JP7146395B2 - ＦｏｌＲ１及びＣＤ３を標的とする二重特異性抗体 - Google Patents

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Description

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、その全内容は本明細書において出典明示により援用される。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１５年１１月９日に作成され、３２１８６＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、大きさは４４５５７０バイトである。
技術分野
本発明は、一般に、Ｔ細胞を活性化するための二重特異性抗原結合分子、特にＣＤ３及び葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）を標的とする二重特異性抗体に関する。加えて、本発明は、このような二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドと、このようなポリヌクレオチドを含むベクター及び宿主細胞とに関する。本発明は更に、本発明の二重特異性抗原結合分子を生成する方法と、このような二重特異性抗原結合分子を疾患の治療に使用する方法とに関する。
個々の細胞又は特定の細胞型の選択的破壊は、しばしば様々な臨床設定において望ましい。例えば、健常な細胞と組織を無傷のまま損傷を与えずに残しながら、腫瘍細胞を特異的に破壊することはがん治療の主要目的である。
これを達成する魅力的な方法は、腫瘍に対する免疫応答を誘導することにより、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞又は細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）のような免疫エフェクター細胞に、腫瘍細胞を攻撃させて破壊させることである。ＣＴＬは、免疫系の最も強力なエフェクター細胞を構成するが、しかしそれらは従来の治療抗体のＦｃドメインによって媒介されるエフェクター機構によって活性化することができない。
これに関し、標的細胞上の表面抗原に一の「アーム」で結合し、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体の活性化インバリアント成分に第２の「アーム」で結合するように設計された二重特異性抗体が、近年注目を浴びている。このような抗体がその標的の両方に同時結合することにより、標的細胞とＴ細胞との間に一時的な相互作用が生じ、これは何れかの傷害性Ｔ細胞を活性化させ、続いて標的細胞を溶解させる。従って、免疫応答は、標的細胞に再指向（ｒｅ－ｄｉｒｅｃｔ）され、ＣＴＬの正常なＭＨＣ制限活性化がそうであるように、標的細胞によるペプチド抗原の提示又はＴ細胞の特異性とは無関係である。このような観点から、標的細胞がそれに対して二重特異性抗体を提示するとき、すなわち免疫シナプスが模倣されるときにのみ、ＣＴＬが活性化されることが重要である。特に望ましいのは、標的細胞の効率のよい溶解を引き起こすために、リンパ球のプレコンディショニング又は同時刺激を必要としない二重特異性抗体である。
ＦＯＬＲ１は、様々な起源の上皮腫瘍細胞、例えば、卵巣がん、肺がん、乳がん、腎臓がん、結腸直腸がん、子宮内膜がんで発現される。腫瘍のイメージングのための、治療用抗体、例えば、ファーレツズマブ（ｆａｒｌｅｔｕｚｕｍａｂ）、抗体薬物コンジュゲートを用いるＦＯＬＲ１を標的とするための幾つかのアプローチ、又は養子Ｔ細胞療法が記載されている(Kandalaft et al., J Transl Med. 2012 Aug 3;10:157. doi: 10.1186/1479-5876-10-157; van Dam et al., Nat Med. 2011 Sep 18;17(10):1315-9. doi: 10.1038/nm.2472; Cliftonet al., Hum Vaccin. 2011 Feb;7(2):183-90. Epub 2011 Feb 1; Kelemen et al., Int J Cancer. 2006 Jul 15;119(2):243-50; Vaitilingam et al., J Nucl Med. 2012 Jul;53(7); Teng et al., 2012 Aug;9(8):901-8. doi: 10.1517/17425247.2012.694863. Epub 2012 Jun 5)。葉酸受容体及びＣＤ３を標的とするコンストラクトを用いて葉酸受容体陽性腫瘍を標的とする幾つかの試みがなされている（Kranz et al., Proc Natl Acad Sci U S A. Sep 26, 1995; 92(20): 9057-9061; Roy et al., Adv Drug Deliv Rev. 2004 Apr 29;56(8):1219-31; Huiting Cui et al Biol Chem. Aug 17, 2012; 287(34): 28206-28214; Lamers et al., Int. J. Cancer. 60(4):450 (1995); Thompson et al., MAbs. 2009 Jul-Aug;1(4):348-56. Epub 2009 Jul 19; Mezzanzanca et al., Int. J. Cancer, 41, 609-615 (1988)）。しかしながら、これまでに取られたアプローチには多くの欠点がある。これまで使用されていた分子は、化学的架橋を必要とするため、容易かつ確実に製造することができなかった。同様に、ハイブリッド分子は、ヒトタンパク質として大規模に産生することができず、ヒトに投与される場合には高度に免疫原性であるラット、マウス又は他のタンパク質の使用を必要とし、従って、治療的価値は限られている。更に、多数の既存の分子がＦｃｇＲ結合を保持していた。
従って、標的化Ｔ細胞媒介性免疫療法のための新規で改良された二重特異性抗体の必要性が依然として存在する。本発明は、標的化Ｔ細胞活性化のために設計された二重特異性抗原結合分子、特に、容易に産生されて投薬され得る有効かつ安全な治療薬として適した二重特異性抗原結合分子を提供する。
発明の要旨
一態様において、本発明は、
（ｉ）ＣＤ３に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第１の抗原結合部分であって、配列番号３７、配列番号３８及び配列番号３９からなる群より選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列と、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４からなる群より選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲとを含む第１の抗原結合部分；並びに
（ｉｉ）葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的に結合することができる第２の抗原結合部分
を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号３６のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む第１の抗原結合部分を含む。一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、（ｉｉｉ）ＦｏｌＲ１に特異的に結合することができる第３の抗原結合部分を更に含む。一実施態様において、ＦｏｌＲ１に特異的に結合することができる第２及び第３の抗原結合部分は、同一の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）及び軽鎖ＣＤＲ配列を含む。一実施態様において、第３の抗原結合部分は、第２の抗原結合部分と同一である。
上記実施態様のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の一実施態様では、第２及び第３の抗原結合部分の少なくとも一つがＦａｂ分子である。一実施態様において、上記実施態様のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、安定した会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを更に含む。幾つかの実施態様において、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分は、それぞれ、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、Ｆｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に連結される。幾つかの実施態様において、第３の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に、任意選択的にペプチドリンカーを介して融合される。
上記実施態様のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の一実施態様において、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的に結合することができる抗原結合部分は、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８からなる群より選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列と、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４からなる群より選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲとを含む。一実施態様において、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的に結合することができる抗原結合部分は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む。一実施態様において、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的に結合することができる抗原結合部分は、配列番号８、配列番号５６及び配列番号５７からなる群より選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列と、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６５からなる群より選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲとを含む。一実施態様において、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的に結合することができる抗原結合部分は、配列番号５５のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号６４のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む。
別の実施態様において、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的に結合することができる抗原結合部分は、配列番号８、配列番号９及び配列番号５０からなる群より選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列と、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４からなる群より選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲとを含む。一実施態様において、ＦｏｌＲ１に特異的に結合することができる抗原結合部分は、（ａ）配列番号８の相補性決定領域重鎖１（ＣＤＲ－Ｈ１）アミノ酸配列；（ｂ）配列番号９のＣＤＲ－Ｈ２アミノ酸配列；（ｃ）配列番号５０のＣＤＲ－Ｈ３アミノ酸配列；（ｄ）配列番号５２の相補性決定領域軽鎖１（ＣＤＲ－Ｌ１）アミノ酸配列；（ｅ）配列番号５３のＣＤＲ－Ｌ２アミノ酸配列、及び（ｆ）配列番号５４のＣＤＲ－Ｌ３アミノ酸配列を含む。一実施態様において、ＦｏｌＲ１に特異的に結合することができる抗原結合部分は、配列番号４９のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号５１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む。
別の実施態様において、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的に結合することができる抗原結合部分は、配列番号１６、配列番号２７５及び配列番号３１５からなる群より選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列と、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４からなる群より選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲとを含む。一実施態様において、ＦｏｌＲ１に特異的に結合することができる抗原結合部分は、（ａ）配列番号１６の相補性決定領域重鎖１（ＣＤＲ－Ｈ１）アミノ酸配列；（ｂ）配列番号２７５のＣＤＲ－Ｈ２アミノ酸配列；（ｃ）配列番号３１５のＣＤＲ－Ｈ３アミノ酸配列；（ｄ）配列番号３２の相補性決定領域軽鎖１（ＣＤＲ－Ｌ１）アミノ酸配列；（ｅ）配列番号３３のＣＤＲ－Ｌ２アミノ酸配列、及び（ｆ）配列番号３４のＣＤＲ－Ｌ３アミノ酸配列を含む。一実施態様において、ＦｏｌＲ１に特異的に結合することができる抗原結合部分は、配列番号２７４のアミノ酸配列を含む可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）を含む。
一実施態様において、上記実施態様のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ヒトＦｏｌＲ１に結合する。一実施態様において、上記実施態様のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ヒトＦｏｌＲ１及びカニクイザルＦｏｌＲ１に結合する。一実施態様において、上記実施態様のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ヒトＦｏｌＲ１、カニクイザルＦｏｌＲ１及びマウスＦｏｌＲ１に結合する。一実施態様において、上記実施態様のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ヒトＦｏｌＲ１、カニクイザルＦｏｌＲ１に結合し、マウスＦｏｌＲ１には結合しない。
上記の実施態様の何れかのＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の一実施態様において、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変領域又は定常領域の何れかが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子である。一実施態様において、上記実施態様の何れかのＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ＣＤ３に特異的に結合することができる一を超えない抗原結合部分を含む。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の一実施態様において、第１及び第２の抗原結合部分及びＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の一部である。一実施態様において、ＦｃドメインはＩｇＧクラスの免疫グロブリン、特にＩｇＧ１又はＩｇＧ４のＦｃドメインである。一実施態様において、ＦｃドメインはヒトＦｃドメインである。
上記実施態様の何れかのＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の一実施態様において、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む。一実施態様において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基がそれよりも大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それにより、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の空洞内に配置可能な隆起が生成され、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基がそれよりも小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それにより、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の隆起を配置可能な空洞が生成される。一実施態様において、Ｆｃドメインは、天然型ＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる少なくとも一つのアミノ酸置換を含む。一実施態様において、Ｆｃドメインの各サブユニットは、活性化Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる３つのアミノ酸置換を含んでおり、該アミノ酸置換はＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ番号付け）である。一実施態様において、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。一実施態様において、エフェクター機能は抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である。
上記実施態様の何れかのＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、インビトロでヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞の増殖を誘導する。一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、インビトロでＦｏｌＲ１発現ヒト腫瘍細胞のヒト末梢血単核細胞媒介性死滅を誘導する。一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、インビトロでＦｏｌＲ１発現ヒト腫瘍細胞のＴ細胞媒介性死滅を誘導する。一実施態様では、Ｔ細胞はＣＤ８陽性Ｔ細胞である。一実施態様において、ＦｏｌＲ１発現ヒト腫瘍細胞は、Ｈｅｌａ、Ｓｋｏｖ－３、ＨＴ－２９、又はＨＲＣＥｐｉＣ細胞である。一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、２４時間後に約３６ｐＭから約３９５７３ｐＭの間のＥＣ５０で、インビトロでＦｏｌＲ１発現ヒト腫瘍細胞のＴ細胞媒介性死滅を誘導する。一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、２４時間後に約３６ｐＭのＥＣ５０で、インビトロでＦｏｌＲ１発現腫瘍細胞のＴ細胞媒介性死滅を誘導する。一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、２４時間後に約１７８．４ｐＭのＥＣ５０で、インビトロでＦｏｌＲ１発現腫瘍細胞のＴ細胞媒介性死滅を誘導する。一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、４８時間後に約１３４．５ｐＭ以上のＥＣ５０で、インビトロでＦｏｌＲ１発現腫瘍細胞のＴ細胞媒介性死滅を誘導する。
一実施態様において、上記の実施態様の何れかのＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、フローサイトメトリーによって測定される、Ｔ細胞上のＣＤ２５及びＣＤ６９の少なくとも一つの細胞表面発現の上方制御を誘導する。一実施態様では、Ｔ細胞は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞又はＣＤ８陽性Ｔ細胞である。一実施態様において、上記の実施態様の何れかのＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、約５．３６ｐＭから約４ｎＭの見かけのＫＤでヒトＦｏｌＲ１に結合する。一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、約４ｎＭの見かけのＫＤでヒト及びカニクイザルＦｏｌＲ１に結合する。一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、約１．５ｎＭの見かけのＫＤでマウスＦｏｌＲ１に結合する。一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、少なくとも約１０００ｎＭの一価結合のＫＤでヒトＦｏｌＲ１に結合する。
一実施態様において、上記の実施態様の何れかのＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ＦｏｌＲ１に特異的であり、ＦｏｌＲ２又はＦｏｌＲ３に結合しない。一実施態様において、上記の実施態様の何れかのＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、１μＭ以上の親和性（一価結合）を有する。一実施態様において、親和性は、ヒトＦｏｌＲ１について約１．４μＭである。一実施態様において、上記の実施態様の何れかのＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、約１－１００ｎＭ以下のアビディティー（二価結合）を有する。一実施態様では、アビディティーは約１０ｎＭ以下である。一実施態様では、アビディティーは１０ｎＭである。
一実施態様において、上記実施態様の何れかのＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ヒト腫瘍細胞上に発現されたＦｏｌＲ１に結合する。一実施態様において、上記実施態様の何れかのＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ヒトＦｏｌＲ１上の立体構造エピトープに結合する。一実施態様において、上記実施態様の何れかのＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ヒト葉酸受容体２（ＦｏｌＲ２）又はヒト葉酸受容体３（ＦｏｌＲ３）に結合しない。上記の実施態様の何れかのＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の一実施態様において、抗原結合部分は、ヒトＦｏｌＲ１（配列番号２２７）のアミノ酸２５から２３４を含むＦｏｌＲ１ポリペプチドに結合する。上記の実施態様の何れかのＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の一実施態様において、ＦｏｌＲ１抗原結合部分は、配列番号２２７、２３０及び２３１のアミノ酸配列を含むＦｏｌＲ１ポリペプチドに結合し、ここで、ＦｏｌＲ１抗原結合部分は、配列番号２２８及び２２９のアミノ酸配列を含むＦｏｌＲポリペプチドに結合しない。
別の態様において、本発明は、ａ）配列番号４９の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び配列番号５１の可変軽鎖ドメインを含む参照抗体とヒトＦｏｌＲ１への結合について競合する第１の抗原結合部位；及びｂ）配列番号３６の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び配列番号３１の可変軽鎖ドメインを含む参照抗体とヒトＣＤ３への結合について競合する第２の抗原結合部位を含む二重特異性抗体を提供し、ここで結合競合は表面プラズモン共鳴アッセイを用いて測定される。
別の態様において、本発明は、ａ）配列番号２７４の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び配列番号３１の可変軽鎖ドメインを含む参照抗体とヒトＦｏｌＲ１への結合について競合する第１の抗原結合部位；及びｂ）配列番号３６の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び配列番号３１の可変軽鎖ドメインを含む参照抗体とヒトＣＤ３への結合について競合する第２の抗原結合部位を含む二重特異性抗体を提供し、ここで結合競合は表面プラズモン共鳴アッセイを用いて測定される。
別の態様では、本発明は、ＣＤ３に特異的に結合することができる第１の抗原結合部分、及び葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的に結合することができる第２の抗原結合部分を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供し、ここでＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号４９の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び配列番号５１の可変軽鎖ドメインを含む第１の参照抗体とヒトＦｏｌＲ１上の同じエピトープに結合し；かつＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号３６の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び配列番号３１の可変軽鎖ドメインを含む第２の参照抗体とヒトＣＤ３上の同じエピトープに結合する。
別の態様では、本発明は、ＣＤ３に特異的に結合することができる第１の抗原結合部分、及び葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的に結合することができる第２の抗原結合部分を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供し、ここでＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号２７４の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び配列番号３１の可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）を含む第１の参照抗体とヒトＦｏｌＲ１上の同じエピトープに結合し；かつＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号３６の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び配列番号３１の可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）を含む第２の参照抗体とヒトＣＤ３上の同じエピトープに結合する。
別の態様において、本発明は、配列番号２７４の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び配列番号３１の可変軽鎖ドメインを含む抗体と、ヒトＦｏｌＲ１への結合について競合する抗体又はその抗原結合断片に関し、ここで結合競合は表面プラズモン共鳴アッセイを用いて測定される。
一態様において、本発明は、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供し、
ここで抗原結合分子は、第１、第２及び第３の抗原結合部分を形成する第１、第２、第３、第４及び第５のポリペプチド鎖を含み、
ここで第１の抗原結合部分はＣＤ３に結合することができ、第２及び第３の抗原結合部分はそれぞれ葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に結合することができ、ここで、ａ）第１及び第２のポリペプチド鎖は、アミノ（Ｎ）末端からカルボキシル（Ｃ）末端方向にＶＬＤ１及びＣＬＤ１を含み；ｂ）第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端方向にＶＬＤ２及びＣＨ１Ｄ２を含み；ｃ）第４のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端方向にＶＨＤ１、ＣＨ１Ｄ１、ＣＨ２Ｄ１及びＣＨ３Ｄ１を含み；ｄ）第５のポリペプチド鎖は、ＶＨＤ１、ＣＨ１Ｄ１、ＶＨＤ２、ＣＬＤ２、ＣＨ２Ｄ２及びＣＨ３Ｄ２を含み；
ここで、
ＶＬＤ１は第１の軽鎖可変ドメインであり、ＶＬＤ２は第２の軽鎖可変ドメインであり、ＣＬＤ１は第１の軽鎖定常ドメインであり、ＣＬＤ２は第２の軽鎖定常ドメインであり、ＶＨＤ１は第１の重鎖可変ドメインであり、ＶＨＤ２は第２の重鎖可変ドメインであり、ＣＨ１Ｄ１は第１の重鎖定常ドメイン１であり、ＣＨ１Ｄ２は第２の重鎖定常ドメイン１であり、ＣＨ２Ｄ１は第１の重鎖定常ドメイン２であり、ＣＨ２Ｄ２は第２の重鎖定常ドメイン２であり、ＣＨ３Ｄ１は第１の重鎖定常ドメイン３であり、ＣＨ３Ｄ２は第２の重鎖定常ドメイン３である。
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の一実施態様において、（ｉ）第３のポリペプチド鎖と、第５のポリペプチド鎖のＶＨＤ２及びＣＬＤ２は、ＣＤ３に結合することができる第１の抗原結合部分を形成し；（ｉｉ）第１のポリペプチド鎖と、第４のポリペプチド鎖のＶＨＤ１及びＣＨ１Ｄ１は、ＦｏｌＲ１に結合することができる第２の結合部分を形成し；（ｉｉｉ）第２のポリペプチド鎖と、第５のポリペプチド鎖のＶＨＤ１及びＣＨ１Ｄ１は、ＦｏｌＲ１に結合することができる第３の結合部分を形成する。一実施態様において、ＣＨ２Ｄ１、ＣＨ３Ｄ１、ＣＨ２Ｄ２及びＣＨ３Ｄ２は、ＩｇＧクラス免疫グロブリンのＦｃドメインを形成する。一実施態様において、ＦｃドメインはヒトＦｃドメインである。一実施態様において、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む。一実施態様において、ＣＨ３Ｄ２は、ＣＨ３Ｄ１内部の空洞に配置可能である、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基を含む。一実施態様において、Ｆｃドメインは、天然型ＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる少なくとも一つのアミノ酸置換を含む。一実施態様において、Ｆｃドメインの各サブユニットは、活性化Ｆｃ受容体への結合及びエフェクター機能の少なくとも一つを低下させる３つのアミノ酸置換を含んでおり、該アミノ酸置換はＫａｂａｔ番号付けに従ってＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇである。一実施態様において、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。上記実施態様の何れか一において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、インビトロでヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞の増殖を誘導する。上記実施態様の一つにおいて、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、インビトロでＦｏｌＲ１発現ヒト腫瘍細胞のヒト末梢血単核細胞媒介性死滅を誘導する。上記実施態様の一つにおいて、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、インビトロでＦｏｌＲ１発現ヒト腫瘍細胞のＴ細胞媒介性死滅を誘導する。一つのそうした実施態様において、ＦｏｌＲ１発現ヒト腫瘍細胞は、Ｈｅｌａ、Ｓｋｏｖ－３、ＨＴ－２９、又はＨＲＣＥｐｉＣ細胞である。上記実施態様の一つにおいて、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、２４時間後に約３６ｐＭから約３９５７３ｐＭの間のＥＣ５０で、インビトロでＦｏｌＲ１発現腫瘍細胞のＴ細胞媒介性死滅を誘導する。上記実施態様の一つにおいて、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、２４時間後に約３６ｐＭのＥＣ５０で、インビトロでＦｏｌＲ１発現腫瘍細胞のＴ細胞媒介性死滅を誘導する。上記実施態様の一つにおいて、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、２４時間後に約１７８．４ｐＭのＥＣ５０で、インビトロでＦｏｌＲ１発現腫瘍細胞のＴ細胞媒介性死滅を誘導する。上記実施態様の一つにおいて、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、４８時間後に約１３４．５ｐＭ以上のＥＣ５０で、インビトロでＦｏｌＲ１発現腫瘍細胞のＴ細胞媒介性死滅を誘導する。上記実施態様の一つにおいて、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、フローサイトメトリーによって測定される、Ｔ細胞上のＣＤ２５及びＣＤ６９の少なくとも一つの細胞表面発現の上方制御を誘導する。一つのそのような実施態様では、Ｔ細胞は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞又はＣＤ８陽性Ｔ細胞である。上記実施態様の一つにおいて、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、約５．３６ｐＭから約４ｎＭの見かけのＫＤでヒトＦｏｌＲ１に結合する。上記実施態様の一つにおいて、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、約４ｎＭの見かけのＫＤでヒト及びカニクイザルＦｏｌＲ１に結合する。上記実施態様の一つにおいて、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、約１．５ｎＭの見かけのＫＤでマウスＦｏｌＲ１に結合する。上記実施態様の一つにおいて、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、少なくとも約１０００ｎＭの一価結合のＫＤでヒトＦｏｌＲ１に結合する。上記実施態様の一つにおいて、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ヒト腫瘍細胞上に発現されたＦｏｌＲ１に結合する。上記実施態様の一つにおいて、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ヒトＦｏｌＲ１上の立体構造エピトープに結合する。上記実施態様の一つにおいて、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ヒト葉酸受容体２（ＦｏｌＲ２）又はヒト葉酸受容体３（ＦｏｌＲ３）に結合しない。上記実施態様の一つにおいて、抗原結合部分は、ヒトＦｏｌＲ１（配列番号２２７）のアミノ酸２５から２３４を含むＦｏｌＲ１ポリペプチドに結合する。上記実施態様の一つにおいて、ＦｏｌＲ１抗原結合部分は、配列番号２２７、２３０及び２３１のアミノ酸配列を含むＦｏｌＲ１ポリペプチドに結合し、ここで、ＦｏｌＲ１抗原結合部分は、配列番号２２８及び２２９のアミノ酸配列を含むＦｏｌＲポリペプチドに結合しない。上記実施態様の一つにおいて、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ヒト化又はキメラ分子である。上記実施態様の一つにおいて、ＶＨＤ２及びＣＨ１Ｄ１は、ペプチドリンカーを介して連結されている。
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の上記実施態様の一つにおいて、第１及び第２のポリペプチド鎖は、配列番号２３０のアミノ酸配列を含む。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の上記実施態様の一つにおいて、第３のポリペプチド鎖は、配列番号８６のアミノ酸配列を含む。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の上記実施態様の一つにおいて、第４のポリペプチド鎖は、配列番号３０９のアミノ酸配列を含む。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の上記実施態様の一つにおいて、第５のポリペプチド鎖は、配列番号３０８のアミノ酸配列を含む。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の上記実施態様の一つにおいて、第１及び第２のポリペプチド鎖は、配列番号２３０のアミノ酸配列を含み；第３のポリペプチド鎖は、配列番号８６のアミノ酸配列を含み；第４のポリペプチド鎖は、配列番号３０９のアミノ酸配列を含み；第５のポリペプチド鎖は、配列番号３０８のアミノ酸配列を含む。
一態様において、本発明は、配列番号３０８のアミノ酸配列を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。一実施態様において、上記実施態様のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は更に、配列番号２３０及び配列番号８６のアミノ酸配列を含む。
一態様において、本発明は、配列番号３０８のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する。一態様において、本発明は、配列番号３０９のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する。
一態様において、本発明は、配列番号２７６のアミノ酸配列を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。一実施態様において、上記実施態様のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は更に、配列番号２７７及び配列番号３５のアミノ酸配列を含む。
一態様において、本発明は、配列番号２７７のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する。一態様において、本発明は、配列番号２７６のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する。
一態様において、本発明は、本明細書に開示される実施態様の何れか１つのＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。一実施態様において、本発明は、配列番号１６９のヌクレオチド配列を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。一実施態様において、本発明は、配列番号２４６のヌクレオチド配列を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。一実施態様において、本発明は、配列番号２４７のヌクレオチド配列を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。一実施態様において、本発明は、配列番号９７のヌクレオチド配列を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。一実施態様において、本発明は、配列番号１９８のヌクレオチド配列を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
一実施態様において、本発明は、配列番号２８７のヌクレオチド配列を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。一実施態様において、本発明は、配列番号２８８のヌクレオチド配列を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。一実施態様において、本発明は、配列番号２８９のヌクレオチド配列を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
一態様において、本発明は、上記実施態様のポリヌクレオチドによってコードされる単離されたポリペプチドを提供する。別の態様において、本発明は、本明細書に開示される実施態様の何れか１つのＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、特に発現ベクターを提供する。別の態様では、本発明は、本明細書に開示される実施態様の何れかのポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞を提供する。
一態様において、本発明は、ａ）上記実施態様の宿主細胞を、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の発現に適した条件下で培養する工程と、ｂ）Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を回収する工程とを含む、ＣＤ３及び標的細胞抗原に特異的に結合することができるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を産生する方法を提供する。
一態様において、本発明は、上記実施態様の方法によって生成されたＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
一態様において、本発明は、上記実施態様の何れか１つのＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子と、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。一態様において、医薬としての使用のための、上記実施態様の何れか１つのＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又は上記実施態様の何れかの薬学的組成物を提供する。
一態様において、本発明は、必要とする個体における疾患の治療における使用のための、上記実施態様の何れか１つのＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又は上記実施態様の何れか１つの薬学的組成物を提供する。幾つかの実施態様において、疾患はがんである。一態様において、本発明は、必要とする個体における疾患の治療のための医薬の製造のための上記実施態様の何れか１つのＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の使用を提供する。
一態様において、本発明は、上記実施態様の何れか１つのＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含む組成物の治療的有効量を前記個体に薬学的に許容される形態で投与することを含む、個体における疾患を治療する方法を提供する。幾つかの実施態様において、前記疾患はがんである。
一態様において、本発明は、標的細胞を、Ｔ細胞の存在下で上記実施態様の何れか１つのＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子と接触させることを含む、標的細胞の溶解を誘導する方法を提供する。
一態様において、本発明は、上記の本発明を提供する。
図１Ａ－Ｉは本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（ＴＣＢ）の例示的構造を説明する。（図１１）のカッパ－ラムダフォーマットを除く全てのコンストラクトは、Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ変異を有し、ノブ・イントゥー・ホール修飾を有するノブ・イントゥー・ホールＦｃ断片を含む。（図１Ａ）「ＦｏｌＲ１ ＴＣＢ ２＋１反転型（共通の軽鎖）」の図。ＦｏｌＲ１結合剤は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、ノブ修飾を含むＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合している。これらのコンストラクトは交差しておらず、３回同じＶＬＣＬ軽鎖を有する。（図１Ａ）「ＦｏｌＲ１ ＴＣＢ １＋１頭尾（共通の軽鎖）」の図。これらのコンストラクトは交差しておらず、２回同じＶＬＣＬ軽鎖を有する。（図１Ｃ）「ＦｏｌＲ１ ＴＣＢ １＋１古典的（共通の軽鎖）」の図。これらのコンストラクトは交差しておらず、２回同じＶＬＣＬ軽鎖を有する。（図１Ｄ）「ＦｏｌＲ１ ＴＣＢ ２＋１古典的（共通の軽鎖）」の図。ＣＤ３結合剤は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、ノブ修飾を含むＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合している。これらのコンストラクトは交差しておらず、３回同じＶＬＣＬ軽鎖を有する。（図１Ｅ）「ＦｏｌＲ１ ＴＣＢ ２＋１ ｃｒｏｓｓｆａｂ古典的」の図。これらのコンストラクトは、従来のＣＨ１－ＶＨ鎖の代わりにＣＤ３結合剤のためのＣｋ－ＶＨ鎖を含む。ＣＤ３結合剤は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、ノブ修飾を含むＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合している。（図１Ｆ）「ＦｏｌＲ１ ＴＣＢ ２＋１ ｃｒｏｓｓｆａｂ反転型」の図。これらのコンストラクトは、従来のＣＨ１－ＶＨ鎖の代わりにＣＤ３結合剤のためのＣｋ－ＶＨ鎖を含む。ＦｏｌＲ１結合剤は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、ノブ修飾を含むＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合している。（図１Ｇ）「ＦｏｌＲ１ ＴＣＢ １＋１ ｃｒｏｓｓｆａｂ頭尾」の図。これらのコンストラクトは、従来のＣＨ１－ＶＨ鎖の代わりにＣＤ３結合剤のためのＣｋ－ＶＨ鎖を含む。（図１Ｈ）「ＦｏｌＲ１ ＴＣＢ １＋１ ｃｒｏｓｓｆａｂ古典的」の図。これらのコンストラクトは、従来のＣＨ１－ＶＨ鎖の代わりにＣＤ３結合剤のためのＣｋ－ＶＨ鎖を含む。図１Ｉは、ＣＤ３／ＦｏｌＲ１カッパ－ラムダ抗体フォーマットを示す。これらのコンストラクトは、交差した共通の軽鎖ＶＬＣＨ１及びＣＤ３に特異的な１つの交差ＶＨＣＬ鎖及びＦｏｌＲ１に特異的な１つの交差ＶＨＣＬ鎖を含む。 図２Ａ－Ｃは、ＦｏＬＲ１ ＩｇＧ結合剤のＨｅＬａ細胞への結合を要約したグラフを示す。ＨｅＬａ細胞上に発現されたＦｏｌＲ１に対する新たに生成されたＦｏｌＲ１結合剤の結合を、フローサイトメトリーにより決定した。結合した抗体を、蛍光標識抗ヒト二次抗体で検出した。 図３Ａ－Ｂは、ＦｏｌＲ１に対するＦｏｌＲ１結合剤の特異性を要約したグラフを示す。ＦｏｌＲ１又はＦｏｌＲ２の何れかで一時的にトランスフェクトされたＨＥＫ細胞へのＦｏｌＲ１ ＩｇＧの結合をフローサイトメトリーにより分析し、ＦｏｌＲ１に特異的に結合しＦｏｌＲ２には特異的に結合しないクローンを同定した。抗体を、蛍光標識抗ヒト二次抗体で検出した。 図４Ａ－Ｂは、ＣｙＦｏＬＲ１に対するＦｏｌＲ１結合剤の交差反応性を要約したグラフを示す。ＦｏｌＲ１抗体のカニクイザルＦｏｌＲ１に対する交差反応性を、フローサイトメトリーによってｃｙＦｏｌＲ１で一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ細胞について検討した。抗体を、蛍光標識抗ヒト二次抗体で検出した。 図５は、結合後のＦｏｌＲ１ ＴＣＢの内部移行を示すグラフを示す。ＦｏｌＲ１に結合した後の４つのＦｏｌＲ１ ＴＣＢの内部移行をＨｅＬａ細胞で試験した。表面上の残りのＦｏｌＲ１ ＴＣＢを、３７℃でのインキュベーションの指示された時点の後に蛍光標識抗ヒト二次抗体で検出した。内部移行の割合を算出した。 図６Ａ－Ｅは、異なるＦｏｌＲ１発現レベルを有する細胞へのＦｏｌＲ１ ＩｇＧの結合を要約したグラフを示す。様々なＦｏｌＲ１発現レベルを有する腫瘍細胞への９Ｄ１１，１６Ｄ５及びＭｏｖ１９ ＩｇＧの結合を、フローサイトメトリーにより分析した。ＤＰ４７ ＩｇＧをアイソタイプ対照として含め、ＭＫＮ－４５をＦｏｌＲ１陰性細胞株として含めた。抗体を、蛍光標識抗ヒト二次抗体で検出した。 図７Ａ－図７Ｌは、ＨＴ－２９及びＳＫＯＶ３細胞のＴ細胞媒介性死滅を要約したグラフを示す。ＦｏｌＲ１ ＴＣＢを用いて、ＨＴ－２９及びＳＫＯＶ３腫瘍細胞のＴ細胞媒介性死滅及び死滅時のＴ細胞上の活性化マーカーの上方制御を試験した。（図７Ａ－Ｄ）９Ｄ１１ ＦｏｌＲ１ ＴＣＢ及び１６Ｄ５ ＦｏｌＲ１ ＴＣＢの存在下でのＨＴ－２９細胞及びＳＫＯＶ３細胞のＴ細胞媒介性死滅を、２４時間後及び４８時間後にＬＤＨ放出により測定した。ＤＰ４７ ＴＣＢを陰性対照として含めた。４８時間のインキュベーション後、ＳＫＯＶ３（図７Ｅ－Ｈ）又はＨＴ－２９（図７Ｉ－Ｌ）の死滅時のＣＤ８Ｔ細胞及びＣＤ４Ｔ細胞上の活性化マーカーＣＤ２５及びＣＤ６９の上方制御を、フローサイトメトリーによって評価した。 図８は、赤血球への抗ＦｏｌＲ１結合の欠如を示すグラフを示す。赤血球をＣＤ２３５ａ陽性集団としてゲートし、この集団への９Ｄ１１ ＩｇＧ、１６Ｄ５ ＩｇＧ、Ｍｏｖ１９ ＩｇＧ及びＤＰ４７ ＩｇＧの結合をフローサイトメトリーによって決定した。抗体を、蛍光標識抗ヒト二次抗体で検出した。 図９Ａ－Ｄは、全血における活性化マーカーの上方制御を要約したグラフを示す。９Ｄ１１ ＦｏｌＲ１ ＴＣＢ、１６Ｄ５ ＦｏｌＲ１ ＴＣＢ、Ｍｏｖ１９ ＦｏｌＲ１ ＴＣＢ及びＤＰ４７ ＴＣＢの添加の２４時間後のＣＤ４ Ｔ細胞及びＣＤ８ Ｔ細胞のＣＤ２５及びＣＤ６９活性化マーカーの上方制御をフローサイトメトリーによって分析した。 ＨｅＬａ細胞への９Ｄ１１ＴＣＢα－ｇｌｙｃｏ変異体の結合。Ｈｅｌａ細胞に対する９Ｄ１１ ＦｏｌＲ１ＴＣＢα－ｇｌｙｃｏ変異体の結合を、ＨｅＬａ細胞に対する元の９Ｄ１１ ＴＣＢの結合に対して比較した。抗体は、蛍光標識された抗ヒト二次抗体で検出され、結合はフローサイトメトリーにより決定された。 図１１Ａ－Ｆは、腫瘍細胞の９Ｄ１１ＦｏｒｅＲ１ＴＣＢα－ｇｌｙｃｏ変異体によるＴ細胞媒介性死滅を要約したグラフを示す。９Ｄ１１ ＦｏｌＲ１ＴＣＢα－ｇｌｙｃｏ変異体を、元の９Ｄ１１ ＦｏｌＲ１ ＴＣＢによる死滅と比較して（図１１Ａ－Ｄ）ＳＫＯＶ３、ＭＫＮ－４５（ＦｏｌＲ１陰性対照として）及び（図１１Ｅ－Ｆ）ＨＴ－２９腫瘍細胞のＴ細胞媒介性死滅を試験するために使用した。読み出しとして、２４時間後及び４８時間後のＬＤＨ放出を使用した。 図１２－Ｘは、初代上皮細胞のＴ細胞媒介性死滅を要約したグラフを示す。非常に低レベルのＦｏｌＲ１を有する初代上皮細胞を用いて、１６Ｄ５ ＦｏｌＲ１ ＴＣＢによるＴ細胞媒介性死滅を試験し、９Ｄ１１ ＦｏｌＲ１ ＴＣＢ、ＤＰ４７ ＴＣＢを陰性対照として含め、ＨＴ２９細胞を陽性対照として含めた。（図１２Ａ－Ｈ）ヒト網膜色素（ＨＲＰ）、ヒト腎皮質（ＨＲＣ）、ヒト気管支（ＨＢ）及びＨＴ２９細胞のＬＤＨ放出を、２４時間後及び４８時間後に測定した。（図１２Ｉ－Ｌ）ＨＲＰ、（図１２Ｍ－Ｐ）ＨＲＣ、（図１２Ｑ－Ｔ）ＨＢ及び（図１２Ｕ－Ｘ）ＨＴ２９の死滅時のＣＤ４ Ｔ細胞及びＣＤ８ Ｔ細胞上のＣＤ２５及びＣＤ６９活性化マーカーの上方制御を４８時間後にフローサイトメトリーにより測定した。 図１３Ａ－図１３Ｃは、１６Ｄ５を有する異なるＴＣＢフォーマットの比較を示す。ＦｏｌＲ１結合剤１６Ｄ５を含有する４つの異なるＴＣＢフォーマットを、図１３ＡではＨｅＬａ細胞に対する結合を、図１４Ｂでは２４時間及び４８時間後のＳＫＯＶ３細胞のＴ細胞媒介性死滅を、及び図１４Ｃでは死滅４８時間後のＣＤ４ Ｔ細胞及びＣＤ８ Ｔ細胞上のＣＤ２５及びＣＤ６９活性化マーカーの上方制御を比較した。 図１４Ａ－Ｃは、９Ｄ１１を有する異なるＴＣＢフォーマットの比較を示す。ＦｏｌＲ１結合剤９Ｄ１１を含有する３つの異なるＴＣＢフォーマットを、Ａ）ではＨｅＬａ細胞に対する結合を、Ｂ）では２４時間及び４８時間後のＳＫＯＶ３細胞のＴ細胞媒介性死滅を、及びＣ）では死滅４８時間後のＣＤ４ Ｔ細胞及びＣＤ８ Ｔ細胞上のＣＤ２５及びＣＤ６９活性化マーカーの上方制御を比較した。 図１５は、３つの異なる用量について、ＮＯＧマウスにおけるＦＯＬＲ１ ＴＣＢのＰＫプロファイルを示す。 図１６は、ＦＯＬＲ１ ＴＣＢによる有効性試験のための実験プロトコルを示す。 図１７Ａ－Ｂは、腫瘍増殖曲線を示す。（図１７Ａ）異なる処置群における腫瘍体積の平均値及びＳＥＭ。（図１７Ｂ）全ての処置群における単一マウスの腫瘍増殖。ＴＧＩ（腫瘍成長阻害）は、ビヒクル群と比較した平均腫瘍体積のパーセンテージを示す。 図１８は、研究終了時の腫瘍重量を示す。 図１９Ａ－Ｂは、研究３２日目の腫瘍浸潤性Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析を示す。（図１９Ａ）腫瘍単細胞懸濁液を抗ヒトＣＤ３／ＣＤ４／ＣＤ８により染色し、フローサイトメトリーで分析した。（図１９Ｂ）異なる処置群の腫瘍組織１ｍｇあたりのＴ細胞数の平均値及びＳＥＭ。 図２０Ａ－Ｂは、研究３２日目のＴ細胞活性化／脱顆粒及びサイトカイン分泌に関するＦＡＣＳ分析を示す。ＣＤ４＋（図２０Ａ）及びＣＤ８＋（図２０Ｂ）腫瘍浸潤性Ｔ細胞を、サイトカイン、活性化及び脱顆粒マーカーについて染色した。異なる処置群の腫瘍組織１ｍｇあたりのＴ細胞数の平均値及びＳＥＭが示される。 図２１Ａ－Ｂは腫瘍溶解のパーセントを示す。ＳＫＯＶ３細胞を、カッパラムダＦｏＬＲ１ ＴＣＢ又はＤＰ４７ ＴＣＢの何れかの存在下でＰＢＭＣとともにインキュベートした。２４時間後（図２１Ａ）及び４８時間後（図２１Ｂ）に、腫瘍細胞の死滅をＬＤＨ放出を測定することによって決定した。 図２２Ａ－Ｄは、ＣＤ４ Ｔ細胞上のＣＤ２５及びＣＤ６９の上方制御を示す。ＳＫＯＶ３細胞を、カッパラムダＦｏＬＲ１ ＴＣＢ又はＤＰ４７ ＴＣＢの何れかの存在下でＰＢＭＣとともにインキュベートした。４８時間後に、ＣＤ４ Ｔ細胞（図２２Ａ－Ｂ）及びＣＤ８ Ｔ細胞（図２２Ｃ－Ｄ）上のＣＤ２５及びＣＤ６９の上方制御をフローサイトメトリーによって測定した。 図２３Ａ－Ｂは腫瘍溶解のパーセントを示す。２４時間（図２３Ａ）及び４８時間（図２３Ｂ）のインキュベーション後に（Ｅ：Ｔ＝１０：１、エフェクター ヒトＰＢＭＣ）３６Ｆ２ ＴＣＢ、Ｍｏｖ１９ ＴＣＢ及び２１Ａ５ ＴＣＢによって誘導されたＳＫｏｖ－３細胞（中間のＦｏｌＲ１）のＴ細胞死滅。 図２４Ａ－Ｃは、ヒト腫瘍細胞であるＨｅｌａ（高度のＦｏｌＲ１）（図２４Ａ）、Ｓｋｏｖ－３（中間のＦｏｌＲ１）（図２４Ｂ）及びＨＴ－２９（低いＦｏｌＲ１）（図２４Ｃ）の３６Ｆ２ ＴＣＢ、１６Ｄ５ ＴＣＢ、１６Ｄ５ ＴＣＢ古典的、１６Ｄ５ ＴＣＢ １＋１及び１６Ｄ５ ＴＣＢ ＨＴによって誘発されたＴ細胞死滅を示す（Ｅ：Ｔ＝１０：１、エフェクター ヒトＰＢＭＣ、インキュベーション時間２４時間）。ＤＰ４７ ＴＣＢを非結合対照として含めた。 図２５Ａ－Ｃは、３６Ｆ２ ＴＣＢ、１６Ｄ５ ＴＣＢ及びＤＰ４７ ＴＣＢ（非結合対照）によって誘導される、Ｈｅｌａ細胞（高度のＦｏｌＲ１）（図２５Ａ）、ＳＫｏｖ－３細胞（中間のＦｏｌＲ１）（図２５Ｂ）及びＨＴ－２９細胞（低いＦｏｌＲ１）（図２５Ｃ）（Ｅ：Ｔ＝１０：１、４８時間のインキュベーション）のＴ細胞媒介性死滅後の、ヒトＣＤ８＋（図２５Ａ、Ｂ）及びＣＤ４＋（図２５Ｃ）Ｔ細胞上のＣＤ２５及びＣＤ６９の上方制御を示す。 図２６Ａ－Ｆは、インキュベーション（Ｅ：Ｔ＝１０：１、エフェクター ヒトＰＢＭＣ）の２４時間後（図２６Ａ、Ｃ、Ｅ）及び４８時間後（図２６Ｂ、Ｄ、Ｆ）のヒト腎皮質上皮細胞（図２６Ａ、Ｂ）、ヒト網膜色素上皮細胞（図２６Ｃ、Ｄ）及びＨＴ－２９細胞（図２６Ａ、Ｂ）（図２６Ｅ、Ｆ）の細胞の３６Ｆ２ ＴＣＢ、１６Ｄ５ ＴＣＢ及びＤＰ４７ ＴＣＢによって誘導されたＴ細胞死滅を示す。 図２７は、様々な正常及びがん細胞株におけるＦｏｌＲ１結合部位の定量化を要約した表を示す。 図２８Ａ－Ｂは、Ｊｕｒｋａｔ細胞上に発現されたヒトＣＤ３に対する、１６Ｄ５ ＴＣＢ及びその対応するＣＤ３脱アミド化変異体１６Ｄ５ ＴＣＢ Ｎ１００Ａ及び１６Ｄ５ ＴＣＢ Ｓ１００ａＡ、並びに９Ｄ１１ ＴＣＢ及びその脱アミド化変異体９Ｄ１１ ＴＣＢ Ｎ１００Ａ及び９Ｄ１１ ＴＣＢ Ｓ１００ａＡの結合を示す。 図２９Ａ－Ｂは、１６Ｄ５ ＴＣＢ及びその対応するＣＤ３脱アミド化変異体１６Ｄ５ ＴＣＢ Ｎ１００Ａ及び１６Ｄ５ ＴＣＢ Ｓ１００ａＡ（図２９Ａ）、並びに９Ｄ１１ ＴＣＢ及びその脱アミド化変異体９Ｄ１１ ＴＣＢ Ｎ１００Ａ及び９Ｄ１１ ＴＣＢ Ｓ１００ａＡ（図２９Ｂ）によって誘導されたＳＫｏｖ－３（中間のＦｏｌＲ１）ヒト腫瘍細胞のＴ細胞死滅を示す（Ｅ：Ｔ＝１０：１、エフェクター ヒトＰＢＭＣ、インキュベーション時間２４時間）。ＤＰ４７ ＴＣＢを非結合対照として含めた。 図３０Ａ－Ｂは、１６Ｄ５ ＴＣＢ及びその対応するＣＤ３脱アミド化変異体１６Ｄ５ ＴＣＢ Ｎ１００Ａ及び１６Ｄ５ ＴＣＢ Ｓ１００ａＡ（図３０Ａ）、並びに９Ｄ１１ ＴＣＢ及びその脱アミド化変異体９Ｄ１１ ＴＣＢ Ｎ１００Ａ及び９Ｄ１１ ＴＣＢ Ｓ１００ａＡ（図３０Ｂ）によって誘導されたＨＴ－２９（低いＦｏｌＲ１）ヒト腫瘍細胞のＴ細胞死滅を示す（Ｅ：Ｔ＝１０：１、エフェクター ヒトＰＢＭＣ、インキュベーション時間２４時間）。ＤＰ４７ ＴＣＢを非結合対照として含めた。 図３１Ａ－Ｃは、平均蛍光強度及び腫瘍細胞溶解を示す。 図３２Ａ－Ｅは、Ｈｅｌａ細胞上に発現されたヒトＦｏｌＲ１に対する３６Ｆ２ ＴＣＢ、１６Ｄ５ ＴＣＢ及び１６Ｄ５ ＨＣ／ＬＣ変異体の結合を示す。 図３３は、Ｈｅｌａ細胞上のヒトＦｏｌＲ１に対する３６Ｆ２ ＴＣＢ、１６Ｄ５ ＴＣＢ及び２つの１６Ｄ５の親和性が減少した変異体１６Ｄ５ Ｗ９６Ｙ／Ｄ５２Ｅ ＴＣＢ及び１６Ｄ５ Ｇ４９Ｓ／Ｓ９３Ａ ＴＣＢの結合を示す。 図３４Ａ－Ｅは、ＨＴ－２９細胞上に発現されたヒトＦｏｌＲ１に対する３６Ｆ２ ＴＣＢ、１６Ｄ５ ＴＣＢ及び１６Ｄ５ ＨＣ／ＬＣ変異体の結合を示す。 図３５Ａ－Ｄは、ヒト又はマウスＦｏｌＲ１又はＦｏｌＲ２の何れかを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞への、中間のＦｏｌＲ１結合剤（６Ｅ１０ ＴＣＢ、１４Ｂ１ ＴＣＢ及び９Ｃ７ ＴＣＢ）、１６Ｄ５ ＴＣＢ及び３６Ｆ２ ＴＣＢの結合を示す。 図３６Ａ－Ｆは、中間のＦｏｌＲ１結合剤（６Ｅ１０ ＴＣＢ、１４Ｂ１ ＴＣＢ及び９Ｃ７ ＴＣＢ）、１６Ｄ５ ＴＣＢ及び３６Ｆ２ ＴＣＢによって、２４時間（Ａ－Ｃ）及び４８時間（Ｄ－Ｆ）のインキュベーション後に誘導されたＨｅｌａ（高度のＦｏｌＲ１発現）、ＳＫｏｖ－３（中間のＦｏｌＲ１発現）及びＨＴ－２９（低いＦｏｌＲ１発現）ヒト腫瘍細胞のＴ細胞死滅を示す図である。ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用した（Ｅ：Ｔ＝１０：１）。 図３７Ａ－Ｆは、親和性が減少した１６Ｄ５変異体（１６Ｄ５－Ｇ４９Ｓ／Ｓ９３Ａ ＴＣＢ、１６Ｄ５－Ｇ４９Ｓ／Ｋ５３Ａ ＴＣＢ、１６Ｄ５ Ｗ９６Ｙ ＴＣＢ、１６Ｄ５ Ｗ９６Ｙ／Ｄ５２Ｅ ＴＣＢ）、１６Ｄ５ ＴＣＢ及び３６Ｆ２ ＴＣＢによって、２４時間（図３８Ａ－Ｃ）及び４８時間（図３８Ｄ－Ｆ）のインキュベーション後に誘導されたＨｅｌａ（高度のＦｏｌＲ１発現）、ＳＫｏｖ－３（中間のＦｏｌＲ１発現）及びＨＴ－２９（低いＦｏｌＲ１発現）ヒト腫瘍細胞のＴ細胞死滅を示す図である。ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用した（Ｅ：Ｔ＝１０：１）。 図３８Ａ－Ｆは、２４時間（図３９Ａ－Ｃ）及び４８時間（図３９Ｄ－Ｆ）のインキュベーション（Ｅ：Ｔ＝１０：１、エフェクター ヒトＰＢＭＣ）後に評価された、親和性が減少した１６Ｄ５変異体（１６Ｄ５－Ｇ４９Ｓ／Ｓ９３Ａ ＴＣＢ、１６Ｄ５ Ｗ９６Ｙ／Ｄ５２Ｅ ＴＣＢ）、１６Ｄ５ ＴＣＢ、３６Ｆ２ ＴＣＢ及び中間のＦｏｌＲ１結合剤１４Ｂ１ ＴＣＢによって誘導された網膜色素上皮及び腎皮質上皮からの初代ヒト細胞のＴ細胞死滅を示す。ＨＴ－２９細胞（低いＦｏｌＲ１発現）を対照細胞株として含み、ＤＰ４７ ＴＣＢを非結合対照として用いた。 図３９Ａ－Ｂは、メスＮＯＧマウスにおけるＦＯＬＲ１ ＴＣＢコンストラクトの単一用量ＰＫを示す。 図４０Ａ－Ｇは、Ｈｅｌａを有するＮＯＧマウスにおけるヒトＰＢＭＣ移入後のＦＯＬＲ１ ＴＣＢコンストラクト（１６Ｄ５、１６Ｄ５ Ｇ４９Ｓ／Ｓ９３Ａ及び１６Ｄ５ Ｗ９６Ｙ／Ｄ５２Ｅ）のインビボ有効性を示す。 図４１は、ファーレツズマブ（Ｆａｒｌｅｔｕｚｕｍａｂ）（濃い緑、上から２番目）及びＭｏｖ１９（灰色、上）は、１６Ｄ５に捕捉されたｈｕＦｏｌＲ１に結合することができることを示し、１６Ｄ５系の結合剤がファーレツズマブ又はＭｏｖ１９によって認識されるエピトープとは異なるエピトープを認識することを実証する。
定義
本明細書の用語は、以下で特に定義されない限り、当該技術分野で一般に使用されるように使用される。
本明細書において使用される用語「抗原結合分子」は、その最も広い意味において、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の例は、免疫グロブリン及び誘導体、例えば、その断片である。
用語「二重特異性」とは、抗原結合分子が少なくとも二つの異なる抗原決定基に特異的に結合することができることを意味する。典型的には、二重特異性抗原結合分子は、各々が異なる抗原決定基に特異的な少なくとも二つの抗原結合部位を含む。特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、二つの抗原決定基、特に二つの別個の細胞上に発現した二つの抗原決定基に同時に結合することができる。
本明細書において使用される用語「価」は、抗原結合分子内における特定数の抗原結合部位の存在を意味する。従って、「抗原への一価の結合」という用語は、抗原結合分子内において、抗原に特異的な一つの（且つ一つを超えない）抗原結合部位の存在を意味する。
「抗原結合部位」は、抗原との相互作用を提供する抗原結合分子の部位、すなわち、一又は複数のアミノ酸残基を指す。例えば、抗体の抗原結合部位は、相補性決定領域（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含む。天然免疫グロブリン分子は、一般に二つの抗原結合部位を有し、Ｆａｂ分子は一般に単一の抗原結合部位を有する。
本明細書で使用される「抗原結合部分」は、抗原決定基に特異的に結合するポリペプチド分子を指す。一実施態様では、抗原結合部分は、それが結合する実体（例えば、第２の抗原結合部分）を標的部位へ、例えば特定の型の腫瘍細胞又は抗原決定基を有する腫瘍間質へと直接方向付けることができる。別の実施態様では、抗原結合部分は、その標的抗原、例えばＴ細胞受容体複合抗原を通してシグナル伝達を活性化することができる。抗原結合部分には、抗体及びその断片が含まれる。これについては後述する。特定の抗原結合部分には、抗体重鎖可変領域及び抗体軽鎖可変領域を含む、抗体の抗原結合ドメインが含まれる。特定の実施態様では、抗原結合部分は、本明細書で更に定義し、且つ当該技術分野において既知であるように、抗体定常領域を含むことができる。有用な重鎖定常領域は、五つのアイソタイプ：α、δ、ε、γ、又はμの何れかを含む。有用な軽鎖定常領域は、二つのアイソタイプ：κ及びλの何れかを含む。
本明細書において使用される用語「抗原決定基」は、「抗原」及び「エピトープ」と同義であり、抗原結合部分が結合し、抗原結合部分－抗原複合体を形成するポリペプチド巨大分子上の部位（例えば、アミノ酸の連続的広がり又は非連続的アミノ酸の異なる領域から形成される立体構造）を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面に、ウイルス感染細胞の表面に、他の疾患細胞の表面に、免疫細胞の表面に、血清中に遊離した状態で、及び／又は細胞外基質（ＥＣＭ）に見出すことができる。特に断らない限り、本明細書において抗原と呼ばれるたんぱく質、例えば、ＦｏｌＲ１及びＣＤ３は、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス、ラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来のタンパク質の任意の天然型を指す。特定の実施態様では、抗原はヒトタンパク質である。本明細書において特定のタンパク質が言及される場合、その用語は「完全長」の未処理のタンパク質と、細胞内での処理により得られる任意の形態のタンパク質とを包含する。その用語はまた、天然に存在するタンパク質の変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を包含する。抗原として有用な例示的なヒトタンパク質には、限定されないが：ＦｏｌＲ１（葉酸受容体アルファ（ＦＲＡ）；葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）；ヒトＦｏｌＲ１ ＵｎｉＰｒｏｔ番号：Ｐ１５３２８；マウスＦｏｌＲ１ ＵｎｉＰｒｏｔ番号：Ｐ３５８４６；カニクイザルＦｏｌＲ１ ＵｎｉＰｒｏｔ番号：Ｇ７ＰＲ１４）及びＣＤ３、特にＣＤ３のイプシロンサブユニット（ヒト配列についてはＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ０７７６６（バージョン１３０）、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ番号ＮＰ＿０００７２４．１、配列番号１５０を；又はカニクイザル［Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ］配列についてはＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｑ９５ＬＩ５（バージョン４９）、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ番号ＢＡＢ７１８４９．１を参照）が含まれる。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、様々な種由来のＣＤ３又は標的抗原の中で保存された、ＣＤ３又は標的細胞抗原のエピトープに結合する。特定の実施態様において、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ＣＤ３及びＦｏｌＲ１に結合するが、ＦｏｌＲ２（葉酸受容体ベータ；ＦＲＢ；ヒトＦｏｌＲ２ ＵｎｉＰｒｏｔ番号：Ｐ１４２０７）又はＦｏｌＲ３（葉酸受容体ガンマ；ヒトＦｏｌＲ３ ＵｎｉＰｒｏｔ番号：Ｐ４１４３９）には結合しない。
「特異的結合」とは、結合が抗原について選択的であり、不必要な又は非特異的相互作用と区別されうることを意味する。特定の抗原決定基に結合する抗原結合部分の能力は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られている他の技術、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ機器で解析される）（Liljeblad,et al.,Glyco.J.17:323-329(2000)）及び伝統的な結合アッセイ（Heeley,R.P.,Endocr.Res.28:217-229(2002)）の何れかによって測定することができる。一実施態様では、無関係のタンパク質への抗原結合部分の結合の程度は、例えばＳＰＲにより測定される場合、抗原に対する抗原結合部分の結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、抗原に結合する抗原結合部分、又は抗原結合部分を含む抗原結合分子は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０－８Ｍ以下、例えば１０－８Ｍ～１０－１３Ｍ、例えば、１０－９Ｍ～１０－１３Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。
「親和性」とは、分子（例えば、受容体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、リガンド）との間の非共有相互作用の総和の強度を指す。本明細書では、特に明記しない限り、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗原結合部分と抗原、又は受容体とそのリガンド）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は、通常、解離定数（ＫＤ）によって表される。この解離定数（ＫＤ）は、解離速度定数と会合速度定数（それぞれ、ｋｏｆｆ及びｋｏｎ）の比である。従って、等価な親和性は、速度定数の比が同じままである限り、異なる速度定数を含み得る。親和性は、本明細書に記載したものを含む、当該技術分野で既知の十分に確立された方法によって測定することができる。親和性を測定するための特定の方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
例えばＦｃ受容体への結合減少といった「結合減少」は、例えばＳＰＲによって測定されるように、各相互作用に対する親和性の減少を指す。明確に示すために、用語はゼロ（又は分析方法の検出限界を下回る値）への親和性の減少、すなわち相互作用の完全な消失も含む。逆に、「結合増大」は、各相互作用に対する親和性の増大を指す。
本明細書で使用される「Ｔ細胞活性化」は、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子の放出、細胞傷害活性、及び活性化マーカーの発現から選択される、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の一又は複数の細胞応答を指す。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Ｔ細胞活性化を誘導することができる。Ｔ細胞活性化を測定するために適切なアッセイは、本明細書において記載される技術分野で既知である。
本明細書において使用される「標的細胞抗原」は、標的細胞、例えばがん細胞又は腫瘍間質の細胞といった腫瘍内細胞の表面に提示される抗原決定基を指す。特に、「標的細胞抗原」は、葉酸受容体１を指す。
本明細書において、抗原結合部分などに関して使用される用語「第１」及び「第２」は、部分の各種類が複数存在するとき、便宜上区別するために使用されている。このような用語の使用は、明瞭に述べているのでない限り、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の特定の順序又は方向を付与することを意図しているのではない。
「Ｆａｂ分子」は、免疫グロブリンの、重鎖（「Ｆａｂ重鎖」）のＶＨ及びＣＨ１ドメインと、軽鎖（「Ｆａｂ軽鎖」）のＶＬ及びＣＬドメインとからなるタンパク質を指す。
本明細書において使用される「同一のＶＬＣＬ軽鎖を有するＦａｂ分子」という用語は、１つの軽鎖を共有するが、依然として別個の特異性を有する、例えばＣＤ３又はＦｏｌＲ１に結合することができる結合体を指す。幾つかの実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、同一のＶＬＣＬ軽鎖を有する少なくとも２つのＦａｂ分子を含む。対応する重鎖は再構築され、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原ＣＤ３及び標的細胞抗原ＦｏｌＲ１にそれぞれ特異的結合を与える。
「融合した」とは、複数の成分（例えば、Ｆａｂ分子及びＦｃドメインサブユニット）が、直接又は一又は複数のペプチドリンカーを介して、ペプチド結合により結合していることを意味する。
本明細書において使用される用語「一本鎖」は、ペプチド結合により線形に結合したアミノ酸単量体を含む分子を指す。特定の実施態様では、抗原結合部分の一つは、一本鎖Ｆａｂ分子、すなわちＦａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖とがペプチドリンカーにより連結されて一本のペプチド鎖を形成しているＦａｂ分子である。このような特定の一実施態様では、一本鎖Ｆａｂ分子においてＦａｂ軽鎖のＣ末端がＦａｂ重鎖のＮ末端に接続している。
「クロスオーバーＦａｂ分子」（「Ｃｒｏｓｓｆａｂ」とも表記される）は、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域の何れかが交換されているＦａｂ分子を意味し、すなわち、クロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変領域と重鎖定常領域からなるペプチド鎖、及び重鎖可変領域と軽鎖定常領域からなるペプチド鎖を含んでいる。明瞭には、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変領域が交換されているクロスオーバーＦａｂ分子において、重鎖定常領域を含むペプチド鎖を、本明細書ではクロスオーバーＦａｂ分子の「重鎖」と呼ぶ。逆に、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の定常領域が交換されているクロスオーバー分子では、重鎖可変領域を含むペプチド鎖を、本明細書ではクロスオーバーＦａｂ分子の「重鎖」と呼ぶ。１つ以上のＣｒｏｓｓＦａｂを含む抗体は、本明細書では「ＣｒｏｓｓＭａｂ」と呼ばれる。
これに対して、「従来の」Ｆａｂ分子とは、その天然フォーマットのＦａｂ分子、すなわち重鎖可変領域と定常領域（ＶＨ－ＣＨ１）からなる重鎖、及び軽鎖可変領域と定常領域（ＶＬ－ＣＬ）からなる軽鎖を含むＦａｂ分子を意味する。
用語「免疫グロブリン分子」は、天然に存在する抗体の構造を有するタンパク質を指す。例えば、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンは、ジスルフィド結合している二つの軽鎖と二つの重鎖からなる約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に、各重鎖は可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、その後に重鎖定常領域とも呼ばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）が続いている。同様に、Ｎ末端からＣ末端に、各軽鎖は可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、その後に軽鎖定常領域とも呼ばれる定常軽鎖（ＣＬ）ドメインが続いている。免疫グロブリンの重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）、又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる五つの種類のうちの一つに割当てることができ、それらの幾つかは更にサブタイプ、例えばγ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）及びα２（ＩｇＡ２）に分けられる。免疫グロブリンの軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる、２つのタイプの何れかに割り当てることができる。免疫グロブリンは、基本的に、免疫グロブリンのヒンジ領域を介して結合された二つのＦａｂ分子とＦｃドメインからなる。
用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、様々な抗体構造を包含し、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、及び所望の抗原結合活性を示す限りにおいて抗体断片を含む。
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部分を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ‘、Ｆａｂ’－ＳＨは、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）、及び単一ドメイン抗体が含まれる。特定の抗体断片の総説については、Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)を参照。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Pluckthuen, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)を参照；また、国際公開第９３／１６１８５号；及び米国特許第５５７１８９４号及び第５５８７４５８号も参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、かつインビボ半減期を増加させたＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の議論については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。ダイアボディは２価又は二重特異性でありうる二つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、ＥＰ４０４０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号； Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)；及びHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)を参照。トリアボディ及びテトラボディもHudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)に記載されている。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部、又は軽鎖可変ドメインの全て又は一部を含む抗体断片である。ある実施態様において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ、Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ；例えば、米国特許第６２４８５１６（Ｂ１）号を参照）。抗体断片は様々な技術で作成することができ、限定されないが、本明細書に記載するように、インタクトな抗体のタンパク分解、並びに組換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による生産を含む。
用語「抗原結合ドメイン」は、抗原の一部又は全部に結合し、且つ抗原の一部又は全部に相補的な領域を含む抗体の部分を指す。抗原結合ドメインは、例えば、一又は複数の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ばれる）により提供される。特に、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。通常、天然型抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、各々が四つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と三つの超可変領域（ＨＶＲ）とを含む類似構造を有する。例えば、Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)を参照されたい。抗原結合特異性を付与するには、単一のＶＨ又はＶＬドメインで十分である。
本明細書で使用される用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、配列が超可変であるか、及び／又は構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの各領域を指す。一般的に、天然型４鎖抗体は、ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、及びＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）、計６つのＨＶＲを含む。ＨＶＲは、一般的に超可変ループ由来及び／又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含み、後者は、最高の配列可変性を有し、及び／又は抗原認識に関与している。ＶＨのＣＤＲ１の例外を除いて、ＣＤＲは一般的に超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。超可変領域（ＨＶＲ）は、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）とも呼ばれ、これらの用語は、抗原結合領域を形成する可変領域の部分に言及して本明細書では交換可能に使用される。このような特定の領域は、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, Sequences of Proteins of Immunological Interest (1983) and by Chothia et al., J Mol Biol 196:901-917 (1987)に記載されており、その定義には、互いに比較されたときのアミノ酸残基の重複又はサブセットが含まれる。それでも、抗体又はその変異体のＣＤＲに言及して何れかの定義が適用される場合、本明細書において定義及び使用される用語の範囲に含まれることが意図されている。上記文献の各々により定義されるＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基は、比較として以下の表Ａに明記した。特定のＣＤＲを包含する正確な残基数は、ＣＤＲの配列及び大きさに応じて変化するであろう。当業者であれば、抗体の可変領域のアミノ酸配列を前提に、いずれの残基が特定のＣＤＲを含むかを、常套的に決定することができる。
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Ｋａｂａｔらは、あらゆる抗体に適用可能な可変領域配列の番号付けシステムも定義した。当業者であれば、配列自体を超える実験データに頼らなくとも、この「カバット番号付け」のシステムをあらゆる可変領域配列に明確に割り当てることができる。ここで使用される「カバット番号付け」は、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983)によって規定された番号付けシステムを指す。特に断らない限り、抗体可変領域内における特定のアミノ酸残基の位置の番号付けへの言及は、カバット番号付けシステムに従っている。
配列リストのポリペプチド配列は、カバット番号付けシステムに従って番号付けされている。しかしながら、当業者には、配列リストの番号付けをカバット番号付けに変換することは周知である。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般に四つのＦＲのドメイン、すなわちＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４で構成される。従って、ＨＶＲ及びＦＲ配列は一般にＶＨ（又はＶＬ）の以下の配列に現れる：ＦＲ１－Ｈ１（Ｌ１）－ＦＲ２－Ｈ２（Ｌ２）－ＦＲ３－Ｈ３（Ｌ３）－ＦＲ４。
抗体又は免疫グロブリンの「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体の五つの主要なクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらの幾つかは、更にサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩＧＡ１、及びＩｇＡ２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
本明細書の用語「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域と変異体Ｆｃ領域を含む。ＩｇＧ重鎖のＦｃ領域の境界はわずかに変化しうるが、通常、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域はＣｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端まで延びると定義される。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在しても、存在してなくともよい。本明細書に明記されていない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載のように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。本明細書において使用されるＦｃドメインの「サブユニット」は、二量体Ｆｃドメインを形成する二つのポリペプチドの一方、すなわち、免疫グロブリン重鎖のＣ末端定常領域を含み、安定な自己会合能を有するポリペプチドを指す。例えば、ＩｇＧ Ｆｃドメインのサブユニットは、ＩｇＧ ＣＨ２及びＩｇＧ ＣＨ３定常ドメインを含む。
「Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促す修飾」とは、Ｆｃドメインのサブユニットを含むポリペプチドの、同一のポリペプチドとの会合結合によるホモ二量体の形成を低減又は抑制する、ペプチド骨格の操作又はＦｃドメインサブユニットの翻訳後修飾である。本明細書において使用される会合を促す修飾には、特に、会合することが望ましい二つのＦｃドメインサブユニット（すなわち、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニット）の各々に対して行われる別々の修飾が含まれ、これらの修飾は、二つのＦｃドメインサブユニットの会合を促進するために互いに相補的である。例えば、会合を促す修飾は、Ｆｃドメインサブユニットの一方又は両方の構造又は電荷を変化させることにより、それらの会合を、それぞれ立体的に又は静電的に好ましいものにすることができる。このように、（ヘテロ）二量体化は、第１のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドと、第２のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドとの間で起こり、これらのポリペプチドは、サブユニットの各々に融合した更なる成分（例えば、抗原結合部分）が同じでないという意味で非同一であり得る。幾つかの実施態様では、結合を促す修飾は、Ｆｃドメイン内におけるアミノ酸変異、特にアミノ酸置換を含む。特定の実施態様では、会合を促す修飾は、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの各々における別々のアミノ酸変異、特にアミノ酸置換を含む。
用語「エフェクター機能」は、抗体のアイソタイプにより変わる、抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例には：抗体エフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介抗原取り込み、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレーション、及びＢ細胞の活性化が含まれる。
本明細書において使用される「改変する（ｅｎｇｉｎｅｅｒ）、改変された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）、改変（ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」などの用語は、ペプチド骨格の何れかの操作、又は天然に存在するポリペプチド又は組換えポリペプチド又はその断片の翻訳後修飾を含むと考慮される。改変には、アミノ酸配列、グリコシル化パターン、又は個々のアミノ酸の側鎖基の修飾と、このような手法の組み合わせが含まれる。
本明細書で使用される用語「アミノ酸変異」は、アミノ酸の置換、欠失、挿入、及び修飾を包含することを意味する。置換、欠失、挿入、及び修飾の任意の組み合わせは、最終的なコンストラクトが所望の特性、例えば、Ｆｃ受容体に対する結合の低減、又は別のペプチドとの会合の増大を保持することを前提に、最終的なコンストラクトに到達するために行うことができる。アミノ酸配列の欠失及び挿入には、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端の欠失、並びにアミノ酸の挿入が含まれる。特定のアミノ酸変異はアミノ酸の置換である。Ｆｃ領域の結合特性などを変更する目的で、非保存的アミノ酸置換、すなわち、一のアミノ酸を、異なる構造及び／又は化学特性を有する別のアミノ酸で置換することは、特に好ましい。アミノ酸置換には、２０の標準のアミノ酸（例えば、４－ヒドロキシプロリン、３－メチルヒスチジン、オルニチン、ホモセリン、５－ヒドロキシリジン）の天然に存在するアミノ酸誘導体又は天然に存在しないアミノ酸による置換が含まれる。アミノ酸変異体は、当該技術分野で周知の遺伝学的方法又は化学的方法を用いて生成することができる。遺伝学的方法は、部位特異的変異原性、ＰＣＲ、遺伝子合成などを含み得る。遺伝学的改変以外の方法、例えば化学的修飾によるアミノ酸の側鎖基の変更方法も有用でありうると考えられる。本明細書では、同じアミノ酸変異を示すために、種々の表記が使用される。例えば、Ｆｃドメインの位置３２９におけるプロリンからグリシンへの置換は、３２９Ｇ、Ｇ３２９、Ｇ３２９、Ｐ３２９Ｇ、又はＰｒｏ３２９Ｇｌｙとして示される。
本明細書において使用される用語「ポリペプチド」は、アミノ結合（ペプチド結合としても知られる）により線形に結合した単量体（アミノ酸）からなる分子を指す。用語「ポリペプチド」は、二つ以上のアミノ酸の任意の鎖を指し、特異的な長さの生成物を指すのではない。従って、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、又は二つ以上のアミノ酸の鎖を指す他のいずれの用語も「ポリペプチド」の定義に含まれ、用語「ポリペプチド」は、これら用語の何れかの代わりに、又は何れかと交換可能に、使用することができる。用語「ポリペプチド」は、ポリペプチドの発現後修飾の成果を指すことも意図しており、このような成果には、限定されないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク分解的切断、又は天然に存在しないアミノ酸による修飾が含まれる。ポリペプチドは、天然の生物学的供給源から得られるか、又は組換え技術により生成されるが、必ずしも指定の核酸配列から翻訳されるものではない。ポリペプチドは、化学合成を含むあらゆる手法で生成されてよい。本発明のポリペプチドは、約３以上、５以上、１０以上、２０以上、２５以上、５０以上、７５以上、１００以上、２００以上、５００以上、１０００以上、又は２０００以上の大きさのアミノ酸からなってよい。ポリペプチドは、規定された三次元構造を有することができるが、必ずしもそのような構造を有するものではない。既定の三次元構造を有するポリペプチドは、折り畳まれていると言われ、既定の三次元構造を有さず、多数の異なる形態をとりうるポリペプチドは折り畳まれていないと言われる。
「単離された」ポリペプチド若しくは変異体、又はその誘導体は、その自然の環境にない目的のポリペプチドである。特定のレベルのどのような精製も必要でない。例えば、単離されたポリペプチドは、その天然又は自然の環境から除去することができる。宿主細胞に発現される、組換えにより生成されたポリペプチド及びタンパク質を、任意の適切な技術により分離、画分化、又は部分的若しくは実質的に精製された天然又は組換えポリペプチドのように、本発明のために単離することが考慮される。
参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、最大の配列同一性パーセントを得るように配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入した後の、いかなる保存的置換も配列同一性の一部とみなさない、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列のアミノ酸残基の百分率として定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のためのアラインメントは、当分野の技術の範囲内にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者であれば、比較する配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含めた、配列を整列させるための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書において、アミノ酸配列同一性％の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムは、ジェネンテック社によって著作され、ソースコードは米国著作権庁、ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７で登録されている。また、ＡＬＩＧＮ－２は、ジェネンテック社（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から公的に入手可能であり、又はそのソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ（登録商標）のＶ４．０Ｄを含めたＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステムでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ－２プログラムによって設定されて変動しない。アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ－２が用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Ｂとの又はそれに対する、所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性％（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂと若しくはそれに対して、ある程度のアミノ酸配列同一性％を有するか又は含む所与のアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ－２により、そのプログラムのＡ及びＢのアラインメントにおいて完全に一致するとされたアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限り、本明細書で使用される全ての％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ－２コンピュータプログラムを使用して、直前の段落で説明したように得られる。
用語「ポリヌクレオチド」は、単離された核酸分子又はコンストラクト、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウイルス由来のＲＮＡ、又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、一般的なホスホジエステル結合又は非一般的結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるようなアミド結合）を含み得る。用語「核酸分子」は、ポリヌクレオチド中に存在する、任意の一又は複数の核酸セグメント、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ断片を指す。
「単離された」核酸分子又はポリヌクレオチドは、その天然環境から除去された目的の核酸分子、ＤＮＡ又はＲＮＡである。例えば、ベクターに含有されるポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを、本発明の目的のために単離することが考慮される。単離されたポリヌクレオチドの更なる例には、異種宿主細胞内に維持される組換えポリヌクレオチド、又は溶液中の精製された（部分的に又は実質的に）ポリヌクレオチドが含まれる。単離されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド分子を通常含む細胞に含まれるポリヌクレオチド分子を含むが、そのポリヌクレオチド分子は、染色体外又はその自然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。単離されたＲＮＡ分子は、インビボ又はインビトロの本発明のＲＮＡ転写物、並びにポジティブ及びネガティブな鎖形式、及び二重鎖形式を含む。本発明の単離されたポリヌクレオチド又は核酸は、更に、合成により生成されたそのような分子を含む。加えて、ポリヌクレオチド又は核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、又は転写ターミネーターといった制御要素を含んでも含まなくてもよい。
少なくとも、例えば、本発明の参照ヌクレオチド配列と少なくとも例えば９５％「同一」であるヌクレオチド配列を有する核酸又はポリヌクレオチドにより、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と、ポリヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列のそれぞれ１００のヌクレオチドにつき最大５ポイントの変異を含んでよいという点以外は同一であることが意図される。換言すれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中最大５％のヌクレオチドが削除又は別のヌクレオチドで置換されてよいか、又は参照配列に含まれる全てのヌクレオチドの最大５％まで複数のヌクレオチドが参照配列に挿入されてよい。参照配列のこのような変更は、参照ヌクレオチド配列の５’又は３’末端の位置で、又はこれら末端の間の何れかで、参照配列に含まれる残基中において個々に散在して、又は参照配列内部の一又は複数の連続する群において、発生してよい。特定の事項として、何れか特定のポリヌクレオチド配列が、本発明のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるかどうかは、ポリペプチドについて上述したもの（例えばＡＬＩＧＮ－２）などの既知のコンピュータープログラムを用いて常套的に決定することができる。
用語「発現カセット」は、組換えにより又は合成により、標的細胞内の一連の特定の核酸の転写を許可する特定の核酸要素を用いて生成されたポリヌクレオチドを指す。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス、又は核酸断片中に取り込むことができる。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分には、他の配列の中でも、転写される核酸配列及びプロモーターが含まれる。特定の実施態様では、本発明の発現カセットは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む。
用語「ベクター」又は「発現ベクター」は、「発現コンストラクト」と同義であり、標的細胞内においてそれが作用可能に結合する特定の遺伝子の発現を導入及び方向付けするために使用されるＤＮＡ分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。本発明の発現ベクターは、発現カセットを含む。発現ベクターは、大量の安定なｍＲＮＡの転写を可能にする。発現ベクターが標的細胞内部に入ると、遺伝子によってコードされるリボ核酸分子又はタンパク質が、細胞転写及び／又は翻訳機械により生成される。一実施態様では、本発明の発現ベクターは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む発現カセットを含む。
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養」は、互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、それには、継代の数に関係なく、それに由来する初代形質転換細胞及び子孫が含まれる。子孫は親細胞と核酸含量が完全に同一ではないかもしれないが、突然変異が含まれる場合がある。本明細書には、最初に形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異型子孫が本含まれる。宿主細胞は、本発明の二重特異性抗原結合分子を生成するために使用することができる何れかの種類の細胞系である。宿主細胞は、培養細胞、例えば幾つか例を挙げると、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、又はハイブリドーマ細胞といった哺乳動物の培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、及び植物細胞を含み、更には、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物、又は培養された植物若しくは動物組織内部に含まれる細胞も含む。
「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃドメインの結合に続いて、エフェクター機能を実行するように受容体保有細胞を刺激するシグナル伝達現象を生じさせるＦｃ受容体である。ヒト活性化Ｆｃ受容体には、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）、及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）が含まれる。
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、免疫エフェクター細胞により抗体で被覆された標的細胞の溶解を招く免疫機構である。標的細胞は、Ｆｃ領域を含む抗体又はその誘導体が通常Ｆｃ領域に対するＮ末端であるタンパク質部分を介して特異的に結合する細胞である。本明細書で使用される用語「ＡＤＣＣの低下」は、標的細胞を囲む媒質中の所定の抗体濃度において、上記に定義したＡＤＣＣの機構により所定の時間内に溶解する標的細胞の数、及び／又は、ＡＤＣＣの機構により所定の時間内に所定の数の標的細胞を溶解させるために必要な、標的細胞を囲む媒質中の抗体濃度の上昇の何れかと定義される。ＡＤＣＣの低下は、同じ標準的な生成、精製、製剤化、及び貯蔵方法（当業者に既知の）を用いて、但し改変されていない、同じ型の宿主細胞により生成される同じ抗体により媒介されるＡＤＣＣと相対的なものである。例えば、そのＦｃドメインにＡＤＣＣを低下させるアミノ酸置換を含む抗体により媒介されるＡＤＣＣの低下は、このアミノ酸置換をＦｃドメインに含まない同じ抗体によって媒介されるＡＤＣＣと比較される。ＡＤＣＣを測定するための適切なアッセイは、当該技術分野でよく知られている（例えば、国際公開第２００６／０８２５１５号又は同第２０１２／１３０８３１号参照）。
「有効量の」薬剤は、それが投与される細胞又は組織中に生理的変化をもたらすために必要な量を指す。
薬剤、例えば、薬学的組成物の「治療的有効量」とは、所望の治療的又予防的結果を達成するために必要な用量及び期間での、有効な量を指す。治療的有効量の薬剤は、疾患の有害作用を、例えば、排除する、低下させる、遅延させる、最小化する、又は防止する。
「個体」又は「対象」とは、哺乳動物である。哺乳動物には、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）が含まれる。特に、個体又は対象はヒトである。
用語「薬学的組成物」は、その中に有効で含有される活性成分の生物学的活性を許容するような形態であって、製剤が投与される対象にとって許容できない毒性を有する他の成分を含まない調製物を指す。
「薬学的に許容される担体」は、対象に非毒性である、有効成分以外の薬学的組成物の成分を指す。薬学的に許容される担体には、限定されないが、緩衝剤、賦形剤、安定剤、又は保存剤が含まれる。
本明細書で用いられる場合、「治療」（及び「治療する（ｔｒｅａｔ）」又は「治療している（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」など文法上の変形）は、治療されている個体の疾患の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理の過程において実行できる。治療の望ましい効果には、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮小、転移を予防すること、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善が含まれる。幾つかの実施態様では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、疾患の発症を遅延させるか又は疾患の進行を遅らせるために使用される。
用語「アンタゴニスト」は最も広い意味で使用され、本明細書に開示される天然ポリペプチドの生物学的活性を部分的に又は完全に遮断、阻害、又は中和する任意の分子を含む。同様に用語「アゴニスト」は最も広い意味で使用され、本明細書に開示される天然ポリペプチドの生物学的活性を誘導する任意の分子を含む。適切なアゴニスト分子又はアンタゴニスト分子は、具体的には、アゴニスト又はアンタゴニスト抗体又は抗体断片を含み、改変された抗体断片、天然ポリペプチドの断片又はアミノ酸配列変異体、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、有機低分子などが含まれる。ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを同定するための方法は、ポリペプチドを候補アゴニスト又はアンタゴニスト分子と接触させること、及び通常ポリペプチドに関連付けられる一又は複数の生物活性の検出可能な変化を測定することを含む。
「添付文書」という用語は、治療製品の商品包装に通例含まれる説明書を指すのに用いられ、適応症、用法、用量、投与、併用療法、当該治療製品の使用に関する禁忌及び／又は注意事項についての情報を含む。
本明細書中に開示される全ての参考文献、刊行物、特許及び特許出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
実施態様の詳細な記述
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は二重特異性であり、すなわち二つの異なる抗原決定基に、すなわちＣＤ３及びＦｏｌＲ１に特異的に結合することができる少なくとも二つの抗原結合部分を含む。本発明によれば、抗原結合部分はＦａｂ分子（すなわち、各々が可変及び定常領域を含む重鎖と軽鎖とからなる抗原結合ドメイン）である。一実施態様では、前記Ｆａｂ分子はヒトである。別の実施態様では、前記Ｆａｂ分子はヒト化されている。また別の実施態様では、前記Ｆａｂ分子はヒト重鎖及び軽鎖定常領域を含む。
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原ＦｏｌＲ１及びＣＤ３に同時に結合することができる。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原ＦｏｌＲ１とＣＤ３に同時結合することにより、Ｔ細胞とＦｏｌＲ１発現標的細胞を架橋することができる。更に特定の実施態様では、このような同時結合は、ＦｏｌＲ１発現標的細胞、特にＦｏｌＲ１発現腫瘍細胞の溶解を引き起こす。一実施態様では、このような同時結合は、Ｔ細胞の活性化を引き起こす。他の実施態様では、このような同時結合は、活性化マーカーの増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子放出、細胞傷害性活性化、及び発現から選択される、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の細胞応答を引き起こす。一実施態様では、標的細胞抗原ＦｏｌＲ１への同時結合を含まないＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＣＤ３に対する結合は、Ｔ細胞の活性化を引き起こさない。
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Ｔ細胞の細胞傷害性活性をＦｏｌＲ１発現標的細胞へと再指向することができる。特定の実施態様では、前記再指向は、標的細胞によるＭＨＣ媒介性ペプチド抗原の提示及び／又はＴ細胞の特異性と無関係である。
特に、本発明の実施態様の幾つかによるＴ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞である。幾つかの実施態様では、Ｔ細胞はＣＤ４＋又はＣＤ８＋ Ｔ細胞、特にＣＤ８＋ Ｔ細胞である。
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ＣＤ３に結合することができる少なくとも一つの抗原結合部分（本明細書では「ＣＤ３抗原結合部分」又は「第１の抗原結合部分」とも呼ぶ）を含む。特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、最大で一つの、ＣＤ３に特異的に結合することができる抗原結合部分を含む。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ＣＤ３に対する一価の結合を提供する。特定の実施態様では、ＣＤ３はヒトＣＤ３又はカニクイザルＣＤ３、最も具体的にはヒトＣＤ３である。特定の実施態様では、ＣＤ３抗原結合部分は、ヒト及びカニクイザルのＣＤ３に交差反応性である（すなわち、特異的に結合する）。幾つかの実施態様において、第１の抗原結合部分は、ＣＤ３のイプシロンサブユニットに特異的に結合することができる（ヒト配列についてはＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ０７７６６（バージョン１３０）、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ番号ＮＰ＿０００７２４．１、配列番号１５０；カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）配列についてはＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｑ９５ＬＩ５（バージョン４９）、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ番号ＢＡＢ７１８４９．１を参照）。
幾つかの実施態様において、ＣＤ３抗原結合部分は、配列番号３７、配列番号３８及び配列番号３９からなる群より選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４の群より選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲとを含む。
一実施態様において、ＣＤ３抗原結合部分は、配列番号３７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３８の重鎖ＣＤＲ２、配列番号３９の重鎖ＣＤＲ３、配列番号３２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３３の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３４の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
一実施態様において、ＣＤ３抗原結合部分は、配列番号３６のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む。
一実施態様において、ＣＤ３抗原結合部分は、配列番号３６と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号３１と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列とを含んでいる。
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原ＦｏｌＲ１に結合することができる少なくとも一つの抗原結合部分（本明細書では「ＦｏｌＲ１結合部分」又は「第２の」又は「第３の」抗原結合部分とも呼ぶ）を含む。一実施態様において、標的細胞抗原ＦｏｌＲ１に結合することができる抗原結合部分は、ＦｏｌＲ２又はＦｏｌＲ３に結合しない。特定の実施態様では、ＦｏｌＲ１抗原結合部分は、ヒト及びカニクイザルのＦｏｌＲ１に交差反応性である（すなわち、特異的に結合する）。特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原ＦｏｌＲ１に結合することができる二つの抗原結合部分を含む。特定のそのような実施態様では、これら抗原結合部分の各々は、同じ抗原決定基に特異的に結合する。更に特定の実施態様では、これら抗原結合部分の全ては同一である。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ＦｏｌＲ１に結合することができる最大で二つの抗原結合部分を含む。
ＦｏｌＲ１結合部分は、一般に、ＦｏｌＲ１に特異的に結合するＦａｂ分子であり、それが連結されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を標的部位に、例えばＦｏｌＲ１を発現する特定の型の腫瘍細胞に指向することができる。
一態様において、本発明は、
（ｉ）ＣＤ３に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第１の抗原結合部分であって、配列番号３７、配列番号３８及び配列番号３９からなる群より選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４からなる群より選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲとを含む第１の抗原結合部分；並びに
（ｉｉ）葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第２の抗原結合部分
を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
一実施態様において、ＣＤ３に特異的に結合することができるＦａｂ分子である抗原結合部分は、配列番号３６のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む。
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、
（ｉｉｉ）ＦｏｌＲ１に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第３の抗原結合部分
を更に含む。
一つのそのような実施態様において、ＦｏｌＲ１に特異的に結合することができる第２及び第３の抗原結合部分は、同一の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）及び軽鎖ＣＤＲ配列を含む。一つのそのような実施態様において、第３の抗原結合部分は第２の抗原結合部分と同一である。
一実施態様において、上記実施態様の何れかのＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、安定した会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを更に含む。
一実施態様において、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分は、それぞれ、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、Ｆｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合される。
一実施態様において、第３の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に、任意選択的にペプチドリンカーを介して融合される。
更なる特定の実施態様では、ＣＤ３に特異的に結合することができる一を超えない抗原結合部分がＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子中に存在する（すなわち、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子はＣＤ３に対する一価の結合を提供する）。
共通の軽鎖を有するＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子
本発明者らは、結合部分がＣＤ３に対する親単一特異性抗体の特異性及び有効性を保持し、かつ同じ軽鎖を用いて第２の抗原（例えば、ＦｏｌＲ１）に結合することができる共通の軽鎖を共有する二重特異性抗体を作製した。親抗体の結合特性を保持する共通の軽鎖を有する二重特異性分子の生成は、ハイブリッド軽鎖の共通のＣＤＲが両方の標的の結合特異性を達成しなければならないために容易ではない。一態様において、本発明は、第１及び第２の抗原結合部分を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供し、その１つはＣＤ３に特異的に結合することができるＦａｂ分子であり、他の１つは、ＦｏｌＲ１に特異的に結合することができるＦａｂ分子であり、ここで第１及び第２のＦａｂ分子は同一のＶＬＣＬ軽鎖を有する。一実施態様において、前記同一の軽鎖（ＶＬＣＬ）は、配列番号３２、配列番号３３及び配列番号３４の軽鎖ＣＤＲを含む。一実施態様において、前記同一の軽鎖（ＶＬＣＬ）は配列番号３５を含む。
一実施態様では、本発明は、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供し、この分子は、
（ｉ）ＣＤ３に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第１の抗原結合部分であって、配列番号３７、配列番号３８及び配列番号３９からなる群より選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４からなる群より選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲとを含む第１の抗原結合部分；
（ｉｉ）葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第２の抗原結合部分であって、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８からなる群より選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４からなる群より選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲとを含む第２の抗原結合部分
を含む。
１つのそのような実施態様において、ＣＤ３抗原結合部分は、配列番号３７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３８の重鎖ＣＤＲ２、配列番号３９の重鎖ＣＤＲ３、配列番号３２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３３の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３４の軽鎖ＣＤＲ３を含み、ＦｏｌＲ１抗原結合部分は、配列番号１６の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１７の重鎖ＣＤＲ２、配列番号１８の重鎖ＣＤＲ３、配列番号３２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３３の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３４の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
一実施態様では、本発明は、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供し、この分子は、
（ｉ）配列番号３６のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、ＣＤ３に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第１の抗原結合部分；
（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第２の抗原結合部分
を含む。
一実施態様では、本発明は、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供し、この分子は、
（ｉ）ＣＤ３に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第１の抗原結合部分であって、配列番号３７、配列番号３８及び配列番号３９からなる群より選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４からなる群より選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲとを含む第１の抗原結合部分；
（ｉｉ）葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第２の抗原結合部分であって、配列番号１６、配列番号２７５及び配列番号３１５からなる群より選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４からなる群より選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲとを含む第２の抗原結合部分
を含む。
一実施態様では、本発明は、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供し、この分子は、
（ｉ）ＣＤ３に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第１の抗原結合部分であって、配列番号３７、配列番号３８及び配列番号３９の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列とを含む第１の抗原結合部分；
（ｉｉ）葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第２の抗原結合部分であって、配列番号１６、配列番号２７５及び配列番号３１５の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列とを含む第２の抗原結合部分
を含む。
一実施態様では、本発明は、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供し、この分子は、
（ｉ）配列番号３６のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、ＣＤ３に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第１の抗原結合部分；
（ｉｉ）配列番号２７４のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第２の抗原結合部分
を含む。
一実施態様では、本発明は、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供し、この分子は、
（ｉ）配列番号３６のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、ＣＤ３に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第１の抗原結合部分；
（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第２の抗原結合部分
を含む。
更なる実施態様では、ＦｏｌＲ１に特異的な抗原結合部分は、配列番号１５と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列、及び配列番号３１と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列、又は機能性を保持するその変異体を含んでいる。
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号３６と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、配列番号１５と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、及び配列番号３１と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列を含む。
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、
（ｉｉｉ）ＦｏｌＲ１に特異的に結合することができる（Ｆａｂ分子である）第３の抗原結合部分
を更に含む。
一つのそのような実施態様において、ＦｏｌＲ１に特異的に結合することができる第２及び第３の抗原結合部分は、同一の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）及び軽鎖ＣＤＲ配列を含む。一つのそのような実施態様において、第３の抗原結合部分は第２の抗原結合部分と同一である。
従って、一実施態様では、本発明は、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供し、この分子は、
（ｉ）ＣＤ３に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第１の抗原結合部分であって、配列番号３７、配列番号３８及び配列番号３９からなる群より選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４からなる群より選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲとを含む第１の抗原結合部分；
（ｉｉ）葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第２の抗原結合部分であって、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８からなる群より選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４からなる群より選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲとを含む第２の抗原結合部分；
（ｉｉｉ）葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第３の抗原結合部分であって、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８からなる群より選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４からなる群より選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲとを含む第３の抗原結合部分
を含む。
１つのそのような実施態様において、ＣＤ３抗原結合部分は、配列番号３７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３８の重鎖ＣＤＲ２、配列番号３９の重鎖ＣＤＲ３、配列番号３２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３３の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３４の軽鎖ＣＤＲ３を含み、ＦｏｌＲ１抗原結合部分は、配列番号１６の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１７の重鎖ＣＤＲ２、配列番号１８の重鎖ＣＤＲ３、配列番号３２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３３の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３４の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
一実施態様では、本発明は、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供し、この分子は、
（ｉ）配列番号３６のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、ＣＤ３に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第１の抗原結合部分；
（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第２の抗原結合部分；
（ｉｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第３の抗原結合部分
を含む。
従って、一実施態様では、本発明は、少なくとも２つの結合部分が、それぞれ同一の軽鎖とＴ細胞活性化抗原ＣＤ３及び標的細胞抗原ＦｏｌＲ１への特異的結合を与える対応する再構築された重鎖とを有する二重特異性分子に関する。このいわゆる「共通軽鎖」の原理の使用、すなわち１つの軽鎖を共有するが別個の特異性を有する２つの結合剤を組み合わせることは、軽鎖の誤対合を防止する。従って、生成の間に副生成物が少なくなり、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の均一な調製を容易にする。
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の成分は、様々な構造で互いに融合することができる。例示的な構造が図１Ａ－Ｉに示され、以下で更に説明される。
幾つかの実施態様では、前記Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、安定した会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを更に含む。以下に、Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の例示的な実施態様を記載する。
クロスオーバーＦａｂ断片を有するＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子
本発明の発明者らは、結合部分の１つがクロスオーバーＦａｂ断片である第２の二重特異性抗体フォーマットを生成した。本発明の一態様では、ＩｇＧ分子のＦａｂ断片の１つがクロスオーバーＦａｂ断片によって置換された一価の二重特異性抗体が提供される。クロスオーバーＦａｂ断片は、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域の何れかが交換されるＦａｂ断片である。クロスオーバーＦａｂ断片を含む二重特異性抗体フォーマットは、例えば、国際公開第２００９０８０２５２号、国際公開第２００９０８０２５３号、国際公開第２００９０８０２５１号、国際公開第２００９０８０２５４号、国際公開第２０１０／１３６１７２号、国際公開第２０１０／１４５７９２及び国際公開第２０１３／０２６８３号に記載されている。特定の実施態様では、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変領域又は定常領域の何れかが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子である。このような修飾は、異なるＦａｂ分子由来の重鎖と軽鎖との誤対合を防ぎ、それにより組換え生成において本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の収率及び純度を向上させる。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に有用な特定のクロスオーバーＦａｂ分子では、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変領域が交換されている。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に有用な別のクロスオーバーＦａｂ分子では、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の定常領域が交換されている。
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、
（ｉ）ＣＤ３に特異的に結合することができるクロスオーバーＦａｂ分子である第１の抗原結合部分であって、配列番号３７、配列番号３８及び配列番号３９からなる群より選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４からなる群より選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲとを含む第１の抗原結合部分；
（ｉｉ）葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的に結合することができる第２の抗原結合部分であって、配列番号８、配列番号５６及び配列番号５７からなる群より選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６５からなる群より選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲとを含む第２の抗原結合部分
を含む。
１つのそのような実施態様において、ＣＤ３抗原結合部分は、配列番号３７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３８の重鎖ＣＤＲ２、配列番号３９の重鎖ＣＤＲ３、配列番号３２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３３の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３４の軽鎖ＣＤＲ３を含み、ＦｏｌＲ１抗原結合部分は、配列番号８の重鎖ＣＤＲ１、配列番号５６の重鎖ＣＤＲ２、配列番号５７の重鎖ＣＤＲ３、配列番号５９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６５の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
一実施態様では、第２の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である。
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、
（ｉ）配列番号３６のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、ＣＤ３に特異的に結合することができるクロスオーバーＦａｂ分子である第１の抗原結合部分；
（ｉｉ）配列番号５５のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号６４のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第２の抗原結合部分
を含む。
一実施態様では、第２の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である。
更なる実施態様では、ＦｏｌＲ１に特異的な抗原結合部分は、配列番号５５と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列、及び配列番号６４と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列、又は機能性を保持するその変異体を含んでいる。
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号３６と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、配列番号３１と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、配列番号５５と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、及び配列番号６４と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列を含む。
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、
（ｉｉｉ）ＦｏｌＲ１に特異的に結合することができる第３の抗原結合部分
を含む。
一実施態様では、第３の抗原結合部分は、一般的なＦａｂ分子である。一実施態様では、第３の抗原結合部分は、クロスオーバーＦａｂ分子である。
一つのそのような実施態様において、ＦｏｌＲ１に特異的に結合することができる第２及び第３の抗原結合部分は、同一の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）及び軽鎖ＣＤＲ配列を含む。一つのそのような実施態様において、第３の抗原結合部分は第２の抗原結合部分と同一である。
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、
（ｉ）ＣＤ３に特異的に結合することができるクロスオーバーＦａｂ分子である第１の抗原結合部分であって、配列番号３７、配列番号３８及び配列番号３９からなる群より選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４からなる群より選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲとを含む第１の抗原結合部分；
（ｉｉ）葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的に結合することができる第２の抗原結合部分であって、配列番号８、配列番号５６及び配列番号５７からなる群より選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６５からなる群より選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲとを含む第２の抗原結合部分；
（ｉｉｉ）葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的に結合することができる第３の抗原結合部分であって、配列番号８、配列番号５６及び配列番号５７からなる群より選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６５からなる群より選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲとを含む第３の抗原結合部分
を含む。
１つのそのような実施態様において、ＣＤ３抗原結合部分は、配列番号３７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３８の重鎖ＣＤＲ２、配列番号３９の重鎖ＣＤＲ３、配列番号３２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３３の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３４の軽鎖ＣＤＲ３を含み、ＦｏｌＲ１抗原結合部分は、配列番号８の重鎖ＣＤＲ１、配列番号５６の重鎖ＣＤＲ２、配列番号５７の重鎖ＣＤＲ３、配列番号５９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６５の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
一実施態様において、第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分は両方とも従来のＦａｂ分子である。
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、
（ｉ）配列番号３６のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、ＣＤ３に特異的に結合することができるクロスオーバーＦａｂ分子である第１の抗原結合部分；
（ｉｉ）配列番号５５のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号６４のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第２の抗原結合部分；
（ｉｉｉ）配列番号５５のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号６４のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第３の抗原結合部分
を含む。
一実施態様において、第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分は両方とも従来のＦａｂ分子である。
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、
（ｉ）ＣＤ３に特異的に結合することができるクロスオーバーＦａｂ分子である第１の抗原結合部分であって、配列番号３７、配列番号３８及び配列番号３９からなる群より選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４からなる群より選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲとを含む第１の抗原結合部分；
（ｉｉ）葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的に結合することができる第２の抗原結合部分であって、配列番号８、配列番号９及び配列番号５０からなる群より選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４からなる群より選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲとを含む第２の抗原結合部分
を含む。
１つのそのような実施態様において、ＣＤ３抗原結合部分は、配列番号３７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３８の重鎖ＣＤＲ２、配列番号３９の重鎖ＣＤＲ３、配列番号３２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３３の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３４の軽鎖ＣＤＲ３を含み、ＦｏｌＲ１抗原結合部分は、配列番号８の重鎖ＣＤＲ１、配列番号９の重鎖ＣＤＲ２、配列番号５０の重鎖ＣＤＲ３、配列番号５２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５３の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５４の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
一実施態様では、第２の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である。一実施態様では、第２の抗原結合部分は、クロスオーバーＦａｂ分子である。
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、
（ｉ）配列番号３６のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、ＣＤ３に特異的に結合することができるクロスオーバーＦａｂ分子である第１の抗原結合部分；
（ｉｉ）配列番号４９のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号５１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第２の抗原結合部分
を含む。
一実施態様では、第２の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である。一実施態様では、第２の抗原結合部分は、クロスオーバーＦａｂ分子である。
更なる実施態様では、ＦｏｌＲ１に特異的な抗原結合部分は、配列番号４９と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列、及び配列番号５１と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列、又は機能性を保持するその変異体を含んでいる。
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号３６と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、配列番号３１と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、配列番号４９と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、及び配列番号５１と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列を含む。
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、
（ｉｉｉ）ＦｏｌＲ１に特異的に結合することができる第３の抗原結合部分
を含む。
一実施態様では、第３の抗原結合部分は、一般的なＦａｂ分子である。一実施態様では、第２の抗原結合部分は、クロスオーバーＦａｂ分子である。
一つのそのような実施態様において、ＦｏｌＲ１に特異的に結合することができる第２及び第３の抗原結合部分は、同一の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）及び軽鎖ＣＤＲ配列を含む。一つのそのような実施態様において、第３の抗原結合部分は第２の抗原結合部分と同一である。
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、
（ｉ）ＣＤ３に特異的に結合することができるクロスオーバーＦａｂ分子である第１の抗原結合部分であって、配列番号３７、配列番号３８及び配列番号３９からなる群より選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４からなる群より選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲとを含む第１の抗原結合部分；
（ｉｉ）葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的に結合することができる第２の抗原結合部分であって、配列番号８、配列番号９及び配列番号４９からなる群より選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４からなる群より選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲとを含む第２の抗原結合部分；
（ｉｉｉ）葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的に結合することができる第３の抗原結合部分であって、配列番号８、配列番号９及び配列番号５０からなる群より選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４からなる群より選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲとを含む第３の抗原結合部分
を含む。
１つのそのような実施態様において、ＣＤ３抗原結合部分は、配列番号３７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３８の重鎖ＣＤＲ２、配列番号３９の重鎖ＣＤＲ３、配列番号３２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３３の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３４の軽鎖ＣＤＲ３を含み、ＦｏｌＲ１抗原結合部分は、配列番号８の重鎖ＣＤＲ１、配列番号９の重鎖ＣＤＲ２、配列番号５０の重鎖ＣＤＲ３、配列番号５２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５３の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５４の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
一実施態様において、第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分は両方とも従来のＦａｂ分子である。
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、
（ｉ）配列番号３６のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、ＣＤ３に特異的に結合することができるクロスオーバーＦａｂ分子である第１の抗原結合部分；
（ｉｉ）配列番号４９のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号５１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第２の抗原結合部分；
（ｉｉｉ）配列番号４９のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号５１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第３の抗原結合部分
を含む。
一実施態様において、第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分は両方とも従来のＦａｂ分子である。
従って、一実施態様において、本発明は、２つの結合部分がＦｏｌＲ１への特異的結合を付与し、１つの結合部分がＴ細胞活性化抗原ＣＤ３に特異性を付与する二重特異性分子に関する。重鎖の１つは、重鎖と軽鎖の適切な対合を確実にするように改変され、共通の軽鎖のアプローチの必要性を排除する。２つのＦｏｌＲ１結合部位の存在は、標的抗原ＦｏｌＲ１との適切な結合及びＴ細胞の活性化を可能にする。
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の成分は、様々な構造で互いに融合することができる。例示的な構造が図１Ａ－Ｉに示され、以下で更に説明される。
幾つかの実施態様では、前記Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、安定した会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを更に含む。以下に、Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の例示的な実施態様を記載する。
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のフォーマット
上記及び図１Ａ－Ｉに示すように、一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、同一の軽鎖（ＶＬＣＬ）を有し、２つの異なる抗原に対する特異性を付与する異なる重鎖（ＶＨＣＬ）を有する少なくとも２つのＦａｂ断片を含み、すなわち１つのＦａｂ断片はＴ細胞活性化抗原ＣＤ３に特異的に結合することができ、他のＦａｂ断片は標的細胞抗原ＦｏｌＲ１に特異的に結合することができる。
別の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、少なくとも２つの抗原結合部分（Ｆａｂ分子）を含み、その１つはクロスオーバーＦａｂ分子であり、その１つは従来のＦａｂ分子である。このような一実施態様では、ＣＤ３に特異的に結合することができる第１の抗原結合部分はクロスオーバーＦａｂ分子であり、ＦｏｌＲに特異的に結合することができる第２の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である。
これらのＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の成分は、様々な構造で互いに融合することができる。例示的構造を図１Ａ－Ｉに示す。
幾つかの実施態様では、第１及び第２の抗原結合部分は、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。特定のそのような実施態様では、Ｔ細胞を活性化する二重特異性抗原結合分子は、第１及び第２の抗原結合部分、第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン、及び任意選択的に一又は複数のペプチドリンカーから本質的になり、ここで第１及び第２の抗原結合部分はそれぞれ、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。１つのそのような実施態様では、第１及び第２の抗原結合部分は両方ともＦａｂ断片であり、同一の軽鎖（ＶＬＣＬ）を有する。別のそのような実施態様では、ＣＤ３に特異的に結合することができる第１の抗原結合部分はクロスオーバーＦａｂ分子であり、ＦｏｌＲに特異的に結合することができる第２の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である。
一実施態様では、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合しており、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。特定のそのような実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第１及び第２の抗原結合部分、第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン、並びに任意選択的に一又は複数のペプチドリンカーから本質的になり、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。１つのそのような実施態様では、第１及び第２の抗原結合部分は両方ともＦａｂ断片であり、同一の軽鎖（ＶＬＣＬ）を有する。別のそのような実施態様では、ＣＤ３に特異的に結合することができる第１の抗原結合部分はクロスオーバーＦａｂ分子であり、ＦｏｌＲに特異的に結合することができる第２の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である。任意選択的に、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖と第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖とは、更に互いに融合していてよい。
他の実施態様では、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。このような特定の一実施態様では、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。特定のそのような実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第１及び第２の抗原結合部分、第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン、並びに任意選択的に一又は複数のペプチドリンカーから本質的になり、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。１つのそのような実施態様では、第１及び第２の抗原結合部分は両方ともＦａｂ断片であり、同一の軽鎖（ＶＬＣＬ）を有する。別のそのような実施態様では、ＣＤ３に特異的に結合することができる第１の抗原結合部分はクロスオーバーＦａｂ分子であり、ＦｏｌＲに特異的に結合することができる第２の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である。任意選択的に、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖と第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖とは、更に互いに融合していてよい。
抗原結合部分は、Ｆｃドメインに対して、又は互いに、直接又はペプチドリンカーを介して融合していてよく、一又は複数のアミノ酸、典型的には約２～２０のアミノ酸を含む。ペプチドリンカーは当分野において既知であり、本明細書において記載される。適切な非免疫原性ペプチドリンカーには、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ（配列番号３００）、（ＳＧ４）ｎ（配列番号３０１）、（Ｇ４Ｓ）ｎ（配列番号３００）又はＧ４（ＳＧ４）ｎ（配列番号３０２）ペプチドリンカーが含まれる。「ｎ」は、通常は１～１０、典型的には２～４の数である。第１及び第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖を互いに融合させるための特定の適切なペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）２（配列番号３０３）である。第１及び第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖を連結するために適した例示的ペプチドリンカーはＥＰＫＳＣ（Ｄ）－（Ｇ４Ｓ）２（配列番号３０４及び３０５）である。加えて、リンカーは免疫グロブリンヒンジ領域（の一部）を含むことができる。特に抗原結合部分がＦｃドメインのサブユニットのＮ末端に融合している場合には、免疫グロブリンヒンジ領域又はその一部を介して、追加のペプチドリンカーを用いて又は用いずに、融合することができる。
本発明の発明者らによって、標的細胞抗原ＦｏｌＲに特異的な２つの結合部分を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原ＦｏｌＲに特異的な１つの結合部分のみを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子と比較して優れた特徴を有することが見いだされている。
従って、特定の実施態様では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ＦｏｌＲに特異的に結合することができる第３の抗原結合部分を更に含む。一つのそのような実施態様において、ＦｏｌＲ１に特異的に結合することができる第２及び第３の抗原結合部分は、同一の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）及び軽鎖ＣＤＲ配列を含む。一つのそのような実施態様において、第３の抗原結合部分は第２の抗原結合部分と同一である（すなわち、それらは同じアミノ酸配列を含む）。
一実施態様では、第１及び第２の抗原結合部分はそれぞれ、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合しており、第３の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。特定のそのような実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第１、第２及び第３の抗原結合部分、第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン、並びに任意選択的に一又は複数のペプチドリンカーから本質的になり、第１及び第２の抗原結合部分はそれぞれ、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しており、第３の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。１つのそのような実施態様では、第１、第２及び第３の抗原結合部分は従来のＦａｂ断片であり、同一の軽鎖（ＶＬＣＬ）を有する。別のそのような実施態様では、ＣＤ３に特異的に結合することができる第１の抗原結合部分はクロスオーバーＦａｂ分子であり、ＦｏｌＲに特異的に結合することができる第２及び第３の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である。任意選択的に、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖と第３の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖とは、更に互いに融合していてよい。
従って、ある実施態様では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第１、第２及び第３の抗原結合部分を形成する５つのポリペプチド鎖を含み、第１の抗原結合部分はＣＤ３に結合することができ、第２及び第３の抗原結合部分はそれぞれ葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に結合することができる。第１及び第２のポリペプチド鎖は、アミノ（Ｎ）末端からカルボキシル（Ｃ）末端方向に第１の軽鎖可変ドメイン（ＶＬＤ１）及び第１の軽鎖定常ドメイン（ＣＬＤ１）を含む。第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端方向に第２の軽鎖可変ドメイン（ＶＬＤ２）及び第２の重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１Ｄ２）を含む。第４のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端方向に第１の重鎖可変ドメイン（ＶＨＤ１）、第１の重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１Ｄ１）、第１の重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２Ｄ１）及び第１の重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３Ｄ１）を含む。第５のポリペプチド鎖は、ＶＨＤ１、ＣＨ１Ｄ１、第２の重鎖可変ドメイン（ＶＨＤ２）、第２の軽鎖定常ドメイン（ＣＬＤ２）、第２の重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２Ｄ２）及び第２の重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３Ｄ２）を含む。第３のポリペプチド鎖及び第５のポリペプチド鎖のＶＨＤ２及びＣＬＤ２は、ＣＤ３に結合することができる第１の抗原結合部分を形成する。第２のポリペプチド鎖及び第５のポリペプチド鎖のＶＨＤ１及びＣＨ１Ｄ１は、ＦｏｌＲ１に結合することができる第３の結合部分を形成する。第１のポリペプチド鎖及び第４のポリペプチド鎖のＶＨＤ１及びＣＨ１Ｄ１は、ＦｏｌＲ１に結合することができる第２の結合部分を形成する。
別の実施態様では、第２及び第３の抗原結合部分はそれぞれ、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合しており、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。特定のそのような実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第１、第２及び第３の抗原結合部分、第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン、並びに任意選択的に一又は複数のペプチドリンカーから本質的になり、第２及び第３の抗原結合部分はそれぞれ、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しており、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において第３の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。１つのそのような実施態様では、第１、第２及び第３の抗原結合部分は従来のＦａｂ断片であり、同一の軽鎖（ＶＬＣＬ）を有する。別のそのような実施態様では、ＣＤ３に特異的に結合することができる第１の抗原結合部分はクロスオーバーＦａｂ分子であり、ＦｏｌＲに特異的に結合することができる第２及び第３の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である。任意選択的に、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖と第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖とは、更に互いに融合していてよい。
抗原結合部分は、直接又はペプチドリンカーを介してＦｃドメインに融合することができる。特定の実施態様では、抗原結合部分はそれぞれ、免疫グロブリンヒンジ領域を介してＦｃドメインに融合している。特定の実施態様では、免疫グロブリンヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。
一実施態様では、第１及び第２の抗原結合部分及びＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の一部である。特定の実施態様では、免疫グロブリン分子はＩｇＧクラスの免疫グロブリンである。更に特定の実施態様では、免疫グロブリンはＩｇＧ１サブクラスの免疫グロブリンである。別の実施態様では、免疫グロブリンはＩｇＧ４サブクラスの免疫グロブリンである。更に特定の実施態様では、免疫グロブリンはヒト免疫グロブリンである。他の実施態様では、免疫グロブリンは、キメラ免疫グロブリン又はヒト化免疫グロブリンである。
前記Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の特定の実施態様において、第１及び第２の抗原結合部分及びＦｃドメインは免疫グロブリン分子の一部であり、第３の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第１、第２及び第３の抗原結合部分は、従来のＦａｂ断片であり、同一の軽鎖（ＶＬＣＬ）を有し、ここで、ＣＤ３に特異的に結合することができる第１の抗原結合部分は、配列番号３７、配列番号３８及び配列番号３９からなる群から選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）、及び配列番号３２、配列番号３３及び配列番号３４の群から選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲを含み；ＦｏｌＲ１に特異的に結合することができる第２及び第３の抗原結合部分は、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８からなる群から選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）、及び配列番号３２、配列番号３３及び配列番号３４の群から選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲを含む。
前記Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の特定の実施態様において、第１及び第２の抗原結合部分及びＦｃドメインは免疫グロブリン分子の一部であり、第３の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第１、第２及び第３の抗原結合部分は、従来のＦａｂ断片であり、同一の軽鎖（ＶＬＣＬ）を有し、ここで、ＣＤ３に特異的に結合することができる第１の抗原結合部分は、配列番号３６の配列を含む可変重鎖、配列番号３１の配列を含む可変軽鎖を含み；ＦｏｌＲ１に特異的に結合することができる第２及び第３の抗原結合部分は、配列番号１５の配列を含む可変重鎖、配列番号３１の配列を含む可変軽鎖を含む。
前記Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の特定の実施態様において、第１及び第２の抗原結合部分及びＦｃドメインは免疫グロブリン分子の一部であり、第３の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ＣＤ３に特異的に結合することができる第１の抗原結合部分はクロスオーバーＦａｂ分子であり、ここではＦａｂ軽鎖の可変又は定常領域の何れかが交換されており、配列番号３７、配列番号３８及び配列番号３９からなる群から選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）、及び配列番号３２、配列番号３３及び配列番号３４の群から選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲを含み；ＦｏｌＲ１に特異的に結合することができる第２及び第３の抗原結合部分は、配列番号８、配列番号５６及び配列番号５７からなる群から選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）、及び配列番号５９、配列番号６０及び配列番号６５の群から選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲを含む。
前記Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の特定の実施態様において、第１及び第２の抗原結合部分及びＦｃドメインは免疫グロブリン分子の一部であり、第３の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ＣＤ３に特異的に結合することができる第１の抗原結合部分はクロスオーバーＦａｂ分子であり、ここではＦａｂ軽鎖の可変又は定常領域の何れかが交換されており、ここで、ＣＤ３に特異的に結合することができる第１の抗原結合部分は、配列番号３６の配列を含む可変重鎖、配列番号３１の配列を含む可変軽鎖を含み；ＦｏｌＲ１に特異的に結合することができる第２及び第３の抗原結合部分は、配列番号５５の配列を含む可変重鎖、配列番号６５の配列を含む可変軽鎖を含む。
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、各抗原に対して一価である。特定の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ヒトＣＤ３及びヒト葉酸受容体アルファ（ＦｏｌＲ１）に結合することができ、ノブ・イントゥー・ホール技術のようなヘテロ二量体化手法を使用せずに作製された。例えば、分子は、共通の軽鎖ライブラリー及びＣｒｏｓｓＭａｂ技術を使用することによって生成され得る。特定の実施態様において、ＣＤ３結合剤の可変領域は、標準的なヒトＩｇＧ１抗体のＣＨ１ドメインに融合されて、両方の特異性に共通である（Ｆｃに融合された）ＶＬＶＨ交差分子を形成する。交差したカウンターパート（ＶＨＣＬ）を生成するために、ＣＤ３特異的可変重鎖ドメインは定常ヒトλ軽鎖に融合され、一方ヒトＦｏｌＲ１に特異的な可変重鎖ドメイン（例えば、共通の軽鎖ライブラリーから単離される）は定常ヒトκ軽鎖に融合される。正確に対合した鎖を有する得られた所望の分子は、カッパ軽鎖及びラムダ軽鎖の両方又はその断片を含む。結果として、この所望の二重特異性分子種は、カッパ及びラムダ軽鎖をどちらかの順番で選択する連続した精製工程を用いて、誤対合種又はホモ二量体種から精製することができる。１つの特定の実施態様において、所望の二重特異性抗体の精製は、所望されないホモ二量体抗体を除去するために、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ及びＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたその後の精製工程を利用する。
Ｆｃドメイン
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含む一対のポリペプチド鎖からなる。例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子のＦｃドメインは二量体であり、その各サブユニットはＣＨ２及びＣＨ３ ＩｇＧ重鎖定常ドメインを含む。Ｆｃドメインの二つのサブユニットは、互いに安定に会合することができる。一実施態様では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、一を超えないＦｃドメインを含む。
本発明による一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインはＩｇＧ Ｆｃドメインである。特定の実施態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。別の実施態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ４のＦｃドメインである。更に特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｓ２２８（カバット番号付け）の位置にアミノ酸置換を、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含む、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。このアミノ酸置換は、ＩｇＧ４抗体のインビボでのＦａｂアーム交換を低減する（Stubenrauch et al., Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010)を参照）。更に特定の実施態様では、Ｆｃドメインはヒトである。ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域の例示的配列は、配列番号２４５に与えられる。
ヘテロ二量体化を促すＦｃドメインの修飾
本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの一方又は他方に融合した複数の異なる抗原結合部分を含み、従ってＦｃドメインの二つのサブユニットは、通常二つの非同一なポリペプチド鎖に含まれている。これらのポリペプチドの組換え同時発現とそれに続く二量体化は、二つのポリペプチドの複数の可能な組合わせをもたらす。従って、組換え生成におけるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の収率及び純度を改善するために、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメイン内に所望のポリペプチドの会合を促す修飾を導入することが有利であろう。
すなわち、特定の実施態様では、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促す修飾を含んでいる。ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインの二つのサブユニット間においてタンパク質－タンパク質相互作用が最大である部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインである。従って、一実施態様では、前記修飾はＦｃドメインのＣＨ３ドメイン内で行われる。
特定の一実施態様では、前記修飾はいわゆる「ノブ－イントゥ－ホール（ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ）」修飾であり、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの一方に「ノブ」修飾を、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの他方に「ホール」修飾を、それぞれ含んでいる。
ノブ－イントゥ－ホール技術は、例えば、米国特許第５７３１１６８号；同第７６９５９３６号； Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996)及びCarter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)に記載されている。一般に、本方法は、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨げるように、隆起が空洞内に配置することができるように、第一のポリペプチドの界面での隆起（「ノブ」）及び第二ポリペプチドの界面における対応する空洞（「ホール」）を導入することを含む。隆起は、第１のポリペプチドの接触面由来の小さなアミノ酸側鎖を大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）で置換することにより構築される。隆起と同じか又は同様のサイズの相補的空洞は、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの（例えばアラニン又はスレオニン）で置換することにより、第２のポリペプチドの接触面に作り出される。
このように、特定の一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基がそれよりも大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それにより、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の空洞内に配置可能な隆起が生成され、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に、アミノ酸残基がそれよりも小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それにより、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の隆起を配置可能な空洞が生成される。
隆起と空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を、例えば部位特異的突然変異誘発により、又はペプチド合成により、変化させることにより作り出すことができる。
特定の実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、３６６の位置のスレオニン残基がトリプトファン残基で置換され（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、４０７の位置のチロシン残基がバリン残基で置換される（Ｙ４０７Ｖ）。一実施態様では、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて更に、３６６の位置のスレオニン残基がセリン残基で置換され（Ｔ３６６Ｓ）、３６８の位置のロイシン残基がアラニン残基で置換される（Ｌ３６８Ａ）。
また更なる実施態様ではＦｃドメインの第１のサブユニットにおいて更に、３５４の位置のセリン残基がシステイン残基で置換され（Ｓ３５４Ｃ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて更に、３４９の位置のチロシン残基がシステイン残基で置換される（Ｙ３４９Ｃ）。これら二つのシステイン残基の導入により、Ｆｃドメインの二つのサブユニット間にジスルフィド架橋が形成され、更に二量体を安定させる（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)）。
特定の実施態様では、ＣＤ３に結合することができる抗原結合部分は、（任意選択的に、標的細胞抗原のＦｏｌＲ１に結合することができる抗原結合部分を介して）Ｆｃドメインの第１のサブユニット（「ノブ」修飾を含んでいる）に融合する。理論に縛られることを望まないが、ＣＤ３に結合することができる抗原結合部分の、Ｆｃドメインのノブ含有サブユニットへの融合は（更に）、ＣＤ３に結合することができる二つの抗原結合部分を含む抗原結合分子の生成を最小化する（二つのノブ含有ポリペプチドの立体的衝突）。
代わりの実施態様において、Ｆｃドメインの第一及び第二サブユニットの会合を促進する修飾は、ＰＣＴ出願公開ＷＯ２００９／０８９００４に記載されるように、静電的ステアリング効果を媒介する修飾を含む。一般に、この方法は、ホモ二量体形成は静電的に不利になるが、ヘテロ二量体は静電的に有利になるように、２つのＦｃドメインサブユニットの界面にて、荷電したアミノ酸残基による一又は複数のアミノ酸残基の置換を含む。
Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能を消失させるＦｃドメインの修飾
Ｆｃドメインは、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に望ましい薬物動態特性を付与し、そのような薬物動態特性には、標的組織中への良好な蓄積に貢献する長い血清半減期、及び望ましい組織－血液分布比が含まれる。しかしながら、同時に、Ｆｃドメインは、好ましい抗原保有細胞ではなく、Ｆｃ受容体を発現する細胞へのＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の望ましくないターゲティングの原因となり得る。更には、Ｆｃ受容体シグナル伝達経路の同時活性化はサイトカイン放出の原因となる可能性があり、サイトカイン放出は、Ｔ細胞活性化特性及び抗原結合分子の長い半減期と組み合わさって、サイトカイン受容体の過剰な活性化を招き、全身投与されると重い副作用性をを引き起こす。Ｔ細胞以外の（Ｆｃ受容体保有）免疫細胞の活性化は、例えばＮＫ細胞によるＴ細胞の破壊の可能性により、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の有効性を更に低下させることすらある。
従って、特定の実施態様では、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、天然のＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較した場合に、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低下及び／又はエフェクター機能の低下を呈する。このような一実施態様では、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）は、天然のＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（又は天然のＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）と比較して、５０％未満、好ましくは２０％未満、更に好ましくは１０％未満、及び最も好ましくは５％未満の、Ｆｃ受容体への結合親和性を呈する、及び／又は、天然のＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（又は天然のＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）と比較して、５０％未満、好ましくは２０％未満、更に好ましくは１０％未満、及び最も好ましくは５％未満の、エフェクター機能を呈する。一実施態様では、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）は、Ｆｃ受容体に実質的に結合しない、及び／又はエフェクター機能を誘導しない。特定の一実施態様では、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。一実施態様では、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。一実施態様では、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃ受容体である。特定の一実施態様では、Ｆｃ受容体は活性化ヒトＦｃγ受容体であり、具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ、更に具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一実施態様では、エフェクター機能は、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及びサイトカイン分泌の群から選択される一又は複数である。特定の一実施態様では、エフェクター機能はＡＤＣＣである。一実施態様では、Ｆｃドメインは、天然ＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較して実質的に同様の、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性を呈する。実質的に同様のＦｃＲｎに対する結合親和性は、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）が、天然ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（又は天然ＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）の約７０％を上回る、具体的には約８０％を上回る、より具体的には約９０％を上回るＦｃＲｎに対する結合親和性を呈するとき、達成される。
特定の実施態様において、Ｆｃドメインは、改変されていないＦｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体への低下した結合親和性及び／又は低下したエフェクター機能を有するように改変される。特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸変異を含む。典型的には、同じ一又は複数のアミノ酸変異がＦｃドメインの二つのサブユニットの各々に存在する。一実施態様では、アミノ酸変異はＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性を低下させる。一実施態様では、アミノ酸変異は、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性を、少なくとも２分の１、少なくとも５分の１、又は少なくとも１０分の１に低下させる。ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性を低下させる複数のアミノ酸変異が存在する一実施態様では、これらアミノ酸変異の組み合わせにより、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性が、少なくとも１０分の１、少なくとも２０分の１、又は少なくとも５０分の１にまで低下する。一実施態様では、改変されたＦｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、改変されていないＦｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子と比較して、２０％未満、特に１０％未満、更には５％未満のＦｃ受容体に対する結合親和性を呈する。特定の一実施態様では、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。幾つかの実施態様では、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。幾つかの実施態様では、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃ受容体である。特定の一実施態様では、Ｆｃ受容体は活性化ヒトＦｃγ受容体であり、具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ、更に具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。好ましくは、これら受容体の各々への結合は低減する。幾つかの実施態様では、補体成分に対する結合親和性、特にＣ１ｑに対する結合親和性も低減する。一実施態様では、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性は低減しない。ＦｃＲｎに対する実質的に同様の結合、すなわち、前記受容体に対するＦｃドメインの結合親和性の保存は、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）がＦｃドメインの改変されていない形態（又はＦｃドメインの前記改変されていない形態を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）の約７０％を上回るＦｃＲｎに対する結合親和性を呈するとき、達成される。Ｆｃドメイン、又は前記Ｆｃドメインを含む本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、このような親和性の約８０％、及び場合によっては約９０％を上回る親和性を呈し得る。特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、改変されていないＦｃドメインと比較してエフェクター機能が低下するように改変される。エフェクター機能の低下は、限定しないが、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の低減、抗体依存性Ｔ細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の低減、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）の低減、サイトカイン分泌の低減、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込みの低減、ＮＫ細胞に対する結合の低減、マクロファージに対する結合の低減、単球に対する結合の低減、多形核細胞に対する結合の低減、アポトーシスを誘導する直接的シグナル伝達の低減、標的結合抗体の架橋の低減、樹状細胞成熟の低減、又はＴ細胞プライミングの低減のうちの一又は複数を含むことができる。一実施態様では、エフェクター機能の低下は、ＣＤＣの低減、ＡＤＣＣの低減、ＡＤＣＰの低減、及びサイトカイン分泌の低下からなる群より選択される一又は複数である。特定の一実施態様では、エフェクター機能の低下はＡＤＣＣの低減である。一実施態様では、低減したＡＤＣＣは、改変されていないＦｃドメイン（又は改変されていないＦｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）によって誘導されるＡＤＣＣの２０％未満である。
一実施態様では、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させるアミノ酸の変異は、アミノ酸置換である。一実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む。具体的な実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＰ３２９の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む。幾つかの実施態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを含む。このような一実施態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ１のＦｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１のＦｃドメインである。一実施態様では、ＦｃドメインはＰ３２９の位置にアミノ酸置換を含む。具体的な実施態様では、アミノ酸置換はＰ３２９Ａ又はＰ３２９Ｇ、特にＰ３２９Ｇである。一実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｐ３２９の位置にアミノ酸置換を、更にＥ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７及びＰ３３１から選択される位置にアミノ酸置換を含む。具体的な実施態様では、更なるアミノ酸置換は、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ又はＰ３３１Ｓである。特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｐ３２９、Ｌ２３４及びＬ２３５の位置にアミノ酸置換を含む。更に特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」）を含む。このような一実施態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ１のＦｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１のＦｃドメインである。ＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／１３０８３１に記載され、その全体が参照により本明細書に援用されるように、アミノ酸置換の「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」の組み合わせは、ＩｇＧ１のＦｃドメインのＦｃγ受容体結合をほとんど完全に消失させる。国際公開第２０１２／１３０８３１号には、このような変異Ｆｃドメインを調製する方法、及びＦｃ受容体結合又はエフェクター機能といったその特性を決定する方法も記載されている。
ＩｇＧ４抗体は、ＩｇＧ１抗体と比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低下及びエフェクター機能の低下を呈する。よって、幾つかの実施態様では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、ＩｇＧ４ Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ４Ｆｃドメインである。一実施態様では、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、Ｓ２２８の位置におけるアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含む。Ｆｃ受容体に対する結合親和性及び／又はそのエフェクター機能を更に低下させるために、一実施態様において、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、位置Ｌ２３５でアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｌ２３５Ｅを含む。別の実施態様では、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、Ｐ３２９の位置におけるアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｐ３２９Ｇを含む。特定の実施態様において、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、位置Ｓ２２８、Ｌ２３５及びＰ３２９でのアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇを含む。このようなＩｇＧ４ Ｆｃドメインの変異及びそれらのＦｃγ受容体結合特性は、国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載されており、これは参照によりその全体が本明細書に取り込まれる。
特定の実施態様では、天然のＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較してＦｃ受容体に対する結合親和性の低下及び／又はエフェクター機能の低下を呈するＦｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及び任意選択的にＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインであるか、又はアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及び任意選択的にＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。
特定の実施態様では、ＦｃドメインのＮ－グリコシル化は除かれている。このような一実施態様では、ＦｃドメインはＮ２９７の位置におけるアミノ酸置換、具体的にはアラニン（Ｎ２９７Ａ）又はアスパラギン酸（Ｎ２９７Ｄ）酸によりアスパラギンを置き換えるアミノ酸置換を含む。
本明細書及び国際公開第２０１２／１３０８３１号において記載されるＦｃドメインに加えて、Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能の低下を有するＦｃドメインは、Ｆｃドメイン残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９の一又は複数の置換を有するものも含む（米国特許第６７３７０５６号）。このようなＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有する、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７の二つ以上における置換を有するＦｃ変異体を含む（米国特許第７３３２５８１号）。
変異Ｆｃドメインは、当該技術分野で周知の遺伝学的又は化学的方法を用いたアミノ酸の欠失、置換、挿入又は修飾によって調製することができる。遺伝学的方法は、コード化ＤＮＡ配列の部位特異的突然変異、ＰＣＲ、遺伝子合成などを含み得る。正確なヌクレオチドの変化は、例えば配列決定により検証することができる。
Ｆｃ受容体に対する結合は、例えばＥＬＩＳＡにより、又はＢＩＡｃｏｒｅ器具（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のような標準の器具類を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により容易に決定することができ、このようなＦｃ受容体は組換え発現により得ることができる。このような適切な結合アッセイは本明細書に記載される。代替的に、Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含む細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃ受容体に対する結合親和性は、特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株、例えばＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するＮＫ細胞を用いて評価してもよい。
Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のエフェクター機能は、当該技術分野で既知の方法により測定することができる。ＡＤＣＣを測定するための適切なアッセイは本明細書に記載される。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの他の例が、米国特許第５５００３６２号；Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986) and Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985)；米国特許第５８２１３３７号； Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987)に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を用いてもよい（例えばフローサイトメトリー用のＡＣＴＩＴＭ非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ． Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ；及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）参照）。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。あるいは、又は更に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Clynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998)に開示される動物モデルにおいてインビボで評価することができる。
幾つかの実施態様では、補体成分に対するＦｃドメインの結合、特にＣ１ｑに対する結合が低減する。従って、Ｆｃドメインがエフェクター機能が低下するように改変されている幾つかの実施態様では、前記エフェクター機能の低下はＣＤＣの低下を含む。Ｃ１ｑ結合アッセイは、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子がＣ１ｑに結合できるかどうか、それによりＣＤＣ活性を有するかどうかを決定するために実行される。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行ってもよい（例えば、Gazzano-Santoro et al., J Immunol Methods 202, 163 (1996); Cragg et al., Blood 101, 1045-1052 (2003)；及び Cragg and Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)を参照）。
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の生物学的特性及び機能特性
当業者は、がん細胞と非がん細胞とを選択的に区別する分子の有利な効率を理解することができる。この目標を達成する１つの方法は、適切な標的選択によるものである。腫瘍細胞のみに発現したマーカーを用いて、そのようなマーカーを発現しない正常細胞を温存しつつ、エフェクター分子又は細胞を腫瘍細胞に選択的に標的化することができる。しかしながら、幾つかの例では、いわゆる腫瘍細胞マーカーもまた、より低いレベルではあるが、正常組織において発現される。正常組織におけるこの発現は毒性の可能性を高める。従って、腫瘍細胞をより選択的に標的とすることができる分子が当該分野で必要であった。本明細書に記載の発明は、低レベルでＦｏｌＲ１を発現するか又は全く発現しない正常な非癌性細胞ではなく、ＦｏｌＲ１陽性腫瘍細胞を選択的に標的とするＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、高度ＦｏｌＲ１発現細胞と低ＦｏｌＲ１発現細胞との間の区別を可能にするアビディティー効果を与える比較的低い親和性の少なくとも２つ、好ましくは２つのＦｏｌＲ１結合部分を含む。腫瘍細胞は、高レベル又は中レベルでＦｏｌＲ１を発現するので、本発明のこの実施態様は、低レベルでＦｏｌＲ１を発現するか又は全く発現しない正常な非癌性細胞ではなく、腫瘍細胞に選択的に結合し、及び／又は腫瘍細胞の死滅を誘導する。一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、２＋１反転型フォーマットである。一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、非腫瘍細胞ではなく、ＦｏｌＲ１陽性腫瘍細胞のＴ細胞媒介性死滅を誘導し、配列番号３７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３８の重鎖ＣＤＲ２、配列番号３９の重鎖ＣＤＲ３、配列番号３２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３３の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３４の軽鎖ＣＤＲ３を含むＣＤ３抗原結合部分と、２つのＦｏｌＲ１抗原結合部分の各々が、配列番号８の重鎖ＣＤＲ１、配列番号９の重鎖ＣＤＲ２、配列番号５０の重鎖ＣＤＲ３、配列番号５２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５３の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５４の軽鎖ＣＤＲ３を含む２つのＦｏｌＲ１抗原結合部分とを含む。
１つの特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、約１０００コピー未満のＦｏｌＲ１を細胞表面に有する正常細胞の死滅を誘導しない。
上記の有利な特徴に加えて、本発明の一実施態様は、化学的架橋又はハイブリッドアプローチが作られることを必要としない。従って、一実施態様において、本発明は、ＣＨＯ細胞において産生することができるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ヒト化及びヒトポリペプチドを含む。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ＦｃｇＲ架橋を引き起こさない。１つのそのような実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ＣＨＯ細胞において産生することができ、配列番号３７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３８の重鎖ＣＤＲ２、配列番号３９の重鎖ＣＤＲ３、配列番号３２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３３の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３４の軽鎖ＣＤＲ３を含むＣＤ３抗原結合部分と、２つのＦｏｌＲ１抗原結合部分の各々が、配列番号８の重鎖ＣＤＲ１、配列番号９の重鎖ＣＤＲ２、配列番号５０の重鎖ＣＤＲ３、配列番号５２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５３の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５４の軽鎖ＣＤＲ３を含む２つのＦｏｌＲ１抗原結合部分とを含む。
上記のように、本明細書で考慮される幾つかの実施態様は、ＦｏｌＲ１に特異的結合を与える２つの結合部分及びＴ細胞活性化抗原ＣＤ３に特異性を与える１つの結合部分を有するＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含み、ここでそれぞれの個々のＦｏｌＲ１結合部分は低親和性で抗原と結合する。分子は、ＦｏｌＲ１への結合を与える２つの抗原結合部分を含むので、分子の全体的なアビディティーは、それにもかかわらず、ＦｏｌＲ１発現標的細胞への有効な結合及びＴ細胞の活性化をもたらし、Ｔ細胞エフェクター機能を誘導する。ＦｏｌＲ１は、腫瘍細胞上に様々なレベルで発現されるが、特定の正常細胞では非常に低いレベル（例えば、細胞表面上に約１０００コピー未満）で発現されることを考慮すると、当業者は、治療剤として使用のためのこのような分子の有利な効率を容易に認識することができる。そのような分子は、正常細胞よりも腫瘍細胞を選択的に標的とする。従って、そのような分子は、それを必要とする個体に、ＦｏｌＲ１陽性正常細胞によって起こる毒性について、ＦｏｌＲ１に高親和性で結合してエフェクター機能を誘導する分子と比較して著しく少ない懸念をもって投与することができる。好ましい実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、マイクロモル範囲のｈｕＦｏｌＲ１に対する一価の結合親和性及びナノモル範囲のｈｕＦｏｌＲ１に対する結合親和性を有する。
一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、約１０ｎＭから約４０ｎＭの見かけのＫＤでヒトＦｏｌＲ１に結合する。一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、約１０ｎＭの見かけのＫＤでヒトＦｏｌＲ１に結合する。一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ヒト及びカニクイザルＦｏｌＲ１とそれぞれ約１０ｎＭ及び約３０ｎＭの見かけのＫＤで結合する。一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、少なくとも約１０００ｎＭの一価結合のＫＤでヒトＦｏｌＲ１に結合する。一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、約１４００ｎＭの一価結合のＫＤでヒトＦｏｌＲ１に結合する。一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、約１４００ｎＭの一価結合のＫＤでヒトＦｏｌＲ１に結合し、約５０００ｎＭの一価結合のＫＤでカニクイザルＦｏｌＲ１に結合する。一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、約１０ｎＭの見かけのＫＤで、及び約１４００ｎＭの一価結合のＫＤでヒトＦｏｌＲ１に結合する。
一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、約５．３６ｐＭから約４ｎＭの見かけのＫＤでヒトＦｏｌＲ１に結合する。一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、約４ｎＭの見かけのＫＤでヒト及びカニクイザルＦｏｌＲ１に結合する。一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、約１．５ｎＭの見かけのＫＤでマウスＦｏｌＲ１に結合する。一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、少なくとも約１０００ｎＭの一価結合のＫＤでヒトＦｏｌＲ１に結合する。特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、約４ｎＭの見かけのＫＤでヒト及びカニクイザルＦｏｌＲ１に結合し、約１．５ｎＭの見かけのＫＤでマウスＦｏｌＲ１に結合し、配列番号３７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３８の重鎖ＣＤＲ２、配列番号３９の重鎖ＣＤＲ３、配列番号３２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３３の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３４の軽鎖ＣＤＲ３を含むＣＤ３抗原結合部分と、２つのＦｏｌＲ１抗原結合部分の各々が、配列番号８の重鎖ＣＤＲ１、配列番号９の重鎖ＣＤＲ２、配列番号５０の重鎖ＣＤＲ３、配列番号５２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５３の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５４の軽鎖ＣＤＲ３を含む２つのＦｏｌＲ１抗原結合部分とを含む。１つのそのような実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、少なくとも約１０００ｎＭの一価結合のＫＤでヒトＦｏｌＲ１に結合し、配列番号３７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３８の重鎖ＣＤＲ２、配列番号３９の重鎖ＣＤＲ３、配列番号３２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３３の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３４の軽鎖ＣＤＲ３を含むＣＤ３抗原結合部分と、２つのＦｏｌＲ１抗原結合部分の各々が、配列番号８の重鎖ＣＤＲ１、配列番号９の重鎖ＣＤＲ２、配列番号５０の重鎖ＣＤＲ３、配列番号５２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５３の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５４の軽鎖ＣＤＲ３を含む２つのＦｏｌＲ１抗原結合部分とを含む。
上述されるように、本明細書で考慮されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Ｔ細胞エフェクター機能、例えば細胞表面マーカー発現、サイトカイン産生、Ｔ細胞媒介性死滅を誘導することができる。一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、インビトロでＦｏｌＲ１発現標的細胞、例えばヒト腫瘍細胞のＴ細胞媒介性死滅を誘導する。一実施態様では、Ｔ細胞はＣＤ８陽性Ｔ細胞である。ＦｏｌＲ１発現ヒト腫瘍細胞の例には、限定されないが、Ｈｅｌａ、Ｓｋｏｖ－３、ＨＴ－２９、及びＨＲＣＥｐｉＣ細胞が含まれる。インビトロ試験に使用することができる他のＦｏｌＲ１陽性ヒトがん細胞は、当業者に容易に利用可能である。一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、２４時間後に約３６ｐＭから約３９５７３ｐＭの間のＥＣ５０で、インビトロでＦｏｌＲ１発現ヒト腫瘍細胞のＴ細胞媒介性死滅を誘導する。具体的に考慮されるのは、２４時間後に約３６ｐＭのＥＣ５０で、インビトロでＦｏｌＲ１発現腫瘍細胞のＴ細胞媒介性死滅を誘導するＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子である。一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、２４時間後に約１７８．４ｐＭのＥＣ５０で、インビトロでＦｏｌＲ１発現腫瘍細胞のＴ細胞媒介性死滅を誘導する。一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、４８時間後に約１３４．５ｐＭ以上のＥＣ５０で、インビトロでＦｏｌＲ１発現腫瘍細胞のＴ細胞媒介性死滅を誘導する。ＥＣ５０は、当技術分野において公知の方法、例えば本明細書中の実施例により開示される方法によって測定することができる。
一実施態様において、上記の実施態様の何れかのＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、フローサイトメトリーによって測定される、Ｔ細胞上のＣＤ２５及びＣＤ６９の少なくとも一つの細胞表面発現の上方制御を誘導する。一実施態様では、Ｔ細胞は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞又はＣＤ８陽性Ｔ細胞である。
一実施態様において、上記実施態様の何れかのＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ヒト腫瘍細胞上に発現されたＦｏｌＲ１に結合する。一実施態様において、上記実施態様の何れかのＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ヒトＦｏｌＲ１上の立体構造エピトープに結合する。一実施態様において、上記実施態様の何れかのＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ヒト葉酸受容体２（ＦｏｌＲ２）又はヒト葉酸受容体３（ＦｏｌＲ３）に結合しない。上記の実施態様の何れかのＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の一実施態様において、抗原結合部分は、ヒトＦｏｌＲ１（配列番号２２７）のアミノ酸２５から２３４を含むＦｏｌＲ１ポリペプチドに結合する。上記の実施態様の何れかのＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の一実施態様において、ＦｏｌＲ１抗原結合部分は、配列番号２２７のアミノ酸配列を含むＦｏｌＲ１ポリペプチドに、配列番号２３０のアミノ酸配列を含むＦｏｌＲ１ポリペプチドに、及び配列番号２３１のアミノ酸配列を含むＦｏｌＲ１ポリペプチドに結合し、ここで、ＦｏｌＲ１抗原結合部分は、配列番号２２８又は２２９のアミノ酸配列を含むＦｏｌＲポリペプチドに結合しない。１つの特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号２２７、２３０及び２３１のアミノ酸配列を含むＦｏｌＲ１ポリペプチドに結合するＦｏｌＲ１抗原結合部分を含み（ここで、ＦｏｌＲ１抗原結合部分は、配列番号２２８又は２２９のアミノ酸配列を含むＦｏｌＲポリペプチドに結合せず）、かつ配列番号３７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３８の重鎖ＣＤＲ２、配列番号３９の重鎖ＣＤＲ３、配列番号３２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３３の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３４の軽鎖ＣＤＲ３を含むＣＤ３抗原結合部分と、２つのＦｏｌＲ１抗原結合部分の各々が、配列番号８の重鎖ＣＤＲ１、配列番号９の重鎖ＣＤＲ２、配列番号５０の重鎖ＣＤＲ３、配列番号５２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５３の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５４の軽鎖ＣＤＲ３を含む２つのＦｏｌＲ１抗原結合部分とを含む。
上記の実施態様の何れかのＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の一実施態様において、ＦｏｌＲ１抗原結合部分は、配列番号２２７のアミノ酸配列を含むＦｏｌＲ１ポリペプチドに、及び配列番号２３１のアミノ酸配列を含むＦｏｌＲ１ポリペプチドに結合し、ここで、ＦｏｌＲ１抗原結合部分は、配列番号２２８、２２９又は２３０のアミノ酸配列を含むＦｏｌＲポリペプチドに結合しない。１つの特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号２２７のアミノ酸配列を含むＦｏｌＲ１ポリペプチドに、及び配列番号２３１のアミノ酸配列を含むＦｏｌＲ１ポリペプチドに結合するＦｏｌＲ１抗原結合部分を含み（ここで、ＦｏｌＲ１抗原結合部分は、配列番号２２８、２２９又は２３０のアミノ酸配列を含むＦｏｌＲポリペプチドに結合せず）、かつ配列番号３７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３８の重鎖ＣＤＲ２、配列番号３９の重鎖ＣＤＲ３、配列番号３２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３３の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３４の軽鎖ＣＤＲ３を含むＣＤ３抗原結合部分と、２つのＦｏｌＲ１抗原結合部分の各々が、配列番号１６の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２７５の重鎖ＣＤＲ２、配列番号３１５の重鎖ＣＤＲ３、配列番号３２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３３の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３４の軽鎖ＣＤＲ３を含む２つのＦｏｌＲ１抗原結合部分とを含む。
ＦｏｌＲ１に関して、本明細書中で考慮されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、アゴニスト、アンタゴニスト又は中性効果を有することができる。アゴニスト効果の例には、ＦｏｌＲ１結合部分による標的細胞上のＦｏｌＲ１受容体との結合の際の、ＦｏｌＲ１を介したシグナル伝達の誘導又は増強が含まれる。アンタゴニスト活性の例には、ＦｏｌＲ１結合部分による標的細胞上のＦｏｌＲ１受容体との結合の際の、ＦｏｌＲ１を介したシグナル伝達の抑止又は低減が含まれる。これは、例えば、葉酸とＦｏｌＲ１との相互作用を遮断又は低減することによって起こり得る。上記の生物学的特性を保持しつつ、より低い親和性を有する、本明細書に開示された実施態様の配列変異体が特に意図される。
イムノコンジュゲート
本発明はまた、細胞傷害性剤、例えば化学療法剤、増殖阻害剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、若しくは動物由来の酵素的に活性な毒素、又はそれらの断片）又は放射性同位体（すなわち、放射性コンジュゲート）にコンジュゲートしたＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含むイムノコンジュゲートに関する。
ポリヌクレオチド
本発明は更に、本明細書に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチド又はその断片を含む。
本発明のポリヌクレオチドは、その機能的断片又は変異体を含め、配列番号１５１－２２６に規定される配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるものを含む。
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドは、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子全体をコードする単一のポリヌクレオチドとして、又は同時発現される複数（例えば、二つ以上）のポリヌクレオチドとして発現され得る。同時発現されるポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドは、例えばジスルフィド結合又は他の手段を介して会合し、機能的Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を形成することができる。例えば、抗原結合部分の軽鎖部分は、抗原結合部分の重鎖部分、Ｆｃドメインサブユニット、及び任意選択的に別の抗原結合部分（の一部）を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の部分とは別のポリヌクレオチドによってコードされ得る。同時発現されるとき、重鎖ポリペプチドは軽鎖ポリペプチドと会合して抗原結合部分を形成することができる。別の例では、二つのＦｃドメインサブユニットの一方び任意選択的に一又は複数の抗原結合部分（の一部）を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の部分は、二つのＦｃドメインサブユニットの他方及び任意選択的に抗原結合部分（の一部）を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の部分とは別のポリヌクレオチドによってコードされ得る。同時発現されるとき、Ｆｃドメインサブユニットは会合してＦｃドメインを形成する。
幾つかの実施態様では、本明細書に記載されるように、単離されたポリヌクレオチドは本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子全体をコードする。他の実施態様では、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に含まれるポリペプチドをコードする。
別の実施態様では、本発明は、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを対象とし、このポリヌクレオチドは、配列番号１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２及び２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３に示される可変領域配列をコードする配列を含む。別の実施態様では、本発明は、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを対象とし、このポリヌクレオチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１，１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４に示されるポリペプチド配列をコードする配列を含む。別の実施態様では、本発明は、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを更に対象とし、このポリヌクレオチドは、配列番号９７、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２４６、２４７に示されるヌクレオチド配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である配列を含む。別の実施態様では、本発明は、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを対象とし、このポリヌクレオチドは、配列番号９７、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２４６、２４７に示される核酸配列を含む。別の実施態様では、本発明は、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを対象とし、このポリヌクレオチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、１１，１３、１５、１９、２１、１２、２５、２７、２９、３１、３６、４１、４５、４９、５１、５５、５８、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である可変領域配列をコードする配列を含む。別の実施態様では、本発明は、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチド又はその断片を目的とし、このポリヌクレオチドは、配列番号８、９、５０、３７、３８、及び３９のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である一又は複数の配列を含むポリペプチドをコードする配列を含む。本発明は、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを包含し、このポリヌクレオチドは、保存的アミノ酸置換を有する配列番号１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２及び２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３の可変領域配列をコードする配列を含む。本発明はまた、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを包含し、このポリヌクレオチドは、保存的アミノ酸置換を有する配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１，１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８及び２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４のポリペプチド配列をコードする配列を含む。
特定の実施態様において、ポリヌクレオチド又は核酸はＤＮＡである。他の実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態のＲＮＡである。本発明のＲＮＡは、一本鎖又は二本鎖であってもよい。
組換え法
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、例えば、固相ペプチド合成（例えばメリフィールド固相合成）又は組換え生成によって得ることができる。組換え生成のために、例えば上述したように、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（断片）をコードする一又は複数のポリヌクレオチドが単離され、宿主細胞内での更なるクローニング及び／又は発現のために一又は複数のベクターに挿入される。このようなポリヌクレオチドは、一般的な手順を使用して容易に単離され配列決定され得る。一実施態様において、本発明のポリヌクレオチドの一又は複数を含むベクタ－、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者によく知られている方法は、適切な転写／翻訳制御シグナルとともに、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（断片）のコード配列を含む発現ベクターを構築するために使用することができる。これらの方法は、インビトロでの組換えＤＮＡ技術、合成技術及びインビボでの組換え／遺伝子組換えを含む。例えば、Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989)；及びAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989)に記載される技術を参照。発現ベクターはプラスミド、又はウイルスの一部とすることができるか、又は核酸断片でよい。発現ベクターは、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（断片）（すなわち、コード領域）をコードするポリヌクレオチドが、プロモーター及び／又は他の転写又は翻訳制御エレメントと作動可能に結合するようにクローニングされる発現カセットを含む。本発明で使用される場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、又はＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないが、存在する場合にはコード領域の一部と考えられ、しかし、任意の隣接配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’及び３’非翻訳領域などはコード領域の一部ではない。二つ以上のコード領域が、単一のポリヌクレオチドコンストラクト、例えば単一のベクター上に、又は別々のポリヌクレオチドコンストラクトの中に、例えば別の（異なる）ベクター上に存在することができる。更に、任意のベクターは、単一のコード領域を含んでいてもよいし、二つ以上のコード領域を含んでいてもよく、例えば本発明のベクターは、タンパク質分解性切断を介して、翻訳後又は翻訳と同時に最終タンパク質中に分離された一又は複数のポリペプチドをコードしてもよい。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、又は核酸は、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（断片）、又はその変異体若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドに融合又は非融合された異種コード領域をコードし得る。異種コード領域は、限定しないが、特殊化要素又はモチーフ、例えば分泌シグナルペプチド又は異種機能ドメインを含む。作動可能に結合とは、ポリペプチドなどの遺伝子産物のコード領域が、制御配列の影響下又は制御下において遺伝子産物の発現を配置するように、一又は複数の制御配列と結合するときである。（ポリペプチドコード領域及びそれに結合するプロモーターのような）二つのＤＮＡ断片は、プロモーター機能の誘導が所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらす場合、及び二つのＤＮＡ断片間の連結の性質が、遺伝子産物の発現を導く発現制御配列の能力を妨げないか又は転写されるべきＤＮＡ鋳型の能力を妨げない場合、「作動可能に結合している」。従って、プロモーター領域は、プロモーターがその核酸の転写をもたらすことができる場合にポリペプチドをコードする核酸に作動可能に結合される。プロモーターは所定の細胞においてのみＤＮＡの実質的な転写を導く細胞特異的プロモーターであってもよい。プロモーターの他に他の転写制御エレメント、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終結シグナルが、細胞特異的転写を導くポリヌクレオチドと作動可能に結合することができる。適切なプロモーター及び他の転写制御領域は本明細書に開示されている。種々の転写制御領域が当業者に知られている。これらには、限定されないが、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域、例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーター及びエンハンサーセグメント（例えばイントロン－Ａと連動した即初期プロモーター）、サルウイルス４０（例えば初期プロモーター）、及びレトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイルスなど）が含まれる。他の転写制御領域は、脊椎動物の遺伝子、例えばアクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギ－αグロビン、並びに、真核細胞における遺伝子発現を制御することができる他の配列に由来するものを含む。更なる適切な転写制御領域は、組織特異的プロモーター及びエンハンサー並びに誘導性プロモーター（例えば、プロモーター誘導性テトラサイクリン）を含む。同様に、種々の翻訳制御エレメントが当業者に知られている。これらには、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終結コドン、及びウイルス系由来の要素（特に、配列内リボソーム進入部位、又はＣＩＴＥ配列とも呼ばれるＩＲＥＳ）が含まれる。発現カセットはまた、例えば、複製起点、及び／又はレトロウイルスの長い末端反復配列（ＬＴＲ）又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の末端反転型配列（ＩＴＲ）など染色体組み込み要素といった他の特徴を含んでいてもよい。
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指示する分泌ペプチド又はシグナルペプチドをコードする更なるコード領域と結合させることができる。例えば、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の分泌が望まれる場合、シグナル配列をコードするＤＮＡが、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又はその断片をコードする核酸の上流に配置され得る。シグナル仮説によると、哺乳類細胞によって分泌されるタンパク質はシグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有し、これは粗面小胞体上で成長するタンパク質鎖の排出が開始されると成熟タンパク質から切断される。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが通常、ポリペプチドの分泌型又は「成熟」型を生成するために翻訳されたポリペプチドから切断されるポリペプチドのＮ末端に融合されたシグナルペプチドを有することを認識している。特定の実施態様では、天然のシグナルペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖又は軽鎖シグナルペプチド又は作動可能に結合しているポリペプチドの分泌を指示する能力を保持するその配列の機能的誘導体が使用される。或いは、異種哺乳動物シグナルペプチド、又はその機能的誘導体を使用することができる。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）又はマウスβ－グルクロニダーゼのリーダー配列で置換されてもよい。
後の精製を容易にするため又はＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の標識化における補助のために使用されうる短タンパク質配列（例えば、ヒスチジンタグ）をコードするＤＮＡは、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（断片）をコードするポリヌクレオチドの中又は末端に含まれ得る。
更なる実施態様では、本発明の一又は複数のポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供される。特定の実施態様では、本発明の一又は複数のベクターを含む宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチド及びベクターは、ポリヌクレオチド及びベクターそれぞれに関連して本明細書に記載される特徴の何れかを単独で又は組み合わせて組み込むことができる。そのような一実施態様において、宿主細胞は、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（の一部）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む（例えば該ベクターで形質転換又はトランスフェクトされている）。本明細書で使用される場合、「宿主細胞」なる用語は、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又はその断片を生成するよう改変できる何れかの種類の細胞系を指す。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の複製及び発現の補助に適切な宿主細胞は当分野でよく知られている。このような細胞は特定の発現ベクターで適切にトランスフェクト又は形質導入することができ、大量のベクター含有細胞を、臨床利用のための十分な量のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を得るために、大規模発酵槽での播種用に増殖させることができる。適切な宿主細胞は、原核生物微生物、例えば大腸菌、又は様々な真核生物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞などを含む。例えば、特に、グリコシル化が必要でない場合には、ポリペプチドは細菌中で生成することができる。発現の後、ポリペプチドは可溶性画分において細菌の細胞ペーストから単離され得、更に精製することができる。原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、菌類や酵母菌株を含むポリペプチドをコードするベクターのための適切なクローニング宿主又は発現宿主であり、そのグリコシル化経路は「ヒト化」されており、部分的又は完全なヒトのグリコシル化パターンを有するポリペプチドの生成をもたらす。Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004)及びLi et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006)を参照。（グリコシル化）ポリペプチドの発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物と脊椎動物）から派生している。無脊椎動物細胞の例としては、植物及び昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株が同定されており、これらは特にヨトウガ細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と併せて使用することができる。植物細胞培養を宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、第６０４０４９８号、第６４２０５４８号、第７１２５９７８号及び第６４１７４２９号（トランスジェニック植物における抗体生成に関するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載）を参照。脊椎動物細胞も宿主として用いることができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合されている哺乳動物細胞株は有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ－７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胚腎臓株（Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)に記載された２９３細胞又は２９３Ｔ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスのセルトリ細胞（例えば、Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)に記載されるＴＭ４細胞）、サル腎細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ－７６）、ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）、マウス乳腺腫瘍細胞（ＭＭＴ０６０５６２）、（例えば、Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)に記載される）ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞（Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)）を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；及びＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株を含む。タンパク質生成に適した特定の哺乳動物宿主細胞系の総説については、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)を参照。宿主細胞は、培養細胞、例えば幾つか挙げると、哺乳動物の培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞及び植物細胞、並びにトランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物又は動物組織内部に含まれる細胞を含む。一実施態様において、宿主細胞は、真核生物細胞、好ましくは哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞、又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。
これらの系において外来遺伝子を発現する標準的な技術が当技術分野で知られている。抗体などの抗原結合ドメインの重鎖又は軽鎖を含むポリペプチドを発現する細胞は、発現された生成物が重鎖及び軽鎖の両方を有する抗体であるように、抗体鎖の他方を発現するように改変することができる。
一実施態様において、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を産生する方法が提供され、この方法は、本明細書に与えられるように、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の発現に適した条件下で、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養し、宿主細胞（又は宿主細胞培地）からＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を回収することを含む。
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の成分は、互いに遺伝的に融合している。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、その成分が互いに直接的に、又はリンカー配列を介して間接的に融合するように、設計することができる。リンカーの組成及び長さは、当該技術分野で周知の方法に従って決定することができ、有効性について試験することができる。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の異なる成分間のリンカー配列の例は、本明細書に提供される配列に見出される。必要に応じて、融合の個々の成分を分離するための切断部位を取り込むために、追加的配列、例えばエンドペプチダーゼ認識配列も含めることができる。
特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の一又は複数の抗原結合部分は、抗原決定基に結合することができる抗体可変領域を少なくとも含む。可変領域は、天然に又は非天然に存在する抗体及びその断片の一部を形成することができ、且つそのような抗体及び断片から誘導することができる。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を生成する方法は、当該技術分野で周知である（例えば、Harlow and Lane, 「Antibodies, a laboratory manual」, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）。非天然に存在する抗体は、固相－ペプチド合成を使用して構築されるか、組換え的に生成されるか（例えば米国特許第４１８６５６７号に記載のように）、又は例えば可変重鎖及び可変軽鎖を含むコンビナトリアルライブラリーのスクリーニング（例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙの米国特許第５９６９１０８号を参照）によって得ることができる。
あらゆる動物種の抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変領域を、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に用いることができる。本発明において有用な非限定的抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変領域は、マウス、霊長類、又はヒト起源のものであり得る。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子がヒトでの使用を意図する場合、定常領域がヒトに由来する抗体のキメラ形態を使用することができる。ヒト化又は完全ヒト形態の抗体も、当分野でよく知られている方法に従って調製されうる（例えばＷｉｎｔｅｒの米国特許第５５６５３３２号を参照）。ヒト化は、様々な方法によって達成することができ、それら方法には、限定されないが、（ａ）非ヒト（例えば、ドナー抗体）のＣＤＲを、重要なフレームワーク残基（例えば、良好な抗原結合親和性又は抗体機能を維持するために重要であるもの）の保持を伴う又は伴わないヒト（例えば、レシピエント抗体）のフレームワーク領域及び定常領域の上に移植すること、（ｂ）非ヒト特異性決定領域（ＳＤＲ又はａ－ＣＤＲ；抗体－抗原相互作用に重要な残基）のみをヒトフレームワーク領域及び定常領域上に移植すること、又は（ｃ）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置換によってヒト様切片で「覆い隠す」ことが含まれる。ヒト化抗体及びそれらの製造方法は、例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)に総説され、更に、例えば、Riechmann et al., Nature 332, 323-329 (1988); Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989)；米国特許第５８２１３３７号、同第７５２７７９１号、同第６９８２３２１号、及び同第７０８７４０９号； Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv Immunol 44, 65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988); Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217 (1994); Kashmiri et al., Methods 36, 25-34 (2005) （ＳＤＲ（ａ－ＣＤＲ）移植を記述する）； Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 (1991) （「リサーフェシング」を記述する）； Dall'Acqua et al., Methods 36, 43-60 (2005) （「ＦＲシャッフリング」を記述する）；及びOsbourn et al., Methods 36, 61-68 (2005)及びKlimka et al., Br J Cancer 83, 252-260 (2000)（ＦＲシャッフリングへの「誘導選択」アプローチを記述する）に記載されている。ヒト抗体及びヒト可変領域は、当技術分野において既知の様々な技術を用いて生産することができる。ヒト抗体は一般的に、van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001)及びLonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)に記載されている。ヒト可変領域は、ハイブリドーマ法によって作製されたヒトモノクローナル抗体の一部を形成することができ、且つそのような抗体から誘導することができる（例えば、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, (1987)を参照）。ヒト抗体及びヒト可変領域は、抗原チャレンジに応答して、インタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を持つインタクトな抗体を生成するように修飾されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することにより調製することができる（例えば、Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005)を参照）。ヒト抗体及びヒト可変領域はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローン可変領域配列を単離することによって生成することができる（例えば、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)；及びMcCafferty et al., Nature 348, 552-554; Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991)）。ファージは、通常、抗体断片を、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、又はＦａｂ断片として表示する。
特定の実施態様では、本発明において有用な抗原結合部分は、例えば米国特許出願公開第２００４／０１３２０６６号（この全内容を出典明記によってここに援用する）に開示される方法に従い、増強された結合親和性を有するように改変される。特定の抗原決定基に結合する本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の能力は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られている他の技術、例えば表面プラズモン共鳴技術（ＢＩＡｃｏｒｅＴ１００システムで解析される）（Liljeblad,et al.,Glyco.J.17:323-329(2000)）及び古典的な結合アッセイ（Heeley,R.P.,Endocr.Res.28:217-229(2002)）によって測定することができる。競合アッセイを、特定の抗原への結合について参照抗体と競合する抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変ドメインを同定するため、例えばＣＤ３への結合についてＶ９抗体と競合する抗体を同定するために使用することができる。特定の実施態様では、このような競合する抗体は、参照抗体によって結合される同じエピトープ（例えば直鎖状又は立体構造エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための典型的な方法の詳細が、Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)に提供されている。例示的な競合アッセイにおいて、固定化抗原（例えばＣＤ３）は、抗原に結合する第一の標識された抗体（例えばＶ９抗体、米国特許第６０５４２９７号に記載）、及び抗原への結合について第一の抗体と競合するその能力について試験されている第二の未標識抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第二抗体はハイブリドーマ上清中に存在してもよい。対照として、固定化抗原が、第一の標識された抗体を含むが第二の未標識抗体は含まない溶液中でインキュベートされる。第一の抗体の抗原への結合を許容する条件下でインキュベートした後、過剰な未結合抗体が除去され、固定化された抗原に結合した標識の量が測定される。固定化抗原に結合した標識の量が、対照試料と比較して試験試料中で実質的に減少している場合、それは、第二抗体が、抗原への結合において第一の抗体と競合していることを示している。Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)を参照。
本明細書で記載のように調製されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、当分野で知られている技術、例えば高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなどによって精製され得る。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の条件は、一部には正味荷電、疎水性、親水性などの要因に依存し、当業者に明瞭であろう。アフィニティークロマトグラフィー精製では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が結合する抗体、リガンド、受容体又は抗原が使用され得る。例えば、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のアフィニティークロマトグラフィー精製では、プロテインＡ又はプロテインＧを伴うマトリックスが使用され得る。逐次的なプロテインＡ又はＧアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーが、基本的に実施例に記載されるようにＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を単離するために使用され得る。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の純度は、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィーなどを含む様々な周知の分析方法の何れかによって決定され得る。例えば、実施例に記載されるように発現される重鎖融合タンパク質は、インタクトで、且つＳＤＳ－ＰＡＧＥの低減により実証されるように適切に構築されていることが示された（図２参照）。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の軽鎖、、及び重鎖／軽鎖融合タンパク質の予測される分子量に対応する、概ねＭｒ２５０００、Ｍｒ５００００及びＭｒ７５０００における三つの帯域が分離された。
アッセイ
本明細書で提供されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が、同定され、当技術分野で既知の様々なアッセイによってその物理的／化学的性質及び／又は生物学的活性についてスクリーニングされる、又は特徴づけられる。
親和性アッセイ
Ｆｃ受容体又は標的抗原に対するＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の親和性を、実施例に規定される方法に従い、ＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のような標準的器具類と、受容体又は組換え発現により得られるもののような標的タンパク質とを用いて、プラズモン共鳴アッセイ（ＳＰＲ）により決定することができる。代替的に、異なる受容体又は標的抗原に対するＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の結合は、特定の受容体又は標的抗原を発現する細胞株を用いて、例えばフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により、評価することができる。結合親和性を測定するための特定の説明的で例示的な実施態様は、後述及び以下の実施例に記載されている。
一実施態様によれば、ＫＤは、２５℃でＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００マシン（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いる表面プラズモン共鳴により測定される。
Ｆｃ部分とＦｃ受容体との相互作用を分析するために、Ｈｉｓタグを付した組換えＦｃ受容体を、ＣＭ５チップ上に固定化された抗ペンタＨｉｓ抗体（配列番号３０６として開示される「ペンタ－Ｈｉｓ」）（Ｑｉａｇｅｎ）により捕捉し、二重特異性コンストラクトを被分析物として使用する。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、供給業者の指示書に従ってＮ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ－ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）で活性化する。抗ペンタ－Ｈｉｓ抗体（配列番号３０６として開示される「ペンタ－Ｈｉｓ」）を、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）で４０μｇ／ｍｌに希釈した後、結合したタンパク質のおよそ６５００反応単位（ＲＵ）を達成するために５μｌ／分の流速で注入する。リガンドの注入後、未反応群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入する。その後、Ｆｃ受容体を４又は１０ｎＭで６０秒間捕捉する。反応速度論的な測定のため、二重特異性コンストラクトの４倍の連続希釈物（５００ｎＭ～４０００ｎＭの）を、２５℃のＨＢＳ－ＥＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％の界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４）に流速３０μｌ／分で１２０秒間注入する。
標的抗原に対する親和性を決定するため、二重特異性コンストラクトを、抗ペンタ－Ｈｉｓ抗体（配列番号３０６として開示される「ペンタ－Ｈｉｓ」）について記載したように、活性化されたＣＭ５－センサーチップ表面上に固定化されている抗ヒトＦａｂ特異性抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により捕捉する。結合したタンパク質の最終的な量は、約１２０００ＲＵである。二重特異性コンストラクトは、３００ｎＭで９０秒間捕捉される。標的抗原は、流速３０μｌ／分且つ濃度範囲２５０～１０００ｎＭでフローセルに１８０秒間通過させる。解離を１８０秒間モニタする。
バルク屈折率の差異は、基準フローセルで取得される応答を差し引くことにより修正される。定常応答を使用して、ラングミュア結合等温線の非線形曲線適合により解離定数ＫＤを得た。会合センサーグラム及び解離センサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン１．１．１）を用いて、会合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）を算出する。平衡解離定数（ＫＤ）はｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出される。例えば、Chen et al., J Mol Biol 293, 865-881 (1999)を参照のこと。
活性のアッセイ
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の生物活性は、実施例に記載される様々なアッセイにより測定することができる。生物活性には、例えば、Ｔ細胞の増殖の誘導、Ｔ細胞中のシグナル伝達の誘導、Ｔ細胞中の活性マーカーの発現の誘導、Ｔ細胞によるサイトカイン分泌の誘導、腫瘍細胞などの標的細胞の溶解の誘導、及び腫瘍後退の誘導及び／又は生存率の改善が含まれる。
投与の組成、製剤、及び経路
更なる態様において、本発明は、例えば下記の治療法の何れかに使用される、本明細書で提供されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の何れかを含む薬学的組成物を提供する。一実施態様では、薬学的組成物は、本明細書で提供されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の何れかと、薬学的に許容される担体とを含む。別の他の実施態様において、薬学的組成物は、本明細書で提供されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の何れかと、少なくとも一つの追加的な治療剤を、例えば後述するように含む。
更には、インビボでの投与に適した形態の、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を製造する方法が提供され、この方法は、（ａ）本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を得ること、及び（ｂ）少なくとも一つの薬学的に許容される担体を用いてＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を製剤化することであって、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の調製物が、インビボでの投与のために製剤化される、製剤化することとを含む。
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される担体中に溶解又は分散された一又は複数のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の治療的有効量を含む。「薬学的に許容される又は薬理学的に許容される」という表現は、用いられる用量及び濃度においてレシピエントに非毒性であり、すなわち、例えばヒトなどの動物に必要に応じて投与されたとき、副作用、アレルギー反応、又は他の望ましくない応答を生じさせない分子的実態及び組成物を指す。少なくとも一つのＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子と、任意選択的に追加的な活性成分とを含む薬学的組成物の調製物は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed.Mack Printing Company, 1990によって例示されているように、本開示内容の検知から当業者には既知であろう。この文献は参照により本明細書に組み込まれる。更に、動物（例えば、ヒト）への投与のために、調製物は、ＦＤＡ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ又は他の国の対応する官庁によって必要とされる滅菌状態、発熱性、一般的安全性、及び純度の基準を満たさねばならない。好ましい組成物は、凍結乾燥製剤又は水溶液である。本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」には、当技術者に既知のように、あらゆる溶媒、バッファー、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、保存料（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、防腐剤、抗酸化剤、タンパク質、薬物、薬物安定剤、ポリマー、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味料、香料、染料、それらの類似物質及び組み合わせが含まれる（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed.Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329を参照。この文献は参照により本明細書に組み込まれる）。いずれの一般的な担体も、活性成分と不適合でない限り、治療的又は薬学的組成物におけるその使用が考慮される。
組成物は、それが固体、液体、又はエアロゾルの形態で投与されるかどうかに応じて、及びそれが注射のような投与経路のために無菌である必要があるかどうかに応じて、異なる種類の担体を含むことができる。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（及び任意の追加的治療剤）は、当業者に既知であるように、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、脾臓内、腎臓内、胸膜内、気管内、鼻腔内、硝子体内、膣内、直腸内、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、皮下、結膜下、小胞内、粘膜内、心膜内、臍帯内、眼球内、経口、局所内、局部内に、吸入（例えば、エアロゾル吸入）、注射、注入、連続的注入、標的細胞を直接浸す局所的かん流により、カテーテル経由で、洗浄により、クリームで、脂質組成物（例えば、リポソーム）で、又は他の方法、又は上記の何れかの組み合わせで投与することができる。（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed.Mack Printing Company, 1990を参照。この文献は参照により本明細書に組み込まれる）。非経口投与、特に静脈内注射が、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のようなポリペプチド分子を投与するために最も一般的に使用される。
非経口組成物には、注射による投与、例えば皮下、皮内、病巣内、静脈内、動脈内、筋肉内、髄腔内又は腹腔内への注射用に考案されたものが含まれる。注射の場合、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、水溶液、好ましくはハンクス液、リンゲル液、又は生理食塩水バッファーといった生理的に適合性のバッファー中において製剤化される。溶液は、懸濁化剤、安定剤、及び／又は分散剤といった製剤関連薬剤を含有することができる。代替的には、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、使用前は、適切なビヒクル、例えば滅菌ピロゲンを含まない水を用いた組成に適した粉末形態であってもよい。無菌の注射可能な溶液は、必要量の本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を、必要に応じて以下に列挙する他の様々な成分を含む適切な溶媒中に取り込むことにより調製される。滅菌状態は、例えば、滅菌濾過膜を通して濾過することにより、達成することができる。通常、分散液は、基本的な分散媒体及び／又は他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に、滅菌された様々な活性成分を取り込むことにより調製される。無菌の注射可能な溶液、懸濁液、又は乳濁液を調製するための無菌の粉末の場合、好ましい調製方法は、その直前の滅菌濾過された液体媒質から活性成分の粉末と任意の所望の追加的成分とを生む真空乾燥又は凍結乾燥技術である。液体媒質は、必要であれば適切にバッファーリングされなければならず、十分な食塩水又はグルコースを注射される前に、液体はまず希釈されて等張性にされる。組成物は、製造及び貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌といった微生物の汚染作用から保護されなければならない。エンドトキシンの汚染が安全レベル、例えばタンパク質１ｍｇあたり０．５ｎｇ未満で最小限に保たれなければならない。薬学的に許容される適切な担体としては、限定されないが；リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸のようなバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；マンノサッカライド、ジサッカライド、及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。水性注射懸濁液には、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、デキストランなどの懸濁液の粘度を上昇させる化合物が含有されていてよい。任意選択的に、懸濁液は、適切な安定剤、又は化合物の溶解度を上昇させて高濃度の溶液の調製を可能にする薬剤も含有することができる。加えて、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射懸濁液として調製することができる。適切な親油性溶媒又はビヒクルには、ごま油のような脂肪油、又はエチルクリート若しくはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステルが含まれる。
活性成分は、例えばコアセルベーション技術又は界面重合法によって調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセル又はゼラチン－マイクロカプセル及びポリ－（メチルメタクリレート（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセルに、コロイド薬物送達システム（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフィア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）に、又はマクロエマルジョンに封入することができる。これらの技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences(18th Ed. Mack Printing Company, 1990)に開示されている。徐放性製剤が調製されてもよい。徐放性製剤の適切な例は、ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリックスは成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。特定の実施態様では、注射可能な組成物の吸収を、例えばモノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン、又はそれらの組み合わせといった吸収を遅延させる薬剤を組成物に使用することにより持続させることができる。
上記の組成物に加えて、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、デポー製剤として製剤化することもできる。このような長時間作用型の製剤は、注入（例えば、皮下若しくは筋肉内）により、又は筋肉内注射により投与することができる。従って、例えば、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、適切なポリマー性若しくは疎水性物質（例えば、許容可能なオイル中の乳濁液としての）又はイオン交換樹脂を用いて、又は難溶性の誘導体として、例えば難溶性の塩として製剤化することができる。
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含む薬学的組成物は、一般的な混合、溶解、乳化、カプセル化、封入、又は凍結乾燥方法により製造することができる。薬学的組成物は、一又は複数の生理的に許容される担体、希釈材、賦形剤、又は薬学的に使用可能な調製物へのタンパク質の処理を容易にする補助剤を用いる一般的な方法で製剤化することができる。適当な製剤は、選択される投与経路によって決定する。
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、遊離酸又は遊離塩基の、天然又は塩の形態の組成物に製剤化することができる。薬学的に許容される塩は、遊離酸又は遊離塩基の生物活性を実質的に保持する塩である。これらには、酸付加塩、例えば、タンパク質性組成物の遊離アミノ基で形成されたもの、又は例えば塩酸若しくはリン酸といった無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸若しくはマンデル酸といった有機酸で形成されたものが含まれる。また、遊離カルボキシル基で形成される塩は、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は水酸化第二鉄といった無機塩基；又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、又はプロカインといった有機塩基から誘導することができる。薬学的塩は、対応する遊離塩基形態より、水性及び他のプロトン性溶媒に溶け易い。
治療的方法及び組成物
本明細書において提供されるいずれのＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子も、治療法に使用することができる。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、例えばがんの治療において、免疫療法薬剤として使用することができる。
治療法において使用される場合、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、医学行動の規範に則って製剤化、投薬、及び投与される。この観点において考慮すべき要因は、治療される特定の障害、治療される特定の患者、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤送達部位、投与方法、投与日程及び医療従事者が知る他の要因を包含する。
一態様では、医薬としての使用のための本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が提供される。更なる態様では、疾患の治療において使用される本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が提供される。特定の実施態様では、治療法において使用される本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が提供される。一実施態様では、本発明は、それを必要とする個体の疾患の治療に使用される、本明細書に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。特定の実施態様では、本発明は、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の治療的有効量を個体に投与することを含む、疾患を有する個体の治療法において使用されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。特定の実施態様では、治療される疾患は増殖性疾患である。特定の一実施態様では、疾患はがんである。特定の実施態様では、方法は更に、個体に対して少なくとも一つの追加の治療剤、例えば、治療される疾患ががんであれば抗がん剤の治療的有効量を投与することを含む。更なる実施態様では、本発明は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解の誘導に使用される、本明細書に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。特定の実施態様では、本発明は、個体に対し、標的細胞の溶解を誘導するためにＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の有効量を投与することを含む、個体の標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導する方法に使用されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。上記実施態様の何れかによる「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトである。
更なる態様では、本発明は、医薬の製造又は調製における本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の使用を提供する。一実施態様では、医薬は、それを必要とする個体の疾患の治療を目的とするものである。更なる実施態様において、本医薬は、疾患を有する個体に対し、医薬の治療的有効量を投与することを含む、疾患を治療する方法で使用するためのものである。特定の実施態様では、治療される疾患は増殖性疾患である。特定の一実施態様では、疾患はがんである。一実施態様では、方法は更に、個体に対し、少なくとも一つの追加の治療剤、例えば、治療される疾患ががんであれば抗がん剤の治療的有効量を投与することを含む。更なる実施態様では、医薬は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導するためのものである。また更なる実施態様では、医薬は、個体に対し、標的細胞の溶解を誘導するために医薬の有効量を投与することを含む、個体の標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導する方法における使用を目的とする。上記実施態様の何れかによる「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトとすることができる。
更なる態様において、本発明は、疾患を治療する方法を提供する。一実施態様では、方法は、そのような疾患を有する個体に対し、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の治療的有効量を投与することを含む。一実施態様では、薬学的に許容される形態の本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含む組成物が、前記個体に対して投与される。特定の実施態様では、治療される疾患は増殖性疾患である。特定の一実施態様では、疾患はがんである。特定の実施態様では、方法は更に、個体に対して少なくとも一つの追加の治療剤、例えば、治療される疾患ががんであれば抗がん剤の治療的有効量を投与することを含む。上記実施態様の何れかによる「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトとすることができる。
更なる態様では、本発明は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導する方法を提供する。一実施態様では、方法は、Ｔ細胞、特に細胞傷害性Ｔ細胞の存在下において、標的細胞に本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を接触させることを含む。更なる態様において、個体の標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導する方法が提供される。このような一実施態様では、方法は、標的細胞の溶解を誘導するために、個体に対してＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の有効量を投与することを含む。一実施態様において、「個体」はヒトである。
特定の実施態様では、治療される疾患は増殖性疾患、特にがんである。がんの非限定的な例には、前立腺がん、脳のがん、頭部及び頸部のがん、膵臓がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頚がん、子宮内膜がん、食道がん、結腸がん、結腸直腸がん、直腸がん、胃がん、前立腺がん、血液がん、皮膚がん、扁平上皮癌、骨のがん、及び腎臓がんが含まれる。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を用いて治療することができる他の細胞増殖性疾患には、限定されないが、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、睾丸、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭部及び頸部、神経系（中枢及び末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、及び泌尿生殖器系に位置する腫瘍が含まれる。前がん性の状態又は病変及びがん転移も含まれる。特定の実施態様では、がんは、腎細胞がん、皮膚がん、肺がん、結腸直腸がん、乳がん、脳のがん、頭部及び頸部のがんからなる群より選択される。当業者は、多くの場合Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は治癒をもたらさず、部分的恩恵を提供するだけであることを認識する。幾つかの実施態様では、幾つかの恩恵を有する生理的変化も治療的に有益と考えられる。従って、幾つかの実施態様では、生理的変化をもたらすＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の量は、「有効量」又は「治療的有効量」と考えられる。治療を必要とする被検体、患者、又は個体は、典型的には哺乳動物であり、具体的にはヒトである。
幾つかの実施態様では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の有効量が細胞に投与される。他の実施態様では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の治療的有効量が、疾患の治療のために個体に投与される。
疾患の予防又は治療のために、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の適切な容量は（単独で使用されるか、或いは一又は複数の他の追加的治療剤との組み合わせで使用されるときの）、治療される疾患の種類、投与経路、患者の体重、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の種類、疾患の重症度及び経過、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が予防又は治療いずれの目的で投与されるか、直前又は同時に行われる治療的介入、患者の病歴及びＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に対する応答、並びに主治医の裁量によって決定される。投与の責任を負う施術者は、いずれにしろ、組成物中の活性成分の濃度及び個別の被験者に適切な用量を決定する。限定されないが、様々な時点にわたる、単一又は複数回投与、ボーラス投与、パルス注入を含む様々な投与スケジュールが本明細書で考慮される。
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、患者に対して、単回、又は一連の治療にわたって適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば一回以上の別個の投与によるか、連続注入によるかに関わらず、約１μｇ／ｋｇ～１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ）のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が患者への投与のための初期候補用量となり得る。一つの典型的な一日あたり用量は、上記要因に応じて約１μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲である。数日以上にわたる反復投与に関しては、状態に応じて、治療は一般に疾患症状の望まれる抑制が起こるまで持続されるであろう。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の一つの例示的用量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇであろう。他の非限定的実施例では、用量は、一回の投与につき、体重１ｋｇあたり約１マイクログラム、体重１ｋｇあたり約５マイクログラム、体重１ｋｇあたり約１０マイクログラム、体重１ｋｇあたり約５０マイクログラム、体重１ｋｇあたり約１００マイクログラム、体重１ｋｇあたり約２００マイクログラム、体重１ｋｇあたり約３５０マイクログラム、体重１ｋｇあたり約５００マイクログラム、体重１ｋｇあたり約１ミリグラム、、体重１ｋｇあたり約５ミリグラム、体重１ｋｇあたり約１０ミリグラム、体重１ｋｇあたり約５０ミリグラム、体重１ｋｇあたり約１００ミリグラム、体重１ｋｇあたり約２００ミリグラム、体重１ｋｇあたり約３５０ミリグラム、体重１ｋｇあたり約５００ミリグラム、体重１ｋｇあたり約１０００ｍｇ以上及びそこから導かれるあらゆる範囲を含む。本明細書に列挙される数字から導かれる範囲の非限定的な例では、上記の数字に基づいて、体重１ｋｇあたり約５ｍｇ～体重１ｋｇあたり約１００ｍｇ、体重１ｋｇあたり約５マイクログラム～体重１ｋｇあたり約５００ミリグラムなどが投与され得る。従って、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの一又は複数の用量（又はこれらの何れかの組み合わせ）を患者に投与してよい。このような用量は断続的に、例えば毎週又は３週毎（例えば患者が約２～約２０投与量、又は例えば約６投与量のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を受けるように）投与してよい。初期の高負荷用量の後、一つ以上の低用量を投与してよい。しかしながら、他の用量用法も有用であり得る。この治療法の進行は、従来の技術及びアッセイにより容易にモニタリングされる。
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、通常、意図された目的を達成するために有効な量で使用される。疾患状態を治療又は予防するための使用のために、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子、又はその薬学的組成物は、治療的有効量で投与又は適用される。治療的有効量の決定は、特に本明細書に提供される詳細な開示内容を踏まえると十分に当業者の能力の範囲内である。
全身投与の場合、治療的に有効な用量は、まずは細胞培養アッセイのようなインビトロアッセイに基づいて推定することができる。次いで用量を、細胞培養物において決定されるＩＣ５０を含む循環濃度範囲を達成するために、動物モデルにおいて製剤化することができる。このような情報は、ヒトにおいて有用な用量を更に正確に決定するために使用することができる。
初期投与量は、インビボデータ、例えば動物モデルから、当該技術分野で周知の技術を用いて推定することもできる。当業者であれば、動物データに基づいて、ヒトへの投与を容易に最適化することができるであろう。
投与の量及び間隔は、治療効果を維持するために十分なＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の血漿レベルを提供するために個別に調整される。注射による投与のための通常の患者への投与量は、約０．１～５０ｍｇ／ｋｇ／日、典型的には約０．５～１ｍｇ／ｋｇ／日にわたる。治療的に有効な血漿レベルは、毎日複数の用量を投与することにより達成することができる。血漿中のレベルは、例えばＨＰＬＣにより測定することができる。
局所投与又は選択的取り込みの場合、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の有効な局所濃度は血漿濃度に関連していなくともよい。当業者であれば、過度の実験をしなくとも、治療的に有効な局所投与量を最適化することができるであろう。
本明細書に記載されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の治療的に有効な用量は、通常、実質的な毒性なしで治療的恩恵を提供する。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の毒性及び治療効果は、細胞培養又は実験動物における標準の薬学的手順により決定することができる。細胞培養アッセイ及び動物の研究は、ＬＤ５０（集団の５０％を死に至らしめる用量）及びＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するために使用することができる。毒性と治療効果との用量比が治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０と表現することができる。大きな治療指数を呈するＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が好ましい。一実施態様では、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、高い治療指数を呈する。細胞培養アッセイ及び動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用に適した一定範囲の投与量の製剤化に使用することができる。投与量は、好ましくは、毒性を殆ど又は全く伴わないＥＤ５０を含む、一定範囲の循環濃度内にある。投与量は、種々の要因、例えば、用いられる投与形態、使用される投与経路、対象の状態などに応じてこの範囲内で変動し得る。正確な製剤、投与経路、及び用量は、患者の状態を考慮して個々の医師により選択されうる（例えば、Fingl et al., 1975, in:ThePharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1, p. 1を参照。この文献はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を用いて治療される患者の主治医には、毒性、器官不全などにより、いつ及びどのようにして投与を終了、中断、又は調整するかが分かるであろう。逆に、主治医は、臨床応答が十分でなかった場合には（毒性なしで）、治療レベルを上げるように調整することも分かっているであろう。対象となる障害の管理において投与される用量の大きさは、治療される状態の重症度、投与経路などによって変動する。例えば、状態の重症度は、部分的には標準の予後評価方法により評価される。更に、用量及び恐らくは投薬回数も、個々の患者の年齢、体重、及び応答により変動する。
その他の薬剤及び治療
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、療法において、一又は複数の他の薬剤との組み合わせで投与される。例えば、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、少なくとも一つの追加的治療剤と共投与される。用語「治療剤」は、症状又は疾患を治療するために、そのような治療を必要とする個体に投与されるあらゆる薬剤を包含する。このような追加的な治療剤は、治療されている特定の兆候に適したあらゆる活性成分、好ましくは、互いに打ち消し合うことのない相補的活性を有する活性成分を含む。特定の実施態様では、追加的治療剤は、免疫調節剤、細胞増殖抑制剤、細胞接着の阻害剤、細胞傷害性剤、細胞アポトーシスの活性剤、又はアポトーシス誘導因子に対する細胞の感受性を増大させる薬剤である。特定の実施態様では、追加的治療剤は、抗がん剤、例えば微小管破壊因子、抗代謝剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ＤＮＡインターカレーター、アルキル化剤、ホルモン療法、キナーゼ阻害剤、受容体アンタゴニスト、腫瘍細胞アポトーシスの活性化因子、又は抗血管新生剤である。
このような他の薬剤は、好適には、意図した目的に有効な量で組み合わされて存在する。このような他の薬剤の有効量は、使用されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の量、障害又は治療の種類、及び上記他の要因によって決まる。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、一般的に、本明細書に記載されるものと同じ用量及び投与経路において、又は本明細書に記載された用量の１％～９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の用量及び任意の経路により使用される。
上記のこうした併用療法は、併用投与（二つ以上の治療剤が、同一又は別々の組成物に含まれている）、及び本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の投与が、追加の治療剤及び／又はアジュバントの投与の前、投与と同時、及び／又は投与の後に起きうる分離投与を包含する。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、放射線療法と組み合わせて使用することもできる。
別の態様では、本発明は、ＰＤ－Ｌ１又はＦＡＰ－４－１ＢＢＬに対する抗体と組み合わせて使用するための、ａ）配列番号２７４の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び配列番号３１の可変軽鎖ドメインを含む第１の抗原結合部位；及びｂ）配列番号３６の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び配列番号３１の可変軽鎖ドメインを含む第２抗原結合部位を含む二重特異性抗体を提供する。一実施態様において、二重特異性抗体は、配列番号２７４の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び配列番号３１の可変軽鎖ドメインを含む第３の抗原結合部位を更に含む。
製造品
本発明の別の態様では、上述した障害の治療、予防、及び／又は診断に有用な材料を含む製造品が提供される。製造品は、容器と容器上又は容器に付随するラベル又はパッケージ挿入物を含む。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ輸液バッグなどを含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器は、症状の治療、予防、及び／又は診断に有効な、単独の又はその他の組成物と併用される化合物を収容し、無菌のアクセスポートを有することができる（例えば、容器は皮下注射針により穿孔可能なストッパーを有する静脈内溶液のバッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも一つの活性な薬剤は、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子である。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が特定の症状の治療のために使用されることを示している。更に、製造品は、（ａ）本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を包含する組成物を中に含む第一の容器；及び（ｂ）更なる細胞障害性又はその他の治療的薬剤を中に含む組成物を含む第２の容器を含み得る。本発明の本実施態様における製造品は、組成物が特定の疾患を治療するために使用されうることを示す添付文書を更に含んでもよい。或いは、又は加えて、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化塩水、リンガー溶液及びデキストロース溶液を含む第二（又は第三）の容器を更に含んでもよい。これは、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的に及びユーザーの立場から望まれる他の物質を更に含んでもよい。
以下は、本発明の方法及び組成物の実施例である。上に提供された一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施されうることが理解される。
一般的方法
組換えＤＮＡ技術
標準的な方法を使用して、Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されているようにＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬を、製造元の指示に従って使用した。ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般情報は以下に与えられている：Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., NIH Publication No. 91-3242。
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列は、Ｓｙｎｅｒｇｅｎｅ（Ｓｃｈｌｉｅｒｅｎ）で標準的な二本鎖配列決定により決定された。
遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントは、必要に応じて、適切なテンプレートを用いてＰＣＲによって生成するか、又は自動化された遺伝子合成による合成オリゴヌクレオチド及びＰＣＲ生成物からＧｅｎｅａｒｔ ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により合成した。正確な遺伝子配列が入手可能でない場合、最も近いホモログ由来の配列に基づいてオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、適切な組織を起源とするＲＮＡからＲＴ－ＰＣＲによって遺伝子を単離した。特異的な制限エンドヌクレアーゼ切断部位に隣接する遺伝子セグメントを、標準のクローニング／シーケンシングベクター中にクローニングした。形質転換した細菌からプラスミドＤＮＡを精製し、ＵＶ分光法により濃度を決定した。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクター中へのサブクローニングを可能にする適切な制限部位を用いて設計された。全てのコンストラクトは、真核細胞内の分泌のためにタンパク質を標的とするリーダーペプチドをコードする５’末端ＤＮＡ配列を含むように設計された。
ＰＢＭＣからの初代ヒトｐａｎ Ｔ細胞の単離
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、地方血液銀行から、又は健常なヒトドナーの新鮮血から得られた濃縮したリンパ球調製物（バフィーコート）のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ密度遠心分離により調製した。簡潔には、血液を滅菌ＰＢＳで希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅグラジエント上に慎重に重ねた（Ｓｉｇｍａ、Ｈ８８８９）。室温で４５０ｘｇで３０分間遠心分離した後（ブレーキをオフに切り替えて）、ＰＢＭＣを含有する界面相の上の血漿の部分を棄てた。ＰＢＭＣを新しい５０ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブに移し、総体積５０ｍｌになるまでチューブをＰＢＳで満たした。混合物を室温で１０分間４００ｘｇ（ブレーキをオンに切り替えて）で遠心分離した。上清を棄て、ＰＢＭＣペレットを滅菌ＰＢＳで２回洗浄した（遠心分離工程は４℃で１０分間、３５０ｘｇで行った）。その結果得られたＰＢＭＣ集団を自動カウントし（ＶｉＣｅｌｌ）、インキュベーター内において、３７℃、５％ＣＯ２で１０％のＦＣＳ及び１％のＬ－アラニル－Ｌ－グルタミン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、Ｋ０３０２）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中に、アッセイ開始まで保管した。
ＰＢＭＣからのＴ細胞濃縮は、製造元の指示に従って、Ｐａｎ Ｔ細胞単離キットＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＃１３０－０９１－１５６）を用いて実行された。簡潔には、細胞ペレットを、細胞１０００万個あたり４０μｌの冷バッファー（０．５％のＢＳＡ、２ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳ、滅菌濾過）で希釈し、細胞１０００万個あたり１０μｌのビオチン抗体カクテルで１０分間４℃でインキュベートした。細胞１０００万個あたり３０μｌの冷バッファー及び２０μｌの抗ビオチン磁気ビーズを加え、混合物を更に１５分間４℃でインキュベートした。現在の体積の１０～２０ｘを加え、続いて３００ｘｇで１０分間の遠心分離工程を行うことにより細胞を洗浄した。最大１億個の細胞を５００μｌのバッファーに再懸濁した。非標識ヒトｐａｎ Ｔ細胞の磁気分離を、製造元の指示に従ってＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＃１３０－０４２－４０１）を用いて実行した。その結果得られたＴ細胞集団を自動カウントし（ＶｉＣｅｌｌ）、インキュベーター内において、３７℃、５％ＣＯ２でＡＩＭ－Ｖ培地中に、アッセイ開始まで（２４時間以内）保管した。
ＰＢＭＣからの初代ヒト天然Ｔ細胞の単離
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、地方血液銀行から、又は健常なヒトドナーの新鮮血から得られた濃縮したリンパ球調製物（バフィーコート）のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ密度遠心分離により調製した。ＰＢＭＣからのＴ細胞濃縮は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社のＮａｉｖｅ ＣＤ８＋Ｔ細胞単離キット（＃１３０－０９３－２４４）を製造元の指示に従って用い、但し最後のＣＤ８＋ Ｔ細胞の単離工程を省いて実行された（初代ヒトｐａｎ Ｔ細胞の単離についての記載も参照）。
脾細胞からのマウスｐａｎ Ｔ細胞の単離
Ｃ５７ＢＬ／６マウスから脾臓を単離し、ＭＡＣＳバッファー（ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ＋２ｍＭのＥＤＴＡ）を含むＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｃ－チューブ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＃１３０－０９３－２３７）に移し、製造元の指示に従ってＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒを用いて解離させ、単一細胞の懸濁液を得た。細胞懸濁液をプリセパレーションフィルターに通し、解離していない残りの組織粒子を除去した。４００ｘｇで４分間、４℃で遠心分離した後、ＡＣＫ溶解バッファーを加えて赤血球を溶解させた（室温で５分間のインキュベーション）。残りの細胞をＭＡＣＳバッファーで２回洗浄し、カウントし、マウスｐａｎ Ｔ細胞の単離に使用した。陰性（磁気性）選択を、製造元の指示に従って、Ｐａｎ Ｔ細胞単離Ｋｉｔ ＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＃１３０－０９０－８６１）を用いて実行した。その結果得られたＴ細胞集団を自動カウントし（ＶｉＣｅｌｌ）、更なるアッセイに直ちに使用した。
ヘパリン添加血液からの一次的カニクイザルＰＢＭＣの単離
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、以下のようにして健常なカニクイザルドナーの新鮮血から密度遠心分離により調製した。ヘパリン添加血液を、滅菌ＰＢＳで１：３に希釈し、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ培地（Ａｘｏｎ Ｌａｂ ＃１１１４５４５）を滅菌ＰＢＳで９０％に希釈した。希釈した血液の二つの体積を、希釈した密度勾配の一体積上に重ね、ＰＢＭＣ画分を、ブレーキなし及び室温で、３０分間にわたり５２０ｘｇで遠心分離した。ＰＢＭＣバンドを新しい５０ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブに移し、１０分間にわたる４℃で４００ｘｇでの遠心分離により滅菌ＰＢＳで洗浄した。一回の低速遠心分離を実行して血小板を除去し（１５０ｘｇで１５分間、４℃）、その結果得られたＰＢＭＣ集団を自動カウントし（ＶｉＣｅｌｌ）、更なるアッセイに直ちに使用した。
実施例１
ビオチン化葉酸受容体－Ｆｃ融合体の精製
ヒトＦｏｌＲ１に対する新しい抗体を生成するために、以下の抗原及びスクリーニングツールを一価Ｆｃ融合タンパク質（Ｆｃ－ホール分子と同時発現されるＦｃ－ノブのヒンジ領域に連結した抗原の細胞外ドメイン）として作製した。ＧｅｎＢａｎｋ又はＳｗｉｓｓＰｒｏｔから得られた配列に基づいて抗原遺伝子を合成し（Ｇｅｎｅａｒｔ、Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、インビボ又はインビトロでのビオチン化のためのＣ末端Ａｖｉタグを有するＦｃ－ノブとの融合タンパク質を生成するための発現ベクターに挿入した。インビボビオチン化は、生成中における、細菌ビオチンリガーゼをコードする細菌ｂｉｒＡ遺伝子の同時発現によって達成された。全ての遺伝子の発現は、ＥＢＮＡ含有細胞株におけるプラスミドの安定した維持のためのｏｒｉＰエレメントを含むプラスミド上のキメラＭＰＳＶプロモーターの制御下にあった。
ビオチン化単量体抗原／Ｆｃ融合分子の調製のために、指数関数的に増殖する懸濁液ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞を、融合タンパク質の２つの成分（ノブ及びホール鎖）ならびにビオチン化反応に必要な酵素であるＢｉｒＡをコードする３つのベクターでコトランスフェクトした。対応するベクターを９．５：９．５：１の比（「抗原ＥＣＤ－Ｆｃノブ－ａｖｉタグ」：「Ｆｃホール」：「ＢｉｒＡ」）で使用した。
５００ｍｌの振盪フラスコ内での生成のために、４億個のＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞をトランスフェクションの２４時間前に播種した。トランスフェクションのために、細胞を２１０ｇで５分間遠心分離し、予め温めた２０ｍｌのＣＤ ＣＨＯ培地により上清を置き換えた。発現ベクターを２００μｇのベクターＤＮＡを含有する２０ｍＬのＣＤ ＣＨＯ培地に再懸濁した。５４０μＬのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）の添加後、溶液を１５秒間混合し、室温で１０分間インキュベートした。その後細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍＬの振盪フラスコに移し、５％のＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７℃で３時間インキュベートした。インキュベーションの後、１６０ｍＬのＦ１７培地を加え、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの１日後、１ｍＭのバルプロ酸及び７％のＦｅｅｄ １（Ｌｏｎｚａ）を培養液に加えた。生産培地には１００μＭのビオチンも補充した。培養の７日後、細胞を２１０ｇで１５分間遠心沈殿することによって細胞上清を回収した。溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍフィルター）、アジ化ナトリウムを０．０１％（ｗ／ｖ）の最終濃度になるように添加し、４℃に保った。
分泌タンパク質を、プロテインＡを用いたアフィニティークロマトグラフィー、次いでサイズ排除クロマトグラフィーにより細胞培養上清から精製した。アフィニティークロマトグラフィーのために、４０ｍＬの２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ７．５で平衡化したＨｉＴｒａｐ ＰｒｏｔｅｉｎＡ ＨＰカラム（ＣＶ＝５ｍＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に上清を充填した。結合していないタンパク質を、少なくとも１０カラム容量の２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）で洗浄することにより除去した。結合したタンパク質を、２０カラム容量の２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１００ｍＭグリシン、ｐＨ３．０において作製した線形ｐＨ勾配を用いて溶出させた。次いでカラムを、１０カラム容量の２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１００ｍＭグリシン、ｐＨ３．０を用いて洗浄した。
収集した画分のｐＨを、ｐＨ８．０の０．５Ｍリン酸ナトリウムの１／１０（ｖ／ｖ）を添加することによって調整した。タンパク質を、濃縮し、濾過した後、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ塩化ナトリウム溶液（ｐＨ６．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填した。
タンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ）を測定することにより決定した。製造者の説明書（機器Ｃａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐＧＸ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）に従い、還元剤の存在下及び非存在下で、ＦｏｌＲ１－Ｆｃ融合体の純度及び分子量をＳＤＳキャピラリー電気泳動により分析した。試料の凝集物含有量を、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ－アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３（ｐＨ６．７、２５℃のランニングバッファー）で平衡化したＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ分析的サイズ除外カラム（Ｔｏｓｏｈ）を用いて分析した。
精製された抗原－Ｆｃ融合タンパク質を、市販の抗体を用いて表面プラズモン共鳴アッセイによって分析して、抗原の正確で自然なコンフォメーションを確認した（データ非表示）。
Figure 0007146395000002
Figure 0007146395000003
実施例２
ＣＤ３ε特異性を有する共通軽鎖の生成
本明細書に記載のＴ細胞活性化二重特異性分子は、少なくとも一つのＣＤ３結合部分を含む。この部分は、実験動物を免疫し、ファージライブラリーをスクリーニングするか、又は既知の抗ＣＤ３抗体を使用して生成することができる。ＣＤ３ε特異性を有する共通軽鎖は、マウスの親の抗ＣＤ３ε抗体（ＣＨ２５２７）の軽鎖をヒト化することによって生成された。非ヒト起源の抗体のヒト化のために、非ヒト抗体（ドナー）由来のＣＤＲ残基をヒト（アクセプター）抗体のフレームワーク上に移植しなければならない。一般的に、アクセプターフレームワーク配列は、ドナーの配列を潜在的なアクセプター配列の集合体に整列させ、ドナーに対して妥当な相同性を有するもの、又は構造及び活性に重要な幾つかの位置に類似のアミノ酸を示すものを選択することにより選択される。この場合、抗体アクセプターフレームワークの探索は、親抗体のマウスＶＬドメイン配列をヒト生殖系列配列の集合体に整列させ、高い配列同一性を示すヒト配列を選択することによって行った。驚くべきことに、フレームワーク配列相同性の点における良好な一致が、ラムダ型のＶドメインファミリー７、より正確には、ｈＶＬ＿７＿４６（ＩＭＧＴ命名法、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ７３６７４）に属するかなりまれなヒト軽鎖で見出された。続いて、このまれなヒト軽鎖は、ＣＨ２５２７の軽鎖のヒト化のためのアクセプターフレームワークとして選択された。マウス軽鎖可変ドメインの３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）をこのアクセプターフレームワークに移植した。フレームワーク４領域は生殖系列Ｖ遺伝子の可変領域の一部分ではないので、この領域（Ｊ－エレメント）のアライメントは個別に行われた。従って、この軽鎖のヒト化のためにＩＧＬＪ３－０２配列を選択した。
１３個のヒト化変異体が生成された（ＣＨ２５２７－ＶＬ７＿４６－１からＶＬ７＿４６－１０、ＶＬ７＿４６－１２からＶＬ７＿４６－１４）。これらは、マウスＶドメイン配列に逆突然変異したフレームワーク残基（及びそれらの組み合わせ）又はヒト生殖細胞系配列と同一に保つことができるＣＤＲ残基（Ｋａｂａｔ定義）が異なる。ＣＤＲの外側の以下のフレームワーク残基を、最終ヒト化ＶＬドメイン変異体ＶＬ７＿４６－１３（マウス残基を記載）：Ｖ３６、Ｅ３８、Ｆ４４、Ｇ４６、Ｇ４９、及びＧ５７においてマウス残基にそれぞれ逆突然変異させた。ヒトＪ－エレメントＩＧＬＪ３－０２は、マウスの親抗体のＪ－エレメントと１００％同一であった。
実施例３
ＣＤ３ε特異性を有するヒト化変異体のＳＰＲ評価
ヒト化ＶＬ変異体を２＋１古典的フォーマット（図１Ｄ）の、すなわちヒト化軽鎖Ｖドメインがマウス重鎖Ｖドメインと対合しているキメラとして評価した。ＳＰＲ評価は、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６機器（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で行った。より正確には、変異体は、抗Ｆａｂ誘導化ＧＬＭセンサーチップ（ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２断片特異的、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）上で培養上清から垂直方向に直接捕捉された。続いて、以下の分析物を、ヒト及びカニクイザルＣＤ３：３μＭのｈｕ ＣＤ３ε（－１－２６）－Ｆｃ（ノブ）－ａｖｉ（ＩＤ８０７）及び２．５μＭのｃｙ ＣＤ３ε－（－１－２６）－Ｆｃ（ノブ）－Ａｖｉ－Ｆｃ（ホール））（ＩＤ８７３）のそれぞれへの結合を評価するために、単一濃度として水平に注入した。結合応答を、マウス対照コンストラクトの結合と定性的に比較し、＋（同等の結合が観察された）、＋／－（結合の減少が観察された）及び－（結合が観察されなかった）と等級づけされた。捕捉抗体は、各サイクルのリガンド捕捉及び分析物結合の後に再生され、マウスコンストラクトは、捕捉表面の活性を確認するために研究の最後に再注入された。結果を３に要約する。
Figure 0007146395000004
実施例４
ＣＤ３ε特異性を有するヒト化共通軽鎖の特性
ヒト化リード分子のために選択された軽鎖Ｖドメイン変異体はＶＬ７＿４６－１３である。ヒトらしさの程度、すなわち、ヒト化Ｖ－ドメインとヒト生殖細胞系Ｖ－ドメイン配列との配列相同性を決定した。ＶＬ７＿４６－１３については、最も近いヒト生殖系列ホモログとの全体的な配列同一性は、ヒト化前で６５％、その後で８０％である。ＣＤＲ領域を除いて、配列同一性は最も近いヒト生殖系列ホモログに対して９２％である。表３からわかるように、ＶＬ７＿４６－１３は、親マウス抗体と同等の結合を示し、かつまたカニクイザルＣＤ３εに対するその交差反応性を保持した１３個の変異体のパネルからの唯一のヒト化ＶＬ変異体である。この結果は、ＣＤＲ１にＧ２４を保持しつつ、マウスフレームワーク残基（特にＧ４６）への幾つかの逆突然変異を必要とするＣＤ３εへの結合親和性を失うことなく、マウスＶＬドメインをヒト化することはささいではなかったことを示す。更に、この結果は、ＶＬドメインが標的認識において重要な役割を果たすことを示す。重要なことに、ラムダ型のＶドメインファミリー７に属し、ＣＤ３εに対する親和性及び特異性を保持するまれなヒト生殖系列に基づくヒト化ＶＬドメインＶＬ７＿４６－１３も、Ｆａｂ－フォーマットのファージディスプレイされた抗体ライブラリーにおいて共通軽鎖として使用するのに適しており、ＣＤ３ε、及び例えば腫瘍標的に結合し、同じ「共通」軽鎖を共有する二重特異性分子の生成及び産生を非常に容易にする新規な特異性のための首尾良い選択を可能にする。
実施例５
ＨＶＫ１－３９由来のヒト生殖細胞系共通軽鎖を用いたファージ提示抗体ライブラリーの作成
完全長ヒトＩｇＧに類似する二重特異性抗体を作成するための幾つかのアプローチは、２つの異なる重鎖のヘテロ二量体化を誘導するＦｃ領域の修飾を利用する。このような例には、ノブ・イントゥー・ホール（Merchant et al., Nat Biotechnol. 1998 Jul;16(7):677-81 )SEED(Davis et al., Protein Eng Des Sel. 2010 Apr;23(4):195-202）及び静電ステアリング技術（Gunasekaran et al., J Biol Chem. 2010 Jun 18;285(25):19637-46）が含まれる。これらのアプローチは、２つの異なる重鎖の効果的なヘテロ二量体化を可能にするが、同族の軽鎖と重鎖の適切な対合が依然として問題である。共通軽鎖（ＬＣ）の使用によりこの問題を解決することができる（Merchant, et al. Nat Biotech 16, 677-681 (1998)）。
ここでは、Ｍ１３ファージ上のディスプレイのための抗体ライブラリーの作成について説明する。本質的に、我々は１つの定常（又は「共通」）軽鎖を有する重鎖のためのマルチフレームワークライブラリーを設計した。このライブラリーは、軽鎖の誤対合を避けるために洗練された技術を使用する必要無しに多重特異性抗体を生成するために設計されている。
共通軽鎖を用いることにより、誤対合がこれ以上は生じないので、これらの分子の産生を促進することができ、高純度の二重特異性抗体の単離が容易になる。他のフォーマットと比較して、構成要素としてのＦａｂ断片の使用は、例えばｓｃＦｖ断片の使用と対照的に、より高い熱安定性及びｓｃＦｖ凝集及び分子間ｓｃＦｖ形成の欠如をもたらす。
ライブラリー作成
以下では、Ｍ１３ファージ上のディスプレイのための抗体ライブラリーの作成について記載する。本質的に、我々は１つの定常（又は「共通」）軽鎖を有する重鎖のためのマルチフレームワークライブラリーを設計した。
我々はライブラリーでこれらの重鎖を使用した（括弧内のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号）：
ＩＧＨＶ１－４６＊０１（Ｘ９２３４３）（配列番号１０４）、
ＩＧＨＶ１－６９＊０６（Ｌ２２５８３）、（配列番号１０５）
ＩＧＨＶ３－１５＊０１（Ｘ９２２１６）、（配列番号１０６）
ＩＧＨＶ３－２３＊０１（Ｍ９９６６０）、（配列番号１０７）
ＩＧＨＶ４－５９＊０１（ＡＢ０１９４３８）、（配列番号１０８）
ＩＧＨＶ５－５１＊０１（Ｍ９９６８６）、（配列番号１０９）
ＩＧＨＪ６配列を使用するＩＧＨＶ１－６９＊０６を除き、全ての重鎖はＪ－エレメントとしてＩＧＨＪ２を使用する。ランダム化の設計には、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３が含まれていた。ＣＤＲ－Ｈ１及びＣＤＲ－Ｈ２については、「ソフト」ランダム化戦略が選択され、ランダム化オリゴヌクレオチドは、生殖系列配列のアミノ酸のコドンが５０％で存在するようなものであった。他の全てのアミノ酸は、システインを除いて、残りの５０％について合計した。遺伝的Ｄ因子の存在のために生殖系列アミノ酸が存在しないＣＤＲ－Ｈ３では、長さが４～９アミノ酸のＶ－エレメントとＪ－エレメントとの間の無作為化インサートの使用を可能にするオリゴヌクレオチドが設計された。それらの無作為化された部分に含まれるこれらのオリゴヌクレオチドは、３つのアミノ酸Ｇ／Ｙ／Ｓがそれぞれ１５％まで存在し、アミノ酸Ａ／Ｄ／Ｔ／Ｒ／Ｐ／Ｌ／Ｖ／Ｎ／Ｗ／Ｆ／Ｉ／Ｅはそれぞれ４，６％まで存在する。
抗体ライブラリー作成のための例示的な方法は、Hoogenboom et al., Nucleic Acids Res. 1991, 19, 4133-413; Lee et., al J. Mol. Biol. (2004) 340, 1073-1093に記載される。
軽鎖はヒト配列ｈＶＫ１－３９に由来し、未改変及び非無作為化様式で使用される。これにより、更なる改変を含まずに同じ軽鎖を他のプロジェクトで使用できることが確かとなるであろう。
例示的なライブラリーの選択：
全ての親和性成熟ライブラリーを用いる選択は、標的抗原Ｘの単量体及びビオチン化細胞外ドメインを用いて、以下の手順に従って溶液中で実施される。
１．各ライブラリーの１０１２個のファージミド粒子を１００ｎＭのビオチン化可溶性抗原に全量１ｍｌで０．５時間で結合させる。２．ビオチン化抗原を捕捉し、特異的に結合したファージ粒子を約５×１０７個のストレプトアビジン被覆磁性ビーズの添加により１０分間で単離する。３．ビーズを５－１０倍の１ｍｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０及び５－１０倍の１ｍｌのＰＢＳを用いて洗浄する。４．ファージ粒子の溶出は、１ｍｌの１００ｍＭのＴＥＡ（トリエチルアミン）を１０分間添加し、５００ｕｌの１ＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を添加することによって中和することによって行う。５．指数関数的に増殖する大腸菌ＴＧ１細菌の再感染、ヘルパーファージＶＣＳＭ１３による感染及び続くファージミド粒子のＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿が、その後の選択ラウンドで適用される。選択は、一定濃度の又は漸減濃度（１０－７Ｍから２×１０－９Ｍへ）の抗原を用いて、３～５ラウンドにわたって行った。２ラウンド目では、ストレプトアビジンビーズの代わりにニュートラアビジンプレートを用いて抗原ファージ複合体の捕捉が行われる。抗体のプラスチック支持体への単なる粘着性結合に起因する望まれないクローンと競合するために、全ての結合反応に１００ｎＭのウシ血清アルブミン又は非脂肪ミルク粉末が補充された。
１００ｎＭから開始して最終選択ラウンドにおいて５ｎＭに低下する抗原の抗原濃度を低下させることを使用して、３ラウンド又は４ラウンドにわたり選択が行われている。特異的結合剤は、バックグラウンドよりも約５倍高いシグナルとして定義され、ＥＬＩＳＡにより同定される。ＥＬＩＳＡにより、以下のようにして特異的結合剤が同定される。１ウェル当たり１０ｎＭビオチン化抗原１００μｌをニュートラアビジンプレート上にコーティングする。Ｆａｂ含有細菌の上清を加え、抗Ｆｌａｇ／ＨＲＰ二次抗体を用いることにより、結合するＦａｂをそれらのＦｌａｇタグにより検出する。ＥＬＩＳＡ陽性クローンが、９６ウェルフォーマットにおいて可溶型Ｆａｂ断片として細菌により発現され、上清には、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６（ＢｉｏＲａｄ）を用いたＳＰＲ分析による動態スクリーニング実験が行われる。最も高い親和性定数でＦａｂを発現するクローンが同定され、対応するファージミドが配列決定される。更なる特徴付けのために、Ｆａｂ配列をファージミドからのＰＣＲにより増幅し、適切な制限部位を介して哺乳動物産生用のヒトＩｇＧ１発現ベクターにクローニングする。
ヒト化ＣＤ３ε特異的共通軽鎖を用いたファージ提示抗体ライブラリーの作成
ここでは、Ｍ１３ファージ上のディスプレイのための抗体ライブラリーの作成について記載する。本質的に、我々は１つの定常（又は「共通」）軽鎖を有する重鎖のためのマルチフレームワークライブラリーを設計した。このライブラリーは、ＩｇＧ１ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ又はＩｇＧ４ ＳＰＬＥ ＰＧアイソタイプの、Ｆｃ含有であるがＦｃｇＲ結合不活性のＴ細胞二重特異性抗体であって、ここでは１つ又は２つのＦａｂは腫瘍細胞上に発現された腫瘍表面抗原を認識するが、抗体の残りのＦａｂアームはＴ細胞上のＣＤ３ｅを認識する抗体の生成のために設計された。
ライブラリー作成
以下では、Ｍ１３ファージ上のディスプレイのための抗体ライブラリーの作成について記載する。本質的に、我々は１つの定常（又は「共通」）軽鎖を有する重鎖のためのマルチフレームワークライブラリーを設計した。このライブラリーは、ＩｇＧ１ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ又はＩｇＧ４ ＳＰＬＥ ＰＧアイソタイプの、Ｆｃ含有であるがＦｃｇＲ結合不活性のＴ細胞二重特異性抗体の生成のためにのみ設計されている。
多様性は、異なる重鎖のＣＤＲ３においてのみランダム化オリゴヌクレオチドを介して導入された。抗体ライブラリーの作成のための方法が、（Hoogenboom et al., Nucleic Acids Res. 1991, 19, 4133-413; or in: Lee et., al J. Mol. Biol. (2004) 340, 1073-1093）に記載される。
我々はライブラリーでこれらの重鎖を使用した：
ＩＧＨＶ１－４６＊０１（Ｘ９２３４３），（配列番号１０４）
ＩＧＨＶ１－６９＊０６（Ｌ２２５８３）、（配列番号１０５）
ＩＧＨＶ３－１５＊０１（Ｘ９２２１６）、（配列番号１０６）
ＩＧＨＶ３－２３＊０１（Ｍ９９６６０）、（配列番号１０７）
ＩＧＨＶ４－５９＊０１（ＡＢ０１９４３８）、（配列番号１０８）
ＩＧＨＶ５－５１＊０１（Ｍ９９６８６）、（配列番号１０９）
本発明者らは、ヒト化ヒト及びカニクイザルＣＤ３ε特異的抗体ＣＨ２５２７に由来する軽鎖をライブラリーにおいて使用した：（ＶＬ７＿４６－１３；配列番号１１２）．この軽鎖は無作為化されず、異なる二重特異性結合剤との適合性を確実にするために任意の更なる改変無しで使用された。
ＩＧＨＪ６配列を使用するＩＧＨＶ１－６９＊０６を除き、全ての重鎖はＪ－エレメントとしてＩＧＨＪ２を使用する。遺伝的Ｄ因子の存在のために生殖系列アミノ酸が存在しないＣＤＲ－Ｈ３では、無作為化の設計は、ＣＤＲ－Ｈ３のみに焦点が当てられ、ＰＣＲオリゴヌクレオチドは、長さが４～９アミノ酸のＶ－エレメントとＪ－エレメントとの間の無作為化インサートの使用を可能にするように設計された。
実施例６
ＦｏｌＲ１に対する共通軽鎖ライブラリー（ＣＤ３ε特異性を有する軽鎖を含む）からの抗体断片の選択
ＦｏｌＲ１の異なる種（ヒト、カニクイザル及びマウス）に対するファージディスプレイ選択により、ＣＤ３ε特異性を有する共通軽鎖ＶＬ７＿４６－１３を含む抗体１６Ａ３、１５Ａ１、１８Ｄ３、１９Ｅ５、１９Ａ４、１５Ｈ７、１５Ｂ６、１６Ｄ５、１５Ｅ１２、２１Ｄ１、１６Ｆ１２、２１Ａ５、２１Ｇ８、１９Ｈ３、２０Ｇ６、及び２０Ｈ７を得た。共通軽鎖がヒト生殖系列ＶＨ１＿４６に基づく重鎖レパートリーと対合したクローン１６Ａ３、１５Ａ１、１８Ｄ３、１９Ｅ５、１９Ａ４、１５Ｈ７、１５Ｂ６、２１Ｄ１、１６Ｆ１２、１９Ｈ３、２０Ｇ６、及び２０Ｈ７をサブライブラリーから選択した。このサブライブラリーでは、ＶＨ１＿４６のＣＤＲ３は、６つの異なるＣＤＲ３の長さに基づいて無作為化されている。共通軽鎖がヒト生殖系列ＶＨ３＿１５に基づく重鎖レパートリーと対合したクローン１６Ｄ５、１５Ｅ１２、２１Ａ５、及び２１Ｇ８をサブライブラリーから選択した。このサブライブラリーでは、ＶＨ３＿１５のＣＤＲ３は、６つの異なるＣＤＲ３の長さに基づいて無作為化されている。種交差反応性（又はマウスＦｏｌＲ１反応性）抗体を得るために、ＦｏｌＲ１の異なる種を３ラウンドのバイオパニングにわたって異なる方法で交互にされた（又は一定に保たれた）：１６Ａ３及び１５Ａ１（ヒト－カニクイザル－ヒトＦｏｌＲ１）；１８Ｄ３（カニクイザル－ヒト－マウスＦｏｌＲ１）；１９Ｅ５及び１９Ａ４（マウスＦｏｌＲ１に対して３ラウンド）；１５Ｈ７，１５Ｂ６，１６Ｄ５，１５Ｅ１２，２１Ｄ１，１６Ｆ１２，２１Ａ５，２１Ｇ８（ヒト－カニクイザル－ヒトＦｏｌＲ１）；１９Ｈ３、２０Ｇ６及び２０Ｈ７（マウスＦｏｌＲ１に対して３ラウンド）。
ヒト、マウス及びカニクイザルＦｏｌＲ１を、ＥＬＩＳＡ及びＳＰＲに基づくスクリーニングと同様に、ファージディスプレイ選択のための抗原として、ＨＥＫ ＥＢＮＡ細胞におけるＮ末端単量体Ｆｃ融合物として一時的に発現させ、受容体鎖（Ｆｃノブ鎖）を有するＦｃ部分のＣ末端に位置するａｖｉタグ認識配列でのＢｉｒＡビオチンリガーゼの共発現を介してインビボで部位特異的にビオチン化された。ＦｏｌＲ１に対する特異性を評価するために、２つの関連受容体、ヒトＦｏｌＲ２及びＦｏｌＲ３が同様に生成された。
選択ラウンド（バイオパニング）を以下のパターンに従って溶液中で行った：
１．抗原のＦｃ部分を認識する抗体のライブラリーを枯渇させるために、１０μｇ／ｍｌの無関係のヒトＩｇＧでコーティングされたｍａｘｉｓｏｒｐプレート上の約１０１２個のファージミド粒子の予備洗浄する。
２．１００ｎＭのビオチン化されたヒト、カニクイザル、又はマウスＦｏｌＲ１で非Ｆｃ結合性ファージミド粒子を、、全量１ｍｌでＦｃ結合剤を更に枯渇させるために、１００ｎＭの非ビオチニル化Ｆｃノブ・イントゥー・ホールコンストラクトの存在下で０．５時間インキュベートする。
３．ビオチン化ＦｏｌＲ１を捕捉し、特異的に結合するファージを、ニュートラアビジンプレコートマイクロタイタープレートの４ウェルに１０分間（ラウンド１及びラウンド３で）移すことによって結合させる。
４．５×ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０及び５×ＰＢＳを用いてそれぞれのウェルを洗浄する。
５．１ウェルあたり１００μＭのＴＥＡ（トリエチルアミン）２５０μｌを１０分間添加することによりファージ粒子を溶出し、５００μｌの１ＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を４つのウェルからのプールされた溶出液に添加することによって中和する。
６．Ｆｃ及び非特異的結合剤を最終的に除去するために、１００ｎＭのビオチン捕捉したＦｏｌＲ２又はＦｏｌＲ３を有するニュートラアビジンプレコートマイクロタイタープレート上でのインキュベーションにより中和溶出液を事後洗浄する。
７．溶出されたファージ粒子の上清による対数期大腸菌ＴＧ１細胞の再感染、ヘルパーファージＶＣＳＭ１３による感染、振盪機で３０℃で一晩のインキュベーション、その後の次の選択ラウンドで使用されるファージミド粒子のＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿。
選択は１００ｎＭの一定の抗原濃度を用いて３ラウンドにわたって行った。ラウンド２では、ニュートラアビジンに対する結合剤の濃縮を避けるために、抗原：ファージ複合体の捕捉を、５．４×１０７個のストレプトアビジン被覆磁性ビーズの添加によって行った。ＥＬＩＳＡにより、以下のようにして特異的結合剤が同定された。２５ｎＭのビオチン化ヒト、カニクイザル又はマウスＦｏｌＲ１及び１００μｇ／ｍｌのヒトＩｇＧをニュートラアビジンプレート及びマキシソーププレートにそれぞれコーティングした。Ｆａｂ含有細菌の上清を加え、抗Ｆｌａｇ／ＨＲＰ二次抗体を用いて、結合するＦａｂをそれらのＦｌａｇタグにより検出した。ヒトＦｏｌＲ１に対するシグナルを示し、ヒトＩｇＧに対して陰性であるクローンは、更なる分析のためにリストに載せられ、ＦｏｌＲ１の残りの２種に対して同様に試験された。それらは、０．５リットルの培養液量で細菌で発現され、アフィニティー精製され、更にＢｉｏＲａｄのＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６バイオセンサーを用いたＳＰＲ分析により特徴付けられた。
選択したクローンの親和性（ＫＤ）を、ビオチン化ヒト、カニクイザル、及びマウスＦｏｌＲ１並びにニュートラアビジン捕捉よってＮＬＣチップ上に固定化されたヒトＦｏｌＲ２及びＦｏｌＲ３（陰性対照）により２５℃でＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６装置（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定した。抗原（リガンド）の固定化：組換え抗原をＰＢＳＴ（１０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ７．４）、０．００５％Ｔｗｅｅｎ ２０）で１０μｇ／ｍｌに希釈し、次いで垂直方向に３０μｌ／分で注入した。分析物の注入：「ワンショットキネティクス」測定のために、注入方向を水平配向に変更し、分離したチャネル１～５に沿って精製Ｆａｂの２倍希釈シリーズ（濃度範囲を変化させる）を２００秒の会合時間及び６００秒の解離時間で同時に注入した。参照用に「インライン」ブランクを提供するために、第６のチャネルに沿ってバッファー（ＰＢＳＴ）を注入した。会合センサーグラム及び解離センサーグラムを同時にフィットさせることによるＰｒｏｔｅＯｎ Ｍａｎａｇｅｒ ｖ３．１ソフトウエアの単純な一対一ラングミュア結合モデルを用いて、結合速度定数（ｋｏｎ）と解離速度定数（ｋｏｆｆ）を算出した。平衡解離定数（ＫＤ）はｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出した。表４は、ＦｏｌＲ１に特異的な選択されたクローンの平衡解離定数（ＫＤ）を列挙する。
Figure 0007146395000005
実施例７
ＦｏｌＲ１に対する一般的なマルチフレームワークライブラリーからの抗体断片の選択
抗体１１Ｆ８、３６Ｆ２、９Ｄ１１、５Ｄ９、６Ｂ６、及び１４Ｅ４は、ＦｏｌＲ１の異なる種（ヒト、カニクイザル及びマウス）に対する一般的なマルチフレームワークサブライブラリーに基づくファージディスプレイ選択によって得られた。これらのマルチフレームワークサブライブラリーでは、無作為化ＣＤＲ３（３つの異なる長さ）を有する異なるＶＬドメインが、無作為化ＣＤＲ３（６つの異なる長さ）を有する異なるＶＨドメインと対合する。選択されたクローンは、以下のＶＬ／ＶＨ対である：１１Ｆ８（Ｖｋ＿１＿５／ＶＨ＿１＿６９）、３６Ｆ２（Ｖｋ＿３＿２０／ＶＨ＿１＿４６）、９Ｄ１１（Ｖｋ２Ｄ＿２８／ＶＨ１＿４６）、５Ｄ９（Ｖｋ３＿２０／ＶＨ１＿４６）、６Ｂ６（Ｖｋ３＿２０／ＶＨ１＿４６）、及び１４Ｅ４（Ｖｋ３＿２０／ＶＨ３＿２３）。種交差反応性（又はマウスＦｏｌＲ１反応性）抗体を得るために、ＦｏｌＲ１の異なる種を３又は４ラウンドのバイオパニングにわたって異なる方法で交互にされた（又は一定に保たれた）：１１Ｆ８（カニクイザル－マウス－ヒトＦｏｌＲ１）；３６Ｆ２（ヒト－マウス－カニクイザル－マウスＦｏｌＲ１）；９Ｄ１１（カニクイザル－ヒト－カニクイザルＦｏｌＲ１）；５Ｄ９（ヒト－カニクイザル－ヒトＦｏｌＲ１）；６Ｂ６（ヒト－カニクイザル－ヒトＦｏｌＲ１）及び１４Ｅ４（マウスＦｏｌＲ１に対して３ラウンド）。
ヒト、マウス及びカニクイザルＦｏｌＲ１を、ＥＬＩＳＡ及びＳＰＲに基づくスクリーニングと同様に、ファージディスプレイ選択のための抗原として、ＨＥＫ ＥＢＮＡ細胞におけるＮ末端単量体Ｆｃ融合物として一時的に発現させ、受容体鎖（Ｆｃノブ鎖）を有するＦｃ部分のＣ末端に位置するａｖｉタグ認識配列でのＢｉｒＡビオチンリガーゼの共発現を介してインビボで部位特異的にビオチン化された。ＦｏｌＲ１に対する特異性を評価するために、２つの関連受容体、ヒトＦｏｌＲ２及びＦｏｌＲ３が同様に生成された。
選択ラウンド（バイオパニング）を以下のパターンに従って溶液中で行った：
１．抗原のＦｃ部分を認識する抗体のライブラリーを枯渇させるために、１０μｇ／ｍｌの無関係のヒトＩｇＧでコーティングされたｍａｘｉｓｏｒｐプレート上の約１０１２個のファージミド粒子の予備洗浄する。
２．１００ｎＭのビオチン化されたヒト、カニクイザル、又はマウスＦｏｌＲ１で非Ｆｃ結合性ファージミド粒子を、、全量１ｍｌでＦｃ結合剤を更に枯渇させるために、１００ｎＭの非ビオチニル化Ｆｃノブ・イントゥー・ホールコンストラクトの存在下で０．５時間インキュベートする。
３．ビオチン化ＦｏｌＲ１を捕捉し、特異的に結合するファージを、ニュートラアビジンプレコートマイクロタイタープレートの４ウェルに１０分間（ラウンド１及びラウンド３で）移すことによって結合させる。
４．５×ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０及び５×ＰＢＳを用いてそれぞれのウェルを洗浄する。
５．１ウェルあたり１００μＭのＴＥＡ（トリエチルアミン）２５０μｌを１０分間添加することによりファージ粒子を溶出し、５００μｌの１ＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を４つのウェルからのプールされた溶出液に添加することによって中和する。
６．Ｆｃ及び非特異的結合剤を最終的に除去するために、１００ｎＭのビオチン捕捉したＦｏｌＲ２又はＦｏｌＲ３を有するニュートラアビジンプレコートマイクロタイタープレート上でのインキュベーションにより中和溶出液を事後洗浄する。
７．溶出されたファージ粒子の上清による対数期大腸菌ＴＧ１細胞の再感染、ヘルパーファージＶＣＳＭ１３による感染、振盪機で３０℃で一晩のインキュベーション、その後の次の選択ラウンドで使用されるファージミド粒子のＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿。
選択は１００ｎＭの一定の抗原濃度を用いて３ラウンドにわたって行った。ラウンド２及び４では、ニュートラアビジンに対する結合剤の濃縮を避けるために、抗原：ファージ複合体の捕捉を、５．４×１０７個のストレプトアビジン被覆磁性ビーズの添加によって行った。ＥＬＩＳＡにより、以下のようにして特異的結合剤が同定された。２５ｎＭのビオチン化ヒト、カニクイザル又はマウスＦｏｌＲ１及び１００μｇ／ｍｌのヒトＩｇＧをニュートラアビジンプレート及びマキシソーププレートにそれぞれコーティングした。Ｆａｂ含有細菌の上清を加え、抗Ｆｌａｇ／ＨＲＰ二次抗体を用いて、結合するＦａｂをそれらのＦｌａｇタグにより検出した。ヒトＦｏｌＲ１に対するシグナルを示し、ヒトＩｇＧに対して陰性であるクローンは、更なる分析のためにリストに載せられ、ＦｏｌＲ１の残りの２種に対して同様に試験された。それらは、０．５リットルの培養液量で細菌で発現され、アフィニティー精製され、更にＢｉｏＲａｄのＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６バイオセンサーを用いたＳＰＲ分析により特徴付けられた。
選択したクローンの親和性（ＫＤ）を、ビオチン化ヒト、カニクイザル、及びマウスＦｏｌＲ１並びにニュートラアビジン捕捉よってＮＬＣチップ上に固定化されたヒトＦｏｌＲ２及びＦｏｌＲ３（陰性対照）により２５℃でＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６装置（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定した。抗原（リガンド）の固定化：組換え抗原をＰＢＳＴ（１０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ７．４）、０．００５％Ｔｗｅｅｎ ２０）で１０μｇ／ｍｌに希釈し、次いで垂直方向に３０μｌ／分で注入した。分析物の注入：「ワンショットキネティクス」測定のために、注入方向を水平配向に変更し、分離したチャネル１～５に沿って精製Ｆａｂの２倍希釈シリーズ（濃度範囲を変化させる）を１５０秒又は２００秒の会合時間及び２００秒又は６００秒の解離時間で同時に注入した。参照用に「インライン」ブランクを提供するために、第６のチャネルに沿ってバッファー（ＰＢＳＴ）を注入した。会合センサーグラム及び解離センサーグラムを同時にフィットさせることによるＰｒｏｔｅＯｎ Ｍａｎａｇｅｒ ｖ３．１ソフトウエアの単純な一対一ラングミュア結合モデルを用いて、結合速度定数（ｋｏｎ）と解離速度定数（ｋｏｆｆ）を算出した。平衡解離定数（ＫＤ）はｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出した。表５は、ＦｏｌＲ１に特異的な選択されたクローンの平衡解離定数（ＫＤ）を列挙する。
Figure 0007146395000006
実施例８
ＩｇＧ及びＴ細胞二重特異的フォーマットの新規ＦｏｌＲ１結合剤の産生及び精製
選択された標的細胞のＴ細胞依存的死滅を誘導することができるＦｏｌＲ１結合剤を同定するために、共通軽鎖又はＦａｂライブラリーから単離された抗体を対応するヒトＩｇＧ１フォーマットに変換した。簡潔には、ファージディスプレイ由来のユニークなＦｏｌＲ１結合剤の可変重鎖及び可変軽鎖を、Ｆａｂクローンを鋳型として用いた標準的なＰＣＲ反応によって増幅した。ＰＣＲ産物を精製し、適切なヒト定常重鎖又はヒト定常軽鎖に融合させた適切な発現ベクターに（制限エンドヌクレアーゼ及びリガーゼに基づくクローニングの何れかによって、又はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＩｎＦｕｓｉｏｎキットを用いた「リコンビニアリング（ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ）」によって）挿入した。これらのベクターにおける発現カセットは、キメラＭＰＳＶプロモーター及び合成ポリアデニル化部位からなる。更に、プラスミドは、ＥＢＶ核抗原（ＥＢＮＡ）を保有するＨＥＫ２９３細胞におけるプラスミドの安定な維持のために、エプスタインバーウイルス由来のｏｒｉＰ領域を含む。ＰＥＩ媒介トランスフェクションの後、抗体をＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞中で一過性に産生させ、標準的なプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー、続いてサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した（記載される通り）。
一過性トランスフェクション及び産生
本明細書中で使用される全ての（二重特異性）抗体（商業的供給源から得られない場合）は、以下に記載するように、必要とされるベクターについてのＰＥＩ媒介トランスフェクションの手順を用いてＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞中で一過性に産生された。ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞を、ＣＤ ＣＨＯ培地において血清を含めないで懸濁培養する。５００ｍｌの振盪フラスコ内での生成のために、４億個のＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞をトランスフェクションの２４時間前に播種する（代替スケールについては、全ての量がそれに応じて調整された）。トランスフェクションのために、細胞を２１０ｘｇで５分間遠心分離する。上清は、予め温めた２０ｍｌのＣＤ ＣＨＯ培地により置き換える。発現ベクターを、ＤＮＡの量が最終的に２００μｇになるまで２０ｍｌのＣＤ ＣＨＯ培地中で混合する。５４０μｌのＰＥＩ溶液を加えた後、１５秒間ボルテックスし、その後室温で１０分間インキュベートする。その後細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍｌの振盪フラスコに移し、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７℃で３時間インキュベートする。インキュベーション時間の後、１６０ｍｌのＦ１７培地を加え、細胞を２４時間培養する。トランスフェクションの１日後、１ｍＭのバルプロ酸及び７％のＦｅｅｄ １を加える。７日後、２１０×ｇで１５分間の遠心分離によって培養物の上清を精製のために収集し、溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍのフィルター）、最終濃度０．０１％ｗ／ｖのアジ化ナトリウムを加えて４℃に維持する。生成後、上清を回収し、上清を含む抗体を０．２２μｍの滅菌フィルターを通して濾過し、精製するまで４℃で保存した。
抗体精製
全ての分子は、プロテインＡアフィニティー精製（Ａｋｔａ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ）及びサイズ排除クロマトグラフィーなどの標準的な手順を使用して２段階で精製した。一過性産生から得られた上清をｐＨ８．０（２ＭのＴＲＩＳ（ｐＨ８．０）を使用）に調整し、８カラム容量（ｃｖ）のバッファーＡ（２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５）で平衡化したＨｉＴｒａｐ ＰＡ ＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カラム容量（ｃｖ）＝５ｍｌ）に適用した。１０ｃｖのバッファーＡで洗浄した後、タンパク質を、バッファーＢ（２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ３）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭグリシン）へのｐＨ勾配を用いて、１２ｃｖ以上で溶出させた。目的のタンパク質を含む画分をプールし、溶液のｐＨをｐＨ６．０に緩やかに調整した（０．５ＭのＮａ２ＨＰＯ４（ｐＨ８．０）を使用）。超濃縮器（Ｖｉｖａｓｐｉｎ １５Ｒ ３０．０００ＭＷＣＯ ＨＹ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いて試料を２ｍｌまで濃縮し、次いで２０ｍＭヒスチジン、ｐＨ６．０、１４０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ－２０で平衡化したＨｉＬｏａｄＴＭ １６／６０ ＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ ２００分取グレード（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用した。溶出画分の凝集物含有量を分析用サイズ排除クロマトグラフィーによって分析した。従って、各画分３０μｌを、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ－アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３、ｐＨ６．７のランニングバッファー中で２５℃で平衡化したＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ分析サイズ排除カラム（Ｔｏｓｏｈ）に適用した。２％未満のオリゴマーを含む画分をプールし、超濃縮器（Ｖｉｖａｓｐｉｎ １５Ｒ ３０．０００ ＭＷＣＯ ＨＹ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いて１～１．５ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで濃縮した。タンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ）を測定することにより決定した。製造者の説明書（機器Ｃａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐＧＸ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）に従い、還元剤の存在下及び非存在下で、コンストラクトの純度及び分子量をＳＤＳキャピラリー電気泳動により分析した。精製したタンパク質を液体Ｎ２中で凍結させ、－８０℃で保存した。
インビトロの特徴づけの結果に基づいて、選択された結合剤をＴ細胞二重特異性フォーマットに変換した。これらの分子において、ＦｏｌＲ１：ＣＤ３結合部分は、Ｎ末端に位置するＦｏｌＲ１ Ｆａｂを有する２：１の順序で配置される。標準的なＦａｂライブラリーから単離されたクローンについて、ＣＤ３結合部分はＣｒｏｓｓＦａｂ（ＣＨ１Ｃκ交差）として生成され、一方、共通軽鎖ライブラリーからのクローンについては交差は必要ではなかった。これらの二重特異性分子は、ＩｇＧと同様に産生され精製された。
Figure 0007146395000007
実施例９
２＋１及び１＋１ Ｔ細胞二重特異性フォーマット
インビトロでの死滅特性を比較するために、１つの共通軽鎖結合剤（１６Ｄ５）について４つの異なるＴ細胞二重特異性フォーマットを調製し、Ｆａｂライブラリーからの１つの結合剤について３つのフォーマット（９Ｄ１１）を調製した。
標準的なフォーマットは、既に記載されているように２＋１反転型フォーマットである（Ｎ末端に位置するＦｏｌＲ１ Ｆａｂを有する２：１の順序で配置されたＦｏｌＲ１：ＣＤ３結合部分）。２＋１古典的フォーマットにおいて、ＦｏｌＲ１：ＣＤ３結合部分は、Ｎ末端に位置するＣＤ３ Ｆａｂを有する２：１の順序で配置される。２つの１価のフォーマットも調製した。１＋１頭尾は、Ｎ末端に位置するＦｏｌＲ１ Ｆａｂを有する分子の同じアーム上に１：１の順序で配置されたＦｏｌＲ１：ＣＤ３結合部分を有する。１＋１古典的フォーマトでは、ＦｏｌＲ１：ＣＤ３結合部分が分子の片方のアームの上に１回存在する。標準的なＦａｂライブラリーから単離された９Ｄ１１クローンについて、ＣＤ３結合部分はＣｒｏｓｓＦａｂ（ＣＨ１Ｃκ交差）として生成され、一方、共通軽鎖ライブラリーからの１６Ｄ５については交差は必要ではなかった。これらの二重特異的分子は、標準の反転型Ｔ細胞二重特異性フォーマットと同様に産生され精製された。
Figure 0007146395000008
実施例１０
表面プラズモン共鳴によるＦｏｌＲ１結合剤の生化学的特徴付け
異なる組換え葉酸受容体（ヒトＦｏｌＲ１，２及び３、マウスＦｏｌＲ１及びカニクイザルＦｏｌＲ１；全てＦｃ融合体として）に対するＩｇＧとしての又はＴ細胞二重特異性フォーマットのＦｏｌＲ１結合剤の結合を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって評価した。全てのＳＰＲ実験をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００において、ランニングバッファーとしてＨＢＳ－ＥＰ（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０、Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて２５℃で行った。
単回注入
最初に、抗ＦｏｌＲ１ ＩｇＧを単回注入によって分析し（表１）、（ヒト、マウス及びカニクイザルＦｏｌＲ１）に対するそれらの交差反応性及び（ヒトＦｏｌＲ１、ヒトＦｏｌＲ２、ヒトＦｏｌＲ３に対する）特異性を特徴付けた。ヒト、カニクイザル及びマウス葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１－Ｆｃ）又はヒト葉酸受容体２及び３（ＦｏｌＲ２－Ｆｃ、ＦｏｌＲ３－Ｆｃ）の組換えビオチン化単量体Ｆｃ融合体を、ＳＡチップ上に標準的なカップリング指示（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて直接カップリングさせた。固定レベルは約３００～４００ＲＵであった。ＩｇＧを５００ｎＭの濃度で６０秒間注入した。ｈｕＦｏｌＲ２及びｈｕＦｏｌＲ３に結合するＩｇＧは、特異性の欠如のために拒絶された。結合剤のほとんどは、ヒトとカニクイザルＦｏｌＲ１との間でのみ交差反応性であり、マウスＦｏｌＲ１に対する更なる交差反応性は、ほとんどの場合特異性の喪失と関連していた。
Figure 0007146395000009
葉酸受容体１に対するアビディティー
抗ＦｏｌＲ１ ＩｇＧ又はＴ細胞二重特異性抗体（Ｔ ｃｅｌｌ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃｓ）と組換え葉酸受容体との間の相互作用のアビディティーを以下に記載するように決定した（表９）。
ヒト、カニクイザル及びマウス葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）の組換えビオチン化単量体Ｆｃ融合体を、ＳＡチップ上に標準的なカップリング指示（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて直接カップリングさせた。固定レベルは約３００～４００ＲＵであった。抗ＦｏｌＲ１ ＩｇＧ又はＴ細胞二重特異性抗体を、フローセルを１８０秒にわたって３０μＬ／分の流速で２．１～５００ｎＭの濃度範囲で通過させた。解離を６００秒間モニターした。バルク屈折率の差異は、組換えビオチン化ＩＬ２受容体Ｆｃ融合体を固定化した基準フローセルで取得される応答を差し引くことにより修正された。１９Ｈ３ ＩｇＧとマウス葉酸受容体１との相互作用の分析のために、葉酸塩（Ｓｉｇｍａ Ｆ７８７６）をＨＢＳ－ＥＰランニングバッファー中に２．３μＭの濃度で添加した。ＩｇＧ又はＴ細胞二重特異性抗体の二価結合から生じる結合曲線を、１：１ラングミュア結合に近似させ、そのモデルに適合させた（これは正しくないが、アビディティーの考えを与える）。相互作用の見かけの結合定数は、Ｂｉａ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたフィッティングの速度定数から導かれた。
Figure 0007146395000010
１．葉酸受容体１に対する親和性
抗ＦｏｌＲ１ ＩｇＧ又はＴ細胞二重特異性抗体と組換え葉酸受容体との間の相互作用の親和性を以下に記載するように決定した（表１０）。
親和性測定のために、抗ヒトＦａｂ特異的抗体（Ｆａｂ捕捉キット、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の約６０００～７０００の共鳴単位（ＲＵ）の直接カップリングを、標準的アミンカップリングキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてｐＨ５．０のＣＭ５チップ上で実施した。抗ＦｏｌＲ１ ＩｇＧ又はＴ細胞二重特異性抗体を、２０又は４０秒間、１０μｌ／分の流速で２０ｎＭで捕捉し、参照フローセルは捕捉せずに放置した。ヒト又はカニクイザル葉酸受容体１ Ｆｃ融合体の希釈系列（６．１７～５００ｎＭ又は１２．３５～３０００ｎＭ）を全てのフローセル上で３０μｌ／分で１２０又は２４０秒間通過させ、結合相を記録した。解離相を２４０秒間モニターし、試料溶液からＨＢＳ－ＥＰへの切り替えによってトリガーした。チップ表面は、１０ｍＭのグリシン－ＨＣｌ（ｐＨ２．１又はｐＨ１．５）の６０秒間の二重注入を使用して、毎サイクル後に再生された。バルク屈折率の差異は、基準フローセルで取得される応答を差し引くことにより修正された。相互作用の親和性定数は、Ｂｉａ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたラングミュア結合に対するフィッティングによる速度定数から導かれた。
Figure 0007146395000011
２．ＣＤ３に対する親和性
抗ＦｏｌＲ１ Ｔ細胞二重特異性抗体と組換えヒトＣＤ３ｅｄ－Ｆｃとの間の相互作用の親和性を以下に記載するように決定した（表１１）。
親和性測定のために、抗ヒトＦａｂ特異的抗体（Ｆａｂ捕捉キット、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の約９０００の共鳴単位（ＲＵ）の直接カップリングを、標準的アミンカップリングキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてｐＨ５．０のＣＭ５チップ上で実施した。抗ＦｏｌＲ１ Ｔ細胞二重特異性抗体を、４０秒間、１０μｌ／分の流速で２０ｎＭで捕捉し、参照フローセルは捕捉せずに放置した。ヒトＣＤ３ｅｄ－Ｆｃ融合体の希釈系列（６．１７～５００ｎＭ）を全てのフローセル上で３０μｌ／分で２４０秒間通過させ、結合相を記録した。解離相を２４０秒間モニターし、試料溶液からＨＢＳ－ＥＰへの切り替えによってトリガーした。チップ表面は、１０ｍＭのグリシン－ＨＣｌ（ｐＨ２．１）の６０秒間の二重注入を使用して、毎サイクル後に再生された。バルク屈折率の差異は、基準フローセルで取得される応答を差し引くことにより修正された。相互作用の親和性定数は、Ｂｉａ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたラングミュア結合に対するフィッティングによる速度定数から導かれた。
Figure 0007146395000012
ＣＤ３結合部分は全てのコンストラクトについて同一であり、親和性は測定されたＴ細胞二重特異性抗体（ＫＤ範囲は６０～９０ｎＭ）について同様である。
実施例１１
葉酸受容体１及びＣＤ３に対するＴ細胞二重特異性抗体の同時結合
組換え葉酸受容体１及び組換えヒトＣＤ３ｅｄ－Ｆｃに対する抗ＦｏｌＲ１ Ｔ細胞二重特異性抗体の同時結合を、下記のように表面プラズモン共鳴によって測定した。ヒト、カニクイザル及びマウス葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）の組換えビオチン化単量体Ｆｃ融合体を、ＳＡチップ上に標準的なカップリング指示（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて直接カップリングさせた。固定レベルは約３００～４００ＲＵであった。抗ＦｏｌＲ１ Ｔ細胞二重特異性抗体をフローセルを通して３０μＬ／分の流速で５００ｎＭで６０秒間注入し、続いて５００ｎＭで６０秒間ｈｕ ＣＤｅｄ－Ｆｃを注入した。バルク屈折率の差異は、組換えビオチン化ＩＬ２受容体Ｆｃ融合体を固定化した基準フローセルで取得される応答を差し引くことにより修正された。試験した４つのＴ細胞二重特異性抗体（１６Ｄ５ ＴＣＢ、２１Ａ５ ＴＣＢ、５１Ｃ７ ＴＣＢ及び４５Ｄ２ ＴＣＢ）は、葉酸受容体１及びヒトＣＤ３に予想通りに同時に結合することができた。
実施例１２
エピトープビニング
エピトープビニングのために、抗ＦｏｌＲ１ ＩｇＧ又はＴ細胞二重特異性抗体を、標準アミンカップリングキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてｐＨ５．０のＣＭ５チップ上に直接固定し、最終応答は約７００ＲＵであった。次いで、５００ｎＭのｈｕＦｏｌＲ１－Ｆｃを６０秒間捕捉し、次に５００ｎＭの異なる結合剤を３０秒間捕捉した。表面を１０ｍＭグリシンｐＨ２の２回の注入によりそれぞれ３０秒間再生した。異なる結合剤が、固定化された結合剤に捕捉されたｈｕＦｏｌＲ１に結合できるかどうかを評価する（表１２）。
Figure 0007146395000013
これらの結果及び固定化されたｈｕＦｏｌＲ１に対する同時結合を伴う追加のデータに基づいて、結合剤を３つの群に分類した。９Ｄ１１が他の全ての結合剤を置換するゆえに、９Ｄ１１が別個のエピトープを有するかどうかは明らかではない。１６Ｄ５及び２１Ａ５は同じ群にあり（Coney et al., Cancer Res. 1991 Nov 15;51(22):6125-32; Kalli et al., Curr Opin Investig Drugs. 2007 Dec;8(12):1067-73）、Ｍｏｖ１９、ファーレツズマブ及び３６Ｆ２は別の群にあるようである（表１３）。しかしながら、３６Ｆ２は、ヒト、カニクイザル及びマウスＦｏｌＲ１に結合するので、Ｍｏｖ１９及びファーレツズマブとは異なるエピトープに結合する。
Figure 0007146395000014
実施例１３
結合剤の選択
ＩｇＧフォーマットのＦｏｌＲ１結合剤を、最良の候補を選択するために、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、及び細胞に対するインビトロアッセイによってスクリーニングした。
抗ＦｏｌＲ１ ＩｇＧをＳＰＲによって分析し、（ヒト、マウス及びカニクイザルＦｏｌＲ１）に対するそれらの交差反応性及び（ヒトＦｏｌＲ１、ヒトＦｏｌＲ２、ヒトＦｏｌＲ３に対する）特異性を特徴付けた。ヒトＦｏｌＲ２及び３に対する非特異的結合は除外因子と考えられた。ヒトＦｏｌＲ１に対する結合及び特異性が細胞上で確認された。一部の結合剤は、ＳＰＲにおいて組換えヒトＦｏｌＲ１を認識したにもかかわらず、ＦｏｌＲ１を発現する細胞上には結合しなかった。凝集温度が決定されたが、選択された結合剤が全て安定であったため、除外因子ではなかった。選択された結合剤を多反応性ＥＬＩＳＡにおいて試験して、非特異的結合を確認し、これにより４つの結合剤を排除した。このプロセスは、３６Ｆ２（Ｆａｂライブラリー）、９Ｄ１１（Ｆａｂライブラリー）及び１６Ｄ５（共通軽鎖）の３つの結合剤の最初の選択をもたらした。３６Ｆ２はｈｕＦｏｌＲ１から急速に解離し、従って最初は好まれなかった。
実施例１４
新しく生成したＦｏｌＲ１結合剤のヒトＦｏｌＲ１陽性腫瘍細胞への特異的結合
Ｆａｂ３ライブラリー又はＣＤ３軽鎖を用いた共通軽鎖ライブラリーのどちらかを用いて、新規ＦｏｌＲ１結合剤をファージディスプレイによって生成した。同定された結合剤をヒトＩｇＧ１フォーマットに変換し、ＦｏｌＲ１高発現ＨｅＬａ細胞への結合が処理された。参照分子として、ヒトＦｏｌＲ１結合剤Ｍｏｖ１９が含まれた。このアッセイで試験した結合剤の大部分は、ＦｏｌＲ１に対する中等度から良好な結合を示し、一部のクローンはＭｏｖ１９と同様に良好に結合している（図２参照）。クローン１６Ａ３、１８Ｄ３、１５Ｈ７、１５Ｂ６、２１Ｄ１、１４Ｅ４及び１６Ｆ１２は、細胞上のＦｏｌＲ１への結合がフローサイトメトリーによって確認できなかったため除外した。次の段階で、選択されたクローンを、密接に関連するヒトＦｏｌＲ２への結合を除外することによって、ヒトＦｏｌＲ１に対する特異性について試験した。特異性に対処するために、ＨＥＫ細胞をヒトＦｏｌＲ１又はヒトＦｏｌＲ２の何れかにより一過性にトランスフェクトした。Ｆａｂライブラリーに由来するクローン３６Ｆ２及び９Ｄ１１ならびにＣＬＣライブラリーに由来するクローン１６Ｄ５及び２１Ａ５は、ヒトＦｏｌＲ１に特異的に結合し、ヒトＦｏｌＲ２には特異的に結合しない（図３Ａ－Ｂを参照）。他の全ての試験したクローンは、ヒトＦｏｌＲ２への少なくともある程度の結合を示した（図３Ａ－Ｂを参照）。従って、これらのクローンは、更なる特徴付けから除外された。カニクイザルＦｏｌＲ１へのＦｏｌＲ１クローンの交差反応性は、カニクイザルＦｏｌＲ１を一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ細胞に対する結合試験を行うことによって対処された。全ての試験したクローンはカニクイＦｏｌＲ１に結合することができ、４つの選択されたヒトＦｏＬＲ１特異的クローン３６Ｆ２、９Ｄ１１、１６Ｄ５及び２１Ａ５は、同等に良好にヒト及びカニクイザルＦｏＬＲ１に結合する（図４）。その後、３つのヒトＦｏｌＲ１特異的カニクイザル交差反応性結合剤をＴＣＢフォーマットに変換し、Ｔ細胞死滅及びＴ細胞活性化の誘導について試験した。これらのクローンは、Ｆａｂライブラリー由来の９Ｄ１１及びＣＬＣライブラリー由来の１６Ｄ５及び２１Ａ５であった。参照分子としてＭｏｖ１９ ＦｏｌＲ１ ＴＣＢを全ての研究に含めた。次いでこれらのＦｏｌＲ１ ＴＣＢを使用して、ＨｅＬａ細胞上のＦｏｌＲ１への結合後の内部移行の誘導を比較した。３つ全ての試験したクローンは、ＦｏｌＲ１への結合の際に内部移行し、これはＭｏｖ１９ＦｏＬＲ１ ＴＣＢの結合の際の内部移行に匹敵する（図５）。２１Ａ５ ＦｏｌＲ１ ＴＣＢは、多反応性の徴候のために中止された。
実施例１５
ＦｏｌＲ１ ＴＣＢ抗体によって誘導されるＦｏｌＲ１発現腫瘍標的細胞のＴ細胞媒介性死滅
ＦｏｌＲ１ ＴＣＢを使用して、ＦｏＬＲ１を発現する腫瘍細胞のＴ細胞媒介性死滅を決定した。潜在的な標的細胞株のパネルを使用してＱｉｆｉｋｉｔ分析によりＦｏＬＲ１結合部位を決定した。
腫瘍細胞の使用されたパネルは、ＦｏｌＲ１を高度、中等度及び低度発現腫瘍細胞並びにＦｏｌＲ１陰性細胞株を含む。
Figure 0007146395000015
３つの異なるＦｏＬＲ１ ＴＣＢ（９Ｄ１１，１６Ｄ５及びＭｏｖ１９結合剤を含む）のこの腫瘍細胞株への結合が決定され、ＦｏＬＲ１ ＴＣＢが、ＦｏＬＲ１陰性腫瘍細胞株ではなく、ＦｏｌＲ１発現腫瘍細胞に特異的に結合することを示している。結合したコンストラクトの量は、ＦｏｌＲ１の発現レベルに比例し、検出可能なＦｏｌＲ１低細胞株ＨＴ－２９に対するコンストラクトの良好な結合が依然として存在する。加えて、陰性対照ＤＰ４７ ＴＣＢが使用された細胞株の何れとも結合しない（図６Ａ～Ｅ）。
中等度発現細胞株ＳＫＯＶ３及び低度発現細胞株ＨＴ－２９を更に使用して、１６Ｄ５ ＴＣＢ及び９Ｄ１１ ＴＣＢを用いたＴ細胞媒介性死滅及びＴ細胞活性化を試験した； ＤＰ４７ ＴＣＢを陰性対照として含めた。両方の細胞株は、既に非常に低いレベルの１６Ｄ５ ＴＣＢ及び９Ｄ１１ ＴＣＢの存在下で死滅し、９Ｄ１１ ＴＣＢが１６Ｄ５ ＴＣＢよりもＦｏｌＲ１に強く結合するにもかかわらず、両方のＴＣＢの間には活性に差異はなかった。ＳＫＯＶ３細胞の全死滅は、ＳＫＯＶ３細胞上のより高い発現レベルのＦｏｌＲ１を反映するＨＴ－２９と比較して高かった（図７Ａ～Ｄ）。これに伴い、ＣＤ４＋ Ｔ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞上の活性化マーカーＣＤ２５及びＣＤ６９の強力な上方制御が検出された。Ｔ細胞の活性化は、ＳＫＯＶ３細胞及びＨＴ－２９細胞の存在下で非常に類似していた。陰性対照ＤＰ４７ ＴＣＢは、使用された濃度で死滅を誘導せず、Ｔ細胞上のＣＤ２５及びＣＤ６９の有意な上方制御もなかった。
Figure 0007146395000016
Figure 0007146395000017
実施例１６
赤血球への結合及び全血中のＴ細胞活性化
ＦｏＬＲ１発現腫瘍細胞の非存在下で自発的活性化がないことを証明するために、我々はＦｏｌＲ１を潜在的に発現する可能性のある赤血球へのＦｏｌＲ１クローンの結合が存在するかどうかを試験した。陰性対照のＤＰ４７ ＩｇＧが含まれていたため、９Ｄ１１ ＩｇＧ、１６Ｄ５ ＩｇＧ及びＭｏｖ１９ ＩｇＧの赤血球への特異的結合は観察されなかった（図８）。
ＦｏＬＲ１ ＴＣＢによる血液細胞への更なる非特異的結合又は非特異的活性化を除外するために、９Ｄ１１ ＴＣＢ、１６Ｄ５ ＴＣＢ及びＭｏｖ１９ ＴＣＢを全血に加え、ＣＤ４＋ Ｔ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞上のＣＤ２５及びＣＤ６９の上方制御をフローサイトメトリーによって分析した。ＤＰ４７ ＴＣＢを陰性対照として含めた。ＣＤ４＋ Ｔ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞上のＣＤ２５及びＣＤ６９の上方制御を分析することにより、試験されたコンストラクトの何れかを用いたＴ細胞の活性化は観察されなかった（図９）。
実施例１７
９Ｄ１１軽鎖中のＮ－グリコシル化部位の除去
潜在的なホットスポット配列を同定するための異なるＦｏｌＲ１結合剤の分析の間に、クローン９Ｄ１１のＣＤＲ Ｌ３の端部で推定上のＮ－グリコシル化部位が同定された。通常、Ｎ－グリコシル化のコンセンサスモチーフは、Ｎ－Ｘ－Ｓ／Ｔ－Ｘ（ＸはＰではない）と定義される。ＣＤＲ Ｌ３の配列（ＭＱＡＳＩＭＮＲＴ）（配列番号６１）は、配列Ｎ－Ｒ－Ｔを有するこのコンセンサスモチーフと完全に一致する。グリコシル化は異なる生成バッチ間で完全に再現可能でない可能性があるので、ＣＤＲ Ｌ３のグリコシル化が抗原結合に寄与する場合、ＦｏｌＲ１結合に影響を与える可能性がある。このＮ－グリコシル化部位がＦｏｌＲ１結合に重要であるかどうか、又は結合を損なわずに置換することができるかどうかを評価するために、部位特異的突然変異誘発によってＮ－グリコシル化部位が交換された９Ｄ１１軽鎖の異なる変異体を作成した。
１．一過性トランスフェクション及び産生
以下に記載するように、４つのＴ細胞二重特異性抗体は必要とされるベクターについてのＰＥＩ媒介トランスフェクションの手順を用いてＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞中で一過性に産生された。ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞を、ＣＤ ＣＨＯ培地において血清を含めないで懸濁培養した。５００ｍｌの振盪フラスコ内での生成のために、４億個のＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞をトランスフェクションの２４時間前に播種した（代替スケールについては、全ての量がそれに応じて調整された）。トランスフェクションのために、細胞を２１０ｘｇで５分間遠心分離し、予め温めた２０ｍｌのＣＤ ＣＨＯ培地により上清を置き換えた。発現ベクターを、ＤＮＡの量が最終的に２００μｇになるまで２０ｍｌのＣＤ ＣＨＯ培地中で混合した。５４０μｌのＰＥＩ溶液を加えた後、１５秒間ボルテックスし、その後室温で１０分間インキュベートした。その後細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍｌの振盪フラスコに移し、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７℃で３時間インキュベートした。インキュベート時間の後、１６０ｍｌのＦ１７培地を加え、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの１日後、１ｍＭのバルプロ酸及び７％のＦｅｅｄ １を加えた。７日後、２１０×ｇで１５分間の遠心分離によって培養物の上清を精製のために収集し、溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍのフィルター）、最終濃度０．０１％ｗ／ｖのアジ化ナトリウムを加えて４℃に維持した。生成後、上清を回収し、上清を含む抗体を０．２２μｍの滅菌フィルターを通して濾過し、精製するまで４℃で保存した。
２．抗体精製
全ての分子は、プロテインＡアフィニティー精製（Ａｋｔａ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ）及びサイズ排除クロマトグラフィーなどの標準的な手順を使用して２段階で精製した。一過性産生から得られた上清をｐＨ８．０（２ＭのＴＲＩＳ（ｐＨ８．０）を使用）に調整し、８カラム容量（ｃｖ）のバッファーＡ（２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５ＭのＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．５）で平衡化したＨｉＴｒａｐ ＰＡ ＨＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カラム容量（ｃｖ）＝５ｍｌ）に適用した。１０ｃｖのバッファーＡで洗浄した後、タンパク質を、バッファーＢ（２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ２．５）、０．５ＭのＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ－２０）へのｐＨ勾配を用いて、２０ｃｖ以上で溶出させた。目的のタンパク質を含む画分をプールし、溶液のｐＨをｐＨ６．０に緩やかに調整した（２ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）を使用）。超濃縮器（Ｖｉｖａｓｐｉｎ １５Ｒ ３０．０００ＭＷＣＯ ＨＹ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いて試料を１ｍｌまで濃縮し、次いで２０ｍＭヒスチジン、ｐＨ６．０、１４０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ－２０で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ２００ １０／３００ ＧＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用した。溶出画分の凝集物含有量を分析用サイズ排除クロマトグラフィーによって分析した。従って、各画分３０μｌを、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ－アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３、ｐＨ６．７のランニングバッファー中で２５℃で平衡化したＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ分析サイズ排除カラム（Ｔｏｓｏｈ）に適用した。２％未満のオリゴマーを含む画分をプールし、超濃縮器（Ｖｉｖａｓｐｉｎ １５Ｒ ３０．０００ＭＷＣＯ ＨＹ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いて１～１．５ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで濃縮した。タンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ）を測定することにより決定した。製造者の説明書（機器Ｃａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐＧＸ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）に従い、還元剤の存在下及び非存在下で、コンストラクトの純度及び分子量をＳＤＳキャピラリー電気泳動により分析した。精製したタンパク質を液体Ｎ２中で凍結させ、－８０℃で保存した。
３．凝集温度
４つのコンストラクトの安定性を、Ｏｐｔｉｍ１０００（Ａｖａｃｔａ、ＰＡＬＬ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で、０．１℃／分で２５℃から８０℃への勾配加熱によって試験した。凝集の開始時の温度を記録する。
Figure 0007146395000018
以下の変異体が生成され：Ｎ１００Ｓ（Ｎ９５Ｓ）；Ｎ１００Ｑ（Ｎ９５Ｑ）、Ｔ１０２Ａ（Ｔ９７Ａ）及びＴ１０２Ｎ（Ｔ９７Ｎ）（カッコ内はカバットの番号付け）、Ｔ細胞二重特異性フォーマットに変換された。ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞での一過性産生及び精製の後、種々の変異体を、元の９Ｄ１１クローンと比較して、標的結合及び細胞死滅活性について分析した。
Figure 0007146395000019
実施例１８
９Ｄ１１α－ｇｌｙｃｏ変異体による結合及びＴ細胞媒介性死滅
ＣＤＲ中のグリコシル化部位のために、４つの異なる９Ｄ１１変異体が、グリコシル化部位を除去する変異を伴って生成された（実施例１７）。これらの４つの変異体は、ＨｅＬａ細胞上のＦｏｌＲ１への結合（図１０）並びにＳＫＯＶ３及びＨＴ－２９における腫瘍細胞死滅の誘導（図１１Ａ－Ｂ、Ｅ－Ｆ）について元の９Ｄ１１と比較して試験された。いずれの変異体も、結合又は腫瘍細胞死滅の誘導において差異を示さなかった。平行して、ＦｏｌＲ１陰性細胞株ＭＫＮ－４５の非特異的死滅が対処された（図１１Ｃ～Ｄ）。また、変異体と元の結合剤との間に差異は見られなかった。何れのコンストラクトも、ＦｏＬＲ１陰性腫瘍細胞に対する非特異的死滅を誘導しなかった。
実施例１９
初代上皮細胞におけるＦｏｌＲ１発現
ＦｏｌＲ１は初代上皮細胞で低レベルで発現される。ここでは、我々は、これらのレベルが、ＦｏｌＲ１ ＴＣＢの存在下でＴ細胞媒介性死滅を誘導するのに十分であるかどうかを試験することを望んだ。これを試験するために、初代ヒト気管支上皮細胞、初代ヒト脈絡叢上皮細胞、初代ヒト腎皮質上皮細胞及び初代ヒト網膜色素上皮細胞を使用した。陽性対照として、ＦｏｌＲ１陽性ＳＫＯＶ３細胞又はＨＴ－２９細胞の何れかが含まれた。最初に、使用した初代細胞におけるＦｏｌＲ１発現を確認し、これらの細胞上のＦｏｌＲ１結合部位の量を決定した。気管支上皮細胞、腎皮質上皮細胞及び網膜色素上皮細胞は、腫瘍細胞上で発現されるレベルと比較して、非常に低いが有意なレベルのＦｏｌＲ１を発現する。脈絡叢上皮細胞は有意なレベルのＦｏｌＲ１を発現しない。
Figure 0007146395000020
これらの細胞がＦｏＬＲ１ ＴＣＢの存在下でＴ細胞によって死滅する可能性があるかどうかという問題に対処するために、表面上にＦｏｌＲ１発現を示した初代上皮細胞を使用した。有意なレベルの死滅は測定できなかったが、ＣＤ２５及びＣＤ６９の上方制御をもたらす網膜色素上皮細胞、気管支上皮細胞及び腎皮質細胞の存在下でのＴ細胞活性化の誘導が検出された。最強の活性化は網膜色素上皮細胞で見られ、ＣＤ４＋ Ｔ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞の両方でＣＤ２５及びＣＤ６９の上方制御をもたらしている。気管支上皮細胞の存在下では、Ｔ細胞のより低い活性化が誘導され、ＣＤ４＋ Ｔ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞上でＣＤ６９の上方制御を伴うが、ＣＤ８＋ Ｔ細胞上でなくＣＤ４＋ Ｔ細胞上でのみＣＤ２５の非常に低い上方制御を伴う。Ｔ細胞の最低の活性化は、腎上皮細胞の存在下で得られ、ＣＤ４＋ Ｔ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞上ではＣＤ２５の上方制御を伴わず、ＣＤ６９はＣＤ８＋ Ｔ細胞上でのみ上方制御されている（図１２Ａ～Ｘ）。
実施例２０
１６Ｄ５又は９Ｄ１１結合剤を含む異なるＴＣＢフォーマットの比較
選択したＦｏｌＲ１結合剤を有するＴＣＢ ２＋１反転型フォーマットが最も活性なフォーマットであるかどうかを決定するために、１６Ｄ５又は９Ｄ１１の何れかを含む異なるフォーマットを作製し、標的細胞結合、Ｔ細胞媒介性死滅及びＴ細胞活性化において比較した。１６Ｄ５結合剤は、ＴＣＢ ２＋１反転型（図１Ａ）、ＴＣＢ １＋１古典的（図１Ｄ）、ＴＣＢ １＋１古典的（図１Ｃ）及びＴＣＢ １＋１頭尾（図１Ｂ）で試験され；９Ｄ１１結合剤は、ＴＣＢ ２＋１反転型（図１Ａ）、ＴＣＢ １＋１古典的（図１Ｃ）及びＴＣＢ １＋１頭尾（図１Ｂ）フォーマットで試験された。
全てのコンストラクトを、ＨｅＬａ細胞上のＦｏｌＲ１への結合について試験した。ＦｏｌＲ１への結合について二価の分子は、アビディティーのために一価のコンストラクトに比べてより強く結合する。二価コンストラクト対一価コンストラクトの差異は、１６Ｄ５についてより顕著である。その理由は、１６Ｄ５のより低い親和性のために、この結合剤に対するアビディティー効果がより強いからであろう。２つの１＋１ ＴＣＢの間には結合に有意な差はないが、２つの２＋１コンストラクトの間には差異がある。反転型２＋１コンストラクトは、古典的な２＋１コンストラクトよりも強くＦｏｌＲ１に結合する。これは、古典的な２＋１コンストラクトにおいて、ＦｏＬＲ１への結合はＣＤ３ Ｆａｂの存在によって影響を受けるが、一方反転型コンストラクトでは結合はあまり影響を受けないことを示す。
これらのコンストラクトによるＴ細胞媒介性死滅を試験することにより、我々は、２＋１反転型ＴＣＢのより強力な結合が、２＋１古典的ＴＣＢと比較してより強い腫瘍細胞死滅及びＴ細胞活性化へと変換されることを示すことができた。１６Ｄ５ ＦｏＬＲ１ ＴＣＢ ２＋１古典的は、それぞれの１＋１頭尾コンストラクトよりほんの少しだけ活性である。１＋１頭尾コンストラクトは、１＋１古典的コンストラクトよりも有意により活性である。これは結合に見られる状況を反映しておらず、頭尾コンストラクトによるより良好な架橋が原因である可能性がある。全体的な腫瘍細胞死滅及びＴ細胞活性化は、試験された全てのコンストラクトと同程度であり、差異において見られる効力の差異は、ＥＣ５０値に関してのみである。一般に、使用された結合剤とは無関係にＦｏｌＲ１ ＴＣＢ ２＋１反転型は、Ｔ細胞媒介腫瘍細胞死滅及びＴ細胞活性化を誘導するための好ましいフォーマットであると結論付けることができる（図１３Ａ～Ｃ及び図１４Ａ～Ｃ参照）。
Figure 0007146395000021
Figure 0007146395000022
実施例２１
腫瘍細胞株及び初代細胞
ＨｅＬａ細胞（ＣＣＬ－２）をＡＴＣＣから入手し、１０％ＦＣＳ及び２ｍＭグルタミンを含むＤＭＥＭ中で培養し、ＳＫＯＶ３（ＨＴＢ－７７）をＡＴＣＣから入手し、１０％ＦＣＳ及び２ｍＭグルタミンを含むＲＰＭＩ中で培養し、ＯＶＣＡＲ５をＮＣＩから入手し、１０％ＦＣＳ及び２ｍＭグルタミンを含むＲＰＭＩ中で培養し、ＨＴ－２９（ＡＣＣ－２９９）をＤＳＭＺから入手し、１０％ＦＣＳ及び２ｍＭグルタミンを含むマッコイ５Ａ培地で培養し、ＭＫＮ－４５（ＡＣＣ－４０９）をＤＳＭＺから入手し、１０％ＦＣＳ及び２ｍＭグルタミンを含むＲＰＭＩ中で培養した。
試験した全ての初代上皮細胞は、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した。ヒト気管支上皮細胞（ＨＢｅｐｉＣ、カタログ番号３２１０）は、気管支上皮細胞培地（ＢＥｐｉＣＭ、カタログ番号３２１１、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ）中で培養した。ヒト結腸上皮細胞（ＨＢｅｐｉＣ、カタログ番号２９５０）は、結腸上皮細胞培地（ＢＥｐｉＣＭ、カタログ番号２９５１、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ）中で培養した。ヒト網膜色素上皮細胞（ＨＢｅｐｉＣ、カタログ番号６５４０）は、上皮細胞培地（ＢＥｐｉＣＭ、カタログ番号４１０１、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ）中で培養した。ヒト腎皮質上皮細胞（ＨＢｅｐｉＣ、カタログ番号４１１０）は、上皮細胞培地（ＢＥｐｉＣＭ、カタログ番号４１０１、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ）中で培養した。ヒト脈絡叢上皮細胞（ＨＢｅｐｉＣ、カタログ番号１３１０）は、上皮細胞培地（ＢＥｐｉＣＭ、カタログ番号４１０１、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ）中で培養した。
実施例２２
フローサイトメトリーによる標的結合
示された標的細胞を細胞解離バッファーで回収し、ＰＢＳで洗浄し、ＦＡＣＳバッファー中に再懸濁した。抗体染色は９６ウェル丸底プレート中で行った。従って、１ウェルあたり２００，０００細胞が播種された。プレートを４００ｇで４分間遠心分離し、上清を除去した。試験抗体をＦＡＣＳバッファーで希釈し、２０μｌの抗体溶液を４℃で３０分間細胞に添加した。未結合抗体を除去するために、細胞をＦＡＣＳバッファーで２回洗浄した後、希釈した二次抗体（ＦＩＴＣ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃｇ断片、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ＃１０９－０９６－０９８又はＰＥ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃｇ断片特異的、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ＃１０９－１１６－１７０）を添加した。４℃で３０分間のインキュベーション後、未結合の二次抗体を洗い流した。測定前に、細胞を２００μｌのＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、ＢＤ Ｃａｎｔｏ ＩＩ又はＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａを用いてフローサイトメトリーにより分析した。
実施例２３
内部移行
細胞を回収し、その生存率を決定した。細胞を２Ｍｉｏ細胞／ｍｌの新鮮な冷培地に再懸濁し、細胞懸濁液を各抗体の１５ｍｌのファルコンチューブに移した。内部移行について試験すべき抗体を、２０μｇ／ｍｌの最終濃度で細胞に添加した。チューブを、低温室で振盪機で４５分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を冷ＰＢＳで３回洗浄し、未結合の抗体を除去した。１ウェルあたり０．２Ｍｉｏ細胞を、時点ゼロとしてＦＡＣＳプレートに移した。標識細胞を暖かい培地に再懸濁し、３７℃でインキュベートした。示された時点で、１ウェルあたり０．２Ｍｉｏ細胞を冷ＰＢＳ中に移し、ＦＡＣＳプレート上にプレーティングして洗浄した。表面上に残っているコンストラクトを検出するために、細胞をＰＥ標識抗ヒトＦｃ二次抗体により染色した。従って、希釈した抗体２０μｌをウェルごとに添加し、プレートを４℃で３０分間インキュベートした。その後、細胞を２回洗浄して未結合抗体を除去し、次いで１％ＰＦＡで固定して、更なる内部移行を防止した。ＢＤ ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩを用いて蛍光を測定した。
実施例２４
ＱＩＦＩＫＩＴ（登録商標）分析
ＱＩＦＩＫＩＴ（登録商標）は、直径１０μｍで、異なるが十分に定義された量のマウスＭａｂ分子（高親和性抗ヒトＣＤ５、クローンＣＲＩＳ－１、アイソタイプＩｇＧ２ａ）でコーティングされている一連のビーズを含んでいる。ビーズは、初代マウスＭａｂ、アイソタイプＩｇＧで標識された異なる抗原密度を有する細胞を模倣する。簡潔には、目的の抗原に対する一次マウスモノクローナル抗体で細胞を標識した。別個の試験ウェルにおいて、細胞を無関係のマウスモノクローナル抗体（アイソタイプ対照）で標識した。次いで、細胞、セットアップビーズ（Ｓｅｔ－Ｕｐ Ｂｅａｄｓ）及び較正ビーズ（Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ Ｂｅａｄｓ）を、キットに含まれるフルオレセイン結合抗マウス二次抗体で標識した。細胞の標識に使用される一次抗体は、飽和濃度で使用されなければならない。一次抗体は、任意のマウスＩｇＧアイソタイプであり得る。これらの条件下で、結合した一次抗体分子の数は、細胞表面上に存在する抗原部位の数に対応する。二次抗体はまた、飽和濃度で使用される。結果として、蛍光は、細胞及びビーズ上の結合した一次抗体分子の数と相関する。
実施例２５
Ｔ細胞媒介性腫瘍細胞死滅及びＴ細胞活性化
標的細胞をトリプシン／ＥＤＴＡにより回収し、計数し、生存率を調べた。細胞をそれぞれの培地中に３００，０００細胞／ｍｌの最終濃度となるように再懸濁した。次いで、１００μｌの標的細胞懸濁液を９６平底プレートの各ウェルに移した。プレートをインキュベーター内で３７℃で一晩インキュベートして、細胞をプレートに付着させた。翌日、健康なドナーからの全血からＰＢＭＣを単離した。血液をＰＢＳで２：１に希釈し、Ｌｅｕｃｏｓｅｐチューブ中のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ－１０７７（＃１０７７１、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）１５ｍｌに重層し、ブレーキを掛けずに４５０ｇで３０分間遠心分離した。遠心分離後、細胞を含むバンドを１０ｍｌのピペットで回収し、５０ｍｌチューブに移した。チューブを５０ｍｌまでＰＢＳで満たし、遠心分離した（４００ｇ、１０分、室温）。上清を除去し、ペレットをＰＢＳに再懸濁した。遠心分離（３００ｇ、１０分、室温）後、上清を捨て、２本のチューブをプールし、洗浄工程を繰り返した（今回の遠心分離は３５０ｘｇ、１０分、室温）。その後、細胞を再懸濁し、ペレットを細胞計数のために５０ｍｌのＰＢＳにプールした。細胞を計数後、細胞を遠心分離し（３５０ｇ、１０分間、室温）、２％ＦＣＳ及び２ｎＭグルタミンを含むＲＰＭＩ中の６Ｍｉｏ細胞／ｍｌで再懸濁した。プレーティングした標的細胞から培地を除去し、２％ＦＣＳ及び２ｎＭグルタミンを含むＲＰＭＩで希釈した試験抗体を添加した。エフェクター細胞溶液の３００，０００細胞を各ウェルに移し、１０：１のＥ：Ｔ比を得た。最大放出を決定するために、標的細胞をＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００により溶解した。ＬＤＨ放出は、細胞傷害性検出キット（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）（＃１６４４７９３、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて２４時間後及び４８時間後に測定した。腫瘍細胞死滅後におけるＴ細胞上の活性化マーカーの上方制御をフローサイトメトリーにより測定した。簡潔には、ＰＢＭＣを回収し、９６ウェル丸底プレートに移し、ＦＡＣＳバッファーで希釈したＣＤ４ ＰＥ－Ｃｙ７（＃３５５７８５２、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ８ ＦＩＴＣ（＃５５５６３４、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ２５ ＡＰＣ（＃５５５４３４、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ６９ ＰＥ（＃３１０９０６、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）により染色した。４℃で３０分間のインキュベーション後、細胞をＦＡＣＳバッファーで２回洗浄した。ＢＤ Ｃａｎｔｏ ＩＩを用いて蛍光を測定する前に、細胞を２００μｌのＦＡＣＳバッファーに再懸濁した。
実施例２６
全血中のＴ細胞活性化
２８０μｌの新鮮な血液を９６ウェル円錐深ウェルプレートに添加した。次いで、２０μｌの希釈ＴＣＢを血液に添加し、プレートを振盪することによって良く混合した。インキュベーター内で３７℃で２４時間のインキュベーション後、血液を混合し、３５μｌを９６ウェル丸底プレートに移した。次いで、ＣＤ４ ＰＥ－Ｃｙ７（＃３５５７８５２、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ８ ＦＩＴＣ（＃５５５６３４、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ２５ ＡＰＣ（＃５５５４３４、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ６９ ＰＥ（＃３１０９０６、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）及びＣＤ４５ Ｖ５００（＃５６０７７７、ＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ）からなる抗体染色混合物２０μｌを添加し、室温で暗所で１５分間インキュベートした。測定前に、２００μｌの新たに調製したＢＤ ＦＡＣＳ溶解溶液（＃３４９２０２、ＢＤ ＦＣＡＳ）を血液に添加した。室温で１５分間インキュベートした後、細胞をＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａにより測定した。
実施例２７
免疫不全ＮＯＤ／Ｓｈｉ－ｓｃｉｄ／ＩＬ－２Ｒγｎｕｌｌ（ＮＯＧ）マウスにおけるヒト化ＦＯＬＲ１ ＴＣＢ（クローン１６Ｄ５）のＳＤＰＫ（単回用量薬物動態）研究
実験の開始時に６～７週齢のメスＮＯＤ／Ｓｈｉ－ｓｃｉｄ／ＩＬ－２Ｒγｎｕｌｌ（ＮＯＧ）マウス（デンマークのＴａｃｏｎｉｃで飼育）を、（ＧＶ－Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従って１２時間明所／１２時間暗所の日周期で特定の病原体のいない条件下で保持した。実験的研究プロトコールは、地方自治体によってレビューされ承認された（Ｐ ２０１１／１２８）。動物は到着後１週間、新しい環境への馴致及び観察のために保持された。継続的な健康管理が定期的に実施された。
マウスに、１０ ／ １ ／ ０．１μｇ／マウスのＦＯＬＲ１ ＴＣＢを静脈注射し、群及び時点ごとに３匹のマウスから採血した。全てのマウスに、総容量２００μｌの適切な溶液を注射した。２００μｌあたりのＦＯＬＲ１ ＴＣＢの適正量を得るために、ストック溶液を必要に応じてＰＢＳで希釈した。治療用注射の５分後、１時間後、３時間後、８時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後、９６時間後及び１６８時間後に血清試料を採取した。
図１５は、１６Ｄ５ ＦＯＬＲ１ ＴＣＢが、遅いクリアランスを有するＮＯＧマウスにおける典型的かつ用量依存的なＩｇＧ様ＰＫ特性を示すことを示す。
Figure 0007146395000023
実施例２８
Ｓｋｏｖ３を有するＮＯＧマウスにおけるヒトＰＢＭＣ移入後のＦＯＬＲ１ ＴＣＢ（クローン１６Ｄ５）のインビボ有効性
ＦＯＬＲ１ ＴＣＢを、ＰＢＭＣ移植ＮＯＧマウスに皮下注射したヒト卵巣癌細胞株Ｓｋｏｖ３で試験した。
Ｓｋｏｖ３卵巣癌細胞はＡＴＣＣ（ＨＴＢ－７７）から得た。その腫瘍細胞株は、５％ＣＯ２の水飽和雰囲気下３７℃で、１０％のＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）を含有するＲＰＭＩ 中で培養された。生存率＞９５％において、継代３５を移植に使用した。１動物当たり５×１０６個の細胞を総量１００μｌのＲＰＭＩ細胞培養培地（Ｇｉｂｃｏ）で動物の右側腹部に皮下注射した。
実験の開始時に６～７週齢のメスＮＯＤ／Ｓｈｉ－ｓｃｉｄ／ＩＬ－２Ｒγｎｕｌｌ（ＮＯＧ）マウス（デンマークのＴａｃｏｎｉｃで飼育）を、（ＧＶ－Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従って１２時間明所／１２時間暗所の日周期で特定の病原体のいない条件下で保持した。実験的研究プロトコールは、地方自治体によってレビューされ承認された（Ｐ ２０１１／１２８）。動物は到着後１週間、新しい環境への馴致及び観察のために保持された。継続的な健康管理が定期的に実施された。
プロトコル（図１６）に従って、マウスに５×１０６個のＳｋｏｖ３を研究０日目に皮下注射した。研究２１日目に、健康なドナーのヒトＰＢＭＣをＦｉｃｏｌｌ法により単離し、１０ｘ１０６個の細胞を腫瘍を有するマウスに腹腔内注射した。２日後、マウスを無作為化し、５つの処置群（ｎ＝１２）に等しく分配し、続いて１０ ／ １ ／ ０．１μｇ／マウスのＦＯＬＲ１ ＴＣＢ又は１０μｇ／マウスのＤＰ４７対照ＴＣＢの何れかを１週間に１回、３週間静脈注射した。全てのマウスに２００μｌの適切な溶液を静脈注射した。ビヒクル群のマウスにＰＢＳを注射した。２００μｌあたりのＴＣＢの適正量を得るために、ストック溶液を必要に応じてＰＢＳで希釈した。腫瘍増殖を、キャリパーを用いて週１回測定し（図１７）、腫瘍体積を以下のように計算した：
Ｔｖ：（Ｗ２／２）ｘＬ （Ｗ：幅、Ｌ：長さ）
ＦＯＬＲ１ ＴＣＢの週１回の注射は、用量依存的な抗腫瘍効果をもたらした。一方１０μｇ／マウス及び１μｇ／マウスの用量は腫瘍縮小を誘発し、０．１μｇ／マウスの用量は腫瘍静止を誘発した（図１７、表２２）。標的化されていない対照のＤＰ４７ ＴＣＢと比較して、１０μｇ／マウスの用量で最大の腫瘍縮小が達成された。
Figure 0007146395000024
ＰＤ読み出しのために、処置群につき３匹のマウスを研究３２日目に屠殺し、腫瘍を除去し、その後のＦＡＣＳ分析のために、単細胞懸濁液をＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅ Ｖ、Ｄｉｓｐａｓｅ ＩＩ及びＤＮＡｓｅによる酵素消化により調製した（図１９及び２０）。単一の細胞が、細胞外抗原及び活性化マーカーの染色のために直接使用されたか、又はタンパク質輸送阻害剤モネンシンの存在下、正常培地中で５時間、５ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ及び５００ｎｇ／ｍｌのイオノマイシンを用いて再刺激された。再刺激後、細胞を表面抗原について染色し、続いて固定し、透過処理工程を行った。次いで、固定試料をＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１０及びＩＬ－２について細胞内に染色し、フローサイトメトリーによって分析した。同じ手順を細胞の脱顆粒のために使用したが、再刺激期間中に抗ＣＤ１０７ａ抗体が添加され、固定された試料を細胞内パーフォリン及びグランザイム－Ｂ含量について染色した。ＦＡＣＳ分析は、ＦＯＬＲ１ ＴＣＢにより処置した際の腫瘍組織における浸潤性ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞の数が、ビヒクル及び非標的対照ＴＣＢと比較して統計的に高かったことを明らかにした。更に、ＦＯＬＲ１ ＴＣＢ処置腫瘍では、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－ｇ及びＩＬ－２産生並びにパーフォリン＋／グランザイムＢ＋ ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞の数が高かった。ＦＯＬＲ１ ＴＣＢで処置した腫瘍浸潤性Ｔ細胞も対照群と比較して高い脱顆粒率を示した。
試験終了の３８日目に、全ての動物を屠殺した；腫瘍を除去し、計量した（図１８）。１０及び１μｇ／マウスのＦＯＬＲ１ ＴＣＢで処置した腫瘍の重量は、対照群と比較して統計的に有意な差異を示した。
Figure 0007146395000025
実施例２９
二重特異性ＦｏｌＲ１／ＣＤ３－カッパ－ラムダ抗体の生成
ヘテロ二量体化アプローチ（例えばノブ・イントゥー・ホール技術）を使用せずにヒトＣＤ３及びヒト葉酸受容体アルファ（ＦｏｌＲ１）に同時に結合することができる二重特異性抗体（各抗原に対して一価）を生成するために、いわゆるＣｒｏｓｓＭａｂ技術と共通の軽鎖ライブラリーの組み合わせが適用された：ヒト化ＣＤ３結合剤の可変領域（ＣＨ２５２７＿ＶＬ７＿４６／１３）が、標準的なヒトＩｇＧ１抗体のＣＨ１ドメインに融合され、両方の特異性に共通である（Ｆｃに融合された）ＶＬＶＨ交差分子を形成した。交差したカウンターパート（ＶＨＣＬ）を生成するために、ＣＤ３特異的可変重鎖ドメイン（ＣＨ２５２７＿ＶＨ＿２３／１２）が定常ヒトλ軽鎖に融合され、一方ヒトＦｏｌＲ１に特異的な可変重鎖ドメイン（クローン１６Ｄ５、共通の軽鎖ライブラリーから単離される）が定常ヒトκ軽鎖に融合された。これは、所望されないホモ二量体抗体を除去するための、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ及びＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたその後の精製工程を適用することによる所望の二重特異性抗体の精製を可能とする。
全ての抗体発現ベクターは、Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記述されるように、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて作成された。分子生物学的試薬を、製造業者の推奨に従って使用した。遺伝子又は遺伝子断片は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅されるか、Ｇｅｎｅａｒｔ ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の合成オリゴヌクレオチドから自動遺伝子合成によって生成された。ＰＣＲ増幅又はサブクローニングされたＤＮＡ断片をＤＮＡ配列決定（Ｓｙｎｅｒｇｅｎｅ ＧｍｂＨ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）により確認した。標準的なＭａｘｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、トランスフェクショングレードのプラスミドＤＮＡの調製のために、プラスミドＤＮＡを適切な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主株に形質転換し、増幅した。二重特異性分子の産生のために、ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞を、標準的なポリヌクレオチド（ＰＥＩ）ベースの方法を用いてそれぞれの遺伝子をコードするプラスミドでトランスフェクトした。３つの発現ベクターの使用されたプラスミドの比は１：１：１であった。トランスフェクトされた細胞を７日間培養し、上清を精製のために採取した。二重特異性ＦｏｌＲ１／ＣＤ３－カッパ－ラムダ抗体は以下のように産生され精製された。
１．一過性トランスフェクション及び産生
カッパ－ラムダ二重特異性抗体は必要とされるベクターについてのＰＥＩ媒介トランスフェクションの手順を用いてＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞中で一過性に産生された。ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞を、ＣＤ ＣＨＯ培地において血清を含めないで懸濁培養した。５００ｍｌの振盪フラスコ内での生成のために、４億個のＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞をトランスフェクションの２４時間前に播種した（代替スケールについては、全ての量がそれに応じて調整された）。トランスフェクションのために、細胞を２１０ｘｇで５分間遠心分離し、予め温めた２０ｍｌのＣＤ ＣＨＯ培地により上清を置き換える。発現ベクターを、ＤＮＡの量が最終的に２００μｇになるまで２０ｍｌのＣＤ ＣＨＯ培地中で混合した。５４０μｌのＰＥＩ溶液を加えた後、１５秒間ボルテックスし、その後室温で１０分間インキュベートする。その後細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍｌの振盪フラスコに移し、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７℃で３時間インキュベートした。インキュベート時間の後、１６０ｍｌのＦ１７培地を加え、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの１日後、１ｍＭのバルプロ酸及び７％のＦｅｅｄ １を加えた。７日後、２１０×ｇで１５分間の遠心分離によって培養物の上清を精製のために収集し、溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍのフィルター）、最終濃度０．０１％ｗ／ｖのアジ化ナトリウムを加えて４℃に維持する。
２．精製
カッパ－ラムダ二重特異性抗体を、カッパ軽鎖に特異的な親和性工程、続いてラムダ軽鎖に特異的な親和性工程、及び最終的に凝集体の除去のためのサイズ排除クロマトグラフィー工程を用いて３工程で精製した。一過性産生から得られた上清をｐＨ８．０（２ＭのＴＲＩＳ（ｐＨ８．０）を使用）に調整し、５カラム容量（ｃｖ）のバッファーＡ（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭグリシン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０）で平衡化した、Ｃａｐｔｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔカッパ親和性マトリックス、又はＨｉＴｒａｐ ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カラム容量（ｃｖ）＝１ｍｌ、に適用した。１５ｃｖのバッファーＡで洗浄した後、タンパク質を、バッファーＢ（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭグリシン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ２．０）へのｐＨ勾配を用いて、２５ｃｖ以上で溶出させた。目的のタンパク質を含む画分をプールし、溶液のｐＨをｐＨ８．０に調整した（２ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）を使用）。中和されたプールされた画分を、５カラム容量（ｃｖ）のバッファーＡ（５０ｍＭトリス、１００ｍＭグリシン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０）で平衡化したＣａｐｔｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔラムダ親和性マトリックス（現在：ＨｉＴｒａｐ ＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カラム容量（ｃｖ）＝１ｍｌ）に適用した。１５ｃｖのバッファーＡで洗浄した後、タンパク質を、バッファーＢ（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭグリシン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ２．０）へのｐＨ勾配を用いて、２５ｃｖ以上で溶出させた。目的のタンパク質を含む画分をプールし、溶液のｐＨをｐＨ８．０に調整した（２ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）を使用）。この溶液を、超濃縮器（Ｖｉｖａｓｐｉｎ １５Ｒ ３０．０００ＭＷＣＯ ＨＹ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いて濃縮し、次いで２０ｍＭヒスチジン、ｐＨ６．０、１４０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ－２０で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ２００ １０／３００ ＧＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用した。サイズ排除後のプールされた画分を、超濃縮器（Ｖｉｖａｓｐｉｎ １５Ｒ ３０．０００ＭＷＣＯ ＨＹ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いて再び濃縮した。
タンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ）を測定することにより決定した。製造者の説明書（機器Ｃａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐＧＸ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）に従い、還元剤の存在下及び非存在下で、コンストラクトの純度及び分子量をＳＤＳキャピラリー電気泳動により分析した。少量のタンパク質しか精製できず、最終収率は０．１７ｍｇ／Ｌであった。
実施例３０
二重特異性ＦｏｌＲ１／ＣＤ３－カッパ－ラムダ抗体によるＴ細胞媒介性死滅
カッパラムダＦｏｌＲ１ ＴＣＢの活性を、新たに単離したＰＢＭＣの存在下でＳＫＯＶ３細胞において試験した。陰性対照としてＤＰ４７ ＴＣＢを含めた。ＳＫＯＶ３細胞のＴ細胞媒介性死滅を、ＬＤＨ放出によって２４時間後及び４８時間後に測定した。４８時間後、Ｔ細胞を回収し、ＣＤ４ Ｔ細胞及びＣＤ８ Ｔ細胞上のＣＤ６９及びＣＤ２５の上方制御をフローサイトメトリーによって測定した。
カッパラムダＦｏｌＲ１コンストラクトは、ＣＤ４ Ｔ細胞及びＣＤ８ Ｔ細胞の両方でＣＤ６９及びＣＤ２５の上方制御を伴う濃度依存的様式でＳＫＯＶ３細胞の死滅を誘導する。
ＳＫＯＶ３細胞を、カッパラムダＦｏＬＲ１ ＴＣＢ又はＤＰ４７ ＴＣＢの何れかの存在下でＰＢＭＣとともにインキュベートした。２４時間後及び４８時間後に、腫瘍細胞の死滅をＬＤＨ放出を測定することによって決定した（図２１）。ＳＫＯＶ３細胞を、カッパラムダＦｏＬＲ１ ＴＣＢ又はＤＰ４７ ＴＣＢの何れかの存在下でＰＢＭＣとともにインキュベートした。４８時間後、ＣＤ４ Ｔ細胞及びＣＤ８ Ｔ細胞上のＣＤ２５及びＣＤ６９の上方制御をフローサイトメトリーによって測定した（図２２）。
実施例３１
表面プラズモン共鳴による１６Ｄ５及び３６Ｆ２ ＦｏｌＲ１結合剤の生化学的特徴付け
異なる一価又は二価Ｔ細胞二重特異性フォーマットの抗ＦｏｌＲ１ １６Ｄ５の、及びＩｇＧとしての又はＴ細胞二重特異性抗体としての抗ＦｏｌＲ１ ３６Ｆ２の組換えヒト、カニクイザル及びマウス葉酸受容体１（全てＦｃ融合体として）に対する結合を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって評価した。全てのＳＰＲ実験をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００において、ランニングバッファーとしてＨＢＳ－ＥＰ（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤 Ｐ２０、Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて２５℃で行った。
１．試験した分子
親和性及びアビディティーの決定に用いた分子を表２４に記載する。
Figure 0007146395000026
２．葉酸受容体１に対するアビディティー
抗ＦｏｌＲ１ ＩｇＧ又はＴ細胞二重特異性抗体（Ｔ ｃｅｌｌ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃｓ）と組換え葉酸受容体との間の相互作用のアビディティーを以下に記載するように決定した（表２５）。
ヒト、カニクイザル及びマウス葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）の組換えビオチン化単量体Ｆｃ融合体を、ＳＡチップ上に標準的なカップリング指示（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて直接カップリングさせた。固定レベルは約３００～４００ＲＵであった。抗ＦｏｌＲ１ ＩｇＧ又はＴ細胞二重特異性抗体を、フローセルを１８０秒にわたって３０μＬ／分の流速で３．７～９００ｎＭの濃度範囲で通過させた。解離を２４０秒間又は６００秒間モニターした。チップ表面は、１０ｍＭのグリシン－ＨＣｌ（ｐＨ２）の３０秒間の二重注入を使用して、毎サイクル後に再生された。バルク屈折率の差異は、組換えビオチン化マウスＣＤ１３４ Ｆｃ融合体を固定化した基準フローセルで取得される応答を差し引くことにより修正された。ＩｇＧ又はＴ細胞二重特異性抗体の二価結合から生じる結合曲線は、１：１のラングミュア結合（１：２結合であるにもかかわらず）に近似され、そのモデルに適合させて、二価結合のアビディティーを表す見かけのＫＤを得た。相互作用の見かけの結合定数は、Ｂｉａ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたフィッティングの速度定数から導かれた。１＋１ Ｔ細胞二重特異性フォーマットの場合、このコンストラクト中に唯一のＦｏｌＲ１結合剤が存在するため、相互作用は実際に１：１であり、ＫＤは親和性を表す。
Figure 0007146395000027
３．葉酸受容体１に対する親和性
抗ＦｏｌＲ１ ＩｇＧ又はＴ細胞二重特異性抗体（Ｔ ｃｅｌｌ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃｓ）と組換え葉酸受容体との間の相互作用の親和性を以下に記載するように決定した（表２６）。
親和性測定のために、抗ヒトＦａｂ特異的抗体（Ｆａｂ捕捉キット、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の約１２０００の共鳴単位（ＲＵ）の直接カップリングを、標準的アミンカップリングキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてｐＨ５．０のＣＭ５チップ上で実施した。抗ＦｏｌＲ１ ＩｇＧ又はＴ細胞二重特異性抗体を、４０秒間、１０μｌ／分の流速で２０ｎＭで捕捉し、参照フローセルは捕捉せずに放置した。ヒト、カニクイザル又はマウス葉酸受容体１ Ｆｃ融合体の希釈系列（１２．３～３０００ｎＭ）を全てのフローセル上で３０μｌ／分で２４０秒間通過させ、結合相を記録した。解離相を３００秒間モニターし、試料溶液からＨＢＳ－ＥＰへの切り替えによってトリガーした。チップ表面は、１０ｍＭのグリシン－ＨＣｌ（ｐＨ１．５）の６０秒間の二重注入を使用して、毎サイクル後に再生された。バルク屈折率の差異は、基準フローセルで取得される応答を差し引くことにより修正された。相互作用の親和性定数は、Ｂｉａ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたラングミュア結合に対するフィッティングによる速度定数から導かれた。
Figure 0007146395000028
３６Ｆ２ ＴＣＢのヒト及びカニクイザルＦｏｌＲ１－Ｆｃに対する親和性（一価の結合）は両者とも同様で約１０００ｎＭであるが、一方マウスＦｏｌＲ１－Ｆｃに対する親和性はわずかに良好で約３００ｎＭである。３６Ｆ２はマウス及び霊長類のモデルで使用することができ、サロゲートは必要としない。
ヒトＦｏｌＲ１に対する３６Ｆ２ ＴＣＢのアビディティー（見かけのＫＤ）は、ヒトＦｏｌＲ１に対する１６Ｄ５ ＴＣＢの親和性より約３０倍低い。二価のフォーマットでは、３６Ｆ２ ＴＣＢは低ナノモル範囲にあり、一方、１６Ｄ５ ＴＣＢは低ピコモル範囲（１０００倍の差）にある。
ＦｏｌＲ１は、卵巣がん、乳がん、腎臓がん、結腸直腸がん、肺がん及び他の固形がんを含む上皮悪性腫瘍の範囲のがん細胞の表面上で間欠的及び高レベルで過剰発現された腫瘍細胞で発現され、また、正常組織における極性化上皮細胞の限定されたサブセットの先端表面上にも発現される。これらの非腫瘍性正常細胞は、低レベルでのみＦｏｌＲ１を発現し、例えば、肺胞表面上の細気管支上皮細胞、管状細胞の腎皮質管腔境界、網膜色素上皮（側底膜）及び脈絡叢を含む。
１６Ｄ５ ＴＣＢは、少量のＦｏｌＲ１を発現する正常組織細胞に結合し、Ｔ細胞媒介性死滅をもたらす。これは、少なくとも部分的には、カニクイザルにおいて１０μｇ／ｋｇで観察される限られた耐性の主要因であるかもしれない。発明者らは、Ｔ細胞二重特異性分子の親和性を低下させることにより、高い標的密度組織と低い標的密度組織との間の差異を増加させることができ、それにより二価の結合及びアビディティーを利用することにより毒性を低下させるかどうかを決定したかった。低親和性結合剤は、低親和性がしばしば低い効力及び有効性に関連するため、通常更なる分析のための適切な候補としては選択されない。それにもかかわらず、低親和性のＦｏｌＲ１結合剤３６Ｆ２は、幾つかのフォーマットにおいて開発され、その生物学的特性について特徴付けられた。二価Ｔ細胞二重特異性フォーマットで使用される３６Ｆ２に関して、アビディティー効果（一価結合と二価結合との間の差）は約２５０倍（１０００ｎＭ対４ｎＭ）である。低い標的密度では、親和性は相互作用を定義し、１０００ｎＭでＴＣＢの低い効力をもたらした。しかしながら、高い標的密度では、分子のアビディティーが作用して、４ｎＭでＴＣＢの高い活性がもたらされた（実施例３２参照）。
代替のアプローチでは、発明者らは、１６Ｄ５の一価のフォーマット及び１６Ｄ５の低親和性の変異体（親和性約１０～４０ｎＭ）を二価のフォーマットで作成した。一価のフォーマット（１＋１）で使用される１６Ｄ５結合剤は、約５０ｎＭの親和性を有する。高い標的密度組織と低い標的密度組織との間の差別化は、アビディティー効果を利用することによってより良好に達成され得る。
実施例３２
３６Ｆ２ ＴＣＢ、Ｍｏｖ１９ ＴＣＢ及び２１Ａ５ ＴＣＢによって誘導されたＳＫｏｖ－３細胞のＴ細胞死滅
３６Ｆ２ ＴＣＢ、Ｍｏｖ１９ ＴＣＢ及び２１Ａ５ ＴＣＢによって媒介されるＴ細胞死滅を、ＳＫｏｖ－３細胞（中間のＦｏｌＲ１）について評価した。ヒトＰＢＭＣをエフェクターとして使用し、二重特異性抗体とのインキュベーションの２４時間及び４８時間にて死滅を検出した。簡潔には、標的細胞をトリプシン／ＥＤＴＡで回収し、洗浄し、平底９６ウェルプレートを用いて２５０００細胞／ウェルの密度でプレーティングした。細胞を一晩接着させた。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、健康なヒトドナーから得られた濃縮リンパ球調製物（バフィーコート）のヒストパーク密度遠心分離によって調製した。新鮮な血液を滅菌ＰＢＳで希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ勾配（Ｓｉｇｍａ、＃Ｈ８８８９）上に重層した。遠心分離（４５０×ｇ、３０分間、室温）後、ＰＢＭＣ含有界面相の上の血漿を廃棄し、ＰＢＭＣを新しいファルコンチューブに移し、その後５０ｍｌのＰＢＳで満たした。混合物を遠心分離し（４００×ｇ、１０分間、室温）、上清を廃棄し、ＰＢＭＣペレットを滅菌ＰＢＳで２回洗浄した（遠心分離工程は３５０×ｇ、１０分間）。得られたＰＢＭＣの集団を自動的に計数し（ＶｉＣｅｌｌ）、細胞インキュベーター中で３７℃、５％ＣＯ２で、１０％ＦＣＳ及び１％のＬ－アラニル－Ｌ－グルタミン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、Ｋ０３０２）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で更に使用するまで保存した（２４時間以内）。死滅アッセイのために、抗体を指示された濃度で添加した（０．００５ｐＭ～５ｎＭの範囲で３通り）。ＰＢＭＣを最終Ｅ：Ｔ比１０：１で標的細胞に添加した。３７℃、５％ＣＯ２で２４時間及び４８時間のインキュベーション後、アポトーシス／壊死細胞により細胞上清中に放出されたＬＤＨの定量によって（ＬＤＨ検出キット、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、＃１１ ６４４ ７９３ ００１）、標的細胞死滅を評価した。標的細胞の最大溶解（＝１００％）は、標的細胞の１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００とのインキュベーションによって達成された。最小溶解（＝０％）は、二重特異性コンストラクトを含まずにエフェクター細胞と共インキュベートした標的細胞を指す。
結果は、３６Ｆ２によって誘導された死滅が、Ｍｏｖ１９ ＴＣＢ及び２１Ａ５ ＴＣＢと比較して大幅に減少することを示している（図２３Ａ－Ｂ）。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ６を用いて計算した死滅アッセイに関連するＥＣ５０値を表２７に要約する。
Figure 0007146395000029
実施例３３
異なる一価及び二価Ｔ細胞二重特異性フォーマットの３６Ｆ２ ＴＣＢ及び１６Ｄ５ ＴＣＢによって誘導されるＴ細胞死滅
Ｈｅｌａ（高度のＦｏｌＲ１、約２００万コピー、表１４、図２７）、Ｓｋｏｖ－３（中間のＦｏｌＲ１、約７００００－９００００コピー、表１４、図２７）及びＨＴ－２９（低いＦｏｌＲ１、約１００００、表１４、図２７）ヒト腫瘍細胞の、３６Ｆ２ ＴＣＢ、１６Ｄ５ ＴＣＢ、１６Ｄ５ ＴＣＢ古典的、１６Ｄ５ ＴＣＢ １＋１及び１６Ｄ５ ＴＣＢ ＨＴ抗体により媒介されたＴ細胞死滅を評価した。ＤＰ４７ ＴＣＢ抗体を陰性対照として含めた。ヒトＰＢＭＣをエフェクターとして使用し、二重特異性抗体とのインキュベーションの２４時間にて死滅を検出した。簡潔には、標的細胞をトリプシン／ＥＤＴＡで回収し、洗浄し、平底９６ウェルプレートを用いて２５０００細胞／ウェルの密度でプレーティングした。細胞を一晩接着させた。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、健康なヒトドナーから得られた濃縮リンパ球調製物（バフィーコート）のヒストパーク密度遠心分離によって調製した。新鮮な血液を滅菌ＰＢＳで希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ勾配（Ｓｉｇｍａ、＃Ｈ８８８９）上に重層した。遠心分離（４５０×ｇ、３０分間、室温）後、ＰＢＭＣ含有界面相の上の血漿を廃棄し、ＰＢＭＣを新しいファルコンチューブに移し、その後５０ｍｌのＰＢＳで満たした。混合物を遠心分離し（４００×ｇ、１０分間、室温）、上清を廃棄し、ＰＢＭＣペレットを滅菌ＰＢＳで２回洗浄した（遠心分離工程は３５０×ｇ、１０分間）。得られたＰＢＭＣの集団を自動的に計数し（ＶｉＣｅｌｌ）、細胞インキュベーター中で３７℃、５％ＣＯ２で、１０％ＦＣＳ及び１％のＬ－アラニル－Ｌ－グルタミン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、Ｋ０３０２）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で更に使用するまで保存した（２４時間以内）。死滅アッセイのために、抗体を指示された濃度で添加した（０．０１ｐＭ～１００ｎＭの範囲で３通り）。ＰＢＭＣを最終Ｅ：Ｔ比１０：１で標的細胞に添加した。３７℃、５％ＣＯ２で２４時間のインキュベーション後、アポトーシス／壊死細胞により細胞上清中に放出されたＬＤＨの定量によって（ＬＤＨ検出キット、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、 ＃１１ ６４４ ７９３ ００１）、標的細胞死滅を評価した。標的細胞の最大溶解（＝１００％）は、標的細胞の１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００とのインキュベーションによって達成された。最小溶解（＝０％）は、二重特異性コンストラクトを含まずにエフェクター細胞と共インキュベートした標的細胞を指す。
結果は、３６Ｆ２ ＴＣＢによって誘導された３つ全てのＦｏｌＲ１＋標的細胞株の標的特異的死滅が、１６Ｄ５ ＴＣＢによって誘導された死滅と比較してはるかに弱いことを示す（図２４Ａ～Ｃ、表２９）。一価１６Ｄ５ ＴＣＢ（１６Ｄ５ ＨＴ及び１６Ｄ５ １＋１）によって誘導される標的特異的死滅は、二価１６Ｄ５ ＴＣＢ（１６Ｄ５ ＴＣＢ及び１６Ｄ５ ＴＣＢ古典的）と比べて悪い。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ６を用いて計算した死滅アッセイに関連するＥＣ５０値を表２８に要約する。重要なことに、このデータは、二価の２＋１ ＴＣＢフォーマットの３６Ｆ２ ＦｏｌＲ１結合剤を使用すると、１６Ｄ５ ＦＯＬＲ１ ＴＣＢと比較して治療ウインドウを広げることを示している（図２４Ａ～Ｃ）。１６Ｄ５と３６Ｆ２ ＦＯＬＲ１ ＴＣＢとの間の効力の減少は、Ｈｅｌａ細胞については約４５倍であり（高度のＦＯＬＲ１発現、表２８：１６Ｄ５ＴＣＢ＝０．８対３６Ｆ２ ＴＣＢ＝３６．０を参照）及びＳｋｏｖ３細胞については約２９７倍であるが（中間のＦＯＬＲ１発現、表２８：１６Ｄ５ ＴＣＢ＝０．６対３６Ｆ２ ＴＣＢ＝１７８．４を参照）、この減少は、ＦＯＬＲ１発現が低いＨＴ２９ではほぼ７０００倍である（表２８：１６Ｄ５ ＴＣＢ＝５．７対３６Ｆ２ ＴＣＢ ３９５７３を参照）。従って、３６Ｆ２ ＦＯＬＲ１ ＴＣＢは、高発現細胞と低発現細胞とを区別し、このことは一部の正常で非腫瘍性の組織の細胞が非常に低いレベルのＦｏｌＲ１（約１０００コピー未満／細胞）を発現するので、毒性を低減するために特に重要である。この観察と一致して、下の実施例３５で議論される結果は、３６Ｆ２ ＴＣＢが初代細胞のＴ細胞死滅を誘導しないことを示すが（図２６Ａ～Ｄ）、一方１６Ｄ５ ＴＣＢの場合、４８時間のインキュベーション後にＨＲＣＥｐｉＣ及びＨＲＰＥｐｉＣ細胞で多少の死滅が観察され得る（図２６Ｂ及びＣ）。３６Ｆ２ ＴＣＢのこの重要な特徴は、ＦｏｌＲ１陽性腫瘍の治療のための投薬を可能にし、その結果、高度又は中間のＦＯＬＲ１発現を有する腫瘍組織の強力な死滅を媒介するが、低（部分的に極性化した）発現を伴う正常組織の死滅は媒介しない。注目すべきことに、この特徴は、同じ低親和性３６Ｆ２結合剤を保有する１＋１の一価フォーマットを使用した場合には観察されなかったので、二価の２＋１反転型フォーマットの３６Ｆ２ ＴＣＢのアビディティーによって媒介されるようである。
つまり、二価２＋１フォーマットの３６Ｆ２ ＴＣＢは、比較的低い親和性のＦｏｌＲ１結合部分を含むが、それは高度ＦｏｌＲ１発現細胞と低ＦｏｌＲ１発現細胞との間の区別を可能にするアビディティー効果を有する。腫瘍細胞は、高レベル又は中レベルでＦｏｌＲ１を発現するので、このＴＣＢは、低レベルでＦｏｌＲ１を発現するか又は全く発現しない正常な非癌性細胞ではなく、腫瘍細胞に選択的に結合する。
上記の有利な特性に加えて、二価の２＋１反転型フォーマットの３６Ｆ２ ＴＣＢは、化学的架橋又は他のハイブリッド法を必要としないという利点も有する。これは、患者、例えば、ＦｏｌＲ１陽性がん性腫瘍を有する患者を治療するための薬剤の製造に適している。二価の２＋１反転型フォーマットの３６Ｆ２ ＴＣＢは、凝集体が少ない標準的なＣＨＯプロセスを使用して製造することができる。更に、二価２＋１の３６Ｆ２ ＴＣＢは、ヒト及びヒト化配列を含み、ヒトに投与した場合に高度に免疫原性であるラット及びマウスポリペプチドを用いる分子よりも優れている。更に、二価２＋１フォーマットの３６Ｆ２ ＴＣＢは、ＦｃｇＲ結合を破壊するように設計されており、ＦｃｇＲ架橋及び注入反応を引き起こさず、患者に投与したときにその安全性を更に高める。
上記の結果により実証されるように、その頭尾の幾何学的形状は、二価の２＋１反転型フォーマットの３６Ｆ２ ＴＣＢを、絶対標的細胞死滅を誘導する非常に強力な分子とする。その二価性はアビディティー及び効力を増強するが、高度発現細胞と低発現細胞との間の区別も可能にする。そのアビディティー効果に起因する高度又は中間の標的発現細胞に対するその優先度は、低レベルでＦｏｌＲ１を発現する正常細胞のＴ細胞媒介性死滅に起因する毒性を低下させる。
二価２＋１フォーマットの及び本明細書に開示される他の実施態様における３６Ｆ２ ＴＣＢの更なる利点は、それらがヒト、カニクイザル及びマウスＦｏｌＲ１に結合するので、それらの臨床開発ではサロゲート分子の使用を必要としないことである。このように、本明細書に開示される分子は、３つ全ての種由来のＦｏｌＲ１を認識しない、先に記載したＦｏｌＲ１に対する抗体とは異なるエピトープを認識する。
Figure 0007146395000030
表２９は、試験した異なる細胞株における１６Ｄ５ＴＣＢ及び３６Ｆ２ ＴＣＢのＥＣ５０値の比較を示す。得られたＥＣ５０値のうち、デルタ（１６Ｄ５ＴＣＢのＥＣ５０から３６Ｆ２ＴＣＢのＥＣ５０を差し引いたもの）及びｘ倍差（１６Ｄ５ＴＣＢのＥＣ５０を３６Ｆ２ＴＣＢのＥＣ５０で割ったもの）を計算した。
Figure 0007146395000031
計算されたＥＣ５０値は、３６Ｆ２ ＴＣＢと１６Ｄ５ ＴＣＢとの間の差が大きくなるほど、標的細胞上のＦｏｌＲ１発現がより低くなることをはっきりと示している。
１６Ｄ５ ＴＣＢ及び３６Ｆ２ ＴＣＢのＥＣ５０値の比較について行われたのと同じ計算を、１６Ｄ５ ＴＣＢ及び２つの一価１６Ｄ５ ＴＣＢ（１６Ｄ５ＴＣＢ ＨＴ及び１６Ｄ５ １＋１）について行った。表３０及び３１は、１６Ｄ５ ＴＣＢ対１６Ｄ５ ＴＣＢ ＨＴ（表３０）及び１６Ｄ５ ＴＣＢ対１６Ｄ５ ＴＣＢ １＋１（表３１）のＥＣ５０値並びに対応するデルタ（１６Ｄ５ＴＣＢのＥＣ５０から１６Ｄ５ ＴＣＢ ＨＴ／１＋１のＥＣ５０を差し引いたもの）及びｘ倍の差（１６Ｄ５ＴＣＢのＥＣ５０を１６Ｄ５ＴＣＢ ＨＴ／１＋１のＥＣ５０で割ったもの）の比較を示す。
Figure 0007146395000032
Figure 0007146395000033
１６Ｄ５ＴＣＢ及び３６Ｆ２ ＴＣＢのＥＣ５０値の比較（表２９）は、ＥＣ５０値の差が大きくなるほど標的細胞上のＦｏｌＲ１発現がより低くなることを示す。この効果は、１６Ｄ５ ＴＣＢ及び一価１６Ｄ５ ＴＣＢの比較では見られない（表２９及び表３０）。１６Ｄ５ＴＣＢ１＋１（表３１）では、１６Ｄ５ＴＣＢとＦｏｌＲ１発現が減少している１６Ｄ５ ＴＣＢ１＋１のＥＣ５０の間の差はわずかに増加しているが１６Ｄ５ ＴＣＢ対３６Ｆ２ ＴＣＢの比較で見ることができるほど顕著ではない。
実施例３４
３６Ｆ２ ＴＣＢ及び１６Ｄ５ ＴＣＢ抗体によって誘導されたＦｏｌＲ１発現腫瘍細胞のＴ細胞死滅後のＣＤ８＋及びＣＤ４＋エフェクター細胞上のＣＤ２５及びＣＤ６９の上方制御
３６Ｆ２ ＴＣＢ及び１６Ｄ５ ＴＣＢによって媒介される、ＦｏｌＲ１発現Ｈｅｌａ、ＳＫｏｖ－３及びＨＴ－２９腫瘍細胞のＴ細胞死滅後のＣＤ８＋及びＣＤ４＋ Ｔ細胞の活性化を、Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ２５（後期活性化マーカー）及びＣＤ６９（早期活性化マーカー）を認識する抗体を使用したＦＡＣＳ分析によって評価した。ＤＰ４７ ＴＣＢを非結合対照として含めた。抗体及び死滅アッセイ条件は、同じ抗体濃度範囲（０．０１μＭ～１００ｎＭ、３通り）、Ｅ：Ｔ比１０：１及び４８時間のインキュベーション時間を用いて、本質的に上記の通りであった（実施例３２）。
インキュベーション後、ＰＢＭＣを丸底９６ウェルプレートに移し、４００ｘｇで４分間遠心分離し、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳで２回洗浄した。ＣＤ８（ＰＥ抗ヒトＣＤ８、ＢＤ＃５５５６３５）、ＣＤ４（Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ４２１ＴＭ抗ヒトＣＤ４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃３００５３２）、ＣＤ６９（ＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ６９、ＢＤ＃５５５５３０）及びＣＤ２５（ＡＰＣ抗ヒトＣＤ２５ ＢＤ＃５５５４３４）の表面染色を、製造者の指示に従って実施した。細胞を、０．１％ＢＳＡを含む１５０μｌ／ウェルのＰＢＳで２回洗浄した。遠心分離後、試料をＦＡＣＳ測定のために２００μｌ／ウェルのＰＢＳ ０．１％に再懸濁した。試料をＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩで分析した。
３６Ｆ２ ＴＣＢは、Ｈｅｌａ（図２５Ａ）及びＳＫｏｖ－３（図２５Ｂ）細胞を死滅させた後のＣＤ８＋及びＣＤ４＋ Ｔ細胞上の活性化マーカー（ＣＤ２５、ＣＤ６９）の標的特異的上方制御を誘導した。１６Ｄ５ ＴＣＢと比較して、３６Ｆ２によって誘導されたＣＤ８＋及びＣＤ４＋ Ｔ細胞上のＣＤ２５及びＣＤ６９の上方制御は、はるかに弱い。
ＨＴ－２９（低ＦｏｌＲ１）では、活性化マーカーの上方制御は３６Ｆ２ ＴＣＢの最高濃度でしか見られない。対照的に、ＣＤ２５及びＣＤ６９の１６Ｄ５ ＴＣＢ上方制御は、はるかに低い抗体濃度で既に見ることができる（図２５Ｃ）。
腫瘍溶解実験においても見られるように、死滅後のＴ細胞（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋）上の活性化マーカー（ＣＤ２５及びＣＤ６９）の分析は、１６Ｄ５ ＴＣＢと３６Ｆ２ ＴＣＢの差が大きくなるほど、標的細胞上のＦｏｌＲ１発現レベルが低くなることを明確に示している。
実施例３５
３６Ｆ２ ＴＣＢ及び１６Ｄ５ ＴＣＢによって誘導された初代細胞のＴ細胞死滅
３６Ｆ２ ＴＣＢ及び１６Ｄ５ ＴＣＢによって媒介されるＴ細胞死滅を、初代細胞（ヒト腎皮質上皮細胞（ＨＲＣＥｐｉＣ）（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；カタログ番号４１１０）及びヒト網膜色素上皮細胞（ＨＲＰＥｐｉＣ）（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；カタログ番号６５４０））で評価した。ＨＴ－２９細胞（低ＦｏｌＲ１）を対照細胞株として含めた。ＤＰ４７ ＴＣＢは非結合対照として機能した。ヒトＰＢＭＣをエフェクターとして使用し、二重特異性抗体とのインキュベーションの２４時間及び４８時間にて死滅を検出した。簡潔には、標的細胞をトリプシン／ＥＤＴＡで回収し、洗浄し、平底９６ウェルプレートを用いて２５０００細胞／ウェルの密度でプレーティングした。細胞を一晩接着させた。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、健康なヒトドナーから得られた濃縮リンパ球調製物（バフィーコート）のヒストパーク密度遠心分離によって調製した。新鮮な血液を滅菌ＰＢＳで希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ勾配（Ｓｉｇｍａ、＃Ｈ８８８９）上に重層した。遠心分離（４５０×ｇ、３０分間、室温）後、ＰＢＭＣ含有界面相の上の血漿を廃棄し、ＰＢＭＣを新しいファルコンチューブに移し、その後５０ｍｌのＰＢＳで満たした。混合物を遠心分離し（４００×ｇ、１０分間、室温）、上清を廃棄し、ＰＢＭＣペレットを滅菌ＰＢＳで２回洗浄した（遠心分離工程は３５０×ｇ、１０分間）。得られたＰＢＭＣの集団を自動的に計数し（ＶｉＣｅｌｌ）、細胞インキュベーター中で３７℃、５％ＣＯ２で、１０％ＦＣＳ及び１％のＬ－アラニル－Ｌ－グルタミン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、Ｋ０３０２）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で更に使用するまで保存した（２４時間以内）。死滅アッセイのために、抗体を指示された濃度で添加した（０．０１ｐＭ～１０ｎＭの範囲で３通り）。ＰＢＭＣを最終Ｅ：Ｔ比１０：１で標的細胞に添加した。３７℃、５％ＣＯ２で２４時間及び４８時間のインキュベーション後、アポトーシス／壊死細胞により細胞上清中に放出されたＬＤＨの定量によって（ＬＤＨ検出キット、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、＃１１ ６４４ ７９３ ００１）、標的細胞死滅を評価した。標的細胞の最大溶解（＝１００％）は、標的細胞の１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００とのインキュベーションによって達成された。最小溶解（＝０％）は、二重特異性コンストラクトを含まずにエフェクター細胞と共インキュベートした標的細胞を指す。
結果は、３６Ｆ２ ＴＣＢが初代細胞のＴ細胞死滅を誘導しないことを示すが（図２６Ａ～Ｄ）、一方１６Ｄ５ ＴＣＢの場合、４８時間のインキュベーション後にＨＲＣＥｐｉＣ及びＨＲＰＥｐｉＣ細胞で多少の死滅が観察され得る（図２６Ｂ及びＤ）。上記のように、１６Ｄ５ ＴＣＢと３６Ｆ２ ＴＣＢとの間で、ＨＴ－２９細胞間のＴ細胞死滅の大きな差異が観察された（図２６Ｅ、Ｆ）。
実施例３６
ＤＰ４７ ＧＳ ＴＣＢ（２＋１ Ｃｒｏｓｓｆａｂ－ＩｇＧ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ 反転型＝「非標的ＴＣＢ」）の調製
上記実験では「非標的ＴＣＢ」を対照として使用した。二重特異性抗体は、ＣＤ３ｅに結合するが、他のいずれの抗原にも結合しないので、Ｔ細胞をいずれの標的細胞にも架橋させることができない（且つその後死滅をまったく誘導することができない）。従って、二重特異性抗体は、任意の非特異的Ｔ細胞活性化をモニタするためのアッセイにおいて陰性対照として使用された。この非標的ＴＣＢはＷＯ２０１４／１３１７１２に記載されているように調製された。簡潔には、重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域を、それぞれのレシピエント哺乳動物発現ベクター中に予め挿入された定常重鎖又は定常軽鎖とインフレームでサブクローニングされている。抗体発現は、ＭＰＳＶプロモーターによって駆動され、ＣＤＳの３’末端に合成ポリＡシグナル配列を有する。加えて、各ベクターはＥＢＶ ＯｒｉＰ配列を含有する。
分子は、ポリエチレンイミンを使用してＨＥＫ２９３－ＥＢＮＡ細胞に哺乳動物発現ベクターをコトランスフェクトすることにより生成された。細胞は、１：２：１：１の比（「ベクター重鎖Ｆｃ（ホール）」：「ベクター軽鎖」：「ベクター軽鎖Ｃｒｏｓｓｆａｂ」：「ベクター重鎖Ｆｃ（ノブ）－ＦａｂＣｒｏｓｓｆａｂ」）の対応発現ベクターでトランスフェクトされた。
トランスフェクションのために、ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞を、ＣＤ ＣＨＯ培地において血清を含めないで懸濁培養した。５００ｍｌの振盪フラスコ内での生成のために、４億個のＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞をトランスフェクションの２４時間前に播種した。トランスフェクションのために、細胞を２１０ｘｇで５分間遠心分離し、予め温めた２０ｍｌのＣＤ ＣＨＯ培地により上清を置き換える。発現ベクターを、ＤＮＡの量が最終的に２００ｇになるまで２０ｍｌのＣＤ ＣＨＯ培地中で混合した。５４０μｌのＰＥＩ溶液を加えた後、１５秒間ボルテックスし、その後室温で１０分間インキュベートした。その後細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍｌの振盪フラスコに移し、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７℃で３時間インキュベートした。インキュベート時間の後、１６０ｍｌのＦ１７培地を加え、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの１日後、１ｍＭのバルプロ酸及び７％のＦｅｅｄ １を加えた。７日後、２１０×ｇで１５分間の遠心分離によって培養物の上清を精製のために収集し、溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍのフィルター）、最終濃度０．０１％ ｗ／ｖのアジ化ナトリウムを加えて４℃に維持した。
分泌されたタンパク質は、ＰｒｏｔｅｉｎＡを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより細胞培養上清から精製した。上清を、４０ｍｌの２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ７．５）で平衡化したＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＨＰカラム（ＣＶ＝５ｍｌ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。結合していないタンパク質を、少なくとも１０カラム体積の２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ７．５）で洗浄することにより除去した。標的タンパク質を、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ７．５）から２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ２．５）の２０カラム体積にわたる勾配中に溶出した。タンパク質溶液を、１／１０の０．５Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ８）を加えることにより中和させた。標的タンパク質を、濃縮し、濾過した後、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ塩化ナトリウム溶液（ｐＨ６．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。
精製されタンパク質試料のタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ）を測定することにより決定した。
分子の純度及び分子量が、還元剤の存在下及び非存在下において、ＣＥ－ＳＤＳ分析により分析された。Ｃａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ）が、製造元の指示に従って使用された。２ｕｇの試料を分析に使用した。
抗体試料の凝集物含有量を、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ－アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３（ｐＨ６．７、２５℃のランニングバッファー）中において、ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ分析的サイズ除外カラム（Ｔｏｓｏｈ）を用いて分析した。
Figure 0007146395000034
Figure 0007146395000035
実施例３７
１６Ｄ５ ＴＣＢ及び９Ｄ１１ ＴＣＢ並びに対応するＣＤ３脱アミド化変異体Ｎ１００Ａ及びＳ１００ａＡのＣＤ３発現Ｊｕｒｋａｔ細胞への結合
Ｊｕｒｋａｔ細胞上に発現されたヒトＣＤ３に対する、１６Ｄ５ ＴＣＢ及びその対応するＣＤ３脱アミド化変異体１６Ｄ５ ＴＣＢ Ｎ１００Ａ及び１６Ｄ５ ＴＣＢ Ｓ１００ａＡ、並びに９Ｄ１１ ＴＣＢ及びその脱アミド化変異体９Ｄ１１ ＴＣＢ Ｎ１００Ａ及び９Ｄ１１ ＴＣＢ Ｓ１００ａＡの結合を、ＣＤ３発現不死化Ｔリンパ球株（Ｊｕｒｋａｔ）について評価した。簡潔には、細胞は、回収され、カウントされ、生存率をチェックされて、ＦＡＣＳバッファー（１００μｌ ＰＢＳ ０．１％ ＢＳＡ）中、１ｍｌあたり２ｘ１０６個の細胞で再懸濁された。１００μｌの細胞懸濁液（０．２ｘ１０６細胞を含む）を丸底９６ウェルプレート中、４℃で６８６分間、異なる濃度の二重特異性抗体（２２９ｐＭ～５００ｎＭ）と共にインキュベートした。冷ＰＢＳ ０．１％ＢＳＡで２回洗浄した後、試料を、ＰＥ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃｇ断片特異的二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ ＰＥ＃１０９－１１６－１７０）と共に４℃で更に３０分間再インキュベートした。冷ＰＢＳ ０．１％ＢＳＡで２回試料を洗浄した後、ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ（Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＦＡＣＳ Ｄｉｖａ）を用いてＦＡＣＳにより直ちに分析した。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ６を用いて結合曲線を得た（図２８Ａ－Ｂ）。
結果は、親抗体１６Ｄ５ ＴＣＢ（図２８Ａ）及び９Ｄ１１ ＴＣＢ（図２８Ｂ）と比較して、脱アミド変異体Ｎ１００Ａ及びＳ１００ａＡのＣＤ３への結合の減少を示す。
実施例３８
１６Ｄ５ ＴＣＢ及び９Ｄ１１ ＴＣＢ及びそれらのＣＤ３脱アミド化変異体Ｎ１００Ａ及びＳ１００ａＡによって誘導されたＳＫｏｖ－３及びＨＴ－２９細胞のＴ細胞死滅
１６Ｄ５ ＴＣＢ及びその対応するＣＤ３脱アミド化変異体１６Ｄ５ ＴＣＢ Ｎ１００Ａ及び１６Ｄ５ ＴＣＢ Ｓ１００ａＡ、並びに９Ｄ１１ ＴＣＢ及びその脱アミド化変異体９Ｄ１１ ＴＣＢ Ｎ１００Ａ及び９Ｄ１１ ＴＣＢ Ｓ１００ａＡによって誘導されるＴ細胞死滅を、ＳＫｏｖ－３（中間のＦｏｌＲ１）及びＨＴ－２９（低ＦｏｌＲ１）細胞について評価した。ヒトＰＢＭＣをエフェクターとして使用し、二重特異性抗体とのインキュベーションの２４時間にて死滅を検出した。簡潔には、標的細胞をトリプシン／ＥＤＴＡで回収し、洗浄し、平底９６ウェルプレートを用いて２５０００細胞／ウェルの密度でプレーティングした。細胞を一晩接着させた。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、健康なヒトドナーから得られた濃縮リンパ球調製物（バフィーコート）のヒストパーク密度遠心分離によって調製した。新鮮な血液を滅菌ＰＢＳで希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ勾配（Ｓｉｇｍａ、＃Ｈ８８８９）上に重層した。遠心分離（４５０×ｇ、３０分間、室温）後、ＰＢＭＣ含有界面相の上の血漿を廃棄し、ＰＢＭＣを新しいファルコンチューブに移し、その後５０ｍｌのＰＢＳで満たした。混合物を遠心分離し（４００×ｇ、１０分間、室温）、上清を廃棄し、ＰＢＭＣペレットを滅菌ＰＢＳで２回洗浄した（遠心分離工程は３５０×ｇ、１０分間）。得られたＰＢＭＣの集団を自動的に計数し（ＶｉＣｅｌｌ）、細胞インキュベーター中で３７℃、５％ＣＯ２で、１０％ＦＣＳ及び１％のＬ－アラニル－Ｌ－グルタミン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、Ｋ０３０２）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で更に使用するまで保存した（２４時間以内）。死滅アッセイのために、抗体を指示された濃度で添加した（０．０１ｐＭ～１０ｎＭの範囲で３通り）。ＰＢＭＣを最終Ｅ：Ｔ比１０：１で標的細胞に添加した。３７℃、５％ＣＯ２で２４時間のインキュベーション後、アポトーシス／壊死細胞により細胞上清中に放出されたＬＤＨの定量によって（ＬＤＨ検出キット、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、＃１１ ６４４ ７９３ ００１）、標的細胞死滅を評価した。標的細胞の最大溶解（＝１００％）は、標的細胞の１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００とのインキュベーションによって達成された。最小溶解（＝０％）は、二重特異性コンストラクトを含まずにエフェクター細胞と共インキュベートした標的細胞を指す。
この結果は、ＳＫｏｖ－３細胞において、ＣＤ３脱アミド化変異体１６Ｄ５ ＴＣＢ Ｎ１００Ａ及び１６Ｄ５ Ｓ１００ａＡによって誘導される死滅が、１６Ｄ５ ＴＣＢによって誘導される死滅に匹敵することを示す（図２９Ａ）。９Ｄ１１ ＴＣＢ及びその変異体９Ｄ１１ ＴＣＢ Ｎ１００Ａ及び９Ｄ１１ ＴＣＢ Ｓ１００ａＡについても同様である（図２９Ｂ）。ＦｏｌＲ１低発現ＨＴ－２９細胞では、１６Ｄ５ ＴＣＢ（図３０Ａ）及び９Ｄ１１ ＴＣＢ（図３０Ｂ）の場合、Ｓ１００ａＡ変異体は死滅効率の低下を示す。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ６を用いて計算された死滅アッセイに関するＥＣ５０値を表３５に示す。
Figure 0007146395000036
実施例３９
脱アミド部位を除去するための２つのＣＤ３結合剤変異体（Ｎ１００Ａ及びＳ１００ａＡ）のＴＣＢとしての表面プラズモン共鳴による生化学的特徴付け
ＣＤ３結合剤変異体（Ｎ１００Ａ又はＳ１００ａＡ）を有する２つの１６Ｄ５ ＴＣＢの、ヒト組換えＣＤ３（Ｆｃ融合体としてのＣＤ３ｅｐｓｉｌｏｎ－ＣＤ３ｄｅｌｔａヘテロ二量体）への結合を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって評価した。全てのＳＰＲ実験をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００において、ランニングバッファーとしてＨＢＳ－ＥＰ（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤 Ｐ２０、Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて２５℃で行った。
ＣＤ３ｅｄ－Ｆｃに対する親和性
抗ＦｏｌＲ１ Ｔ細胞二重特異性抗体と組換えＣＤ３イプシロンデルタヘテロ二量体との間の相互作用の親和性を以下に記載するように決定した（表３６）。
親和性測定のために、抗ヒトＦａｂ特異的抗体（Ｆａｂ捕捉キット、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の約６０００の共鳴単位（ＲＵ）の直接カップリングを、標準的アミンカップリングキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてｐＨ５．０のＣＭ５チップ上で実施した。抗ＦｏｌＲ１ Ｔ細胞二重特異性抗体を、６０秒間、１０μｌ／分の流速で２００ｎＭで捕捉し、参照フローセルは捕捉せずに放置した。ヒト及びカニクイザル葉酸受容体１ Ｆｃ融合体の希釈系列（４．１～３０００ｎＭ）を全てのフローセル上で３０μｌ／分で２４０秒間通過させ、結合相を記録した。解離相を２４０秒間モニターし、試料溶液からＨＢＳ－ＥＰへの切り替えによってトリガーした。チップ表面は、１０ｍＭのグリシン－ＨＣｌ（ｐＨ１．５）の６０秒間の二重注入を使用して、毎サイクル後に再生された。バルク屈折率の差異は、基準フローセルで取得される応答を差し引くことにより修正された。相互作用の親和性定数は、Ｂｉａ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたラングミュア結合に対するフィッティングによる速度定数から導かれた。
Figure 0007146395000037
２つのＣＤ３脱アミド化変異体は、野生型ＣＤ３結合剤（ＣＨ２５２７）と比較してわずかに減少した親和性を有するが、その差異は重大ではない。
実施例４０
ＣＤ３結合剤中の脱アミド部位を除去する変異を有する１６Ｄ５ Ｔ細胞二重特異性の２つの変異体：１６Ｄ５ ＴＣＢ Ｎ１００Ａ、１６Ｄ５ ＴＣＢ Ｓ１００ａＡの産生及び精製
一過性トランスフェクション及び産生
以下に記載するように、２つの脱アミド化変異体１６Ｄ５ ＴＣＢは必要とされるベクターについてのＰＥＩ媒介トランスフェクションの手順を用いてＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞中で一過性に産生された。ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞を、ＣＤ ＣＨＯ培地において血清を含めないで懸濁培養する。５００ｍｌの振盪フラスコ内での生成のために、４億個のＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞をトランスフェクションの２４時間前に播種する（代替スケールについては、全ての量がそれに応じて調整された）。トランスフェクションのために、細胞を２１０ｘｇで５分間遠心分離する。上清は、予め温めた２０ｍｌのＣＤ ＣＨＯ培地により置き換える。発現ベクターを、ＤＮＡの量が最終的に２００μｇになるまで２０ｍｌのＣＤ ＣＨＯ培地中で混合する。５４０μｌのＰＥＩ溶液を加えた後、１５秒間ボルテックスし、その後室温で１０分間インキュベートする。その後細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍｌの振盪フラスコに移し、５％ ＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７℃で３時間インキュベートする。インキュベーション時間の後、１６０ｍｌのＦ１７培地を加え、細胞を２４時間培養する。トランスフェクションの１日後、１ｍＭのバルプロ酸及び７％のＦｅｅｄ １を加える。７日後、２１０×ｇで１５分間の遠心分離によって培養物の上清を精製のために収集し、溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍのフィルター）、最終濃度０．０１％ｗ／ｖのアジ化ナトリウムを加えて４℃に維持する。生成後、上清を回収し、０．２２μｍの滅菌フィルターを通して濾過し、精製するまで４℃で保存した。
精製
２つの脱アミド化変異体１６Ｄ５ ＴＣＢは、プロテインＡアフィニティー精製（Ａｋｔａ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ）及びサイズ排除クロマトグラフィーなどの標準的な手順を使用して２段階で精製した。一過性産生から得られた上清をｐＨ８．０（２ＭのＴＲＩＳ（ｐＨ８．０）を使用）に調整し、８カラム容量（ｃｖ）のバッファーＡ（２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）、２０ｍＭクエン酸ナトリウム）で平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カラム容量（ｃｖ）＝２ｍｌ）に適用した。１０ｃｖのバッファーＡで洗浄した後、タンパク質を、バッファーＢ（２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭグリシン）へのｐＨ勾配を用いて、２０ｃｖ以上で溶出させた。目的のタンパク質を含む画分をプールし、溶液のｐＨをｐＨ６．０に緩やかに調整した（０．５ＭのＮａ２ＨＰＯ４（ｐＨ８．０）を使用）。超濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５、３０．０００ＭＷＣＯ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて試料を１ｍｌまで濃縮し、次いで２０ｍＭヒスチジン、ｐＨ６．０、１４０ｍＭのＮａＣｌで平衡化したＨｉＬｏａｄＴＭ １６／６０ ＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ ２００分取グレード（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用した。溶出画分の凝集物含有量を分析用サイズ排除クロマトグラフィーによって分析した。従って、各画分３０μｌを、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ－アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３、ｐＨ６．７のランニングバッファー中で２５℃で平衡化したＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ分析サイズ排除カラム（Ｔｏｓｏｈ）に適用した。２％未満のオリゴマーを含む画分をプールした。タンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ）を測定することにより決定した。製造者の説明書（機器Ｃａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐＧＸ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）に従い、還元剤の存在下及び非存在下で、コンストラクトの純度及び分子量をＳＤＳキャピラリー電気泳動（ＣＥ－ＳＤＳ）により分析した。精製したタンパク質を液体Ｎ２中で凍結させ、－８０℃で保存した。
Figure 0007146395000038
ＴＣＢは両方とも、野生型ＣＤ３結合剤を用いたコンストラクトと同様に良好な品質で産生された。
実施例４１
ＣＤＲ中のホットスポットを除去するＩｇＧとしての２つの１６Ｄ５結合剤変異体（Ｄ５２ｄＥ及びＤ５２ｄＱ）の産生及び精製
一過性トランスフェクション及び産生
以下に記載するように、２つのＩｇＧは必要とされるベクターについてのＰＥＩ媒介トランスフェクションの手順を用いてＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞中で一過性に産生された。ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞を、ＣＤ ＣＨＯ培地において血清を含めないで懸濁培養する。５００ｍｌの振盪フラスコ内での生成のために、４億個のＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞をトランスフェクションの２４時間前に播種する（代替スケールについては、全ての量がそれに応じて調整された）。トランスフェクションのために、細胞を２１０ｘｇで５分間遠心分離する。上清は、予め温めた２０ｍｌのＣＤ ＣＨＯ培地により置き換える。発現ベクターを、ＤＮＡの量が最終的に２００μｇになるまで２０ｍｌのＣＤ ＣＨＯ培地中で混合する。５４０μｌのＰＥＩ溶液を加えた後、１５秒間ボルテックスし、その後室温で１０分間インキュベートする。その後細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍｌの振盪フラスコに移し、５％のＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７℃で３時間インキュベートする。インキュベーション時間の後、１６０ｍｌのＦ１７培地を加え、細胞を２４時間培養する。トランスフェクションの１日後、１ｍＭのバルプロ酸及び７％のＦｅｅｄ １を加える。７日後、２１０×ｇで１５分間の遠心分離によって培養物の上清を精製のために収集し、溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍのフィルター）、最終濃度０．０１％ｗ／ｖのアジ化ナトリウムを加えて４℃に維持する。生成後、上清を回収し、上清を含む抗体を０．２２μｍの滅菌フィルターを通して濾過し、精製するまで４℃で保存した。
抗体精製
２つのＩｇＧは、プロテインＡアフィニティー精製（Ａｋｔａ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ）及びサイズ排除クロマトグラフィーなどの標準的な手順を使用して２段階で精製した。一過性産生から得られた上清をｐＨ８．０（２ＭのＴＲＩＳ（ｐＨ８．０）を使用）に調整し、８カラム容量（ｃｖ）のバッファーＡ（２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５）で平衡化したＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カラム容量（ｃｖ）＝１ｍｌ）に適用した。１０ｃｖのバッファーＡで洗浄した後、タンパク質を、バッファーＢ（２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭグリシン）へのｐＨ工程を用いて、５ｃｖ以上で溶出させた。目的のタンパク質を含む５ｍｌをＡｋｔａＥｘｐｌｏｒｅｒ上のループに貯蔵し、続いて２０ｍＭのヒスチジン、ｐＨ６．０，１４０ｍＭのＮａＣｌで平衡化したＨｉＬｏａｄ １６／６０ ＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用する（ＴＷＥＥｎは使用しない）。ＩｇＧを含む画分をプールし、超濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５，３００００ＭＷＣＯ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて濃縮した。最終プールの凝集物含有量を分析用サイズ排除クロマトグラフィーによって分析した。従って、３０μｌを、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ－アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３、ｐＨ６．７のランニングバッファー中で２５℃で平衡化したＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ分析サイズ排除カラム（Ｔｏｓｏｈ）に適用した。タンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ）を測定することにより決定した。製造者の説明書（機器Ｃａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐＧＸ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）に従い、還元剤の存在下及び非存在下で、コンストラクトの純度及び分子量をＳＤＳキャピラリー電気泳動（ＣＥ－ＳＤＳ）により分析した。精製したタンパク質を４℃で保存した。
Figure 0007146395000039
両方のＩｇＧが良好に産生され、良質であった。
実施例４２
ＣＤＲ中のホットスポットを除去するＩｇＧとしての２つの１６Ｄ５結合剤変異体（Ｄ５２ｄＥ及びＤ５２ｄＱ）の表面プラズモン共鳴による生化学的特徴付け
ＩｇＧとしての２つの１６Ｄ５結合剤変異体（Ｄ５２ｄＥ及びＤ５２ｄＱ）のヒト及びカニクイザル組換え葉酸受容体１（両方ともＦｃ融合体）への結合を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって評価した。全てのＳＰＲ実験をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００において、ランニングバッファーとしてＨＢＳ－ＥＰ（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤 Ｐ２０、Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて２５℃で行った。
１．葉酸受容体１に対するアビディティー
抗ＦｏｌＲ１ ＩｇＧ又はＴ細胞二重特異性抗体（Ｔ ｃｅｌｌ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃｓ）と組換え葉酸受容体との間の相互作用のアビディティーを以下に記載するように決定した（表３８）。
ヒト、カニクイザル及びマウス葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）の組換えビオチン化単量体Ｆｃ融合体を、ＳＡチップ上に標準的なカップリング指示（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて直接カップリングさせた。固定レベルは約１６０であった。抗ＦｏｌＲ１ ＩｇＧ又はＴ細胞二重特異性抗体を、フローセルを１８０秒にわたって３０μＬ／分の流速で３．７～９００ｎＭの濃度範囲で通過させた。解離を６００秒間モニターした。バルク屈折率の差異は、組換えビオチン化マウスＩＬ２受容体Ｆｃ融合体を固定化した基準フローセルで取得される応答を差し引くことにより修正された。ＩｇＧ又はＴ細胞二重特異性抗体の二価結合から生じる結合曲線は、１：１のラングミュア結合（１：２結合であるにもかかわらず）に近似され、そのモデルに適合させて、二価結合のアビディティーを表す見かけのＫＤを得た。相互作用の見かけの結合定数は、Ｂｉａ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたフィッティングの速度定数から導かれた。
Figure 0007146395000040
２．葉酸受容体１に対する親和性
抗ＦｏｌＲ１ ＩｇＧ又はＴ細胞二重特異性抗体と組換え葉酸受容体との間の相互作用の親和性を以下に記載するように決定した（表３９）。
親和性測定のために、抗ヒトＦａｂ特異的抗体（Ｆａｂ捕捉キット、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の約１００００の共鳴単位（ＲＵ）の直接カップリングを、標準的アミンカップリングキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてｐＨ５．０のＣＭ５チップ上で実施した。抗ＦｏｌＲ１ ＩｇＧ又はＴ細胞二重特異性抗体を、４０秒間、１０μｌ／分の流速で２０ｎＭで捕捉し、参照フローセルは捕捉せずに放置した。ヒト及びカニクイザル葉酸受容体１ Ｆｃ融合体の希釈系列（１２．３５～３０００ｎＭ）を全てのフローセル上で３０μｌ／分で２４０秒間通過させ、結合相を記録した。解離相を３００秒間モニターし、試料溶液からＨＢＳ－ＥＰへの切り替えによってトリガーした。チップ表面は、１０ｍＭのグリシン－ＨＣｌ（ｐＨ１．５）の６０秒間の二重注入を使用して、毎サイクル後に再生された。バルク屈折率の差異は、基準フローセルで取得される応答を差し引くことにより修正された。相互作用の親和性定数は、Ｂｉａ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたラングミュア結合に対するフィッティングによる速度定数から導かれた。
Figure 0007146395000041
２つの１６Ｄ５ホットスポット変異体は、野生型１６Ｄ５結合剤と類似のアビディティー（二価結合）を有する。アビディティーはＤ５２ｄＱ変異体ではわずかに減少し、この差異は親和性（一価結合）において更に明らかである。
実施例４３
ＦｏｌＲ１に対する親和性を減少させるための重鎖及び軽鎖に変異を有する１６Ｄ５結合剤の１２の変異体のＩｇＧとしての産生及び精製
一過性トランスフェクション及び産生
以下に記載するように、１２のＩｇＧは必要とされるベクターについてのＰＥＩ媒介トランスフェクションの手順を用いてＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞中で一過性に産生された。ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞を、ＣＤ ＣＨＯ培地において血清を含めないで懸濁培養する。５００ｍｌの振盪フラスコ内での生成のために、４億個のＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞をトランスフェクションの２４時間前に播種する（代替スケールについては、全ての量がそれに応じて調整された）。トランスフェクションのために、細胞を２１０ｘｇで５分間遠心分離する。上清は、予め温めた２０ｍｌのＣＤ ＣＨＯ培地により置き換える。発現ベクターを、ＤＮＡの量が最終的に２００μｇになるまで２０ｍｌのＣＤ ＣＨＯ培地中で混合する。５４０μｌのＰＥＩ溶液を加えた後、１５秒間ボルテックスし、その後室温で１０分間インキュベートする。その後細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍｌの振盪フラスコに移し、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７℃で３時間インキュベートする。インキュベーション時間の後、１６０ｍｌのＦ１７培地を加え、細胞を２４時間培養する。トランスフェクションの１日後、１ｍＭのバルプロ酸及び７％のＦｅｅｄ １を加える。７日後、２１０×ｇで１５分間の遠心分離によって培養物の上清を精製のために収集し、溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍのフィルター）、最終濃度０．０１％ｗ／ｖのアジ化ナトリウムを加えて４℃に維持する。生成後、上清を回収し、上清を含む抗体を０．２２μｍの滅菌フィルターを通して濾過し、精製するまで４℃で保存した。
抗体精製
全ての分子は、プロテインＡアフィニティー精製（Ａｋｔａ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ）及びサイズ排除クロマトグラフィーなどの標準的な手順を使用して２段階で精製した。一過性産生から得られた上清をｐＨ８．０（２ＭのＴＲＩＳ（ｐＨ８．０）を使用）に調整し、８カラム容量（ｃｖ）のバッファーＡ（２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５）で平衡化したＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カラム容量（ｃｖ）＝１ｍｌ）に適用した。１０ｃｖのバッファーＡで洗浄した後、タンパク質を、バッファーＢ（２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭグリシン）へのｐＨ工程を用いて、５ｃｖ以上で溶出させた。目的のタンパク質を含む５ｍｌをＡｋｔａＥｘｐｌｏｒｅｒ上のループに貯蔵し、続いて２０ｍＭのヒスチジン、ｐＨ６．０，１４０ｍＭのＮａＣｌで平衡化したＨｉＬｏａｄ １６／６０ ＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用する。ＩｇＧを含む画分をプールし、超濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５，３００００ ＭＷＣＯ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて濃縮した。最終プールの凝集物含有量を分析用サイズ排除クロマトグラフィーによって分析した。従って、３０μｌを、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ－アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３、ｐＨ６．７のランニングバッファー中で２５℃で平衡化したＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ分析サイズ排除カラム（Ｔｏｓｏｈ）に適用した。タンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ）を測定することにより決定した。製造者の説明書（機器Ｃａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐＧＸ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）に従い、還元剤の存在下及び非存在下で、コンストラクトの純度及び分子量をＳＤＳキャピラリー電気泳動（ＣＥ－ＳＤＳ）により分析した。精製したタンパク質を４℃で保存した。
Figure 0007146395000042
１２の全てのＩｇＧが良好に産生され、良質であった。
実施例４４
表面プラズモン共鳴によるＩｇＧとしての１６Ｄ５重鎖及び軽鎖組み合わせ変異体の生化学的特徴付け
異なる組換え葉酸受容体（ヒト、マウス及びカニクイザルＦｏｌＲ１；全てＦｃ融合体として）に対するＩｇＧとしてのＦｏｌＲ１ １６Ｄ５重鎖及び軽鎖組み合わせ変異体結合剤の結合を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって評価した。全てのＳＰＲ実験をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００において、ランニングバッファーとしてＨＢＳ－ＥＰ（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤 Ｐ２０、Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて２５℃で行った。
葉酸受容体１に対するアビディティー
抗ＦｏｌＲ１ ＩｇＧ又はＴ細胞二重特異性抗体（Ｔ ｃｅｌｌ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃｓ）と組換え葉酸受容体との間の相互作用のアビディティーを以下に記載するように決定した（表４１）。
ヒト、カニクイザル及びマウス葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）の組換えビオチン化単量体Ｆｃ融合体を、ＳＡチップ上に標準的なカップリング指示（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて直接カップリングさせた。固定レベルは約３００であった。抗ＦｏｌＲ１ ＩｇＧ又はＴ細胞二重特異性抗体を、フローセルを１８０秒にわたって３０μＬ／分の流速で１１．１～９００ｎＭの濃度範囲で通過させた。解離を２４０秒間又は６００秒間モニターした。バルク屈折率の差異は、組換えビオチン化マウスＩＬ２受容体Ｆｃ融合体を固定化した基準フローセルで取得される応答を差し引くことにより修正された。ＩｇＧ又はＴ細胞二重特異性抗体の二価結合から生じる結合曲線は、１：１のラングミュア結合（１：２結合であるにもかかわらず）に近似され、そのモデルに適合させて、二価結合のアビディティーを表す見かけのＫＤを得た。相互作用の見かけの結合定数は、Ｂｉａ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたフィッティングの速度定数から導かれた。１：１ Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルによって適合させるには速すぎる会合及び解離相を有する低親和性動態については、定常状態解析モデルをＢｉａ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて適用した。定常状態分析は、平衡状態での結合反応のＫＤを与える。
Figure 0007146395000043
Figure 0007146395000044
葉酸受容体１に対する親和性
抗ＦｏｌＲ１ ＩｇＧ又はＴ細胞二重特異性抗体と組換え葉酸受容体との間の相互作用の親和性を以下に記載するように決定した（表４２）。
親和性測定のために、抗ヒトＦａｂ特異的抗体（Ｆａｂ捕捉キット、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の約１００００の共鳴単位（ＲＵ）の直接カップリングを、標準的アミンカップリングキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてｐＨ５．０のＣＭ５チップ上で実施した。抗ＦｏｌＲ１ ＩｇＧ又はＴ細胞二重特異性抗体を、４０秒間、１０μｌ／分の流速で２００ｎＭで捕捉し、参照フローセルは捕捉せずに放置した。ヒト及びカニクイザル葉酸受容体１ Ｆｃ融合体の希釈系列（１２．３５～３０００ｎＭ）を全てのフローセル上で３０μｌ／分で２４０秒間通過させ、結合相を記録した。解離相を３００秒間モニターし、試料溶液からＨＢＳ－ＥＰへの切り替えによってトリガーした。チップ表面は、１０ｍＭのグリシン－ＨＣｌ（ｐＨ１．５）の６０秒間の二重注入を使用して、毎サイクル後に再生された。バルク屈折率の差異は、基準フローセルで取得される応答を差し引くことにより修正された。相互作用の親和性定数は、Ｂｉａ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたラングミュア結合に対するフィッティングによる速度定数から導かれた。
Figure 0007146395000045
１６Ｄ５のＦｏｌＲ１結合剤の１２の「親和性が減少した」変異体を、１６Ｄ５野生型結合剤及び３６Ｆ２結合剤と比較して表面プラズモン共鳴によって分析した。目標は、３６Ｆ２に匹敵する親和性及びアビディティーを有する１６Ｄ５変異体を見出すことであった。一価の結合（親和性）を測定する場合、３６Ｆ２よりも高い親和性を有する変異体及び３６Ｆ２よりも低い親和性を有する変異体が存在した。しかしながら、二価結合（アビディティー）において、全ての変異体は、３６Ｆ２よりも高い見かけのＫＤ値を有する。これは主に３６Ｆ２の速い会合速度（ｋａ）に起因し、その結果、３６Ｆ２の小さな見かけのＫＤを生じる。３６Ｆ２が二価で結合するときの大きなアビディティー効果は、この結合剤に特有のようである。上記のように、３６Ｆ２は、同定され得るヒト、マウス及びカニクイザルの交差反応性結合剤の唯一のものであった。
実施例４５
Ｈｅｌａ細胞上に発現されたヒトＦｏｌＲ１への１６Ｄ５ ＨＣ／ＬＣ変異体の結合
Ｈｅｌａ細胞上において、ヒトＦｏｌＲ１に対する３６Ｆ２ ＴＣＢ、１６Ｄ５ ＴＣＢ及び１６Ｄ５の様々なＨＣ／ＬＣ変異体の結合を評価した。簡潔には、細胞は、回収され、カウントされ、生存率をチェックされて、ＦＡＣＳバッファー（１００μｌ ＰＢＳ ０．１％ ＢＳＡ）中、１ｍｌあたり２ｘ１０６個の細胞で再懸濁された。１００μｌの細胞懸濁液（０．２ｘ１０６細胞を含む）を丸底９６ウェルプレート中、４℃で２２９分間、異なる濃度の二重特異性抗体（２２９ｐＭ～５００ｎＭ）と共にインキュベートした。冷ＰＢＳ ０．１％ＢＳＡで２回洗浄した後、試料を、ＰＥ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃｇ断片特異的二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ ＰＥ＃１０９－１１６－１７０）と共に４℃で更に３０分間再インキュベートした。冷ＰＢＳ ０．１％ＢＳＡで２回試料を洗浄した後、１％ＰＦＡで一晩固定した。その後、試料を遠心分離し、ＰＢＳ ０．１％ＢＳＡに再懸濁し、ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ（Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＦＡＣＳ Ｄｉｖａ）を用いてＦＡＣＳにより分析した。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ６を用いて結合曲線を得た（図３２Ａ－Ｅ）。３６Ｆ２ ＴＣＢに結合したＦｏｌＲ２は、マウスにおいて十分に耐容されず、望まれる有効性を示さなかった。
実施例４６
ヒト及びカニクイザルＦｏｌＲ１への親和性を減少させる変異を有する１６Ｄ５ Ｔ細胞二重特異性の４つの変異体：１６Ｄ５ ＴＣＢ Ｇ４９Ｓ／Ｓ９３Ａ、Ｇ４９Ｓ／Ｋ５３Ａ、Ｗ９６Ｙ、Ｗ９６Ｙ／Ｄ５２Ｅの産生及び精製
一過性トランスフェクション及び産生
以下に記載するように、ＦｏｌＲ１に対して減少した親和性を有する１６Ｄ５ ＴＣＢの４つの更なる変異体が、必要とされるベクターについてのＰＥＩ媒介トランスフェクションの手順を用いてＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞中で一過性に産生された。トランスフェクションのために、ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞を、６ｍＭのＬ－グルタミン及び２５０ｍｇ／ｌのＧ４１８培地を含む無血清のＥｘｃｅｌｌ培養液中で懸濁状態で培養する。６００ｍｌのチューブスピンフラスコ（最大作業容量４００ｍＬ）内での生成のために、６億個のＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞をトランスフェクションの２４時間前に播種する。トランスフェクションのために、細胞を２１０ｘｇで５分間遠心分離する。上清は、予め温めた２０ｍｌのＣＤ ＣＨＯ培地により置き換える。発現ベクターを、ＤＮＡの量が最終的に４００μｇになるまで２０ｍｌのＣＤ ＣＨＯ培地中で混合する。１０８０μｌのＰＥＩ溶液（２．７μｇ／ｍｌ）を加えた後、１５秒間ボルテックスし、その後室温で１０分間インキュベートする。その後細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、６００ｍｌのＴｕｂｅＳｐｉｎフラスコに移し、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７℃で３時間インキュベートする。インキュベーション時間の後、３６０ｍｌのＥｘｃｅｌｌ＋６ｍＭのＬ－グルタミン＋５ｇ／ＬのＰｅｐｓｏｙ＋１．０ｍＭのＶＰＡ培地を加え、細胞を２４時間培養する。トランスフェクションの１日後、７％のＦｅｅｄ ７を添加した。７日後、３６００×ｇで２０～３０分間の遠心分離（Ｓｉｇｍａ ８Ｋ遠心分離機）によって培養物の上清を精製のために収集し、溶液を滅菌濾過し（０．２２ｍｍのフィルター）、最終濃度０．０１％ ｗ／ｖのアジ化ナトリウムを加えて４℃で維持する。
精製
親和性が減少した変異体１６Ｄ５ ＴＣＢは、プロテインＡアフィニティー精製（Ａｋｔａ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ）及びサイズ排除クロマトグラフィーなどの標準的な手順を使用して２段階で精製した。一過性産生から得られた上清をｐＨ８．０（２ＭのＴＲＩＳ（ｐＨ８．０）を使用）に調整し、８カラム容量（ｃｖ）のバッファーＡ（２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）、２０ｍＭクエン酸ナトリウム）で平衡化したＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カラム容量（ｃｖ）＝５ｍｌ）に適用した。１０ｃｖのバッファーＡで洗浄した後、タンパク質を、バッファーＢ（２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭグリシン）へのｐＨ勾配を用いて、２０ｃｖ以上で溶出させた。目的のタンパク質を含む画分をプールし、溶液のｐＨをｐＨ６．０に緩やかに調整した（０．５ＭのＮａ２ＨＰＯ４（ｐＨ８．０）を使用）。超濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５、３０．０００ＭＷＣＯ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて試料を１ｍｌまで濃縮し、次いで２０ｍＭヒスチジン、ｐＨ６．０、１４０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ ２０で平衡化したＨｉＬｏａｄＴＭ １６／６０ ＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ ２００分取グレード（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用した。溶出画分の凝集物含有量を分析用サイズ排除クロマトグラフィーによって分析した。従って、各画分３０μｌを、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ－アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３、ｐＨ６．７のランニングバッファー中で２５℃で平衡化したＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ分析サイズ排除カラム（Ｔｏｓｏｈ）に適用した。２％未満のオリゴマーを含む画分をプールした。タンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ）を測定することにより決定した。製造者の説明書（機器Ｃａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐＧＸ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）に従い、還元剤の存在下及び非存在下で、コンストラクトの純度及び分子量をＳＤＳキャピラリー電気泳動（ＣＥ－ＳＤＳ）により分析した。精製したタンパク質を液体Ｎ２中で凍結させ、－８０℃で保存した。
Figure 0007146395000046
減少した親和性を有する全ての変異体は高品質で産生され得る。
実施例４７
Ｈｅｌａ細胞上で発現されたヒトＦｏｌＲ１に対する３６Ｆ２ ＴＣＢ、１６Ｄ５ ＴＣＢ及び２つの１６Ｄ５の親和性が減少した変異体１６Ｄ５ Ｗ９６Ｙ／Ｄ５２Ｅ ＴＣＢ及び１６Ｄ５ Ｇ４９Ｓ／Ｓ９３Ａ ＴＣＢの結合
ヒトＦｏｌＲ１に対する３６Ｆ２ ＴＣＢ、１６Ｄ５ ＴＣＢ及び２つの１６Ｄ５の親和性が減少した変異体１６Ｄ５ Ｗ９６Ｙ／Ｄ５２Ｅ ＴＣＢ及び１６Ｄ５ Ｇ４９Ｓ／Ｓ９３Ａ ＴＣＢの結合がＨｅｌａ細胞上で評価された。簡潔には、細胞は、回収され、カウントされ、生存率をチェックされて、ＦＡＣＳバッファー（１００μｌ ＰＢＳ ０．１％ ＢＳＡ）中、１ｍｌあたり２ｘ１０６個の細胞で再懸濁された。１００μｌの細胞懸濁液（０．２ｘ１０６細胞を含む）を丸底９６ウェルプレート中、４℃で３０分間、異なる濃度の二重特異性抗体（２２９ｐＭ～５００ｎＭ）と共にインキュベートした。冷ＰＢＳ ０．１％ＢＳＡで２回洗浄した後、試料を、ＦＩＴＣ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃｇ断片特異的二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ ＰＥ＃１０９－０９６－０９８）と共に４℃で更に３０分間再インキュベートした。冷ＰＢＳ ０．１％ＢＳＡで２回試料を洗浄した後、試料をを遠心分離し、ＰＢＳ ０．１％ＢＳＡに再懸濁し、ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ（Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＦＡＣＳ Ｄｉｖａ）を用いてＦＡＣＳにより分析した。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ６を用いて結合曲線を得た（図３３）。
実施例４８
ヒト及びカニクイザルＦｏｌＲ１：１４Ｂ１、６Ｅ１０、２Ｃ７に対する中間親和性を有する３つのＴ細胞二重特異性抗体の産生及び精製
一過性トランスフェクション及び産生
以下に記載するように、中間親和性のＴＣＢは必要とされるベクターについてのＰＥＩ媒介トランスフェクションの手順を用いてＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞中で一過性に産生された。トランスフェクションのために、ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞を、６ｍＭのＬ－グルタミン及び２５０ｍｇ／ｌのＧ４１８培地を含む無血清のＥｘｃｅｌｌ培養液中で懸濁状態で培養する。６００ｍｌのチューブスピンフラスコ（最大作業容量４００ｍＬ）内での生成のために、６億個のＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞をトランスフェクションの２４時間前に播種する。トランスフェクションのために、細胞を２１０ｘｇで５分間遠心分離する。上清は、予め温めた２０ｍｌのＣＤ ＣＨＯ培地により置き換える。発現ベクターを２０ｍｌのＣＤ ＣＨＯ培地中で最終的に４００μｇのＤＮＡの量まで混合する。１０８０μｌのＰＥＩ溶液（２．７μｇ／ｍｌ）を加えた後、１５秒間ボルテックスし、その後室温で１０分間インキュベートする。その後細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、６００ｍｌのＴｕｂｅＳｐｉｎフラスコに移し、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７℃で３時間インキュベートする。インキュベーション時間の後、３６０ｍｌのＥｘｃｅｌｌ＋６ｍＭのＬ－グルタミン＋５ｇ／ＬのＰｅｐｓｏｙ＋１．０ｍＭのＶＰＡ培地を加え、細胞を２４時間培養する。トランスフェクションの１日後、７％のＦｅｅｄ ７を添加した。７日後、３６００×ｇで２０～３０分間の遠心分離（Ｓｉｇｍａ ８Ｋ遠心分離機）によって培養物の上清を精製のために収集し、溶液を滅菌濾過し（０．２２ｍｍのフィルター）、最終濃度０．０１％ ｗ／ｖのアジ化ナトリウムを加えて４℃で維持する。
精製
中間親和性のＴＣＢは、プロテインＡアフィニティー精製（Ａｋｔａ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ）及びサイズ排除クロマトグラフィーなどの標準的な手順を使用して２段階で精製した。一過性産生から得られた上清をｐＨ８．０（２ＭのＴＲＩＳ（ｐＨ８．０）を使用）に調整し、８カラム容量（ｃｖ）のバッファーＡ（２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）、２０ｍＭクエン酸ナトリウム）で平衡化したＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カラム容量（ｃｖ）＝５ｍｌ）に適用した。１０ｃｖのバッファーＡで洗浄した後、タンパク質を、バッファーＢ（２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭグリシン）へのｐＨ勾配を用いて、２０ｃｖ以上で溶出させた。目的のタンパク質を含む画分をプールし、溶液のｐＨをｐＨ６．０に緩やかに調整した（０．５ＭのＮａ２ＨＰＯ４（ｐＨ８．０）を使用）。超濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５、３０．０００ＭＷＣＯ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて試料を１ｍｌまで濃縮し、次いで２０ｍＭヒスチジン、ｐＨ６．０、１４０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ ２０で平衡化したＨｉＬｏａｄＴＭ １６／６０ ＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ ２００分取グレード（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用した。溶出画分の凝集物含有量を分析用サイズ排除クロマトグラフィーによって分析した。従って、各画分３０μｌを、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ－アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３、ｐＨ６．７のランニングバッファー中で２５℃で平衡化したＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ分析サイズ排除カラム（Ｔｏｓｏｈ）に適用した。２％未満のオリゴマーを含む画分をプールした。タンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ）を測定することにより決定した。製造者の説明書（機器Ｃａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐＧＸ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）に従い、還元剤の存在下及び非存在下で、コンストラクトの純度及び分子量をＳＤＳキャピラリー電気泳動（ＣＥ－ＳＤＳ）により分析した。精製したタンパク質を液体Ｎ２中で凍結させ、－８０℃で保存した。
Figure 0007146395000047
全ての中間親和性Ｔ細胞二重特異性抗体を産生することができた。収率は高くない。品質は９Ｃ７については良好で、１４Ｂ１及び６Ｅ１０については許容可能である。
実施例４９
ＨＴ－２９細胞上に発現されたヒトＦｏｌＲ１への１６Ｄ５ ＨＣ／ＬＣ変異体の結合
ＨＴ－２９細胞上において、ヒトＦｏｌＲ１に対する３６Ｆ２ ＴＣＢ、１６Ｄ５ ＴＣＢ及び１６Ｄ５の様々なＨＣ／ＬＣ変異体（図３４Ａ－Ｅ）の結合を評価した。簡潔には、細胞は、回収され、カウントされ、生存率をチェックされて、ＦＡＣＳバッファー（１００μｌ ＰＢＳ ０．１％ ＢＳＡ）中、１ｍｌあたり２ｘ１０６個の細胞で再懸濁された。１００μｌの細胞懸濁液（０．２ｘ１０６細胞を含む）を丸底９６ウェルプレート中、４℃で２２９分間、異なる濃度の二重特異性抗体（２２９ｐＭ～５００ｎＭ）と共にインキュベートした。冷ＰＢＳ ０．１％ＢＳＡで２回洗浄した後、試料を、ＰＥ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃｇ断片特異的二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ ＰＥ＃１０９－１１６－１７０）と共に４℃で更に３０分間再インキュベートした。冷ＰＢＳ ０．１％ＢＳＡで２回試料を洗浄した後、１％ＰＦＡで一晩固定した。その後、試料を遠心分離し、ＰＢＳ ０．１％ＢＳＡに再懸濁し、ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ（Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＦＡＣＳ Ｄｉｖａ）を用いてＦＡＣＳにより分析した。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ６を用いて結合曲線を得た（図３４Ａ－Ｅ）。
実施例５０
ヒト及びマウスＦｏｌＲ１及びＦｏｌＲ２に対する中間のＦｏｌＲ１結合剤の結合
ヒト及びマウスＦｏｌＲ１及びＦｏｌＲ２に対する中間のＦｏｌＲ１結合剤（６Ｅ１０ ＴＣＢ、１４Ｂ１ ＴＣＢ及び９Ｃ７ ＴＣＢ）ならびに１６Ｄ５ ＴＣＢ及び３６Ｆ２ ＴＣＢの交差反応性を、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞についてのＦＡＣＳ結合アッセイで評価した。
簡潔には、細胞は、回収され、カウントされ、生存率をチェックされて、ＦＡＣＳバッファー（１００μｌ ＰＢＳ ０．１％ ＢＳＡ）中、１ｍｌあたり２ｘ１０６個の細胞で再懸濁された。１００μｌの細胞懸濁液（０．２ｘ１０６細胞を含む）を丸底９６ウェルプレート中、４℃で２２９分間、１００ｎＭの二重特異性抗体と共にインキュベートした。冷ＰＢＳ ０．１％ＢＳＡで２回洗浄した後、試料を、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ断片特異的二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ ＰＥ＃１０９－０９６－０９８）と共に４℃で更に３０分間再インキュベートした。冷ＰＢＳ ０．１％ＢＳＡで２回試料を洗浄した後、１％ＰＦＡで一晩固定した。その後、試料を遠心分離し、ＰＢＳ ０．１％ＢＳＡに再懸濁し、ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ（Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＦＡＣＳ Ｄｉｖａ）を用いてＦＡＣＳにより分析した。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ６を用いてグラフを得た（図３５Ａ－Ｄ）。
結果は、３６Ｆ２ ＴＣＢ及び１４Ｂ１ ＴＣＢがマウスＦｏｌＲ１並びにヒト及びマウスＦｏｌＲ２に対して交差反応性であることを示す。６Ｅ１０ ＴＣＢについては、ヒトＦｏｌＲ２への弱い結合が観察され得る。１６Ｄ５ ＴＣＢ及び９Ｃ７ ＴＣＢは、ヒトＦｏｌＲ１に特異的であり、マウスＦｏｌＲ１又はヒト及びマウスＦｏｌＲ２に対する交差反応性を示さない。
実施例５１
Ｔ細胞二重特異性フォーマットの１６Ｄ５の親和性が減少した変異体及び更なる中間親和性結合剤の表面プラズモン共鳴による生化学的特徴付け
二価Ｔ細胞二重特異性フォーマットの抗ＦｏｌＲ１ １６Ｄ５の親和性が減少した変異体及び更なる中間親和性結合剤の組換えヒト、カニクイザル及びマウス葉酸受容体１（全てＦｃ融合体として）に対する結合を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって評価した。全てのＳＰＲ実験をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００において、ランニングバッファーとしてＨＢＳ－ＥＰ（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤 Ｐ２０、Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて２５℃で行った。親和性及びアビディティーの決定に用いた分子を表４５に記載する。
Figure 0007146395000048
単回注入
最初に、抗ＦｏｌＲ１ ＴＣＢを単回注入によって分析し（表４６）、（ヒト、マウス及びカニクイザルＦｏｌＲ１）に対するそれらの交差反応性及び（ヒトＦｏｌＲ１、ヒトＦｏｌＲ２、ヒトＦｏｌＲ３に対する）特異性を特徴付けた。ヒト、カニクイザル及びマウス葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１－Ｆｃ）又はヒト葉酸受容体２及び３（ＦｏｌＲ２－Ｆｃ、ＦｏｌＲ３－Ｆｃ）の組換えビオチン化単量体Ｆｃ融合体を、ＳＡチップ上に標準的なカップリング指示（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて直接カップリングさせた。固定レベルは約３００～４００ＲＵであった。ＴＣＢを５００ｎＭの濃度で６０秒間注入した。
Figure 0007146395000049
葉酸受容体１に対するアビディティー
抗ＦｏｌＲ１ Ｔ細胞二重特異性抗体と組換え葉酸受容体との間の相互作用のアビディティーを以下に記載するように決定した（表４７）。
ヒト、カニクイザル及びマウス葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）の組換えビオチン化単量体Ｆｃ融合体を、ＳＡチップ上に標準的なカップリング指示（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて直接カップリングさせた。固定レベルは約２００～３００ＲＵであった。抗ＦｏｌＲ１ Ｔ細胞二重特異性抗体を、１１．１から９００ｎＭ（１６Ｄ５の親和性が減少した変異体について）又は０．２から５００ｎＭ（更なる中間親和性結合剤及び３６Ｆ２について）の濃度範囲で３０μＬ／分のフローで１８０秒にわたってフローセルを介して通過させた。解離を２４０秒間又は６００秒間モニターした。チップ表面は、１０ｍＭのグリシン－ＨＣｌ（ｐＨ１．５）の３０秒間の二重注入を使用して、毎サイクル後に再生された。バルク屈折率の差異は、組換えビオチン化マウスＩＬ２Ｒ Ｆｃ融合体（無関係のＦｃ融合受容体）を固定化した基準フローセルで取得される応答を差し引くことにより修正された。Ｔ細胞二重特異性抗体の二価結合から生じる結合曲線は、１：１のラングミュア結合（１：２結合であるにもかかわらず）に近似され、そのモデルに適合させて、二価結合のアビディティーを表す見かけのＫＤを得た。相互作用の見かけの結合定数は、Ｂｉａ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたフィッティングの速度定数から導かれた。
Figure 0007146395000050
３．葉酸受容体１に対する親和性
抗ＦｏｌＲ１ Ｔ細胞二重特異性抗体と組換え葉酸受容体との間の相互作用の親和性を以下に記載するように決定した（表４８）。
親和性測定のために、抗ヒトＦａｂ特異的抗体（Ｆａｂ捕捉キット、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の約１２０００の共鳴単位（ＲＵ）の直接カップリングを、標準的アミンカップリングキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてｐＨ５．０のＣＭ５チップ上で実施した。抗ＦｏｌＲ１ Ｔ細胞二重特異性抗体を、４０秒間、１０μｌ／分の流速で２０ｎＭで捕捉し、参照フローセルは捕捉せずに放置した。ヒト、カニクイザル又はマウス葉酸受容体１ Ｆｃ融合体の希釈系列（１２．３～３０００ｎＭ）を全てのフローセル上で３０μｌ／分で２４０秒間通過させ、結合相を記録した。解離相を３００秒間モニターし、試料溶液からＨＢＳ－ＥＰへの切り替えによってトリガーした。チップ表面は、１０ｍＭのグリシン－ＨＣｌ（ｐＨ２．１）の６０秒間の二重注入を使用して、毎サイクル後に再生された。バルク屈折率の差異は、基準フローセルで取得される応答を差し引くことにより修正された。相互作用の親和性定数は、Ｂｉａ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたラングミュア結合に対するフィッティングによる速度定数から導かれた。１：１ Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルによって適合させるには速すぎる会合及び解離相を有する低親和性動態については、定常状態解析モデルをＢｉａ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて適用した。定常状態分析は、平衡状態での結合反応のＫＤを与える。
Figure 0007146395000051
１６Ｄ５結合剤に導入された変異は、表面プラスモン共鳴によって決定されるように、ヒト及びカニクイザルＦｏｌＲ１に対するその親和性を低下させる。減少した親和性による順位は、１６Ｄ５ ＷＴ（５７ｎＭ）＞Ｗ９６Ｙ（６．５倍低い）＞Ｇ４９Ｓ／Ｓ９３Ａ（１４．５倍低い）＞Ｗ９６Ｙ／Ｄ５２Ｅ（２４．５倍低い）＞Ｇ４９Ｓ／Ｋ５３Ａ（３０倍低い）である。同じ順位はアビディティー値において見えるが、しかし倍率の差は小さく、１６Ｄ５ ＷＴ（３ｎＭ）＞Ｗ９６Ｙ、Ｇ４９Ｓ／Ｓ９３Ａ、Ｗ９６Ｙ／Ｄ５２Ｅ（３倍低い）＞Ｇ４９Ｓ／Ｋ５３Ａ（１３倍低い）である。
中間親和性結合剤は親和性において以下の順位を有する；１６Ｄ５（５７ｎＭ）＞１４Ｂ１（８．５倍低い）＞９Ｃ７（１５倍低い）＞６Ｅ１０（２１倍低い）＞３６Ｆ２（２４．５倍低い）。しかし、これらの違いはアビディティー測定において消失し、１４Ｂ１、９Ｃ７、６Ｅ１０（１ｎＭ）＞１６Ｄ５（３ｎＭ）＞３６Ｆ２（７ｎＭ）である。
１６Ｄ５ Ｗ９６Ｙ／Ｄ５２Ｅ ＴＣＢは、以前の候補で見られた問題に対処する。１６Ｄ５ Ｗ９６Ｙ／Ｄ５２Ｅ ＴＣＢは、共通の軽鎖１６Ｄ５結合剤に基づいており、親の１６Ｄ５結合剤について重鎖上に２つの点変異を有する。Ｗ９６Ｙ変異は、親結合剤と比較して結合剤のＦｏｌＲ１への親和性を低下させ、Ｄ５２Ｅ変異は脱アミノ化部位を除去し、親和性の低下にも寄与する。１６Ｄ５ Ｗ９６Ｙ／Ｄ５２Ｅ ＴＣＢは、ヒト及びカニクイザルＦｏｌＲ１に結合するが、マウスＦｏｌＲ１には結合しない。これは、ＦｏｌＲ１に特異的であり、組換えヒトＦｏｌＲ２又はヒトＦｏｌＲ３には結合しない。１６Ｄ５ Ｗ９６Ｙ／Ｄ５２Ｅの親和性（一価結合）は、ヒトＦｏｌＲ１については約１．４μＭであり（親１６Ｄ５結合剤よりも２４．５倍低い）、アビディティー（二価結合）は約１０ｎＭ（親１６Ｄ５結合剤よりも３倍低い）である。
実施例５２
中間のＦｏｌＲ１ ＴＣＢによって誘導されたＨｅｌａ、ＳＫｏｖ－３及びＨＴ－２９細胞のＴ細胞死滅
Ｈｅｌａ（高ＦｏｌＲ１）、ＳＫｏｖ－３（中間のＦｏｌＲ１）及びＨＴ－２９（低ＦｏｌＲ１）細胞において、中間のＦｏｌＲ１結合剤（６Ｅ１０ ＴＣＢ、１４Ｂ１ ＴＣＢ及び９Ｃ７ ＴＣＢ）によって媒介されるＴ細胞死滅を評価した。１６Ｄ５ ＴＣＢ及び３６Ｆ２ ＴＣＢがベンチマークとして含まれた。ヒトＰＢＭＣをエフェクターとして使用し、二重特異性抗体とのインキュベーションの２４時間及び４８時間にて死滅を検出した。簡潔には、標的細胞をトリプシン／ＥＤＴＡで回収し、洗浄し、平底９６ウェルプレートを用いて２５０００細胞／ウェルの密度でプレーティングした。細胞を一晩接着させた。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、健康なヒトドナーから得られた濃縮リンパ球調製物（バフィーコート）のヒストパーク密度遠心分離によって調製した。新鮮な血液を滅菌ＰＢＳで希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ勾配（Ｓｉｇｍａ、＃Ｈ８８８９）上に重層した。遠心分離（４５０×ｇ、３０分間、室温）後、ＰＢＭＣ含有界面相の上の血漿を廃棄し、ＰＢＭＣを新しいファルコンチューブに移し、その後５０ｍｌのＰＢＳで満たした。混合物を遠心分離し（４００×ｇ、１０分間、室温）、上清を廃棄し、ＰＢＭＣペレットを滅菌ＰＢＳで２回洗浄した（遠心分離工程は３５０×ｇ、１０分間）。得られたＰＢＭＣの集団を自動的に計数し（ＶｉＣｅｌｌ）、細胞インキュベーター中で３７℃、５％ＣＯ２で、１０％ＦＣＳ及び１％のＬ－アラニル－Ｌ－グルタミン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、Ｋ０３０２）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で更に使用するまで保存した（２４時間以内）。死滅アッセイのために、抗体を指示された濃度で添加した（０．０１ｐＭ～１０ｎＭの範囲で３通り）。ＰＢＭＣを最終Ｅ：Ｔ比１０：１で標的細胞に添加した。３７℃、５％ＣＯ２で２４時間及び４８時間のインキュベーション後、アポトーシス／壊死細胞により細胞上清中に放出されたＬＤＨの定量によって（ＬＤＨ検出キット、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、＃１１ ６４４ ７９３ ００１）、標的細胞死滅を評価した。標的細胞の最大溶解（＝１００％）は、標的細胞の１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００とのインキュベーションによって達成された。最小溶解（＝０％）は、二重特異性コンストラクトを含まずにエフェクター細胞と共インキュベートした標的細胞を指す。
結果は、中間のＦｏｌＲ１結合剤（６Ｅ１０ ＴＣＢ、１４Ｂ１ ＴＣＢ及び９Ｃ７ ＴＣＢ）によって誘導された腫瘍溶解が、高親和性１６Ｄ５ ＴＣＢ及び低親和性３６Ｆ２ ＴＣＢについて得られたものの範囲であることを示す（図３６Ａ－Ｆ）。中間のＦｏｌＲ１結合剤の中で、１４Ｂ１ ＴＣＢは、４８時間のインキュベーション後に見られるように最強の死滅を示す（図３６Ｄ－Ｆ）。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ６を用いて計算された２４時間及び４８時間後の死滅アッセイに関するＥＣ５０値を表４９及び表５０に示す。
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実施例５３
親和性が減少した１６Ｄ５変異体によって誘導されたＨｅｌａ、ＳＫｏｖ－３及びＨＴ－２９細胞のＴ細胞死滅
Ｈｅｌａ（高ＦｏｌＲ１）、ＳＫｏｖ－３（中間のＦｏｌＲ１）及びＨＴ－２９（低ＦｏｌＲ１）細胞において、親和性が減少した１６Ｄ５変異体（１６Ｄ５－Ｇ４９Ｓ／Ｓ９３Ａ ＴＣＢ、１６Ｄ５－Ｇ４９Ｓ／Ｋ５３Ａ ＴＣＢ、１６Ｄ５ Ｗ９６Ｙ ＴＣＢ、１６Ｄ５ Ｗ９６Ｙ／Ｄ５２Ｅ ＴＣＢ）によって媒介されるＴ細胞死滅を評価した。１６Ｄ５ ＴＣＢ及び３６Ｆ２ ＴＣＢがベンチマークとして含まれた。アッセイを上述されるように行った（実施例５２）。
結果は、親和性が減少した１６Ｄ５変異体（１６Ｄ５－Ｇ４９Ｓ／Ｓ９３Ａ ＴＣＢ、１６Ｄ５－Ｇ４９Ｓ／Ｋ５３Ａ ＴＣＢ、１６Ｄ５ Ｗ９６Ｙ ＴＣＢ、１６Ｄ５ Ｗ９６Ｙ／Ｄ５２Ｅ ＴＣＢ）によって誘導された腫瘍溶解は高親和性１６Ｄ５ ＴＣＢ及び低親和性３６Ｆ２について得られたものの範囲であることを示す。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ６を用いて計算された２４時間及び４８時間後の死滅アッセイに関するＥＣ５０値を表５１及び表５２に示す（図３７Ａ－Ｆ）。
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従って、上述の３６Ｆ２ ＦＯＬＲ１ ＴＣＢと同様に、１６Ｄ５ Ｗ９６Ｙ／Ｄ５２Ｅ ＴＣＢは、高発現細胞と低発現細胞とを区別し、このことは一部の正常で非腫瘍性の組織の細胞が非常に低いレベルのＦｏｌＲ１（約１０００コピー未満／細胞）を発現するので、毒性を低減するために特に重要である。この観察と一致して、以下の実施例５４で議論された結果は、１６Ｄ５ Ｗ９６Ｙ／Ｄ５２Ｅ ＴＣＢが、親１６Ｄ５ ＴＣＢと比較して、はるかに低いレベルの初代細胞のＴ細胞媒介性死滅を誘導することを示す（図３８Ａ～Ｆ）。このように、１６Ｄ５ Ｗ９６Ｙ／Ｄ５２Ｅ ＴＣＢは、高又は中間のＦＯＬＲ１発現を伴う腫瘍組織の強力な死滅を媒介するが、低発現を伴う正常組織の死滅を媒介しない。二価２＋１フォーマットの１６Ｄ５ Ｗ９６Ｙ／Ｄ５２Ｅ ＴＣＢは、比較的低い親和性のＦｏｌＲ１結合部分を含むが、それは高度ＦｏｌＲ１発現細胞と低ＦｏｌＲ１発現細胞との間の区別を可能にするアビディティー効果を有する。腫瘍細胞は、高レベル又は中レベルでＦｏｌＲ１を発現するので、このＴＣＢは、低レベルでＦｏｌＲ１を発現するか又は全く発現しない正常な非癌性細胞ではなく、腫瘍細胞に選択的に結合する。上記の３６Ｆ２ ＦＯＬＲ１ ＴＣＢに対する更なる利点として、１６Ｄ５ Ｗ９６Ｙ／Ｄ５２Ｅ ＴＣＢは、ＦｏｌＲ１に特異的に結合し、ＦｏｌＲ２又はＦｏｌＲ３には結合せず、インビボにおける処置のその安全性を更に高めている。
上記の有利な特性に加えて、二価の２＋１反転型フォーマットの１６Ｄ５ Ｗ９６Ｙ／Ｄ５２Ｅ ＴＣＢは、化学的架橋又は他のハイブリッド法を必要としないという利点も有する。これは、患者、例えば、ＦｏｌＲ１陽性がん性腫瘍を有する患者を治療するための薬剤の製造に適している。二価の２＋１反転型フォーマットの１６Ｄ５ Ｗ９６Ｙ／Ｄ５２Ｅ ＴＣＢは、凝集体が少ない標準的なＣＨＯプロセスを使用して製造することができる。更に、二価２＋１の１６Ｄ５ Ｗ９６Ｙ／Ｄ５２Ｅ ＴＣＢは、ヒト及びヒト化配列を含み、ヒトに投与した場合に高度に免疫原性であるラット及びマウスポリペプチドを用いる分子よりも優れている。更に、二価２＋１フォーマットの１６Ｄ５ Ｗ９６Ｙ／Ｄ５２Ｅ ＴＣＢは、ＦｃｇＲ結合を破壊するように設計されており、ＦｃｇＲ架橋及び注入反応を引き起こさず、患者に投与したときにその安全性を更に高める。
上記の結果により実証されるように、その頭尾の幾何学的形状は、二価の２＋１反転型フォーマットの１６Ｄ５ Ｗ９６Ｙ／Ｄ５２Ｅ ＴＣＢを、絶対標的細胞死滅を誘導する非常に強力な分子とする。その二価性はアビディティー及び効力を増強するが、高度発現細胞と低発現細胞との間の区別も可能にする。そのアビディティー効果に起因する高度又は中間の標的発現細胞に対するその優先度は、低レベルでＦｏｌＲ１を発現する正常細胞のＴ細胞媒介性死滅に起因する毒性を低下させる。
二価２＋１フォーマットの及び本明細書に開示される他の実施態様における１６Ｄ５ Ｗ９６Ｙ／Ｄ５２Ｅ ＴＣＢの更なる利点は、それらがヒト及びカニクイザルＦｏｌＲ１に結合するので、それらの臨床開発ではサロゲート分子の使用を必要としないことである。このように、本明細書に開示される分子は、両方の種由来のＦｏｌＲ１を認識しない、先に記載したＦｏｌＲ１に対する抗体とは異なるエピトープを認識する（図４１も参照）。
実施例５４
親和性が減少した１６Ｄ５変異体及び中間のＦｏｌＲ１ ＴＣＢによって誘導された初代細胞のＴ細胞死滅
親和性が減少した１６Ｄ５変異体（１６Ｄ５－Ｇ４９Ｓ／Ｓ９３Ａ ＴＣＢ、１６Ｄ５ Ｗ９６Ｙ／Ｄ５２Ｅ ＴＣＢ）及び中間のＦｏｌＲ１結合剤１４Ｂ１ ＴＣＢによって媒介されるＴ細胞死滅を、初代細胞（ヒト腎皮質上皮細胞（ＨＲＣＥｐｉＣ）（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；カタログ番号４１１０）及びヒト網膜色素上皮細胞（ＨＲＰＥｐｉＣ）（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；カタログ番号６５４０））で評価した。ＨＴ－２９細胞（低ＦｏｌＲ１）を対照細胞株として含めた。１６Ｄ５ ＴＣＢ及び３６Ｆ２ ＴＣＢをベンチマークとして含め、ＤＰ４７ ＴＣＢを非結合性対照として用いた。
アッセイは、０．１ｐＭ～１００ｎＭの抗体の濃度範囲（３通り）を用いて、実施例５２に記載のように行った。
ヒト初代細胞が標的として使用される場合、全細胞溶解は、これらの細胞上のＦｏｌＲ１の発現率が低いためにはるかに低い（図３８Ａ～Ｆ）。高親和性ＦｏｌＲ１結合剤１６Ｄ５ ＴＣＢの場合、Ｔ細胞媒介性溶解が、使用された初代細胞型の両方で観察され得る。以前に観察されたように、腫瘍細胞株を標的として使用した場合、中間のＦｏｌＲ１結合剤１４Ｂ１ ＴＣＢ及び親和性が減少した１６Ｄ５変異体（１６Ｄ５－Ｇ４９Ｓ／Ｓ９３Ａ ＴＣＢ、１６Ｄ５ Ｗ９６Ｙ／Ｄ５２Ｅ ＴＣＢ）によって誘導された溶解は、高親和性１６Ｄ５ ＴＣＢ及び低親和性３６Ｆ２ ＴＣＢについて得られたものの範囲である。低レベルでＦｏｌＲ１を発現する細胞の溶解の有意な減少は、低いオフターゲット活性と一致し、親和性が減少した１６Ｄ５変異体１６Ｄ５－Ｇ４９Ｓ／Ｓ９３Ａ ＴＣＢ及び１６Ｄ５ Ｗ９６Ｙ／Ｄ５２Ｅ ＴＣＢはインビボにおいて良好な耐容性が期待される。
実施例５５
メスＮＯＧマウスにおけるＦＯＬＲ１ ＴＣＢコンストラクトの単一用量ＰＫ
実験の開始時に平均８～１０週齢のメスＮＯＤ／Ｓｈｉ－ｓｃｉｄ／ＩＬ－２Ｒγｎｕｌｌ（ＮＯＧ）マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ、ＳＯＰＦ施設から購入）を、（ＧＶ－Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従って１２時間明所／１２時間暗所の日周期で特定の病原体のいない条件下で保持した。実験的研究プロトコールは、地方自治体によってレビューされ承認された（ＺＨ１９３／２０１４）。動物は到着後１週間、新しい環境への馴致及び観察のために保持された。継続的な健康モニタリングが定期的に実施された。
ＦＯＬＲ１ ＴＣＢコンストラクト（３６Ｆ２、１６Ｄ５、１６Ｄ５ Ｇ４９Ｓ／Ｓ９３Ａ及び１６Ｄ５ Ｗ９６Ｙ／Ｄ５２Ｅ）の曝露を評価するために、単一用量薬物動態研究（ＳＤＰＫ）を実施した。０．５ｍｇ／ｋｇのｉ．ｖ．ボーラス投与をＮＯＧマウスに投与し、薬物動態評価のために選択した時点で血液試料を採取した。マウス血清試料をＥＬＩＳＡによって分析した。ビオチン化ａ－ｈｕＣＤ３－ＣＤＲ（ｍＡｂ＜ＩＤ－ｍＡｂ＜ＣＤ３＞＞Ｍ－４．２５．９３－ＩｇＧ－Ｂｉ）、試験試料、ジゴキシゲニン標識ａ－ｈｕＦｃ抗体（ｍＡｂ＜Ｈ－ＦＣ ｐａｎ＞Ｍ－Ｒ１０Ｚ８Ｅ９－ＩｇＧ－Ｄｉｇ）及び抗ジゴキシゲニン検出抗体（ＰＯＤ）を９６ウェルストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレートに段階的に添加し、室温で１時間各工程の後にインキュベートした。プレートを各工程の後に３回洗浄して未結合物質を除去する。最後に、ペルオキシダーゼ結合複合体を、ＡＢＴＳ基質溶液を添加することによって可視化し、着色反応生成物を形成させる。４０５ｎｍ（４９０ｎｍでの基準波長による）で測光法で決定される反応生成物の強度は、血清試料中の検体濃度に比例する。コンストラクトの標準曲線の較正範囲は０．０７８～５ｎｇ／ｍｌであった（ここでは１．５ｎｇ／ｍｌが定量の下限値（ＬＬＯＱ）である）。
ＳＤＰＫ研究は、１６Ｄ５、１６Ｄ５ Ｗ９６Ｙ／Ｄ５２Ｅ及び１６Ｄ５ Ｇ４９Ｓ／Ｓ９３ＡコンストラクトについてＩｇＧ様ＰＫプロファイルを明らかにした（図３９Ａ－Ｂ）。そのために、有効性研究のために１週間に１回のスケジュールを選択した（図４０Ｂ）。３６Ｆ２の半減期は、他のクローンと比較して低い。３６Ｆ２は、マウスＦＯＬＲ１に対して交差反応性である試験された４つの分子のうち、この分子のより低い半減期を説明する可能性があり、ＴＭＤＤ（Ｔａｒｇｅｔ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）を示す、唯一のものである。
実施例５６
Ｈｅｌａを有するＮＯＧマウスにおけるヒトＰＢＭＣ移入後のＦＯＬＲ１ ＴＣＢコンストラクト（１６Ｄ５、１６Ｄ５ Ｇ４９Ｓ／Ｓ９３Ａ及び１６Ｄ５ Ｗ９６Ｙ／Ｄ５２Ｅ）のインビボ有効性。
ＦＯＬＲ１ ＴＣＢコンストラクトを、ＰＢＭＣ移植ＮＯＧマウスに皮下注射したＦＯＬＲ１発現ヒト子宮頸がん細胞株Ｈｅｌａで試験した。
Ｈｅｌａ細胞は、もともとはＡＴＣＣ（ＣＣＬ２）から得られ、増殖後にＲｏｃｈｅ－Ｇｌｙｃａｒｔ内部細胞バンクに寄託された。該腫瘍細胞株は、５％ＣＯ２の水飽和雰囲気下３７℃で、１０％のＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）を含有するＲＰＭＩ中で常套的に培養された。生存率＞９５％において、継代１３を移植に使用した。１動物当たり１×１０６個の細胞を総量１００μｌのＲＰＭＩ細胞培養培地（Ｇｉｂｃｏ）で動物の右側腹部に皮下注射した。
実験の開始時に８～１０週齢の６０匹のメスＮＯＧマウス（デンマークのＴａｃｏｎｉｃで飼育）を、（ＧＶ－Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従って１２時間明所／１２時間暗所の日周期で特定の病原体のいない条件下で保持した。実験的研究プロトコールは、地方自治体によってレビューされ承認された（ＺＨ１９３／２０１４）。動物は到着後１週間、新しい環境への馴致及び観察のために保持された。継続的な健康管理が定期的に実施された。
研究プロトコル（図４０Ｂ）に従って、マウスに１×１０６個のＨｅｌａ細胞を研究０日目に皮下注射した。研究３０日目、腫瘍が約１５０ｍｍ３の大きさに達したとき、健康なドナーのヒトＰＢＭＣをＦｉｃｏｌｌ法により単離し、１０ｘ１０６６個の細胞を腫瘍を有するマウスに静脈内注射した。２日後（３２日目）、マウスを無作為化し、６つの処置群（ｎ＝１０）に等しく分配させ、続いて１６Ｄ５（０．５ｍｇ／ｋｇ）、１６Ｄ５ Ｇ４９Ｓ／Ｓ９３Ａ（２．５又は０．５ｍｇ／ｋｇ）及び１６Ｄ５ Ｗ９６Ｙ／Ｄ５２Ｅ（２．５又は０．５ｍｇ／ｋｇ）の何れかを静脈内注射した。全ての処置群に毎週１回、計３週間注射した。マウスに２００μｌの適切な溶液を静脈注射した。ビヒクル群のマウスにＰＢＳを注射した。２００μｌあたりのＴＣＢの適正量を得るために、ストック溶液を必要に応じてＰＢＳで希釈した。腫瘍増殖を、キャリパーを用いて週１回測定し（図４０Ｃ－Ｅ）、腫瘍体積を以下のように計算した：
Ｔｖ：（Ｗ２／２）ｘＬ （Ｗ：幅、Ｌ：長さ）
ＦＯＬＲ１ ＴＣＢコンストラクトの１週間に１回の注射は、有意な腫瘍縮小をもたらした（図４０Ｃ～Ｅ）。１６Ｄ５（０．５ｍｇ／ｋｇ）及び１６Ｄ５ Ｗ９６Ｙ／Ｄ５２Ｅ１６Ｄ５（０．５ｍｇ／ｋｇ）の有効性は同等であったが、１６Ｄ５ Ｇ４９Ｓ／Ｓ９３Ａ（０．５ｍｇ／ｋｇ）はわずかに少ない効力を示した。２．５ｍｇ／ｋｇの高用量の１６Ｄ５ Ｗ９６Ｙ／Ｄ５２Ｅ１６Ｄ５及び１６Ｄ５ Ｇ４９Ｓ／Ｓ９３Ａは、０．５ｍｇ／ｋｇの用量と比較して有効性の増加を示さなかった。ＰＤ読み出しのためにマウスを研究５２日目に屠殺し、腫瘍を除去し、その後のＦＡＣＳ分析のために、単細胞懸濁液をＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅ Ｖ、Ｄｉｓｐａｓｅ ＩＩ及びＤＮＡｓｅによる酵素消化により調製した。ビヒクル対照腫瘍と比較して、全ての処置群の外植された腫瘍は試験終了時に有意に低い腫瘍重量を示した（図４０Ｆ）。腫瘍由来の単細胞懸濁液をｈｕＣＤ４５及びｈｕＣＤ３について染色し、ＤＡＰＩで死細胞を排除し、ＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａで分析した。ＦＡＣＳ分析は、ビヒクル対照腫瘍と比較して、１６Ｄ５並びに１６Ｄ５ Ｗ９６Ｙ／Ｄ５２Ｅ１６Ｄ５での処置の際に、腫瘍組織における浸潤ＣＤ３陽性ヒトＴ細胞の統計的に高い数字を明らかにした（図４０Ｃ）。
実施例５７
カニクイザルにおける毒性試験
カニクイザルにおいて、親和性が減少した１６Ｄ５変異体ＴＣＢ（例えば、１６Ｄ５－Ｇ４９Ｓ／Ｓ９３Ａ ＴＣＢ、１６Ｄ５ Ｗ９６Ｙ／Ｄ５２Ｅ ＴＣＢ）の単回静脈内投与の耐容性、薬物動態学的（ＰＫ）及び薬力学的（ＰＤ）効果を調べるために、ＰＫ、ＰＤ及び耐容性試験を実施する。この研究では、ナイーブなカニクイザル（１匹のオス及び１匹のメスのサル／群）は、用量漸増プロトコルに従って、１６Ｄ５ Ｗ９６Ｙ／Ｄ５２Ｅ ＴＣＢを含む、親和性が減少した１６Ｄ５変異体ＴＣＢの単回静脈内投与を受ける。例示的な用量レベルには、０．００３、０．０３、及び０．０９ｍｇ／ｋｇが含まれる。標準的な毒性パラメータ（臨床徴候、体重、血液学＆臨床化学）及び血液中のＴ細胞数及び活性化状態の動力学及びサイトカイン放出の動力学を評価する。また、１６Ｄ５ Ｗ９６Ｙ／Ｄ５２Ｅ ＴＣＢを含む親和性が減少した１６Ｄ５変異体ＴＣＢ及び抗薬物抗体の測定のために、２８日間の期間、ＰＫのために採取する。
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前述の発明は理解を明確にするために例示及び実施例によってある程度詳細に説明されているが、説明及び実施例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に引用される全ての特許及び科学文献の開示内容は、その全体が出典明示により援用される。

Claims (26)

  1. （ｉ）ＣＤ３に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第１の抗原結合部分であって、配列番号３７の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号３８の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３９の重鎖ＣＤＲ３と、配列番号３２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３３の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３４の軽鎖ＣＤＲ３とを含む第１の抗原結合部分；
    （ｉｉ）葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的に結合することができる第２の抗原結合部分
    を含み、
    ＦｏｌＲ１に特異的に結合することができる抗原結合部分が、
    ａ）配列番号１６の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１７の重鎖ＣＤＲ２、配列番号１８の重鎖ＣＤＲ３、配列番号３２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３３の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３４の軽鎖ＣＤＲ３、
    ｂ）配列番号８の重鎖ＣＤＲ１、配列番号５６の重鎖ＣＤＲ２、配列番号５７の重鎖ＣＤＲ３、配列番号５９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６５の軽鎖ＣＤＲ３、又は
    ｃ）配列番号１６の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２７５の重鎖ＣＤＲ２、配列番号３１５の重鎖ＣＤＲ３、配列番号３２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３３の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３４の軽鎖ＣＤＲ３
    を含む、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
  2. 第１の抗原結合部分が、配列番号３６のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、請求項１に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
  3. （ｉｉｉ）ＦｏｌＲ１に特異的に結合することができる第３の抗原結合部分
    を更に含む、請求項１又は２に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
  4. 第３の抗原結合部分が第２の抗原結合部分と同一である、請求項３に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
  5. 第２及び第３の抗原結合部分の少なくとも一つがＦａｂ分子である、請求項３又は４に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
  6. （ｉｖ）安定した会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
    を更に含む、請求項１から５の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
  7. 葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的に結合することができる抗原結合部分が、配列番号１５のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、請求項１から６の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
  8. 葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的に結合することができる抗原結合部分が、配列番号５５のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号６４のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、請求項１から６の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
  9. ＦｏｌＲ１に特異的に結合することができる抗原結合部分が、配列番号２７４のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、請求項１から６の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
  10. 第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変領域又は定常領域の何れかが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子である、請求項８に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
  11. ＦｃドメインがＩｇＧクラスの免疫グロブリン、特にＩｇＧ１又はＩｇＧ４のＦｃドメインである、請求項６から１０の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
  12. ＦｃドメインがヒトＦｃドメインである、請求項６から１１の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
  13. Ｆｃドメインが、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む、請求項６から１２の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
  14. Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基がそれよりも大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それにより、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の空洞内に配置可能な隆起が生成され、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基がそれよりも小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それにより、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の隆起を配置可能な空洞が生成される、請求項１３に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
  15. Ｆｃドメインが天然型ＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる少なくとも一つのアミノ酸置換を含む、請求項６から１４の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
  16. Ｆｃドメインの各サブユニットが、活性化Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる３つのアミノ酸置換を含み、該アミノ酸置換がＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ番号付け）である、請求項１５に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
  17. 配列番号２７６のアミノ酸配列、配列番号２７７のアミノ酸、及び配列番号３５のアミノ酸配列を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
  18. 請求項１から１７の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又はその抗原結合断片をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
  19. 請求項１８に記載のポリヌクレオチドを含むベクター、特に発現ベクター。
  20. 請求項１８に記載のポリヌクレオチド又は請求項１９に記載のベクターを含む宿主細胞。
  21. ａ）請求項２０の宿主細胞を、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の発現に適した条件下で培養する工程と、ｂ）Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を回収する工程とを含む、ＣＤ３及び標的細胞抗原に特異的に結合することができるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を産生する方法。
  22. 請求項１から１７の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子と、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
  23. 医薬としての使用のための、請求項１から１７の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又は請求項２２に記載の薬学的組成物。
  24. 必要とする個体における疾患の治療のための、請求項１から１７の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又は請求項２２に記載の薬学的組成物。
  25. 疾患ががんである、請求項２４に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又は薬学的組成物。
  26. 必要とする個体における疾患の治療のための医薬の製造のための、請求項１から１７の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の使用。
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