO：315組成之群的重鏈互補決定區(CDR)胺基酸序列及至少一個選自SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34之群的輕鏈CDR。在一個實施例中，能夠特異性結合至FolR1之抗原結合部分包含(a)SEQ ID NO：16之互補決定區重鏈1(CDR-H1)胺基酸序列；(b)SEQ ID NO：275之CDR-H2胺基酸序列；(c)SEQ ID NO：315之CDR-H3胺基酸序列；(d)SEQ ID NO：32之互補決定區輕鏈1(CDR-L1)胺基酸序列；(e)SEQ ID NO：33之CDR-L2胺基酸序列，及(f) SEQ ID NO：34之CDR-L3胺基酸序列。在一個實施例中，能夠特異性結合至FolR1之抗原結合部分包含含SEQ ID NO：274之胺基酸序列的可變重鏈域(VH)及含SEQ ID NO：31之胺基酸序列的可變輕鏈域(VL)。
在一個實施例中，以上實施例之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子結合至人類FolR1。在一個實施例中，以上實施例之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子結合至人類FolR1及食蟹獼猴(cynomolgus monkey)FolR1。在一個實施例中，以上實施例之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子結合至人類FolR1、食蟹獼猴FolR1及鼠類FolR1。在 一個實施例中，以上實施例之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子結合至人類FolR1、食蟹獼猴FolR1，且不結合至鼠類FolR1。
在以上實施例中之任一者的活化T細胞之雙特異性抗原結合分子的一個實施例中，第一抗原結合部分為互換型Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變區或恆定區發生交換。在一個實施例中，以上實施例中之任一者的活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含不超過一個能夠特異性結合至CD3之抗原結合部分。在活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之一個實施例中，第一及第二抗原結合部分及Fc域為免疫球蛋白分子之一部分。在一個實施例中，Fc域為IgG類免疫球蛋白Fc域，該IgG類免疫球蛋白特定言之為IgG1 或IgG4 。在一個實施例中，Fc域為人類Fc域。
在以上實施例中之任一者的活化T細胞之雙特異性抗原結合分子的一個實施例中，Fc域包含促進Fc域之第一及第二亞單元之結合的修飾。在一個實施例中，在Fc域之第一亞單元之CH3域中，胺基酸殘基經具有較大側鏈體積之胺基酸殘基置換，從而在第一亞單元之CH3域內產生可定位於第二亞單元之CH3域內之空腔中的隆凸，且在Fc域之第二亞單元之CH3域中，胺基酸殘基經具有較小側鏈體積之胺基酸殘基置換，從而在第二亞單元之CH3域內產生第一亞單元之CH3域內之隆凸可定位於其中的空腔。在一個實施例中，Fc域包含至少一個使與Fc受體之結合及/或效應功能相比於原生IgG1 Fc域有所減少的胺基酸取代。在一個實施例中，Fc域之各亞單元包含三個使與活化Fc受體之結合及/或效應功能減少的胺基酸取代，其中該等胺基酸取代為L234A、L235A及P329G(Kabat編號)。在一個實施例中，Fc受體為Fcγ受體。在一個實施例中，效應功能為抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)。
在以上實施例中之任一者的活化T細胞之雙特異性抗原結合分子 的一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子活體外誘導人類CD3陽性T細胞之增殖。在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子活體外誘導人類周邊血液單核細胞介導殺死表現FolR1之人類腫瘤細胞。在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子活體外誘導T細胞介導殺死表現FolR1之人類腫瘤細胞。在一個實施例中，T細胞為CD8陽性T細胞。在一個實施例中，表現FolR1之人類腫瘤細胞為Hela、Skov-3、HT-29或HRCEpiC細胞。在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子在24小時後以介於約36pM與約39573pM之間的EC50活體外誘導T細胞介導殺死表現FolR1之人類腫瘤細胞。在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子在24小時後以約36pM之EC50活體外誘導T細胞介導殺死表現FolR1之腫瘤細胞。在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子在24小時後以約178.4pM之EC50活體外誘導T細胞介導殺死表現FolR1之腫瘤細胞。在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子在48小時後以約134.5pM或大於134.5pM之EC50活體外誘導T細胞介導殺死表現FolR1之腫瘤細胞。
在一個實施例中，以上實施例中之任一者的活化T細胞之雙特異性抗原結合分子誘導T細胞上之CD25及CD69中之至少一者的細胞表面表現上調，如藉由流動式細胞測量術所量測。在一個實施例中，T細胞為CD4陽性T細胞或CD8陽性T細胞。在一個實施例中，以上實施例中之任一者的活化T細胞之雙特異性抗原結合分子以約5.36pM至約4nM之表觀K D 結合人類FolR1。在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子以約4nM之表觀K D 結合人類及食蟹獼猴FolR1。在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子以約1.5nM之表觀K D 結合鼠類FolR1。在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子以至少約1000nM之單價結合K D 結合人類FolR1。
在一個實施例中，以上實施例中之任一者的活化T細胞之雙特異性抗原結合分子對FolR1具有特異性且不結合至FolR2或FolR3。在一個實施例中，以上實施例中之任一者的活化T細胞之雙特異性抗原結合分子具有1μM或大於1μM之親和力(單價結合)。在一個實施例中，對人類FolR1之親和力為約1.4μM。在一個實施例中，以上實施例中之任一者的活化T細胞之雙特異性抗原結合分子具有約1-100nM或低於1nM之結合力(avidity)(二價結合)。在一個實施例中，結合力為約10nM或小於10nM。在一個實施例中，結合力為10nM。
在一個實施例中，以上實施例中之任一者的活化T細胞之雙特異性抗原結合分子結合至人類腫瘤細胞上所表現之FolR1。在一個實施例中，以上實施例中之任一者的活化T細胞之雙特異性抗原結合分子結合至人類FolR1上之構形抗原決定基。在一個實施例中，以上實施例中之任一者的活化T細胞之雙特異性抗原結合分子不結合至人類葉酸受體2(FolR2)或人類葉酸受體3(FolR3)。在以上實施例中之任一者的活化T細胞之雙特異性抗原結合分子的一個實施例中，抗原結合部分結合至包含人類FolR1之胺基酸25至234(SEQ ID NO：227)的FolR1多肽。在以上實施例中之任一者的活化T細胞之雙特異性抗原結合分子的一個實施例中，FolR1抗原結合部分結合至包含SEQ ID NO：227、230及231之胺基酸序列的FolR1多肽，且其中FolR1抗原結合部分不結合至包含SEQ ID NO：228及229之胺基酸序列的FolR多肽。
在另一態樣中，本發明提供一種雙特異性抗體，其包含a)第一抗原結合位點，其與包含SEQ ID NO：49之可變重鏈域(VH)及SEQ ID NO：51之可變輕鏈域的參考抗體競爭結合至人類FolR1；及b)第二抗原結合位點，其與包含SEQ ID NO：36之可變重鏈域(VH)及SEQ ID NO：31之可變輕鏈域的參考抗體競爭結合至人類CD3，其中結合競爭使用表面電漿子共振分析量測。
在另一態樣中，本發明提供一種雙特異性抗體，其包含a)第一抗原結合位點，其與包含SEQ ID NO：274之可變重鏈域(VH)及SEQ ID NO：31之可變輕鏈域的參考抗體競爭結合至人類FolR1；及b)第二抗原結合位點，其與包含SEQ ID NO：36之可變重鏈域(VH)及SEQ ID NO：31之可變輕鏈域的參考抗體競爭結合至人類CD3，其中結合競爭使用表面電漿子共振分析量測。
在另一態樣中，本發明提供一種活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其包含能夠特異性結合至CD3之第一抗原結合部分及能夠特異性結合至葉酸受體1(FolR1)之第二抗原結合部分，其中活化T細胞之雙特異性抗原結合分子與包含SEQ ID NO：49之可變重鏈域(VH)及SEQ ID NO：51之可變輕鏈域的第一參考抗體結合至人類FolR1上之同一抗原決定基；且其中活化T細胞之雙特異性抗原結合分子與包含SEQ ID NO：36之可變重鏈域(VH)及SEQ ID NO：31之可變輕鏈域的第二參考抗體結合至人類CD3上之同一抗原決定基。
在另一態樣中，本發明提供一種活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其包含能夠特異性結合至CD3之第一抗原結合部分及能夠特異性結合至葉酸受體1(FolR1)之第二抗原結合部分，其中活化T細胞之雙特異性抗原結合分子與包含SEQ ID NO：274之可變重鏈域(VH)及SEQ ID NO：31之可變輕鏈域(VL)的第一參考抗體結合至人類FolR1上之同一抗原決定基；且其中活化T細胞之雙特異性抗原結合分子與包含SEQ ID NO：36之可變重鏈域(VH)及SEQ ID NO：31之可變輕鏈域(VL)的第二參考抗體結合至人類CD3上之同一抗原決定基。
在另一態樣中，本發明係關於一種抗體或其抗原結合片段，其與包含SEQ ID NO：274之可變重鏈域(VH)及SEQ ID NO：31之可變輕鏈域的抗體競爭結合至人類FolR1，其中結合競爭使用表面電漿子共振分析量測。
在一個態樣中，本發明提供一種活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含形成第一、第二及第三抗原結合部分之第一、第二、第三、第四及第五多肽鏈，其中第一抗原結合部分能夠結合CD3且第二及第三抗原結合部分各自能夠結合葉酸受體1(FolR1)，其中a)第一及第二多肽鏈按胺基(N)端至羧基(C)端方向包含VLD1及CLD1；b)第三多肽鏈按N端至C端方向包含VLD2及CH1D2；c)第四多肽鏈按N端至C端方向包含VHD1、CH1D1、CH2D1及CH3D1；d)第五多肽鏈包含VHD1、CH1D1、VHD2、CLD2、CH2D2及CH3D2；其中VLD1為第一輕鏈可變域，VLD2為第二輕鏈可變域，CLD1為第一輕鏈恆定域，CLD2為第二輕鏈恆定域，VHD1為第一重鏈可變域，VHD2為第二重鏈可變域，CH1D1為第一重鏈恆定域1，CH1D2為第二重鏈恆定域1，CH2D1為第一重鏈恆定域2，CH2D2為第二重鏈恆定域2，CH3D1為第一重鏈恆定域3，且CH3D2為第二重鏈恆定域3。
在活化T細胞之雙特異性抗原結合分子的一個實施例中，(i)第三多肽鏈與第五多肽鏈之VHD2及CLD2形成能夠結合CD3之第一抗原結合部分；(ii)第一多肽鏈與第四多肽鏈之VHD1及CH1D1形成能夠結合至FolR1之第二結合部分；及(iii)第二多肽鏈與第五多肽鏈之VHD1及CH1D1形成能夠結合至FolR1之第三結合部分。在一個實施例中，CH2D1、CH3D1、CH2D2及CH3D2形成IgG類免疫球蛋白之Fc域。在一個實施例中，Fc域為人類Fc域。在一個實施例中，Fc域包含促進Fc域之第一及第二亞單元之結合的修飾。在一個實施例中，CH3D2包含具有較大側鏈體積之胺基酸殘基，其可定位於CH3D1內之空腔中。在一個實施例中，Fc域包含至少一個使與Fc受體之結合及/或效應功能相比於原生IgG1 Fc域有所減少的胺基酸取代。在一個實施例中，Fc域之各亞單元包含三個使與活化Fc受體之結合及效應功能中之至少一者 減少的胺基酸取代，其中該等胺基酸取代根據Kabat編號為L234A、L235A及P329G。在一個實施例中，Fc受體為Fcγ受體。在以上實施例中之一者中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子活體外誘導人類CD3陽性T細胞之增殖。在以上實施例中之一者中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子活體外誘導人類周邊血液單核細胞介導殺死表現FolR1之人類腫瘤細胞。在以上實施例中之一者中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子活體外誘導T細胞介導殺死表現FolR1之人類腫瘤細胞。在一個此類實施例中，表現FolR1之人類腫瘤細胞為Hela、Skov-3、HT-29或HRCEpiC細胞。在以上實施例中之一者中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子在24小時後以介於約36pM與約39573pM之間的EC50活體外誘導T細胞介導殺死表現FolR1之腫瘤細胞。在以上實施例中之一者中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子在24小時後以約36pM之EC50活體外誘導T細胞介導殺死表現FolR1之腫瘤細胞。在以上實施例中之一者中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子在24小時後以約178.4pM之EC50活體外誘導T細胞介導殺死表現FolR1之腫瘤細胞。在以上實施例中之一者中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子在48小時後以約134.5pM或大於134.5pM的EC50活體外誘導T細胞介導殺死表現FolR1之腫瘤細胞。在以上實施例中之一者中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子誘導T細胞上之CD25及CD69中之至少一者的細胞表面表現上調，如藉由流動式細胞測量術所量測。在一個這類實施例中，T細胞為CD4陽性T細胞或CD8陽性T細胞。在以上實施例中之一者中，其中活化T細胞之雙特異性抗原結合分子以約5.36pM至約4nM之表觀K D 結合人類FolR1。在以上實施例中之一者中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子以約4nM之表觀K D 結合人類及食蟹獼猴FolR1。在以上實施例中之一者中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子以約1.5nM之表觀K D 結合鼠類FolR1。在以上實施例中之一 者中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子以至少約1000nM之單價結合K D 結合人類FolR1。在以上實施例中之一者中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子結合至人類腫瘤細胞上所表現之FolR1。在以上實施例中之一者中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子結合至人類FolR1上之構形抗原決定基。在以上實施例中之一者中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子不結合至人類葉酸受體2(FolR2)或人類葉酸受體3(FolR3)。在以上實施例中之一者中，抗原結合部分結合至包含人類FolR1之胺基酸25至234(SEQ ID NO：227)的FolR1多肽。在以上實施例中之一者中，FolR1抗原結合部分結合至包含SEQ ID NO：227、230及231之胺基酸序列的FolR1多肽，且其中FolR1抗原結合部分不結合至包含SEQ ID NO：228及229之胺基酸序列的FolR多肽。在以上實施例中之一者中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子為人類化或嵌合分子。在以上實施例中之一者中，VHD2及CH1D1經由肽連接子連接。
在活化T細胞之雙特異性抗原結合分子的以上實施例中之一者中，第一及第二多肽鏈包含SEQ ID NO：230之胺基酸序列。在活化T細胞之雙特異性抗原結合分子的以上實施例中之一者中，第三多肽鏈包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列。在活化T細胞之雙特異性抗原結合分子的以上實施例中之一者中，第四多肽鏈包含SEQ ID NO：309之胺基酸序列。在活化T細胞之雙特異性抗原結合分子的以上實施例中之一者中，第五多肽鏈包含SEQ ID NO：308之胺基酸序列。在活化T細胞之雙特異性抗原結合分子的以上實施例中之一者中，第一及第二多肽鏈包含SEQ ID NO：230之胺基酸序列；第三多肽鏈包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列；第四多肽鏈包含SEQ ID NO：309之胺基酸序列；且第五多肽鏈包含SEQ ID NO：308之胺基酸序列。
在一個態樣中，本發明提供一種包含SEQ ID NO：308之胺基酸序 列的活化T細胞之雙特異性抗原結合分子。在一個實施例中，以上實施例之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子進一步包含SEQ ID NO：230及SEQ ID NO：86之胺基酸序列。
在一個態樣中，本發明提供一種包含SEQ ID NO：308之胺基酸序列的經分離多肽。在一個態樣中，本發明提供一種包含SEQ ID NO：309之胺基酸序列的經分離多肽。
在一個態樣中，本發明提供一種包含SEQ ID NO：276之胺基酸序列的活化T細胞之雙特異性抗原結合分子。在一個實施例中，以上實施例之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子進一步包含SEQ ID NO：277及SEQ ID NO：35之胺基酸序列。
在一個態樣中，本發明提供一種包含SEQ ID NO：277之胺基酸序列的經分離多肽。在一個態樣中，本發明提供一種包含SEQ ID NO：276之胺基酸序列的經分離多肽。
在一個態樣中，本發明提供一種經分離聚核苷酸，其編碼本文所揭示之實施例中之任一者的活化T細胞之雙特異性抗原結合分子。在一個實施例中，本發明提供一種經分離聚核苷酸，其編碼包含SEQ ID NO：169之核苷酸序列的活化T細胞之雙特異性抗原結合分子。在一個實施例中，本發明提供一種經分離聚核苷酸，其編碼包含SEQ ID NO：246之核苷酸序列的活化T細胞之雙特異性抗原結合分子。在一個實施例中，本發明提供一種經分離聚核苷酸，其編碼包含SEQ ID NO：247之核苷酸序列的活化T細胞之雙特異性抗原結合分子。在一個實施例中，本發明提供一種經分離聚核苷酸，其編碼包含SEQ ID NO：97之核苷酸序列的活化T細胞之雙特異性抗原結合分子。在一個實施例中，本發明提供一種經分離聚核苷酸，其編碼包含SEQ ID NO：198之核苷酸序列的活化T細胞之雙特異性抗原結合分子。
在一個實施例中，本發明提供一種經分離聚核苷酸，其編碼包 含SEQ ID NO：287之核苷酸序列的活化T細胞之雙特異性抗原結合分子。在一個實施例中，本發明提供一種經分離聚核苷酸，其編碼包含SEQ ID NO：288之核苷酸序列的活化T細胞之雙特異性抗原結合分子。在一個實施例中，本發明提供一種經分離聚核苷酸，其編碼包含SEQ ID NO：289之核苷酸序列的活化T細胞之雙特異性抗原結合分子。
在一個態樣中，本發明提供一種由以上實施例之聚核苷酸編碼的經分離多肽。在另一態樣中，本發明提供一種載體，特定言之表現載體，其包含編碼本文所揭示之實施例中之任一者的活化T細胞之雙特異性抗原結合分子的聚核苷酸。在另一態樣中，本發明提供一種宿主細胞，其包含本文所揭示之實施例中之任一者的聚核苷酸或載體。
在一個態樣中，本發明提供一種製造能夠特異性結合至CD3及目標細胞抗原的活化T細胞之雙特異性抗原結合分子的方法，該方法包含以下步驟：a)在適於表現活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之條件下培養以上實施例之宿主細胞及b)回收活化T細胞之雙特異性抗原結合分子。
在一個態樣中，本發明提供藉由以上實施例之方法製造的活化T細胞之雙特異性抗原結合分子。
在一個態樣中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含以上實施例中之任一者的活化T細胞之雙特異性抗原結合分子及醫藥學上可接受之載劑。在一個態樣中，本發明提供以上實施例中之任一者的活化T細胞之雙特異性抗原結合分子或以上實施例中之任一者的醫藥組合物，其用作藥物。
在一個態樣中，本發明提供以上實施例中之任一者的活化T細胞之雙特異性抗原結合分子或以上實施例中之任一者的醫藥組合物，其用於治療有需要之個體的疾病。在一些實施例中，該疾病為癌症。在 一個態樣中，本發明提供以上實施例中之任一者的活化T細胞之雙特異性抗原結合分子的用途，其用於製造供治療有需要之個體之疾病用的藥物。
在一個態樣中，本發明提供一種治療個體之疾病的方法，該方法包含向該個體投與治療有效量之組合物，該組合物包含呈醫藥學上可接受之形式的以上實施例中之任一者的活化T細胞之雙特異性抗原結合分子。在一些實施例中，該疾病為癌症。
在一個態樣中，本發明提供一種用於誘導目標細胞溶解之方法，該方法包含在T細胞存在下使目標細胞與以上實施例中之任一者的活化T細胞之雙特異性抗原結合分子接觸。
在一個態樣中，本發明提供如上文所述之本發明。
圖1A至I 圖示本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子(TCB)的例示性組態。除(圖1I)中之κ-λ格式之外的所有構築體均具有P329G LALA突變且包含具有杵-臼(knob-into-hole)修飾之杵-臼Fc片段。(圖1A)「FolR1 TCB 2+1反向(共同輕鏈)」之圖示。FolR1結合子在Fab重鏈之C端融合至包含杵修飾之Fc域的第一亞單元之N端。此等構築體不互換且具有三條相同的VLCL輕鏈。(圖1B)「FolR1 TCB 1+1頭對尾(共同輕鏈)」之圖示。此等構築體不互換且具有兩條相同的VLCL輕鏈。(圖1C)「FolR1 TCB 1+1經典(共同輕鏈)」之圖示。此等構築體不互換且具有兩條相同的VLCL輕鏈。(圖1D)「FolR1 TCB 2+1經典(共同輕鏈)」之圖示。CD3結合子在Fab重鏈之C端融合至包含杵修飾之Fc域的第一亞單元之N端。此等構築體不互換且具有三條相同的VLCL輕鏈。(圖1E)「FolR1 TCB 2+1互換Fab(crossfab)經典」之圖示。此等構築體包含用於CD3結合子之Ck-VH鏈代替習知CH1-VH鏈。CD3結合子在Fab重鏈之C端融合至包含杵修飾之Fc域的第一亞單 元之N端。(圖1F)「FolR1 TCB 2+1互換Fab反向」之圖示。此等構築體包含用於CD3結合子之Ck-VH鏈代替習知CH1-VH鏈。FolR1結合子在Fab重鏈之C端融合至包含杵修飾之Fc域的第一亞單元之N端。(圖1G)「FolR1 TCB 1+1互換Fab頭對尾」之圖示。此等構築體包含用於CD3結合子之Ck-VH鏈代替習知CH1-VH鏈。(圖1H)「FolR1 TCB 1+1互換Fab經典」之圖示。此等構築體包含用於CD3結合子之Ck-VH鏈代替習知CH1-VH鏈。圖1I圖示CD3/FolR1 κ-λ抗體格式。此等構築體包含互換型共同輕鏈VLCH1及一個對CD3具有特異性的互換型VHCL鏈及一個對FolR1具有特異性的互換型VHCL鏈。
圖2A至C 描繪概述FoLR1 IgG結合子與HeLa細胞之結合的圖。藉由流動式細胞測量術測定新產生之FolR1結合子與HeLa細胞上所表現之FolR1的結合。用螢光標記之抗人類二級抗體偵測結合抗體。
圖3A至B 描繪概述FolR1結合子對FolR1之特異性的圖。藉由流動式細胞測量術分析FolR1 IgG與經FolR1或FolR2短暫轉染之HEK細胞的結合來鑑別特異性結合至FolR1且不結合至FolR2之純系。用螢光標記之抗人類二級抗體偵測抗體。
圖4A至B 描繪概述FolR1結合子與cyFoLR1之交叉反應性的圖。藉由流動式細胞測量術處理經cyFolR1短暫轉染之HEK細胞上FolR1抗體與cyno FolR1之交叉反應性。用螢光標記之抗人類二級抗體偵測抗體。
圖5 描繪說明FolR1 TCB在結合之後的內化的圖。對HeLa細胞測試四個FolR1 TCB在結合至FolR1之後的內化。在所規定的在37℃下培育的時間點之後，用螢光標記之抗人類二級抗體偵測表面上之剩餘FolR1 TCB。計算內化百分比。
圖6A至E 描繪概述FolR1 IgG與具有不同FolR1表現量之細胞的結合的圖。藉由流動式細胞測量術分析9D11、16D5及Mov19 IgG與具有 不同FolR1表現量之腫瘤細胞的結合。包括DP47 IgG作為同型對照且包括MKN-45作為FolR1陰性細胞株。用螢光標記之抗人類二級抗體偵測抗體。
圖7A至L 描繪概述T細胞介導殺死HT-29及SKOV3細胞的圖。使用FolR1 TCB來測試HT-29及SKOV3腫瘤細胞之T細胞介導之殺死以及在殺死之後T細胞上之活化標誌物之上調。(圖7A至D)藉由在24小時及48小時之後的LDH釋放來量測在9D11 FolR1 TCB及16D5 FolR1 TCB存在下HT-29及SKOV3細胞之T細胞介導之殺死。包括DP47 TCB作為陰性對照。在培育48小時之後，藉由流動式細胞測量術評定在殺死SKOV3(圖7E至H)或HT-29(圖7I至L)腫瘤細胞後CD8 T細胞及CD4 T細胞上之活化標誌物CD25及CD69的上調情況。
圖8 描繪展示不存在抗FolR1與紅血球之結合的圖。閘控紅血球作為CD235a陽性群體且藉由流動式細胞測量術測定9D11 IgG、16D5 IgG、Mov19 IgG及DP47 IgG與此群體之結合。用螢光標記之抗人類二級抗體偵測抗體。
圖9A至D 描繪概述全血中之活化標誌物上調的圖。藉由流動式細胞測量術分析在添加9D11 FolR1 TCB、16D5 FolR1 TCB、Mov19 FolR1 TCB及DP47 TCB之後24小時CD4 T細胞及CD8 T細胞之CD25及CD69活化標誌物上調情況。
圖10 9D11 TCB a-糖基變異體與HeLa細胞之結合。比較9D11 FolR1 TCB a-糖基變異體與Hela細胞之結合與初始9D11 TCB於HeLa細胞上之結合。用螢光標記之抗人類二級抗體偵測抗體且藉由流動式細胞測量術測定結合。
圖11A至F 描繪概述T細胞介導殺死腫瘤細胞之9D11 FolR1 TCB a-糖基變異體的圖。9D11 FolR1 TCB a-糖基變異體用於測試(圖11A至D)SKOV3、MKN-45(作為FolR1陰性對照)及(圖11E至F)HT-29腫瘤 細胞之T細胞介導之殺死，相較於用初始9D11 FolR1 TCB殺死。關於讀出，使用在24小時及48小時之後LDH釋放。
圖12A至X 描繪概述T細胞介導殺死初級上皮細胞的圖。使用FolR1含量極低之初級上皮細胞來測試用16D5 FolR1 TCB及9D11 FolR1 TCB進行之T細胞介導之殺死，包括DP47 TCB作為陰性對照且包括HT29細胞作為陽性對照。(圖12A至H)在24小時及48小時之後測定人類視網膜色素(HRP)、人類腎皮質(HRC)、人類支氣管(HB)及HT29細胞之LDH釋放。在48小時後藉由流動式細胞測量術測定在殺死(圖12I至L)HRP、(圖12M至P)HRC、(圖12Q至T)HB及(圖12 U至X)HT29之後CD4 T細胞及CD8 T細胞上之CD25及CD69活化標誌物上調。
圖13A至C 顯示具有16D5之不同TCB格式的比較。比較含有FolR1結合子16D5之四種不同TCB格式，在圖13A中，比較與HeLa細胞之結合；在圖13B中，比較24小時及48小時後SKOV3細胞之T細胞介導之殺死；且在圖13C中，比較在殺死之後48小時，CD4 T細胞及CD8 T細胞上之CD25及CD69活化標誌物上調。
圖14A至C 描繪具有9D11之不同TCB格式的比較。比較含有FolR1結合子9D11之三種不同TCB格式，在A)中，比較與HeLa細胞之結合；在B)中，比較24小時及48小時後SKOV3細胞之T細胞介導之殺死；且在C)中，比較在殺死之後48小時，CD4 T細胞及CD8 T細胞上之CD25及CD69活化標誌物上調。
圖15 描繪三個不同劑量之FOLR1 TCB在NOG小鼠中之PK概況。
圖16 圖示FOLR1 TCB之功效研究的實驗方案。
圖17A至B 描繪腫瘤生長曲線。(圖17A)不同處理組中腫瘤體積之平均值及SEM。(圖17B)所有處理組中單隻小鼠之腫瘤生長。TGI(腫瘤生長抑制)給出相比於媒劑組之平均腫瘤體積之百分比。
圖18 顯示研究終止時之腫瘤重量。
圖19A至B 顯示在研究第32天腫瘤浸潤性T細胞之FACS分析。(圖19A)腫瘤單細胞懸浮液用抗人類CD3/CD4/CD8染色且藉由流動式細胞測量術分析。(圖19B)不同處理組中每毫克腫瘤組織T細胞計數之平均值及SEM。
圖20A至B 顯示在研究第32天T細胞活化/脫粒及細胞激素分泌的FACS分析。將CD4+(圖20A)及CD8+(圖20B)腫瘤浸潤性T細胞針對細胞激素、活化及脫粒標誌物進行染色。展示不同處理組中每毫克腫瘤組織T細胞計數之平均值及SEM。
圖21A至B 顯示腫瘤溶解百分比。在κλFoLR1 TCB或DP47 TCB存在下，將SKOV3細胞與PBMC一起培育。在24小時(圖21A)及48小時(圖21B)之後，藉由量測LDH釋放來判定腫瘤細胞之殺死。
圖22A至D 顯示CD4 T細胞上之CD25及CD69上調。在κλFoLR1 TCB或DP47 TCB存在下，將SKOV3細胞與PBMC一起培育。在48小時後，藉由流動式細胞測量術量測CD4 T細胞(圖22A至B)及CD8 T細胞(圖22C至D)上之CD25及CD69上調。
圖23A至B 顯示腫瘤溶解百分比。在培育24小時(圖23A)及48小時(圖23B)之後，藉由36F2 TCB、Mov19 TCB及21A5 TCB誘導之Skov-3細胞(中等FolR1)(E：T=10：1，效應人類PBMC)之T細胞殺死。
圖24A至C 顯示藉由36F2 TCB、16D5 TCB、16D5 TCB經典、16D5 TCB 1+1及16D5 TCB HT誘導之Hela(高FolR1)(圖24A)、Skov-3(中等FolR1)(圖24B)及HT-29(低FolR1)(圖24C)人類腫瘤細胞(E：T=10：1，效應人類PBMC，培育時間24小時)的T細胞殺死。包括DP47 TCB作為非結合對照。
圖25A至C 顯示在T細胞介導殺死Hela細胞(高FolR1)(圖25A)、Skov-3細胞(中等FolR1)(圖25B)及HT-29細胞(低FolR1)(圖25C)(E：T= 10：1，48小時培育)之後，藉由36F2 TCB、16D5 TCB及DP47 TCB(非結合對照)誘導之人類CD8+(圖25A、B)及CD4+(圖25C)T細胞上之CD25及CD69的上調。
圖26A至F 顯示在培育(E：T=10：1，效應人類PBMC)24小時(圖26A、C、E)及48小時(圖26B、D、F)之後，由36F2 TCB、16D5 TCB及DP47 TCB誘導之T細胞殺死人類腎皮質上皮細胞(圖26A、B)、人類視網膜色素上皮細胞(圖26C、D)及HT-29細胞(圖26E、F)。
圖27 描繪概述各種正常細胞株及癌細胞株上之FolR1結合位點的數量的表格。
圖28A至B 顯示16D5 TCB及其對應CD3脫醯胺變異體16D5 TCB N100A及16D5 TCB S100aA以及9D11 TCB及其脫醯胺變異體9D11 TCB N100A及9D11 TCB S100aA與Jurkat細胞上所表現之人類CD3的結合。
圖29A至B 顯示藉由16D5 TCB及其對應CD3脫醯胺變異體16D5 TCB N100A及16D5 TCB S100aA(圖29A)以及9D11 TCB及其脫醯胺變異體9D11 TCB N100A及9D11 TCB S100aA(圖29B)(E：T=10：1，效應人類PBMC，培育時間24小時)誘導之Skov-3(中等FolR1)人類腫瘤細胞的T細胞殺死。包括DP47 TCB作為非結合對照。
圖30A至B 顯示藉由16D5 TCB及其對應CD3脫醯胺變異體16D5 TCB N100A及16D5 TCB S100aA(圖30A)以及9D11 TCB及其脫醯胺變異體9D11 TCB N100A及9D11 TCB S100aA(圖30B)(E：T=10：1，效應人類PBMC，培育時間24小時)誘導之HT-29(低FolR1)人類腫瘤細胞的T細胞殺死。包括DP47 TCB作為非結合對照。
圖31A至C 顯示平均螢光強度及腫瘤細胞溶解。
圖32A至E 顯示36F2 TCB、16D5 TCB及16D5 HC/LC變異體與Hela細胞上所表現之人類FolR1的結合。
圖33 顯示36F2 TCB、16D5 TCB及兩種親和力降低之16D5變異體16D5 W96Y/D52E TCB及16D5 G49S/S93A TCB與Hela細胞上之人類FolR1的結合。
圖34A至E 顯示36F2 TCB、16D5 TCB及16D5 HC/LC變異體與HT-29細胞上所表現之人類FolR1的結合。
圖35A至D 顯示中等FolR1結合子(6E10 TCB、14B1 TCB及9C7 TCB)、16D5 TCB及36F2 TCB與表現人類或小鼠FolR1或FolR2之HEK293T細胞的結合。
圖36A至F 顯示在培育24小時(A至C)及48小時(D至F)之後藉由中等FolR1結合子(6E10 TCB、14B1 TCB及9C7 TCB)、16D5 TCB及36F2 TCB誘導之Hela(高FolR1表現)、Skov-3(中等FolR1表現)及HT-29(低FolR1表現)人類腫瘤細胞的T細胞殺死。人類PBMC用作效應細胞(E：T=10：1)。
圖37A至F 顯示在培育24小時(圖38A至C)及48小時(圖38D至F)之後，藉由親和力降低之16D5變異體(16D5-G49S/S93A TCB、16D5-G49S/K53A TCB、16D5 W96Y TCB、16D5 W96Y/D52E TCB)、16D5 TCB及36F2 TCB誘導之Hela(高FolR1表現)、Skov-3(中等FolR1表現)及HT-29(低FolR1表現)人類腫瘤細胞的T細胞殺死。人類PBMC用作效應細胞(E：T=10：1)。
圖38A至F 顯示在培育(E：T=10：1，效應人類PBMC)24小時(圖39A至C)及48小時(圖39D至F)之後，評定藉由親和力降低之16D5變異體(16D5-G49S/S93A TCB、16D5 W96Y/D52E TCB)、16D5 TCB、36F2 TCB及中等FolR1結合子14B1 TCB誘導之來自視網膜色素上皮及腎皮質上皮之初級人類細胞的T細胞殺死。包括HT-29細胞(低FolR1表現)作為對照細胞株且DP47 TCB充當非結合對照。
圖39A至B 顯示FOLR1 TCB構築體在雌性NOG小鼠中之單劑量 PK。
圖40A至G 顯示在含Hela之NOG小鼠中在人類PBMC轉移之後FOLR1 TCB構築體(16D5、16D5 G49S/S93A及16D5 W96Y/D52E)之活體內功效。
圖41 顯示，伐吐珠單抗(深綠色，自頂部向下第二)及Mov19(灰色，頂部)能夠結合16D5上所捕捉之huFolR1，證明16D5系列結合子識別與伐吐珠單抗或Mov19識別之抗原決定基不同的抗原決定基。
 定義
除非在下文中另外定義，否則術語在本文中的使用如此項技術一般性所用。
如本文所用，術語「抗原結合分子」在其最廣泛的意義上係指特異性結合抗原決定子的分子。抗原結合分子之實例為免疫球蛋白及其衍生物，例如片段。
術語「雙特異性」意謂抗原結合分子能夠特異性結合至至少兩個不同的抗原決定子。通常，雙特異性抗原結合分子包含至少兩個抗原結合位點，其中之每一者對不同抗原決定子具有特異性。在某些實施例中，雙特異性抗原結合分子能夠同時結合兩個抗原決定子，特定言之兩個不同細胞上所表現的兩個抗原決定子。
如本文所用，術語「價」表示抗原結合分子中存在指定數目個抗原結合位點。因而，術語「單價結合至抗原」表示抗原結合分子中存在一個(且不超過一個)對抗原具有特異性的抗原結合位點。
「抗原結合位點」係指抗原結合分子中提供與抗原之相互作用的位點，亦即一或多個胺基酸殘基。舉例而言，抗體之抗原結合位點包含來自互補決定區(CDR)的胺基酸殘基。原生免疫球蛋白分子通常具有兩個抗原結合位點，Fab分子通常具有單個抗原結合位點。
如本文所用，術語「抗原結合部分」係指特異性結合抗原決定子的多肽分子。在一個實施例中，抗原結合部分能夠使其所連接的實體(例如第二抗原結合部分)指向目標位點，例如攜帶抗原決定子的特定類型腫瘤細胞或腫瘤基質。在另一實施例中，抗原結合部分能夠經由其目標抗原(例如T細胞受體複合物抗原)活化信號傳導。抗原結合部分包括如本文進一步定義的抗體及其片段。特定抗原結合部分包括抗體之抗原結合域，包含抗體重鏈可變區及抗體輕鏈可變區。在某些實施例中，抗原結合部分可包含如本文進一步定義及此項技術中已知的抗體恆定區。適用的重鏈恆定區包括五種同型中的任一者：α、δ、ε、γ或μ。適用的輕鏈恆定區包括兩種同型中的任一者：κ及λ。
如本文所用，術語「抗原決定子」與「抗原」及「抗原決定基」同義且係指多肽大分子上與抗原結合部分結合，形成抗原結合部分-抗原複合物的位點(例如鄰近胺基酸區段或由非鄰近胺基酸之不同區域組成的構形組態)。適用的抗原決定子可發現於例如腫瘤細胞表面上、病毒所感染細胞之表面上、其他病變細胞表面上、免疫細胞表面上、游離於血清中及/或細胞外基質(ECM)中。除非另外指明，否則本文中稱為抗原的蛋白質(例如FolR1及CD3)可為來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠))之蛋白質的任何原生形式。在一特定實施例中，抗原為人類蛋白質。在本文中提及特定蛋白質的情況下，該術語涵蓋「全長」的未處理蛋白質，以及在細胞中處理所產生的任何形式之蛋白質。該術語亦涵蓋天然存在之蛋白質變異體，例如剪接變異體或對偶基因變異體。適用作抗原之例示性人類蛋白質包括(但不限於)：FolR1(葉酸受體α(FRA)；葉酸結合蛋白(FBP)；人類FolR1 UniProt編號：P15328；鼠類FolR1 UniProt編號：P35846；食蟹獼猴FolR1 UniProt編號：G7PR14)及CD3，特定言之CD3之ε亞單元(參見：關於人類序列， UniProt編號P07766(130版)，NCBI參考序列編號NP_000724.1，SEQ ID NO：150；或關於食蟹獼猴[食蟹猴(Macaca fascicularis)]序列，UniProt編號Q95LI5(49版)，NCBI GenBank編號BAB71849.1)。本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子結合至CD3之抗原決定基或來自不同物種之CD3或目標抗原中的保守目標細胞抗原。在某些實施例中，本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子結合至CD3及FolR1，但不結合至FolR2(葉酸受體β；FRB；人類FolR2 UniProt編號：P14207)或FolR3(葉酸受體γ；人類FolR3 UniProt編號：P41439)。
「特異性結合」意謂結合對於抗原而言具選擇性且可與非所需或非特異性相互作用區分。抗原結合部分結合至特定抗原決定子的能力可經由酶聯免疫吸附分析(ELISA)或熟習此項技術者熟悉的其他技術量測，例如表面電漿子共振(SPR)技術(在BIAcore儀器上分析)(Liljeblad等人，Glyco J 17,323-329(2000))及傳統結合分析(Heeley,Endocr Res 28,217-229(2002))。在一個實施例中，抗原結合部分與無關蛋白質結合的程度小於抗原結合部分與抗原之結合的約10%，如藉由例如SPR所量測。在某些實施例中，結合至抗原的抗原結合部分或包含該抗原結合部分的抗原結合分子具有
Figure 104138283-A0202-12-0024-699
1μM、
Figure 104138283-A0202-12-0024-700
100nM、
Figure 104138283-A0202-12-0024-701
10nM、
Figure 104138283-A0202-12-0024-702
1nM、
Figure 104138283-A0202-12-0024-703
0.1nM、
Figure 104138283-A0202-12-0024-704
0.01nM或
Figure 104138283-A0202-12-0024-705
0.001nM(例如10-8 M或小於10-8 M，例如10-8 M至10-13 M，例如10-9 M至10-13 M)的解離常數(KD )。
「親和力」係指分子(例如受體)之單一結合位點與其結合搭配物(例如配體)之間的非共價相互作用之總和的強度。除非另外指明，否則如本文所用，「結合親和力」係指反映結合對成員(例如抗原結合部分與抗原，或受體與其配體)之間的1：1相互作用的固有結合親和力。分子X對其搭配物Y的親和力一般可由解離常數(KD )表示，解離常數為解離速率常數與結合速率常數(分別為koff 與kon )之比率。因此，等 效親和力可包含不同速率常數，只要速率常數之比率保持相同即可。親和力可藉由此項技術中已知之沿用已久的方法來量測，包括本文所述之彼等方法。一種用於量測親和力之具體方法為表面電漿子共振(SPR)。
「減弱的結合」(例如與Fc受體之減弱的結合)係指對應相互作用的親和力降低，如藉由例如SPR所量測。為清楚起見，該術語亦包括親和力降低至零(或低於分析方法之偵測極限)，亦即相互作用完全消除。反之，「增強的結合」係指對應相互作用的結合親和力增強。
如本文所用，「T細胞活化」係指T淋巴細胞(特定言之，細胞毒性T淋巴細胞)的一或多種細胞反應，選自：增殖、分化、細胞激素分泌、細胞毒性效應分子釋放、細胞毒性活性及活化標誌物之表現。本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子能夠誘導T細胞活化。適於量測T細胞活化的分析在本文所述之技術中已知。
如本文所用，「目標細胞抗原」係指目標細胞(例如腫瘤細胞，諸如癌細胞或腫瘤基質細胞)表面上所呈遞的抗原決定子。特定言之，「目標細胞抗原」係指葉酸受體1。
如本文所用，當各類型部分超過一種時，為便於區別，關於抗原結合部分等使用術語「第一」及「第二」。使用此等術語並非希望賦予活化T細胞之雙特異性抗原結合分子以特定次序或取向，除非明確如此陳述。
「Fab分子」係指由免疫球蛋白之重鏈(「Fab重鏈」)之VH及CH1域及輕鏈(「Fab輕鏈」)之VL及CL域組成的蛋白質。
如本文所用之術語「具有一致的VLCL輕鏈的Fab分子」係指共用一個輕鏈但仍然具有獨立特異性的結合子，例如可結合CD3或FolR1。在一些實施例中，活化T細胞之雙特異性分子包含至少兩個具有一致的VLCL輕鏈之Fab分子。對應重鏈經重構且賦予分別對活化T 細胞之雙特異性抗原CD3及目標細胞抗原FolR1的特異性結合。
「融合」意謂各組分(例如Fab分子及Fc域亞單元)經肽鍵直接連接，或經由一或多個肽連接子連接。
如本文所用，術語「單鏈」係指包含胺基酸單體經肽鍵線性連接而成的分子。在某些實施例中，抗原結合部分中之一者為單鏈Fab分子，亦即其中Fab輕鏈及Fab重鏈經肽連接子連接形成單一肽鏈的Fab分子。在一特定的此類實施例中，在單鏈Fab分子中，Fab輕鏈之C端連接至Fab重鏈之N端。
「互換型(crossover)」Fab分子(亦稱為「互換Fab(Crossfab)」意指其中Fab重鏈及輕鏈之可變區或恆定區發生交換的Fab分子，亦即互換型Fab分子包含由輕鏈可變區及重鏈恆定區構成的肽鏈及由重鏈可變區及輕鏈恆定區構成的肽鏈。為清楚起見，在其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變區發生交換的互換型Fab分子中，包含重鏈恆定區之肽鏈在本文中稱為互換型Fab分子之「重鏈」。反之，在其中Fab輕鏈及Fab重鏈之恆定區發生交換的互換型Fab分子中，包含重鏈可變區之肽鏈在本文中稱為互換型Fab分子之「重鏈」。包含一或多個互換Fab之抗體在本文中稱為「互換單抗(CrossMab)」。
與此相反，「習知」Fab分子意指呈其天然格式之Fab分子，亦即包含由重鏈可變區及恆定區(VH-CH1)構成的重鏈及由輕鏈可變區及恆定區(VL-CL)構成的輕鏈。術語「免疫球蛋白分子」係指具有天然存在之抗體之結構的蛋白質。舉例而言，IgG類免疫球蛋白為約150,000道爾頓(dalton)之雜四聚體糖蛋白，其由兩條輕鏈及兩條重鏈經二硫鍵鍵結而構成。自N端至C端，各重鏈具有可變區(VH)，亦稱為可變重鏈域或重鏈可變域；繼之為三個恆定域(CH1、CH2及CH3)，亦稱為重鏈恆定區。類似地，自N端至C端，各輕鏈具有可變區(VL)，亦稱為可變輕鏈域或輕鏈可變區；繼之為恆定輕鏈(CL)域， 亦稱為輕鏈恆定區。免疫球蛋白之重鏈可歸為五種類型中之一者，該五種類型稱為α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM)，其中一些可進一步分成亞型，例如γ1 (IgG1 )、γ2 (IgG2 )、γ3 (IgG3 )、γ4 (IgG4 )、α1 (IgA1 )及α2 (IgA2 )。免疫球蛋白之輕鏈基於其恆定域之胺基酸序列可歸為兩種類型中之一者，該兩種類型稱為卡帕(kappa；κ)及拉姆達(lambda；λ)。免疫球蛋白基本上由兩個Fab分子及一個Fc域經由免疫球蛋白鉸鏈區連接而組成。
術語「抗體」在本文中以最廣泛意義使用且涵蓋各種抗體結構，包括(但不限於)單株抗體、多株抗體及抗體片段，只要其展現所要抗原結合活性即可。
「抗體片段」係指不同於完整抗體，包含完整抗體之一部分，結合完整抗體所結合之抗原的分子。抗體片段之實例包括(但不限於)Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2 、雙功能抗體、線性抗體、單鏈抗體分子(例如scFv)及單域抗體。關於某些抗體片段之綜述，參見Hudson等人，Nat Med 9,129-134(2003)。關於scFv片段之綜述，參見例如Plückthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg及Moore編，Springer-Verlag,New York，第269-315頁(1994)；亦參見WO 93/16185；及美國專利第5,571,894號及第5,587,458號。關於包含救助受體結合抗原決定基殘基且具有延長之活體內半衰期之Fab及F(ab')2 片段的論述，參見美國專利第5,869,046號。雙功能抗體為可為二價或雙特異性之具有兩個抗原結合位點之抗體片段。參見例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat Med 9,129-134(2003)；及Hollinger等人，Proc Natl Acad Sci USA 90,6444-6448(1993)。三功能抗體及四功能抗體亦描述於Hudson等人，Nat Med 9,129-134(2003)中。單域抗體為包含抗體之重鏈可變域之全部或一部分或輕鏈可變域之全部或一部分的抗體片段。在某些實施 例中，單域抗體為人類單域抗體(Domantis,Inc.,Waltham,MA；參見例如美國專利第6,248,516 B1號)。抗體片段可藉由各種技術製得，包括(但不限於)蛋白分解消化完整抗體以及藉由重組宿主細胞(例如大腸桿菌(E.coli)或噬菌體)產生，如本文所述。
術語「抗原結合域」係指抗體中包含特異性結合至抗原之一部分或全部且與之互補的區域的部分。抗原結合域可由例如一或多個抗體可變域(亦稱為抗體可變區)提供。特定言之，抗原結合域包含抗體輕鏈可變區(VL)及抗體重鏈可變區(VH)。
術語「可變區」或「可變域」係指抗體重鏈或輕鏈中參與抗體與抗原之結合的結構域。原生抗體之重鏈及輕鏈(分別為VH及VL)可變域一般具有類似的結構，其中各域包含四個保守性構架區(FR)及三個高變區(HVR)。參見例如Kindt等人，Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91頁(2007)。單一VH或VL域可足以賦予抗原結合特異性。
如本文所用，術語「高變區」或「HVR」係指抗體可變域中在序列上具有高變性及/或形成結構限定環(「高變環」)的各區域。一般而言，原生四鏈抗體包含六個HVR；三個位於VH中(H1、H2、H3)，且三個位於VL中(L1、L2、L3)。HVR一般包含來自高變環及/或來自互補決定區(CDR)的胺基酸殘基，後者具有最高的序列可變性及/或參與抗原識別。除VH中之CDR1之外，CDR一般包含形成高變環的胺基酸殘基。高變區(HVR)亦稱為「互補決定區」(CDR)，且此等術語在本文中、在提及形成抗原結合區之可變區之部分時可互換使用。此特定區域已由Kabat等人，U.S.Dept.of Health and Human Services,Sequences of Proteins of Immunological Interest(1983)及Chothia等人，J Mol Biol 196：901-917(1987)描述，其中各定義在彼此比較時包括胺基酸殘基之重疊或子集。然而，涉及抗體或其變異體之CDR之任何定 義的應用意欲處於如本文所定義及所用之術語的範疇內。涵蓋如上文所引用之參考文獻中之每一者所定義之CDR的適當胺基酸殘基闡述於下表A中作為比較。涵蓋特定CDR的確切殘基數目將視CDR之序列及大小而變。在抗體之可變區胺基酸序列指定的情況下，熟習此項技術者可以常規方式確定哪些殘基包含特定CDR。
Figure 104138283-A0202-12-0029-1
1 表A中之所有CDR定義之編號均根據Kabat等人所闡述之編號約定(參見下文)。
2 如表A中所用之含有小寫「b」的「AbM」係指如由Oxford Molecular之「AbM」抗體模型化軟體所定義的CDR。
Kabat等人亦定義適用於任何抗體的可變區序列編號系統。一般技術者可將此「Kabat編號」系統明確地分配給任何可變區序列，而不依賴於超過序列本身的任何實驗資料。如本文所用，「Kabat編號」係指由Kabat等人，U.S.Dept.of Health and Human Services,「Sequence of Proteins of Immunological Interest」(1983)所闡述之編號系統。除非另外說明，否則提及抗體可變區中之特定胺基酸殘基位置的編號係根據Kabat編號系統。
序列表之多肽序列並非根據Kabat編號系統編號。然而，將序列表之序列編號轉換為Kabat編號完全屬於熟習此項技術者之普通技能範圍內。
「構架」或「FR」係指除高變區(HVR)殘基之外的可變域殘基。可變域之FR通常由四個FR域組成：FR1、FR2、FR3及FR4。因此， 在VH(或VL)中，HVR及FR序列通常按以下次序出現：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
抗體或免疫球蛋白之「類別」係指其重鏈所具有之恆定域或恆定區的類型。存在五種主要類別之抗體：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且此等類別中之若干者可進一步分成子類(同型)，例如IgG1 、IgG2 、IgG3 、IgG4 、IgA1 及IgA2 。對應於不同類別之免疫球蛋白之重鏈恆定域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。
本文術語「Fc域」或「Fc區」用於定義含有恆定區之至少一部分的免疫球蛋白重鏈之C端區。該術語包括原生序列Fc區及變異體Fc區。雖然IgG重鏈之Fc區的邊界可能稍微變化，但人類IgG重鏈Fc區通常定義為自Cys226或自Pro230延伸至重鏈之羧基端。然而，Fc區之C端離胺酸(Lys447)可存在或可不存在。除非本文另外說明，否則Fc區或恆定區中胺基酸殘基之編號係根據EU編號系統，亦稱為EU索引，如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述。如本文所用，Fc域之「亞單元」係指形成二聚Fc域之兩個多肽中之一者，亦即包含免疫球蛋白重鏈之C端恆定區的多肽，其能夠穩定的自結合。舉例而言，IgG Fc域之亞單元包含IgG CH2及IgG CH3恆定域。
「促進Fc域之第一及第二亞單元之結合的修飾」為肽主鏈之操縱或Fc域亞單元之轉譯後修飾，從而減少或阻止包含Fc域亞單元之多肽與一致多肽結合形成均二聚體。如本文所用之促進結合之修飾特定言之包括對希望結合之兩個Fc域亞單元(亦即Fc域之第一及第二亞單元)中之每一者所做的單獨修飾，其中該等修飾彼此互補，以便促進兩個Fc域亞單元之結合。舉例而言，促進結合之修飾可改變Fc域亞單元中之一或兩者的結構或電荷以便使其結合在空間上或在靜電上分別 為有利的。因此，在包含第一Fc域亞單元之多肽與包含第二Fc域亞單元之多肽之間發生(雜)二聚，就與該等亞單元中之每一者融合的其他組分(例如抗原結合部分)不相同而言，(雜)二聚可能為非一致的。在一些實施例中，促進結合之修飾包含Fc域中之胺基酸突變，特定言之胺基酸取代。在一特定實施例中，促進結合之修飾包含Fc域之兩個亞單元中之每一者中的各別胺基酸突變，特定言之胺基酸取代。
術語「效應功能」係指可歸因於抗體之Fc區之彼等生物活性，其因抗體同型而異。抗體效應功能之實例包括：C1q結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)、Fc受體結合、抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞吞噬(ADCP)、細胞激素分泌、免疫複合物介導抗原呈遞細胞攝入抗原、細胞表面受體(例如B細胞受體)下調及B細胞活化。
如本文所用，術語「工程改造(engineer/engineered/engineering)」視為包括任何肽主鏈操縱或天然存在或重組多肽或其片段之轉譯後修飾。工程改造包括胺基酸序列、糖基化模式或個別胺基酸之側鏈基團之修飾，以及此等方法之組合。
如本文所用，術語「胺基酸突變」意欲涵蓋胺基酸取代、缺失、插入及修飾。取代、缺失、插入及修飾可進行任意組合以獲得最終構築體，其限制條件為最終構築體具有所要特徵，例如與Fc受體之結合減弱，或與另一肽之結合增強。胺基酸序列缺失及插入包括胺基酸之胺基端及/或羧基端缺失及插入。特定胺基酸突變為胺基酸取代。出於改變例如Fc區之結合特徵之目的，非保守性胺基酸取代，亦即一個胺基酸經具有不同結構及/或化學性質的另一胺基酸置換為尤其較佳的。胺基酸取代包括經非天然存在之胺基酸置換或經二十種標準胺基酸之天然存在之胺基酸衍生物(例如4-羥基脯胺酸、3-甲基組胺酸、鳥胺酸、高絲胺酸、5-羥基離胺酸)置換。胺基酸突變可使用此 項技術中熟知之遺傳學或化學方法產生。遺傳學方法可包括定點突變誘發、PCR、基因合成及其類似方法。預期藉由除遺傳學工程改造之外的方法(諸如化學修飾)改變胺基酸側鏈基團的方法亦可為適用的。本文中可使用不同名稱表示相同的胺基酸突變。舉例而言，Fc域之位置329之脯胺酸取代為甘胺酸可以329G、G329、G329 、P329G或Pro329Gly表示。
如本文所用，術語「多肽」係指由單體(胺基酸)經醯胺鍵(亦稱為肽鍵)線性連接而構成之分子。術語「多肽」係指兩個或兩個以上胺基酸之任何鏈，且並非指產物之特定長度。因此，「多肽」之定義內包括肽、二肽、三肽、寡肽、「蛋白質」、「胺基酸鏈」或用於指兩個或兩個以上胺基酸之鏈的任何其他術語，且可使用術語「多肽」替代此等術語中的任一者，或術語「多肽」可與此等術語中的任一者互換使用。術語「多肽」亦意指多肽之表現後修飾產物，包括(但不限於)糖基化、乙醯化、磷酸化、醯胺化、藉由已知保護/阻斷基團衍生化、蛋白水解分裂或藉由非天然存在之胺基酸修飾。多肽可衍生自天然生物學來源或藉由重組技術製得，但不一定自指定的核酸序列轉譯而成。其可以任何方式產生，包括化學合成。本發明多肽之大小可為約3個或超過3個、5個或超過5個、10個或超過10個、20個或超過20個、25個或超過25個、50個或超過50個、75個或超過75個、100個或超過100個、200個或超過200個、500個或超過500個、1,000個或超過1,000個、或2,000個或超過2,000個胺基酸。多肽可具有定義的三維結構，但其不一定具有此類結構。具有定義之三維結構的多肽稱為摺疊，且不具有定義之三維結構，而是可採用許多不同構形的多肽稱為展開。
「經分離」多肽或其變異體或衍生物意指不處於天然環境下的多肽。不需要特定的純化程度。舉例而言，經分離多肽可自其原生或 天然環境中轉移。出於本發明之目的，宿主細胞中所表現之重組產生型多肽及蛋白質視為經分離，已藉由任何適合技術分離、分級分離或部分或實質上純化的原生或重組多肽亦視為經分離。
相對於參考多肽序列之「胺基酸序列一致性百分比(%)」定義為在比對序列且引入空位(若需要)以達到最大序列一致性百分比之後，候選序列中之與參考多肽序列胺基酸殘基一致的胺基酸殘基的百分比，且任何保守性取代不視為序列一致性之一部分。出於測定胺基酸序列一致性百分比之目的的比對可以此項技術之技能範圍內之多種方式達成，例如使用公開可獲得之電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。熟習此項技術者可確定適用於比對序列之參數，包括在所比較序列之全長內達成最大比對所需的任何算法。然而，出於本文之目的，使用序列比較電腦程式ALIGN-2產生胺基酸序列一致性%值。ALIGN-2序列比較電腦程式由Genentech,Inc.創作，且原始程式碼已在U.S.Copyright Office,Washington D.C.,20559申請用戶文檔，其在此註冊在美國版權註冊第TXU510087號下。ALIGN-2程式可公開獲自Genentech,Inc.,South San Francisco,California，或可自原始程式碼編寫。ALIGN-2程式經編寫可用於UNIX操作系統，包括數位UNIX V4.0D。所有序列比較參數由ALIGN-2程式設定且不變化。在採用ALIGN-2進行胺基酸序列比較之情形下，給定胺基酸序列A與給定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性%(或者，其可表述為與給定胺基酸序列B具有或包含一定胺基酸序列一致性%的給定胺基酸序列A)如下計算：100乘分數X/Y
其中X為在A與B之程式比對中藉由序列比對程式ALIGN-2評為一致匹配之胺基酸殘基的數目，且其中Y為B中之胺基酸殘基的總數目。應瞭解，在胺基酸序列A之長度與胺基酸序列B之長度不相等之 情況下，A相對於B之胺基酸序列一致性%與B相對於A之胺基酸序列一致性%將不相等。除非另外特定陳述，否則本文所用之所有胺基酸序列一致性%值係如前一段落中剛剛所述使用ALIGN-2電腦程式獲得。
術語「聚核苷酸」係指經分離核酸分子或構築體，例如信使RNA(mRNA)、病毒源性RNA或質體DNA(pDNA)。聚核苷酸可包含習知磷酸二酯鍵或非習知鍵(例如醯胺鍵，諸如肽核酸(PNA)中所發現)。術語「核酸分子」係指聚核苷酸中存在的任一或多個核酸區段，例如DNA或RNA片段。「經分離」核酸分子或聚核苷酸意指已自原生環境中轉移的核酸分子、DNA或RNA。舉例而言，出於本發明之目的，編碼載體中所含之多肽的重組聚核苷酸視為經分離。經分離聚核苷酸之其他實例包括異源宿主細胞中所維持的重組聚核苷酸或溶液中之經純化(部分或實質上)之聚核苷酸。經分離聚核苷酸包括通常含有聚核苷酸分子之細胞中所含的聚核苷酸分子，但聚核苷酸分子存在於染色體外或不同於其天然染色體位置之染色體位置。經分離RNA分子包括本發明的活體內或活體外RNA轉錄物，以及正股及負股形式，及雙股形式。本發明之經分離聚核苷酸或核酸進一步包括以合成方式產生的此類分子。另外，聚核苷酸或核酸可為或可包括調節元件，諸如啟動子、核糖體結合位點或轉錄終止子。
一種核酸或聚核苷酸的核苷酸序列與本發明之參考核苷酸序列至少例如95%「一致」意指該聚核苷酸之核苷酸序列與參考序列一致，但該聚核苷酸序列相對於參考核苷酸序列可每100個核苷酸中包括至多五個點突變。換言之，為獲得核苷酸序列與參考核苷酸序列至少95%一致的聚核苷酸，參考序列中至多5%的核苷酸可缺失或經另一核苷酸取代，或參考序列中可插入佔參考序列核苷酸總數至多5%的多個核苷酸。參考序列之此等改變可發生於參考核苷酸序列之5'或3' 端位置或彼等末端位置之間的任何位置，此等位置個別地穿插於參考序列殘基中或參考序列內的一或多個鄰近基團中。實際來看，任何特定聚核苷酸序列是否與本發明之核苷酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致可習知地使用已知電腦程式確定，諸如上文針對多肽所論述的電腦程式(例如ALIGN-2)。
術語「表現卡匣」係指以重組或合成方式產生的聚核苷酸，其具有允許目標細胞中之特定核酸發生轉錄的一系列特定核酸元件。重組表現卡匣可併入質體、染色體、粒線體DNA、質體DNA、病毒或核酸片段中。通常，表現載體之重組表現卡匣部分包括待轉錄的核酸序列及啟動子，以及其他序列。在某些實施例中，本發明之表現卡匣包含編碼本發明之雙特異性抗原結合分子或其片段的聚核苷酸序列。
術語「載體」或「表現載體」與「表現構築體」同義且係指用於引入特定基因且引導該基因表現的DNA分子，該DNA分子與該基因在目標細胞中可操作地連接。該術語包括作為自我複製核酸結構之載體以及併入其已引入之宿主細胞之基因組中的載體。本發明之表現載體包含表現卡匣。表現載體允許大量的穩定mRNA發生轉錄。一旦表現載體進入目標細胞內，則藉由細胞轉錄及/或轉譯機構產生由該基因編碼的核糖核酸分子或蛋白質。在一個實施例中，本發明之表現載體包含表現卡匣，該表現卡匣包含編碼本發明之雙特異性抗原結合分子或其片段的聚核苷酸序列。
術語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及「宿主細胞培養物」可互換使用且係指已引入外源核酸之細胞，包括此類細胞之後代。宿主細胞包括「轉型體」及「轉型細胞」，其包括初級轉型細胞及自其衍生之後代(不考慮繼代次數)。後代之核酸含量與親代細胞可能不完全相同，而是可能含有突變。本文包括所篩選或選擇之與最初轉型細胞具有相同功能或生物活性的突變型後代。宿主細胞為可用於產生本發明 之雙特異性抗原結合分子的任何類型之細胞系統。宿主細胞包括培養細胞，例如哺乳動物培養細胞，諸如CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髓瘤細胞、P3X63小鼠骨髓瘤細胞、PER細胞、PER.C6細胞或融合瘤細胞、酵母細胞、昆蟲細胞及植物細胞(僅舉數例)，而且包括轉殖基因動物、轉殖基因植物或培養植物或動物組織內所含的細胞。
「活化Fc受體」為在與抗體Fc域接合之後，引發信號傳導事件，刺激攜帶受體之細胞執行效應功能的Fc受體。人類活化Fc受體包括FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)及FcαRI(CD89)。
抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)為促使免疫效應細胞溶解塗有抗體之目標細胞的免疫機制。目標細胞為包含Fc區之抗體或其衍生物特異性結合(一般經由Fc區N端之蛋白質部分結合)的細胞。如本文所使用，術語「降低之ADCC」定義為在圍繞目標細胞之介質中、在指定的抗體濃度下、在指定時間內、藉由上文所定義之ADCC機制溶解之目標細胞的數目減少，及/或在圍繞目標細胞之介質中，在指定時間內藉由ADCC機制達成指定數目個目標細胞溶解所需的抗體濃度增加。ADCC降低係相對於由同類型宿主細胞使用相同的標準生產、純化、調配及儲存方法(熟習此項技術者已知)所產生、但尚未經工程改造之相同抗體介導的ADCC而言。舉例而言，Fc域中包含降低ADCC之胺基酸取代的抗體所介導之ADCC降低係相對於Fc域中無此胺基酸取代之相同抗體所介導的ADCC而言。適於量測ADCC的分析在此項技術中已熟知(參見例如PCT公開案第WO 2006/082515號或PCT公開案第WO 2012/130831號)。
藥劑之「有效量」係指在所投與之細胞或組織中產生生理變化所需的量。
藥劑(例如醫藥組合物)之「治療有效量」係指在必需劑量下且在必需時間內可有效達成所需治療或預防結果之量。舉例而言，治療有效量之藥劑消除、減少、延遲、最小化或預防疾病副作用。
「個體(individual)」或「個體(subject)」為哺乳動物。哺乳動物包括(但不限於)馴養動物(例如牛、綿羊、貓、狗及馬)、靈長類動物(例如人類及非人類靈長類動物，諸如猴)、兔及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠)。特定言之，個體為人類。
術語「醫藥組合物」係指所呈形式允許其中所含活性成分之生物活性有效發揮的製劑，且其不含對調配物將投與之個體具有不可接受毒性之其他組分。
「醫藥學上可接受之載劑」係指醫藥組合物中除活性成分之外的對個體無毒的成分。醫藥學上可接受之載劑包括(但不限於)緩衝液、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
如本文所用，「治療(treatment)」(及其文法變化形式，諸如「治療(treat)」或「治療(treating)」)係指試圖改變所治療個體之疾病之自然過程的臨床介入且可出於預防或在臨床病理學過程中進行。所需治療作用包括(但不限於)預防疾病發生或復發、緩解症狀、減輕疾病之任何直接或間接病理性後果、預防轉移、降低疾病進展速率、改善或緩和疾病病況及緩解或改善預後。在一些實施例中，本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子用於延遲疾病發展或減緩疾病進展。
術語「拮抗劑」係以最廣泛含義使用，且包括任何部分或完全阻斷、抑制或中和本文所揭示之原生多肽之生物活性的分子。以類似方式，術語「促效劑」係以最廣泛含義使用且包括任何誘導本文所揭示之原生多肽之生物活性的分子。適合促效劑或拮抗劑分子特定言之包括促效劑或拮抗劑抗體或抗體片段，包括經工程改造之抗體片段、原生多肽之片段或胺基酸序列變異體、肽、反義寡核苷酸、小有機分 子等。用於鑑別多肽之促效劑或拮抗劑之方法可包含使多肽與候選促效劑或拮抗劑分子接觸且量測通常與多肽相關之一或多種生物活性之可偵測變化。
術語「藥品說明書」用於指通常包括於治療性產品之商業包裝中之說明書，其含有關於與使用該等治療性產品有關之適應症、用法、劑量、投與、組合療法、禁忌及/或警告之資訊。
本文揭示之所有參考文獻、公開案、專利及專利申請案均以全文引用的方式併入本文中。
實施例之詳細說明
本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子為雙特異性的，亦即其包含至少兩個能夠特異性結合至兩個不同抗原決定子(亦即CD3及FolR1)的抗原結合部分。根據本發明，抗原結合部分為Fab分子(亦即由重鏈及輕鏈構成之抗原結合域，該重鏈及輕鏈各自包含可變區及恆定區)。在一個實施例中，該等Fab分子為人類Fab分子。在另一實施例中，該等Fab分子為人類化Fab分子。在又另一實施例中，該等Fab分子包含人類重鏈及輕鏈恆定區。
本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子能夠同時結合至目標細胞抗原FolR1及CD3。在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子能夠藉由同時結合至目標細胞抗原FolR1及CD3而使T細胞與表現FolR1之目標細胞交聯。在甚至更特定實施例中，此同時結合引起表現FolR1之目標細胞、特定言之表現FolR1之腫瘤細胞溶解。在一個實施例中，此同時結合引起T細胞活化。在其他實施例中，此同時結合引起T淋巴細胞(特定言之，細胞毒性T淋巴細胞)之細胞反應，細胞反應選自以下之群組：增殖、分化、細胞激素分泌、細胞毒性效應分子釋放、細胞毒活性及活化標誌物之表現。在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子與CD3結合但不同時結合至目標細 胞抗原FolR1不會引起T細胞活化。
在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子能夠使T細胞之細胞毒活性再定向於表現FolR1之目標細胞。在一特定實施例中，該再定向不依賴於MHC介導目標細胞呈遞肽抗原及/或T細胞之特異性。
特定言之，根據一些本發明實施例的T細胞為細胞毒性T細胞。在一些實施例中，T細胞為CD4+ 或CD8+ T細胞，特定言之CD8+ T細胞。
本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含至少一個能夠結合至CD3之抗原結合部分(在本文中亦稱為「CD3抗原結合部分」或「第一抗原結合部分」)。在一特定實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含不超過一個能夠特異性結合至CD3之抗原結合部分。在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子提供單價結合至CD3。在一特定實施例中，CD3為人類CD3或食蟹獼猴CD3，尤其最佳為人類CD3。在一特定實施例中，CD3抗原結合部分可與人類及食蟹獼猴CD3交叉反應(亦即特異性結合)。在一些實施例中，第一抗原結合部分能夠特異性結合至CD3之ε亞單元(參見：關於人類序列，UniProt編號P07766(130版)，NCBI參考序列編號NP_000724.1，SEQ ID NO：150；關於食蟹獼猴[食蟹猴]序列，UniProt編號Q95LI5(49版)，NCBI GenBank編號BAB71849.1)。
在一些實施例中，CD3抗原結合部分包含至少一個選自由SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38及SEQ ID NO：39組成之群的重鏈互補決定區(CDR)及至少一個選自SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34之群的輕鏈CDR。
在一個實施例中，CD3抗原結合部分包含SEQ ID NO：37之重鏈CDR1、SEQ ID NO：38之重鏈CDR2、SEQ ID NO：39之重鏈CDR3、 SEQ ID NO：32之輕鏈CDR1、SEQ ID NO：33之輕鏈CDR2及SEQ ID NO：34之輕鏈CDR3。
在一個實施例中，CD3抗原結合部分包含含SEQ ID NO：36之胺基酸序列的可變重鏈及含SEQ ID NO：31之胺基酸序列的可變輕鏈。
在一個實施例中，CD3抗原結合部分包含與SEQ ID NO：36至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的重鏈可變區序列及與SEQ ID NO：31至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的輕鏈可變區序列。
本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含至少一個能夠結合至目標細胞抗原FolR1之抗原結合部分(在本文中亦稱為「FolR1結合部分」或「第二」或「第三」抗原結合部分)。在一個實施例中，能夠結合至目標細胞抗原FolR1之抗原結合部分不結合至FolR2或FolR3。在一特定實施例中，FolR1抗原結合部分可與人類及食蟹獼猴FolR1交叉反應(亦即特異性結合)。在某些實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含兩個能夠結合至目標細胞抗原FolR1之抗原結合部分。在一特定的此類實施例中，此等抗原結合部分中之每一者特異性結合至相同抗原決定子。在一甚至更特定實施例中，所有此等抗原結合部分為一致的。在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含不超過兩個能夠結合至FolR1之抗原結合部分。
FolR1結合部分通常為特異性結合至FolR1且能夠使其所連接之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子定向於目標位點的Fab分子，該目標位點例如表現FolR1之特定類型的腫瘤細胞。
在一個態樣中，本發明提供一種活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其包含(i)第一抗原結合部分，其為能夠特異性結合至CD3之Fab分子，且其包含至少一個選自由SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38及SEQ ID NO：39組成之群的重鏈互補決定區(CDR)及至少一個選自SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34之群的輕鏈CDR；及(ii)第二抗原結合部分，其為能夠特異性結合至葉酸受體1(FolR1)之Fab分子。
在一個實施例中，作為能夠特異性結合至CD3之Fab分子的第一抗原結合部分包含含SEQ ID NO：36之胺基酸序列的可變重鏈及含SEQ ID NO：31之胺基酸序列的可變輕鏈。
在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子另外包含(iii)第三抗原結合部分，其為能夠特異性結合至FolR1之Fab分子。
在一個此類實施例中，能夠特異性結合至FolR1之第二及第三抗原結合部分包含一致的重鏈互補決定區(CDR)及輕鏈CDR序列。在一個此類實施例中，第三抗原結合部分與第二抗原結合部分一致。
在一個實施例中，以上實施例中之任一者的活化T細胞之雙特異性抗原結合分子另外包含由能夠穩定結合之第一及第二亞單元構成的Fc域。
在一個實施例中，第一抗原結合部分及第二抗原結合部分各自在Fab重鏈之C端融合至Fc域之第一或第二亞單元之N端。
在一個實施例中，第三抗原結合部分在Fab重鏈之C端視情況經由肽連接子融合至第一抗原結合部分之Fab重鏈的N端。
在另一特定實施例中，在活化T細胞之雙特異性抗原結合分子中存在不超過一個能夠特異性結合至CD3之抗原結合部分(亦即，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子提供單價結合至CD3)。
含共同輕鏈之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子
本發明之發明人產生一種雙特異性抗體，其中結合部分共用保留親本單特異性抗體針對CD3之特異性及功效的共同輕鏈且可使用同 一輕鏈結合第二抗原(例如，FolR1)。共同輕鏈保留有親本抗體之結合性質的雙特異性分子之產生並非直接的，因為雜合輕鏈之共同CDR必須實現針對兩個目標之結合特異性。在一個態樣中，本發明提供一種活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其包含第一及第二抗原結合部分，其中一者為能夠特異性結合至CD3之Fab分子且另一者為能夠特異性結合至FolR1之Fab分子，其中該第一及該第二Fab分子具有一致的VLCL輕鏈。在一個實施例中，該一致輕鏈(VLCL)包含SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33及SEQ ID NO：34之輕鏈CDR。在一個實施例中，該一致輕鏈(VLCL)包含SEQ ID NO：35。
在一個實施例中，本發明提供一種活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其包含(i)第一抗原結合部分，其為能夠特異性結合至CD3之Fab分子，且其包含至少一個選自由SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38及SEQ ID NO：39組成之群的重鏈互補決定區(CDR)及至少一個選自SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34之群的輕鏈CDR；(ii)第二抗原結合部分，其為能夠特異性結合至葉酸受體1(FolR1)之Fab分子，且其包含至少一個選自由SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18組成之群的重鏈互補決定區(CDR)及至少一個選自SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34之群的輕鏈CDR。
在一個此類實施例中，CD3抗原結合部分包含SEQ ID NO：37之重鏈CDR1、SEQ ID NO：38之重鏈CDR2、SEQ ID NO：39之重鏈CDR3、SEQ ID NO：32之輕鏈CDR1、SEQ ID NO：33之輕鏈CDR2及SEQ ID NO：34之輕鏈CDR3，且FolR1抗原結合部分包含SEQ ID NO：16之重鏈CDR1、SEQ ID NO：17之重鏈CDR2、SEQ ID NO：18之重鏈CDR3、SEQ ID NO：32之輕鏈CDR1、SEQ ID NO：33之輕鏈CDR2及 SEQ ID NO：34之輕鏈CDR3。
在一個實施例中，本發明提供一種活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其包含
(i)第一抗原結合部分，其為能夠特異性結合至CD3之Fab分子，包含含SEQ ID NO：36之胺基酸序列的可變重鏈及含SEQ ID NO：31之胺基酸序列的可變輕鏈。
(ii)第二抗原結合部分，其為能夠特異性結合至葉酸受體1(FolR1)之Fab分子，包含含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的可變重鏈及含SEQ ID NO：31之胺基酸序列的可變輕鏈。
在一個實施例中，本發明提供一種活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其包含(i)第一抗原結合部分，其為能夠特異性結合至CD3之Fab分子，且其包含至少一個選自由SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38及SEQ ID NO：39組成之群的重鏈互補決定區(CDR)及至少一個選自SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34之群的輕鏈CDR；(ii)第二抗原結合部分，其為能夠特異性結合至葉酸受體1(FolR1)之Fab分子，且其包含至少一個選自由SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：275及SEQ ID NO：315組成之群的重鏈互補決定區(CDR)及至少一個選自SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34之群的輕鏈CDR。
在一個實施例中，本發明提供一種活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其包含(i)第一抗原結合部分，其為能夠特異性結合至CD3之Fab分子，且其包含SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38及SEQ ID NO：39之重鏈互補決定區(CDR)胺基酸序列及SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33及SEQ ID NO：34之輕鏈CDR胺基酸序列； (ii)第二抗原結合部分，其為能夠特異性結合至葉酸受體1(FolR1)之Fab分子且其包含SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：275及SEQ ID NO：315之重鏈互補決定區(CDR)胺基酸序列及SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33及SEQ ID NO：34之輕鏈CDR胺基酸序列。
在一個實施例中，本發明提供一種活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其包含(i)第一抗原結合部分，其為能夠特異性結合至CD3之Fab分子，包含含SEQ ID NO：36之胺基酸序列的可變重鏈及含SEQ ID NO：31之胺基酸序列的可變輕鏈；(ii)第二抗原結合部分，其為能夠特異性結合至葉酸受體1(FolR1)之Fab分子，包含含SEQ ID NO：274之胺基酸序列的可變重鏈及含SEQ ID NO：31之胺基酸序列的可變輕鏈。
在一個實施例中，本發明提供一種活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其包含
(i)第一抗原結合部分，其為能夠特異性結合至CD3之Fab分子，包含含SEQ ID NO：36之胺基酸序列的可變重鏈及含SEQ ID NO：31之胺基酸序列的可變輕鏈。
(ii)第二抗原結合部分，其為能夠特異性結合至葉酸受體1(FolR1)之Fab分子，包含含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的可變重鏈及含SEQ ID NO：31之胺基酸序列的可變輕鏈。
在另一實施例中，對FolR1具有特異性的抗原結合部分包含與SEQ ID NO：15至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的重鏈可變區序列及與SEQ ID NO：31至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的輕鏈可變區序列或其保留功能之變異體。
在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含與SEQ ID NO：36至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的多 肽序列、與SEQ ID NO：15至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的多肽序列及與SEQ ID NO：31至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的多肽序列。
在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子另外包含 (iii)能夠特異性結合至FolR1之第三抗原結合部分(其為Fab分子)。
在一個此類實施例中，能夠特異性結合至FolR1之第二及第三抗原結合部分包含一致的重鏈互補決定區(CDR)及輕鏈CDR序列。在一個此類實施例中，第三抗原結合部分與第二抗原結合部分一致。
因此，在一個實施例中，本發明提供一種活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其包含
(i)第一抗原結合部分，其為能夠特異性結合至CD3之Fab分子，且其包含至少一個選自由SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38及SEQ ID NO：39組成之群的重鏈互補決定區(CDR)及至少一個選自SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34之群的輕鏈CDR；
(ii)第二抗原結合部分，其為能夠特異性結合至葉酸受體1(FolR1)之Fab分子，且其包含至少一個選自由SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18組成之群的重鏈互補決定區(CDR)及至少一個選自SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34之群的輕鏈CDR。
(iii)第三抗原結合部分，其為能夠特異性結合至葉酸受體1(FolR1)之Fab分子，且其包含至少一個選自由SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18組成之群的重鏈互補決定區(CDR)及至少一個選自SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34之群的輕鏈CDR。
在一個此類實施例中，CD3抗原結合部分包含SEQ ID NO：37之 重鏈CDR1、SEQ ID NO：38之重鏈CDR2、SEQ ID NO：39之重鏈CDR3、SEQ ID NO：32之輕鏈CDR1、SEQ ID NO：33之輕鏈CDR2及SEQ ID NO：34之輕鏈CDR3，且FolR1抗原結合部分包含SEQ ID NO：16之重鏈CDR1、SEQ ID NO：17之重鏈CDR2、SEQ ID NO：18之重鏈CDR3、SEQ ID NO：32之輕鏈CDR1、SEQ ID NO：33之輕鏈CDR2及SEQ ID NO：34之輕鏈CDR3。
在一個實施例中，本發明提供一種活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其包含
(i)第一抗原結合部分，其為能夠特異性結合至CD3之Fab分子，包含含SEQ ID NO：36之胺基酸序列的可變重鏈及含SEQ ID NO：31之胺基酸序列的可變輕鏈。
(ii)第二抗原結合部分，其為能夠特異性結合至葉酸受體1(FolR1)之Fab分子，包含含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的可變重鏈及含SEQ ID NO：31之胺基酸序列的可變輕鏈。
(iii)第三抗原結合部分，其為能夠特異性結合至葉酸受體1(FolR1)之Fab分子，包含含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的可變重鏈及含SEQ ID NO：31之胺基酸序列的可變輕鏈。
因此，在一個實施例中，本發明係關於如下雙特異性分子，其中至少兩個結合部分具有分別賦予與活化T細胞之抗原CD3及目標細胞抗原FolR1之特異性結合的一致輕鏈及對應重構重鏈。使用此所謂的『共同輕鏈』原理可防止輕鏈誤配，亦即組合兩個結合子，這兩個結合子共用一個輕鏈但仍然具有單獨的特異性。因此，在製造期間，副產物較少，有助於均勻製備活化T細胞之雙特異性抗原結合分子。
活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之組分彼此間可以多種組態融合。例示性組態描繪於圖1A至I中且進一步描述於下文中。
在一些實施例中，該活化T細胞之雙特異性抗原結合分子進一步 包含由能夠穩定結合之第一及第二亞單元構成的Fc域。下文描述包含Fc域之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子的例示性實施例。
含互換型Fab片段之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子
本發明之發明人產生一種第二雙特異性抗體格式，其中結合部分中之一者為互換型Fab片段。在本發明之一個態樣中，提供一種單價雙特異性抗體，其中IgG分子之Fab片段中之一者經互換型Fab片段置換。互換型Fab片段為其中重鏈及輕鏈之可變區或恆定區發生交換的Fab片段。包含互換型Fab片段之雙特異性抗體格式在例如WO2009080252、WO2009080253、WO2009080251、WO2009080254、WO2010/136172、WO2010/145792及WO2013/026831中已有描述。在一特定實施例中，第一抗原結合部分為其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變區或恆定區發生交換的互換型Fab分子。此類修飾防止來自不同Fab分子之重鏈與輕鏈之誤配，從而改良本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子在重組製造時之產量及純度。在適用於本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子的特定互換型Fab分子中，Fab輕鏈及Fab重鏈之可變區發生交換。在適用於本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子的另一互換型Fab分子中，Fab輕鏈及Fab重鏈之恆定區發生交換。
在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含(i)第一抗原結合部分，其為能夠特異性結合至CD3之互換型Fab分子，包含至少一個選自由SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38及SEQ ID NO：39組成之群的重鏈互補決定區(CDR)及至少一個選自SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34之群的輕鏈CDR；(ii)能夠特異性結合至葉酸受體1(FolR1)之第二抗原結合部分，其包含至少一個選自由SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：56及SEQ ID NO：57組成之群的重鏈互補決定區(CDR)及至少一個選自SEQ ID NO： 59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：65之群的輕鏈CDR。
在一個此類實施例中，CD3抗原結合部分包含SEQ ID NO：37之重鏈CDR1、SEQ ID NO：38之重鏈CDR2、SEQ ID NO：39之重鏈CDR3、SEQ ID NO：32之輕鏈CDR1、SEQ ID NO：33之輕鏈CDR2及SEQ ID NO：34之輕鏈CDR3，且FolR1抗原結合部分包含SEQ ID NO：8之重鏈CDR1、SEQ ID NO：56之重鏈CDR2、SEQ ID NO：57之重鏈CDR3、SEQ ID NO：59之輕鏈CDR1、SEQ ID NO：60之輕鏈CDR2及SEQ ID NO：65之輕鏈CDR3。
在一個實施例中，第二抗原結合部分為習知Fab分子。
在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含
(i)第一抗原結合部分，其為能夠特異性結合至CD3之互換型Fab分子，包含含SEQ ID NO：36之胺基酸序列的可變重鏈及含SEQ ID NO：31之胺基酸序列的可變輕鏈。
(ii)第二抗原結合部分，其為能夠特異性結合至葉酸受體1(FolR1)之Fab分子，包含含SEQ ID NO：55之胺基酸序列的可變重鏈及含SEQ ID NO：64之胺基酸序列的可變輕鏈。
在一個實施例中，第二抗原結合部分為習知Fab分子。
在另一實施例中，對FolR1具有特異性的抗原結合部分包含與SEQ ID NO：55至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的重鏈可變區序列及與SEQ ID NO：64至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的輕鏈可變區序列或其保留功能之變異體。
在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含與SEQ ID NO：36至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的多肽序列、與SEQ ID NO：31至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的多肽序列、與SEQ ID NO：55至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的多肽序列及與SEQ ID NO：64至少約95%、 96%、97%、98%、99%或100%一致的多肽序列。
在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子另外包含(iii)能夠特異性結合至FolR1之第三抗原結合部分。
在一個實施例中，第三抗原結合部分為習知Fab分子。在一個實施例中，第三抗原結合部分為互換型Fab分子。
在一個此類實施例中，能夠特異性結合至FolR1之第二及第三抗原結合部分包含一致的重鏈互補決定區(CDR)及輕鏈CDR序列。在一個此類實施例中，第三抗原結合部分與第二抗原結合部分一致。
在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含
(i)第一抗原結合部分，其為能夠特異性結合至CD3之互換型Fab分子，包含至少一個選自由SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38及SEQ ID NO：39組成之群的重鏈互補決定區(CDR)及至少一個選自SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34之群的輕鏈CDR；
(ii)能夠特異性結合至葉酸受體1(FolR1)之第二抗原結合部分，其包含至少一個選自由SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：56及SEQ ID NO：57組成之群的重鏈互補決定區(CDR)及至少一個選自SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：65之群的輕鏈CDR。
(iii)能夠特異性結合至葉酸受體1(FolR1)之第三抗原結合部分，其包含至少一個選自由SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：56及SEQ ID NO：57組成之群的重鏈互補決定區(CDR)及至少一個選自SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：65之群的輕鏈CDR。
在一個此類實施例中，CD3抗原結合部分包含SEQ ID NO：37之重鏈CDR1、SEQ ID NO：38之重鏈CDR2、SEQ ID NO：39之重鏈CDR3、SEQ ID NO：32之輕鏈CDR1、SEQ ID NO：33之輕鏈CDR2及SEQ ID NO：34之輕鏈CDR3，且FolR1抗原結合部分包含SEQ ID NO：8之重鏈CDR1、SEQ ID NO：56之重鏈CDR2、SEQ ID NO：57之重鏈 CDR3、SEQ ID NO：59之輕鏈CDR1、SEQ ID NO：60之輕鏈CDR2及SEQ ID NO：65之輕鏈CDR3。
在一個實施例中，第二抗原結合部分及第三抗原結合部分均為習知Fab分子。
在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含
(i)第一抗原結合部分，其為能夠特異性結合至CD3之互換型Fab分子，包含含SEQ ID NO：36之胺基酸序列的可變重鏈及含SEQ ID NO：31之胺基酸序列的可變輕鏈。
(ii)第二抗原結合部分，其為能夠特異性結合至葉酸受體1(FolR1)之Fab分子，包含含SEQ ID NO：55之胺基酸序列的可變重鏈及含SEQ ID NO：64之胺基酸序列的可變輕鏈。
(iii)第三抗原結合部分，其為能夠特異性結合至葉酸受體1(FolR1)之Fab分子，包含含SEQ ID NO：55之胺基酸序列的可變重鏈及含SEQ ID NO：64之胺基酸序列的可變輕鏈。
在一個實施例中，第二抗原結合部分及第三抗原結合部分均為習知Fab分子。
在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含 (i)第一抗原結合部分，其為能夠特異性結合至CD3之互換型Fab分子，包含至少一個選自由SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38及SEQ ID NO：39組成之群的重鏈互補決定區(CDR)及至少一個選自SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34之群的輕鏈CDR；(ii)能夠特異性結合至葉酸受體1(FolR1)之第二抗原結合部分，其包含至少一個選自由SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：50組成之群的重鏈互補決定區(CDR)及至少一個選自SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54之群的輕鏈CDR。
在一個此類實施例中，CD3抗原結合部分包含SEQ ID NO：37之 重鏈CDR1、SEQ ID NO：38之重鏈CDR2、SEQ ID NO：39之重鏈CDR3、SEQ ID NO：32之輕鏈CDR1、SEQ ID NO：33之輕鏈CDR2及SEQ ID NO：34之輕鏈CDR3，且FolR1抗原結合部分包含SEQ ID NO：8之重鏈CDR1、SEQ ID NO：9之重鏈CDR2、SEQ ID NO：50之重鏈CDR3、SEQ ID NO：52之輕鏈CDR1、SEQ ID NO：53之輕鏈CDR2及SEQ ID NO：54之輕鏈CDR3。
在一個實施例中，第二抗原結合部分為習知Fab分子。在一個實施例中，第二抗原結合部分為互換型Fab分子。
在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含
(i)第一抗原結合部分，其為能夠特異性結合至CD3之互換型Fab分子，包含含SEQ ID NO：36之胺基酸序列的可變重鏈及含SEQ ID NO：31之胺基酸序列的可變輕鏈。
(ii)第二抗原結合部分，其為能夠特異性結合至葉酸受體1(FolR1)之Fab分子，包含含SEQ ID NO：49之胺基酸序列的可變重鏈及含SEQ ID NO：51之胺基酸序列的可變輕鏈。
在一個實施例中，第二抗原結合部分為習知Fab分子。在一個實施例中，第二抗原結合部分為互換型Fab分子。
在另一實施例中，對FolR1具有特異性的抗原結合部分包含與SEQ ID NO：49至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的重鏈可變區序列及與SEQ ID NO：51至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的輕鏈可變區序列或其保留功能之變異體。
在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含與SEQ ID NO：36至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的多肽序列、與SEQ ID NO：31至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的多肽序列、與SEQ ID NO：49至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的多肽序列及與SEQ ID NO：51至少約95%、 96%、97%、98%、99%或100%一致的多肽序列。
在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子另外包含(iii)能夠特異性結合至FolR1之第三抗原結合部分。
在一個實施例中，第三抗原結合部分為習知Fab分子。在一個實施例中，第二抗原結合部分為互換型Fab分子。
在一個此類實施例中，能夠特異性結合至FolR1之第二及第三抗原結合部分包含一致的重鏈互補決定區(CDR)及輕鏈CDR序列。在一個此類實施例中，第三抗原結合部分與第二抗原結合部分一致。
在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含
(i)第一抗原結合部分，其為能夠特異性結合至CD3之互換型Fab分子，包含至少一個選自由SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38及SEQ ID NO：39組成之群的重鏈互補決定區(CDR)及至少一個選自SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34之群的輕鏈CDR；
(ii)能夠特異性結合至葉酸受體1(FolR1)之第二抗原結合部分，其包含至少一個選自由SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：49組成之群的重鏈互補決定區(CDR)及至少一個選自SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54之群的輕鏈CDR。
(iii)能夠特異性結合至葉酸受體1(FolR1)之第三抗原結合部分，其包含至少一個選自由SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：50組成之群的重鏈互補決定區(CDR)及至少一個選自SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54之群的輕鏈CDR。
在一個此類實施例中，CD3抗原結合部分包含SEQ ID NO：37之重鏈CDR1、SEQ ID NO：38之重鏈CDR2、SEQ ID NO：39之重鏈CDR3、SEQ ID NO：32之輕鏈CDR1、SEQ ID NO：33之輕鏈CDR2及SEQ ID NO：34之輕鏈CDR3，且FolR1抗原結合部分包含SEQ ID NO：8之重鏈CDR1、SEQ ID NO：9之重鏈CDR2、SEQ ID NO：50之重鏈 CDR3、SEQ ID NO：52之輕鏈CDR1、SEQ ID NO：53之輕鏈CDR2及SEQ ID NO：54之輕鏈CDR3。
在一個實施例中，第二抗原結合部分及第三抗原結合部分均為習知Fab分子。
在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含
(i)第一抗原結合部分，其為能夠特異性結合至CD3之互換型Fab分子，包含含SEQ ID NO：36之胺基酸序列的可變重鏈及含SEQ ID NO：31之胺基酸序列的可變輕鏈。
(ii)第二抗原結合部分，其為能夠特異性結合至葉酸受體1(FolR1)之Fab分子，包含含SEQ ID NO：49之胺基酸序列的可變重鏈及含SEQ ID NO：51之胺基酸序列的可變輕鏈。
(iii)第三抗原結合部分，其為能夠特異性結合至葉酸受體1(FolR1)之Fab分子，包含含SEQ ID NO：49之胺基酸序列的可變重鏈及含SEQ ID NO：51之胺基酸序列的可變輕鏈。
在一個實施例中，第二抗原結合部分及第三抗原結合部分均為習知Fab分子。
因此，在一個實施例中，本發明係關於如下雙特異性分子，其中兩個結合部分賦予與FolR1之特異性結合且一個結合部分賦予針對活化T細胞之抗原CD3的特異性。重鏈中之一者經修飾以確保重鏈及輕鏈之恰當配對，由此消除對共同輕鏈方法的需要。兩個FolR1結合位點之存在使得能夠與目標抗原FolR1恰當接合及活化T細胞。
活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之組分彼此間可以多種組態融合。例示性組態描繪於圖1A至I中且進一步描述於下文中。
在一些實施例中，該活化T細胞之雙特異性抗原結合分子進一步包含由能夠穩定結合之第一及第二亞單元構成的Fc域。下文描述包含Fc域之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子的例示性實施例。
活化T細胞之雙特異性抗原結合分子格式
如上文及圖1A至I中所描繪，在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含至少兩個具有一致輕鏈(VLCL)且具有賦予兩種不同抗原以特異性之不同重鏈(VHCL)的Fab片段，亦即一個Fab片段能夠特異性結合至活化T細胞之抗原CD3且另一個Fab片段能夠特異性結合至目標細胞抗原FolR1。
在另一實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含至少兩個抗原結合部分(Fab分子)，其中一個為互換型Fab分子且另一個為習知Fab分子。在一個此類實施例中，能夠特異性結合至CD3之第一抗原結合部分為互換型Fab分子且能夠特異性結合至FolR之第二抗原結合部分為習知Fab分子。
活化T細胞之雙特異性抗原結合分子的此等組分彼此間可以多種組態融合。例示性組態描繪於圖1A至I中。
在一些實施例中，第一及第二抗原結合部分各自在Fab重鏈之C端融合至Fc域之第一或第二亞單元之N端。在一特定此類實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子基本上由第一及第二抗原結合部分、由第一及第二亞單元構成之Fc域及視情況存在之一或多個肽連接子組成，其中第一及第二抗原結合部分各自在Fab重鏈之C端融合至Fc域之第一或第二亞單元之N端。在一個此類實施例中，第一及第二抗原結合部分均為Fab片段且具有一致輕鏈(VLCL)。在另一個此類實施例中，能夠特異性結合至CD3之第一抗原結合部分為互換型Fab分子且能夠特異性結合至FolR之第二抗原結合部分為習知Fab分子。
在一個實施例中，第二抗原結合部分在Fab重鏈之C端融合至Fc域之第一或第二亞單元之N端且第一抗原結合部分在Fab重鏈之C端融合至第二抗原結合部分之Fab重鏈之N端。在一特定此類實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子基本上由第一及第二抗原結合部 分、由第一及第二亞單元構成之Fc域及視情況存在之一或多個肽連接子組成，其中第一抗原結合部分在Fab重鏈之C端融合至第二抗原結合部分之Fab重鏈之N端，且第二抗原結合部分在Fab重鏈之C端融合至Fc域之第一或第二亞單元之N端。在一個此類實施例中，第一及第二抗原結合部分均為Fab片段且具有一致輕鏈(VLCL)。在另一個此類實施例中，能夠特異性結合至CD3之第一抗原結合部分為互換型Fab分子且能夠特異性結合至FolR之第二抗原結合部分為習知Fab分子。視情況，第一抗原結合部分之Fab輕鏈及第二抗原結合部分之Fab輕鏈可進一步彼此間融合。
在其他實施例中，第一抗原結合部分在Fab重鏈之C端融合至Fc域之第一或第二亞單元之N端。在一特定此類實施例中，第二抗原結合部分在Fab重鏈之C端融合至第一抗原結合部分之Fab重鏈之N端。在一特定此類實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子基本上由第一及第二抗原結合部分、由第一及第二亞單元構成之Fc域及視情況存在之一或多個肽連接子組成，其中第二抗原結合部分在Fab重鏈之C端融合至第一抗原結合部分之Fab重鏈之N端，且第一抗原結合部分在Fab重鏈之C端融合至Fc域之第一或第二亞單元之N端。在一個此類實施例中，第一及第二抗原結合部分均為Fab片段且具有一致輕鏈(VLCL)。在另一個此類實施例中，能夠特異性結合至CD3之第一抗原結合部分為互換型Fab分子且能夠特異性結合至FolR之第二抗原結合部分為習知Fab分子。視情況，第一抗原結合部分之Fab輕鏈及第二抗原結合部分之Fab輕鏈可進一步彼此間融合。
抗原結合部分可直接或經由包含一或多個胺基酸(通常約2-20個胺基酸)之肽連接子與Fc域融合或彼此間融合。肽連接子在此項技術中已知且描述於本文中。適合之非免疫原性肽連接子包括例如(G4 S)n (SEQ ID NO：300)、(SG4 )n (SEQ ID NO：301)、(G4 S)n (SEQ ID NO： 300)或G4 (SG4 )n (SEQ ID NO：302)肽連接子。「n」一般為介於1與10之間，通常介於2與4之間的數值。尤其適合第一及第二抗原結合部分之Fab輕鏈彼此間融合之肽連接子為(G4 S)2 (SEQ ID NO：303)。適於連接第一及第二抗原結合部分之Fab重鏈之例示性肽連接子為EPKSC(D)-(G4 S)2 (SEQ ID NO：304及305)。另外，連接子可包含免疫球蛋白鉸鏈區(之一部分)。特定言之，在抗原結合部分融合至Fc域亞單元之N端的情況下，其可在存在或不存在額外肽連接子之情況下，經由免疫球蛋白鉸鏈區或其部分融合。
本發明之發明人已發現，包含兩個對目標細胞抗原FolR具有特異性的結合部分的活化T細胞之雙特異性抗原結合分子的特徵優於包含僅一個對目標細胞抗原FolR具有特異性的結合部分的活化T細胞之雙特異性抗原結合分子。
因此，在某些實施例中，本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子進一步包含第三抗原結合部分，其為能夠特異性結合至FolR之Fab分子。在一個此類實施例中，能夠特異性結合至FolR1之第二及第三抗原結合部分包含一致的重鏈互補決定區(CDR)及輕鏈CDR序列。在一個此類實施例中，第三抗原結合部分與第二抗原結合部分一致(亦即其包含相同的胺基酸序列)。
在一個實施例中，第一及第二抗原結合部分各自在Fab重鏈之C端融合至Fc域之第一或第二亞單元之N端且第三抗原結合部分在Fab重鏈之C端融合至第一抗原結合部分之Fab重鏈之N端。在一特定此類實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子基本上由第一、第二及第三抗原結合部分、由第一及第二亞單元構成之Fc域及視情況存在之一或多個肽連接子組成，其中第一及第二抗原結合部分各自在Fab重鏈之C端融合至Fc域之第一亞單元之N端，且第三抗原結合部分在Fab重鏈之C端融合至第一抗原結合部分之Fab重鏈之N端。在一個此 類實施例中，第一、第二及第三抗原結合部分為習知Fab片段且具有一致輕鏈(VLCL)。在另一個此類實施例中，能夠特異性結合至CD3之第一抗原結合部分為互換型Fab分子且能夠特異性結合至FolR之第二及第三抗原結合部分為習知Fab分子。視情況，第一抗原結合部分之Fab輕鏈及第三抗原結合部分之Fab輕鏈可進一步彼此間融合。
因此，在某些實施例中，本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含五個多肽鏈且形成第一、第二及第三抗原結合部分，其中第一抗原結合部分能夠結合CD3與第二及第三抗原結合部分各自能夠結合葉酸受體1(FolR1)。第一及第二多肽鏈按胺基(N)端至羧基(C)端方向包含第一輕鏈可變域(VLD1)及第一輕鏈恆定域(CLD1)。第三多肽鏈按N端至C端方向包含第二輕鏈可變域(VLD2)及第二重鏈恆定域1(CH1D2)。第四多肽鏈按N端至C端方向包含第一重鏈可變域(VHD1)、第一重鏈恆定域1(CH1D1)、第一重鏈恆定域2(CH2D1)及第一重鏈恆定域3(CH3D1)。第五多肽鏈包含VHD1、CH1D1、第二重鏈可變域(VHD2)、第二輕鏈恆定域(CLD2)、第二重鏈恆定域2(CH2D2)及第二重鏈恆定域3(CH3D2)。第三多肽鏈與第五多肽鏈之VHD2及CLD2形成能夠結合CD3之第一抗原結合部分。第二多肽鏈與第五多肽鏈之VHD1及CH1D1形成能夠結合至FolR1之第三結合部分。第一多肽鏈與第四多肽鏈之VHD1及CH1D1形成能夠結合至FolR1之第二結合部分。
在另一實施例中，第二及第三抗原結合部分各自在Fab重鏈之C端融合至Fc域之第一或第二亞單元之N端且第一抗原結合部分在Fab重鏈之C端融合至第二抗原結合部分之Fab重鏈之N端。在一特定此類實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子基本上由第一、第二及第三抗原結合部分、由第一及第二亞單元構成之Fc域及視情況存在之一或多個肽連接子組成，其中第二及第三抗原結合部分各自在Fab 重鏈之C端融合至Fc域之第一亞單元之N端，且第一抗原結合部分在Fab重鏈之C端融合至第三抗原結合部分之Fab重鏈之N端。在一個此類實施例中，第一、第二及第三抗原結合部分為習知Fab片段且具有一致輕鏈(VLCL)。在另一個此類實施例中，能夠特異性結合至CD3之第一抗原結合部分為互換型Fab分子且能夠特異性結合至FolR之第二及第三抗原結合部分為習知Fab分子。視情況，第一抗原結合部分之Fab輕鏈及第二抗原結合部分之Fab輕鏈可進一步彼此間融合。
抗原結合部分可與Fc域直接融合或經由肽連接子融合。在一特定實施例中，抗原結合部分各自經由免疫球蛋白鉸鏈區融合至Fc域。在一特定實施例中，免疫球蛋白鉸鏈區為人類IgG1 鉸鏈區。
在一個實施例中，第一及第二抗原結合部分及Fc域為免疫球蛋白分子之一部分。在一特定實施例中，免疫球蛋白分子為IgG類免疫球蛋白。在一甚至更特定實施例中，免疫球蛋白為IgG1 子類免疫球蛋白。在另一實施例中，免疫球蛋白為IgG4 子類免疫球蛋白。在另一特定實施例中，免疫球蛋白為人類免疫球蛋白。在其他實施例中，免疫球蛋白為嵌合免疫球蛋白或人類化免疫球蛋白。
在該活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之一特定實施例中，第一及第二抗原結合部分及Fc域為免疫球蛋白分子之一部分，且第三抗原結合部分在Fab重鏈之C端融合至第一抗原結合部分之Fab重鏈之N端，其中第一、第二及第三抗原結合部分為習知Fab片段且具有一致輕鏈(VLCL)，其中能夠特異性結合至CD3之第一抗原結合部分包含至少一個選自由SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38及SEQ ID NO：39組成之群的重鏈互補決定區(CDR)及至少一個選自SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33及SEQ ID NO：34之群的輕鏈CDR；且能夠特異性結合至FolR1之第二及第三抗原結合部分包含至少一個選自由SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18組成之群的重鏈互補決定區 (CDR)及至少一個選自SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33及SEQ ID NO：34之群的輕鏈CDR。
在該活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之一特定實施例中，第一及第二抗原結合部分及Fc域為免疫球蛋白分子之一部分，且第三抗原結合部分在Fab重鏈之C端融合至第一抗原結合部分之Fab重鏈之N端，其中第一、第二及第三抗原結合部分為習知Fab片段且具有一致輕鏈(VLCL)，其中能夠特異性結合至CD3之第一抗原結合部分包含含SEQ ID NO：36之序列的可變重鏈、含SEQ ID NO：31之序列的可變輕鏈；且能夠特異性結合至FolR1之第二及第三抗原結合部分包含含SEQ ID NO：15之序列的可變重鏈、含SEQ ID NO：31之序列的可變輕鏈。
在該活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之一特定實施例中，第一及第二抗原結合部分及Fc域為免疫球蛋白分子之一部分，且第三抗原結合部分在Fab重鏈之C端融合至第一抗原結合部分之Fab重鏈之N端，且能夠特異性結合至CD3之第一抗原結合部分為其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變區或恆定區發生交換的互換型Fab分子，其包含至少一個選自由SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38及SEQ ID NO：39組成之群的重鏈互補決定區(CDR)及至少一個選自SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33及SEQ ID NO：34之群的輕鏈CDR；且能夠特異性結合至FolR1之第二及第三抗原結合部分包含至少一個選自由SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：56及SEQ ID NO：57組成之群的重鏈互補決定區(CDR)及至少一個選自SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60及SEQ ID NO：65之群的輕鏈CDR。
在該活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之一特定實施例中，第一及第二抗原結合部分及Fc域為免疫球蛋白分子之一部分，且第三抗原結合部分在Fab重鏈之C端融合至第一抗原結合部分之Fab重鏈之N 端，且能夠特異性結合至CD3之第一抗原結合部分為其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變區或恆定區發生交換的互換型Fab分子，其中能夠特異性結合至CD3之第一抗原結合部分包含含SEQ ID NO：36之序列的可變重鏈、含SEQ ID NO：31之序列的可變輕鏈；且能夠特異性結合至FolR1之第二及第三抗原結合部分包含含SEQ ID NO：55之序列的可變重鏈、含SEQ ID NO：65之序列的可變輕鏈。
在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子對於各抗原為單價的。在一特定實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子可結合至人類CD3及人類葉酸受體α(FolR1)且在不採用諸如杵-臼技術之雜二聚方法的情況下製成。舉例而言，該分子可藉由採用共同輕鏈文庫及互換單抗技術製造。在一特定實施例中，CD3結合子之可變區融合至標準人類IgG1抗體之CH1域，形成共享兩種特異性之VLVH互換分子(融合至Fc)。為產生互換對應物(VHCL)，CD3特異性可變重鏈域融合至恆定人類λ輕鏈，而對人類FolR1具有特異性的可變重鏈域(例如，自共同輕鏈文庫分離)融合至恆定人類κ輕鏈。鏈正確配對之所得合乎需要之分子包含κ及λ輕鏈或其片段。因此，此合乎需要之雙特異性分子物質可藉由依序純化步驟自誤配或均二聚物質中純化，選出任一序列中之κ及λ輕鏈。在一個特定實施例中，合乎需要之雙特異性抗體之純化採用後續純化步驟用KappaSelect及LambdaFabSelect管柱(GE Healthcare)來移除不合需要之均二聚抗體。
Fc域
活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之Fc域由一對包含免疫球蛋白分子重鏈域的多肽鏈組成。舉例而言，免疫球蛋白G(IgG)分子之Fc域為二聚體，其中各亞單元包含CH2及CH3 IgG重鏈恆定域。Fc域之兩個亞單元彼此間能夠穩定結合。在一個實施例中，本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含不超過一個Fc域。
在根據本發明之一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之Fc域為IgG Fc域。在一特定實施例中，Fc域為IgG1 Fc域。在另一實施例中，Fc域為IgG4 Fc域。在一更特定實施例中，Fc域為包含位置S228(Kabat編號)之胺基酸取代(特定言之，胺基酸取代S228P)的IgG4 Fc域。此胺基酸取代減少活體內IgG4 抗體之Fab臂交換(參見Stubenrauch等人，Drug Metabolism and Disposition 38,84-91(2010))。在另一特定實施例中，Fc域為人類Fc域。人類IgG1 Fc區之例示性序列以SEQ ID NO：245給出。
促進雜二聚化之Fc域修飾
本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含不同的抗原結合部分，該等抗原結合部分融合至Fc域之兩個亞單元中之一個或另一個，因此Fc域之兩個亞單元通常包含於兩個非一致多肽鏈中。此等多肽之重組共表現及隨後二聚化引起兩種多肽出現若干種可能的組合。因此有利的是，將促進所要多肽之結合的修飾引入活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之Fc域中以改良活化T細胞之雙特異性抗原結合分子在重組製造時的產量及純度。
因此，在特定實施例中，本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之Fc域包含促進Fc域之第一及第二亞單元之結合的修飾。人類IgG Fc域之兩個亞單元之間最廣泛蛋白質-蛋白質相互作用的位點存在於Fc域之CH3域中。因此，在一個實施例中，該修飾存在於Fc域之CH3域中。
在一特定實施例中，該修飾為所謂的「杵-臼」修飾，其包含Fc域之兩個亞單元中之一者中的「杵」修飾及Fc域之兩個亞單元之另一者中的「臼」修飾。
杵-臼技術在例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人，Prot Eng 9,617-621(1996)及Carter,J Immunol Meth 248,7-15(2001) 中有所描述。一般而言，該方法涉及在第一多肽之界面處引入隆凸(「杵」)及在第二多肽之界面處引入相應空腔(「臼」)，使得隆凸可定位於空腔中以便促進雜二聚體形成且阻礙均二聚體形成。隆凸藉由用較大側鏈(例如酪胺酸或色胺酸)置換第一多肽界面中之小胺基酸側鏈來構築。大小與隆凸相同或相似的補償性空腔藉由用較小胺基酸側鏈(例如丙胺酸或蘇胺酸)置換大胺基酸側鏈而形成於第二多肽之界面中。
因此，在一特定實施例中，在活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之Fc域的第一亞單元之CH3域中，胺基酸殘基經具有較大側鏈體積的胺基酸殘基置換，從而在第一亞單元之CH3域內產生可定位於第二亞單元之CH3域內之空腔中的隆凸，且在Fc域之第二亞單元之CH3域中，胺基酸殘基經具有較小側鏈體積的胺基酸殘基置換，從而在第二亞單元之CH3域內產生第一亞單元之CH3域內之隆凸可定位於其中的空腔。
隆凸及空腔可藉由改變編碼多肽之核酸產生，例如藉由位點特異性突變誘發或藉由肽合成。
在一特定實施例中，在Fc域之第一亞單元之CH3域中，位置366處之蘇胺酸殘基經色胺酸殘基(T366W)置換，且在Fc域之第二亞單元之CH3域中，位置407處之酪胺酸殘基經纈胺酸殘基(Y407V)置換。在一個實施例中，另外在Fc域之第二亞單元中，位置366處之蘇胺酸殘基經絲胺酸殘基(T366S)置換且位置368處之白胺酸殘基經丙胺酸殘基(L368A)置換。
在另一實施例中，另外在Fc域之第一亞單元中，位置354處之絲胺酸殘基經半胱胺酸殘基(S354C)置換，且另外在Fc域之第二亞單元中，位置349處之酪胺酸殘基經半胱胺酸殘基(Y349C)置換。引入這兩個半胱胺酸殘基使得Fc域之兩個亞單元之間形成二硫橋鍵，由此進一 步穩定二聚體(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。
在一特定實施例中，能夠結合至CD3之抗原結合部分融合(視情況經由能夠結合至目標細胞抗原上之FolR1的抗原結合部分)至Fc域之第一亞單元(包含「杵」修飾)。不希望受理論限制，能夠結合至CD3之抗原結合部分與Fc域之含杵亞單元的融合將(進一步)使包含兩個能夠結合至CD3之抗原結合部分的抗原結合分子之產生減到最少(兩個含杵多肽之空間位阻)。
在一替代性實施例中，促進Fc域之第一及第二亞單元之結合的修飾包含介導靜電導引效應之修飾，例如如PCT公開案WO 2009/089004中所述。一般而言，此方法涉及用帶電荷胺基酸殘基置換兩個Fc域亞單元之界面處之一或多個胺基酸殘基，使得均二聚體形成變成在靜電上不利的，但雜二聚在靜電上為有利的。
消除Fc受體結合及/或效應功能之Fc域修飾
Fc域賦予活化T細胞之雙特異性抗原結合分子有利的藥物動力學性質，包括長血清半衰期，其有助於目標組織中之良好聚積及有利的組織-血液分佈比率。然而，其同時引起活化T細胞之雙特異性抗原結合分子不合需要地靶向表現Fc受體之細胞，而非優先靶向攜帶抗原之細胞。此外，Fc受體信號傳導路徑之共活化可引起細胞激素釋放，細胞激素釋放與抗原結合分子之活化T細胞之性質及長半衰期組合，導致全身性投藥後的細胞激素受體過度活化及重度副作用。由於T細胞存在被摧毀(例如被NK細胞摧毀)的可能性，因此除T細胞之外的免疫細胞(攜帶Fc受體)之活化甚至會降低活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之功效。
因此，在特定實施例中，相較於原生IgG1 Fc域，本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之Fc域展現減小之對Fc受體的結合親和力及/或減少之效應功能。在一個此類實施例中，Fc域(或包含該Fc域 的活化T細胞之雙特異性抗原結合分子)對Fc受體展現的結合親和力小於原生IgG1 Fc域(或包含原生IgG1 Fc域的活化T細胞之雙特異性抗原結合分子)對Fc受體之結合親和力的50%，較佳小於20%，更佳小於10%且最佳小於5%，及/或Fc域(或包含該Fc域的活化T細胞之雙特異性抗原結合分子)展現的效應功能小於原生IgG1 Fc域(或包含原生IgG1 Fc域的活化T細胞之雙特異性抗原結合分子)所展現之效應功能的50%，較佳小於20%，更佳小於10%且最佳小於5%。在一個實施例中，Fc域(或包含該Fc域的活化T細胞之雙特異性抗原結合分子)實質上不結合至Fc受體及/或誘導效應功能。在一特定實施例中，Fc受體為Fcγ受體。在一個實施例中，Fc受體為人類Fc受體。在一個實施例中，Fc受體為活化Fc受體。在一特定實施例中，Fc受體為活化人類Fcγ受體，更特定言之人類FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最特定言之人類FcγRIIIa。在一個實施例中，效應功能為選自CDC、ADCC、ADCP及細胞激素分泌之群的一或多者。在一特定實施例中，效應功能為ADCC。在一個實施例中，Fc域對新生兒Fc受體(FcRn)展現的結合親和力實質上類似於原生IgG1 Fc域。當Fc域(或包含該Fc域的活化T細胞之雙特異性抗原結合分子)對FcRn展現的結合親和力大於原生IgG1 Fc域(或包含原生IgG1 Fc域的活化T細胞之雙特異性抗原結合分子)對FcRn之結合親和力的約70%、特定言之大於約80%、更特定言之大於約90%時，達成與FcRn之實質上相似的結合。
在某些實施例中，相較於未經工程改造的Fc域，經工程改造的Fc域對Fc受體的結合親和力減小及/或效應功能減少。在特定實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之Fc域包含一或多個使Fc域對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸突變。通常，在Fc域之兩個亞單元中之每一者中存在該一或多個胺基酸突變。在一個實施例中，胺基酸突變使Fc域對Fc受體的結合親和力減小。在一個實 施例中，胺基酸突變使Fc域對Fc受體的結合親和力減小至少2倍、至少5倍或至少10倍。在其中存在超過一個使Fc域對Fc受體之結合親和力減小之胺基酸突變的實施例中，此等胺基酸突變之組合可使Fc域對Fc受體的結合親和力減小至少10倍、至少20倍或甚至至少50倍。在一個實施例中，包含經工程改造之Fc域的活化T細胞之雙特異性抗原結合分子對Fc受體展現的結合親和力小於包含未經工程改造之Fc域的活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之結合親和力的20%，特定言之小於10%，更特定言之小於5%。在一特定實施例中，Fc受體為Fcγ受體。在一些實施例中，Fc受體為人類Fc受體。在一些實施例中，Fc受體為活化Fc受體。在一特定實施例中，Fc受體為活化人類Fcγ受體，更特定言之人類FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最特定言之人類FcγRIIIa。較佳地，與此等受體中之每一者的結合減少。在一些實施例中，與補體組分之結合親和力，特定言之與C1q之結合親和力，亦減小。在一個實施例中，相對於新生兒Fc受體(FcRn)的結合親和力未減小。當Fc域(或包含該Fc域之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子)對FcRn展現的結合親和力大於未經工程改造形式之Fc域(或包含該未經工程改造形式之Fc域的活化T細胞之雙特異性抗原結合分子)對FcRn的結合親和力的約70%時，達成與FcRn之實質上相似的結合，亦即保存Fc域對該受體之結合親和力。Fc域或包含該Fc域的本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子可展現大於此親和力的約80%且甚至大於約90%。在某些實施例中，相較於未經工程改造之Fc域，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之Fc域經工程改造可具有減少之效應功能。減少之效應功能可包括(但不限於)以下一或多者：補體依賴性細胞毒性(CDC)降低、抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)降低、抗體依賴性細胞吞噬(ADCP)減少、細胞激素分泌減少、免疫複合物介導之抗原呈遞細胞攝入抗原減少、與NK細胞之結合減少、與巨噬細 胞之結合減少、與單核細胞之結合減少、與多形核細胞之結合減少、誘導細胞凋亡之直接信號傳導減少、目標所結合抗體之交聯減少、樹突狀細胞成熟減少或T細胞激活減少。在一個實施例中，減少之效應功能為選自以下之群的一或多者：CDC降低、ADCC降低、ADCP減少及細胞激素分泌減少。在一特定實施例中，減少之效應功能為ADCC降低。在一個實施例中，降低之ADCC小於未經工程改造之Fc域(或包含未經工程改造之Fc域的活化T細胞之雙特異性抗原結合分子)所誘導之ADCC的20%。
在一個實施例中，使Fc域對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸突變為胺基酸取代。在一個實施例中，Fc域包含在選自E233、L234、L235、N297、P331及P329之群的位置處之胺基酸取代。在一更特定實施例中，Fc域包含在選自L234、L235及P329之群的位置處之胺基酸取代。在一些實施例中，Fc域包含胺基酸取代L234A及L235A。在一個此類實施例中，Fc域為IgG1 Fc域，特定言之人類IgG1 Fc域。在一個實施例中，Fc域包含在位置P329處之胺基酸取代。在一更特定實施例中，胺基酸取代為P329A或P329G，特定言之P329G。在一個實施例中，Fc域包含在位置P329處之胺基酸取代及在選自E233、L234、L235、N297及P331之位置處之另一胺基酸取代。在一更特定實施例中，另一胺基酸取代為E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S。在特定實施例中，Fc域包含在位置P329、L234及L235處之胺基酸取代。在更特定實施例中，Fc域包含胺基酸突變L234A、L235A及P329G(「P329G LALA」)。在一個此類實施例中，Fc域為IgG1 Fc域，特定言之人類IgG1 Fc域。胺基酸取代之「P329G LALA」組合幾乎完全消除人類IgG1 Fc域之Fcγ受體結合，如PCT公開案第WO 2012/130831號中所述，其以全文引用之方式併入本文中。WO 2012/130831亦描述製備此類突變型Fc域的 方法及測定其性質(諸如Fc受體結合或效應功能)的方法。
相較於IgG1 抗體，IgG4 抗體展現減小之針對Fc受體的結合親和力及減少之效應功能。因此，在一些實施例中，本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子的Fc域為IgG4 Fc域，特定言之人類IgG4 Fc域。在一個實施例中，IgG4 Fc域包含在位置S228處之胺基酸取代，特定言之胺基酸取代S228P。為進一步減小其對Fc受體之結合親和力及/或其效應功能，在一個實施例中，IgG4 Fc域包含在位置L235處之胺基酸取代，特定言之胺基酸取代L235E。在另一實施例中，IgG4 Fc域包含在位置P329處之胺基酸取代，特定言之胺基酸取代P329G。在一特定實施例中，IgG4 Fc域包含在位置S228、L235及P329處之胺基酸取代，特定言之胺基酸取代S228P、L235E及P329G。此類IgG4 Fc域突變體及其Fcγ受體結合性質描述於PCT公開案第WO 2012/130831號中，該案以全文引用的方式併入本文中。
在一特定實施例中，相比於原生IgG1 Fc域，展現減小之對Fc受體之結合親和力及/或減少之效應功能的Fc域為包含胺基酸取代L234A、L235A及視情況存在之P329G的人類IgG1 Fc域，或包含胺基酸取代S228P、L235E及視情況存在之P329G的人類IgG4 Fc域。
在某些實施例中，Fc域之N糖基化已消除。在一個此類實施例中，Fc域包含在位置N297處之胺基酸突變，特定言之用丙胺酸(N297A)或天冬胺酸(N297D)置換天冬醯胺的胺基酸取代。
除上文及PCT公開案第WO 2012/130831號中所述之Fc域以外，具有減小之Fc受體結合及/或效應功能的Fc域亦包括具有Fc域殘基238、265、269、270、297、327及329中之一或多者之取代的Fc域(美國專利第6,737,056號)。此類Fc突變體包括具有胺基酸位置265、269、270、297及327中之兩者或兩者以上之取代的Fc突變體，包括殘基265及297取代為丙胺酸的所謂「DANA」Fc突變體(美國專利第7,332,581 號)。
突變型Fc域可使用此項技術中熟知之遺傳學或化學方法、藉由胺基酸缺失、取代、插入或修飾來製備。遺傳學方法可包括DNA編碼序列之位點特異性突變誘發、PCR、基因合成及類似方法。恰當的核苷酸變化可藉由例如定序來檢驗。
與Fc受體的結合可容易測定，例如藉由ELISA，或藉由表面電漿子共振(SPR)，使用標準儀器，諸如BIAcore儀器(GE Healthcare)，且可藉由重組表現來獲得諸如Fc受體。適合的此類結合分析描述於本文中。或者，Fc域或包含Fc域之活化細胞之雙特異性抗原結合分子對Fc受體的結合親和力可使用已知表現特定Fc受體的細胞株(諸如表現FcγIIIa受體的人類NK細胞)來評估。
Fc域或包含Fc域之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子的效應功能可藉由此項技術中已知之方法量測。適用於量測ADCC的分析描述於本文中。用於評定相關分子之ADCC活性的活體外分析之其他實例描述於美國專利第5,500,362號；Hellstrom等人Proc Natl Acad Sci USA 83,7059-7063(1986)及Hellstrom等人，Proc Natl Acad Sci USA 82,1499-1502(1985)；美國專利第5,821,337號；Bruggemann等人，J Exp Med 166,1351-1361(1987)中。或者，可採用非放射性分析方法(參見例如流動式細胞測量術用的ACTITM 非放射性細胞毒性分析(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；及CytoTox 96® 非放射性細胞毒性分析(Promega,Madison,WI))。適用於此類分析之效應細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC)及天然殺手(NK)細胞。或者或另外，可評定相關分子之活體內ADCC活性，例如在動物模型中，諸如Clynes等人，Proc Natl Acad Sci USA 95,652-656(1998)中所揭示之動物模型。
在一些實施例中，Fc域與補體組分、特定言之C1q的結合減少。 因此，在其中Fc域經工程改造而具有減少之效應功能的一些實施例中，該減少之效應功能包括降低之CDC。可進行C1q結合分析來確定活化T細胞之雙特異性抗原結合分子是否能夠結合C1q且因此具有CDC活性。參見例如WO 2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c結合ELISA。為評定補體活化，可執行CDC分析(參見例如Gazzano-Santoro等人，J Immunol Methods 202,163(1996)；Cragg等人，Blood 101,1045-1052(2003)；及Cragg及Glennie,Blood 103,2738-2743(2004))。
活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之生物性質及功能特徵
熟習此項技術者可瞭解選擇性區分癌細胞與非癌健康細胞之分子的有利功效。用於實現此目的之一種方式為藉由恰當目標選擇。可採用專門在腫瘤細胞上表現之標誌物以使效應分子或細胞選擇性地靶向腫瘤細胞，同時保留不表現此類標誌物之正常細胞。然而，在一些情況下，所謂的腫瘤細胞標誌物亦表現於組織正常中，儘管程度較低。此在正常組織中之表現增加毒性可能性。因此，在此項技術中存在對可以較大選擇性靶向腫瘤細胞之分子的需要。本文所述之本發明提供活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其選擇性靶向FolR1陽性腫瘤細胞且不靶向FolR1表現程度低或完全不表現之正常非癌細胞。在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含至少兩個、較佳兩個親和力相對較低之FolR1結合部分，其賦予允許區分高與低FolR1表現細胞的結合力效應。因為腫瘤細胞之FolR1表現程度高或中等，所以本發明之此實施例選擇性結合至腫瘤細胞及/或誘導殺死腫瘤細胞，且不結合至FolR1表現程度低或完全不表現之正常非癌細胞及/或不誘導殺死該等正常非癌細胞。在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子呈2+1反向格式。在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子誘導T細胞介導殺死FolR1陽性腫瘤細胞且 不誘導T細胞介導殺死非腫瘤細胞，且包含CD3抗原結合部分，其包含SEQ ID NO：37之重鏈CDR1、SEQ ID NO：38之重鏈CDR2、SEQ ID NO：39之重鏈CDR3、SEQ ID NO：32之輕鏈CDR1、SEQ ID NO：33之輕鏈CDR2及SEQ ID NO：34之輕鏈CDR3；及兩個FolR1抗原結合部分，其各自包含SEQ ID NO：8之重鏈CDR1、SEQ ID NO：9之重鏈CDR2、SEQ ID NO：50之重鏈CDR3、SEQ ID NO：52之輕鏈CDR1、SEQ ID NO：53之輕鏈CDR2及SEQ ID NO：54之輕鏈CDR3。
在一個特定實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子不誘導殺死其表面具有小於約1000個FolR1複本之正常細胞。
除以上有利特徵以外，本發明之一個實施例亦不需要化學交聯或產生雜合方法。因此，在一個實施例中，本發明提供能夠在CHO細胞中產生之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子。在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含人類化多肽及人類多肽。在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子不造成FcgR交聯。在一個此類實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子能夠在CHO細胞中產生，且包含CD3抗原結合部分，其包含SEQ ID NO：37之重鏈CDR1、SEQ ID NO：38之重鏈CDR2、SEQ ID NO：39之重鏈CDR3、SEQ ID NO：32之輕鏈CDR1、SEQ ID NO：33之輕鏈CDR2及SEQ ID NO：34之輕鏈CDR3；及兩個FolR1抗原結合部分，其各自包含SEQ ID NO：8之重鏈CDR1、SEQ ID NO：9之重鏈CDR2、SEQ ID NO：50之重鏈CDR3、SEQ ID NO：52之輕鏈CDR1、SEQ ID NO：53之輕鏈CDR2及SEQ ID NO：54之輕鏈CDR3。
如上文所指出，本文中所涵蓋之一些實施例包括活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其具有兩個賦予與FolR1之特異性結合的結合部分及一個賦予與活化T細胞之抗原CD3之特異性的結合部分，其中各個別FolR1結合部分以低親和力接合抗原。因為該分子包含兩個賦 予與FolR1之結合的抗原結合部分，所以該分子之總結合力仍然提供對表現FolR1之目標細胞的有效結合且活化T細胞以誘導T細胞效應功能。考慮到雖然FolR1以各種程度表現於腫瘤細胞上，但其在某些正常細胞中亦以極低程度(例如，細胞表面上小於約1000個複本)表現，熟習此項技術者可容易認識到此類分子之有利功效適用作治療劑。相對於正常細胞，此類分子選擇性靶向腫瘤細胞。因此，可向有需要之個體投與此類分子，且關於由FolR1陽性正常細胞引起之毒性的擔憂顯著少於以高親和力結合至FolR1以誘導效應功能的分子。在一較佳實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子對huFolR1之單價結合親和力在微莫耳範圍內且對huFolR1之結合力在奈莫耳範圍內。
在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子以約10nM至約40nM之表觀K D 結合人類FolR1。在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子以約10nM之表觀K D 結合人類FolR1。在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子分別以約10nM及約30nM之表觀K D 結合人類及食蟹獼猴FolR1。在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子以至少約1000nM之單價結合K D 結合人類FolR1。在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子以約1400nM之單價結合K D 結合人類FolR1。在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子以約1400nM之單價結合K D 結合人類FolR1且以約5600nM之單價結合K D 結合至食蟹獼猴FolR1。在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子以約10nM之表觀K D 且以約1400nM之單價結合K D 結合人類FolR1。
在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子以約5.36pM至約4nM之表觀K D 結合人類FolR1。在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子以約4nM之表觀K D 結合人類及食蟹獼猴FolR1。在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子以約 1.5nM之表觀K D 結合鼠類FolR1。在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子以至少約1000nM之單價結合K D 結合人類FolR1。在一特定實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子以約4nM之表觀K D 結合人類及食蟹獼猴FolR1，以約1.5nM之表觀K D 結合鼠類FolR1，且包含CD3抗原結合部分，其包含SEQ ID NO：37之重鏈CDR1、SEQ ID NO：38之重鏈CDR2、SEQ ID NO：39之重鏈CDR3、SEQ ID NO：32之輕鏈CDR1、SEQ ID NO：33之輕鏈CDR2及SEQ ID NO：34之輕鏈CDR3；及兩個FolR1抗原結合部分，其各自包含SEQ ID NO：8之重鏈CDR1、SEQ ID NO：9之重鏈CDR2、SEQ ID NO：50之重鏈CDR3、SEQ ID NO：52之輕鏈CDR1、SEQ ID NO：53之輕鏈CDR2及SEQ ID NO：54之輕鏈CDR3。在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子以至少約1000nM之單價結合K D 結合人類FolR1，且包含CD3抗原結合部分，其包含SEQ ID NO：37之重鏈CDR1、SEQ ID NO：38之重鏈CDR2、SEQ ID NO：39之重鏈CDR3、SEQ ID NO：32之輕鏈CDR1、SEQ ID NO：33之輕鏈CDR2及SEQ ID NO：34之輕鏈CDR3；及兩個FolR1抗原結合部分，其各自包含SEQ ID NO：8之重鏈CDR1、SEQ ID NO：9之重鏈CDR2、SEQ ID NO：50之重鏈CDR3、SEQ ID NO：52之輕鏈CDR1、SEQ ID NO：53之輕鏈CDR2及SEQ ID NO：54之輕鏈CDR3。
如上所述，本文中所涵蓋之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子可誘導T細胞效應功能，例如細胞表面標誌物表現、細胞激素產生、T細胞介導之殺死。在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子活體外誘導T細胞介導殺死表現FolR1之目標細胞，諸如人類腫瘤細胞。在一個實施例中，T細胞為CD8陽性T細胞。表現FolR1之人類腫瘤細胞之實例包括(但不限於)Hela、Skov-3、HT-29及HRCEpiC細胞。可用於活體外測試之其他FolR1陽性人類癌細胞可由熟習此項技 術者容易獲得。在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子在24小時後以介於約36pM與約39573pM之間的EC50活體外誘導T細胞介導殺死表現FolR1之人類腫瘤細胞。尤其涵蓋在24小時後以約36pM之EC50活體外誘導T細胞介導殺死表現FolR1之腫瘤細胞的活化T細胞之雙特異性抗原結合分子。在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子在24小時後以約178.4pM之EC50活體外誘導T細胞介導殺死表現FolR1之腫瘤細胞。在一個實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子在48小時後以約134.5pM或大於134.5pM之EC50活體外誘導T細胞介導殺死表現FolR1之腫瘤細胞。EC50可藉由此項技術中已知之方法量測，例如藉由本文中用實例所揭示之方法。
在一個實施例中，以上實施例中之任一者的活化T細胞之雙特異性抗原結合分子誘導T細胞上之CD25及CD69中之至少一者的細胞表面表現上調，如藉由流動式細胞測量術所量測。在一個實施例中，T細胞為CD4陽性T細胞或CD8陽性T細胞。
在一個實施例中，以上實施例中之任一者的活化T細胞之雙特異性抗原結合分子結合至人類腫瘤細胞上所表現之FolR1。在一個實施例中，以上實施例中之任一者的活化T細胞之雙特異性抗原結合分子結合至人類FolR1上之構形抗原決定基。在一個實施例中，以上實施例中之任一者的活化T細胞之雙特異性抗原結合分子不結合至人類葉酸受體2(FolR2)或人類葉酸受體3(FolR3)。在以上實施例中之任一者的活化T細胞之雙特異性抗原結合分子的一個實施例中，抗原結合部分結合至包含人類FolR1之胺基酸25至234(SEQ ID NO：227)的FolR1多肽。在以上實施例中之任一者的活化T細胞之雙特異性抗原結合分子的一個實施例中，FolR1抗原結合部分結合至包含SEQ ID NO：227之胺基酸序列的FolR1多肽、包含SEQ ID NO：230之胺基酸序列的FolR1多肽及包含SEQ ID NO：231之胺基酸序列的FolR1多肽，且其中 該FolR1抗原結合部分不結合至包含SEQ ID NO：228或229之胺基酸序列的FolR多肽。在一個特定實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含FolR1抗原結合部分，其結合至包含SEQ ID NO：227、230及231之胺基酸序列的FolR1多肽，且其中該FolR1抗原結合部分不結合至包含SEQ ID NO：228或229之胺基酸序列的FolR多肽，且包含CD3抗原結合部分，其包含SEQ ID NO：37之重鏈CDR1、SEQ ID NO：38之重鏈CDR2、SEQ ID NO：39之重鏈CDR3、SEQ ID NO：32之輕鏈CDR1、SEQ ID NO：33之輕鏈CDR2及SEQ ID NO：34之輕鏈CDR3；及兩個FolR1抗原結合部分，各包含SEQ ID NO：8之重鏈CDR1、SEQ ID NO：9之重鏈CDR2、SEQ ID NO：50之重鏈CDR3、SEQ ID NO：52之輕鏈CDR1、SEQ ID NO：53之輕鏈CDR2及SEQ ID NO：54之輕鏈CDR3。
在以上實施例中之任一者的活化T細胞之雙特異性抗原結合分子的一個實施例中，FolR1抗原結合部分結合至包含SEQ ID NO：227之胺基酸序列的FolR1多肽及包含SEQ ID NO：231之胺基酸序列的FolR1多肽，且其中該FolR1抗原結合部分不結合至包含SEQ ID NO：228、229或230之胺基酸序列的FolR多肽。在一個特定實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子包含FolR1抗原結合部分，其結合至包含SEQ ID NO：227之胺基酸序列的FolR1多肽及包含SEQ ID NO：231之胺基酸序列的FolR1多肽，且其中該FolR1抗原結合部分不結合至包含SEQ ID NO：228、229或230之胺基酸序列的FolR多肽，且包含CD3抗原結合部分，其包含SEQ ID NO：37之重鏈CDR1、SEQ ID NO：38之重鏈CDR2、SEQ ID NO：39之重鏈CDR3、SEQ ID NO：32之輕鏈CDR1、SEQ ID NO：33之輕鏈CDR2及SEQ ID NO：34之輕鏈CDR3；及兩個FolR1抗原結合部分，各包含SEQ ID NO：16之重鏈CDR1、SEQ ID NO：275之重鏈CDR2、SEQ ID NO：315之重鏈CDR3、SEQ ID NO：32之輕鏈CDR1、SEQ ID NO：33之輕鏈CDR2及SEQ ID NO：34之輕鏈CDR3。
關於FolR1，本文中所涵蓋之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子可具有促效劑、拮抗劑或中性作用。促效劑作用之實例包括誘導或增強在FolR1結合部分與目標細胞上之FolR1受體接合之後經由FolR1之信號傳導。拮抗劑活性之實例包括取消或減弱在FolR1結合部分與目標細胞上之FolR1受體接合之後經由FolR1之信號傳導。此可例如藉由阻擋或減弱葉酸與FolR1之間的相互作用而發生。尤其涵蓋本文所揭示之實施例之序列變異體，其具有較低親和力同時保留上述生物性質。
免疫結合物
本發明亦關於包含活化T細胞之雙特異性抗原結合分子與細胞毒性劑結合之免疫結合物，該細胞毒性劑諸如化學治療劑、生長抑制劑、毒素(例如，細菌、真菌、植物或動物來源之酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(亦即放射性結合物)。
聚核苷酸
本發明進一步提供編碼如本文所述之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子或其片段的經分離聚核苷酸。
本發明之聚核苷酸包括與SEQ ID NO：151至226中所闡述之序列(包括其功能片段或變異體)至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的聚核苷酸。
編碼本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子的聚核苷酸可以編碼整個活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之單一聚核苷酸形式或以共表現之多種(例如兩種或兩種以上)聚核苷酸形式表現。由共表現之聚核苷酸編碼的多肽可經由例如二硫鍵或形成功能性活化T細胞之雙特異性抗原結合分子的其他方式結合。舉例而言，抗原結合部分 之輕鏈部分可由來自活化T細胞之雙特異性抗原結合分子中包含抗原結合部分之重鏈部分、Fc域亞單元及視情況存在之另一抗原結合部分(之一部分)的部分的各別聚核苷酸編碼。共表現時，重鏈多肽將與輕鏈多肽結合形成抗原結合部分。在另一實例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子中包含兩個Fc域亞單元中之一者及視情況存在之一或多個抗原結合部分(之一部分)的部分可由來自活化T細胞之雙特異性抗原結合分子中包含兩個Fc域亞單元之另一者及視情況存在之抗原結合部分(之一部分)的部分的各別聚核苷酸編碼。共表現時，Fc域亞單元將結合而形成Fc域。
在一些實施例中，經分離聚核苷酸編碼如本文所述之本發明之整個活化T細胞之雙特異性抗原結合分子。在其他實施例中，經分離聚核苷酸編碼如本文所述之本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子中所包含之多肽。
在另一實施例中，本發明係有關一種編碼本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子或其片段的經分離聚核苷酸，其中該聚核苷酸包含編碼如以下各者中所示之可變區序列的序列：SEQ ID NO：151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182及205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223。在另一實施例中，本發明係有關一種編碼活化T細胞之雙特異性抗原結合分子或其片段的經分離聚核苷酸，其中該聚核苷酸包含編碼如以下各者中所示之多肽序列的序列：SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、 50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244。在另一實施例中，本發明進一步有關一種編碼本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子或其片段的經分離聚核苷酸，其中該聚核苷酸包含與以下各者中所示之核苷酸序列至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致的序列：97、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、12、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、246、247。在另一實施例中，本發明係有關一種編碼本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子或其片段的經分離聚核苷酸，其中該聚核苷酸包含以下各者中所示之核酸序列：SEQ ID NO：97、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、12、213、214、215、216、217、218、 219、220、221、222、223、224、225、226、246、247。在另一實施例中，本發明係有關一種編碼本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子或其片段的經分離聚核苷酸，其中該聚核苷酸所包含之序列編碼與以下各者中之胺基酸序列至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致的可變區序列：SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、11、13、15、19、21、12、25、27、29、31、36、41、45、49、51、55、58、62、64、66、68、70、72、74、76、78、82、113、114、115、116、117、118、119、12、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135。在另一實施例中，本發明係有關一種編碼活化T細胞之雙特異性抗原結合分子或其片段的經分離聚核苷酸，其中該聚核苷酸所包含之序列編碼包含一或多個與SEQ ID NO：8、9、50、37、38及39中之胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致的序列的多肽。本發明涵蓋一種編碼本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子或其片段的經分離聚核苷酸，其中該聚核苷酸所包含之序列編碼以下各者含保守胺基酸取代之可變區序列：SEQ ID NO：151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182及205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223。本發明亦涵蓋一種編碼本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子或其片段的經分離聚核苷酸，其中該聚核苷酸所包含之序列編碼以下各者含保守胺基酸取代之多肽序列：SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、 51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138及227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244。
在某些實施例中，該聚核苷酸或核酸為DNA。在其他實施例中，本發明之聚核苷酸為RNA，例如呈信使RNA(mRNA)形式。本發明之RNA可為單股或雙股RNA。
重組方法
本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子可藉由例如固態肽合成(例如梅里菲爾德固相合成(Merrifield solid phase synthesis))或重組製造法獲得。關於重組製造，分離出一或多個編碼例如如上文所述的活化T細胞之雙特異性抗原結合分子(片段)的聚核苷酸且將其插入一或多個載體中以便在宿主細胞中進一步選殖及/或表現。此類聚核苷酸可容易使用習知程序分離及定序。在一個實施例中，提供包含本發明之聚核苷酸中之一或多者的載體，較佳為表現載體。可使用熟習此項技術者已熟知的方法構築含有活化T細胞之雙特異性抗原結合分子(片段)之編碼序列與適當轉錄/轉譯控制信號的表現載體。此等方法包括活體外重組DNA技術、合成技術及活體內重組/基因重組。參見例如Maniatis等人，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL,Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.(1989)；及Ausubel等人，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,Greene Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y(1989)中所述之技術。表現載體可為質體、病毒之一部分，或可為核酸片段。表現載體包括表現卡匣，其中編碼活化T細胞之雙特異性抗原結合分子(片段)的聚核苷酸(亦即編碼區)以與啟動子及/或其他轉錄或轉譯控制元件可操作結合之方式選殖至該表現卡匣中。如本文所用，「編碼區」為核酸中由轉譯成胺基酸之密碼子組成的一部分。「終止密碼子」(TAG、TGA或TAA)雖然未轉譯成胺基酸，但其可視為編碼區(若存在)之一部分，但任何側接序列(例如啟動子、核糖體結合位點、轉錄終止子、內含子、5'及3'未轉譯區及類似序列)並非編碼區之一部分。兩個或兩個以上編碼區可存在於單一聚核苷酸構築體中，例如單一載體上，或存在於各別聚核苷酸構築體中，例如各別(不同)載體上。此外，任何載體可含有單一編碼區，或可包含兩個或兩個以上編碼區，例如本發明之載體可編碼一或多個多肽，其經由蛋白水解分裂而轉譯後或共轉譯分離成最終蛋白質。另外，本發明之載體、聚核苷酸或核酸可編碼與編碼本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子(片段)的聚核苷酸或其變異體或衍生物融合或未融合的異源編碼區。異源編碼區包括(但不限於)專門化元件或基元，諸如分泌性信號肽或異源功能域。可操作結合為例如多肽之基因產物的編碼區與一或多個調節序列按使基因產物之表現受到調節序列之影響或控制的方式結合。若誘導啟動子功能引起編碼所要基因產物之mRNA轉錄且若兩個DNA片段之間連接的性質不干擾表現調節序列引導基因產物表現的能力或不干擾DNA模板轉錄的能力，則兩個DNA片段(諸如多肽編碼區及與其結合的啟動子)為「可操作地結合」。因此，若啟動子能夠實現編碼多肽之核酸的轉錄，則啟動子區域與該核酸可操作地結合。啟動子可為僅引導預定細胞中之DNA的實質性轉錄的細胞特異性啟動子。除啟動子之外的其他轉錄控制元件(例如強化子、操縱子、抑制子及轉錄終止信號)可與 引導細胞特異性轉錄的聚核苷酸可操作地結合。適合啟動子及其他轉錄控制區揭示於本文中。多種轉錄控制區已為熟習此項技術者所知。此等區域包括(但不限於)在脊椎動物細胞中起作用的轉錄控制區，諸如(但不限於)啟動子及強化子區段，其來自巨細胞病毒(例如即刻早期啟動子，連同內含子A)、猿猴病毒40(例如早期啟動子)及反轉錄病毒(諸如勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus))。其他轉錄控制區包括來源於脊椎動物基因(諸如肌動蛋白、熱休克蛋白、牛生長激素及兔â-血球蛋白)的彼等區域，以及能夠控制真核細胞中之基因表現的其他序列。其他適合轉錄控制區包括組織特異性啟動子及強化子以及誘導性啟動子(例如啟動子誘導性四環素(tetracyclin))。類似地，多種轉譯控制元件已為一般技術者所知。此等元件包括(但不限於)核糖體結合位點、轉譯起始及終止密碼子，以及來源於病毒系統的元件(特定言之，內部核糖體進入位點或IRES，亦稱為CITE序列)。表現卡匣亦可包括其他特徵，諸如複製起點，及/或染色體整合元件，諸如反轉錄病毒長末端重複序列(LTR)，或腺相關病毒(AAV)反向末端重複序列(ITR)。
本發明之聚核苷酸及核酸編碼區可與編碼分泌肽或信號肽的其他編碼區結合，從而引導由本發明之聚核苷酸編碼的多肽的分泌。舉例而言，若需要分泌活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，則編碼信號序列的DNA可置於編碼本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子或其片段之核酸的上游。根據信號假設，哺乳動物細胞所分泌的蛋白質具有自成熟蛋白質裂解(一旦生長蛋白質鏈跨越粗糙內質網輸出已起始)的信號肽或分泌性前導序列。一般技術者清楚，脊椎動物細胞分泌的多肽一般具有與多肽N端融合的信號肽，該信號肽自所轉譯多肽裂解而產生呈分泌或「成熟」形式的多肽。在某些實施例中，使用原生信號肽(例如免疫球蛋白重鏈或輕鏈信號肽)，或該序列之功能 衍生物，該功能衍生物保留引導與其可操作地結合之多肽之分泌的能力。或者，可使用異源哺乳動物信號肽，或其功能衍生物。舉例而言，野生型前導序列可經人類組織纖維蛋白溶酶原活化因子(TPA)或小鼠β-葡糖醛酸酶之前導序列取代。
編碼可用於促進隨後純化(例如組胺酸標籤)或有助於標記活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之短蛋白質序列的DNA可包括於編碼活化T細胞之雙特異性抗原結合分子(片段)之聚核苷酸的內部或末端。
在另一實施例中，提供包含一或多種本發明聚核苷酸之宿主細胞。在某些實施例中，提供包含一或多種本發明載體之宿主細胞。聚核苷酸及載體可併入本文分別關於聚核苷酸及載體所述之任何特徵(單個或組合)。在一個此類實施例中，宿主細胞包含(例如，已經轉型或轉染)載體，該載體包含編碼本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子(之一部分)的聚核苷酸。如本文所用，術語「宿主細胞」係指可經工程改造而產生本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子或其片段的任何種類之細胞系統。適於複製及支持活化T細胞之雙特異性抗原結合分子表現的宿主細胞在此項技術中已熟知。此類細胞適當時可經特定表現載體轉染或轉導且可使大量含有載體的細胞生長用於接種大型醱酵器，以獲得足量的活化T細胞之雙特異性抗原結合分子用於臨床應用。適合的宿主細胞包括原核微生物，諸如大腸桿菌，或各種真核細胞，諸如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、昆蟲細胞或其類似物。舉例而言，可在細菌中產生多肽，尤其在不需要糖基化時。表現之後，多肽可以可溶性部分自細菌細胞糊狀物中分離且可進一步純化。除原核生物外，諸如絲狀真菌或酵母之真核微生物亦為適用於編碼抗體之載體的選殖或表現宿主，包括糖基化路徑已經「人類化」、從而產生具有部分或完全人類糖基化型態之多肽的真菌及酵母株。參見Gerngross,Nat Biotech 22,1409-1414(2004)及Li等人，Nat Biotech 24,210-215(2006)。適用於表現(糖基化)多肽的宿主細胞亦來源於多細胞生物體(無脊椎動物及脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已鑑別出眾多可與昆蟲細胞聯合使用，尤其用於轉染草地黏蟲(Spodoptera frugiperda )細胞之桿狀病毒株。植物細胞培養物亦可用作宿主。參見例如美國專利第5,959,177號、第6,040,498號、第6,420,548號、第7,125,978號及第6,417,429號(描述在轉殖基因植物中產生抗體的PLANTIBODIESTM 技術)。脊椎動物細胞亦可用作宿主。舉例而言，適於在懸浮液中生長之哺乳動物細胞株可為適用的。適用哺乳動物宿主細胞株之其他實例為經SV40轉型的猴腎CV1細胞株(COS-7)；人類胎腎細胞株(293或293T細胞，如例如Graham等人，J Gen Virol 36,59(1977)中所述)；幼倉鼠腎細胞(BHK)；小鼠塞特利氏細胞(mouse sertoli cell)(TM4細胞，如例如Mather,Biol Reprod 23,243-251(1980)中所述)；猴腎細胞(CV1)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76)；人類子宮頸癌細胞(HELA)；犬腎細胞(MDCK)；水牛鼠肝細胞(buffalo rat liver cell)(BRL 3A)；人類肺細胞(W138)；人類肝細胞(Hep G2)；小鼠乳腺腫瘤細胞(MMT 060562)；TRI細胞(如例如Mather等人，Annals N.Y.Acad Sci 383,44-68(1982)中所述)；MRC 5細胞及FS4細胞。其他適用的哺乳動物宿主細胞株包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括dhfr- CHO細胞(Urlaub等人，Proc Natl Acad Sci USA 77,4216(1980))；及骨髓瘤細胞株，諸如YO、NS0、P3X63及Sp2/0。關於適於產生蛋白質的某些哺乳動物宿主細胞株之綜述，參見例如Yazaki及Wu,Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo編，Humana Press,Totowa,NJ)，第255-268頁(2003)。宿主細胞包括經培養細胞，例如經培養之哺乳動物細胞、酵母細胞、昆蟲細胞、細菌細胞及植物細胞(僅舉數例)，而且包括轉殖基因動物、轉殖基因植物或經培養之植物或動物組織中所包含的細胞。在一個實施例中，宿主細 胞為真核細胞，較佳為哺乳動物細胞，諸如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、人類胎腎(HEK)細胞或淋巴細胞(例如Y0、NS0、Sp20細胞)。
此項技術中已知在此等系統中表現外源基因的標準技術。表現包含抗原結合域之重鏈或輕鏈之多肽(諸如抗體)的細胞可經工程改造以便亦表現抗體鏈中之另一者，使得所表現產物為具有重鏈與輕鏈的抗體。
在一個實施例中，提供一種製造本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子的方法，其中該方法包含在適於表現活化T細胞之雙特異性抗原結合分子的條件下培養如本文所提供之包含編碼活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之聚核苷酸的宿主細胞，以及自宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收活化T細胞之雙特異性抗原結合分子。
活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之組分以遺傳學方式彼此間融合。活化T細胞之雙特異性抗原結合分子可設計成其組分彼此間直接融合或經由連接子序列間接融合。連接子之組成及長度可根據此項技術中熟知之方法確定且可測試其功效。活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之不同組分之間的連接子序列之實例可見於本文所提供之序列中。亦可包括額外序列以併入裂解位點，從而在必要時分離融合體之個別組分，該等額外序列例如肽鏈內切酶識別序列。
在某些實施例中，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子中之一或多個抗原結合部分包含至少一個能夠結合抗原決定子的抗體可變區。可變區可形成天然或非天然存在之抗體及其片段之一部分且來源於天然或非天然存在之抗體及其片段。多株抗體及單株抗體之製造方法在此項技術中已熟知(參見例如Harlow及Lane,「Antibodies,a laboratory manual」,Cold Spring Harbor Laboratory,1988)。非天然存在之抗體可使用固相肽合成法構築，可以重組方式產生(例如如美國專利第4,186,567號中所述)或可藉由例如篩選包含可變重鏈及可變輕 鏈的組合文庫來獲得(參見例如McCafferty之美國專利第5,969,108號)。
任何動物物種之抗體、抗體片段、抗原結合域或可變區可用於本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子中。適用於本發明的非限制性抗體、抗體片段、抗原結合域或可變區可具有鼠類、靈長類動物或人類來源。若活化T細胞之雙特異性抗原結合分子意欲用於人類用途，則可使用呈嵌合形式的抗體，其中抗體恆定區來自人類。呈人類化或完全人類形式的抗體亦可根據此項技術中熟知之方法製備(參見例如Winter之美國專利第5,565,332號)。人類化可藉由各種方法達成，包括(但不限於)(a)將非人類(例如供體抗體)CDR移植至人類(例如受者抗體)構架區及恆定區上，保留或不保留關鍵構架殘基(例如對於保留良好抗原結合親和力或抗體功能而言具有重要作用的彼等殘基)；(b)僅將非人類特異性決定區(SDR或a-CDR；對於抗體-抗原相互作用而言具有關鍵作用的殘基)移植至人類構架區及恆定區上；或(c)移植整個非人類可變域，但藉由表面殘基置換而用人類類似區段對其進行「遮掩」。人類化抗體及其製造方法綜述於例如Almagro及Fransson,Front Biosci 13,1619-1633(2008)中，且進一步描述於例如Riechmann等人，Nature 332,323-329(1988)；Queen等人，Proc Natl Acad Sci USA 86,10029-10033(1989)；美國專利第5,821,337號、第7,527,791號、第6,982,321號及第7,087,409號；Jones等人，Nature 321,522-525(1986)；Morrison等人，Proc Natl Acad Sci 81,6851-6855(1984)；Morrison及Oi,Adv Immunol 44,65-92(1988)；Verhoeyen等人，Science 239,1534-1536(1988)；Padlan,Molec Immun 31(3),169-217(1994)；Kashmiri等人，Methods 36,25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)移植)；Padlan,Mol Immunol 28,489-498(1991)(描述「表面重修」)；Dall'Acqua等人，Methods 36,43-60(2005)(描述「FR改 組」)；及Osbourn等人，Methods 36,61-68(2005)及Klimka等人，Br J Cancer 83,252-260(2000)(描述FR改組的「導向選擇」方法)中。人類抗體及人類可變區可使用此項技術中已知之各種技術產生。人類抗體大體上描述於van Dijk及van de Winkel,Curr Opin Pharmacol 5,368-74(2001)及Lonberg,Curr Opin Immunol 20,450-459(2008)中。人類可變區可形成藉由融合瘤方法製得之人類單株抗體的一部分且可來源於藉由融合瘤方法製得的人類單株抗體(參見例如Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第51-63頁(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。人類抗體及人類可變區亦可藉由如下製備：向已經修飾之轉殖基因動物投與免疫原，從而響應於抗原攻擊而產生完整人類抗體或具有人類可變區之完整抗體(參見例如Lonberg,Nat Biotech 23,1117-1125(2005)。人類抗體及人類可變區亦可藉由分離選自源自人類之噬菌體呈現文庫的Fv純系可變區序列來產生(參見例如Hoogenboom等人Methods in Molecular Biology 178,1-37(O'Brien等人編，Human Press,Totowa,NJ,2001)；及McCafferty等人，Nature 348,552-554；Clackson等人，Nature 352,624-628(1991))。噬菌體通常以單鏈Fv(scFv)片段或Fab片段形式呈現抗體片段。
在某些實施例中，適用於本發明的抗原結合部分根據例如美國專利申請公開案第2004/0132066號中所揭示之方法經工程改造可具有增強的結合親和力，該案之整個內容以引用的方式併入本文中。本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子結合至特定抗原決定子的能力可經由酶聯免疫吸附分析(ELISA)或熟習此項技術者熟悉的其他技術量測，例如表面電漿子共振技術(在BIACORE T100系統上分析)(Liljeblad等人，Glyco J 17,323-329(2000))及傳統結合分析(Heeley,Endocr Res 28,217-229(2002))。競爭分析可以用於鑑別與參考抗體競爭結合至特定抗原的抗體、抗體片段、抗原結合域或可變域，例如 與V9抗體競爭結合至CD3之抗體。在某些實施例中，此類競爭性抗體結合至參考抗體所結合之相同抗原決定基(例如線性或構形抗原決定基)。抗體所結合之抗原決定基之定位的例示性詳細方法提供於Morris(1996)「Epitope Mapping Protocols」,Methods in Molecular Biology第66卷(Humana Press,Totowa,NJ)中。在例示性競爭分析中，在溶液中培育所固定之抗原(例如CD3)，該溶液包含結合至該抗原的第一經標記抗體(例如US 6,054,297中所述之V9抗體)及待測試與第一抗體競爭結合至該抗原之能力的第二未標記抗體。第二抗體可存在於融合瘤上清液中。作為對照，在包含第一經標記抗體、但不包含第二未標記抗體之溶液中培育所固定之抗原。在允許第一抗體結合至抗原之條件下培育之後，移除過量的未結合抗體，且量測與所固定抗原結合之標記的量。若測試樣品中與所固定抗原結合之標記的量實質上低於對照樣品，則表明第二抗體與第一抗體競爭結合至抗原。參見Harlow及Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual第14章(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。
如本文所述製備之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子可藉由此項技術中已知之技術純化，諸如高效液相層析、離子交換層析、凝膠電泳、親和層析、尺寸排阻層析及類似技術。用於純化特定蛋白質的實際條件部分地視諸如淨電荷、疏水性、親水性等因素而定，且對於熟習此項技術者而言為顯而易見的。親和層析純化時，可使用活化T細胞之雙特異性抗原結合分子所結合的抗體、配體、受體或抗原。舉例而言，關於親和層析純化本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，可使用具有蛋白A或蛋白G之基質。可依序使用蛋白A或G親和層析及尺寸排阻層析來基本上分離活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，如實例中所述。活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之純度可藉由多種熟知分析方法中的任一者測定，包括凝膠電泳、高壓液相層析 及類似方法。舉例而言，如實例中所述表現的重鏈融合蛋白顯示為完整的且經正確組裝，如還原性SDS-PAGE所證明(參見例如圖2)。在約Mr 25,000、Mr 50,000及Mr 75,000解析出三條色帶，對應於活化T細胞之雙特異性抗原結合分子輕鏈、重鏈及重鏈/輕鏈融合蛋白之分子量預測值。
分析
本文所提供之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子可藉由此項技術中已知的各種分析，針對其物理/化學性質及/或生物學活性加以鑑別、篩選或表徵。
親和力分析
活化T細胞之雙特異性抗原結合分子對於Fc受體或目標抗原的親和力可根據實例中所闡述之方法，藉由表面電漿子共振(SPR)，使用標準儀器(諸如BIAcore儀器(GE Healthcare))來測定，且諸如受體或目標蛋白質可藉由重組表現來獲得。或者，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子對於不同受體或目標抗原的結合可使用表現特定受體或目標抗原的細胞株，例如藉由流動式細胞測量術(FACS)來評估。量測結合親和力的特定說明性及例示性實施例描述於下文及以下實例中。
根據一個實施例，藉由表面電漿子共振，使用BIACORE® T100機器(GE Healthcare)，在25℃下量測KD 。
為分析Fc部分與Fc受體之間的相互作用，藉由固定在CM5晶片上之抗Penta His抗體(以SEQ ID NO：306形式揭示之「Penta His」)(Qiagen)捕捉經His標記的重組Fc受體且使用雙特異性構築體作為分析物。簡言之，根據供應商說明書，用N-乙基-N'-(3-二甲胺基丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基丁二醯亞胺(NHS)活化羧基甲基化聚葡萄糖生物感測器晶片(CM5，GE Healthcare)。用10mM乙酸鈉，pH 5.0稀釋抗Penta-His抗體(以SEQ ID NO：306形式揭示之 「Penta-His」)至40μg/ml，隨後以5μl/min之流動速率注射以達成約6500個響應單位(RU)之偶聯蛋白質。注射配體之後，注射1M乙醇胺以將未反應之基團封端。隨後，在4或10nM下捕捉Fc受體60秒。關於動力學量測，在25℃下以30μl/min之流動速率注射雙特異性構築體(500nM與4000nM之間的範圍)於HBS-EP(GE Healthcare，10mM HEPES，150mM NaCl，3mM EDTA，0.05%界面活性劑P20，pH 7.4)中之四倍連續稀釋液120秒。
為測定對目標抗原之親和力，藉由如針對抗Penta-His抗體(以SEQ ID NO：306形式揭示之「Penta-His」)所述固定於經活化CM5感測器晶片表面上之抗人類Fab特異性抗體(GE Healthcare)捕捉雙特異性構築體。偶聯蛋白質之最終量為約12000RU。在300nM下捕捉雙特異性構築體90秒。使目標抗原以250nM至1000nM範圍內之濃度，以30μl/min之流動速率通過流動池，持續180秒。監測解離180秒。
藉由減去參考流動池上所得之反應來校正整體折射率差異。藉由朗格繆爾結合等溫線(Langmuir binding isotherm)之非線性曲線擬合，使用穩態反應來推導解離常數KD 。使用簡單的一比一朗格繆爾結合模型(BIACORE® T100評估軟體1.1.1版)，藉由同時擬合結合及解離感測器圖譜來計算結合速率(kon )及解離速率(koff )。平衡解離常數(KD )按比率koff /kon 來計算。參見例如Chen等人，J Mol Biol 293,865-881(1999)。
活性分析
本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子的生物活性可藉由如實例中所述的各種分析來量測。生物學活性可例如包括誘導T細胞增殖、誘導T細胞中之信號傳導、誘導T細胞中之活化標誌物的表現、誘導T細胞分泌細胞激素、誘導目標細胞(諸如腫瘤細胞)溶解及誘導腫瘤消退及/或改善存活率。
組合物、調配物及投藥途徑
在另一態樣中，本發明提供醫藥組合物，其包含本文所提供之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子中的任一者，例如用於以下治療方法中之任一者中。在一個實施例中，醫藥組合物包含本文所提供之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子中的任一者及醫藥學上可接受之載劑。在另一實施例中，醫藥組合物包含本文所提供之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子中的任一者及至少一種其他治療劑，例如如下文所述。
另外提供一種製造呈適於活體內投與之形式的本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子的方法，該方法包含(a)獲得本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，及(b)用至少一種醫藥學上可接受之載劑調配活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，藉此調配出用於活體內投與的活化T細胞之雙特異性抗原結合分子製劑。
本發明之醫藥組合物包含治療有效量之一或多種溶解於或分散於醫藥學上可接受之載劑中的活化T細胞之雙特異性抗原結合分子。片語「醫藥學上或藥理學上可接受」係指分子實體及組合物在所用劑量及濃度下對於接受者而言一般為無毒性的，亦即當適當時投與至動物(諸如人類)時，不會產生有害的過敏反應或其他不良反應。熟習此項技術者根據本發明將獲知含有至少一種活化T細胞之雙特異性抗原結合分子及視情況存在之另一種活性成分的醫藥組合物的製備，如Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Printing Company,1990中舉例說明，該文獻以引用的方式併入本文中。此外，關於動物(例如人類)投藥，應瞭解，製劑應滿足FDA生物學標準局(FDA Office of Biological Standards)或其他國家之相應機關所要求的無菌性、發熱性、總體安全及純度標準。較佳組合物為凍乾調配物或水溶液。如本文所用，「醫藥學上可接受之載劑」包括任何及所有溶劑、緩衝液、 分散介質、塗料、界面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(例如抗細菌劑、抗真菌劑)、等張劑、吸收延遲劑、鹽、防腐劑、抗氧化劑、蛋白質、藥物、藥物穩定劑、聚合物、凝膠、黏合劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑、甜味劑、調味劑、染料、類似材料及其組合，如一般技術者所知(參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Printing Company,1990，第1289-1329頁，該文獻以引用的方式併入本文中)。除非任何習知載劑與活性成分不相容，否則涵蓋其在治療或醫藥組合物中之用途。
組合物可包含不同類型的載劑，此視其是否以固體、液體或氣霧劑形式投與及投藥途徑(諸如注射)是否需要其為無菌而定。本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子(及任何其他治療劑)可如下投與：靜脈內、皮內、動脈內、腹膜內、病灶內、顱內、關節內、前列腺內、脾內、腎內、胸膜內、氣管內、鼻內、玻璃體內、陰道內、直腸內、瘤內、肌肉內、腹膜內、皮下、結膜下、囊泡內、經黏膜、心包內、臍內、眼內、經口、表面、局部、藉由吸人(例如氣霧劑吸入)、注射、輸注、連續輸注、直接局部灌注浸浴目標細胞、經由導管、經由灌洗法、於乳膏中、於脂質組合物(例如脂質體)中或藉由一般技術者已知的其他方法或前述者之任何組合(參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Printing Company,1990，該文獻以引用的方式併入本文中)。非經腸投藥，特定言之靜脈內注射，最常用於投與多肽分子，諸如本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子。
非經腸組合物包括為藉由注射(例如皮下、皮內、病灶內、靜脈內、動脈內、肌肉內、鞘內或腹膜內注射)投藥所設計的彼等組合物。關於注射，本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子可於水溶液中調配，較佳於生理上相容的緩衝液(諸如漢克氏溶液(Hanks' solution)、林格氏溶液(Ringer's solution)或生理鹽水緩衝液)中調配。溶液可含有調配劑，諸如懸浮劑、穩定劑及/或分散劑。或者，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子可呈粉末形式以便在使用之前用適合媒劑(例如無菌無熱原質水)復原。無菌可注射溶液係藉由必要時將有所需量之本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子與下文所列之各種其他成分一起併入適當溶劑中來製備。無菌性可容易藉由例如無菌過濾膜過濾來實現。一般而言，分散液係藉由將各種經滅菌之活性成分併入含有基本分散介質及/或其他成分的無菌媒劑中來製備。在用於製備無菌可注射溶液、懸浮液或乳液之無菌粉末的情況下，較佳製備方法為真空乾燥或冷凍乾燥技術，該等技術自預先無菌過濾之液體介質產生活性成分加任何其他所需成分之粉末。必要時，液體介質宜經緩衝，且在注射之前，首先用足量鹽水或葡萄糖使液體稀釋劑呈等張性。該組合物在製造及儲存條件下必須為穩定的，且必須避免諸如細菌及真菌之微生物的污染作用。應瞭解，內毒素污染應最低限度地保持在安全水準，例如低於0.5ng/mg蛋白質。適合的醫藥學上可接受之載劑包括(但不限於)：緩衝液，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基苯甲基銨；氯化六羥季銨；氯化苯甲烴銨(benzalkonium chloride)；苄索氯銨(benzethonium chloride)；苯酚、丁醇或苯甲醇；對羥苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽抗衡離子，諸如鈉；金屬錯 合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子界面活性劑，諸如聚乙二醇(PEG)。水性注射懸浮液可含有增加懸浮液黏度之化合物，諸如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇、聚葡萄糖或其類似物。視情況，懸浮液亦可含有適合穩定劑或增加化合物溶解性之試劑以允許製備高度濃縮之溶液。另外，活性化合物之懸浮液可製備成適當的油性注射懸浮液。適合親脂性溶劑或媒劑包括脂肪油，諸如芝麻油；或合成脂肪酸酯，諸如油酸乙酯或三酸甘油酯；或脂質體。
活性成分可截留於微膠囊中，例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合法所製備之微膠囊，例如分別為羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊；截留於膠態藥物遞送系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)中或巨乳液中。此類技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences(第18版，Mack Printing Company,1990)中。可製備持續釋放製劑。持續釋放型製劑之適合實例包括含有多肽之固體疏水性聚合物之半滲透基質，該等基質呈成形物品形式，例如膜或微膠囊。在特定實施例中，可注射組合物之延長吸收可藉由在組合物中使用延遲吸收劑(諸如單硬脂酸鋁、明膠或其組合)來達成。
除先前描述的組合物之外，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子亦可調配為儲槽式製劑。此類長效調配物可藉由植入(例如皮下或肌肉內植入)或藉由肌肉內注射來投與。因此，舉例而言，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子可用適合聚合物或疏水性材料(例如呈可接受之油中之乳液形式)或離子交換樹脂調配，或調配為微溶性衍生物，例如調配為微溶性鹽。
包含本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子的醫藥組合物可藉助於習知混合、溶解、乳化、囊封、截留或凍乾方法製造。醫藥組合物可使用一或多種有利於將蛋白質處理成可在醫藥學上使用之製 劑的生理學上可接受之載劑、稀釋劑、賦形劑或助劑，以習知方式調配。適當調配物視所選投藥途徑而定。
活化T細胞之雙特異性抗原結合分子可調配成呈游離酸或鹼、中性或鹽形式的組合物。醫藥學上可接受之鹽為實質上保留游離酸或鹼之生物活性的鹽。此等鹽包括酸加成鹽，例如與蛋白質組合物之游離胺基形成的鹽，或與無機酸(諸如鹽酸或磷酸)或有機酸(諸如乙酸、草酸、酒石酸或杏仁酸)形成的鹽。與游離羧基形成的鹽亦可衍生自無機鹼，諸如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵；或有機鹼，諸如異丙胺、三甲胺、組胺酸或普魯卡因(procaine)。相較於對應游離鹼形式，醫藥鹽傾向於更溶於水性及其他質子溶劑中。
治療方法及組合物
本文所提供之任一種活化T細胞之雙特異性抗原結合分子可用於治療方法中。本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子可用作免疫治療劑，例如治療癌症。
用於治療方法時，本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子係以符合良好醫學實務之方式調配、給予及投與。在此情形中考慮之因素包括所治療之特定病症、所治療之特定哺乳動物、個別患者之臨床病況、病症起因、藥劑遞送部位、投藥方法、投藥時程及醫學從業者已知的其他因素。
在一個態樣中，提供本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子用作藥物。在其他態樣中，提供本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子用於治療疾病。在某些實施例中，提供本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子用於治療方法中。在一個實施例中，本發明提供如本文所述之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子用於治療有需要之個體之疾病。在某些實施例中，本發明提供活化T細胞之雙特異性抗原結合分子用於治療患有疾病之個體的方法中，該方法包含向 該個體投與治療有效量之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子。在某些實施例中，所治療之疾病為增生性病症。在一特定實施例中，該疾病為癌症。在某些實施例中，該方法進一步包含向個體投與治療有效量之至少一種其他治療劑，例如抗癌劑(若所治療之疾病為癌症)。在其他實施例中，本發明提供如本文所述之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子用於誘導目標細胞(特定言之，腫瘤細胞)溶解。在某些實施例中，本發明提供活化T細胞之雙特異性抗原結合分子用於誘導個體中之目標細胞(特定言之，腫瘤細胞)溶解的方法中，該方法包含向該個體投與有效量之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子以誘導目標細胞溶解。根據任一上述實施例之「個體」為哺乳動物，較佳為人類。
在另一態樣中，本發明提供本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子用於製造或製備藥物的用途。在一個實施例中，該藥物用於治療有需要之個體的疾病。在另一實施例中，該藥物係用於治療疾病之方法中，該方法包含向患有疾病之個體投與治療有效量之藥物。在某些實施例中，所治療之疾病為增生性病症。在一特定實施例中，該疾病為癌症。在一個實施例中，該方法進一步包含向個體投與治療有效量之至少一種其他治療劑，例如抗癌劑(若所治療之疾病為癌症)。在另一實施例中，該藥物係用於誘導目標細胞(特定言之，腫瘤細胞)溶解。在另一實施例中，該藥物係用於誘導個體中之目標細胞(特定言之，腫瘤細胞)溶解的方法中，該方法包含向個體投與有效量之藥物以誘導目標細胞溶解。根據任一上述實施例之「個體」可為哺乳動物，較佳為人類。
在另一態樣中，本發明提供一種治療疾病之方法。在一個實施例中，該方法包含向患有此類疾病之個體投與治療有效量之本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子。在一個實施例中，向該個體投與包含本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子、呈醫藥學上可 接受之形式的組合物。在某些實施例中，所治療之疾病為增生性病症。在一特定實施例中，該疾病為癌症。在某些實施例中，該方法進一步包含向個體投與治療有效量之至少一種其他治療劑，例如抗癌劑(若所治療之疾病為癌症)。根據任一上述實施例之「個體」可為哺乳動物，較佳為人類。
在另一態樣中，本發明提供一種誘導目標細胞(特定言之，腫瘤細胞)溶解的方法。在一個實施例中，該方法包含使目標細胞與本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子在T細胞(特定言之，細胞毒性T細胞)存在下接觸。在另一態樣中，提供一種用於誘導個體中之目標細胞(特定言之，腫瘤細胞)溶解的方法。在一個此類實施例中，該方法包含向個體投與有效量之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子以誘導目標細胞溶解。在一個實施例中，「個體」為人類。
在某些實施例中，所治療之疾病為增生性病症，特定言之，癌症。癌症之非限制性實例包括膀胱癌、腦癌、頭頸癌、胰臟癌、肺癌、乳癌、卵巢癌、子宮癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、食道癌、結腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、胃癌、前列腺癌、血液癌、皮膚癌、鱗狀細胞癌、骨癌及腎臟癌。可使用本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子治療的其他細胞增殖病症包括(但不限於)位於以下中之贅瘤：腹部、骨、乳房、消化系統、肝臟、胰臟、腹膜、內分泌腺體(腎上腺、副甲狀腺、垂體、睾丸、卵巢、胸腺、甲狀腺)、眼、頭頸部、神經系統(中樞及周邊)、淋巴系統、骨盆、皮膚、軟組織、脾臟、胸區域及泌尿生殖系統。亦包括癌前病況或病變及癌症轉移。在某些實施例中，癌症係選自由以下組成之群：腎細胞癌、皮膚癌、肺癌、結腸直腸癌、乳癌、腦癌、頭頸癌。熟習此項技術者容易認識到，在許多情況下，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子可能不提供治癒，而是僅可提供部分益處。在一些實施例中，具有一些益處之生 理學變化亦視為治療上有益的。因此，在一些實施例中，提供生理學變化之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子的量視為「有效量」或「治療有效量」。需要治療之個體(subject)、患者或個體(individual)通常為哺乳動物，更特定言之，人類。
在一些實施例中，向細胞投與有效量之本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子。在其他實施例中，向個體投與治療有效量之本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子來治療疾病。
關於疾病之預防或治療，本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子(單獨或與一或多種其他額外治療劑組合使用時)的適當劑量將視以下而定：所治療之疾病類型、投藥途徑、患者體重、活化T細胞之雙特異性抗原結合分子類型、疾病之嚴重程度及病程、投與活化T細胞之雙特異性抗原結合分子係出於預防目的還是治療目的、先前或並行治療介人、患者臨床病史及對活化T細胞之雙特異性抗原結合分子的反應，以及主治醫師之判斷。負責投藥的從業者將在任何情況下確定組合物中活性成分之濃度及適用於單獨個體的劑量。本文中涵蓋各種給藥時程，包括(但不限於)單次投藥或經各個時間點多次投藥、團式投藥及脈衝式輸注。
活化T細胞之雙特異性抗原結合分子宜一次性或在一系列治療期間投與給患者。視疾病之類型及嚴重程度而定，約1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg至10mg/kg)之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子可為向患者投藥的初始候選劑量，無論例如藉由一或多次各別投藥或藉由連續輸注。視上文所提及之因素而定，一種典型的日劑量可在約1μg/kg至100mg/kg之範圍內或大於100mg/kg。對於歷經數日或更長時間之重複投與，治療一般將視病況而定持續至發生疾病症狀之所需抑制為止。活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之一種例示性劑量在約0.005mg/kg至約10mg/kg範圍內。在其他非限制性實例中，每次投藥 時的劑量亦可包含每公斤體重約1微克、每公斤體重約5微克、每公斤體重約10微克、每公斤體重約50微克、每公斤體重約100微克、每公斤體重約200微克、每公斤體重約350微克、每公斤體重約500微克、每公斤體重約1毫克、每公斤體重約5毫克、每公斤體重約10毫克、每公斤體重約50毫克、每公斤體重約100毫克、每公斤體重約200毫克、每公斤體重約350毫克、每公斤體重約500毫克至每公斤體重約1000毫克或1000毫克以上，及可自其中推導的任何範圍。在本文所列數字之可推導範圍之非限制性實例中，基於上述數字，可投與的範圍為每公斤體重約5mg至每公斤體重約100mg、每公斤體重約5微克至每公斤體重約500毫克等。因此，可向患者投與約0.5mg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/kg或10mg/kg(或其任何組合)中之一或多個劑量。此類劑量可間歇地投與，例如每週或每三週投與(例如使得患者接受約二至約二十，或例如約六個劑量之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子)。可投與初始較高起始劑量，隨後投與一或多個較低劑量。然而，其他給藥方案可為適用的。此療法之進展易於藉由習知技術及分析監測。
本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子一般以可有效達成預定目的的量使用。用於治療或預防疾病病況時，本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子或其醫藥組合物係以治療有效量投與或施用。治療有效量之確定完全屬於熟習此項技術者之能力範圍內，尤其根據本文所提供之詳細揭示內容。
關於全身性投藥，可首先自活體外分析(諸如細胞培養分析)估算治療有效劑量。接著可在動物模型中調配劑量以達成循環濃度範圍，包括如在細胞培養物中測定的IC50 。此類資訊可用於更準確地判定適用於人類之劑量。
初始劑量亦可自活體內資料(例如動物模型)、使用此項技術中熟知的技術估算。一般熟習此項技術者容易基於動物資料最佳化人類投 藥。
劑量及時間間隔可個別地調整以提供足以維持治療作用的活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之血漿含量。常見的患者注射投藥劑量範圍為約0.1至50毫克/公斤/天，通常為約0.5至1毫克/公斤/天。治療有效的血漿含量可藉由每日投與多個劑量來達成。血漿含量可藉由例如HPLC量測。
在局部投藥或選擇性吸收之情況下，活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之有效局部濃度可與血漿濃度無關。熟習此項技術者能夠最佳化治療有效局部劑量而無需不當實驗。
治療有效劑量之本文所述活化T細胞之雙特異性抗原結合分子通常提供治療益處而不會導致實質性毒性。活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之毒性及治療功效可藉由細胞培養或實驗動物之標準醫藥程序測定。可使用細胞培養分析及動物研究來確定LD50 (50%群體致死劑量)及ED50 (50%群體治療有效劑量)。毒性作用與治療作用之間的劑量比率為治療指數，其可以比率LD50 /ED50 表示。展現大治療指數的活化T細胞之雙特異性抗原結合分子為較佳的。在一個實施例中，本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子展現高治療指數。自細胞培養分析及動物研究獲得之資料可用於調配適用於人類的劑量範圍。該劑量較佳在循環濃度範圍內，包括毒性極小或無毒性的ED50 。該劑量可視各種因素而定在此範圍內變化，該等因素例如所採用之劑型、所採用之投藥途徑、個體之病況及類似因素。準確調配物、投藥途徑及劑量可由個別醫師鑒於患者之病況加以選擇(參見例如Fingl等人，1975,The Pharmacological Basis of Therapeutics，第1章第1頁，其以全文引用之方式併入本文中)。
用本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子治療之患者的主治醫師瞭解由於毒性、器官功能障礙及類似因素而如何及何時終止、 中斷或調整投藥。反之，主治醫師亦已知在臨床反應不充足(排除毒性)時將治療調整至較高水準。管理所關注病症時所投與劑量之量值將隨所治療之病況之嚴重強度及投藥途徑及類似因素而不同。病況之嚴重程度可例如部分地藉由標準預後評估方法來評估。另外，劑量及可能的給藥頻率亦將根據個別患者之年齡、體重及反應而變。
其他藥劑及療法
治療時，本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子可與一或多種其他藥劑組合投與。舉例而言，本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子可與至少一種其他治療劑共投與。術語「治療劑」涵蓋為治療需要此類治療之個體之症狀或疾病而投與的任何藥劑。此類其他治療劑可包含適於治療特定適應症的任何活性成分，較佳為具有互補活性、彼此間無不利影響的彼等活性成分。在某些實施例中，其他治療劑為免疫調節劑、細胞抑制劑、細胞黏附抑制劑、細胞毒性劑、細胞凋亡活化劑或增強細胞對細胞凋亡誘導劑之敏感性的藥劑。在一特定實施例中，其他治療劑為抗癌劑，例如微管中斷劑、抗代謝物、拓撲異構酶抑制劑(topoisomerase inhibitor)、DNA嵌入劑、烷化劑、激素療法、激酶抑制劑、受體拮抗劑、腫瘤細胞凋亡活化劑或抗血管生成劑。
此類其他藥劑宜以可有效達成預定目的之量組合存在。此類其他藥劑之有效量視活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之用量、病症或治療類型及上文所論述的其他因素而定。活化T細胞之雙特異性抗原結合分子通常以如本文所述之相同劑量及投藥途徑使用，或以本文所述劑量之約1%至99%，或以憑經驗/臨床上確定為適當的任何劑量及任何途徑使用。
上文指出的此類組合療法涵蓋組合投藥(其中在相同或各別組合物中包括兩種或兩種以上治療劑)及各別投藥，在此情況下，本發明 之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子之投與可發生於其他治療劑及/或佐劑之投與之前、同時及/或之後。本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子亦可與輻射療法組合使用。
在另一態樣中，本發明提供一種雙特異性抗體，其包含a)包含SEQ ID NO：274之可變重鏈域(VH)及SEQ ID NO：31之可變輕鏈域的第一抗原結合位點；及b)包含SEQ ID NO：36之可變重鏈域(VH)及SEQ ID NO：31之可變輕鏈域的第二抗原結合位點，該雙特異性抗體與PD-L1或FAP-4-1BBL之抗體組合使用。在一個實施例中，該雙特異性抗體進一步包含第三抗原結合位點，其包含SEQ ID NO：274之可變重鏈域(VH)及SEQ ID NO：31之可變輕鏈域。
製品
在本發明之另一態樣中，提供一種製品，其含有適用於治療、預防及/或診斷上文所描述之病症的材料。該製品包含容器及容器上或容器隨附之標籤或藥品說明書。適合的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可由各種材料形成，諸如玻璃或塑膠。容器容納某一組合物本身或某一組合物與可有效治療、預防及/或診斷病況之另一組合物之組合，且可具有無菌接取口(例如容器可為具有可由皮下注射針刺穿之塞子的靜脈內溶液袋或小瓶)。組合物中之至少一種活性劑為本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子。標籤或藥品說明書指示該組合物用於治療所選病況。此外，製品可包含(a)其中含有組合物的第一容器，其中該組合物包含本發明之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子；及(b)其中含有組合物的第二容器，其中該組合物包含另一種細胞毒性劑或其他治療劑。本發明之此實施例中之製品可進一步包含指示組合物可用於治療特定病況之藥品說明書。或者或另外，該製品可進一步包含第二(或第三)容器，其包含醫藥學上可接受之緩衝液，諸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽 水、林格氏溶液及右旋糖溶液。其可進一步包括就商業及使用者觀點而言所需之其他物質，包括其他緩衝液、稀釋劑、過濾器、針及注射器。
實例
以下為本發明之方法及組合物之實例。應理解，鑒於上文提供之一般說明，可實踐各種其他實施例。
一般方法 重組DNA技術
使用標準方法操縱DNA，如Sambrook等人，Molecular cloning：A laboratory manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989中所述。根據製造商說明書，使用分子生物學試劑。關於人類免疫球蛋白輕鏈及重鏈之核苷酸序列的總體資訊提供於Kabat,E.A.等人，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，NIH公告第91-3242號。
DNA定序
DNA序列藉由在Synergene(Schlieren)下之標準雙股定序測定。
基因合成
必要時，所要基因區段係藉由PCR，使用適當模板產生，或藉由Geneart AG(Regensburg,Germany)，藉由自動化基因合成，自合成寡核苷酸及PCR產物合成。在確切基因序列無法獲得的情況下，基於來自最近同源物的序列來設計寡核苷酸引子且藉由RT-PCR自來源於適當組織之RNA分離基因。將側接有單數個限制性核酸內切酶裂解位點的基因區段選殖至標準選殖/定序載體中。自經轉型之細菌純化質體DNA且藉由UV光譜學來測定濃度。經次選殖之基因片段之DNA序列藉由DNA定序來證實。基因區段經設計具有允許次選殖至相應表現載體中的適合限制位點。所有構築體均設計成5'端DNA序列編碼靶向真 核細胞中用於分泌之蛋白質的前導肽。
自PBMC分離初級人類泛T細胞
藉由Histopaque密度離心，自由本地血庫獲得之富含淋巴細胞之製劑(白血球層)或自來自健康人類供體之新鮮血液製備周邊血液單核細胞(PBMC)。簡言之，用無菌PBS稀釋血液且血液依Histopaque梯度(Sigma,H8889)仔細分層。在室溫下在450×g下離心30分鐘之後(切斷制動器)，丟棄含PBMC之相界面上方之血漿部分。將PBMC轉移至新的50ml法爾康管(Falcon tube)中且用PBS填充管子至總體積為50ml。使混合物在室溫下在400×g下離心10分鐘(接通制動器)。丟棄上清液且PBMC集結粒用無菌PBS洗滌兩次(離心步驟在4℃下在350×g下持續10分鐘)。對所得PBMC群體進行自動計數(ViCell)且將其於RPMI1640培養基中儲存在培育箱中37℃，5% CO2 下直至分析開始為止，該培養基含有10% FCS及1% L-丙胺醯基-L-麩醯胺酸(Biochrom,K0302)。
使用泛T細胞分離套組II(Miltenyi Biotec #130-091-156)，根據製造商說明書，自PBMC富集T細胞。簡言之，在每1000萬個細胞40μl冷緩衝液(PBS與0.5% BSA、2mM EDTA，無菌過濾)中稀釋細胞集結粒且將其與每1000萬個細胞10μl生物素-抗體混合物一起在4℃下培育10分鐘。每1000萬個細胞添加30μl冷緩衝液及20μl抗生物素磁珠，且混合物在4℃下再培育15分鐘。藉由添加10-20×當前體積及在300×g下持續10分鐘之後續離心步驟來洗滌細胞。將多達1億個細胞再懸浮於500μl緩衝液中。使用LS管柱(Miltenyi Biotec #130-042-401)，根據製造商說明書，執行未標記之人類泛T細胞的磁性分離。對所得T細胞群體進行自動計數(ViCell)且將其於AIM-V培養基中儲存在培育箱中37℃，5% CO2 下直至分析開始為止(不超過24小時)。
自PBMC分離初級人類未處理T細胞
藉由Histopaque密度離心，自由本地血庫獲得之富含淋巴細胞之 製劑(白血球層)或自來自健康人類供體之新鮮血液製備周邊血液單核細胞(PBMC)。使用來自Miltenyi Biotec(#130-093-244)之未處理CD8+ T細胞分離套組，根據製造商說明書，但跳過CD8+ T細胞之最後一個分離步驟，自PBMC富集T細胞(亦參見關於初級人類泛T細胞之分離的描述)。
自脾細胞分離鼠類泛T細胞
根據製造商說明書，自C57BL/6小鼠分離出脾，將其轉移至含有MACS緩衝液(PBS+0.5% BSA+2mM EDTA)之GentleMACS C管(Miltenyi Biotech #130-093-237)中且用GentleMACS解離劑解離，從而獲得單細胞懸浮液。使細胞懸浮液通過預分離過濾器以移除剩餘的未解離組織粒子。在400×g下在4℃下離心4分鐘之後，添加ACK溶解緩衝液以溶解紅血細胞(在室溫下培育5分鐘)。剩餘的細胞用MACS緩衝液洗滌兩次，計數且用於分離鼠類泛T細胞。使用來自Miltenyi Biotec(#130-090-861)之泛T細胞分離套組，遵循製造商說明書，執行陰性(磁性)選擇。所得T細胞群體自動計數(ViCell)且立即用於進一步分析。
自肝素化血液分離初級食蟹獼猴PBMC
藉由密度離心，自來自健康的食蟹獼猴供體之新製血液如下製備周邊血液單核細胞(PBMC)：用無菌PBS 1：3稀釋肝素化血液，且用無菌PBS將Lymphoprep培養基(Axon Lab #1114545)稀釋至90%。在一個體積之經稀釋之密度梯度中分層得到兩個體積之經稀釋血液，且藉由在室溫下在520×g下在無制動器之情況下離心30分鐘來分離PBMC部分。將PBMC條帶轉移至新的50ml法爾康管中且藉由在4℃下在400×g下離心10分鐘，用無菌PBS洗滌。進行一次低速離心以移除血小板(15分鐘，在150×g，4℃下)，且所得PBMC群體自動計數(ViCell)且立即用於進一步分析。
實例1 純化經生物素化葉酸受體-Fc融合體
為產生針對人類FolR1之新抗體，以單價Fc融合蛋白(抗原之細胞外域連接至Fc-杵之鉸鏈區，Fc-杵與Fc-臼分子共表現)形式產生以下抗原及篩選工具。基於自GenBank或SwissProt獲得之序列合成抗原基因(Geneart,Regensburg,Germany)且將其插入表現載體中，產生含Fc-杵與用於活體內或活體外生物素化之C端Avi標籤的融合蛋白。在製造期間，藉由編碼細菌生物素連接酶之細菌birA基因之共表現達成活體內生物素化。所有基因之表現均在質體上之嵌合MPSV啟動子的控制下，該質體含有用於在含EBNA之細胞株中穩定維持質體的oriP元件。
關於生物素化單體抗原/Fc融合分子之製備，用三個編碼融合蛋白之兩個組分(杵及臼鏈)的載體以及BirA(生物素化反應所需之酶)共轉染以指數方式生長之懸浮液HEK293 EBNA細胞。以9.5：9.5：1比率使用相應載體(「抗原ECD-Fc杵-avi標籤」：「Fc臼」：「BirA」)。
關於在500ml搖瓶中製造蛋白質，在轉染之前24小時接種4億個HEK293 EBNA細胞。關於轉染，使細胞在210g下離心5分鐘，且用預溫熱之CD CHO培養基置換上清液。使表現載體再懸浮於20mL含有200μg載體DNA之CD CHO培養基中。在添加540μL聚乙烯亞胺(PEI)之後，將溶液混合15秒且在室溫下培育10分鐘。隨後，將細胞與DNA/PEI溶液混合，轉移至500mL搖瓶中且在具有5% CO2 氛圍的培育箱中在37℃下培育3小時。在培育之後，添加160mL F17培養基且培養細胞24小時。在轉染之後一天，向培養物中添加1mM丙戊酸及7%饋料1(Lonza)。生產培養基亦補充有100μM生物素。培養7天之後，藉由使細胞在210g下短暫離心15分鐘收集細胞上清液。將溶液無菌過濾(0.22μm過濾器)，補充疊氮化鈉至最終濃度為0.01%(w/v)， 且保持在4℃下。
藉由親和層析，使用蛋白A，隨後藉由尺寸排阻層析，自細胞培養物上清液純化所分泌之蛋白質。關於親和層析，將上清液加載至經40mL之20mM磷酸鈉、20mM檸檬酸鈉(pH 7.5)平衡的HiTrap蛋白AHP管柱(CV=5mL，GE Healthcare)上。藉由用至少10管柱體積之20mM磷酸鈉、20mM檸檬酸鈉(pH 7.5)洗滌來移除未結合蛋白質。使用在20管柱體積之20mM檸檬酸鈉、100mM氯化鈉、100mM甘胺酸(pH 3.0)中形成之線性pH梯度來溶離結合蛋白質。隨後用10管柱體積之20mM檸檬酸鈉、100mM氯化鈉、100mM甘胺酸(pH 3.0)洗滌管柱。
藉由添加1/10(v/v)之0.5M磷酸鈉(pH 8.0)來調整所收集之溶離份之pH。將蛋白質進行濃縮且過濾，隨後加載至經20mM組胺酸、140mM氯化鈉(pH 6.0)平衡的HiLoad Superdex 200管柱(GE Healthcare)上。
蛋白質濃度係藉由量測280nm下之光學密度(OD)，使用基於胺基酸序列所計算之莫耳消光係數來測定。藉由SDS毛細管電泳，在存在及不存在還原劑之情況下，遵循製造商說明書(儀器測徑規LabChipGX,Perkin Elmer)分析FolR1-Fc融合體之純度及分子量。在25℃下，使用在25mM K2HPO4、125mM NaCl、200mM L-精胺酸單鹽酸鹽、0.02%(w/v)NaN3，pH 6.7操作緩衝液中平衡之TSKgel G3000 SW XL分析型尺寸排阻管柱(Tosoh)分析樣品中之聚集體含量。
藉由表面電漿子共振分析，使用市售抗體來分析經純化之抗原-Fc融合蛋白，從而確認抗原之正確的天然構形(資料未示出)。
Figure 104138283-A0202-12-0107-2
Figure 104138283-A0202-12-0107-3
實例2 產生具有CD3ε特異性之共同輕鏈
本文所述之活化T細胞之雙特異性分子包含至少一個CD3結合部分。此部分可藉由使實驗室動物免疫、篩選噬菌體文庫或使用已知抗 CD3抗體來產生。藉由使鼠類親本抗CD3ε抗體(CH2527)之輕鏈人類化來產生具有CD3ε特異性之共同輕鏈。關於非人類來源之抗體的人類化，必須將來自非人類抗體(供體)之CDR殘基移植至人類(受體)抗體之構架上。一般而言，藉由以下選擇受體構架序列：比對供體序列與一批可能的受體序列且選擇與供體具有合理的同源性或在對結構及活性至關重要的一些位置顯示類似胺基酸的序列。在當前情況下，藉由比對親本抗體之小鼠VL域序列與一批人類生殖系序列且選擇顯示高序列一致性之人類序列來搜尋抗體受體構架。出人意料地，在屬於λ類V域家族7之相當罕見的人類輕鏈中，更精確而言在hVL_7_46(IMGT命名法，GenBank寄存編號Z73674)中發現了就構架序列同源性而言的良好匹配。隨後選擇此罕見的人類輕鏈作為用於CH2527之輕鏈之人類化的受體構架。將小鼠輕鏈可變域之三個互補決定區(CDR)移植至此受體構架上。因為構架4區並非生殖系V基因之可變區的一部分，所以有關此區域(J元件)之比對單獨進行。因此，選擇IGLJ3-02序列用於此輕鏈之人類化。
產生十三個人類化變異體(CH2527-VL7_46-1至VL7_46-10、VL7_46-12至VL7_46-14)。此等變異體之構架殘基(及其組合)或CDR殘基(Kabat定義)不同，該等構架殘基回復突變為鼠類V域序列且該等CDR殘基可以保持與人類生殖系序列一致。在最終人類化VL域變異體VL7_46-13(所列鼠類殘基)中，超出CDR之以下構架殘基回復突變為鼠類殘基：分別為V36、E38、F44、G46、G49及G57。人類J元件IGLJ3-02與鼠類親本抗體之J元件100%一致。
實例3 具有CD3ε特異性之人類化變異體的SPR評定
以呈2+1經典格式之嵌合體形式(圖1D)評定人類化VL變異體，亦即人類化輕鏈V域與鼠類重鏈V域配對。在ProteOn XPR36儀器(Bio- Rad)上進行SPR評定。更精確而言，在抗Fab衍生化GLM感測器晶片(山羊抗人類IgG，F(ab')2片段特異性，Jackson ImmunoResearch)上，沿垂直取向自培養物上清液直接捕捉變異體。隨後以單一濃度水平注射以下分析物來評定與人類及食蟹獼猴CD3ε之結合：分別為3μM hu CD3ε(-1-26)-Fc(杵)-avi(ID807)及2.5μM cy CD3ε-(-1-26)-Fc(杵)-Avi-Fc(臼)(ID873)。針對鼠類對照構築體之結合，定性比較結合反應且分級為+(觀察到類似結合)、+/-(觀察到結合減少)及-(未觀察到結合)。在配體捕捉及分析物結合之各循環之後再生捕捉抗體且在研究結束時再注射鼠類構築體以確認捕捉表面之活性。結果概述於表3中。
Figure 104138283-A0202-12-0109-4
實例4 具有CD3ε特異性之人類化共同輕鏈的性質
選擇用於人類化前導分子之輕鏈V域變異體為VL7_46-13。測定人類化程度，亦即人類化V域與人類生殖系V域序列之序列同源性。關於VL7_46-13，與最近的人類生殖系同源物的總序列一致性在人類 化之前為65%且之後為80%。忽略CDR區，與最近的人類生殖系同源物之序列一致性為92%。如表3可見，VL7_46-13為一組13種變異體中唯一顯示出與親本鼠類抗體類似之結合且亦保留其與食蟹獼猴CD3ε之交叉反應性的人類化VL變異體。此結果表明，在不丟失與CD3ε之結合親和力(其需要若干回復突變為鼠類構架殘基(特定言之G46))同時保留CDR1中之G24的情況下使鼠類VL域人類化並非無足輕重的。另外，此結果顯示，VL域在目標識別中起關鍵作用。重要地，基於屬於λ類V域家族7且保留對CD3ε之親和力及特異性的罕見人類生殖系的人類化VL域VL7_46-13亦適合用作Fab格式之噬菌體呈現抗體文庫中之共同輕鏈且使得能夠成功選出極大地促進結合至CD3ε及例如腫瘤目標且共用同一個『共同』輕鏈之雙特異性分子的產生及製造的新穎特異性。
實例5 使用來源於HVK1-39之人類生殖系共同輕鏈產生噬菌體呈現抗體文庫
用於產生類似於全長人類IgG之雙特異性抗體的若干方法利用Fc區中誘導兩個不同重鏈之雜二聚的修飾。該等實例包括杵-臼(Merchant等人，Nat Biotechnol.1998年7月；16(7)：677-81)、SEED(Davis等人，Protein Eng Des Sel.2010年4月；23(4)：195-202)及靜電導引技術(Gunasekaran等人，J Biol Chem.2010年6月18日；285(25)：19637-46)。雖然此等方法能夠使兩個不同重鏈有效雜二聚，但同源輕鏈與重鏈之恰當配對依然成問題。使用共同輕鏈(LC)可解決此問題(Merchant等人Nat Biotech 16,677-681(1998))。
此處，吾人描述呈現於M13噬菌體上之抗體文庫的產生。基本上，吾人設計出用於重鏈與一個恆定(或「共同」)輕鏈之多構架文庫。此文庫經設計用於在不需要使用複雜技術來避免輕鏈誤配的情況下產生多特異性抗體。
藉由使用共同輕鏈，可促進此等分子之產生，因為不再發生誤配；且有助於分離出高純度雙特異性抗體。相比於其他格式，使用Fab片段作為構造部分相較於例如使用scFv片段而言產生更高的熱穩定性且無scFv聚集及分子間scFv形成。
文庫產生
在下文中，描述呈現於M13噬菌體上之抗體文庫的產生。基本上，吾人設計出用於重鏈與一個恆定(或「共同」)輕鏈之多構架文庫。
吾人在文庫中使用此等重鏈(GenBank寄存編號在括號中)：
IGHV1-46*01(X92343)(SEQ ID NO：104)
IGHV1-69*06(L22583)(SEQ ID NO：105)
IGHV3-15*01(X92216)(SEQ ID NO：106)
IGHV3-23*01(M99660)(SEQ ID NO：107)
IGHV4-59*01(AB019438)(SEQ ID NO：108)
IGHV5-51*01(M99686)(SEQ ID NO：109)
所有重鏈使用IGHJ2作為J元件，但IGHV1-69*06改用IGHJ6序列。隨機化之設計包括CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3。關於CDR-H1及CDR-H2，選擇「軟」隨機化策略，且隨機化寡核苷酸使得生殖系序列之胺基酸的密碼子以50%存在。除半胱胺酸之外的所有其他胺基酸總計達剩餘的50%。在CDR-H3中，在由於遺傳D元件之存在而不存在生殖系胺基酸的情況下，將寡核苷酸設計成允許在V元件與J元件之間使用長度為4至9個胺基酸的隨機化插入物。此等寡核苷酸含於其隨機化部分中，例如三個胺基酸G/Y/S各存在15%，胺基酸A/D/T/R/P/L/V/N/W/F/I/E各存在4.6%。
用於產生抗體文庫之例示性方法描述於Hoogenboom等人，Nucleic Acids Res.1991,19,4133-413；Lee等人，J.Mol.Biol.(2004) 340,1073-1093中。
輕鏈來源於人類序列hVK1-39，且以未經修飾且非隨機化方式使用。此將確保同一輕鏈可用於其他項目而無需額外修飾。
例示性文庫選擇：
根據以下程序，使用目標抗原X之單體及生物素化細胞外域，在溶液中進行所有親和力成熟文庫的選擇。
1. 在1ml總體積中，各文庫之1012 個噬質體粒子結合至100nM生物素化可溶性抗原，持續0.5小時。2. 捕捉生物素化抗原，且特定言之，藉由添加約5×107 顆經抗生蛋白鏈菌素塗佈之磁珠，持續10分鐘來分離所結合之噬菌體粒子。3. 使用5-10×1ml PBS/Tween20及5-10×1ml PBS洗滌珠粒。4. 藉由添加1ml 100mM TEA(三乙胺)溶離噬菌體粒子，歷時10分鐘，且藉由添加500μl 1M Tris/HCl pH 7.4進行中和；及5. 再感染以指數方式生長的大腸桿菌TG1細菌，用輔助噬菌體VCSM13感染且隨後在後續幾輪選擇中施加噬質體粒子之PEG/NaCl沈澱。使用恆定或遞減(自10-7 M至2×10-9 M)抗原濃度進行3-5輪選擇。在第2輪中，使用中性鏈親和素培養盤代替抗生蛋白鏈菌素珠粒捕捉抗原/噬菌體複合物。用100nM牛血清白蛋白或用脫脂奶粉補充所有結合反應以便競爭由抗體與塑膠支撐件之僅黏性結合產生的不合需要之純系。
使用抗原濃度遞減的抗原進行三或四輪選擇，自100nM開始且在最終一輪選擇中降低至5nM。特異性結合子定義為比背景高約5倍且由ELISA鑑別的信號。特異性結合子藉由ELISA鑑別如下：在中性鏈親和素培養盤上，每孔塗佈100μl 10nM生物素化抗原。添加含Fab之細菌上清液且藉由使用抗Flag/HRP二級抗體經由其Flag標籤偵測結合Fab。ELISA陽性純系經細菌表現為呈96孔格式的可溶性Fab片段且藉由SPR分析，使用ProteOn XPR36(BioRad)，對上清液進行動力學 篩選實驗。鑑別出以最高親和力常數表現Fab之純系且對相應噬質體進行定序。關於進一步表徵，經由PCR自噬質體擴增Fab序列且經由恰當限制位點將其選殖至人類IgG1表現載體中用於哺乳動物製造。
使用人類化CD3ε特異性共同輕鏈產生噬菌體呈現抗體文庫
本段描述呈現於M13噬菌體上之抗體文庫的產生。基本上，吾人設計出用於重鏈與一個恆定(或「共同」)輕鏈之多構架文庫。此文庫設計成用於產生IgG1 P329G LALA或IgG4 SPLE PG同型的含Fc、但FcgR結合不活化T細胞的雙特異性抗體，其中一個或兩個Fab識別腫瘤細胞上所表現之腫瘤表面抗原，而該抗體之其餘的Fab臂識別T細胞上之CD3e。
文庫產生
在下文中，描述呈現於M13噬菌體上之抗體文庫的產生。基本上，吾人設計出用於重鏈與一個恆定(或「共同」)輕鏈之多構架文庫。此文庫設計成僅用於產生IgG1 P329G LALA或IgG4 SPLE PG同型之含Fc、但FcgR結合不活化T細胞的雙特異性抗體。
經由隨機化寡核苷酸僅在不同重鏈之CDR3中引入多樣性。用於產生抗體文庫之方法為此項技術中所熟知且描述於(Hoogenboom等人，Nucleic Acids Res.1991,19,4133-413；或Lee等人，J.Mol.Biol.(2004)340,1073-1093)中。
吾人在文庫中使用此等重鏈：
IGHV1-46*01(X92343)(SEQ ID NO：104)
IGHV1-69*06(L22583)(SEQ ID NO：105)
IGHV3-15*01(X92216)(SEQ ID NO：106)
IGHV3-23*01(M99660)(SEQ ID NO：107)
IGHV4-59*01(AB019438)(SEQ ID NO：108)
IGHV5-51*01(M99686)(SEQ ID NO：109)
吾人在文庫中使用來源於人類化人類及食蟹獼猴CD3ε特異性抗體CH2527之輕鏈：(VL7_46-13；SEQ ID NO：112)。此輕鏈不進行隨機化且不進行任何進一步修飾即加以使用，以便確保與不同雙特異性結合子之兼容性。
所有重鏈使用IGHJ2作為J元件，但IGHV1-69*06改用IGHJ6序列。隨機化之設計僅集中於CDR-H3，且PCR寡核苷酸設計成允許在V元件與J元件之間使用長度為4至9個胺基酸的隨機化插入物。
實例6 自共同輕鏈文庫(包含具有CD3ε特異性之輕鏈)選擇FolR1之抗體片段
抗體16A3、15A1、18D3、19E5、19A4、15H7、15B6、16D5、15E12、21D1、16F12、21A5、21G8、19H3、20G6及20H7包含具有CD3ε特異性之共同輕鏈VL7_46-13，藉由針對不同物種(人類、食蟹獼猴及鼠類)之FolR1噬菌體呈現選擇獲得。純系16A3、15A1、18D3、19E5、19A4、15H7、15B6、21D1、16F12、19H3、20G6及20H7選自其中共同輕鏈與基於人類生殖系VH1_46之重鏈基因譜配對的子文庫。在此子文庫中，已基於6種不同CDR3長度對VH1_46之CDR3進行隨機化。純系16D5、15E12、21A5及21G8選自其中共同輕鏈與基於人類生殖系VH3_15之重鏈基因譜配對的子文庫。在此子文庫中，已基於6種不同CDR3長度對VH3_15之CDR3進行隨機化。為獲得物種交叉反應(或鼠類FolR1反應性)抗體，使FolR1之不同物種經3輪生物淘選以不同方式交替(或保持恆定)：16A3及15A1(人類-食蟹獼猴-人類FolR1)；18D3(食蟹獼猴-人類-鼠類FolR1)；19E5及19A4(3輪，針對鼠類FolR1)；15H7、15B6、16D5、15E12、21D1、16F12、21A5、21G8(人類-食蟹獼猴-人類FolR1)；19H3、20G6及20H7(3輪，針對鼠類FolR1)。
人類、鼠類及食蟹獼猴FolR1作為用於噬菌體呈現選擇以及基於 ELISA及SPR之篩選的抗原，在HEK EBNA細胞中經短暫表現為N端單體Fc融合體且經由位於攜帶受體鏈(Fc杵鏈)之Fc部分的C端處之avi標籤識別序列處的BirA生物素連接酶之共表現發生活體內位點特異性生物素化。為評定對FolR1之特異性，以相同方式產生兩個相關受體：人類FolR2及FolR3。
根據以下模式，在溶液中進行數輪選擇(生物淘選)：
1. 預清除經10μg/ml不相關的人類IgG塗佈之maxisorp培養盤上約1012 個噬質體粒子以消耗識別抗原之Fc部分的抗體文庫。
2. 在100nM不相關的非生物素化Fc杵-臼構築體存在下，將非Fc結合噬質體粒子與100nM生物素化人類、食蟹獼猴或鼠類FolR1一起培育0.5小時，用於進一步消耗總體積1ml中之Fc結合子。
3. 藉由轉移至經中性鏈親和素預塗佈之微量滴定盤的4個孔中持續10分鐘，捕捉生物素化FolR1及所連接之特異性結合噬菌體(在第1輪及第3輪中)。
4. 使用5×PBS/Tween20及5×PBS洗滌相應的孔。
5. 藉由每孔添加250μl 100mM TEA(三乙胺)溶離噬菌體粒子，歷時10分鐘，且藉由向來自4個孔之經合併之溶離液中添加500μl 1M Tris/HCl pH 7.4進行中和。
6. 藉由在經中性鏈親和素預塗佈之微量滴定盤上與100nM經生物素捕捉之FolR2或FolR3一起培育，後清除經中和之溶離液，以便最終移除Fc及非特異性結合子。
7. 用經溶離之噬菌體粒子的上清液再感染對數期大腸桿菌TG1細胞，用輔助噬菌體VCSM13感染，在震盪器上在30℃下培育隔夜且對下一輪選擇中所用之噬質體粒子進行後續PEG/NaCl沈澱。
使用100nM之恆定抗原濃度進行3輪選擇。在第2輪中，為避免中性鏈親和素之結合子富集，捕捉抗原：藉由添加5.4×107 顆經抗生 蛋白鏈菌素塗佈之磁珠進行噬菌體複合。特異性結合子藉由ELISA鑑別如下：將100μl 25nM生物素化人類、食蟹獼猴或鼠類FolR1及10μg/ml人類IgG分別塗佈在中性鏈親和素培養盤及maxisorp培養盤上。添加含Fab之細菌上清液且使用抗Flag/HRP二級抗體經由其Flag標籤偵測結合Fab。將在人類FolR1上展現信號且在人類IgG上為陰性的純系列入候選清單進行進一步分析且亦以類似方式針對FolR1之其餘兩個物種進行測試。其在0.5公升培養體積中經細菌表現，進行親和力純化且使用BioRad之ProteOn XPR36生物感測器藉由SPR分析進行進一步表徵。
藉由表面電漿子共振(SPR)，使用ProteOn XPR36儀器(Biorad)，在25℃下，在藉由中性鏈親和素捕捉固定於NLC晶片上之生物素化人類、食蟹獼猴及鼠類FolR1以及人類FolR2及FolR3(陰性對照)的情況下，量測所選純系之親和力(KD )。抗原(配體)之固定：用PBST(10mM磷酸鹽、150mM氯化鈉pH 7.4、0.005% Tween 20)將重組抗原稀釋至10μg/ml，隨後沿垂直取向以30微升/分鐘注射。分析物之注射：關於『一步法動力學(one-shot kinetics)』量測，注射方向改為水平取向，將兩倍稀釋度之各系列經純化Fab(不同濃度範圍)沿著各別通道1-5同時注射，其中結合時間為200s，且解離時間為600s。沿第六通道注射緩衝液(PBST)以提供「在線(in-line)」空白用於參考。使用簡單的一比一朗格繆爾結合模型，在ProteOn Manager v3.1軟體中，藉由同時擬合結合及解離感測器圖譜來計算結合速率常數(kon )及解離速率常數(koff )。平衡解離常數(KD )按比率koff /kon 來計算。表4列舉所選擇的對FolR1具有特異性的純系之平衡解離常數(KD )。
表4：藉由噬菌體呈現自包含VL7_46-13(對CD3ε具有特異性之人類化輕鏈)之共同輕鏈子文庫中選出之抗FolR1抗體(Fab格式)的平衡解離常數(KD)。KD以nM計。
Figure 104138283-A0202-12-0117-5
實例7 自FolR1之通用多構架文庫中選擇抗體片段
針對FolR1之不同物種(人類、食蟹獼猴及鼠類)，藉由基於通用多構架子文庫之噬菌體呈現選擇獲得抗體11F8、36F2、9D11、5D9、6B6及14E4。在此等多構架子文庫中，含隨機化CDR3(3種不同長度)之不同VL域與含隨機化CDR3(6種不同長度)之不同VH域進行配對。所選擇之純系具有以下VL/VH配對：11F8(Vk_1_5/VH_1_69)、36F2(Vk_3_20/VH_1_46)、9D11(Vk2D_28/VH1_46)、5D9(Vk3_20/VH1_46)、6B6(Vk3_20/VH1_46)及14E4(Vk3_20/VH3_23)。為獲得物種交叉反應(或鼠類FolR1反應性)抗體，使FolR1之不同物種經3或4輪生物淘選以不同方式交替(或保持恆定)：11F8(食蟹獼猴-鼠類-人類FolR1)；36F2(人類-鼠類-食蟹獼猴-鼠類FolR1)；9D11(食蟹獼猴-人類-食蟹獼猴FolR1)；5D9(人類-食蟹獼猴-人類FolR1)；6B6(人類-食蟹獼猴-人類FolR1)及14E4(3輪，針對鼠類FolR1)。
人類、鼠類及食蟹獼猴FolR1作為用於噬菌體呈現選擇以及基於ELISA及SPR之篩選的抗原，在HEK EBNA細胞中經短暫表現為N端 單體Fc融合體且經由位於攜帶受體鏈(Fc杵鏈)之Fc部分的C端處之avi標籤識別序列處的BirA生物素連接酶之共表現發生活體內位點特異性生物素化。為評定對FolR1之特異性，以相同方式產生兩個相關受體：人類FolR2及FolR3。
根據以下模式，在溶液中進行數輪選擇(生物淘選)：
1. 預清除經10μg/ml不相關的人類IgG塗佈之maxisorp培養盤上約1012 個噬質體粒子以消耗識別抗原之Fc部分的抗體文庫。
2. 在100nM不相關的非生物素化Fc杵-臼構築體存在下，將非Fc結合噬質體粒子與100nM生物素化人類、食蟹獼猴或鼠類FolR1一起培育0.5小時，用於進一步消耗總體積1ml中之Fc結合子。
3. 藉由轉移至經中性鏈親和素預塗佈之微量滴定盤的4個孔中持續10分鐘，捕捉生物素化FolR1及所連接之特異性結合噬菌體(在第1輪及第3輪中)。
4. 使用5×PBS/Tween20及5×PBS洗滌相應的孔。
5. 藉由每孔添加250μl 100mM TEA(三乙胺)溶離噬菌體粒子，歷時10分鐘，且藉由向來自4個孔之經合併之溶離液中添加500μl 1M Tris/HCl pH 7.4進行中和。
6. 藉由在經中性鏈親和素預塗佈之微量滴定盤上與100nM經生物素捕捉之FolR2或FolR3一起培育，後清除經中和之溶離液，以便最終移除Fc及非特異性結合子。
7. 用經溶離之噬菌體粒子的上清液再感染對數期大腸桿菌TG1細胞，用輔助噬菌體VCSM13感染，在震盪器上在30℃下培育隔夜且對下一輪選擇中所用之噬質體粒子進行後續PEG/NaCl沈澱。
使用100nM之恆定抗原濃度進行3輪選擇。在第2輪及第4輪中，為避免中性鏈親和素之結合子富集，捕捉抗原：藉由添加5.4×107 顆經抗生蛋白鏈菌素塗佈之磁珠進行噬菌體複合。特異性結合子藉由 ELISA鑑別如下：將100μl 25nM生物素化人類、食蟹獼猴或鼠類FolR1及10μg/ml人類IgG分別塗佈在中性鏈親和素培養盤及maxisorp培養盤上。添加含Fab之細菌上清液且使用抗Flag/HRP二級抗體經由其Flag標籤偵測結合Fab。將在人類FolR1上展現信號且在人類IgG上為陰性的純系列入候選清單進行進一步分析且亦以類似方式針對FolR1之其餘兩個物種進行測試。其在0.5公升培養體積中經細菌表現，進行親和力純化且使用BioRad之ProteOn XPR36生物感測器藉由SPR分析進行進一步表徵。
藉由表面電漿子共振(SPR)，使用ProteOn XPR36儀器(Biorad)，在25℃下，在藉由中性鏈親和素捕捉固定於NLC晶片上之生物素化人類、食蟹獼猴及鼠類FolR1以及人類FolR2及FolR3(陰性對照)的情況下，量測所選純系之親和力(KD )。抗原(配體)之固定：用PBST(10mM磷酸鹽、150mM氯化鈉pH 7.4、0.005% Tween 20)將重組抗原稀釋至10μg/ml，隨後沿垂直取向以30微升/分鐘注射。分析物之注射：關於『一步法動力學』量測，注射方向改為水平取向，將兩倍稀釋度之各系列經純化Fab(不同濃度範圍)沿著各別通道1-5同時注射，其中對應地，結合時間為150或200s，且解離時間為200或600s。沿第六通道注射緩衝液(PBST)以提供「在線」空白用於參考。使用簡單的一比一朗格繆爾結合模型，在ProteOn Manager v3.1軟體中，藉由同時擬合結合及解離感測器圖譜來計算結合速率常數(kon )及解離速率常數(koff )。平衡解離常數(KD )按比率koff /kon 來計算。表5列舉所選擇的對FolR1具有特異性的純系之平衡解離常數(KD )。
Figure 104138283-A0202-12-0119-6
Figure 104138283-A0202-12-0120-7
實例8 製造且純化呈IgG及T細胞雙特異性抗體格式之新穎FolR1結合子
為鑑別能夠誘導T細胞依賴性殺死所選擇之目標細胞的FolR1結合子，將自共同輕鏈文庫或Fab文庫分離之抗體轉換成相應人類IgG1格式。簡言之，來自噬菌體呈現之獨特FolR1結合子之可變重鏈及可變輕鏈藉由標準PCR反應，使用Fab純系作為模板進行擴增。將PCR產物進行純化且插入(藉由基於限制性核酸內切酶及連接酶之選殖，或藉由『重組工程(recombineering)』使用來自Invitrogen之InFusion套組)適合的表現載體中，在該等表現載體中，該等PCR產物融合至恰當的人類恆定重鏈或人類恆定輕鏈。此等載體中之表現卡匣由嵌合MPSV啟動子及合成聚腺苷酸化位點組成。另外，質體含有來自埃-巴二氏病毒(Epstein Barr virus)之oriP區，用於將質體穩定維持在攜帶EBV核抗原(EBNA)之HEK293細胞中。在PEI介導轉染之後，在HEK293 EBNA細胞中短暫製造抗體且相繼藉由標準蛋白A親和層析、尺寸排阻層析純化該等抗體，描述如下：
短暫性轉染及製造
本文所用之所有(雙特異性)抗體(若並非獲自商業來源)均係使用關於所需載體之PEI介導之轉染程序，在HEK293 EBNA細胞中短暫製造，如下文所述。在不含血清之懸浮液中在CD CHO培養基中培養HEK293 EBNA細胞。關於在500ml搖瓶中製造，在轉染之前24小時接種4億個HEK293 EBNA細胞(關於替代性規模，相應地調整所有量)。關於轉染，藉由210×g使細胞離心5分鐘，用預溫熱之20ml CD CHO培養基置換上清液。表現載體於20ml CD CHO培養基中混合至 200μg DNA之最終量。在添加540μl PEI溶液之後，使其渦旋15秒且隨後在室溫下培育10分鐘。隨後，將細胞與DNA/PEI溶液混合，轉移至500ml搖瓶中且在具有5% CO2氛圍的培育箱中在37℃下培育3小時。在培育時間之後，添加160ml F17培養基且培養細胞24小時。在轉染之後一天，添加1mM丙戊酸及7%饋料1。培養7天後，收集上清液，藉由在210×g下離心15分鐘進行純化，將溶液無菌過濾(0.22μm過濾器)且以0.01% w/v之最終濃度添加疊氮化鈉，且保持在4℃下。在製造之後，收集上清液且經由0.22μm無菌過濾器過濾含有抗體之上清液且將其儲存在4℃下直至純化。
抗體純化
所有分子均使用標準程序，諸如蛋白A親和力純化(Äkta Explorer)及尺寸排阻層析，分兩步進行純化。將自短暫製造獲得之上清液調整至pH 8.0(使用2M TRIS 8.0)且施加經8管柱體積(cv)緩衝液A (20mM磷酸鈉、20mM檸檬酸鈉，pH 7.5)平衡之HiTrap PA FF(GE Healthcare，管柱體積(cv)=5ml)。在用10cv緩衝液A 洗滌之後，使用相對於緩衝液B (20mM檸檬酸鈉pH 3、100mM NaCl、100mM甘胺酸)之pH梯度，經12cv溶離蛋白質。合併含有相關蛋白質之溶離份且將溶液之pH溫和地調整至pH 6.0(使用0.5M Na2 HPO4 pH 8.0)。使用超濃縮器(Vivaspin 15R 30.000 MWCO HY,Sartorius)將樣品濃縮至2ml且隨後施加經20mM組胺酸pH 6.0、140mM NaCl、0.01% Tween-20平衡之HiLoadTM 16/60 SuperdexTM 200製備級(GE Healthcare)。藉由分析型尺寸排阻層析分析溶離份之聚集體含量。因此，在25℃下，向30μl各溶離份施加在25mM K2 HPO4 、125mM NaCl、200mM L-精胺酸單鹽酸鹽、0.02%(w/v)NaN3 、pH 6.7操作緩衝液中平衡之TSKgel G3000 SW XL分析型尺寸排阻管柱(Tosoh)。合併含有小於2%寡聚物之溶離份且使用超濃縮器(Vivaspin 15R 30.000 MWCO HY,Sartorius) 將其濃縮至1-1.5mg/ml之最終濃度。蛋白質濃度係藉由量測280nm下之光學密度(OD)，使用基於胺基酸序列所計算之莫耳消光係數來測定。藉由SDS毛細管電泳，在存在及不存在還原劑之情況下，遵循製造商說明書(儀器測徑規LabChipGX,Perkin Elmer)分析構築體之純度及分子量。將經純化蛋白質冷凍在液氮中且儲存在-80℃下。
基於活體外表徵結果，將所選結合子轉換成T細胞雙特異性抗體格式。在此等分子中，FolR1：CD3結合部分按2：1順序配置，其中FolR1 Fab位於N端。關於自標準Fab文庫分離之純系，以互換Fab(CH1Cκ互換)形式產生CD3結合部分；而關於來自共同輕鏈文庫之純系，互換為不必要的。此等雙特異性分子以類似於IgG之方式產生且純化。
Figure 104138283-A0202-12-0122-8
CLC：共同輕鏈
實例9 2+1及1+1 T細胞雙特異性抗體格式
關於一個共同輕鏈結合子(16D5)製備四種不同T細胞雙特異性抗體格式，且關於一個來自Fab文庫之結合子(9D11)製備三種格式，從而比較其活體外殺死性質。
標準格式為已描述之2+1反向格式(FolR1：CD3結合部分按2：1順序配置，其中FolR1 Fab位於N端)。在2+1經典格式中，FolR1：CD3結合部分按2：1順序配置，其中CD3 Fab位於N端。亦製備兩種單價格式。在1+1頭對尾中，FolR1：CD3結合部分在分子之同一條臂上按1：1順序配置，其中FolR1 Fab位於N端。在1+1經典格式中，FolR1：CD3結合部分存在一次，各自在分子之一條臂上。關於自標準Fab文庫分離之9D11純系，以互換Fab(CH1Cκ互換)形式產生CD3結合部分；而關於來自共同輕鏈文庫之16D5，互換為不必要的。此等雙特異性分子以類似於標準反向T細胞雙特異性抗體格式之方式產生且純化。
Figure 104138283-A0202-12-0123-9
實例10 藉由表面電漿子共振對FolR1結合子進行生物化學表徵
藉由表面電漿子共振(SPR)評定呈IgG形式或呈T細胞雙特異性抗體格式之FolR1結合子與不同重組葉酸受體(人類FolR1、2及3、鼠類FolR1及食蟹獼猴FolR1；均呈Fc融合體形式)之結合。所有SPR實驗均在Biacore T200上在25℃下以HBS-EP作為操作緩衝液(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005%界面活性劑P20,Biacore,Freiburg/Germany)來進行。
單一注射
首先，藉由單一注射(表1)分析抗FolR1 IgG來表徵其交叉反應性(針對人類、鼠類及食蟹獼猴FolR1)及特異性(針對人類FolR1、人類FolR2、人類FolR3)。使用標準偶聯指令(Biacore,Freiburg/Germany)，將人類、食蟹獼猴及鼠類葉酸受體1(FolR1-Fc)或人類葉酸受體2及3(FolR2-Fc、FolR3-Fc)之重組生物素化單體Fc融合體直接偶聯於SA晶片上。固定量為約300-400RU。以500nM之濃度注射IgG 60秒。結合至huFolR2及huFolR3之IgG因缺乏特異性遭排斥。大多數結合子僅可在人類與食蟹獼猴FolR1之間交叉反應，大多數時候與鼠類FolR1之額外交叉反應性緊密相關，缺乏特異性。
Figure 104138283-A0202-12-0124-10
Figure 104138283-A0202-12-0125-11
與葉酸受體1之結合力
抗FolR1 IgG或T細胞雙特異性抗體與重組葉酸受體之間的相互作用之結合力如下所述進行測定(表9)。
使用標準偶聯指令(Biacore,Freiburg/Germany)，將人類、食蟹獼猴及鼠類葉酸受體1之重組生物素化單體Fc融合體(FolR1-Fc)直接偶聯於SA晶片上。固定量為約300-400RU。抗FolR1 IgG或T細胞雙特異性抗體以2.1至500nM範圍內之濃度，以30微升/分鐘之流率通過流動池，持續180秒。監測解離600秒。藉由減去經重組生物素化IL2受體Fc融合體固定之參考流動池上所得之反應來校正整體折射率差異。關於19H3 IgG與鼠類葉酸受體1之相互作用的分析，以2.3μM之濃度在HBS-EP操作緩衝液中添加葉酸(Sigma F7876)。由IgG或T細胞雙特異性抗體之二價結合產生的結合曲線接近1：1朗格繆爾結合且與彼模型(其並不正確，但反映出結合力)進行擬合。使用Bia評估軟體(GE Healthcare)，自擬合之速率常數推導出相互作用之表觀結合力常數。
Figure 104138283-A0202-12-0125-12
1. 與葉酸受體1之親和力
抗FolR1 IgG或T細胞雙特異性抗體與重組葉酸受體之間的相互作用之親和力如下所述進行測定(表10)。
關於親和力量測，在CM5晶片上在pH 5.0下使用標準胺偶聯套組(GE Healthcare)進行約6000-7000個共振單位(RU)之抗人類Fab特異性抗體(Fab捕捉套組，GE Healthcare)的直接偶聯。以10μl/min之流動速率，以20nM捕捉抗FolR1 IgG或T細胞雙特異性抗體20或40秒，剩餘參考流動池無捕捉。人類或食蟹獼猴葉酸受體1 Fc融合體之稀釋系列(6.17至500nM或12.35至3000nM)以30μl/min通過所有流動池，持續120或240秒來記錄結合階段。解離階段監測240秒且藉由自樣品溶液切換至HBS-EP進行觸發。在每一個循環之後，使用60秒10mM甘胺酸鹽酸鹽pH 2.1或pH 1.5之雙重注射使晶片表面再生。藉由減去參考流動池1上所得之反應來校正整體折射率差異。使用Bia評估軟體(GE Healthcare)，自藉由與1：1朗格繆爾結合擬合所得之速率常數推導出相互作用之親和力常數。
Figure 104138283-A0202-12-0126-13
2. 與CD3之親和力
抗FolR1 T細胞雙特異性抗體與重組人類CD3εδ-Fc之間的相互作用之親和力如下所述進行測定(表11)。
關於親和力量測，在CM5晶片上在pH 5.0下使用標準胺偶聯套組(GE Healthcare)進行約9000個共振單位(RU)之抗人類Fab特異性抗體(Fab捕捉套組，GE Healthcare)的直接偶聯。以10μl/min之流動速率，以20nM捕捉抗FolR1 T細胞雙特異性抗體40秒，剩餘參考流動池無捕捉。人類CD3εδ-Fc融合體之稀釋系列(6.17至500nM)以30μl/min通過所有流動池，持續240秒以記錄結合階段。解離階段監測240秒且藉由自樣品溶液切換至HBS-EP進行觸發。在每一個循環之後，使用60秒10mM甘胺酸鹽酸鹽pH 2.1之雙重注射使晶片表面再生。藉由減去參考流動池1上所得之反應來校正整體折射率差異。使用Bia評估軟體(GE Healthcare)，自藉由與1：1朗格繆爾結合擬合所得之速率常數推導出相互作用之親和力常數。
Figure 104138283-A0202-12-0127-14
所有構築體之CD3結合部分均相同且關於所量測之T細胞雙特異性抗體，親和力類似(KD範圍介於60與90nM之間)。
實例11 T細胞雙特異性抗體對葉酸受體1及CD3之同時結合
如下文所述，藉由表面電漿子共振測定抗FolR1 T細胞雙特異性抗體對重組葉酸受體1及重組人類CD3εδ-Fc之同時結合。使用標準偶聯指令(Biacore,Freiburg/Germany)，將人類、食蟹獼猴及鼠類葉酸受體1之重組生物素化單體Fc融合體(FolR1-Fc)直接偶聯於SA晶片上。固定量為約300-400RU。以500nM，以30微升/分鐘之流率注射抗FolR1 T細胞雙特異性抗體持續60秒，通過流動池，隨後以500nM注射huCDεδ-Fc持續60秒。藉由減去經重組生物素化IL2受體Fc融合體固 定之參考流動池上所得之反應來校正整體折射率差異。不出所料，所測試之四種T細胞雙特異性抗體(16D5 TCB、21A5 TCB、51C7 TCB及45D2 TCB)均能夠同時結合至葉酸受體1及人類CD3。
實例12 抗原決定基分組(Epitope binning)
關於抗原決定基分組，在pH 5.0下，使用標準胺偶聯套組(GE Healthcare)，將抗FolR1 IgG或T細胞雙特異性抗體直接固定於CM5晶片上，且最終反應為約700RU。隨後捕捉500nM huFolR1-Fc持續60秒，隨後捕捉500nM不同結合子持續30秒。藉由注射兩次10mM甘胺酸pH 2各30秒，使表面再生。評定不同結合子是否可結合至經固定結合子上所捕捉之huFolR1(表12)。
Figure 104138283-A0202-12-0128-15
基於此等結果及在經固定huFolR1上之同時結合的其他資料，將該等結合子分成三組。不清楚9D11是否具有單獨的抗原決定基，因為其取代所有其他結合子。16D5及21A5似乎在同一組中，且Mov19、伐吐珠單抗(Coney等人，Cancer Res.1991年11月15日；51(22)：6125-32；Kalli等人，Curr Opin Investig Drugs.2007年12月；8(12)：1067-73)及36F2在另一組中(表13)。然而，36F2結合至不同於Mov 19及伐吐珠單抗之抗原決定基，因為其結合至人類、食蟹獼猴及鼠類FolR1。
Figure 104138283-A0202-12-0129-16
實例13 結合子之選擇
藉由表面電漿子共振(SPR)及藉由對細胞之活體外分析篩選呈IgG格式之FolR1結合子，從而選出最佳候選者。
藉由SPR分析抗FolR1 IgG來表徵其交叉反應性(針對人類、鼠類及食蟹獼猴FolR1)及特異性(針對人類FolR1、人類FolR2、人類FolR3)。與人類FolR2及3之非特異性結合視為排除因素。在細胞上證實與人類FolR1之結合及特異性。一些結合子在表現FolR1之細胞上不結合，即使其在SPR中識別重組人類FolR1。測定聚集溫度，但聚集溫度並非排除因素，因為所選結合子均穩定。在多反應性ELISA中測試所選結合子以檢查非特異性結合，該檢查導致排除四個結合子。此過程初步選出三個結合子：36F2(Fab文庫)、9D11(Fab文庫)及16D5(共同輕鏈)。36F2自huFolR1迅速解離且因此，最初並非有利的。
實例14 新產生之FolR1結合子與人類FolR1陽性腫瘤細胞之特異性結合
使用Fab文庫或共同輕鏈文庫，使用CD3輕鏈，經由噬菌體呈現產生新的FolR1結合子。將所鑑別之結合子轉換成人類IgG1格式且論述與高度表現FolR1之HeLa細胞的結合。關於參考分子，包括人類FolR1結合子Mov19。在此分析中測試之大多數結合子顯示與FolR1之中等至良好結合，一些純系與Mov19結合得同樣好(參見圖2)。排除純系16A3、18D3、15H7、15B6、21D1、14E4及16F12，因為藉由流動 式細胞測量術，與細胞上之FolR1之結合未得到證實。在下一步中，藉由排除與密切相關之人類FolR2的結合，測試所選純系對人類FolR1之特異性。用人類FolR1或人類FolR2短暫轉染HEK細胞來論述特異性。來源於Fab文庫之純系36F2及9D11及來源於CLC文庫之純系16D5及21A5特異性結合至人類FolR1且不結合至人類FolR2(參見圖3A至B)。所測試之所有其他純系顯示與人類FolR2之至少一些結合(參見圖3A至B)。因此，自進一步表徵中排除此等純系。並行地，FolR1純系與食蟹獼猴FolR1之交叉反應性藉由對用食蟹獼猴FolR1短暫轉染之HEK細胞執行結合研究來論述。所測試之所有純系均能夠結合食蟹獼猴FolR1且所選擇之四個人類FoLR1特異性純系36F2、9D11、16D5及21A5類似地很好地結合人類及食蟹獼猴FoLR1(圖4)。隨後，將三個人類FolR1特異性食蟹獼猴交叉反應結合子轉換成TCB格式且測試T細胞殺死及T細胞活化之誘導作用。此等純系為來自Fab文庫之9D11及來自CLC文庫之16D5及21A5。關於參考分子，在所有研究中包括Mov19 FolR1 TCB。此等FolR1 TCB隨後用於比較在與HeLa細胞上之FolR1結合之後的內化誘導。所測試之所有三個純系均在與FolR1結合時發生內化，類似於在Mov19 FoLR1 TCB之結合時的內化(圖5)。21A5 FolR1 TCB由於多反應性跡象而中斷。
實例15 FolR1 TCB抗體誘導T細胞介導殺死表現FolR1之腫瘤目標細胞
FolR1 TCB用於測定表現FoLR1之腫瘤細胞的T細胞介導之殺死。藉由Qifikit分析，使用一組潛在目標細胞株來測定FoLR1結合位點。
所用的這組腫瘤細胞含有高表現、中等表現及低表現FolR1之腫瘤細胞及FolR1陰性細胞株。
表14：腫瘤細胞上之FolR1結合位點
Figure 104138283-A0202-12-0131-17
測定三個不同FoLR1 TCB(含有9D11、16D5及Mov19結合子)與該組腫瘤細胞株之結合，顯示FoLR1 TCB特異性結合至表現FolR1之腫瘤細胞且不結合至FoLR1陰性腫瘤細胞株。已結合構築體之量與FolR1表現量成比例且仍然存在構築體與可偵測之低FolR1細胞株HT-29之良好結合。另外，不存在陰性對照DP47 TCB與所用細胞株中之任一者的結合(圖6A至E)。
使用16D5 TCB及9D11 TCB，使用中等表現之細胞株SKOV3及低表現之細胞株HT-29進一步測試T細胞介導殺死及T細胞活化；包括DP47 TCB作為陰性對照。在已經極低含量之16D5 TCB及9D11 TCB存在下，兩個細胞株均遭到殺死，且在兩種TCB之間不存在活性差異，即使9D11 TCB對FolR1之結合強於16D5 TCB。SKOV3細胞之總殺死量高於HT-29，其反映SKOV3細胞上之FolR1之表現量較高(圖7A至D)。與此相吻合，偵測到CD4+ T細胞及CD8+ T細胞上之活化標誌物CD25及CD69強烈上調。在SKOV3細胞及HT-29細胞存在下，T細胞之活化非常類似。陰性對照DP47 TCB在所用濃度下不誘導任何殺死且T細胞上之CD25及CD69無顯著上調。
Figure 104138283-A0202-12-0131-18
Figure 104138283-A0202-12-0132-19
實例16 在全血中與紅血球之結合及T細胞活化
為證明在不存在表現FoLR1之腫瘤細胞的情況下不存在自發活化，吾人測試FolR1純系與可能表現FolR1之紅血球是否存在結合。吾人未觀察到9D11 IgG、16D5 IgG及Mov19 IgG與紅血球之任何特異性結合，關於陰性對照，包括DP47 IgG(圖8)。
為排除與血細胞之任何其他非特異性結合或經由FoLR1 TCB之非特異性活化，向全血中添加9D11 TCB、16D5 TCB及Mov19 TCB且藉由流動式細胞測量術分析CD4+ T細胞及CD8+ T細胞上之CD25及CD69之上調情況。包括DP47 TCB作為陰性對照。藉由分析CD4+ T細胞及CD8+ T細胞上之CD25及CD69之上調情況，在任何所測試構築體之情況下，未觀察到T細胞活化(圖9)。
實例17 移除9D11輕鏈中之N糖基化位點
在分析不同FolR1結合子以鑑別潛在序列熱點期間，在純系9D11之CDR L3之末端，鑑別假定的N糖基化位點。通常，用於N糖基化之共同基元定義為N-X-S/T-X(其中X不為P)。CDR L3之序列(MQASIMNRT )(SEQ ID NO：61)完美地匹配此具有序列N-R-T之共同基元。因為在不同製造批次中糖基化可能並非完全可複製的，所以若CDR L3中之糖基化有助於抗原結合，則糖基化會影響FolR1結合。為 評估此N糖基化位點對於FolR1結合而言是否重要或是否可在不削弱結合之情況下進行置換，產生9D11輕鏈之不同變異體，其中N糖基化位點藉由位點特異性突變誘發發生交換。
1. 短暫性轉染及製造
如下文所述，針對所需載體使用PEI介導之轉染程序，在HEK293 EBNA細胞中短暫製造四個T細胞雙特異性抗體。在不含血清之懸浮液中在CD CHO培養基中培養HEK293 EBNA細胞。關於在500ml搖瓶中製造，在轉染之前24小時接種4億個HEK293 EBNA細胞(關於替代性規模，相應地調整所有量)。關於轉染，藉由210×g使細胞離心5分鐘，用預溫熱之20ml CD CHO培養基置換上清液。表現載體於20ml CD CHO培養基中混合至200μg DNA之最終量。在添加540μl PEI溶液之後，使其渦旋15秒且隨後在室溫下培育10分鐘。隨後，將細胞與DNA/PEI溶液混合，轉移至500ml搖瓶中且在具有5% CO2氛圍的培育箱中在37℃下培育3小時。在培育時間之後，添加160ml F17培養基且培養細胞24小時。在轉染之後一天，添加1mM丙戊酸及7%饋料1。培養7天後，收集上清液，藉由在210×g下離心15分鐘進行純化，將溶液無菌過濾(0.22μm過濾器)且以0.01% w/v之最終濃度添加疊氮化鈉，且保持在4℃下。在製造之後，收集上清液且經由0.22μm無菌過濾器過濾含有抗體之上清液且將其儲存在4℃下直至純化。
2. 抗體純化
所有分子均使用標準程序，諸如蛋白A親和力純化(Äkta Explorer)及尺寸排阻層析，分兩步進行純化。將自短暫製造獲得之上清液調整至pH 8.0(使用2M TRIS 8.0)且施加經8管柱體積(cv)緩衝液A (20mM磷酸鈉、20mM檸檬酸鈉、0.5M NaCl、0.01% Tween-20，pH 7.5)平衡之HiTrap PA FF(GE Healthcare，管柱體積(cv)=5ml)。在用10cv緩衝液A 洗滌之後，使用相對於緩衝液B (20mM檸檬酸鈉pH 2.5、0.5M NaCl、0.01% Tween-20)之pH梯度，經20cv溶離蛋白質。合併含有相關蛋白質之溶離份且將溶液之pH溫和地調整至pH 6.0(使用2M Tris pH 8.0)。使用超濃縮器(Vivaspin 15R 30.000 MWCO HY,Sartorius)將樣品濃縮至1ml且隨後施加經20mM組胺酸pH 6.0、140mM NaCl、0.01% Tween-20平衡之SuperdexTM 200 10/300 GL(GE Healthcare)。藉由分析型尺寸排阻層析分析溶離份之聚集體含量。因此，在25℃下，向30μl各溶離份施加在25mM K2 HPO4 、125mM NaCl、200mM L-精胺酸單鹽酸鹽、0.02%(w/v)NaN3 ，pH 6.7操作緩衝液中平衡之TSKgel G3000 SW XL分析型尺寸排阻管柱(Tosoh)。合併含有小於2%寡聚物之溶離份且使用超濃縮器(Vivaspin 15R 30.000 MWCO HY,Sartorius)將其濃縮至1-1.5mg/ml之最終濃度。蛋白質濃度係藉由量測280nm下之光學密度(OD)，使用基於胺基酸序列所計算之莫耳消光係數來測定。藉由SDS毛細管電泳，在存在及不存在還原劑之情況下，遵循製造商說明書(儀器測徑規LabChipGX,Perkin Elmer)分析構築體之純度及分子量。將經純化蛋白質冷凍在液氮中且儲存在-80℃下。
3. 聚集溫度
在Optim1000(Avacta,PALL Corporation)上，藉由以0.1℃/min自25°梯度加熱至80°來測試四個構築體之穩定性。記錄聚集開始時之溫度。
Figure 104138283-A0202-12-0134-20
產生以下變異體：N100S(N95S)；N100Q(N95Q)、T102A(T97A)及T102N(T97N)(Kabat編號示出在括弧中)且轉換成T細胞雙特異性抗體格式。在HEK293 EBNA細胞中短暫製造且純化之後，分析不同變異體之目標結合及細胞殺死活性，與初始9D11純系進行比較。
Figure 104138283-A0202-12-0135-21
實例18 9D11 a-糖基變異體之結合及T細胞介導之殺死
由於CDR中之糖基化位點，產生含突變之四種不同的9D11變異體，移除糖基化位點(實例17)。測試這四個變異體，與初始9D11比較與HeLa細胞上之FolR1的結合(圖10)及SKOV3及HT-29上之腫瘤細胞殺死的誘導情況(圖11A至B、E至F)。沒有變異體在結合或誘導腫瘤細胞殺死方面顯示出差異。並行地，論述FolR1陰性細胞株MKN-45之非特異性殺死(圖11C至D)。此外，在變異體與初始結合子之間未觀察到差異。該等構築體在FoLR1陰性腫瘤細胞上不誘導非特異性殺死。
實例19 初級上皮細胞上之FolR1表現
FolR1在初級上皮細胞上之表現量低。此處，吾人想要測試此等表現量是否足以在FolR1 TCB存在下誘導T細胞介導之殺死。為測試這一點，吾人使用初級人類支氣管上皮細胞、初級人類脈絡叢上皮細胞、初級人類腎皮質上皮細胞及初級人類視網膜色素上皮細胞。關於陽性對照，包括FolR1陽性SKOV3細胞或HT-29細胞。首先，吾人檢 驗所用初級細胞上之FolR1表現且測定此等細胞上之FolR1結合位點之量。相比於腫瘤細胞上之表現量，支氣管上皮細胞、腎皮質上皮細胞及視網膜色素上皮細胞之FolR1表現量極低但顯著。脈絡叢上皮細胞之FolR1表現量不顯著。
Figure 104138283-A0202-12-0136-22
若在表面上展現FolR1表現之初級上皮細胞可在FoLR1 TCB存在下藉由T細胞殺死，則使用此等細胞解決該問題。未量測到顯著殺死量，但偵測到，在視網膜色素上皮細胞、支氣管上皮細胞及腎皮質細胞存在下誘導T細胞活化引起CD25及CD69上調。在視網膜色素上皮細胞之情況下見到最強活化，引起CD4+ T細胞及CD8+ T細胞上之CD25及CD69上調。在支氣管上皮細胞存在下，誘導較低T細胞活化，且CD4+ T細胞及CD8+ T細胞上之CD69上調，但僅CD4+ T細胞上之CD25極低上調且CD8+ T細胞上之CD25不上調。在腎上皮細胞存在下獲得最低T細胞活化，且CD4+ T細胞及CD8+ T細胞上之CD25不上調，且僅CD8+ T細胞上之CD69上調(圖12A至X)。
實例20 比較含有16D5或9D11結合子之不同TCB格式
為判定TCB 2+1反向格式是否為所選FolR1結合子之活性最強格式，產生含有16D5或9D11之不同格式且比較目標細胞結合、T細胞介導之殺死及T細胞活化。測試呈TCB 2+1反向(圖1A)、TCB 2+1經典(圖1D)、TCB 1+1經典(圖1C)及TCB 1+1頭對尾(圖1B)格式之16D5結 合子；測試呈TCB 2+1反向(圖1A)、TCB 1+1經典(圖1C)及TCB 1+1頭對尾(圖1B)格式之9D11結合子。
測試所有構築體與HeLa細胞上之FolR1之結合。由於結合力，與FolR1二價結合之分子的結合強於單價構築體。二價構築體對比單價構築體之間的差異於16D5而言較顯著。原因可能為，歸因於16D5之較低親和力，故此結合子之結合力效應較強。兩個1+1 TCB之間在結合方面不存在顯著差異，但在兩個2+1構築體中存在差異。反向2+1構築體與FolR1之結合強於經典2+1構築體。這表明，在經典2+1構築體中，與FoLR1之結合受CD3 Fab之存在的影響，然而在反向構築體中，結合受到之影響較小。
藉由用此等構築體測試T細胞介導之殺死，可以顯示，相比於2+1經典TCB，2+1反向TCB之結合較強，轉換成較強腫瘤細胞殺死及T細胞活化。16D5 FoLR1 TCB 2+1經典之活性僅略強於相應的1+1頭對尾構築體。1+1頭對尾構築體之活性顯著大於1+1經典構築體。這一點並未反映在結合中所見到之情況且可能係由於與頭對尾構築體之較佳交聯。所測試之所有構築體之總腫瘤細胞殺死及T細胞活化為類似的，在效能方面見到差異，該等差異僅就EC50值而言。一般而言，可推斷，與所用結合子無關的FolR1 TCB 2+1反向為用於誘導T細胞介導腫瘤細胞殺死及T細胞活化的較佳格式(參見圖13A至C及圖14A至C)。
Figure 104138283-A0202-12-0137-23
Figure 104138283-A0202-12-0138-25
Figure 104138283-A0202-12-0138-26
實例21 腫瘤細胞株及初級細胞
自ATCC獲得HeLa細胞(CCL-2)且將其培養在含10% FCS及2mM麩醯胺酸之DMEM中，自ATCC獲得SKOV3(HTB-77)且將其培養在含10% FCS及2mM麩醯胺酸之RPMI中，自NCI獲得OVCAR5且將其培養在含10% FCS及2mM麩醯胺酸之RPMI中，自DSMZ獲得HT-29(ACC-299)且將其培養在含10% FCS及2mM麩醯胺酸之McCoy's 5A培養基中，自DSMZ獲得MKN-45(ACC-409)且將其培養在含10% FCS及2mM麩醯胺酸之RPMI中。
所測試之所有初級上皮細胞均獲自ScienCell Research Laboratories。人類支氣管上皮細胞(HBEpiC，目錄號3210)在支氣管上皮細胞培養基(BEpiCM，目錄號3211，ScienCell)中培養。人類結腸上皮細胞(HCoEpiC，目錄號2950)在結腸上皮細胞培養基(CoEpiCM，目錄號2951，ScienCell)中培養。人類視網膜色素上皮細胞(HRPEpiC，目錄號6540)在上皮細胞培養基(EpiCM，目錄號4101，ScienCell)中培養。人類腎皮質上皮細胞(HRCEpiC，目錄號4110)在上 皮細胞培養基(EpiCM，目錄號4101，ScienCell)中培養。人類脈絡叢上皮細胞(HCPEpiC，目錄號1310)在上皮細胞培養基(EpiCM，目錄號4101，ScienCell)中培養。
實例22 藉由流動式細胞測量術得到之目標結合
用細胞解離緩衝液收集如所指示之目標細胞，用PBS洗滌且將其再懸浮於FACS緩衝液中。在96孔圓底培養盤中進行抗體染色。因此，每孔接種200,000個細胞。使培養盤在400g下離心4分鐘且移除上清液。在FACS緩衝液中稀釋測試抗體且在4℃下，向細胞中添加20μl抗體溶液，持續30分鐘。為移除未結合抗體，用FACS緩衝液洗滌細胞兩次，隨後添加經稀釋之二級抗體(FITC結合親和純化F(ab')2片段山羊抗人類IgG，Fcg片段，Jackson免疫研究編號109-096-098或PE結合親和純化F(ab')2片段山羊抗人類IgG Fcg片段特異性，Jackson免疫研究編號109-116-170)。在4℃下培育30分鐘後，洗掉未結合二級抗體。在量測之前，使細胞再懸浮於200μl FACS緩衝液中，且藉由流動式細胞測量術使用BD Canto II或BD Fortessa分析。
實例23 內化
收集細胞且測定活力。使細胞以每毫升200萬個細胞再懸浮於新製冷培養基中，且針對各抗體，將細胞懸浮液轉移至15ml法爾康管中。應該針對內化進行測試之抗體以20μg/ml之最終濃度添加至細胞中。在冷室中在震盪器上培育該等管子45分鐘。培育後，用冷PBS洗滌細胞三次以移除未結合抗體。在零時間點將每孔20萬個細胞轉移至FACS培養盤。使經標記細胞再懸浮於溫熱的培養基中且在37℃下進行培育。在指定時間點，將每孔20萬個細胞轉移至冷PBS中，洗滌，塗鋪在FACS培養盤上。為偵測保留於表面上之構築體，用PF標記之 抗人類Fc二級抗體對細胞進行染色。因此，每孔添加20μl經稀釋抗體且培養盤在4℃下培育30分鐘。隨後，洗滌細胞兩次以移除未結合抗體且隨後用1% PFA固定以防止任何進一步內化。使用BD FACS CantoII量測螢光。
實例24 QIFIKIT®分析
QIFIKIT®含有一系列珠粒，該等珠粒之直徑為10μm且經不同的但明確界定數量之小鼠Mab分子(高親和力抗人類CD5，純系CRIS-1，同型IgG2a)塗佈。該等珠粒模擬具有不同抗原密度之細胞，其已經初級小鼠Mab同型IgG標記。簡言之，用針對相關抗原之初級小鼠單株抗體標記細胞。在各別測試孔中，用無關的小鼠單株抗體(同型對照)標記細胞。隨後，用套組中所包括之螢光素結合之抗小鼠二級抗體標記細胞、組裝珠粒及校準珠粒。用於標記細胞之初級抗體必須在飽和濃度下使用。初級抗體可具有任何小鼠IgG同型。在此等條件下，所結合之初級抗體分子之數目對應於細胞表面上所存在之抗原位點的數目。二級抗體亦在飽和濃度下使用。因此，螢光與細胞上及珠粒上所結合之初級抗體分子之數目有關。
實例25 T細胞介導之腫瘤細胞殺死及T細胞活化
用胰蛋白酶/EDTA收集目標細胞，計數且檢查活力。使細胞以300,000個細胞/毫升之最終濃度再懸浮於其相應的培養基中。隨後，將100μl目標細胞懸浮液轉移至96平底培養盤之各孔中。將該培養盤在培育箱中在37℃下培育隔夜以使細胞黏附至培養盤。在第二天，自健康供體之全血中分離出PBMC。血液用PBS 2：1稀釋且覆蓋在Leucosep管中之15ml Histopaque-1077(# 10771,Sigma-Aldrich)上且在450g下不間斷離心30分鐘。離心之後，用10ml吸液管收集含有該 等細胞之條帶且將其轉移至50ml管中。該等管用PBS填充直至50ml為止且離心(400g，10分鐘，室溫)移除上清液且將集結粒再懸浮於PBS中。離心(300g，10分鐘，室溫)之後，丟棄上清液，合併2根管子且重複洗滌步驟(此次離心350×g，10分鐘，室溫)。之後，使細胞再懸浮且將集結粒合併於50ml PBS中用於細胞計數。在計數之後，使細胞離心(350g，10分鐘，室溫)且以600萬個細胞/毫升再懸浮於含2% FCS及2nM麩醯胺酸之RPMI中。自所塗鋪之目標細胞移除培養基，以及添加在含2% FCS及2nM麩醯胺酸之RPMI中稀釋之測試抗體。將效應細胞溶液之300,000個細胞轉移至各孔，產生10：1之E：T比。為測定最大釋放，用Triton X-100溶解目標細胞。在24小時及48小時之後，使用細胞毒性偵測套組(#1644793,Roche Applied Science)測定LDH釋放。在腫瘤細胞殺死之後，藉由流動式細胞測量術量測T細胞上之活化標誌物上調。簡言之，收集PBMC，將其轉移至96孔圓底培養盤中且用在FACS緩衝液中稀釋之CD4 PE-Cy7(#3557852,BD Bioscience)、CD8 FITC(#555634,BD Bioscience)、CD25 APC(#555434,BD Bioscience)、CD69 PE(#310906,BioLegend)抗體染色。在4℃下培育30分鐘後，用FACS緩衝液洗滌細胞兩次。在使用BD Canto II量測螢光之前，使細胞再懸浮於200μl FACS緩衝液中。
實例26 全血中之T細胞活化
向96孔圓錐形深孔盤中添加280μl新鮮血液。隨後向血液中添加20μl經稀釋之TCB且藉由震盪培養盤充分混合。在培育箱中在37℃下培育24小時之後，混合血液且將35μl轉移至96孔圓底培養盤中。隨後添加20μl抗體染色混合物，其由CD4 PE-Cy7(#3557852,BD Bioscience)、CD8 FITC(#555634,BD Bioscience)、CD25 APC(#555434,BD Bioscience)、CD69 PE(#310906,BioLegend)及CD45 V500(#560777,BD Horizon)組成，且在暗處在室溫下培育15分鐘。在量測之前，向血液中添加200μl新製備的BD FACS溶解溶液(#349202，BD FCAS)。在室溫下培育15分鐘後，用BD Fortessa量測細胞。
實例27 免疫缺陷型NOD/Shi-scid/IL-2Rγ缺陷(NOG)小鼠中人類化FOLR1 TCB(純系16D5)的SDPK(單劑量藥物動力學)研究
使實驗開始時年齡為6-7週之雌性NOD/Shi-scid/IL-2Rγ缺陷(NOG)小鼠(在Taconic,Denmark育種)根據已提交之準則(GV-Solas；Felasa；TierschG)以12小時光/12小時黑暗之每日循環維持在無特定病原體之條件下。實驗研究方案由當地政府審查且批准(P 2011/128)。動物在到達之後維持一週以使其適應新環境且進行觀察。在常規基礎上進行連續健康監測。
給小鼠靜脈內注射10/1/0.1微克/小鼠之FOLR1 TCB，同時每組且每個時間點對3隻小鼠進行抽血。給所有小鼠注射總體積200μl之恰當溶液。為獲得恰當量之FOLR1 TCB/200μl，必要時用PBS稀釋儲備溶液。在療法注射之後5min、1h、3h、8h、24h、48h、72h、96h及168h，收集血清樣品。
圖15顯示，在具有緩慢清除率之NOG小鼠中，16D5 FOLR1 TCB顯示典型的且劑量相稱之IgG樣PK性質。
Figure 104138283-A0202-12-0142-27
實例28 在攜帶Skov3之NOG小鼠中在人類PBMC轉移之後FOLR1 TCB(純系16D5)之活體內功效
在人類卵巢癌細胞株Skov3中測試FOLR1 TCB，將其皮下注射至PBMC移植之NOG小鼠中。
Skov3卵巢癌細胞獲自ATCC(HTB-77)。在37℃下於水飽和氛圍中，在5% CO2 下於含有10% FCS(Gibco)之RPMI中培養腫瘤細胞株。 使用第35代進行移植，活力>95%。將總共100μl RPMI細胞培養基(Gibco)中5×106 個細胞/動物皮下注射至動物之右側腹中。
使實驗開始時年齡為6-7週之雌性NOD/Shi-scid/IL-2Rγ缺陷(NOG)小鼠(在Taconic,Denmark育種)根據已提交之準則(GV-Solas；Felasa；TierschG)以12小時光/12小時黑暗之每日循環維持在無特定病原體之條件下。實驗研究方案由當地政府審查且批准(P 2011/128)。動物在到達之後維持一週以使其適應新環境且進行觀察。在常規基礎上進行連續健康監測。
根據該方案(圖16)，在研究第0天，給小鼠注射5×106 個Skov3。在研究第21天，經由菲科爾法(Ficoll method)分離健康供體之人類PBMC且將10×106 個細胞腹膜內注射至攜帶腫瘤之小鼠中。兩天後，將小鼠隨機分組且同等地分配於五個處理組(n=12)中，隨後靜脈內注射10/1/0.1微克/小鼠之FOLR1 TCB或10微克/小鼠之DP47對照TCB，每週一次，持續三週。給所有小鼠靜脈內注射200μl恰當溶液。給媒劑組中之小鼠注射PBS。為獲得恰當量之TCB/200μl，必要時用PBS稀釋儲備溶液。使用測徑規(圖17)量測腫瘤生長，每週一次，且腫瘤體積計算如下：Tv ：(W2 /2)×L(W：寬度，L：長度)
每週一次注射FOLR1 TCB產生劑量依賴性抗腫瘤作用。其中10 微克/小鼠及1微克/小鼠之劑量誘導腫瘤收縮且0.1微克/小鼠之劑量誘導腫瘤停滯(圖17，表22)。相比於非靶向對照DP47 TCB，在10微克/小鼠之劑量下達成最大腫瘤收縮。
Figure 104138283-A0202-12-0144-28
關於PD讀出，在研究第32天殺死三隻小鼠/處理組，移出腫瘤且經由用膠原酶V、分散酶II及DNA酶進行酶消化來製備單細胞懸浮液用於後續FACS分析(圖19及20)。單細胞直接用於對細胞外抗原及活化標誌物進行染色或在正常培養基中使用5ng/ml PMA及500ng/ml離子黴素(Ionomycin)在蛋白質轉運抑制劑莫能黴素(Monensin)存在下再刺激5小時。在再刺激之後，針對表面抗原對細胞進行染色，繼之以固定及滲透步驟。隨後針對TNF-α、IFN-γ、IL-10及IL-2對固定樣品進行細胞內染色且藉由流動式細胞測量術分析。關於細胞之脫粒使用相同程序，但在再刺激階段期間添加抗CD107a抗體且針對細胞內穿孔蛋白及顆粒酶B內含物對經固定樣品進行染色。FACS分析以統計方式揭示，在用FOLR1 TCB處理之後，相比於用媒劑及未靶向之對照TCB處理，腫瘤組織中之浸潤性CD4+ 及CD8+ T細胞之數目較大。此外，偵測經FOLR1 TCB處理之腫瘤中所產生之TNF-α、IFN-γ及IL-2以及穿孔蛋白+ /顆粒酶B+ CD4+ 及CD8+ T細胞之較高數目。經FOLR1 TCB處理之腫瘤浸潤性T細胞亦顯示脫粒率高於對照組。
在研究終止第38天，殺死所有動物；移出腫瘤且稱重(圖18)。相比於對照組，經10及1微克/小鼠之FOLR1 TCB處理之腫瘤的重量顯示出統計學上顯著之差異。
表23：實驗條件.
Figure 104138283-A0202-12-0145-29
實例29 產生雙特異性FolR1/CD3-κ-λ抗體
為產生可在不使用任何雜二聚方法(例如，杵-臼技術)的情況下同時結合至人類CD3及人類葉酸受體α(FolR1)之雙特異性抗體(對各抗原而言為單價)，應用共同輕鏈文庫與所謂的互換單抗技術之組合：使人類化CD3結合子之可變區(CH2527_VL7_46/13)融合至標準人類IgG1抗體之CH1域，形成共享兩種特異性之VLVH互換分子(融合至Fc)。為產生互換對應物(VHCL)，CD3特異性可變重鏈域(CH2527_VH_23/12)融合至恆定人類λ輕鏈，而對人類FolR1具有特異性的可變重鏈域(純系16D5，自共同輕鏈文庫分離)融合至恆定人類κ輕鏈。這使得能夠藉由施加後續純化步驟用KappaSelect及LambdaFabSelect管柱(GE Healthcare)純化合乎需要之雙特異性抗體來移除不合需要之均二聚抗體。
所有抗體表現載體均係使用標準重組DNA技術產生，如Sambrook,J.等人，Molecular cloning：A laboratory manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989中所述。根據製造商之建議，使用分子生物試劑。基因或基因片段藉由聚合酶鏈式反應(PCR)擴增或自藉由自動化基因合成在Geneart AG(Regensburg,Germany)之合成寡核苷酸產生。經PCR擴增或次選殖之DNA片段藉由DNA定序(Synergene GmbH,Switzerland)證實。使用標 準Maxiprep套組(Qiagen)，將質體DNA轉型至適合的大腸桿菌宿主菌株中且擴增以便製備轉染級質體DNA。關於雙特異性分子之製造，使用基於聚乙烯亞胺(PEI)之標準方法，用編碼相應基因之質體轉染HEK293 EBNA細胞。三個表現載體之所用質體比為1：1：1。將經轉染細胞培養7天，隨後收集上清液進行純化。雙特異性FolR1/CD3-κ-λ抗體如下製造且純化。
1. 短暫性轉染及製造
如下文所述，針對所需載體使用PEI介導之轉染程序，在HEK293 EBNA細胞中短暫製造κ-λ雙特異性抗體。在不含血清之懸浮液中在CD CHO培養基中培養HEK293 EBNA細胞。關於在500ml搖瓶中製造，在轉染之前24小時接種4億個HEK293 EBNA細胞(關於替代性規模，相應地調整所有量)。關於轉染，藉由210×g使細胞離心5分鐘，用預溫熱之20ml CD CHO培養基置換上清液。表現載體於20ml CD CHO培養基中混合至200μg DNA之最終量。在添加540μl PEI溶液之後，使其渦旋15秒且隨後在室溫下培育10分鐘。隨後，將細胞與DNA/PEI溶液混合，轉移至500ml搖瓶中且在具有5% CO2氛圍的培育箱中在37℃下培育3小時。在培育時間之後，添加160ml F17培養基且培養細胞24小時。在轉染之後一天，添加1mM丙戊酸及7%饋料1。培養7天後，收集上清液，藉由在210×g下離心15分鐘進行純化，將溶液無菌過濾(0.22μm過濾器)且以0.01% w/v之最終濃度添加疊氮化鈉，且保持在4℃下。
2. 純化
分三步純化κ-λ雙特異性抗體：使用對κ輕鏈具有特異性的親和力步驟，繼之以對λ輕鏈具有特異性的親和力步驟且最後藉由尺寸排阻層析步驟來移除聚集體。將自短暫製造獲得之上清液調整至pH 8.0(使用2M TRIS pH 8.0)且施加捕捉選擇κ親和力基質或HiTrap KappaSelect(GE Healthcare)，管柱體積(cv)=1ml，其經5管柱體積(cv)緩衝液A (50mM Tris、100mM甘胺酸、150mM NaCl，pH 8.0)平衡。在用15cv緩衝液A 洗滌之後，使用相對於緩衝液B (50mM Tris、100mM甘胺酸、150mM NaCl，pH 2.0)之pH梯度，經25cv溶離蛋白質。合併含有相關蛋白質之溶離份且將溶液之pH調整至pH 8.0(使用2M Tris pH 8.0)。向經中和合併之溶離份施加捕捉選擇λ親和力基質(現在：HiTrap LambdaFabSelect,GE醫療保健，管柱體積(cv)=1ml)，其經5管柱體積(cv)緩衝液A (50mM Tris、100mM甘胺酸、150mM NaCl，pH 8.0)平衡。在用15cv緩衝液A 洗滌之後，使用相對於緩衝液B (50mM Tris、100mM甘胺酸、150mM NaCl，pH 2.0)之pH梯度，經25cv溶離蛋白質。合併含有相關蛋白質之溶離份且將溶液之pH調整至pH 8.0(使用2M Tris pH 8.0)。使用超濃縮器(Vivaspin 15R 30.000 MWCO HY,Sartorius)濃縮此溶液且隨後施加經20mM組胺酸pH 6.0、140mM NaCl、0.01% Tween-20平衡之SuperdexTM 200 10/300 GL(GE Healthcare)。在尺寸排阻之後，使用超濃縮器(Vivaspin 15R 30.000 MWCO HY,Sartorius)再次濃縮經合併之溶離份。
蛋白質濃度係藉由量測280nm下之光學密度(OD)，使用基於胺基酸序列所計算之莫耳消光係數來測定。藉由SDS毛細管電泳，在存在及不存在還原劑之情況下，遵循製造商說明書(儀器測徑規LabChipGX,Perkin Elmer)分析構築體之純度及分子量。僅可純化少量蛋白質，最終產量為0.17mg/L。
實例30 藉由雙特異性FolR1/CD3-κ-λ抗體進行T細胞介導殺死
在剛分離之PBMC存在下，測試SKOV3細胞上之κλFolR1 TCB之活性。關於陰性對照，包括DP47 TCB。在24小時及48小時之後藉由LDH釋放測定SKOV3細胞之T細胞介導之殺死。48小時後，收集T細 胞且藉由流動式細胞測量術量測CD4 T細胞及CD8 T細胞上之CD69及CD25上調。
κλFolR1構築體以濃度依賴性方式誘導殺死SKOV3細胞，其伴隨著CD4 T細胞上及CD8T細胞上之CD69及CD25上調。
在κλFoLR1 TCB或DP47 TCB存在下，將SKOV3細胞與PBMC一起培育。在24小時及48小時之後藉由量測LDH釋放來測定腫瘤細胞之殺死(圖21)。在κλFoLR1 TCB或DP47 TCB存在下，將SKOV3細胞與PBMC一起培育。48小時後，藉由流動式細胞測量術量測CD4 T細胞及CD8 T細胞上之CD25及CD69上調(圖22)。
實例31 藉由表面電漿子共振生物化學表徵16D5及36F2 FolR1結合子
藉由表面電漿子共振(SPR)評定呈不同單價或二價T細胞雙特異性抗體格式之抗FolR1 16D5及呈IgG形式或呈T細胞雙特異性抗體形式之抗FolR1 36F2與重組人類、食蟹獼猴及鼠類葉酸受體1(均呈Fc融合體形式)之結合。所有SPR實驗均在Biacore T200上在25℃下以HBS-EP作為操作緩衝液(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005%界面活性劑P20,Biacore,GE Healthcare)來進行。
1. 所測試之分子
用於親和力及結合力測定之分子描述於表24中。
Figure 104138283-A0202-12-0148-30
2. 與葉酸受體1之結合力
抗FolR1 IgG或T細胞雙特異性抗體與重組葉酸受體之間的相互作用之結合力如下所述進行測定(表25)。
使用標準偶聯指令(Biacore,GE Healthcare)，將人類、食蟹獼猴及鼠類葉酸受體1之重組生物素化單體Fc融合體(FolR1-Fc)直接偶聯於SA晶片上。固定量為約300-400RU。抗FolR1 IgG或T細胞雙特異性抗體以3.7至900nM範圍內之濃度，以30微升/分鐘之流率通過流動池，持續180秒。監測解離240或600秒。在每一個循環之後，使用30秒10mM甘胺酸鹽酸鹽pH 2之雙重注射使晶片表面再生。藉由減去經重組生物素化鼠類CD134 Fc融合體固定之參考流動池上所得之反應來校正整體折射率差異。由IgG或T細胞雙特異性抗體之二價結合產生的結合曲線接近1：1朗格繆爾結合(即使其為1：2結合)且與彼模型擬合得到表觀KD，其代表二價結合之結合力。使用Bia評估軟體(GE Healthcare)，自擬合之速率常數推導出相互作用之表觀結合力常數。關於1+1 T細胞雙特異性抗體格式，相互作用為真正的1：1且KD表示親和力，因為在此構築體中僅存在一個FolR1結合子。
Figure 104138283-A0202-12-0149-31
3. 與葉酸受體1之親和力
抗FolR1 IgG或T細胞雙特異性抗體與重組葉酸受體之間的相互作用之親和力如下所述進行測定(表26)。
關於親和力量測，在CM5晶片上在pH 5.0下使用標準胺偶聯套組(GE Healthcare)進行約12000個共振單位(RU)之抗人類Fab特異性抗體(Fab捕捉套組，GE Healthcare)的直接偶聯。以10μl/min之流動速率，以20nM捕捉抗FolR1 IgG或T細胞雙特異性抗體40秒，剩餘參考流動池無捕捉。人類、食蟹獼猴或鼠類葉酸受體1 Fc融合體之稀釋系列(12.3至3000nM)以30μl/min通過所有流動池，持續240秒來記錄結合階段。解離階段監測300秒且藉由自樣品溶液切換至HBS-EP進行觸發。在每一個循環之後，使用60秒10mM甘胺酸鹽酸鹽pH 1.5之雙重注射使晶片表面再生。藉由減去參考流動池1上所得之反應來校正整體折射率差異。使用Bia評估軟體(GE Healthcare)，自藉由與1：1朗格繆爾結合擬合所得之速率常數推導出相互作用之親和力常數。
Figure 104138283-A0202-12-0150-32
36F2 TCB對人類及食蟹獼猴FolR1-Fc之親和力(單價結合)為類似的且均為約1000nM，然而對鼠類FolR1-Fc之親和力略佳且為約300 nM。可在鼠類及靈長類動物模型中使用36F2，不需要替代物。
36F2 TCB與人類FolR1之結合力(表觀KD)比16D5 TCB與人類FolR1之親和力小約30倍。在二價格式中，36F2 TCB處於低奈莫耳範圍內，而16D5 TCB處於低皮莫耳範圍(相差1000倍)內。
FolR1表現於以間歇性高水準過度表現之腫瘤細胞上，表現於一些列上皮惡性腫瘤中之癌細胞之表面上且亦表現於正常組織中有限子集之極化上皮細胞的頂部表面上，該等上皮惡性腫瘤包括卵巢癌、乳癌、腎癌、結腸直腸癌、肺癌及其他實體癌症。此等非腫瘤性正常細胞僅以低水準表現FolR1，且包括例如肺泡表面上之支氣管上皮細胞、管狀細胞之腎皮質內腔邊界、視網膜色素上皮(底外側膜)及脈絡叢。
16D5 TCB結合至表現少量FolR1之正常組織細胞，這促使其T細胞介導之殺死。這可能至少部分解釋了在10μg/kg下在食蟹獼猴中觀察到之有限耐受性。諸位發明人想要判定，藉由利用二價結合及結合力，降低T細胞雙特異性分子之親和力是否可以增加高目標密度組織與低目標密度密度組織之間的差異，且從而降低毒性。一般不選擇低親和力結合子作為進一步分析之適合候選者，因為低親和力常常與低效能及功效相關。儘管如此，仍研發呈若干格式之低親和力FolR1結合子36F2且對其生物性質進行表徵。關於以二價T細胞雙特異性抗體格式使用之36F2，結合力效應(單價結合與二價結合之間的差異)為約250倍(1000nM對比4nM)。在低目標密度下，親和力限定相互作用且1000nM導致TCB之低效能。然而，在高目標密度下，分子之結合力開始起作用且4nM導致TCB之高活性(參見實例32)。
在替代方法中，諸位發明人產生16D5之單價格式及呈二價格式之16D5之低親和力變異體(親和力約10-40nM)。以單價格式(1+1)使用之16D5結合子具有約50nM之親和力。高目標密度組織與低目標密 度組織之間的差異可藉由利用結合力效應較佳達成。
實例32 藉由36F2 TCB、Mov19 TCB及21A5 TCB誘導T細胞殺死Skov-3細胞
評定Skov-3細胞(中等FolR1)上由36F2 TCB、Mov19 TCB及21A5 TCB介導之T細胞殺死。人類PBMC用作效應子且在與雙特異性抗體一起培育24h及48h時偵測殺死。簡言之，用胰蛋白酶/EDTA收集目標細胞，洗滌且使用平底96孔盤以25 000個細胞/孔之密度塗鋪。使細胞黏附隔夜。藉由自健康人類供體獲得之富含淋巴細胞之製劑(白血球層)的Histopaque密度離心製備周邊血液單核細胞(PBMC)。新鮮血液用無菌PBS稀釋且依Histopaque梯度(Sigma,#H8889)分層。離心(450×g，30分鐘，室溫)之後，丟棄含PBMC之相界面上方的血漿且將PBMC轉移至新的法爾康管中，隨後填充50ml PBS。對混合物進行離心(400×g，10分鐘，室溫)，丟棄上清液且PBMC集結粒用無菌PBS洗滌兩次(離心步驟350×g，10分鐘)。對所得PBMC群體進行自動計數(ViCell)且於含有10% FCS及1% L-丙胺醯基-L-麩醯胺酸(Biochrom,K0302)之RPMI1640培養基中，在細胞培育箱中在37℃、5% CO2下儲存直至進一步使用(不久於24小時)。關於殺死分析，以指定濃度(範圍為0.005pM-5nM，一式三份)添加抗體。以10：1之最終E：T比添加PBMC至目標細胞中。在37℃、5% CO2 下培育24小時及48小時之後，藉由對藉由細胞凋亡/壞死細胞釋放至細胞上清液中之LDH進行定量來評定目標細胞殺死(LDH偵測套組，Roche Applied Science,#11 644 793 001)。藉由將目標細胞與1% Triton X-100一起培育來達成目標細胞之最大溶解(=100%)。最小溶解(=0%)係指在不存在雙特異性構築體的情況下，目標細胞與效應細胞共培育。
結果顯示，藉由36F2誘導之殺死相較於Mov19 TCB及21A5 TCB強烈減少(圖23A至B)。與殺死分析有關之EC50值使用 GraphPadPrism6計算，概述於表27中。
Figure 104138283-A0202-12-0153-33
實例33 藉由呈不同單價及二價T細胞雙特異性抗體格式之36F2 TCB及16D5 TCB誘導之T細胞殺死
評定藉由36F2 TCB、16D5 TCB、16D5 TCB經典、16D5 TCB 1+1及16D5 TCB HT抗體介導之Hela(高FolR1，約200萬個複本，表14，圖27)、Skov-3(中等FolR1，約70000-90000個複本，表14，圖27)及HT-29(低FolR1，約10000個，表14，圖27)人類腫瘤細胞之T細胞殺死。包括DP47 TCB抗體作為陰性對照。人類PBMC用作效應子且在與雙特異性抗體一起培育24h時偵測殺死。簡言之，用胰蛋白酶/EDTA收集目標細胞，洗滌且使用平底96孔盤以25 000個細胞/孔之密度塗鋪。使細胞黏附隔夜。藉由自健康人類供體獲得之富含淋巴細胞之製劑(白血球層)的Histopaque密度離心製備周邊血液單核細胞(PBMC)。新鮮血液用無菌PBS稀釋且依Histopaque梯度(Sigma,#H8889)分層。離心(450×g，30分鐘，室溫)之後，丟棄含PBMC之相界面上方的血漿且將PBMC轉移至新的法爾康管中，隨後填充50ml PBS。對混合物進行離心(400×g，10分鐘，室溫)，丟棄上清液且PBMC集結粒用無菌PBS洗滌兩次(離心步驟350×g，10分鐘)。對所得PBMC群體進行自動計數(ViCell)且於含有10% FCS及1% L-丙胺醯基-L-麩醯胺酸(Biochrom,K0302)之RPMI1640培養基中，在細胞培育箱 中在37℃、5% CO2下儲存直至進一步使用(不久於24小時)。關於殺死分析，以指定濃度(範圍為0.01pM-100nM，一式三份)添加抗體。以10：1之最終E：T比添加PBMC至目標細胞中。在37℃、5% CO2 下培育24小時之後，藉由對藉由細胞凋亡/壞死細胞釋放至細胞上清液中之LDH進行定量(LDH偵測套組，Roche Applied Science,#11 644 793 001)來評定目標細胞殺死。藉由將目標細胞與1% Triton X-100一起培育來達成目標細胞之最大溶解(=100%)。最小溶解(=0%)係指在不存在雙特異性構築體的情況下，目標細胞與效應細胞共培育。
結果顯示，藉由36F2 TCB誘導之所有三個FolR1+目標細胞株之目標特異性殺死相比於藉由16D5 TCB誘導之殺死而言非常弱(圖24A至C，表29)。藉由單價16D5 TCB(16D5 HT及16D5 1+1)誘導之目標特異性殺死比二價16D5 TCB(16D5 TCB及16D5 TCB經典)差。與殺死分析有關之EC50值使用GraphPadPrism6計算，概述於表28中。重要地，此資料顯示，使用呈二價2+1 TCB格式之36F2 FolR1結合子相比於16D5 FOLR1 TCB而言可加寬治療窗(圖24A至C)。然而16D5與36F2 FOLR1 TCB之間的效能降低對於Hela細胞為約45倍(高FOLR1表現，參見表28：16D5 TCB=0.8對比36F2 TCB 36.0)，且對於Skov3細胞為約297倍(中等FOLR1表現，參見表28：16D5 TCB=0.6對比36F2 TCB 178.4)，此降低對於具有低FOLR1表現之HT29而言為幾乎7000倍(參見表28：16D5 TCB=5.7對比36F2 TCB 39573)。因此，36F2 FOLR1 TCB在高表現與低表現細胞之間有區別，這一點對於降低毒性尤其重要，因為一些正常的非腫瘤性組織之細胞表現極低水準之FolR1(約小於1000個複本/細胞)。與此觀察結果一致，下文實例35中所論述之結果顯示，36F2 TCB不誘導T細胞殺死初級細胞(圖26A至D)，然而對於16D5 TCB而言，可在培育48小時之後在HRCEpiC及HRPEpiC細胞上觀察到一些殺死(圖26B及C)。36F2 TCB之此重要特徵允許給藥治 療FolR1陽性腫瘤，使得其介導強力殺死具有高或中等FOLR1表現之腫瘤組織，但不介導殺死具有低(部分極化)表現之正常組織。值得注意地，此特徵似乎藉由呈二價2+1反向格式之36F2 TCB的結合力介導，因為當使用攜帶相同的低親和力36F2結合子之1+1單價格式時，未觀察到此特徵。
換言之，呈二價2+1格式之36F2 TCB包含具有相對較低之親和力的FolR1結合部分，但其具有允許區分高FolR1表現細胞與低FolR1表現細胞的結合力效應。因為腫瘤細胞以高水準或中等水準表現FolR1，故此TCB選擇性結合至腫瘤細胞且不結合至以低水準表現FolR1或完全不表現FolR1之正常的非癌細胞。
除以上有利特徵以外，呈二價2+1反向格式之36F2 TCB亦具有以下優勢：其不需要化學交聯或其他雜合方法。這使其適合製造用於治療患者、例如患有FolR1陽性癌性腫瘤的患者的藥物。呈二價2+1反向格式之36F2 TCB可使用標準CHO方法製造，且聚集體少。此外，呈二價2+1形式之36F2 TCB包含人類及人類化序列，使其優於採用大鼠及鼠類多肽的分子，大鼠及鼠類多肽在投與給人類時具有高度免疫原性。此外，呈二價2+1格式之36F2 TCB經工程改造以消除FcgR結合，且因而，不會引起FcgR交聯及輸注反應，進一步增強其在投與給患者時之安全性。
如以上所述之結果所證明，其頭對尾幾何結構使得呈二價2+1反向格式之36F2 TCB成為誘導絕對目標細胞殺死之高效分子。其二價性增強結合力及效能，且亦使得對高表現細胞與低表現細胞有所區分。其偏好高或中等目標表現細胞，這歸因於其結合力效應降低由T細胞介導殺死以低水準表現FolR1之正常細胞所產生的毒性。
呈二價2+1格式之36F2 TCB及本文中所揭示之其他實施例的進一步優勢在於，其臨床發展不需要使用替代分子，因為其結合至人類、 食蟹獼猴及鼠類FolR1。因而，本文中所揭示之分子識別不同於先前所述不識別來自所有三個物種之FolR1的FolR1抗體的抗原決定基。
Figure 104138283-A0202-12-0156-34
表29顯示16D5 TCB及36F2 TCB在所測試之不同細胞株上的EC50值之比較。自所得EC50值計算△(16D5 TCB之EC50減36F2 TCB之EC50)及x倍差異(16D5 TCB之EC50除以36F2 TCB之EC50)。
Figure 104138283-A0202-12-0156-35
所計算之EC50值清楚地顯示，36F2 TCB與16D5 TCB之間的差異變得愈大，目標細胞上之FolR1表現愈低。
對16D5 TCB及兩個單價16D5 TCB(16D5 TCB HT及16D5 1+1)進行與16D5 TCB及36F2 TCB之EC50值比較所做的相同計算。表30及31顯示16D5 TCB對比16D5 TCB HT(表30)及16D5 TCB對比16D5 TCB 1+1(表31)之EC50值比較以及相應△(16D5 TCB之EC50減16D5 TCB HT/1+1之EC50)及x倍差異(16D5 TCB之EC50除以16D5 TCB HT/1+1之EC50)。
Figure 104138283-A0202-12-0157-36
Figure 104138283-A0202-12-0157-37
16D5 TCB及36F2 TCB之EC50值比較(表29)顯示，EC50值之差異變得愈大，目標細胞上之FolR1表現愈低。在比較16D5 TCB及單價16D5 TCB(表29及表30)時未見到此效應。關於16D5 TCB 1+1(表31)，16D5 TCB與16D5 TCB 1+1之間的EC50差異亦隨著FolR1表現遞減而存在略微增加，但目前為止尚不如16D5 TCB對比36F2 TCB之比較中可見般顯著。
實例34 在藉由36F2 TCB及16D5 TCB抗體誘導T細胞殺死表現FolR1之腫瘤細胞之後，CD8+及CD4+效應細胞上之CD25及CD69上調
使用識別T細胞活化標誌物CD25(晚期活化標誌物)及CD69(早期活化標誌物)之抗體，藉由FACS分析評定在藉由36F2 TCB及16D5 TCB介導T細胞殺死表現FolR1之Hela、Skov-3及HT-29腫瘤細胞之後CD8+ 及CD4+ T細胞之活化情況。包括DP47 TCB作為非結合對照。抗體及殺死分析條件基本上如上文(實例32)所述，使用相同的抗體濃度範圍(0.01pM-100nM，一式三份)，E：T比10：1且培育時間為48小時。
在培育之後，將PBMC轉移至圓底96孔盤中，在400×g下離心4分 鐘且用含有0.1% BSA的PBS洗滌兩次。根據製造商說明書，對CD8(PE抗人類CD8，BD #555635)、CD4(Brilliant Violet 421TM 抗人類CD4，Biolegend #300532)、CD69(FITC抗人類CD69，BD #555530)及CD25(APC抗人類CD25 BD #555434)進行表面染色。用含有0.1% BSA之PBS以150微升/孔洗滌細胞兩次。離心後，使樣品再懸浮於200微升/孔PBS 0.1%中進行FACS量測。以BD FACS Canto II分析樣品。
在殺死Hela(圖25A)及Skov-3(圖25B)細胞之後，36F2 TCB誘導CD8+及CD4+ T細胞上之活化標誌物(CD25、CD69)目標特異性上調。相較於16D5 TCB，藉由36F2誘導之CD8+及CD4+ T細胞上之CD25及CD69的上調非常弱。
在HT-29(低FolR1)上，僅可在最高濃度之36F2 TCB下見到活化標誌物上調。對比而言，在16D5 TCB之情況下，已可在低得多的抗體濃度下見到CD25及CD69上調(圖25C)。
如腫瘤溶解實驗中清楚所見，在殺死之後T細胞(CD4+及CD8+)上之活化標誌物(CD25及CD69)之分析清楚地顯示，16D5 TCB與36F2 TCB之間的差異變得愈大，目標細胞上之FolR1表現量愈低。
實例35 藉由36F2 TCB及16D5 TCB誘導T細胞殺死初級細胞
評定初級細胞(人類腎皮質上皮細胞(HRCEpiC)(ScienCell Research Laboratories；目錄號4110)及人類視網膜色素上皮細胞(HRPEpiC)(ScienCell Research Laboratories；目錄號6540))上藉由36F2 TCB及16D5 TCB介導之T細胞殺死。包括HT-29細胞(低FolR1)作為對照細胞株。DP47 TCB充當非結合對照。人類PBMC用作效應子且在與雙特異性抗體一起培育24h及48h時偵測殺死。簡言之，用胰蛋白酶/EDTA收集目標細胞，洗滌且使用平底96孔盤以25 000個細胞/孔之密度塗鋪。使細胞黏附隔夜。藉由自健康人類供體獲得之富含淋巴 細胞之製劑(白血球層)的Histopaque密度離心製備周邊血液單核細胞(PBMC)。新鮮血液用無菌PBS稀釋且依Histopaque梯度(Sigma,#H8889)分層。離心(450×g，30分鐘，室溫)之後，丟棄含PBMC之相界面上方的血漿且將PBMC轉移至新的法爾康管中，隨後填充50ml PBS。對混合物進行離心(400×g，10分鐘，室溫)，丟棄上清液且PBMC集結粒用無菌PBS洗滌兩次(離心步驟350×g，10分鐘)。對所得PBMC群體進行自動計數(ViCell)且於含有10% FCS及1% L-丙胺醯基-L-麩醯胺酸(Biochrom,K0302)之RPMI1640培養基中，在細胞培育箱中在37℃、5% CO2下儲存直至進一步使用(不久於24小時)。關於殺死分析，以指定濃度(範圍為0.01pM-10nM，一式三份)添加抗體。以10：1之最終E：T比添加PBMC至目標細胞中。在37℃、5% CO2 下培育24小時及48小時之後，藉由對藉由細胞凋亡/壞死細胞釋放至細胞上清液中之LDH進行定量來評定目標細胞殺死(LDH偵測套組，Roche Applied Science,#11 644 793 001)。藉由將目標細胞與1% Triton X-100一起培育來達成目標細胞之最大溶解(=100%)。最小溶解(=0%)係指在不存在雙特異性構築體的情況下，目標細胞與效應細胞共培育。
結果顯示，36F2 TCB不誘導T細胞殺死初級細胞(圖26A至D)，然而對於16D5 TCB而言，在培育48小時之後，可觀察到殺死一些HRCEpiC及HRPEpiC細胞(圖26B及D)。如上所述，觀察到在16D5 TCB與36F2 TCB之間T細胞殺死HT-29細胞之間之強大差異(圖26E、F)。
實例36 製備DP47 GS TCB(2+1互換Fab-IgG P329G LALA反向=「未靶向之TCB」)
「未靶向之TCB」在以上實驗中用作對照。該雙特異性抗體接合CD3e但不結合至任何其他抗原，且因此不能使T細胞與任何目標細胞 交聯(且隨後不能誘導任何殺死)。因此，其在分析中用作陰性對照，以監測任何非特異性T細胞活化。此未靶向之TCB如WO2014/131712中所述製備。簡言之，將重鏈及輕鏈可變區之DNA序列次選殖於具有恆定重鏈或恆定輕鏈之框架經預先插入各別接受者哺乳動物之表現載體中。該抗體表現係由MPSV啟動子驅動且在CDS之3'端攜帶合成polyA信號序列。另外，各載體含有EBV OriP序列。
該分子係藉由使用聚乙烯亞胺以該等哺乳動物表現載體共轉染HEK293-EBNA細胞來製造。該等細胞係用相應表現載體以1：2：1：1之比率(「載體重鏈Fc(臼)」：「載體輕鏈」：「載體輕鏈互換Fab」：「載體重鏈Fc(杵)-Fab互換Fab」)轉染。
關於轉染，使HEK293 EBNA細胞在CD CHO培養基中不含血清之懸浮液中培養。關於在500ml搖瓶中製造，在轉染前24小時接種4億個HEK293 EBNA細胞。關於轉染，藉由210×g使細胞離心5分鐘，用預溫熱之20ml CD CHO培養基置換上清液。表現載體於20ml CD CHO培養基中混合至200g DNA之最終量。在添加540μl PEI溶液之後，使其渦旋15秒且隨後在室溫培育10分鐘。隨後，將細胞與DNA/PEI溶液混合，轉移至500ml搖瓶中且在具有5% CO2氛圍的培育箱中在37℃培育3小時。在培育時間之後，添加160ml F17培養基且培養細胞24小時。在轉染後一天，添加1mM丙戊酸及7%饋料1。培養7天後，收集上清液，藉由在210×g離心15分鐘純化，將溶液無菌過濾(0.22μm過濾器)且以0.01% w/v之最終濃度添加疊氮化鈉，且保持在4℃。
藉由親和層析，使用蛋白A，自細胞培養物上清液純化所分泌之蛋白質。將上清液加載至經40ml之20mM磷酸鈉、20mM檸檬酸鈉、0.5M氯化鈉(pH 7.5)平衡之HiTrap蛋白A HP管柱(CV=5mL，GE Healthcare)上。藉由用至少10管柱體積20mM磷酸鈉、20mM檸檬酸 鈉、0.5M氯化鈉(pH 7.5)洗滌，移除未結合蛋白質。在20管柱體積內，在自20mM檸檬酸鈉、0.5M氯化鈉(pH 7.5)至20mM檸檬酸鈉、0.5M氯化鈉(pH 2.5)之梯度期間，溶離目標蛋白質。藉由添加1/10之0.5M磷酸鈉(pH 8)來中和蛋白質溶液。將目標蛋白質濃縮且過濾，隨後加載至經20mM組胺酸、140mM氯化鈉溶液(pH 6.0)平衡的HiLoad Superdex 200管柱(GE Healthcare)上。
所純化蛋白質樣品之蛋白質濃度係藉由量測280nm下之光學密度(OD)、使用基於胺基酸序列所計算之莫耳消光係數來測定。
藉由在存在及不存在還原劑情況下之CE-SDS分析來分析分子之純度及分子量。根據製造商說明書，使用測徑規LabChip GXII系統(Caliper lifescience)。使用2μg樣品進行分析。
在25℃下，使用在25mM K2HPO4、125mM NaCl、200mM L-精胺酸單鹽酸鹽、0.02%(w/v)NaN3，pH 6.7操作緩衝液中平衡之TSKgel G3000 SW XL分析型尺寸排阻管柱(Tosoh)分析抗體樣品中之聚集體含量。
Figure 104138283-A0202-12-0161-38
Figure 104138283-A0202-12-0161-39
實例37 16D5 TCB及9D11 TCB及其相應CD3脫醯胺變異體N100A及S100aA與 表現CD3之Jurkat細胞的結合
評定表現CD3之永生化T淋巴細胞株(Jurkat)上16D5 TCB及相應CD3脫醯胺變異體16D5 TCB N100A及16D5 TCB S100aA以及9D11 TCB及脫醯胺變異體9D11 TCB N100A及9D11 TCB S100aA與人類CD3之結合。簡言之，收集細胞，計數，檢查活力且以2×106 個細胞/毫升再懸浮於FACS緩衝液(100μl PBS 0.1% BSA)中。在4℃下，在圓底96孔盤中，使100μl細胞懸浮液(含有0.2×106 個細胞)與不同濃度雙特異性抗體(686pM-500nM)一起培育30分鐘。在用冷PBS 0.1% BSA進行之兩個洗滌步驟之後，使樣品與PE結合親和純化F(ab')2片段山羊抗人類IgG Fcg片段特異性二級抗體(Jackson Immuno Research Lab PE #109-116-170)一起在4℃下另外再培育30分鐘。在用冷PBS 0.1% BSA洗滌樣品兩次之後，即刻使用FACS CantoII(軟體FACS Diva)，藉由FACS對其進行分析。使用GraphPadPrism6獲得結合曲線(圖28A至B)。
結果顯示，脫醯胺變異體N100A及S100aA與CD3之結合少於親本抗體16D5 TCB(圖28A)及9D11 TCB(圖28B)。
實例38 藉由16D5 TCB及9D11 TCB及其CD3脫醯胺變異體N100A及S100aA誘導T細胞殺死Skov-3及HT-29細胞
評定Skov-3(中等FolR1)及HT-29(低FolR1)細胞上藉由16D5 TCB及相應CD3脫醯胺變異體16D5 TCB N100A及16D5 TCB S100aA以及9D11 TCB及脫醯胺變異體9D11 TCB N100A及9D11 TCB S100aA介導之T細胞殺死。人類PBMC用作效應子且在與雙特異性抗體一起培育24h時偵測殺死。簡言之，用胰蛋白酶/EDTA收集目標細胞，洗滌且使用平底96孔盤以25 000個細胞/孔之密度塗鋪。使細胞黏附隔夜。藉由自健康人類供體獲得之富含淋巴細胞之製劑(白血球層)的 Histopaque密度離心製備周邊血液單核細胞(PBMC)。新鮮血液用無菌PBS稀釋且依Histopaque梯度(Sigma,#H8889)分層。離心(450×g，30分鐘，室溫)之後，丟棄含PBMC之相界面上方的血漿且將PBMC轉移至新的法爾康管中，隨後填充50ml PBS。對混合物進行離心(400×g，10分鐘，室溫)，丟棄上清液且PBMC集結粒用無菌PBS洗滌兩次(離心步驟350×g，10分鐘)。對所得PBMC群體進行自動計數(ViCell)且於含有10% FCS及1% L-丙胺醯基-L-麩醯胺酸(Biochrom,K0302)之RPMI1640培養基中，在細胞培育箱中在37℃、5% CO2下儲存直至進一步使用(不久於24小時)。關於殺死分析，以指定濃度(範圍為0.01pM-10nM，一式三份)添加抗體。以10：1之最終E：T比添加PBMC至目標細胞中。在37℃、5% CO2 下培育24小時之後，藉由對藉由細胞凋亡/壞死細胞釋放至細胞上清液中之LDH進行定量(LDH偵測套組，Roche Applied Science,#11 644 793 001)來評定目標細胞殺死。藉由將目標細胞與1% Triton X-100一起培育來達成目標細胞之最大溶解(=100%)。最小溶解(=0%)係指在不存在雙特異性構築體的情況下，目標細胞與效應細胞共培育。
結果顯示，在Skov-3細胞上，藉由CD3脫醯胺變異體16D5 TCB N100A及16D5 S100aA誘導之殺死類似於藉由16D5 TCB誘導之殺死(圖29A)。這同樣適用於9D11 TCB及其變異體9D11 TCB N100A及9D11 TCB S100aA(圖29B)。在FolR1低表現HT-29細胞上，S100aA變異體顯示殺死功效削弱，16D5TCB(圖30A)以及9D11 TCB(圖30B)之情況即如此。與殺死分析相關之EC50值使用GraphPadPrism6計算，提供於表35中。
表35：藉由16D5 TCB及9D11 TCB及其脫醯胺變異體N100A及A100aA誘導T細胞介導殺死表現FolR1之Skov-3及HT-29細胞的EC50值(pM).
Figure 104138283-A0202-12-0164-40
實例39 藉由表面電漿子共振生物化學表徵含兩個CD3結合子變異體(N100A及S100aA)之TCB以移除脫醯胺位點
藉由表面電漿子共振(SPR)評定兩個含CD3結合子變異體(N100A或S100aA)之16D5TCB與人類重組CD3(呈Fc融合體形式之CD3ε-CD3δ雜二聚體)的結合。所有SPR實驗均在Biacore T200上在25℃下以HBS-EP作為操作緩衝液(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005%界面活性劑P20,Biacore,Freiburg/Germany)來進行。
與CD3ed-Fc之親和力
抗FolR1 T細胞雙特異性抗體與重組CD3ε-δ雜二聚體之間的相互作用之親和力如下所述進行測定(表36)。
關於親和力量測，在CM5晶片上在pH 5.0下使用標準胺偶聯套組(GE Healthcare)進行約6000個共振單位(RU)之抗人類Fab特異性抗體(Fab捕捉套組，GE Healthcare)的直接偶聯。以20μl/min之流動速率，以200nM捕捉抗FolR1 T細胞雙特異性抗體60秒，剩餘參考流動池無捕捉。人類及食蟹獼猴葉酸受體1 Fc融合體之稀釋系列(4.1至3000nM)以30μl/min通過所有流動池，持續240秒來記錄結合階段。解離階段監測240秒且藉由自樣品溶液切換至HBS-EP進行觸發。在每一個循環之後，使用60秒10mM甘胺酸鹽酸鹽pH 1.5之雙重注射使晶片表面再生。藉由減去參考流動池1上所得之反應來校正整體折射率 差異。使用Bia評估軟體(GE Healthcare)，自藉由與1：1朗格繆爾結合擬合所得之速率常數推導出相互作用之親和力常數。
Figure 104138283-A0202-12-0165-41
兩個CD3脫醯胺變異體之親和力相比於野生型CD3結合子(CH2527)略有降低，但差異不大。
實例40 含用於移除CD3結合子中之脫醯胺位點之突變的16D5 T細胞雙特異性抗體之兩個變異體(16D5 TCB N100A、16D5 TCB S100aA)的製造及純化 短暫性轉染及製造
如下文所述，針對所需載體使用PEI介導之轉染程序，在HEK293 EBNA細胞中短暫製造兩個脫醯胺變異體16D5 TCB。在不含血清之懸浮液中在CD CHO培養基中培養HEK293 EBNA細胞。關於在500ml搖瓶中製造，在轉染之前24小時接種4億個HEK293 EBNA細胞(關於替代性規模，相應地調整所有量)。關於轉染，藉由210×g使細胞離心5分鐘，用預溫熱之20ml CD CHO培養基置換上清液。表現載體於20ml CD CHO培養基中混合至200μg DNA之最終量。在添加540μl PEI溶液之後，使其渦旋15秒且隨後在室溫下培育10分鐘。隨後，將細胞與DNA/PEI溶液混合，轉移至500ml搖瓶中且在具有5% CO2氛圍的培育箱中在37℃下培育3小時。在培育時間之後，添加160ml F17培養基且培養細胞24小時。在轉染之後一天，添加1mM丙戊酸及7%饋料1。培養7天後，收集上清液，藉由在210×g下離心15分鐘進行純 化，將溶液無菌過濾(0.22μm過濾器)且以0.01% w/v之最終濃度添加疊氮化鈉，且保持在4℃下。製造後，收集上清液，經由0.22μm無菌過濾器過濾且儲存在4℃下直至純化為止。
純化
兩個脫醯胺變異體16D5 TCB使用標準程序，諸如蛋白A親和力純化(Äkta Explorer)及尺寸排阻層析，分兩步進行純化。將自短暫製造獲得之上清液調整至pH 8.0(使用2M TRIS 8.0)且施加經8管柱體積(cv)緩衝液A (20mM磷酸鈉pH 7.5、20mM檸檬酸鈉)平衡之MabSelect SuRe(GE Healthcare，管柱體積(cv)=2ml)。在用10cv緩衝液A 洗滌之後，使用相對於緩衝液B (20mM檸檬酸鈉pH 3.0、100mM NaCl、100mM甘胺酸)之pH梯度，經20cv溶離蛋白質。合併含有相關蛋白質之溶離份且將溶液之pH溫和地調整至pH 6.0(使用0.5M Na2 HPO4 pH 8.0)。使用超濃縮器(Amicon Ultra-15,30.000 MWCO,Millipore)將樣品濃縮至1ml且隨後施加經20mM組胺酸pH 6.0、140mM NaCl平衡之HiLoadTM 16/60 SuperdexTM 200製備級(GE Healthcare)。藉由分析型尺寸排阻層析分析溶離份之聚集體含量。因此，在25℃下，向30μl各溶離份施加在25mM K2 HPO4 、125mM NaCl、200mM L-精胺酸單鹽酸鹽、0.02%(w/v)NaN3 ，pH 6.7操作緩衝液中平衡之TSKgel G3000 SW XL分析型尺寸排阻管柱(Tosoh)。合併含有小於2%寡聚物之溶離份。蛋白質濃度係藉由量測280nm下之光學密度(OD)，使用基於胺基酸序列所計算之莫耳消光係數來測定。藉由SDS毛細管電泳(CE-SDS)，在存在及不存在還原劑之情況下，遵循製造商說明書(儀器測徑規LabChipGX,Perkin Elmer)分析構築體之純度及分子量。將經純化蛋白質冷凍在液氮中且儲存在-80℃下。
表36：呈T細胞雙特異性抗體格式之兩個16D5脫醯胺變異體之藉由CE-SDS獲得的產量、單體含量及純度.
Figure 104138283-A0202-12-0167-42
兩個TCB均以良好品質製得，類似於含野生型CD3結合子之構築體。
實例41 製造且純化呈IgG形式之兩個16D5結合子變異體(D52dE及D52dQ)來移除CDR中之熱點 短暫性轉染及製造
如下所述，針對所需載體使用PEI介導之轉染程序，在HEK293 EBNA細胞中短暫製造兩個IgG。在不含血清之懸浮液中在CD CHO培養基中培養HEK293 EBNA細胞。關於在500ml搖瓶中製造，在轉染之前24小時接種4億個HEK293 EBNA細胞(關於替代性規模，相應地調整所有量)。關於轉染，藉由210×g使細胞離心5分鐘，用預溫熱之20ml CD CHO培養基置換上清液。表現載體於20ml CD CHO培養基中混合至200μg DNA之最終量。在添加540μl PEI溶液之後，使其渦旋15秒且隨後在室溫下培育10分鐘。隨後，將細胞與DNA/PEI溶液混合，轉移至500ml搖瓶中且在具有5% CO2氛圍的培育箱中在37℃下培育3小時。在培育時間之後，添加160ml F17培養基且培養細胞24小時。在轉染之後一天，添加1mM丙戊酸及7%饋料1。培養7天後，收集上清液，藉由在210×g下離心15分鐘進行純化，將溶液無菌過濾(0.22μm過濾器)且以0.01% w/v之最終濃度添加疊氮化鈉，且保持在4℃下。在製造之後，收集上清液且經由0.22μm無菌過濾器過濾含有抗體之上清液且將其儲存在4℃下直至純化。
抗體純化
兩個IgG使用標準程序，諸如蛋白A親和力純化(Äkta Explorer)及 尺寸排阻層析，分兩步進行純化。將自短暫製造獲得之上清液調整至pH 8.0(使用2M TRIS 8.0)且施加經8管柱體積(cv)緩衝液A (20mM磷酸鈉、20mM檸檬酸鈉，pH 7.5)平衡之POROS MabCapture A(Applied Biosystems，管柱體積(cv)=1ml)。在用10cv緩衝液A 洗滌之後，使用相對於緩衝液B (20mM檸檬酸鈉pH 3.0、100mM NaCl、100mM甘胺酸)之pH步驟，經5cv溶離蛋白質。將5ml含相關蛋白質者儲存於Äkta Explorer上之迴路中且隨後施加經20mM組胺酸pH 6.0、140mM NaCl(不使用TWEEn)平衡之HiLoad 16/60 SuperdexTM 200(GE Healthcare)。合併含有IgG之溶離份且使用超濃縮器(Amicon Ultra-15,30.000 MWCO,Millipore)濃縮。藉由分析型尺寸排阻層析分析最終合併物中之聚集體含量。因此，在25℃下，向30μl施加在25mM K2 HPO4 、125mM NaCl、200mM L-精胺酸單鹽酸鹽、0.02%(w/v)NaN3 ，pH 6.7操作緩衝液中平衡之TSKgel G3000 SW XL分析型尺寸排阻管柱(Tosoh)。蛋白質濃度係藉由量測280nm下之光學密度(OD)，使用基於胺基酸序列所計算之莫耳消光係數來測定。藉由SDS毛細管電泳(CE-SDS)，在存在及不存在還原劑之情況下，遵循製造商說明書(儀器測徑規LabChipGX,Perkin Elmer)分析構築體之純度及分子量。將經純化蛋白質儲存於4℃下。
Figure 104138283-A0202-12-0168-43
兩個IgG均較佳地且以良好品質製得。
實例42 藉由表面電漿子共振生物化學表徵呈IgG形式之用於移除CDR中之熱點的兩個16D5結合子變異體(D52dE及D52dQ)
藉由表面電漿子共振(SPR)評定呈IgG形式之兩個16D5結合子變異體(D52dE及D52dQ)與人類及食蟹獼猴重組葉酸受體1(均呈Fc融合體形式)之結合。所有SPR實驗均在Biacore T200上在25℃下以HBS-EP作為操作緩衝液(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005%界面活性劑P20,Biacore,Freiburg/Germany)來進行。
1. 與葉酸受體1之結合力
抗FolR1 IgG或T細胞雙特異性抗體與重組葉酸受體之間的相互作用之結合力如下所述進行測定(表38)。
使用標準偶聯指令(Biacore,Freiburg/Germany)，將人類、食蟹獼猴及鼠類葉酸受體1之重組生物素化單體Fc融合體(FolR1-Fc)直接偶聯於SA晶片上。固定量為約160。抗FolR1 IgG或T細胞雙特異性抗體以3.7至900nM範圍內之濃度，以30微升/分鐘之流率通過流動池，持續180秒。監測解離600秒。藉由減去經重組生物素化鼠類IL2受體Fc融合體固定之參考流動池上所得之反應來校正整體折射率差異。由IgG或T細胞雙特異性抗體之二價結合產生的結合曲線接近1：1朗格繆爾結合(即使其為1：2結合)且與彼模型擬合得到表觀KD，其代表二價結合之結合力。使用Bia評估軟體(GE Healthcare)，自擬合之速率常數推導出相互作用之表觀結合力常數。
Figure 104138283-A0202-12-0169-44
2. 與葉酸受體1之親和力
抗FolR1 IgG或T細胞雙特異性抗體與重組葉酸受體之間的相互作用之親和力如下所述進行測定(表39)。
關於親和力量測，在CM5晶片上在pH 5.0下使用標準胺偶聯套組(GE Healthcare)進行約10000個共振單位(RU)之抗人類Fab特異性抗體(Fab捕捉套組，GE Healthcare)的直接偶聯。以10μl/min之流動速率，以20nM捕捉抗FolR1 IgG或T細胞雙特異性抗體40秒，剩餘參考流動池無捕捉。人類及食蟹獼猴葉酸受體1 Fc融合體之稀釋系列(12.35至3000nM)以30μl/min通過所有流動池，持續240秒來記錄結合階段。解離階段監測300秒且藉由自樣品溶液切換至HBS-EP進行觸發。在每一個循環之後，使用60秒10mM甘胺酸鹽酸鹽pH 1.5之雙重注射使晶片表面再生。藉由減去參考流動池1上所得之反應來校正整體折射率差異。使用Bia評估軟體(GE Healthcare)，自藉由與1：1朗格繆爾結合擬合所得之速率常數推導出相互作用之親和力常數。
Figure 104138283-A0202-12-0170-45
相比於野生型16D5結合子，兩個16D5熱點變異體具有類似結合力(二價結合)。D52dQ變異體之結合力略有降低且此差異在親和力(單價結合)方面甚至更明顯。
實例43 製造且純化呈IgG形式之16D5結合子之在重鏈及輕鏈中含突變的十二個變異體來降低對FolR1之親和力 短暫性轉染及製造
如下所述，針對所需載體使用PEI介導之轉染程序，在HEK293 EBNA細胞中短暫製造十二個IgG。在不含血清之懸浮液中在CD CHO培養基中培養HEK293 EBNA細胞。關於在500ml搖瓶中製造，在轉染之前24小時接種4億個HEK293 EBNA細胞(關於替代性規模，相應地調整所有量)。關於轉染，藉由210×g使細胞離心5分鐘，用預溫熱之20ml CD CHO培養基置換上清液。表現載體於20ml CD CHO培養基中混合至200μg DNA之最終量。在添加540μl PEI溶液之後，使其渦旋15秒且隨後在室溫下培育10分鐘。隨後，將細胞與DNA/PEI溶液混合，轉移至500ml搖瓶中且在具有5% CO2氛圍的培育箱中在37℃下培育3小時。在培育時間之後，添加160ml F17培養基且培養細胞24小時。在轉染之後一天，添加1mM丙戊酸及7%饋料1。培養7天後，收集上清液，藉由在210×g下離心15分鐘進行純化，將溶液無菌過濾(0.22μm過濾器)且以0.01% w/v之最終濃度添加疊氮化鈉，且保持在4℃下。在製造之後，收集上清液且經由0.22μm無菌過濾器過濾含有抗體之上清液且將其儲存在4℃下直至純化。
抗體純化
所有分子均使用標準程序，諸如蛋白A親和力純化(Äkta Explorer)及尺寸排阻層析，分兩步進行純化。將自短暫製造獲得之上清液調整至pH 8.0(使用2M TRIS 8.0)且施加經8管柱體積(cv)緩衝液A (20mM磷酸鈉、20mM檸檬酸鈉，pH 7.5)平衡之POROS MabCapture A(Applied Biosystems，管柱體積(cv)=1ml)。在用10cv緩衝液A 洗滌之後，使用相對於緩衝液B (20mM檸檬酸鈉pH 3.0、100mM NaCl、100mM甘胺酸)之pH步驟，經5cv溶離蛋白質。將5ml含相關蛋白質者儲存於Äkta Explorer上之迴路中且隨後施加經20mM組胺酸pH 6.0、140mM NaCl、0.01% Tween-20平衡之HiLoad 16/60 SuperdexTM 200(GE Healthcare)。合併含有IgG之溶離份且使用超濃縮器(Amicon Ultra-15,30.000 MWCO,Millipore)濃縮。藉由分析型尺寸排阻層析分析最終合併物中之聚集體含量。因此，在25℃下，向30μl施加在25mM K2 HPO4 、125mM NaCl、200mM L-精胺酸單鹽酸鹽、0.02%(w/v)NaN3 ，pH 6.7操作緩衝液中平衡之TSKgel G3000 SW XL分析型尺寸排阻管柱(Tosoh)。蛋白質濃度係藉由量測280nm下之光學密度(OD)，使用基於胺基酸序列所計算之莫耳消光係數來測定。藉由SDS毛細管電泳(CE-SDS)，在存在及不存在還原劑之情況下，遵循製造商說明書(儀器測徑規LabChipGX,Perkin Elmer)分析構築體之純度及分子量。將經純化蛋白質儲存於4℃下。
Figure 104138283-A0202-12-0172-46
所有十二個IgG均較佳地且以良好品質製得。
實例44 藉由表面電漿子共振生物化學表徵呈IgG形式之16D5重鏈及輕鏈組合變異體
藉由表面電漿子共振(SPR)評定呈IgG形式之FolR1 16D5重鏈及輕鏈組合變異體結合子與不同重組葉酸受體(人類、鼠類及食蟹獼猴FolR1；均呈Fc融合體形式)的結合。所有SPR實驗均在Biacore T200上在25℃下以HBS-EP作為操作緩衝液(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005%界面活性劑P20,Biacore,Freiburg/Germany)來進行。
與葉酸受體1之結合力
抗FolR1 IgG或T細胞雙特異性抗體與重組葉酸受體之間的相互作用之結合力如下所述進行測定(表41)。
使用標準偶聯指令(Biacore,Freiburg/Germany)，將人類、食蟹獼猴及鼠類葉酸受體1之重組生物素化單體Fc融合體(FolR1-Fc)直接偶聯於SA晶片上。固定量為約300。抗FolR1 IgG或T細胞雙特異性抗體以11.1至900nM範圍內之濃度，以30微升/分鐘之流率通過流動池，持續180秒。監測解離240或600秒。藉由減去經重組生物素化鼠類IL2受體Fc融合體固定之參考流動池上所得之反應來校正整體折射率差異。由IgG或T細胞雙特異性抗體之二價結合產生的結合曲線接近1：1朗格繆爾結合(即使其為1：2結合)且與彼模型擬合得到表觀KD，其代表二價結合之結合力。使用Bia評估軟體(GE Healthcare)，自擬合之速率常數推導出相互作用之表觀結合力常數。關於低親和力動力學，由於結合及解離階段過快以致於無法藉由1：1朗格繆爾結合模型擬合，故使用Bia評估軟體(GE Healthcare)來應用穩態分析模型。穩態分析給出平衡時結合反應之KD。
Figure 104138283-A0202-12-0173-47
Figure 104138283-A0202-12-0174-48
與葉酸受體1之親和力
抗FolR1 IgG或T細胞雙特異性抗體與重組葉酸受體之間的相互作用之親和力如下所述進行測定(表42)。
關於親和力量測，在CM5晶片上在pH 5.0下使用標準胺偶聯套組(GE Healthcare)進行約10000個共振單位(RU)之抗人類Fab特異性抗體(Fab捕捉套組，GE Healthcare)的直接偶聯。以10μl/min之流動速率，以200nM捕捉抗FolR1 IgG或T細胞雙特異性抗體40秒，剩餘參考流動池無捕捉。人類葉酸受體1 Fc融合體之稀釋系列(12.35至3000nM)以30μl/min通過所有流動池，持續240秒來記錄結合階段。解離階段監測300秒且藉由自樣品溶液切換至HBS-EP進行觸發。在每一個循環之後，使用60秒10mM甘胺酸鹽酸鹽pH 1.5之雙重注射使晶片表面再生。藉由減去參考流動池1上所得之反應來校正整體折射率差異。使用Bia評估軟體(GE Healthcare)，自藉由與1：1朗格繆爾結合擬合所得之速率常數推導出相互作用之親和力常數。
Figure 104138283-A0202-12-0175-49
藉由表面電漿子共振分析16D5 FolR1結合子之十二個「親和力降低」之變異體，相較於16D5野生型結合子及36F2結合子而言。目標為尋找具有類似於36F2之親和力及結合力的16D5變異體。當量測單價結合(親和力)時，存在親和力高於36F2之變異體及親和力低於36F2之變異體。然而，在二價結合(結合力)中，所有變異體之表觀KD值均高於36F2。此主要歸因於36F2之快速結合速率(ka)，其導致36F2之表觀KD小。當36F2以二價結合時，大結合力效應似乎為此結合子所特有的。如上文所指出，36F2為唯一可以鑑別的人類、鼠類及食蟹獼猴交叉反應結合子。
實例45 16D5 HC/LC變異體與Hela細胞上所表現之人類FolR1的結合
評定36F2 TCB、16D5 TCB及16D5之各種HC/LC變異體與Hela細胞上之人類FolR1的結合。簡言之，收集細胞，計數，檢查活力且以2×106 個細胞/毫升再懸浮於FACS緩衝液(100μl PBS 0.1% BSA)中。在4℃下，在圓底96孔盤中，使100μl細胞懸浮液(含有0.2×106 個細胞)與 不同濃度雙特異性抗體(229pM-500nM)一起培育30分鐘。在用冷PBS 0.1% BSA進行之兩個洗滌步驟之後，使樣品與PE結合親和純化F(ab')2片段山羊抗人類IgG Fcg片段特異性二級抗體(Jackson Immuno Research Lab PE #109-116-170)一起在4℃下另外再培育30分鐘。在用冷PBS 0.1% BSA洗滌樣品兩次之後，用1% PFA將其固定隔夜。在使樣品離心之後，將其再懸浮於PBS 0.1% BSA中且藉由FACS，使用FACS CantoII(軟體FACS Diva)分析。使用GraphPadPrism6獲得結合曲線(圖32A至E)。經36F2 TCB結合之FolR2在小鼠中並非很能耐受，且未展現出所要功效。
實例46 製造且純化16D5 T細胞雙特異性抗體之含突變的四個變異體來降低與人類及食蟹獼猴FolR1之親和力：16D5 TCB G49S/S93A、G49S/K53A、W96Y、W96Y/D52E 短暫性轉染及製造
如下所述，針對所需載體使用PEI介導之轉染程序，在HEK293 EBNA細胞中短暫製造16D5 TCB之與FolR1之親和力降低的四個額外變異體。關於轉染，使HEK293 EBNA細胞在不含血清之懸浮液中在含有6mM L-麩醯胺酸及250mg/l G418培養基的Excell培養基中培養。關於在600ml旋轉管燒瓶(tubespin flask)(最大工作體積400mL)中製造，在轉染之前24小時接種6億個HEK293 EBNA細胞。關於轉染，藉由210×g使細胞離心5分鐘，用預溫熱之20ml CD CHO培養基置換上清液。表現載體於20ml CD CHO培養基中混合至400μg DNA之最終量。在添加1080μl PEI溶液(2.7μg/ml)之後，使其渦旋15秒且隨後在室溫下培育10分鐘。隨後，將細胞與DNA/PEI溶液混合，轉移至600ml旋轉管燒瓶中且在具有5% CO2氛圍的培育箱中在37℃下培育3小時。在培育時間之後，添加360ml Excell+6mM L-麩醯胺酸+ 5g/L Pepsoy+1.0mM VPA培養基且將細胞培養24小時。轉染後一天，添加7%饋料7。在培養7天之後，收集上清液，藉由在3600×g(Sigma 8K離心機)下離心20-30分鐘進行純化，將溶液無菌過濾(0.22mm過濾器)且以0.01% w/v之最終濃度添加疊氮化鈉，且保持在4℃下。
純化
使用標準程序，諸如蛋白A親和力純化(Äkta Explorer)及尺寸排阻層析，分兩步純化親和力降低之變異體16D5 TCB。將自短暫製造獲得之上清液調整至pH 8.0(使用2M TRIS 8.0)且施加經8管柱體積(cv)緩衝液A (20mM磷酸鈉pH 7.5、20mM檸檬酸鈉)平衡之HiTrap蛋白A(GE Healthcare，管柱體積(cv)=5ml)。在用10cv緩衝液A 洗滌之後，使用相對於緩衝液B (20mM檸檬酸鈉pH 3.0、100mM NaCl、100mM甘胺酸)之pH梯度，經20cv溶離蛋白質。合併含有相關蛋白質之溶離份且將溶液之pH溫和地調整至pH 6.0(使用0.5M Na2 HPO4 pH 8.0)。使用超濃縮器(Amicon Ultra-15,30.000 MWCO,Millipore)將樣品濃縮至1ml且隨後施加經20mM組胺酸pH 6.0、140mM NaCl、0.01% Tween 20平衡之HiLoadTM 16/60 SuperdexTM 200製備級(GE Healthcare)。藉由分析型尺寸排阻層析分析溶離份之聚集體含量。因此，在25℃下，向30μl各溶離份施加在25mM K2 HPO4 、125mM NaCl、200mM L-精胺酸單鹽酸鹽、0.02%(w/v)NaN3 ，pH 6.7操作緩衝液中平衡之TSKgel G3000 SW XL分析型尺寸排阻管柱(Tosoh)。合併含有小於2%寡聚物之溶離份。蛋白質濃度係藉由量測280nm下之光學密度(OD)，使用基於胺基酸序列所計算之莫耳消光係數來測定。藉由SDS毛細管電泳(CE-SDS)，在存在及不存在還原劑之情況下，遵循製造商說明書(儀器測徑規LabChipGX,Perkin Elmer)分析構築體之純度及分子量。將經純化蛋白質冷凍在液氮中且儲存在-80℃下。
Figure 104138283-A0202-12-0178-50
親和力降低之所有變異體均可以良好品質製得。
實例47 36F2 TCB、16D5 TCB及兩種親和力降低之16D5變異體16D5 W96Y/D52E TCB及16D5 G49S/S93A TCB與Hela細胞上所表現之人類FolR1的結合
評定36F2 TCB、16D5 TCB及兩種親和力降低之16D5變異體16D5 W96Y/D52E TCB及16D5 G49S/S93A TCB與Hela細胞上之人類FolR1的結合。簡言之，收集細胞，計數，檢查活力且以2×106 個細胞/毫升再懸浮於FACS緩衝液(100μl PBS 0.1% BSA)中。在4℃下，在圓底96孔盤中，使100μl細胞懸浮液(含有0.2×106 個細胞)與不同濃度雙特異性抗體(30pM-500nM)一起培育30分鐘。在用冷PBS 0.1% BSA進行之兩個洗滌步驟之後，使樣品與FITC結合親和純化F(ab')2片段山羊抗人類IgG Fcg片段特異性二級抗體(Jackson Immuno Research Lab PE #109-096-098)一起在4℃下另外再培育30分鐘。在用冷PBS 0.1% BSA洗滌樣品兩次之後，使樣品離心，將其再懸浮於PBS 0.1% BSA中且藉由FACS，使用FACS CantoII(軟體FACS Diva)分析。使用GraphPadPrism6獲得結合曲線(圖33)。
實例48 製造且純化與人類及食蟹獼猴FolR1具有中等親和力之三個T細胞雙特異性抗體：14B1、6E10、2C7 短暫性轉染及製造
如下文所述，針對所需載體使用PEI介導之轉染程序，在HEK293 EBNA細胞中短暫製造中等親和力TCB。關於轉染，使HEK293 EBNA細胞在不含血清之懸浮液中在含有6mM L-麩醯胺酸及250mg/l G418培養基的Excell培養基中培養。關於在600ml旋轉管燒瓶(最大工作體積400mL)中製造，在轉染之前24小時接種6億個HEK293 EBNA細胞。關於轉染，藉由210×g使細胞離心5分鐘，用預溫熱之20ml CD CHO培養基置換上清液。表現載體於20ml CD CHO培養基中混合至400μg DNA之最終量。在添加1080μl PEI溶液(2.7μg/ml)之後，使其渦旋15秒且隨後在室溫下培育10分鐘。隨後，將細胞與DNA/PEI溶液混合，轉移至600ml旋轉管燒瓶中且在具有5% CO2氛圍的培育箱中在37℃下培育3小時。在培育時間之後，添加360ml Excell+6mM L-麩醯胺酸+5g/L Pepsoy+1.0mM VPA培養基且將細胞培養24小時。轉染後一天，添加7%饋料7。在培養7天之後，收集上清液，藉由在3600×g(Sigma 8K離心機)下離心20-30分鐘進行純化，將溶液無菌過濾(0.22μm過濾器)且以0.01% w/v之最終濃度添加疊氮化鈉，且保持在4℃下。
純化
使用標準程序，諸如蛋白A親和力純化(Äkta Explorer)及尺寸排阻層析，分兩步純化中等親和力TCB。將自短暫製造獲得之上清液調整至pH 8.0(使用2M TRIS 8.0)且施加經8管柱體積(cv)緩衝液A (20mM磷酸鈉pH 7.5、20mM檸檬酸鈉)平衡之HiTrap蛋白A(GE Healthcare，管柱體積(cv)=5ml)。在用10cv緩衝液A 洗滌之後，使用相對於緩衝液B (20mM檸檬酸鈉pH 3.0、100mM NaCl、100mM甘胺酸)之pH梯度，經20cv溶離蛋白質。合併含有相關蛋白質之溶離份且將溶液之pH溫和地調整至pH 6.0(使用0.5M Na2 HPO4 pH 8.0)。使 用超濃縮器(Amicon Ultra-15,30.000 MWCO,Millipore)將樣品濃縮至1ml且隨後施加經20mM組胺酸pH 6.0、140mM NaCl、0.01% Tween 20平衡之HiLoadTM 16/60 SuperdexTM 200製備級(GE Healthcare)。藉由分析型尺寸排阻層析分析溶離份之聚集體含量。因此，在25℃下，向30μl各溶離份施加在25mM K2 HPO4 、125mM NaCl、200mM L-精胺酸單鹽酸鹽、0.02%(w/v)NaN3 ，pH 6.7操作緩衝液中平衡之TSKgel G3000 SW XL分析型尺寸排阻管柱(Tosoh)。合併含有小於2%寡聚物之溶離份。蛋白質濃度係藉由量測280nm下之光學密度(OD)，使用基於胺基酸序列所計算之莫耳消光係數來測定。藉由SDS毛細管電泳(CE-SDS)，在存在及不存在還原劑之情況下，遵循製造商說明書(儀器測徑規LabChipGX,Perkin Elmer)分析構築體之純度及分子量。將經純化蛋白質冷凍在液氮中且儲存在-80℃下。
Figure 104138283-A0202-12-0180-51
所有中等親和力T細胞雙特異性抗體均可以製造。產量不高。品質對於9C7而言為良好的且對於14B1及6E10而言為可接受的。
實例49 16D5 HC/LC變異體與HT-29細胞上所表現之人類FolR1的結合
評定36F2 TCB、16D5 TCB及16D5之各種HC/LC變異體(圖34A至E)與HT-29細胞上之人類FolR1的結合。簡言之，收集細胞，計數，檢查活力且以2×106 個細胞/毫升再懸浮於FACS緩衝液(100μl PBS 0.1% BSA)中。在4℃下，在圓底96孔盤中，使100μl細胞懸浮液(含有0.2×106 個細胞)與不同濃度雙特異性抗體(229pM-500nM)一起培育30分鐘。在用冷PBS 0.1% BSA進行之兩個洗滌步驟之後，使樣品與PE 結合親和純化F(ab')2片段山羊抗人類IgG Fcg片段特異性二級抗體(Jackson Immuno Research Lab PE #109-116-170)一起在4℃下另外再培育30分鐘。在用冷PBS 0.1% BSA洗滌樣品兩次之後，用1% PFA將其固定隔夜。在使樣品離心之後，將其再懸浮於PBS 0.1% BSA中且藉由FACS，使用FACS CantoII(軟體FACS Diva)分析。使用GraphPadPrism6獲得結合曲線(圖34A至E)。
實例50 中等FolR1結合子與人類及小鼠FolR1及FolR2之結合
在FACS結合分析中在經轉染之HEK293T細胞上評定中等FolR1結合子(6E10 TCB、14B1 TCB及9C7 TCB)以及16D5 TCB及36F2 TCB與人類及小鼠FolR1及FolR2的交叉反應性。
簡言之，收集細胞，計數，檢查活力且以2×106 個細胞/毫升再懸浮於FACS緩衝液(100μl PBS 0.1% BSA)中。在4℃下，在圓底96孔盤中，使100μl細胞懸浮液(含有0.2×106 個細胞)與100nM雙特異性抗體一起培育30分鐘。在用冷PBS 0.1% BSA進行之兩個洗滌步驟之後，使樣品與螢光素(FITC)親和純化F(ab')2 片段山羊抗人類IgG Fcγ片段特異性二級抗體(Jackson Immuno Research Lab PE #109-096-098)一起在4℃下另外再培育30分鐘。在用冷PBS 0.1% BSA洗滌樣品兩次之後，用1% PFA將其固定隔夜。在使樣品離心之後，將其再懸浮於PBS 0.1% BSA中且藉由FACS，使用FACS CantoII(軟體FACS Diva)分析。使用GraphPadPrism6獲得圖(圖35A至D)。
結果顯示，36F2 TCB及14B1 TCB可與小鼠FolR1以及人類及小鼠FolR2交叉反應。關於6E10 TCB，可觀察到與人類FolR2之弱結合。16D5 TCB及9C7 TCB對人類FolR1具有特異性且未顯示出與小鼠FolR1或人類及小鼠FolR2之交叉反應性。
實例51 藉由表面電漿子共振生物化學表徵呈T細胞雙特異性抗體格式之親和力降低之16D5變異體及其他中等親和力結合子
藉由表面電漿子共振(SPR)評定呈二價T細胞雙特異性抗體格式之抗FolR1 16D5親和力降低變異體及其他中等親和力結合子與重組人類、食蟹獼猴及鼠類葉酸受體1(均呈Fc融合體形式)的結合。所有SPR實驗均在Biacore T200上在25℃下以HBS-EP作為操作緩衝液(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005%界面活性劑P20,Biacore,GE Healthcare)來進行。用於親和力及結合力測定之分子描述於表45中。
Figure 104138283-A0202-12-0182-52
單一注射
首先，藉由單一注射(表46)分析抗FolR1 TCB來表徵其交叉反應性(針對人類、鼠類及食蟹獼猴FolR1)及特異性(針對人類FolR1、人類FolR2、人類FolR3)。使用標準偶聯指令(Biacore,Freiburg/Germany)，將人類、食蟹獼猴及鼠類葉酸受體1(FolR1-Fc)或人類葉酸受體2及3(FolR2-Fc、FolR3-Fc)之重組生物素化單體Fc融合體直接偶聯於SA晶片上。固定量為約300-400RU。以500nM之濃度注射TCB 60秒。
表46：7種葉酸受體1 T細胞雙特異性抗體之交叉反應性及特異性.+意
Figure 104138283-A0202-12-0183-53
與葉酸受體1之結合力
抗FolR1 T細胞雙特異性抗體與重組葉酸受體之間的相互作用之結合力如下所述進行測定(表47)。
使用標準偶聯指令(Biacore,GE Healthcare)，將人類、食蟹獼猴及鼠類葉酸受體1之重組生物素化單體Fc融合體(FolR1-Fc)直接偶聯於SA晶片上。固定量為約200-300RU。使抗FolR1 T細胞雙特異性抗體以11.1至900nM(對於16D5親和力降低變異體)或0.2至500nM(對於其他中等親和力結合子及36F2)範圍內之濃度，以30微升/分鐘之流率通過流動池，持續180秒。監測解離240或600秒。在每一個循環之後，使用30秒10mM甘胺酸鹽酸鹽pH 1.5之雙重注射使晶片表面再生。藉由減去經重組生物素化鼠類IL2R Fc融合體(不相關的Fc融合受體)固定之參考流動池上所得之反應來校正整體折射率差異。由T細胞雙特異性抗體之二價結合產生的結合曲線接近1：1朗格繆爾結合(即使其為1：2結合)且與彼模型擬合得到表觀KD，其代表二價結合之結合力。使用Bia評估軟體(GE Healthcare)，自擬合之速率常數推導出相互作用之表觀結合力常數。
Figure 104138283-A0202-12-0183-54
Figure 104138283-A0202-12-0184-55
3. 與葉酸受體1之親和力
抗FolR1 T細胞雙特異性抗體與重組葉酸受體之間的相互作用之親和力如下所述進行測定(表48)。
關於親和力量測，在CM5晶片上在pH 5.0下使用標準胺偶聯套組(GE Healthcare)進行約12000個共振單位(RU)之抗人類Fab特異性抗體(Fab捕捉套組，GE Healthcare)的直接偶聯。以10μl/min之流動速率，以20nM捕捉抗FolR1 T細胞雙特異性抗體40秒，剩餘參考流動池無捕捉。人類、食蟹獼猴或鼠類葉酸受體1 Fc融合體之稀釋系列(12.3至3000nM)以30μl/min通過所有流動池，持續240秒來記錄結合階段。解離階段監測300秒且藉由自樣品溶液切換至HBS-EP進行觸發。在每一個循環之後，使用60秒10mM甘胺酸鹽酸鹽pH 2.1之雙重注射使晶片表面再生。藉由減去參考流動池1上所得之反應來校正整體折射率差異。使用Bia評估軟體(GE Healthcare)，自藉由與1：1朗格繆爾結合擬合所得之速率常數推導出相互作用之親和力常數。關於低親和力動力學，由於結合及解離階段過快以致於無法藉由1：1朗格繆爾結合模型擬合，故使用Bia評估軟體(GE Healthcare)來應用穩態分析模型。穩態分析給出平衡時結合反應之KD。
Figure 104138283-A0202-12-0185-56
如藉由表面電漿子共振所測定，引入16D5結合子中之突變降低其與人類及食蟹獼猴FolR1之親和力。親和力遞減評級為16D5 WT(57nM)>W96Y(小6.5倍)>G49S/S93A(小14.5倍)>W96Y/D52E(小24.5倍)>G49S/K53A(小30倍)。在結合力值方面可見到相同評級，然而倍數差異較小，16D5 WT(3nM)>W96Y、G49S/S93A、W96Y/D52E(小3倍)>G49S/K53A(小13倍)。
中等親和力結合子之親和力評級如下：16D5(57nM)>14B1(小 8.5倍)>9C7(小15倍)>6E10(小21倍)>36F2(小24.5倍)。然而，在結合力量測結果中，此等差異消失：14B1、9C7、6E10(1nM)>16D5(3nM)>36F2(7nM)。
16D5 W96Y/D52E TCB解決了在先前候選者之情況下所觀察到的問題。16D5 W96Y/D52E TCB係基於共同輕鏈16D5結合子且在重鏈上相對於親本16D5結合子具有兩個點突變。W96Y突變使該結合子與FolR1之親和力相比於親本結合子有所降低，且D52E突變移除脫醯胺位點且亦有助於降低親和力。16D5 W96Y/D52E TCB結合至人類及食蟹獼猴FolR1，但不結合至鼠類FolR1。其對FolR1具有特異性且不結合至重組人類FolR2或人類FolR3。16D5 W96Y/D52E對人類FolR1之親和力(單價結合)為約1.4μM(比親本16D5結合子小24.5倍)且結合力(二價結合)為約10nM(比親本16D5結合子小3倍)。
實例52 中等FolR1 TCB誘導T細胞殺死Hela、Skov-3及HT-29細胞
在Hela(高FolR1)、Skov-3(中等FolR1)及HT-29(低FolR1)細胞上評定藉由中等FolR1結合子(6E10 TCB、14B1 TCB及9C7 TCB)介導之T細胞殺死。包括16D5 TCB及36F2 TCB作為基準。人類PBMC用作效應子且在與雙特異性抗體一起培育24h及48h時偵測殺死。簡言之，用胰蛋白酶/EDTA收集目標細胞，洗滌且使用平底96孔盤以25 000個細胞/孔之密度塗鋪。使細胞黏附隔夜。藉由自健康人類供體獲得之富含淋巴細胞之製劑(白血球層)的Histopaque密度離心製備周邊血液單核細胞(PBMC)。新鮮血液用無菌PBS稀釋且依Histopaque梯度(Sigma,#H8889)分層。離心(450×g，30分鐘，室溫)之後，丟棄含PBMC之相界面上方的血漿且將PBMC轉移至新的法爾康管中，隨後填充50ml PBS。對混合物進行離心(400×g，10分鐘，室溫)，丟棄上清液且PBMC集結粒用無菌PBS洗滌兩次(離心步驟350×g，10分鐘)。 對所得PBMC群體進行自動計數(ViCell)且於含有10% FCS及1% L-丙胺醯基-L-麩醯胺酸(Biochrom,K0302)之RPMI1640培養基中，在細胞培育箱中在37℃、5% CO2下儲存直至進一步使用(不久於24小時)。關於殺死分析，以指定濃度(範圍為0.01pM-10nM，一式三份)添加抗體。以10：1之最終E：T比添加PBMC至目標細胞中。在37℃、5% CO2 下培育24小時及48小時之後，藉由對藉由細胞凋亡/壞死細胞釋放至細胞上清液中之LDH進行定量來評定目標細胞殺死(LDH偵測套組，Roche Applied Science,#11 644 793 001)。藉由將目標細胞與1% Triton X-100一起培育來達成目標細胞之最大溶解(=100%)。最小溶解(=0%)係指在不存在雙特異性構築體的情況下，目標細胞與效應細胞共培育。
結果顯示，藉由中等FolR1結合子(6E10 TCB、14B1 TCB及9C7 TCB)誘導之腫瘤溶解範圍介於用高親和力16D5 TCB獲得之腫瘤溶解與用低親和力36F2 TCB獲得之腫瘤溶解之間(圖36A至F)。在中等FolR1結合子中，14B1 TCB顯示最強殺死，如在培育48小時後可見(圖36D至F)。與培育24小時及48小時後之殺死分析相關之EC50值使用GraphPadPrism6計算，提供於表49及表50中。
Figure 104138283-A0202-12-0187-57
表50：在培育48小時之後，中等FolR1 TCB誘導T細胞介導殺死Hela、Skov-3及HT-29細胞之EC50值(pM).
Figure 104138283-A0202-12-0188-58
實例53 親和力降低之16D5變異體誘導T細胞殺死Hela、Skov-3及HT-29細胞
在Hela(高FolR1)、SKov-3(中等FolR1)及HT-29(低FolR1)細胞上評定親和力降低之16D5變異體(16D5-G49S/S93A TCB、16D5-G49S/K53A TCB、16D5 W96Y TCB、16D5 W96Y/D52E TCB)介導之T細胞殺死。包括16D5 TCB及36F2 TCB作為基準。如上文(實例52)所述進行分析。
結果顯示，藉由親和力降低之16D5變異體(16D5-G49S/S93A TCB、16D5-G49S/K53A TCB、16D5 W96Y TCB、16D5 W96Y/D52E TCB)誘導之腫瘤溶解範圍介於用高親和力16D5 TCB獲得之腫瘤溶解與用低親和力36F2 TCB獲得之腫瘤溶解之間。與培育24小時及48小時後之殺死分析相關之EC50值使用GraphPadPrism6計算，提供於表51及表52(圖37A至F)中。
Figure 104138283-A0202-12-0188-59
表52：在培育48小時之後，16D5 TCB及其親和力降低變異體誘導T細
Figure 104138283-A0202-12-0189-60
因此，如同上文所述之36F2 FOLR1 TCB一樣，16D5 W96Y/D52E TCB在高表現細胞與低表現細胞之間有區別，這一點對於降低毒性尤其重要，因為一些正常的非腫瘤性組織之細胞表現極低水準之FolR1(約小於1000個複本/細胞)。與此觀察結果一致，下文實例54中所論述之結果顯示，相比於親本16D5 TCB而言，16D5 W96Y/D52E TCB所誘導之T細胞介導殺死初級細胞之水準低得多(圖38A至F)。因而，16D5 W96Y/D52E TCB介導強力殺死具有高或中等FOLR1表現之腫瘤組織，但不介導殺死具有低表現之正常組織。呈二價2+1格式之16D5 W96Y/D52E TCB包含具有相對較低之親和力的FolR1結合部分，但其具有允許區分高FolR1表現細胞與低FolR1表現細胞的結合力效應。因為腫瘤細胞以高水準或中等水準表現FolR1，故此TCB選擇性結合至腫瘤細胞且不結合至以低水準表現FolR1或完全不表現FolR1之正常的非癌細胞。作為優於上文所述之36F2 FOLR1 TCB的額外優勢，16D5 W96Y/D52E TCB特異性結合至FolR1且不結合至FolR2或FolR3，進一步增強其用於活體內治療之安全性。
除以上有利特徵以外，呈二價2+1反向格式之16D5 W96Y/D52E TCB亦具有以下優勢：其不需要化學交聯或其他雜合方法。這使其適合製造用於治療患者、例如患有FolR1陽性癌性腫瘤的患者的藥物。呈二價2+1反向格式之16D5 W96Y/D52E TCB可使用標準CHO方法製 造，且聚集體少。此外，呈二價2+1形式之16D5 W96Y/D52E TCB包含人類及人類化序列，使其優於採用大鼠及鼠類多肽的分子，大鼠及鼠類多肽在投與給人類時具有高度免疫原性。此外，呈二價2+1格式之16D5 W96Y/D52E TCB經工程改造以消除FcgR結合，且因而，不會引起FcgR交聯及輸注反應，進一步增強其在投與給患者時之安全性。
如以上所述之結果所證明，其頭對尾幾何結構使得呈二價2+1反向格式之16D5 W96Y/D52E TCB成為誘導絕對目標細胞殺死之高效分子。其二價性增強結合力及效能，且亦使得對高表現細胞與低表現細胞有所區分。其偏好高或中等目標表現細胞，這歸因於其結合力效應降低由T細胞介導殺死以低水準表現FolR1之正常細胞所產生的毒性。
呈二價2+1格式之16D5 W96Y/D52E TCB及本文中所揭示之其他實施例的進一步優勢在於，其臨床發展不需要使用替代分子，因為其結合至人類及食蟹獼猴FolR1。因而，本文中所揭示之分子識別不同於先前所述不識別來自兩個物種之FolR1的FolR1抗體的抗原決定基(亦參見圖41)。
實例54 親和力降低之16D5變異體及中等FolR1 TCB誘導T細胞殺死初級細胞
在初級細胞(人類腎皮質上皮細胞(HRCEpiC)(ScienCell Research Laboratories；目錄號4110)及人類視網膜色素上皮細胞(HRPEpiC)(ScienCell Research Laboratories；目錄號6540))上評定藉由親和力降低16D5變異體(16D5-G49S/S93A TCB、16D5 W96Y/D52E TCB)及中等FolR1結合子14B1 TCB介導之T細胞殺死。包括HT-29細胞(低FolR1)作為對照細胞株。包括16D5 TCB及36F2 TCB作為基準且DP47 TCB充當非結合對照。
如實例52中所述進行分析，其中抗體之濃度範圍為0.1pM至100 nM(一式三份)。
當使用人類初級細胞作為目標時，總溶解低得多，這歸因於FolR1在此等細胞上之表現率較低(圖38A至F)。關於高親和力FolR1結合子16D5 TCB，可在所使用之兩種初級細胞類型上觀察到T細胞介導之溶解。如先前使用腫瘤細胞株作為目標時所觀察到，藉由中等FolR1結合子14B1 TCB及親和力降低16D5變異體(16D5-G49S/S93A TCB、16D5 W96Y/D52E TCB)誘導之溶解範圍介於用高親和力16D5 TCB獲得之溶解與用低親和力36F2 TCB獲得之溶解之間。以低水準表現FolR1之細胞的溶解顯著降低符合低脫靶活性且因此，預期親和力降低之16D5變異體16D5-G49S/S93A TCB及16D5 W96Y/D52E TCB在活體內較佳耐受。
實例55 FOLR1 TCB構築體在雌性NOG小鼠中之單劑量PK
使實驗開始時平均年齡為8-10週之雌性NOD/Shi-scid/IL-2Rγ缺陷(NOG)小鼠(購自Taconic,SOPF設施)根據已提交之準則(GV-Solas；Felasa；TierschG)以12小時光/12小時黑暗之每日循環維持在無特定病原體之條件下。實驗研究方案由當地政府審查且批准(ZH193/2014)。動物在到達之後維持一週以使其適應新環境且進行觀察。在常規基礎上進行連續健康監測。
進行單劑量藥物動力學研究(SDPK)來評估FOLR1 TCB構築體(36F2、16D5、16D5 G49S/S93A及16D5 W96Y/D52E)之曝露。向NOG小鼠投與0.5mg/kg之靜脈內團式投藥且在所選時間點獲得血液樣品用於藥物動力學評估。ELISA分析小鼠血清樣品。向塗有抗生蛋白鏈菌素之96孔微量滴定盤中逐步添加生物素化a-huCD3-CDR(mAb<ID-mAb<CD3>>M-4.25.93-IgG-Bi)、測試樣品、經洋地黃毒苷(Digoxygenin)標記之a-huFc抗體(mAb<H-FC pan>M-R10Z8E9-IgG- Dig)及抗洋地黃毒苷偵測抗體(POD)且在每一個步驟之後在室溫下培育1小時。在各步驟之後洗滌培養盤三次以移除未結合物質。最後，藉由添加ABTS受質溶液形成著色反應產物而使經過氧化酶結合之複合物可視化。在405nm(其中參考波長在490nm下)下進行光度測定之反應產物強度與血清樣品中之分析物濃度成比例。構築體之標準曲線之校準範圍為0.078至5ng/ml，其中1.5ng/ml為定量下限(LLOQ)。
SDPK研究揭示16D5、16D5 W96Y/D52E及16D5 G49S/S93A構築體之IgG樣PK概況(圖39A至B)。正因如此，選擇每週一次之排程進行功效研究(圖40B)。36F2之半衰期低於其他純系。在所測試之四個分子中，僅36F2可與小鼠FOLR1交叉反應，其可解釋此分子之較低半衰期且指示TMDD(目標介導之藥物處置)。
實例56 在人類PBMC轉移至攜帶Hela之NOG小鼠中之後，FOLR1 TCB構築體(16D5、16D5 G49S/S93A及16D5 W96Y/D52E)之活體內功效
在表現FOLR1之人類宮頸癌細胞株Hela中測試FOLR1 TCB構築體，將其皮下注射至PBMC移植之NOG小鼠中。
Hela細胞最初獲自ATCC(CCL2)且膨脹後，沈積於Roche-Glycart內部細胞庫中。在37℃下於水飽和氛圍中，在5% CO2下於含有10% FCS(Gibco)之RPMI中常規培養腫瘤細胞株。使用第13代進行移植，活力>95%。將總共100μl RPMI細胞培養基(Gibco)中1×106 個細胞/動物皮下注射至動物之右側腹中。
使60隻實驗開始時年齡為8-10週之雌性NOG小鼠(在Taconic,Denmark育種)根據已提交之準則(GV-Solas；Felasa；TierschG)以12小時光/12小時黑暗之每日循環維持在無特定病原體之條件下。實驗研究方案由當地政府審查且批准(ZH193/2014)。動物在到達之後維持一週以使其適應新環境且進行觀察。在常規基礎上進行連續健康監測。
根據研究方案(圖40B)，在研究第0天，向小鼠皮下注射1×106 個Hela細胞。在研究第30天，當腫瘤達到約150mm3之大小時，經由菲科爾法分離健康供體之人類PBMC且將10×106 個細胞靜脈內注射至攜帶腫瘤之小鼠中。兩天後(第32天)，將小鼠隨機分組且同等分配於六個處理組(n=10)中，隨後靜脈內注射16D5(0.5mg/kg)、16D5 G49S/S93A(2.5或0.5mg/kg)及16D5 W96Y/D52E(2.5或0.5mg/kg)。所有治療組每週注射一次，總共持續三週。給小鼠靜脈內注射200μl恰當溶液。給媒劑組中之小鼠注射PBS。為獲得恰當量之TCB/200μl，必要時用PBS稀釋儲備溶液。使用測徑規(圖40C至E)量測腫瘤生長，每週一次，且腫瘤體積計算如下：Tv：(W2/2)×L(W：寬度，L：長度)
每週一次注射FOLR1 TCB構築體引起顯著的腫瘤消退(圖40C至E)。16D5(0.5mg/kg)及16D5 W96Y/D52E16D5(0.5mg/kg)之功效為類似的，然而16D5 G49S/S93A(0.5mg/kg)顯示略微較低之效能。相比於0.5mg/kg劑量，較高劑量2.5mg/kg之16D5 W96Y/D52E16D5及16D5 G49S/S93A未顯示功效增加。關於PD讀出，在研究第52天殺死小鼠，移出腫瘤，稱重且經由用膠原酶V、分散酶II及DNA酶進行酶消化製備單細胞懸浮液用於後續FACS分析。所有處理組之外植入腫瘤顯示在研究終止時之腫瘤重量顯著低於媒劑對照腫瘤(圖40F)。來自腫瘤之單細胞懸浮液針對huCD45及huCD3及DAPI進行染色以排除死細胞，且在BD Fortessa下分析。FACS分析以統計方式揭示，相比於媒劑對照腫瘤，在用16D5以及16D5 W96Y/D52E16D5處理後之腫瘤組織中之浸潤性CD3陽性人類T細胞之數目較高(圖40C)。
實例57 食蟹獼猴中之毒性研究
進行藥物動力學(PK)、藥效學(PD)及耐受性研究來研究單一靜脈 內劑量之親和力降低16D5變異體TCB(例如，16D5-G49S/S93A TCB、16D5 W96Y/D52E TCB)在食蟹獼猴中之耐受性、PK及PD效應。在此研究中，遵循劑量遞增方案，未經處理之食蟹獼猴(每組1隻雄猴及1隻雌猴)接受單一靜脈內劑量之親和力降低16D5變異體TCB，包括16D5 W96Y/D52E TCB。例示性劑量包括0.003、0.03及0.09mg/kg。評定標準毒性參數(臨床徵象、體重、血液學及臨床化學)及血液中之T細胞數目及活化狀態的動力學及細胞激素釋放動力學。亦獲取血液樣品用於量測親和力降低之16D5變異體TCB(包括16D5 W96Y/D52E TCB)及抗藥物抗體之PK，為期28天。
例示性實施例之胺基酸序列
1)適用於共同輕鏈格式、可變重鏈之FolR結合子
Figure 104138283-A0202-12-0194-61
Figure 104138283-A0202-12-0195-62
2)CD3結合子共同輕鏈(CLC)
Figure 104138283-A0202-12-0195-63
Figure 104138283-A0202-12-0196-64
3)CD3結合子，重鏈
Figure 104138283-A0202-12-0196-65
4)適用於互換Fab格式之FolR結合子
Figure 104138283-A0202-12-0196-66
Figure 104138283-A0202-12-0197-67
Figure 104138283-A0202-12-0198-68
5)適用於互換Fab格式之CD3結合子
Figure 104138283-A0202-12-0198-69
Figure 104138283-A0202-12-0199-70
6)-CD3-FolR雙特異性抗體2+1反向互換單抗格式之例示性胺基酸序列
Figure 104138283-A0202-12-0199-71
Figure 104138283-A0202-12-0200-72
7)具有共同輕鏈之CD3-FolR雙特異性抗體之例示性胺基酸序列
Figure 104138283-A0202-12-0200-73
Figure 104138283-A0202-12-0201-74
Figure 104138283-A0202-12-0202-75
Figure 104138283-A0202-12-0203-76
8)具有降低親和力之例示性16D5變異體
a. 具有降低親和力之例示性輕鏈變異體
Figure 104138283-A0202-12-0203-77
b. 具有降低親和力之例示性重鏈變異體
Figure 104138283-A0202-12-0203-78
Figure 104138283-A0202-12-0204-79
9)自噬菌體呈現文庫產生之額外例示性實施例(CDR加底線)
Figure 104138283-A0202-12-0204-80
Figure 104138283-A0202-12-0205-81
Figure 104138283-A0202-12-0206-82
10)9D11糖基化位點變異體：例示性實施例之可變輕鏈(CDR加底線)
Figure 104138283-A0202-12-0206-83
Figure 104138283-A0202-12-0207-84
11)脫胺變異體
Figure 104138283-A0202-12-0207-85
Figure 104138283-A0202-12-0208-86
Figure 104138283-A0202-12-0209-87
12)基於例示性實施例之TCB之Mov19(CDR加底線)
Figure 104138283-A0202-12-0209-88
13)中等親和力結合子之額外FolR1 TCB(CDR根據Kabat，加底線)：
Figure 104138283-A0202-12-0209-89
Figure 104138283-A0202-12-0210-90
Figure 104138283-A0202-12-0211-91
14)抗原序列
Figure 104138283-A0202-12-0211-92
Figure 104138283-A0202-12-0212-93
15)例示性實施例之核苷酸序列
Figure 104138283-A0202-12-0213-94
Figure 104138283-A0202-12-0214-95
Figure 104138283-A0202-12-0215-96
Figure 104138283-A0202-12-0216-97
Figure 104138283-A0202-12-0217-98
Figure 104138283-A0202-12-0218-99
Figure 104138283-A0202-12-0219-100
Figure 104138283-A0202-12-0220-101
Figure 104138283-A0202-12-0221-102
Figure 104138283-A0202-12-0222-103
Figure 104138283-A0202-12-0223-104
Figure 104138283-A0202-12-0224-105
Figure 104138283-A0202-12-0225-106
Figure 104138283-A0202-12-0226-107
Figure 104138283-A0202-12-0227-108
Figure 104138283-A0202-12-0228-109
Figure 104138283-A0202-12-0229-110
Figure 104138283-A0202-12-0230-111
Figure 104138283-A0202-12-0231-112
Figure 104138283-A0202-12-0232-113
Figure 104138283-A0202-12-0233-114
Figure 104138283-A0202-12-0234-115
Figure 104138283-A0202-12-0235-116
Figure 104138283-A0202-12-0236-117
Figure 104138283-A0202-12-0237-118
Figure 104138283-A0202-12-0238-119
Figure 104138283-A0202-12-0239-120
Figure 104138283-A0202-12-0240-121
***
雖然出於清楚理解之目的，上述發明已藉助於說明及實例較詳細地加以描述，但該等描述及實例不應解釋為限制本發明之範疇。本文中所引用之所有專利及科學文獻之揭示內容以全文引用的方式明確併入本文中。
<110> 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司(F.HOFFMANN-LA ROCHE AG)
<120> 活化T細胞之雙特異性抗原結合分子
<140> TW 104138283
<141> 2015-11-19
<150> EP14194147.6
<151> 2014-11-20
<160> 316
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 1
Figure 104138283-A0305-02-0243-1
<210> 2
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 2
Figure 104138283-A0305-02-0244-2
<210> 3
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 3
Figure 104138283-A0305-02-0244-3
Figure 104138283-A0305-02-0245-4
<210> 4
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 4
Figure 104138283-A0305-02-0245-5
<210> 5
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 5
Figure 104138283-A0305-02-0246-6
<210> 6
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 6
Figure 104138283-A0305-02-0246-7
Figure 104138283-A0305-02-0247-8
<210> 7
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 7
Figure 104138283-A0305-02-0247-9
<210> 8
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 8
Figure 104138283-A0305-02-0247-10
<210> 9
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 9
Figure 104138283-A0305-02-0248-11
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 10
Figure 104138283-A0305-02-0248-12
<210> 11
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 11
Figure 104138283-A0305-02-0248-13
Figure 104138283-A0305-02-0249-14
<210> 12
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 12
Figure 104138283-A0305-02-0249-15
<210> 13
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 13
Figure 104138283-A0305-02-0249-16
<210> 14
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 14
Figure 104138283-A0305-02-0250-17
<210> 15
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 15
Figure 104138283-A0305-02-0250-18
<210> 16
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 16
Figure 104138283-A0305-02-0251-19
<210> 17
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 17
Figure 104138283-A0305-02-0251-20
<210> 18
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 18
Figure 104138283-A0305-02-0251-21
<210> 19
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 19
Figure 104138283-A0305-02-0251-22
Figure 104138283-A0305-02-0252-23
<210> 20
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 20
Figure 104138283-A0305-02-0252-24
<210> 21
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 21
Figure 104138283-A0305-02-0252-25
Figure 104138283-A0305-02-0253-26
<210> 22
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 22
Figure 104138283-A0305-02-0253-27
<210> 23
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 23
Figure 104138283-A0305-02-0253-28
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 24
Figure 104138283-A0305-02-0254-29
<210> 25
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 25
Figure 104138283-A0305-02-0254-30
<210> 26
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 26
Figure 104138283-A0305-02-0255-31
<210> 27
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 27
Figure 104138283-A0305-02-0255-32
<210> 28
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 28
Figure 104138283-A0305-02-0255-33
<210> 29
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 29
Figure 104138283-A0305-02-0256-34
<210> 30
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 30
Figure 104138283-A0305-02-0256-35
<210> 31
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 31
Figure 104138283-A0305-02-0256-36
Figure 104138283-A0305-02-0257-37
<210> 32
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 32
Figure 104138283-A0305-02-0257-38
<210> 33
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 33
Figure 104138283-A0305-02-0257-39
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 34
Figure 104138283-A0305-02-0257-40
Figure 104138283-A0305-02-0258-41
<210> 35
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 35
Figure 104138283-A0305-02-0258-42
Figure 104138283-A0305-02-0259-43
<210> 36
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 36
Figure 104138283-A0305-02-0259-44
<210> 37
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 37
Figure 104138283-A0305-02-0259-45
<210> 38
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 38
Figure 104138283-A0305-02-0260-46
<210> 39
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 39
Figure 104138283-A0305-02-0260-47
<210> 40
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 40
Figure 104138283-A0305-02-0260-48
Figure 104138283-A0305-02-0261-49
<210> 41
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 41
Figure 104138283-A0305-02-0261-50
Figure 104138283-A0305-02-0262-51
<210> 42
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 42
Figure 104138283-A0305-02-0262-52
<210> 43
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 43
Figure 104138283-A0305-02-0262-53
<210> 44
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 44
Figure 104138283-A0305-02-0262-54
<210> 45
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 45
Figure 104138283-A0305-02-0263-55
<210> 46
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 46
Figure 104138283-A0305-02-0263-56
<210> 47
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 47
Figure 104138283-A0305-02-0263-57
<210> 48
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 48
Figure 104138283-A0305-02-0264-58
<210> 49
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 49
Figure 104138283-A0305-02-0264-59
<210> 50
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 50
Figure 104138283-A0305-02-0264-60
<210> 51
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 51
Figure 104138283-A0305-02-0265-61
<210> 52
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 52
Figure 104138283-A0305-02-0265-62
<210> 53
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 53
Figure 104138283-A0305-02-0265-63
<210> 54
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 54
Figure 104138283-A0305-02-0266-64
<210> 55
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 55
Figure 104138283-A0305-02-0266-65
<210> 56
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 56
Figure 104138283-A0305-02-0267-66
<210> 57
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 57
Figure 104138283-A0305-02-0267-67
<210> 58
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 58
Figure 104138283-A0305-02-0267-68
<210> 59
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 59
Figure 104138283-A0305-02-0268-69
<210> 60
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 60
Figure 104138283-A0305-02-0268-70
<210> 61
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 61
Figure 104138283-A0305-02-0268-71
<210> 62
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 62
Figure 104138283-A0305-02-0268-72
Figure 104138283-A0305-02-0269-73
<210> 63
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 63
Figure 104138283-A0305-02-0269-74
<210> 64
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 64
Figure 104138283-A0305-02-0269-75
<210> 65
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 65
Figure 104138283-A0305-02-0270-76
<210> 66
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 66
Figure 104138283-A0305-02-0270-77
<210> 67
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 67
Figure 104138283-A0305-02-0270-78
Figure 104138283-A0305-02-0271-79
<210> 68
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 68
Figure 104138283-A0305-02-0271-80
<210> 69
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 69
Figure 104138283-A0305-02-0271-81
<210> 70
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 70
Figure 104138283-A0305-02-0272-82
<210> 71
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 71
Figure 104138283-A0305-02-0272-83
<210> 72
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 72
Figure 104138283-A0305-02-0272-84
Figure 104138283-A0305-02-0273-85
<210> 73
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 73
Figure 104138283-A0305-02-0273-86
<210> 74
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 74
Figure 104138283-A0305-02-0273-87
Figure 104138283-A0305-02-0274-88
<210> 75
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 75
Figure 104138283-A0305-02-0274-89
<210> 76
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 76
Figure 104138283-A0305-02-0274-90
<210> 77
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 77
Figure 104138283-A0305-02-0275-91
<210> 78
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 78
Figure 104138283-A0305-02-0275-92
<210> 79
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 79
Figure 104138283-A0305-02-0276-93
<210> 80
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 80
Figure 104138283-A0305-02-0276-94
<210> 81
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 81
Figure 104138283-A0305-02-0276-95
<210> 82
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 82
Figure 104138283-A0305-02-0276-96
Figure 104138283-A0305-02-0277-97
<210> 83
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 83
Figure 104138283-A0305-02-0277-98
<210> 84
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 84
Figure 104138283-A0305-02-0277-99
<210> 85
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 85
Figure 104138283-A0305-02-0278-100
<210> 86
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 86
Figure 104138283-A0305-02-0278-101
Figure 104138283-A0305-02-0279-102
<210> 87
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 87
Figure 104138283-A0305-02-0279-104
Figure 104138283-A0305-02-0280-105
<210> 88
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 88
Figure 104138283-A0305-02-0280-106
Figure 104138283-A0305-02-0281-107
<210> 89
<211> 689
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 89
Figure 104138283-A0305-02-0281-108
Figure 104138283-A0305-02-0282-109
Figure 104138283-A0305-02-0283-110
<210> 90
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 90
Figure 104138283-A0305-02-0284-111
Figure 104138283-A0305-02-0285-112
<210> 91
<211> 689
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 91
Figure 104138283-A0305-02-0286-113
Figure 104138283-A0305-02-0287-114
Figure 104138283-A0305-02-0288-115
<210> 92
<211> 455
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 92
Figure 104138283-A0305-02-0288-116
Figure 104138283-A0305-02-0289-117
Figure 104138283-A0305-02-0290-118
<210> 93
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 93
Figure 104138283-A0305-02-0290-119
Figure 104138283-A0305-02-0291-120
<210> 94
<211> 690
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 94
Figure 104138283-A0305-02-0291-121
Figure 104138283-A0305-02-0292-122
Figure 104138283-A0305-02-0293-123
Figure 104138283-A0305-02-0294-124
<210> 95
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 95
Figure 104138283-A0305-02-0294-125
Figure 104138283-A0305-02-0295-126
Figure 104138283-A0305-02-0296-127
<210> 96
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 96
Figure 104138283-A0305-02-0296-128
Figure 104138283-A0305-02-0297-129
<210> 97
<211> 648
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<220>
<221> modified_base
<222> (603)..(603)
<223> a、c、t、g、未知或其他
<400> 97
Figure 104138283-A0305-02-0297-130
<210> 98
<211> 459
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 98
Figure 104138283-A0305-02-0298-131
Figure 104138283-A0305-02-0299-132
<210> 99
<211> 689
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 99
Figure 104138283-A0305-02-0299-133
Figure 104138283-A0305-02-0300-134
Figure 104138283-A0305-02-0301-135
Figure 104138283-A0305-02-0302-136
<210> 100
<211> 689
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 100
Figure 104138283-A0305-02-0302-137
Figure 104138283-A0305-02-0303-138
Figure 104138283-A0305-02-0304-139
Figure 104138283-A0305-02-0305-140
<210> 101
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 101
Figure 104138283-A0305-02-0305-141
Figure 104138283-A0305-02-0306-142
Figure 104138283-A0305-02-0307-143
<210> 102
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 102
Figure 104138283-A0305-02-0307-144
Figure 104138283-A0305-02-0308-145
<210> 103
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 103
Figure 104138283-A0305-02-0308-146
Figure 104138283-A0305-02-0309-147
<210> 104
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 104
Figure 104138283-A0305-02-0309-149
<210> 105
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 105
Figure 104138283-A0305-02-0310-150
<210> 106
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 106
Figure 104138283-A0305-02-0310-151
Figure 104138283-A0305-02-0311-152
<210> 107
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 107
Figure 104138283-A0305-02-0311-153
<210> 108
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 108
Figure 104138283-A0305-02-0312-154
<210> 109
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 109
Figure 104138283-A0305-02-0312-155
Figure 104138283-A0305-02-0313-156
<210> 110
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 110
Figure 104138283-A0305-02-0313-157
<210> 111
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 111
Figure 104138283-A0305-02-0313-158
Figure 104138283-A0305-02-0314-159
<210> 112
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 112
Figure 104138283-A0305-02-0314-160
<210> 113
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 113
Figure 104138283-A0305-02-0315-161
<210> 114
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 114
Figure 104138283-A0305-02-0315-162
<210> 115
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 115
Figure 104138283-A0305-02-0316-163
<210> 116
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 116
Figure 104138283-A0305-02-0316-164
Figure 104138283-A0305-02-0317-165
<210> 117
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 117
Figure 104138283-A0305-02-0317-166
<210> 118
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 118
Figure 104138283-A0305-02-0318-167
<210> 119
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 119
Figure 104138283-A0305-02-0318-168
Figure 104138283-A0305-02-0319-169
<210> 120
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 120
Figure 104138283-A0305-02-0319-170
<210> 121
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 121
Figure 104138283-A0305-02-0320-171
<210> 122
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 122
Figure 104138283-A0305-02-0320-172
Figure 104138283-A0305-02-0321-173
<210> 123
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 123
Figure 104138283-A0305-02-0321-174
<210> 124
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 124
Figure 104138283-A0305-02-0321-175
Figure 104138283-A0305-02-0322-176
<210> 125
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 125
Figure 104138283-A0305-02-0322-177
<210> 126
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 126
Figure 104138283-A0305-02-0323-178
<210> 127
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 127
Figure 104138283-A0305-02-0323-179
Figure 104138283-A0305-02-0324-180
<210> 128
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 128
Figure 104138283-A0305-02-0324-181
<210> 129
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 129
Figure 104138283-A0305-02-0325-182
<210> 130
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 130
Figure 104138283-A0305-02-0325-183
Figure 104138283-A0305-02-0326-184
<210> 131
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 131
Figure 104138283-A0305-02-0326-185
<210> 132
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 132
Figure 104138283-A0305-02-0327-186
<210> 133
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 133
Figure 104138283-A0305-02-0327-187
Figure 104138283-A0305-02-0328-188
<210> 134
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 134
Figure 104138283-A0305-02-0328-189
<210> 135
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 135
Figure 104138283-A0305-02-0328-190
Figure 104138283-A0305-02-0329-191
<210> 136
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 136
Figure 104138283-A0305-02-0329-192
Figure 104138283-A0305-02-0330-193
Figure 104138283-A0305-02-0331-194
<210> 137
<211> 691
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 137
Figure 104138283-A0305-02-0331-195
Figure 104138283-A0305-02-0332-196
Figure 104138283-A0305-02-0333-197
<210> 138
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 138
Figure 104138283-A0305-02-0334-198
<210> 139
<211> 257
<212> PRT
<213> 智人
<400> 139
Figure 104138283-A0305-02-0334-199
Figure 104138283-A0305-02-0335-200
<210> 140
<211> 468
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 140
Figure 104138283-A0305-02-0336-201
Figure 104138283-A0305-02-0337-202
<210> 141
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 141
Figure 104138283-A0305-02-0338-203
<210> 142
<211> 255
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 142
Figure 104138283-A0305-02-0339-204
<210> 143
<211> 466
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 143
Figure 104138283-A0305-02-0340-205
Figure 104138283-A0305-02-0341-206
<210> 144
<211> 257
<212> PRT
<213> 食蟹猴
<400> 144
Figure 104138283-A0305-02-0342-207
Figure 104138283-A0305-02-0343-208
<210> 145
<211> 468
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 145
Figure 104138283-A0305-02-0343-209
Figure 104138283-A0305-02-0344-210
<210> 146
<211> 255
<212> PRT
<213> 智人
<400> 146
Figure 104138283-A0305-02-0345-211
Figure 104138283-A0305-02-0346-212
<210> 147
<211> 472
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 147
Figure 104138283-A0305-02-0346-213
Figure 104138283-A0305-02-0347-214
<210> 148
<211> 243
<212> PRT
<213> 智人
<400> 148
Figure 104138283-A0305-02-0348-215
Figure 104138283-A0305-02-0349-216
<210> 149
<211> 479
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 149
Figure 104138283-A0305-02-0349-217
Figure 104138283-A0305-02-0350-218
<210> 150
<211> 207
<212> PRT
<213> 智人
<400> 150
Figure 104138283-A0305-02-0351-219
<210> 151
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 151
Figure 104138283-A0305-02-0352-220
<210> 152
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 152
Figure 104138283-A0305-02-0352-221
<210> 153
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 153
Figure 104138283-A0305-02-0352-222
<210> 154
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<220>
<221> modified_base
<222> (47)..(47)
<223> a、c、t、g、未知或其他
<400> 154
Figure 104138283-A0305-02-0353-223
<210> 155
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 155
Figure 104138283-A0305-02-0353-224
<210> 156
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 156
Figure 104138283-A0305-02-0353-225
Figure 104138283-A0305-02-0354-226
<210> 157
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 157
Figure 104138283-A0305-02-0354-227
<210> 158
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 158
Figure 104138283-A0305-02-0354-228
<210> 159
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<220>
<221> modified_base
<222> (53)..(53)
<223> a、c、t、g、未知或其他
<400> 159
Figure 104138283-A0305-02-0355-229
<210> 160
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 160
Figure 104138283-A0305-02-0355-230
<210> 161
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<220>
<221> modified_base
<222> (47)..(47)
<223> a、c、t、g、未知或其他
<220>
<221> modified_base
<222> (177)..(177)
<223> a、c、t、g、未知或其他
<400> 161
Figure 104138283-A0305-02-0356-231
<210> 162
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 162
Figure 104138283-A0305-02-0356-232
<210> 163
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 163
Figure 104138283-A0305-02-0356-233
<210> 164
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 164
Figure 104138283-A0305-02-0357-234
<210> 165
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 165
Figure 104138283-A0305-02-0357-235
<210> 166
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 166
Figure 104138283-A0305-02-0357-236
<210> 167
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 167
Figure 104138283-A0305-02-0358-237
<210> 168
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 168
Figure 104138283-A0305-02-0358-239
<210> 169
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 169
Figure 104138283-A0305-02-0358-240
Figure 104138283-A0305-02-0359-241
<210> 170
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 170
Figure 104138283-A0305-02-0359-242
<210> 171
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 171
Figure 104138283-A0305-02-0359-243
<210> 172
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 172
Figure 104138283-A0305-02-0359-244
Figure 104138283-A0305-02-0360-245
<210> 173
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 173
Figure 104138283-A0305-02-0360-246
<210> 174
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 174
Figure 104138283-A0305-02-0360-247
<210> 175
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 175
Figure 104138283-A0305-02-0361-248
<210> 176
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 176
Figure 104138283-A0305-02-0361-249
<210> 177
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 177
Figure 104138283-A0305-02-0361-250
<210> 178
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 178
Figure 104138283-A0305-02-0362-252
<210> 179
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 179
Figure 104138283-A0305-02-0362-254
<210> 180
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 180
Figure 104138283-A0305-02-0362-255
<210> 181
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 181
Figure 104138283-A0305-02-0363-256
<210> 182
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 182
Figure 104138283-A0305-02-0363-258
<210> 183
<211> 684
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 183
Figure 104138283-A0305-02-0363-259
Figure 104138283-A0305-02-0364-260
<210> 184
<211> 696
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 184
Figure 104138283-A0305-02-0364-261
<210> 185
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成引子」
<400> 185
Figure 104138283-A0305-02-0365-262
<210> 186
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成引子」
<400> 186
Figure 104138283-A0305-02-0365-263
<210> 187
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成引子」
<400> 187
Figure 104138283-A0305-02-0365-264
<210> 188
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成引子」
<400> 188
Figure 104138283-A0305-02-0365-265
<210> 189
<211> 2067
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 189
Figure 104138283-A0305-02-0365-266
Figure 104138283-A0305-02-0366-267
<210> 190
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 190
Figure 104138283-A0305-02-0367-268
<210> 191
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 191
Figure 104138283-A0305-02-0367-269
Figure 104138283-A0305-02-0368-270
<210> 192
<211> 2067
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 192
Figure 104138283-A0305-02-0368-271
Figure 104138283-A0305-02-0369-272
<210> 193
<211> 1365
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 193
Figure 104138283-A0305-02-0369-273
Figure 104138283-A0305-02-0370-274
<210> 194
<211> 681
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 194
Figure 104138283-A0305-02-0370-275
<210> 195
<211> 2070
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 195
Figure 104138283-A0305-02-0371-276
Figure 104138283-A0305-02-0372-277
<210> 196
<211> 1341
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 196
Figure 104138283-A0305-02-0372-278
<210> 197
<211> 657
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 197
Figure 104138283-A0305-02-0373-279
<210> 198
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 198
Figure 104138283-A0305-02-0373-280
<210> 199
<211> 1377
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 199
Figure 104138283-A0305-02-0374-281
<210> 200
<211> 2067
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 200
Figure 104138283-A0305-02-0375-282
Figure 104138283-A0305-02-0376-283
<210> 201
<211> 2067
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 201
Figure 104138283-A0305-02-0376-284
Figure 104138283-A0305-02-0377-285
<210> 202
<211> 1323
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 202
Figure 104138283-A0305-02-0377-286
Figure 104138283-A0305-02-0378-288
<210> 203
<211> 681
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 203
Figure 104138283-A0305-02-0378-289
<210> 204
<211> 693
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 204
Figure 104138283-A0305-02-0378-290
Figure 104138283-A0305-02-0379-291
<210> 205
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 205
Figure 104138283-A0305-02-0379-292
<210> 206
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 206
Figure 104138283-A0305-02-0379-293
<210> 207
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 207
Figure 104138283-A0305-02-0380-294
<210> 208
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 208
Figure 104138283-A0305-02-0380-295
<210> 209
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 209
Figure 104138283-A0305-02-0380-296
Figure 104138283-A0305-02-0381-297
<210> 210
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 210
Figure 104138283-A0305-02-0381-298
<210> 211
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 211
Figure 104138283-A0305-02-0381-299
<210> 212
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 212
Figure 104138283-A0305-02-0382-300
<210> 213
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 213
Figure 104138283-A0305-02-0382-301
<210> 214
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 214
Figure 104138283-A0305-02-0382-302
Figure 104138283-A0305-02-0383-303
<210> 215
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 215
Figure 104138283-A0305-02-0383-304
<210> 216
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 216
Figure 104138283-A0305-02-0383-305
<210> 217
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 217
Figure 104138283-A0305-02-0383-306
Figure 104138283-A0305-02-0384-307
<210> 218
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 218
Figure 104138283-A0305-02-0384-308
<210> 219
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 219
Figure 104138283-A0305-02-0384-309
<210> 220
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 220
Figure 104138283-A0305-02-0385-310
<210> 221
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 221
Figure 104138283-A0305-02-0385-311
<210> 222
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 222
Figure 104138283-A0305-02-0385-312
<210> 223
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 223
Figure 104138283-A0305-02-0386-313
<210> 224
<211> 1344
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 224
Figure 104138283-A0305-02-0386-314
Figure 104138283-A0305-02-0387-315
<210> 225
<211> 2073
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 225
Figure 104138283-A0305-02-0387-316
Figure 104138283-A0305-02-0388-317
<210> 226
<211> 654
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 226
Figure 104138283-A0305-02-0388-318
<210> 227
<211> 209
<212> PRT
<213> 智人
<400> 227
Figure 104138283-A0305-02-0389-319
<210> 228
<211> 214
<212> PRT
<213> 智人
<400> 228
Figure 104138283-A0305-02-0389-320
Figure 104138283-A0305-02-0390-321
<210> 229
<211> 220
<212> PRT
<213> 智人
<400> 229
Figure 104138283-A0305-02-0390-322
Figure 104138283-A0305-02-0391-323
<210> 230
<211> 208
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 230
Figure 104138283-A0305-02-0391-324
Figure 104138283-A0305-02-0392-325
<210> 231
<211> 213
<212> PRT
<213> 食蟹猴
<400> 231
Figure 104138283-A0305-02-0392-326
Figure 104138283-A0305-02-0393-327
<210> 232
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 232
Figure 104138283-A0305-02-0393-328
<210> 233
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 233
Figure 104138283-A0305-02-0393-329
<210> 234
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 234
Figure 104138283-A0305-02-0394-330
<210> 235
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 235
Figure 104138283-A0305-02-0394-331
<210> 236
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 236
Figure 104138283-A0305-02-0394-332
<210> 237
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋「人工序列之描述：合成肽」
<400> 237
Figure 104138283-A0305-02-0394-333
<210> 238
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋「人工序列之描述：合成肽」
<400> 238
Figure 104138283-A0305-02-0394-334
Figure 104138283-A0305-02-0395-335
<210> 239
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 239
Figure 104138283-A0305-02-0395-336
<210> 240
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 240
Figure 104138283-A0305-02-0395-337
<210> 241
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 241
Figure 104138283-A0305-02-0395-338
<210> 242
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 242
Figure 104138283-A0305-02-0395-339
<210> 243
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 243
Figure 104138283-A0305-02-0396-340
<210> 244
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 244
Figure 104138283-A0305-02-0396-341
<210> 245
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 245
Figure 104138283-A0305-02-0396-342
Figure 104138283-A0305-02-0397-343
<210> 246
<211> 2076
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 246
Figure 104138283-A0305-02-0397-344
Figure 104138283-A0305-02-0398-345
<210> 247
<211> 1347
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 247
Figure 104138283-A0305-02-0398-346
Figure 104138283-A0305-02-0399-347
<210> 248
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 248
Figure 104138283-A0305-02-0399-348
Figure 104138283-A0305-02-0400-349
<210> 249
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 249
Figure 104138283-A0305-02-0400-350
<210> 250
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 250
Figure 104138283-A0305-02-0400-351
Figure 104138283-A0305-02-0401-352
<210> 251
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 251
Figure 104138283-A0305-02-0401-353
Figure 104138283-A0305-02-0402-354
<210> 252
<211> 689
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 252
Figure 104138283-A0305-02-0402-355
Figure 104138283-A0305-02-0403-356
Figure 104138283-A0305-02-0404-357
<210> 253
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 253
Figure 104138283-A0305-02-0405-358
Figure 104138283-A0305-02-0406-359
<210> 254
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 254
Figure 104138283-A0305-02-0406-360
Figure 104138283-A0305-02-0407-361
<210> 255
<211> 689
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 255
Figure 104138283-A0305-02-0407-362
Figure 104138283-A0305-02-0408-363
Figure 104138283-A0305-02-0409-364
Figure 104138283-A0305-02-0410-365
<210> 256
<211> 690
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 256
Figure 104138283-A0305-02-0410-366
Figure 104138283-A0305-02-0411-367
Figure 104138283-A0305-02-0412-368
Figure 104138283-A0305-02-0413-369
<210> 257
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 257
Figure 104138283-A0305-02-0413-370
Figure 104138283-A0305-02-0414-371
Figure 104138283-A0305-02-0415-372
<210> 258
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 258
Figure 104138283-A0305-02-0415-373
Figure 104138283-A0305-02-0416-374
<210> 259
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 259
Figure 104138283-A0305-02-0416-375
Figure 104138283-A0305-02-0417-376
<210> 260
<211> 690
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 260
Figure 104138283-A0305-02-0417-377
Figure 104138283-A0305-02-0418-378
Figure 104138283-A0305-02-0419-379
<210> 261
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 261
Figure 104138283-A0305-02-0420-380
<210> 262
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 262
Figure 104138283-A0305-02-0420-381
<210> 263
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 263
Figure 104138283-A0305-02-0420-382
Figure 104138283-A0305-02-0421-383
<210> 264
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 264
Figure 104138283-A0305-02-0421-384
<210> 265
<211> 2067
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 265
Figure 104138283-A0305-02-0421-385
Figure 104138283-A0305-02-0422-386
<210> 266
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 266
Figure 104138283-A0305-02-0422-387
Figure 104138283-A0305-02-0423-388
<210> 267
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 267
Figure 104138283-A0305-02-0423-389
Figure 104138283-A0305-02-0424-390
<210> 268
<211> 2067
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 268
Figure 104138283-A0305-02-0424-391
Figure 104138283-A0305-02-0425-392
<210> 269
<211> 2070
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 269
Figure 104138283-A0305-02-0425-393
Figure 104138283-A0305-02-0426-394
<210> 270
<211> 1341
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 270
Figure 104138283-A0305-02-0426-395
Figure 104138283-A0305-02-0427-396
<210> 271
<211> 657
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 271
Figure 104138283-A0305-02-0427-397
<210> 272
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 272
Figure 104138283-A0305-02-0428-398
<210> 273
<211> 2070
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 273
Figure 104138283-A0305-02-0428-399
Figure 104138283-A0305-02-0429-400
<210> 274
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 274
Figure 104138283-A0305-02-0429-401
Figure 104138283-A0305-02-0430-402
<210> 275
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 275
Figure 104138283-A0305-02-0430-403
<210> 276
<211> 689
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 276
Figure 104138283-A0305-02-0430-404
Figure 104138283-A0305-02-0431-405
Figure 104138283-A0305-02-0432-406
Figure 104138283-A0305-02-0433-407
<210> 277
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 277
Figure 104138283-A0305-02-0433-408
Figure 104138283-A0305-02-0434-409
Figure 104138283-A0305-02-0435-410
<210> 278
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 278
Figure 104138283-A0305-02-0435-411
<210> 279
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 279
Figure 104138283-A0305-02-0436-412
<210> 280
<211> 674
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 280
Figure 104138283-A0305-02-0436-413
Figure 104138283-A0305-02-0437-414
Figure 104138283-A0305-02-0438-415
Figure 104138283-A0305-02-0439-416
<210> 281
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 281
Figure 104138283-A0305-02-0439-418
Figure 104138283-A0305-02-0440-419
Figure 104138283-A0305-02-0441-420
<210> 282
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 282
Figure 104138283-A0305-02-0441-421
Figure 104138283-A0305-02-0442-422
<210> 283
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 283
Figure 104138283-A0305-02-0442-423
<210> 284
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 284
Figure 104138283-A0305-02-0442-424
Figure 104138283-A0305-02-0443-425
<210> 285
<211> 673
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 285
Figure 104138283-A0305-02-0443-426
Figure 104138283-A0305-02-0444-427
Figure 104138283-A0305-02-0445-428
Figure 104138283-A0305-02-0446-429
<210> 286
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 286
Figure 104138283-A0305-02-0446-430
Figure 104138283-A0305-02-0447-431
<210> 287
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 287
Figure 104138283-A0305-02-0448-432
<210> 288
<211> 2067
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 288
Figure 104138283-A0305-02-0448-433
Figure 104138283-A0305-02-0449-434
<210> 289
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 289
Figure 104138283-A0305-02-0449-435
Figure 104138283-A0305-02-0450-436
<210> 290
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 290
Figure 104138283-A0305-02-0450-437
<210> 291
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 291
Figure 104138283-A0305-02-0450-438
Figure 104138283-A0305-02-0451-439
<210> 292
<211> 2022
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 292
Figure 104138283-A0305-02-0451-440
Figure 104138283-A0305-02-0452-441
<210> 293
<211> 1347
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 293
Figure 104138283-A0305-02-0452-442
Figure 104138283-A0305-02-0453-443
<210> 294
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 294
Figure 104138283-A0305-02-0453-444
<210> 295
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 295
Figure 104138283-A0305-02-0453-445
<210> 296
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 296
Figure 104138283-A0305-02-0454-446
<210> 297
<211> 2019
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 297
Figure 104138283-A0305-02-0454-447
Figure 104138283-A0305-02-0455-448
<210> 298
<211> 1344
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 298
Figure 104138283-A0305-02-0455-449
Figure 104138283-A0305-02-0456-450
<210> 299
<211> 654
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」
<400> 299
Figure 104138283-A0305-02-0456-451
<210> 300
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(50)
<223> /註釋=「此序列可涵蓋1-10個『Gly Gly Gly Gly Ser』重複單元，其中一些位置可不存在」
<220>
<221> source
<223> /註釋=「參見所申請之說明書中關於取代及較佳實施例之詳細描述」
<400> 300
Figure 104138283-A0305-02-0457-452
<210> 301
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(50)
<223> /註釋=「此序列可涵蓋1-10個『Ser Gly Gly Gly Gly』重複單元，其中一些位置可不存在」
<220>
<221> source
<223> /註釋=「參見所申請之說明書中關於取代及較佳實施例之詳細描述」
<400> 301
Figure 104138283-A0305-02-0457-453
Figure 104138283-A0305-02-0458-454
<210> 302
<211> 54
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(54)
<223> /註釋=「此區域可涵蓋1-10個『Ser Gly Gly Gly Gly』重複單元，其中一些位置可不存在」
<220>
<221> source
<223> /註釋=「參見所申請之說明書中關於取代及較佳實施例之詳細描述」
<400> 302
Figure 104138283-A0305-02-0458-455
<210> 303
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 303
Figure 104138283-A0305-02-0458-456
<210> 304
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋「人工序列之描述：合成肽」
<400> 304
Figure 104138283-A0305-02-0459-457
<210> 305
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 305
Figure 104138283-A0305-02-0459-458
<210> 306
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成的Penta-His標籤」
<400> 306
Figure 104138283-A0305-02-0459-459
<210> 307
<211> 104
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 307
Figure 104138283-A0305-02-0459-460
Figure 104138283-A0305-02-0460-461
<210> 308
<211> 692
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 308
Figure 104138283-A0305-02-0460-462
Figure 104138283-A0305-02-0461-463
Figure 104138283-A0305-02-0462-464
<210> 309
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 309
Figure 104138283-A0305-02-0463-465
Figure 104138283-A0305-02-0464-466
<210> 310
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<220>
<221> MOD_RES
<222> (201)..(201)
<223> 任何胺基酸
<400> 310
Figure 104138283-A0305-02-0465-467
<210> 311
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 311
Figure 104138283-A0305-02-0466-468
<210> 312
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 312
Figure 104138283-A0305-02-0466-469
<210> 313
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 313
Figure 104138283-A0305-02-0466-470
<210> 314
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 314
Figure 104138283-A0305-02-0466-471
<210> 315
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 315
Figure 104138283-A0305-02-0467-472
<210> 316
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 316
Figure 104138283-A0305-02-0467-473
Figure 104138283-A0305-02-0468-474

Claims (39)

  1. 一種活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其包含(i)第一抗原結合部分，其為能夠特異性結合至CD3之Fab分子，且其包含至少一個選自由SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38及SEQ ID NO：39組成之群的重鏈互補決定區(CDR)胺基酸序列及至少一個選自SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34之群的輕鏈CDR；(ii)能夠特異性結合至葉酸受體1(FolR1)之第二抗原結合部分，其中能夠特異性結合至FolR1之抗原結合部分包含：a)SEQ ID NO：16之重鏈CDR1、SEQ ID NO：17之重鏈CDR2、SEQ ID NO：18之重鏈CDR3、SEQ ID NO：32之輕鏈CDR1、SEQ ID NO：33之輕鏈CDR2及SEQ ID NO：34之輕鏈CDR3；b)SEQ ID NO：8之重鏈CDR1、SEQ ID NO：56之重鏈CDR2、SEQ ID NO：57之重鏈CDR3、SEQ ID NO：59之輕鏈CDR1、SEQ ID NO：60之輕鏈CDR2及SEQ ID NO：65之輕鏈CDR3；或c)SEQ ID NO：16之重鏈CDR1、SEQ ID NO：275之重鏈CDR2、SEQ ID NO：315之重鏈CDR3、SEQ ID NO：32之輕鏈CDR1、SEQ ID NO：33之輕鏈CDR2及SEQ ID NO：34之輕鏈CDR3。
  2. 如請求項1之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其中該第一抗原結合部分包含有包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列的可變重鏈及包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列的可變輕鏈。
  3. 如請求項1或2之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其另外包含(iii)能夠特異性結合至FolR1之第三抗原結合部分。
  4. 如請求項3之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至FolR1之該第二及第三抗原結合部分包含相同的重鏈互補決定區(CDR)及輕鏈CDR序列。
  5. 如請求項3之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其中該第三抗原結合部分與該第二抗原結合部分相同。
  6. 如請求項3之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其中該第二及第三抗原結合部分中之至少一者為Fab分子。
  7. 如請求項1或2之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其另外包含(iv)由能夠穩定結合之第一及第二亞單元構成的Fc域。
  8. 如請求項7之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其中該第一抗原結合部分及該第二抗原結合部分各在該Fab重鏈之C端連接至該Fc域之第一或第二亞單元之N端。
  9. 如請求項7之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其中第三抗原結合部分在該Fab重鏈之C端直接或經由肽連接子連接至該第一抗原結合部分之Fab重鏈之N端。
  10. 如請求項1或2之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至葉酸受體1(FolR1)之該抗原結合部分包含有包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的可變重鏈及包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列的可變輕鏈。
  11. 如請求項1或2之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至葉酸受體1(FolR1)之該抗原結合部分包含有包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列的可變重鏈及包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列的可變輕鏈。
  12. 如請求項1或2之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至FolR1之該抗原結合部分包含有包含SEQ ID NO： 274之胺基酸序列的可變重鏈及包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列的可變輕鏈。
  13. 如請求項11之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其中該第一抗原結合部分為互換型(crossover)Fab分子，其中該Fab輕鏈及該Fab重鏈之可變區或恆定區交換。
  14. 如請求項1或2之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其包含不超過一個能夠特異性結合至CD3之抗原結合部分。
  15. 如請求項7之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其中該第一及該第二抗原結合部分及該Fc域為免疫球蛋白分子之一部分。
  16. 如請求項15之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其中該Fc域為IgG類免疫球蛋白Fc域。
  17. 如請求項16之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其中該Fc域為IgG1或IgG4 Fc域。
  18. 如請求項7之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其中該Fc域為人類Fc域。
  19. 如請求項7之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其中該Fc域包含促進該Fc域之第一及第二亞單元結合的修飾。
  20. 如請求項19之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其中在該Fc域之第一亞單元之CH3域中，胺基酸殘基經具有較大側鏈體積之胺基酸殘基置換，從而在該第一亞單元之CH3域內產生隆凸，可定位於該第二亞單元之CH3域內之空腔中，且在該Fc域之第二亞單元之CH3域中，胺基酸殘基經具有較小側鏈體積之胺基酸殘基置換，從而在該第二亞單元之CH3域內產生空腔，該第一亞單元之CH3域內之該隆凸可定位於其中。
  21. 如請求項7之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其中該Fc域包含至少一個胺基酸取代使該Fc域結合至Fc受體及/或效應功能 比原生(native)IgG1 Fc域減少。
  22. 如請求項21之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其中該Fc域之各亞單元包含三個胺基酸取代使該Fc域結合至活化Fc受體及/或效應功能減少，其中該等胺基酸取代為L234A、L235A及P329G(Kabat編號)。
  23. 如請求項16之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其中該Fc受體為Fcγ受體。
  24. 如請求項21之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其中該效應功能為抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)。
  25. 一種活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其包含SEQ ID NO：276之胺基酸序列且其進一步包含SEQ ID NO：277及SEQ ID NO：35之胺基酸序列。
  26. 如請求項1、2及25中任一項之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其用作藥物。
  27. 如請求項1、2及25中任一項之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其用於治療有需要個體之疾病。
  28. 如請求項27之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其中該疾病為癌症。
  29. 一種經分離之聚核苷酸，其編碼如請求項1至25中任一項之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子。
  30. 一種多肽，其由如請求項29之聚核苷酸編碼。
  31. 一種載體，其包含如請求項29之聚核苷酸。
  32. 如請求項31之載體，其係表現載體。
  33. 一種宿主細胞，其包含如請求項29之聚核苷酸或如請求項31或32之載體。
  34. 一種製造能夠特異性結合至CD3及目標細胞抗原之活化T細胞之 雙特異性抗原結合分子的方法，該方法包含以下步驟：a)如請求項33之宿主細胞在適於表現該活化T細胞之雙特異性抗原結合分子的條件下培養及b)回收該活化T細胞之雙特異性抗原結合分子。
  35. 一種活化T細胞之雙特異性抗原結合分子，其係由如請求項34之方法製造。
  36. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至25中任一項之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子及醫藥學上可接受之載劑。
  37. 一種如請求項1至25中任一項之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子的用途，其係用於製造供治療有需要個體之疾病的藥物。
  38. 如請求項37之用途，其中該疾病為癌症。
  39. 一種用於誘導FolR1+目標細胞溶解的活體外方法，該方法包含在CD3+ T細胞存在下，使目標細胞與如請求項1至25中任一項之活化T細胞之雙特異性抗原結合分子接觸。
TW104138283D 2014-11-20 2015-11-19 活化ｔ細胞之雙特異性抗原結合分子 TWI756164B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP14194147 2014-11-20
EP14194147.6 2014-11-20

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TWI756164B true TWI756164B (zh) 2022-03-01

Family

ID=52100988

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW104138283A TW201632556A (zh) 2014-11-20 2015-11-19 活化ｔ細胞之雙特異性抗原結合分子
TW104138283D TWI756164B (zh) 2014-11-20 2015-11-19 活化ｔ細胞之雙特異性抗原結合分子

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW104138283A TW201632556A (zh) 2014-11-20 2015-11-19 活化ｔ細胞之雙特異性抗原結合分子

Country Status (33)

Country Link
US (3) US20160208019A1 (zh)
EP (1) EP3221356B1 (zh)
JP (2) JP7146395B2 (zh)
KR (1) KR102648966B1 (zh)
CN (1) CN107074955B (zh)
AR (1) AR102732A1 (zh)
AU (1) AU2015348595B2 (zh)
BR (1) BR112017007086A2 (zh)
CA (1) CA2960929A1 (zh)
CL (1) CL2017000954A1 (zh)
CO (1) CO2017003048A2 (zh)
CR (1) CR20170203A (zh)
DK (1) DK3221356T3 (zh)
EA (1) EA201791121A1 (zh)
ES (1) ES2829829T3 (zh)
HR (1) HRP20201747T1 (zh)
HU (1) HUE051715T2 (zh)
IL (1) IL251292A0 (zh)
LT (1) LT3221356T (zh)
MA (1) MA40972B1 (zh)
MX (1) MX2017006571A (zh)
MY (1) MY184889A (zh)
PE (1) PE20170585A1 (zh)
PH (1) PH12017500939A1 (zh)
PL (1) PL3221356T3 (zh)
PT (1) PT3221356T (zh)
RS (1) RS61010B1 (zh)
SG (1) SG11201702976TA (zh)
SI (1) SI3221356T1 (zh)
TW (2) TW201632556A (zh)
UA (1) UA122676C2 (zh)
WO (1) WO2016079076A1 (zh)
ZA (1) ZA201701843B (zh)

Families Citing this family (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
WO2012116926A1 (en) 2011-02-28 2012-09-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Antigen binding proteins
AR085403A1 (es) 2011-02-28 2013-09-25 Hoffmann La Roche Proteinas monovalentes que se unen a antigenos
CN107586340B (zh) 2011-08-23 2022-01-21 罗切格利卡特公司 对t细胞活化性抗原和肿瘤抗原特异性的双特异性抗体及使用方法
KR20150064068A (ko) 2012-10-08 2015-06-10 로슈 글리카트 아게 2개의 Fab 단편을 포함하는 FC-부재 항체 및 이용 방법
CN105143270B (zh) 2013-02-26 2019-11-12 罗切格利卡特公司 双特异性t细胞活化抗原结合分子
MY192312A (en) 2013-02-26 2022-08-17 Roche Glycart Ag Bispecific t cell activating antigen binding molecules
CA2922912A1 (en) * 2013-10-11 2015-04-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Multispecific domain exchanged common variable light chain antibodies
DK3608337T3 (da) 2014-08-04 2024-06-17 Hoffmann La Roche Bispecifikke T-celleaktiverende antigenbindende molekyler
PL3221355T3 (pl) 2014-11-20 2021-03-08 F. Hoffmann-La Roche Ag Terapia skojarzona składająca się z dwuswoistych aktywujących limfocyty T cząsteczek wiążących antygen CD3 i receptor folianowy 1 (FolR1) oraz antagonistów wiązania osi PD-1
AR106188A1 (es) 2015-10-01 2017-12-20 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización
CR20180162A (es) 2015-10-02 2018-05-25 Hoffmann La Roche Moléculas biespecíficas de unión a antígeno activadoras de células t
CA2997406C (en) 2015-12-09 2024-05-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Type ii anti-cd20 antibody for reducing formation of anti-drug antibodies or cytokine release
AU2017205089B2 (en) 2016-01-08 2023-10-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods of treating CEA-positive cancers using PD-1 axis binding antagonists and anti-CEA/anti-CD3 bispecific antibodies
DK3433280T3 (da) 2016-03-22 2023-06-19 Hoffmann La Roche Protease-aktiverede T-celle-bispecifikke molekyler
JP7022123B2 (ja) * 2016-09-30 2022-02-17 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｃｄ３に対する二重特異性抗体
WO2018085358A1 (en) 2016-11-02 2018-05-11 Jounce Therapeutics, Inc. Antibodies to pd-1 and uses thereof
CN110114674B (zh) * 2016-12-13 2023-05-09 豪夫迈·罗氏有限公司 确定肿瘤样品中存在靶抗原的方法
JP7125400B2 (ja) 2016-12-19 2022-08-24 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 標的化４－１ｂｂ（ｃｄ１３７）アゴニストとの併用療法
US11285207B2 (en) 2017-04-05 2022-03-29 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific antibodies specifically binding to PD1 and LAG3
US11248054B2 (en) 2017-06-12 2022-02-15 Bluefin Biomedicine, Inc. Anti-IL1RAP antibodies and antibody drug conjugates
WO2019012141A1 (en) 2017-07-14 2019-01-17 Immatics Biotechnologies Gmbh IMPROVED POLYPEPTIDE MOLECULE WITH DOUBLE SPECIFICITY
BR112020007630A2 (pt) 2017-11-01 2020-11-17 F. Hoffmann-La Roche Ag anticorpo biespecífico ox40, produto farmacêutico, composição farmacêutica e anticorpos biespecíficos anti-fap/ anti-ox40
EP3502140A1 (en) 2017-12-21 2019-06-26 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy of tumor targeted icos agonists with t-cell bispecific molecules
JP2021508479A (ja) * 2017-12-27 2021-03-11 テネオバイオ， インコーポレイテッド ヘテロ二量体特異的抗体上のｃｄ３デルタ及びｃｄ３イプシロン
US11866498B2 (en) 2018-02-08 2024-01-09 Genentech, Inc. Bispecific antigen-binding molecules and methods of use
US20200407434A1 (en) * 2018-03-13 2020-12-31 Vascular Biogenics Ltd. Bispecific antibodies to mospd2 and t cell- or nk cell-specific molecules
EA202092125A1 (ru) 2018-03-13 2020-12-15 Фейнз Терапьютикс, Инк. Антитела против рецептора фолата 1 и их применения
EP3821006A4 (en) * 2018-07-09 2022-12-07 Multitude Inc. ANTIBODIES SPECIFIC TO FOLATE RECEPTOR ALPHA
WO2020028269A2 (en) * 2018-07-30 2020-02-06 Invenra Inc. Multispecific treg binding molecules
WO2020067199A1 (ja) * 2018-09-27 2020-04-02 公益財団法人実験動物中央研究所 免疫不全マウス
JP6935383B2 (ja) * 2018-09-27 2021-09-15 公益財団法人実験動物中央研究所 免疫不全マウス
EP3898682A1 (en) 2018-12-21 2021-10-27 F. Hoffmann-La Roche AG Tumor-targeted agonistic cd28 antigen binding molecules
MY194642A (en) * 2018-12-21 2022-12-09 Hoffmann La Roche Antibodies binding to cd3
WO2020210392A1 (en) * 2019-04-09 2020-10-15 Sanofi Trispecific binding proteins, methods, and uses thereof
EP4023230A4 (en) * 2019-06-05 2023-11-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha ANTIBODY CLEAVAGE SITE BINDING MOLECULE
CA3140192A1 (en) 2019-06-19 2020-12-24 Johannes Auer Method for the generation of a multivalent, multispecific antibody expressing cell by targeted integration of multiple expression cassettes in a defined organization
WO2020254352A1 (en) 2019-06-19 2020-12-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for the generation of a trivalent antibody expressing cell by targeted integration of multiple expression cassettes in a defined organization
WO2020260326A1 (en) 2019-06-27 2020-12-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Novel icos antibodies and tumor-targeted antigen binding molecules comprising them
WO2021007371A1 (en) * 2019-07-11 2021-01-14 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Dll3-targeting antibodies and uses thereof
CN111018969A (zh) * 2019-12-27 2020-04-17 上海药明生物技术有限公司 采用轻链select联合层析色谱纯化双特异性抗体的方法
AR121706A1 (es) 2020-04-01 2022-06-29 Hoffmann La Roche Moléculas de unión a antígeno biespecíficas dirigidas a ox40 y fap
AU2021291011A1 (en) * 2020-06-19 2023-01-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to CD3 and CD19
WO2021255146A1 (en) * 2020-06-19 2021-12-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to cd3 and cea
WO2021255142A1 (en) * 2020-06-19 2021-12-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to cd3
JP2023531625A (ja) 2020-06-19 2023-07-25 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト ＣＤ３及びＦｏｌＲ１に結合する抗体
JP2023544769A (ja) * 2020-10-07 2023-10-25 アムジエン・インコーポレーテツド 多重特異性抗体の構築のためのビルディングブロックの合理的選択
TW202233684A (zh) * 2020-11-18 2022-09-01 美商泰尼歐生物公司 結合於葉酸受體α之重鏈抗體
CN112794911B (zh) * 2021-04-14 2021-08-03 上海偌妥生物科技有限公司 人源化抗叶酸受体1抗体及其应用
CA3237018A1 (en) * 2021-11-03 2023-05-11 Joachim Koch Bispecific cd16a binders
WO2023161457A1 (en) 2022-02-27 2023-08-31 Evobright Gmbh Bispecific antibodies against cd277 and a tumor-antigen

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014151910A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Amgen Inc. Heterodimeric bispecific antibodies

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102361883A (zh) 2009-04-07 2012-02-22 罗氏格黎卡特股份公司 双特异性抗-ErbB-1/抗-c-Met抗体
CA2837975C (en) * 2011-08-23 2022-04-05 Roche Glycart Ag Bispecific t cell activating antigen binding molecules
RU2668824C2 (ru) * 2012-08-31 2018-10-02 Иммьюноджен Инк. Диагностические анализы и наборы для детекции фолатного рецептора 1
CN104884617B (zh) * 2012-12-07 2019-02-19 协和发酵麒麟株式会社 抗folr1抗体
WO2014104270A1 (ja) 2012-12-25 2014-07-03 国立大学法人鹿児島大学 葉酸リセプターα及びβを認識する抗体
CN105143270B (zh) * 2013-02-26 2019-11-12 罗切格利卡特公司 双特异性t细胞活化抗原结合分子
WO2014144357A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Merck Patent Gmbh Tetravalent bispecific antibodies
UA118028C2 (uk) * 2013-04-03 2018-11-12 Рош Глікарт Аг Біспецифічне антитіло, специфічне щодо fap і dr5, антитіло, специфічне щодо dr5, і спосіб їх застосування
US20160257748A1 (en) * 2013-09-25 2016-09-08 Amgen Inc. V-c-fc-v-c antibody

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014151910A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Amgen Inc. Heterodimeric bispecific antibodies

Also Published As

Publication number Publication date
JP2021058189A (ja) 2021-04-15
BR112017007086A2 (pt) 2018-01-16
EP3221356B1 (en) 2020-09-02
ZA201701843B (en) 2018-05-30
PL3221356T3 (pl) 2021-01-11
MY184889A (en) 2021-04-29
JP2017536121A (ja) 2017-12-07
UA122676C2 (uk) 2020-12-28
AU2015348595B2 (en) 2021-06-10
US20160208019A1 (en) 2016-07-21
LT3221356T (lt) 2020-11-25
US20190031784A1 (en) 2019-01-31
SG11201702976TA (en) 2017-05-30
MX2017006571A (es) 2017-09-29
AU2015348595A1 (en) 2017-04-20
SI3221356T1 (sl) 2021-01-29
CA2960929A1 (en) 2016-05-26
KR102648966B1 (ko) 2024-03-19
TW201632556A (zh) 2016-09-16
EP3221356A1 (en) 2017-09-27
PT3221356T (pt) 2020-10-29
RS61010B1 (sr) 2020-11-30
CL2017000954A1 (es) 2017-12-29
HUE051715T2 (hu) 2021-03-29
EA201791121A1 (ru) 2018-04-30
US20220220224A1 (en) 2022-07-14
MA40972B1 (fr) 2020-11-30
AR102732A1 (es) 2017-03-22
WO2016079076A1 (en) 2016-05-26
JP7146395B2 (ja) 2022-10-04
DK3221356T3 (da) 2020-11-02
KR20170081188A (ko) 2017-07-11
CN107074955A (zh) 2017-08-18
ES2829829T3 (es) 2021-06-02
PE20170585A1 (es) 2017-05-11
PH12017500939A1 (en) 2017-11-27
CR20170203A (es) 2017-06-29
IL251292A0 (en) 2017-05-29
CN107074955B (zh) 2021-06-22
CO2017003048A2 (es) 2017-07-11
HRP20201747T1 (hr) 2020-12-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI756164B (zh) 活化ｔ細胞之雙特異性抗原結合分子
US20210253704A1 (en) Bispecific t cell activating antigen binding molecules
US11214622B2 (en) Antibodies specific for DR5 and methods of use
US20220213224A1 (en) T cell activating bispecific antigen binding molecules
TWI633121B (zh) 雙特異性活化ｔ細胞之抗原結合分子
TW201726720A (zh) 雙特異性t細胞活化抗原結合分子
TW201726735A (zh) 雙特異性t細胞活化抗原結合分子
TW201726721A (zh) 雙特異性t細胞活化抗原結合分子
TW201726719A (zh) 雙特異性t細胞活化抗原結合分子
TW201726736A (zh) 雙特異性t細胞活化抗原結合分子
TW202214704A (zh) 蛋白酶活化ｔ細胞雙特異性抗體