KR20150064068A - 2개의 Fab 단편을 포함하는 FC-부재 항체 및 이용 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 2 개 이상의 Fab 단편을 포함하는 이중특이적 항체로서, 제 1 Fab 단편은 제 1 항원에 대해 특이적인 1 개 이상의 항원 결합 부위를 포함하고; 제 2 Fab 단편은 제 2 항원에 대해 특이적인 1 개 이상의 항원 결합 부위를 포함하고, 여기서, 제 2 Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역은 교환되어 있고, 상기 2 개의 Fab 단편은 2 개의 펩타이드 링커에 의해 서로 연결되어 있고; 상기 이중특이적 항체는 Fc 도메인이 결여되어 있는 것인 이중특이적 항체; 이들의 제조 방법, 상기 항체를 함유하는 약제학적 조성물, 및 이들의 용도에 관한 것이다.

Description

2개의 Fab 단편을 포함하는 FC-부재 항체 및 이용 방법 {FC-FREE ANTIBODIES COMPRISING TWO Fab-FRAGMENTS AND METHODS OF USE}
본 발명은 2 개 이상의 Fab 단편을 포함하는 이중특이적 항체로서, 제 1 Fab 단편은 제 1 항원에 대해 특이적인 1 개 이상의 항원 결합 부위를 포함하고; 제 2 Fab 단편은 제 2 항원에 대해 특이적인 1 개 이상의 항원 결합 부위를 포함하고, 여기서, 제 2 Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역은 교환되어 있고, 상기 2 개의 Fab 단편은 2 개의 펩타이드 링커에 의해 서로 연결되어 있고; 상기 이중특이적 항체는 Fc 도메인이 결여되어 있는 것인 이중특이적 항체; 이의 제조 방법, 상기 항체를 함유하는 약제학적 조성물, 및 이들의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 제 1 Fab 단편 및 제 2 Fab 단편을 포함하는, T-세포 활성화 항원 및 종양 항원 (Tumor Antigen: TA) 에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체로서, 여기서, 제 2 Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역은 교환되어 있고, 상기 2 개의 Fab 단편은 2 개의 펩타이드 링커에 의해 서로 연결되어 있고; 상기 이중특이적 항체는 Fc 도메인을 포함하지 않는 것인 이중특이적 항체; 이의 제조 방법, 상기 항체를 함유하는 약제학적 조성물, 및 이들의 용도에 관한 것이다.
단일클론 항체 (mAb) 는 점점 더 중요한 부류의 치료제이다. 실치수 형태의 IgG 로 이루어진 mAb 제품을 제외하고, 광범위한 다중특이적 재조합 항체 형식, 예를 들면, IgG 항체 형식과 단일 쇄 도메인의 융합에 의한 4가 이중특이적 항체가 개발되었다 (예를 들면, 문헌 [Coloma, M.J., et al., Nature Biotech 15 (1997) 159-163]; 국제 공개 공보 WO　2001/077342; 및 문헌 [Morrison, S.L., Nature Biotech 25 (2007) 1233-1234] 참조).
항체 코어 구조 (IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM) 를 더 이상 보유하지 않은 몇몇의 다른 새로운 형식, 예를 들면, 2 개 이상의 항원에 결합할 수 있는 디아바디 (diabody), 트리아바디 (triabody), 테트라바디 (tetrabody), 미니바디 (minibody), 몇몇의 단일 쇄 형식 (scFv, Bis-scFv) 가 개발되었다 [Holliger, P., et al, Nature Biotech 23 (2005) 1126-1136; Fischer, N., and Leger, O., Pathobiology 74 (2007) 3-14; Shen, J., et al., Journal of Immunological Methods 318 (2007) 65-74; Wu, C., et al., Nature Biotech. 25 (2007) 1290-1297].
모든 이러한 형식은 항체 코어 (IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM) 를 추가의 결합 단백질 (예를 들면, scFv) 에 융합시키거나, 예를 들면, 2 개의 Fab 단편 또는 scFv 에 융합시키기 위해 링커를 사용한다 [Fischer, N., Leger, O., Pathobiology 74 (2007) 3-14]. 일렬 (tandem) scFV 는 여분의 펩타이드 링커에 의해 연결된 2 개의 scFv 단편이며, 또한 (scFv)2 로서도 지칭된다. 가변 도메인들 사이의 펩타이드 링커의 길이를 감소시킴으로써, 디아바디를 생성한다. 2 개의 폴리펩타이드 사이에 여분의 펩타이드 링커를 부가함으로써, 소위 단일 쇄 디아바디를 수득한다. US　2007/0274985 는 단일 쇄 Fab (scFab) 단편을 포함하는 항체에 관한 것이다. 항체 단편은 실치수 단일클론 항체와 비교하여 치료제로서 장단점을 가진다: 하나의 장점은 이들이 보다 작아서 조직 및 종양에 보다 신속하게 침투한다는 것이다. 또한, 소형 크기의 단편은 실치수 단일클론 항체에 접근할 수 없는 에피토프와의 결합을 허용하는 것으로 제시되었다. 단점으로, 단편은 아마도 신장 청소로 인해, 인간에서 짧은 순환 반감기를 나타낸다. 보다 짧은 반감기는 표적 부위에서 충분한 치료의 누적을 방지할 수 있다. 항체 단편의 제조는 평범하지 않은데, 이는 단편들이 응집물을 형성하기 쉽고 실치수 단일클론 항체보다 덜 안정적일 수 있기 때문이다. 또한, 동족이 아닌 중쇄 및 경쇄의 원하지 않는 짝짓기로 인해, 불활성 항원-결합 부위 및/또는 다른 비-작용성의 바람직하지 않은 부생성물이 형성되는데, 이것은 항체 단편의 임상적 규모의 제조 및 치료적 적용에 있어서 주요한 문제이다. 특히, 2 개 이상의 Fab 가 하나의 연결기를 통해 서로 융합되어 있는 일렬-Fab 작제물은 2개의 경쇄의 무작위 결합으로 인해 실현가능하지 않으므로, 바람직하지 않은 불활성 부생성물이 초래된다. 이러한 단점들은 본 발명의 새로운 항체 형식에 의해 이제 극복되었다. 여기서, 잘못 짝지어진 부생성물의 양의 감소로 인해 증가된 수율로 용이하게 제조될 수 있고 당업계에 공지된 이중특이적 항체 단편보다 덜한 응집을 나타내는 새로운 이중특이적 항체 형식이 제공된다. 교차 접근법을 이용하여, 공통 경쇄를 제조할 필요 없이 정확한 LC 연합을 실시할 수 있다. 공통 경쇄 접근법은 기존 항체에 대해서는 가능하지 않다. 또한, 새로운 이중특이적 항체 형식은 안정하고, 기존 이중특이적 형식 보다 더 높은 온도에서 응집하지 않는데, 이것은 보다 양호한 생산 가능성 및 개발 가능성을 허용한다. 또한, 새로운 이중특이적 항체 형식은 다수의 통상의 이중특이적 항체 단편 보다 더 높은 분자량을 가지고, 따라서 과도한 신장 청소를 방지하고 개선된 생체내 반감기를 유도한다. 새로운 이중특이적 항체 형식은 완전히 작용성이고, 상응하는 통상의 이중특이적 항체에 필적할만하거나 개선된 결합 및 활성을 가진다.
개별 세포 또는 특정 세포 유형의 선택적 파괴는 종종 다양한 임상 환경에서 바람직하다. 예를 들면, 건강한 세포 및 조직을 손상되지 않은 상태로 두면서 종양 세포를 특이적으로 파괴하는 것은 암 치료의 주요 목표이다. 하나의 접근법은 종양에 대해 면역 반응을 선택적으로 유도하는 것인데, 이것은 자연 살해 (natural killer: NK) 세포 또는 세포독성 T 림프구 (cytotoxic T-lymphocyte: CTL) 와 같은 면역 효과기 세포에 의해 종양 세포의 공격 및 후속적인 파괴를 촉발한다. CTL은 면역 시스템의 가장 강력한 효과기 세포를 구성하지만, 이들은 통상의 치료 항체의 Fc 도메인에 의해 매개된 효과기 기작에 의해 활성화될 수 없다. 이와 관련하여, 암 세포 상의 표면 항원 및 T 세포 수용체 (T cell receptor: TCR) 복합체의 활성화 불변 구성성분에 결합할 수 있는 이중특이적 항체가 최근에 관심대상이 되었다. 2개의 표적에 대한 이중특이적 항체의 동시 결합은 암 세포와 T 세포 사이의 일시적 상호작용을 강화하여, 세포독성 T 세포의 활성화 및 종양 세포의 후속적인 용균을 초래한다.
몇몇의 이중특이적 항체 형식이 개발되었으며, T 세포 매개된 암 면역요법에 대한 이들의 적합성이 조사되었다. 이들 중에서, 소위 BiTE (bispecific T cell engager: 이중특이적 T 세포 관여항체) 분자는 매우 잘 특성화되었으며, 병원에서 일부 유망한 결과를 이미 나타냈다 (문헌 [Nagorsen and Bauerle, Exp Cell Res 317, 1255-1260 (2011)] 에서 검토되었음). BiTE 는 2개의 scFv 분자가 유연한 링커에 의해 융합되어 있는 일렬 scFv 분자이다. T 세포 관여에 대해 평가되고 있는 추가의 이중특이적 형식은 디아바디 [Holliger et al., Prot Eng 9, 299-305 (1996)] 및 이의 유도체, 예를 들면, 일렬 디아바디 [Kipriyanov et al., J Mol Biol 293, 41-66 (1999)] 를 포함한다. 보다 최근에 개발된 것은 디아바디 형식을 기본으로 하지만 추가의 안정화를 위한 C-말단 이화화 브릿지를 특징으로 하는 소위 DART (dual affinity retargeting: 이중 친화도 재표적화) 분자이다 [Moore et al., Blood 117, 4542-51 (2011)]. 전체 하이브리드 마우스/래트 IgG 분자이고 또한 현재 임상 시험에서 평가되고 있는 소위 트리오맙 (triomab) 은 보다 큰 크기의 형식을 나타낸다 (문헌 [Seimetz et al., Cancer Treat Rev 36, 458-467 (2010)] 에서 검토되었음).
그러나, 지금까지 공지된 T 세포 매개된 암 면역요법을 위해 개발된 이중특이적 항체는 이의 효능, 독성 및 적용성과 관련하여 주요한 단점을 가지고 있다. 예를 들면, BiTE 분자와 같은 소형 작제물은 - 효과기 및 표적 세포를 충분히 교차결합시킬 수 있지만 - 연속 주입으로 환자에게 투여되도록 요구되는 매우 짧은 혈청 반감기를 가진다. 다른 한편으로, IgG-유사 형식은 - 긴 반감기의 큰 이익을 가지지만 - IgG 분자에 내재하는 고유한 효과기 기능과 관련된 독성을 가진다. 이러한 면역원성 잠재능은 성공적인 치료제 개발을 위한 IgG-유사 이중특이적 항체의 또 다른 불리한 특징을 구성한다. 마지막으로, 이중특이적 항체의 일반적 개발에서의 주요한 도전은 여전히 임상적으로 충분한 양 및 순도의 이중특이적 항체 작제물의 생산이다. 공동-발현시 상이한 특이성의 항체 중쇄 및 경쇄의 잘못된 짝짓기는 정확히 조립된 작제물의 수율을 감소시키고, 다수의 비-작용성 부생성물을 초래한다.
T 세포 매개된 암 면역요법을 위한 현재 이용가능한 비특이적 항체와 관련된 어려움 및 단점을 고려해 볼 때, 이러한 분자의 새로운 개선된 형식에 대한 필요성이 여전히 있다. 이러한 단점들은 본 발명의 새로운 이중특이적 항체에 의해 이제 극복되었다. 새로운 이중특이적 항체는 잘못 짝지어진 부생성물의 양의 감소로 인해 증가된 수율로 용이하게 제조될 수 있는데, 이것은 당업계에 공지된 이중특이적 항체 단편보다 덜한 응집을 나타낸다. 또한, 새로운 이중특이적 항체는 당업계에 공지된 이중특이적 항체 형식과 비교하여 증가된 온도에서 안정하다. 교차 접근법을 이용하여, 공통 경쇄를 제조할 필요 없이 정확한 쇄 연합을 실시할 수 있다. 또한, 새로운 이중특이적 항체는 다수의 통상의 이중특이적 항체 단편과 비교하여 더 높은 분자량을 가지고, 따라서 과도한 신장 청소를 방지하고 개선된 생체내 반감기를 유도한다. 또한, 새로운 이중특이적 항체를 생산하기 위해 오직 2개의 플라스미드만이 요구된다. 새로운 이중특이적 항체는 완전히 작용성이고, 상응하는 통상의 이중특이적 항체에 필적하거나 개선된 결합 및 활성을 가진다.
본 발명은 낮은 독성 및 유리한 약동학적 특성을 가지는 양호한 효능과 생산 가능성을 조합하는 T 세포 활성화 및 방향전환 (re-direction) 을 위해 디자인된 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다.
본 발명의 개요
본 발명은 2 개 이상의 Fab 단편을 포함하는 이중특이적 항체로서, 제 1 Fab 단편은 제 1 항원에 대해 특이적인 1 개 이상의 항원 결합 부위를 포함하고; 제 2 Fab 단편은 제 2 항원에 대해 특이적인 1 개 이상의 항원 결합 부위를 포함하고, 여기서, 제 2 Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역은 교환되어 있고, 상기 2 개의 Fab 단편은 2 개의 펩타이드 링커에 의해 서로 연결되어 있고; 상기 이중특이적 항체는 Fc 도메인이 결여되어 있는 것인 이중특이적 항체에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 펩타이드 링커는 (G4S)2 링커이다.
하나의 실시형태에서, 상기 항체는 제 3 Fab 단편을 추가로 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 제 3 Fab 단편은 제 1 항원 또는 제 2 항원에 대해, 바람직하게는 제 1 항원에 대해 특이적인 1 개 이상의 항원 결합 부위를 포함한다.
하나의 실시형태에서, 제 3 Fab 단편은 제 1 Fab 단편의 경쇄 또는 중쇄에 연결되어 있다. 다른 실시형태에서, 제 3 Fab 단편은 제 2 Fab 단편의 경쇄 또는 중쇄의 N-말단 또는 C-말단에 연결되어 있다. 하나의 실시형태에서, 제 3 Fab 단편은 1 개 이상의 펩타이드 링커 (들) 을 통해 제 1 Fab 단편 또는 제 2 Fab 단편에 연결되어 있다. 바람직하게는, 상기 펩타이드 링커는 (G4S)2 링커이다.
본 발명에 따른 이중특이적 항체는 2가 이상이고, 3가 또는 다가, 예를 들면, 4가일 수 있다. 하나의 실시형태에서, 상기 이중특이적 항체는 제 1 항원 및 제 2 항원을 각각 표적화하는 1개의 결합 부위를 각각 가지는 2가 (1+1 형식) 이다. 다른 실시형태에서, 상기 이중특이적 항체는, 하기 섹션에서 상세히 기재되는 바와 같이, 제 1 항원을 각각 표적화하는 2 개의 결합 부위 및 제 2 항원을 표적화하는 1 개의 결합 부위를 가지는 3가 (2+1 형식) 이다.
본 발명은 제 1 Fab 단편 및 제 2 Fab 단편을 포함하는, T-세포 활성화 항원 및 종양 항원 (TA) 에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체로서, 제 2 Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역은 교환되어 있고, 상기 2 개의 Fab 단편은 2 개의 펩타이드 링커에 의해 서로 연결되어 있고, 상기 이중특이적 항체는 Fc 도메인을 포함하지 않는 것인 이중특이적 항체에 관한 것이다.
본 발명의 항체는 종양 세포의 표면 상의 종양 항원에 특이적으로 결합하고, 동시에 T-세포 활성화 항원에 결합한다. 이에 의해, 이중특이적 항체는 종양의 부위에서 특이적으로 면역 반응을 유도하고, 이후에 표적 세포의 아폽토시스 (apoptosis) 를 초래할 수 있다.
하나의 측면에서, 2 개의 펩타이드 링커에 의해 서로 연결되어 있는 2 개 이상의 Fab 단편을 포함하는, T-세포 활성화 항원 및 종양 항원 (TA) 에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체로서, 제 1 Fab 단편은 종양 항원 (TA) 에 대해 특이적인 1 개 이상의 항원 결합 부위를 포함하고; 제 2 Fab 단편은 T-세포 활성화 항원에 대해 특이적인 1 개 이상의 항원 결합 부위를 포함하고, 여기서, 제 2 Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역은 교환되어 있고; 상기 이중특이적 항체는 Fc 도메인이 결여되어 있는 것인 이중특이적 항체가 제공된다.
특히, 본 발명은 T-세포 활성화 항원이 CD3 T-세포 공동-수용체 (CD3) 표적화 항원인 것인 이중특이적 항체에 관한 것이다. 하나의 실시형태에서, 종양 항원은 흑색종-관련 콘드로이틴 황산 프로테오글리칸 (Melanoma-associated Chondroitin Sulfate Proteoglycan: MCSP), 표피 성장 인자 수용체 (Epidermal Growth Factor Receptor: EGFR), 암배아 항원 (Carcinoembryonic Antigen: CEA), 섬유아세포 활성화 단백질 (Fibroblast Activation Protein: FAP) 및 CD33 의 군으로부터 선택되는 것인 이중특이적 항체에 관한 것이다.
하나의 측면에서, 2 개의 펩타이드 링커에 의해 서로 연결되어 있는 2 개 이상의 Fab 단편을 포함하는, CD3 T-세포 공동-수용체 (CD3) 항원 및 종양 항원 (TA) 에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체로서, 제 1 Fab 단편은 종양 항원 (TA) 에 대해 특이적인 1 개 이상의 항원 결합 부위를 포함하고; 제 2 Fab 단편은 CD3 T-세포 공동-수용체 (CD3) 항원에 대해 특이적인 1 개 이상의 항원 결합 부위를 포함하고, 여기서, 제 2 Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역은 교환되어 있고; 상기 이중특이적 항체는 Fc 도메인이 결여되어 있는 것인 이중특이적 항체가 제공된다. 바람직하게는, 상기 펩타이드 링커는 (G4S)2 링커이다.
하나의 실시형태에서, 상기 항체는 1 개 또는 2 개의 펩타이드 링커에 의해 제 1 단편 또는 제 2 단편에 연결되어 있는 제 3 Fab 단편을 추가로 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 제 3 Fab 단편은 종양 항원에 대해 특이적인 1 개 이상의 항원 결합 부위를 포함한다. 하나의 실시형태에서, 제 3 Fab 단편은 제 1 Fab 단편의 경쇄 또는 중쇄의 N-말단 또는 C-말단에 연결되어 있다. 다른 실시형태에서, 제 3 Fab 단편은 제 2 Fab 단편의 경쇄 또는 중쇄의 N-말단 또는 C-말단에 연결되어 있다. 하나의 실시형태에서, 제 3 Fab 단편은 1 개 또는 2 개의 펩타이드 링커에 의해 제 1 Fab 단편 또는 제 2 Fab 단편에 연결되어 있다. 바람직하게는, 상기 펩타이드 링커는 (G4S)2 링커이다.
본 발명에 따른 이중특이적 항체는 2가 이상이고, 3가 또는 다가, 예를 들면, 4가 또는 6가일 수 있다. 하나의 실시형태에서, 상기 이중특이적 항체는 종양 항원 (TA) 및 T-세포 활성화 항원을 각각 표적화하는 1개의 결합 부위를 각각 가지는 2가 (1+1 형식) 이다. 다른 실시형태에서, 상기 이중특이적 항체는, 하기 섹션에서 상세히 기재되는 바와 같이, 종양 항원 (TA) 을 각각 표적화하는 2 개의 결합 부위 및 T-세포 활성화 항원을 표적화하는 1 개의 결합 부위를 가지는 3가 (2+1 형식) 이다. 바람직한 실시형태에서, 상기 T-세포 활성화 항원은 CD3 이다.
두번째 목적에서, 본 발명은 본 발명의 이중특이적 항체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
세번째 목적에서, 본 발명은 암의 치료를 위한 본 발명의 이중특이적 항체에 관한 것이다. 다른 실시형태에서, 약제로서의 이중특이적 항체의 용도가 제공된다. 바람직하게는, 상기 용도는 암의 치료를 위한 것이다.
추가의 목적에서, 본 발명은 본 발명의 이중특이적 항체의 중쇄를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산 서열, 본 발명의 이중특이적 항체의 경쇄를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산 서열, 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터, 및 본 발명의 벡터를 포함하는 원핵 또는 진핵 숙주 세포에 관한 것이다. 또한, 항체를 생산하도록 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는 항체의 제조 방법이 제공된다.
추가의 실시형태에서, 본 발명의 이중특이적 항체 및 세포독성제를 포함하는 면역접합체가 제공된다.
도 1: 2 개의 Fab 단편이 1 개의 링커에 의해 서로 연결되어 있는 이중특이적 항체 형식의 예의 개략도. a) Fab-Crossfab 분자 C-말단, b) Fab-Crossfab 분자 N-말단, c) (Fab)2-Crossfab 분자 C-말단, d) (Fab)2-Crossfab 분자 N-말단, e) Fab-Crossfab-Fab 분자.
도 2: hu Fab(MCSP)-Crossfab(CD3) 제조 및 정제의 분석: SDS-Page: 4-12 % Bis/Tris (NuPage [invitrogen]; 쿠마시 염색): a) 1 - Mark 12 (invitrogen), 2 - hu Fab(MCSP)-Crossfab(CD3) 환원되지 않음; b) 1 - Mark 12 (invitrogen), 2 - hu Fab(MCSP)-Crossfab(CD3) 환원됨.
도 3: Fab(MCSP)-Crossfab(CD3) 제조 및 정제의 분석. 분석용 크기 배제 크로마토그래피, Chromatogram A280 (Superdex 200 10/300 GL [GE Healthcare]; 2 mM MOPS pH 7.3, 150 mM NaCl, 0.02 % (w/v) NaCl; 50 ㎍ 샘플을 주입함).
도 4: hu Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3) 제조 및 정제의 분석: SDS-Page: 4-12 % Bis/Tris (NuPage [invitrogen]; 쿠마시 염색): a) 1 - Mark 12 (invitrogen), 2 - hu Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3) 환원되지 않음; b) 1 - Mark 12 (invitrogen), 2 - hu Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3) 환원됨.
도 5: hu Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3) 제조 및 정제의 분석. 분석용 크기 배제 크로마토그래피, Chromatogram A280 (Superdex 200 10/300 GL [GE Healthcare]; 2 mM MOPS pH 7.3, 150 mM NaCl, 0.02 % (w/v) NaCl; 50 ㎍ 샘플을 주입함).
도 6: hu Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)-Fab(MCSP) 제조 및 정제의 분석. SDS-Page: 4-12 % Bis/Tris (NuPage [invitrogen]; 쿠마시 염색): a) 1 - Mark 12 (invitrogen), 2 - hu Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)-Fab(MCSP) 환원되지 않음; b) 1 - Mark 12 (invitrogen), 2 - hu Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)-Fab(MCSP) 환원됨.
도 7: hu Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)-Fab(MCSP) 제조 및 정제의 분석. 분석용 크기 배제 크로마토그래피, Chromatogram A280 (Superdex 200 10/300 GL [GE Healthcare]; 2 mM MOPS pH 7.3, 150 mM NaCl, 0.02 % (w/v) NaCl; 50 ㎍ 샘플을 주입함).
도 8: 쥐과동물 Crossfab(CD3)-Fab(MCSP)-Fab(MCSP) 제조 및 정제의 분석. SDS-Page: 4-12 % Bis/Tris (NuPage [invitrogen]; 쿠마시 염색): a) 1 - Mark 12 (invitrogen), 2 - 쥐과동물 Crossfab(CD3)-Fab(MCSP)-Fab(MCSP) 환원되지 않음; b) 1 - Mark 12 (invitrogen), 2 - 쥐과동물 Crossfab(CD3)-Fab(MCSP)-Fab(MCSP) 환원됨.
도 9: 쥐과동물 Crossfab(CD3)-Fab(MCSP)-Fab(MCSP) 제조 및 정제의 분석. 분석용 크기 배제 크로마토그래피, Chromatogram A280 (Superdex 200 10/300 GL [GE Healthcare]; 2 mM MOPS pH 7.3, 150 mM NaCl, 0.02 % (w/v) NaCl; 50 ㎍ 샘플을 주입함).
도 10: 인간 pan (췌장) T 세포와의 공동-배양시 (E:T 비율 = 5:1) 의 MDA-MB-435 종양 세포의 사멸 (LDH 방출에 의해 측정), 및 상이한 농도의 hu Fab(MCSP)-Crossfab(CD3) (= "Fab-Crossfab"), hu Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)-Fab(MCSP) (= "Fab-Crossfab-Fab"), hu Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3) (= "(Fab)2-Crossfab") 뿐만 아니라 (scFv)2 (항MCSP/항 huCD3e) (= "(scFv)2") 이중특이적 분자에 의한 20 시간 동안의 활성화. 2가 MCSP-표적화를 가지는 작제물은 "(scFv)2" 작제물과 비교하여 필적할만한 세포독성 활성을 보이는 반면에, 1가 MCSP 결합을 가지는 "Fab-Crossfab" 작제물은 명백히 덜 강력하다.
도 11: hu Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3) (= "(Fab)2-Crossfab") 와 (scFv)2 (항MCSP/항 huCD3e) (= "(scFv)2") 작제물의 비교. 인간 pan T 세포와의 공동-배양시 (E/T 비율 = 5:1) 의 MDA-MB-435 종양 세포로부터의 LDH 방출, 및 상이한 농도의 이중특이적 작제물 및 상응하는 IgG 에 의한 21 시간 동안의 활성화를 나타낸다. "(Fab)2-Crossfab" 는 (scFv)2 분자에 적어도 필적할 정도로 양호한 표적 세포에서의 아폽토시스를 유도한다.
도 12: hu Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3) (= "(Fab)2-Crossfab") 및 (scFv)2 (항MCSP/항 huCD3e) (= "(scFv)2") 작제물의 비교. 인간 PBMC 와의 공동-배양시 (E/T 비율 = 10:1) 의 MV-3 인간 흑색종 종양 세포로부터의 LDH 방출, 및 상이한 농도의 이중특이적 작제물 및 상응하는 IgG 에 의한 26 시간 동안 활성화를 나타낸다. "(Fab)2-Crossfab" 는 (scFv)2 분자에 적어도 필적할 정도로 양호한 표적 세포에서의 아폽토시스를 유도한다.
도 13: 쥐과동물 CD3 뿐만 아니라, 인간 MCSP 를 표적화하는 쥐과동물 Crossfab(CD3)-Fab(MCSP)-Fab(MCSP) 작제물 (= (Fab)2-Crossfab) 에 의한 주요한 쥐과동물 T 세포 활성화에 의해 유도된 B16/F10-huMCSP Fluc2, 클론 48 종양 세포로부터의 LDH 방출. 효과기 대 표적 세포 비율은 5:1 이었다. 37℃, 5 % CO2 에서 23.5 시간 동안 항온처리 후에 검정을 분석하였다. 작제물은 인간 MCSP-발현 표적 세포의 농도-의존적 T 세포-매개된 아폽토시스를 유도한다.
도 14: 쥐과동물 CD3 뿐만 아니라, 인간 MCSP 를 표적화하는 50 nM 의 쥐과동물 Crossfab(CD3)-Fab(MCSP)-Fab(MCSP) 작제물 (= (Fab)2-Crossfab) 에 의한 주요한 쥐과동물 T 세포 활성화에 의해 유도된 B16/F10-huMCSP Fluc2, 클론 48 종양 세포로부터의 LDH 방출. 효과기 대 표적 세포 비율은 5:1 이었다. 37℃, 5 % CO2 에서 23.5 시간 동안 항온처리 후에 검정을 분석하였다. 작제물은 인간 MCSP-발현 표적 세포의 T 세포-매개된 아폽토시스를 유도한다. 본 농도의 작제물에서는 단지 T 세포의 약한 과잉 활성화만 존재한다.
도 15: 24 시간 동안 Colo-38 종양 세포의 존재 (A, B) 또는 부재 (C, D) 하에 1 nM 의 상이한 CD3-MCSP 이중특이적 작제물 (hu Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3) (= "(Fab)2-Crossfab") 및 (scFv)2 (항MCSP/항 huCD3e) (= "(scFv)2")) 에 의한 처리 후에 전혈의 상청액에서 측정된 상이한 사이토카인 수준. 96-웰 플레이트의 웰 당 280 μl 전혈을 플레이팅하고, 30 000 Colo-38 세포를 지시된 대로 첨가하였다. Colo-38 종양 세포의 존재 하에 T 세포의 활성화시 분비된 주요 사이토카인은 IL-6, 뒤이어 IFN감마이다. 또한, 그랜자임 B 의 수준도 또한 표적 세포의 존재 하에 T 세포의 활성화시 굉장히 증가하였다. 일반적으로, "(scFv)2" 작제물은 다른 이중특이적 작제물과 비교하여 표적 세포의 존재 (A 및 B) 하에서 그랜자임 B 뿐만 아니라 TNF 와 IFN감마의 수준도 조금 더 증가시켰다.
표적 세포의 존재 (또는 부재) 하에 이중특이적 작제물에 의한 T 세포의 활성화시의 Th2 사이토카인 (IL-10 및 IL-4) 의 유의미한 분비는 없었다. 본 검정에서, 표적 세포의 부재 하에 "(Fab)2-Crossfab" 작제물에 의해 유도된 IFN감마의 약한 분비가 또한 존재하였다.
도 16: 비장세포에서 단리된 쥐과동물 pan T 세포 상의 후기 활성화 마커 (late activation marker) CD25 의 표면 발현 수준. 지시된 바와 같이, B16/F10-huMCSP Fluc2 클론 48 종양 표적 세포의 존재 또는 부재 하에, 쥐과동물 pan T 세포를 50 nM 의 쥐과동물 Crossfab(CD3)-Fab(MCSP)-Fab(MCSP) 작제물 (= (Fab)2-Crossfab) 이중특이적 작제물 (인간 MCSP 뿐만 아니라 쥐과동물 CD3 을 표적화함) 과 항온처리하였다 (E:T 비율은 10:1이다). 70 시간 후 CD8+ T 세포 상의 후기 활성화 마커 CD25 의 발현 수준을 나타낸다. (Fab)2-Crossfab 작제물에 의한 CD8+ T 세포 상의 CD25 의 상향 조절은 오로지 표적 세포의 존재 하에서만 발생한다. 동일한 몰 농도로 조정되어 사용된 기준 IgG 는 CD25 를 상향조절할 수 없었다.
도 17: Fab(CD33)-Crossfab (CD3) 제조 및 정제의 분석. SDS-Page: a) 3-8 % Tris/아세테이트 (NuPage [invitrogen]; 쿠마시 염색): a) 1 - HiMark (invitrogen), 2 - Fab(CD33)-Crossfab (CD3) 환원되지 않음; b) 4-12 % Bis/Tris (NuPage [invitrogen]: 1 - Mark 12 (invitrogen), 2 - Fab(CD33)-Crossfab (CD3) 환원됨.
도 18: Fab(CD33)-Crossfab (CD3) 제조 및 정제의 분석. 분석용 크기 배제 크로마토그래피, Chromatogram A280 (Superdex 200 10/300 GL [GE Healthcare]; 2 mM MOPS pH 7.3, 150 mM NaCl, 0.02 % (w/v) NaCl; 50㎍ 샘플을 주입함).
도 19: 인간 PBMC 와의 공동-배양시 (E:T 비율 = 10:1) 의 MV-3 종양 세포의 사멸 (LDH 방출에 의해 측정), 및 상이한 농도의 CD3-MCSP 이중특이적 작제물 (hu Fab(MCSP)-Crossfab(CD3); "1+1 non-Fc" 로 표기, 및 (scFv)2 (항MCSP/항 huCD3e) (= "(scFv)2") 기준 분자) 에 의한 24 시간 동안의 활성화. "1+1 non-Fc" 작제물은 25.4 pM 의 EC50 계산치로 MV-3 표적 세포에서의 아폽토시스를 유도하는 반면에, "(scFv)2" 기준 분자에 대한 EC50 계산치는 57 pM 인데, 이것은 EC50 의 관점에서 "1+1 non-Fc" 분자가 약간 더 양호한 효능을 가지는 것을 보여준다.
도 20: CD3-MCSP 이중특이적 작제물 (각각, hu Fab(MCSP)-Crossfab(CD3); "1+1 non-Fc" 로서 표시, 및 (scFv)2 (항MCSP/항 huCD3e) (= "(scFv)2") 기준 분자) 로 약 24 시간 동안 처리된, 인간 PBMC 와의 공동-배양시 (E:T 비율 = 10:1) 의 huMCSP-양성 MV-3 종양 세포의 존재 하에 CD69-양성 세포의 각각의 증가율 (B) 및 CD69 의 상향 조절에 의해 측정된 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 활성화 (A). 일반적으로, CD69 중앙값은 CD4+ T 세포와 비교하여 CD8+ T 세포 상에서 더 높다. 두 작제물에 대한 CD69 양성 세포의 백분율 뿐만 아니라 둘 다의 CD69 중앙값에서, 분명한 농도-의존적 증가가 존재한다.
도 21: (scFv)2 기준 분자의 도해
도 22: (scFv)2 (항MCSP/항 huCD3e) 제조 및 정제의 분석. SDS-Page: 4-12 % Bis/Tris (NuPage [invitrogen]; 쿠마시 염색): 1 - Mark 12 (invitrogen), 2 - (scFv)2 (항MCSP/항 huCD3e) 환원됨; 3 - (scFv)2 (항MCSP/항 huCD3e) 환원되지 않음.
도 23: (scFv)2 (항MCSP/항 huCD3e) 제조 및 정제의 분석. 분석용 크기 배제 크로마토그래피, Chromatogram A280 (Superdex 75 10/300 GL [GE Healthcare]; 2 mM MOPS pH 7.3, 150 mM NaCl, 0.02 % (w/v) NaCl; 50㎍ 샘플 ((scFv)2 (항MCSP/항 huCD3e)) 을 주입함).
도 24: 2 개의 Fab 단편이 2 개의 링커에 의해 서로 연결되어 있는 이중특이적 항체 형식의 예의 개략도. a) Fab=Crossfab 분자 C-말단, b) Fab=Crossfab 분자 N-말단, c) Fab-Fab=Crossfab 분자 및 Fab=Fab=Crossfab 분자 C-말단, d) Fab-Fab=Crossfab 분자 및 Fab=Fab=Crossfab 분자 N-말단, e) Fab-Crossfab=Fab 및 Fab=Crossfab=Fab 분자.
도 25: hu Fab(MCSP)=Crossfab(CD3) 제조 및 정제의 분석: SDS-Page: 4-12 % Bis/Tris (NuPage [invitrogen]; 쿠마시 염색): A) hu Fab(MCSP)=Crossfab(CD3) 환원됨; B) Mark 12 (invitrogen), C) hu Fab(MCSP)=Crossfab(CD3) 환원되지 않음.
도 26: 상이한 CD3-MCSP 이중특이적 작제물 (각각 hu Fab(MCSP)=Crossfab(CD3), "1+1 non-Fc, 연결된 LC" 로 표기; hu Fab(MCSP)-Crossfab(CD3), "1+1 non-Fc" 로 표기; 및 (scFv)2 (항MCSP/항 huCD3e) (= "scFv)2") 기준 분자) 로 약 24 시간 동안 처리된, 인간 PBMC 와의 공동-배양시 (E:T 비율 = 10:1) 의 MCSP-양성 MV-3 인간 흑색종 세포의 사멸 (LDH 방출에 의해 측정). 인간 PBMC를 건강한 지원자의 신선혈로부터 단리하였다. Graph Pad Prism 소프트웨어를 사용하여 EC50 값을 측정하였다.
도 27: 인간 MCSP-발현 MV-3 흑색종 표적 세포 (E:T 비율 = 10:1) 의 존재 하에 인간 CD3 및 인간 MCSP 를 암호화하는 non-Fc T 세포 이중특이적 작제물 (각각 hu Fab(MCSP)=Crossfab(CD3), "1+1 non-Fc, 연결된 LC" 로 표기; hu Fab(MCSP)-Crossfab(CD3), "1+1 non-Fc" 로 표기; 및 (scFv)2 (항MCSP/항 huCD3e) (= "(scFv)2") 기준 분자)) 10 nM, 80 pM 또는 16 pM 과의 24 시간 항온처리 후 인간 CD4 및 CD8 T 세포 상의 조기 활성화 마커 CD69 의 표면 발현 수준. (A) 는 CD69 의 중앙 발현 값을 보여주고, (B) 는 CD69 양성 T 세포의 백분율을 나타낸다.
도 28: "(scFv)2" 기준 분자 (항MCSP/항 huCD3)와 비교한 2 개의 링커를 가지는 Fab-Crossfab 분자 (항MCSP/항 huCD3) 의 열 안정성. 0.05 ℃/분으로 25 - 75 ℃의 온도 램프에서 측정된 동적 광 산란. 2 개의 링커를 가지는 Fab-Crossfab 분자는 흑색으로 보이고, "(scFv)2" 기준 분자는 회색으로 보인다.
I. 정의
"프레임워크 (framework)" 또는 "FR" 이란, 고가변 영역 (hypervariable region: HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 의미한다. 가변 도메인의 FR 은 일반적으로 4 개의 FR 도메인: FR1, FR2, FR3 및 FR4 로 이루어진다. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH (또는 VL) 에서 다음 서열로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
본원에서의 목적을 위한 "수용체 인간 프레임워크" 란, 하기 정의된 바와 같이 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크로부터 유래된 경쇄 가변 도메인 (VL) 프레임워크 또는 중쇄 가변 도메인 (VH) 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크"로부터 유래된" 수용체 인간 프레임워크는 이의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 이것은 아미노산 서열 변경을 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 아미노산 변경의 수는 10 개 이하, 9 개 이하, 8 개 이하, 7 개 이하, 6 개 이하, 5 개 이하, 4 개 이하, 3 개 이하 또는 2 개 이하이다. 일부 실시형태에서, VL 수용체 인간 프레임워크는 VL 인간 면역글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 공통 프레임워크 서열과 서열에서 동일하다.
"인간 공통 프레임워크"는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선별에서 가장 통상적으로 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열의 선별은 가변 도메인 서열의 서브그룹으로부터 이루어진다. 일반적으로, 서열들의 서브그룹은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3] 에서와 같은 서브그룹이다. 하나의 실시형태에서, VL 의 경우, 서브그룹은 문헌 [Kabat et al., supra] 에서와 같은 서브그룹 카파 I 이다. 하나의 실시형태에서, VH 의 경우, 서브그룹은 문헌 [Kabat et al., supra] 에서와 같은 서브그룹 III 이다.
본원에서 사용되는 용어 "고가변 영역" 또는 "HVR" 이란, 서열에서 고가변적이고/이거나 구조적으로 정의된 루프 ("고가변 루프") 를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역의 각각을 의미한다. 일반적으로, 천연형 4-쇄 항체는 6 개의 HVR 을 포함한다: VH 에서 3 개 (H1, H2, H3) 및 VL 에서 3 개 (L1, L2, L3). HVR 은 일반적으로 고가변 루프로부터 및/또는 "상보성 결정 영역" (complementarity determining region: CDR) 으로부터의 아미노산 잔기를 포함하는데, 후자는 서열 가변성이 가장 크고/거나 항원 인지에 관여한다. 예시적인 고가변 루프는 아미노산 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3) 에서 발생한다 [Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)]. 예시적인 CDR (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3) 은 L1 의 아미노산 잔기 24-34, L2 의 아미노산 잔기 50-56, L3 의 아미노산 잔기 89-97, H1 의 아미노산 잔기 31-35B, H2 의 아미노산 잔기 50-65 및 H3 의 아미노산 잔기 95-102 에서 발생한다 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]. 용어 고가변 영역 (HVR) 및 상보성 결정 영역 (CDR) 은 본원에서 항원 결합 영역을 형성하는 가변 영역의 일부와 관련하여 상호교환적으로 사용된다. 이러한 특정 영역은 문헌 [Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983); 및 Chothia et al., J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)] 에 기재되어 있으며, 그 정의는 서로에 대하여 비교될 때 아미노산 잔기의 중복 또는 부분집합을 포함한다. 그럼에도 불구하고, 항체 또는 이의 변이체의 CDR 을 의미하기 위한 정의의 적용은 본원에 정의되고 사용된 용어의 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 상기 인용된 참조문헌의 각각에서 정의된 CDR 을 포함하는 적절한 아미노산 잔기는 비교로서 하기 표 1 에 제시된다. 특정 CDR 을 포함하는 정확한 잔기 수는 CDR 의 서열 및 크기에 따라 달라질 것이다. 당업자는 항체의 가변 영역 아미노산 서열을 고려하여, 어떠한 잔기가 특정 CDR 을 포함하는지를 일상적으로 결정할 수 있다.
표 1. CDR 정의 1
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Kabat 등은 또한 임의의 항체에 적용가능한 가변 도메인 서열을 위한 번호지정 시스템을 정의하였다. 당업자는, 서열 자체를 넘어서는 임의의 실험 데이터에 의존하지 않고, 이러한 "Kabat 번호지정" 시스템을 임의의 가변 영역 서열에 명백하게 배정할 수 있다. 본원에 사용되는 "Kabat 번호지정" 이란, 문헌 [Kabat et al., "U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983)"] 에 제시된 번호지정 시스템을 의미한다. 달리 명시되지 않는다면, 항체 가변 영역 내의 특정 아미노산 잔기 위치의 번호지정에 대한 언급은 Kabat 번호지정 시스템에 따른다.
VH 에서 CDR1 을 제외하고, CDR 은 일반적으로 고가변 루프를 형성하는 아미노산 잔기를 포함한다. CDR 은 또한 항원과 접촉하는 잔기인 "특이성 결정 잔기" 또는 "SDR" 을 포함한다. SDR 은 단축된-CDR, 즉 a-CDR 로 호칭되는 CDR 의 영역 내에 함유되어 있다. 예시적인 a-CDR (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 및 a-CDR-H3) 은 L1 의 아미노산 잔기 31-34, L2 의 아미노산 잔기 50-55, L3 의 아미노산 잔기 89-96, H1 의 아미노산 잔기 31-35B, H2 의 아미노산 잔기 50-58 및 H3 의 아미노산 잔기 95-102 에서 발생한다 ([Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13: 1619-1633 (2008)] 참조). 달리 명시되지 않는다면, HVR 잔기 및 가변 도메인 내의 기타 잔기 (예를 들면, FR 잔기) 는 본원에서 문헌 [Kabat et al., supra] 에 따라 번호지정된다.
본원에서의 용어 "항체" 란, 가장 넓은 의미로 사용되며, 단일클론 항체, 다클론 항체, 다중특이적 항체 (예를 들면, 이중특이적 항체), 및 목적하는 항원-결합 활성을 나타내는 한에 있어서의 항체 단편을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 각종 항체 구조를 포함한다. 특히, 용어 "항체" 는 또한 Fc 도메인이 결여되어 있는 2 개 이상의 Fab 단편을 포함하는 본 발명의 이중특이적 항체를 포함한다.
용어 "인간 항체" 란, 인간 또는 인간 세포에 의해 생산되거나, 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-암호화 서열을 이용하는 비-인간 출처로부터 유래되는 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 가지는 것이다. 인간 항체의 이러한 정의는 구체적으로 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 배제한다.
본원에서 사용되는 용어 "재조합 인간 항체" 란, 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 제작 또는 단리된 모든 인간 항체, 예를 들면, NS0 또는 CHO 세포와 같은 숙주 세포로부터, 또는 숙주 세포 내로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 인간 면역글로불린 유전자 또는 항체에 대한 형질전환 동물 (예를 들면, 마우스) 로부터 단리된 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 재조합 인간 항체는 가변 영역 및 불변 영역을 재배열된 형태로 가진다. 본 발명에 따른 재조합 인간 항체는 생체내 체세포 과돌연변이를 겪는다. 따라서, 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 인간 생식세포 계열 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 이와 관련되는 서열인 반면, 생체내 인간 항체 생식세포 계열 레퍼토리 내에 자연적으로 존재할 수 없는 서열이다.
"인간화" 항체란, 비-인간 HVR 로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR 로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 의미한다. 특정 실시형태에서, 인간화 항체는 실질적으로 모든 1 개 이상, 전형적으로 2 개의 가변 도메인을 포함할 것이고, 여기서, 모든 또는 실질적으로 모든 HVR (예를 들면, CDR) 은 비-인간 항체의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 은 인간 항체의 것에 상응한다. 인간화 항체는 인간 항체로부터 유래하는 항체 불변 영역의 일부 이상을 임의로 포함할 수 있다. 항체, 예를 들면, 비-인간 항체의 "인간화 형태" 는 인간화를 겪은 항체를 의미한다. 본 발명에 포함되는 다른 형태의 "인간화 항체" 는, 불변 영역이 본래의 항체의 불변 영역으로부터 추가로 변형 또는 변화되어, 특히 C1q 결합 및/또는 Fc 수용체 (FcR) 결합과 관련하여 본 발명에 따른 특성을 발생시키는 것들이다.
용어 "키메라" 항체란, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 출처 또는 종으로부터 유래하지만, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지가 상이한 출처 또는 종으로부터 유래하고, 재조합 DNA 기술에 의해 통상 제조되는 항체를 의미한다. 쥐과동물 가변 영역 및 인간 불변 영역을 포함하는 키메라 항체가 바람직하다. 본 발명에 포함되는 다른 바람직한 형태의 "키메라 항체" 는 불변 영역이 본래의 항체의 것으로부터 변형되거나 변화되어, 특히 C1q 결합 및/또는 Fc 수용체 (FcR) 결합과 관련하여 본 발명에 따른 특성을 창출하는 것들이다. 이러한 키메라 항체는 또한 "클래스-전환 항체 (class-switched antibody)" 로서 언급된다. 키메라 항체는 면역글로불린 가변 영역을 암호화하는 DNA 분절 및 면역글로불린 불변 영역을 암호화하는 DNA 분절을 포함하는 발현된 면역글로불린 유전자의 생성물이다. 키메라 항체의 생산 방법은 통상의 재조합 DNA 및 유전자 형질감염 기술을 포함하며, 이들은 당업계에 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌 [Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855]; 미국 특허　US 5,202,238 및 US　5,204,244 를 참조한다.
본원에 사용되는 용어 "단일클론 항체" 란, 예를 들면, 자연 발생적 돌연변이를 함유하거나 단일클론 항체 제제의 생산 동안 발생하는 일반적으로 소량으로 존재하는 가능한 변이체 항체를 제외하고, 실질적인 동종 항체의 모집단으로부터 수득된 항체를 의미하며, 즉, 모집단을 구성하는 개별 항체들은 동일하고/하거나 동일한 에피토프에 결합한다. 전형적으로 상이한 결정인자 (에피토프) 에 대한 상이한 항체를 포함하는 다클론 항체와 대조적으로, 단일클론 항체 제제의 각각의 단일클론 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대한 것이다. 따라서, 수식어 "단일클론" 은 실질적인 동종 항체의 모집단으로부터 수득되는 항체의 특징을 나타내고, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되지 않는다. 예를 들면, 본 발명에 따라 사용되는 단일클론 항체는, 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 인간 면역글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유하는 형질전환 동물을 이용하는 방법을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 각종 기술에 의해 제조될 수 있으며, 단일클론 항체를 제조하기 위한 이러한 방법 및 다른 예시적인 방법들은 본원에 기재되어 있다.
"항체 단편" 이란, 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 일부를 포함하는 온전한 항체 이외의 분자를 의미한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일-쇄 항체 분자 (예를 들면, scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. scFv 항체는, 예를 들면, 문헌 [Huston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-52] 에 기재되어 있다. 또한, 항체 단편은, VH 도메인의 특징, 즉, VL 도메인과 함께 어셈블링할 수 있는 특징, 또는 VL 도메인의 특징, 즉, 기능적 항원 결합 부위에 VH 도메인과 함께 어셈블링할 수 있는 특징을 가지고, 이렇게 함으로써 전장 항체의 항원 결합 특성을 제공하는 단일 쇄 폴리펩타이드를 포함한다.
본원에서 사용되는 "Fab 단편" 이란, 경쇄의 VL 도메인 및 불변 도메인 (CL) 을 포함하는 경쇄 단편, 및 중쇄의 VH 도메인 및 제 1 불변 도메인 (CH1) 을 포함하는 항체 단편을 의미한다. 본 발명의 이중특이적 항체는 2 개 이상의 Fab 단편을 포함하는데, 여기서, 제 2 Fab 단편의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역은 교환되어 있다. 가변 영역 또는 불변 영역의 교환으로 인해, 상기 제 2 Fab 단편은 또한 "cross-Fab 단편" 또는 "xFab 단편" 또는 "crossover Fab 단편" 으로서 지칭된다. crossover Fab 분자의 2 개의 상이한 쇄 조성이 가능하고, 본 발명의 이중특이적 항체에 포함된다: 한편으로는, Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 교환되어 있고, 즉, crossover Fab 분자는 경쇄 가변 영역 (VL) 및 중쇄 불변 영역 (CH1) 으로 이루어진 펩타이드 쇄와, 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 불변 영역 (CL) 으로 이루어진 펩타이드 쇄를 포함한다. 이러한 crossover Fab 분자는 또한 CrossFab (VLVH) 로서 지칭된다. 다른 한편으로, Fab 중쇄 및 경쇄의 불변 영역이 교환되는 경우, crossover Fab 분자는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 불변 영역 (CL) 으로 이루어진 펩타이드 쇄와, 경쇄 가변 영역 (VL) 및 중쇄 불변 영역 (CH1) 으로 이루어진 펩타이드 쇄를 포함한다. 이러한 crossover Fab 분자는 또한 CrossFab (CLCH1) 로서 지칭된다.
Fab 단편은 하기에 요약하는 바와 같이 2 개 이상의 펩타이드 링커를 통해 연결된다. 달리 정의되지 않는다면, "연결됨" 이란, Fab 단편들이 직접 또는 1 개 이상의 펩타이드 링커를 통해 펩타이드 결합에 의해 연결되는 것을 의미한다. 본 발명 내에 사용되는 용어 "펩타이드 링커" 란, 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 의미하는데, 이것은 바람직하게는 합성 기원의 것이다. 본 발명에 따른 이들 펩타이드 링커는 Fab 단편들 중의 하나를 다른 Fab 단편의 C-말단 또는 N-말단에 연결시켜 본 발명에 따른 다중특이적 항체를 형성하는데 사용된다. 바람직하게는, 상기 펩타이드 링커는 5 개 이상의 아미노산 길이, 바람직하게는 5 개 내지 100 개의 아미노산 길이, 보다 바람직하게는 10 개 내지 50 개의 아미노산 길이의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드이다. 하나의 실시형태에서, 상기 펩타이드 링커는 (GxS)n 또는 (GxS)nGm 으로서, 여기서, G = 글라이신, S = 세린, 및 (x = 3, n = 3, 4, 5 또는 6, 및 m = 0, 1, 2 또는 3) 또는 (x = 4, n = 2, 3, 4 또는 5, 및 m = 0, 1, 2 또는 3), 바람직하게는 x = 4 및 n = 2 또는 3, 보다 바람직하게는 x = 4, n = 2 이다. 또한, 링커는 면역글로불린 힌지 영역 (의 일부) 을 포함할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 상기 펩타이드 링커는 (G4S)2 (서열 번호: 28) 이다. Fab 단편을 연결하는데 적합한 다른 펩타이드 링커는, 예를 들면, (G4S)6-GG (서열 번호: 147) 또는 (SG3)2-(SEG3)4-(SG3)-SG (서열 번호: 148), 또는 EPKSC(D)-(G4S)2 (서열 번호: 145 및 146) 이다.
용어 "항원 결합 도메인" 이란, 항원의 일부 또는 전부에 특이적으로 결합하고 이에 대해 상보적인 부분을 포함하는 항원 결합 분자의 일부를 의미한다. 항원이 대형인 경우, 항원 결합 분자는 오로지 항원의 특정 부분에 결합할 수 있으며, 이 부분은 에피토프로서 호칭된다. 항원 결합 도메인은, 예를 들면, 1 개 이상의 항체 가변 도메인 (또한 항체 가변 영역으로도 호칭됨) 에 의해 제공될 수 있다. 바람직하게는, 항원 결합 도메인은 항체 경쇄 가변 영역 (VL) 및 항체 중쇄 가변 영역 (VH) 을 포함한다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인" 이란, 항체를 항원에 결합시키는데 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 의미한다. 본래의 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 (각각 VH 및 VL) 은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각각의 도메인은 4 개의 보존 프레임워크 영역 (FR) 및 3 개의 고가변 영역 (HVR) 을 포함한다 (예를 들면, 문헌 [Kindt, et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)] 참조). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 더욱이, 특정 항원과 결합하는 항체는, 각각 상보성 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 항원과 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리될 수 있다. 예를 들면, 문헌 [Portolano et al., J. Immunol. 150: 880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352: 624-628 (1991)] 을 참조한다.
본원에서 사용될 때의 용어 "항체의 항원 결합 부위" 란, 항원-결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 의미한다. 항체의 항원-결합 부분은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR" 로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. "프레임워크" 또는 "FR" 영역은 본원에서 정의된 바와 같은 고가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 영역이다. 따라서, 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 도메인은 N-말단에서부터 C-말단까지 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4 를 포함한다. 특히, 중쇄의 CDR3 은 항원 결합에 가장 많이 기여하고, 항체의 특성을 정의하는 영역이다. CDR 및 FR 영역은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)] 의 표준 정의 및/또는 "고가변 루프" 로부터의 잔기에 따라 결정된다.
용어 "에피토프" 는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 폴리펩타이드 결정인자를 포함한다. 특정 실시형태에서, 에피토프 결정인자는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 또는 설포닐과 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹을 포함하며, 특정 실시형태에서는 특이적인 3차원 구조적 특징 및/또는 특이적 전하 특징을 가질 수 있다. 에피토프는 항체에 의해 결합되는 항원의 영역이다.
본원에서의 용어 "Fc 도메인" 은 불변 영역의 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는데 사용된다. 예를 들면, 천연 항체에서, Fc 도메인은 IgG, IgA 및 IgD 아이소타입에서 항체의 2개의 중쇄의 제 2 불변 도메인 및 제 3 불변 도메인으로부터 유래된, 2 개의 동일한 단백질 단편들로 이루어지고; IgM 및 IgE Fc 도메인은 각각의 폴리펩타이드 쇄에서 3 개의 중쇄 불변 도메인 (CH 도메인 2-4) 을 함유한다. 본 발명의 이중특이적 항체는 Fc 도메인이 결여되어 있다. 본원에서 사용되는 "Fc 도메인이 결여됨" 이란, 본 발명의 이중특이적 항체가 CH2, CH3 또는 CH4 도메인을 포함하지 않는 것, 즉, 불변 중쇄가 오로지 1 개 이상의 CH1 도메인으로 이루어진 것을 의미한다.
"친화도" 란, 분자 (예를 들면, 항체) 의 단일 결합 부위와 이의 결합 파트너 (예를 들면, 항원) 사이의 비공유적 상호작용의 총합의 강도를 의미한다. 달리 명시되지 않는다면, 본원에서 사용되는 "결합 친화도" 란, 결합 쌍의 구성원들 (예를 들면, 항체와 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 의미한다. 분자 X 의 이의 파트너 Y 에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수 (KD) 로 나타낼 수 있다. 친화도는 본원에서 기재된 것들을 포함하여, 당업계에 공지되어 있는 통상의 방법에 의해 측정될 수 있다. 결합 친화도를 측정하기 위한 구체적인 구체적으로 설명적이고 예시적인 특정 실시형태들은 하기에 기재되어 있다.
본원에서 사용되는 용어 "결합" 또는 "특이적 결합" 이란, 결합이 항원에 대해 선택적이고, 원치 않거나 비특이적 상호작용과는 구별될 수 있는 것을 의미한다. 특이적 항원 결정인자와 결합하는 항원 결합 모이어티 (moiety) 의 능력은, 효소-결합 면역흡착 측정법 (enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA) 또는 당업자에게 익숙한 다른 기술, 예를 들면, 표면 플라스몬 공명 (surface plasmon resonance: SPR) 기술 (BIAcore 기기 상에서 분석함) [Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)], 및 전통적인 결합 측정법 [Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)] 을 통해 측정될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 관련 없는 단백질에 대한 항원 결합 모이어티의 결합 정도는, 예를 들면, SPR 에 의한 측정시, 항원에 대한 항원 결합 모이어티의 결합의 약 10 % 미만이다. 특정 실시형태에서, 항원에 결합하는 항원 결합 모이어티, 또는 항원 결합 모이어티를 포함하는 항원 결합 분자는 ≤ 1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들면, 10-8 M 이하, 예를 들면, 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들면, 10-9 M 내지 10-13 M) 의 해리 상수 (KD) 를 가진다.
"친화도 성숙된" 항체란, 변경을 가지지 않은 부모 항체와 비교하여, 1 개 이상의 고가변 영역 (HVR) 내에서 1 개 이상의 변경을 가지는 항체를 의미하며, 이러한 변경은 항원에 대한 항체의 친화도에서의 개선을 초래한다.
하나의 실시형태에서, 관련 없는 단백질에 대하여, 제 1 항원 및 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체의 결합 정도는, 예를 들면, 방사면역측정법 (radioimmunoassay: RIA) 또는 유세포측정법 (flow cytometry: FACS) 에 의한 측정시, 제 1 항원 또는 제 2 항원에 대한 항체의 결합의 약 10 % 미만이다. 특정 실시형태에서, 제 1 항원 및 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체는 ≤　1 μM, ≤　100 nM, ≤　10 nM, ≤　1 nM, ≤　0.1 nM, ≤　0.01 nM, 또는 ≤　0.001 nM (예를 들면, 10-8 M 이하, 예를 들면, 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들면, 10-9 M 내지 10-13 M) 의 해리 상수 (KD) 를 가진다. 특정 실시형태에서, 제 1 항원 및 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체는, 상이한 종들로부터의 제 1 항원 또는 제 2 항원 중에서 보존되는 제 1 항원 또는 제 2 항원의 에피토프에 결합한다.
하나의 실시형태에서, 관련 없는 단백질에 대하여, T-세포 활성화 항원 및 종양 항원 (TA) 에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체의 결합 정도는, 예를 들면, 방사면역측정법 (RIA) 또는 유세포측정법 (FACS) 에 의한 측정시, T-세포 활성화 항원 또는 종양 항원 (TA) 에 대한 항체의 결합의 약 10 % 미만이다. 특정 실시형태에서, T-세포 활성화 항원 및 종양 항원 (TA) 에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체는 ≤　1 μM, ≤　100 nM, ≤　10 nM, ≤　1 nM, ≤　0.1 nM, ≤　0.01 nM, 또는 ≤　0.001 nM (예를 들면, 10-8 M 이하, 예를 들면, 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들면, 10-9 M 내지 10-13 M) 의 해리 상수 (KD) 를 가진다. 특정 실시형태에서, T-세포 활성화 항원 및 종양 항원 (TA) 에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체는, 상이한 종들로부터의 T-세포 활성화 항원 또는 종양 항원 (TA) 중에서 보존되는 T-세포 활성화 항원 또는 종양 항원 (TA) 의 에피토프에 결합한다.
"T-세포 활성화 항원 및 종양 항원 (TA) 에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체" 란, 이중특이적 항체가 종양 항원을 발현하는 세포 내에서 또는 근처에서 T-세포 매개된 면역 반응을 매개하는데 유용하도록 충분한 친화도로 T-세포 활성화 항원 및 종양 항원 (TA) 에 결합할 수 있는 이중특이적 항원을 의미한다. 특정 실시형태에서, T-세포 활성화 항원은 CD3 T-세포 공동-수용체 (CD3) 항원, 특히 인간 또는 게잡이 원숭이 (cynomolgus) CD3, 가장 특히 인간 CD3 이다. 일부 실시형태에서, T-세포 활성화 항원은 CD3 의 알파 또는 베타 서브유닛이다.
하나의 실시형태에서, T-세포 활성화 항원 및 종양 항원 (TA) 에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체는 CD3 의 에피토프에 결합하기 위해 단일클론 항체 H2C (PCT 공개 공보 WO 2008/119567 에 기재됨) 와 경쟁할 수 있다. 다른 양태에서, T-세포 활성화 항원 및 종양 항원 (TA) 에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체는 CD3 의 에피토프에 결합하기 위해 단일클론 항체 V9 (문헌 [Rodrigues et al., Int J Cancer Suppl 7, 45-50 (1992)] 및 US 특허 US 6,054,297 에 기재됨) 와 경쟁할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, T-세포 활성화 항원 및 종양 항원 (TA) 에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체는 CD3 의 에피토프에 결합하기 위해 단일클론 항체 FN18 (문헌 [Nooij et al., Eur J Immunol 19, 981-984 (1986)] 에 기재됨) 와 경쟁할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 이중특이적 항체는 CD3 의 에피토프에 결합하기 위해 단일클론 항체 CH2527 (서열 번호: 157 및 158) 또는 이의 친화도 성숙된 변이체와 경쟁할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
본원에서 사용되는 "T-세포 활성화 항원" 이란, 항원 결합 분자와 상호작용시 T-세포 활성화를 유도할 수 있는, T 림프구, 특히 세포독성 T 림프구의 표면 상에 발현된 항원 결정인자를 의미한다. 구체적으로, 항원 결합 분자와 T-세포 활성화 항원의 상호작용은 T-세포 수용체 복합체의 신호전달 연쇄반응을 촉발시킴으로써 T-세포 활성화를 유도할 수 있다. 특정 실시형태에서, T-세포 활성화 항원은 CD3 이다.
본원에서 사용되는 "T-세포 활성화" 란, 증식, 분화, 사이토카인 분비, 세포독성 효과기 분자 방출, 세포독성 활성 및 활성화 마커의 발현으로부터 선택되는 T 림프구, 특히 세포독성 T 림프구의 1 개 이상의 세포 반응을 의미한다. 본 발명의 T-세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 T-세포 활성화를 유도할 수 있다. T-세포 활성화를 측정하기 위한 적합한 검정은 본원에서 기재된 당업계에 공지되어 있다.
본원에서 사용되는 용어 "CD3 T-세포 공동-수용체 (CD3)" 란, 단백질 복합체를 의미하며, 4개의 별개의 쇄로 이루어진다. 포유동물에서, 상기 복합체는 CD3γ 쇄, CD3δ 쇄 및 2개의 CD3ε 쇄를 함유한다. 이들 쇄는 T-세포 수용체 (TCR) 및 ζ-쇄로서 공지된 분자와 연합하여 T 림프구에서 활성화 신호를 생성한다. 용어 "CD3 T-세포 공동-수용체 (CD3)" 는, 달리 명시되지 않는다면, 영장류 (예를 들면, 인간) 및 설치류 (예를 들면, 마우스 및 래트) 와 같은 포유동물을 포함한 임의의 척추동물 출처, 바람직하게는 인간 출처로부터의 임의의 본래의 CD3 을 포함한다. 상기 용어는 세포에서의 가공 처리로부터 생성되는 CD3 의 임의의 형태 뿐만 아니라, 미가공된 "전장" CD3 을 포함한다. 상기 용어는 또한 CD3 의 자연 발생적 변이체, 예를 들면, 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 용어 CD3 T-세포 공동-수용체 (CD3) 는 인간 또는 게잡이 원숭이 CD3, 특히 인간 CD3 을 의미한다. 일부 실시형태에서, T 세포 활성화 항원은 CD3 의 엡실론 서브유닛이다. 다른 실시형태에서, T 세포 활성화 항원은 CD3 의 알파 또는 베타 서브유닛이다. 예시적인 인간 CD3 의 서열은 서열 번호: 103 으로 제공된다.
본원에서 사용되는 용어 "종양 항원 (TA)" 이란, 종양-관련 항원 뿐만 아니라 종양-특이적 항원, 즉, 종양 세포에 의해 발현된 임의의 면역원 에피토프 (예를 들면, 단백질) 를 의미한다. 상기 단백질은 비종양 세포에 의해 발현될 수 있지만, 종양 세포에 의해 발현될 때에만 면역원성일 수 있다. 다르게는, 상기 단백질은 정상 세포가 아니라 종양 세포에 의해 발현될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 항-TA 항체는 TA 의 세포외 도메인에 결합한다. 하나의 바람직한 실시형태에서, 상기 종양 항원은 인간 종양 항원이다. 예시적인 종양 항원은 흑색종-관련 콘드로이틴 황산 프로테오글리칸 (MCSP, UniProt Q6UVK1, NCBI Accession NP_001888), 섬유아세포 활성화 단백질 (FAP, Uni Prot Q12884, Q86Z29, Q99998; NCBI Accession NP_004451), 표피 성장 인자 수용체 (EGFR, 또한 ErbB1 및 Her1 로도 공지됨, UniProt P00533; NCBI Accession NP_958439, NP_958440), 암배아 항원 (CEA, 또한 암배아 항원-관련 세포 부착 분자 5 또는 CD66e 로도 공지됨; UniProt P06731, NCBI Accession NP_004354) 및 CD33 (또한 gp76 또는 시알산-결합 Ig-유사 렉틴 3 (Siglec-3), UniProt P20138, NCBI Accession NP_001076087, NP_001171079) 를 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
하나의 실시형태에서, 본 발명의 이중특이적 항체는 흑색종-관련 콘드로이틴 황산 프로테오글리칸 (MCSP) 에 대해 특이적인 1 개 이상의 항원 결합 부위를 포함한다.
항체 특이성이란, 항원의 특정 에피토프에 대한 항체의 선택적인 인지를 의미한다. 천연 항체는, 예를 들면, 단일특이적이다. 본 발명에 따른 "이중특이적 항체" 는 2 개의 상이한 항원-결합 특이성을 가지는 항체이다. 본 발명의 항체는 2 개의 상이한 항원에 대해 특이적이다, 즉 제 1 항원 및 제 2 항원에 대해 특이적이다. 종양 항원 (TA) 및 T-세포 활성화 항원에 대해 결합 특이성을 기지는 이중 특이적 항체가 본원에서 제공된다. 특정 실시형태에서, 이중특이적 항체는 TA의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이중특이적 항체는 또한 TA 를 발현하는 세포에 세포독성제를 국한시키는데 사용될 수 있다.
본원에서 사용는 용어 "단일특이적 항체" 란, 각각 동일한 항원의 동일한 에피토프에 결합하는 1 개 이상의 결합 부위를 가지는 항체를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "이중특이적" 항체란, 각각 동일한 항원 또는 상이한 항원의 상이한 에피토프에 결합하는 2 개 이상의 결합 부위를 가지는 항체를 의미한다.
본원에서 제공되는 항체는 다중특이적 항체, 예를 들면, 이중특이적 항체이다. 다중특이적 항체는 2 개 이상의 상이한 부위에 대해 결합 특이성을 가지는 단일클론 항체이다. 제 1 항원 및 제 2 항원에 대해 결합 특이성을 가지는 이중특이적 항체가 본원에서 제공된다. 특정 실시형태에서, 이중특이적 항체는 제 1 항원 또는 제 2 항원의 2 개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다.
이중특이적 항체는 또한 제 1 항원 또는 제 2 항원을 발현하는 세포에 세포독성제를 국한시키는데 사용될 수 있다.
하나의 실시형태에서, 관련 없는 단백질에 대하여, T-세포 활성화 항원 및 종양 항원 (TA) 에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체의 결합 정도는, 예를 들면, 방사면역측정법 (RIA) 또는 유세포측정법 (FACS) 에 의한 측정시, T-세포 활성화 항원 또는 종양 항원 (TA) 에 대한 항체의 결합의 약 10 % 미만이다. 특정 실시형태에서, T-세포 활성화 항원 및 종양 항원 (TA) 에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체는 ≤　1 μM, ≤　100 nM, ≤　10 nM, ≤　1 nM, ≤　0.1 nM, ≤　0.01 nM, 또는 ≤　0.001 nM (예를 들면, 10-8 M 이하, 예를 들면, 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들면, 10-9 M 내지 10-13 M) 의 해리 상수 (KD) 를 가진다. 특정 실시형태에서, T-세포 활성화 항원 및 종양 항원 (TA) 에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체는, 상이한 종들로부터의 T-세포 활성화 항원 또는 종양 항원 (TA) 중에서 보존되는 T-세포 활성화 항원 또는 종양 항원 (TA) 의 에피토프에 결합한다.
본원에서 사용되는 용어 "가 (valent)" 란, 항체 분자 내의 특정 개수의 결합 부위의 존재를 의미한다. 이와 같이, 용어 "2가", "4가" 및 "6가" 는 항체 분자 내에서 각각 2 개의 결합 부위, 4 개의 결합 부위 및 6 개의 결합 부위의 존재를 의미한다. 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 "2가" 이상이고, "3가" 또는 "다가" (예를 들면, "4가" 또는 "6가") 일 수 있다.
본 발명의 항체는 2 개 이상의 결합 부위를 가지며, 이중특이적이다. 즉, 본 발명의 항체는 심지어 2 개 초과의 결합 부위인 경우 (즉, 항체가 3가 또는 다가인 경우) 에서도 이중특이적일 수 있다.
기준 항체로서의 "동일한 에피토프에 결합하는 항체" 란, 항원에 대한 기준 항체의 결합을 경쟁 검정에서 50 % 이상 차단하는 항체를 지칭하고, 역으로, 기준 항체는 항원에 대한 항체의 결합을 경쟁 검정에서 50 % 이상 차단한다. 예시적인 경쟁 검정이 본원에서 제시된다.
"실질적 교차-반응성 부재" 란, 특히 표적 항원과 비교할 때, 분자 (예를 들면, 항체) 가 그 분자의 실제 표적 항원과 상이한 항원 (예를 들면, 표적 항원과 밀접한 항원) 을 인지하거나 특이적으로 결합하지 않는 것을 의미한다. 예를 들면, 항체는 실제 표적 항원과 상이한 항원에 약 10 % 미만 내지 약 5 % 미만 결합할 수 있거나, 약 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0.5 %, 0.2 % 또는 0.1 % 미만, 바람직하게는 약 2 %, 1 % 또는 0.5 % 미만, 가장 바람직하게는 약 0.2% 또는 0.1% 미만으로 이루어진 군으로부터 선택된 양으로 실제 표적 항원과 상이한 상기 항원에 결합할 수 있다.
기준 폴리펩타이드 서열과 관련하는 "퍼센트 (%) 아미노산 서열 상동성" 은, 서열을 나란히 정렬시키고, 필요에 따라, 갭을 도입하여 최대 퍼센트 서열 상동성을 달성고, 임의의 보존적 치환을 서열 상동성의 일부로서 고려하지 않은 후, 기준 폴리펩타이드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 상동성을 측정하기 위한 정렬은 당업계 내에 있는 각종 방식으로, 예를 들면, 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예를 들면, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 이용하여 달성될 수 있다. 당업자는 비교할 전장의 서열에 대하여 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 서열을 정렬하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원에서의 목적상, % 아미노산 서열 상동성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2 를 이용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램의 저작자는 Genentech, Inc. 이었고, 소스 코드는 사용자 문서와 함께 미국 저작권청 (U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559) 에 제출되었는데, 여기서, 미국 저작권 등록 번호 TXU510087 로 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 South San Francisco, California 의 Genentech, Inc. 로부터 공개적으로 입수가능하거나, 소스 코드로부터 컴파일될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D 를 포함한 UNIX 운영 체제 상에서 사용하기 위해 컴파일되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고, 다르지 않다.
ALIGN-2 를 아미노산 서열 비교에 이용하는 상황에서, 주어진 아미노산 서열 B 에 대한, 이와의 또는 이에 대항하는 주어진 아미노산 서열 A 의 % 아미노산 서열 상동성 (이것은 주어진 아미노산 서열 B 에 대한, 이와의 또는 이에 대항하는 특정 % 아미노산 서열 상동성을 가지거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A 로서 대체하여 표현될 수 있다) 은 하기와 같이 산출된다:
100 × 분수 X/Y
여기서, X는 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2 에 의해 그 프로그램의 A 와 B 의 정렬에서 동일한 매치 (match) 로서 채점된 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B 내의 아미노산 잔기의 총수이다. 아미노산 서열 A 의 길이가 아미노산 서열 B 의 길이와 동일하지 않은 경우, B 에 대한 A 의 % 아미노산 서열 상동성은 A 에 대한 B 의 % 아미노산 서열 상동성과 동일하지 않은 것으로 인식될 것이다. 구체적으로 달리 명시되지 않는다면, 본원에서 사용되는 모든 % 아미노산 서열 상동성 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 직전 단락에서 기재된 바와 같이 수득된다.
"단리된" 항체는 이의 자연 환경의 구성성분으로부터 분리된 것이다. 일부 실시형태에서, 항체는, 예를 들면, 전기영동 (예를 들면, SDS-PAGE, 등전위 초점 (IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피 (예를 들면, 이온 교환 또는 역상 HPLC) 에 의한 측정시 95 % 또는 99 % 초과의 순도까지 정제된다. 항체 순도의 평가 방법의 검토를 위해, 예를 들면, 문헌 [Flatman et al., J. Chromatogr. B 848: 79-87 (2007)] 을 참조한다.
"단리된" 핵산이란, 이의 자연 환경의 구성성분으로부터 분리된 핵산 분자를 의미한다. 단리된 핵산은 통상적으로 핵산 분자를 함유하는 세포에 함유된 핵산 분자를 포함하지만, 상기 핵산 분자는 염색체외에 또는 이의 자연적 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다.
"본 발명의 이중특이적 항체를 암호화하는 단리된 핵산" 이란, 단일 벡터 또는 별도의 벡터들 내의 핵산 분자 (들), 및 숙주 세포 내의 1 개 이상의 위치에 존재하는 핵산 분자 (들) 을 포함하여, 항체 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 상기 1 개 이상의 핵산 분자 (또는 이의 단편) 을 의미한다.
"T-세포 활성화 항원 및 종양 항원 (TA) 에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체를 암호화하는 단리된 핵산" 이란, 단일 벡터 또는 별도의 벡터들 내의 핵산 분자 (들), 및 숙주 세포 내의 1 개 이상의 위치에 존재하는 핵산 분자 (들) 을 포함하여, 항체 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 상기 1 개 이상의 핵산 분자 (또는 이의 단편) 을 의미한다.
본원 내에서 사용되는 용어 "아미노산" 이란, 알라닌 (3 자리 문자 코드: ala, 1 자리 문자 코드: A), 아르기닌 (arg, R), 아스파라긴 (asn, N), 아스파르트산 (asp, D), 시스테인 (cys, C), 글루타민 (gln, Q), 글루탐산 (glu, E), 글라이신 (gly, G), 히스티딘 (his, H), 아이소류신 (ile, I), 류신 (leu, L), 라이신 (lys, K), 메티오닌 (met, M), 페닐알라닌 (phe, F), 프롤린 (pro, P), 세린 (ser, S), 트레오닌 (thr, T), 트립토판 (trp, W), 타이로신 (tyr, Y) 및 발린 (val, V) 을 포함하는 자연 발생적 카복시 α-아미노산의 군을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "벡터" 란, 연결되어 있는 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 상기 용어는 자기-복제 핵산 구조로서의 벡터 뿐만 아니라, 도입된 숙주 세포의 게놈 내에 통합된 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 작동가능게 연결되어 있는 핵산의 발현을 유도할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터" 로서 언급된다.
본원에서 사용되는 표현 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물" 은 상호교환적으로 사용되며, 모든 이러한 명칭은 자손을 포함한다. 따라서, 단어 "형질감염체" 및 "형질감염 세포" 는 1차 피험자 세포 및 계대수에 관계없이 그로부터 유래된 배양물을 포함한다. 모든 자손은 인공 또는 우발 돌연변이로 인해 DNA 내용에서 정확히 동일할 수 없는 것으로 또한 이해된다. 최초로 형질전환된 세포에서 스크리닝된 바와 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 가지는 변이체 자손이 포함된다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물" 은 상호교환적으로 사용되며, 세포의 자손을 포함한, 외인성 핵산이 내부에 도입된 세포를 의미한다. 숙주 세포는 1차 형질전환 세포 및 계대수에 관계없이 그로부터 유래된 자손을 포함한 "형질전환체" 및 "형질전환 세포" 를 포함한다. 자손은 핵산 내용에서 부모 세포와 완전히 동일할 수 없지만, 돌연변이를 함유할 수 있다. 최초로 형질전환된 세포에서 스크리닝되거나 선별된 바와 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 가지는 돌연변이체 자손이 여기에 포함된다.
"네이키드 항체 (naked antibody) " 란, 이종 모이어티 (예를 들면, 세포독성 모이어티) 또는 방사성표지에 접합되지 않은 항체를 의미한다. 네이키드 항체는 약제학적 제형 중에 존재할 수 있다.
"면역접합체" 는 세포독성제를 포함하지만 이에 한정되지 않는 1 개 이상의 이종 분자 (들) 에 접합된 항체이다.
본원에서 사용되는 용어 "세포독성제" 란, 세포 기능을 억제 또는 방해하고/하거나 세포 사멸 또는 파괴를 야기하는 물질을 의미한다. 세포독성제는 방사성 동위원소 (예를 들면, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu 의 방사성 동위원소); 화학치료제 또는 약물 (예를 들면, 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 빈카 알칼로이드 (빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포사이드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 다른 중격제); 성장 억제제; 효소 및 이의 단편, 예를 들면, 핵산분해 효소; 항생제; 독소, 예를 들면, 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 소형 분자 독소 또는 효소적 활성 독소, 및 이들의 단편 및/또는 변이체; 및 하기에 개시된 각종 항종양제 또는 항암제를 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
용어 "N-말단" 이란, N-말단의 마지막 아미노산을 의미하며, 용어 "C-말단" 이란, C-말단의 마지막 아미노산을 의미한다.
용어 "약제학적 제형" 이란, 내부에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성을 유효하도록 허용하는 형태인 제제로서, 제형을 투여할 피험자에게 수용불가능할 정도로 독성인 추가의 성분을 함유하지 않은 제제를 의미한다.
"약제학적으로 허용가능한 담체" 란, 피험자에게 무독성인, 활성 성분 이외의, 약제학적 제형 중의 성분을 의미한다. 약제학적으로 허용가능한 담체는 완충액, 부형제, 안정화제 또는 보존제를 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
본원에 사용되는 "치료" (및 이의 문법적 변형, 예를 들면, "치료하다" 또는 "치료함") 이란, 치료하고자 하는 개체의 자연적 경과를 변형하기 위한 시도에서의 임상적 개입을 의미하며, 예방을 위해 수행되거나 임상 병리학의 과정 동안 수행될 수 있다. 목적하는 치료 효과는 질환의 발생 또는 재발의 방지, 증상의 경감, 질환의 임의의 직접적 또는 간접적 병리학적 결과의 축소, 전이 방지, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 관해 또는 개선된 예후를 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 항체는 질환의 발달을 지연시키거나 질환의 진행을 둔화시키기 위해 사용된다.
"개체" 또는 "피험자" 는 포유동물이다. 포유동물은 가축 (예를 들면, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류 (예를 들면, 인간 및 비-인간 영장류, 예를 들면, 원숭이), 토끼 및 설치류 (예를 들면, 마우스 및 래트) 를 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 특정 실시형태에서, 개체 또는 피험자는 인간이다.
제제, 예를 들면, 약제학적 제형의 "유효량" 이란, 목적하는 치료 또는 예방 결과를 달성하는데 필요한 시간 동안 투약량에서의 유효량을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "암" 이란, 증식성 질환, 예를 들면, 림프종, 림프구성 백혈병, 폐암, 비소세포 폐암 (non small cell lung: NSCL), 기관지 세포 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부의 암, 위암, 위장암, 결장암, 유방암, 자궁암, 난관의 암종, 자궁내막의 암종, 자궁경부의 암종, 질의 암종, 외음부의 암종, 호지킨스병, 식도암, 소장암, 내분비계 암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직의 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 방광암, 신장또는 수뇨관의 암, 신장 세포 암종, 신우 암종, 중피종, 간세포암, 담관암, 중추계 (central nervous system: CNS) 신생물, 척추 종양, 뇌간 교세포종, 다형성 아교모세포종, 성상세포종, 신경초종, 뇌실막세포종, 속질모세포종, 수막종, 편평세포 암종, 뇌하수체 선종 및 유잉 육종, 및 상기 암들 중의 임의의 불응성 버전, 또는 상기 암들 중의 1 개 이상의 조합을 의미한다.
용어 "패키지 삽입물" 이란, 치료용 제품의 사용에 관한 지시, 용법, 복용량, 투여법, 병용 요법, 금기사항 및/또는 주의사항에 대한 정보를 함유하는, 치료용 제품의 상업적 패키지 내에 통상적으로 포함되는 설명서를 언급하기 위해 사용된다.
II. 조성물 및 방법
A. 예시적인 이중특이적 항체
본 발명은 2 개 이상의 Fab 단편을 포함하는 이중특이적 항체에 관한 것으로서, 여기서, 제 1 Fab 단편은 제 1 항원에 대해 특이적인 1 개 이상의 항원 결합 부위를 포함하고; 제 2 Fab 단편은 제 2 항원에 대해 특이적인 1 개 이상의 항원 결합 부위를 포함하고, 여기서, 상기 제 2 Fab 단편의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역은 교환되어 있고; 상기 2 개의 Fab 단편은 2 개의 펩타이드 링커에 의해 서로 연결되어 있고; 상기 이중특이적 항체는 Fc 도메인이 결여되어 있다. 바람직하게는, 상기 펩타이드 링커는 5 개 이상의 아미노산 길이, 바람직하게는 5 개 내지 100 개 길이, 보다 바람직하게는 10 개 내지 50 개의 아미노산 길이의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드이다. 하나의 실시형태에서, 상기 펩타이드 링커는 (GxS)n 또는 (GxS)nGm 으로서, 여기서, G = 글라이신, S = 세린, 및 (x = 3, n = 3, 4, 5 또는 6, 및 m = 0, 1, 2 또는 3) 또는 (x = 4, n = 2, 3, 4 또는 5, 및 m = 0, 1, 2 또는 3), 바람직하게는 x = 4 및 n = 2 또는 3, 보다 바람직하게는 x = 4, n = 2 이다. 하나의 실시형태에서, 상기 펩타이드 링커는 (G4S)2 이다. 펩타이드 링커는 제 1 Fab 단편 및 제 2 Fab 단편을 연결하는데 사용된다.
하나의 실시형태에서, 제 1 Fab 단편은 2 개의 펩타이드 링커에 의해 제 2 Fab 단편의 N-말단에 연결된다. 제 2 Fab 단편의 중쇄 및 경쇄의 가변 또는 불변 도메인이 교환되는지 여부에 따라, 상이한 이중특이적 항체 분자는 제 1 Fab 단편이 2 개의 펩타이드 링커에 의해 제 2 Fab 단편의 N-말단에 연결될 때에 가능하다.
하나의 실시형태에서, 제 2 Fab 단편의 가변 도메인은 교환되고 (즉, 제 2 Fab 단편은 CrossFab (VHVL) 이다), 제 1 Fab 단편의 중쇄의 C-말단은 펩타이드 링커에 의해 제 2 Fab 단편의 VLCH1 쇄의 N-말단에 연결되고, 제 1 Fab 단편의 경쇄의 C-말단은 펩타이드 링커에 의해 제 2 Fab 단편의 VHCL 쇄의 N-말단에 연결된다. 따라서, 하나의 실시형태에서, 이중특이적 항체는 다음 2 개의 쇄를 포함한다: 펩타이드 링커를 통해 제 2 Fab 단편의 VHCL 쇄에 연결된 제 1 Fab 단편의 경쇄 (VLCL) (VLCL-링커-VHCL), 및 펩타이드 링커를 통해 제 2 Fab 단편의 VLCH1 쇄에 연결된 제 1 Fab 단편의 중쇄 (VHCH1) (VHCH1-링커-VLCH1).
다른 실시형태에서, 제 2 Fab 단편의 불변 도메인은 교환되고 (즉, 제 2 Fab 단편은 CrossFab (CLCH1) 이다), 제 1 Fab 단편의 중쇄의 C-말단은 펩타이드 링커를 통해 제 2 Fab 단편의 VHCL 쇄의 N-말단에 연결되고, 제 1 Fab 단편의 경쇄는 펩타이드 링커에 의해 VLCH1 쇄의 N-말단에 연결된다. 따라서, 하나의 실시형태에서, 이중특이적 항체는 다음 2 개의 쇄를 포함한다: 펩타이드 링커를 통해 제 2 Fab 단편의 VLCH1 쇄에 연결된 제 1 Fab 단편의 경쇄 (VLCL) (VLCL-링커-VLCH1), 및 펩타이드 링커를 통해 제 2 Fab 단편의 VHCL 쇄에 연결된 제 1 Fab 단편의 중쇄 (VHCH1) (VHCH1-링커-VHCL).
하나의 실시형태에서, 제 1 Fab 단편은 2 개의 펩타이드 링커에 의해 제 2 Fab 단편의 C-말단에 연결된다. 제 2 Fab 단편의 중쇄 및 경쇄의 가변 또는 불변 도메인이 교환되는지 여부에 따라, 상이한 이중특이적 항체 분자는 제 1 Fab 단편이 2 개의 펩타이드 링커에 의해 제 2 Fab 단편의 C-말단에 연결될 때에 가능하다.
하나의 실시형태에서, 제 2 Fab 단편의 가변 도메인은 교환되고 (즉, 제 2 Fab 단편은 CrossFab (VHVL) 이다), 제 1 Fab 단편의 중쇄의 N-말단은 펩타이드 링커에 의해 제 2 Fab 단편의 VLCH1 쇄의 C-말단에 연결되고, 제 1 Fab 단편의 경쇄의 N-말단은 펩타이드 링커에 의해 제 2 Fab 단편의 VHCL 쇄의 C-말단에 연결된다. 따라서, 하나의 실시형태에서, 이중특이적 항체는 다음 2 개의 쇄를 포함한다: 펩타이드 링커를 통해 제 1 Fab 단편의 경쇄 (VLCL) 에 연결된 제 2 Fab 단편의 VHCL 쇄 (VHCL-링커-VLCL), 및 펩타이드 링커를 통해 제 1 Fab 단편의 중쇄 (VHCH1) 에 연결된 제 2 Fab 단편의 VLCH1 쇄 (VLCH1-링커-VHCH1).
다른 실시형태에서, 제 2 Fab 단편의 불변 도메인은 교환되고 (즉, 제 2 Fab 단편은 CrossFab (CLCH1) 이다), 제 1 Fab 단편의 중쇄의 N-말단은 펩타이드 링커에 의해 제 2 Fab 단편의 VHCL 쇄의 C-말단에 연결되고, 제 1 Fab 단편의 경쇄의 N-말단은 펩타이드 링커에 의해 VLCH1 쇄의 C-말단에 연결된다. 따라서, 하나의 실시형태에서, 이중특이적 항체는 다음 2 개의 쇄를 포함한다: 펩타이드 링커를 통해 제 1 Fab 단편의 경쇄 (VLCL) 에 연결된 제 2 Fab 단편의 VLCH1 쇄 (VLCH1-링커-VLCL), 및 펩타이드 링커를 통해 제 1 Fab 단편의 중쇄 (VHCH1) 에 연결된 제 2 Fab 단편의 VHCL 쇄 (VHCL-링커-VHCH1). 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 2가 이상이고, 3가 또는 다가, 예를 들면, 4가일 수 있다. 하나의 실시형태에서, 상기 이중특이적 항체는 각각 제 1 항원 및 제 2 항원을 각각 표적화하는 1 개의 결합 부위를 가지는 2가 (1+1 형식) 이다. 다른 실시형태에서, 상기 이중특이적 항체는, 하기 섹션에서 보다 상세히 기재되는 바와 같이, 제 1 항원을 표적화하는 2 개의 결합 부위와 제 2 항원을 표적화하는 1 개의 결합 부위를 가지는 3가 (2+1 형식) 이다.
하나의 실시형태에서, 상기 항체는 제 3 Fab 단편을 추가로 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 제 3 Fab 단편은 제 1 항원 또는 제 2 항원에 대해, 바람직하게는 제 1 항원에 대해 특이적인 1 개 이상의 항원 결합 부위를 포함한다.
하나의 실시형태에서, 제 3 Fab 단편은 제 1 Fab 단편의 N-말단 또는 C-말단에 연결된다. 하나의 실시형태에서, 제 3 Fab 단편은 1 개 이상의 펩타이드 링커를 통해 제 1 Fab 단편에 연결된다. 바람직하게는, 상기 펩타이드 링커는 (G4S)2 링커이다.
하나의 실시형태에서, 제 3 Fab 단편은 제 1 Fab 단편의 경쇄 또는 중쇄의 N-말단 또는 C-말단에 연결된다. 제 1 Fab 단편의 어떠한 말단이 (상기 상세히 기재된 바와 같이) 제 2 Fab 단편에 연결되는지에 따라, 제 3 Fab 단편은 제 1 단편의 맞은편 (자유로운) 말단 상에 연결된다. 제 3 Fab 단편은 1 개 또는 2 개의 링커에 의해 연결될 수 있다.
하나의 실시형태에서, 본 발명의 이중특이적 항체는 3 개의 Fab 단편을 포함하는데, 여기서, 상기 Fab 단편 및 상기 링커는 다음 순서대로 N-말단에서부터 C-말단 방향으로 연결된다: Fab 단편 3-(1 개 또는 2 개의 링커)-Fab 단편 1-(2개의 링커)-Fab 단편 2, 여기서, 제 2 Fab 단편의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역은 교환되어 있다. 본 실시형태에서, 제 3 Fab 단편의 C-말단은 제 1 Fab 단편의 N-말단에 연결된다. 상기에서 상세히 설명한 바와 같이, Fab 단편은 중쇄 또는 경쇄를 통해 서로 연결될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 제 3 Fab 단편의 중쇄의 C-말단은 펩타이드 링커를 통해 제 1 Fab 단편의 중쇄의 N-말단에 연결되고; 제 1 Fab 단편은 2 개의 링커에 의해 제 2 Fab 단편에 연결되고, 여기서, 제 2 Fab 단편의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역이 교환된다. 제 2 Fab 단편의 중쇄 및 경쇄의 가변 또는 불변 도메인이 교환되는지 여부에 따라, 상이한 이중특이적 항체 분자가 가능하다.
하나의 실시형태에서, 제 2 Fab 단편의 가변 도메인은 교환되고 (즉, 제 2 Fab 단편은 CrossFab (VHVL) 이다), 3 개의 Fab 단편의 쇄는 다음 순서대로 N-말단에서부터 C-말단 방향으로 연결된다: VHCH1-링커-VHCH1-링커-VLCH1. 하나의 실시형태에서, 이중특이적 항체는 다음 3 개의 쇄를 포함한다: 제 3 Fab 단편의 경쇄 (VLCL), 펩타이드 링커에 의해 제 2 Fab 단편의 VHCL 쇄에 연결된 제 1 Fab 단편의 경쇄 (VLCL) (VLCL-링커-VHCL), 및 그 자체가 펩타이드 링커를 통해 제 2 Fab 단편의 VLCH1에 연결되어 있는 제 1 Fab 단편의 중쇄에 연결된 제 3 단편의 중쇄 (VHCH1-링커-VHCH1-링커-VLCH1). 다른 실시형태에서, 상기 제 3 Fab 단편은 2 개의 링커에 의해 제 1 Fab 단편에 연결되고, 이중특이적 항체는 다음 2개의 쇄를 포함한다: 펩타이드 링커에 의해 제 2 Fab 단편의 VHCL 쇄에 차례차례 연결되어 있는 제 1 Fab 단편의 경쇄 (VLCL) 에 링커에 의해 연결된 제 3 Fab 단편의 경쇄 (VLCL) (VLCL-링커-VLCL-링커-VHCL), 및 그 자체가 펩타이드 링커를 통해 제 2 Fab 단편의 VLCH1 쇄에 연결되어 있는 제 1 Fab 단편의 중쇄에 연결된 제 3 단편의 중쇄 (VHCH1-링커-VHCH1-링커-VLCH1).
하나의 실시형태에서, 제 2 Fab 단편의 불변 도메인은 교환되고 (즉, 제 2 Fab 단편은 CrossFab (CLCH1) 이다), 3 개의 Fab 단편의 쇄는 다음 순서대로 N-말단에서부터 C-말단 방향으로 연결된다: VHCH1-링커-VHCH1-링커-VHCL. 하나의 실시형태에서, 이중특이적 항체는 다음 3 개의 쇄를 포함한다: 제 3 Fab 단편의 경쇄 (VLCL), 펩타이드 링커에 의해 제 2 Fab 단편의 VLCH1 쇄에 연결된 제 1 Fab 단편의 경쇄 (VLCL) (VLCL-링커-VLCH1), 및 그 자체가 펩타이드 링커를 통해 제 2 Fab 단편의 VHCL 쇄에 연결되어 있는 제 1 Fab 단편의 중쇄에 연결된 제 3 단편의 중쇄 (VHCH1-링커-VHCH1-링커-VHCL). 다른 실시형태에서, 상기 제 3 Fab 단편은 2 개의 링커에 의해 제 1 Fab 단편에 연결되고, 이중특이적 항체는 다음 2개의 쇄를 포함한다: 펩타이드 링커에 의해 제 2 Fab 단편의 VLCH1 쇄에 차례차례 연결되어 있는 제 1 Fab 단편의 경쇄 (VLCL) 에 연결된 제 3 Fab 단편의 경쇄 (VLCL) (VLCL-링커-VLCL-링커-VLCH1), 및 그 자체가 펩타이드 링커를 통해 제 2 Fab 단편의 VHCL 쇄에 연결되어 있는 제 1 Fab 단편의 중쇄에 연결된 제 3 단편의 중쇄 (VHCH1-링커-VHCH1-링커-VHCL).
하나의 실시형태에서, 본 발명의 이중특이적 항체는 3 개의 Fab 단편을 포함하는데, 여기서, 상기 Fab 단편 및 상기 링커는 다음 순서대로 N-말단에서부터 C-말단 방향으로 연결된다: Fab 단편 2-(2개의 링커)-Fab 단편 1-(1 개 또는 2 개의 링커)-Fab 단편 3, 여기서, 제 2 Fab 단편의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역은 교환된다. 본 실시형태에서, 제 3 Fab 단편의 N-말단은 제 1 Fab 단편의 C-말단에 연결된다. 상기에서 상세하게 설명한 바와 같이, Fab 단편은 중쇄 또는 경쇄를 통해 서로 연결될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 제 3 Fab 단편의 중쇄의 N-말단은 펩타이드 링커를 통해 제 1 Fab 단편의 중쇄의 C-말단에 연결되고; 제 1 Fab 단편은 2 개의 링커에 의해 제 2 Fab 단편에 연결되고, 여기서, 제 2 Fab 단편의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역은 교환된다. 제 2 Fab 단편의 중쇄 및 경쇄의 가변 또는 불변 도메인이 교환되는지 여부에 따라, 상이한 이중특이적 항체 분자가 가능하다.
하나의 실시형태에서, 제 2 Fab 단편의 가변 도메인은 교환되고 (즉, 제 2 Fab 단편은 CrossFab (VHVL) 이다), 3 개의 Fab 단편의 쇄는 다음 순서대로 N-말단에서부터 C-말단 방향으로 연결된다: VLCH1-링커-VHCH1-링커-VHCH1. 하나의 실시형태에서, 이중특이적 항체는 다음 3 개의 쇄를 포함한다: 제 3 Fab 단편의 경쇄 (VLCL), 펩타이드 링커에 의해 제 1 Fab 단편의 경쇄 (VLCL) 에 연결된 제 2 Fab 단편의 VHCL 쇄 (VHCL-링커-VLCL), 및 그 자체가 펩타이드 링커를 통해 제 1 Fab 단편의 중쇄에 연결되어 있는 제 1 단편의 중쇄에 연결된 제 2 Fab 단편의 VLCH1 쇄 (VLCH1-링커-VHCH1-링커-VHCH1). 다른 실시형태에서, 상기 제 3 Fab 단편은 2 개의 링커에 의해 제 1 Fab 단편에 연결되고, 이중특이적 항체는 다음 2개의 쇄를 포함한다: 펩타이드 링커에 의해 제 3 Fab 단편의 경쇄 (VLCL) 에 차례차례 연결되어 있는 제 1 Fab 단편의 경쇄 (VLCL) 에 펩타이드 링커에 의해 연결된 제 2 Fab 단편의 VHCL 쇄 (VHCL-링커-VLCL-링커-VLCL), 및 그 자체가 펩타이드 링커를 통해 제 1 Fab 단편의 중쇄에 연결되어 있는 제 1 단편의 중쇄에 연결된 제 2 Fab 단편의 VLCH1 쇄 (VLCH1-링커-VHCH1-링커-VHCH1).
하나의 실시형태에서, 제 2 Fab 단편의 불변 도메인은 교환되고 (즉, 제 2 Fab 단편은 CrossFab (CLCH1) 이다), 3 개의 Fab 단편의 쇄는 다음 순서대로 N-말단에서부터 C-말단 방향으로 연결된다: VHCL-링커-VHCH1-링커-VHCH1. 하나의 실시형태에서, 이중특이적 항체는 다음 3 개의 쇄를 포함한다: 제 3 Fab 단편의 경쇄 (VLCL), 제 1 Fab 단편의 경쇄 (VLCL) 에 연결된 제 2 Fab 단편의 VLCH1 쇄 (VLCH1-링커-VLCL), 및 그 자체가 펩타이드 링커를 통해 제 1 Fab 단편의 중쇄에 연결되어 있는 제 1 단편의 중쇄에 연결된 제 2 Fab 단편의 VHCL 쇄 (VHCL-링커-VHCH1-링커-VHCH1). 다른 실시형태에서, 상기 제 3 Fab 단편은 2 개의 링커에 의해 제 1 Fab 단편에 연결되고, 이중특이적 항체는 다음 2개의 쇄를 포함한다: 제 3 단편의 경쇄에 차례차례 연결되어 있는 제 1 Fab 단편의 경쇄 (VLCL) 에 연결된 제 2 Fab 단편의 VLCH1 쇄 (VLCH1-링커-VLCL-링커-VLCL), 및 그 자체가 펩타이드 링커를 통해 제 1 Fab 단편의 중쇄에 연결되어 있는 제 1 단편의 중쇄에 연결된 제 2 Fab 단편의 VHCL 쇄 (VHCL-링커-VHCH1-링커-VHCH1).
다른 실시형태에서, 제 3 Fab 단편은 제 2 Fab 단편의 경쇄 또는 중쇄의 N-말단 또는 C-말단에 연결된다. 하나의 실시형태에서, 제 3 Fab 단편은 펩타이드 링커를 통해 제 2 Fab 단편에 연결된다. 바람직하게는, 상기 펩타이드 링커는 (G4S)2 링커이다. 상기에서 상세히 설명한 바와 같이, Fab 단편은 중쇄 또는 경쇄를 통해 서로 연결될 수 있다.
하나의 실시형태에서, 본 발명의 이중특이적 항체는 3 개의 Fab 단편을 포함하는데, 여기서, 상기 Fab 단편 및 상기 링커는 다음 순서대로 N-말단에서부터 C-말단 방향으로 연결된다: Fab 단편 1-(2개의 링커)-Fab 단편 2-(1 개 또는 2 개의 링커)-Fab 단편 3, 여기서, 제 2 Fab 단편의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역은 교환된다. 하나의 실시형태에서, 제 3 Fab 단편의 N-말단은 제 2 Fab 단편의 C-말단에 연결된다.
다른 실시형태에서, 제 3 Fab 단편의 중쇄의 C-말단은 펩타이드 링커를 통해 제 2 Fab 단편의 N-말단에 연결되고; 제 1 Fab 단편은 2 개의 링커에 의해 제 2 Fab 단편에 연결되고, 여기서, 제 2 Fab 단편의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역은 교환된다.
제 2 Fab 단편의 중쇄 및 경쇄의 가변 또는 불변 도메인이 교환되는지 여부에 따라, 상이한 이중특이적 항체 분자가 가능하다.
하나의 실시형태에서, 제 2 Fab 단편의 가변 도메인은 교환되고 (즉, 제 2 Fab 단편은 CrossFab (VHVL) 이다), 3 개의 Fab 단편의 쇄는 다음 순서대로 N-말단에서부터 C-말단 방향으로 연결된다: VHCH1-링커-VLCH1-링커-VHCH1. 하나의 실시형태에서, 이중특이적 항체는 다음 3 개의 쇄를 포함한다: 제 3 Fab 단편의 경쇄 (VLCL), 링커에 의해 제 2 Fab 단편의 VHCL 쇄에 연결된 제 1 Fab 단편의 경쇄 (VLCL) (VLCL-링커-VHCL), 및 제 2 Fab 단편의 VLCH1 쇄의 N-말단 및 펩타이드 링커를 통해 제 1 Fab 단편의 중쇄의 N-말단에 연결되어 있는 상기 VLCH1 쇄의 C-말단에 연결된 제 3 단편의 중쇄 (VHCH1-링커-VLCH1-링커-VHCH1). 다른 실시형태에서, 상기 제 3 Fab 단편은 2 개의 링커에 의해 제 2 Fab 단편에 연결되고, 이중특이적 항체는 다음 2개의 쇄를 포함한다: 제 3 Fab 단편의 경쇄에 차례차례 연결되어 있는 제 2 Fab 단편의 VHCL 쇄에 링커에 의해 연결된 제 1 Fab 단편의 경쇄 (VLCL) (VLCL-링커-VHCL-링커-VLCL), 및 제 2 Fab 단편의 VLCH1 쇄의 N-말단 및 펩타이드 링커를 통해 제 1 Fab 단편의 중쇄의 N-말단에 연결되어 있는 상기 VLCH1 쇄의 C-말단에 연결된 제 3 단편의 중쇄 (VHCH1-링커-VLCH1-링커-VHCH1).
하나의 실시형태에서, 제 2 Fab 단편의 불변 도메인은 교환되고 (즉, 제 2 Fab 단편은 CrossFab (CLCH1) 이다), 3 개의 Fab 단편의 쇄는 다음 순서대로 N-말단에서부터 C-말단 방향으로 연결된다: VHCH1-링커-VHCL-링커-VHCH1. 하나의 실시형태에서, 이중특이적 항체는 다음 3 개의 쇄를 포함한다: 제 3 Fab 단편의 경쇄 (VLCL), 펩타이드 링커에 의해 제 2 Fab 단편의 VLCH1 쇄에 연결된 제 1 Fab 단편의 경쇄 (VLCL) (VLCL-링커-VHCH1), 및 제 2 Fab 단편의 VHCL 쇄의 N-말단 및 펩타이드 링커를 통해 제 1 Fab 단편의 중쇄의 N-말단에 연결되어 있는 상기 VHCL 쇄의 C-말단에 연결된 제 3 단편의 중쇄 (VHCH1-링커-VHCL-링커-VHCH1). 다른 실시형태에서, 상기 제 3 Fab 단편은 2 개의 링커에 의해 제 2 Fab 단편에 연결되고, 이중특이적 항체는 다음 2개의 쇄를 포함한다: 제 3 Fab 단편의 경쇄에 차례차례 연결되어 있는 제 2 Fab 단편의 VLCH1 쇄에 펩타이드 링커에 의해 연결된 제 1 Fab 단편의 경쇄 (VLCL) (VLCL-링커-VHCH1-링커-VLCL), 및 제 2 Fab 단γ편의 VHCL 쇄의 N-말단 및 펩타이드 링커를 통해 제 1 Fab 단편의 중쇄의 N-말단에 연결되어 있는 상기 VHCL 쇄의 C-말단에 연결된 제 3 단편의 중쇄 (VHCH1-링커-VHCL-링커-VHCH1).
B. T-세포 활성화 항원 및 종양 항원 (TA) 에 결합하는 예시적 이중특이적 항체
본 발명은 T-세포 활성화 항원 결합 부위와 종양 항원 (TA) 을 표적화하는 제 2 항원 결합 부위를 조합한 이중특이적 항체에 관한 것이다. 본 발명의 항체는 종양 세포의 표면 상의 종양 항원에 특이적으로 결합하고, 동시에 세포독성 T 림프구의 표면 상의 항원에 결합한다. 바람직하게는, 상기 항원은 CD3 T-세포 공동-수용체 (CD3) 항원이다. 이중특이적 항체는 종양의 부위에서 특이적으로 면역 반응을 유도하고, 이후에 표적 세포의 아폽토시스를 야기할 수 있다. 본 섹션에서 예시된 서열은 상기 섹션 A 의 실시형태에서 예시된 항체 형식으로 배열될 수 있는 것으로 이해된다.
본 발명에 따른 특정 실시형태에서, T-세포 활성화 이중특이적 항체는 종양 세포 항원 및 T-세포 활성화 항원에 동시 결합할 수 있다. 하나의 실시형태에서, T-세포 활성화 이중특이적 항체는 종양 세포 항원 및 T-세포 활성화 항원에 동시 결합함으로써 T-세포 및 종양 세포를 가교결합시킬 수 있다. 훨씬 보다 특정한 실시형태에서, 이러한 동시 결합은 종양 세포의 용균을 초래한다. 하나의 실시형태에서, 이러한 동시 결합은 T-세포의 활성화를 초래한다. 다른 실시형태에서, 이러한 동시 결합은 증식, 분화, 사이토카인 분비, 세포독성 효과기 분자 방출, 세포독성 활성 및 활성화 마커의 발현의 군으로부터 선택되는 T 림프구, 특히 세포독성 T 림프구의 세포 반응을 초래한다. 하나의 실시형태에서, 표적 세포 항원에 대한 동시 결합 없이 T-세포 활성화 항원에 대한 T-세포 활성화 이중특이적 항체의 결합은 T-세포 활성화를 초래하지 않는다.
하나의 실시형태에서, T-세포 활성화 이중특이적 항체는 표적 세포에 대한 T-세포의 세포독성 활성을 재유도할 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 재유도는 표적 세포에 의한 MHC-매개된 펩타이드 항원 제시 및/또는 T-세포의 특이성과는 관계없다. 특히, 본 발명의 임의의 실시형태에 따른 T-세포는 세포 독성 T-세포이다. 일부 실시형태에서, T-세포는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포, 특히 CD8+ T 세포이다.
하나의 실시형태에서, 상기 섹션 A에서 상세하게 설명한 바와 같은 제 1 Fab 단편 및 제 2 Fab 단편을 포함하는, T-세포 활성화 항원 및 종양 항원 (TA) 에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체가 제공되는데, 여기서, 제 2 Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역은 교환되어 있고, 상기 2 개의 Fab 단편은 2 개의 펩타이드 링커에 의해 서로 연결되어 있고, 상기 이중특이적 항체는 Fc 도메인을 포함하지 않는다.
하나의 측면에서, 2 개의 펩타이드 링커에 의해 연결된 2 개 이상의 Fab 단편을 포함하는, T-세포 활성화 항원 및 종양 항원 (TA) 에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체가 제공되는데, 여기서, 제 1 Fab 단편은 종양 항원 (TA) 에 대해 특이적인 1 개 이상의 항원 결합 부위를 포함하고; 제 2 Fab 단편은 T-세포 활성화 항원에 대해 특이적인 1 개 이상의 항원 결합 부위를 포함하고, 여기서, 제 2 Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역은 교환되어 있고; 상기 이중특이적 항체는 Fc 도메인이 결여되어 있다.
특정 실시형태에서, T-세포 활성화 항원은 CD3 T-세포 공동-수용체 (CD3) 항원, 특히 인간 또는 게잡이 원숭이 CD3, 가장 특히 인간 CD3이다. 일부 실시형태에서, T-세포 활성화 항원은 CD3 의 엡실론 서브유닛이다. 다른 실시형태에서, T-세포 활성화 항원은 CD3 의 알파 또는 베타 서브유닛이다.
하나의 측면에서, 2 개의 펩타이드 링커에 의해 연결된 2 개 이상의 Fab 단편을 포함하는, CD3 T-세포 공동-수용체 (CD3) 항원 및 종양 항원 (TA) 에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체가 제공되는데, 여기서, 제 1 Fab 단편은 종양 항원 (TA) 에 대해 특이적인 1 개 이상의 항원 결합 부위를 포함하고; 제 2 Fab 단편은 CD3 T-세포 공동-수용체 (CD3) 에 대해 특이적인 1 개 이상의 항원 결합 부위를 포함하고, 여기서, 제 2 Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역은 교환되어 있고; 상기 이중특이적 항체는 Fc 도메인이 결여되어 있다.
본 발명에 따른 이중특이적 항체는 2가 이상이고, 3가 또는 다가, 예를 들면, 4가 또는 6가일 수 있다. 하나의 실시형태에서, 상기 이중특이적 항체는 각각 종양 항원 (TA) 및 T-세포 활성화 항원을 각각 표적화하는 1개의 결합 부위를 가지는 2가 (1+1 형식) 이다. 다른 실시형태에서, 상기 이중특이적 항체는, 하기 섹션에서 상세히 설명하는 바와 같이, 종양 항원 (TA) 을 각각 표적화하는 2 개의 결합 부위 및 T-세포 활성화 항원을 표적화하는 1 개의 결합 부위를 가지는 3가 (2+1 형식) 이다.
하나의 실시형태에서, 상기 항체는, 상기 섹션 A 에서 상세하게 설명한 바와 같이, 제 3 Fab 단편을 추가로 포함한다. 하나의 실시형태에서, 상기 제 3 Fab 단편은 종양 항원에 대해 특이적인 1 개 이상의 항원 결합 부위를 포함한다. 하나의 실시형태에서, 상기 제 3 Fab 단편의 항원 결합 부위는 제 1 Fab 단편의 항원 결합 부위와 동일한 종양 항원에 대해 특이적이다.
하나의 실시형태에서, 상기 제 3 Fab 단편의 항원 결합 부위는 제 1 Fab 단편의 항원 결합 부위와 동일한 종양 항원에 대해 특이적이고, 본 발명의 이중특이적 항체는 다음 순서대로 (N-말단에서부터 C-말단 방향으로 또는 C-말단에서부터 N-말단 방향으로) 펩타이드 링커에 의해 연결된 3개의 Fab 단편을 포함한다: Fab (TA)-(1 개 또는 2 개의 링커)-Fab (TA)-(2 개의 링커)-xFab (T-세포 활성화 항원), 여기서, Fab (TA) 는 종양 항원에 대해 특이적인 항원 결합 부위를 가지는 Fab 단편을 의미하고, xFab (T-세포 활성화 항원) 는 T-세포 활성화 항원에 대해 특이적인 항원 결합 부위를 가지는 Fab 단편을 의미하고, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역은 교환되어 있다.
하나의 실시형태에서, 상기 제 3 Fab 단편의 항원 결합 부위는 제 1 Fab 단편의 항원 결합 부위와 동일한 종양 항원에 대해 특이적이고, 본 발명의 이중특이적 항체는 다음 순서대로 (N-말단에서부터 C-말단 방향으로 또는 C-말단에서부터 N-말단 방향으로) 펩타이드 링커에 의해 연결된 3개의 Fab 단편을 포함한다: Fab (TA)-(2 개의 링커)-xFab (T-세포 활성화 항원)-(1 개 또는 2 개의 링커)-Fab (TA), 여기서, Fab (TA) 는 종양 항원에 대해 특이적인 항원 결합 부위를 가지는 Fab 단편을 의미하고, xFab (T-세포 활성화 항원) 는 T-세포 활성화 항원에 대해 특이적인 항원 결합 부위를 가지는 Fab 단편을 의미하고, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역은 교환되어 있다.
하나의 실시형태에서, 이중특이적 항체는 CD3 의 에피토프에 결합하기 위해 단일클론 항체 V9 와 경쟁할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함한다. 예를 들면, 그 전문이 본원에 참조로 인용된 문헌 [Rodigues et al., Int J Cancer Suppl 7 (1992), 45-50]; US 6,054,297 을 참조한다.
하나의 실시형태에서, 이중특이적 항체는 CD3 의 에피토프에 결합하기 위해 단일클론 항체 FN18 과 경쟁할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함한다. 그 전문이 본원에 참조로 인용된 문헌 [Nooij et al., Eur J Immunol 19 (1986), 981-984] 을 참조한다.
하나의 실시형태에서, 이중특이적 항체는 CD3 의 에피토프에 결합하기 위해 단일클론 항체 CH2527 (서열 번호: 157 및 158, 및 인간화 변이체) 또는 이의 친화도 성숙된 변이체와 경쟁할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함한다.
하나의 실시형태에서, 이중특이적 항체는 CD3 에 특이적으로 결합하는 제 2 Fab 단편을 포함하는데, 여기서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 10 또는 서열 번호: 32 의 CDR1, 서열 번호: 11 또는 서열 번호: 33 의 CDR2, 및 서열 번호: 12 또는 서열 번호: 34 의 CDR3 을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 7 또는 서열 번호: 29 의 CDR1, 서열 번호: 8 또는 서열 번호: 30 의 CDR2, 및 서열 번호: 9 또는 서열 번호: 31 의 CDR3 을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 이중특이적 항체는 CD3 에 특이적으로 결합하는 제 2 Fab 단편을 포함하는데, 여기서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 10 의 CDR1, 서열 번호: 11 의 CDR2 및 서열 번호: 12 의 CDR3 을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 7 의 CDR1, 서열 번호: 8 의 CDR2 및 서열 번호: 9 의 CDR3 을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 이중특이적 항체는 CD3 에 특이적으로 결합하는 제 2 Fab 단편을 포함하는데, 여기서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 32 의 CDR1, 서열 번호: 33 의 CDR2 및 서열 번호: 34 의 CDR3 을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 29 의 CDR1, 서열 번호: 30 의 CDR2 및 서열 번호: 31 의 CDR3 을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 이중특이적 항체는 CD3 에 특이적으로 결합하는 제 2 Fab 단편을 포함하는데, 여기서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 170 의 CDR1, 서열 번호: 171 의 CDR2 및 서열 번호: 172 의 CDR3 을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 174 의 CDR1, 서열 번호: 175 의 CDR2 및 서열 번호: 176 의 CDR3 을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 이중특이적 항체는 CD3 에 특이적으로 결합하는 제 2 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄를 포함하는데, 여기서, 중쇄 가변 영역 서열은 서열 번호: 20 또는 서열 번호: 36 과 적어도 약 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 % 동일하고; 경쇄 가변 영역 서열은 서열 번호: 19 또는 서열 번호: 35 또는 기능성을 보유하는 이들의 변이체와 적어도 약 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 % 동일하다. 하나의 실시형태에서, 이중특이적 항체는 CD3 에 특이적으로 결합하는 제 2 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄를 포함하는데, 여기서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 20 의 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 19 또는 기능성을 보유하는 이의 변이체의 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 이중특이적 항체는 CD3 에 특이적으로 결합하는 제 2 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄를 포함하는데, 여기서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 36 의 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 35 또는 기능성을 보유하는 이의 변이체의 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 이중특이적 항체는 CD3 에 특이적으로 결합하는 제 2 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄를 포함하는데, 여기서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 158 의 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 157 또는 기능성을 보유하는 이의 변이체의 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 이중특이적 항체는 CD3 에 특이적으로 결합하는 제 2 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄를 포함하는데, 여기서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 158 과 적어도 약 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 % 동일하고; 경쇄 가변 영역 서열은 서열 번호: 157 또는 기능성을 보유하는 이의 변이체와 적어도 약 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 % 동일하다. 하나의 실시형태에서, 이중특이적 항체는 CD3 에 특이적으로 결합하는 제 2 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄를 포함하는데, 여기서, 중쇄 가변 영역 서열은 서열 번호: 158 의 친화도 성숙된 변이체이고, 경쇄 가변 영역 서열은 서열 번호: 157 의 친화도 성숙된 변이체이다. 본 실시형태에서의 친화도 성숙된 변이체란, 서열 번호: 158 및/또는 서열 번호: 157 중의 1 개, 2 개, 3 개 또는 4 개의 아미노산이 독립적으로 교환되는 것을 의미한다.
하나의 실시형태에서, 이중특이적 항체는 CD3 에 특이적으로 결합하는 제 2 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄를 포함하는데, 여기서, 중쇄 가변 영역 서열은 서열 번호: 169 의 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 173 의 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 이중특이적 항체는 CD3 에 특이적으로 결합하는 제 2 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄를 포함하는데, 여기서, 상기 중쇄는 서열 번호: 22 또는 서열 번호: 38 또는 기능성을 보유하는 이들의 변이체의 아미노산 서열을 포함하는 불변 영역을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 이중특이적 항체는, CD3 에 특이적으로 결합하는 제 2 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄 (여기서, 상기 중쇄는 서열 번호: 22 또는 서열 번호: 38 의 아미노산 서열을 포함하는 불변 영역을 포함한다), 및 본원에 기재된 임의의 실시형태에서 정의된 바와 같은 1 개 이상의 아미노산 서열을 포함하는, 종양 항원 (TA) 에 대해 특이적인 제 1 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄를 포함한다.
하나의 실시형태에서, 이중특이적 항체는 CD3 에 특이적으로 결합하는 제 2 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄를 포함하는데, 여기서, 상기 중쇄는 서열 번호: 22 의 아미노산 서열을 포함하는 불변 영역을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 이중특이적 항체는, CD3 에 특이적으로 결합하는 제 2 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄 (여기서, 상기 중쇄는 서열 번호: 22 의 아미노산 서열을 포함하는 불변 영역을 포함한다), 및 본원에 기재된 임의의 실시형태에서 정의된 바와 같은 1 개 이상의 아미노산 서열을 포함하는, 종양 항원 (TA) 에 대해 특이적인 제 1 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄를 포함한다.
하나의 실시형태에서, 이중특이적 항체는 CD3 에 특이적으로 결합하는 제 2 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄를 포함하는데, 여기서, 상기 경쇄는 서열 번호: 21 또는 서열 번호: 37 의 아미노산 서열을 포함하는 불변 영역을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 이중특이적 항체는, CD3 에 특이적으로 결합하는 제 2 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄 (여기서, 상기 경쇄는 서열 번호: 21 또는 서열 번호: 37 의 아미노산 서열을 포함하는 불변 영역을 포함한다), 및 본원에 기재된 임의의 실시형태에서 정의된 바와 같은 1 개 이상의 아미노산 서열을 포함하는, 종양 항원 (TA) 에 대해 특이적인 제 1 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄를 포함한다.
하나의 실시형태에서, 이중특이적 항체는 CD3 에 특이적으로 결합하는 제 2 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄를 포함하는데, 여기서, 상기 경쇄는 서열 번호: 21 의 아미노산 서열을 포함하는 불변 영역을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 이중특이적 항체는, CD3 에 특이적으로 결합하는 제 2 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄 (여기서, 상기 경쇄는 서열 번호: 21 의 아미노산 서열을 포함하는 불변 영역을 포함한다), 및 본원에 기재된 임의의 실시형태에서 정의된 바와 같은 1 개 이상의 아미노산 서열을 포함하는, 종양 항원 (TA) 에 대해 특이적인 제 1 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄를 포함한다.
또 다른 특정 실시형태에서, 본 발명의 이중특이적 항체는 CD3 에 특이적으로 결합하는 제 2 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄를 포함하는데, 여기서, 상기 중쇄는 서열 번호: 22 또는 서열 번호: 38 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고; 상기 경쇄는 서열 번호: 21 또는 서열 번호: 37 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함한다.
또 다른 특정 실시형태에서, 본 발명의 이중특이적 항체는 CD3 에 특이적으로 결합하는 제 2 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄를 포함하는데, 여기서, 상기 중쇄는 서열 번호: 22 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고; 상기 경쇄는 서열 번호: 21 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함한다.
또 다른 특정 실시형태에서, 본 발명의 이중특이적 항체는, CD3 에 특이적으로 결합하는 제 2 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄 (여기서, 상기 중쇄는 서열 번호: 22 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고; 상기 경쇄는 서열 번호: 21 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함한다), 및 본원에 기재된 임의의 실시형태에서 정의된 바와 같은 1 개 이상의 아미노산 서열을 포함하는, 종양 항원 (TA) 에 대해 특이적인 제 1 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄를 포함한다.
하나의 실시형태에서, 본 발명의 이중특이적 항체는, 서열 번호: 19 의 가변 경쇄 및 서열 번호: 20 의 가변 중쇄, 및 서열 번호: 22 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역, 및 서열 번호: 21 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함하는, CD3 에 특이적으로 결합하는 제 2 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄를 포함한다.
하나의 실시형태에서, 본 발명의 이중특이적 항체는, 서열 번호: 19 의 가변 경쇄 및 서열 번호: 20 의 가변 중쇄, 및 서열 번호: 22 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역, 및 서열 번호: 21 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함하는, CD3 에 특이적으로 결합하는 제 2 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄, 및 본원에 기재된 임의의 실시형태에서 정의된 바와 같은 1 개 이상의 아미노산 서열을 포함하는, 종양 항원 (TA) 에 대해 특이적인 제 1 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄를 포함한다.
하나의 실시형태에서, 본 발명의 이중특이적 항체는, 서열 번호: 35 의 가변 경쇄 및 서열 번호: 36 의 가변 중쇄, 및 서열 번호: 38 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역, 및 서열 번호: 37 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함하는, CD3 에 특이적으로 결합하는 제 2 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄를 포함한다.
하나의 실시형태에서, 본 발명의 이중특이적 항체는, 서열 번호: 35 의 가변 경쇄 및 서열 번호: 36 의 가변 중쇄, 및 서열 번호: 38 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역, 및 서열 번호: 37 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함하는, CD3 에 특이적으로 결합하는 제 2 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄, 및 본원에 기재된 임의의 실시형태에서 정의된 바와 같은 1 개 이상의 아미노산 서열을 포함하는, 종양 항원 (TA) 에 대해 특이적인 제 1 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄를 포함한다.
하나의 실시형태에서, 본 발명의 이중특이적 항체는, 서열 번호: 173 의 가변 경쇄 및 서열 번호: 169 의 가변 중쇄, 및 서열 번호: 38 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역, 및 서열 번호: 37 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함하는, CD3 에 특이적으로 결합하는 제 2 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄를 포함한다.
하나의 실시형태에서, 본 발명의 이중특이적 항체는, 서열 번호: 173 의 가변 경쇄 및 서열 번호: 169 의 가변 중쇄, 및 서열 번호: 38 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역, 및 서열 번호: 37 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함하는, CD3 에 특이적으로 결합하는 제 2 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄, 및 본원에 기재된 임의의 실시형태에서 정의된 바와 같은 1 개 이상의 아미노산 서열을 포함하는, 종양 항원 (TA) 에 대해 특이적인 제 1 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄를 포함한다.
하나의 실시형태에서, 본 발명의 이중특이적 항체는, 서열 번호: 157 의 가변 경쇄 및 서열 번호: 158 의 가변 중쇄, 및 서열 번호: 22 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역, 및 서열 번호: 21 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함하는, CD3 에 특이적으로 결합하는 제 2 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄를 포함한다.
하나의 실시형태에서, 본 발명의 이중특이적 항체는, 서열 번호: 157 또는 이의 친화도 성숙된 변이체의 가변 경쇄와 서열 번호: 158 또는 이의 친화도 성숙된 변이체의 가변 중쇄, 및 서열 번호: 22 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역, 및 서열 번호: 21 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함하는, CD3 에 특이적으로 결합하는 제 2 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄를 포함한다.
본 실시형태에서의 친화도 성숙된 변이체란, 서열 번호: 158 및/또는 서열 번호: 157 중의 1 개, 2 개, 3 개 또는 4 개의 아미노산이 독립적으로 교환되는 것을 의미한다.
하나의 실시형태에서, 본 발명의 이중특이적 항체는, 서열 번호: 157 의 가변 경쇄 및 서열 번호: 158 의 가변 중쇄, 및 서열 번호: 22 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역, 및 서열 번호: 21 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함하는, CD3 에 특이적으로 결합하는 제 2 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄, 및 본원에 기재된 임의의 실시형태에서 정의된 바와 같은 1 개 이상의 아미노산 서열을 포함하는, 종양 항원 (TA) 에 대해 특이적인 제 1 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄를 포함한다.
하나의 실시형태에서, 본 발명의 이중특이적 항체는, 서열 번호: 157 또는 이의 친화도 성숙된 변이체의 가변 경쇄와 서열 번호: 158 또는 이의 친화도 성숙된 변이체의 가변 중쇄, 및 서열 번호: 22 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역, 및 서열 번호: 21 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함하는, CD3 에 특이적으로 결합하는 제 2 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄, 및 본원에 기재된 임의의 실시형태에서 정의된 바와 같은 1 개 이상의 아미노산 서열을 포함하는, 종양 항원 (TA) 에 대해 특이적인 제 1 Fab 단편의 중쇄를 포함한다. 본 실시형태에서의 친화도 성숙된 변이체란, 서열 번호: 158 및/또는 서열 번호: 157 중의 1 개, 2 개, 3 개 또는 4 개의 아미노산이 독립적으로 교환되는 것을 의미한다.
하나의 실시형태에서, 종양 항원은 흑색종-관련 콘드로이틴 황산 프로테오글리칸 (MCSP), 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), 암배아 항원 (CEA), 섬유아세포 활성화 단백질 (FAP) 및 CD33 의 군으로부터 선택된다. 하나의 바람직한 실시형태에서, 종양 항원은 MCSP 이다.
하나의 실시형태에서, T-세포 활성화 이중특이적 항체는 흑색종-관련 콘드로이틴 황산 프로테오글리칸 (MCSP) 에 대해 특이적인 1 개 이상의 항원 결합 부위를 포함한다. 다른 실시형태에서, T-세포 활성화 이중특이적 항체는 MCSP 의 에피토프에 결합하기 위해 단일클론 항체 M4-3 ML2 (서열 번호: 161 및 162) 또는 이의 친화도 성숙된 변이체와 경쟁할 수 있는 1 개 이상, 전형적으로는 2 개 이상의 항원 결합 모이어티를 포함한다.
하나의 실시형태에서, 이중특이적 항체는 MCSP 에 특이적으로 결합하는 제 1 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄를 포함하는데, 여기서, 가변 중쇄는 서열 번호: 4 의 CDR1, 서열 번호: 5 의 CDR2, 서열 번호: 6 의 CDR3 을 포함하고; 가변 경쇄는 서열 번호: 1 의 CDR1, 서열 번호: 2 의 CDR2 및 서열 번호: 3 의 CDR3 을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 이중특이적 항체는 MCSP 에 특이적으로 결합하는 제 1 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄를 포함하는데, 여기서, 가변 중쇄는 서열 번호: 180 의 CDR1, 서열 번호: 181 의 CDR2, 서열 번호: 6 의 CDR3 을 포함하고; 가변 경쇄는 서열 번호: 183 의 CDR1, 서열 번호: 2 의 CDR2 및 서열 번호: 184 의 CDR3 을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 이중특이적 항체는 MCSP 에 특이적으로 결합하는 제 1 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄를 포함하는데, 여기서, 중쇄 가변 영역 서열은 서열 번호: 14 와 적어도 약 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 % 동일하고; 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 13 과 적어도 약 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 % 동일하다.
하나의 실시형태에서, 이중특이적 항체는 MCSP 에 특이적으로 결합하는 제 1 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄를 포함하는데, 여기서, 중쇄 가변 영역 서열은 서열 번호: 161 과 적어도 약 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 % 동일하고; 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 162 와 적어도 약 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 % 동일하다.
하나의 실시형태에서, 이중특이적 항체는 MCSP 에 특이적으로 결합하는 제 1 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄를 포함하는데, 여기서, 중쇄 가변 영역 서열은 서열 번호: 161 의 친화도 성숙된 변이체이고, 경쇄 가변 영역 서열은 서열 번호: 162 의 친화도 성숙된 변이체이다. 본 실시형태에서의 친화도 성숙된 변이체란, 서열 번호: 161 및/또는 서열 번호: 162 중의 1 개, 2 개, 3 개 또는 4 개의 아미노산이 독립적으로 교환되는 것을 의미한다.
하나의 실시형태에서, 상기 친화도 성숙된 변이체는 서열 번호: 180 의 CDR1, 서열 번호: 181 의 CDR2, 서열 번호: 6 의 CDR3 을 포함하는 가변 중쇄; 및 서열 번호: 183 의 CDR1, 서열 번호: 2 의 CDR2 및 서열 번호: 184 의 CDR3 을 포함하는 가변 경쇄를 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 친화도 성숙된 변이체는 서열 번호: 179 의 중쇄 가변 영역 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역 서열은 서열 번호: 182 의 친화도 성숙된 변이체이다.
하나의 실시형태에서, 이중특이적 항체는 MCSP 에 특이적으로 결합하는 제 1 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄를 포함하는데, 여기서, 상기 중쇄는 서열 번호: 16 의 아미노산 서열을 포함하는 불변 영역을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 이중특이적 항체는 MCSP 에 특이적으로 결합하는 제 1 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄 (여기서, 상기 중쇄는 서열 번호: 16 의 아미노산 서열을 포함하는 불변 영역을 포함한다), 및 본원에 기재된 임의의 실시형태에서 정의된 바와 같은 1 개 이상의 아미노산 서열을 포함하는 CD3 에 대해 특이적인 제 2 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄를 포함한다.
하나의 실시형태에서, 이중특이적 항체는 MCSP 에 특이적으로 결합하는 제 1 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄를 포함하는데, 여기서, 상기 경쇄는 서열 번호: 15 의 아미노산 서열을 포함하는 불변 영역을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 이중특이적 항체는 MCSP 에 특이적으로 결합하는 제 2 항체의 경쇄 및 중쇄 (여기서, 상기 경쇄는 서열 번호: 15 의 아미노산 서열을 포함하는 불변 영역을 포함한다), 및 본원에 기재된 임의의 실시형태에서 정의된 바와 같은 1 개 이상의 아미노산 서열을 포함하는, CD3 에 대해 특이적인 제 2 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄를 포함한다.
하나의 실시형태에서, 이중특이적 항체는 MCSP 에 특이적으로 결합하는 제 1 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄를 포함하는데, 여기서, 중쇄 불변 영역은 서열 번호: 16 의 아미노산 서열; 및 서열 번호: 15 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 이중특이적 항체는 MCSP 에 특이적으로 결합하는 제 1 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄를 포함하는데, 여기서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 14 의 아미노산 서열; 및 서열 번호: 13 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 중쇄 불변 영역은 서열 번호: 16 의 아미노산 서열; 및 서열 번호: 15 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함한다.
추가의 실시형태에서, 본 발명의 이중특이적 항체는, 서열 번호: 19 의 가변 경쇄 및 서열 번호: 20 의 가변 중쇄를 포함하는, CD3 에 특이적으로 결합하는 제 2 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄; 및 서열 번호: 13 의 가변 경쇄 및 서열 번호: 14 의 가변 중쇄를 포함하는, MCSP 에 대해 특이적인 제 1 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄를 포함한다.
하나의 실시형태에서, 이중특이적 항체는 MCSP 에 특이적으로 결합하는 제 1 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄를 포함하는데, 여기서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 161 의 아미노산 서열; 및 서열 번호: 162 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 중쇄 불변 영역은 서열 번호: 16 의 아미노산 서열; 및 서열 번호: 15 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함한다.
추가의 실시형태에서, 본 발명의 이중특이적 항체는, 서열 번호: 19 의 가변 경쇄 및 서열 번호: 20 의 가변 중쇄를 포함하는, CD3 에 특이적으로 결합하는 제 2 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄; 및 서열 번호: 161 의 가변 경쇄 및 서열 번호: 162 의 가변 중쇄를 포함하는, MCSP 에 대해 특이적인 제 1 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄를 포함한다.
하나의 실시형태에서, 이중특이적 항체는 MCSP 에 특이적으로 결합하는 제 1 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄를 포함하는데, 여기서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 161 또는 이의 친화도 성숙된 변이체의 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 162 또는 이의 친화도 성숙된 변이체의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 불변 영역은 서열 번호: 16 의 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 불변 영역은 서열 번호: 15 의 아미노산 서열을 포함한다. 본 실시형태에서의 친화도 성숙된 변이체란, 서열 번호: 161 및/또는 서열 번호: 162 중의 1 개, 2 개, 3 개 또는 4 개의 아미노산이 독립적으로 교환되는 것을 의미한다.
추가의 실시형태에서, 본 발명의 이중특이적 항체는, 서열 번호: 19 의 가변 경쇄 및 서열 번호: 20 의 가변 중쇄를 포함하는, CD3 에 특이적으로 결합하는 제 2 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄; 및 서열 번호: 161 또는 이의 친화도 성숙된 변이체의 가변 경쇄와 서열 번호: 162 또는 이의 친화도 성숙된 변이체의 가변 중쇄를 포함하는, MCSP 에 대해 특이적인 제 1 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄를 포함한다. 본 실시형태에서의 친화도 성숙된 변이체란, 서열 번호: 161 및/또는 서열 번호: 162 중의 1 개, 2 개, 3 개 또는 4 개의 아미노산이 독립적으로 교환되는 것을 의미한다.
추가의 실시형태에서, 본 발명의 이중특이적 항체는, 서열 번호: 158 의 가변 경쇄 및 서열 번호: 157 의 가변 중쇄를 포함하는, CD3 에 특이적으로 결합하는 제 2 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄; 및 서열 번호: 161 의 가변 경쇄 및 서열 번호: 162 의 가변 중쇄를 포함하는, MCSP 에 대해 특이적인 제 1 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄를 포함한다.
추가의 실시형태에서, 본 발명의 이중특이적 항체는, 서열 번호: 158 또는 이의 친화도 성숙된 변이체의 가변 경쇄와 서열 번호: 157 또는 이의 친화도 성숙된 변이체의 가변 중쇄를 포함하는, CD3 에 특이적으로 결합하는 제 2 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄; 및 서열 번호: 161 또는 이의 친화도 성숙된 변이체의 가변 경쇄와 서열 번호: 162 또는 이의 친화도 성숙된 변이체의 가변 중쇄를 포함하는, MCSP 에 대해 특이적인 제 1 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄를 포함한다. 본 실시형태에서의 친화도 성숙된 변이체란, 서열 번호: 157, 서열 번호: 158, 서열 번호: 161 및/또는 서열 번호: 162 의 1 개 이상 중의 1 개, 2 개, 3 개 또는 4 개의 아미노산이 독립적으로 교환되는 것을 의미한다.
하나의 실시형태에서, 이중특이적 항체는 MCSP 에 특이적으로 결합하는 경쇄 및 중쇄를 포함하는 제 3 Fab 단편을 포함하는데, 여기서, 가변 중쇄는 서열 번호: 4 의 CDR1, 서열 번호: 5 의 CDR2, 서열 번호: 6 의 CDR3 을 포함하고; 가변 경쇄는 서열 번호: 1 의 CDR1, 서열 번호: 2 의 CDR2, 및 서열 번호: 3 의 CDR3 을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 이중특이적 항체는 MCSP 에 특이적으로 결합하는 경쇄 및 중쇄를 포함하는 제 3 Fab 단편을 포함하는데, 여기서, 중쇄 가변 영역 서열은 서열 번호: 14 와 적어도 약 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 % 동일하고; 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 13 과 적어도 약 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 % 동일하다.
하나의 실시형태에서, 이중특이적 항체는 MCSP 에 특이적으로 결합하는 경쇄 및 중쇄를 포함하는 제 3 Fab 단편을 포함하는데, 여기서, 중쇄 가변 영역 서열은 서열 번호: 161 과 적어도 약 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 % 동일하고; 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 162 와 적어도 약 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 % 동일하다.
하나의 실시형태에서, 이중특이적 항체는 MCSP 에 특이적으로 결합하는 경쇄 및 중쇄를 포함하는 제 3 Fab 단편을 포함하는데, 여기서, 중쇄 가변 영역 서열은 서열 번호: 161 의 친화도 성숙된 변이체이고, 경쇄 가변 영역 서열은 서열 번호: 162 의 친화도 성숙된 변이체이다. 본 실시형태에서의 친화도 성숙된 변이체란, 서열 번호: 161 및/또는 서열 번호: 162 중의 1 개, 2 개, 3 개 또는 4 개의 아미노산이 독립적으로 교환되는 것을 의미한다.
하나의 실시형태에서, 이중특이적 항체는 MCSP 에 특이적으로 결합하는 경쇄 및 중쇄를 포함하는 제 3 Fab 단편을 포함하는데, 여기서, 상기 중쇄는 서열 번호: 16 의 아미노산 서열을 포함하는 불변 영역 포함한다. 하나의 실시형태에서, 이중특이적 항체는, MCSP 에 특이적으로 결합하는 경쇄 및 중쇄를 포함하는 제 3 Fab 단편 (여기서, 상기 중쇄는 서열 번호: 16 의 아미노산 서열을 포함하는 불변 영역을 포함한다), 및 본원에 기재된 임의의 실시형태에서 정의된 바와 같은 1 개 이상의 아미노산 서열을 포함하는, CD3 에 대해 특이적인 제 2 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄, 및 본원에 기재된 임의의 실시형태에서 정의된 바와 같은 1 개 이상의 아미노산 서열을 포함하는 MCSP 에 대해 특이적인 제 1 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄를 포함한다.
하나의 실시형태에서, 이중특이적 항체는 MCSP 에 특이적으로 결합하는 경쇄 및 중쇄를 포함하는 제 3 Fab 단편을 포함하는데, 여기서, 상기 경쇄는 서열 번호: 15 의 아미노산 서열을 포함하는 불변 영역을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 이중특이적 항체는, MCSP 에 특이적으로 결합하는 제 2 항체의 경쇄 및 중쇄 (여기서, 상기 경쇄는 서열 번호: 15 의 아미노산 서열을 포함하는 불변 영역을 포함한다), 및 CD3 에 대해 특이적인 제 2 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄, 및 본원에 기재된 임의의 실시형태에서 정의된 바와 같은 1 개 이상의 아미노산 서열을 포함하는, MCSP 에 대해 특이적인 제 1 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄를 포함한다.
하나의 실시형태에서, 이중특이적 항체는 MCSP 에 특이적으로 결합하는 경쇄 및 중쇄를 포함하는 제 3 Fab 단편을 포함하는데, 여기서, 중쇄 불변 영역은 서열 번호: 16 의 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 불변 영역은 서열 번호: 15 의 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 이중특이적 항체는 MCSP 에 특이적으로 결합하는 경쇄 및 중쇄를 포함하는 제 3 Fab 단편을 포함하는데, 여기서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 14 의 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 13 의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 불변 영역은 서열 번호: 16 의 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 불변 영역은 서열 번호: 15 의 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 이중특이적 항체는 MCSP 에 특이적으로 결합하는 경쇄 및 중쇄를 포함하는 제 3 Fab 단편을 포함하는데, 여기서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 161 의 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 162 의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 불변 영역은 서열 번호: 16 의 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 불변 영역은 서열 번호: 15 의 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 이중특이적 항체는 MCSP 에 특이적으로 결합하는 경쇄 및 중쇄를 포함하는 제 3 Fab 단편을 포함하는데, 여기서, 중쇄 가변 영역 서열은 서열 번호: 161 의 친화도 성숙된 변이체이고, 경쇄 가변 영역 서열은 서열 번호: 162 의 친화도 성숙된 변이체이고, 중쇄 불변 영역은 서열 번호: 16 의 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 불변 영역은 서열 번호: 15 의 아미노산 서열을 포함한다. 본 실시형태에서의 친화도 성숙된 변이체란, 서열 번호: 161 및/또는 서열 번호: 162 중의 1 개, 2 개, 3 개 또는 4 개의 아미노산이 독립적으로 교환되는 것을 의미한다.
추가의 실시형태에서, 본 발명의 이중특이적 항체는, 서열 번호: 19 의 가변 경쇄 및 서열 번호: 20 의 가변 중쇄를 포함하는, CD3 에 특이적으로 결합하는 제 2 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄; 및 서열 번호: 13 의 가변 경쇄 및 서열 번호: 14 의 가변 중쇄를 포함하는, MCSP 에 대해 특이적인 제 1 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄, 및 서열 번호: 13 의 가변 경쇄 및 서열 번호: 14 의 가변 중쇄를 포함하는, MCSP 에 대해 특이적인 제 3 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄를 포함한다.
추가의 실시형태에서, 본 발명의 이중특이적 항체는, 서열 번호: 19 의 가변 경쇄 및 서열 번호: 20 의 가변 중쇄를 포함하는, CD3 에 특이적으로 결합하는 제 2 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄; 및 서열 번호: 162 의 가변 경쇄 및 서열 번호: 161 의 가변 중쇄를 포함하는, MCSP 에 대해 특이적인 제 1 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄, 및 서열 번호: 162 의 가변 경쇄 및 서열 번호: 161 의 가변 중쇄를 포함하는, MCSP 에 대해 특이적인 제 3 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄를 포함한다.
추가의 실시형태에서, 본 발명의 이중특이적 항체는, 서열 번호: 19 의 가변 경쇄 및 서열 번호: 20 의 가변 중쇄를 포함하는, CD3 에 특이적으로 결합하는 제 2 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄; 및 서열 번호: 162 또는 이의 친화도 성숙된 변이체의 가변 경쇄와 서열 번호: 161 또는 이의 친화도 성숙된 변이체의 가변 중쇄를 포함하는, MCSP 에 대해 특이적인 제 1 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄, 및 서열 번호: 162 또는 이의 친화도 성숙된 변이체의 가변 경쇄와 서열 번호: 161 또는 이의 친화도 성숙된 변이체의 가변 중쇄를 포함하는, MCSP 에 대해 특이적인 제 3 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄를 포함한다. 본 실시형태에서의 친화도 성숙된 변이체란, 서열 번호: 161 및/또는 서열 번호: 162 중의 1 개, 2 개, 3 개 또는 4 개의 아미노산이 독립적으로 교환되는 것을 의미한다.
추가의 실시형태에서, 본 발명의 이중특이적 항체는, 서열 번호: 157 의 가변 경쇄 및 서열 번호: 158 의 가변 중쇄를 포함하는, CD3 에 특이적으로 결합하는 제 2 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄; 서열 번호: 162 의 가변 경쇄 및 서열 번호: 161 의 가변 중쇄를 포함하는, MCSP 에 대해 특이적인 제 1 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄, 및 서열 번호: 162 의 가변 경쇄 및 서열 번호: 161 의 가변 중쇄를 포함하는, MCSP 에 대해 특이적인 제 3 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄를 포함한다.
추가의 실시형태에서, 본 발명의 이중특이적 항체는, 서열 번호: 157 의 가변 경쇄 및 서열 번호: 158 의 가변 중쇄를 포함하는, CD3 에 특이적으로 결합하는 제 2 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄; 및 서열 번호: 162 또는 이의 친화도 성숙된 변이체의 가변 경쇄와 서열 번호: 161 또는 이의 친화도 성숙된 변이체의 가변 중쇄를 포함하는, MCSP 에 대해 특이적인 제 1 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄, 및 서열 번호: 162 또는 이의 친화도 성숙된 변이체의 가변 경쇄와 서열 번호: 161 또는 이의 친화도 성숙된 변이체의 가변 중쇄를 포함하는, MCSP 에 대해 특이적인 제 3 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄를 포함한다. 본 실시형태에서의 친화도 성숙된 변이체란, 서열 번호: 161 및/또는 서열 번호: 162 중의 1 개, 2 개, 3 개 또는 4 개의 아미노산이 독립적으로 교환되는 것을 의미한다.
또 다른 실시형태에서, 상기 이중특이적 항체는 서열 서열 번호: 25, 서열 번호: 26, 서열 번호: 27, 서열 번호: 41 및 서열 번호: 43 의 군으로부터 선택된 1 개 이상의 아미노산을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 상기 이중특이적 항체는 서열 번호: 23, 서열 번호: 25, 서열 번호: 26, 서열 번호: 27 을 포함한다.
하나의 바람직한 실시형태에서, 상기 이중특이적 항체는 서열 번호: 163 및 서열 번호: 164 를 포함한다.
하나의 실시형태에서, T-세포 활성화 이중특이적 항체는 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 에 대해 특이적인 1 개 이상의 항원 결합 부위를 포함한다. 다른 실시형태에서, T-세포 활성화 이중특이적 항체는 EGFR 의 에피토프에 결합하기 위해 단일클론 항체 GA201 과 경쟁할 수 있는 1 개 이상, 전형적으로는 2 개 이상의 항원 결합 모이어티를 포함한다. 그 전문이 본원에 참조로 인용되는 PCT 국제 공개 공보 WO 2006/082515 를 참조한다. 하나의 실시형태에서, EGFR 에 대해 특이적인 항원 결합 부위는 서열 번호: 68 의 중쇄 CDR1, 서열 번호: 69 의 중쇄 CDR2, 서열 번호: 70 의 중쇄 CDR3, 서열 번호: 71 의 경쇄 CDR1, 서열 번호: 72 의 경쇄 CDR2, 및 서열 번호: 73 의 경쇄 CDR3 을 포함한다. 추가의 실시형태에서, EGFR 에 대해 특이적인 항원 결합 부위는, 서열 번호: 74 와 적어도 약 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 % 동일한 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열 서열 번호: 75, 또는 기능성을 보유하는 이의 변이체와 적어도 약 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 % 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
추가의 실시형태에서, 이중특이적 항체는, 서열 번호: 74 와 적어도 약 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 % 동일한 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열 번호: 75, 또는 기능성을 보유하는 이의 변이체와 적어도 약 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 % 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 EGFR 에 대해 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 제 1 Fab 단편, 및 본원에 기재된 임의의 실시형태에서 정의된 바와 같은 1 개 이상의 아미노산 서열을 포함하는, CD3 에 대해 특이적인 제 2 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄를 포함한다.
추가의 실시형태에서, 이중특이적 항체는, 서열 번호: 74 와 적어도 약 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 % 동일한 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열 번호: 75, 또는 기능성을 보유하는 이의 변이체와 적어도 약 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 % 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, EGFR 에 대해 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 제 1 Fab 단편 및 제 3 Fab 단편, 및 본원에 기재된 임의의 실시형태에서 정의된 바와 같은 1 개 이상의 아미노산 서열을 포함하는, CD3 에 대해 특이적인 제 2 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄를 포함한다.
하나의 실시형태에서, T-세포 활성화 이중특이적 항체는 섬유아세포 활성화 단백질 (FAP) 에 대해 특이적인 1 개 이상의 항원 결합 부위를 포함한다. 다른 실시형태에서, T-세포 활성화 이중특이적 항체는 FAP 의 에피토프에 결합하기 위해 단일클론 항체 3F2 와 경쟁할 수 있는 1 개 이상, 전형적으로는 2 개 이상의 항원 결합 모이어티를 포함한다. 그 전문이 참조에 의해 본원에 삽입된 유럽 특허 출원 EP 10172842.6 을 참조한다. 하나의 실시형태에서, FAP 에 대해 특이적인 항원 결합 부위는 서열 번호: 76의 중쇄 CDR1, 서열 번호: 77 의 중쇄 CDR2, 서열 번호: 78 의 중쇄 CDR3, 서열 번호: 79 의 경쇄 CDR1, 서열 번호: 80 의 경쇄 CDR2 및 서열 번호: 81 의 경쇄 CDR3 을 포함한다. 추가의 실시형태에서, FAP 에 대해 특이적인 항원 결합 부위는, 서열 번호: 82 와 적어도 약 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 % 동일한 중쇄 가변 영역 서열과 서열 번호: 83, 또는 기능성을 보유하는 이의 변이체와 적어도 약 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 % 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
추가의 실시형태에서, 이중특이적 항체는, 서열 번호: 82 와 적어도 약 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 % 동일한 중쇄 가변 영역 서열과 서열 번호: 83, 또는 기능성을 보유하는 이의 변이체와 적어도 약 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 % 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, FAP 에 대해 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 제 1 Fab 단편, 및 본원에 기재된 임의의 실시형태에서 정의된 바와 같은 1 개 이상의 아미노산 서열을 포함하는 CD3 에 대해 특이적인 제 2 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄를 포함한다.
추가의 실시형태에서, 이중특이적 항체는, 서열 번호: 82 와 적어도 약 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 % 동일한 중쇄 가변 영역 서열과 서열 번호: 83, 또는 기능성을 보유하는 이의 변이체와 적어도 약 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 % 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 FAP 에 대해 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 제 1 Fab 단편 및 제 3 Fab 단편, 및 본원에 기재된 임의의 실시형태에서 정의된 바와 같은 1 개 이상의 아미노산 서열을 포함하는, CD3 에 대해 특이적인 제 2 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄를 포함한다.
하나의 실시형태에서, T-세포 활성화 이중특이적 항체는 암배아 항원 (CEA) 에 대해 특이적인 1 개 이상의 항원 결합 부위를 포함한다. 다른 실시형태에서, T-세포 활성화 이중특이적 항체는 CEA 의 에피토프에 결합하기 위해 단일클론 항체 CH1A1A 와 경쟁할 수 있는 1 개 이상, 전형적으로는 2 개 이상의 항원 결합 모이어티를 포함한다. 하나의 실시형태에서, T-세포 활성화 이중특이적 항체는 CEA 의 에피토프와 경쟁하기 위해 단일클론 항체 CH1A1A 클론 98/99 (CH1A1(98/99)) 와 경쟁할 수 있는 1 개 이상, 전형적으로는 2 개 이상의 항원 결합 모이어티를 포함한다. 그 전문이 본원에 참조로 인용되는 PCT 특허 출원 번호 PCT/EP2010/062527 을 참조한다. 하나의 실시형태에서, CEA 에 대해 특이적인 항원 결합 부위는 서열 번호: 84 의 중쇄 CDR1, 서열 번호: 85 의 중쇄 CDR2, 서열 번호: 86 의 중쇄 CDR3, 서열 번호: 87 의 경쇄 CDR1, 서열 번호: 88 의 경쇄 CDR2 및 서열 번호: 89 의 경쇄 CDR3 을 포함한다. 추가의 실시형태에서, CEA 에 대해 특이적인 항원 결합 부위는, 서열 번호: 90 또는 서열 번호: 159 와 적어도 약 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 % 동일한 중쇄 가변 영역 서열과 서열 번호: 91 또는 서열 번호: 160, 또는 기능성을 보유하는 이들의 변이체와 적어도 약 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 % 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 이중특이적 항체는 CEA 에 대해 특이적으로 결합하는 제 1 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄를 포함하는데, 여기서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 159 의 친화도 성숙된 변이체를 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 160 의 친화도 성숙된 변이체를 포함한다. 본 실시형태에서의 친화도 성숙된 변이체란, 서열 번호: 159 및/또는 서열 번호: 160 중의 1 개, 2 개, 3 개 또는 4 개의 아미노산이 독립적으로 교환되는 것을 의미한다.
추가의 실시형태에서, 이중특이적 항체는, 서열 번호: 90 과 적어도 약 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 % 동일한 중쇄 가변 영역 서열과 서열 번호: 91, 또는 기능성을 보유하는 이의 변이체와 적어도 약 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 % 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 CEA 에 대해 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 제 1 Fab 단편, 및 본원에 기재된 임의의 실시형태에서 정의된 바와 같은 1 개 이상의 아미노산 서열을 포함하는, CD3 에 대해 특이적인 제 2 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄를 포함한다.
추가의 실시형태에서, 이중특이적 항체는, 서열 번호: 159 와 적어도 약 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 % 동일한 중쇄 가변 영역 서열과 서열 번호: 160, 또는 기능성을 보유하는 이의 변이체와 적어도 약 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 % 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, CEA 에 대해 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 제 1 Fab 단편, 및 본원에 기재된 임의의 실시형태에서 정의된 바와 같은 1 개 이상의 아미노산 서열을 포함하는, CD3 에 대해 특이적인 제 2 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄를 포함한다.
하나의 실시형태에서, 이중특이적 항체는, CEA 에 대해 특이적으로 결합하는 제 1 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄 (여기서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 159 의 친화도 성숙된 변이체를 포함하고; 경쇄 가변 영역는 서열 번호: 160 의 친화도 성숙된 변이체를 포함한다), 및 본원에 기재된 임의의 실시형태에서 정의된 바와 같은 1 개 이상의 아미노산 서열을 포함하는, CD3 에 대해 특이적인 제 2 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄를 포함한다. 본 실시형태에서의 친화도 성숙된 변이체란, 서열 번호: 159 및/또는 서열 번호: 160 중의 1 개, 2 개, 3 개 또는 4 개의 아미노산이 독립적으로 교환되는 것을 의미한다.
추가의 실시형태에서, 이중특이적 항체는, 서열 번호: 90 또는 서열 번호: 159 와 적어도 약 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 % 동일한 중쇄 가변 영역 서열과 서열 번호: 91 또는 서열 번호: 160, 또는 기능성을 보유하는 이들의 변이체와 적어도 약 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 % 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 CEA 에 대해 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 제 1 Fab 단편 및 제 3 Fab 단편, 및 본원에 기재된 임의의 실시형태에서 정의된 바와 같은 1 개 이상의 아미노산 서열을 포함하는, CD3 에 대해 특이적인 제 2 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄를 포함한다. 본 실시형태에서의 친화도 성숙된 변이체란, 서열 번호: 159 및/또는 서열 번호: 160 중의 1 개, 2 개, 3 개 또는 4 개의 아미노산이 독립적으로 교환되는 것을 의미한다.
추가의 실시형태에서, 이중특이적 항체는 CEA 에 대해 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 제 1 Fab 단편 및 제 3 Fab 단편을 포함하는데, 여기서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 159 의 친화도 성숙된 변이체를 포함하고; 및 경쇄 가변 영역는 서열 번호: 160 의 친화도 성숙된 변이체를 포함한다. 본 실시형태에서의 친화도 성숙된 변이체란, 서열 번호: 159 및/또는 서열 번호: 160 중의 1 개, 2 개, 3 개 또는 4 개의 아미노산이 독립적으로 교환되는 것을 의미한다.
하나의 실시형태에서, T-세포 활성화 이중특이적 항체는 1 개 이상의 CD33 에 대해 특이적인 항원 결합 부위를 포함한다. 하나의 실시형태에서, CD33 에 대해 특이적인 항원 결합 부위는 서열 번호: 92 의 중쇄 CDR1, 서열 번호: 93 의 중쇄 CDR2, 서열 번호: 94 의 중쇄 CDR3, 서열 번호: 95 의 경쇄 CDR1, 서열 번호: 96 의 경쇄 CDR2 및 서열 번호: 97 의 경쇄 CDR3 을 포함한다. 추가의 실시형태에서, CD33 에 대해 특이적인 항원 결합 부위는, 서열 서열 번호: 98 과 적어도 약 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 % 동일한 중쇄 가변 영역 및 서열 번호: 99, 또는 기능성을 보유하는 이들의 변이체와 적어도 약 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 % 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
추가의 실시형태에서, 이중특이적 항체는, 서열 서열 번호: 98 과 적어도 약 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 % 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 번호: 99, 또는 기능성을 보유하는 이의 변이체와 적어도 약 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 % 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, CD33 에 대해 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 제 1 Fab 단편, 및 본원에 기재된 임의의 실시형태에서 정의된 바와 같은 1 개 이상의 아미노산 서열을 포함하는, CD3 에 대해 특이적인 제 2 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄를 포함한다.
특정 실시형태에서, T-세포 활성화 이중특이적 항체는, 서열 번호: 100, 서열 번호: 101 및 서열 번호: 102 의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 약 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 % 동일한 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
하나의 실시형태에서, T-세포 활성화 이중특이적 항체는, 서열 번호: 151, 서열 번호: 152 및 서열 번호: 153 의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 약 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 % 동일한 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 상기 이중특이적 항체는 서열 번호: 100, 서열 번호: 101, 서열 번호: 151, 서열 번호: 152 및 서열 번호: 153 의 군으로부터 선택된 1 개 이상의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 하나의 실시형태에서, 이중특이적 항체는 하기에 상세하게 설명하는 바와 같이 인간화 항체이다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 이중특이적 항체는 하기에 상세하게 설명하는 바와 같이 인간 항체이다.
두번째 목적으로, 본 발명은 본 발명의 이중특이적 항체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
세번째 목적으로, 본 발명은 암의 치료를 위한 본 발명의 이중특이적 항체에 관한 것이다. 다른 실시형태에서, 약제로서의 이중특이적 항체의 용도가 제공된다. 바람직하게는, 상기 용도는 암의 치료를 위한 것이다.
추가의 목적으로, 본 발명은 본 발명의 이중특이적 항체의 중쇄를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산 서열, 본 발명의 이중특이적 항체의 경쇄를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산 서열, 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터, 및 본 발명의 벡터를 포함하는 원핵 또는 진핵 숙주 세포에 관한 것이다. 또한, 항체를 생산하도록 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는 항체의 제조 방법이 제공된다.
추가의 실시형태에서, 본 발명의 이중특이적 항체 및 세포독성제를 포함하는 면역접합체가 제공된다.
추가의 목적으로, 본 발명은 본 발명의 이중특이적 항체의 중쇄를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산 서열, 본 발명의 이중특이적 항체의 경쇄를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산 서열, 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터, 및 본 발명의 벡터를 포함하는 원핵 또는 진핵 숙주 세포에 관한 것이다. 또한, 항체를 생산하도록 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는 항체의 제조 방법이 제공된다.
특정 실시형태에서, T-세포 활성화 이중특이적 항체는, 서열 번호: 44, 서열 번호: 45, 서열 번호: 46, 서열 번호: 47, 서열 번호: 48, 서열 번호: 49, 서열 번호: 50, 서열 번호: 51, 서열 번호: 52, 서열 번호: 53, 서열 번호: 54, 서열 번호: 55, 서열 번호: 56, 서열 번호: 57, 서열 번호: 58, 서열 번호: 59, 서열 번호: 60, 서열 번호: 61, 서열 번호: 62, 서열 번호: 63, 서열 번호: 64, 서열 번호: 65, 서열 번호: 66 및 서열 번호: 67 의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 약 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 % 동일한 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, T-세포 활성화 이중특이적 항체는, 서열 번호: 107, 서열 번호: 108, 서열 번호: 109, 서열 번호: 110, 서열 번호: 111 및 서열 번호: 112 의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 약 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 % 동일한 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, T-세포 활성화 이중특이적 항체는, 서열 번호: 113, 서열 번호: 114, 서열 번호: 115, 서열 번호: 116, 서열 번호: 117, 서열 번호: 118, 서열 번호: 119 및 서열 번호: 120 의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 약 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 % 동일한 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, T-세포 활성화 이중특이적 항체는 서열 번호: 121, 서열 번호: 122, 서열 번호: 123, 서열 번호: 124, 서열 번호: 125, 서열 번호: 126, 서열 번호: 127 및 서열 번호: 128 의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 약 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 % 동일한 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, T-세포 활성화 이중특이적 항체는, 서열 번호: 129, 서열 번호: 130, 서열 번호: 131, 서열 번호: 132, 서열 번호: 133, 서열 번호: 134, 서열 번호: 135 및 서열 번호: 136 의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 약 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 % 동일한 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, T-세포 활성화 이중특이적 항체는, 서열 번호: 105, 서열 번호: 106, 서열 번호: 137, 서열 번호: 138, 서열 번호: 139, 서열 번호: 140, 서열 번호: 141, 서열 번호: 142, 서열 번호: 143, 서열 번호: 144, 서열 번호: 154, 서열 번호: 155 및 서열 번호: 156 의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 약 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 % 동일한 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, T-세포 활성화 이중특이적 항체는, 서열 번호: 165 및 서열 번호: 166 의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 약 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 % 동일한 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
추가의 측면에서, 상기 실시형태들 중 임의의 것에 따른 이중특이적 항체는 임의의 특징들을 단독으로 또는 조합하여 하기 섹션 1-5 에 기재된 바와 같이 포함할 수 있다:
1. 항체 친화도
표적 항원에 대한 본원에서 제공된 이중특이적 항체의 친화도는, BIAcore 기구 (GE Healthcare) 와 같은 표준 기구를 이용하여, 표면 플라스몬 공명 (SPR) 에 의해 실시예에서 제시된 방법에 따라 측정할 수 있고, 수용체 또는 표적 단백질은 재조합 발현에 의해 수득할 수 있다. 다르게는, 상이한 수용체 또는 표적 항원에 대한 이중특이적 항체의 결합은, 특정 수용체 또는 표적 항원을 발현하는 세포주를 이용하여, 예를 들면, 유세포측정법 (FACS) 을 통해 평가할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본원에서 제공된 이중특이적 항체는 ≤　1μM, ≤　100 nM, ≤　10 nM, ≤　1 nM, ≤　0.1 nM, ≤　0.01 nM 또는 ≤　0.001 nM (예를 들면, 10-8 M 이하, 예를 들면, 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들면, 10-9 M 내지 10-13 M) 의 해리 상수 (KD) 를 가진다.
하나의 실시형태에 따르면, KD 는, BIACORE®-2000 또는 BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) 을 사용하는 표면 플라스몬 공명 검정을 사용하여, 고정된 항원 CM5 칩에 의해 25℃ 에서 약 10 반응 유닛 (response unit: RU) 으로 측정한다. 간단히 말하자면, 공급사의 설명서에 따라 카복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, BIACORE, Inc.) 을 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC) 및 N-하이드록시석신이미드 (NHS) 로 활성화시킨다. 5 μl/분의 유속으로 주입하기 전에 항원을 10 mM 아세트산나트륨, pH 4.8 에 의해 5 ㎍/㎖ (약 0.2 μM) 까지 희석하여 대략 10 반응 유닛 (RU) 의 커플링된 단백질을 달성한다. 항원의 주입 후, 1 M 에탄올아민을 주입하여 미반응 기를 차단한다. 동역학 측정을 위해, Fab 의 2배 연속 희석액 (0.78 nM 내지 500 nM) 을 대략 25 μl/분의 유속으로 25℃ 에서 0.05% 폴리소르베이트 20 (TWEEN-20TM) 계면활성제 (PBST) 를 함유하는 PBS 중에 주입한다. 연합 속도 (ka 또는 kon) 및 해리 속도 (kd 또는 koff) 는, 단순한 일대일 랭뮤어 (Langmuir) 결합 모델 (BIACORE ® Evaluation Software version 3.2) 을 사용하여, 연합 및 해리 센서그램을 동시에 피팅 (fitting) 함으로써 산출한다. 평형 해리 상수 (KD) 는 koff/kon 의 비율로서 산출한다. 예를 들면, 문헌 [Chen, et al., J. Mol. Biol. 293: 865-881 (1999)] 를 참조한다. 연합 속도 (on-rate) 가 상기 표면 플라스몬 공명 검정에 의해 106 M-1 s-1 을 초과하는 경우, 연합 속도는, 정지-유동 장비를 갖춘 분광광도계 (stop-flow equipped spectrophotometer; Aviv Instruments) 또는 교반 큐벳을 갖춘 8000-시리즈 SLM-AMINCOTM 분광광도계 (ThermoSpectronic) 와 같은 분광계로 측정시, 증가하는 농도의 항원의 존재 하에, PBS, pH 7.2 중의 20 nM 항-항원 항체 (Fab 형태) 의 25℃ 에서의 형광 방출 강도 (여기 = 295 ㎚; 방출 = 340 ㎚, 16 ㎚ 대역 통과) 의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭 기술 (fluorescent quenching technique) 을 사용함으로써, 측정할 수 있다.
2. 키메라 및 인간화 항체
특정 실시형태에서, 본원에서 제공된 이중특이적 항체는 키메라 항체이다. 특정 키메라 항체는, 예를 들면, 미국 특허 US 4,816,567; 및 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)] 에 기재되어 있다. 하나의 예에서, 키메라 항체는 비-인간 가변 영역 (예를 들면, 마우스, 래트, 햄스터, 래빗, 또는 비-인간 영장류, 예를 들면, 원숭이로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 추가의 예에서, 키메라 항체는 클래스 또는 서브클래스가 부모 항체의 것으로부터 변화된 "클래스 전환" 항체이다. 키메라 항체는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
특정 실시형태에서, 키메라 항체는 인간화 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는 인간화되어 인간에 대한 면역원성을 감소시키지만, 여전히 부모 비-인간 항체의 특이성 및 친화도를 보유한다. 일반적으로, 인간화 항체는, HVR, 예를 들면, CDR (또는 이의 일부) 이 비-인간 항체로부터 유래하고 FR (또는 이의 일부) 이 인간 항체 서열로부터 유래하는 1 개 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화 항체는 임의로 인간 불변 영역의 적어도 일부를 또한 포함할 것이다. 일부 실시형태에서, 인간화 항체 내의 일부 FR 잔기는, 예를 들면, 항체 특이성 또는 친화도를 회복 또는 개선하도록, 비-인간 항체 (예를 들면, HVR 잔기가 유래된 항체) 로부터의 상응하는 잔기에 의해 치환된다.
인간화 항체 및 이의 제조 방법은, 예를 들면, 문헌 [Almagro, and Fransson, Front. Biosci. 13: 1619-1633 (2008)] 에서 검토되어 있고, 예를 들면, 문헌 [Riechmann, et al., Nature 332: 323-329 (1988); Queen, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86: 10029-10033 (1989)]; 미국 특허 US 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321 및 7,087,409; 문헌 [Kashmiri, et al., Methods 36: 25-34 (2005) (SDR (a-CDR) 그래프팅을 기재함); Padlan, Mol. Immunol. 28: 489-498 (1991) ("재표면화 (resurfacing)" 을 기재함); Dall'Acqua, et al., Methods 36: 43-60 (2005) ("FR 셔플링" 을 기재함); 및 Osbourn, et al., Methods 36: 61-68 (2005); 및 Klimka, et al., Br. J. Cancer, 83: 252-260 (2000) (FR 셔플링에 대한 "유도 선택 (guided selection)" 접근을 기재함)] 에 추가로 기재되어 있다.
인간화를 위해 사용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은 다음을 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다: "최적-피트 (best-fit)" 방법을 사용하여 선별된 프레임워크 영역 (예를 들면, 문헌 [Sims, et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993)] 참조); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정 서브그룹의 인간 항체의 공통 서열로부터 유래하는 프레임워크 영역 (예를 들면, 문헌 [Carter, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1992); 및 Presta, et al., J. Immunol., 151: 2623 (1993)] 참조); 인간 성숙 (체세포 돌연변이된) 프레임워크 영역 또는 인간 생식선 프레임워크 영역 (예를 들면, 문헌 [Almagro, and Fransson, Front. Biosci. 13: 1619-1633 (2008)] 참조); 및 FR 라이브러리의 스크리닝으로부터 유래하는 프레임워크 영역 (예를 들면, 문헌 [Baca, et al., J. Biol. Chem. 272: 10678-10684 (1997); 및 Rosok, et al., J. Biol. Chem. 271: 22611-22618 (1996)] 참조).
3. 인간 항체
특정 실시형태에서, 본원에서 제공되는 이중특이적 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 당업계에 공지된 각종 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 인간 항체는 문헌 [van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001); 및 Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20: 450-459 (2008)] 에 일반적으로 기술되어 있다.
인간 항체는, 항원 공격에 반응하여 인간 가변 영역을 가지는 온전한 항체 또는 온전한 인간 항체를 생산하도록 변형된 형질전환 동물에게 면역원을 투여함으로써 제조될 수 있다. 이러한 동물은 전형적으로, 내인성 면역글로불린 유전자좌를 대체하거나, 염색체외에 존재하거나 동물의 염색체 내로 무작위로 통합되는, 인간 면역글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유한다. 이러한 형질전환 마우스에서, 내인성 면역글로불린 유전자좌는 일반적으로 불활성화되었다. 형질전환 동물로부터 인간 항체를 수득하기 위한 방법의 검토에 대해서는 문헌 [Lonberg, Nat. Biotech. 23: 1117-1125 (2005)] 를 참조한다. 또한, 예를 들면, XENOMOUSETM 기술을 기재하고 있는 미국 특허 US 6,075,181 및 6,150,584; HUMAB® 기술을 기재하고 있는 미국 특허 US 5,770,429; K-M MOUSE® 기술을 기재하고 있는 미국 특허 US 7,041,870, 및 VELOCIMOUSE® 기술을 기재하고 있는 미국 출원 공개 US 2007/0061900 을 참조한다. 이러한 동물에 의해 생산된 온전한 항체로부터의 인간 가변 영역은, 예를 들면, 상이한 인간 불변 영역과 조합함으로써 추가로 변형될 수 있다.
인간 항체는 또한 하이브리도마-기반 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 단일클론 항체의 생산을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 헤테로골수종 세포주가 기재되어 있다 (예를 들면, 문헌 [Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 및 Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)] 참조). 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체도 또한 문헌 [Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103: 3557-3562 (2006)] 에 기술되어 있다. 추가의 방법은, 예를 들면, 미국 특허 US 7,189,826 (하이브리도마 세포주로부터의 단일클론 인간 IgM 항체의 제조를 기재함) 및 문헌 [Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4): 265-268 (2006)] (인간-인간 하이브리도마를 기재함) 에 기재된 것들을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술 (트리오마 기술) 은 또한 문헌 [Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3): 927-937 (2005); 및 Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3): 185-91 (2005)] 에 기재되어 있다.
인간 항체는 또한 인간-유래된 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선별된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리함으로써 생성될 수 있다. 이어서, 이러한 가변 도메인 서열은 목적하는 인간 불변 도메인과 조합될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선별하기 위한 기술은 하기에 기재되어 있다.
4. 라이브러리-유래된 항체
본 발명의 이중특이적 항체는 목적하는 활성 또는 활성들을 가지는 항체에 대해 조합 라이브러리를 스크리닝함으로써 단리될 수 있다. 예를 들면, 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하고 이러한 라이브러리를 목적하는 결합 특징을 가지는 항체에 대해 스크리닝하기 위한 각종 방법은 당업계에 공지되어 있다. 이러한 방법은, 예를 들면, 문헌 [Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178: 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)] 에서 검토되어 있고, 예를 들면, 문헌 [McCafferty et al., Nature 348: 552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248: 161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 및 Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)] 에 추가로 기재되어 있다.
특정 파지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리를 폴리머라아제 연쇄 반응 (polymerase chanin reaction: PCR) 에 의해 별도로 클로닝하고, 파지 라이브러리에서 무작위로 재조합하고, 이어서 이것을 문헌 [Winter, et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)] 에 기재된 바와 같이 항원-결합 파지에 대해 스크리닝할 수 있다. 파지는 전형적으로 항체 단편을 단일 쇄 Fv (scFv) 단편으로서 또는 Fab 단편으로서 디스플레이한다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 작제할 필요도 없이 면역원에 대한 높은 친화도 항체를 제공한다. 다르게는, 문헌 [Griffiths, et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)] 에 기재된 바와 같이, (예를 들면, 인간으로부터) 순수한 레퍼토리를 클로닝하여, 어떠한 면역화도 없이 광범위한 비-자가 및 또한 자가 항원에 대한 항체의 단일 출처의 항체를 제공할 수 있다. 마지막으로, 순수한 라이브러리는 또한 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)] 에 기재된 바와 같이, 줄기 세포로부터 재배열되지 않은 V-유전자 분절을 클로닝하고, 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용하여 고도 가변 CDR3 영역을 암호화하고 시험관내 재배열을 달성함으로써, 합성에 의해 제조될 수 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 기재하고 있는 특허 공보는, 예를 들면, 미국 특허 US 5,750,373 및 미국 출원 공개 US 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 및 2009/0002360 을 포함한다.
인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은 본원에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로 간주된다.
5. 항체 변이체
특정 실시형태에서, 본원에서 제공된 이중특이적 항체의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들면, 이중특이적 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 이중특이적 항체의 아미노산 서열 변이체는 이중특이적 항체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 내에 적절한 변형을 도입함으로써 또는 펩타이드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이러한 변형은 항체의 아미노산 서열로부터의 결실, 및/또는 이러한 서열 내로의 삽입, 및/또는 이러한 서열 내의 잔기의 치환을 포함한다. 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합을 수행하여 최종 작제물에 도달할 수 있지만, 단, 최종 작제물은 목적하는 특징, 예를 들면, 항원-결합 특징을 가져야 한다.
a) 치환, 삽입 및 결실 변이체
특정 실시형태에서, 1 개 이상의 아미노산 치환을 가지는 항체 변이체가 제공된다. 치환 돌연변이유발을 위한 관심 부위는 HVR 및 FR 을 포함한다. 보존적 치환은 표 2 에서 "보존적 치환" 의 제목 하에 나타나 있다. 보다 많은 실질적 변화들이 표 2 에서 "치환의 예" 의 제목 하에 제공되어 있고, 아미노산 측쇄 클래스와 관련하여 하기에 추가로 기재되어 있다. 아미노산 치환을 관심 대상의 항체 내로 도입할 수 있고, 생성물을 목적하는 활성, 예를 들면, 유지/개선된 항원 결합, 또는 감소된 면역원성에 대해 스크리닝할 수 있다.
표 2
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아미노산은 공통적인 측쇄 특성에 따라 분류할 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 이들 클래스 중의 하나의 구성원을 다른 클래스로 교환하는 것을 포함할 것이다.
치환 변이체의 한 유형은 부모 항체 (예를 들면, 인간화 또는 인간 항체) 의 1 개 이상의 과가변 영역 잔기를 치환시키는 것을 포함한다. 일반적으로, 추가의 연구를 위해 선별되는 수득된 변이체 (들) 은 부모 항체에 비해 특정 생물학적 특성 (예를 들면, 증가된 친화도, 감소된 면역원성) 의 변형 (예를 들면, 개선) 을 가지고/가지거나 부모 항체의 실질적으로 유지된 특정 생물학적 특성을 가질 것이다. 예시적인 치환 변이체는 친화도 성숙된 항체이며, 이것은, 예를 들면, 본원에 기재된 것들과 같은 파지-디스플레이-기반 친화도 성숙 기술을 사용하여 편리하게 생성될 수 있다. 간단히 말하자면, 1 개 이상의 HVR 잔기를 돌연변이시키고, 변이체 항체를 파지 상에 디스플레이하고, 특정 생물학적 활성 (예를 들면, 결합 친화도) 에 대해 스크리닝한다.
예를 들면, 항체 친화도를 개선하기 위해, 변경 (예를 들면, 치환) 이 HVR 에서 일어날 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스팟 (hotspot)", 즉, 체세포 돌연변이 과정 동안 높은 빈도로 돌연변이를 겪는 코돈에 의해 암호화되는 잔기 (예를 들면, 문헌 [Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207: 179-196 (2008)] 참조), 및/또는 SDR (a-CDR) 에서 일어날 수 있으며, 수득된 변이체 VH 또는 VL 은 결합 친화도에 대해 테스트한다. 2차 라이브러리로부터의 작제 및 재선별에 의한 친화도 성숙은, 예를 들면, 문헌 [Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178: 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)] 에 기재되어 있다. 친화도 성숙의 일부 실시형태에서, 임의의 각종 방법 (예를 들면, 오류-유발 PCR, 쇄 셔플링 또는 올리고뉴클레오타이드-지정 돌연변이유발) 에 의해, 성숙을 위해 선택된 가변 유전자 내로 다양성을 도입한다. 이어서, 2차 라이브러리를 생성한다. 이어서, 상기 라이브러리를 스크리닝하여 목적하는 친화도를 가지는 임의의 항체 변이체를 확인한다. 다양성을 도입하기 위한 다른 방법은 몇몇의 HVR 잔기 (예를 들면, 한번에 4 개 내지 6 개의 잔기) 가 무작위배정되는 HVR-지정 접근방법을 포함한다. 항원 결합에 관여하는 HVR 잔기는, 예를 들면, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모델링을 사용하여 특이적으로 확인될 수 있다. CDR-H3 및 CDR-L3 이 특히 종종 표적화된다.
특정 실시형태에서, 이러한 변경이 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 치환, 삽입 또는 결실은 1 개 이상의 HVR 내에서 일어날 수 있다. 예를 들면, 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경 (예를 들면, 본원에 제공된 바와 같은 보존적 치환) 은 HVR 에서 일어날 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스팟" 또는 SDR 의 외부에서 일어날 수 있다. 상기에서 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 특정 실시형태에서, 각각의 HVR 은 변경되지 않거나, 1 개, 2 개 또는 3 개 이하의 아미노산 치환을 함유한다.
돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역을 확인하기에 유용한 방법은, 문헌 [Cunningham, and Wells (1989) Science 244: 1081-1085] 에 기재된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발" 로 지칭된다. 이러한 방법에서, 잔기 또는 표적 잔기들의 그룹 (예를 들면, arg, asp, his, lys 및 glu 와 같은 하전된 잔기들) 을 확인하고, 중성 또는 음으로 하전된 아미노산 (예를 들면, 알라닌 또는 폴리알라닌) 으로 대체하여 항체와 항원의 상호작용이 영향을 받는지 여부를 결정한다. 초기 치환에 대해 기능적 민감성을 나타내는 아미노산 위치에 추가의 치환을 도입할 수 있다. 다르게는 또는 추가로는, 항체와 항원 사이의 접촉점을 확인하기 위한 항원-항체 복합체의 결정 구조. 이러한 접촉 잔기 및 인접 잔기를 치환을 위한 후보로서 표적화하거나 제거할 수 있다. 변이체를 스크리닝하여 이들이 목적하는 특성을 가지는지 여부를 확인할 수 있다.
아미노산 서열 삽입은, 길이가 1 개의 잔기로부터 100 개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩타이드까지의 범위인 아미노-말단 및/또는 카복실-말단 융합 뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 가지는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩타이드 또는 효소 (예를 들면, ADEPT 을 위한) 에 대한 항체의 N-말단 또는 C-말단의 융합을 포함한다.
b) 시스테인 조작된 항체 변이체
특정 실시형태에서, 시스테인 조작된 이중특이적 항체, 예를 들면, 이중특이적 항체의 1 개 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환되어 있는 "thioMAb" 을 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 특정 실시형태에서, 치환된 잔기는 이중특이적 항체의 접근가능한 부위에서 발생한다. 이러한 잔기를 시스테인으로 치환함으로써, 이에 의해 반응성 티올기를 항체의 접근가능한 부위에 위치시키고, 이러한 반응성 티올기를 사용하여 항체를 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티와 같은 다른 모이어티에 접합시키고, 본원에 추가로 기재된 바와 같은 면역접합체를 생성할 수 있다. 특정 실시형태에서, 임의의 1 개 이상의 다음 잔기를 시스테인으로 치환할 수 있다: 경쇄의 V205 (Kabat 번호지정) 및 중쇄의 A118 (EU 번호지정). 시스테인 조작된 항체는, 예를 들면, 미국 특허 US 7,521,541 에 기재된 바와 같이 생성될 수 있다.
c) 항체 유도체
특정 실시형태에서, 본원에서 제공되는 이중특이적 항체는, 당업계에서 공지되어 있고 용이하게 입수가능한 추가의 비단백질성 모이어티를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 이중특이적 항체의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 중합체를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 수용성 중합체의 비-제한적 예는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (단독중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 (예를 들면, 글리세롤), 폴리비닐 알코올 및 이들의 혼합물을 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데하이드는 이의 수중 안정성으로 인해 제조시에 이점을 가질 수 있다. 상기 중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있고, 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 항체에 부착되는 중합체의 수는 달라질 수 있고, 1 개 초과의 중합체가 부착되는 경우, 이들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은, 개선될 항체의 특별한 특성 또는 기능, 항체 유도체가 규정 조건 하의 요법에서 사용될지 여부 등을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 고려사항에 기초하여 결정될 수 있다.
다른 실시형태에서, 방사선에 대한 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 비단백질성 모이어티와 이중특이적 항체의 접합체가 제공된다. 하나의 실시형태에서, 비단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브이다 [Kam, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)]. 방사선은, 임의의 파장을 가질 수 있고, 평범한 세포를 손상시키지 않지만 항체-비단백질성 모이어티에 근접한 세포가 사멸하는 온도까지 비단백질성 모이어티를 가열하는 파장을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
C. 재조합 방법 및 조성물
본 발명의 이중특이적 항체는, 예를 들면, 고체-상태 펩타이드 합성 (예를 들면, Merrifield 고체 상 합성) 또는 재조합 제조를 통해 수득될 수 있다. 재조합 방법의 경우, 예를 들면, 상기 기재된 바와 같은 이중특이적 항체 (단편) 를 암호화하는 1 개 이상의 폴리뉴클레오타이드를 단리하고, 숙주 세포에서 추가의 클로닝 및/또는 발현을 위한 1 개 이상의 벡터에 삽입한다. 이러한 폴리뉴클레오타이드는 통상의 절차를 이용하여 용이하게 단리하고 서열분석할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 1 개 이상 포함하는 벡터, 바람직하게는 발현 벡터가 제공된다. 당업자에게 잘 공지되어 있는 방법을 이용하여, 적절한 전사/번역 제어 신호와 함께 이중특이적 항체 (단편)의 암호화 서열을 포함하는 발현 벡터를 작제할 수 있다. 이들 방법은 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술 및 생체내 재조합/유전자 재조합을 포함한다. 예를 들면, 문헌 [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989); 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989)] 에 기재된 기술을 참조한다. 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스의 일부일 수 있거나, 핵산 단편일 수 있다. 발현 벡터는, 이중특이적 항체 (단편) 를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 (즉, 암호화 영역) 가 프로모터 및/또는 다른 전사 또는 번역 제어 요소와 작동가능한 연합으로 클로닝되는 발현 카세트를 포함한다. 본원에서 사용되는 "암호화 영역" 은 아미노산으로 번역되는 코돈으로 이루어진 핵산 부분이다. 비록 "정지 코돈" (TAG, TGA 또는 TAA) 은 아미노산으로 번역되지 않지만, 존재하는 경우에는 암호화 영역의 일부로 고려될 수 있으나, 임의의 인접 서열, 예를 들면, 프로모터, 리보솜 결합 부위, 전사 종결자, 인트론, 5' 및 3' 미번역 영역 등은 암호화 영역의 일부가 아니다. 2 개 이상의 암호화 영역은 단일 폴리뉴클레오타이드 작제물 내에, 예를 들면, 단일 벡터 상에 존재하거나, 별도의 폴리뉴클레오타이드 작제물 내에, 예를 들면, 별도의 (상이한) 벡터 상에 존재할 수 있다. 더욱이, 임의의 벡터는 단일 암호화 영역을 포함할 수 있거나, 2 개 이상의 암호화 영역을 포함할 수 있는데, 예를 들면, 본 발명의 벡터는 단백질분해 절단을 통해 최종 단백질로 번역과 동시에 또는 번역 후에 분리되는 1 개 이상의 폴리펩타이드를 암호화할 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산은 본 발명의 이중특이적 항체 (단편) 를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 변이체 또는 유도체와 융합 또는 비융합된 이종 암호화 영역을 암호화할 수 있다. 이종 암호화 영역은 특수 요소 또는 모티프, 예를 들면, 분비 신호 펩타이드 또는 이종 기능성 도메인을 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 작동가능한 연합은, 유전자 산물, 예를 들면, 폴리펩타이드에 대한 암호화 영역이, 조절 서열 (들) 의 영향 또는 제어 하에 유전자 산물의 발현을 하게 하는 방식으로, 1 개 이상의 조절 서열들과 연합될 때이다. 2 개의 DNA 단편들 (예를 들면, 폴리펩타이드 암호화 영역 및 이와 함께 연합된 프로모터) 은, 프로모터 기능의 유도가 목적하는 유전자 산물을 암호화하는 mRNA 의 전사를 초래하는 경우, 및 2 개의 DNA 단편들 간의 연결 성질이 유전자 산물의 발현을 지시하는 발현 조절 서열의 능력을 방해하지 않거나 전사되는 DNA 주형의 능력을 방해하지 않는 경우, "작동가능하게 연합된다". 따라서, 프로모터 영역은, 그 프로모터가 핵산의 전사를 가져올 수 있었던 경우, 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산과 작동가능하게 연합될 것이다. 프로모터는 오로지 소정의 세포 내에서만 DNA 의 실질적 전사를 지시하는 세포-특이적 프로모터일 수 있다. 프로모터 이외의 다른 전사 제어 요소, 예를 들면, 인핸서, 작동유전자, 억제인자, 및 전사 종료 신호는 폴리뉴클레오타이드와 작동가능하게 연합하여 세포-특이적 전사를 지시할 수 있다. 적합한 프로모터 및 다른 전사 제어 영역은 본원에 개시되어 있다. 각종 전사 제어 영역은 당업자에게 공지되어 있다. 이들은 척추동물 세포에서 작용하는 전사 제어 영역, 예를 들면, 이들에 한정되는 것은 아니지만 사이토메갈로바이러스 (예를 들면, 인트론-A 와 결합되는 조기 발현 프로모터), 시미안 바이러스 40 (예를 들면, 조기 발현 프로모터) 및 레트로바이러스 (예를 들면, 라우스 육종 바이러스) 로부터의 프로모터 및 인핸서를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 다른 전사 제어 영역은 액틴, 열 충격 단백질, 소 성장 호르몬 및 토끼 알파 글로빈과 같은 척추동물 유전자로부터 유래된 것들 뿐만 아니라 진핵 세포 내에서 유전자 발현을 제어할 수 있는 다른 서열을 포함한다. 추가의 적합한 전사 제어 영역은 조직-특이적 프로모터 및 인핸서 뿐만 아니라 유도성 프로모터 (예를 들면, 프로모터 유도성 테트라사이클린) 를 포함한다. 마찬가지로, 각종 번역 제어 요소는 당업자에게 공지되어 있다. 이들은 리보솜 결합 부위, 번역 개시 및 종료 코돈, 및 바이러스 시스템 유래의 요소 (특히, 내부 리보솜 진입 부위 (internal ribosome entry site: IRES) 또는 IRES, 또한 CITE 서열로도 지칭함) 를 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 발현 카세트는 또한 다른 특징, 예를 들면, 복제 원점, 및/또는 염색체 통합 요소, 예를 들면, 레트로바이러스의 긴 말단 반복부 (long terminal repeat: LTR) 또는 아데노-관련 바이러스 (adeno-associated virus: AAV) 의 역전 말단 반복부 (inverted terminal repeat: ITR) 를 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및 핵산 암호화 영역은, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 분비를 지시하는 분비 또는 신호 펩타이드를 암호화하는 추가의 암호화 영역과 연합될 수 있다. 예를 들면, 이중특이적 항원 결합 분자의 분비가 바람직한 경우, 신호 서열을 암호화하는 DNA 는 본 발명의 이중특이적 항체를 암호화하는 핵산 또는 그 단편의 상류에 배치될 수 있다. 신호 가설에 따르면, 포유동물 세포에 의해 분비된 단백질은 신호 펩타이드 또는 분비 선도 서열을 가지고 있는데, 이것은 조면 소포체를 가로질러 성장 단백질 쇄의 유출이 개시되면 성숙 단백질로부터 절단된다. 척추동물 세포에 의해 분비된 폴리펩타이드는 일반적으로 그 폴리펩타이드의 N-말단에 융합된 신호 펩타이드를 가지며, 이것은 번역된 폴리펩타이드로부터 절단되어, 분비되거나 "성숙된" 형태의 폴리펩타이드를 생성한다는 것을 당업자들은 알고 있다. 특정 실시형태에서, 천연 신호 펩타이드, 예를 들면, 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 신호 펩타이드, 또는 이와 작동가능하게 연합된 폴리펩타이드의 분비를 지시하는 능력을 보유하는 서열의 기능성 유도체가 사용된다. 다르게는, 이종 포유동물 신호 펩타이드 또는 이의 기능성 유도체가 사용될 수 있다. 예를 들면, 야생형 선도 서열은 마우스 β-글루쿠로니다아제 또는 인간 조직 플라스미노겐 활성자 (TPA) 의 선도 서열로 치환될 수 있다.
후기 정제 (예를 들면, 히스티딘 태그) 를 용이하게 하거나 이중특이적 항체의 표지를 보조하는데 사용될 수 있는 짧은 단백질 서열을 암호화하는 DNA 는 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 이중특이적 항체 (단편) 내에 또는 이의 말단에 포함될 수 있다.
추가의 실시형태에서, 본 발명의 1 개 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 1 개 이상의 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 폴리뉴클레오타이드 및 벡터는, 각각 폴리뉴클레오타이드 및 벡터와 관련하여 본원에서 기재된 임의의 특징들을 단독으로 또는 조합으로 포함할 수 있다. 하나의 이러한 실시형태에서, 숙주 세포는 본 발명의 이중특이적 항체 (의 일부) 를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 포함한다 (예를 들면, 이 벡터에 의해 형질전환 또는 형질감염된다). 본원에서 사용되는 용어 "숙주 세포" 란, 본 발명의 이중특이적 항체 또는 이의 단편을 제조하도록 조작될 수 있는 임의 종류의 세포 시스템을 의미한다. 이중특이적 항체의 발현을 복제하고 지지하는데 적합한 숙주 세포는 당업계에 잘 공지되어 있다. 이러한 세포는 적절하게는 특정 발현 벡터에 의해 형질감염 또는 형질도입될 수 있으며, 다량의 벡터 함유 세포를 씨딩 (seeding) 을 위해 대규모 발효조에서 성장시켜, 임상 적용을 위해 충분한 양의 이중특이적 항체를 수득할 수 있다. 적합한 숙주 세포는 원핵 미생물, 예를 들면, 대장균, 또는 각종 진핵 세포, 예를 들면, 중국 햄스터 난소 세포 (Chinese hamster Ovary cell: CHO 세포), 곤충 세포 등을 들 수 있다. 예를 들면, 폴리펩타이드는, 특히 글리코실화가 요구되지 않을 때, 박테리아에서 생산될 수 있다. 발현 후, 폴리펩타이드는 가용성 분획으로 박테리아 세포 페이스트로부터 단리될 수 있고, 추가로 정제될 수 있다. 원핵생물에 추가하여, 글리코실화 경로를 "인간화"시킴으로써 부분적이거나 완전한 인간 글리코실화 패턴을 가지는 폴리펩타이드를 제조하는 진균 및 효모 균주를 포함한, 사상균 또는 효모와 같은 진핵 미생물은 폴리펩타이드-암호화 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 문헌 [Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004); 및 Li et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006)] 을 참조한다. (글리코실화) 폴리펩타이드의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체 (무척추동물 및 척추동물) 로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 특히 스포도프테라 프루지페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해, 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 다수의 바큘로바이러스 균주가 동정되었다. 식물 세포 배양물도 또한 숙주로서 이용될 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 US 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978 및 6,417,429 (형질전환 식물에서 항체를 생성하기 위한 PLANTIBODIES™ 기술을 기재함) 를 참조한다. 척추동물 세포도 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 현탁액에서 성장하도록 적응시킨 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40 에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7); 인간 배아 신장 세포주 (예를 들면, 문헌 [Graham et al., J Gen Virol 36, 59 (1977)] 에 기재된 바와 같은 293 또는 293T 세포); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK); 마우스 세르톨리 세포 (예를 들면, 문헌 [Mather, Biol. Reprod 23, 243-251 (1980)] 에 기재된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포 (CV1); 아프리카 초록 원숭이 신장 세포 (VERO-76); 인간 자궁경부암 세포 (HELA); 개 신장 세포 (MDCK); 버팔로 래트 간세포 (BRL 3A); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포 (Hep G2); 마우스 유방암 세포 (MMT 060562); TRI 세포 (예를 들면, 문헌 [Mather, et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383, 44-68 (1982)] 에 기재된 바와 같음); MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는, dhfr- CHO 세포 [Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980)] 를 포함한 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포; 및 Y0, NS0, P3X63 및 Sp2/0 와 같은 골수종 세포주를 포함한다. 단백질 생산에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해, 예를 들면, 문헌 [Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)] 을 참조한다. 숙주 세포는 배양 세포, 예를 들면, 몇 가지만 언급하자면, 포유동물 배양 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 박테리아 세포 및 식물 세포 뿐만 아니라, 형질전환 동물, 형질전환 식물 또는 배양 식물 또는 동물 조직 내에 포함된 세포도 포함된다. 하나의 실시형태에서, 숙주 세포는 진핵 세포, 바람직하게는 포유동물 세포, 예를 들면, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 인간 배아 신장 (HEK) 세포 또는 림프계 세포 (예를 들면, Y0, NS0, Sp20 세포) 이다. 외래 유전자를 이들 시스템에서 발현시키기 위한 표준 기술은 당업계에 공지되어 있다. 항체와 같은 항원 결합 도메인의 중쇄 또는 경쇄를 포함하는 폴리펩타이드를 발현하는 세포는, 항체 쇄의 나머지를 발현하기 위해 조작되어, 발현된 생성물은 중쇄와 경쇄 모두를 가지는 항체가 될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체의 제조 방법이 제공되는데, 여기서, 상기 방법은 이중특이적 항원 결합 분자의 발현에 적합한 조건 하에서 본원에서 제공되는 이중특이적 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포를 배양하고, 숙주 세포 (또는 숙주 세포 배양 배지) 로부터 이중특이적 항체를 회수하는 것을 포함한다.
이중특이적 항체의 성분들은 서로 유전자 융합된다. 이중특이적 항체는 성분들이 서로 직접 융합되거나 링커 서열을 통해 간접적으로 융합되도록 디자인될 수 있다. 링커의 조성 및 길이는 당업계에 잘 공지된 방법에 따라 결정될 수 있으며, 효능에 대해 테스트될 수 있다. 이중특이적 항체의 상이한 성분들 사이의 링커 서열의 예는 본원에서 제공된 서열에서 발견된다. 추가의 서열들, 예를 들면, 엔도펩티다아제 인지 서열도 또한 경우에 따라 각각의 융합 성분들을 분리하기 위한 절단 부위를 도입하도록 포함될 수 있다.
특정 실시형태에서, 이중특이적 항체의 1 개 이상의 항원 결합 모이어티는 항원 결정인자와 결합할 수 있는 항체 가변 영역을 적어도 포함한다. 가변 영역은 자연적 또는 비자연적 발생 항체 및 이의 단편의 일부를 형성하거나, 이들로부터 유래될 수 있다. 다클론 항체 및 단일클론 항체의 제조 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다 (예를 들면, 문헌 [Harlow and Lane, "Antibodies, a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988] 참조). 비자연적 발생 항체는 또한 고체 상-펩타이드 합성을 이용하여 작제될 수 있거나, 재조합적으로 제조될 수 있거나 (예를 들면, 미국 특허 US 4,186,567 에 기재된 바와 같음), 예를 들면, 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 포함하는 조합 라이브러리를 스크리닝함으로써 수득될 수 있다 (예를 들면, McCafferty 의 미국 특허 US 5,969,108 참조).
임의의 동물 종의 항체, 항체 단편, 항원 결합 도메인 또는 가변 영역은 본 발명의 이중특이적 항체에서 사용될 수 있다. 본 발명에서 유용한 항체, 항체 단편, 항원 결합 도메인 또는 가변 영역은 쥐과동물, 영장류 또는 인간 기원의 것일 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 항체가 인간 용도를 위해 의도되는 경우, 항체의 불변 영역이 인간으로부터 유래되는 키메라 형태의 항체를 사용할 수 있다. 인간화 또는 완전 인간 형태의 항체도 또한 당업계에 잘 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다 (예를 들면, Winter 의 미국 특허 US 5,565,332 참조). 인간화는 (a) 비-인간 (예를 들면, 공여 항체) CDR 을, 중요한 프레임워크 잔기들 (예를 들면, 양호한 항원 결합 친화도 또는 항체 기능을 보유하는데 중요한 것들) 을 보유하거나 보유하지 않는 인간 (예를 들면, 수령 항체) 프레임워크 및 불변 영역 상에 이식하는 것, (b) 오로지 비-인간 특이성-결정 영역 (SDR 또는 a-CDR; 항체-항원 상호작용에 중요한 잔기) 만을 인간 프레임워크 및 불변 영역 상에 이식하는 것, 또는 (c) 비-인간 가변 도메인 전체를 이식하지만, 표면 잔기의 대체에 의해 인간-유사 섹션으로 이들을 "은폐 (cloaking)" 하는 것을 포함한 각종 방법에 의해 달성될 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 인간화 항체 및 이의 제조 방법은, 예를 들면, 문헌 [Almagro and Fransson, Front Biosci 13, 1619-1633 (2008)] 에서 검토되었으며, 예를 들면, 문헌 [Riechmann et al., Nature 332, 323-329 (1988); Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989)]; 미국 특허 US 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321 및 7,087,409; 문헌 [Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv Immunol 44, 65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988); Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217 (1994); Kashmiri et al., Methods 36, 25-34 (2005) (SDR (a-CDR) 이식을 기재함); Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 (1991) ("재표면화" 를 기재함); Dall'Acqua et al., Methods 36, 43-60 (2005) ("FR 셔플링" 을 기재함); 및 Osbourn et al., Methods 36, 61-68 (2005) 및 Klimka et al., Br J Cancer 83, 252-260 (2000) (FR 셔플링에 대한 "유도 선택" 접근을 기재함)] 에 추가로 기재되어 있다. 인간 항체 및 인간 가변 영역은 당업계에 공지된 각종 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 문헌 [van Dijk and van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 368-74 (2001) 및 Lonberg, Curr Opin Immunol 20, 450-459 (2008)] 에 기재되어 있다. 인간 가변 영역은 하이브리도마 방법에 의해 제조된 인간 단일클론 항체의 일부를 형성할 수 있거나, 이로부터 유래될 수 있다 (예를 들면, 문헌 [Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)] 참조). 인간 항체 및 인간 가변 영역은 또한 항원 공격에 반응하여 온전한 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 가지는 온전한 인간 항체를 제조하도록 변형된 형질전환 동물에게 면역원을 투여함으로써 제조될 수 있다 (예를 들면, 문헌 [Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005)] 참조). 인간 항체 및 인간 가변 영역은 또한 인간-유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 영역 서열을 단리함으로써 제조될 수 있다 (예를 들면, 문헌 [Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001); 및 McCafferty et al., Nature 348, 552-554; Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991)] 참조). 파지는 전형적으로 단일-쇄 Fv (scFv) 단편으로서 또는 Fab 단편으로서 항체 단편을 디스플레이한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 이중특이적 항체는, 예를 들면, 그 전문이 본원에서 참조로 인용된 미국 출원 공개 US 2004/0132066 에서 개시된 방법에 따라 증강된 결합 친화도를 가지도록 조작된다. 특이적 항원 결정인자에 결합하는 본 발명의 이중특이적 항체의 능력은 효소-결합 면역흡착 측정법 (ELISA) 또는 당업자에게 익숙한 다른 기술, 예를 들면, 표면 플라스몬 공명 기술 (BIACORE T100 시스템 상에서 분석함) [Liljeblad, et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)] 및 전통적인 결합 검정 [Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)] 을 통해 측정될 수 있다. 경쟁 검정은 특정 항원에 결합하기 위해 기준 항체와 경쟁하는 항체, 항체 단편, 항원 결합 도메인 또는 가변 도메인, 예를 들면, CD3 에 결합하기 위해 V9 항체와 경쟁하는 항체를 확인하는데 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 이러한 경쟁 항체는 기준 항체에 의해 결합되는 동일한 에피트프 (예를 들면, 선형 또는 입체형태 에피토프) 에 결합한다. 항체가 결합하는 에피토프를 지도화하기 위한 상세한 예시적인 방법은 문헌 [Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)] 에서 제공된다. 예시적인 경쟁 검정에서, 고정 항원 (예를 들면, CD3) 은, 항원에 결합하는 제 1 표지 항체 (예를 들면, V9 항체) 및 항원에 결합하기 위해 제 1 항체와 경쟁하는 능력에 대해 테스트되는 제 2 비표지 항체를 포함하는 용액 중에서 항온처리된다. 제 2 항체는 하이브리도마 상청액에 존재할 수 있다. 대조군으로서, 고정 항원은 제 1 표지 항체를 포함하지만 제 2 비표지 항체를 포함하지 않는 용액 중에서 항온처리된다. 항원에 대한 제 1 항체의 결합의 허용 조건 하에서 항온처리 후, 과량의 미결합된 항체를 제거하고, 고정 항원과 연합된 표지의 양을 측정한다. 고정 항원과 연합된 표지의 양이 대조군 샘플과 비교하여 테스트 샘플에서 실질적으로 감소하는 경우, 이것은 제 2 항체가 항원에 결합하기 위해 제 1 항체와 경쟁하고 있는 것을 나타낸다. 문헌 [Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)] 을 참조한다.
본원에서 기재된 바와 같이 제조된 이중특이적 항체는 고성능 액체 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 전기영동, 친화도 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 등과 같은 당업계에 공지된 기술로에 의해 정제할 수 있다. 특정 단백질을 정제하는데 사용되는 실제 조건은 부분적으로 순수한 전하, 소수성, 친수성 등과 같은 인자에 따라 좌우될 것이며, 당업자에게는 자명할 것이다. 친화도 크로마토그래피 정제를 위해, 이중특이적 항체가 결합하는 항체, 리간드, 수용체 또는 항원을 사용할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 이중특이적 항체의 친화도 크로마토그래피 정제를 위해, 단백질 A 또는 단백질 G 를 가지는 매트릭스가 사용될 수 있다. 순차적인 단백질 A 또는 G 친화도 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 실시예에서 기재된 바와 같은 본질적으로 이중특이적 항체를 단리할 수 있다. 이중특이적 항체의 순도는 겔 전기영동, 고압 액체 크로마토그래피 등을 포함한 잘 공지된 임의의 각종 분석 방법에 의해 측정할 수 있다.
D. 검정
본원에서 제공된 이중특이적 항체는 이의 물리적/화학적 특성 및/또는 생물학적 활성에 대해 당업계에 공지된 각종 검정을 통해 확인, 스크리닝 또는 특성화할 수 있다.
1. 결합 검정 및 다른 검정
하나의 측면에서, 본 발명의 이중특이적 항체는, 예를 들면, ELISA, 웨스턴 블롯 등과 같은 공지된 방법에 의해 이의 항원 결합 활성에 대해 테스트된다.
다른 측면에서, 경쟁 검정은 제 1 항원 또는 제 2 항원과 결합하기 위해 특이적 항체와 경쟁하는 항체를 확인하는데 이용할 수 있다. 특정 실시형태에서, 이러한 경쟁 항체는 특이적 항체에 의해 결합되는 동일한 에피토프 (예를 들면, 선형 또는 입체형태 에피토프) 에 결합한다. 항체가 결합하는 에피토프를 지도화하기 위한 상세한 예시적인 방법은 문헌 [Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)] 에 제공된다.
2. 활성 검정
하나의 측면에서, 생물학적 활성을 가지는 이의 이중특이적 항체를 확인하는 검정이 제공된다. 생물학적 활성은, 예를 들면, 표적화 세포의 용균 또는 아폽토시스의 유도를 포함할 수 있다. 생체 내에서 및/또는 시험관 내에서 이러한 생물학적 활성을 가지는 항체가 또한 제공된다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 이중특이적 항체는 상기 생물학적 활성에 대해 테스트된다. 세포 용균 (예를 들면, LDH 방출의 측정에 의함) 또는 아폽토시스 (예를 들면, TUNEL 검정을 이용함) 를 탐지하기 위한 검정은 당업계에 잘 공지되어 있다.
E. 면역접합체
본 발명은 1 개 이상의 세포독성제, 예를 들면, 화학치료제 또는 약물, 성장 억제제, 독소 (예를 들면, 단백질 독소, 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소, 또는 이들의 단편), 또는 방사성 동위원소와 접합된 본 발명의 이중특이적 항체를 포함하는 면역접합체를 또한 제공한다.
하나의 실시형태에서, 면역접합체는, 항체가 메이탄시노이드 (미국 특허 US 5,208,020, 5,416,064 및 유럽 특허 EP 0 425 235 B1 참조); 아우리스타틴, 예를 들면, 모노메틸아우리스타틴 약물 모이어티 DE 및 DF (MMAE 및 MMAF) (미국 특허 US 5,635,483 및 5,780,588 및 7,498,298 참조); 돌라스타틴; 칼리케아미신 또는 이의 유도체 (미국 특허 US 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001 및 5,877,296; 문헌 [Hinman et al., Cancer Res. 53: 3336-3342 (1993); 및 Lode et al., Cancer Res. 58: 2925-2928 (1998)] 참조); 안트라사이클릭, 예를 들면, 다우노마이신 또는 독소루비신 (문헌 [Kratz et al., Current Med. Chem. 13: 477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16: 358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16: 717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12: 1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45: 4336-4343 (2002)]; 및 미국 특허 US 6,630,579 참조); 메토트렉세이트; 빈데신; 탁산, 예를 들면, 도세탁셀, 파클리탁셀, 라로탁셀, 테세탁셀 및 오르타탁셀; 트리코테센; 및 CC1065 를 포함하지만 이들에 한정되지 않은 1 개 이상의 약물에 접합되어 있는 항체-약물 접합체 (antibody-drug conjugate: ADC) 이다.
다른 실시형태에서, 면역접합체는 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 미결합 활성 단편, 엑소톡신 A 쇄 (슈도모나스 아에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa) 로부터), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이 (Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나 (Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 (Momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 (Sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 효소적 활성 독소 또는 이의 단편에 접합된 본원에 기재된 바와 같은 이중특이적 항체를 포함한다.
다른 실시형태에서, 면역접합체는 방사성 원자에 접합되어 방사성 접합체 (radioconjugate) 를 형성하는 본원에서 기재된 이중특이적 항체를 포함한다. 각종 방사성 동위원소는 방사성 접합체의 제조에 이용가능하다. 그 예는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu 의 방사성 동위원소를 포함한다. 방사성 접합체가 탐지를 위해 사용될 때, 이것은 신티그래피 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들면, tc99m 또는 I123, 또는 핵 자기 공명 (NMR) 영상화 (또한 자기 공명 영상화, mri 로도 알려짐) 를 위한 스핀 표지, 예를 들면, 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.
이중특이적 항체와 세포독성제의 접합체는 각종 이작용성 단백질 커플링제, 예를 들면, N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP), 석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이작용성 유도체 (예를 들면, 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예를 들면, 디석신이미딜 수베레이트), 알데하이드 (예를 들면, 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물 (예를 들면, 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예를 들면, 비스(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예를 들면, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 불소 화합물 (예를 들면, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠) 을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들면, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta, et al., Science 238: 1098 (1987)] 에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA) 은 항체에 대한 방사성 뉴클레오타이드 (radionucleotide) 의 접합을 위한 예시적인 킬레이트제이다. WO 94/11026 을 참조한다. 링커는 세포에서 세포독성 약물의 방출을 용이하게 하는 "절단가능한 링커" 일 수 있다. 예를 들면, 산-불안정성 링커, 펩티다아제-민감성 링커, 광불안정성 링커, 디메틸 링커 또는 다이설파이드-함유 링커 (문헌 [Chari et al., Cancer Res. 52: 127-131 (1992)]; 미국 특허 US 5,208,020) 가 사용될 수 있다.
본원에서의 면역접합체 또는 ADC 는 상업적으로 입수가능한 (예를 들면, Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A 로부터) BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 설포-EMCS, 설포-GMBS, 설포-KMUS, 설포-MBS, 설포-SIAB, 설포-SMCC 및 설포-SMPB, 및 SVSB (석신이미딜-(4-비닐설폰)벤조에이트) 를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 가교결합제 시약으로 제조된 이러한 접합체를 명백히 고려하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
F. 진단 및 탐지를 위한 방법 및 조성물
특정 실시형태에서, 본원에서 제공되는 임의의 이중특이적 항체는 생물학적 샘플 중의 제 1 항원 및/또는 제 2 항원의 존재를 탐지하는데 유용하다. 본원에서 사용되는 용어 "탐지함" 은 정량적 또는 정성적 탐지를 포함한다. 특정 실시형태에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 진단 또는 탐지의 방법에 사용하기 위한 이중특이적 항체가 제공된다. 추가의 측면에서, 생물학적 샘플 중의 제 1 항원 및/또는 제 2 항원의 존재를 탐지하는 방법이 제공된다. 특정 실시형태에서, 상기 방법은 제 1 항원 및/또는 제 2 항원에 대한 이중특이적 항체의 결합의 허용 조건 하에 생물학적 샘플과 본원에 기재된 이중특이적 항체를 접촉시키고, 이중특이적 항체와 제 1 항원 및/또는 제 2 항원 사이에 복합체가 형성되는지 여부를 탐지하는 것을 포함한다. 이러한 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다. 하나의 실시형태에서, 이중특이적 항체는 이중특이적 항체 요법에 적격인 피험자를 선별하기 위해 사용되며, 예를 들면, 여기서, 제 1 항원 및/또는 제 2 항원은 환자의 선별을 위한 바이오마커이다.
본 발명의 항체를 사용하여 진단될 수 있는 예시적인 장애는 암을 포함한다.
특정 실시형태에서, 표지된 이중특이적 항체가 제공된다. 표지는 직접적으로 탐지되는 표지 또는 모이어티 (예를 들면, 형광, 발색, 전자-밀도, 화학발광 및 방사성 표지) 뿐만 아니라, 예를 들면, 효소 반응 또는 분자 상호작용을 통해 간접적으로 탐지되는 모이어티, 예를 들면, 효소 또는 리간드를 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 예시적 표지는 방사성동위원소 32P, 14C, 125I, 3H 및 131I, 형광단, 예를 들면, 희토류 킬레이트 또는 플루오레세인 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 단실, 움벨리페론, 루시퍼라아제, 예를 들면, 반딧불이 루시퍼라아제 및 박테리아 루시퍼라아제 (미국 특허 US 4,737,456), 루시페린, 2,3-디하이드로프탈라진디온, 고추냉이 퍼옥시다아제 (horseradish peroxidase: HRP), 알칼리성 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, 라이소자임, 당류 옥시다아제, 예를 들면, 글루코오스 옥시다아제, 갈락토오스 옥시다아제 및 글루코오스-6-포스페이트 데하이드로게나아제, 헤테로사이클릭 옥시다아제, 예를 들면, 과산화수소를 이용하여 염료 전구체를 산화시키는 효소, 예를 들면, HRP, 락토퍼옥시다아제 또는 마이크로퍼옥시다아제와 커플링된 우리카아제 및 잔틴 옥시다아제, 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정한 자유 라디칼 등을 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
G. 약제학적 제형
본원에 기재된 바와 같은 이중특이적 항체의 약제학적 제형은 목적하는 정도의 순도를 가지는 이러한 이중특이적 항체를 1 개 이상의 임의적인 약제학적으로 허용가능한 담체와 혼합함으로써 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)], 동결건조 제형 또는 수용액의 형태로 제조된다. 약제학적으로 허용가능한 담체는 사용되는 투약량 및 농도에서 수용자에게 일반적으로 무독성이며, 완충액, 예를 들면, 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 산화방지제, 예를 들면, 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제 (예를 들면, 옥타데실 디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예를 들면, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레솔); 저분자량 (약 10개의 잔기 미만) 폴리펩타이드; 단백질, 예를 들면, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들면, 폴리(비닐피롤리돈); 아미노산, 예를 들면, 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물, 예를 들면, 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린; 킬레이트제, 예를 들면, EDTA; 당류, 예를 들면, 수크로오스, 만니톨, 트레할로오스 또는 소르비톨; 염-형성 반대이온, 예를 들면, 나트륨; 금속 착물 (예를 들면, Zn-단백질 착물); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 본원에서의 약제학적으로 허용가능한 담체의 예는 틈새 약물 분산제 (interstitial drug dispersion agent), 예를 들면, 가용성 중성-활성 히알루로니다아제 당단백질 (soluble neutral-active hyaluronidase glycoprotein: sHASEGP), 예를 들면, 인간 가용성 PH-20 히알루로니다아제 당단백질, 예를 들면, rhuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.) 을 추가로 포함한다. rhuPH20 을 포함한 특정 sHASEGP 및 사용 방법의 예는 미국 출원 공개 US 2005/0260186 및 US 2006/0104968 에 기재되어있다. 하나의 측면에서, sHASEGP는 1개 이상의 추가의 글리코사미노글리카나아제, 예를 들면, 콘드로이티나아제와 조합된다.
동결건조 항체 제형의 예는 미국 특허 US 6,267,958 에 기재되어 있다. 수성 항체 제형은 미국 특허 US 6,171,586 및 WO 2006/044908 에 기재된 것들을 포함하며, 후자의 제형은 히스티딘-아세테이트 완충액을 포함한다.
본원에서의 제형은 치료하는 특정한 징후에 필요한 1개 초과의 활성 성분, 바람직하게는 서로 불리하게 영향을 주지 않는 상보적 활성을 가지는 것들을 또한 함유할 수 있다. 이러한 활성 성분은 적합하게는 의도되는 목적에 효과적인 양의 조합으로 존재한다.
활성 성분은, 예를 들면, 액적형성 (coacervation) 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들면, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들면, 리포솜, 알부민 미세구체, 미세유화액, 나노-입자 및 나노캡슐) 또는 미세유화액 중의 각각 하이드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸 메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)] 에 개시되어 있다.
서방성 제제가 제조될 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하는데, 여기서, 매트릭스는 성형품, 예를 들면, 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다.
생체내 투여에 사용되는 제형은 일반적으로 멸균된다. 멸균은, 예를 들면, 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성될 수 있다.
H. 치료 방법 및 조성물
본원에서 제공되는 임의의 이중특이적 항체는 치료 방법에 사용될 수 있다.
하나의 측면에서, 약제로서 사용하기 위한 이중특이적 항체가 제공된다. 추가의 측면에서, 암 치료에 사용하기 위한 이중특이적 항체가 제공된다. 특정 실시형태에서, 치료 방법에 사용하기 위한 이중특이적 항체가 제공된다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 유효량의 이중특이적 항체를 암을 가진 개체에게 투여하는 것을 포함하는 암을 가진 개체의 치료 방법에 사용하기 위한 이중특이적 항체를 제공한다. 하나의 이러한 실시형태에서, 상기 방법은 유효량의 1 개 이상의 추가의 치료제, 예를 들면, 하기에 기재된 바와 같은 것들을 개체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 임의의 상기 실시형태에 따른 "개체"는 바람직하게는 인간이다.
추가의 측면에서, 본 발명은 약제의 제조 또는 조제에서의 이중특이적 항체의 용도를 제공한다. 하나의 실시형태에서, 약제는 암의 치료를 위한 것이다. 추가의 실시형태에서, 약제는 유효량의 약제를 암을 가진 개체에게 투여하는 것을 포함하는 암의 치료 방법에서 사용하기 위한 것이다. 하나의 이러한 실시형태에서, 상기 방법은 유효량의 1 개 이상의 추가의 치료제, 예를 들면, 하기 기재된 바와 같은 것들을 개체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 임의의 상기 실시형태에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.
추가의 측면에서, 본 발명은 암의 치료 방법을 제공한다. 하나의 실시형태에서, 상기 방법은 유효량의 이중특이적 항체를 암을 가진 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 하나의 이러한 실시형태에서, 상기 방법은 하기에 기재된 바와 같은 유효량의 1 개 이상의 추가의 치료제를 개체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 임의의 상기 실시형태에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.
추가의 측면에서, 본 발명은, 예를 들면, 임의의 상기 치료 방법에 사용하기 위한 본원에서 제공되는 임의의 이중특이적 항체를 포함하는 약제학적 제형을 제공한다. 하나의 실시형태에서, 약제학적 제형은 본원에서 제공되는 임의의 이중특이적 항체 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 다른 실시형태에서, 약제학적 제형은 본원에서 제공되는 임의의 이중특이적 항체 및 1 개 이상의 추가의 치료제, 예를 들면, 하기에 기재된 바와 같은 것들을 포함한다.
본 발명의 이중특이적 항체는 치료에서 단독으로 또는 다른 제제와 병용하여 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 이중특이적 항체는 1 개 이상의 추가의 치료제와 동시-투여될 수 있다.
상기에서 언급한 이러한 병용 요법은 병용 투여 (2개 이상의 치료제가 동일한 제형 또는 별도의 제형에 포함되어 있는 경우) 및 별도 투여를 포함하는데, 이러한 경우에서, 본 발명의 항체의 투여는 추가의 치료제 및/또는 보조제의 투여 이전에, 이와 동시에 및/또는 이후에 일어날 수 있다. 본 발명의 이중특이적 항체는 또한 방사선 요법과 병용하여 사용될 수 있다.
본 발명의 항체 (및 임의의 추가의 치료제) 는, 예를 들면, 비경구, 폐내 및 비강내, 및 국소 치료에 바람직한 경우, 병변내 투여를 포함한 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 피내 또는 피하 투여를 포함한다. 투약은 임의의 적합한 경로에 의해, 예를 들면, 투여가 부분적으로 간단한지 또는 만성인지에 따라, 정맥내 또는 피하 주사와 같은 주사에 의해 수행될 수 있다. 다양한 시점에 따라 단일 또는 다중 투여, 볼루스 투여 및 펄스 주입을 포함하지만 이에 한정되지 않는 각종 투여 스케쥴이 본원에서 고려된다.
본 발명의 이중특이적 항체는 양호한 의료 행위와 일치하는 방식으로 제형화, 투약 및 투여될 것이다. 이러한 맥락에서 고려되는 요인은 치료할 특정 장애, 치료할 특정 포유동물, 개별 환자의 임상적 병태, 장애의 원인, 제제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케쥴, 및 의사에게 공지된 기타 요인을 포함한다. 이중특이적 항체는 반드시 그럴 필요는 없지만, 문제의 장애를 예방 또는 치료하는데 현재 사용되는 1개 이상의 제제와 함께 임의로 제형화된다. 이러한 다른 제제의 유효량은 제형에 존재하는 항체의 양, 장애 또는 치료의 유형, 및 상기에서 논의된 다른 요인들에 좌우된다. 이들은 일반적으로 본원에서 기재된 것과 동일한 투약량으로 및 투여 경로에 의해, 또는 본원에서 기재된 투약량의 약 1% 내지 99%로, 또는 적절한 것으로 경험적으로/임상적으로 결정된 임의의 경로에 의해 및 임의의 투약량으로 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 이중특이적 항체의 적절한 투약량 (단독으로 또는 1개 이상의 다른 추가의 치료제와 병용하여 사용할 때) 은 치료할 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 이중특이적 항체가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 이전의 치료, 이중특이적 항체에 대한 환자의 임상 이력 및 반응, 및 주치의의 재량에 좌우될 것이다. 항체는 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적합하게 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 이중특이적 항체 약 1 ㎍/kg 내지 15 mg/kg (예를 들면, 0.1 mg/kg - 10 mg/kg) 은, 예를 들면, 1회 이상의 별도 투여에 의해 또는 연속 주입에 의해 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투약량일 수 있다. 하나의 전형적인 1일 투약량은, 상기에서 언급된 요인에 따라, 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 이상의 범위일 수 있다. 수일에 걸쳐 또는 그 보다 장기간에 걸친 반복 투여의 경우, 병태에 따라, 목적하는 질환 증상의 억제가 나타날 때까지, 치료는 일반적으로 지속될 것이다. 이중특이적 항체의 투약량의 하나의 예는 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg의 범위일 것이다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg (또는 이들의 임의의 조합) 의 1개 이상의 투약량을 환자에게 투여할 수 있다. 이러한 투약량을 간헐적으로, 예를 들면, 매주 또는 3주 마다 (예를 들면, 환자는 약 2 회 내지 약 20 회, 또는, 예를 들면, 약 6 회 투약량의 이중특이적 항체를 수용할 수 있을 정도로) 투여할 수 있다. 초기의 보다 높은 투약량에 이어서 1회 이상의 보다 낮은 투약량을 투여할 수 있다. 그러나, 다른 투약량 요법이 유용할 수 있다. 이러한 요법의 진행은 통상적인 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링될 수 있다.
임의의 상기 제형 또는 치료 방법은 본 발명의 이중특이적 항체 대신에 또는 이에 추가하여 본 발명의 면역접합체를 사용하여 수행될 수 있는 것으로 이해된다.
I. 제조 제품
본 발명의 다른 측면에서, 상기에서 기재된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제조 물품이 제공된다. 제조 물품은 용기와, 용기 상의 또는 이와 연합된 표지 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는, 예를 들면, 병, 바이알, 시린지, IV 용액 백 등을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 각종 물질로부터 형성될 수 있다. 용기는 그 자체인 조성물을 보유하거나, 병태를 치료, 예방 및/또는 진단하는데 유효한 다른 조성물과 병용된 조성물을 보유하며, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들면, 용기는 정맥내 용액 백이거나, 피하 주사침에 의해 관통가능한 마개를 가지는 바이알일 수 있다). 조성물 중의 1개 이상의 활성제는 본 발명의 이중특이적 항체이다. 표지 또는 패키지 삽입물은, 조성물이 선택되는 병태의 치료에 사용되는 것을 나타낸다. 더욱이, 제조 물품은 (a) 내부에 함유된 조성물을 가지는 제 1 용기로서, 여기서, 상기 조성물은 본 발명의 이중특이적 항체를 포함하는 것인 제 1 용기; 및 (b) 내부에 함유된 조성물을 가지는 제 2 용기로서, 여기서, 상기 조성물은 추가의 세포독성제 또는 치료제를 포함하는 것인 제 2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 본 실시형태의 제조 물품은, 조성물이 특정 병태를 치료하는데 사용될 수 있는 것을 나타내는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 다르게는 또는 추가로는, 제조 물품은 정균 주사용수 (bacteriostatic water for injection: BWFI), 인산-완충된 식염수, 링거액 및 덱스트로오스 용액과 같은 약제학적으로 허용가능한 완충액을 포함하는 제 2 (또는 제 3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이것은 다른 완충액, 희석제, 필터, 주사바늘 및 시린지를 포함한, 상업적 관점 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
임의의 상기 제조 물품은 이중특이적 항체 대신에 또는 이에 추가하여 본 발명의 면역접합체를 포함할 수 있는 것으로 이해된다.
III. 실시예
하기는 본 발명의 방법 및 조성물의 실시예이다. 상기에서 제공된 일반적인 설명을 고려하여, 다양한 다른 실시형태들이 실시될 수 있는 것으로 이해된다.
전술한 본 발명은 이해를 명확하게 할 목적으로 설명 및 예에 의해 다소 상세하게 기재되었지만, 설명 및 예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 말아야 한다. 본원에서 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 개시는 그 전문이 본원에 참조로 명백히 포함된다.
실시예 1: Fab (MCSP)-CrossFab(CD3) 의 제조
수득된 중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역을, 각각의 수용자 포유동물 발현 벡터에 미리 삽입된 불변 중쇄 또는 불변 경쇄로 프레임 내에 서브클로닝하였다. 항체 발현은 MPSV 프로모터에 의해 구동되며, CDS 의 3' 말단에 합성 polyA 신호 서열을 보유한다. 또한, 각각의 벡터는 EBV OriP 서열을 포함한다.
상기 분자는 인산칼슘-형질감염을 이용하여 포유동물 발현 벡터로 HEK293-EBNA 세포를 공동-형질감염시킴으로써 제조하였다. 기하급수적으로 성장하는 HEK293-EBNA 세포를 인산칼슘 방법으로 형질감염시켰다. 다르게는, 현탁액 중에서 성장하는 HEK293-EBNA 세포를 폴리에틸렌이민으로 형질감염시켰다. 상기 세포를 상응하는 발현 벡터에 의해 1:1:1 비율 ("벡터 CH1-VH-CK-VH":"벡터 경쇄":"벡터 경쇄 CH1-VL") 로 형질감염시켰다.
인산칼슘을 이용하는 형질감염을 위해, 10　% (v/v) FCS 로 보충된 DMEM 배양 배지를 이용하여 세포를 T-플라스크에서 부착 단층 배양물로서 성장시키고, 상기 세포의 밀집도가 50 % 와 80 % 사이일 때 형질감염시켰다. T150 플라스크의 형질감염을 위해, 1500 만개의 세포를 FCS (최종 10 % v/v) 로 보충된 DMEM 배양 배지 25 ml 에서 형질감염 24 시간 전에 씨딩하고, 세포를 5% CO2 분위기 하에서 하룻밤 동안 37　℃ 에서 항온처리기에 넣었다. 형질감염될 각각의 T150 플라스크의 경우, DNA, CaCl2 및 물의 용액을, 상응하는 비율로 나누어진 전체 플라스미드 벡터 DNA 94　㎍, 최종 부피 469　μl 의 물 및 1　M CaCl2 용액 469　μl 를 혼합함으로써 제조하였다. 이 용액에, 50　mM HEPES, 280　mM NaCl, 1.5　mM Na2HPO4 용액 938　μl 를 pH 7.05 로 첨가하고, 10 초 동안 즉시 혼합하고, 실온에서 20 초 동안 정치하였다. 현탁액을 2　% (v/v) FCS 로 보충된 DMEM 10 ml 로 희석하고, 기존의 배지 대신 T150 에 첨가하였다. 이어서, 추가의 형질감염 배지 13 ml 를 첨가하였다. 세포를 37　℃, 5　% CO2 에서 약 17 시간 내지 20 시간 동안 항온처리하고, 이어서 배지를 25 ml 의 DMEM, 10 % FCS 로 대체한다. 조건화 배양 배지를 15 분 동안 210 x g 에서 원심분리에 의해 약 7 일 배지 교환후 수확하고, 용액을 멸균 여과하고 (0.22 ㎛ 필터), 0.01 % (w/v) 의 최종 농도로 나트륨 아지드를 첨가하고, 4　℃ 에서 유지하였다.
폴리에틸렌이민을 이용한 형질감염을 위해, HEK293 EBNA 세포를 CD CHO 무혈청 배양 배지 중의 현탁액에서 배양하였다. 500 ml 진탕 플라스크에서 제조하기 위해, 4 억개의 HEK293 EBNA 세포를 형질감염 24 시간 이전에 씨딩하였다. 형질감염을 위해, 세포를 5 분 동안 210 x g 로 원심분리하고, 상청액을 예열된 CD CHO 배지 20 ml 로 대체하였다. 발현 벡터를 CD CHO 배지 20 ml 에서 DNA 200 ㎍ 의 최종 양까지 혼합하였다. PEI 540　μl 의 첨가 후, 용액을 15 초 동안 보르텍스 (vortex) 하고, 이어서 10 분 동안 실온에서 항온처리한다. 이후, 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고, 500 ml 진탕 플라스크로 옮기고, 3 시간 동안 37　℃ 에서 항온처리기에서 5% CO2 분위기 하에서 항온처리하였다. 항온처리 시간 후 F17 배지 160 ml 를 첨가하고, 세포를 24 시간 동안 배양하였다. 형질감염 후 1 일 후, 1 mM 발포르산 및 7% Feed 1 (Lonza) 를 첨가하였다. 7 일 후, 배양 상청액을 15 분 동안 210 x g 에서의 원심분리에 의해 정제를 위해 수집하고, 용액을 멸균 여과하고 (0.22　㎛ 필터), 0.01 % w/v 의 최종 농도로 나트륨 아지드를 첨가하고, 4　℃ 에서 유지하였다.
단백질 A 및 단백질 G 친화도 크로마토그래피를 이용한 친화도 크로마토그래피에 이어서, 크기 배제 크로마토그래피 단계에 의해, 분비된 단백질을 세포 배양물 상청액으로부터 정제하였다. 친화도 크로마토그래피를 위해, 30 ml 의 20　mM 인산나트륨, 20　mM 시트르산나트륨, pH 7.5 로 각각 평형화된 HiTrap Protein　G HP 컬럼 (CV　=　5 ml, GE Healthcare) 에 커플링된 HiTrap Protein　A HP 컬럼 (CV　=　5 ml, GE Healthcare) 상에 상청액을 로딩하였다. 2 개의 컬럼을 6 컬럼 용적의 20　mM 인산나트륨, 20　mM 시트르산나트륨, pH 7.5 로 세척함으로써 미결합된 단백질을 제거하였다. 이어서, 8 컬럼 용적 이상의 20　mM 인산나트륨, 20　mM 시트르산나트륨, pH 7.5 를 이용하여 HiTrap Protein　G HP 컬럼만을 세척하기 위해, 추가의 세척 단계가 필요하였다. 7 컬럼 용적의 8.8　mM 포름산, pH 3.0 을 가지는 단계 구배를 이용하는 HiTrap Protein　G HP 컬럼으로부터 표적 단백질을 용출시켰다. 1/10 의 0.5　M 인산나트륨, pH　8.0 을 첨가함으로써 단백질 용액을 중화하였다. 25 mM 인산칼륨, 125 mM 염화나트륨, 100 mM 글라이신 용액, pH 6.7 로 평형화된 HiLoad Superdex 200 컬럼 (GE Healthcare) 상에 표적 단백질을 직접 로딩하였다.
정제된 단백질 샘플의 단백질 농도는, 아미노산 서열에 기초하여 산출된 몰 흡광 계수를 이용하여, 280 nm 에서의 흡광도 (OD) 를 측정함으로써 결정하였다. 항체의 순도 및 분자량은 환원제 (5 mM 1,4-디티오트레이톨) 의 존재 및 부재 하에서 쿠마시 염색 (SimpleBlue™ SafeStain, Invitrogen) 의 SDS-PAGE 에 의해 분석하였다. NuPAGE® Pre-Cast 겔 시스템 (Invitrogen, USA) 은 제조사의 설명서 (4-12　% Tris-아세테이트 겔 또는 4-12　% Bis-Tris) 에 따라 이용하였다. 항체 샘플의 응집물 함량은 25℃ 에서 2 mM MOPS, 150　mM NaCl, 0.02　% (w/v) NaN3, pH 7.3 작동 완충액에서의 Superdex 200 10/300GL 분석용 크기-배제 컬럼 (GE Healthcare, Sweden) 을 이용하여 분석하였다.
예시적인 Fab-CrossFab 분자 (3 개의 쇄: VHCH1(MCSP)-VLCH1(CD3V9) = 서열 번호: 25, VLCL(MCSP) = 서열 번호: 17 및 VHCL(CD3V9) = 서열 번호: 23 으로 이루어짐; 도 1 a) 에 도시된 바와 같은 배향으로) 의 제조 및 정제 분석은 도 2 및 도 3 에 나타낸다. 이러한 분자는 추가로 Fab (MCSP)-CrossFab (CD3) 또는 hu Fab (MCSP)-CrossFab (CD3) 로서 지칭된다.
실시예 2: Fab (MCSP)-Fab (MCSP)-CrossFab(CD3) 및 Fab (MCSP)- CrossFab(CD3)- Fab (MCSP) 의 제조
수득된 중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역을, 각각의 수용자 포유동물 발현 벡터에 미리 삽입된 불변 중쇄 또는 불변 경쇄로 프레임 내에 서브클로닝하였다. 항체 발현은 MPSV 프로모터에 의해 구동되며, CDS 의 3' 말단에 합성 polyA 신호 서열을 보유한다. 또한, 각각의 벡터는 EBV OriP 서열을 포함한다.
상기 분자는 인산칼슘-형질감염을 이용하여 포유동물 발현 벡터로 HEK293-EBNA 세포를 공동-형질감염시킴으로써 제조하였다. 기하급수적으로 성장하는 HEK293-EBNA 세포를 인산칼슘 방법으로 형질감염시켰다. 다르게는, 현탁액 중에서 성장하는 HEK293-EBNA 세포를 폴리에틸렌이민으로 형질감염시켰다. 상응하는 발현 벡터에 의해 1:2:1 비율 ("벡터 CH1-VH-CH1-VH-CK-VH":"벡터 경쇄":"벡터 경쇄 CH1-VL") 로 세포를 형질감염시켰다.
인산칼슘을 이용하는 형질감염을 위해, 10　% (v/v) FCS 로 보충된 DMEM 배양 배지를 이용하여 T-플라스크에서 부착 단층 배양물로서 세포를 성장시키고, 상기 세포의 밀집도가 50 % 와 80 % 사이일 때 형질감염시켰다. T150 플라스크의 형질감염을 위해, FCS (최종 10 % v/v) 로 보충된 DMEM 배양 배지 25 ml 에서 형질감염 24 시간 전에 1500 만개의 세포를 씨딩하고, 세포를 5% CO2 분위기 하에서 하룻밤 동안 37　℃ 에서 항온처리기에 넣었다. 형질감염될 각각의 T150 플라스크의 경우, 상응하는 비율로 나누어진 전체 플라스미드 벡터 DNA 94　㎍, 최종 부피 469　μl 까지의 물 및 1　M CaCl2 용액 469　μl 를 혼합함으로써 DNA, CaCl2 및 물의 용액을 제조하였다. 이러한 용액에, 938　μl 의 50　mM HEPES, 280　mM NaCl, 1.5　mM Na2HPO4 용액, pH 7.05 를 첨가하고, 10 초 동안 즉시 혼합하고, 실온에서 20 초 동안 정치하였다. 현탁액을 2　% (v/v) FCS 로 보충된 DMEM 10 ml 로 희석하고, 기존 배지 대신에 T150 에 첨가하였다. 이어서, 추가의 형질감염 배지 13 ml 를 첨가하였다. 세포를 37　℃, 5　% CO2 에서 약 17 시간 내지 20 시간 동안 항온처리하고, 이어서 배지를 25 ml 의 DMEM, 10 % FCS 로 대체하였다. 조건화 배양 배지를 15 분 동안 210 x g 에서 원심분리에 의해 배지 교환후 약 7 일에서 수확하고, 용액을 멸균 여과하고 (0.22　㎛ 필터), 0.01 % (w/v) 의 최종 농도로 나트륨 아지드를 첨가하고, 4　℃ 에서 유지하였다. 폴리에틸렌이민을 이용한 형질감염을 위해, HEK293 EBNA 세포를 CD CHO 무혈청 배양 배지 중의 현탁액에서 배양하였다. 500 ml 진탕 플라스크에서 제조하기 위해, 4 억개의 HEK293 EBNA 세포를 형질감염 24 시간 전에 씨딩하였다. 형질감염을 위해, 세포를 5 분 동안 210 x g 로 원심분리하고, 상청액을 예열된 CD CHO 배지 20 ml 로 대체하였다. 발현 벡터를 CD CHO 배지 20 ml 에서 DNA 200 ㎍ 의 최종 양으로 혼합하였다. PEI 540　μl 의 첨가 후, 용액을 15 초 동안 보르텍스하고, 이어서 10 분 동안 실온에서 항온처리하였다. 이후, 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고, 500 ml 진탕 플라스크로 옮기고, 3 시간 동안 37　℃ 에서 항온처리기에서 5% CO2 분위기 하에서 항온처리하였다. 항온처리 시간 후 F17 배지 160 ml 를 첨가하고, 세포를 24 시간 동안 배양하였다. 형질감염 1 일 후, 1 mM 발포르산 및 7% Feed 1 (Lonza) 을 첨가하였다. 7 일 후, 배양 상청액을 15 분 동안 210 x g 에서의 원심분리에 의해 정제를 위해 수집하고, 용액을 멸균 여과하고 (0.22　㎛ 필터), 0.01 % w/v 의 최종 농도로 나트륨 아지드를 첨가하고, 4　℃ 에서 유지하였다.
단백질 A 및 단백질 G 친화도 크로마토그래피를 이용한 친화도 크로마토그래피에 이어서, 크기 배제 크로마토그래피 단계에 의해, 분비된 단백질을 세포 배양물 상청액으로부터 정제하였다.
친화도 크로마토그래피를 위해, 30 ml 의 20　mM 인산나트륨, 20　mM 시트르산나트륨, pH 7.5 로 각각 평형화된 HiTrap Protein　G HP 컬럼 (CV　=　5 ml, GE Healthcare) 에 커플링된 HiTrap Protein　A HP 컬럼 (CV　=　5 ml, GE Healthcare) 상에 상청액을 로딩하였다. 2 개의 컬럼을 6 컬럼 용적의 20　mM 인산나트륨, 20　mM 시트르산나트륨, pH 7.5 로 세척함으로써 미결합 단백질을 제거하였다. 이어서, 8 컬럼 용적 이상의 20　mM 인산나트륨, 20　mM 시트르산나트륨, pH 7.5 를 이용하여 HiTrap Protein　G HP 컬럼만을 세척하기 위해, 추가의 세척 단계가 필요하였다. 7 컬럼 용적의 8.8　mM 포름산, pH 3.0 을 가지는 단계 구배를 이용하여 HiTrap Protein　G HP 컬럼으로부터 표적 단백질을 용출시켰다. 1/10 의 0.5　M 인산나트륨, pH　8.0 을 첨가함으로써 단백질 용액을 중화하였다. 표적 단백질을 농축 및 여과한 후, 25 mM 인산칼륨, 125 mM 염화나트륨, 100 mM 글라이신 용액, pH 6.7 로 평형화된 HiLoad Superdex 200 컬럼 (GE Healthcare) 상에 로딩하였다.
정제된 단백질 샘플의 단백질 농도는, 아미노산 서열에 기초하여 산출된 몰 흡광 계수를 이용하여, 280 nm 에서의 흡광도 (OD) 를 측정함으로써 결정하였다. 항체의 순도 및 분자량은 환원제 (5 mM 1,4-디티오트레이톨) 의 존재 및 부재 하에서 쿠마시 염색 (SimpleBlue™ SafeStain, Invitrogen) 의 SDS-PAGE 에 의해 분석하였다. NuPAGE® Pre-Cast 겔 시스템 (Invitrogen, USA) 은 제조사의 설명서 (4-12　% Tris-아세테이트 겔 또는 4-12　% Bis-Tris) 에 따라 이용하였다. 항체 샘플의 응집물 함량은 25 ℃ 에서 2 mM MOPS, 150　mM NaCl, 0.02　% (w/v) NaN3, pH 7.3 작동 완충액에서의 Superdex 200 10/300GL 분석용 크기-배제 컬럼 (GE Healthcare, Sweden) 을 이용하여 분석하고, 종래 기술의 항체 단편 (scFv)2 와 비교하였다 (결과는 하기 표를 참조한다).
Figure pct00003

예시적인 Fab-Fab-CrossFab 분자 (4 개의 쇄: VHCH1(MCSP)-VHCH1(MCSP)-VLCH1(CD3V9) = 서열 번호: 26, 2 개의 VLCL(MCSP) 쇄 = 서열 번호: 17 및 1 개의 VHCL(CD3V9) 쇄 = 서열 번호: 23 으로 이루어짐; 도 1 c) 에 도시된 바와 같은 배향으로) 의 제조 및 정제 분석을 도 4 및 도 5 에 나타낸다. 이러한 분자는 추가로 Fab (MCSP)- Fab (MCSP)-CrossFab (CD3) 또는 hu Fab (MCSP)- Fab (MCSP)-CrossFab (CD3) 로서 지칭된다.
예시적인 Fab-CrossFab-Fab 분자 (4 개의 쇄: VHCH1(MCSP)-VLCH1(CD3V9)-VHCH1(MCSP) = 서열 번호: 27, 2 개의 VLCL(MCSP) 쇄 = 서열 번호: 17 및 1 개의 VHCL(CD3V9) 쇄 = 서열 번호: 23 으로 이루어짐; 도 1 e) 에 도시된 바와 같은 배향으로) 의 제조 및 정제 분석은 도 6 및 도 7 에 나타낸다. 이러한 분자는 추가로 Fab (MCSP)- Fab (MCSP)-CrossFab (CD3) 또는 hu Fab (MCSP)- Fab (MCSP)-CrossFab (CD3) 로서 지칭된다.
예시적인 CrossFab-Fab-Fab 분자 (4 개의 쇄: VLCH1(CD32C11)- VHCH1(MCSP)- VHCH1(MCSP) = 서열 번호: 42, 2 개의 VLCL(MCSP) 쇄 = 서열 번호: 17 및 1 개의 VHCL(CD32C11) 쇄 = 서열 번호: 43; 도 1 d) 에 도시된 방향으로) 의 제조 및 정제 분석은 도 8 및 도 9 에 나타낸다. 이러한 분자는 추가로 쥐과동물 CrossFab (CD3)-Fab (MCSP)- Fab (MCSP) 로서 지칭된다.
실시예 3: Fab(CD33)-CrossFab (CD3) 의 제조
수득된 중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역을, 각각의 수용자 포유동물 발현 벡터에 미리 삽입된 불변 중쇄 또는 불변 경쇄로 프레임 내에 서브클로닝하였다. 항체 발현은 MPSV 프로모터에 의해 구동되며, CDS 의 3' 말단에 합성 polyA 신호 서열을 보유한다. 또한, 각각의 벡터는 EBV OriP 서열을 포함한다.
상기 분자는 인산칼슘-형질감염을 이용하여 포유동물 발현 벡터로 HEK293-EBNA 세포를 공동-형질감염시킴으로써 제조하였다. 기하급수적으로 성장하는 HEK293-EBNA 세포는 인산칼슘 방법으로 형질감염시켰다. 다르게는, 현탁액 중에서 성장하는 HEK293-EBNA 세포를 폴리에틸렌이민으로 형질감염시켰다. 상응하는 발현 벡터로 1:1:1 비율 ("벡터 CH1-VH-CK-VH":"벡터 경쇄":"벡터 경쇄 CH1-VL") 로 세포를 형질감염시켰다.
인산칼슘을 이용하는 형질감염을 위해, 10　% (v/v) FCS 로 보충된 DMEM 배양 배지를 이용하여 T-플라스크에서 부착 단층 배양물로서 세포를 성장시키고, 상기 세포의 밀집도가 50 % 와 80 % 사이일 때 형질감염시켰다. T150 플라스크의 형질감염을 위해, 1500 만 세포를 FCS (최종 10 % v/v) 로 보충된 DMEM 배양 배지 25 ml 에서 형질감염 24 시간 전에 씨딩하고, 세포를 5% CO2 분위기 하에서 하룻밤 동안 37　℃ 에서 항온처리기에 넣었다. 형질감염될 각각의 T150 플라스크의 경우, 상응하는 비율로 나누어진 전체 플라스미드 벡터 DNA 94　㎍, 최종 부피 469　μl 까지의 물 및 1　M CaCl2 용액 469　μl 를 혼합함으로써 DNA, CaCl2 및 물의 용액을 제조하였다. 이러한 용액에, 938　μl 의 50　mM HEPES, 280　mM NaCl, 1.5　mM Na2HPO4 용액, pH 7.05 를 첨가하고, 10 초 동안 즉시 혼합하고, 실온에서 20 초 동안 정치하였다. 현탁액을 2　% (v/v) FCS 로 보충된 DMEM 10 ml 로 희석하고, 기존 배지 대신에 T150 에 첨가하였다. 이어서, 추가의 형질감염 배지 13 ml 를 첨가하였다. 세포를 37　℃, 5　% CO2 에서 약 17 시간 내지 20 시간 동안 항온처리한 다음, 배지를 25 ml 의 DMEM, 10 % FCS 로 대체하였다. 조건화 배양 배지를 15 분 동안 210 x g 에서 원심분리에 의해 배지-교환후 약 7 일에 수집하고, 용액을 멸균 여과하고 (0.22 ㎛ 필터), 0.01 % (w/v) 의 최종 농도로 나트륨 아지드를 첨가하고, 4　℃ 에서 유지하였다.
폴리에틸렌이민을 이용한 형질감염을 위해, HEK293 EBNA 세포를 CD CHO 무혈청 배양 배지 중의 현탁액에서 배양하였다. 500 ml 진탕 플라스크에서 제조하기 위해, 4 억개의 HEK293 EBNA 세포를 형질감염 24 시간 이전에 씨딩하였다. 형질감염을 위해, 세포를 5 분 동안 210 x g 로 원심분리하고, 상청액을 예열된 CD CHO 배지 20 ml 로 대체하였다. 발현 벡터를 CD CHO 배지 20 ml 에서 DNA 200 ㎍ 의 최종 양으로 혼합하였다. PEI 540　μl 의 첨가 후, 용액을 15 초 동안 보르텍스하고, 이어서 10 분 동안 실온에서 항온처리하였다. 이후, 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고, 500 ml 진탕 플라스크로 옮기고, 3 시간 동안 37　℃ 에서 항온처리기에서 5% CO2 분위기 하에서 항온처리하였다. 항온처리 시간 후 F17 배지 160 ml 를 첨가하고, 세포를 24 시간 동안 배양하였다. 형질감염 1 일 후, 1 mM 발포르산 및 7% Feed 1 (Lonza) 을 첨가하였다. 7 일 후, 배양 상청액을 15 분 동안 210 x g 에서의 원심분리에 의해 정제를 위해 수집하고, 용액을 멸균 여과하고 (0.22　㎛ 필터), 0.01 % w/v 의 최종 농도로 나트륨 아지드를 첨가하고, 4　℃ 에서 유지하였다.
단백질 A 및 단백질 G 친화도 크로마토그래피를 이용한 친화도 크로마토그래피에 이어서, 크기 배제 크로마토그래피 단계에 의해, 분비된 단백질을 세포 배양물 상청액으로부터 정제하였다.
친화도 크로마토그래피를 위해, 30 ml 의 20　mM 인산나트륨, 20　mM 시트르산나트륨, pH 7.5 로 각각 평형화된 HiTrap Protein　G HP 컬럼 (CV　=　5 ml, GE Healthcare) 에 커플링된 HiTrap Protein　A HP 컬럼 (CV　=　5 ml, GE Healthcare) 상에 상청액을 로딩하였다. 2 개의 컬럼을 6 컬럼 용적의 20　mM 인산나트륨, 20　mM 시트르산나트륨, pH 7.5 로 세척함으로써 미결합 단백질을 제거하였다. 이어서, 8 컬럼 용적 이상의 20　mM 인산나트륨, 20　mM 시트르산나트륨, pH 7.5 를 이용하여 HiTrap Protein　G HP 컬럼만을 세척하기 위해, 추가의 세척 단계가 필요하였다. 7 컬럼 용적의 8.8　mM 포름산, pH 3.0 을 가지는 단계 구배를 이용하여 HiTrap Protein　G HP 컬럼으로부터 표적 단백질을 용출시켰다. 1/10 의 0.5　M 인산나트륨, pH　8.0 을 첨가함으로써 단백질 용액을 중화하였다. 표적 단백질을 농축 및 여과한 후, 25 mM 인산칼륨, 125 mM 염화나트륨, 100 mM 글라이신 용액, pH 6.7 로 평형화된 HiLoad Superdex 200 컬럼 (GE Healthcare) 상에 로딩하였다.
정제된 단백질 샘플의 단백질 농도는, 아미노산 서열에 기초하여 산출된 몰 흡광 계수를 이용하여, 280 nm 에서의 흡광도 (OD) 를 측정함으로써 결정하였다. 항체의 순도 및 분자량은 환원제 (5 mM 1,4-디티오트레이톨) 의 존재 및 부재 하에서 쿠마시 염색 (SimpleBlue™ SafeStain, Invitrogen) 의 SDS-PAGE 에 의해 분석하였다. NuPAGE® Pre-Cast 겔 시스템 (Invitrogen, USA) 은 제조사의 설명서 (4-12　% Tris-아세테이트 겔 또는 4-12　% Bis-Tris) 에 따라 이용하였다. 항체 샘플의 응집물 함량은 25 ℃ 에서 2 mM MOPS, 150　mM NaCl, 0.02　% (w/v) NaN3, pH 7.3 작동 완충액에서의 Superdex 200 10/300GL 분석용 크기-배제 컬럼 (GE Healthcare, Sweden) 을 이용하여 분석하였다.
예시적인 Fab-CrossFab 분자 (3 개의 쇄: VHCH1(CD33)-VLCH1(CD3V9) = 서열 번호: 102, VLCL(CD33) = 서열 번호: 100 및 VHCL(CD3V9) = 서열 번호: 23 또는 서열 번호: 101 로 이루어짐; 도 1 a) 에 도시된 바와 같은 배향으로) 의 제조 및 정제 분석은 도 17 및 도 18 에 나타낸다. 이러한 분자는 추가로 Fab(CD33)-CrossFab (CD3) 또는 hu Fab(CD33)-CrossFab (CD3) 로서 지칭된다.
실시예 4: 기준 분자 (scFv)2 의 제조
클로닝 및 제조
수득된 중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역을, 각각의 수용자 포유동물 발현 벡터 내의 프레임 내에서 서브클로닝하였다. 항체 발현은 MPSV 프로모터에 의해 구동되며, CDS 의 3' 말단에 합성 polyA 신호 서열을 보유한다. 또한, 각각의 벡터는 EBV OriP 서열을 포함한다.
상기 분자는 폴리에틸렌이민을 이용하여 포유동물 발현 벡터로 HEK293-EBNA 세포를 형질감염시킴으로써 제조하였다. HEK293 EBNA 세포를 무혈청 CD CHO 배양 배지 중의 현탁액에서 배양하였다. 500 ml 진탕 플라스크에서 제조하기 위해, 4 억개의 HEK293 EBNA 세포를 형질감염 24 시간 이전에 씨딩하였다. 형질감염을 위해, 세포를 5 분 동안 210 x g 로 원심분리하고, 상청액을 예열된 CD CHO 배지 20 ml 로 대체하였다. 발현 벡터를 CD CHO 배지 20 ml 에서 DNA 200 ㎍ 의 최종 양으로 혼합하였다. PEI 540　μl 의 첨가 후, 용액을 15 초 동안 보르텍스하고, 이어서 10 분 동안 실온에서 항온처리하였다. 이후, 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고, 500 ml 진탕 플라스크로 옮기고, 3 시간 동안 37　℃ 에서 항온처리기에서 5% CO2 분위기 하에서 항온처리하였다. 항온처리 시간 후 F17 배지 160 ml 를 첨가하고, 세포를 24 시간 동안 배양하였다. 형질감염 1 일 후, 1 mM 발포르산 및 7% Feed 1 (Lonza) 을 첨가하였다. 7 일 후, 배양 상청액을 15 분 동안 210 x g 에서의 원심분리에 의해 정제를 위해 수집하고, 용액을 멸균 여과하고 (0.22　㎛ 필터), 0.01 % w/v 의 최종 농도로 나트륨 아지드를 첨가하고, 4　℃ 에서 유지하였다.
(scFv)2 (항 MCSP/항 huCD3) 의 정제
고정화 금속 이온 친화도 크로마토그래피 (Immobilized Metal Ion Chromatography: IMAC) 를 이용한 친화도 크로마토그래피에 이어서, 크기 배제 크로마토그래피 단계에 의해, 분비된 단백질을 세포 배양물 상청액으로부터 정제하였다.
제 1 정제 단계 이전에, 상청액으로부터 방해 성분들을 5.000　MWCO 막 (Sartocon Slice Cassette, Hydrosart; Sartorius) 이 구비된 접선 유동 여과 시스템 Sarcojet (Sartorius) 를 이용하여 정용여과 (diafiltration) 에 의해 제거하였다. 상청액을 210 ml 로 농축하고, 이어서 1　l 의 20　mM 인산나트륨, 500　mM 염화나트륨, pH　6.5 로 희석하였다. 단백질 용액을 210 ml 로 다시 농축하였다. 이러한 과정을 2 회 반복하여 완전한 완충액 교환을 보장하였다.
친화도 크로마토그래피를 위해, 25　ml 의 20　mM 인산나트륨, 500　mM 염화나트륨, 15　mM 이미다졸, pH 6.5 로 평형화된 NiNTA Superflow Cartridge (CV = 5 mL, Qiagen) 상에 정용여과 과정의 농축물을 로딩하였다. 2 컬럼 용적 이상의 20　mM 인산나트륨, 500　mM 염화나트륨, 15　mM 이미다졸, pH　6.5 로 세척한 후, 3 컬럼 용적의 20　mM 인산나트륨, 500　mM 염화나트륨, 62.5　mM 이미다졸, pH　6.5 를 이용한 추가의 세척 단계에 의해 미결합 단백질을 제거하였다. 2 컬럼 용적의 20　mM 인산나트륨, 500　mM 염화나트륨, 125　mM 이미다졸, pH　6.5 로 표적 단백질을 용출시켰다. 이어서, 컬럼을 20　mM 인산나트륨, 500　mM 염화나트륨, 250　mM 이미다졸, pH 6.5 로 세척하였다.
표적 단백질을 농축한 후, 25　mM KH2PO4, 125　mM NaCl, 200　mM 아르기닌, pH　6.7 로 평형화된 HiLoad Superdex 75 컬럼 (GE Healthcare) 상에 로딩하였다.
수율, 제 1 정제 단계 후의 응집물 함량 및 최종 단량체 함량을 상기 표에 나타낸다. 제 1 정제 단계 후의 응집물 함량의 비교는 (scFv)2 와 대조적으로 Fab-CrossFab 작제물의 탁월한 안정성을 나타낸다.
(scFv)2 의 특성화
정제된 단백질 샘플의 단백질 농도는, 아미노산 서열에 기초하여 산출된 몰 흡광 계수를 이용하여, 280 nm 에서의 흡광도 (OD) 를 측정함으로써 결정하였다. 항체의 순도 및 분자량은 환원제 (5 mM 1,4-디티오트레이톨) 의 존재 및 부재 하에서 쿠마시 염색 (SimpleBlue™ SafeStain, Invitrogen) 의 SDS-PAGE 에 의해 분석하였다. NuPAGE® Pre-Cast 겔 시스템 (Invitrogen, USA) 은 제조사의 설명서 (4-12　% Tris-아세테이트 겔 또는 4-12　% Bis-Tris) 에 따라 이용하였다. 항체 샘플의 응집물 함량은 25 ℃ 에서 2 mM MOPS, 150　mM NaCl, 0.02　% (w/v) NaN3, pH 7.3 작동 완충액에서의 Superdex 75 10/300GL 분석용 크기-배제 컬럼 (GE Healthcare, Sweden) 을 이용하여 분석하였다.
(scFv)2 분자의 개략도는 도 21 에 나타낸다.
예시적인 (scFv)2 분자 (항MCSP/항 huCD3; 2 개의 단일 쇄 Fvs: VL-VH (MCSP) 및 VH-VL (CD3V9) = 서열 번호: 149 로 이루어짐) 의 제조 및 정제 분석은 도 22 및 도 23 에 나타낸다. 이러한 분자는 추가로 (scFv)2 (항MCSP/항 huCD3e) 로서 지칭된다
실시예 5: PBMC 로부터의 일차 인간 pan T 세포의 단리
현지 혈액 은행으로부터 또는 건강한 인간 기증자의 신선한 혈액으로부터 수된한 풍부한 림프구 준비물 (버피 코트) 로부터, Histopaque 밀도 원심분리에 의해 말초혈 단핵 세포 (Peripheral blood mononuclear cell: PBMC) 를 제조하였다.
Pan T Cell Isolation Kit II (Miltenyi Biotec #130-091-156) 를 이용하여, PBMC 로부터의 T-세포 강화 (enrichment) 를 제조사의 설명서에 따라 수행하였다. 간단히 말하자면, 세포 펠릿을 Mio 세포 10 개 당 냉 완충액 40μl 으로 희석하고 (0.5 % BSA, 2 mM EDTA 를 가지는 PBS - 멸균 여과함), 10 분 동안 4 ℃ 에서 Mio 세포 10 개 당 비오틴-항체 칵테일 (Biotin-Antibody Cocktail) 10μl 로 항온처리하였다.
Mio 세포 10 개 당 항-비오틴 자기 비즈 (magnetic beads) 20μl 및 냉 완충액 30μl 를 첨가하고, 혼합물을 추가로 15 분 동안 4 ℃ 에서 항온처리하였다.
10-20x 의 표지 용적을 첨가하고 10 분간 300g 에서의 원심분리에 의해 세포를 세척하였다. Mio 세포 100 개 이하를 완충액 500 μl 중에 재현탁하였다.
LS 컬럼 (Miltenyi Biotec #130-042-401) 을 이용하여 제조사의 설명서에 따라 비표지된 인간 pan T 세포의 자기 분리를 수행하였다. 수득된 T 세포 모집단을 자동 계수하고 (ViCell), 검정을 시작할 때까지 (24 시간 이하) AIM-V 배지에 37℃, 5 % CO2, 항온처리기에서 보관하였다.
실시예 6: 비장세포로부터의 쥐과동물 pan T 세포의 단리
C57BL/6 마우스로부터 비장을 단리하고, MACS 완충액 (PBS + 0.5 % BSA + 2 mM EDTA) 을 함유하는 GentleMACS C-튜브 (Miltenyi Biotech #130-093-237) 로 옮기고, 제조사의 설명서에 따라 GentleMACS Dissociator 로 분리하여 단일-세포 현탁액을 수득하였다.
세포 현탁액을 예비-분리 필터를 통과시켜 잔류하는 비분리 조직 입자들을 제거하였다. 4 분 동안 4℃ 에서 400 g 로 원심분리한 후, ACK 용균 완충액을 첨가하여 적혈구 세포를 용균시켰다 (5 분 동안 실온에서 항온처리). 잔류하는 세포를 MACS 완충액으로 2 회 세척하고, 계수하고, 쥐과동물 pan T 세포의 단리에 사용하였다. Miltenyi Biotec 사의 Pan T Cell Isolation Kit (#130-090-861) 를 이용하여 제조사의 설명서에 따라 음성 (자기) 선별을 수행하였다. 수득된 T 세포 모집단을 자동 계수하고 (ViCell), 추가의 검정을 위해 즉시 사용하였다.
실시예 7: T 세포 상의 CD3 및 종양 세포 상의 MCSP 를 표적화하는 가교결합 이중특이적 작제물에 의해 매개된 방향전환된 (re-directed) T 세포 세포독성 (LDH 방출 검정).
인간 또는 마우스 T 세포 상의 CD3 및 종양 세포 상의 인간 MCSP 를 표적화하는 이중특이적 작제물을, 표적 세포의 T-세포 매개된 아폽토시스를 유도하는 이의 잠재능에 대해 LDH 방출 검정에 의해 분석하였다.
간단히 말하자면, 표적 세포 (인간 Colo-38, 인간 MDA-MB-435, 인간 흑색종 MV-3 또는 쥐과동물 B16/F10-huMCSP Fluc 2 클론 48 세포, 모두 인간 MCSP 를 발현함) 를 세포 분리 완충액 (MCSP 는 트립신-민감성이다) 또는 트립신 (그 전날 플레이팅함) 으로 수확하고, 세척 및 적절 세포 배양 배지에서 재현탁한다 (상이한 도면들의 상세한 설명 참조). 웰 당 20 000 - 30 000 세포를, 환저 96 웰-플레이트에 플레이팅하고, 각각의 항체 희석액을 지시된 바와 같이 (3 반복) 첨가하였다. 효과기 세포를 첨가하여, 5:1 (인간 pan T 세포), 10:1 (인간 PBMC) 의 최종 E:T 비율을 수득하였다.
또한, 강낭콩 (Phaseolus vulgaris) 으로부터 단리된 이소렉틴 혼합물인 1-10 ㎍/ml PHA-M (Sigma #L8902) 을 인간 또는 게잡이 원숭이 T 세포 활성화를 유도하기 위한 분열유발성 (mitogenic) 자극으로서 이용하였다. 쥐과동물 T 세포에 있어서, "rat T-Stim with ConA" (BD #354115) 의 5% 용액을 T 세포 활성화를 위한 양성 대조군으로서 사용하였다.
정규화를 위해, 표적 세포의 최대 용균 (= 100 %) 은 최종 농도 1 % Triton-X-100 에 의한 표적 세포의 항온처리에 의해 달성되었다. 최저 용균 (= 0 %) 은 어떠한 작제물 또는 항체도 없이 효과기 세포와 공동-항온처리된 표적 세포를 나타낸다.
18 시간 이상 37℃, 5 % CO2 의 하룻밤 항온처리 후, 상청액으로의 아폽토시스/괴사 표적 세포의 LDH 방출을, LDH 탐지 키트 (Roche Applied Science, # 11 644 793 001) 에 의해, 제조사의 설명서에 따라 측정하였다.
Fab (MCSP)-CrossFab (CD3) 및 Fab (MCSP)- Fab (MCSP)-CrossFab (CD3) 이중특이적 작제물에 의한 LDH 방출 검정
정제된 Fab (MCSP)-CrossFab (CD3), Fab (MCSP)- Fab (MCSP)-CrossFab (CD3) 및 (scFv)2 (항MCSP/항 huCD3e) 기준 분자를, 세포 상의 각각의 항원에 대한 2 개의 표적 모이어티의 결합을 통한 작제물의 가교결합시, 종양 표적 세포에서의 T 세포-매개된 아폽토시스를 유도하는 이의 잠재능에 대해 분석하였다. 간단히 말하자면, huMCSP-발현 MDA-MB-435 인간 흑색종 표적 세포를 세포 분해 완충액으로 수확하고, 세척하고, AIM-V 배지 (Invitrogen # 12055-091) 중에서 재현탁하였다. 웰 당 30 000 개의 세포를 환저 96-웰-플레이트에서 플레이팅하고, 각각의 항체 희석액을 지시된 농도로 첨가하였다. 모든 작제물 및 대조군을 동일한 몰 농도로 조정하였다.
인간 pan T 효과기 세포를 첨가하여 5:1 의 최종 E:T 비율을 수득하였다. 인간 pan T 세포의 활성화를 위한 양성 대조군으로서, 1 ㎍/ml PHA-M (Sigma #L8902) 을 사용하였다. 정규화를 위해, 표적 세포의 최대 용균 (= 100 %) 은 최종 농도 1 % Triton-X-100 에 의한 표적 세포의 항온처리에 의해 달성되었다. 최저 용균 (= 0 %) 은 어떠한 작제물 또는 항체도 없이 효과기 세포와 공동-항온처리된 표적 세포를 나타낸다.
20 시간 동안 37℃, 5 % CO2 의 하룻밤 항온처리 후, 아폽토시스/괴사 표적 세포의 상청액으로의 LDH 방출을, LDH 탐지 키트 (Roche Applied Science, # 11 644 793 001) 에 의해, 제조사의 설명서에 따라 측정하였다.
도 10 에 도시된 바와 같이, 2가 MCSP-표적화를 가지는 작제물은 (scFv)2 (항MCSP/항 huCD3e) 작제물과 비교하여 필적할만한 세포독성 활성을 나타낸 반면, 1가 MCSP 결합을 가지는 Fab (MCSP)-CrossFab (CD3) 작제물은 명백히 덜 강력하였다.
MDA-MB-435 인간 흑색종 표적 세포와 Fab (MCSP)- Fab (MCSP)-CrossFab (CD3) 이중특이적 작제물에 의한 LDH 방출 검정
정제된 Fab (MCSP)- Fab (MCSP)-CrossFab (CD3) 및 (scFv)2 (항MCSP/항 huCD3e) 기준 분자를, 세포 상의 각각의 항원에 대한 2 개의 표적 모이어티의 결합을 통한 작제물의 가교결합시, 종양 표적 세포에서의 T 세포-매개된 아폽토시스를 유도하는 이의 잠재능에 대해 분석하였다.
간단히 말하자면, huMCSP-발현 MDA-MB-435 인간 흑색종 표적 세포를 세포 분해 완충액으로 수확하고, 세척하고, AIM-V 배지 (Invitrogen # 12055-091) 중에서 재현탁하였다. 웰 당 30 000 개의 세포를 환저 96-웰-플레이트에서 플레이팅하고, 각각의 항체 희석액을 지시된 농도로 첨가하였다. 모든 작제물 및 대조군을 동일한 몰 농도로 조정하였다.
인간 pan T 효과기 세포를 첨가하여 5:1 의 최종 E:T 비율을 수득하였다. 인간 pan T 세포의 활성화를 위한 양성 대조군으로서, 5 ㎍/ml PHA-M (Sigma #L8902) 을 사용하였다. 정규화를 위해, 표적 세포의 최대 용균 (= 100 %) 은 최종 농도 1 % Triton-X-100 에 의한 표적 세포의 항온처리에 의해 결정되었다. 최저 용균 (= 0 %) 은 어떠한 작제물 또는 항체도 없이 효과기 세포와 공동-항온처리된 표적 세포를 나타낸다.
21 시간 동안 37℃, 5 % CO2 에서의 하룻밤 항온처리 후, 아폽토시스/괴사 표적 세포의 상청액으로의 LDH 방출을, LDH 탐지 키트 (Roche Applied Science, # 11 644 793 001) 에 의해, 제조사의 설명서에 따라 측정하였다.
도 11 에 도시된 바와 같이, Fab (MCSP)- Fab (MCSP)-CrossFab (CD3) 는 표적 세포에서 (scFv)2 (항MCSP/항 huCD3e) 분자만큼 적어도 필적할 정도로 양호하게 아폽토시스를 유도하였다.
MV-3 인간 흑색종 표적 세포와 Fab (MCSP)- Fab (MCSP)-CrossFab (CD3) 이중특이적 작제물에 의한 LDH 방출 검정
정제된 Fab (MCSP)- Fab (MCSP)-CrossFab (CD3) 및 (scFv)2 (항MCSP/항 huCD3e) 분자를, 세포 상의 각각의 항원에 대한 2 개의 표적 모이어티의 결합을 통한 작제물의 가교결합시, 종양 표적 세포에서의 T 세포-매개된 아폽토시스를 유도하는 잠재능에 대해 분석하였다.
간단히 말하자면, huMCSP-발현 MV-3 인간 흑색종 표적 세포를 LDH 방출 검정을 시작하기 전일에 트립신으로 수확하였다. 세포를 세척하고, 적절한 세포 배양 배지에서 재현탁하였다. 웰 당 30 000 개의 세포를 환저 96-웰-플레이트에서 플레이팅하였다. 다음날, 상청액을 버리고, 100 μl/웰 AIM-V 배지 (Invitrogen # 12055-091) 뿐만 아니라, 각각의 항체 희석액을 지시된 농도로 첨가하였다. 모든 작제물 및 대조군을 동일한 몰 농도로 조정하였다.
인간 PBMC 효과기 세포를 첨가하여 10:1 의 최종 E:T 비율을 수득하였다. 인간 pan T 세포의 활성화를 위한 양성 대조군으로서, 5 ㎍/ml PHA-M (Sigma #L8902) 을 사용하였다. 정규화를 위해, 표적 세포의 최대 용균 (= 100 %) 은 최종 농도 1 % Triton-X-100 에 의한 표적 세포의 항온처리에 의해 결정되었다. 최저 용균 (= 0 %) 은 어떠한 작제물 또는 항체도 없이 효과기 세포와 공동-항온처리된 표적 세포를 나타낸다.
26 시간 동안 37℃, 5 % CO2 에서의 하룻밤 항온처리 후, 아폽토시스/괴사 표적 세포의 상청액으로의 LDH 방출을, LDH 탐지 키트 (Roche Applied Science, # 11 644 793 001) 에 의해, 제조사의 설명서에 따라 측정하였다.
도 12 에 도시된 바와 같이, Fab (MCSP)- Fab (MCSP)-CrossFab (CD3) 는 (scFv)2 (항MCSP/항 huCD3e) 분자만큼 적어도 필적할 정도로 양호하게 아폽토시스를 유도하였다.
MV-3 인간 흑색종 표적 세포와 Fab (MCSP)- CrossFab (CD3) 이중특이적 작제물에 의한 LDH 방출 검정
LDH 방출 검정을 상기 개략적으로 설명한 바와 같이 수행하였다. 도 19 는 약 24 시간 동안 각각 (scFv)2 (항MCSP/항 huCD3e) 기준 분자, Fab (MCSP)- CrossFab (CD3) 로 처리된 인간 PBMC (E:T 비율 = 10:1) 와의 공동 배양시의 huMCSP-양성 MV-3 종양 세포의 사멸을 보여준다.
쥐과동물 CrossFab (CD3)-Fab (MCSP)- Fab (MCSP) 이중특이적 작제물에 의한 LDH 방출 검정
쥐과동물 CD3 뿐만 아니라 인간 MCSP 를 표적화하는, 정제된 쥐과동물 CrossFab (CD3)-Fab (MCSP)- Fab (MCSP) 을, 세포 상의 각각의 항원에 대한 2 개의 표적 모이어티의 결합을 통한 작제물의 가교결합시, 종양 표적 세포에서의 T 세포-매개된 아폽토시스를 유도하는 잠재능에 대해 분석하였다.
간단히 말하자면, huMCSP-발현 B16/F10-huMCSP Fluc2 클론 48 종양 표적 세포를 세포 분해 완충액으로 수확하고, 세척하고, 1x NEAA, 10 mM Hepes, 50 μm 2-b-ME 및 1 mM 피루브산나트륨을 포함하는 RPMI1640 배지에서 재현탁하였다.
웰 당 20 000 개의 세포를 환저 96-웰-플레이트에 플레이팅하고, 각각의 항체 희석액을 지시된 농도로 첨가하였다. 이중특이적 작제물 및 상이한 IgG 대조군을 동일한 몰 농도로 조정하였다. 쥐과동물 T 세포의 활성화에 대한 추가의 대조군으로서, "T Cell Stim with ConA" (BD #354115) 를 사용하고, 검정 배지로 1:160 희석하였다.
비장세포 (C57BL/6 마우스) 로부터 단리된 쥐과동물 pan T 효과기 세포를 첨가하여 10:1 의 최종 E:T 비율을 수득하였다. 정규화를 위해, 표적 세포의 최대 용균 (= 100 %) 은 최종 농도 1 % Triton-X-100 에 의한 표적 세포의 항온처리에 의해 결정되었다. 최저 용균 (= 0 %) 은 어떠한 작제물 또는 항체도 없이 효과기 세포와 공동-항온처리된 표적 세포를 나타낸다.
70 시간 동안 37℃, 5 % CO2 에서의 항온처리 후, 아폽토시스/괴사 표적 세포의 상청액으로의 LDH 방출을, LDH 탐지 키트 (Roche Applied Science, # 11 644 793 001) 에 의해, 제조사의 설명서에 따라 측정하였다.
도 13 에 도시된 바와 같이, 이중특이적 작제물은 "T Cell Stim with ConA" 에 의한 양성 대조군과 필적할 정도로 표적 세포로부터 농도-의존적 LDH 방출을 유도하였다.
쥐과동물 CrossFab (CD3)-Fab (MCSP)- Fab (MCSP) 이중특이적 작제물에 의한 LDH 방출 검정
쥐과동물 CD3 뿐만 아니라 인간 MCSP 를 표적화하는 정제된 쥐과동물 CrossFab (CD3)-Fab (MCSP)- Fab (MCSP) 을, 세포 상의 각각의 항원에 대한 2 개의 표적 모이어티의 결합을 통한 작제물의 가교결합시, 종양 표적 세포에서의 T 세포-매개된 아폽토시스를 유도하는 잠재능에 대해 분석하였다.
간단히 말하자면, huMCSP-발현 B16/F10-huMCSP Fluc2 클론 48 종양 표적 세포를 세포 분해 완충액으로 수확하고, 세척하고, 1x NEAA, 10 mM Hepes, 50 μM 2-b-ME 및 1 mM 피루브산나트륨을 포함하는 RPMI1640 배지에서 재현탁하였다.
웰 당 20 000 개의 세포를 환저 96-웰-플레이트에 플레이팅하고, 각각의 항체 희석액을 첨가하여 50 nM 의 최종 농도를 수득하였다. 이중특이적 작제물 및 상이한 IgG 대조군을 동일한 몰 농도로 조정하였다.
비장세포 (C57BL/6 마우스) 로부터 단리된 쥐과동물 pan T 효과기 세포를 첨가하여 10:1 의 최종 E:T 비율을 수득하였다. 표적 세포의 부재 하에서 쥐과 동물 T 세포의 과활성화 수준을 평가하기 위해, 50 nM 이중특이적 작제물 및 T 세포를 가지는 대조군 웰을 상응하게 플레이팅하였다.
정규화를 위해, 표적 세포의 최대 용균 (= 100 %) 은 최종 농도 1 % Triton-X-100 에 의한 표적 세포의 항온처리에 의해 결정되었다. 최저 용균 (= 0 %) 은 어떠한 작제물 또는 항체도 없이 효과기 세포와 공동-항온처리된 표적 세포를 나타낸다.
70 시간 동안 37℃, 5 % CO2 에서의 항온처리 후, 아폽토시스/괴사 표적 세포의 상청액으로의 LDH 방출을, LDH 탐지 키트 (Roche Applied Science, # 11 644 793 001) 로, 제조사의 설명서에 따라 측정하였다.
도 14 에 도시된 바와 같이, 이중특이적 작제물은 표적 세포로부터 강력한 LDH 방출을 유도한다. 표적 세포의 부재 하에서, 표적 세포와 공동 항온처리된 무처리 쥐과동물 T 세포와 비교하여 단지 약간의 LDH 증가만 (T 세포의 과활성화를 반영함) 이 있었다. 어떠한 대조군 IgG 도 표적 세포의 LDH 방출을 유도하지 않는다.
실시예 8: 사이토카인 방출 검정 (CBA 분석)
표적 세포의 존재 또는 부재 하에서 CD3-이중특이적 작제물에 의한 T 세포 활성화시에 상이한 사이토카인의 새로운 (de novo) 분비를 평가하기 위해, 인간 PBMC 를 버피 코트로부터 단리하고, 웰 당 Mio 세포 0.3 개를 환저 96-웰-플레이트에 플레이팅하였다. 다르게는, 건강한 기증자의 전혈 280 μl 를 딥-웰 96-웰 플레이트의 웰마다 플레이팅하였다.
종양 표적 세포 (예를 들면, CD3-MCSP-이중특이적 작제물을 위한 MDA-MB-435 세포) 를 첨가하여 10:1 의 최종 E/T 비율을 수득하였다. 이중특이적 작제물 및 대조군을 지시된 바와 같이 첨가하였다. 24 시간 이하 동안 37℃, 5 % CO2 에서의 항온처리 후, 검정 플레이트를 5 분 동안 350 g 에서 원심분리하고, 상청액을 후속적인 분석을 위해 새로운 딥-웰 96 웰에 옮겼다.
다음 CBA Flex Set 의 조합을 이용하여 FACS CantoII 에 대한 제조사의 설명서에 따라 CBA 분석을 수행하였다: 인간 그랜자임 B (BD 560304), 인간 IFN-γ Flex Set (BD 558269), 인간 TNF Flex Set (BD 558273), 인간 IL-10 Flex Set (BD 558274), 인간 IL-6 Flex Set (BD 558276), 인간 IL-4 Flex Set (BD 558272).
MCSP-CD3 이중특이적 작제물에 의한 사이토카인 방출 탐지
인간 MCSP 및 인간 CD3 을 표적화하는 다음의 정제된 이중특이적 작제물을, 종양 표적 세포의 존재 (A, B) 대 부재 (C, D) 하에서, T-세포 매개된 사이토카인의 새로운 분비를 유도하는 능력에 대해 분석하였다: "Fab (MCSP)- Fab (MCSP)-CrossFab (CD3) 및 (scFv)2 (항MCSP/항 huCD3e) 기준 분자.
간단히 말하자면, 건강한 기증자의 전혈 280 μl 를 딥-웰 96-웰 플레이트의 웰 마다 플레이팅하였다. IgG 대조군 및 상이한 이중특이적 작제물 뿐만 아니라 인간 MCSP 를 발현하는 30 000 개의 Colo-38 종양 표적 세포를 1 nM 의 최종 농도로 첨가하였다. 세포를 24 시간 동안 37℃, 5 % CO2 에서 항온처리하고, 이어서 5 분 동안 350 x g 로 원심분리하였다. 상청액을 후속적인 분석을 위해 새로운 딥-웰 96-웰-플레이트에 옮겼다.
다음 CBA Flex Set 의 조합을 이용하여 FACS CantoII 에 대한 제조사의 설명서에 따라 CBA 분석을 수행하였다: 인간 그랜자임 B (BD 560304), 인간 IFN-γ Flex Set (BD 558269), 인간 TNF Flex Set (BD 558273), 인간 IL-10 Flex Set (BD 558274), 인간 IL-6 Flex Set (BD 558276), 인간 IL-4 Flex Set (BD 558272).
도 15 는 상이한 사이토카인 수준을 도시하는데, 이것은 24 시간 동안 Colo-38 종양 세포의 존재 (A, B) 또는 부재 (C, D) 하에서 1 nM 의 상이한 CD3-MCSP 이중특이적 작제물 (Fab (MCSP)- Fab (MCSP)-CrossFab (CD3) 및 (scFv)2 (항MCSP/항 huCD3e)) 에 의한 처리 후 전혈 상청액에서 측정하였다. 전혈 280 μl 를 96-웰-플레이트의 웰 마다 플레이팅하고, 30 000 개의 Colo-38 세포를 지시된 바와 같이 첨가하였다.
Colo-38 종양 세포의 존재 하에서 T 세포의 활성화시에 분비된 주요한 사이토카인은 IL-6, 이어서 IFN감마이었다. 또한, 그랜자임 B 의 수준은 표적 세포의 존재 하에서 T 세포의 활성화시에 크게 증가하였다. 일반적으로, (scFv)2 (항MCSP/항 huCD3e) 작제물은 다른 이중특이적 작제물과 비교하여 조금 더 표적 세포의 존재 하에서 그랜자임 B 뿐만 아니라, TNF 와 IFN 감마의 수준을 상승시켰다 (A 및 B).
표적 세포의 존재 (또는 부재) 하에서 이중특이적 작제물에 의한 T 세포의 활성화시의 Th2 사이토카인 (IL-10 및 IL-4) 의 유의미한 분비는 없었다.
본 검정에서, 표적 세포의 부재 하에서 Fab (MCSP)- Fab (MCSP)-CrossFab (CD3) 작제물에 의해 유도된 IFN 감마의 약한 분비가 또한 존재하였다.
MCSP-쥐과동물 CD3 이중특이적 작제물에 의한 사이토카인 방출 검정
쥐과동물 CrossFab (CD3)-Fab (MCSP)- Fab (MCSP) 로서의 정제된 huMCSP-muCD3-표적화 이중특이적 분자를, 인간 MCSP-발현 종양 세포의 존재 하에서 CD8+ T 세포 상의 후기 활성화 마커 CD25 를 상향 조절하는 이의 잠재능에 대해 유세포측정법에 의해 테스트하였다.
간단히 말하자면, MCSP-양성 B16/F10-huMCSP Fluc2 클론 48 종양 세포를 세포 분해 완충액으로 수확하고, 계수하고, 생존력에 대해 검사하였다. 세포를 RPMI1640 배지 (1x NEAA, 10 mM Hepes, 50 ㎛ 2-b-ME, 1 mM 피루브산나트륨을 포함함) 에서 ml 당 0.3 x 106 (생) 세포로 조정하고, 이러한 세포 현탁액 100 μl 를 환저 96-웰 플레이트에 (지시된 바와 같이) 웰 마다 피펫팅하였다. (희석된) 이중특이적 작제물 50 μl 를 세포-함유 웰에 첨가하여 50 nM 의 최종 농도를 수득하였다. 인간 쥐과동물 T 효과기 세포를 비장세포 (C57BL/6 마우스) 로부터 단리하고, AIM-V 배지에서 ml 당 3 x 106 (생) 세포로 조정하였다. 이러한 세포 현탁액 50 μl 를 검정 플레이트 (상기 참조) 웰 마다 첨가하여 10:1 의 최종 E:T 비율을 수득하였다. 이중특이적 작제물이 huMCSP 를 발현하는 표적 세포의 존재 하에서만 T 세포를 활성화할 수 있는 경우, 50 nM 의 각각의 이중특이적 분자 뿐만 아니라 T 효과기를 함유하지만 표적 세포를 함유하지 않는 웰을 포함하였다.
70 시간 동안 37℃, 5 % CO2 에서의 항온처리 후, 세포를 원심분리하고 (5 분, 350 x g), 0.1 % BSA 를 포함하는 PBS 150 μl/웰로 2 회 세척하였다.
CD8a (래트 IgG2a; 클론 53-6.7; BioLegend #100712) 및 CD25 (래트 IgG2b; 클론 3C7; BD #553075) 에 대한 표면 염색을 공급사의 권고에 따라 수행하였다. 세포를 0.1 % BSA 를 포함하는 PBS 150 μl/웰로 2 회 세척하고, 고정화 완충액 (BD ##554655) 100 μl/웰을 사용하여 15 분 동안 4℃ 에서 고정하였다.
원심분리 후, 샘플을 200 μl/웰의 PBS, 0.1 % BSA 중에서 재현탁하고, FACS CantoII 기계 (Software FACS Diva) 를 이용하여 분석하였다.
도 16 은 쥐과동물 CrossFab (CD3)-Fab (MCSP)- Fab (MCSP) 작제물이 오직 표적 세포의 존재 하에서만 CD25 의 상향 조절을 유도한다는 것을 나타낸다.
실시예 9: 이중특이적 작제물의 관여시의 주요한 인간 T 세포 상의 표면 활성화 마커의 발현
오로지 종양 표적 세포의 배타적 존재 하에서, CD3 이중특이적 작제물의 결합시의 T 세포의 특이적 활성화에 대해 검사하기 위해, 주요한 인간 PBMC (상기에 기재된 바와 같이 단리함) 를 종양 항원-양성 표적 세포의 존재 또는 부재 하에 24 시간 이상 동안 지시된 농도의 이중특이적 작제물과 함께 항온처리하였다.
간단히 말하자면, 30 만개의 주요한 인간 PBMC 를, 배지 또는 huMCSP-양성 표적 세포 (MV-3 종양 세포) 를 함유하는 평저 96-웰 플레이트의 웰 마다 플레이팅하였다. 효과기 대 표적 세포 (E:T) 의 최종 비율은 10:1 이었다. 세포를, 지시된 농도의 CD3-MCSP 이중특이적 작제물 (Fab (MCSP)-CrossFab (CD3) ("1+1 non-Fc" 로서 표기함), 및 (scFv)2 (항MCSP/항 huCD3e) 기준 분자 ("(scFv)2" 로서 표기함) 과 함께 지시된 항온처리 시간 동안 37℃, 5% CO2 에서 항온처리하였다. 효과기 세포를 CD8, 및 조기 활성화 마커 CD69 또는 후기 활성화 마커 CD25 에 대해 염색하고, FACS CantoII 에 의해 분석하였다.
도 20 은 본 실험의 결과를 나타낸다.
실시예 10: Fab-CrossFab 연결된 경쇄 (2 개의 링커를 가지는 Fab-Crossfab) 의 제조
상기 분자는 폴리에틸렌이민을 사용하여 현탁액 중에서 성장하는 HEK293-EBNA 세포를 포유동물 발현 벡터로 공동-형질감염시킴으로써 제조하였다. 상기 세포를 상응하는 발현 벡터에 의해 1:1 비율 ("벡터 중쇄":"벡터 연결된 경쇄") 로 형질감염시켰다.
HEK293 EBNA 세포를 CD CHO 무혈청 배양 배지 중의 현탁액에서 배양하였다. 500 ml 진탕 플라스크에서 제조하기 위해, 4 억개의 HEK293 EBNA 세포를 형질감염 24 시간 전에 씨딩하였다. 형질감염을 위해, 세포를 5 분 동안 210 x g 로 원심분리하고, 상청액을 예열된 CD CHO 배지 20 ml 로 대체하였다. 발현 벡터를 CD CHO 배지 20 ml 에서 DNA 200 ㎍ 의 최종 양으로 혼합하였다. PEI 540　μl 의 첨가 후, 용액을 15 초 동안 보르텍스하고, 이어서 10 분 동안 실온에서 항온처리하였다. 이후, 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고, 500 ml 진탕 플라스크로 옮기고, 37　℃ 에서 3 시간 동안 항온처리기에서 5% CO2 분위기 하에서 항온처리하였다. 항온처리 시간 후, F17 배지 160 ml 를 첨가하고, 세포를 24 시간 동안 배양하였다. 형질감염 1 일 후, 1 mM 발포르산 및 7% Feed 1 을 첨가하였다. 7 일 후, 배양 상청액을 15 분 동안 210 x g 에서의 원심분리에 의해 정제를 위해 수집하고, 용액을 멸균 여과하고 (0.22　㎛ 필터), 0.01 % w/v 의 최종 농도로 나트륨 아지드를 첨가하고, 4　℃ 에서 유지하였다.
단백질 G 친화도 크로마토그래피를 이용한 친화도 크로마토그래피, 이어서 크기 배제 크로마토그래피 단계에 의해, 분비된 단백질을 세포 배양물 상청액으로부터 정제하였다.
친화도 크로마토그래피를 위해, 30 ml 의 20　mM 인산나트륨, 20　mM 시트르산나트륨, pH 7.5 로 평형화된 HiTrap Protein　G HP 컬럼 (CV =　5 ml, GE Healthcare) 상에 상청액을 로딩하였다. 2개의 컬럼을 6 컬럼 용적의 20　mM 인산나트륨, 20　mM 시트르산나트륨, pH 7.5 로 세척함으로써 미결합된 단백질을 제거하였다. 이어서, 컬럼을 8 컬럼 용적 이상의 20　mM 인산나트륨, 20　mM 시트르산나트륨, pH 7.5 를 이용하여 세척하였다. 7 컬럼 용적의 8.8　mM 포름산, pH 3.0 을 가지는 단계 구배를 이용하여 HiTrap Protein　G HP 컬럼으로부터 표적 단백질을 용출시켰다. 25 mM 인산칼륨, 125 mM 염화나트륨, 100 mM 글라이신 용액, pH 6.7 로 평형화된 HiLoad Superdex 200 컬럼 (GE Healthcare) 상에 표적 단백질을 직접 로딩하였다.
정제된 단백질 샘플의 단백질 농도는, 아미노산 서열에 기초하여 산출된 몰 흡광 계수를 이용하여, 280 nm 에서의 흡광도 (OD) 를 측정함으로써 결정하였다.
항체의 순도 및 분자량은 환원제 (5 mM 1,4-디티오트레이톨) 의 존재 및 부재 하에서 쿠마시 염색 (SimpleBlue™ SafeStain, Invitrogen) 의 SDS-PAGE 에 의해 분석하였다. NuPAGE® Pre-Cast 겔 시스템 (Invitrogen, USA) 은 제조사의 설명서 (4-12　% Tris) 에 따라 이용하였다.
항체 샘플의 응집물 함량은 25℃ 에서의 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-아르기닌 모노하이드로클로라이드, 0.02 % (w/v) NaN3, pH 6.7 작동 완충액 중에서 TSKgel G3000 SW XL 분석용 크기-배제 컬럼 (Tosoh) 을 이용하여 분석하였다. 최종 단량체 함량은 99.4 % 이었다.
Figure pct00004

2 개의 링커를 가지는 예시적인 Fab-Crossfab 분자 (2 개의 쇄: VHCH1(MCSP)-(G4S)2-VLCH1(CD3V9) = 서열 번호: 164, VLCL(MCSP) - -(G4S)2-VHCL(CD3V9) = 서열 번호: 163 으로 이루어짐; 도 24a 에 도시된 바와 같은 배향으로) 의 제조 및 정제 분석을 도 25 에 나타낸다. 이러한 분자는 추가로 Fab (MCSP)=Crossfab (CD3) 또는 hu Fab (MCSP)=Crossfab (CD3) 으로서 지칭된다.
Fab-CrossFab 연결된 경쇄의 열 안정성
단백질의 열 안정성을 동적 광 산란 (Dynamic Light Scattering: DLS) 으로 모니터링하였다. 1 mg/ml 의 단백질 농도를 가지는 여과된 단백질 샘플 30 μg 을 Dynapro 플레이트 판독기 (Wyatt Technology Corporation; USA) 에 2 반복으로 적용하였다. 온도를 25℃ 에서부터 75 ℃ 까지 0.05 ℃/분으로 증가시키면서, 반경 및 총 산란 강도를 수집하였다.
그 결과를 도 28 에 나타낸다. 2 개의 링커를 가지는 예시적인 Fab-Crossfab 분자 (2 개의 쇄: VHCH1(MCSP)-(G4S)2-VLCH1(CD3V9) = 서열 번호: 164, VLCL(MCSP) - -(G4S)2-VHCL(CD3V9) = 서열 번호: 163 으로 이루어짐; 도 24a 에 도시된 바와 같은 배향으로) 에 대하여 (scFv)2 분자와 비교하여 열 안정성을 분석하였다. Fab-CrossFab 연결된 경쇄 분자의 응집물 온도를 63 ℃ 에서 측정하였다 (흑색 선). (scFv)2 분자는 2 개의 링커를 가지는 Fab-Crossfab 분자에 비해 열등하였는데, 이는 이것이 45 ℃ 에서 이미 응집하기 시작하기 때문이다 (회색 선).
2 개의 링커를 가지는 Fab-Crossfab 분자는 보다 높은 안정성을 가지고, 따라서 (scFv)2 분자 보다 더 개발가능하다.
실시예 11: 2 개의 링커를 가지는 Fab-Crossfab (Fab (MCSP)=Crossfab (CD3)) 의 분석
신선혈 또는 피피 코트로부터의 일차 인간 PBMC 의 분리
현지 혈액 은행으로부터 또는 건강한 인간 기증자의 신선한 혈액으로부터 수득된 풍부한 림프구 준비물 (버피 코트) 로부터, 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 를 Histopaque 밀도 원심분리에 의해 제조하였다. 간단히 말하자면, 혈액을 멸균 PBS 로 희석하고, Histopaque 구배 (Sigma, H8889) 에 걸쳐 조심스럽게 층을 이루게 하였다. 실온 (브레이크 스위치를 끔) 에서 450 x g 로 30 분 동안 원심분리 후, PBMC 함유 계면 위의 혈장 부분을 버렸다. PBMC 를 새로운 50 ml 팔콘 튜브에 옮기고 튜브를 50 ml 의 총 용적까지 충전하였다. 브레이크 스위치를 켜고, 실온에서 400 x g 로 10 분 동안 원심분리하였다. 상청액을 버리고, PBMC 펠릿을 멸균 PBS 로 2 회 세척하였다 (4 ℃ 에서 350 x g 로 10 분 동안의 원심분리 단계).
수득된 PBMC 모집단을 자동적으로 계수하고 (ViCell), 검정을 시작할 때까지 10 % FCS 및 1 % L-알라닐-L-글루타민 (Biochrom, K0302) 을 함유하는 RPMI1640 배지에 37 ℃, 5 % CO2 의 항온처리기에서 보관하였다.
이중특이적 작제물의 관여시 일차 인간 T 세포 상의 표면 활성화 마커의 FACS 분석
종양 표적 세포의 배타적 존재 하에 CD3 이중특이적 작제물의 결합시 T 세포의 특이적 활성화를 검토하기 위해, 일차 인간 PBMC 를 표시된 농도의 이중특이적 작제물로 MCSP-양성 표적 세포의 존재 또는 부재 하에서 22 h 이상 동안 항온처리하였다. 간단히 말하자면, MCSP-양성 표적 세포 (또는 배지) 를 함유하는 평저 96-웰 플레이트의 웰 당 0.3 백만의 일차 인간 PBMC 를 플레이팅하였다. 최종 효과기 대 표적 세포 (E:T) 비율은 10:1 이었다. 상기 세포를 표시된 항온처리 시간 동안 37 ℃, 5 % CO2 에서 표시된 농도의 이중특이적 작제물 및 대조군으로 항온처리하였다. 효과기 세포를 CD8, 및 조기 활성화 마커 CD69 또는 후기 활성화 마커 CD25 에 대해 염색하고, FACS CantoII 에 의해 분석하였다.
도 27 은 본 검정의 결과를 나타낸다: CD69 중앙 형광의 상향 조절 (A), CD69 양성 세포의 각각의 % (B) 로서 측정된, 24 시간 후 MCSP-양성 MV-3 종양 세포 (E:T = 10:1) 의 존재 대 부재 하에 상이한 CD3-MCSP 이중특이적 작제물에 의해 매개된 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 활성화.
LDH 방출 검정
인간 T 세포 상의 CD3 및 종양 세포 상의 인간 MCSP 를 표적화하는 이중특이적 작제물은, 표적 세포의 T 세포 매개된 아폽토시스를 유도하는 이의 잠재능에 대하여 LDH 방출 검정으로 분석하였다. 간단히 말하자면, 표적 세포 (인간 Colo-38 또는 인간 MV-3 흑색종 세포) 를 검정일에 세포 분리 완충액으로 (또는 검정을 시작하기 전일에 트립신으로) 수확하고, 세척하고, 적절한 세포 배양 배지에서 재현탁하였다 (지시된 바와 같음). 웰 당 20 000 - 30 000 개의 세포를, 평저 96 웰-플레이트에 플레이팅하고, 각각의 항체 희석액을 지시된 바와 같이 첨가하였다 (3 반복). 효과기 세포를 첨가하여 10:1 의 최종 E:T 비율을 수득하였다. 모든 작제물 및 대조군을 동일한 몰 농도로 조정하였다. 정규화를 위해, 표적 세포의 최대 용균 (= 100 %) 은 최종 농도 1 % Triton-X-100 에 의한 표적 세포의 항온처리에 의해 달성되었다. 최저 용균 (= 0 %) 은 어떠한 작제물도 없이 효과기 세포와 공동-항온처리된 표적 세포를 나타낸다. 37℃, 5 % CO2 에서 22 h 이상의 하룻밤 항온처리 후, LDH 탐지 키트 (Roche Applied Science, # 11 644 793 001) 를 사용하여, 제조사의 설명서에 따라 상청액으로의 아폽토시스/괴사 표적 세포의 LDH 방출을 측정하였다.
도 26 은 본 검정의 결과를 나타낸다: 상이한 CD3-MCSP 이중특이적 작제물로 약 24 시간 동안 처리된, 인간 PBMC 와의 공동-배양시 (E:T 비율 = 10:1) 의 MCSP-양성 MV-3 종양 세포의 사멸 (LDH 방출에 의해 측정).
EC50 값은 Graph Pad Prism 소프트웨어를 사용하여 측정하였다.
Figure pct00005

본 발명의 바람직한 실시형태를 현재 보여주고 기재하였지만, 본 발명이 이에 한정되지 않으며 하기 특허청구범위 내에서 달리 다양하게 구체화되고 실시될 수 있는 것은 명백히 이해되어야 한다.
실시예 12: 항-MCSP 항체 M4-3 / ML2 의 친화도 성숙
친화도 성숙은 그 전문이 본원에 참조로 인용되는 유럽 특허 출원 EP 13156686.1 에 기재되어 있다.
올리고뉴클레오타이드-지정된 돌연변이유발 절차를 통해 친화도 성숙을 수행하였다. 이를 위해, 문헌 [Hoogenboom et al., Nucleic Acids Res. 1991, 19, 4133-4137] 에 기재된 것들과 유사하게 중쇄 변이체 M4-3 및 경쇄 변이체 ML2 를 파지미드 벡터에 클로닝하였다. 무작위배정되는 잔기는 먼저 고전적인 상동성 모델링을 통해 항체의 3D 모델을 생성하고, 이어서 중쇄 및 경쇄의 상보성 결정 영역 (CDR) 의 용매 접근가능한 잔기를 확인함으로써 확인되었다. 표 3 에 나타낸 바와 같이 트리뉴클레오타이드 합성에 기초하여 무작위배정된 올리고뉴클레오타이드는 Ella-biotech (Munich, Germany) 로부터 구입하였다. 고전적인 PCR 을 통해 3 개의 독립 서브라이브러리를 생성하고, CDR-H2 와 함께 CDR-H1, 또는 CDR-L2 와 함께 CDR-L1 에 무작위 포함시키고, CDR-L3 을 별도의 접근법으로 무작위배정하였다. 제한 효소분해 및 리게이션을 통해 이들 라이브러리의 DNA 단편을 파지미드에 클로닝하고, 이어서 TG1 박테리아에 전기천공하였다.
라이브러리 선별
이렇게 하여 생성된 항체 변이체를 각각의 입자 내에 패키지된 M13 의 유전자 III 생성물에 대한 방식으로서 필라멘트형 파지 입자로부터 1가 방식으로 디스플레이하였다. 이어서, 파지-디스플레이된 변이체를 이의 생물학적 활성 (본원: 결합 친화도) 에 대해 스크리닝하고, 1 개 이상의 개선된 활성을 가지는 후보를 추가의 개발을 위해 사용하였다. 파지 디스플레이 라이브러리의 제조 방법은 문헌 [Lee et al., J. Mol. Biol. (2004) 340, 1073-1093] 에서 발견될 수 있다.
모든 친화도 성숙 라이브러리에 의한 선별을 다음 절차에 따라 용액에서 수행하였다: 1. 총 용적 1ml 중에서 0.5 h 동안 100nM 비오틴화 hu-MCSP(D3 도메인)-avi-his (서열 번호: 118) 에 대한 각각의 친화도 성숙 라이브러리의 약 1012 개의 파지미드 입자의 결합, 2. 10 분 동안 5.4 x107 개의 스트렙타비딘-코팅된 자기 비드의 첨가에 의한 비오틴화 hu-MCSP(D3 도메인)-avi-his 및 특이적으로 결합된 파지 입자의 포획, 3. PBS/Tween20 5-10x 1ml 및 PBS 5-10x 1ml 를 사용하는 비드의 세척, 4. 10 분 동안 100mM TEA (트리에틸아민) 1ml 의 첨가에 의한 파지 입자의 용출 및 1 M Tris/HCl pH 7.4 500 μl 의 첨가에 의한 중성화, 및 5. 기하급수적으로 성장하는 대장균 TG1 박테리아의 재감염, 보조 파지 VCSM13 에 의한 감염 및 후속적 선별 라운드에서 사용될 파지미드 입자의 후속적인 PEG/NaCl 침전. 일정하거나 감소하는 (10-7 M 내지 2x10-9 M) 항원 농도를 사용하여 선별을 3-5 라운드에 걸쳐 수행하였다. 라운드 2 에서, 항원의 포획: 스트렙타비딘 비드 대신에 뉴트라비딘 플레이트를 사용하여 파지 복합체를 실시하였다. 특이적인 바인더를 다음과 같이 ELISA 에 의해 확인하였다: 웰 당 10nM 비오틴화 hu-MCSP(D3 도메인)-avi-his 100 μl 를 뉴트라비딘 플레이트 상에 코팅하였다. Fab-함유 박테리아 상청액을 첨가하고, 항-Flag/HRP 이차 항체를 사용함으로써 결합 Fab 를 이의 Flag-tag 를 통해 탐지하였다. ELISA-양성 클론을 96-웰 형식에서 가용성 Fab 단편으로서 박테리아에 의해 발현시키고, 상청액에 대해 ProteOn XPR36 (BioRad) 을 사용하는 SPR-분석에 의해 동력학 선별 실험을 실시하였다. 최대 친화도 상수를 가지는 Fab 를 발현하는 클론을 확인하고, 상응하는 파지미드를 서열분석하였다.
표 3 (Cys 및 Met 는 항상 배제되었다. Lys 는 올리고뉴클레오타이드가 역전사 프라이머인 경우에 상부에서 배제되었다)
Figure pct00006

중쇄 무작위배정을 CDR1 및 CDR2 에서만 수행하였다. CDR3 에서와 독립적으로 CDR1 및 CDR2 에서 경쇄 무작위배정을 수행하였다.
선별 동안, 프레임 워크 내의 약간의 돌연변이가 클론 G3 내의 F71Y 또는 클론 E10 내의 Y87H 와 같이 발생하였다.
인간 IgG1 의 제조 및 정제
친화도 성숙된 변이체의 중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역을, 각각의 수용자 포유동물 발현 벡터에 미리 삽입된 불변 중쇄 또는 불변 경쇄로 프레임 내에 서브클로닝하였다. 항체 발현은 MPSV 프로모터에 의해 구동되며, CDS 의 3' 말단에 합성 polyA 신호 서열을 보유한다. 또한, 각각의 벡터는 EBV OriP 서열을 포함하였다.
상기 분자는 폴리에틸렌이민을 사용하여 HEK293-EBNA 세포를 포유동물 발현 벡터로 공동-형질감염시킴으로써 제조하였다. 상기 세포를 상응하는 발현 벡터에 의해 1:1 비율로 형질감염시켰다. 형질감염을 위해, HEK293 EBNA 세포를 CD CHO 무혈청 배양 배지 중의 현탁액에서 배양하였다. 500 ml 진탕 플라스크에서 제조하기 위해, 4 억개의 HEK293 EBNA 세포를 형질감염 24 시간 전에 씨딩하였다. 형질감염을 위해, 세포를 5 분 동안 210 x g 로 원심분리하고, 상청액을 예열된 CD CHO 배지 20 ml 로 대체하였다. 발현 벡터를 CD CHO 배지 20 ml 에서 DNA 200 ㎍ 의 최종 양으로 혼합하였다. PEI 540　μl 의 첨가 후, 용액을 15 초 동안 보르텍스하고, 이어서 10 분 동안 실온에서 항온처리하였다. 이후, 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고, 500 ml 진탕 플라스크로 옮기고, 37　℃ 에서 3 시간 동안 항온처리기에서 5% CO2 분위기 하에서 항온처리하였다. 항온처리 시간 후, F17 배지 160 ml 를 첨가하고, 세포를 24 시간 동안 배양하였다. 형질감염 1 일 후, 1 mM 발포르산 및 7% Feed 1 을 첨가하였다. 7 일 후, 배양 상청액을 15 분 동안 210 x g 에서의 원심분리에 의해 정제를 위해 수집하고, 용액을 멸균 여과하고 (0.22　㎛ 필터), 0.01 % w/v 의 최종 농도로 나트륨 아지드를 첨가하고, 4　℃ 에서 유지하였다.
단백질 A 를 이용하는 친화도 크로마토그래피에 의해, 분비된 단백질을 세포 배양물 상청액으로부터 정제하였다. 40 ml 의 20　mM 인산나트륨, 20　mM 시트르산나트륨, 0.5　M 염화나트륨, pH 7.5 로 평형화된 HiTrap Protein　A HP 컬럼 (CV = 5 ml, GE Healthcare) 상에 상청액을 로딩하였다. 10 컬럼 용적 이상의 20　mM 인산나트륨, 20　mM 시트르산나트륨, 0.5　M 염화나트륨, pH 7.5 로 세척함으로써 미결합된 단백질을 제거하였다. 20　mM 시트르산나트륨, 0.5　M 염화나트륨, pH 7.5 에서부터 20　mM 시트르산나트륨, 0.5　M 염화나트륨, pH 2.5 까지의 20 컬럼 용적에 걸친 구배 동안 표적 단백질을 용출하였다. 1/10 의 0.5　M 인산나트륨, pH　8 을 첨가함으로써 단백질 용액을 중화하였다. 표적 단백질을 농축시키고, 여과한 후, 20 mM 히스티딘, 140 mM 염화나트륨 용액, pH 6.0 으로 평형화된 HiLoad Superdex 200 컬럼 (GE Healthcare) 상에 로딩하였다.
정제된 단백질 샘플의 단백질 농도는, 아미노산 서열에 기초하여 산출된 몰 흡광 계수를 이용하여, 280 nm 에서의 흡광도 (OD) 를 측정함으로써 결정하였다. 분자의 순도 및 분자량은 환원제의 존재 및 부재 하에서 CE-SDS 에 의해 분석하였다. Caliper LabChip GXII 시스템 (Caliper lifescience) 은 제조사의 설명서에 따라 이용하였다. 샘플 2㎍ 을 분석에 사용하였다. 항체 샘플의 응집물 함량은 25℃ 에서의 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-아르기닌 모노하이드로클로라이드, 0.02 % (w/v) NaN3, pH 6.7 작동 완충액 중에서 TSKgel G3000 SW XL 분석용 크기-배제 컬럼 (Tosoh) 을 이용하여 분석하였다.
친화도 결정
프로테온 분석 (ProteOn Analysis)
CM5 칩 상의 아민 커플링 및 박테리아 상청액으로부터 또는 정제된 Fab 준비물로부터의 Fab 의 후속적 포획에 의해 고정된 항-인간 F(ab')2 단편 특이적 포획 항체 (Jackson ImmunoResearch # 109-005-006) 를 가지는 ProteOn XPR36 기계 (BioRad) 를 25℃ 에서 사용하는 표면 플라스몬 공명으로 KD 를 측정하였다. 간단히 말하자면, 공급사의 설명서에 따라 카복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, GE Healthcare) 을 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC) 및 N-하이드록시석신이미드 (NHS) 로 활성화시켰다. 10 μl/분의 유속으로 주입하기 전에 항-인간 F(ab')2 단편 특이적 포획 항체를 10 mM 아세트산나트륨, pH 5.0 에 의해 50 ㎍/㎖ 로 희석하여 대략 10.000 반응 유닛 (RU) 이하의 커플링된 포획 항체를 달성하였다. 포획 항체의 주입 후, 1 M 에탄올아민을 주입하여 미반응 기를 차단하였다. 동역학 측정을 위해, 박테리아 상청액으로부터 또는 정제된 Fab 로부터의 Fab 를 300 초 동안 10 μl/분의 유속 및 포획 기준선 안정화를 위한 300 초의 해리로 주입하였다. 포획 수준은 100 - 500 RU 의 범위이었다. 후속적 단계로, 인간 MCSP(D3 도메인)-avi-his 분석물을 50 μl/분의 유속으로 25 ℃ 에서 HBS-EP+ (GE Healthcare, 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05 % Surfactant P20, pH 7.4) 에 희석된 농도 시리즈 (100nM 과 250pM 사이의 범위의 클론 친화도에 의존함) 또는 단일 농도로서 주입하였다. 센서칩의 표면을 90 μl/분으로 30 초 동안 글라이신 pH 1.5 의 주입에 이어서, 동일한 유속으로 20초 동안 NaOH 의 주입에 의해 재생하였다. 연합 속도 (kon) 및 해리 속도 (koff) 는, 단순한 일대일 랭뮤어 결합 모델 (ProteOn XPR36 Evaluation Software 또는 Scrubber software (BioLogic)) 을 사용하여, 연합 및 해리 센서그램을 동시에 피팅함으로써 산출하였다. 평형 해리 상수 (KD) 는 koff/kon 의 비율로서 산출하였다. 이러한 데이터를 사용하여 부모 항체와 친화도 성숙된 변이체의 비교 결합 친화도를 결정하였다. 표 4a 는 이들 검정으로부터 생성된 데이터를 나타낸다.
경쇄에 대한 G3, E10, C5, 및 중쇄에 대한 D6, A7, B7, B8, C1 을 인간 IgG1 형식으로 전환하기 위해 선택하였다. 경쇄의 CDR1 및 CDR2 는 CDR3 과 독립적으로 무작위배정되기 때문에, 수득된 CDR 을 IgG 전환 동안 조합하였다.
IgG 형식에서, 인간 MCSP 항체 및 게잡이 원숭이 동족체에 대한 친화도를 다시 측정하였다.
Fab 단편에 대해 정확히 기재된 방법을 사용하여 포유동물 생산으로부터 IgG 를 바로 정제하였다.
표 4a: MCSP 친화도 성숙된 클론: 프로테온 데이터
Figure pct00007

Biacore T200 을 사용하는 표면 플라스몬 공명 (SPR) 에 의한 친화도 결정
친화도 성숙된 IgG 의 친화도 및 결합능을 측정하기 위한 표면 플라스몬 공명 (SPR) 실험을, 작동 완충액 (0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005 % Surfactant P20, Biacore, Freiburg/Germany) 으로서 HBS-EP 를 가지는 Biacore T200 상에서 25 ℃ 에서 수행하였다.
인간 및 게잡이 원숭이 MCSP D3 에 대한 상이한 항MCSP IgG 의 상호작용의 결합능 분석을 분석하기 위해, 표준 아민 커플링 키트 (Biacore, Freiburg/Germany) 를 사용하여 항-Penta His 항체 (Qiagen) 의 대략 9,500 공명 유닛 (resonance unit: RU) 의 직접 커플링을 pH 5.0 에서 CM5 칩 상에서 수행하였다. 항원을 각각 10 μl/분으로 30 nM 에서 60 초 동안 포획하였다. IgG 를 유세포를 통해 280 초에 걸쳐 30 μl/분의 유속으로 0.0064 - 100　nM 의 농도로 통과시켰다. 해리를 180 초 동안 모니터링하였다. 기준 유세포 상에서 수득된 반응값을 공제함으로써 벌크 굴절률 차이를 보정하였다. 여기서, 항-Penta His 항체를 고정시킨 표면에 걸쳐 IgG 를 흐르게 하였지만, 인간 MCSP D3 또는 게잡이 원숭이 MCSP D3 보다 오히려 HBS-EP 상에 주입하였다.
친화도 측정을 위해, 항 인간 Fc 를 고정시킨 CM5 센서칩 표면 상에 IgG 를 포획하였다. 표준 아민 커플링 키트 (Biacore, Freiburg/Germany) 를 사용하여 pH 5.0 에서 대략 9,500 공명 유닛 (RU) 의 직접 고정화에 의해 포획 IgG 를 센서칩 표면에 커플링시켰다. IgG 를 30 μl/분으로 10 nM 에서 25 초 동안 포획하였다. 인간 및 게잡이 원숭이 MCSP D3 을 유세포를 통해 120 초에 걸쳐 30 μl/분의 유속으로 2 - 500　nM 의 농도로 통과시켰다. 해리를 60 초 동안 모니터링하였다. 농도 166 nM 및 500 nM 에 대한 연합 및 해리는 각각 1200 초 및 600 초 동안 모니터링하였다. 기준 유세포 상에서 수득된 반응값을 공제함으로써 벌크 굴절률 차이를 보정하였다. 여기서, 항-인간 Fc 항체를 고정시킨 표면에 걸쳐 항원을 흐르게 하였지만, 항 MCSP IgG 보다 오히려 HBS-EP 상에 주입하였다.
Biacore T200 Evaluation Software (vAA, Biacore AB, Uppsala/Sweden) 를 사용하여 동력학 상수를 유도하고, 수치 적분에 의해 1:1 랭뮤어 결합에 대한 반응 속도식을 피팅하였다.
인간 및 게잡이 원숭이 MCSP D3 에 대한 보다 높은 친화도는 Biacore T200 을 사용하여 표면 플라스몬 공명 방법에 의해 확인하였다. 또한, 결합능 측정은 2가 결합에서 3 배 이하의 증가를 나타냈다 (표 4b).
표 4b. 인간 MCSP-D3 및 게잡이 원숭이 MCSP D3 에 대한 항 MCSP IgG 의 친화도 및 결합능
Figure pct00008

서열
범례: GA201=EGFR 바인더, 3F2=FAP 바인더, CH1A1A=CEA 바인더.
단백질 서열
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
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단백질 서열: 인간화된 CD3 바인더 및 친화도 성숙된 MCSP 바인더
Figure pct00017
Figure pct00018
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Figure pct00020
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DNA 서열
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Figure pct00043
Figure pct00044

본 발명의 바람직한 실시형태를 현재 보여주고 기재하였지만, 본 발명이 이에 한정되지 않으며 하기 특허청구범위 내에서 달리 다양하게 구체화되고 실시될 수 있는 것은 명백히 이해되어야 한다.
<110> Roche Glycart AG <120> FC-FREE ANTIBODIES COMPRISING TWO FAB FRAGMENTS AND METHODS OF USE <130> 31270 WO <150> EP12187647.8 <151> 2012-10-08 <160> 203 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 VL MCSP <400> 1 Ser Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 VL MCSP <400> 2 Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 VL MCSP <400> 3 Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Trp Thr 1 5 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 VH MCSP <400> 4 Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly Tyr Tyr Trp Asn 1 5 10 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 VH MCSP <400> 5 Tyr Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn 1 5 10 15 <210> 6 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 VH MCSP <400> 6 Phe Asp Tyr 1 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> 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Claims (18)

  1. 2 개 이상의 Fab 단편을 포함하는 이중특이적 항체로서,
    제 1 Fab 단편은 제 1 항원에 대해 특이적인 1 개 이상의 항원 결합 부위를 포함하고; 제 2 Fab 단편은 제 2 항원에 대해 특이적인 1 개 이상의 항원 결합 부위를 포함하고, 여기서, 제 2 Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역은 교환되어 있고; 상기 2 개의 Fab 단편은 2 개의 펩타이드 링커에 의해 서로 연결되어 있고, 상기 이중특이적 항체는 Fc 도메인이 결여되어 있는 것인 이중특이적 항체.
  2. 제 1 항에 있어서, 제 3 Fab 단편을 추가로 포함하는 것인, 이중특이적 항체.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 제 3 Fab 단편은 상기 제 1 항원 또는 제 2 항원에 대해 특이적인 1 개 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 것인, 이중특이적 항체.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 제 3 Fab 단편은 상기 제 1 항원에 대해 특이적인 1 개 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 것인, 이중특이적 항체.
  5. 제 2 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 3 Fab 단편은 1 개 또는 2 개의 펩타이드 링커에 의해 상기 제 1 Fab 단편에 연결되어 있는 것인, 이중특이적 항체.
  6. 제 2 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 3 Fab 단편은 1 개 또는 2 개의 펩타이드 링커에 의해 상기 제 2 Fab 단편에 연결되어 있는 것인, 이중특이적 항체.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 Fab 단편은 종양 항원에 대해 특이적인 1 개 이상의 항원 결합 부위를 포함하고; 상기 제 2 Fab 단편은 T-세포 활성화 항원에 대해 특이적인 1 개 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 것인, 이중특이적 항체.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 T-세포 활성화 항원은 CD3 T-세포 공동-수용체 (CD3) 항원인 것인, 이중특이적 항체.
  9. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, 상기 종양 항원은 흑색종-관련 콘드로이틴 황산 프로테오글리칸 (Melanoma-associated Chondroitin Sulfate Proteoglycan: MCSP), 표피 성장 인자 수용체 (Epidermal Growth Factor Receptor: EGFR), 암배아 항원 (Carcinoembryonic Antigen: CEA), 섬유아세포 활성화 단백질 (Fibroblast Activation Protein: FAP) 및 CD33 의 군으로부터 선택되는 것인, 이중특이적 항체.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 종양 항원은 MCSP인 것인, 이중특이적 항체.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항의 이중특이적 항체를 포함하는 약제학적 조성물.
  12. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 암의 치료를 위한 것인, 이중특이적 항체.
  13. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 약제로서 사용하기 위한 것인, 이중특이적 항체.
  14. 약제의 제조에서의, 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항의 이중특이적 항체의 용도.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 약제는 암의 치료를 위한 것인, 용도.
  16. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항의 이중특이적 항체의 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함하는 원핵 또는 진핵 숙주 세포.
  17. 항체를 생산하도록 제 16 항의 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는 항체의 제조 방법.
  18. 본원에서, 특히 전술한 실시예에 관하여 기재된 바와 같은 발명.
KR1020157008972A 2012-10-08 2013-10-03 2개의 Fab 단편을 포함하는 FC-부재 항체 및 이용 방법 KR20150064068A (ko)

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